Procedimiento analítico para identificar y semicuantificar compuestos emergentes de las familias de antibióticos y betabloqueadores por cromatografía de líquidos de alta

resolución y/o cromatografía de gases

Antecedentes

La presencia de contaminantes emergentes en aguas superficiales y aguas subterráneas es actualmente una preocupación, debido a los posibles riesgos ambientales y de salud pública. Los contaminantes emergentes comprenden una amplia gama de productos compuestos, que incluyen hormonas naturales y sintéticas, productos para el cuidado personal, fármacos, surfactantes, aditivos industriales, plastificantes, plaguicidas y retardantes de flama, entre otros.

Los productos farmacéuticos se liberan al medio ambiente vía excreción, ya sea metabolizados o no metabolizados, por vertido de los productos no utilizados o caducos, o bien procedentes como residuos de los procesos de producción, por lo que pueden estar presentes en todas las etapas de un ciclo de vida del agua puntual y referido a su uso. Este tipo de compuestos se encuentra en concentraciones traza y ultrataraza, es decir en niveles de microgramos y nanogramos por litro (ng·L -1), por lo que su relevancia ambiental, independientemente de la concentración, se debe a la frecuencia con la cual son emitidos, liberados o descargados a los cuerpos de agua. Por ej., el consumo de fármacos en los países de la Unión Europea se cifra en toneladas por año y los más utilizados son los antibióticos, que se emplean en cantidades similares a los plaguicidas (Jones et al., 2001).

Se sabe poco sobre los efectos tóxicos de estos compuestos a las concentraciones comúnmente presentes en el agua; sin embargo, hay evidencia de su potencial para afectar la salud humana aún a bajas dosis. Mucho de estos compuestos, se sospecha tienen el potencial de alterar al sistema hormonal. La magnitud del efecto está influido por la edad de individuo, el tiempo de la exposición (los organismos muy jóvenes o añosos tienen poca capacidad para eliminar tóxicos), el estado de salud general, sensibilidad o alergia a ciertos compuestos durante periodos de vida particularmente vulnerables tales como el embarazo.

Otro problema de gran preocupación asociado con la presencia de fármacos, y en particular con los antibióticos, se centra en el hecho de que favorecen la persistencia de cepas bacterianas resistentes en el

ambiente acuático, constituyendo así un riesgo de infección para diversos grupos poblacionales a través de diferentes vías.

Estudios han revelado recientemente la presencia de fármacos en ciudades como Alemania, Italia, Estados Unidos, Canadá, algunos contaminantes son: Gemfibrozil (70 ng·L-1 ), ácido clofíbrico (270 ng·L-1 ), bezafíbrato (27 ng·L-1), carbamezapina (258 ng·L-1), diclofenaco (6 ng·L-1), fenazona (400 ng·L-1), provocando un alta preocupación al presentarse en agua potable (Yi Hua et al., 2006;Gross et al., 2007; Farre et al., 2007; Drewes et al., 2003).

En aguas superficiales, al norte de América y Europa, se han detectado concentraciones de 0.75-1.50 µg·L-1 de gemfibrozil (Sanderson et al., 2003). En Río de Janeiro se identificaron concentraciones de 40 ng·L-1 de ácido fenofíbrico en corrientes naturales (Stumpf et al., 1999), también se reportaron concentraciones de gemfibrozil en aguas de irrigación en regiones áridas de Estados Unidos de 190- 790 ng·L-1 y en corrientes de agua de 160 – 360 ng·L-1. En Italia se llevó a cabo un estudio en seis diferentes plantas de tratamiento de agua residual con el fin de identificar y cuantificar los fármacos más prevalecientes, así como su remoción. Los grupos de fármacos más frecuentemente identificados fueron: antiinflamatorios, cardiovasculares y reguladores de lípidos.

En México Siemens et al. (2008) realizaron un estudio con muestras de agua residual municipal provenientes del Valle del Mezquital en México, con el objetivo de determinar las concentraciones y flujos de fármacos en este sistema de irrigación. Como resultado, las concentraciones de GFZ oscilaron entre 0.02 y 0.22 µg·L-1 y las de BZF entere 0.08 y 0.10 µg·L-1. Estas concentraciones son menores en comparación con los resultados de los estudios en ciudades europeas (Carballa et al., 2005).

En México no existen Normas Oficiales Mexicanas en materia de agua y no se cuenta con información suficiente que indiquen la presencia, destino, riesgo y toxicidad de compuestos emergentes presentes en el medio ambiente, específicamente en fuentes de abastecimiento, considerando esta problemática es esencial desarrollar metodologías analíticas capaces de detectar o identificar contaminantes orgánicos en concentraciones traza (nano gramos por litro) que permitan evaluar la calidad del agua que son destinadas al consumo humano así como a sus fuentes de contaminación.

En el Instituto Mexicano de Tecnología del Agua se han desarrollado y validado 25 metodologías de análisis para la identificación y cuantificación de compuestos emergentes en agua; se ha comprobado su aplicación en distintas matrices ambientales: agua de pozo, río y efluentes de plantas de tratamiento de aguas residuales por

cromatografía de líquidos – espectrometría de masas triple cuadrupolo (LC-MS).

Análisis de compuestos emergentes

Se adaptaron y desarrollaron métodos para la validación de 25 contami-nantes emergentes, mediante el método de adición de estándar el cual implica una extracción en fase sólida con cartuchos HLB. La aplicabili-dad de los métodos se comprobó con análisis de muestras de agua de pozo de los estados de Morelos, Hidalgo y Zacatecas, agua de río Cuau-tla, Yautepec Morelos y Chetumal, Quintana Roo y efluentes de agua re-sidual en dos plantas de tratamiento (PTAR) ubicadas en el estado de Morelos y la ciudad de México.

Analitos

Los analitos validados fueron: 4dimethylaminoantipirina, pindolol, meto-prolol, clenbuterol, bisoprolol, propanolol, betaxolol, antipirina, sulfame-toxazol, ifosfamida, propifenazona, atenolol, salbutamol, terbutalina y sotalol, sulfadiazina, sulfamerazina, sulfametazina, ácido clofíbrico, di-clofenaco, indometacina, naproxeno, estrona, estradiol y pravastatina.

Equipo

Cromatografo de líquidos acoplado a espectrómetro de masas triple cuadrupolo modelo SHIMADZU 8040 (Error: Reference source not found). La espectrometría de masas es una técnica basada, previa ionización de la muestra, en la separación y registro de los iones producidos, de acuerdo a su relación masa-carga, en un sistema de vacío. Las ventajas de la espectrometría de masas y que la convierten en técnica de referencia para el análisis de contaminantes en matrices medioambientales son las siguientes: es cualitativa y cuantitativa, analiza mezclas complejas, tiene gran sensibilidad, determina especies que coeluyen, proporcionar información estructural.

Figura 1. Cromatógrafo de líquidos-espectrómetro de masas triple cuadrupolo

Método analítico

La selección del método depende de las propiedades físicas y químicas del contaminante, la implementación de un método analítico es experi-mental, la elección de la fase móvil y los tiempos de retención están da-das por las condiciones particulares de cada uno de los compuestos a separar.

La detección de los contaminantes emergentes se realizó mediante un análisis cualitativo, el cual consiste en detectar la presencia de los con-taminantes emergentes con base en el tiempo de retención, la masa del ion del analito (ion molecular), y las masas de los iones producto. El tiempo de retención corresponde al tiempo transcurrido desde que se in-yecta la muestra en el cromatógrafo, hasta la detección del máximo del pico.

El tiempo de retención y los iones característicos son únicos para cada compuesto; cada determinación se realizó con múltiple reacción monito-reada (MRM) en modo positivo y negativo, que permite la identificación inequívoca de los analitos de interés, así como reducir el efecto matriz debido a su alta selectividad.

Extracción

La determinación de compuestos a nivel de traza y ultra-traza (µg·L -1 o ng·L -1) normalmente requiere de un proceso de extracción que permita,

además de separar el analito del resto de los componentes de la matriz, conseguir su preconcentración. Esta es una de las etapas más importantes y críticas del procedimiento analítico, debido a la elevada manipulación que sufre la muestra.

La extracción en fase sólida (SPE, por sus siglas en inglés), consiste en hacer pasar la muestra a través de un cartucho relleno con un adsorben-te sólido, de forma tal que los analitos queden retenidos en él y puedan ser eluídos con un disolvente adecuado. Se divide en cuatro etapas:

1. Acondicionamiento del sorbente pasando disolventes de propieda-des similares a la muestra;

2. Carga de la muestra en el cartucho; 3. Lavado con un disolvente que no eluya los analitos, pero sí otras

sustancias interferentes presentes en la muestra y,4. Elución de los analitos con un disolvente apropiado.

La extracción en fase sólida se utiliza para la extracción de analitos pola-res o semipolares (Figura 2), varios factores influyen en la eficiencia del proceso, pero los dos más importantes son la capacidad del absorbente y la retención de los analitos en él.

Existe en el mercado una amplia gama de adsorbentes como las sílices enlazadas químicamente con cadenas alquílicas (C-18, C-8) o grupos po-lares (-CN, -NH2), polímeros porosos (estireno-divinilbenceno), Florisil (silicato de magnesio activado) y carbón grafitizado. Grupos funcionales iónicos como el ácido carboxílico o los grupos amino también pueden en-lazarse a sílice o polímeros para crear adsorbentes de intercambio ióni-co. Las interacciones analito-adsorbente pueden estar basadas, por tan-to, en enlaces de hidrógeno, interacciones polares o apolares, intercam-bio aniónico o catiónico, y exclusión por tamaño.

Esto nos permite seleccionar adsorbentes adecuados para la determina-ción de analitos dentro de un mayor rango de polaridades y característi-cas fisicoquímicas.

Los cartuchos Oasis HLB mostraron recuperaciones más confiables y me-jor reproducibilidad para los compuestos polares y no polares. Además, estos cartuchos presentan la ventaja de que se pueden trabajar en un amplio rango de pH.

Figura 2. Dispositivo de extracción

Validación del método analítico

La validación es el proceso que establece, mediante pruebas de laborato-rio, las características de desempeño de un método y satisfacen los requi-sitos para su aplicación analítica.

La validación del sistema cromatográfico se realizó de acuerdo a la li-nealidad, exactitud y precisión, límite de detección y límite de cuantifica-ción (Figura 3).

Figura 3. Parámetros de validación método analítico.

Linealidad del método

La linealidad del método es la relación entre la respuesta del instrumento y las concentraciones conocidas del analito. La curva de calibración se elaboró con la relación de áreas de analito estándar versus las concentra-ciones del analito.

El análisis de regresión lineal se realizó para determinar la linealidad del método, así como para generar la ecuación de la curva de calibración y = mx + b, donde y es la relación de área, x la concentración, m la pen-diente y b el intercepto. En la Figura 4 se muestra la curva de calibración del clenbuterol y se anexa, a manera de ejemplo, hoja de cálculo con da-tos reales, de cada uno de los parámetros estimados en la validación del método.

Figura 4. Linealidad del método para clenbuterol

Exactitud

La exactitud de un método analítico es la cercanía de los resultados al valor verdadero. Se determina mediante la aplicación del procedimiento analítico en los estudios de recuperación, donde se fortifican disolucio-nes de muestras con una cantidad conocida de compuestos emergentes.

Precisión

El estudio de la precisión se realizó a través del modelo de repetibilidad de seis réplicas; se determinaron los valores medios, la desviación es-tándar y el coeficiente de variación. Para el ensayo de la precisión inter-media se utilizaron 3 valores de concentración que correspondieron a valores bajo, medio y alto.

Límite de detección y cuantificación

La determinación de los límites de detección (LD) y de cuantificación (LC) fue realizada con base en la desviación estándar de la respuesta del blanco y a la pendiente de la curva de linealidad.

Robustez

La robustez del método analítico fue evaluada a lo largo del desarrollo del mismo. Durante esta evaluación se detectaron y mejoraron los pun-tos débiles del método en general. Por ejemplo, las condiciones de la ex-tracción acelerada con disolventes fueron variadas hasta encontrar las óptimas. Así mismo, se seleccionaron los cartuchos para extracción en fase sólida que proveen las más altas recuperaciones posibles. Estos procesos de optimización promueven que el método analítico propuesto en este trabajo pueda ser usado por cualquier analista sin comprometer de manera significativa los resultados que de ella se obtengan.

Conclusiones

En el Instituto Mexicano de Tecnología del Agua se desarrollaron, validaron y optimizaron métodos para el análisis de 25 contaminantes emergentes por extracción en fase sólida y cromatografía de líquidos-espectrometría de masas (LC-MS), los cuales son lineales, exactos, precisos y reproducibles con eficiencias de recuperación promedio de 70 a 110 %, comprobándose la aplicabilidad del método con análisis de

muestras de agua de pozo de los estados de Morelos, Hidalgo y Zacatecas, agua de río Cuautla, Yautepec Morelos y Chetumal, Quintana Roo y efluentes de agua residual en dos plantas de tratamiento (PTAR) ubicadas en el estado de Morelos y Distrito Federal.

Los métodos de extracción en fase sólida optimizados mostraron ser eficientes para la extracción simultánea de los compuestos emergentes estudiados. Este paso de extracción combinado con una técnica de HPLC-MS/MS constituye un método rápido, sensible, preciso y con una buena exactitud para a cuantificar trazas de diversos fármacos.

La naturaleza no polar de los contaminantes identificados indica la posible presencia de otros compuestos similares que pueden representar un riesgo a la salud humana, razón por la cual es de suma importancia continuar con el desarrollo y validación de metodologías para diferentes compuestos por cromatografía de líquidos-masas (LC-MS) para prevenir posibles repercusiones en las fuentes de abastecimiento, agua subterránea y agua residual.

Referencias

Carballa, M., Omil, F., Lema, J.M., Lomopart, M., Garcia, C., Rodriguez, I., Gomez, M., Ternes, T., 2005. Behaviour of pharmaceutical and personal care products in a sewage treatment plant of northwest Spain. Water Science and technology. 8, 29-35

Drewes, J.E., Heberer, T., Rauch, T., Reddersen, K., 2003. Fate on phar-maceutical during Ground Water Recharge. Ground Water Monitoring and Remediation. 23, 64-72.

Farre, M., Petrovic, M., Barcelo, D. (2007). Recently developed GC/MS and LC/MS.

Gross, M., Petrovic, M., Barcelo, D. (2007). Wastewater treatment plant as a pathway for aquatic contamination by pharmaceuticals in the Ebro River basin (Northeast Spain). Environmental toxicology and chemistry. 26, 1553-1562.

Jones O, Voulvoulis N, y Lester J. 2001. Human pharmaceuticals in the aquatic environment: a review. Environmental Technology. 22:1383–1394.

Sanderson, H., Johnson, D.J., Wilson, C.J., Brain, R.A., Solomon, K.R., 2003. Probabilistics Hazard assessment of envoronmetally occurring

pharmaceutical toxicity to fish, daphnids and algae by ECOSAR screen-ing. Toxicology Letters 144, 383-395.

Siemens, J., Huschek, G., Siebe, C., Kaupenjohann, M., 2008, Concentrations and mobility of human pharmaceuticals in the world's largest wastewater irrigation system, Mexico City–Mezquital Valley: Water Research, 42(8–9), 2124–2134.  

Stumpf M., Ternes T. A. Wilken R., Vianna S. and Baumann W. (1999). Polar drugs residues in sewage and natural waters in the state of Rio de Janeiro, Brazil. Science of the Total Environment, Vol. 225, pag. 135-141.

Yi Hua, W., Bennett, E., Maio, X., Metcalfe, C., Letcher, R. (2006). Sea-sonality effects on pharmaceuticals and S-Triazine herbicides in waste-water effluent and surface water from the Canadian side of the upper Detroit River. Environmental Toxicology and Chemistry. 25, 2356-2365.