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DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA
Y DE LA AGRICULTURA
CARRERA DE INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA
TESIS PREVIO A LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO DE
INGENIERA EN BIOTECNOLOGÍA
TEMA: ESTUDIO DE LA DIVERSIDAD GENÉTICA DE
POBLACIONES DE GUAYACÁN SABANERO (Tabebuia
billbergii) DE BOSQUES SECOS DEL ECUADOR
AUTOR: RUEDA CÓRDOVA, ANA ELIZABETH
DIRECTORA: M.Sc. JADÁN, MÓNICA
CODIRECTOR: ING. TAIPE, MARCO
SANGOLQUÍ, JULIO 2015
i
CERTIFICACIÓN
M.Sc. Mónica Jadán Ing. Marco Taipe
Certifican:
Que el trabajo titulado “Estudio de la Diversidad Genética de Poblaciones de
Guayacán Sabanero (Tabebuia Billbergii) de Bosques Secos del Ecuador”,
realizado por Ana Elizabeth Rueda Córdova, ha sido guiado y revisado
periódicamente y cumple normas estatutarias establecidas en el Reglamento de
Estudiantes de la Universidad de las Fuerzas Armadas- ESPE.
Sangolquí, julio 2015
___________________
M.Sc. Mónica Jadán
__________________
Ing. Marco Taipe
DIRECTORA CODIRECTOR
ii
DECLARACIÓN DE RESPONSABILIDAD
Yo, ANA ELIZABETH RUEDA CÓRDOVA
Declaro que:
El proyecto de grado denominado “Estudio de la Diversidad Genética de
Poblaciones de Guayacán Sabanero (Tabebuia Billbergii) de Bosques Secos del
Ecuador”, ha sido desarrollado con base a una investigación exhaustiva, respetando
derechos intelectuales de terceros, conforme las citas que constan al pie de las
páginas correspondientes, cuyas fuentes se incorporan en la bibliografía.
Consecuentemente este trabajo es de mi autoría.
En virtud de esta declaración, me responsabilizo del contenido, veracidad y alcance
científico del proyecto de grado en mención.
Sangolquí, julio 2015
___________________________
Ana Elizabeth Rueda Córdova
iii
AUTORIZACIÓN
Yo, ANA ELIZABETH RUEDA CÓRDOVA
Autorizo que:
El proyecto de grado denominado “Estudio de la Diversidad Genética de
Poblaciones de Guayacán Sabanero (Tabebuia Billbergii) de Bosques Secos del
Ecuador”; sea publicado en la biblioteca virtual de la Universidad de las Fuerzas
Armadas – ESPE, cuyo contenido, ideas y criterios son de mi exclusiva
responsabilidad y autoría.
Sangolquí, julio 2015
_____________________________
Ana Elizabeth Rueda Córdova
iv
DEDICATORIA
A Dios, quien supo guiar mi camino,
A mi abuelito, por su sabiduría y su motivación,
A mis padres por ser el pilar de cada uno de mis pasos,
A mis hermanos, por su afecto, confianza y compresión.
Anita Elizabeth Rueda Córdova
v
AGRADECIMIENTO
El presente trabajo de tesis primeramente me gustaría agradecerte a ti Dios por
bendecirme en cada paso que doy, cuidándome y dándome fortaleza para continuar y
llegar hasta donde he llegado, porque hiciste realidad este sueño anhelado.
A mis padres, Jorge y Rita, pilares fundamentales en mi vida que con su apoyo, amor
y confianza me inspiraron a ser mejor cada día, porque son un ejemplo de vida,
admiración y respeto. A mis hermanos Kleber, Jorge y Christopher por su cariño y
apoyo que me brindaron en todo momento. A mis sobrinos que se han encargado de
llenar mi vida de ternura y alegría.
Expreso mis sinceros agradecimientos al Departamento Nacional de Biotecnología
del Instituto Nacional Autónomo de investigaciones Agropecuarias INIAP, en
especial al Dr. Eduardo Morillo, jefe del Departamento, por haber confiado en mí y
haberme otorgado esta magnífica oportunidad; además de su guía y colaboración en
el presente proyecto.
A la Secretaría Nacional de Educación Superior, Ciencia, Tecnología e Innovación –
SENESCYT, la cual financió el proyecto PIC-12-INIAP-001: “Desarrollo e
innovación biotecnológica para la potencia de rubros agrícolas de importancia en
seguridad alimentaria, competitividad exportable y adaptación al cambio climático”.
A los colaboradores del Departamento Nacional de Biotecnología del INIAP, a la
Ing. Johanna Buitrón por ser mi guía en el trabajo de laboratorio, a la Lic. Katherine
Orbe y al Ing. Santiago Meneses por su colaboración en mi tesis.
A mi querida Escuela Politécnica del Ejército, a la Carrera de Ingeniería en
Biotecnología y a mis profesores, por los conocimientos impartidos durante el
transcurso de la carrera, en especial a mi estimada Directora de tesis M.Sc. Mónica
Jadán por toda su ayuda y apoyo, a mi Codirector de tesis Ing. Marco Taipe gracias
por su guía y su apoyo en esta investigación.
vi
A mis compañeros del laboratorio de Biotecnología del INIAP, gracias por su
amistad, consejos, apoyo y las risas que hicieron que todo el trabajo sea más fácil.
A mis buenos amigos, Ivonne, Mayrita, Andresito, Morita y Dianita los que siempre
compartieron una sonrisa a mi lado y han sido personas muy importantes en mi paso
por la universidad y en el transcurso de mi vida.
Finalmente quiero agradecer a la persona que estuvo en el transcurso de esta carrera
porque fue un pilar muy importante para su culminación, gracias por apoyarme,
insistirme, por brindarme tu amor, tu apoyo, por ser mi compañía y mi alegría,
Victor.
Anita Elizabeth Rueda Córdova
vii
ÍNDICE DE CONTENIDOS
CERTIFICACIÓN ................................................................................................ i
DECLARACIÓN DE RESPONSABILIDAD ...................................................... ii
AUTORIZACIÓN ................................................................................................ iii
DEDICATORIA ................................................................................................... iv
AGRADECIMIENTOS ........................................................................................ v
ÍNDICE DE CONTENIDOS ................................................................................ vii
ÍNDICE DE TABLAS .......................................................................................... x
ÍNDICE DE FIGURAS ......................................................................................... xii
ÍNDICE DE ANEXOS .......................................................................................... xiv
RESUMEN ............................................................................................................ xv
ABSTRACT .......................................................................................................... xvi
CAPÍTULO I: INTRODUCCIÓN ....................................................................... 1
1.1 Formulación del problema .................................................................... 1
1.2 Justificación del problema ................................................................... 2
1.3 Objetivos de la investigación ............................................................... 3
1.3.1 Objetivo general ................................................................................... 3
1.3.2 Objetivos específicos ............................................................................ 3
1.4 Marco teórico ....................................................................................... 4
1.4.1 El género Tabebuia .............................................................................. 4
1.4.2 Taxonomía ............................................................................................ 5
1.4.3 Descripción Botánica de Tabebuia billbergii ....................................... 6
1.4.4 Distribución geográfica ….................................................................... 7
1.4.5 Importancia de la especie Tabebuia billbergii ..................................... 9
1.4.6 Diversidad genética .............................................................................. 10
1.4.6.1 Cuantificación de la diversidad genética ............................................. 11
1.4.7 Genética de poblaciones ....................................................................... 14
1.4.7.1 Selección natural .................................................................................. 14
1.4.7.2 Deriva genética ………………………................................................. 15
1.4.7.3 Flujo génico .......................................................................................... 15
viii
1.4.7.4 Mutación ............................................................................................... 16
1.4.8 Marcadores moleculares ...................................................................... 16
1.4.8.1 Marcadores ISSRs ............................................................................... 17
1.9 Hipótesis .......................................................................................... 21
CAPÍTULO II: MATERIALES Y METODOS.............................................. 22
2.1 Participantes............................................................................................. 22
2.1.1 Instituciones………………....................................................................... 22
2.1.2 Responsable del proyecto........................................................................... 22
2.1.3 Colaboradores científicos........................................................................... 22
2. 2 Zona de Estudio.......................................................................................... 23
2.2.1 Fase de Campo........................................................................................... 23
2.2.2 Fase de Laboratorio.................................................................................... 23
2.3 Período de tiempo de investigación…………………………………....... 23
2.4 Procedimientos…………………………………………………………... 23
2.4.1 Recolección de material vegetal……………………………………….... 23
2.4.2 Extracción de ADN genómico de guayacán………………..…………... 25
2.4.3 Cuantificación de ADN…………………...……………………………... 25
2.4.4 Validación del ADN de Guayacán Sabanero……………..……………... 26
2.4.5 Determinación de la especie Tabebuia billbergii con
el marcador ISSR 844A ………………………………………………… 28
2.4.6 Pre-selección de marcadores ISSR……………………………………….
29
2.4.8 Amplificación de fragmentos de ADN mediante
primers ISSR………………………………………………….…………. 30
2.4.8 Registro de datos……………………..………………………………….. 31
2.5.6 Análisis de datos………………………………..……………………….. 31
2 6.1 Análisis de diversidad genética………………………………………….. 31
2 6.2 Análisis de agrupamiento……………………………….………............. 32
2.6.3 Análisis de componentes principales……………………..……………... 32
2.6.4 Análisis molecular de varianza…………….…………………..………... 32
2.6.5 Distancia genética de Nei…………………………………...………....... 33
ix
CAPÍTULO III: RESULTADOS…………..………………………………….. 34
3.1 Extracción y cuantificación de ADN………….………….…………….... 34
3.2 Validación del ADN de Guayacán Sabanero…………………………….. 35
3.3 Determinación de la especie Tabebuia billbergii con el
marcador ISSR 844A…………………..………………………………… 36
3.4 Pre-selección de marcadores ISSRs……………………………….……... 36
3.5 Optimización de la Técnica de PCR……………………………………... 39
3.5.1 Concentración de MgCl2…………………………………………….…… 39
3.5.2 Temperatura de alineamiento………………………………………......... 40
3.6 Amplificación de ADN de guayacán (T. billbergii) mediante
los primers ISSR seleccionados…………………………………….……. 41
3.7 Análisis de datos………………………..……………………..…………. 43
3.7.1 Diversidad genética…………...…………………………………………. 43
3.7.2 Análisis de agrupamiento……………………….………………………... 48
3.7.3 Análisis de coordenadas principales………………………………….….. 50
3.7.4 Análisis molecular de varianza…………………………………………... 54
3.7.5 Distancia Genética de Nei………………………………………………... 57
CAPÍTULO IV: DISCUSIÓN………….……………………….………………. 58
4.1 Extraccion y calidad del ADN genómico……..…..…………………... 58
4.2 Amplificación de fragmentos de ADN mediante primers
ISSRs………................................................................................... 59
4.3 Análisis de diversidad genética…………………………..……………. 60
4.4 Análisis de agrupamiento………...……...…………..………………… 62
4.5 Análisis de coordenadas principales…………………..………………. 63
4.6 Análisis molecular de varianza………………………………………… 64
CAPITULO V: CONCLUSIONES…………………………………………….. 65
CAPÍTULO VI: RECOMENDACIONES……………………………………… 67
CAPÍTULO VII: BIBLIOGRAFÍA ……………………………………………. 68
ANEXOS ………………………………………...……………………………… 81
x
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1.1: Clasificación taxonómica de la especie Tabebuia billbergii……...
5
Tabla 1.2: Comparación de las características principales de las técnicas
moleculares para identificar diversidad genética (Spooner et al.,
2005)……………………………………………………………... 20
Tabla 2.1: Concentraciones y volúmenes de reacción para ensamblaje de la
PCR, validación con primer SSR TAU-15 (Morrillo & Miño,
2011)……………………...........................................................
27
Tabla 2.2: Temperaturas empleadas para la amplificación de SSR TAU-
15……………………………………………………………….…
27
Tabla 2.3: Concentraciones y volúmenes de reacción para ensamblaje de la
PCR, validación con primer ISSRs (Morrillo & Miño,
2011)……………….................................................................
28
Tabla 2.4: Temperaturas empleadas para la amplificación de
ISSR………………………………………………………………
29
Tabla 2.5: Lista de marcadores ISSR seleccionados para el
estudio………………............................................................
30
Tabla 3.1: Volúmenes de reactivos para una reacción de PCR, variando la
concentración de MgCl2…………………………………………..
39
Tabla 3.2: Alelos registrados con sus respectivas frecuencias en 5
poblaciones de guayacán con 10 primer ISSRs………………...
44
Tabla 3.3: Análisis de diversidad genética en 5 poblaciones de Tabebuia
billbergii provenientes de las localidades de las provincias de
Loja, Guayas y El Oro de los bosques secos del
Ecuador……………………………………….…..........................
46
Tabla 3.4: Análisis de diversidad genética de la población de guayacán
(Tabebuia billbergii) con 10 primer ISSRs………………............
47
Tabla 3.5: Valores Eigen, porcentaje individual y acumulativo de la
varianza por coordenada principal del ACoP de 214 genotipos de
guayacán con 10 primers ISSRs……………………………….....
51
Tabla 3.6: Análisis molecular de varianza de de 5 poblaciones de guayacán:
Mangahurco, Isla Puná, Cazaderos, Garza Real y La Cuca,
analizadas con 10 primers ISSR………………………………..... 54
xi
Tabla 3.7: Análisis molecular de varianza de poblaciones más alejadas
según el ACoP como lo son: Isla Puná, Garza Real y La Cuca
analizadas con 10 primers ISSR…………....................................
56
Tabla 3.8. Análisis molecular de varianza de poblaciones más cercanas
según el ACoP como lo son: Mangahurco, Isla Puná y Cazaderos
analizadas con 10 primers ISSR…..............................................
57
Tabla 3.9: Distancia de Nei (1978) calculadas en 214 genotipos de
guayacán analizados con 10 primers ISSRs……………………... 57
xii
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1.1: Fotografía de características de algunas especies del género
Tabebuia………………………………………………….…….
4
Figura 1.2: Características morfológicas de Tabebuia billbergii. a) Flores,
b) Hojas, c) fruto (Gentry, 1992)…………..………………........
7
Figura 1.3: Distribución de especies del género Tabebuia en
Sudamérica: = T. alba, = T. aurea, = T. barbata, = T.
billbergii ssp. billbergii, = T. billbergii ssp. Ampla (Gentry,
1992)….................................................................................
9
Figura 1.4: Foto de la especie Tabebuia billbergii tomada en el bosque seco
de Zapotillo en la Provincia de Loja……………………….……
10
Figura 1.5: Representación del alineamiento de los iniciadores ISSR no
anclados con respecto a un ADN molde. Los primers ISSR
anclados se muestran en color azul y rojo (De Vicente &
Fulton, 2003)…………………………………………………...
18
Figura 1.6: Representacion del alineamiento de iniciadores ISSR anclados
con respecto a un ADN molde. Los primers ISSR anclados se
muestran en color azul y rojo (De Vicente & Fulton,
2003)…………...…….…………………………………...……..
19
Figura 2.1: Mapa del Ecuador donde se muestran los puntos de recolección
de las muestras de guayacán (T. billbergii), realizado en DIVA-
GIS………....................................................................................
24
Figura 3.1: Electroforesis en gel de agarosa al 1% del ensayo de
extracciones de ADN con cuatro protocolos usando el marcador
de peso Low Mass Ladder……………………………………....
34
Figura 3.2: Electroforesis horizontal en gel de agarosa al 1.5 % de ADN
genómico de guayacán utilizando el marcador de peso
molecular Low Mass ladder……………………..………...……
35
Figura 3.3: Validación de los ADNs de guayacán (Carril M: marcador de
peso molecular Low Mass Ladder)……………………….……
35
Figura 3.4: Amplificación del ADN genómico de guayacán con el
marcador molecular ISSR 844A en gel de agarosa al 2%. En
donde se diferencia la especie T. billbergii de T. chrysantha
mediante el patrón de banda…………..……………………… 36
xiii
Figura 3.5:
Amplificación de ADN de guayacán con 10 primers ISSRs
siendo estos: a) 17899A y 17899B b) ISSR840 y ISSR841 c)
ISSR853 y ISSR857 d) HB12 y HB14 e) ISSR824 f)
ISSR900……….………………..………....................................
37
Figura 3.6: Amplificación de los primers ISSRs 853, 857 utilizando la
concentración de MgCl2 de 1.5mM……………………………
40
Figura 3.7: Amplificación de ADN de guayacán con el ISSR 840
utilizando diferentes temperaturas de alineamiento……….…....
40
Figura 3.8: Electroforesis en gel de agarosa al 1.5% de productos
amplificados con los primers: a) 841 b) 7899A………………
41
Figura 3.9: Análisis comparativo de los índices de diversidad genética de
las cinco poblaciones de guayacán (Tabebuia billbergii)………
46
Figura 3.10: Dendograma para los 214 genotipos de guayacán con el
coeficiente de similitud Jaccard, realizado en el programa
NTSYS.pc versión 2.02…………………………………………
49
Figura 3.11: Distribución en dos dimensiones de los 214 individuos de
Tabebuia billbergii mediante el análisis de coordenadas
principales (ACoP) en el programa NTSYS pc. 2.02 basado en
el coeficiente de similaridad de Jaccard…………………..….....
50
Figura 3.12: Distribución en dos dimensiones de las 5 poblaciones de
Tabebuia billbergii: a) genotipos de Mangahurco, b) genotipos
de la Isla Puná, c) genotipos de Cazaderos, d) genotipos de La
Cuca e) genotipos de Garza Real, mediante el análisis de
coordenadas principales (ACoP) en el programa
MULTBIPLOT basado en el coeficientes de similaridad de
Jaccard………………………………………………………….
52
Figura 3.13: Porcentaje de varianza molecular de 5 poblaciones de
guayacán: Mangahurco, Isla Puná, Cazaderos, Garza Real y La
Cuca, analizadas con 10 primers ISSR……….…………………
54
Figura 3.14: Porcentaje de varianza molecular de 3 poblaciones alejadas de
guayacán: Isla Puná, Garza Real y La Cuca, analizadas con 10
primers ISSR……………………………………………………
55
Figura 3.15: Porcentaje de varianza molecular de 3 poblaciones cercanas de
guayacán: Mangahurco, Isla Puná y Cazaderos, analizadas con
10 primers ISSR…………………………..……………………. 56
xiv
ÍNDICE ANEXOS
Anexo 1 : Datos del material vegetal de T. billbergii spp que corresponde a
las colectas realizadas en localidades de las provincias de Loja
(Mangahurco. Zapotillo. Cazaderos). Guayas (Isla Puná) y El Oro
(Arenillas)…………………………………………………………
81
Anexo 2: Tampón de extracción Sorbitol del protocolo de extracción de
ADN de Mariac et al. (1999) modificado por Morillo (2002)……..
87
Anexo 3: Tampón de lisis (CTAB 4%) del protocolo de extracción de ADN
de Mariac et al. (1999) modificado por Morillo (2002)………….
88
Anexo 4: Lista de los Primers ISSRs con los que se realizaron pruebas para
el estudio …………………………………………………………..
89
Anexo 5: a) Protocolo de extracción de ADN de Ferreira y Grattapaglia
(1998)…………………………………………………………... 90
Anexo 5:
b) Protocolo de extracción de ADN de Graham (1993)…………... 91
Anexo 5:
c) Protocolo de extracción de ADN de Álzate Marín (2001)……..
92
Anexo 6: Amplificación de 214 genotipos de guayacán con 10 primers ISSR
seleccionados para el estudio, mediante electroforesis horizontal
en geles de agarosa al 1.5%.......................................................
93
Anexo 7: Matriz binaria de los 214 genotipos de guayacán (Tabebuia
billbergii)………………………………………………………….. 99
xv
RESUMEN
Los bosques secos del Ecuador se caracterizan por la presencia de los guayacanes
sabaneros en especial de la especie endémica Tabebuia billbergii, conocida como
guayacán parquetero o “madero negro”, la cual es considerada de gran
importancia en el ámbito forestal, ambiental e incluso actualmente turístico. En el
país no existen estudios de caracterización molecular que sirvan para aclarar las
interrogantes sobre la variabilidad genética del guayacán. Por ende, en esta
investigación se emplearon 10 marcadores moleculares (ISSR) para el estudio de
la diversidad genética de 214 muestras de Tabebuia billbergii recolectadas en las
provincias de El Oro, Guayas y Loja. En el análisis molecular se detectaron 49
alelos con un promedio de 4.9 alelos/loci, en un rango desde 430 pb hasta 2105
pb. Se determinó el contenido de información polimórfica (PIC) y la
heterocigosidad esperada en la población obteniendo un valor promedio de 0.46 y
0.50 respectivamente. Además, la población de Mangahurco (Loja) presentó el
mayor porcentaje de polimorfismo o diversidad alélica con el 100 %, mientras que
la población La Cuca (El Oro) presentó el menor porcentaje de polimorfismo que
fue de 61.22%. También se determinó mediante el análisis de agrupamiento
UPGMA y el análisis de coordenadas principales (ACoP), que los individuos se
distribuyeron indistintamente y no de acuerdo a su distribución geográfica, sino
por características genotípicas que presentó la especie T. billbergii. Al utilizar el
análisis molecular de varianza, se determinó que la diversidad genética se
distribuye en mayor proporción dentro de cada población obteniendo el (89%, Φst
= 0.112).
PALABRAS CLAVES:
DIVERSIDAD GENÉTICA
TABEBUIA BILLBERGII
GUAYACÁN
ISSR
xvi
SUMMARY
The dry forests of Ecuador are characterized by the presence of sabaneros
guayacanes especially the endemic species Tabebuia billbergii, known as
parquetero guayacán or "black tree", which is considered of great importance
in forestry area, environmental and even today tourism. In the country there are
no molecular characterization studies that serve to clarify questions about the
genetic variability of guayacán. Therefore, in this investigation 10 molecular
markers (ISSR) were used to study the genetic diversity of 214 samples of
Tabebuia billbergii collected in the provinces of El Oro, Guayas and Loja. In
molecular analysis were detected 49 alleles averaging 4.9 alleles / loci, ranging
from 430 bp to 2105 bp. Polymorphic information content (PIC) and expected
heterozygosity in the population was determined by obtaining an average value
of 0.46 and 0.50 respectively. In addition, the population of Mangahurco (Loja)
had the highest percentage of polymorphism or allelic diversity with 100%,
while the population La Cuca (El Oro) had the lowest percentage of
polymorphism was 61.22%. It was also determined by cluster analysis
(UPGMA) and principal coordinate analysis (ACoP), individuals were
distributed equally and not according to their geographical distribution, but by
genotypic characteristics that submitted the species T. billbergii. By using the
molecular analysis of variance, it was determined that genetic diversity is
distributed in greater proportion within each population getting the (89%, Φst =
0.112).
KEYWORDS:
GENETIC DIVERSITY
TABEBUIA BILLBERGII
GUAYACAN
ISSR
1
CAPÍTULO I
INTRODUCCIÓN
1.1 Formulación del problema
Los bosques secos del sur del Ecuador y norte del Perú, constituyen
“El Centro de Endemismo Tumbesino”, que es considerado una de las
regiones más importantes del planeta por su riqueza biológica endémica y
biodiversidad, está ubicado en las provincias de El Oro y Loja a una altura
comprendida entre 0 a 700 m.s.n.m (Sierra et al., 1999) citado por (Espinosa,
2012). Estos bosques secos representan aproximadamente el 50 % de lo que
queda de este ecosistema y que constituye no más del 25 % de bosque seco
original, este ecosistema constituye según Sierra et al. (1999) la primera
prioridad de conservación del Ecuador continental.
Los bosques secos deciduos del Ecuador, han soportado durante los
últimos 70 años, grandes presiones antrópicas, se ha registrado la pérdida de
diversidad biológica arbórea ocasionada por los efectos del cambio climático
combinados con el inadecuado uso de tierras (expansión de la frontera
agrícola y ganadera) y la deforestación selectiva de especies comerciales;
Estos problemas se reflejan en el guayacán de sabana (T. billbergii spp) ),
esta especie de gran importancia en el cultivo forestal, contribuye una
importante protección de cuencas hidrográficas, además, permite la
estabilización del clima, la conservación de la biodiversidad, mejora las
condiciones y los nutrientes del suelo, ayuda a la fijación de carbono, mejora
la calidad del aire y brinda albergue a la vida silvestre (Aguirre et al., 2001;
Aguirre et al., 2005; Espinosa et al., 2012). También, se ha evidenciado que
el cambio climático puede producir alteraciones en la distribución biológica,
aumento de las tasas de extinción de especies, variaciones en los tiempos de
reproducción y en la duración de las estaciones de crecimiento de las plantas
(FAO, 2010).
2
El guayacán es una de las especies más representativas de los bosques
secos deciduos del Ecuador. Dos especies conocidas como guayacanes de
sabana o sabaneros estan presentes siendo estos Tabebuia billbergii y
Tabebuia chrysantha, en el caso de T. billbergii, especie endémica y conocida
como guayacán parquetero o “madero negro”, se han descrito las subespecies
T. billbergii–billbergii y T. billbergii-ampla, describiendo a esta última como
una mezcla de T. chrysantha spp y T. billbergii spp (Gentry, 1992).
Monitoreos de la diversidad genética en especies representativas de este
ecosistema son de importancia para determinar el estado de las poblaciones y
definir estrategias apropiadas de regeneración, uso sostenible y conservación.
En el caso de las especies de guayacán sabanero, no existen reportes a la
fecha de estudios de diversidad genética que se hayan publicado.
1.2 Justificación del problema
Los bosques secos del Ecuador se caracterizan por la presencia de los
guayacanes sabaneros T. billbergii y T. chrysantha, los cuales son
considerados de gran importancia en el ámbito forestal, ambiental e incluso
actualmente turístico. Por su potencial económico el guayacán parquetero, T.
billbergii, debería ser utilizado en programas de reforestación y restauración
de hábitats degradados como una estrategia de mitigación a los efectos
ocasionados por el cambio climático y la deforestación. A pesar de su
importancia estudios de diversidad genética en especies endémicas y
representativas de estos bosques secos, como T. billbergii aún no se han
realizado en el país.
Los estudios de diversidad biológica y genética en bosques, permiten
entender el funcionamiento y la conformación de los hábitats, esta
información se utiliza con el propósito de desarrollar acciones de
conservación de especies representativas, además, el uso de herramientas
tales, como los marcadores moleculares, han sido clave para realizar estudios
de diversidad genética permitiendo determinar la estructura genética de
poblaciones existentes, el flujo de genes y el nivel de variabilidad que puede
3
ser utilizado como acervo genético para la implementación de estrategias de
regeneración, uso sostenible y conservación adecuados.
El Departamento Nacional de Biotecnología del Instituto Nacional
Autónomo de Investigaciones Agropecuarias (INIAP), desarrolla el proyecto
“Desarrollo e innovación biotecnológica para la potenciación de rubros
agrícolas de importancia en seguridad alimentaria, competitividad exportable
y adaptación al cambio climático” financiado por la SENESCYT; este
proyecto entre sus objetivos, aplica biotecnologías en especies forestales
prioritarias para uso y conservación con el fin de generar conocimiento y
aportar al desarrollo de capacidades institucionales en recursos genéticos
forestales, para lo cual se seleccionaron seis especies forestales de
importancia en los bosques Ecuatorianos, entre ellas el guayacán sabanero.
1.3 Objetivos de la investigación
1.3.1 Objetivo general
Estudiar la diversidad genética de poblaciones de guayacán sabanero
(Tabebuia billbergii) en bosques secos del Ecuador a través del uso de
marcadores moleculares
1.3.2 Objetivos específicos
1) Realizar una prospección en los bosques secos del Ecuador para
establecer poblaciones de T. billbergii.
2) Monitorear la diversidad genética en cinco poblaciones de T. billbergii
a través de la caracterización molecular con marcadores ISSR en 214
árboles georeferenciados.
3) Determinar la diversidad genética entre las poblaciones en estudio y
asociar la variabilidad con su distribución geográfica.
4
1.4 Marco Teórico
1.4.1 El género Tabebuia
Tabebuia es el género más diverso de la familia Bignoniaceae
(Gentry, 1992); más del 75% de sus especies florecen una vez al año y
pierden las hojas durante la estación seca (Aguirre et at., 2006). Este género
está constituido por aproximadamente 100 especies; Su distribución abarca
regiones del trópico y subtrópico americano desde el norte de México hasta el
norte de Argentina (Gentry, 1992). En el Ecuador este género está
representado por 8 especies: T. billbergii, T. chrysantha, T. donnell-smithii, T.
incana, T. ochracea, T. palustris Hemsl, T. rosea y T. serratifolia (Jorgensen
& León-Yánez, 1999). Este género presenta: flores de color amarillo, blanco,
rosado y rojo, poseen hojas palmeadas de 3-7 foliolos, algunas presentan
pubescencia en hojas y cáliz y su madera es muy dura y pesada (figura 1.1)
(Grose & Olmstead, 2007).
Figura 1.1: Fotografía de características morfológicas de algunas especies
del género Tabebuia. (Bolfor et al., 2000).
5
1.4.2 Taxonomía
El género Tabebuia está ubicado dentro de la tribu Tecomae,
perteneciente a la familia Bignoniaceae. Esta familia está incluida en el orden
Scrophulariales, que pertenece a la subclase Asteridae (Gentry, 1992a). En
estudios taxonómicos realizados por Gentry (1992), se reportó que este género
en un inicio estaba constituido por 100 especies, de las cuales luego fueron 67
y un híbrido, dos fueron transferidas al género Roseodendron y 30 al género
Handroanthus, este último distribuido por Centro y Sudamérica (Grose &
Olmstead, 2007).
Estudios filogenéticos moleculares realizados por Grose & Olmstead
(2007), determinaron que el género Tabebuia forma parte de un grupo
parafilético, es decir, presentan a un antepasado en común con grupos
hermanos como Handroanthus y Roseodendron; razón por la cual a estos tres
géneros se les conoce como Alianza Tabebuia.
En el Ecuador el género Tabebuia está representado por 8 especies
siendo estas: T. chrysantha, T. donnell-smithii, T. incana, T. ochracea, T.
palustris Hemsl., T. rosea, T. serratifolia y T. billbergii (tabla 1.1) (Jorgensen
& León, 1999).
Tabla 1.1: Clasificación taxonómica de la especie Tabebuia billbergii.
TAXONOMÍA
Nombre Científico Tabebuia billbergii
Reino Plantae
Phylum Magnoliophyta
Clase Magnoliopsida
Orden Lamiales
Familia Bignoniaceae
Género Tabebuia
Especie billbergii
Nombre Común Madero negro
Sinónimo Guayacán
Fuente: (INRENA, 2002).
6
1.4.3 Descripción Botánica de Tabebuia billbergii
Los árboles de Tabebuia billbergii se encuentran en los bosques
semideciduos y secos, tienen una altura entre 12 a 14 metros, su copa se
caracteriza por ser redondeada y densa.
También presenta un tronco fuerte, compacto, recto, cilíndrico y de
aproximadamente 60 a 90 cm de diámetro a la altura del pecho (DAP), de
color pardo oscuro marcadamente fisurada.
Presenta hojas compuestas, opuestas, palmadas de 3 a 5 foliolos,
ovados angostos que miden hasta 10 cm de longitud y 5 cm de ancho, sus
hojas son de color verde claro y tienen peciolos delgados de 4 a 6 cm, el
folíolo terminal es más grande que los laterales y presenta un ápice agudo
acuminado.
Sus flores son amarillas con racimos florales terminales, cortos y no
ramificados, parecidas a umbelas con varias flores en pedúnculos cortos
dispuestas en una inflorescencia de racimo de 6 a 8 flores, además la flor está
compuesta del cáliz tubular de 1 cm con lóbulos irregulares en el ápice,
corola tubular amarillo limón.
El fruto es una cápsula linear oblonga de 17 a 25 cm de longitud por 8
a 10 mm de ancho; con pelos diminutos dispersos café oscuro cuando se
secan. Sus semillas son delgadas y tienen alas transparentes membranosas
(Aguirre, 2012) (figura 1.2).
7
Figura 1.2: Características morfológicas de Tabebuia billbergii. a) Flores,
b) Hojas, c) fruto (Gentry, 1992).
8
1.4.4 Distribución geográfica
Tabebuia es un género de plantas compuesto por un gran número de
especies estrictamente leñosas. Su distribución geográfica abarca grandes
regiones del trópico y subtrópico americano, en el ámbito regional una parte
de este género está presente en algunos países de América del Sur que son
muy conocidos por la calidad de la madera que se extrae de un grupo selecto
de sus especies, las cuales están consideradas entre las más pesadas y
durables de la Amazonía (Gentry, 1992b).
El límite meridional de su distribución se encuentra proximadamente
en 30 ºN en México y se extiende a través de toda centroamérica hasta el
norte del Uruguay y Argentina aproximadamente a los 35 ºS, lo que
constituye el extremo meridional de su distribución (Gentry, 1992b).
En el Ecuador específicamente en las provincias de Loja
(Mangahurco, Zapotillo, Cazaderos), Guayas (Isla Puná) y El Oro (Arenillas)
se encuentra Tabebuia billbergii, especie endémica presente en los bosques
secos tropicales en altitudes de 0 a 700 m.s.n.m (figura 1.3) (Sierra et
al.1999).
9
Figura 1.3: Distribución de especies del género Tabebuia en
Sudamérica: = T. alba, = T. aurea, = T. barbata, = T. billbergii
ssp. billbergii, = T. billbergii ssp. Ampla (Gentry, 1992).
1.4.5 Importancia de la especie Tabebuia billbergii
Tabebuia billbergii spp., es una especie representativa dentro de este
género, reconocida por su madera dura, resistente al ataque de termitas y al
agua salada; por esta razón es de gran interés comercial, comúnmente
utilizada en: ebanistería, artesanías finas, construcciones de puentes,
construcciones marinas, parquet, puertas y ventanas (Valverde, 1998). Es un
árbol melífero, el extracto de su corteza posee propiedades curativas utilizado
en tratamientos terapéuticos para el paludismo, tuberculosis, sífilis y
10
reumatismo (García, 1991); además es de interés en arboricultura urbana de
fincas y paisajes (figura 1.4) (Valverde, 1998).
Además, está especie es de gran interés ambiental, ya que contribuye a
una importante protección de cuencas hidrográficas, ayuda a la estabilización
del clima, favorece a la conservación de la biodiversidad, mejora las
condiciones y los nutrientes del suelo, ayuda a la fijación de carbono, mejora
la calidad del aire y brinda albergue a la vida silvestre (Aguirre et al., 2001;
Aguirre et al., 2005; Espinosa et al., 2012).
Figura 1.4: Foto de la especie Tabebuia billbergii tomada en el bosque
seco de Mangahurco en la Provincia de Loja.
1.4.6 Diversidad genética
La diversidad genética o variabilidad genética es el componente más
esencial de la biodiversidad, que da a conocer las variaciones de los genes
dentro de cada especie, ya que representa la variación heredable dentro y
entre poblaciones de organismos, esta variación se manifiesta en las
11
modificaciones ocurridas en la secuencia de nucleótidos del ADN, como
resultado de la migración, mutación, deriva génica, selección y la
combinación de estos eventos (Spooner et al., 2005).
La variabilidad genética ha avanzado progresivamente desde los
estudios de polimorfismo cromosómico (variación en el número y forma), los
análisis fisiológicos, los estudios bioquímicos isoenzimáticos, hasta el análisis
a escala molecular que incluye el secuenciamiento del ADN, logrando
detectar la variación a nivel nucleotídico (Nuez et al., 2000).
El estudio de la diversidad genética ha facilitado el conocimiento
básico para entender la evolución de las especies arbóreas forestales, la cual
ha permitido la adaptación de las especies a condiciones ambientales adversas
y variables durante miles de años, dando como resultado un conjunto de
recursos genéticos de árboles insustituibles, se estima que existe un número
alrededor de 100.000 especies arbóreas, de las cuales menos de 500 se han
estudiado detalladamente (FAO, 2005).
1.4.6.1 Cuantificación de la diversidad genética
El estudio de la diversidad genética dentro y entre poblaciones es
generalmente abordado a través de dos parámetros, una de ellas se basa en el
empleo de matrices de distancia y similitud con la finalidad de caracterizar la
población basados en la afinidad relativa de cada individuo respecto cada uno
de los individuos analizados, mientras que la segunda trata sobre el empleo de
parámetros basados en la determinación de las frecuencias alélicas en un
número de loci polimórficos, para distribuir la variación genética en
componentes de la variación dentro y entre poblaciones (Weising et al.,
2005).
Una de las medidas más frecuentemente usadas de variación genética es la
diversidad genética de Nei (1973) o heterocigosidad (h), la cual tiene en
12
cuenta las frecuencias alélicas que determina la probabilidad de que 2 alelos
elegidos al azar sean diferentes en la muestra. La misma se calcula como:
donde h es la heterocigosidad en un locus cuando se estudia una población de
apareamiento al azar, o la diversidad de un gen en un locus cuando los
apareamientos no son aleatorios en el grupo de estudio; h es la sumatoria de
i=1 a k, pi es la frecuencia del alelo y k es el número de alelos. La
diversidad genética h es luego promediada sobre el total de loci y a menudo
se denota como H.
Para obtener una visión más general de la diversidad en un grupo, la
heterocigosidad o diversidad genética se calcula para cada locus. La
estimación normalizada de esta medida es la Heterocigosidad esperada
imparcial o normalizada (UHe) (Nei, 1978):
Donde UHe es la heterocigosidad o diversidad genética para un solo locus, xi
es la frecuencia del alelo (o marcador) y n es el número de individuos.
El promedio de todos los loci (o marcadores) representará el promedio de la
heterocigosidad (H) o el promedio de la diversidad genética en el grupo,
calculada como:
Donde r es el número total de loci. En una población ideal y apareada
aleatoreamente, H es idéntica a la heterocigosidad esperada He.
13
La diversidad genética de Nei o también llamada contenido de información
polimórfica (PIC) puede calcularse para datos dominantes bialélicos como:
Aquí p es la frecuencia de los alelos visibles y q es la frecuencia de los alelos
nulos para el marcador i. En este caso, para los datos binarios diploides se
asume el equilibrio de Hardy-Weinberg:
q = (1-frecuencia de la banda)1/2 y p = 1- q
El contenido de información polimórfica provee una estimación del poder
discriminatorio de un locus teniendo en cuenta, no sólo el número de alelos
que son expresados, sino también las frecuencias relativas de los mismos
(Smith et al., 1997); para datos dominantes tiene un máximo de 0,5 cuando la
frecuencia toma el valor p= 0,5 (De Riek et al., 2001).
Según Botstein et al., (1980), menciona que el valor PIC va desde 0 (Perfil
monomórficos) a 1 (perfil altamente polimórfico) por lo que, marcadores con
valores PIC superior a 0,5 se consideran muy informativos, mientras que los
valores entre 0,25 y 0,50 indican una nivel informativo moderado y los
valores menores de 0,25 se consideran poco informativos.
Otra medida de diversidad, la cual se utiliza a menudo para datos dominantes,
es el Índice de Shannon (H’). Éste generalmente se calcula como:
donde pi es la frecuencia del alelo en la población, grupo de individuos o
especies, y ambos alelos (presencia y ausencia) de cada locus debe ser
tomado en cuenta.
14
Alternativamente, el logaritmo natural es usado en lugar del log2. La fórmula
quedaría de la siguiente manera:
1.4.7 Genética de Poblaciones
La genética de poblaciones estudia la distribución de los genes en las
poblaciones y la manera en que la frecuencia de genes y genotipos se
mantienen o cambian de una generación a otra, considerando los cambios
que se presentan a través del tiempo y el espacio (Gardner et al., 2003;
Griffiths et al., 2005). Dichos cambios pueden ser observados dentro y entre
poblaciones por el fenotipo, se dice que un gen o un rasgo fenotípico es
polimórfico cuando existe más de una forma del gen o más de un rasgo
fenotípico para un carácter dentro de una población (Griffiths et al., 2005).
En la genética de poblaciones la presencia de variabilidad genética es
requerida no solo para el mejoramiento genético o conservación de especies,
ya que el rol fundamental de la variabilidad genética es ser la materia prima
para los procesos evolutivos, sin variabilidad no hay evolución (Buckler &
Thornsberry, 2002).
Las poblaciones, están sujetas a cambios evolutivos que varían las
frecuencias alélicas o génicas, a su vez están influenciadas por la selección
natural y la deriva génica que actúan disminuyendo la variabilidad genética
de las poblaciones, en cambió sucesos como la migración y mutación actúan
aumentando la variabilidad genética (Griffiths et al., 2005).
1.4.7.1 Selección natural
La selección natural ha sido un medio importante para la evolución,
ya que actúa en las poblaciones que presentan una mejor adaptación al
15
ambiente ya sea en el fenotipo o genotipo, originando que los individuos más
aptos tengan mayor probabilidad de sobrevivir y reproducirse (Campbell et
al., 2005).
La selección natural también explica la diversidad entre organismos
ya que promueve su adaptación a diferentes modos de vida, según Charles
Darwin mostró que “los portadores de variantes hereditarias que permitan a
los mismos adaptarse al medio son más probables que sobrevivan y originen
más progenie que organismos que carecen de dichas variantes” (Grant, 1991).
Otro factor seria la eficacia biológica o valor adaptativo destacando la
reproducción diferencial que puede deberse a diferentes tasas de fertilidad,
fecundidad y la selección sexual (Haldane, 1927).
1.4.7.2 Deriva genética
La deriva genética explica que la reproducción de organismos origina
cambios aleatorios en las frecuencias alélicas en una población (Gardner et
al., 2003). En la deriva genética existen dos fenómenos conocidos como:
cuello de botella y el efecto fundador; el cuello de botella ocurre cuando el
tamaño de la población disminuye drásticamente debido a la falta de alimento
o por desastres ambientales, mientras que el efecto fundador da a conocer la
generación de una nueva población a partir de un grupo pequeño de
individuos provenientes de una población más grande (Slatkin, 2004;
Mancera, 2007).
1.4.7.3 Flujo génico
El flujo genético o migración es la transferencia de genes de una
población a otra producida por diferentes factores como la movilidad
(Hastings et al., 2009). También ocurre cuando una población al no estar
completamente aislada recibe material genético adicional de otras
poblaciones con frecuencias genéticas diferentes, de esta manera cualquier
16
población puede contribuir a la constitución genética de otras por medio de la
migración (Griffiths et al., 2005).
1.4.7.4 Mutación
La mutación es la principal fuente de variabilidad genética, ya que
altera la secuencia del ADN introduciendo nuevas variantes mediante
procesos de recombinación, otro suceso son las mutaciones puntuales que
insercionan o deleccionan nucleótidos sueltos o pequeñas secuencias; además,
cada especie tiene una tasa de mutación propia que ha sido modulada por la
selección natural para que la especie pueda enfrentarse de un modo más
óptimo a los cambio que le impone su ambiente (Gravel, 2012).
1.4.8 Marcadores moleculares
Históricamente se han usado herramientas moleculares para la
caracterización e identificación de variedades (Rallo et al, 2002). Existen dos
clases de marcadores genéticos, los marcadores morfológicos y los
marcadores moleculares. Los marcadores morfológicos han permitido evaluar
la taxonomía o clasificación de organismos mediante el estudio de
características fenotípicas, estos marcadores son limitados ya que las
características a medir no son infinitas, ya que, se deben medir en cierta etapa
del crecimiento y pueden estar influenciados por el ambiente (Tanksley,
1983). Por otro lado el desarrollo de los marcadores moleculares ha ayudado
a eliminar los inconvenientes de una selección basada en el análisis exclusivo
del fenotipo, como la identificación de especies y variedades de una forma
más rigurosa y repetitiva (ArgenBio, 2007).
Los marcadores moleculares han sido desarrollados para detectar la
transmisión de un segmento de cromosoma de una generación a otra
(Tanksley, 1983). Son utilizados en estudios de variabilidad genética, mapeo
genético, localización y aislamiento de genes de interés, estudios de genética
humana, vegetal, animal y microbiana; En la actualidad existen varias
17
técnicas moleculares que nos permiten conocer cómo se encuentran las
proporciones de genes en las poblaciones naturales de manera indirecta, con
los análisis de proteínas o de manera directa con estudios de ADN, los
diferentes tipos de marcadores se distinguen por su capacidad de detectar
polimorfismos en loci únicos o múltiples y son de tipo dominante o
codominante (Simpson, 1997).
1.4.8.1 Marcadores ISSRs
Las siglas ISSR provienen de (Interspread single sequence repeats),
traducido como secuencias intercaladas entre los microsatélites (Zietkewicz et
al., 1994). Técnica basada en PCR, es de característica semiarbitraria debido
a que se utiliza un solo primer de 14 pb o más, complementario a dos
microsatélites cercanos presentes en el genoma. La amplificación ocurrirá si
hay un adecuado alineamiento de los iniciadores y la distancia entre éstos sea
de 100 a 2500 pb, o más dependiendo de las condiciones PCR (González &
Aguirre, 2007).
Existen dos clases de iniciadores usados con los ISSR. Los primeros
son los conocidos como: no anclados que poseen una secuencia
complementaria al microsatélite pero no posee nucleótidos diferentes a éste.
Además, presentan dos lugares diferentes de alineamiento para un mismo
primer no anclado; es decir, que los iniciadores, dada su complementariedad
total con la secuencia microsatélite, se podrían alinear a lo largo de éste,
pudiendo variar de esta manera la longitud del producto amplificado (figura
1.5), esto está influenciado por las condiciones de temperatura que se le
proporcione a la reacción (De Vicente y Fulton, 2003).
18
Figura 1.5: Representación del alineamiento de los iniciadores ISSR no
anclados con respecto a un ADN molde. Los primers ISSR anclados se
muestran en color rojo y azul (De Vicente & Fulton, 2003).
En la figura 1.6 se muestran los segundos iniciadores conocidos
como: anclados los que tienen uno o varios nucleótidos diferentes (en
posición 3’ o 5’) que facilitan el alineamiento del iniciador en una posición
específica con relación al microsatélite. Existen dos casos que presentan los
iniciadores anclados: en el caso 1 se trata de un primer anclado con un
nucleótido T (en posición 3’) adicional a la secuencia del microsatélite (AG),
ya que para que ocurra la hibridación, debe haber complementariedad entre el
nucleótido N y la Timina 3’ del primer (señalados con un círculo). El caso 2
sucede cuando el primer anclado posee la secuencia adicional en el extremo
5’ en donde se señala con un círculo un grupo de tres nucleótidos (CTG) del
extremo 5’ del cebador que deben ser complementarios a los tres nucleótidos
19
(NNN) para que los primers se logren hibridar al ADN molde (De Vicente &
Fulton, 2003).
Figura 1.6: Representacion del alineamiento de iniciadores ISSR anclados
con respecto a un ADN molde. Los primers ISSR anclados se muestran en
color rojo y azul (De Vicente & Fulton, 2003).
En los ISSRs la presencia de la banda representa el genotipo
dominante (homócigo o heterócigo), mientras que su ausencia representa el
genotipo homócigo recesivo, también la ausencia de una banda puede deberse
a varios factores como: la no existencia de un sitio de unión completo al
primer debido a una mutación, rearreglos estructurales en el cromosoma
durante la meiosis, inserciones o deleciones suficientemente grandes como
para aumentar o disminuir el tamaño de la banda de manera que se identifica
como un locus diferente (González & Aguirre, 2007).
20
Los marcadores ISSR presentan la característica de semiarbitrariedad,
esto es de gran importancia al presentar una mayor reproducibilidad, que
ciertos marcadores como los RAPDs, ya que, la reproducibilidad corresponde
a que son secuencias de nucleótidos más largas que los RAPDs, por lo que la
temperatura de alineamiento es más alta y estable así obteniendo un mayor
número de bandas (Bornet & Branchard, 2001).
La técnica de los ISSR combina la mayoría de los beneficios de los
RAPD, microsatélites (SSR) y los AFLP. La Tabla 1.2 resume las
características principales de estos marcadores.
Tabla 1.2: Comparación de las características principales de las técnicas
moleculares para identificar diversidad genética (Spooner et al., 2005).
MARCADOR
ISSR RAPD SSR AFLP CARACTERÍSTICA
Abundancia genómica Alta Alta Alta Alta
Nivel de polimorfismo Medio/alto Medio Alto Medio
Especifico de locus No No Si No
Codominancia No/Si No Si No/Si
Reproducibilidad Medio/alto Baja Alta Medio/alto
laboriosidad Baja Baja Baja/Media Media
Demanda técnica Baja/Media Baja Baja/Media Medio
Costos operacionales Bajos Bajos Bajos/Medios Medio
Costos de desarrollo Bajo Bajo/Medio Alto Bajo
Cantidad de ADN requerido Baja Baja/Media Baja Baja
Facilidad de automatización Si Si Si Si
Los ISSRs son marcadores dominantes y proveen alta variabilidad,
han sido utilizados en estudios de cultivos de especies desde el año de 1994,
pero hace algunos años se han utilizado en investigaciones de variabilidad
poblacional en especies silvestres por su reproducibilidad, rapidez y costo
(Wolfe, et al., 1998), facilitado la identificación de grupos genéticos,
21
evaluación de diversidad genética en poblaciones, reconstrucción filogenética
e identificación de individuos con origen clonal y sexual (Pradeep, et al,
2002).
1.9 Sistema de hipótesis
No existe diversidad genética en las poblaciones de Tabebuia
billbergii presentes en bosques secos del Ecuador.
22
CAPÍTULO II
MATERIALES Y MÉTODOS
2.1 Participantes
2.1.1 Instituciones
Las instituciones auspiciantes de esta investigación son el INIAP y la
Secretaria de Educación Superior, Ciencia, Tecnología e Innovación
SENESCYT quien financia el proyecto: “Desarrollo e innovación
biotecnológica para la potencia de rubros agrícolas de importancia en
seguridad alimentaria, competitividad exportable y adaptación al cambio
climático” (SENESCYT PIC-12-INIAP-001).
2.1.2 Responsable del proyecto
Ana Elizabeth Rueda Córdova
2.1.3 Colaboradores científicos
PhD. Eduardo Morrillo. Director de tesis y Líder del
Departamento Nacional de
Biotecnología del INIAP
Lic. Katherine Orbe Responsable del Departamento de
Biotecnología de la Estación
Experimental Santa Catalina.
Ing. Johanna Buitrón Técnica del área de biología
molecular
Ing. Santiago Meneses Técnico del área de cultivo de tejidos
vegetales
M.Sc. Mónica Jadán Directora de tesis
Ing. Marco Taipe Codirector de tesis
23
2.2 Zona de Estudio
2.2.1 Fase de Campo
En el presente trabajo se analizaron muestras de ADN de 214 árboles
de guayacán sabanero georeferenciados durante misiones de prospección
realizadas en localidades de las provincias de Loja (Mangahurco, Cazaderos,
Garza Real), Guayas (Isla Puná) y El Oro (Arenillas- La Cuca), recolectadas en
los meses de Febrero, Marzo y Abril del 2014 respectivamente.
2.2.2 Fase de Laboratorio
La parte experimental se realizó en el Laboratorio de Biología Molecular
del Departamento Nacional de Biotecnología en la Estación Experimental Santa
Catalina del INIAP, ubicada en la parroquia Cutuglagua, cantón Mejía, provincia
de Pichincha.
2.3 Período de tiempo de investigación
La investigación se inició en el mes de Abril del año 2014 y finalizó
en el mes de marzo del año 2015.
2.4 Procedimientos
2.4.1 Recolección de material vegetal
El muestreo del material vegetal se realizó en las provincias de Loja,
El Oro y Guayas en los meses de Febrero, Marzo y Abril del 2014 y en
anteriores prospecciones por técnicos del Departamento de Biotecnología del
INIAP, ya que el guayacán sabanero presenta un ciclo fenológico de floración
entre los meses de Diciembre a Enero (Aguirre, 2012). Para realizar el
muestreo se georeferenció el área de prospección dentro del bosque, el tamaño
24
de la prospección por población fue de 4 km2 dentro de la cual se seleccionaron
en algunos casos diez plantas por cada población, ya que no se contaba con
suficiente material vegetal foliar. Para la selección de los árboles se
consideraron las características morfológicas de la especie como la altura,
grosor del tallo, las hojas palmeadas y el florecimiento. En el campo se realizó
una codificación de los individuos, para su posterior identificación, tomando en
cuenta las coordenadas donde se los recolectó (anexo 1). Se recolectaron de 5 a
10 hojas jóvenes, las que se colocaron en fundas herméticas con sílica gel (50g)
debidamente etiquetada. La figura 2.1 muestra los puntos de colecta realizados
en tres provincias.
Figura 2.1: Mapa del Ecuador donde se muestran los puntos de recolección de
las muestras de guayacán (T. billbergii), realizado en DIVA-GIS.
25
2.4.2 Extracción de ADN genómico de guayacán
Para la extracción de ADN se utilizó el protocolo descrito por Mariac
et al. (1999) modificado por Morillo (2002). En microtubos de 1,5 ml con
100 mg de muestra (tejido foliar seco) y 50 mg de metasulfito de sodio se
añadió 1 ml de tampón de extracción Sorbitol (anexo 2) en cada tubo. A
continuación se centrifugaron los tubos a 13000 rpm por 10 minutos luego se
eliminó el sobrenadante y se añadió 700 µl de Tampón de lisis (CTAB 4%)
(anexo 3) y se homogenizó, luego se incubaron los tubos a 65°C por 2 horas,
agitándolos muy cuidadosamente cada 30 minutos. Luego de dejarlos enfriar
se centrifugaron por 10 minutos a 13000 rpm, en un tubo se recuperó el
sobrenadante y se añadió 700 µl de cloroformo-alcohol isoamílico (24:1), se
agitaron y se centrifugaron a 13000 rpm por 10 minutos nuevamente en un
tubo se recuperó el sobrenadante y se añadió 700 µl de cloroformo-alcohol
isoamílico (24:1), prontamente se centrifugó a 13000 rpm por 10 minutos.
Luego se recuperó la fase acuosa en un nuevo tubo y se añadió 700 µl de
etanol al 100%, se invirtió los tubos para mezclar completamente el contenido
el que se distinguió como unos hilitos o una pelotilla (en caso contrario, se
puso las muestras a -20 ºC durante 20 minutos). Luego se centrifugó por 3
minutos a 10000 rpm en donde se recuperó el pellet de ADN después de
haber desechado el sobrenadante. A continuación se realizó dos lavados del
pellet de ADN con 250 µL de etanol 70%. Luego se dejó secar los tubos boca
abajo y se colocó en la micro estufa por media hora o hasta que se haya
eliminado completamente el olor a etanol. Luego se añadió 100 µl de TE y 1
µl de ARNsa. Por último se dio un vórtex y un punto de centrífuga, se colocó
en la microestufa por ½ hora aproximadamente y se conservó el ADN a 4 °C.
2.4.3 Cuantificación de ADN
La cuantificación de ADN permitió determinar características
cualitativas y cuantitativas como la concentración de ADN y la pureza
existente en las muestras de guayacán. La cuantificación de ADN genómico
de guayacán se realizó utilizando el espectrofotómetro para microplacas
26
EPOCH™ de Biotek®, el cual detecta la radiación emitida por las bases
nitrogenadas presentes en el ADN luego de ser excitadas con luz de 260 nm
(Rocha, 2002). En la microplaca se añadió 2μl de cada muestra y se obtuvo
la absorbancia del material vegetal, con referencia a un blanco como el buffer
Tris-EDTA, se obtuvo la pureza y la concentración en unidades de ng/μl
(Biotec Instruments, 2011).
Las muestras de ADN genómico tambien fueron cuantificadas
mediante electroforesis horizontal en geles de agarosa al 1%, en cada pocillo
se cargó 2.5 μl de buffer Blue Juice 5X, 7.5 μl de ADN y se cargó 2 μl del
marcador de peso molecular Low DNA Mass Ladder INVITROGEN®. La
corrida electroforética se fijó en 100 V durante 30 minutos. Posteriormente se
realizó la tinción de los geles en una solución de bromuro de etidio (15 ppm)
por un periodo de tiempo de 45 minutos en agitación continua; los geles se
visualizaron en el fotodocumentador Dolphin View Wealtec (Morillo &
Miño, 2011).
2.4.4 Validación del ADN de Guayacán Sabanero
El ADN genómico obtenido fue validado con el primer Tau 15,
marcador reportado en el estudio realizado en la especie Tabebuia aurea por
Braga et al. (2007). Para la amplificación de las muestras de Tabebuia
billbergii se utilizó el coctel de reacción PCR (tabla 2.1 y tabla 2.2).
27
Tabla 2.1: Concentraciones y volúmenes de reacción para ensamblaje de la
PCR, validación con primer SSR TAU-15 (Morrillo & Miño, 2011).
Reactivos Ci Cf
Volumen para una
reacción (µL)
Agua ---------- -----------
2.18
Buffer PCR 5 X 1 X
1.50
MgCl2 25 mM 2 mM
0.6
dNTP’s 5 mM 0.2 mM
0.38
Primer forward 10 µM 0.5 µM 0.38
Primer reverse 10µM 0.5 µM 0.38
Taq polimerasa 5 U/µL 0.067 U/µL 0.10
Muestra (ADN) 5 ng/µL 1.33 ng/µL 2
Ci= concentración inicial, Cf = concentración final
Tabla 2.2: Temperaturas empleadas para la amplificación de SSR TAU-15
Temperatura Tiempo N° de ciclos
1 94 °C 5 min 1
2 94 °C 45 seg
34 3 56 °C 1 min
4 72 °C 2 min
5 72 °C 7 min 1
6 10 °C 5 min 1
Los productos de PCR se visualizaron mediante electroforesis
horizontal en geles de agarosa al 2%, posteriormente se realizó la tinción de
los mismos en una solución de bromuro de etidio (15 ppm) por un periodo de
tiempo de 30 minutos en agitación continua; los geles se visualizaron en el
fotodocumentador Dolphin View Wealtec (Morillo & Miño, 2011).
28
2.4.5 Determinación de la especie Tabebuia billbergii con el marcador
ISSR 844A
Para verificar que el ADN validado corresponde a T. billbergii, se
realizó una amplificación con el marcador universal ISSR 844A, esto se
efectuó utilizando el coctel de PCR descrito a continuación (tabla 2.3 y tabla
2.4).
Tabla 2.3: Concentraciones y volúmenes de reacción para ensamblaje de la
PCR, validación con primer ISSRs (Morrillo & Miño, 2011).
Mix PCR: Ci Cf Vol. 1 Rx
(µL)
Agua
2.6
Buffer PCR (X) 10 1
1
MgCl2 (mM) 50 3
0.6
dNTP's (mM) 2.5 0.1
0.4
Primer (µM) 10 0.2
0.2
Taq casera (U/ µL) 5 0.1
0.2
Muestra (ng/ µL) 5 2.5
5
Volumen de reacción (µL)
10
ng de ADN por Rx (ng)
25
Ci= concentración inicial, Cf = concentración final
29
Tabla 2.4: Temperaturas empleadas para la amplificación de ISSR
Temperatura Tiempo N° de ciclos
1 92 °C 4 min 1
2 92 °C 30 seg
40 3 37 °C 1 min
4 72 °C 1 min
5 72 °C 10 min 1
6 4 °C 10 min 1
Los productos de PCR se visualizaron mediante electroforesis
horizontal en geles de agarosa al 2% y posteriormente se realizó la tinción de
los mismos en una solución de bromuro de etidio (15 ppm) por un periodo de
tiempo de una hora en agitación continua; los geles se visualizaron en el
fotodocumentador Dolphin View Wealtec (Morillo & Miño, 2011).
2.4.6 Pre-selección de marcadores ISSRs
Para la selección de marcadores que proporcionen una alta
información en términos de amplificación de bandas polimórficas; se realizó
una pre-selección utilizando 48 marcadores ISSR detallados en el (anexo 4)
con 8 muestras representativas de la población de Tabebuia billbergii. De las
amplificaciones realizadas se seleccionaron 10 marcadores los que
presentaron mayor polimorfismo. A continuación se detalla la lista de
marcadores seleccionados (tabla 2.5).
30
Tabla 2.5: Lista de marcadores ISSR seleccionados para el estudio
No. Primer Secuencia (5’-3’) TºA
1 17899A CACACACACACAAG 37 °C
2 17899B CACACACACACAGG 37°C
3 HB12 CACCACCACGC 37°C
4 HB14 CTCCTCCTCGC 37°C
5 824 TCTCTCTCTCTCTCTCG 37°C
6 840 GAGAGAGAGAGAGAG AYT 52°C
7 841 GAGAGAGAGAGAGAGAYC 37°C
8 853 TCTCTCTCTCTCTCTCRT 37°C
9 857 ACACACACACACACACYG 37°C
10 900 ACT TCCCCACAGGTTAACACA 37°C
Y = T C, R = G A
2.4.7 Amplificación de fragmentos de ADN mediante primers ISSR
Para realizar la amplificación con los marcadores moleculares
seleccionados se realizaron pruebas preliminares utilizando el coctel de
reacción PCR descrito por Morrillo y Miño (2011), detallado en la Tabla 3 y
4. Los productos amplificados se analizaron por electroforesis horizontal en
geles de agarosa al 2% en tampón TAE 1X, cada pocillo se cargó con 2.5 μl
de buffer Blue Juice 5X, 7.5 μl de ADN y se cargó 2 μl del marcador de peso
molecular 1Kb Plus DNA Ladder INVITROGEN®. La corrida electroforética
se fijó en 100 V durante una hora. Posteriormente se realizó la tinción de los
geles en una solución de bromuro de etidio (15 ppm) por un periodo de
tiempo de una hora en agitación continua; Para la visualización se colocó el
gel bajo un transiluminador UV y la imagen se analizó en el programa
PhotoCaptMw versión 10.01, para la estimación del peso de las bandas en
relación al marcador de referencia 1Kb plus DNA Ladder Marker
INVITROGEN®.
31
Además se realizaron ensayos para determinar la concentración de
cloruro de magnesio y la temperatura de alineamiento. Luego de establecer
las condiciones de PCR, se realizaron las amplificaciones con los 10 primers
con toda la población de Tabebuia billbergii.
2.5 Registro de datos
Las fotografías de los geles fueron analizados en el programa
PhotoCaptMw que es un asistente de lectura de las imágenes. Los datos
obtenidos se utilizaron para determinar el nivel de polimorfismo presente
teniendo como variable al número de alelos por locus. Se tomó como
referencia los pesos moleculares de cada banda del marcador 1Kb plus DNA
Ladder Marker INVITROGEN® para determinar el peso de las bandas
amplificadas. Se realizó una matriz de pesos moleculares con los 10
marcadores ISSRs y otra matriz con los datos en código binario siendo la
presencia igual a 1 y la ausencia igual a 0 (Shen et al., 2006). La matriz
obtenida fue compatible para el análisis de diversidad genética utilizada en
diversos programas bioestadísticos.
2.7 Análisis de datos
2.7.1 Análisis de diversidad genética
Para el análisis de diversidad genética se utilizó el software GenALEX
versión 6.5 (Peakall et al., 2012), que determinó las frecuencias de alelos, el
porcentaje de loci polimórfico. También se uso el programa en línea
Polymorphic Information Calculator (Nagy et al., 2012), para determinar el
Contenido de Información de Polimorfismo (PIC) y la heterocigosis
esperada.
32
2.7.2 Análisis de agrupamiento
Los análisis estadísticos para observar la diversidad genética fueron
realizados utilizando los coeficientes de similaridad los cuales comparan las
bandas compartidas entre individuos o poblaciones y consideran para el
análisis solamente la presencia de bandas excluyendo así el equilibrio de
Hardy-Weinberg. Estos coeficientes son: Dice (1945) y Jaccard (1908)
usados en análisis de marcadores dominantes. Los análisis de agrupamiento
fueron realizados utilizando el programa NTSYSpc versión 2.02 (Rohlf,
2002), con el que se construyó los dendrogramas utilizando, el análisis de
agrupamiento UPGMA (unweighted pair-group method with arithmetic
averages) que nos permite determinar las relaciones entre poblaciones.
2.7.2 Análisis de coordenadas principales
El análisis de coordenadas principales (ACoP) permite observar la
diversidad genética utilizando el coeficiente de similaridad de Jaccard (1908)
el que permite conocer la distribución que tienen los individuos en las
poblaciones. El ACoP resume en pocas dimensiones, la variabilidad de una
matriz de dispersión que tiene un gran número de variables (Legendre &
Legendre, 2000). Este análisis se lo llevó a cabo en el programa NTSYSpc
versión 2.02 con el módulo Eigen (Rohlf, 2002), también se utilizó el
programa MULTBIPLOT (Vicente-Villardón, 2014), para realizar el análisis
de coordenadas principales, donde se creó los gráficos de cada una de las
poblaciones de guayacán.
2.7.3 Análisis molecular de varianza
El análisis molecular de varianza AMOVA (Excoffier et al., 1992) es
un análisis jerárquico que nos permite observar la variación dentro y entre los
componentes de una población usando distancias genéticas (Culley et al.,
2007). Para el análisis molecular de varianza se utilizó el software GenALEX
versión 6.5 (Peakall et al., 2012), este programa trata a los datos dominantes
33
como haplotipos y analiza el total de la varianza en los componentes de la
covarianza asociados con diferencias entre individuos dentro de poblaciones,
entre individuos en diferentes poblaciones dentro de grupos y entre grupos
(Culley et al., 2007).
2.7.4 Distancia genética de Nei
Los índices de distancias genéticas se calcularon entre las poblaciones
formadas en el análisis de agrupamiento UPGMA y ACoP, con el objetivo de
describir el grado de diferenciación genética entre grupos. Este valor se
refiere a las diferencias genéticas obtenidas en función de las frecuencias
genéticas (Nei, 1979).
Para el cálculo de la distancia genética de Nei, se utilizó la matriz
binaria que fue introducida en el software GenALEX versión 6.5 (Peakall et
al., 2012), usando la opción frequency.
34
CAPÍTULO III
RESULTADOS
3.1 Extracción y cuantificación de AND
Se probaron cuatro protocolos de extracción de ADN con 12 muestras
de guayacán siendo estos: Graham (1993), Álzate Marín (2001), Ferreira &
Grattapaglia (1998), Mariac et al., (1999) adaptado por Morillo (2002)
detallados en el (anexo 5) Con los resultados obtenidos de la cuantificación se
escogió el protocolo Mariac et al., (1999) adaptado por Morillo (2002), que
resultó ser más efectivo en la extracción de ADN mostrando una molécula
más definida y con menos degradación (figura 3.1).
Figura 3.1: Electroforesis en gel de agarosa al 1% del ensayo de
extracciones de ADN con cuatro protocolos usando el marcador de peso
Low Mass Ladder.
Se realizaron las extracciones de ADN genómico de un total de 214
individuos con el protocolo de Mariac et al., (1999) adaptado por Morillo
(2002), el que resultó ser el más eficaz para la extracción de ADN mostrando
ADN de buena calidad y sin degradación, obteniendo una concentración
promedio de la población de 568,67 ng/μl y un índice de pureza promedio de
35
1,81. Además se comprobó la calidad de ADN con electroforesis horizontal
en geles de agarosa al 1.5 % (figura 3.2).
Figura 3.2: Cuantificación de ADN genómico de guayacán utilizando el
marcador de peso molecular Low Mass Ladder.
3.2 Validación del ADN de Guayacán Sabanero
Para validar las 214 muestras de ADN obtenidas, se realizó una
amplificación con el marcador Tau 15 (Braga et al., 2007), utilizando
diluciones de ADN a una concentración de 5ng/µl, con el coctel de PCR
descrito por Morrillo & Miño (2011), detallado en la tabla 2.1 y 2.2. No se
detectaron problemas en la amplificación de las muestras de ADN, los
amplicones presentaron buena intensidad. A continuación se muestra la
imagen de la validación de ADN de guayacán sabanero (figura 3.3).
Figura 3.3: Validación de los ADNs de guayacán (Carril M: marcador de
peso molecular Low Mass Ladder).
36
3.3 Determinación de la especie Tabebuia billbergii con el marcador
ISSR 844A.
Se realizó la amplificación de los 214 ADNs genómico de guayacán
donde se utilizó el marcador molecular ISSR 844A con el coctel de PCR
descrito por Morrillo & Miño (2011), detallado en la tabla 2.3 y 2.4, el
marcador de peso molecular 100 bp DNA Ladder. Se comprobó que el ADN
validado corresponde a T. billbergii con el marcador ISSR 844A, ya que este
marcador resultó ser el más idóneo en la diferenciación de las especies T.
billbergii y T. chrysantha mediante el patrón de banda (figura 3.4).
Figura 3.4: Amplificación del ADN genómico de guayacán con el marcador
molecular ISSR 844A en gel de agarosa al 2%. En donde se diferencia la
especie T. billbergii de T. chrysantha mediante el patrón de banda.
3.4 Pre-selección de marcadores ISSRs
Se realizaron pruebas de amplificación con 48 marcadores ISSR y 8
muestras de ADN de guayacán (T. billbergii) diluidas a una concentración de
37
5ng/µl, utilizando el coctel de PCR para ISSRs descrito por Morrillo & Miño
(2011), detallado en la tabla 2.3 y 2.4. Se seleccionaron 10 marcadores ISSR
los que mostraron el mayor número de fragmentos de ADN polimórficos en
la población de T. billbergii. Se realizó pruebas de Temperatura de Annealing
para obtener una mejor resolución de banda y pruebas variando la
concentración de MgCl2. En la (Figura 3.5) se indica los productos
amplificados con los 10 marcadores seleccionados.
Figura 3.5: Amplificación de ADN de guayacán con 10 marcadores ISSRs
siendo estos: a) 17899A y 17899B b) ISSR840 y ISSR841.
38
Figura 3.5: Amplificación de ADN de guayacán con 10 marcadores ISSRs
siendo estos: c) ISSR853 y ISSR857 d) HB12 y HB14 e) ISSR824 f)
ISSR900.
39
3.5 Optimización de la Técnica de PCR
Para establecer las condiciones adecuadas de PCR se llevaron a cabo
distintos ensayos para optimizar: concentración de cloruro de magnesio y
temperatura de alineamiento.
3.5.1 Concentración de MgCl2
En la estandarización del MgCl2
se tomó en consideración el patrón
de bandas en busca de una mejor definición de las bandas, para lo cual, se
trabajó con tres concentraciones diferentes de MgCl2siendo estas: 1.5, 2.5 y
3 mM, utilizando el coctel de PCR descrito por Morrillo & Miño (2011),
detallado a continuación en la tabla 3.1.
Tabla 3.1: Volúmenes de reactivos para una reacción de PCR, variando la
concentración de MgCl2
MIX PCR Ci Cf VOL. 1 Rx
(µL)
Agua
2.6
Buffer PCR (X) 10 1
1
MgCl2 (mM) 50 [1.5], [2.5] ,[3]
0.6
dNTP's (mM) 2.5 0.1
0.4
Primer (µM) 10 0.2
0.2
Taq casera (U/ µL) 5 0.1
0.2
Muestra (ng/ µL) 5 2.5
5
Volumen de reacción (µL) 10
ng de ADN por Rx 25
Ci= concentración inicial, Cf = concentración final
40
Se obtuvo una mejor definición de bandas utilizando la concentración
de MgCl2: 1.5 mM. Una vez determinada la concentración idónea de
MgCl2
se procedió a pasar los primers que presentaron un mayor número
de bandas siendo estos: 841, 853, 857, 17899A y 17899B (figura 3.6).
Figura 3.6: Amplificación de los primers ISSRs 853, 857 utilizando la
concentración de MgCl2 de 1.5mM.
3.5.2 Temperatura de alineamiento
Las condiciones de temperatura para la amplificación de los 10 ISSRs
se mantuvieron según el programa de PCR para ISSRs detallado en la (tabla
2. 4). En el caso del primer 840, se probaron cuatro temperaturas 37 ºC, 42
ºC, 47 ºC y 52 ºC (figura 3.7), de las cuales se observó que a 52 ° C resultó
ser la temperatura más idónea al conseguir una mejor definición de banda.
Figura 3.7: Amplificación de ADN de guayacán con el ISSR 840 utilizando
diferentes temperaturas de alineamiento.
41
3.6 Amplificación de ADN de guayacán (T. billbergii) mediante los
primers ISSR seleccionados.
Luego de haber comprobado las condiciones de PCR para cada primer
se procedió a la amplificación de los 10 primers ISSR seleccionados con los
214 ADNs de guayacán (T. billbergii). Los productos amplificados con los
primers se muestran en el anexo 5 y a continuación dos de ellos (figura 3.8).
Figura 3.8: Electroforesis en gel de agarosa al 1.5% de productos
amplificados con los primers: a) 841 b) 17899A c) HB12 d) 840 e) 824.
42
c)
d)
e)
Figura 3.8: Electroforesis en gel de agarosa al 1.5% de productos
amplificados con los primers: c) HB12 d) 840 e) 824.
43
Las fotografías de los geles fueron analizados en el programa
PhotoCaptMw que es un asistente de lectura de imágenes. Los datos
obtenidos se utilizaron para determinar el nivel de polimorfismo presente
teniendo como variable al número de alelos por locus. Se tomó como
referencia los pesos moleculares de cada banda del marcador 1Kb plus DNA
Ladder Marker INVITROGEN® para determinar el peso de las bandas
amplificadas. Se realizó una matriz de pesos moleculares con los 10
marcadores ISSRs y otra matriz con los datos en código binarios siendo la
presencia igual a 1 y la ausencia igual a 0 (Shen et al., 2006). La matriz
obtenida fue compatible para ser utilizada en diversos programas
bioestadísticos para el análisis de diversidad genética.
3.7 Análisis de datos
3.7.1 Diversidad genética
Para el análisis de diversidad genética de los 214 genotipos de
guayacán (T. billbergii) para los 10 marcadores ISSR se elaboró una matriz
genotípica que se muestra (anexo7). Se detectaron 49 alelos con un promedio
de 4.9 alelos/loci, el rango de longitud para los alelos fue de 430 a 2105 pb.
Con ayuda del software GenALEx versión 6.5 (Peakall et al., 2012),
se obtuvo las frecuencias alélicas de las cinco poblaciones de T. billbergii,
que estuvieron en el rango de 0.010 para los alelos de 989pb y 1408pb para
los loci ISSR900 y HB12, hasta el valor de 1 para los alelos de 650pb y
770pb para el locus ISSR840, 1015pb, 1065pb y 1276pb para los loci,
ISSR853, ISSR824 y 17899A respectivamente. El mayor número de alelos
reportados fue 8 para el loci 17899A, mientras que el loci ISSR857 presentó
el menor número que fue de 3 alelos. En el anexo 8 y tabla 3.2 se detalla las
frecuencias alélicas para cada uno de los loci.
44
Tabla 3.2: Alelos registrados con sus respectivas frecuencias en 5
poblaciones de guayacán con 10 primer ISSRs.
Locus
Tamaño
encontrado
(pb)
Frecuencia
(Loja)
Mangahurco
(Guayas)
Isla Puná
(Loja)
Cazaderos
(El Oro)
La Cuca
(Loja)
Garza
Real
ISSR
824
1368 0.322 0.491 0.650 0.900 0.400
1237 0.455 0.453 0.150 0.200 0.300
1065 0.975 1.000 1.000 1.000 1.000
950 0.099 0.321 0.300 0.200 0.200
ISSR
853
1627 0.372 0.358 0.300 0.800 0.800
1444 0.446 0.245 0.250 0.800 0.400
1015 0.793 0.868 1.000 0.800 1.000
950 0.017 0.300 0.020 0.300 0.010
ISSR
841
704 0.884 0.962 0.800 0.300 0.100
606 0.901 0.962 0.900 0.800 0.600
508 0.132 0.264 0.350 0.800 0.800
453 0.777 0.679 0.800 0.050 0.200
ISSR
HB14
1676 0.074 0.060 0.150 0.200 0.020
1325 0.215 0.302 0.200 0.050 0.040
952 0.603 0.792 0.950 0.700 0.800
615 0.380 0.811 0.800 1.000 0.600
ISSR
840
1384 0.182 0.038 0.200 0.400 0.200
1220 0.545 0.981 0.850 0.200 0.300
960 0.355 0.434 0.450 0.200 0.400
770 0.744 0.283 0.400 0.600 1.000
650 0.868 1.000 1.000 1.000 1.000
562 0.446 0.774 0.550 0.100 0.800
ISSR
857
1375 0.496 0.377 0.550 0.600 1.000
950 0.314 0.132 0.150 0.400 0.900
524 0.025 0.100 0.100 0.300 0.040
ISSR
900
1680 0.240 0.245 0.100 0.400 0.030
1329 0.132 0.132 0.200 0.400 0.100
1080 0.413 0.151 0.650 0.800 0.900
989 0.017 0.020 0.010 0.030 0.040
920 0.025 0.040 0.040 0.400 0.200
850 0.058 0.010 0.020 0.030 0.300
ISSR
17899A
1734 0.041 0.100 0.030 0.200 0.040
1559 0.975 0.981 0.900 0.800 0.800
Continúa
45
1276 0.959 1.000 1.000 1.000 0.900
1142 0.967 0.962 0.900 0.100 0.300
1074 0.017 0.038 0.050 0.300 0.030
978 0.545 0.472 0.700 0.020 0.020
727 0.769 0.736 0.800 0.020 0.100
650 0.107 0.415 0.250 0.030 0.030
ISSR
17899B
1178 0.198 0.321 0.600 0.100 0.400
650 0.099 0.472 0.350 0.300 0.020
550 0.521 0.604 0.200 0.400 0.700
500 0.496 0.604 0.100 0.400 0.700
430 0.372 0.642 0.020 0.020 0.050
ISSR
HB12
2105 0.521 0.434 0.600 0.700 0.500
1408 0.099 0.113 0.010 0.200 0.100
966 0.570 0.774 0.600 0.700 0.700
874 0.826 0.623 0.700 0.700 0.700
739 0.339 0.226 0.300 0.500 0.600
En la tabla 3.3 y figura 3.9 se ilustra algunos parámetros de diversidad
genética realizados en el software GenALEx versión 6.5 (Peakall et al.,
2012). Como: el índice de información de Shannon que tuvo su valor máximo
de 0.455 para la población de Mangahurco y el mínimo de 0.326 para la
población de Garza Real con un promedio de 0.39. Asimismo se pudo
evidenciar que la población de Mangahurco presentó el mayor valor del
porcentaje de polimorfismo y diversidad siendo: 100% y 0.300
respectivamente, mientras que la población de Garza Real presentó el valor
más bajo de 61.22% y 0.217.
46
Tabla 3.3: Análisis de diversidad genética en 5 poblaciones de Tabebuia
billbergii provenientes de las localidades de las provincias de Loja, Guayas y
El Oro de los bosques secos del Ecuador.
Población N Na Na Freq.
> =5% Ne I h %P
Mangahurco 121 2.000 1.79 1.514 0.455 0.300 100
Isla Puná 53 1.796 1.65 1.466 0.402 0.269 79.59
Cazaderos 20 1.735 1.73 1.429 0.386 0.256 73.47
Garza Real 10 1.694 1.69 1.427 0.381 0.255 69.39
La Cuca 10 1.612 1.61 1.364 0.326 0.217 61.22
Promedio
1.77 1.69 1.44 0.39 0.26 76.73
N= número de Individuos. Na = número de alelos diferentes. Ne = número
de alelos efectivos. I = índice de información de Shannon's. h = diversidad.
%P = porcentaje de polimorfismo.
Figura 3.9: Análisis comparativo de los índices de diversidad genética de las
cinco poblaciones de guayacán (Tabebuia billbergii).
47
También se uso el programa en línea Polymorphic Information
Calculator (Nagy et al., 2012), para determinar el Contenido de Información
de Polimorfismo (PIC) y la heterocigosis esperada con diez marcadores
ISSRs detallado en la tabla 3.4. El índice de diversidad genética de Nei o
heterocigosidad esperada presentó un valor promedio en toda la población de
0.50, su valor máximo fue de 0.53 para los marcadores: 17899A, ISSR824,
ISSR840 y el mínimo de 0.27 con el marcador ISSR900. El valor del
contenido de información de polimorfismo (PIC), asimismo fue el más alto
para los marcadores: 17899A, ISSR824, ISSR840 con un valor de 0.50 y un
mínimo de 0.24 para el ISSR900, mientras que el promedio para toda la
población fue de 0.46.
Tabla 3.4: Análisis de diversidad genética de la población de guayacán
(Tabebuia billbergii) con 10 primer ISSRs.
Primer Secuencia (5’-3’) NBT NBP He PIC
17899A CACACACACACAAG 9 8 0.53 0.50
17899B CACACACACACAGG 11 5 0.36 0.33
HB12 CACCACCACGC 8 5 0.37 0.34
HB14 CTCCTCCTCGC 9 4 0.51 0.47
824 TCTCTCTCTCTCTCTCG 8 4 0.53 0.50
840 GAGAGAGAGAGAGAGAYT 8 6 0.53 0.50
841 GAGAGAGAGAGAGAGAYC 10 4 0.47 0.44
853 TCTCTCTCTCTCTCTCRT 5 4 0.51 0.49
857 ACACACACACACACACYG 6
3 0.44 0.40
900 ACTTCCCCACAGGTTAACACA 10 6 0.27 0.24
PROMEDIO 8.4 4.9 0.50 0.46
NBT= número de bandas totales. NBP= número de bandas polimórficas.
He= heterocigosidad esperada o diversidad genética de Nei (1973). PIC=
Contenido de Información de Polimorfismo. (Y = T C, R = G A).
48
3.7.2 Análisis de agrupamiento
El análisis UPGMA agrupa a los individuos en forma aglomerativa y
jerárquica en base a promedios de similaridad, como resultado de ello se
obtiene una representación gráfica o dendograma.
Usando el programa NTSYSpc versión 2.02 se generó el dendograma
para los 214 genotipos de guayacán con el coeficiente de asociación o
similitud Jaccard. En el dendograma se pudo distinguir que los agrupamientos
de los genotipos no coinciden de acuerdo al lugar de su proveniencia ya que
los genotipos se distribuyeron indistintamente.
El análisis del dendograma muestra 2 grandes grupos, denominados A
y B, conformados por varios subgrupos, se escogió un valor de similitud de
0.40 para resolver los agrupamientos, los cuales se incluyen en la (figura
3.10). El grupo A, reúne a los subgrupos conformado por los genotipos de las
poblaciones de (Mangahurco, Isla Puná y Cazaderos); La población de
Mangahurco está presente en un 90.08%, así también, los genotipos de la
población de la Isla Puná están presentes en un 100%, y los genotipos
pertenecientes a Cazaderos presentaron un 100%. Dentro del grupo B pueden
distinguirse subgrupos constituidos por los genotipos pertenecientes a las
poblaciones de La Cuca, Garza Real y Mangahurco en un 100%, 80% y
7.45% respectivamente.
Además, ciertos genotipos están en forma aislada de los grupos A y
B, siendo: los genotipos (241 y 242) partieron de un valor de similitud de
0.74, mientras que los genotipos (152 y 165) partieron de 0.77 y el genotipo
(11) partió de un valor de similitud de 0.36, estos genotipos pertenecen a las
poblaciones de Garza Real y Mangahurco. Los grupos que presentaron una
mayor connotación en agrupación fueron los de las poblaciones de
Mangahurco y la Isla Puná ya que tuvieron el mayor número de genotipos de
la población de guayacán siendo de 121 y 53 respectivamente.
49
Figura 3.10: Dendograma para los 214 genotipos de guayacán con el
coeficiente de similitud Jaccard, realizado en el programa NTSYS.pc versión
2.02. Representación de los grupos A y B, los que estan conformados por las
5 poblaciones de guayacán.
50
3.7.3 Análisis de coordenadas principales
Se realizó un análisis de ACoP en el programa NTSYS.pc versión
2.02 basado en la matriz binaria a partir de las similaridades obtenidas con el
coeficiente de Jaccard, el cual permite conocer las agrupaciones que tienen
los genotipos en un espacio bidimensional (figura 3.11). Se obtuvo el grafico
que representa los genotipos de las cinco poblaciones de guayacán (Tabebuia
billbergii) las cuales se distribuyeron indistintamente a lo largo del plano de
variación.
Figura 3.11: Distribución en dos dimensiones de los 214 individuos de
Tabebuia billbergii mediante el análisis de coordenadas principales (ACoP)
en el programa NTSYS pc. 2.02 basado en el coeficiente de similaridad de
Jaccard.
A partir de la matriz binaria (anexo 7) y mediante el coeficiente de
similitud de Jaccard en el programa NTSYS pc.versión 2.02, se obtuvo los
ejes de variabilidad de los genotipos con respectó a su ordenación en el
51
espacio, en donde se muestra los valores “Eigen” que indican el porcentaje
individual y el porcentaje acumulado de la variabilidad de cada una de las
coordenadas obtenidas. El análisis determinó tres coordenadas principales en
donde la tercera coordenada presentó el valor más alto de 20.79% de la
varianza total, las coordenadas 1 y 2 presentaron un porcentaje de varianza de
8.53% y 6.35% respectivamente (tabla 3.5).
Tabla 3.5: Valores Eigen, porcentaje individual y acumulativo de la varianza
por coordenada principal del ACoP de 214 genotipos de guayacán con 10
primers ISSRs.
Coordenada Valores Eigen Porcentaje
individual
Porcentaje
acumulado
1 4.83 8.53 8.53
2 3.59 6.35 14.88
3 3.35 5.91 20.79
También se realizó el análisis de coordenadas principales (ACoP) en
el programa MULTBIPLOT y se obtuvo los gráficos que representan los
genotipos de las cinco poblaciones de guayacán (Tabebuia billbergii) en
donde no se diferenció agrupamientos de los genotipos de acuerdo al lugar de
su proveniencia, ya que se distribuyeron indistintamente a lo largo del plano
de variación representado (figura 3.12).
En este análisis se puede distinguir que las poblaciones de la Isla
Puná, Garza Real y La Cuca son las más alejadas entre sí, ya que, la
distribución de los genotipos de la Isla Puná presentan una mayor agrupación
en el segundo y tercer cuadrante del plano de variación, mientras que los
genotipos de La Cuca y Garza Real se agrupan en el primer y cuarto
cuadrante. Además las poblaciones de Mangahurco, Isla Puná y Cazaderos
son más cercanas entre sí, presentando sus genotipos distribuidos en los
cuatro cuadrantes del plano de variación.
53
d)
e)
Figura 3.12: Distribución en dos dimensiones de las 5 poblaciones de
Tabebuia billbergii: a) genotipos de Mangahurco, b) genotipos de la Isla Puná,
c) genotipos de Cazaderos, d) genotipos de La Cuca e) genotipos de Garza
Real, mediante el análisis de coordenadas principales (ACoP) en el programa
MULTBIPLOT basado en el coeficientes de similaridad de Jaccard.
54
3.7.4 Análisis molecular de varianza
En el análisis molecular de varianza (AMOVA) se obtuvo un índice de
diferenciación genética (Φst) de 0.112 entre las 5 poblaciones de guayacán
(Mangahurco, Isla Puná, Cazaderos, Garza Real y La Cuca). Se determinó que el
11% de la diversidad aporta a la diferenciación entre las poblaciones mientras
que el 89% de la varianza está presente en cada una de las poblaciones, es decir,
la varianza genética está distribuida heterogéneamente de tal manera que la
mayor parte de la diversidad se encuentra dentro de cada población detallado
(figura 3.13 y tabla 3.6).
Figura 3.13: Porcentaje de varianza molecular de 5 poblaciones de guayacán:
Mangahurco, Isla Puná, Cazaderos, Garza Real y La Cuca.
Tabla 3.6. Análisis molecular de varianza de de 5 poblaciones de guayacán:
Mangahurco, Isla Puná, Cazaderos, Garza Real y La Cuca, analizadas con 10
primers ISSR.
C
o
n
e
l
Origen de
la
variación
g.l. Suma de
cuadrados
Promedio de
cuadrados
Componente de
varianza
% variación
genética Φst
Entre
poblaciones 4 28.895 7.224 0.179 11% 0.000
Dentro de
cada
población
209 295.521 1.414 1.414 89% 0.112
Total 213 324.416
1.593 100%
55
Con el objetivo de robustecer el análisis de coordenadas principales y
los resultados del análisis molecular de varianza, se efectuaron análisis de
varianza entre las poblaciones de guayacán más alejadas (Isla Puná, Garza
Real y La Cuca) y más cercanas (Mangahurco, Isla Puná y Cazaderos) del
origen del plano de variación.
El resultado de las poblaciones más alejadas (Isla Puná, Garza Real y
La Cuca) dió un porcentaje de variación del (28%) entre poblaciones, se
evidenció que la fuente de variación fue dentro de cada población con el
(72%) (figura 3.14 y tabla 3.7), esto explica gran parte la variación dentro de
las poblaciones detectado en el análisis molecular de varianza para las cinco
poblaciones de guayacán.
Figura 3.14: Porcentaje de varianza molecular de 3 poblaciones lejanas
de guayacán: Isla Puná, Garza Real y La Cuca.
56
Tabla 3.7. Análisis molecular de varianza de las poblaciones más alejadas
según el ACoP como lo son Isla Puná, Garza Real y La Cuca, analizadas con
10 primers ISSR.
El resultado para las poblaciones más cercanas (Mangahurco, Isla
Puná y Cazaderos) fue mayor la fuente de variación dentro de las poblaciones
con un 91%, que la existente entre las poblaciones con un 9% de variación
(figura 3.15 y tabla 3.8).
Figura 3.15: Porcentaje de varianza molecular de 3 poblaciones cercanas
de guayacán que son Mangahurco, Isla Puná y Cazaderos.
Origen de
la
variación
g.l. Suma de
cuadrados
Promedio de
cuadrados
Componente de
varianza
% variación
genética Φst
Entre
poblaciones 2 92,137 46,068 2,495 28% 0.000
Dentro de
cada
población 70 449,726 6,425 6,425 72% 0.280
Total 72 541,863
8,919 100%
57
Tabla 3.8. Análisis molecular de varianza de las poblaciones más cercanas
según el ACoP que son Mangahurco, Isla Puná y Cazaderos, analizadas con 10
primers ISSR.
2.7.5 Distancia Genética de Nei
La tabla 3.9 muestra las distancias genéticas de Nei entre las cinco
poblaciones de guayacán (T. billbergii). Se observó que el valor más bajo se
encuentra entre la relación de la población de Mangahurco e Isla Puná
(D=0.044) mientras que el valor más alto corresponde a la población de la
Isla Puná y La Cuca (D=0.215). Por los valores obtenidos menores a 0.15 se
aprecia que las poblaciones están muy relacionadas entre ellas.
Tabla 3.9: Distancia de Nei (1978) calculadas en 214 genotipos de guayacán
analizados con 10 primers ISSRs.
Mangahurco Isla
Puná Cazaderos La Cuca
Garza
Real
0.000
Mangahurco
0.044 0.000
Isla Puná
0.053 0.053 0.000
Cazaderos
0.163 0.215 0.168 0.000
La Cuca
0.136 0.192 0.164 0.078 0.000 Garza Real
Origen de
la
variación
g.l. Suma de
cuadrados
Promedio de
cuadrados
Componente de
varianza
% variación
genética Φst
Entre
poblaciones 2 83,712 41,856 0,681 9% 0.000
Dentro de
cada
población 191 1363,700 7,140 7,140 91% 0.087
Total 193 1447,412
7,821 100%
58
CAPITULO IV
DISCUSIÓN
4.1 Extraccion y calidad del ADN genómico
Hoy en día existen varios protocolos de extracción de ADN vegetal en
donde se requiere el aislamiento de ADN de buena calidad y de alto peso
molecular ya que este proceso no es siempre simple debido a que un gran
número de plantas producen metabolitos secundarios tales como fenoles,
alcaloides, polisacáridos, flavonoides, quininas y nucleasas que dificultan su
aislamiento. Además ciertos protocolos de extracción de ADN no son siempre
reproducibles para cualquier especie, ya que no se cuenta con un protocolo
específico y establecido para cada especie como es el caso de Tabebuia
billbergii (Khanuja, et al., 1999; Fellers, et al., 2002; Chen y Ronald, 1999).
Al analizar los resultados de los cuatro protocolos de extracción de
ADN que se realizaron en este estudio se escogió el protocolo de Mariac et
al., (1999) adaptado por Morillo (2002), con el que se obtuvo la mayor
calidad y cantidad de ADN al revelar bandas nítidas de alto peso molecular
y sin degradación. La concentración promedio de la población de guayacán
fue de 568.67 ng/μl y la pureza promedio fue de 1.81 encontrándose dentro de
los parámetros aceptables de pureza de ADN a aquellas que se encuentren
entre 1.7 y 1.9 mientras que valores superiores a este rango indican
contaminación por sales y los inferiores a interferencias de proteínas, fenol y
otros compuestos aromáticos (Touil et al., 2008).
La mayor concentración de ADN puede deberse a que este protocolo
emplea dos buffer uno de extracción y otro de lisis, el buffer de lisis contiene
porcentajes altos de CTAB (bromuro de cetil trimetil amonio) siendo 4%
mayor que la usada en los diferentes protocolos (Graham, 1993; Ferreira &
Grattapaglia, 1998 y Alzate-Marin, 2009), este reactivo solubiliza los lípidos
de la membrana aumentando así la lisis celular lo que permitió la degradación
59
de moléculas de fenol y proteínas. Otro factor fue el tiempo de incubación
que fue de dos horas el que permitió una mayor acción de los compuestos de
la buffer de lisis con la muestra.
La calidad del ADN extraído se aseguró mediante la resuspensión del
pellet en la solución TE y RNAsa, además de su refrigeración a - 20 °C. La
solución TE contiene EDTA el cual es un quelante de iones magnesio e
inhibidor de las DNAsas debido a que el ión Magnesio es un cofactor para su
actividad evitando que las DNAsas presentes actúen sobre el ADN
(Lehninger, 1981). La RNAsa son enzimas que degradan secuencias de RNA
evitando así que actúen sobre el ADN. (Somma, 2002).
4.2 Amplificación de fragmentos de ADN mediante primers ISSRs
Las condiciones de temperatura de Annealing para la amplificación
de los 10 ISSRs se mantuvieron según el programa de PCR para ISSRs
descrito por Morrillo & Miño (2011). Solo en el caso del primer 840, se
probaron cuatro temperaturas de Annealing siendo estas 37 ºC. 42 ºC. 47 ºC y
52 ºC, de las cuales se pudo observar que a 52°C resultó ser la temperatura
más idónea al conseguir una mejor resolución y definición de bandas.
En la estandarización de la concentración de MgCl2
se tomó en
consideración el patrón de bandas en busca de una mejor definición de las
bandas para lo cual se realizó ensayos con tres concentraciones diferentes de
MgCl2siendo estas 1.5. 2.5 y 3 mM, en donde se obtuvo una mejor definición
de bandas con la concentración de MgCl2de 1.5 mM. En estudios realizados
por Shen et al., (2006). Prevost & Wilkinson (1999) y Casasoli et al., (2001)
recomiendan utilizar concentraciones de 1.2 mM a 1.8 mM de MgCl2; además
la reducción de concentraciones de MgCl2
evita la generación de una gran
cantidad de bandas poco intensas e inespecíficas en la amplificación, debido a
que el MgCl2
es un cofactor de la DNA polimerasa y al disminuir la
60
concentración del cofactor se evita una exagera actividad de la enzima la cual
puede ser inespecífica (Rickwood & Homes. 1995).
4.3 Análisis de diversidad genética
El estudio de la diversidad genética en las cinco poblaciones del
guayacán (Tabebuia billbergii) es abordado a través de la determinación de
las frecuencias alélicas sobre un número de marcadores polimórficos y el
empleó de medidas basadas en estas frecuencias como: el contenido de
información polimórfica (PIC), el porcentaje de polimorfismo y el índice de
diversidad genética de Nei o heterocigosidad esperada (He) (Weising et al.,
2005).
La presente investigación es una de las pioneras en el estudio de
diversidad genética de la especie endémica Tabebuia billbergii en los
bosques secos del Ecuador, por lo que es considerada como un estudio guía,
del cual se obtuvo algunos parámetros de diversidad genética como: el
contenido de información polimórfica (PIC) y el índice de diversidad
genética de Nei o heterocigosidad esperada con valores promedio de 0.46 y
0.50 respectivamente. Para cotejar los resultados obtenidos de PIC y He se
tomó con guía estudios realizados en otras especies del género Tabebuia,
como por ejemplo: En un estudio realizado en la especie Tabebuia rosea con
microsatélites en Colombia, se reportó un índice de polimorfismo (PIC)
promedio de 0.60 y un índice de diversidad genética promedio de 0.64
(López et al., 2015). En otro estudio de caracterización molecular con
microsatélites desarrollados para Tabebuia aurea en Brasil, obtuvieron un
índice de diversidad genética o heterocigosidad promedio de 0.91 (Braga et
al., 2006), mientras que según Silva (2011) para la misma especie reporto un
índice de diversidad genética promedio de 0.95.
Con estos estudios realizados en diferentes especies del género
Tabebuia se puede apreciar que los valores del contenido de información
61
polimórfica (PIC) y el índice de diversidad genética de Nei o heterocigosidad
esperada, variaron aún cuando se trabajó con microsatélites demostrando que
cada especie tiene sus características genotípicas diferentes del resto, aún así
cuando puedan presentar un antepasado en común.
Según González et al., (2005) & Pérez de la Torre et al., (2010), el
nivel de polimorfismo detectado por los ISSR, depende tanto del tipo de
secuencia repetitiva incorporada al iniciador utilizado para generar los
productos de amplificación, así como de la especie vegetal a ser analizada.
Según Pradeep et al., (2002) los iniciadores con motivos poli con
repeticiones (AG), (GA), (CT), (TC), (AC) y (CA), generan en promedio
mayor número de bandas y mayor polimorfismo que otros iniciadores di, tri o
tetranucleótidos con diferentes motivos. Los resultados del análisis de
diversidad genética obtenido revelaron que los marcadores ISSR 824, ISSR
840 y 17899A con motivos poli (TC), (GA) y (CA) respectivamente,
obtuvieron los mayores valores de PIC que fueron de 0.50 y el índice de
diversidad genética fue de 0.53. Estos resultados podrían llegar a explicarse
debido a que los iniciadores anclados en el extremo 5’ incluyen en su
producto de amplificación la secuencia completa del microsatélite y dado que
su longitud varía a lo largo de todo el genoma, es esperable encontrar un
mayor número de bandas y mayor grado de polimorfismo (Pradeep et al.,
2002).
Además, según Botstein et al., (1980) menciona que el contenido de
información polimórfica (PIC), indica la calidad del marcador y que el valor
PIC va desde (0 = Perfil monomórficos) a (1= perfil altamente polimórfico);
por lo que, marcadores con valores PIC superior a 0.5 se consideran muy
informativos, mientras que los valores entre 0.25 y 0.50 indican un nivel
informativo moderado y los valores menores de 0.25 se consideran poco
informativos. Razón por la que los resultados obtenidos indican que los
marcadores ISSR 824, ISSR 840 y 17899A mostraron un nivel informativo
62
moderado de diversidad genética presente en la población de tabebuia
billbergii.
También, se encontró una mayor diversidad alélica o porcentaje de
polimorfismo en la población de Mangahurco (Loja) con 100 %, demostrando
que la población presenta los 49 alelos establecidos para este estudio, además
de que posee el mayor número de individuos, seguida de la población de la
Isla Puná (Guayas) que obtuvo un 79.59% y posteriormente las poblaciones
de Cazaderos y Garza Real (Loja) con 73.47% y 69.39% respectivamente,
mientras que la población La Cuca (El Oro) presentó el menor porcentaje de
polimorfismo que fue de 61.22%.
4.4 Análisis de agrupamiento
Al realizar el dendograma UPGMA con los datos moleculares, usando
el coeficiente de similitud de Jaccard, se observó que los genotipos se
distribuyeron indistintamente y no de acuerdo a su distribución geográfica, es
decir, que genotipos de regiones distantes pueden ser genéticamente muy
próximos. El análisis del dendograma mostró 2 grandes grupos (con un valor
de similitud de 0.40). El primer grupo denominado (A), reúne a los subgrupos
conformado por los genotipos de las poblaciones de (Mangahurco, Isla Puná
y Cazaderos); La población de Mangahurco está presente en este grupo en un
90.08%, los genotipos de las poblaciones de la Isla Puná y Cazaderos
presentaron igual porcentaje que fue de 100% para cada uno. Dentro del
segundo grupo (B) pueden distinguirse subgrupos constituidos por los
genotipos pertenecientes a las poblaciones de La Cuca, Garza Real y
Mangahurco con: 100%, 80% y 7.45% respectivamente.
Además los resultados obtenidos del dendograma revelaron que cinco
individuos están en forma aislada de los grupos A y B, revelando que sus
genotipos pueden ser diferentes del resto de la población. Gentry (1992)
menciona, que la especie T. billbergii presenta dos subespecies conocidas
como T. billbergii–billbergii y T. billbergii-ampla, lo que explicaría el
63
porqué ciertos individuos están aislados, ya que pueden pertenecer a una de
estas subespecies. Según, Gentry (1992) indica que la subespecie T. billbergii
ampla está presente en las provincias de Guayas y El Oro. Además se conoce
que el guayacán T. billbergii está presente en las provincias de Manabí,
Guayas y Loja (Aguirre, 2006; Aguirre, 2012; Brack & Mendiola, 2004;
Jorgense & León 1999).
4.5 Análisis de coordenadas principales
También con los resultados del análisis de coordenadas principales se
puede afirmar que los individuos se distribuyeron indistintamente a lo largo
del plano de variación y no de acuerdo a su distribución geográfica sino más
bien por características genotípicas que presentó la especie T. billbergii.
En los agrupamientos realizados se observó que los individuos de las
poblaciones de Garza Real (Loja) y La Cuca (El Oro) se encuentran muy
cercanos entre sí, pero separados del resto de individuos de las otras
poblaciones, esto puede deberse a que las características fenotípicas de estas
dos poblaciones son muy similares a diferencia del resto de la población de
guayacán (T. billbergii).
La distribución de los individuos de poblaciones alejadas del origen
del plano de variación como: Garza Real, Isla Puná y La Cuca presentaron el
28% de la diversidad genética aportada a la diferenciación entre las
poblaciones, mientras que el 72% de la diversidad se encuentra en cada
población. Mientras que en poblaciones que se encuentran muy cercanas
según el ACoP como: Mangahurco, Isla Puná y Cazaderos, presentaron el
9% de diversidad genética entre las poblaciones, mientras que el 91% de la
diversidad genética está dentro de las poblaciones.
No se descarta la existencia del flujo de genes entre las poblaciones de
guayacán, debido a que, usualmente las semillas son esparcidas por aves,
ganado y hasta el hombre, ya que, el guayacán (Tabebuia billbergii) se ha
64
caracterizado por poseer una madera dura y resistente al ataque de termitas y
al agua salada, representando un gran interés en la industria comercial
(Rodríguez et al., 1991).
4.6 Análisis molecular de varianza
El análisis de varianza molecular (AMOVA) realizado para examinar
las diferencias existentes en las poblaciones, con el valor significativo (Φst
=0,112), indica que la mayor diversidad genética se debió a la variabilidad
existente dentro de las cinco poblaciones con un (89%) y el 11% corresponde
a la variabilidad existente entre poblaciones. Estos resultados indican la
diferenciación genética dentro de las cinco poblaciones, revelando la
homogeneidad de las poblaciones en estudio. De acuerdo a Salhi-Hannachi et
al., (2005), la baja diversidad entre las poblaciones y la gran variabilidad
detectada dentro las mismas podrían estar explicadas por la ocurrencia del
flujo génico en poblaciones naturales de las cuales se originaron estas
poblaciones o bien pudieran tener un origen común.
El AMOVA distribuyó la variación observada en componentes dentro
y entre poblaciones usando distancias genéticas. El componente de varianza
entre las poblaciones es llamada Φst, y es un análogo de Fst y θ. Este método
no fue originalmente diseñado para analizar datos estrictamente dominantes
como los RAPD, AFLP o ISSR, y ciertamente se deben considerar los datos
como haplotipos moleculares. El resultado obtenido del componente de
varianza Φst fue estimado en 0.112, lo que según De Vicente et al., (2004)
indica que las poblaciones analizadas no difieren considerablemente, ya que a
un mayor valor de Fst de 0,25 el flujo génico entre las poblaciones será
mayor.
65
CAPITULO V
CONCLUSIONES
Se realizó las prospecciones en los bosques secos del Ecuador en donde se
estableció cinco poblaciones representativas para la especie Tabebuia
billbergii, siendo estas: Mangahurco, Isla Puná, Cazaderos, Garza Real y
La Cuca.
Los análisis de diversidad genética mostraron que al utilizar 10
marcadores ISSR en 214 genotipo de guayacán Tabebuia billbergii fue
posible detectar el valor promedio del contenido de información
polimórfica (PIC) de 0.46 y el índice de diversidad genética de Nei o
heterocigosidad esperada con el valor promedio de 0.50
Se determinó el contenido de información polimórfica (PIC) y el índice de
diversidad genética de Nei o heterocigosidad esperada (He) en la
población de Tabebuia billbergii, en donde los marcadores: ISSR824,
ISSR840 y 17899A presentaron un nivel informativo moderado de
diversidad genética, ya que presentaron los mismos resultados tanto para el
PIC que fue 0.50 y He de 0.53.
Se determinó que la población de Mangahurco (Loja) presentó la mayor
diversidad alélica o porcentaje de polimorfismo con el 100 %, mientras
que la población La Cuca (El Oro) tiene la menor diversidad alélica con el
61.22%. Estos resultados pueden ser influenciados por el número de
individuos que presentó cada población ya que Mangahurco posee el
mayor número de individuos a diferencia de La Cuca.
66
Se determinó mediante el análisis de coordenadas principales y
agrupamiento, que los individuos no se distribuyeron de acuerdo a su
localidad geográfica, sino por características genotípicas que presentó la
especie Tabebuia billbergii.
El análisis molecular de varianza nos muestra que la contribución a la
mayor diversidad genética se debió a las diferencias dentro de cada
población, sin embargo los resultados obtenidos entre las poblaciones nos
indican cuán diferenciados se encuentran los genotipos, presentando un
nivel moderado de diversidad genética.
67
CAPITULO VI
RECOMENDACIONES
Se recomienda realizar un estudio morfológico que permita confirmar, la
especie con la que se está trabajando. Ya que la especie T. billbergii, según
Gentry (1992) presenta dos subespecies conocidas como T. billbergii–
billbergii y T. billbergii-ampla y en este tipo de estudio esto puede
perturbar la interpretación de los resultados.
Las bandas amplificadas con los marcadores ISSRs de la presente
investigación podrían ser usadas para desarrollar microsatélites específicos
para la especie Tabebuia billbergii los mismos que, podrían relacionarlos
en un futuro con caracteres morfológicos deseados
En los ensayos de amplificación, es importante usar un mayor número de
primers tanto para marcadores dominantes como codominantes, lo cual
podría ayudar a detectar una mayor cantidad de variación a lo largo del
genoma, permitiendo obtener resultados más consistentes.
68
CAPITULO VII
BIBLIOGRAFÍA
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81
ANEXOS
Anexo 1
Datos del material vegetal de T. billbergii spp que corresponde a las colectas
realizadas en localidades de las provincias de Loja (Mangahurco. Zapotillo.
Cazaderos). Guayas (Isla Puná) y El Oro (Arenillas).
Árbol Provincia Cantón Sitio
Altura Edad Altitud Coordenadas GPS
Especie Total
(m) (años) m.s.n.m. Latitud Longitud
1 Loja Zapotillo Mangahurco 29 200 354 562506 9540360 Tabebuia
billbergii
2 Loja Zapotillo Mangahurco 17 100 362 563682 9540860 Tabebuia
billbergii
5 Loja Zapotillo Mangahurco 20 80 331 563746 9538150 Tabebuia billbergii
6 Loja Zapotillo Mangahurco 30 200 314 563285 9539824 Tabebuia
billbergii
7 Loja Zapotillo Mangahurco 22 180 564 566474 9542902 Tabebuia
billbergii
9 Loja Zapotillo Mangahurco 18 50 453 565495 9541860 Tabebuia billbergii
11 Loja Zapotillo Mangahurco 24 200 513 565779 9543686 Tabebuia
billbergii
12 Loja Zapotillo Mangahurco 25 180 547 565822 9543948 Tabebuia
billbergii
13 Loja Zapotillo Mangahurco 30 170 646 565014 9545505 Tabebuia billbergii
14 Loja Zapotillo Mangahurco 25 80 646 565020 9545512 Tabebuia
billbergii
15 Loja Zapotillo Cazaderos 38 300 247 557599 9548336 Tabebuia
billbergii
17 Loja Zapotillo Cazaderos 35 250 240 558372 9551420 Tabebuia billbergii
18 Loja Zapotillo Cazaderos 17 100 232 558936 9552752 Tabebuia
billbergii
19 Loja Zapotillo Progreso 17 100 226 561093 9555078 Tabebuia
billbergii
20 Loja Zapotillo Progreso 15 50 274 563676 9555992 Tabebuia billbergii
23 Loja Zapotillo Zapotillo 14 80 381 583724 9528700 Tabebuia
billbergii
24 Loja Zapotillo Zapotillo 26 150 381 583347 9531542 Tabebuia
billbergii
37 Guayas Guayaquil Isla Puná
Agua Piedra 40 250 41
S 02° 46' 51.5''
W 80° 04' 49.3''
Tabebuia billbergii
38 Guayas Guayaquil Isla Puná
Agua Piedra 25 80 41
S 02° 46'
51.5''
W 80° 04'
49.3''
Tabebuia
billbergii
40 Guayas Guayaquil
Isla Puná
Campo Alegre
18 80 21 S 02° 47'
15.1''
W 80° 10'
53.3''
Tabebuia
billbergii
41 Guayas Guayaquil
Isla Puná
Campo
Alegre
5 60 21 S 02° 47'
15.1'' W 80° 10'
53.3'' Tabebuia billbergii
60 Loja Zapotillo Mangahurco 17 100 331 -4.14513 -80.43843 Tabebuia billbergii
61 Loja Zapotillo Mangahurco 20 100 359 -4.14734 -80.43992 Tabebuia
billbergii
62 Loja Zapotillo Mangahurco 20 80 323 -4.13499 -80.43976 Tabebuia
billbergii
63 Loja Zapotillo Mangahurco 20 80 351 -4.13466 -80.43622 Tabebuia
billbergii
Continúa
82
64 Loja Zapotillo Mangahurco 30 200 419 -4.12614 -80.43457 Tabebuia
billbergii
65 Loja Zapotillo Mangahurco 22 180 318 -4.12702 -80.44129 Tabebuia
billbergii
66 Loja Zapotillo Mangahurco 20 120 331 -4.12595 -80.44153 Tabebuia
billbergii
67 Loja Zapotillo Mangahurco 18 50 341 -4.14888 -80.43015 Tabebuia
billbergii
68 Loja Zapotillo Mangahurco 18 80 381 -4.15155 -80.42427 Tabebuia billbergii
69 Loja Zapotillo Mangahurco 24 200 363 -4.15091 -80.42294 Tabebuia billbergii
70 Loja Zapotillo Mangahurco 25 180 345 -4.15426 -8042637 Tabebuia
billbergii
71 Loja Zapotillo Mangahurco 30 170 337 -4.16048 -80.42787 Tabebuia
billbergii
72 Loja Zapotillo Mangahurco 25 80 440 -4.16705 -80.41523 Tabebuia
billbergii
73 Loja Zapotillo Mangahurco 38 300 427 -4.16615 -80.39061 Tabebuia
billbergii
74 Loja Zapotillo Mangahurco 9 50 336 -4.14617 -80.41804 Tabebuia billbergii
75 Loja Zapotillo Mangahurco 35 250 381 -4.14621 -80.41503 Tabebuia billbergii
76 Loja Zapotillo Mangahurco 17 100 515 -4.13668 -80.40402 Tabebuia
billbergii
77 Loja Zapotillo Mangahurco 17 100 491 -4.13527 -80.40220 Tabebuia
billbergii
78 Loja Zapotillo Mangahurco 15 50 706 -4.12580 -80.38107 Tabebuia
billbergii
79 Loja Zapotillo Mangahurco 16 80 447 -4.14200 -80.43112 Tabebuia
billbergii
80 Loja Zapotillo Mangahurco 10 50 623 -4.11438 -80.42173 Tabebuia billbergii
81 Loja Zapotillo Mangahurco 14 80 386 -4.15881 -80.42217 Tabebuia billbergii
82 Loja Zapotillo Mangahurco 26 150 467 -4.12080 -80.40729 Tabebuia
billbergii
83 Loja Zapotillo Mangahurco 25 50 492 -4.10839 -80.40102 Tabebuia
billbergii
84 Loja Zapotillo Mangahurco 17 100 618 -4.11455 -80.41543 Tabebuia
billbergii
85 Loja Zapotillo Mangahurco 17 100 644 -4.10962 -80.41760 Tabebuia
billbergii
86 Loja Zapotillo Cazaderos 15 50 241 -4.08103 -80.47330 Tabebuia billbergii
87 Loja Zapotillo Cazaderos 16 80 207 -3.99802 -80.39475 Tabebuia billbergii
88 Loja Zapotillo Cazaderos 10 50 182 -3.99438 -80.39560 Tabebuia
billbergii
89 Loja Zapotillo Cazaderos 14 80 180 -3.99125 -80.37583 Tabebuia
billbergii
90 Loja Zapotillo Cazaderos 26 150 169 -3.98543 -80.36174 Tabebuia
billbergii
91 Loja Zapotillo Cazaderos 18 100 200 -3.99799 -80.34353 Tabebuia
billbergii
101 Guayas Guayaquil Isla Puna Campo
Alegre
18 80 41 -2.78111 -80.08056 Tabebuia billbergii
102 Guayas Guayaquil Isla Puna Campo
Alegre
5 60 41 -2.78111 -80.08056 Tabebuia billbergii
103 Guayas Guayaquil Isla Puna
Campo
Alegre
20 80 43 -2.79067 -80.19222 Tabebuia
billbergii
104 Guayas Guayaquil Isla Puna
Campo
Alegre
18 60 43 -2.79086 -80.19214 Tabebuia
billbergii
105 Guayas Guayaquil Isla Puna
Campo Alegre
12 60 36 -2.79061 -80.19250 Tabebuia
billbergii
106 Guayas Guayaquil Isla Puna
Campo Alegre
7 20 33 -2.79061 -80.19253 Tabebuia
billbergii
107 Guayas Guayaquil Isla Puna Campo
Alegre
12 30 40 -2.79106 -80.19219 Tabebuia billbergii
108 Guayas Guayaquil Isla Puna Campo
Alegre
30 100 37 -2.79122 -80.19231 Tabebuia billbergii
109 Guayas Guayaquil Isla Puna
Campo
Alegre
40 250 37 -2.79122 -80.19231 Tabebuia
billbergii
110 Guayas Guayaquil Isla Puna
Campo
Alegre
12 30 31 -2.79122 -80.19222 Tabebuia
billbergii
111 Guayas Guayaquil Isla Puna
Campo Alegre
30 100 25 -2.79001 -80.09003 Tabebuia
billbergii
112 Guayas Guayaquil Isla Puna
Campo Alegre
40 250 29 -2.79014 -80.09019 Tabebuia
billbergii
Continúa
83
113 Guayas Guayaquil Isla Puna
Campo
Alegre
25 80 42 -2.79061 -80.08992 Tabebuia
billbergii
114 Guayas Guayaquil Isla Puna
Campo
Alegre
8 40 40 -2.79089 -80.08983 Tabebuia
billbergii
115 Guayas Guayaquil Isla Puna
Campo Alegre
18 80 36 -2.79097 -80.08969 Tabebuia
billbergii
116 Guayas Guayaquil Isla Puna
Campo Alegre
5 60 37 -2.79111 -80.08956 Tabebuia
billbergii
117 Guayas Guayaquil Isla Puna Campo
Alegre
5 60 35 -2.79067 -80.08911 Tabebuia billbergii
118 Guayas Guayaquil Isla Puna Campo
Alegre
20 80 42 -2.79072 -80.08894 Tabebuia billbergii
119 Guayas Guayaquil Isla Puna
Campo
Alegre
18 60 38 -2.79078 -80.08950 Tabebuia
billbergii
120 Guayas Guayaquil Isla Puna
Campo
Alegre
17 100 26 -2.74717 -80.07633 Tabebuia
billbergii
121 Guayas Guayaquil Isla Puna
Campo Alegre
20 100 26 -2.74689 -80.07631 Tabebuia
billbergii
122 Guayas Guayaquil Isla Puna
Campo Alegre
20 80 35 -2.74703 -80.07642 Tabebuia
billbergii
123 Guayas Guayaquil Isla Puna Campo
Alegre
20 80 35 -2.74703 -80.07642 Tabebuia billbergii
124 Guayas Guayaquil Isla Puna Campo
Alegre
30 200 33 -2.74722 -80.07667 Tabebuia billbergii
125 Guayas Guayaquil Isla Puna
Campo
Alegre
22 180 41 -2.74725 -80.07672 Tabebuia
billbergii
126 Guayas Guayaquil Isla Puna
Campo
Alegre
20 120 41 -2.74725 -80.07672 Tabebuia
billbergii
127 Guayas Guayaquil Isla Puna
Campo Alegre
18 50 49 -2.74753 -80.07644 Tabebuia
billbergii
128 Guayas Guayaquil Isla Puna
Campo Alegre
18 80 42 -2.74758 -80.07664 Tabebuia
billbergii
129 Guayas Guayaquil Isla Puna Campo
Alegre
24 200 42 -2.74758 -80.07664 Tabebuia billbergii
130 Guayas Guayaquil Isla Puna Campo
Alegre
25 180 14 -2.71494 -80.09383 Tabebuia billbergii
131 Guayas Guayaquil Isla Puna
Campo
Alegre
30 170 11 -2.71747 -80.09278 Tabebuia
billbergii
132 Guayas Guayaquil Isla Puna
Campo
Alegre
25 80 10 -2.71783 -80.09350 Tabebuia
billbergii
133 Guayas Guayaquil Isla Puna
Campo Alegre
38 300 12 -2.71622 -80.09081 Tabebuia
billbergii
134 Guayas Guayaquil Isla Puna
Campo Alegre
9 50 15 -2.71600 -80.09078 Tabebuia
billbergii
135 Guayas Guayaquil Isla Puna Campo
Alegre
35 250 9 -2.71589 -80.09089 Tabebuia billbergii
136 Guayas Guayaquil Isla Puna Campo
Alegre
17 100 13 -2.71639 -80.09028 Tabebuia billbergii
137 Guayas Guayaquil Isla Puna
Campo
Alegre
17 100 2 -2.71497 -80.09292 Tabebuia
billbergii
138 Guayas Guayaquil Isla Puna
Campo
Alegre
15 50 6 -2.71528 -80.09267 Tabebuia
billbergii
139 Guayas Guayaquil Isla Puna
Campo Alegre
16 80 6 -2.71422 -80.08839 Tabebuia
billbergii
140 Guayas Guayaquil Isla Puna
Campo Alegre
10 50 8 -2.71294 -80.03731 Tabebuia
billbergii
141 Guayas Guayaquil Isla Puna Campo
Alegre
14 80 8 -2.71314 -80.03742 Tabebuia billbergii
142 Guayas Guayaquil Isla Puna Campo
Alegre
26 150 18 -2.71353 -80.03747 Tabebuia billbergii
143 Guayas Guayaquil Isla Puna
Campo
Alegre
25 50 9 -2.71300 -80.03764 Tabebuia
billbergii
144 Guayas Guayaquil Isla Puna
Campo
Alegre
17 100 6 -2.71314 -80.03800 Tabebuia
billbergii
145 Guayas Guayaquil Isla Puna
Campo Alegre
17 100 6 -2.72653 -79.97142 Tabebuia
billbergii
146 Guayas Guayaquil Isla Puna
Campo Alegre
15 50 11 -2.72631 -79.96967 Tabebuia
billbergii
147 Guayas Guayaquil Isla Puna Campo
Alegre
16 80 10 -2.72650 -79.96953 Tabebuia billbergii
148 Guayas Guayaquil Isla Puna Campo
Alegre
20 120 13 -2.72639 -79.96908 Tabebuia billbergii
149 Guayas Guayaquil Isla Puna
Campo
Alegre
18 50 9 -2.72717 -79.99139 Tabebuia
billbergii
150 Loja Zapotillo Paletilla 18 80 586 -4.17444 -80.29517 Tabebuia
billbergii
151 Loja Zapotillo Paletilla 24 200 586 -4.17450 -80.29531 Tabebuia
billbergii
152 Loja Zapotillo Bolaspamba 25 180 464 -4.17111 -80.38072 Tabebuia
billbergii
Continúa
84
153 Loja Zapotillo Bolaspamba 30 170 501 -4.16394 -80.39658 Tabebuia
billbergii
154 Loja Zapotillo Bolaspamba 25 80 501 -4.16397 -80.39650 Tabebuia
billbergii
155 Loja Zapotillo Bolaspamba 38 300 533 -4.16472 -80.40539 Tabebuia
billbergii
156 Loja Zapotillo Bolaspamba 9 50 530 -4.16400 -80.40250 Tabebuia
billbergii
157 Loja Zapotillo Mangahurco 24 200 465 -4.16794 -80.41161 Tabebuia billbergii
158 Loja Zapotillo Mangahurco 25 180 464 -4.16800 -80.41167 Tabebuia billbergii
159 Loja Zapotillo Mangahurco 30 170 471 -4.16781 -80.41150 Tabebuia
billbergii
160 Loja Zapotillo Mangahurco 25 80 474 -4.16772 -80.41144 Tabebuia
billbergii
161 Loja Zapotillo Mangahurco 38 300 472 -4.16781 -80.41131 Tabebuia
billbergii
162 Loja Zapotillo Mangahurco 9 50 467 -4.16772 -80.41189 Tabebuia
billbergii
163 Loja Zapotillo Mangahurco 7 80 465 -4.16769 -80.41192 Tabebuia billbergii
164 Loja Zapotillo Mangahurco 10 80 465 -4.16761 -80.41192 Tabebuia billbergii
165 Loja Zapotillo Mangahurco 18 100 466 -4.16758 -80.41189 Tabebuia
billbergii
166 Loja Zapotillo Mangahurco 10 80 465 -4.16742 -80.41175 Tabebuia
billbergii
167 Loja Zapotillo Mangahurco 8 60 352 -4.15747 -80.43697 Tabebuia
billbergii
168 Loja Zapotillo Mangahurco 10 80 353 -4.15742 -80.43703 Tabebuia
billbergii
169 Loja Zapotillo Mangahurco 10 120 347 -4.15731 -80.43756 Tabebuia billbergii
170 Loja Zapotillo Mangahurco 8 100 345 -4.15778 -80.43772 Tabebuia billbergii
171 Loja Zapotillo Mangahurco 10 60 346 -4.15789 -80.43750 Tabebuia
billbergii
172 Loja Zapotillo Mangahurco 7 80 340 -4.15786 -80.43797 Tabebuia
billbergii
173 Loja Zapotillo Mangahurco 15 100 342 -4.15781 -80.43803 Tabebuia
billbergii
174 Loja Zapotillo Mangahurco 18 80 344 -4.15792 -80.43836 Tabebuia
billbergii
175 Loja Zapotillo Mangahurco 12 80 344 -4.15781 -80.43853 Tabebuia billbergii
176 Loja Zapotillo Saucecito 8 80 331 -4.13503 -80.43967 Tabebuia billbergii
177 Loja Zapotillo Saucecito 15 100 323 -4.13517 -80.43928 Tabebuia
billbergii
178 Loja Zapotillo Saucecito 10 60 321 -4.13522 -80.43933 Tabebuia
billbergii
179 Loja Zapotillo Saucecito 12 200 318 -4.13542 -80.43931 Tabebuia
billbergii
180 Loja Zapotillo Saucecito 20 200 319 -4.13556 -80.43933 Tabebuia
billbergii
181 Loja Zapotillo Saucecito 22 300 320 -4.13550 -80.43969 Tabebuia billbergii
182 Loja Zapotillo Saucecito 8 80 320 -4.13547 -80.43967 Tabebuia billbergii
183 Loja Zapotillo Saucecito 8 60 321 -4.13553 -80.43978 Tabebuia
billbergii
184 Loja Zapotillo Mangahurco 12 80 430 -4.14203 -80.43111 Tabebuia
billbergii
185 Loja Zapotillo Mangahurco 15 100 437 -4.14211 -80.43119 Tabebuia
billbergii
186 Loja Zapotillo Mangahurco 12 150 431 -4.14225 -80.43122 Tabebuia
billbergii
187 Loja Zapotillo Mangahurco 6 60 433 -4.14222 -80.43128 Tabebuia billbergii
188 Loja Zapotillo Mangahurco 8 100 432 -4.14217 -80.43128 Tabebuia billbergii
189 Loja Zapotillo Mangahurco 15 150 439 -4.14228 -80.43017 Tabebuia
billbergii
190 Loja Zapotillo Mangahurco 20 120 438 -4.14228 -80.43033 Tabebuia
billbergii
191 Loja Zapotillo Mangahurco 12 120 436 -4.14233 -80.43044 Tabebuia
billbergii
192 Loja Zapotillo Mangahurco 10 80 444 -4.14242 -80.43039 Tabebuia
billbergii
Continúa
85
193 Loja Zapotillo Mangahurco 8 60 435 -4.14239 -80.43025 Tabebuia
billbergii
194 Loja Zapotillo Balneario el
Inca 12 80 485 -4.10844 -80.40119 Tabebuia
billbergii
195 Loja Zapotillo Balneario el
Inca 15 100 483 -4.10819 -80.40092 Tabebuia
billbergii
196 Loja Zapotillo Balneario el
Inca 15 120 501 -4.10758 -80.40178 Tabebuia
billbergii
197 Loja Zapotillo Balneario el Inca
10 110 489 -4.10603 -80.40147 Tabebuia billbergii
197a Loja Zapotillo Balneario el Inca
- 5 490 -4.10600 -80.40150 Tabebuia billbergii
197b Loja Zapotillo Balneario el
Inca - 5 490 -4.10608 -80.40147 Tabebuia
billbergii
197c Loja Zapotillo Balneario el
Inca - 12 486 -4.10606 -80.40144 Tabebuia
billbergii
198 Loja Zapotillo Balneario el
Inca 8 200 501 -4.12478 -80.40683 Tabebuia
billbergii
199 Loja Zapotillo Casaderos 15 200 241 -4.07886 -80.47203 Tabebuia
billbergii
220 Loja Zapotillo Casaderos 20 200 239 -4.07867 -80.47211 Tabebuia billbergii
201 Loja Zapotillo Casaderos 12 200 238 -4.07847 -80.47228 Tabebuia billbergii
202 Loja Zapotillo Casaderos 10 200 241 -4.07919 -80.47244 Tabebuia
billbergii
203 Loja Zapotillo Casaderos 12 120 238 -4.07922 -80.47294 Tabebuia
billbergii
204 Loja Zapotillo Casaderos 10 80 234 -4.07938 -80.47300 Tabebuia
billbergii
205 Loja Zapotillo Casaderos 8 60 249 -4.08119 -80.47330 Tabebuia
billbergii
206 Loja Zapotillo Casaderos 12 80 263 -4.08197 -80.47350 Tabebuia billbergii
207 Loja Zapotillo Casaderos 15 100 241 -4.08089 -80.47330 Tabebuia billbergii
208 Loja Zapotillo Casaderos 12 150 250 -4.08042 -80.47233 Tabebuia
billbergii
209 Loja Zapotillo Las Vegas 6 60 220 -4.01158 -80.40822 Tabebuia
billbergii
210 Loja Zapotillo Las Vegas 8 100 224 -4.01169 -80.40808 Tabebuia
billbergii
211 Loja Zapotillo Las Vegas 15 150 227 -4.01200 -80.40814 Tabebuia
billbergii
212 Loja Zapotillo Las Vegas 20 120 228 -4.01225 -80.40817 Tabebuia billbergii
213 Loja Zapotillo Las Vegas 12 120 229 -4.01183 -80.40850 Tabebuia billbergii
214 Loja Zapotillo Las Vegas 10 80 180 -3.99244 -80.39528 Tabebuia
billbergii
215 Loja Zapotillo Las Vegas 8 60 179 -3.99242 -80.39553 Tabebuia
billbergii
216 Loja Zapotillo Las Vegas 12 80 174 -3.99242 -80.39569 Tabebuia
billbergii
217 Loja Zapotillo Las Vegas 15 100 173 -3.99247 -80.39575 Tabebuia
billbergii
218 Loja Zapotillo Las Vegas 12 150 161 -3.99283 -80.3567 Tabebuia billbergii
219 Loja Zapotillo Las Vegas 6 60 151 -3.98636 -80.36118 Tabebuia billbergii
220 Loja Zapotillo Las Vegas 8 100 158 -3.98633 -80.3611 Tabebuia
billbergii
221 Loja Zapotillo Mangahurco 15 150 430 -4.16703 -80.41544 Tabebuia
billbergii
222 Loja Zapotillo Mangahurco 20 120 428 -4.16725 -80.41567 Tabebuia
billbergii
223 Loja Zapotillo Mangahurco 12 120 403 -4.16750 -80.41569 Tabebuia
billbergii
224 Loja Zapotillo Mangahurco 10 80 416 -4.16794 -80.41567 Tabebuia billbergii
225 Loja Zapotillo Mangahurco 8 60 413 -4.16817 -80.41578 Tabebuia billbergii
226 Loja Zapotillo Mangahurco 12 80 402 -4.16856 -80.41606 Tabebuia
billbergii
227 Loja Zapotillo Mangahurco 15 100 395 -4.16847 -80.41647 Tabebuia
billbergii
228 Loja Zapotillo Mangahurco 12 150 389 -4.16833 -80.41728 Tabebuia
billbergii
229 Loja Zapotillo Mangahurco 6 60 404 -4.16767 -80.41761 Tabebuia
billbergii
Continúa
86
230 Loja Zapotillo Balsa Real 8 100 306 -4.23883 -80.23917 Tabebuia
billbergii
231 Loja Zapotillo Balsa Real 15 150 305 -4.23917 -80.24069 Tabebuia
billbergii
233 Loja Zapotillo Balsa Real 12 120 312 -4.23797 -80.23994 Tabebuia
billbergii
234 Loja Zapotillo Balsa Real 10 80 330 -4.23794 -80.23967 Tabebuia
billbergii
235 Loja Zapotillo Balsa Real 8 60 340 -4.23756 -80.23883 Tabebuia billbergii
236 Loja Zapotillo Balsa Real 12 80 337 -4.23744 -80.23883 Tabebuia billbergii
237 Loja Zapotillo Balsa Real 15 100 317 -4.23864 -80.23906 Tabebuia
billbergii
238 Loja Zapotillo Balsa Real 12 150 318 -4.23867 -80.23922 Tabebuia
billbergii
239 Loja Zapotillo Balsa Real 6 60 309 -4.23858 -80.23958 Tabebuia
billbergii
240 Loja Zapotillo Garza Real 8 100 261 -4.29508 -80.23406 Tabebuia
billbergii
241 Loja Zapotillo Garza Real 15 150 260 -4.28722 -80.23961 Tabebuia billbergii
242 Loja Zapotillo Garza Real 20 120 251 -4.28719 -80.23964 Tabebuia billbergii
243 Loja Zapotillo Garza Real 12 120 250 -4.28756 -80.24039 Tabebuia
billbergii
244 Loja Zapotillo Garza Real 10 80 250 -4.28758 -80.24039 Tabebuia
billbergii
245 Loja Zapotillo Garza Real 8 60 250 -4.28750 -80.24039 Tabebuia
billbergii
246 Loja Zapotillo Garza Real 12 80 250 -4.28747 -80.24036 Tabebuia
billbergii
247 Loja Zapotillo Garza Real 15 100 250 -4.28742 -80.24036 Tabebuia billbergii
248 Loja Zapotillo Garza Real 12 150 250 -4.28736 -80.24039 Tabebuia billbergii
249 Loja Zapotillo Garza Real 6 60 250 -4.28731 -80.24039 Tabebuia
billbergii
250 El Oro Arenillas La Cuca 8 100 25 -3.48394 -80.10781 Tabebuia
billbergii
251 El Oro Arenillas La Cuca 15 150 25 -3.48392 -80.10794 Tabebuia
billbergii
252 El Oro Arenillas La Cuca 20 120 25 -3.48403 -80.10800 Tabebuia
billbergii
253 El Oro Arenillas La Cuca 12 120 25 -3.48444 -80.10814 Tabebuia billbergii
254 El Oro Arenillas La Cuca 10 80 27 -3.48389 -80.10819 Tabebuia billbergii
255 El Oro Arenillas La Cuca 8 60 24 -3.48333 -80.10828 Tabebuia
billbergii
256 El Oro Arenillas La Cuca 12 80 23 -3.48333 -80.10856 Tabebuia
billbergii
257 El Oro Arenillas La Cuca 15 100 25 -3.48308 -80.10864 Tabebuia
billbergii
258 El Oro Arenillas La Cuca 12 150 24 -3.48300 -80.10875 Tabebuia
billbergii
259 El Oro Arenillas La Cuca 6 60 27 -3.48356 -80.10869 Tabebuia billbergii
87
Anexo 2
Tampón de extracción Sorbitol del protocolo de extracción de ADN de
Mariac et al. (1999) modificado por Morillo (2002).
Componentes Cantidad (50 ml)
Sorbitol 3.18 g
Trizma base 0.60 g
EDTA 0.009 g
Bisulfito de sodio 0.25 g
88
Anexo 3
Tampón de lisis (CTAB 4%) del protocolo de extracción de ADN de
Mariac et al. (1999) modificado por Morillo (2002).
Componentes Cantidad (100 ml)
Trizma base 1.2 g
NaCl 7.2 g
EDTA 0.74 g
CTAB 4 g
89
Anexo 4.
Lista de los Primers ISSRs con los que se realizaron pruebas para el estudio
No. PRIMER TºA No. PRIMER TºA
1 ISSR 840 52 25 ISSR 859 37
2 ISSR 841 37 26 ISSR 877 37
3 ISSR 853 37 27 ISSR 827 37
4 ISSR 857 37 28 ISSR 842 37
5 ISSR 900 37 29 ISSR 844 37
6 ISSR HB12 37 30 ISSR 881 37
7 ISSR HB14 37 31 ISSR 886 37
8 ISSR 17899A 37 32 ISSR 894 37
9 ISSR 17899B 37 33 ISSR 852 37
10 ISSR 824 37 34 ISSR 854 37
11 ISSR 822 37 35 ISSR 814 37
12 ISSR 844B 37 36 ISSR 815 37
13 ISSR HB 11 37 37 ISSR 816 37
14 ISSR HB 9 37 38 ISSR 823 37
15 ISSR 884 37 39 ISSR 843 37
16 ISSR 875 37 40 ISSR 870 37
17 ISSR 889 37 41 ISSR 886 37
18 ISSR 834 37 42 ISSR 887 37
19 ISSR 856 37 43 ISSR 881 37
20 ISSR 865 37 44 ISSR 834 37
21 ISSR 863 37 45 ISSR 853 37
22 ISSR 17898A 37 46 ISSR 837 37
23 ISSR 17898B 37 47 ISSR 855 37
24 ISSR 810 37 48 ISSR 813 37
90
Anexo 5
a) Protocolo de extracción de ADN de Ferreira y Grattapaglia (1998)
Soluciones necesarias
- Tampón de extracción CTAB 2X
- CIA (24:1)
- ISOPROPANOL
- TE (0.1 M)
Procedimiento:
1. Añadir 700 l de buffer a 0.05 g de tejido seco de cada material.
2. Incubar a 65 ºC por 1 hora agitando cada 30 minutos.
3. Centrifugar a velocidad tope por 15 minutos.
4. Tomar el sobrenadante y añadir 600 l de CIA (24:1). Homogeneizar.
5. Centrifugar a 13000 rpm por 5 minutos.
6. Repetir el paso 4 y 5.
7. Adicionar 400 l de isopropanol (2/3 volumen de sobrenadante).
8. Centrifugar por 4 minutos a 13000 rpm Si el pellet no es visible colocar
el tubo a -20 ºC durante 30 minutos y centrifugar nuevamente.
9. Retirar el isopropanol y lavar dos veces con 1 ml de etanol 70% la
pastilla de ADN formada.
10. Secar en la microestufa por 30 minutos a 37 C.
11. Resuspender el ADN en 100 l de TE a temperatura ambiente por toda la
noche.
12. Cuantificar el ADN en un gel de agarosa 1%
91
Anexo 5
b) Protocolo de extracción de ADN de Graham (1993)
Procedimiento:
1. Macerar las hojas secas y obtener 200mg de muestra
2. Añadir 700 l de buffer de extracción.
3. Incubar a 65 ºC por 1 hora agitando cada 30 minutos.
4. Centrifugar a 4000 rpm por 10 minutos.
5. Tomar el sobrenadante y añadir 300 l de CIA (24:1). Homogeneizar.
6. Centrifugar a 4000 rpm por 10 minutos.
7. Tomar el sobrenadante y añadir 50 l de acetato de amonio 7.5 M y 500
l de etanol al 100%.
8. Colocar a -20 °C por 1 hora
9. Centrifugar por 10 minutos a 13000 rpm.
10. Retirar el etanol al 100% y lavar dos veces con 1 ml de etanol al 70% la
pastilla de ADN formada.
11. Secar en la microestufa por 30 minutos a 37 C.
12. Resuspender el ADN en 200 l de TE y añadir 2l de RNAsa y colocar a
baño maría a 65 °C por 15 minutos.
13. Cuantificar el ADN en un gel de agarosa 1%.
92
Anexo 5
c) Protocolo de extracción de ADN de Álzate Marín (2001)
Procedimiento:
1. Macerar en un mortero 200 mg de tejido seco
2. Añadir 900 l de buffer de extracción mas 2l B- marcaptoetanol.
3. Incubar a 65 ºC por 1 hora agitando cada 30 minutos.
4. Centrifugar a velocidad tope por 15 minutos.
5. Tomar el sobrenadante y añadir 800 l de CIA (24:1). Homogeneizar.
6. Centrifugar a 13000 rpm por 5 minutos.
7. Repetir el paso 4 y 5.
8. Adicionar 400 l de isopropanol (2/3 volumen de sobrenadante).
9. Centrifugar por 4 minutos a 13000 rpm Si el pellet no es visible colocar el
tubo a -20 ºC durante 30 minutos y centrifugar nuevamente.
10. Retirar el isopropanol y lavar dos veces con 1 ml de etanol 70% la pastilla de
ADN formada.
11. Secar en la microestufa por 30 minutos a 37 C.
12. Resuspender el ADN en 100 l de TE a temperatura ambiente por toda la
noche.
13. Cuantificar el ADN en un gel de agarosa 1%
93
Anexo 6
Amplificación de 214 genotipos de guayacán con 10 primers ISSR
seleccionados para el estudio, mediante electroforesis horizontal en geles de
agarosa al 1.5%.
94
Continuación Anexo 6
Amplificación de 214 genotipos de guayacán con 10 primers ISSR
seleccionados para el estudio, mediante electroforesis horizontal en geles de
agarosa al 1.5%.
95
Continuación Anexo 6
Amplificación de 214 genotipos de guayacán con 10 primers ISSR
seleccionados para el estudio, mediante electroforesis horizontal en geles de
agarosa al 1.5%.
96
Continuación Anexo 6
Amplificación de 214 genotipos de guayacán con 10 primers ISSR
seleccionados para el estudio, mediante electroforesis horizontal en geles de
agarosa al 1.5%.
97
Continuación Anexo 6
Amplificación de 214 genotipos de guayacán con 10 primers ISSR
seleccionados para el estudio, mediante electroforesis horizontal en geles de
agarosa al 1.5%.
98
Continuación Anexo 6
Amplificación de 214 genotipos de guayacán con 10 primers ISSR
seleccionados para el estudio, mediante electroforesis horizontal en geles de
agarosa al 1.5%.
1 1 1 0 1 0 1 0 1 0 1 1 0 0 0 1 1 1 0 0 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 1 0 0 0 1 1 0 1 0 1 1 0
2 1 1 0 1 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0
5 1 1 0 1 0 1 1 1 0 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0
6 1 0 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 1 1 0
7 1 0 1 1 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 1 1 1 1 0 0 1 0
9 1 1 0 1 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 0 0 1 1 1 1 0 0 1 1
11 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0
12 1 0 1 1 0 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 1 1 0 0 1 0 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1
13 1 0 0 1 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 1 1 1 1 0 1 1 1
14 1 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 1 1 0 0 1 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 1 1 0
15 3 1 0 1 0 1 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 1 1 1 1 1 0 1 1 0
17 3 1 0 1 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 0 1 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0
18 3 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 1 0 0 1 1 0 1 0 1 1 1
19 1 1 1 1 0 0 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 1 0 0 1 0 1 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 0 1 0 1 1 1
20 1 0 1 1 0 1 0 1 0 1 1 0 0 1 0 1 1 0 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0
23 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 1 1 0 1 0 1 1 0
24 1 1 0 1 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0
37 2 0 1 1 1 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 1 0 1 1 0 1 0 1 0
38 2 0 1 1 1 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 1 0 0 1 1 1 1 0 0 1 1 0
40 2 1 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 1 1 1 1 1 0 0 1 0
41 2 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 1 1 1 1 0 0 0 1 0
60 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 0 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1
61 1 0 0 1 0 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 1 1 1 1 0 1 1 0
62 1 1 1 1 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 1 0 1 0 1 1 1 1 0 1 1 0
63 1 0 1 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1
64 1 0 1 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0
65 1 0 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1
66 1 0 0 1 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 1
67 1 0 0 1 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 1 1 0
68 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0
69 1 0 1 1 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0
70 1 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 1 1 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 1
71 1 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 0 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 1 1 0
72 1 0 1 1 0 0 0 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0
73 1 1 0 1 0 1 1 1 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0
74 1 0 1 1 0 1 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1
75 1 0 1 1 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 1 0 0 1 0 1 1 1
76 1 1 0 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 1 0 0 1 0 1 1 1
77 1 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 1 1 0
78 1 1 0 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1
79 1 0 1 1 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 1 1 0 1 0 1 1 0
80 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 1 1 1 0 0 0 1 1
81 1 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 1 1 1 1 0 1 1 1
82 1 0 0 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0
83 1 0 0 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
84 1 0 0 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
85 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0
86 3 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0
87 3 0 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0
88 3 0 1 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0
89 3 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0
90 3 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0
91 3 0 1 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0
101 2 0 0 1 0 1 0 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0
102 2 0 1 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0
103 2 0 0 1 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
104 2 0 0 1 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0
105 2 0 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 1 0 1 0
106 2 0 0 1 0 1 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1
107 2 1 0 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0
108 2 1 0 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 0 0 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0
109 2 0 1 1 0 1 0 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0
110 2 0 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0
111 2 0 0 1 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0
112 2 0 1 1 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
113 2 0 1 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0
114 2 0 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0
115 2 0 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 0 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0
116 2 0 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 0 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0
117 2 0 1 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0
118 2 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
119 2 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
120 2 0 1 1 0 1 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1
121 2 0 1 1 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0
122 2 0 1 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 1 1 1
123 2 0 1 1 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1
124 2 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 1 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1
125 2 0 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0
126 2 0 1 1 0 1 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 1 1 0 1 0 1 1 0
127 2 0 1 1 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0
128 2 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 1
129 2 0 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0
130 2 0 1 1 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 1 1
131 2 0 1 1 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 0 0 1 0 1 1 0 1 0 1 0 1
132 2 0 1 1 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 0 1 1 0 1 1 1 0 0 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0 1 0 1 0 1 1 0
133 2 0 1 1 0 1 0 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 0 1 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0
134 2 0 0 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 0 1
CONTINÚA .
ISSR 900 ISSR 17899A ISSR17899B
Matriz binaria de los 214 genotipos de guayacán (Tabebuia billbergii )
Anexo 7:
Muestra Pob. ISSR824 ISSR HB12ISSR853 ISSR841 ISSR HB14 ISSR840 ISSR853
136 2 0 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 0 0 1 0 0 1 0 1 1 1
137 2 0 1 1 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1
138 2 0 1 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 0 1 1 0 1 1 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 1 1 1 1 0 1 1 0
139 2 0 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 0 0 1 0 1 0 0 1 1 1
140 2 0 1 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 1 1
141 2 0 1 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 1
142 2 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 1 0 0 1 1 1 1 0 1 1 1
143 2 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 0
144 2 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1
145 2 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 1 1 0 0 1 1 1
146 2 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 0
147 2 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 1
148 2 0 1 1 0 0 0 1 0 1 1 1 1 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 1 0 0 1 0 1 1 1
149 2 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 1 1 0
150 1 0 1 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 0 1 1 0 1 1 1 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 1 1 0 0 1 1 0
151 1 1 0 1 1 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0 1 1 0 1 1 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0
152 1 1 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0
153 1 0 1 1 1 0 0 1 0 1 1 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 0 0 1 1 1 0 0 1 1 0
154 1 0 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 1 0 0
155 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1
156 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 1 1 0 0 1 1 0
157 1 0 1 1 0 1 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 0 0 1 1 0
158 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1
159 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 1 1 0 0 1 1 1
160 1 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 1 1 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 1
161 1 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 0 1 1 0 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 1 1 0 0 0 1 1 1
162 1 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0
163 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 1 1 0 1 0 1 1 0
164 1 1 0 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 1 1 0 1 0 1 1 1
165 1 1 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 1 1 1 1 1 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 0
166 1 1 0 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 0 0 1 1 1 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 1 1 0
167 1 0 1 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0
168 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0
169 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0
170 1 0 1 1 0 0 0 1 0 1 1 1 1 0 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
171 1 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 1 1 0 0 1 1 0 1 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0
172 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0
173 1 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 0 1 0 0 1 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0
174 1 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0
175 1 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 1 0 1 1 1 0 0 1 0 0
176 1 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 1 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 1 0 0 0 1 1 0 1 0 0 0
177 1 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 1 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1
178 1 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 0 1 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 1 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0
179 1 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0
180 1 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 0 1 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 0 1 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0
181 1 1 0 1 0 1 0 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 0 1 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0
182 1 1 0 1 0 1 0 1 0 1 1 1 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 0 1 0 1 1 1 1 1 0 1 1 0
183 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 1 1 1 1 1 0 1 1 0
184 1 1 0 1 0 1 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 1 1 1 1 1 0 1 1 0
185 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 1 1 0 0 1 0 0 1 1 0
186 1 0 1 1 0 1 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0
187 1 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 1 1 0
188 1 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0
189 1 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 1 1 1 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 0 0 1 1 1 0
190 1 0 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 0 1 1 0
191 1 0 1 1 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 1 1 0
192 1 0 1 1 0 0 1 1 0 1 1 1 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 1 1 1 1 0 0 1 1 0
193 1 0 1 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 1 1 1 1 0 0 1 1 0
194 1 0 1 1 0 0 1 1 0 1 1 1 0 0 1 1 1 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0
195 1 0 1 1 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 1 0 0 0 1 0 1 1 1
196 1 0 1 1 1 1 0 1 0 1 1 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0
197 1 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 1 0
197a 1 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 1 1 1 0 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
197b 1 0 1 1 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 1 1 1 1 1 0 1 1 0
197c 1 0 1 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 1 1 1 0 0 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1
198 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0
199 3 0 1 1 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 1 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 1 0 0 0 1 1 0 0 1 1 1
200 3 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 1 0
201 3 0 1 1 1 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 1 0 1 0 1 1 1 0 1 0 0
202 3 0 1 1 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 0
203 3 0 1 1 0 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 1 1 1 1 0 0 1 1 1
204 3 0 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 1 1 1 1 1 0 0 1 0 0
205 3 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0
206 3 0 1 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1
207 3 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 1 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 1
208 3 1 0 1 1 1 0 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 1 1 0
209 3 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 1 0 1 1 1 0 0 1 1 1
210 1 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 1 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0
211 1 1 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0
212 1 1 0 1 1 1 0 1 0 1 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 0 1 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 1 0
213 1 1 0 1 1 1 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 0 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 1 0 1
214 1 1 0 1 1 1 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 1 0 0 1 0 1 1 0
215 1 1 0 1 1 1 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1
216 1 1 1 1 1 1 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0
217 1 0 0 1 1 0 0 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1 0 0 1 0 1 1 1
218 1 0 0 1 1 0 0 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 1 1 0 0 0 1 0 1 0 1
219 1 1 0 1 1 1 0 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 0 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 1 1 1 0 0 1 0 1 1 0
CONTINÚA .
ISSR853 ISSR 900 ISSR 17899A
Anexo 7:
Matriz binaria de los 214 genotipos de guayacán (Tabebuia billbergii )
Muestra Pob. ISSR824 ISSR853 ISSR841 ISSR HB14 ISSR840 ISSR17899B ISSR HB12
221 1 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0
222 1 0 0 1 1 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 1 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1
223 1 0 1 1 1 0 0 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 1 1 1
224 1 0 0 1 0 0 0 1 0 1 1 1 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 0 1 0 1 0 0 0 0 1 0 1 1 0
225 1 1 0 1 1 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 1 0 1 1 1 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1
226 1 1 0 1 1 0 0 1 0 1 1 1 1 0 0 1 0 0 1 0 1 1 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 1 1 0
227 1 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 1 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 0 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 1 1 1
228 1 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 1 1 1 0 1 0 0 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0
229 1 1 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 0
230 1 0 0 1 0 1 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0
231 1 1 0 1 0 1 0 1 0 1 1 0 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 1 0
233 1 1 0 1 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0
234 1 1 0 1 0 0 0 1 0 1 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0
235 1 1 0 1 0 1 0 1 0 1 1 0 1 1 0 1 1 0 1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
236 1 0 1 1 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1
237 1 0 1 1 0 0 1 1 0 0 1 1 0 0 0 1 1 1 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0
238 1 0 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1
239 1 1 0 1 0 0 1 1 0 0 1 1 0 0 0 1 1 1 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0
240 4 0 0 1 0 1 1 0 1 0 1 1 0 0 0 1 1 1 0 0 0 1 1 1 0 1 0 1 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0
241 4 1 1 1 0 1 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 0 1 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 1
242 4 1 1 1 0 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0
243 4 1 0 1 0 0 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1
244 4 1 0 1 0 0 1 1 0 0 1 1 0 1 0 1 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0
245 4 1 0 1 1 1 1 1 0 0 1 1 0 0 0 1 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1
246 4 1 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 1 1 0
247 4 1 0 1 0 1 1 1 0 1 1 1 0 1 0 1 1 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 1 1 0
248 4 1 0 1 0 1 1 1 0 1 1 1 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 0 1 1 0 1 1 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 0 1 1 1
249 4 1 0 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 1 1 0 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 1 1
250 5 0 0 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 1 0 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1
251 5 1 0 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 1 1 0
252 5 1 0 1 1 1 0 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 0 0 1 0 1
253 5 1 0 1 0 1 0 1 0 0 1 1 1 0 0 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 1 0 1
254 5 1 0 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0 1 0 1 1 1
255 5 0 1 1 0 1 0 1 0 0 1 1 0 0 0 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 1 0
256 5 0 1 1 0 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 1 1 1
257 5 0 0 1 0 0 1 1 0 0 1 1 0 0 0 1 0 0 1 0 1 1 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 0
258 5 0 0 1 0 0 0 1 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 1
259 5 0 1 1 0 1 1 1 0 0 1 1 0 0 0 1 0 0 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 1 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0
ISSR17899B ISSR HB12
Matriz binaria de los 214 genotipos de guayacán (Tabebuia billbergii )
Muestra Pob. ISSR824 ISSR853 ISSR841 ISSR HB14 ISSR 840 ISSR853 ISSR 900 ISSR 17899A
Anexo 7: