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Desenvolvimento Embrionário: das Células ao Coração.
Ana Paula Alves
2011
Universidade Federal de Minas Gerais - UFMG
Instituto de Ciências Exatas - ICEx
Programa de Pós Graduação em Física
Desenvolvimento Embrionário: das Células ao Coração.
Ana Paula Alves
Orientador: Prof. Ubirajara Agero Batista
Co-orientador: Prof. Oscar Nassif de Mesquita
Dissertação apresentada ao departamento de Física da Univer-
sidade Federal de Minas Gerais, para a obtenção de Título de
Mestre em Física
Área de Concentração: Física Biologica .
2010
Quando uma criatura humana desperta para um grande sonho e sobre ele lança toda a força de
sua alma, todo o universo conspira a seu favor. (Goethe)
Agradecimentos
Quero agradecer ao meu orientador Professor Ubirajara Agero pelo compromisso com este
trabalho, além do grande entusiasmo e compreensão. Ao Professor Oscar Nassif de Mesquita
pela oportunidade de conhecer o trabalho do grupo e me encaminhar ao Bira. Aos colegas
do laboratório de Física de Sistemas Biológicos da UFMG, Lívia, Ulisses, Paula, Pedro,
Barbara e ao Edgar. Aos funcionários da o�cina mecânica do departamento de física da
UFMG, Sr. João e ao Thiago e ao funcionário da o�cina elétrica, Rubens. Eles contribuiram
bastante no desenvolmento da montagem experimental deste trabalho. À minha família, pelo
apoio, especialmente minha mãe e minha irmã. Aos amigos do mestrado, pelos momentos de
descontração e de bandejão, especialmente gostaria de agradecer ao clube da luluzinha pelas
muitas risadas, e pelo grande apoio em todas as horas. Aos meus amigos de alguns anos,
boa parte da turma de 2005 de física. Gostaria de agradecer também à agência �nanciadora
CAPES pela bolsa de mestrado no periodo de 2 anos.
iv
Resumo
Usamos a Microscopia de Desfocalização (MD), técnica desenvolvida no laboratório de
Física de Sistemas Biológicos para obter informações sobre Desenvolvimento Embrionário.
Estudamos células extraídas de embriões de galinha nos primeiros estágios de desenvolvi-
mento, o batimento cardíaco e o crescimento de vasos no embrião. Desenvolvemos um
processo de extração e cultura de células mesenquimais somáticas no laboratório. As células
mesenquimais somáticas vão dar origem aos tecidos e órgãos do embrião, nosso objetivo
neste trabalho é caracterizar a dinâmica celular (membrana + citoesqueleto). Para tanto
foram obtidas células aderidas, em cultura, as quais exibiam diversos formatos. Através
das análises de correlação temporal do contraste obtemos os tempos de relaxação das �u-
tuações na membrana. Para uma mesma célula foram encontrados diferentes tempos de
relaxação na membrana celular, diferentemente dos resultados obtidos com células de outros
vertebrados analisados no laboratório. Neste trabalho conseguimos relacionar o tempo de
relaxação encontrado na membrana com a direção do movimento da célula, resultados pre-
liminares mostram que a célula se move na direção da região da membrana que apresenta
menor tempo de relaxação. Além disso, foram feitas análises da freqüência de batimento
cardíaco fazendo a transformada de Fourier do sinal do batimento cardíaco do embrião de
galinha durante o desenvolvimento embrionário. Os resultados obtidos mostram que em
estágios iniciais do desenvolvimento a freqüência de batimento é aleatória e similar à fre-
qüência das células do coração em cultura, os cardiomiócitos, tornando-se de�nida com o
desenvolvimento do embrião. Outro grande interesse neste trabalho é conseguir acompanhar
o crescimento de vasos durante o desenvolvimento embrionário. Para tanto, conseguimos
obter o embrião em estágios no qual não apresentava vasos, e em estágios posteriores já
vascularizado. Assim temos um sistema poderoso para estudar como ocorre o crescimento
de vasos no tempo, durante o desenvolvimento embrionário.
Palavras-chave:células mesenquimais somáticas, desenvolvimento embrionário, MD
I
Abstract
We use the defocusing microscopy, technique developed at laboratory, Physics of Bio-
logical Systems, for information on Embryonic Development. We study cell extracted from
chicken embryos in the early stages of development, heartbeat and vessel growth in the em-
bryo. We developed an extraction and culture procedure to obtain somatic mesenchymal
cells applied our laboratory. Somatic mesenchymal cells will give rise to tissues and organs
in embryo, our goal in this work is to characterize the cellular (membrane + cytoskeleton).
Adherent cells were obtained in culture, which exhibited a variety of formats. Through the
analysis of temporal correlation of the contrast of gray level we obtain the relaxation times
of the �uctuations in the membrane. For the same cell were found di�erent times in the
cell membrane, unlike the results obtained with cells of other vertebrates analyzed in the
laboratory. Relate the relaxation time found in the membrane with the movement of the cell,
preliminary results show that the cell moves toward the membrane region of least time. Also,
tests were made of the frequency of heart rate by doing the Fourier transform of the signal
from the heartbeat of the chicken embryo during embryonic development. The results show
that in the early stages of developing the beat frequency is similar to the random frequency
of heart cells in culture, cardiomyocytes, making it set to the developing embryo. We also
get the embryo stages in which had no pots, and in later stages as vascularized. So we have
a powerful system for studying how growth occurs in the time of vessels during embryonic
development.
Keywords: somatic mesenchymal cells, Embryonic Development, Defocusing Microscopic
II
Sumário
Resumo I
Abstract II
Lista de Figuras IV
1 Introdução 1
2 Desenvolvimento Embrionário 5
2.1 Introdução Geral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
2.2 Formação do Embrião . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
Gastrulação . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
Formação e Regressão da Linha Primitiva . . . . . . . . . . . . . . . . 9
Folhetos Embrionários . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
Mesoderme Paraxial. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
Somitogênese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
2.3 Formação do Coração Durante o Desenvolvimento Embrionário . . . . . . . . 16
Batimento Cardíaco . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
3 Microscopia de Desfocalização 20
3.1 Campo Elétrico da Luz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
Espaço Real e espaço dos vetores de onda . . . . . . . . . . . . . . . . 22
Propagação do campo elétrico através de um objeto de fase. . . . . . . 23
3.2 Propagação do Campo Elétrico através do microscópio desfocalizado . . . . . 25
4 Montagem Experimental 28
III
SUMÁRIO IV
4.1 Extraindo Embriões . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
Protocolo de Extração de Embriões . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
4.2 Extraindo células dos somitos do embrião . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
Porta-Amostras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
Meio de cultura: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
Cultura de Células Mesenquimais Somáticas. . . . . . . . . . . . . . . 35
4.3 Cultura de Embrião . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
5 Resultados e Discussões 41
5.1 Células Mesenquimais Extraídas dos Somitos . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
Caracterizando a membrana das células mesenquimais somáticas. . . . 43
5.2 Frequência de Batimento Cardíaco Durante o Desenvolvimento Embrionário. . 48
5.3 Crescimento de vasos em embrião de galinha
(Gallus gallus). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
6 Conclusões 1
A Programa para auto-correlação temporal. 3
Referências Bibliográ�cas 6
Lista de Figuras
2.1 Estágios Embrionários . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
2.2 Formação da Blastoderme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
2.3 Grastulação . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
2.4 Regressão da Linha Primitiva . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
2.5 Divisões da Blastoderme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
2.6 Regiões da mesoderme incluindo Mesoderme Intermediária e Paraxial com os
respectivos derivados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
2.7 Somitos no embrião: estágio 10. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
2.8 Somitogenese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
2.9 Corte transversal da região pericardial do embrião em vários estágios . . . . . 16
2.10 Coração corte ventral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
3.1 Sistema de Coordenadas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
3.2 Esboço de um objeto de fase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
3.3 Esquema óptico do microscópio com óptica corrigida no in�nito . . . . . . . . 25
4.1 Esboço da montagem experimental para obtenção dos embriões . . . . . . . . 31
4.2 Embrião no estagio 10 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
4.3 Montagem experimental para extração de material dos somitos . . . . . . . . 34
4.4 Montagem esquemática do microoscopio usado para obter �lmes das células . 37
4.5 Montagem da caixa de acrílico sobre a Lupa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
5.1 Tempo de aderencia das Células . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
5.2 Células aderidas a partir do terceiro dia de cultura . . . . . . . . . . . . . . . 43
5.3 Diferentes regiões da membrana celular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
V
LISTA DE FIGURAS VI
5.4 Correlação temporal das região da membrana celular . . . . . . . . . . . . . . 45
5.5 Células aderidas extraídas dos somitos inicialmente, 2 e 1 horas depois . . . . 46
5.6 Correlação temporal para diferentes regiões das células observadas em inter-
valos de tempo de 1 a 2 horas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
5.7 Sinal obtido da variação da interface do coração. . . . . . . . . . . . . . . . . 48
5.8 Espectro de potência pela freqüência em (Hz), para um cardiomiocito. . . . . 49
5.9 Espectro de potência pela freqüência em (Hz) para um embrião cultivado em
vitro. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
5.10 Freqüência do pico do espectro pela idade do embrião em: horas e número de
somitos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
5.11 Embrião no estágio 10 em meio de cultura de Agar+Albumina. . . . . . . . . 52
5.12 Embrião no estágio 17 (60 horas), em meio de cultura de Agar+Albumina. . . 53
5.13 (a) Vasos do arco interno, na região da área pelucida em um embrião de 36
horas.(b) Vasos do arco interno em um embrião de 49 horas. . . . . . . . . . . 53
5.14 Embrião está no estágio 29, com o sistema vasculatório está bem avançado . . 54
Capítulo 1
Introdução
Nesta dissertação apresentaremos os primeiros trabalhos de uma nova linha de pesquisa
em Desenvolvimento Embrionário que se inicia no Laboratório de Física de Sistemas Biológi-
cos do Departamento de Física da UFMG. Essa linha no laboratório se iniciou a partir dos
trabalhos do professor Ubirajara Agero na Universidade de Indiana EUA, com o professor
James Glazier. Interessados em caracterizar as regiões que compõem embrião de galinha
no estágio 10 através das propriedades elásticas. Eles aplicaram uma deformação na região
de interesse e obtiveram diferentes valores para módulo de Young em cada região do em-
brião, a saber: área opaca, pelúcida, notocorda, somitos e tubo neural [1]. Atualmente
temos realizado vários experimentos com embrião de galinha com o objetivo de extrair infor-
mações do comportamento celular, do batimento cardíaco e do crescimento de vasos durante
o Desenvolvimento Embrionário.
Interessados em analisar células extraídas dos embriões no estágio 10 (33-38) horas,
desenvolvemos um protocolo de extração e cultura de células mesenquimais. As células
mesenquimais possuem grande capacidade de diferenciação, são precursoras dos tecidos:
conjuntivo, epitelial, ósseo, cartilaginoso e muscular, que são compostos de células já espe-
cializadas.
1
Capítulo 1. Introdução 2
A MD é uma técnica ideal para estudar objetos de fase, células bem aderidas em uma
lâmina são objetos de fase ideais para a aplicação da microscopia de desfocalização. Os
objetos de fase são transparentes quando estão no foco, tornando-se visíveis quando desfo-
calizados por um microscópio óptico operando em campo claro. A desfocalização do objeto
introduz uma diferença de fase entre a luz difratada e a luz não difratada que produz um con-
traste não nulo quando interferem no plano imagem. A Microscopia de Desfocalização agora
com seus limites de validades bem de�nidos é uma técnica ideal para extrair informações
quantitativas da dinâmica que ocorre na membrana celular [2].
Usamos a Microscopia de Desfocalização (MD), para analisar a membrana das células
extraídas dos embriões de galinha. O objetivo deste trabalho foi explorar as informações
extraídas das células mesenquimais através da MD. Esta técnica já está bem estabelecida, e
através dela conseguimos obter informações que caracteriza de forma e�ciente a dinâmica que
ocorre na membrana celular. Atualmente existem na literatura vários trabalhos que usam
marcadores para identi�car os tipos de células que se originam de células mesenquimais.
Quando uma célula mesenquimal se diferencia em um �broblasto, por exemplo, ocorre a
produção de matriz extracelular que neste caso é o colágeno. Assim o marcador usado reage
com uma proteína presente no colágeno mudando a coloração do meio. E para diferentes
matrizes extracelulares produzidas existem diferentes marcadores com protocolos bem esta-
belecidos pela literatura, o que permite caracterizar de forma precisa os diferentes tipos de
células originadas das células mesenquimais [3].
O próximo passo deste trabalho é veri�car se através MD conseguimos caracterizar difer-
entes grupos de células mesenquimais. Para tanto precisaremos usar marcadores em nossa
cultura, e assim para cada grupo separadamente seria estudado a dinâmica que ocorre na
membrana celular. Resultados obtidos em [4][5] mostram que a MD é uma técnica muito
robusta para caracterizar a dinâmica na membrana celular.
No presente trabalho conseguimos através da MD e das análises de correlação temporal,
do contraste em nivel de cinza, determinar o tempo de relaxação da membrana celular.
Através deste tempo de relaxação podemos caracterizar as �utuações na membrana como
rápidas ou lentas. Para tanto, mapeamos a membrana das células mesenquimais e em cada
região obtemos o tempo de relaxação temporal, o qual se mostrou bastante heterogêneo.
Neste trabalho observamos que a heterogênedade do tempo de relaxação da membrana está
Capítulo 1. Introdução 3
relacionada com o movimento da célula. Nossos experimentos con�rmaram que as células
sempre se movimentam na direção da membrana que possue menor tempo de relaxação
temporal.
Além disso, foram feitas análises da freqüência de batimento cardíaco e do crescimento de
vasos durante o desenvolvimento embrionário. Resultados preliminares mostram que durante
o desenvolvimento embrionário o coração do embrião de�ne uma freqüência de batimento que
tende a aumentar até atingir o valor do animal adulto. Inicialmente as contrações do coração
são fracas e bastante aleátorias, com o desenvolvimento do embrião passam ser mais fortes e
regulares. A vascularização do embrião inicia-se com a formação do coração, posteriormente
de�nem-se duas redes de vasos uma mais interna ao corpo do embrião, na região denominada
por área pelúcida e a outra externa ao corpo, na região denominada por área opaca, na
qual os vasos são mais visíveis. Conseguimos obter algumas fotos que mostram diferentes
estágios do processo de vascularização. Nosso objetivo é conseguir acompanhar a criação de
vasos no tempo. Conhecer a dinâmica do crescimento de vasos é muito interessante porque
várias doenças são identi�cadas pelo crescimento desordenado de vasos. E conhecendo este
comportamento podemos fazer ensaios com possíveis inibidores à proliferação dos vasos.
Nesta dissertação desenvolvemos vários protocolos de métodos experimentais para o estudo
do embrião de galinha, e pretendemos que estes protocolos sejam utilizados no laboratório
nos próximos anos.
Esta dissertação está organizada da seguinte forma:
Capítulo 1 é esta a introdução ao trabalho.
No Capítulo 2 será apresentado o Desenvolvimento Embrionário, apresentando o desen-
volvimento do embrião desde momento em que ele é formado ainda no oviducto (dentro da
galinha) até nos estágios posteriores que nós estudamos.
No Capítulo 3 será introduzida a técnica Microscopia de Desfocalização, mostrando suas
aplicações e limites de validade.
No Capítulo 4 será apresentado a montagem experimental e os protocolos de extração e
cultura de células extraídas dos embriões, além do protocolo de cultura de embrião em vitro.
No Capítulo 5 serão apresentados os resultados obtidos para �utuações em células, ba-
timento cardíaco, resultados preliminares da formação de vasos e a discussão dos resultados
obtidos.
Capítulo 1. Introdução 4
No Capítulo 6 serão apresentados as perspectivas e conclusões deste trabalho.
Capítulo 2
Desenvolvimento Embrionário
2.1 Introdução Geral
Neste capitulo faremos uma revisão básica dos termos envolvidos no desenvolvimento do
embrião de galinha Gallus gallus. Não serão apresentadas discussões detalhadas sobre a
biologia do desenvolvimento, pois o objetivo do presente capitulo é apenas abordar os fatos
em ordem cronológica familiarizando o leitor com os termos que serão citados posteriormente.
Descreveremos o desenvolvimento do embrião de galinha desde a fase inicial dos primeiros
agregados celulares até a formação do coração. Os primeiros estágios do desenvolvimento
de todos os vertebrados são muito parecidos, e os embriões de galinha em especial, devido à
facilidade em obter, manipular e monitorar durante o desenvolvimento tem sido um modelo
popular para estudos da formação embrionária ha muito tempo (mais de 2000 anos), desde
Aristóteles, o qual estudou progressivamente os estágios da embriogênese abrindo ovos de
galinha diariamente [6] [7] [8].
Na �gura 2.1 estão apresentados todos os estágios de desenvolvimento do embrião de gal-
inha [9]. Este é um trabalho pioneiro sendo um dos artigos da literatura de desenvolvimento
5
Capítulo 2. Desenvolvimento Embrionário 6
Figura 2.1: Estágios Embrionários. Retirado de [9].
embrionário mais citados, pois apresenta um mapeamento completo do desenvolvimento do
embrião de galinha, desde o momento em que o ovo é eclodido, nasce da galinha, até o
nascimento do embrião.
A grande vantagem de trabalhar com embriões de galinha, é que o desenvolvimento
embrionário em galinha é um processo bastante rápido. Nas primeiras 48 horas de incubação,
o embrião se transforma de um disco de células para uma estrutura trilaminar, contendo
três folhetos germinativos que vão dar origem às estruturas embrionárias [10]. Através da
�gura 2.1 conseguimos acompanhar de forma simpli�cada a formação do embrião: entre os
estágios H-H (1-3') o embrião é um disco com espessamento celular na futura região caudal,
posteriormente o espessamento celular se alonga formando uma linha entre estágios H-H
(3-4), e o disco passa a ter um formato oval. E entre estágios H-H (5-7) a linha regressa.
Ao longo deste processo estruturas vão se formando e o embrião sofre uma torssão entre os
estágios H-H (13-14), passando de uma estrutura em 2D para o espaço 3D. No estágio H-H
35 o feto estará completamente formado.
Capítulo 2. Desenvolvimento Embrionário 7
2.2 Formação do Embrião
Nesta secção inicialmenete será introduzida uma de�nição dos conceitos básicos da embri-
ologia em galinha. Vamos apresentar o processo de formação do embrião de galinha Gallus
gallus a partir dos primeiros agregados celulares até a formação de estruturas mais com-
plexas.
Oviducto: canal que inicia no ovário da galinha e segue até a cloaca, anus da galinha.
Ovo: é uma célula, formada pela fecundação do óvulo da galinha pelo espermatozóide
do galo. Durante e copula os espermatozóides do galo penetra pelo oviducto da galinha e
fecunda o óvulo. O ovo galado, óvulo fecundado, ao descer pelo oviducto é revestido pela
albumina, formando uma parede de revestimento, a clara, que vai proteger ovo de impactos
mecânicos.
Vitelo: reserva de nutrientes do ovo, a gema propriamente dita.
Clivagem: é um processo de sucessivas divisões da ciclatrícula, região ativa do ovo, esta
região contém o citoplasma ativo do ovo recém ovulado ver �gura 2.2.
Blastoderme: uma camada unidimensional de células. Formada pelo processo de su-
cessivas clivagens que ocorre na ciclatrícula. Esta região será de grande importância na
formação do embrião. A blastoderme está localizada logo acima do vitelo.
Blastômeros: células �lhas resultante de sucessivas divisões da ciclatura por mitose.
Figura 2.2: Formação da Blastoderme: (A) primeira clivagem. (B) Segunda e terceira
clivagem. (C) Quarta segmentação formando os primeiros blastômeros. (D) O número de
blastômeros aumentam rapidamente na região central, a ciclatrícula cresce e a passa a se
chamar blastoderme. Retirado de [11].
A região da ciclatrícula cresce ocupando parte do vitelo e passa a se chamar blastoderme
Capítulo 2. Desenvolvimento Embrionário 8
ou blastodisco. No momento que a blastoderme contém de 32 a 64 células inicia-se o processo
de separação dos blastômeros centrais, que não tem contato com o vitelo, dos blastômeros
periféricos, que tem contato com o vitelo, por uma fenda chamada de cavidade subgerminal,
esta cavidade esta mostrada na �gura 2.5 (A).
O número das células na região central aumentam muito mais rápido e são menores que
as células marginais. Assim a massa celular central e constituída por várias camadas de
pequenas células acima da cavidade subgerminal. Na região periférica ocorrem clivagens ho-
rizontais que separam as células em camadas superiores, mas as células inferiores desta região
ainda continuam em contato com o vitelo. Nesta fase é possível distinguir a blastoderme em
duas regiões como mostra a �gura 2.2.
Área pelúcida: formada pelos blastômeros centrais, encontra-se sobre a cavidade sub-
germinal. Como não há aderência desta área ao vitelo ela se apresenta transparente [11].
Área opaca: formada pelos blastômeros periféricos. Como esta área não se separa do
vitelo em profundidade, tem um aspecto mais denso e se apresenta mais turva (ou opaca)
[11].
Para se ter uma idéia dos tempos envolvidos no desenvolvimento da galinha, apresentare-
mos resumidamente o seu ciclo de vida. A galinha (Gallus gallus) vive em torno de sete anos.
O desenvolvimento embrionário começa com as clivagens ainda no oviducto da galinha, for-
mando a blastoderme que contém duas regiões bem de�nidas, a área opaca e a área pelúcida.
Posteriormente após ser eclodido e incubado inicia-se a Gastrulação, que vai dar origem a
linha primitiva, no estágio H-H 14 começa a formação dos órgãos no embrião e após 21 dias
de incubação o embrião está pronto para nascer.
Gastrulação
Para prosseguir o desenvolvimento embrionário fora da galinha, o ovo deve ser incubado a
37, 500C e mantido a uma umidade relativa de 50%. Nas primeiras horas de incubação inicia-
se o processo da gastrulação. No �nal deste processo o germe do embrião estará formado
pelos três folhetos germinativos, ectoderme, mesoderme e endoderme. A gastrulação
consiste na migração das células do Epiblasto para o espaço entre o Epiblasto e
Hipoblasto, como mostra a �gura 2.3. Esta migração ocorrerá através da linha primitiva e
da fosseta primitiva do nó de Hensen, que serão de�nidas a seguir.
Capítulo 2. Desenvolvimento Embrionário 9
Figura 2.3: Gastrulação: consiste no deslocamento do nodulo de Hensen da região ventral
para a região dorsal. Retirado de [11].
Formação e Regressão da Linha Primitiva
Formação da linha primitiva: a maior característica da gastrulação em aves, anfíbios e
mamíferos é a formação da linha primitiva. Nota-se um espessamento celular na região caudal
que se alonga para a futura região da cabeça do embrião como mostra a �gura 2.1 entre os
estágios H-H (1-3'). A linha primitiva termina em uma zona mais brilhante, conhecida por
nó de Hensen. Durante a formação da linha primitiva a blastoderme perde sua forma circular
e alonga-se. A linha primitiva de�ne o eixo do embrião e se estende da região posterior à
anterior do embrião. As células migram entrando do lado dorsal, ao longo da futura região
da coluna vertebral, e movem para o lado ventral, separando assim a porção esquerda da
direita do embrião. As células convergem para formar a linha primitiva, e formam uma
depressão dentro da linha. Esta depressão é chamada de sulco primitivo, através da qual
células migram passando para parte interna da blastocole, cavidade entre o hipoblasto e
epiblasto. Na região anterior da linha primitiva surge uma região com espessamento de
células chamado de Nó de Hensen. No centro deste nó aparece uma depressão em forma de
funil na qual as células podem passar para parte interna da blastocole.
Regresão da linha primitiva: agora começa uma nova fase da gastrulação, com a
regressão da linha primitiva mostrado na �gura 2.1 entre os estágios H-H (5-7). O nó de
Capítulo 2. Desenvolvimento Embrionário 10
Hensen desloca da futura região do célebro, na área pelúcida, para a posição mais posterior,
futura região anal, veja a �gura 2.4(A). Ao mover o nó de Hensen em direção posterior, o
notocorda passa a cobrir a parte anterior começando no nível da futura região média do
célebro, como mostra em 2.4(B). Pode-se observar a regressão da linha primitiva na �gura
2.4(B), sinalizada pela linha grossa em vermelho, enquanto a linha preta �na representa
o aumento do notocorda. A �gura 2.4(C) mostra o nó de Hensen, na extremidades da
linha primitiva marcado com carbono, regredindo para a região posterior do embrião e
simultaneamente observa-se a formação das estruturas que vão dar origem ao embrião.
Figura 2.4: Regressão da Linha Primitiva adaptação de [11]. (A) Crescimento da linha
primitiva, alongando a região da aréa pelúcida e posteriormente a regressão da linha. (B)
Regressão da linha primitiva e crescimento do notocorda, linha primitiva sinalizada pela
linha grossa e a linha �na representa o crescimento do notocorda. (C) Regressão da linha
primitiva e o surgimento da prega cefálica e somitos durante este processo. O ponto marcado
na extremidade da linha primitiva, o nódulo de Hensen, que regressa para a região posterior
do embrião.
Como conseqüência da seqüência pelo qual são formados a região da cabeça e notocorda,
os embriões de aves e vertebrados em geral exibem um gradiente de desenvolvimento ântero-
posterior que é atenuado em estágios de maior maturidade. Enquanto as células da porção
Capítulo 2. Desenvolvimento Embrionário 11
posterior do embrião participam da gastrulação, as células no �m da porção anterior estão
começando a formar os órgãos. Tudo isso ocorre paralelamente a somitogênese, formação
de blocos compactados de células, os somitos. Assim nos próximos dias de incubação o �m
anterior do embrião exibirá um desenvolvimento maior que o �m posterior.
Folhetos Embrionários
Grande parte das células centrais da blastoderme formaram o Epiblasto �gura 2.5 (A). Outra
parte destas células migraram para a cavidade subgerminal, formando arquipélagos celulares
contendo de 5 a 20 células. Esse conjunto de vários arquipélagos celulares forma o hipoblasto
primário, �gura 2.5 (B). Na região posterior do embrião localiza-se o crescente de Koller, as
células desse crescente migraram da região anterior para posterior ligando os conjuntos de
células formando assim o hipoblasto secundário �gura 2.5 (C).
Figura 2.5: (A)Formação do Epiblasto. (B)Formação do hipoblasto primário. (C)Formação
do hipoblasto secundário. Retirado de [11].
O embrião forma-se inteiramente a partir do epiblasto, do qual se origina os três folhetos
germinativos: ectoderme (ecto=externo), mesoderme (meso=meio), endoderme (endo=interno),
aminion e mesoderme extra-embrionária. Enquanto oHipoblasto dá origem ao saco vitelino.
Posteriormente da Ectoderme se originam a pele, sistema nervoso e a crista neural. Da
Mesoderme se originam a notocorda, músculo rins e sangue. E da Endoderme se originam
tubo digestivo, faringe e tubo respiratório.
Capítulo 2. Desenvolvimento Embrionário 12
A endoderme é formada pelas primeiras células a migrarem através do nó de Hensen,
estas células estão marcadas em amarelo na �gura 2.3. Dentro da bastocole as células do
hipoblasto, em verde na 2.3, migram con�nando as células da endoderme entre as células do
epiblasto. As próximas células a entrarem na blastocole, através do nó de Hesen, assumem
uma posição entre o endoderme e o epiblasto formando a mesoderme, células marcadas
em rosa na �gura 2.3. Enquanto as células presuntivas da mesoderme e endoderme estão
movendo internamente, as percussoras da ectoderme proliferam no epiblasto. Além disso,
as células da ectoderme migram ao redor da gema pelo epiblasto. A gema é cercada pelo
ectoderme. A gastrulação em aves traça um fechamento, a ectoderma cerca a gema, a
endoderme substituiu o Hipoblasto, e a mesoderme se posiciona entre estas duas regiões.
Mesoderme Paraxial.
Nesta subsecção vamos apresentar a mesoderme Paraxial. O Ectoderme no estágio da neu-
rulação do embrião pode ser dividida em cinco regiões, mesoderme intermediária, corda-
mesoderme, mesoderme paraxial, mesoderme lateral e tubo neural mostrado na �gura 2.6.
Figura 2.6: Regiões da mesoderme incluindo Mesoderme Intermediária e Paraxial com os
respectivos derivados. Retirado de [11].
A mesoderme paraxial, é uma região que vai dar origem aos somitos, blocos de células
do mesoderme em ambos os lados do tubo neural. As células da região que irão formar a
cabeça e os somitos, que produzirão tecidos conectivos, a saber: osséo; músculo; cartilagem
Capítulo 2. Desenvolvimento Embrionário 13
e derme. A mesoderme intermediária, forma o sistema urogenital. A corda-mesoderme
contém material que dará origem ao notocorda. A placa da mesoderme lateral dará origem
ao coração, veias sanguíneas, células do sangue e sistema circulatório, bem como a linhagem
da cavidade do corpo, além disso, formará membranas extra-embrionárias, importantes para
transportar nutrientes no embrião.
Uma das tarefas da gastrulação é criar a camada da mesoderme entre a endoderme e a
ectoderme. A formação da mesoderme e órgãos da endoderme ocorrem simultaneamente à
formação do tubo neural. O notocorda estende debaixo do tubo neural da base da cabeça até
a cauda. Com a regressão da linha primitiva, as pregas neurais começam a se juntar ao centro
embrião, a mesoderme paraxial se separa em blocos de células chamado somitos. Embora
os somitos sejam estruturas transientes, elas são extremamente importantes na organização
do padrão segmental dos embriões de vertebrados. Os somitos determinam o caminho de
migração das células da crista neural e o eixo do nervo espinhal.
Somitogênese
A somitogênese é o processo de formação dos somitos, massas celulares compactadas en-
�leiradas imediatamente na lateral da dobra neural �gura 2.7. Os somitos darão origem as
células que formarão as vértebras e costelas, a derme da pele dorsal, o músculo esquelético
das costas e os músculos esqueléticos da parede do corpo e membros.
Primeira estrutura organizada metamericamente que aparece no embrião de galinha são
os somitos. Estes se originam da divisão do mesoderme dorsal para formar blocos de massas
celulares.
A adição regular dos somitos durante o crescimento do embrião em idade faz com que
o número de somitos seja um critério con�ável para analisar o estagio de desenvolvimento.
Embriões que tenham sido incubados por um dado número de horas encontram-se em estágios
bastante diferentes, enquanto embriões com o mesmo número de somitos variam muito pouco
entre si. Assim normalmente designamos o estágio do embrião com base no número de pares
de somitos que ele tem formado. A palavra par usualmente é omitida, mas entendemos que
um embrião de 6 somitos é um embrião de 6 pares de somitos [12]. Até agora tratamos do
estágio de desenvolvimento do embrião em horas, porque ainda não tinha sido introduzido
a somitogênese e sua importância para designar o estágio do embrião.
Capítulo 2. Desenvolvimento Embrionário 14
Figura 2.7: Em (A) está apresentado o embrião indenti�cando a região dos somitos. Em
(B) está mostrando um zoom dos somitos, massas celulares compactadas.
Componentes importantes da somitogenese são: periodicidade, epitelização, especi�cação
e diferenciação. Os primeiros somitos aparecem na porção anterior do tronco, e os novos
somitos brotam do �nal da mesoderme paraxial em intervalos regulares.
A partir das 25 horas começam a se formar os primeiros pares de somitos e a cada 90
minutos surge um novo par e assim sucessivamente até o embrião estiver completamente de-
senvolvido com 52-somitos. Existe na literatura muitos trabalhos sobre os mecanismos que
controlam a periodicidade na formação dos somitos, um agente chave é a expressão gênica
[6] [13]. Apresentaremos um modelo para ilustrar como ocorre à divisão da mesoderme. É
expresso na parte mais caudal da mesoderme não segmentada uma onda cíclica a cada 90
minutos metamerizando-a, como se fosse uma onda na praia que vai deixando conchas na
areia como mostra a �gura 2.8 [6]. A associação do processo de segmentação foi primeira-
mente reconhecido em embriões de galinha como ondas cíclicas expressas nas células da
Capítulo 2. Desenvolvimento Embrionário 15
mesoderme que estão relacionadas aos fatores de transcrição do gene c-hairy1[13]. Este gene
é fortemente expressado na mesoderme pre-somática, onde mRNAs exibem ondas cíclicas
de expressão as quais correspondem a periodicidade de formação de um somito a cada (90
min). O movimento aparente destas ondas é devido aos pulsos coordenados da expressão
c-hairy1, não esta ligada ao deslocamento de células ao longo do eixo ântero-posterior tam-
pouco com a propagação de um sinal. A expressão rítmica do c-hairy1 é uma propriedade
autônoma da mesoderme paraxial funciona como um relógio oscilador. Este oscilador foi
denominado de relógio de segmentação, pois controla a transcrição periódica de um grupo
de genes, chamados genes cíclicos. Estes genes cíclicos, ativam e desativam a transcrição
do c-hairy1 dentro de um processo auto- recursivo [6] [13]. Além disso, a expressão gênica
está relacionada com a posição na qual o somito se separará da mesoderme não segmentada.
O processo de diferenciação das células somáticas em estruturas mais complexas também
envolve fatores de expressão gênica [13] [14].
Figura 2.8: Um modelo da Somitogênese determinando a segmentação horária
e a frente de onda: são caracterizados pelo FCF (Fator de crescimento de �broblasto)
este está marcado (lilás), e pela concentração de acido retinoíco (verde) [6]. A cada 90 min
um novo par de somitos surge. A expressão gênica da onda cíclica é controlada pelo relógio
oscilador de segmentação que esta marcado ao lado esquerdo do embrião (laranja). A linha
preta marca o limite entre a mesoderme não segmentada (pre-somática) e a segmentada.
Retirado de [6].
Capítulo 2. Desenvolvimento Embrionário 16
2.3 Formação do Coração Durante o Desenvolvimento Embri-
onário
Nesta secção descreveremos a formação anatômica dos primeiros estágios do coração de
galinha (Gallus gallus) acompanhada de sua função �siologica. O coração é um dos primeiros
órgãos a funcionar durante o desenvolvimento do embrião, nos embriões de galinha é possível
acompanhar seu desenvolvimento em embriões cultivados in vitro. O coração é derivado da
mesoderme, e é uma estrutura não pareada, mas surge de um primórdio pareado o qual é
a primeira estrutura a estar extremamente separada de um dos dois lados na linha média
�gura 2.9.
Figura 2.9: Corte transversal da região pericardial do embrião em vários estágios de desen-
volvimento mostrando a formação do coração. (A) Às 25 horas, (B) às 26 horas, (C) às 27
horas, (D) às 28 horas. Retirado de [11].
O coração origina-se da mesoderme lateral, na embriogênese esta camada se divide em
duas, a camada mais interna se une à mesoderme formando a esplanctopleure e a mais ex-
terna à mesoderme formando o somatopleure, como mostra a �gura 2.9 (A). Os primeiros
clusters de células surgem internamente na esplanctopleure entre a camada da mesoderme e
a endoderme como mostra �gura 2.9 (A). Estes clusters de células formaram espessamentos
que darão origem a estruturas tubulares, o primórdio do endocárdio, um par de estruturas
tubulares delicados como mostra �gura 2.9 (B), estas estruturas darão origem a linhagem
endotelial do coração. Grande parte do espessamento original mesodérmico formará a parte
lateral dos tubos como o primórdio do epicárdico, que está destinado a aumentar a parte de
Capítulo 2. Desenvolvimento Embrionário 17
revestimento externo do coração, e camadas musculares pesadas do coração como o miocár-
dio. Em seguida o primórdio do endocárdio, estruturas tubulares, ou tubo endocardial, vão
se aproximando um do outro. Esse processo é concomitante ao fechamento do intestino
�gura 2.9 (C), todos os fenômenos aqui ocorrem sincronizadamente. E �nalmente quando o
embrião completa 29 horas os tubos se fundem formando um único tubo, o Endocárdio como
mostra a �gura 2.9 (D). A parte interna é o Endocárdio, a parte do meio é o Miocárdio e o
revestimento externo posteriormente formará o Epicárdio.
Figura 2.10: (A) As primeiras migrações celulares para formar os tubos do coração, (B)
tubos formados, (C) fusão dos tubos, (D) deslocamento do tubo resultante para a direita.
A linha numerada (1-4) representada o corte da secção transversal da �gura 2.9. Retirado
de [12].
Analisando a formação do coração sob um plano ventral. Sob este plano é possível ob-
servar as células na região do primórdio do endocárdio formando um espessamento celular
�gura 2.10(A). Este espessamento dará origem às estruturas tubulares �gura 2.10(B), estas
estruturas tubulares se encontram primeiro separadas e localizadas ao lado da linha média.
E posteriormente, quando estes tubos estão mais calibrados são aproximados um do outro
�gura 2.10(C). Em um momento posterior ocorre a fusão dos tubos formando o Endocárdio, e
Capítulo 2. Desenvolvimento Embrionário 18
o coração é deslocado para à direita. Através de um estudo cuidadoso das secções do coração
foi descoberto à presença de uma geléia cardíaca entre o miocárdio e o endocárdio [12]. Em
embriões vivos esta geléia aparece homogênea e tem uma função importante de prender o en-
docárdio ao miocárdio, e fazer com que se movam juntos sincronizadamente quando o coração
começa a pulsar. É funcionalmente interessante não apenas como uma unidade mecânica
do endocárdio e miocárdio durante estágios prematuros, mas, posteriormente ela servirá de
substrato em que as células migrarão movendo e formando tecidos celulares bem organiza-
dos. As regiões fundamentais estão começando a ser formadas. No �nal do desenvolvimento
do coração em direção a seu ao seu despejamento �nal serão formados: ventrículo, átrio,
seios venosos e artérias troncosas.
Às 33 horas de incubação, no estágio de 9-somitos, o coração está alargado e deslocado
para a direita da linha média. Neste momento se iniciam as primeiras contrações. Das 36-38
horas, no estágio de 16 somitos, o sangue começa a circular. O Átrio e o ventrículo estão
se estabelecendo. Além disso, parte do coração se encontra mais dobrado para a direita.
E apartir do estágio H-H 14 veja na �gura 2.1 o embrião encontra-se bem deslocado para
à direita. Neste estágio o embrião passa de sua forma planar para a forma mais côncava.
A função �siológica do coração durante o desenvolvimento embrionário está diretamente
relacionada ao processo de sua formação anatômica. A seguir veremos que a dinâmica das
contrações está diretamente relacionada ao processo de formação do coração.
Batimento Cardíaco
As contrações do coração vão se de�nindo durante a formação do coração. Inicialmente os
batimentos são aleatórios e irregulares e com o desenvolvimento do coração esta freqüência
vai se tornando menos aleatória. A partir do quarto dia de incubação estes batimentos
tornam-se mais regulares e provalvemente a freqüência de batimento do embrião já estará
bem próximo de um individuo adulto (5 batimentos/s) [15] [16] [17][18].
Estágio 10 [33-38 horas]- 10 somitos. Durante este estágio começam as primeiras
contrações do coração que tornam-se aparentes no nível da região ventricular, estas con-
trações são ambas irregulares e intermitentes. As contrções se iniciam bem antes do sangue
começar a circular no embrião. Contrações regulares e circulação efetiva do sangue serão
estabelecidas durante estágios posteriores do desenvolvimento [15].
Capítulo 2. Desenvolvimento Embrionário 19
Estágio 11 [40-45 horas]-13 somitos. Durante este período as contrações cardíacas
que inicialmente começaram na area ventricular tornam-se regulares [15].
Estágio 12 [45-49 horas]-16 somitos. Neste estágio o átrio está formado, e as batidas
cardíacas passam a ser controladas pelo átrio, agora à uma taxa mais rápida que quando
estavam com o controle do marca-passo ventricular. No �m deste estágio, a circulação do
sangue torna-se aparente na direção cefalica-caudal [15].
Assim no quarto dia de incubação o coração já esta completamente formado e os bati-
mentos já são bem próximos de uma galinha adulta.
Capítulo 3
Microscopia de Desfocalização
Neste capítulo será apresentado a Microscopia de Desfocalização, técnica que começou a
ser desenvolvida durante o doutorado do Professor Ubirajara Agero no laboratório de Física
de Sistemas Biológicos da UFMG, com o Professor Oscar Nassif de Mesquita [4] [19] [5][20].
Ao estudarem estruturas nas membranas de macrófagos, células brancas que fazem parte do
sistema imune, eles observaram que ao variar o foco as estruturas na membrana mudavam o
contrate. A observação deste fenômeno levou ao desenvolvimento da técnica. Desde então
tem-se feito vários trabalhos no nosso laboratório para mostrar a capacidade da técnica,
torná-la mais robusta e disseminar sua aplicação no meio cientí�co.
Na dissertação do aluno Ulisses Moreira Silveira Andrade, investigou-se os limites da
aproximação paraxial que foi utilizada no desenvolvimento do modelo teórico da técnica. Os
resultados obtidos experimentalmente mostraram-se bastantes promissores comparados com
os teóricos [2]. Para aplicar esta técnica é necessário apenas um microoscopio e um deslocador
de alta precisão, no laboratório usamos um deslocador piezoelétrico, Digital Piezo Controller
(PI E-710-3CD). Através da Microscopia de Desfocalização é possível obter informações
quantitativas de objetos de fase, que outras técnicas ópticas não conseguem extrair. As
membranas biológicas bem aderidas em um substrato são objetos ideais para aplicação da
20
Capítulo 3. Microscopia de Desfocalização 21
Microscopia de Desfocalização pois se comportam como um objeto de fase.
Os objetos de fase são transparentes quando estão no foco, tornando-se visíveis quando
desfocalizados por um microscópio óptico operando em campo claro. A desfocalização do
objeto introduz uma diferença de fase entre a luz difratada e a luz não difratada que produz
um contraste não nulo quando estas interferem no plano imagem. Devido a esta característica
é difícil observar estes objetos no microscópio óptico, sendo necessário o uso de técnicas de
contraste de fase. Uma das técnicas mais usadas é o contraste de fase descrita por Zernike
em 1935. Nesta técnica a mudança na intensidade da imagem é proporcional a mudança de
fase no objeto. Enquanto que na Desfocalização a intensidade local da imagem do objeto é
proporcional a curvatura local. Esta técnica extrai informações físicas da membrana celular,
pois a curvatura é um parâmetro importante na dinâmica de superfícies e a partir deste dado
pode-se obter informações das atividades que ocorrem na célula.
Grande parte dos biólogos que trabalham com técnicas tradicionais de contraste de fase
não conseguem explorar muitas informações quantitativas da dinâmica que ocorre na mem-
brana celular. Atualmente o laboratório tem colaborado bastante com biólogos que buscam
obter maiores informações de membranas, procurando entender os processos dinâmicos que
ali ocorrem.
Aqui será esboçado um tratamento matemático desta técnica apenas apresentando-a.
Pois um tratamento mais rigoroso e detalhado foi desenvolvido em trabalhos anteriores
[20][2].
3.1 Campo Elétrico da Luz
Supondo um campo elétrico monocromático ~E(~r, t) de frequência, ω, e dependência har-
mônica temporal, eiωt, que se propaga na direção do vetor de onda ~k, podemos escrever:
~E (~r, t) = ~E (~r) eiωt. (3.1)
Substituindo a equação do campo elétrico 3.1 na equação de onda .
∇2 ~E = εµ∂2 ~E
∂t2. (3.2)
Capítulo 3. Microscopia de Desfocalização 22
Obtém-se:
∇2 ~E(~r)eiωt + ω2εµ ~E(~r)eiωt = 0. (3.3)
Usando a relação: k = ωυ = ω
√εµ obtém-se a equação
∇2 ~E(~r) + k2 ~E(~r) = 0. (3.4)
A parte espacial do campo elétrico satisfaz a equação 3.4 que é conhecida por equação de
Helmholtz.
Espaço Real e espaço dos vetores de onda
Vamos trabalhar com campos elétricos escalares, que se propagam na direção do eixo z.
Podemos tratar o sistema, que se encontra no espaço real em termos do espaço dos vetores
de onda. A �gura 3.1 apresenta estes espaços.
Figura 3.1: Coordenadas do Sistema de Referência: (a) No espaço real. (b) No espaço dos
vetores de onda. Onde ~q é a projeção transversal de ~k no espaço dos vetores de onda e ~ρ é
a projeção no plano xy de ~r. Retirado de [2].
É importante introduzir este conceito porque a seguir trataremos do per�l do objeto de
fase h(~ρ), este pode ser de�nido no espaço dos vetores de onda, ~q aplicando a transformada
de Fourier.
Aplicando a transformada de Fourier:
h(~q) =
∫ ∞−∞
h(~ρ)ei~q.~ρdρ (3.5)
Capítulo 3. Microscopia de Desfocalização 23
Para obtermos h(~ρ) podemos aplicar a transformada inversa:
h(~ρ) =
∫ ∞−∞
h(~q)e−i~ρ.~qd~q (3.6)
Propagação do campo elétrico através de um objeto de fase.
Agora vamos propagar campo elétrico através de objetos de fase. Como descrito anterior-
mente, membranas celulares bem aderidas em um substrato se comportam como objetos de
fase. Objetos de fase são aqueles que mudam a fase da luz incidente sem que ocorra perda
de intensidade. A �gura 3.2 apresenta um esboço de um campo elétrico atravessando um
objeto de fase, que podemos pensar ser a região de uma célula dentro de um meio, separados
pela membrana celular.
Figura 3.2: Esboço de um objeto de fase. Onde ~E0 é o campo elétrico incidente, h(~ρ) é a
amplitude do objeto , n1 e n2 são índices de refração do meio por onde o campo elétrico se
propaga , ~ρ é o vetor posição no plano (x, y) perpendicular à direção z de propagação do
campo elétrico.
A variação da fase do campo elétrico no espaço livre, com índice de refração n1, propa-
gando por uma distância d é dada por:
φ0 = n1k0d. (3.7)
Considerando o objeto de fase, a fase introduzida é dada por:
ϕφ(~ρ) = n1k0(l + h(ρ)) + n2k0[d− (l + h(~ρ))], (3.8)
Capítulo 3. Microscopia de Desfocalização 24
Assim, a diferença de fase é dada por:
∆φ(~ρ) = ϕφ(~ρ)− φ0 (3.9)
= (n1 − n2)k0(l − d) + (n1 − n2)k0h(~ρ)
= −∆nk0(l − d)−∆nk0h(~ρ)
= constante+ φ(~ρ),
(3.10)
Onde ∆n = n2 − n1.
Então, temos que o campo elétrico ao passar por um objeto de fase é dado por:
~E(~ρ) = E0ei∆φ(~ρ). (3.11)
Retirando o termo contante da fase , pois esta não interfere nos cálculos e substituindo
em 3.11 obtemos:
E(~ρ) = E0eiφ(~ρ) = E0e
−i∆nk0h(~ρ), (3.12)
onde E0 é o campo elétrico incidente.
A equação 3.12 é uma aproximação local para o campo elétrico difratado e deixa de ser
válida para componentes de Fourier de h(~ρ) com números de onda comparáveis ou maior
que o número de onda da luz incidente no meio.
Para φ(~ρ) << 1, o campo elétrico incidente da equação 3.12 é dado por:
E(~ρ) ≈ E0 [1− iφ(~ρ)] = E0 [1 + i∆nk0h(~ρ)] . (3.13)
Como de�nimos em 3.6, é possivel escrever E(~ρ) no espaço dos vetores de onda ~q. E o
vetor ~q representa a ondulação na interface. Assim o campo elétrico ao atravessar um objeto
de fase no espaço dos vetores de onda é dado por:
E(~q) = E0
[1 + i∆nk0
∫ ∞−∞
h(~q)e−i~ρ.~qd~q
]. (3.14)
Capítulo 3. Microscopia de Desfocalização 25
3.2 Propagação do Campo Elétrico através do microscópio
desfocalizado
Nesta secção apresentaremos a propagação do campo elétrico através do microscópio desfo-
calizado. No microscópio com óptica corrigida no in�nito, o objeto é colocado no foco da
objetiva, assim a imagem é formada no in�nito, por isso é necessário introduzir uma lente
para que a imagem seja conjugada na ocular a qual é conhecida como lente de tubo. A �gura
3.3 representa um esboço do sistema óptico utilizado no laboratório.
Figura 3.3: Esquema óptico do microscópio com óptica corrigida no in�nito: S é a fonte de
luz branca, L1 é a lente objetiva com distância focal f1, L2 é a lente de tubo com distância
focal f2, O é o objeto que está no foco de L1, d é a distância entre lentes, I é o plano imagem
que está no plano focal de L2. (a) Esboço do Microscópio. (b) Microscópio desfocalizado,
é introduzido uma pequena desfocalização ∆f na distância focal da lente L1, a imagem é
desfocalizada no plano I.
O termo −k0f1
kf2que é o fator de magni�cação do microscópio, e o sinal negativo signi�ca
que a imagem é invertida.
Para encontrar o campo elétrico ao passar pelo microscópio desfocalizado, é calculado
Capítulo 3. Microscopia de Desfocalização 26
o campo após passar por cada elemento óptico como mostrado em [20][2]. O campo �nal
obtido ao passar pelo microscópio desfocalizado e levando se em conta essa desfocalização é
dado por:
E(~ρ,∆f) = ceiβ(~ρ′)E0
{1 + i∆nk0
∫ ∞−∞
h(~q)e−i~ρ.~qd~q)ei∆f2kq2
}(3.15)
Onde c = 1i2π
√k0f1
kf2
E β(~ρ′) é dado por:
β(~ρ′) =
[k(f1∆f) + k0d+ k0f2 +
k20
2f22
(f1
k− d
k0+f2
k0
)]~ρ (3.16)
Vamos obter o contraste de fase de um objeto desfocalizado.
O contraste é dado por:
C(~ρ,∆f) =I(~ρ,∆f)− I0
I0= 0 (3.17)
Obtendo a intensidade para um objeto desfocalizado:
I(~ρ,∆f) = |E(~ρ,∆f)|2
= c2|E0|2{
1 + i∆nk0
[∫ ∞−∞
h(~q)e−i~ρ.~qd~q(ei
∆f2k q2 − ei
∆f2kq2)]}
= I0
{1− 2∆nk0
[∫ ∞−∞
h(~q)e−i~ρ.~qd~qsen(∆f
2kq2)
]}.
(3.18)
Substituindo 3.18 em 3.17 obtemos:
C(~ρ,∆f) = −2∆nk0
[∫ ∞−∞
h(~q)e−i~ρ.~qd~qsen
(∆f
2kq2
)]. (3.19)
O contraste é uma função oscilatória com frequência q2
2k . Para pequenas desfocalizações
temos: sen∆f2k q
2 ≈= ∆f2k q
2 E a relação do contraste de fase torna-se:
C(~ρ,∆f) = −2∆nk0
∫ ∞−∞
∆f
2kq2h(~q)e−i~ρ.~qd~q (3.20)
Como k = n2k0 obtemos:
C(~ρ,∆f) = ∆nk0
∫ ∞−∞
∆f
n2k0q2h(~q)e−i~ρ.~qd~q
=∆n
n2∆f
∫ ∞−∞
q2h(~q)e−i~ρ.~qd~q
(3.21)
Capítulo 3. Microscopia de Desfocalização 27
Portanto temos uma expressão para o contraste de fase da qual é possível obter caracterís-
ticas quantitativas de células aderidas em especial da dinâmica que ocorre nas membranas
celulares.
Para ∆f = 0 ⇔ microscópio não desfocalizado a equação do contraste torna-se:
C(~ρ,∆f = 0) =∆n
n2∆f
∫ ∞−∞
q2h(~q)e−i~ρ.~qd~q = 0.
Este resultado mostra que os objetos de fase não são visíveis quando estão no foco. A
desfocalização introduz uma diferença de fase ∆f , entre a luz difratada e a não difratada
que ao se interferirem no plano imagem produz um contraste diferente de zero, e assim é
possível visualizar o objeto.
Capítulo 4
Montagem Experimental
Neste capítulo será apresentada toda a montagem experimental desenvolvida neste tra-
balho, bem como todos os protocolos de extração e cultura de embriões, além dos procedi-
mentos usados pra se estabelecer a cultura de células extraídas dos embriões. Nesse trabalho
foi possível adaptar os protocolos de extração e cultura de embrião existentes na literatura
ao laboratório de Física de Sistemas Biológicos do Departamento de Física. Além de esta-
belecer um protolo de extração e cultura de células mesenquimais somáticas extraídas dos
embriões em estágios prematuros.
4.1 Extraindo Embriões
Os embriões de galinha são obtidos de ovos fertilizados fornecidos pela empresa Rivelli.
Utilizamos uma linhagem para frangos de corte do tipo Cobb Avian tipo 1. Usando uma
incubadora que mantém o ambiente a 37 0C e umidade de 50 % obtêm-se embriões de galinha
em vários estágios de desenvolvimento. Os embriões são extraídos seguindo o protocolo
descrito em [1], que explicitaremos com mais detalhes a seguir.
28
Capítulo 4. Montagem Experimental 29
Protocolo de Extração de Embriões
Material:
• Incubadora que mantém o ambiente a 37 0C e 50 % de umidade, a que utilizamos tem
capacidade para incubar 20 ovos.
• Ovos fertilizados.
• Papel �ltro cortado em forma de anel.
• Pratos petri fundo com 10cm de diâmetro.
• Um aro de arame.
• Tesoura ponta �na.
• Pinça metálica de ponta �na.
• PBS (do inglês Phosphate-Bu�ered Saline) com pH de 7,4.
• Béquer de 1L.
Preparando PBS (Phosphate-Bu�ered Saline).
O PBS pH 7,4 é preparado a partir da diluição de duas soluções bases: solução doadora
(D) e a solução aceitadora (A).
Preparando a solução aceitadora:
• Dissolver 5 mM de Na2HPO4 (Fosfato de Sódio Dibásico Anidro) em 600 mL de H2O
deionizada (DI). Um mol de Na2HPO4 corresponde a m=141,96 g, assim a massa
correspondente a 5 mM será m=426 mg.
Preparando a solução doadora:
• Dissolver 10 mM de NaH2PO4 (Fosfato de Sódio Monobásico Anidro) em 500mL de
H2O DI. Um mol de NaH2PO4 corresponde a m=137,99 mg, então a massa corre-
spondente a 10 mM será m=690 mg.
Para obter o PBS de pH 7,4: 44,6 mL da solução doadora é díluída em 355,4 mL da
solução aceitadora. Posteriormente acrescenta-se 3,27g de NaCl, o pH deverá ser medido
Capítulo 4. Montagem Experimental 30
para a con�rmação após o acréscimo de NaCl, pois o pH da solução será levemente alterado.
A osmolaridade desta solução é aproximadamente 0.14M.
Procedimentos
1. Limpar os ovos com álcool 70%.
2. Para romper a casca do ovo: deve-se segurar o ovo horizontalmente na mesma posição
retirado da incubadora, sobre o prato petri de 10 cm de diâmetro, abrir o ovo e remover
a casca. Na maioria dos casos, a blastoderme estará posicionada na parte superior e
aproximadamente na região central da gema.
3. Identi�car a região onde está o embrião, esta região não será nítida nos primeiros
estágios .
4. Retirar o excesso da clara com o aro de arame na região próxima ao embrião, com
cuidado pra não destruir o embrião, pois este é muito frágil. É necessário retirar todo
o excesso de clara para permitir uma boa adesão do papel �ltro em forma de anel à
membrana vitelina.
5. Colocar o anel sobre a membrana vitelina, de forma a cobrir a região onde o embrião
se encontra. É importante que o anel esteja bem aderido a membrana para evitar que
este despreenda da membrana durante o experimento.
6. Recortar com a tesoura a região ao redor do anel.
7. Retirar o anel de papel da superfície da gema com a pinça �na, o anel deve conter em
seu meio o embrião. Retirar o anel sempre obliquamente à superfície, para evitar que
o embrião se depreenda do anel e que não ocorra acúmulo de gema.
8. Em um prato petri de 10 cm colocar PBS, lavar o embrião no PBS de forma a retirar
todo o excesso de gema. Deixando assim a região em que o embrião se encontra
totalmente transparente. Isso é importante porque facilitará a visualização do embrião
na Lupa ou no microscópio.
9. Assim o embrião está pronto para ser cultivado ou para extrair material dos somi-
tos. Sendo que para serem cultivados é necessário a produção de um meio de cultura
Capítulo 4. Montagem Experimental 31
Figura 4.1: (a) Incubadora com 20 ovos. (b) Bancada preparada para extração dos embriões.
(c) Os embriões sendo preparados para extração das células dos somitos. (d) Os embriões
levados à Lupa para observar o batimento cardíaco e o crescimento de vasos.
Agar+Albumina que será descrito posteriormente quando tratarmos de cultura de em-
brião.
10. O béquer será utilizado para colher o restante do ovo, o qual o embrião foi retirado.
Em média conseguimos obter 75 % de embriões dos 20 ovos colocados na incubadora.
No �nal dos experimentos tínhamos o equivalente a 1L de material restante dos ovos.
Imagens do processo de extração são mostradas na �gura 4.1.
É importante que todo material usado neste protocolo seja limpo com álcool etanol 70%
e esterilizado. O processo de esterilização usado neste trabalho será descrito a seguir:
Esterilização
Capítulo 4. Montagem Experimental 32
1. Levar o material ao microondas juntamente com um béquer de 1L de água e deixar
por 4min. A água do béquer deve ser trocada à cada 4min. Este processo é repetido 4
vezes, que equivale deixar o material 16 minutos no microondas. Durante os 4min que a
água permanece no microondas ela começa a entrar em ebulição, assim o sistema atinge
uma temperatura próxima à 100 0C. À esta temperatura grande parte das bactérias
que conseguem sobreviver a temperatura ambiente morrem. É sempre importante
entre um intervalo e outro manter a porta do microondas fechada.
2. Posteriormente todo o material deve permanecer na luz UV por 20 minutos para de-
struir o restante dos microorganismos.
4.2 Extraindo células dos somitos do embrião
Um dos primeiros padrões estruturados que surgem no embrião em desenvolvimento são os
somitos. As células dos somitos ainda possuem grande capacidade de diferenciação, mas
começam a apresentar alguma especialização com surgimento de epitélio nas bordas. Para
extrair células dos embriões precisamos de um embrião que já tenha somitos desenvolvidos,
entretanto como queremos obter parâmetros que caracterize células não especializadas, é
necessário que o embrião se encontre em um estágio prematuro, ou seja, com pouca diferen-
ciação celular. O embrião no estágio 10 atende estes requisitos segundo [9]. Para se obter
o embrião no estagio 10 o ovo deve permanecer de (33-38) horas na incubadora a 37 oC e
a 50 % de umidade. Como descrito no capitulo 2, neste estágio já houve a segmentação da
mesoderme somática, e o embrião apresenta de 7 a 10 pares de somitos, mas seu sistema
nervoso ainda encontra-se bastante prematuro. A região de interesse para a extração de
células são os somitos mostrados na �gura 4.2, a �gura apresenta um embrião com 9 pares
de somitos.
O material removido dos somitos é extraído usando uma micropipeta com uma ponta de
15 µm a 20 µm de diâmetro. Construimos as pipetas com um puxador comercial de pipetas,
Pipette Puller (CE-HEKA). Realizamos várias tentativas até encontrar os parâmetros que
nos permitiram obter a pipeta com a ponta de dimensões desejadas. Desenvolvemos a
montagem para conectar a micropipeta, por uma mangueira, à uma seringa e assim conseguir
sugar o material dos somitos. A micropipeta esta ligada a um deslocador (x,y,z), o qual
Capítulo 4. Montagem Experimental 33
Figura 4.2: Embrião com 9 pares de somitos. Estão identi�cadas acima as principais estru-
turas do embrião no estágio H-H 10 segundo [9]. Esta foto foi obtida com uma Lupa (modelo
GWH10X-D OLYMPUS-JAPAN), calibração da Lupa 1pixel=0.007mm.
permite escolher com bastante precisão o somito do qual será sugado o material 4.3.
O material removido dos somitos é colocado em portas-amostra de acrílico com aproxi-
madamente 0.5ml de meio de cultura RPMI 1640. Como segue os protocolos a seguir.
Porta-Amostras
Para observar as células com objetiva de pequena distância de trabalho foi necessário de-
senvolver portas-amostra especiais os materiais e procedimentos estão descritos a seguir.
Material:
• Reservatório de acrílico de 1,5ml.
• Lamínulas de microscópio (CORNING).
• Graxa de silicone para AUTO-VÁCUO.
• Mistura de ÁLCOOL-ETER 50% de cada.
• Papel de seda branco.
Capítulo 4. Montagem Experimental 34
Figura 4.3: Montagem Experimental. (a) Micropipeta acoplada por uma seringa a um
deslocador (x,y,z). (b) Embrião após remover material de um somito.
Todo procedimento abaixo foi realizado dentro do �uxo laminar para evitar a contami-
nação das amostras.
Procedimentos
1. As lamínulas permanecem mergulhadas na mistura de ÁLCOOL-ETER 50% em um
recipiente fechado de um dia para outro. Esta solução retira qualquer gordura da
superfície das lamínulas permitindo ou facilitando a adesão das células
2. As lamínulas devem ser secadas usando papel de seda branco.
3. Os reservatórios de acrílico serão colados às lamínulas usando a graxa de silicone para
auto-vácuo.
Atualmente existe no mercado alguns porta-amostras, apropriados para cultivar células
que posteriormente serão analisadas em objetivas de pequena distância de trabalho. En-
tretanto como não conseguimos adquirir estes porta-amostras em tempo abil à conclusão
do mestrado desenvolvemos porta-amostras com reservatórios de acrilico, lamínulas e graxa
de silicone. Inicialmente encontramos di�culdade em conseguir células aderidas nos porta-
amostras fabricados, pois as colas usadas para aderir o reservatório de acrilico à lamínula
eram tóxicas às células. Posteriormente testamos uma graxa de silicone para auto-vácuo e
obtemos sucesso na cultura. Desde então obtemos células bem aderidas nos porta-amostras
fabricados.
Capítulo 4. Montagem Experimental 35
Meio de cultura:
As células foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com SFB (Soro Fetal Bovino),
com proteínas inativadas. Foram usadas concentrações 10 % e 20 % de SFB.
Procedimentos para fazer 50 ml de meio de cultura:
1-Preparando 50ml de RPMI com 10% SFB.
Após esterilizar todo material a ser utilizado na preparação do meio. Em um béquer de
80 ml é colocado 45 ml de RPMI, e em um béquer de 15 ml são medidos 5 ml de SFB que
será então adicionado ao béquer de 80ml. Usamos antibiotico para evitar contaminação por
bactérias, Penicilina (100Unidades/ml).
2-Preparando 50ml de RPMI com 20% SFB.
Em um béquer de 80 ml é colocado 40 ml de RPMI, e em um béquer de 15 ml são medidos
10 ml de SFB que será então adicionado ao béquer de 80 ml. Todo este procedimento deverá
ser realizado dentro de um ambiente esteril, a capela. Foi observado um maior número de
células aderidas nas amostras que estavam com meio suplementado a 20% de SFB.
Cultura de Células Mesenquimais Somáticas.
A cultura de células mesenquimais somáticas é obtida através do material removido dos
somitos que será mantido em cultura com meio RPMI 1640. O cultivo de células é muito
suscetível à contaminações. Assim, antes de iniciar o processo de colhimento de material dos
somitos para ser colocado em cultura, todo material a ser utilizado na cultura deve estar
previamente separado e esterilizado.
Material:
• Material retirado dos somitos.
• Portas-amostra de acrílico, esterilizados.
• Meio de cultura.
• Câmera de CO2 mantida a 370C e com 5% de CO2.
• Placas petri de 10cm de diâmetro com tampas descartáveis.
• Penicillina 1% da solução total.
Capítulo 4. Montagem Experimental 36
Procedimentos
1. O material retirado dos somitos deverá ser colocado no porta-amostra de acrílico e lev-
ado rapidamente à capela para evitar qualquer tipo de contaminação com o ambiente.
O esquema de extração de material dos somitos é mostrado na �gura 4.3-(a).
2. Acrescentar 1ml de meio de cultura RPMI 1640 ao reservatório de acrílico.
3. Os portas-amostra são colocados em placa petri, e levados a câmera de CO2 onde
permaneceram de 2 a 3 dias. Cada placa de petri pode conter até dois portas-amostra.
O meio de cultura deve ser trocado todos os dias para manter o meio sadio e evitar
possíveis contaminações. As células realizam metabolismo rápido e consequentemente o pH
do meio muda, conseguimos identi�car a variação de pH pela mudança da coloração no meio
de cultura. Quando os portas-amostra são colocadas na câmera de CO2 o meio contém uma
coloração rósea e posteriormente quando as células iniciam o metabolismo o meio torna-se
mais amarelo. Se ocorrer uma contaminação por fungo, por exemplo, o tom amarelado
normalmente torna-se bastante escuro. Isso pode ocorrer durante a obtenção de células, e
nesse caso as células devem ser descartadas e o procedimento para obtenção das células deve
ser recomeçado do princípio.
Para veri�car se as células aderiram às lamínulas é necessário aguardar de 2 a 3 dias.
Posteriormente é realizada uma lavagem nas amostras com meio de cultura suplementado
com SBF, neste processo as células não aderidas são removidas da amostra. A amostra
deverá ser levada do �uxo para a montagem experimental da �gura 4.4, normalmente tam-
pamos a amostra com uma lamínula de microscópio previamente esterilizada para evitar
contaminações.
Montagem Experimental
Utilizamos a montagem mostrada no esquema da �gura 4.4 para realizarmos os experi-
mentos. A montagem é feita sobre um microscópio invertido (Nikon Eclipse TE300) com
uma objetiva de imersão a óleo (CFI Plan Apochromat 60X oil) com aumento de 60X e
abertura numérica 1,4.
Para manter o sistema à 37 0C, placas de cerâmicas são ligadas a um controlador de
temperatura e funcionam como aquecedores. Toda a montagem experimental apresentada na
Capítulo 4. Montagem Experimental 37
Figura 4.4: Esboço da montagem experimental. A luz da lâmpada de tungstênio halógena
passa por um condensador e ilumina a amostra. A amostra está entre duas placas de cerâmica
que funcionam como aquecedores mantendo o ambiente a 37 0C, estas são ligadas a um
controlador de temperatura. A amostra é livre para deslocar em x, y, z usando um deslocador
piezoelétrico, Digital Piezo Controller (PI E-710-3CD). As estruturas são visualizadas com
uma objetiva de imersão a oléo com aumento de 60X, e as imagens são capturadas por uma
camera CCD (UNIQ Vision lnc) e processadas por um computador.
�gura 4.4 é isolada por uma caixa de acrílico. Usamos um termômetro digital (EQUITHERM
SERIE-27341) para veri�car se a temperatura próximo as amostras permanece a 37 0C.
A imagem é obtida por uma câmera CCD (UNIQ Vision lnc) que está ligada ao com-
putador. Para capturar os �lmes usamos o programa X-CAP (EPIX). E para analisar os
�lmes usamos o ImageJ, software livre http://rsbweb.nih.gov/ij/.
4.3 Cultura de Embrião
Para analisar a freqüência do batimento cardíaco e o crescimento de vasos durante o desen-
volvimento embrionário desenvolvemos um sistema de cultura de embriões no Laboratório
de Física de Sistemas Biológicos. Para tanto �zemos uma adaptação do protocolo descrito
em [21]. O meio de cultura Agar-Albumina, contém os nutrientes necessários para o embrião
Capítulo 4. Montagem Experimental 38
sobreviver até 36 horas in vitro.
Preparando meio de Cultura de embriões.
Material:
• 0.18g de Agar (HIMEDIA RM-666).
• 30 ml de solução salina (0.791g de NaCl dissolvido em 100 ml de água destilada).
• 0.6 ml de Penicilina (100Unidades/ml).
• Placas petri de 35mm.
• 2 Béquers de 100ml.
• 30ml de clara �na extraída de 8 ovos frescos.
• Recipiente com grande área super�cial, e com tampa, reservatório de porta-amostras.
Todos materiais utilizados neste protocolo devem ser submetidos ao processo de esteril-
ização.
Procedimentos
1. Colocar 30 ml de salina em um béquer de 100 ml e levar a um aquecedor ou microondas.
Quando a salina começar a entrar em ebulição deve-se adicionar 0.18g de Agar e
devemos mexer até que o Agar esteja completamente dissolvido. Inicialmente a solução
tem uma coloração turva e isso indica que o Agar ainda não está completamente
dissolvido, quando o Agar esta completamente dissolvido a solução terá uma coloração
transparente.
2. Extrair 30ml de clara �na, parte mais líquida da clara, de 8 ovos frescos.
3. Aquecer a clara em banho-maria. Neste procedimento a água deve estar à temper-
atura menor ou igual à 50 0C para evitar que as enzimas presentes na clara sejam
desnaturadas, o que leva à perda da atividade biológica do meio.
4. A clara aquecida em banho-maria é adicionada no bequer contendo o Agar dissolvido
em salina. É necessário adicionar a clara devagar para evitar a criação de bolhas na
solução. As bolhas são indesejadas, pois atrapalham na obtenção dos �lmes.
Capítulo 4. Montagem Experimental 39
5. Forrar com papel toalha o reservatório de porta-amostras e molhar para manter o
ambiente úmido, evitando assim que o meio resseque.
6. A solução é distribuida em placas petri de 35 mm, mantendo à temperatura ambiente
o meio adquire uma consistência de gelatina.
Após o embrião ser extraído, no estágio de interesse, de acordo com o protocolo de-
scrito acima e colocado em meio de cultura. O embrião é levado à montagem experimental
apresentada na �gura 4.5 para obtenção dos �lmes, que posteriormente serão analisados.
Montagem Experimental
A montagem experimental apresentada na �gura 4.5 foi desenvolvida para obter �lmes
do embrião in vitro. A montagem é feita sobre uma Lupa, modelo GWH10X-D OLYMPUS-
JAPAN. Esta montagem foi realizada com a colaboração dos funcionários da o�cina mecânica
e elétrica do Departamento de Física da UFMG.
Figura 4.5: Montagem da caixa de acrílico sobre a Lupa, internamente a caixa esta acoplada
a uma resistência que funciona como um aquecedor para manter o sistema a 37 0.
Para manter o sistema à 37 0C e à umidade de 50 % montamos uma caixa de acrílico com
um orifício central, onde a amostra será colocada. Ao redor do orifício na caixa de acrílico
foi acoplada uma resistência que funciona como um aquecedor em imersão à água. A água
umedece a região ao redor da amostra, mantendo assim o ambiente nas condições necessárias
à sobrevivência do embrião in vitro. Entretanto, como a lupa está localizada logo acima da
Capítulo 4. Montagem Experimental 40
caixa, a imagem do embrião embaçava devido a grande umidade do ambiente, sendo assim,
foi necessário retirar a água do sistema. A resistência usada era ideal para funcionar imersa
à água, ao retirar a água do sistema ela superaquecia o ambiente. Assim foi necessário ligar
ao sistema um transformador, que diminuiu a tensão da resistência. Desta forma foi possível
manter o sistema a uma temperatura constante próximo aos 370C. Um termômetro digital
foi usado para medir a temperatura próximo as amostras, e veri�car a estabilidade desta
temperatura. Atualmente já instalamos controladores de temperatura para esta montagem,
o que deverá melhorar nosso sistema experimental. A imagem é obtida por uma câmera
CCD, a captura é feita usando o X-CAP e para analisar dos �lmes usamos o Imagej, mesmo
sistema descrito anteriormente para observar células.
Capítulo 5
Resultados e Discussões
Neste capitulo, em primeiro lugar, serão apresentados os resultados obtidos usando a
Microscopia de Desfocalização, para analisar o tempo de relaxação da membrana das células
mesenquimais somáticas. Posteriormente, serão discutidos os resultados da freqüência de
batimento cardíaco e a criação de vasos durante o desenvolvimento embrionário.
5.1 Células Mesenquimais Extraídas dos Somitos
Nas primeiras tentativas para se estabelecer o protocolo de extração, cultura e o tempo
de aderência à lamínula das células extraídas dos somitos, células mesenquimais somáticas,
usamos uma objetiva de 40X para observar as amostras, pois o porta-amostra, placa-petri,
era bastante espesso e não conseguimos analisar as amostras com objetiva 60X, que possui
pequena distância de trabalho.
41
Capítulo 5. Resultados e Discussões 42
Para estabelecer o tempo de aderência das células à lamínula as amostras foram levadas
ao microscópio a partir do primeiro dia após a extração. A �gura 5.1 apresenta as amostras
observadas após o primeiro, segundo e terceiro dia de cultura.
Figura 5.1: (a) Primeiro dia após a extração, di�cilmente se observa células aderidas. (b)
Segundo dia após a extração, poucas células aderidas. (c) Terceiro dia após a extração,
maior quantidade de células aderidas.
Usualmente células de cultura necessitam de algumas horas para aderirem ao substrato
mas como podemos observar na �gura 5.1, apenas após o segundo e terceiro dia que o
material permanece em cultura é possível observar células aderidas à lamínula. Em poucas
amostras foram observados células aderidas no segundo dia de cultura, enquanto o maior
número de células aderidas em 75% das amostras é observado a partir do terceiro dia de
cultura.
Foram testadas concentrações diferentes de SFB (Soro Fetal bovino) 10% e 20% da
solução total de meio de cultura RPMI 1640. Para ambas concentrações foram observadas
células aderidas, entretanto foi observado um número maior de células aderidas para as
amostras com 20% de SFB.
Após estabelecer o protocolo de extração, cultura e o tempo de aderência das células à
laminula, a proxima etapa deste trabalho foi conseguir observar células com uma objetiva
de maior aumento, 60X. A distância de trabalho da objetiva de 60X é pequena, assim foi
necessário desenvolver porta-amostras de acrílico, cubetas de acrílico aderidos com uma graxa
de silicone à laminulas de microscópio, e com estes porta-amostras foi possível analisar as
células em uma objetiva de maior aumento.
A �gura 5.2 apresenta células extraídas dos somitos desfocalizadas de aproximadamente
1, 5µm, mantidas em cultura com 20% de SFB e com mesmo período de incubação na câmera
de CO2, entretanto estas células exibem formatos bem diferentes. Para fazer uma caracteri-
Capítulo 5. Resultados e Discussões 43
zação mais rigorosa destas células seria necessário usarmos marcadores, através destes seria
possivel detectar quais os tipos de células presentes nas amostras. Entretanto neste trabalho
o objetivo principal foi obter parâmetros quantitativos da dinâmica na membrana celular,
através dos quais conseguiriamos caracterizar o comportamento de uma célula.
Figura 5.2: Células extraídas dos somitos e bem aderidas na lamínula. Esta �gura apresenta
as células a partir do terceiro dia, do qual o material extraído dos somitos permaneceu bem
aderido em cultura.
Caracterizando a membrana das células mesenquimais somáticas.
Para caracterizar as células foi obtido o tempo de relaxação da membrana. Para isto foram
feitas analises de correlação temporal do contraste de �lmes digitalizados. A �gura 5.3
apresenta uma célula que exibe duas regiões com comportamentos diferentes. A seta indica
a direção de movimento de cada região da membrana.
Os tempos de correlação temporal foram obtidos a partir de um �lme de 10 minutos cap-
turado pelo programa X-CAP(EPIX) e processado usando um plugin do Imagej, Correlação
Temporal Média Pixel segue em Anexo. Através deste plugin obtemos as curvas correlação
temporal para o contraste, que podem ser ajustadas pela equação 5.1, que apresenta um
decaimento exponencial simples.
⟨C(~r, t′)
⟩〈C(0)C(t)〉 = (∆n∆f)2
⟨k2⟩e−
tτ . (5.1)
Onde ~r é a distância pixel a pixel, t é o tempo entre um pixel e o pixel de referência.
∆n é a diferença dos índices de refração entre o meio e o objeto de fase, as células. ∆f
Capítulo 5. Resultados e Discussões 44
Figura 5.3: Através da correlação temporal encontramos resultados diferentes para diferentes
regiões da membrana celular. Nesta �gura estão identi�cadas duas regiões 1 e 2 que exibem
comportametos diferentes.
é a desfocalização introduzida na imagem, e é esta desfocalização que gera a diferença de
fase, que nos permite observar o objeto como descrito no capitulo 3. O termo k2 é a cur-
vatura local da membrana. Para caracterizar o tempo de relaxação da membrana foi feito
um mapeamento em toda membrana celular e obtemos resultados diferentes para regiões
diferentes, o grá�co 5.4(a) mostra o tempo de relaxação característico para a região que ap-
resenta maior motilidade, região 1 sinalizada na �gura 5.3. Obtemos também o tempo de
relaxação da região da membrana que apresenta menor motilidade, região 2 sinalizada na
�gura 5.3. Usualmente as células de vertebrados estudadas no laboratório como macrófagos
e �broblastos apresentam um comportamento isotropico em toda membrana celular, bem
diferente do comportamento apresentado pelas células mesenquimais extraídas dos somitos.
Nos grá�cos 5.4(a) e 5.4(b) os pontos experimentais estam bem ajustados à uma expo-
nencial simples, equação 5.1, através do ajuste da curva obtemos um tempo de relaxação
para a região de menor motilidade e outro para a região de maior motilidade. O tempo de
relaxação da região de maior motilidade é menor que o tempo da região de menor motilidade.
A membrana celular das células mesenquimais somáticas não apresentava um tempo de re-
laxação homogêneo, assim foi necessário fazer novos experimentos, nos quais fosse possivel
Capítulo 5. Resultados e Discussões 45
(a) (b)
Figura 5.4: Tempo de relaxação obtido do ajuste da equação 5.1 de autocorrelacção temporal
do contraste em nivel de cinza para as regiões de: a)Maior motilidade, menor tempo de
relaxação obtido foi τ = (6.6±0.1)s. b)Menor motilidade, maior tempo de relaxação obtido
foi τ = (17± 3)s.
acompanhar celo comportamento celulra por um longo tempo. Além disso, obtemos o tempo
de relaxação em cada região da membrana para �lmes curtos. Como mostrado na �gura 5.3
para o �lme curto podemos observar a membrana aderindo em uma direção e desaderindo
na direção oposta.Então, nós monitoramos a célula por um longo tempo, a �m de analisar
o comportamento de células com diferentes tempos de relaxação obtidos em membrana. Os
resultados são muito interessantes durante um �lme de (1-2) horas é possível ver o desloca-
mento de células, como mostrado na �gura 5.3.
As células mesenquimais são bastante invasivas, pois elas vão se deslocando pelo embrião,
diferenciando e montando os tecidos [22]. Além disso, estas células tem características bas-
tante semelhantes às células cancerígenas [23]. Sendo assim é esperado que a dinâmica na
membrana celular seja diferente das células de vertebrados já analisadas no laboratório. A
partir da observação dos �lmes veri�cou-se que as regiões das células apresentavam dinâmi-
cas diferentes. Algumas partes da membrana celular estão aderindo em uma direção da
lamínula enquanto outras estavam desaderindo em outra região. Para relacionar o tempo
de relaxação da membrana com o movimento da célula foram feitos �lmes de longa duração
Capítulo 5. Resultados e Discussões 46
com 1 e 2 horas. A �gura 5.5 apresenta uma foto inicial do �lme de 1 e 2 horas, e uma foto
no �nal do �lme mostrando o deslocamento da célula no intervalo de tempo analisado. Com
os �lmes longos foi possível acompanhar o comportamento da célula em um tempo maior,
observar a direção do deslocamento da célula, enquanto que os �lmes curtos de 10min foram
obtidos para analisar o tempo de relaxação da membrana celular.
Figura 5.5: Fotos de células aderidas extraídas dos somitos inicialmente, 2 e 1 horas depois,
as setas na região 1 indicam as regiões de maior motilidade, menor tempo de relaxação
temporal. As setas na região 2 indicam as regiões de menor motilidade, maior tempo de
relaxação temporal. A seta GRANDE indica a direção do movimento da célula.
Novamente encontramos o tempo de relaxação em toda membrana e os resultados obtidos
mostram que o tempo de relaxação é menor na região para qual o movimento da célula está
direcionado. Os grá�cos 5.6 e 5.6 apresentam os tempos de relaxação, obtidos nas regiões de
maior motilidade da membrana e de menor motilidade respectivamente. Os �lmes mostram
uma região da membrana espalhando e aderindoem uma direção da lamínula (região com
menor tempo de relaxação) enquanto o maior tempo de relaxação da membrana está na
região contraria à direção do movimento da célula.
Os resultados desta análise mostraram que as células mesenquimias somáticas, extraídas
dos somitos, exibem comportamentos diferentes na membrana celular. Para caracterizar esta
Capítulo 5. Resultados e Discussões 47
(a) (b)
Figura 5.6: Grá�cos de correlação temporal do contrate em nivel de cinza ajustado com a
equação 5.1 para diferentes regiões das células observadas em intervalos de tempo de 1 a 2
horas. No grá�co a) O tempo de relaxação obtido foi τ = 7 ± 2s para a região de maior
motilidade. No grá�co b) o tempo de relaxação obtido foi τ=20± 2s para a região de menor
motilidade.
diferença, analisamos o tempo de relaxação da membrana, o qual é bastante heterogêneo.
Os tempos obtidos foram: da ordem de τ = 7 ± 2s nas regiões de maior motilidade e da
ordem de τ=20 ± 2s nas regiões de menor motilidade. Associando o tempo de relaxação
da membrana com o movimento da célula obtemos um resultado bastante consistente. As
análises mostram que as regiões na qual encontramos o menor tempo de relaxação é a região
de maior motilidade da membrana celular. Enquanto que na região na qual encontramos o
maior tempo de relaxação da membrana a molitidade é menor. Assim podemos a�rmar que
a célula sinaliza a direção do seu movimento, ou seja a célula sempre se move na direção
da região de maior motilidade. Precisamos agora obter uma estatística maior para com-
provar de�nitivamente nossos resultados. Um outro fator importante que podemos explorar
nos próximos experimentos é usar marcadores de células, com estes é possível analisar se
um mesmo grupo de células tem comportamentos semelhantes. Em nossas amostras tin-
hamos grupos variados de células, algumas apresentaram grande motilidade analisadas em
um tempo maior enquanto outras �cavam completamente paradas.
Capítulo 5. Resultados e Discussões 48
5.2 Frequência de Batimento Cardíaco Durante o Desenvolvi-
mento Embrionário.
Nesta seção será apresentado o comportamento da freqüência de batimento cardíaco do
embrião de galinha(Gallus gallus), cultivado in vitro em meio de Agar + albumina durante
o desenvolvimento embrionário. A freqüência de batimento cardíaco começa irregular e vai se
de�nindo durante o desenvolvimento embrionário, as primeiras contrações começam quando
os embriões se encontram no estágio 10 (33-38 horas). Aqui vamos apresentar também
resultados encontrados para a freqüência de batimento de cardiomiócitos em cultura, células
do coração para comparação.
Para obter a freqüência de batimento foram feitos �lmes de 900 frames durante 60 se-
gundos. Foram feitos �lmes dos corações de embriões extraídos de acordo com o protocolo
descrito 4. Usamos o plugin, Mouse Listener (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/mouse-
listener.html) para capturar a posição (x,y) da interface do coração. A posição x é mantida
como uma posição �xa enquanto a componente y desloca a medida que o coração se contrai
nos 900 frames do �lme. Assim obtemos o sinal das contrações, variação da componente y,
do coração durante um minuto, a cada intervalo de uma hora. A �gura 5.7 apresenta um
exemplo do sinal obtido das contrações do coração. Usamos o programa Mathcad (PTC
software) para fazer a transformada de Fourier do sinal. Inserimos a posição da interface do
coração e o tempo para obter o espectro de potência pela freqüência em (Hz).
Figura 5.7: (a) Sinal obtido da variação da interface do coração, posição y, mostrando um
zoom em uma região.
Capítulo 5. Resultados e Discussões 49
Apresentaremos no grá�co 5.8, o resultado do espectro de potência pela frequência
em (Hz) de um cardiomiocito, célula do coração, para comparação com as contrações nos
primeiros estágios de desenvolvimento embrionário
Figura 5.8: Espectro de potência pela freqüência em (Hz), para um cardiomiocito, célula
do coração de camundongo de cultura primária.
Os embriões foram cultivados in vitro e acompanhamos as contrações ao longo de algumas
horas para obter os espectros de potência. A partir do sinal apresentado na �gura 5.7,
obtém-se a transformada de Fourier das contrações do coração. A �gura 5.9 apresenta o
espectro de potência pela freqüência em (Hz). Inicialmente o espectro é bastante aleatório,
similar ao comportamento do espectro obtido para o cardiomiocito apresentado no grá�co
5.8, e posteriormente observa-se a de�nição de um pico em uma determinada frequência de
batimento.
O grá�co 5.10(a) apresenta os resultados obtidos para dois embriões cultivados in vitro.
Apresentaremos a frequência do maior pico em função da idade do embrião em horas. Os
pontos apresentam um comportamento bastante interessante, inicialmente a frequência de
batimento é pequena e vai aumentando com a idade do embrião. Espera-se que esta curva
atinja um ponto de saturação quando a freqüência de batimento cardíaco do embrião estiver
de�nida, esse tempo é da ordem de 9 dias.
Como discutido no capítulo 2, o número de somitos é um parâmetro ideal para indicar o
estágio embrionário, a idade do embrião que se desenvolve in vitro, assim o grá�co 5.10(b)
apresenta a freqüência do batimento cardíaco pelo número de somitos. Os resultados apre-
sentados no grágico 5.10(b) foram obtidos para dois embriões cultivados in vitro. Apesar
Capítulo 5. Resultados e Discussões 50
Figura 5.9: Espectro de potência pela freqüência em (Hz), para um embrião cultivado em
vitro a partir das 36hs ate 49hs.
do grá�co 5.10(b) ter poucos pontos seu comportamento é similar ao do grá�co 5.10(a),
conseguimos obter um comportamento padrão que descreve a frequência de batimento do
coração de galinha nos primeiros estágios do desenvolvimento embrionário.
Estes resultados são muito interressantes, entretanto não são inéditos, quando iniciamos
o trabalho sobre a freqüência de batimento cardíaco procuramos na literatura trabalhos rela-
cionados e não encontramos, entretanto ao fazer a revisão bibliográ�ca mais rigorosa, após
obter estes resultados foram encontrados alguns trabalhos antigos, publicados em livros de
periódicos. Desde 1932 existem pesquisadores, investigando a freqüência de batimento do
coração de galinha durante o desenvolvimento embrionário. No artigo de 1932 [24] foi in-
vestigado a freqüência de batimento cardíaco do coração de galinha (Gallus gallus) durante
o desenvolvimento embrionário, desde as primeiras contrações do coração até o momento
Capítulo 5. Resultados e Discussões 51
(a) (b)
Figura 5.10: Freqüência do pico do espectro obtido através da Transformada de Fourier pela
idade do embrião em: horas e número de somitos a)Idade do embrião em Horas. b)Idade
do embrião em número de somitos
em que o embrião nasce. Neste artigo é apresentado um grá�co das batidas do coração em
um minuto pela idade do embrião em horas. Inicialmente o grá�co tem um comportamento
exponencial similar aos resultados que obtemos nesta dissertação, e a partir do nono dia de
incubação a curva satura até o momento do nascimento. Além disso, no artigo [24] foi anal-
isado a freqüência de batimento do coração de galinha para machos e fêmeas e os resultados
obtidos mostram que não ha diferença signi�cativa entre as freqüências de batimentos de
ambos sexos. Em outro artigo de 1967 [25], foi feito uma análise da freqüência de batimento
cardíaco do coração de galinha (Gallus gallus) pela idade do embrião em horas por dois
métodos diferentes, um método não invasivo (embrião não é exposto ao ambiente), e outro
invasivo (embrião é exposto ao ambiente). Os resultados mostram que o comportamento
da curva em ambos casos é o mesmo, entretanto, análises dos batimentos usando o método
invasivo mostram-se menores comparadas com os resultados dos batimentos do método não
invasivo. Em todos os trabalhos citados, a frequência de batimento inicialmente tem um
comportemento exponencial e posteriormente atinge um patamar de saturação. Portanto,
os resultados da literatura comprovam o comportamento exponencial para a frequência de
batimento cárdico que obtemos neste trabalho nos estágios iniciais do desenvolvimento em-
brionário. Ainda assim, esperamos que nosso método seja útil para identi�car parâmetros
importantes que levam o coração a iniciar seu batimento, principalmente quando compara-
mos esses resultados com cultura de cardiomiócitos.
Capítulo 5. Resultados e Discussões 52
5.3 Crescimento de vasos em embrião de galinha
(Gallus gallus).
O sistema circulatório é muito importante no desenvolvimento embrionário, sua tarefa é
complicada porque além de crescer e ser continuamente remodelado para acompanhar o
crescimento global do embrião, ele deve permanecer totalmente funcional para suprir as
necessidades das células embrionárias desde o início do desenvolvimento. Além disso, é um
modelo interessante para se estudar e entender o processo de formação de vasos, que é um
ponto de partida para se estudar doenças como o câncer, que induz regiões irrigadas de
vasos sanguíneos. Sendo assim, pretendemos usar nosso sistema para estudar a formação
dos vasos, nesta seção será apresentado algumas fotos extraídas dos embriões mantidos na
incubadora.
A �gura 5.11 apresenta um embrião no estágio 10, este embrião apresenta poucas estru-
turas do sistema vasculatório. Não conseguimos identi�car nenhum vaso na area opaca e
é possível identi�car os primeiros vasos que estão se formando na região da área pelucida,
região interna do embrião.
Figura 5.11: Embrião no estágio 10 em meio de cultura de Agar+Albumina.
A primeira e mais importante estrutura do sistema vascular é o coração que analisamos
anteriormente. As estruturas tubulares que se fundem formando o coração estudado no
capitulo 2, darão origem aos primeiros grandes vasos do sistema vasculatório. A circulação no
embrião de galinha pode ser dividida em circulação de dois arcos distintos sendo que o coração
Capítulo 5. Resultados e Discussões 53
é uma estrutura comum e está localizado no centro. Um arco completamente circulatório
é estabelecido internamente com o corpo do embrião. E um segundo arco determina veias
localizadas nas membranas extra-embrionárias envolvendo a gema. As veias vitelinas se
comunicam com o coração por meio de veias que atravessam o corpo embrionário [12].
Figura 5.12: Embrião no estágio 17 (60 horas), em meio de cultura de Agar+Albumina.
Nesta �gura está apresentando os vasos na região da área opaca (são vasos mais calibrados),
e os vasos na região da área pelucida (vasos mais �nos).
Na �gura 5.12 conseguimos observar que o sistema vascular do embrião está em um
estágio bem avançado, as duas arterias principais já estão formadas e a região da area opaca
encontra-se completamente vascularizada.
Figura 5.13: (a) Vasos do arco interno, na região da área pelucida em um embrião de 36
horas.(b) Vasos do arco interno em um embrião de 49 horas.
Capítulo 5. Resultados e Discussões 54
A seguir apresentaremos na �gura5.14 um embrião extraído no sexto dia de incubação.
Em (A) está apresentado o embrião sobre a super�cíe do ovo identi�cando as regiões 1 e 2.
As regiões 1 e 2 são imagens extraídas das rami�cações dos vasos no embrião.
Figura 5.14: Embrião no estágio 29, neste estágio o sistema vasculatório está bem avançado e
começa envolver toda a superfície do ovo. Na foto (A) do embrião sobre ovo está identi�cado
as regiões 1 e 2, estas regiões são mostradas as imagens obtidas pela lupa. Em 1 está
apresentado as rami�cações das extremidades dos vasos, e em 2 é apresentado o tronco do
qual se origina as rami�cações.
Com as fotos obtidas oberva-se que o crescimento de vasos no embrião de galinha é um
processo que pode ser acompanhado, pois ocorre na ordem de horas . Apesar dos embriões
de galinha não apresentar um desenvolvimento bem característico, em nossos experimentos
conseguimos observar que os primeiros vasos se formam no embrião apartir das 36 horas de
incubação. E segundo [9] as primeiras vesiculas ópticas ocorrem entre os estágios 9(29-33
horas) e 10(33-38 horas).Um dos próximos objetivos deste trabalho é acompanhar a formação
dos vasos no tempo. Queremos acompanhar a evolução no tempo de um embrião no estágio
10 para o estagio 29 por exemplo. A �gura 5.13 mostra que estamos progredindo bastante
Capítulo 5. Resultados e Discussões 55
para observar esse fenômeno em um embrião. Para tanto precisamos aprimorar o sistema de
observação do embrião in vitro no microscópio.
Capítulo 6
Conclusões
Neste trabalho, desenvolvemos protocolos, também como toda montagem experimen-
tal, para extração e cultura de células mesenquimais somáticas e de embriões de galinha
Gallus gallus adaptados ao Laboratório de Física de Sistemas Biológicos do Departamento
de Física da UFMG. Usando a Microscopia de Desfocalização foi possível observar célu-
las mesenquimais somáticas aderidas em substrato desfocalizadas aproximadamente 1,5µm,
após o segundo dia de cultura. A partir das análises de correlação temporal do contraste
obtemos os tempos de relaxação de diferentes regiões na membrana celular. Os tempos
de relaxação obtidos foram bastante heterogêneos. Para relacionar o tempo de relaxação
da membrana com o comportamento das células foram capturados �lmes longos de (1-2)
horas. Os resultados indicam que a célula apresenta uma sinalização do seu movimento.
Em nossas análises, as células sempre se movimentam em direção a região da membrana
que apresenta menor tempo de relaxação. Além disso, temos grande interesse em analisar
o tempo de relaxação da membrana durante o processo de diferenciação celular. Células
mesenquimais têm capacidade de se transformarem em outros tipos de células devido a sua
grande plasticidade. No processo de diferenciação a rigidez da membrana varia, com isso
esperamos que o tempo de relaxação da membrana também sofra alterações. Além disso,
analisamos o batimento cardíaco e o crescimento de vasos durante o desenvolvimento embri-
onário. Utilizamos uma Lupa com aumento de 7.5X para obter os �lmes dos embriões em
diferentes estágios de desenvolvimento. Estudamos a evolução da freqüência de batimento
do coração de galinha nas primeiras horas do desenvolvimento. Para tanto, obtemos o es-
pectro de potência a partir da posição (x-y) na interface do coração capturados durante as
contrações. Em estágios iniciais as contrações são irregulares e fracas, como as contrações em
1
Capítulo 6. Conclusões 2
culturas de cardiomiócitos, tornando-se mais regulares e fortes em estágios posteriores. As
análises da frequência de batimento mostram que inicialmente a freqüência de batimento é
bastante irregular bem próxima da freqüência de batimento de uma única célula do coração,
o cardiomiocito, tornando mais regular durante o desenvolvimento embrionário. Além disso,
conseguimos observar o crescimento de vasos no embrião de galinha, obtemos estágios no
qual o embrião não apresentava vasos e estágios bem vascularizados. Na próxima etapa
deste trabalho queremos acompanhar o crescimento de vasos no tempo e conseguir obter
paramentos da dinâmica de crescimento.
Apêndice A
Programa para auto-correlação
temporal.
import ij.*;
import ij.process.*;
import ij.gui.*;
import java.awt.*;
import ij.plugin.*;
import ij.plugin.filter.*;
public class CorrelaçãoTemporalMediaPixel_ implements PlugIn {
3
public void run(String arg) {
ImagePlus imp = WindowManager.getCurrentImage();
if (imp==null)
{IJ.noImage(); return;}
Roi roi = imp.getRoi();
if (!(roi!=null && roi.getType()==roi.LINE) )
{IJ.error("Straight line selection required."); return;}
double angle = 0.0;
if (roi.getType()==Roi.LINE) {
Line line = (Line)roi;
angle = roi.getAngle(line.x1, line.y1, line.x2, line.y2);
} else if (roi.getType()==Roi.POLYLINE)
angle = ((PolygonRoi)roi).getAngle();
int nSlices=imp.getStackSize();
double[] data = ((Line)roi).getPixels();
int tamanholinha = (int)data.length-1;
double[][] dados = new double[tamanholinha][nSlices];
double[] correlacao = new double[nSlices];
double[] media = new double[tamanholinha];
for (int j=0;j<nSlices;j++) {
IJ.showProgress((double)j/nSlices);
imp.setSlice(j+1);
double[] ddata = ((Line)roi).getPixels();
for(int i=0; i<tamanholinha;i++){
dados[i][j]=(double)ddata[i];
media[i]+=dados[i][j];
}
}
for (int i=0; i<tamanholinha; i++)
media[i]=media[i]/nSlices;
for (int k=0; k<tamanholinha; k++)
{
IJ.showProgress((double)k/tamanholinha);
for (int j=0; j<nSlices;j++)
{
double temp = 0;
for (int i=0; i<nSlices-j; i++)
temp += (dados[k][i]-media[k])*(dados[k][i+j]-media[k])/(media[k]*media[k]);
correlacao[j] += temp/(nSlices-j);
}
}
String headings = "t\t<C(0)C(t)>";
IJ.setColumnHeadings(headings);
for(int i=0;i<nSlices;i++)
{
correlacao[i] = correlacao[i]/tamanholinha;
IJ.write(i+"\t"+(float)correlacao[i]);
IJ.register(CorrelaçãoTemporalMediaPixel_.class);
}
//IJ.write("media="+media);
//IJ.write("tamanho linha="+tamanholinha);
//IJ.write("nSlices="+nSlices);
IJ.showProgress(1.0);
}
}
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