Uji sterilitas : Ada beberapa metode:

Direct inoculation of culture medium : Meliputi pengujian langsung dari sampel dalam media pertumbuhan. Menurut British Farmakope: media tioglikolat cair yang mengandung glukosa dan Na Tioglikolat cocok untuk pembiakan aerob. Suhu inkubasi 30-35oC.

Soya bean casein digest medium : Media ini membantu pertumbuhan bakteri anaerob dan fungsi. Suhu inkubasi 30-35oC, sedang fungi 20-25oC.

Membran filtrasi: Teknik yang banyak direkomendasikan farmakope, meliputi filtrasi cairan melalui membran steril. Filter lalu ditanam dalam media. Masa inkubasi 7-14 hari karena mungkin organisme perlu adaptasi dulu.

Introduction od concentrate culture medium: Medium yang pekat langsung dimasukkan dalam wadah sampel yang akan ditumbuhkan. Tidak banyak digunakan, hanya dipakai bila ada kecurigaan akan adanya bakteri.

Sifat – sifat pirogen:

•        Thermostabil, sehingga hanya dapat dihilangkan dengan pemanasan pada suhu 650ºC selama 1 menit, 250ºC selama 15 menit atau 180ºC selama 4 jam;

•        Larut dalam air. Sehingga tidak bisa memakai penyaring bakteri;

•        Tidak dipengaruhi oleh bakterisida yang biasa;

•        Tidak menguap, destilasi biasa ada yang ikut bersama percikan air;

•        Berat molekul (BM) antara 15.000 – 4.000.000; dan

•        Ukuran umumnya 1 – 50µm.

Berdasarkan respon demam pada kelinci. Digunakan kelinci karena kelinci menunjukkan respon terhadap  pirogen sesuai dengan keadaan manusia. Kenaikan suhu diukur melalui rektal.

Pengujian meliputi pengukuran kenaikan suhu kelinci setelah penyuntikan larutan uji secara i.v

Cara menghilangkan pirogenPustaka: PTM : 139, SDF : 46-47, RPS 18th : 1850, Pirogen :203-213

-       Inaktifasi endotoksin

a.    Hidrolisis asam basa

b.    Oksidasi

c.    Alkilasi

d.    Pemanasan kering pada suhu tinggi (250 selama 30-45 menit atau 170-180oC, selama 3-4 jam)

e.    Pemanasan basah

f.     Radiasi ionisasi

g.    Polymixin B dan limulus amebasit lysat

-       Penghilangan endotoksin

a.    Membilas dengan API steril

b.    Destilasi

c.    Ultrafiltrasi

d.    Osmosa balik

e.    Karbon aktif

f.     Daya tarik elektrostatik

g.    Daya tarik hidrofobik

Metode penghilangan Pyrogen

Cara menghilangkan pirogen

a.    PTM : 139

      Pirogen dapat dipindahkan dari suatu larutan melalui destilasi dan ini merupakan metode paling tua untuk memperoleh air bebas progen, dasar untuk memperoleh atau memproduksi parenteral volume besar bebas pirogen dalam skala besar. Ultrafiltrasi sampai 100 KD adalah alat yang efektif dari penyaringan endotoksin yang mempunyai BM kira-kira 20 KD tetapi pada kenyataannya ukuran agregat paling kurang 1000 KD. Osmosa balik juga efektif memindahkan partikel samapai 1 nm, meliputi endotoksin. Disisi lain, norit aktif, serat asbes dan polipropilen atau politeffiber atau permukaan, seluruhnya efektif menyerap pirogen, utamanya melalui interaksi hidrofobik. Pirogen atau endotoksin yang diadsorbsi dalam permukaan lebih sulit untuk di pindahkan. Permukaan

elestomerik seperti pada segel dan penutup tidak dapat dipanaskan. Pirogen disini disyaratkan untuk dipindahkan melalui pembilasan dengan air apirogenik. Banyak permukaan logam atau gelas dapat diolah secara kimia, kebanyakan bahan pengoksidasi seperti peroxid atau permanganat menjadi efektif. Sterilisasi panas kering tidak efektif, tekanan pada 20 psig disyaratkan selama paling kurang 5 jam untuk menghancurkan kebanyakan endotoksin. Metode depirogenisasi ini di pilih untuk permukaan adalah panas kering pada suhu sekitar 160-250oC paling kurang 30 menit kondisi yang baik yang telah diset. Pengolah ini mengasumsikan  bahwa peralatan pada bagian permukaan dapat dipanaskan, dan tentu saja sangat sedikit produk yang dapat diolah dengan cara ini. Wdah gelas, setelah pencucian dengan air untuk injeksi, dikeringkan dan dipanaskan di bawah kondisi aliran laminar pada oven berkesinambungan suhu 250oC atau lebih tinggi. Kondisi ini meliputi kombinasi pengeringan, oksidasi dan pembakaran untuk menghancurkan bahan pirogen.

b.    SDF : 46-47

Pirogen dipindahkan dari air dengan destilasi, pirogen tidak menguap. Destilasi bebas pirogen dikumpulkan dalam wadah steril dan bebas pirogen. Air untuk injeksi, ketika dikumpulkan dalam wadah bebas pirogen dan steril, harus digunakan kurang dari 24 jam untuk sediaan produk parenteral yang disterilkan pada periode ini. Jika air untuk injeksi disimpan untuk waktu lebih panjang, air untuk injeksi dapat disimpan dalam wadah bebas pirogen dan steril pada suhu 5-80oC suhu dimana mikroorganisme tidak akan tumbuh, kemungkinan menghilangkan pirogen. Pirogen dapat dihilangkan dari wadah logam dan gelas melalui panas kering. Ketika metode tidak praktis untuk ukutan wadah atau bukan metode pilihan untuk alat-alat pada panas kering, pirogen dapat dihilangkan melalui pembilasan wadah dengan baik dengan air untuk injeksi bebas pirogen, pirogen larut air, dipindahkan melalui pembilasan yang diulang.

c.    RPS 18th : 1850

Pirogen dapat dihancurkan melalui pemanasan pada temperatur tinggi. Prosedur yang direkombinasikan untuk depirogenasi gelas dan peralatan adalah pemanasan pada suhu 250oC selama 45 menit. Telah dilaporkan bahwa 650o selama 1 menit atau selama 4 jam diharapkan dapat menghancurkan pirogen. Hal itu dipastikan bahwa pencucian yang teliti dengan deterjen akan menjadikan wadah gelas bebas pirogen jika dilindungi selama proses produksi dan penyimpanan dari kontaminasi pirogen berat. Putaran autoklaf biasa tidak bisa melakukan hal ini. Pemanasan dengan alkali kuat dan atau larutan oksidasi akan

menghancurkan pirogen. Suatu metode yang digunakan untuk memindahkan pirogen dari larutan adalah adsobsi dalam bahan adsortif. Namun, karena fenomena adsorbsi juga dapat menyebabkan pemindahan selektif dari bahan kimia dari larutan dan filtrat dapat dikontaminasi dengan bahan, metode ini dibatasi penggunaannya.

 Wadah tertutup baik, yaitu wadah yang dapat melindungi isinya dari zat padat dari luar dan dari hilangnya obat pada kondisi pengangkutan, pengapalan, penyimpanan dan distribusi yang lazim.

2.      Wadah tertutup baik terlindung dari cahaya3.      Wadah tertutup rapat, yaitu wadah yang dapat melindungi isinya dari kontaminasi cairan-

cairan, zat padat atau uap dari luar, dari hilangnya obat tersebut, dan dari pengembangan, pencairan, atau penguapan pada kondisi pengangkutan, pengapalan, penyimpanan, dan distribusi yang lazim. Suatu wadah tertutup rapat ditutup kembali sehingga kemampuan yang sama seperti sebelum dibuka.

4.      Wadah tertutup rapat terlindung dari cahayaBahan kemas yang kontak langsung dengan bahan yang dikemas, dinyatakan dengan

bahan kemas primer, sebaliknya pembungkus selanjutnya, seperti kotak terlipat, karton dan sebagainya dinamakan sebagai bahan kemas sekunder. Untuk menjamin stabilitas produk, harus ditetapkan syarat yang sangat tegas terhadap bahan kemas primer, yang seringkali menyatu dengan seluruh bahan yang diisikan baik berupa cairan dan semi padatan. Bahan kemas sekunder pada umumnya tidak berpengaruh terhadap stabilitas.

 Beberapa istilah wadah yaitu:

1. Kemasan tahan dirusak, wadah suatu bahan steril yang dimaksudkan untuk pengobatan mata atau telinga, kecuali yang disiapkan segera sebelum diserahkan atas dasar resep, harus disegel sedemikian rupa hingga isinya tidak dapat digunakan tanpa merusak segel.2. Wadah tidak tembus cahaya, harus dapat melindungi isi dari pengaruh cahaya, dibuat dari bahan khusus yang mempunyai sifat menahan cahaya atau dengan melapisi wadah tersebut. Wadah yang bening dan tidak berwarna atau wadah yang tembus cahaya dapat dibuat tidak tembus cahaya dengan cara memberi pembungkus yang buram. Dalam hal ini pada etiket harus disebutkan bahwa pembungkus buram diperlukan sampai isi dari wadah habis karena diminum atau digunakan untuk keperluan lain.Jika dalam monografi dinyatakan “terlindung dari cahaya”, dimaksudkan agar penyimpanan dilakukan dalam wadah tidak tembus cahaya.

3.      Wadah tertutup baik harus dapat melindungi isi terhadap masuknya bahan padat dan mencegah hilangnya isi selama penanganan, pengangkutan, penyimpanan, dan pendistribusian.

4.      Wadah tertutup rapat harus dapat melindungi isi terhadap masuknya bahan cair, bahan padat, atau uap dan mencegah kehilangan, merekat, mencair atau menguapnya bahan selama penanganan, pengangkutan, penyimpanan, dan distribusi dan harus dapat ditutup rapat kembali. Wadah ini dapat diganti dengan wadah tertutup kedap untuk bahan dosis tunggal.

5.      Wadah tertutup kedap harus dapat mencegah menembusnya udara atau gas selama penanganan, pengangkutan, penyimpanan, dan distribusi.

6.      Wadah satuan tunggal digunakan untuk produk obat yang dimasukkan untuk digunakan sebagai dosis tunggal yang harus digunakan segera setelah dibuka. Wadah atau pembungkusnya sebaiknya dirancang sedemikian rupa hingga dapat diketahui apabila wadah tersebut pernah dibuka. Tiap wadah satuan tunggal harus diberi etiket yang menyebutkan identitas, kadar atau kekuatan, nama produsen, nomor batch, dan tanggal kadaluwarsa.

7.      Wadah dosis tunggal adalah wadah satuan tunggal untuk bahan yang hanya digunakan secara parenteral. Contoh : ampul

8.      Wadah dosis satuan adalah wadah satuan tunggal untuk bahan yang digunakan bukan secara parenteral dalam dosis tunggal, tetapi langsung dari wadah.

9.      Wadah satuan ganda adalah wadah yang memungkinkan isinya dapat diambil beberapa kali tanpa mengakibatkan perubahan kekuatan, mutu, atau kemurnian sisa zat dalam wadah tersebut.Contoh : obat tetes mata

10.  Wadah dosis ganda adalah wadah satuan ganda untuk bahan yang digunakan hanya secara parenteral. Contoh : vial

Timbang contoh uji, masukkan ke dalam labu erlenmeyer 250 ml yang diekstraksi dengan air

kemurnian tinggi dalam tangas air pada suhu 90  selama tidak kurang dari 24 jam atau pada suhu

121  selama 1 jam. Tambahkan 50,0 ml air kemurnian tinggi ke dalam labu dan ke dalam labu lain

untuk blanko. Tutup semua labu dengal gelas piala terbuat dari borosilikat yang sebelumnya telah

diperlakukan seperti ditetapkan denagn ukuran sedemikian hingga dasar gelas piala menyentuh

bagian tepi labu.Letakkan wadah dalam otoklaf dan tutup hati-hati, biarkan lubang ventilassi terbuka.

Panaskan hingga uap keluar dan lanjutkan pemanasan  selama 10 menit. Tutup lubang ventilasi dan

atur suhu 121 .Pertahankan suhu pada 121 2 selam 30 menit dihitung saat suhu tercapai. Kurangi

panas hingga otoklaf mendingin dan mencapai tekanan atmosfer dalam 38 menit hingga 46 menit,

jika perlu buka lubang ventilasi untuk mencegah terjadinya hampa udara.  Dinginkan segera labu

dalam air mengalir, enaptuangkan air dalam labu ke dalam bejana sesuai yang bersih dan cuci sisa

serbuk kaca 4 kali , tiap kali dengan 15 ml air kemurnian tinggi.

Tambahkan 5 tetes larutan merah metil dan titrasi segera dengan asam sulfat 0,020 N LV. Catat

volume asam sulfat 0,020 N yang digunakan untuk menetralkan ekstrak dari 10 g contoh uji, lakukan

titrassi blanko. Volume tidak lebih dari yang tertera pada tabel tipe kaca dan tabel uji untuk tipe gelas

yang diuji.

• Water attack test

  Isi setiap wadah dengan air kemurnian tinggi hingga 90% dari kapasitas penuh dan lakukan prosedur seperti yang tertera pada uji serbuk kaca mulai dengan “Tutup semua labu…..”, kecuali waktu pemansan dengan otoklaf 60 menit bukan 30 menit dan diakhiri dengan “untuk mencegah terjadinya hampa udara”. Kosongkan isi dari 1 atau lebih wadah ke dalam gelas ukur 100 ml. Jika wadah lebih kecil, gabungkan isi dari beberapa wadah untuk memperoleh voluyme 100 ml. Masukkan kumpulan contoh dalam labu erlenmeyer 250 ml terbuat dari kaca tahan bahan kimia, tambahkan 5 tetes larutan metil merah, titrasi dalam keadaan hangat dengan asam sulfat 0,020N LV. Selesaikan titrasi dalam waktu 60 menit setelah otoklaf dibuka. Catat volume asam sulfat 0,020 N yang digunakan , lakukan titrasi blanko dengan 100 ml air kemurnian tinggi pada suhu yang sama dan dengan jumlah indikator yang sama. Volume tidak lebih dari yang tertera pada tabel tipe kaca dan batas uji untuk tipe kaca yang diuji.