DANMARKS TEKNISKE UNIVERSITET

BACHELOR PROJEKT

Investigating acute changes in brain structure in response to experimentally induced changes in serotonergic function

Julie Hjorth SAABYEMarissa Kavony ULAGARAJAH

Kongens Lyngby 2009

IMM-B.Sc-2009-3

Technical University of DenmarkInformatics and Mathematical ModellingBuilding 321, DK-2800 Kongens Lyngby, DenmarkPhone: +45 45253351, Fax: +45 45882673reception@imm.dtu.dkwww.imm.dtu.dk

2

Abstract

This bachelor project consists of the investigation of acute changes in the brain structure due to the neurotransmitter serotonin. The project aims to find and hence investigate whether there are changes of the grey matter in the brain.In order to perform the above mentionened analysis, data has been recorded by using a magnetic resonance scanner. The software program Statistical Parametric Mapping 5 (SPM5) has been used to analyse the data. During the data analysis a wide range of operations have been used, e.g. spatial normalization, modulation, smoothing and others. The program is constructed in a particular manner that enables analysis of the structural changes in each individual voxel. This procedure is called Voxel-Based Morphometry (VBM). The background for this project consists of an experiment based on a number of volunteers, who have been given different kinds of medication that each regulate the concentration of serotonin in the brain. For the analysis of the results, statistics have been used in the form of paired t-test through matrix computations.

Furthermore the goal of this project is to simplify the complexity of the technical terms in a way so that it is easy for the reader to get a top down approch. This has been achieved through a range of smaller but more detailed sections. Thereby the reader can relate to both the technicality and the physiology of this analysis.

Through the comprehension and interpretation of the data and the results, the conclusion of the project is that the changes that occur have little significance. The reason for this is firstly because areas of interest vanished after the FDR correction was applied. Secondly, the p-value had to be adjusted in a way that increased the level of significance. And finally the amount of subjects which have been used was too small a sample. These three reasons play a very important role of accepting the structural changes that have been detected. One must admit that although interesting areas have been found, a more thorough investigation, in which the above mentioned uncertainties have been improved, is needed.

3

Forord

Dette projekt er fremstillet ved Institut for Informatik og Matematisk Modulering (IMM) ved Danmarks Tekniske Universitet (DTU) som hovedformål til opnåelse af Bsc. graden i Medicin og Teknologi. Projektet har primært foregået i samarbejde med Danish Research Centre for Magnetic Resonance (DRCMR) på Hvidovre Hospital og IMM ved DTU.

I projektet arbejdes med voxel-baseret morformetri ved hjælp af data taget med en MR-scanner. Et program, som bearbejder billederne med hensyn til statistik, parametre og kortlægning, er anvendt.

Dette projekt er blevet vejledt af Professor Lars Kai Hansen ved IMM, DTU. Herudover har Professor Hartwig Siebner (Prof., MD, PhD), Julian Macoveanu (PhD, Msc.), William Baaré (Msc. Psych., PhD) samt Arnold Skimminge (Msc., PhD stud.) fra CIMBI, Hvidovre Hospital, DRCMR været med til vejledning.

4

Tak til

Vi takker vores vejleder Lars Kai Hansen ved IMM, DTU for hans vejledning til skriveprocessen.

Herudover takker vi Arnold Skimminge for hans hjælp til databehandlingen i SPM5.

Slutteligt takker vi William Baaré, Hartwig Siebner og Julian Macoveanu for fortolkningen af resultaterne.

_________________________________________Julie Hjorth Saabye – s062286 D. 2/6-2009

og

________________________________________________Marissa Kavony Ulagarajah – s051907 D. 2/6-2009

5

Indholdsfortegnelse

Abstract.................................................................................................................................................3Forord...................................................................................................................................................4Tak til....................................................................................................................................................5Liste over forkortelser..........................................................................................................................8Notation og symbolforklaring..............................................................................................................9Introduktion........................................................................................................................................10Teori....................................................................................................................................................11

1. Hjernens struktur........................................................................................................................111.1 Storhjernen og dens komponenter.......................................................................................121.2 Hjernens andre dele.............................................................................................................121.3 Grå og hvid substans...........................................................................................................14

2. Serotonin....................................................................................................................................142.1 Serotoninsystemet...............................................................................................................152.2 5-HT receptorer samt serotoninproduktion........................................................................162.3 Tryptophan..........................................................................................................................19

2.3.1 Akut Tryptophan Depletion (ATD)..............................................................................192.4 SSRI – Citalopram..............................................................................................................192.5 Ketanserin...........................................................................................................................20

3. MRI - Magnetic Resonance Imaging.........................................................................................203.1 MPRAGE............................................................................................................................23

Forsøgsbeskrivelse.............................................................................................................................244. Forsøgspersoner.........................................................................................................................245. Forsøget.....................................................................................................................................24

Databehandling...................................................................................................................................256. Dataoptagelse og filformat.........................................................................................................257. Databehandling i SPM5.............................................................................................................25

7.1 Unified Segmentering og spatial normalisering..................................................................267.1.1 Segmentering på basis af voxel-intenstitet..................................................................267.1.2 Biaskorrektion............................................................................................................287.1.3 Segmentering på basis af tissue probability maps.......................................................297.1.4 Deformerbare TMP'er..................................................................................................307.1.5 Spatial normalization...................................................................................................31

7.2 Modulering..........................................................................................................................317.3 Smoothing...........................................................................................................................32

General Lineær Model........................................................................................................................358. Matrixformulering.....................................................................................................................359. Parret t-test.................................................................................................................................37

9.1 Hypoteseformulering af en parret t-test..............................................................................379.2 False Discovery Rate (FDR)...............................................................................................399.3 Familywise Error (FWE) og Bonferroni korrektion ..........................................................40

Resultater............................................................................................................................................4110. Kontrolscanning versus Ketanserin.........................................................................................41

6

10.1 Kontrolscanning > Ketanserin, p = 0.001 uden FDR korrektion......................................4110.2 Kontrolscanning > Ketanserin, p = 0.05 med FDR korrektion.........................................4210.3 Kontrolscanning > Ketanserin, p = 0.01 uden FDR korrektion........................................4310.4 Kontrolscanning < Ketanserin, p = 0.01 uden FDR korrektion........................................45

11. Kontrolscanning versus ATD...................................................................................................4611.1 Kontrolscanning > ATD, p = 0.01 uden FDR korrektion..................................................4611.2 Kontrolscanning < ATD, p = 0.01 uden FDR korrektion..................................................48

12. Kontrolscanning versus Citalopram.........................................................................................4912.1 Kontrolscanning > Citalopram, p = 0.01 uden FDR korrektion.......................................4912.2 Kontrolscanning < Citalopram, p = 0.01 uden FDR korrektion.......................................51

13. Citalopram vs. ATD.................................................................................................................5213.1 Citalopram > ATD med p = 0.01 uden FDR korrektion....................................................5213.2 Citalopram < ATD med p = 0.01 uden FDR korrektion ..................................................54

14. T-tests konstrueret af Splus software.......................................................................................55Diskussion..........................................................................................................................................56

15. Diskussion af resultater............................................................................................................5616. Kritik af forsøget......................................................................................................................5817. Forbedringer af SPM5.............................................................................................................59

Konklusion.........................................................................................................................................60Referencer...........................................................................................................................................61Appendiks A.......................................................................................................................................63

A.1 t-test i Splus.............................................................................................................................63A.2 Oversigt over Brodmann's Areas (BA)...................................................................................66A.3 ATD opløsningen....................................................................................................................68

7

Liste over forkortelser

2D To dimensionel3D Tre dimensionel5-HIAA 5-Hydroxyindoleacetic acid5-HT 5-hydroxytryptamin (kemisk navn for serotonin)ATD Akut Tryptophan DepletionBA Brodmanns AreacAMP Cyklisk adenosin monofosfatCIMBI Center for Integrated Molecular Brain ImagingCNS Central nervesystemetCSF Cerebro Spinal FluidDAG DiacylglycerolDARTEL Diffeomorphic Anatomical Registration Through Exponentiated Lie AlgebraDICOM Digital Imaging and Communications in MedicineDRCMR Danish Research Centre for Magnetic Resonance DTU Danmarks Tekniske UniversitetFDR False Discovery RateFWE Familywise ErrorFWHM Full width half maximumGLM Generel linær modelGM Grey matterIMM Institut for Informatik og Matematisk ModuleringIP3 Inositol trifosfatMOG Mixture of GaussiansMPRAGE Magnetization Prepared Rapid Acquisition Gradient EchoMR Magnetisk ResonansMRI Magnetic Resonance ImagingNifTI Neuroimaging Informatics Technology InitiativeOLS Ordinary least squaresPD Proton DensityRF Radio frequencySPM Statisical Parametric MappingSPM5 Statistical Parametric Mapping Software version 5SSRI Selective Serotonin Reuptake Inhibitor TE EkkotidTPM Tissue Propablity MapTR RepetitionstidVBM Voxel-Baseret MorfometriWM White matter

8

Notation og symbolforklaring

Symbol Betegnelse Enhed Type

f Frekvens [Hz] KonstantB0 Magnetfelt [Tesla] Konstant/vektorγ Gyromagnetiske forhold [Hz/Tesla] KonstantMz Longitudinale magnetisering VektorM0 Ligevægtsmagnetisering VektorMxy Transversale magnetisering Vektoryi Intensitet i voxel i Konstantci Cluster i voxel iμk Middelværdi i k'te klasse Konstantσ2

k Variansen i k'te klasse KonstantP Sandsynlighed Konstantγk Proportionsfaktor Konstantk Vævsklasseβ Vektor med ukendte parametre Vektorρi(β) Biaskorrektionbik(α)J Jacobimatrix Matrixσ Spredning KonstantYj Observeret dataY Observeret data Vektorβl Ukendt hældningskoefficient Konstantxjl Explanatory variablerX Designmatrix Matrixεj Fejl i j'te rækkeN(μ,σ2) Normalfordelingε Fejl VektorXT Transponeret designmatrix Matrix(X)-1 Inverse designmatrix Matrixα Signifikantsniveau

9

Introduktion

Serotonin er en neurotransmitter, som har stor betydning for centralnervesystemet (CNS). Serotonin bliver blandt andet brugt i antidepressive lægemidler, og man mener at tilstedeværelse af fri serotonin i hjernen kan hjælpe patienter mod for eksempel depression. Serotonin er også med til at modulere forskellige følelser såsom vrede, aggression, glæde mm.

I denne rapport er der anvendt MR-billeder samt SPM5 fra et forsøg med 20 personer, til at undersøge serotonins effekt i hjernen. I SPM5 benyttes en række operationer, som muliggør sammenligningen af hjernerne ved at korrigere billederne, således at de placeres ovenpå hinanden og er ens positions- og størrelsesmæssigt. Hertil inddeles hjernen i de forskellige væv således at man kan betragte grå substans for sig selv og lave statistiske beregninger.

I dette projekt benyttes de nævnte redskaber til at måle eventuelle strukturelle ændringer i grå substans for de forskellige niveauer af serotonin. Dermed kan der opnås en viden om hvorvidt serotonin har en effekt på hjernens struktur.

10

Teori

1. Hjernens struktur

Hjernen er et af de mest komplicerede organer, man kan finde. Den består af to hjernehalvdele, også kaldet de to hemisfærer, og vejer i alt i gennemsnit 1,5 kg. Dens volumen ligger mellem 1130 til 1260 cm3. Hjernen er et meget vigtigt og sårbart organ, og er derfor godt beskyttet af et stærkt skjold i form af kraniet. Derudover er hjernen også beskyttet imod fremmedlegemer via blodbanen ved hjælp af blod-hjerne barrieren. I hjernens kapillærer er det inderste cellelag meget tætliggende, som ikke lader fremmedlegemer trænge igennem. Det er sådan blod-hjerne barrieren udgør en effektiv adskillelse mellem blod og hjernevæv.Hjernens ”kredsløbsvæske” er cerebropinal væsken (CSF). Den findes i hjernens ventrikler og virker som hjernens affjedring. CFS fungerer desuden som en udrensningsvæske og bliver udskiftet fuldstændigt hver syvende time.

Hjernen kan inddeles i flere mindre organer. Den største del udgør storhjernen (cerebrum). Derudover findes lillehjernen (cerebellum), som er lokaliseret lige under cerebrum. Hjernestammen er en fælles betegnelse for midthjernen (mesencephalon), hjernebroen (pons) og den forlængede rygmarv (medulla oblongata). Hjernestammen er den del, som forbinder rygmarven til resten af hjernen. Mellemhjernen (diencephalon) er den del inde i storhjernen, der ligger over mesencephalon, og består af thalamus og hypothalamus.

11

Figur 1. Billedet viser et af hemisfærerne. Modificeret fra [1].

1.1 Storhjernen og dens komponenter

Storhjernen kan inddeles i et antal områder som kaldes lobi. Hjernen består af to hemisfærer. En enkel hemisfære består af en frontallobi, temporallobi, parietallobi og occipitallobi.

Frontalloben Denne del af hjernen involverer evnen til at genkende fremtidige konsekvenser fra nuværende handlinger, og dermed være i stand til at skelne mellem gode og dårlige handlinger. Denne er også med til at bestemme ligheder og forskelle mellem ting og begivenheder.Frontalloben indgår desuden i langtidshukommelsen af minder, som ikke er opgavebaseret, dvs. minder som er dannet fra følelsesmæssige situationer af hjernens limbiske system.

TemporallobenDennes funktioner involverer hørelse og heriblandt evnen til at skelne mellem de forskellige auditive inputs. Temporalloben er med til genkendelse af ansigter, objekter, scener og steder via visuel forarbejdning.Herudover er temporalloben med til forståelse, navngivning, tale, verbal hukommelse samt andre sproglige egenskaber. I temporallobens midte findes en region kaldet hippocampus, som spiller en stor rolle for overførslen af korttidshukommelsen til langtidshukommelsen.

ParietallobenPatietalloben spiller en stor rolle i det sensoriske system. Det vil sige sanser som berøring, tryk, temperatur og smerte opfattes og fortolkes i dette område. Den har også stor betydning i manipulation af objekter samt tal. Parietalloben har herudover indflydelse i synet, dels i forhold til rumlig bevidsthed og rumlig orientering.

OccipitallobenOccipitalloben indeholder det primære visuelle cortex og dennes hovedfunktion er synet.

1.2 Hjernens andre dele

Disse dele gennemgås kun på tabelform, da det primært er storhjernen vi beskæftiger os med.

Navn FunktionCerebellum Koordination, motor kontrol,

stimuleringsforståelse via sensorisk system, balance og ligevægtssansen.

Mesencephalon Kontrol af respons vha. syn, bevægelse af øjne, pupil dilation, kropsbevægelighed og hørelse.

12

Pons Videresender sensorisk information mellem cerebellum og cerebrum.

Medulla Oblongata Kontrol af autonome funktioner, videresender nervesignaler mellem hjerne og rygmarv.

Hjernestamme Årvågenhed, erektion, vejrtrækning, blodtryk, indeholder kraniale nerver, fordøjelse, hjertets slag, andre autonome funktioner og videresender information mellem perifere nerver samt rygmarv til de øvre dele af hjernen.

Hypothalamus Endokrine funktioner, kontrol af autonome funktioner, følelser, homeostasis, motor funktioner, regulerer sult og tørst, regulerer døgncyklus (nat/dag – søvn/vågen).

Thalamus Motor kontrol, modtager auditoriske, somatosensoriske og visuelsensoriske signaler, videresender sensoriske signaler til det cerebrale cortex.

Diencephalon Videresende sanseimpulser gennem kroppen, ligevægtssansen, bevægelse af øjne, synet, ansigtssensation, hørelse, udtale, respiration, synke og spytdannelse, lugte- og smagssans.

13

Figur 2. Hjernen set medialt mellem de to hemisfærer. [2]

1.3 Grå og hvid substans

På et MR-billede kan man se, at hjernen primært er opbygget af grå og hvid substans.

Grå substans (GM) består primært af nervecellekroppe. GM er fordelt ved overfladen af de cerebrale hemisfærer (cerebral cortex) og på overfladen af cerebellum (cerebellar cortex). GM findes også dybt i hjernen såsom i thalamus, hypothalamus og septal nuclei. Herudover findes det i midten af cerebellum (nucleus dentatus), hjernestammen og i rygmarven (anterior-, lateral- og posterior horn).

Hvid substans (WM) består primært af axoner, som er myeliniserede. Disse myelinskeder er lavet af fedt og protein og medvirker til at øge nerveledningshastigheden.WM findes i de dybere dele af hjernen og i overfladen af rygmarven. Ventriklerne, som er fyldte med CSF, er også omgivet af WM.

2. Serotonin

Serotonin er et neurotransmitterstof som findes naturligt i kroppen. Stoffet er en perifer signal mediator, idet omkring 80-90% af kroppens totale serotoninmængde findes i enterochromaffin-celler i tarmene. I blodet ophobes serotonin i trombocytterne for at hele skaderne efter en vasokonstriktion, dvs. en sammentrækning af blodkar [16], [17].

14

Figur 3. Et T1 -vægtet MR-billede. Modificeret fra [3].

Figur 4. Serotonins kemiske formel. [19]

2.1 Serotoninsystemet

Serotoninaktiviteten i hjernen er reguleret af natrium-klorid-afhængige transportører som er beliggende på cellens plasmamembran.Serotonin udskilles ikke på samme måde som andre neurotransmittere. Serotonin udskilles ved hjælp af serotonergic varicosities (en slags hævelse) ud i neuronal rummet, hvorimod andre neurotransmittere udskilles vha. den synaptiske terminal.Serotonin kan diffundere over en afstand på over 20 μm for at aktivere serotonin receptorer beliggende på naboneuronerne.

Raphe nuclei er en samling af neuronbundter opbygget af 9 neuronpar, som befinder sig langs hjernestammen. Dette er også stedet for serotoninudskillelse i hjernen. Neuroner, som udgår fra raphe nuclei, danner et neurotransmittersystem som udbreder sig til de forskellige dele af hjernen, dette system kaldes også serotoninsystemet. Man kan primært inddele udbreddelsen af neurotransmittersystemet i to dele afhængig af den rostrale og caudale del af raphe nuclei.

Fra den rostrale del udløber axonerne til thalamus, striatum, hypothalamus, nucleus accumbens, neocortex, cingulate gyrus, cingulum, hippocampus og amygdala.

Fra den caudale del af raphe nuclei udløber axonerne til det dybe cerebellar nuclei, cerebellar cortex og rygmarven.

15

Figur 5. På figuren ses serotonins pathway. Udskillelsen foregår ved den caudale og rostrale raphe nuclei. Fra den caudale nucleui føres serotnin til rygmarven og til cerebellem. Fra den rostrale nucleus føres serotonin til cerebellum og til forskellige dele af cerebrum; se de blå pile. [4].

2.2 5-HT receptorer samt serotoninproduktion

Serotonin betegnes også som 5-hydroxytryptamin (5-HT), og derfor betegnes serotoninreceptorerne som 5-HT receptorer.5-HT receptorerne kan inddeles i syv forskellige grupper af receptorer: 5-HT1, 5-HT2, 5-HT3, 5-HT4, 5-HT5A, 5-HT6 og 5-HT7. Alle disse receptorer, på nær 5-TH3, er G-protein opbyggede receptorer, dvs. de er heptahelicale receptorer (indeholder syv elementer). 5-TH3 er en ligandgated ionkanal. Nedenfor ses eksempler på de to forskellige receptor typer.

5-HTT er en betegnelse for serotonin transportørmolekylerne.

De forskellige receptorer har forskellige funktioner. Nogle af dem ændrer på cyklisk adenosin monofosfat (cAMP) niveauet, nogle øger inositol trifosfat (IP3) og diacylglycerol (DAG). Andre hæmmer adenylat cyklase og depolariserer plasma membranen. Alle disse receptorers funktioner påvirker hovedsageligt CNS og mave-tarm systemet.

16

Figur 6. Til venstre ses en heptahelical receptor og til højre ses en ligand gated ionkanal. [5] og [6]

Efter udskillelsen af serotonin vil det præsynaptisk-beliggende serotonintransportørmolekyle tilbagegive serotoninen til cellen for genoptagelse eller metabolsk nedbrydning. Under normale fysiologiske forhold vil genoptagelsesmekanismen af serotonintransportørerne bestå i at fjerne serotonin fra det ekstracellulære rum, men under dysfunktion kan der forekomme et forhøjet serotoninniveau i det ekstracellulære rum.Serotoninnedbrydelsen danner et produkt kaldet 5-HIAA. Denne er unødvendig for kroppen og udskilles derved med urinen.

17

Figur 7. Denne figur viser dannelsen af serotonin fra tryptophan samt det restprodukt (5-HIAA) som dannes under serotoninnedbrydelse. [7]

2.3 Tryptophan

Tryptophan er en af de 20 essentielle aminosyrer, som menneskekroppen har brug for. Det er en af de aminosyrer, som kroppen ikke selv kan producere, hvilket betyder at tryptophan skal indtages via kosten. Tryptophan er en biokemisk precursor for serotonin og niacin. I dette projekt prioteres serotonin fremfor niacin og derfor diskuteres niacin ikke yderligere. Serotonin syntetiseres ud fra tryptophan hydroxylase som kan ses på figur 7.

Tryptophan kan findes i bananer, chokolade, sesamfrø, solsikkefrø, yoghurt og æg mm. Serotonin som indtages oralt kan, til forskel fra tryptophan, ikke bryde blod-hjerne barrieren. Det vides, at de kendte mave-tarm komplikationer såsom fructose malabsorption og lactose intolerans skyldes dårlig absorption af tryptophan i tarmsystemet og reduceret tryptophanmængde i blodet.

2.3.1 Akut Tryptophan Depletion (ATD)

Akut Tryptophan Depletion (ATD) er en pulveropløsning, der består af nogle essentielle og ikke-essentielle aminosyrer opløst i vand (se Appendiks A.3 for yderligere beskrivelse). Indtagelsen af denne blanding tvinger kroppen til at bruge sit eget tryptophan-lager til at bygge proteiner og dermed sænke indholdet at serotonin i hjernen [20]. ATD påvirker derfor serotoninsystemet i hjernen som en helhed og ikke blot specifikke områder.

2.4 SSRI – Citalopram

I forbindelse med forsøget blev medikamentet Citalopram anvendt. Citalopram tilhører en bestemt lægemiddelgruppe kaldet Selective Serotonin Reuptake Inhibitor (SSRI). Lægemidler i SSRI-gruppen øger det ekstracellulære niveau af serotonin ved at hæmme genoptagelsen af serotonin i den præsynaptiske celle. Herved kommer der en øget mængde fri serotonin i den synaptiske kløft.

18

Figur 8. Citaloprams kemiske formel. [8]

2.5 Ketanserin

Ketanserin er en serotonin antagonist. Det vil sige at stoffet går ind og binder sig på receptorer, således at serotonin ikke kan binde sig. Ketanserin binder sig bedst til 5-HT2A receptorer. Det vides at ketanserin har en højere affinitet overfor 5-HT2A receptorer. Ketanserin kan også binde sig til de resterende 5-HT receptorer. Ketanserin bliver oftest brugt under operationer, fordi stoffet påvirker blodtrykket således at det sænkes.

3. MRI - Magnetic Resonance Imaging

En menneskekrop består af 75-80 % vand. Et vandmolekyle (H2O) består af to brintatomer og et enkelt oxygenatom. Under denne form for billeddannelse er det kernen i brintatomerne, der har hovedrollen. Kernen i et brintatom består af en proton, og har en egenskab som kaldes spin, hvilket betyder at protonen snurrer rundt om sin egen akse. Dette gør, at den får magnetiske egenskaber.

Hovedbestanddelen i en MR-scanner er en stor elektromagnet, hvor vindingerne i spolen genererer et magnetfelt B0, som er orienteret langs scannerens længdeakse.

19

Figur 9. Ketanserins kemiske formel. [9]

Figur 10. En protons spin. Modificeret fra [10]

Uden magnetfeltet er protonernes spin-retning fuldstændig tilfældige. Men på grund af feltet bliver spinnene delvist ensrettede. Denne delvise ensretning gør, at de mange protoner tilsammen danner en samlet magnetisering kaldet nettomagnetiseringen M0. Nettomagnetiseringen kan indføres i et 3D koordinatsystem og kan beskrives som en vektor med en størrelse og en retning. Vektoren M0

kan opløses i en xy-komposant (Mxy) og i en z-komposant (Mz), hvor sidstnævnte ligger parallelt med feltet B0 i ligevægt.

Når der er ligevægt vil Mz være på sit maksimale og Mxy være nul. Spinnene vil dreje cirkulært som en top omkring B0. Denne bevægelse kaldes præcession. Præcession omkring B0 foregår med en vis frekvens. Denne frekvens kan beskrives ved Larmor-ligningen

f =⋅B0

Ligningen fortæller, at frekvensen f er proportional med magnetfeltet, B0. For protoner er proportionalitetsfaktoren gamma, også kaldet det gyromagnetiske forhold, på 42 MHz/T. Protonernes resonansfrekvens i for eksempel en 3 Tesla scanner er på 126 MHz.

En anden hovedbestanddel af en MR-scanner er den såkaldte Radio Frequency (RF) spole. Denne udsender både en puls i form af radiobølger ved Larmorfrekvensen og opfanger radiobølgerne genereret af protonerne. I det næste betragtes en 90° puls. Den tilførte energi (radiobølgerne) vil få protonerne til at ændre stilling således, at Mz vil aftage og energitilførslen fortsættes indtil Mz er lig nul. Her vil Mxy nu være maksimal. Hvis energitilførslen standses, vil den absorberede energi afgives i form af elektromagnetisk energi ved Larmorfrekvensen. Mz vil nu stige og Mxy vil aftage til nul. Mxy komponenten roterer i xy-planet med Larmorfrekvensen og inducerer en strøm i RF-spolen. Den inducerede strøm er styrken af signalet. Når RF pulsen standses (dermed den tilførte energi), vil Mz stige eksponentielt fra 0 til M0 med en tidskonstant kaldet T1. Processen kaldes T1-relaktion og beskrives ved ligningen:

T1 kaldes også den longitudinale relaksation.

20

Figur 11. En MR-scanner, dens magnetiske felt og komposanter.

0 01

expztM M MT

= − ⋅ −

Tilsvarende vil Mxy være maksimal ved afslutningen af en RF puls. Alle protoner vil præcessere i fase. Dette betyder, at alle protoners magnetiske vektorer i xy-planet vil pege i samme retning og præcessere i samme takt. Som tiden går kommer protonerne mere og mere ud af fase, og til slut peger de enkelte protoners vektor i xy-planet i vidt forskellige retninger, således at protonernes fasekohærens aftager til nul. Denne defasing kaldes T2-relaksation og beskrives ved ligningen:

T2 kaldes også den transverse relaksationstid.

Når man taler om et MR-billede, så angives altid vægtningen af billedet. Et billede kan eksempelvis være T1- eller T2-vægtet. Der findes også andre vægtninger, men dem vil vi ikke kommer nærmere ind på her.

Et billede er T2 vægtet hvis parametrene for målingen er valgt således, at billedet fremhæver T2-forskelle. Ekkotiden, TE, er tiden fra man drejer magnetiseringen ud i det transversale plan, til man vælger at måle radiobølgerne. Repetitionstiden, TR, er tiden mellem gentagne målinger.

T1-vægtede billeder fås ved at anvende kort TR og kort TE, idet T1 kontrast derved maksimeres, og T2-kontrast minimeres.

T2-vægtede billeder fås ved at anvende lang TR og lang TE, idet T1 kontrast derved minimeres, og T2-kontrast maksimeres.

3.1 MPRAGE

En sekvens er en bestemt MR-målemetode. En måling er karakteriseret ved den sekvens af

21

Figur 12. Til højre ses forløbet for T1-relaktionstiden. Til venstre ses forløbet for T2-relaktionstiden. [11]

02

expxytM M

T

= ⋅ −

begivenheder, der udspiller sig før målingen. Man skelner mellem multi-slice og 3D-sekvenser. Disse navne refererer til optagelsesmåden og ikke til resultatet. I begge tilfælde er resultatet et 3D-datasæt. En oftest anvendt 3D-sekvens er MPRAGE som står for Magnetization Prepared Rapid Acquisition Gradient Echo. 3D-sekvenser anvendes næsten altid med kort repetitionstid TR, da målingerne ellers bliver meget tidskrævende. De er derfor næsten altid T1-vægtede.

Med 3D-målinger kan man få en høj rumlig opløsning i alle retninger. Ved 2D-sekvenser sættes opløsningen i billedplanen højt. Dette giver flotte billeder men meget aflange voxels. Når man skal analysere på eksempelvis GM og WM, giver det problemer med en 2D-sekvens. Når man skal bruge billeddata til voxel-baseret morformetri (VBM) er det netop vigtigt at alle voxels har samme størrelse, er kubiske og veldefinerede. Til dette kan den førnævnte 3D-sekvens bruges.

22

Forsøgsbeskrivelse

4. Forsøgspersoner

I forsøget deltog 26 højrehåndede raske voksne. Der var 17 mænd og 9 kvinder. Gennemsnitsalderen var 31.8 år med en spredning på 6.49. Ingen af personerne havde et stimulans misbrug eller en historie med neurologiske eller psykiske lidelser. Ingen af personerne havde prøvet at tage antipsykotiske eller antidepressive midler og deres neurologiske undersøgelser var normale. 4 personer trak sig tilbage midt i forsøget, hvilket gav MR data for 22 personer. Efter en gennemgang af rådata, fandt vi dårlig billedkvalitet hos to af forsøgspersonerne, som slutteligt gav et antal på 20 forsøgspersoner.

5. Forsøget

Forsøget er inddelt i fire dele. Derfor har vi 4 MR-billeder for hver forsøgsperson. Hver scanning er optaget med mindst en uges mellemrum. Rækkefølgen af de følgende scanninger var tilfældige:

Den første slags scanning var en kontrolscanning. Det vil sige at personerne ikke har indtaget nogen som helst form for psykofarmaka inden scanningen.

Den næste scanning var en SSRI scanning. Her fik forsøgspersonerne intravenøs tilførsel af SSRI-stoffet Citalopram med en dosis på 20 mg/h. Den første dosis blev givet to timer inden den første scanning og i løbet af scanningen, blev der tilført en dosis på 8 mg/h (~ 50 mg ialt).

Den næste scanning var en ATD scanning. Forsøgspersonerne fik af vide, at de skulle indtage en lav protein-holdig diæt dagen inden scanningen. Da de kom på hospitalet, drak personerne en 75 g tryprophan-fri pulveriseret blanding af essentielle og ikke-essentielle aminosyrer opløst i vand (XLYS, TRY Glutaridon, SHS International Ltd.). Forsøgspersonerne blev herefter scannet fem timer senere.

Den sidste slags scanning var en Ketanserin scanning. Ketanserin blev tilført intravenøst med bolus på 10 mg efterfulgt af 6 mg/h i omkring 75 minutter (~ 17.5 mg i alt).

23

Databehandling

6. Dataoptagelse og filformat

Scanningerne blev foretaget af en 3 Tesla Siemens trio scanner med High-Resolution 3D-struktur, T1-vægtet spin echo billeder blev optaget med tiderne TI/TE/TR =800/3.93/1540 ms, flip angle = 90°; 256 x 256 FOV; 192 slices.

MR-data bliver generet i scanneren som DICOM-filer. DICOM står for Digital Imaging and Communications in Medicine og er udviklet af American College of Radiology. Disse filer betragtes som rådata. Filerne bliver herefter konverteret til NIfTI-filer, som står for Neuroimaging Informatics Technology Initiative. Denne filtype er nyere og bliver brugt til databehandlingsdelen. Det er denne filtype som findes i arkiverne på computerne og bruges af SPM5.

7. Databehandling i SPM5

Til databehandlingen bruges programmet Matlab v. 7.3.0 (Mathworks, Sherborn, MA). Herfra bruges SPM5 (Ashburner og Friston, 2005; Wellcome Department of Imaging Neuroscience, London, www.fil.ion.ucl.ac.uk/spm), som køres simultant med Matlab. Til SPM5 bruges toolboxen VBM5 v1.14 (http://dbm.neuro.uni-jena.de).

Den type databehandling, som bruges i dette projekt, kan under ét betegnes som voxel-baseret morfometri (VBM).

I SPM5 bliver MR-billederne inddelt i voxels med en størrelse på 1x1x1 mm. Herefter bliver billederne inddelt i forskellige vævstyper (segmentering) og warpet til en standard skabelon hjerne, kaldet en template (spatial normalisering). Hernæst tages forbehold for, at der ikke skal tabes noget volumen information (modulering). Slutteligt udjævnes (smoothes) billederne for bedre statistisk validitet.

24

7.1 Unified Segmentering og spatial normalisering

Unified Segmentering og spatial normalisering er en automatiseret proces i SPM5, som adskiller de forskellige vævstyper i hjernen, korrigerer for magnetfeltets inhomogenitet og spatial normaliserer hjernen i én samlet omgang.

7.1.1 Segmentering på basis af voxel-intenstitet.

Den første del af segmenteringen er baseret på voxel-intenstitet. Fra et MR-billede kan intensitetsfordelingen for alle voxels afbildes i et histogram.

25

Figur 13. Oversigt over de forskellige databehandlingsdele.

Figur 14. Til venstre ses et T1-vægtet MR-billede. Til højre ses intensitetsfordelingen i et histogram. Ud af x-aksen ses intensiten og ud af y-aksen ses antal. Modificeret fra [12].

Segmentering baseret på voxel-intenstitet bruger intensitetsfordelingen til at adskille de forskellige væv fra hinanden. Jo længere ud af x-aksen, jo lysere er vævet på et T1-vægtet MR-billede. Et ideelt histogram ville have en enkelt søjle for hver vævstype, men på grund af støj i billedet, kommer der en Gaussisk fordeling for hvert væv.

Fordi man netop ikke kan adskille de forskellige væv i histogrammet, bruges derfor en modificeret Mixture of Gaussians (MOG) model. Denne model inddeler histogrammet i et antal Gaussiske kurver.

Først ser vi nærmere på en simpel MOG, som også er en almindelig Gaussisk sandsynlighedtæthedsfordeling. I denne simple MOG er sandsynligheden for at observere et punkt med intensiteten yi, hvor yi tilhører en Gaussisk fordelt vævsklasse k, givet ved:

hvor μk er middelværdien og σ2k er variansen.

For den førnævnte sandsynlighed for hvilket som helst voxel, uanset intensitet, tilhørende den Gaussisk fordelte vævsklasse k, er proportionen af voxels givet ved:

Hvis man bruger Bayes' regel, så er den fælles sandsynlighed for vævsklassen k og intensiteten yi

givet ved:

Ved at integrere over alle vævsklasser k, opnås sandsynligheden for de givne parametre som vist:

Således er sandsynligheden for alle voxels, altså hele datasættet, hvor det er forudsat at alle

26

( | )i k kP c k γ γ= =

( , | , , ) ( | , , ) ( | )i i k k k i i k k i kP y c k P y c k P c kµ σ γ µ σ γ= = = =

1

( | , , ) ( , | , , )K

i i i k k kk

P y P y c k µ σ γ=

= =∑µ σ γ

Figur 15. På figuren ses et histogram for en intensitetsfordeling som er inddelt i tre Gaussiske kurver. [13]

( ) 2

22

1( | , , ) exp22

i ki i k k

kk

yP y c k

µµ σ

σπ σ

−= = −

elementerne er uafhængige givet ved:

Det vil sige at

Sandsynligheden er maksimeret med hensyn til de ukendte parametre (μ, σ og γ), når den følgende funktion er minimeret:

Hvilket vil sige

7.1.2 Biaskorrektion

Et bias felt bliver nu inkluderet i modellen. Dette gøres for at korrigere for magnetfeltets inhomogenitet. Det inhomogene magnetfelt gør, at intensitetsværdierne gennem hele hjernen ikke har samme nulpunkt. For eksempel vil det sige, at en bestemt værdi i venstre side af MR-billedet tilhører GM , mens den samme værdi i højre side tilhører WM.

Bias feltet bliver inkluderet i modellen ved hjælp af nogle ekstra parametre, som tager højde for denne inhomogenitet. Bias feltet modellerer variationen i elementet i og er betegnet som

hvor β er en vektor med ukendte parametre. Intensiteter fra den k'te cluster antages at være normalfordelte med en middelværdi på

og en varians på

Herved bliver sandsynligheden for at observere intensiteten yi :

27

1( | , , ) ( | , , )I

iiP P y

== ∏µ σ γ µ σ γy

2

21 21

( )1( | , , ) exp22

KI i kki

k kk

yP µγσπ σ=

=

− = − ∑∏µ σ γy

( )iρ β

( )k

i

µρ β

2

( )k

i

σρ

β

( ) 2

21 1 2log exp

22I K i kki k

kk

yø

µγσπ σ= =

− = − − ∑ ∑

log( ( | , , ))ø P= − y µ σ γ

Og herved bliver den førnævnte funktion ø nu til

7.1.3 Segmentering på basis af tissue probability maps.

Nu forklares den del af segmenteringen, som bruger et såkaldt tissue probability map (TPM). Den data, som er brugt i SPM5 til TMP kommer fra en modificeret udgave af ICBM Tissue Probalistic Atlas.1

Implementeringen bruger TMP for alle tre vævstyper plus en ekstra, som har værdien 1 minus summen af de tre andre. Modellen bliver modificeret således, at der tages højde for disse TMP'er. I stedet for at bruge stationære proportioner, som før var givet ved

antages det nu, at den tidligere sandsynlighed kan variere over et antal voxels. På denne måde er den forrige sandsynlighed af en voxel i, som tilhører den vævsklassen k er givet ved

1 Dette er tilgængeligt fra http://www.loni.ucla.edu/ICBM/ICBM_Probalistic.htm

28

2

22

( ( ) )1( | , , , ) ( ) exp22

i i ki i k k i

kk

yP y c k ρ µµ σ ρσπ σ

−= = −

ββ β

Figur 16. Til venstre ses et rå MR-billede. På det rå billede kan man se magnetfeltets inhomogenitet i form af varierende nuancer i GM og WM. I midten ses biasfeltet. Dette biasfelt bliver ganget på det rå MR-billede og ophæver nuanceforskellene. Til højre er bias feltet ganget på det rå MR-billede. Således korrigeres for magnetfeltets inhomogenitet, og det kan ses at billedet ikke har nuanceforskelle.[13]

( | )i kP c k γ= =γ

1

( | ) k iki K

j ijj

bP c kb

γ

γ=

= =∑

γ

( ) 2

21 1 2

( )log ( ) exp

22I K i i kk

ii kkk

yø

ρ µγρσπ σ= =

− = − − ∑ ∑ β

β

hvor bik er sandsynligheden for det pågældende væv fra klasse k i voxel i.

Antallet af Gaussiske kurver, som er brugt til at repræsentere intensitetsfordelingen for hver vævsklasse, kan være større end 1. Med andre ord kan et TPM for en vævsklasse være delt mellem adskillige Gaussiske kurver. Antagelsen om at en enkelt Gaussisk fordeling for hver vævsklasse holder derfor ikke. En voxel består ikke kun af en slags vævstype, men indeholder et signal fra flere forskellige væv.

7.1.4 Deformerbare TMP'er

Fordi ingen hjerner er 100% identiske, er det vigtigt at tilpasse TPM til den enkelte forsøgspersons hjerne. Det vil sige, at der skal tilføjes et skridt, som kan deformere TPM til den pågældende persons hjerne. Ved dette skridt tilføjes endnu parameter α. Denne muliggør registrering til et standard rum.

Herefter kan dette inkluderes i ø, som også kaldes OBJEKT-funktionen (Ø). Denne bliver nu:

Det næste skridt er at estimere de bedste parametre. De bedste parametre er dem, som kan minimere OBJEKT-funktionen. Der findes et antal metoder til at optimere denne funktion. Vi vil ikke gå nærmere ind på dette.

29

Figur 17. Tissue Probality Maps bliver implemteret i segmenteringsprocessen. Rækkefølgen for de forskellige væv, startende længst fra venstre er: GM, WM, CSF og "andet". [14]

1

( )( | , )( )

k iki K

j ijj

bP c kb

γ

γ=

= =∑

αγ αα

( ) 2

21 1 21

( )( ) ( )log exp2( ) 2

I K i i ki k ikKi k

kk ik kk

ybØb

ρ µρ γσγ π σ= =

=

− = − − ∑ ∑∑

ββ αα

7.1.5 Spatial normalization

Et andet skridt i Unified segmentering og spatial normalisering er normaliseringsdelen. Dette kaldes også warping. Det går ud på normalisere alle hjernerne til en standard template. Alle hjerner er forskellige, og for at kunne sammenligne dem, skal de normaliseres. Til dette er der involveret to slags transformationer; en affine transformation og en ikke-lineær transformation.

Formålet med affine transformation er at fitte hjernen til en template. Dette foregår ved at bruge tolv parametre. Denne transformation er lineær og tilpasser hjernen ved skalering, shear, rotation og translation.Denne transformation laver blot et overall fit.Ved en ikke-lineær transformation, antages det at den affine transformation har fundet sted. Hjernen er dog stadig deformeret i forhold til template. En ikke-lineær transformation indeholder ikke skalering, shear, rotation og translation. Ved en ikke-lineær transformation er alle deformationerne fundet ved brug af omkring 1000 lav-frekvente 3D cosinus transformationsbaser.

7.2 Modulering

I det foregående afsnit med spatial normalisering, ændres volumen i visse regioner af hjernen i forhold til template. Det vil sige, at visse områder af hjernen ekspanderer mens andre trækker sig sammen. Hele formålet med denne VBM analyse er at måle regionale ændringer i mængden af voxels indeholdende GM. Derfor ønskes bibeholdelse af den samme mængde GM, selvom man sammenligner med en template. Templaten er forskellig i visse regioner af hjernen sammenlignet med forsøgspersonerne. Derfor moduleres hjernen ved at multiplicere voxel-intensitetsværdien af

30

Figur 18. En hjerne bliver fittet til template ved affine registrering og ikke lineær registrering. [14]

det normaliserede GM billede med den tilsvarende Jacobi-determinant af deformationsfeltet. På denne måde bliver mængden af GM i den enkelte voxel, som er et produkt af GM densitet og voluminet af den deformerede voxel, uændret ved modulering.

Modulering = (voxel-intesitets-værdi) x (Jacobian determinant) = (bibeholdelse af volumen information)

Jacobimatricen er givet ved:

Determinanten af denne matrix koder for den relative volumen af deformerede og udeformerede strukturer.

7.3 Smoothing

Efter de forgående skridt skal GM billedet smoothes. Dette gøres ved at billedet bliver foldet med en isotropisk (ens i alle retninger) Gaussisk kernel. Det vil sige at den enkelte voxel indeholder gennemsnitsværdien af de omkringliggende voxels.

Den Gaussiske kernel kan være med Full Width Half Maximum (FWHM) på mellem 4 og 16

31

1 1 1

1 2 3

2 2 2

1 2 3

3 3 3

1 2 3

y y yx x xy y yJx x xy y yx x x

∂ ∂ ∂ ∂ ∂ ∂ ∂ ∂ ∂= ∂ ∂ ∂ ∂ ∂ ∂ ∂ ∂ ∂

Figur 19a. Til venstre ses et warped GM billede. I midten er et map over Jacobideterminaterne fra warpet. Til højre er det warpede billede og Jacobi determinant-billedet multipliceret med hinanden. Således går intet volumen tabt. [15]

millimeter. Når man smoother billeder, medvirker det til, at billederne bliver mere normalt fordelt, hvilket øger validiteten for statistiske tests. I vores forsøg sætter vi den Gaussiske kernel til at være 8 millimeter.

I ovenstående illustration kan en Gaussisk kurve ses. Denne har en middelværdien (μ) på 0 og en spredning (σ) på 3.4. Det vides at FWHM benyttes til udregningen af den faldende voxelintensitet. På x-aksen kan det ses at x-værdierne ligger mellem -4.0 og 4.0. På y-aksen kan det ses at half maximum er 2.0.

For en Gaussisk klokke er FWHM givet ved formlen

Altså er FWHM = 8 i dette tilfælde. Dette beskriver hvor mange voxels der i intervallet fra -4.0 til 4.0, hvis det antages at voxelstørrelsen er 1x1x1 mm.

De 8 mm, som man har smoothed med i dette tilfælde, beskriver altså bredden af den gaussiske kurve. Betragtes voxelintensiten kan det siges, at intensiteten er 100% ved middelværdien, og når man går 4 mm ud til enten højre eller venstre, vil den falde til at være blot 50%.

Smoothing spiller stor rolle i undertrykkelsen af non-spatial fordelt støj fra nabovoxels. Herudover kan smoothing også være med i minimeringen af anatomiske forskelle mellem de enkelte individer. Et af ulemperne ved smoothing er at spatial opløsning bliver begrænset.

32

2 2ln(2)FWHM σ= ⋅

Figur 19b. En Gaussisk kernel med FWHM på 8 mm.

33

Figur 19c. Således ser billederne ud efter de har været igennem de tre trin. [3]

General Lineær Model

8. Matrixformulering

Lad os for eksempel sige, at vi laver et eksperiment, hvor man ønsker at finde blodgennemstrømningen gennem en enkelt voxel Yj, hvor j = 1,...,J og indikerer antallet af observationer. Yj er en random variabel. For hver observation er der også fundet et sæt L (L< J) antal variabler (som hver er fundet uden fejl), disse kaldes xjl, hvor l = 1,...,L. En generel lineær model (GLM) forklarer Yj som en linearkombination af variablerne xjl plus en fejl:

Her er betaerne ukendte parametre. Fejlene εj er uafhængige og identisk normal fordelte random variabler med middelværdi nul og med variansen σ2

Det vil altså sige, at fejlen er

GLM kan også skrives på matrixform. Inden da skal man indse, at dette kan gøres fordi man har flere observationer. For hver observation er der givet en ligning:

Som på matrixform kan skrives:

Som til sidst kan skrives på notationen

34

1 1j j jl l jL L jY x x xβ β β ε= + ⋅ ⋅ ⋅ + + ⋅ ⋅ ⋅ + +

2(0, )j Nε σ:

1 11 1 1 1 1

1 1

1 1

l l L L

j j jl l jL L j

J J Jl l JL L J

Y x x x

Y x x x

Y x x x

β β β ε

β β β ε

β β β ε

= + ⋅ ⋅ ⋅ + + ⋅ ⋅ ⋅ + +=

= + ⋅ ⋅ ⋅ + + ⋅ ⋅ ⋅ + +

== + ⋅ ⋅ ⋅ + + ⋅ ⋅ ⋅ + +

M M

M M

1 11 1 1 1 1

1

1

l L

j j jl jL j j

J Jl JL J JJ

Y x x x

Y x x x

x x xY

β ε

β ε

β ε

= +

L LM M O M O M M M

L LM M O M M MOM

LL

• Y er den observerede data• X er design matricen• β indeholder parametre, som kan estimeres og testes• ε er de normalt fordelte fejl

Når man har udført et eksperiment, er den observerede data i variablen Y. Herefter ønsker man at bestemme parametrene, ved brug af metoden ordinary least squares (OLS). Herved finder man det bedste fit til den data, der ligger i Y. De estimater man får fra OLS-metoden, er parameter-estimater, som minimerer the residual sum of squares. Det vil altså sige

Dette bliver minimeret når

Ovenstående ligning er den l'te række af

Herved er least squares estimater, betegnet med en hat på, givet ved

Hvis (XTX) er invertibel, hvilket den er hvis, og kun hvis, designmatricen X har fuld rang, så er least squares estimater:

Hvis X har lineært afhængige søjler, så er dens rang ikke fuld. Det vil sige, at

er singulær og ikke har nogen invers. I dette tilfælde er modellen overparametriseret. Det vil sige, at der findes et uendeligt antal parametersæt, som kan beskrive præcis den samme model.

35

21 1

1

( )J

j j jL Lj

S Y x xβ β=

= − − −∑ % %L

( )TX X

Y = Xβ + ε

°° ° 2

1

2 ( )( )J

l Ljl j jl jLj

S x Y x xβ ββ =

∂ = − − − −∂ ∑ L

°( )T TX Y X X β=

µ( )T TX Y X X β=

µ 1( )T TX X X Yβ −=

9. Parret t-test

Man kan lave mange forskellige statistiske teste med GLM. I vores projekt ønsker vi at finde, om der er nogen forskel på GM mellem kontrolscanningen og en af de tre andre scanninger. Til dette kan man lave en parret t-test. Det vil sige, at vi har et skema, som ser sådan ud eksempelvis for kontrol og Citalopram.

Forsøgsperson Mængde af GM ved kontrolscanning. (Gruppe 1)

Mængde af GM ved scanning med Citalopram. (Gruppe 2)

Forskel

1 x11 x12 x11-x12

2 x21 x22 x21-x22

... ... ... ...N xN1 xN2 xN1-xN2

μ1 μ2 μ1-μ2

Den parrede t-test er en statistisk test, som sammenligner middelværdien fra de to observerede grupper. Kriterierne for at lave en parret t-test er:

• Antallet af Scanninger i Gruppe 1 skal være det sammen antal som i Gruppe 2, så alle observationer kan ordnes i par. Således er der for hver scanning i Gruppe 1, en tilhørende scanning i Gruppe 2.

• Forsøgspersonerne er uafhængige af hinanden. Det vil sige, at de er taget tilfældigt ud af befolkningen.

• Den observerede forskel mellem Gruppe 1 og Gruppe 2 er normalfordelt.• Desuden skal observationerne næsten være normalfordelt hvis antallet at forsøgspersoner

ikke er stort. Derimod hvis antallet at forsøgspersoner er stort, er der ingen krav til fordelingen af observationerne.

9.1 Hypoteseformulering af en parret t-test

I analysen af data foregår der en statistisk test, som tester en nulhypotese. I princippet kan man sammenligne alle grupper med hinanden. I denne rapport er det interessant at sammenligne kontrol scanningen med hver af de tre andre grupper (X = ATD, Ketanserin, Citalopram). Nulhypotesen formuleres således, at man ser på om middelværdien for de to grupper er ens:

hvoraf μ står for middelværdien.

Desuden skal man formulere en alternativ hypotese. Den alternative hypotese beskriver det man gerne vil teste for. Dette kan være om middelværdien fra kontrolgruppen er større eller mindre (en-

36

0 : kontrol XH µ µ=

sidet) eller forskellig (to-sidet) end en af de tre andre grupper. Dette opstilles på følgende vis

Når man laver disse tests, kan man enten acceptere nulhypotesen eller forkaste nulhypotesen.

Et eksempel kan være, at man tester på to grupper. Gruppe 1 har en middelværdi på 10 og gruppe 2 har en middelværdi på 12. Antallet af testpersoner er 12 i hver gruppe. Den alternative hypotese er, at middelværdien er forskellig fra hinanden. Ud fra denne får man en t-værdi på t = -2.65 med 22 frihedsgrader og en p-værdi på p = 0.0147. En lav p-værdi peger i retning af, at nulhypotesen skal forkastes, da den indikerer usandsynligheden for at en given værdi vil blive observeret fra denne population, hvis nulhypotesen er sand. Eftersom p = 0.0147, betyder det at hvis populationen havde ens middelværdi (som jo er nulhypotesen), er der ca. en 15 ud af 1000 chance for at få en middelværdi, der er lig hinanden.Man kan aldrig være 100 % sikker på begge af sine hypoteser, men man kan konkludere, om der er nok bevis for at forkaste nulhypotesen eller acceptere den.Man kan vælge forskellige signifikantsniveauer. Det vil sige ved hvilken cutoff punkt man vælger at beslutte om der er signifikants. Det mest brugte signifikantsniveau er 0.05.

I SPM5 bruges design matricen til at lave de parrede t-tests. I kontrastvektoren indtastes den alternative hypotese, altså hvad man ønsker at teste. En kontrastvektor består af en masse nuller og nogle et-taller med forskelligt fortegn. I figur 20 ses et eksempel på en kontrastvektor og en designmatrix. I dette tilfælde ses det, at kontrastvetoren består af 20 nuller og et -1 og 1. Det vil sige, at man her tester den alternative hypotese om, at Gruppe 1 er mindre end Gruppe 2.

37

:A kontrol XH µ µ>

:A kontrol XH µ µ<

:A kontrol XH µ µ≠

Figur 20. Øverst ses kontrastvektoren og nederst ses designmatricen

Når man laver statistiske hypoteseberegninger, så kan man lave 2 slags fejl.Type I fejl: når man forkaster nulhypotesen, når den skulle have været accepteret. Dette kaldes også falske positive, eller en alpha-fejl.

Type II fejl: Når man accepterer nulhypotesen, når den skulle have været forkastet. Dette kaldes også falske negative eller en beta-fejl

Beslutning Nulhypotese SAND Nulhypotese FALSKForkastelse af nulhypotese

Type I fejl Korrekt

Accept af nulhypotese

Korrekt Type II fejl

Når man laver forsøg generelt er det vigtigt, at man ikke laver type I fejl. Dette kan lede til, at man får en masse positive resultater, som i virkeligheden ikke er sande. Der findes dog forskellige metoder til at korrigere for disse fejl. Disse er beskrevet nedenunder.

9.2 False Discovery Rate (FDR)Hvis man for eksempel har 1000 voxels med en p-værdi på 0.05, så er der chance for at 50 af dem er type I fejl. For at korrigere for disse falske positive bruges FDR korrektion.

FDR korrektion består i at kunne forudsige en forventet del af falske positive blandt de voxels, som blev udnævnt til at være sande. Selve proceduren er simpel at implementere og går ud på, at beregne de ukorrekte p-værdier for hver voxel og sortere dem. Metoden er som følger:

1. p-værdierne for hver voxel rangeres fra den største til den mindste.2. Den største p-værdi forbliver som den er.3. Den næststørste p-værdi multipliceres med det totale antal voxel divideret med rangen4. Som ovennævnte bare divideret med en rang lavere.

Et eksempel kan være at vi har 1000 voxels og en fejlrate på 0.05

Voxel nummer P-værdi (fra størst til mindst)

Rang Korrektion Er den pågældende voxel signifikant?

1 0.1 1000 Ingen 0.1 > 0.05 NEJ2 0.06 999 0.06·(1000/999) =

0.060060.06006 > 0.05 NEJ

3 0.04 998... 0.04·(1000/998) = 0.04008

0.04008 < 0.05 JA

38

Som man kan se på eksemplet ovenover, så bliver korrektionen mere og mere hård når p-værdien er lille, for dette gør således at rangen også bliver meget lille. Det vil sige at den lille p-værdi bliver multipliceret med noget stort, hvilket bevirker at voxelen ikke bliver dømt til at være signifikant.Grunden til at denne korrektion bliver brugt er fordi, de enkelte voxels i hjernen er afhængige af hinanden.

9.3 Familywise Error (FWE) og Bonferroni korrektion

Når man laver VBM analyser, så er der rigtigt mange voxels involveret og derfor bliver der også lavet rigtigt mange t-tests. FWE raten er sandsynligheden for at observere én eller flere type I fejl når man laver multiple parrede t-tests. Sandsynligheden for FWE er:

hvor alpha er signifikantsniveauet og n er antal målinger.

Hvis man for eksempel har 1000 voxels og en p-værdi på 0.05, så er sandsynligheden for at observere en type I fejl på 50 gange. For at undgå disse fejl bruges Bonferroni korrektion. Denne ændrer p-værdien til 0.05/1000 = 0.00005. Derved bliver denne korrektion meget hård, da den ikke tillader mange målinger at slippe igennem.Bonferroni-korrektionen anvendes når det drejer sig om uafhængige parametre, men i dette forsøg er parametrene afhængige. Dette er grunden til at Bonferroni-korrektionen ikke kan benyttes i dette projekt.

39

1 (1 )FWE nP α= − −

Resultater

Til resultatbehandlingen benyttes SPM5's Anatomy Toolbox. Denne toolbox kan finde hvilken del af hjernen der er tale om ud fra koordinater. Toolboxen bruger Broadmann's areas (BA) til at identificere hvilke områder der er tale om. En oversigt over BA kan ses i Appendiks A.2

10. Kontrolscanning versus Ketanserin

10.1 Kontrolscanning > Ketanserin, p = 0.001 uden FDR korrektionFørst prøves med en p-værdi på 0.001 uden FDR korrektion. Følgende SPM resultat kommer frem:

40

Figur 21. Kontrolscanning > Ketanserin, p = 0.001 uden FDR korrektion. Det blå kryds viser hvor der er globalt maksimum t-værdien.

På figur 21 ses øverst et SPM resultat i gråtoner over de områder der har signifikants. Figuren er vist i 3 planer. Til højre ses den designmatrix, som forklarer hvilken t-test man laver og det nederste billede illustrerer ligeledes de områder i hjernen der har signifikants. Dette er i farver og er bedre til at illustrere resultaterne. Farveskalaen har her en t-værdi fra 0 til 5-6. Jo højere t-værdi, des lysere er det på billedet. Ligeledes ses det at jo lavere t-værdi, des rødere er det på billedet. De områder hvor der absolut ingen signifikants er, er ikke markeret og dermed ikke røde.

10.2 Kontrolscanning > Ketanserin, p = 0.05 med FDR korrektion

41

Figur 22. Kontrolscanning > Ketanserin, p = 0.05 med FDR korrektion. På dette billede er der ikke noget at se da korrektionen ikke gør nogle voxels signifikante.

I det FDR-korrigerede billede kan det ses, at der absolut ingen signifikants er. Under denne korrektion bliver ingen voxels dømt til at være signifikante. Vi har lavet FDR korrektion med alle vores statistiske tests, og hver gang er der ikke kommet noget signifikant frem. Derfor vil vi ikke vise de FDR-korrigerede billeder i efterfølgende resultatbehandling.

For at danne et bedre billede af resultaterne, vil der fremover blive benyttet en p-værdi på 0.01. Det vil sige at flere områder vil udvise signifikants, da signifikantsniveauet øges. Fremover medtages ikke designmatricen og de øverste billeder med gråtonerne.

10.3 Kontrolscanning > Ketanserin, p = 0.01 uden FDR korrektion

Man kan i SPM5 tilføje en tabel som giver et overblik over de forskellige signifikante områder i hjernen som vist forneden.

42

Figur 23. Kontrol > Ketanserin, p = 0.01 uden FDR korrektion. Det blå kryds markerer det globale maksimum for t-værdien.

Tallene i den første blå cirkel beskriver nummeret på den angivne cluster (en ansamling af voxels), og denne indeholder, som det kan ses ved cirkel nr. 2, 2443 voxels. Cirkel nr. 3 fortæller hvad den højeste t-værdi er i pågældende cluster. Sidste cirkel beskriver koordinaterne for clusteren. Det er disse 3D koordinater der kan bruges til at bestemme hvilken struktur, der netop er i denne cluster ved hjælp af toolboxen.I følgende resultatbehandling vil vi koncentrere os om clusters med mange voxels (over 500) og en høj t-værdi, eftersom disse er mest relevante i denne sammenhæng.

På ovenstående tabel er de tre største clusters blevet betragtet. Disse clusters er henholdsvis på 2443, 2318 og 583 voxels. Den største cluster på 2243 voxels omkring [23, 17, 5] tilhører højre putamen. Den næststørste cluster med 2318 voxels ved [-19, 34, 40] er ved den venstre superior del af frontallappen. Og clusteren på 583 voxels med koordinaterne [-17, -11, 61] ligger ved BA 6 som er frontal cortex. Disse områder er alle en del af serotonin pathways.

43

Tabel 1. Denne tabel viser for når Kontrol > Ketanserin, p =0.01 uden FDR korrektion. Derudover kan store clusters med høj t-værdi og deres beliggenhed også ses heri.

10.4 Kontrolscanning < Ketanserin, p = 0.01 uden FDR korrektion

På figur 24 testes der for om mængden af GM for ketanserin er større end for kontrol hos forsøgspersonerne. I tabel 2 kan det ses at de mest relevante clusters er på 2318, 1165, og 882 voxels. Clusteren på 2318 voxels ligger ved koordinaterne [12, 56, -3] som er ved den højre frontallobe. Den næststørste cluster på 1165 voxels ligger ved [22, -3, -29] og tilhører motor cortex ved den højre hemisfære. Clusteren med 882 voxels omkring [9, 52, 28] ligger i superior del af højre frontallobe.

44

Figur 24. Kontrol < Ketanserin, p = 0.01 uden FDR korrektion. Her er der observeret signifikante områder i den højre frontallobe.

Tabel 2. Kontrol < Ketanserin, p = 0.01 uden FDR korrektion. Denne tabel viser clusterstørrelsen samt t-værdien for når mængden af GM er større for ketanserin end for kontrolscanningen hos forsøgspersonerne.

11. Kontrolscanning versus ATD

11.1 Kontrolscanning > ATD, p = 0.01 uden FDR korrektion

På figur 25 ses den ændring der fremkommer når der testes for mængden af GM for kontrolscanningen er større end for ATD. Ved denne tabel ses kun en enkel stor cluster som er ved koordinaterne [-29, -57, -67]. Denne har den største t-værdi på 4.98. Ved hjælp af toolboxen og figur 25 kan det ses, at den største cluster ligger uden for hjernen. Den ligger under den venstre cerebellum og dette ligger uden for GM.

45

Figur 25. Kontrol > ATD, p = 0.01 uden FDR korrektion. Det markerede område er hvor der er global maksimum for ændring af struktur.

Tabel 3. Kontrol > ATD, p = 0.01 uden FDR korrektion. Denne tabel viser hvor mange voxels de pågældende clusters indeholder. Derudover angiver tabellen også om clusteren er signifikant.

11.2 Kontrolscanning < ATD, p = 0.01 uden FDR korrektion

På figur 26 er der testet for om mængden af GM større for ATD end for kontrolscanningen hos forsøgspersonerne. Den største cluster på tabel 4 er på 69749 voxels og ligger ved [-38, -48, -2]. Denne cluster ligger ved venstre hippocampus.

46

Figur 26. Kontrol < ATD, p = 0.01 uden FDR korrektion. På denne figur ses de ændringer når der testes for om mængden af GM er større for ATD end for kontrolscanningen.

Tabel 4. Kontrol < ATD, p = 0.01 uden FDR korrektion. Denne tabel viser clusterstørrelse samt t-værdier således at områdernes signifikants kan bestemmes.

Den næststørste cluster har 1716 voxels og koordinaterne [5, -30, 49]. Denne cluster befinder sig ved Brodmann's Area 6, som består af præmotor cortex. Denne er også en del af frontal cortex. Den sidste cluster som betragtes har 1484 voxels og er ved [-4, -30, 54]. Dette område ligger ved Brodmann's Area 4a, som tilhører det primære motor cortex.

Udover de ovennævnte ses der store områder med signifikants. Disse clusters ligger oven over cerebellum både på højre og venstre hæmisfære.

12. Kontrolscanning versus Citalopram

12.1 Kontrolscanning > Citalopram, p = 0.01 uden FDR korrektion

47

Figur 27. Kontrol > Citalopram, p = 0.01 uden FDR korrektion. I dette tilfælde er det når der testes for om GM's mængde er større for kontrolscanningen end ved citalopram.Krydset markerer globalt maksimum for t-værdi.

På figur 27 ses nogle forholdsvis små områder med strukturændringer. Der ses også et område, som ligger uden for hjernen ved cerebellum.På tabel 5 ses ikke store clusters, dette afspejles også i figur 27. Den største cluster er kun på 942 voxels med koordinaterne [-46, -29, -36] og ligger uden for det ønskede måleområde. Denne cluster ligger ved cerebellum i højre side af hjernen. En anden mere relevant cluster har 688 voxels med koordinaterne [-28, 7, 29]. Denne cluster ligger tæt ved BA 44 og 45, som er en del af frontal cortex.

48

Tabel 5. Kontrol > Citalopram, p = 0.01 uden FDR korrektion. Denne tabel viser clusterstørrelse samt t-værdier for de pågældende områder der har ændret sig når GM's mængde for kontrolscanningen er større end for citalopram.

12.2 Kontrolscanning < Citalopram, p = 0.01 uden FDR korrektion

På figur 28 ses der en store områder med ændringer ved cerebellum og synscortex. På tabel 6 ses det, at den største cluster består af 20959 voxels med koordinaterne [0, -63, -13]. Denne ligger mellem højre og venstre cerebellum. Den næststørste cluster er på 11265 voxels og ligger omkring [46, -5, 57], som er i BA 6, dvs. ved præmotor cortex.

49

Figur 28. Kontrol < Citalopram, p = 0.01 uden FDR korrektion.Krydset markerer globalt maksimum for t-værdi.

Tabel 6. Kontrol < Citalopram, p = 0.01 uden FDR korrektion. Tabellen angiver clusterstørrelse samt t-værdier der er med til at bestemme hvor signifikant figuren foroven (figur 28) er.

Den sidste cluster som betragtes består af 2720 voxels. Denne clusters ligger ved [-28, -97, 3] som tilhører BA 18. Dette område er ved det occipitale cortex. Her ses de signifikante områder nær parietallappen og occipitallappen. Den cluster, som har den største t-værdi på 7,56 ligger ved synscortex.

13. Citalopram vs. ATD

Til slut har vi valgt at sammenligne de to ekstremer; Citalopram og ATD. Dette gøres fordi vi er interesserede i at se på strukturen når der er meget fri serotonin og når der ikke er serotonin til stede.

13.1 Citalopram > ATD med p = 0.01 uden FDR korrektion

50

Figur 29. Citalopram >ATD, p = 0.01 uden FDR korrektion. På figuren betragtes situationen når mængden af GM er større for Citalopram end ATD.

Her betragtes clusteren med voxelstørrelsen 2057 og koordinaterne [0, -53, -66]. Denne cluster ligger udenfor cerebrum, under cerebellum og nær hjernestammen. Dette kan også ses på figur 29.Herudover er der en anden relevant cluster med voxelstørrelsen 1001 omkring [22, 58, -19]. Denne cluster ligger forrest i pandelappen.

På figur 29 foroven ses den største cluster udenfor hjernen, under cerebellum, nær hjernestammen. Der ses dog et lille område som har en cirkulær form i den venstre hemisfære ved den venstre insular lobe.På figuren ses at clusteren under cerebellum ser ud til at ligge ved basilar arterierne.

51

Tabel 7. Citalopram >ATD, p = 0.01 uden FDR korrektion. Tabellen viser de markerede områder (repræsenteret i form af voxels) og disses signifikants (i form af de angivne t-værdier).

13.2 Citalopram < ATD med p = 0.01 uden FDR korrektion

I tabellen skal der lægges mærke til, at t-værdien går helt op til 8.61.Den største cluster består af 85674 voxels med koordinaterne [-37, -70, -6]. Denne cluster ligger i området ved højre og venstre fusiform gyrus som er en del af temporalloben, oven over cerebellum på begge hemisfærer. Den næststørste cluster har 2325 voxels omkring [-32, 8, 30]. Denne cluster

52

Figur 30. Citalopram < ATD, p = 0.01 uden FDR korrektion. Det blå kryds markerer globalt maksimum for t-værdi.

Tabel 8. Citalopram >ATD, p = 0.01 uden FDR korrektion. Denne tabel viser clusterstørrelsen samt t-værdien for de pågældende clusters.

ligger i BA 44, som tilhører frontal cortex. Den sidste cluster, som er antaget til at være relevant har voxelstørrelsen 1312 med koordinaterne [14, -21, -21], ligger ved den venstre hippocampus.

14. T-tests konstrueret af Splus software

For at få et overblik, om der er sket en volumenændring af GM, laves en parret t-test for de forskellige situationer som ovenfor. Når man laver databehandling i SPM5, så kommer den med volumen for GM, WM og CSF. Det er således volumet for GM, som bruges her.

α = 1% Kontrol > Ketanserin

Kontrol < Ketanserin

Kontrol > ATD

Kontrol < ATD

Kontrol > Citalopram

Kontrol < Citalopram

Cita > ATD

Cita < ATD

T - værdi

0.454 0.454 -3.773 -3.773 -2.759 -2.759 -1.064 -1.064

P - værdi

0.328 0.672 0.999 0.001 0.994 0.006 0.850 0.150

Konf. int.

[-3.542;∞[ ]-∞;5.082] [-10.312;∞[ ]-∞;-2.014] [-7.615;∞[ ]-∞;-0.315] [-7.444;∞[

]-∞; 3.048]

Forkast eller accept?

Accept af H0

Accept af H0

Accept af H0

Accept af H0

Accept af H0

Accept af H0

Accept af H0

Accept af H0

Ud fra denne tabel kan det ses, at ingen af de alternative hypoteser bliver accepteret. Altså kan man ikke sige med sikkerhed om der er sket en volumen ændring af GM fra ovenstående test. I Appendiks A.1 ses den fulde test fra programmet Splus.

53

Diskussion

I det følgende diskussionsafsnit vil vi diskutere de fundne resultater. Herudover vil vi komme med forslag til forbedring af forsøget. Til sidst vil vi diskutere mulige forbedringer til databehandling i SPM5.

15. Diskussion af resultater

Under en VBM analyse, vil man oftest kigge efter bilaterale ændringer, da serotonin forventes at udbredes på begge hemisfærer. Ved ændring på begge hemisfærer, kan dette være med til at verificere, at resultaterne ikke blot skyldes statistisk usikkerhed.

På figur 21 kan der umiddelbart ikke ses bilaterale ændringer. Ændringerne befinder sig ved højre putamen og den venstre superior frontallobe. Disse områder er med til at styre følelserne og humøret. Man kan diskutere hvorvidt clusterstørrelsen har betydning for de signifikante områder. Putamen er kun et lille område i hjernen, som derfor ikke indeholder mange voxels. Dette betyder, at en forventet ændring i putamen har en lille clusterstørrelse. Hvis man derimod forventede signifikante områder i frontalloben, ville man forvente en større clusterstørrelse. Altså er clusterstørrelsen et relativt begreb i forhold til størrelsen af det område man undersøger.

Øges signifikantsniveauet som på figur 23, kan den største ændring stadig ses ved putamen, som forventet. Derudover er der også nogle mindre clusters som befinder sig ved occipitalloben.Hvis man klikker rundt i billederne for figur 23 mens SPM5 kører, kan man tydeligt se ændringer. Disse ændringer ses ved hippocampus, amygdala, højre midt orbital, højre precuneus og nær cerebellum. Amygdala og hippocampus tilhører det limbiske system. Hippocampus medvirker til langtidshukommelsen samt rumlig orientering. Det vides at serotonins påvirkning nær amygdala og hippocampus spiller en rolle med hensyn til angst [23]. En forklaring på, at disse områder er ændret kan skyldes at patienterne har haft en smule klaustrofobi pga. manglende plads inde i scanneren. Det signifikante område nær cerebellum kunne være forårsaget af ændringen af blodvolumen i blodkarene, da der i dette område findes mange blodkar. På figur 24 ses unilaterale ændringer, og disse ser ud til at befinde sig på den højre hemisfære. Også her kan det tydeligt ses at forskellen i strukturen er ved frontalloben. Denne styrer personligheden og sociale kompetencer hos det enkelte individ. Det er bl.a. vidst at patienter med psykiske lidelser som fx svær depression og skizofreni også har ændringer i disse områder.Det vides at ketanserin spiller en stor rolle i vasodilation. Ketanserin anvendes derfor under operationer til regulering af blodtryk. Vasodilationen påvirker blodtrykket således at det sænkes [22]. Om dette fænomen også er gældende i hjernens blodkar vides ikke med sikkerhed. Derfor kan vi heller ikke vide, om dette gør sig gældende i dette forsøg.

På figur 25 kan der ses en enkelt cluster under venstre del af cerebellum. Denne cluster ligger dog helt uden for hjernen. Til dette kan man konkludere, at det ikke har noget at gøre med serotonins

54

påvirkning på hjernen. Det kan skyldes statistisk måleusikkerhed forårsaget af SPM5s dataforarbejdning.

På figur 26 ses store ændringerne over cerebellum og under cerebrum. Disse ændringer er bilaterale. Derudover er BA 44 og 45 også forandret. Disse områder er ved frontal cortex.

Det er svært at sige helt konkret, hvad der kan ske med hjernens struktur efter ATD. Det vides at ATD har en virkning på hele serotoninsystemet, således at kroppen opbruger sit eget tryptophan lager. Ud fra vores figurer ligger strukturændringerne ikke i selve GM, men uden for hjernen.

På figur 27 ses ikke nogle signifikante områder af betydning. På figur 28 ses ændringer bilateralt ved cerebellum. Desuden ses også et signifikant område i midten mellem højre og venstre cerebellum. Dette område kan måske relateres til blodkarenes volumenændring. Desuden ses områder ved serotonin pathways. Ligesom for ATD er det uvidst hvilken effekt Citalopram har på hjernens struktur. Det vides dog at Citalopram er med til at øge mængden af fri serotonin i det neurale rum. Vi kan ikke relatere ændringerne til noget fysiologisk, da dette ikke er blevet undersøgt endnu. Dermed kan fortolkningen af resultaterne ikke vides med sikkerhed.

I sammenligningen af de to ekstremer på figur 29 ses en ændring under cerebellum nær hjernestammen. Denne ændring kan måske være forårsaget af en forandring af blodvolumen ved basilararterien [18].

Betragtes den modsatte situationen på figur 30, kan der ses store bilaterale ændringer. Ændringerne ses ved occipital cortex. Forsøgspersonerne blev bedt om at holde øjnene lukkede under scanningen. Derfor var det ikke det første område vi ville forvente at se en ændring i.

Resultaterne for den parrede t-test i tabellen fortæller, at der overordnet set ikke er sket en ændring af volumet for GM. Dette er med til at verificere at der ikke er sket særligt meget med hjernens volumen som helhed.

Når man laver statistiske tests, er der altid en problematik med hvilken p-værdi man skal vælge. Det vil sige hvor meget man er villig til at slippe igennem. Vi startede ud med en p-værdi på 0.1%. Denne valgte vi ikke at bruge, da der ikke blev vist mange signifikante områder. Herefter blev den øget til 1%, hvilket betød, at flere voxels blev dømt til at være signifikante. Dog skal det siges, at en øgning af p-værdien gør, at områderne bliver mere domineret af type I fejl. Dette bevirker til, at der er flere falske positive voxels, som kommer med. Hvis vi havde observeret signifikante områder med FDR korrektion, kunne vi være mere sikre på, at områderne var uden type I fejl.

Selvom det vides, at serotonin spiller en rolle i vasokonstriktion, er dette dog målt på rotter, men ikke på en menneske-hjerne [25]. Det er stadig begrænset, hvor meget viden man har omkring serotonin og dens receptorer. Derfor er det også svært at konstatere, om disse vaskulære dilationer og konstriktioner kan forekomme i hjernen forårsaget af serotoninen. Umiddelbart mangles der viden, som kun kan opnås vha. flere forsøg på mennesker.

55

16. Kritik af forsøget

Selve forsøgsudførelsen har nogle ulemper som medvirker til at nedsætte validiteten af resultaterne. Man kan sagtens komme med forslag til at forbedre forsøget. Der er altid en problematik om hvorvidt man har nok forsøgspersoner. I dette forsøg har vi kun data fra 20 personer. Man kan derfor diskutere om 20 forsøgspersoner er nok til at afspejle en hel befolkning. Ved de statistiske tests vi laver, er det en forudsætning at personernes data er normal fordelt. En tommelfingerregel inden for statistik siger, at for at have data der er normal fordelt, skal man som minimum have 30 forsøgspersoner involveret. Jo flere involveret, des bedre. Derfor er vores antal på 20 nok lige i underkanten, således at man kan drage en generel konklusion for hele befolkningen.

Det er et kendt fænomen, at hjernens struktur og funktionsevne ændres med alderen. Som sagt var gennemsnitsalderen på 31.8 år med en spredning på 6.49. Ud fra dette kan man se at den yngste og ældste forsøgsperson er hhv. ca. 18 og 45 år. Det vil sige at der er mange års forskel mellem den yngste og ældste forsøgsperson. Hjernen ændres med alderen, og dermed ændres serotoninsystemet sig ligeledes. Studier har vist at serotonins evne til at binde sig til HT2a-receptorerne falder markant jo ældre man bliver [24]. For at optimere forsøget kunne man have valgt, at alle forsøgspersonerne skulle være lige gamle, eller også kunne man have medtaget alderen som en ekstra covariat.

En anden ting som man kunne gøre for at forbedre forsøget er, ved at kigge på den måde de forskellige medikamenter blev givet på. Citalopram og Ketanserin blev som sagt givet intravenøst, mens ATD skulle indtages oralt.Disse forskellige metoder kan spille en stor rolle for forsøgspersonernes psyke og fysiske behag/ubehag. Det kan være, at imens forsøgspersonerne fik et medikament intravenøst, så har de kunne mærke smerte eller ubehag. Disse følelser spiller en vigtig rolle i det limbiske system og kan dermed medvirke til at der sker en uhensigtsmæssig ændring af GM.I og med, at de kunne have følt ubehag ved at få et medikament intravenøst, har de måske ligget meget anspændt på lejet. Når man ligger anspændt kan de ubevist have kommet til at presse hovedet ned på lejet. Dette kan føre til forandringer i hjernen omkring det visuelle cortex. Det er klart at man ikke presser på selve hjernen, men dens omkringliggende kar. Der udløber en stor vene ved det visuelle cortex. Hvis hovedet er blevet presset ned i lejet, vil det måske syne på et SPM at mængden af GM er blevet ændret på grund af det øgede pres på venen.For at optimere dette skulle man have besluttet inden, at alle medikamenter skulle gives på præcis samme måde. Alle skulle være givet intravenøst eller alle skulle være givet oralt (inklusive kontrolscanningen). En anden forbedring af forsøget kunne være sket under kontrolscanningen. Forsøgspersonerne fik ikke givet noget medikament under kontrolscanningen, og har dermed vidst at det blot var en kontrolscanning. Ved at give dem et eller andet form for medikament ville man være sikker på, at de kom i samme sindstilstand som ved de andre scanninger. Som sagt er det limbiske system styret af følelser, og et medikament ville give dem samme følelse som ved de andre scanninger.

Til slut kunne man have valgt at strække perioden for forsøget. I stedet for at se på akutte ændringer, kunne man have givet en daglig dosis af fx Citalopram over et længere stykke tid og derefter scanne forsøgspersonerne. På den måde kan der være en chance for at der er sket en ændring af strukturen for GM, end hvad vi har observeret på kort tid. Dette kunne være et interessant eksperiment at lave, da mange personer med psykiske lidelser tager anti-depressive midler i mange år. På den måde ville man kunne få et billede af, om hjernen ændres over en længere periode.

56

17. Forbedringer af SPM5

SPM5 softwaren bliver løbende opdateret med nye versioner. De opdaterede versioner kommer med et bud på en forbedring til forarbejdning af data. Ved forarbejdning af data tænkes blandt andet på skridtene som Unified segmentering og spatial normalisering, modulering og smoothing.

I SPM5 antages det, at hjernen består af 3 slags væv; GM, WM og CSF. Dette er i virkeligheden ikke sandt, da der også findes blodkar i hjernen, som kan have et skiftende volumen afhængig af forskellige situationer. Dette kunne forbedres ved at tilføje nogle ekstra TPMs, som tager højde for disse andre strukturer, som findes i hjernen. Ved at tilføje disse ekstra TPMs, ville det gøre segmenteringsprocessen mere præcis.En anden ting, som kunne optimere segmenteringenprocessen er ved at sammenholde billeder fra flere forskellige vægtninger, såsom T2-vægtede og Proton Density (PD) billeder. Disse indeholder andre kontraster end et T1-vægtet billede. Ved at lave en fælles sandsynlighed for billederne kan man opnå en forbedring af segmenteringen.Derudover kan dem som har fået et medikament intravenøst have ligget uroligt. På grund af dette kan der være kommet bevægelsesartefakter på MR-billedet. Disse artefakter gør kvaliteten af segmenteringen dårligere således, at de måske bliver segmenteret forkert i visse regioner af hjernen. Dette ville til sidst vise sig i statistikken ved, at visse områder bliver dømt signifikante, selvom de i virkeligheden ikke er. For at undgå at billeder har bevægelsesartefakter, har vi nøje studeret alle MR-billederne. Ved sorteringen af billederne, har vi kun kunne se de bevægelsesartefakter, som man har kunne se med det blotte øje. Vi mener derfor, at vi har udryddet de slemmeste MR-billeder, og fejl fra bevægelsesartefakter burde ikke dominere lige netop i vores projekt.

I dette projekt er MR-billederne genereret ved at bruge den samme scanner med præcis samme sekvens. Man skulle tro at MR-billederne herved ville have den præcis samme kontrast (kontrast her referer til gråtoneskalaen). I den virkelige verden opstår der dog kontrastforskelle på MR-billeder forårsaget af for eksempel kalibrering af scanneren. Når gråtoneskalaen ændres fra billede til billede, giver dette en usikkerhed i forbindelse med forarbejdning af data. SPM5 kunne implementere en algoritme, som tjekkede for dette; en såkaldt gråtone korrektion. Denne skal dog ikke sammenlignes med bias korrektion, da denne korrigerer for magnetfeltets inhomogenitet. Måden man kunne implementere denne algoritme ville være at finde nogle bestemte fixpuntker i hjernen som alle skal have samme intensitet. Baggrunden kan for eksempel sættes lig nul. På et område man er sikker på indeholder WM, sættes til en anden værdi. Disse værdier skal sætte standarden for alle MR-billeder man tester på i forsøget.

Spatial normalisering i SPM5 bruger kun omkring 1000 parametre til ikke-lineær transformation, og den fitter kun hjernen globalt til template. En forbedring af dette kunne være at bruge toolboxen DARTEL. I modsætning til den ikke-lineære transformation i Unified segmentering og spatial normalisering, benytter DARTEL i stedet cirka 6 millioner parametre. Herved opnås en mere præcis warping. Undersøgelser har vist [26], at nøjagtigheden for DARTEL-transformation er større end for den metode brugt i dette projekt.

57

Konklusion

Hovedformålet med dette projekt var at undersøge om der kom strukturelle ændringer i hjernens grå substans forårsaget af forskellig koncentration af serotonin. For at regulere koncentrationen af serotonin i det nerurale rum, blev tre medikamenter brugt; Ketanserin, Citalopram og Akut Tryptophan Depletion. Disses indvirkning blev undersøgt hver for sig og sammenlignet med en kontrolscanning. Desuden blev scanningerne for Citalopram og ATD også sammenlignet med hinanden.

Overordnet kan det siges at analysen af resultaterne indikerer, at de fundne ændringer i GM ikke er signifikante. Dette kan konkluderes eftersom de fundne områder ikke var til stede efter anvendelse af FDR-korrektion. Derudover forsvandt antallet af signifikante områder, da p-værdien blev sat til 0.1%. Desuden var antallet af forsøgspersonerne ikke tilstrækkelig rent statistisk. Alle disse ovennævnte ting spiller en vigtig rolle for en bestemmelse af, om der er sket en ændring i mængden af GM. Det kan siges, at de fundne resultater skal efterforskes yderligere ved at forbedre forsøget, før det kan afsløres om der er sket en ændring rent strukturelt eller ej.

Til dags dato ved man meget lidt om serotonins påvirkning i hjernen. For at gøre dette forsøg bedre kræves en større viden indenfor dette område. Man behøver et bedre kendskab både til serotonins biokemiske egenskaber og ligeledes til hvordan hjernen helt præcist bruger serotonin og til hvad.

Der kommer hele tiden nye MR-scannere på markedet. Disse MR-scannere kan måske have sekvenser, som kan lave MR-billeder med en højere opløsning. I fremtiden kan man gøre dataforarbejdning bedre netop fordi MR billederne bliver bedre. Inden for dette områder er der plads til store forbedringer, og disse vil komme løbende gennem årene. Ved at sammenholde resultaterne med andre modaliteter, såsom funktionel MRI og PET scanninger, kan man få bedre indsigt i serotonins virkning i hjernen.

58

Referencer

[1] http://www.brainhealthandpuzzles.com/diagram_of_brain.html

[2] Mary Lindsay et al., The Visual Dictionary of the Human Body, London, Dorling Kindersley, 1991, ch. 32.

[3] www.fil.ion.ucl.ac.uk/spm/doc/mfd/2007/powerpoint%20presentations/VBM_MfD_full.ppt

[4] http://www.cnsforum.com/content/pictures/imagebank/hirespng/Neuro_path_SN_OCD.png

[5] http://en.wikipedia.org/wiki/File:7TM4_(GPCR).png

[6] http://en.wikipedia.org/wiki/File:LGIC.png

[7] Er lavet selv fra en bruger på wikipedia - http://en.wikipedia.org/wiki/File:Serotonin_biosynthesis.svg

[8] Er lavet ud fra programmet BKChem fra en bruger på wikipedia - http://en.wikipedia.org/wiki/File:Citalopram_structure.svg

[9] Er lavet selv fra en bruger på wikipedia - http://en.wikipedia.org/wiki/File:Ketanserin.png

[10] http://www.elp.manchester.ac.uk/pub_projects/2003/MNAT0GCS/Techno2.gif

[11] http://www.cis.rit.edu/htbooks/mri/inside.htm

[12] www.fil.ion.ucl.ac.uk/spm/doc/mfd/2007/powerpoint%20presentations/VBM_MfD_full.ppt

[13] http://www.fil.ion.ucl.ac.uk/spm/course/slides09-zurich/Ged_VBM.ppt

[14] www.bcn-nic.nl/txt/activities/methodology_group/presentations/fmrimeeting-20090414-Meffert.ppt

[15] K. Friston, J. Ashburner et al., Statistical Parametric Mapping, London, Elsevier, 2007, p. 95.

[16] Artikel fra New York Times' Science sektion: Jane E. Brody, Studies Unmask Origins of Brutal Migrane, New York, New York Times Science, 11/10/1988http://www.nytimes.com/1988/10/11/science/studies-unmask-origins-of-brutal-migraines.html?pagewanted=3

59

[17] Contributed By: Frederick G. Moeller, M.D., Serotonin, University of Texas Houston Health Science Center, Serotonin, Microsoft® Encarta® Online Encyclopedia 2009 http://encarta.msn.com/encyclopedia_761553105/serotonin.html

[18] Mark F. Bear, Barry W. Conners, Michael A. Paradiso, Neuroscience Exploring the Brain, Lippincott Williams & Wilkins, 2006.

[19] Selvlavet figur af bruger på wikipedia. http://en.wikipedia.org/wiki/File:Serotonin_(5-HT).svg

[20] Young SN et al 1985, to Ruhé et al, 2007

[22] Machiko Matsumoto, Mitsuhiro Yoshioka, Hiraoko Togashi, Masaru Minami og Hideya Saito, Antihypertensive drugs today, Serotonin-2 receptor Antagonist: Ketanserin - Focus on the sympathoinhibitory action, Japan, 1991, p. 189-205

[23] Shauna MacMillan, Philip R. Szeszko et al., Increased Amygdala: Hippocampal Volume Ratios Associated with Severity of Anxiety in Pediatric Major Depression, Journal of Child and Adolescent Phychopharmacology, Volume 13, Number 1, Mary Ann Liebert, Inc., 2003, Pp. 65-73.

[24] Yvette I. Sheline (M.D.), Mark A. Mintun (M.D.) et al., Greater Loss of 5-HT2A Receptors in Midlife Than in Late Life, Am J Psychiatry, March 2002, 159: 430-435

[25] A. Elizabeth Linder et al., Serotonin (5-HT) in Veins: Not All in Vain, The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, Michigan, 31 July, 2007, JPET 323:415

[26] Klein A, Andersson J, Ardekani BA, Ashburner J, Avants B, ChiangM-C, et al. Evaluation of 15 nonlinear deformation algorithms appliedto human brain MRI registration. Neuroimage, in press.

[27] Brent A. Vogt, Deepak N. Pandya, Douglas L. Rosene (August 1987). "Cingulate cortex of the rhesus monkey: I. Cytoarchitecture and thalamic afferents". The Journal of Comparative Neurology 262 (2): 256–270.

[28] Gerhardt von Bonin & Percival Bailey (1925). The Neocortex of Macaca Mulatta. Urbana, Illinois: The University of Illinois Press

[29] Constantin von Economo & Georg N. Koskinas (1925). Die Cytoarchitektonik der Hirnrinde des erwachsenen Menschen. Vienna and Berlin: Julius Springer.

[30] Roshan Cools, Andy J. Calder et al.,Individual differences in threat sensitivity predict serotonergic modulation of amygdala response to fearful faces, Psychopharmacology (2005) 180: 670–679

60

Appendiks A

A.1 t-test i Splus

x1 = kontrolscanningernex2 = ketanserinscanningerne

signifikantsniveau = 1%

Paired t-Testdata: x: x1 , and y: x2 t = 0.4535, df = 19, p-value = 0.3277 alternative hypothesis: mean of differences is greater than 0 99 percent confidence interval:

[-3.542558 ; NA[sample estimates:mean of x - y

0.7702

Paired t-Testdata: x: x1 , and y: x2 t = 0.4535, df = 19, p-value = 0.6723 alternative hypothesis: mean of differences is less than 0 99 percent confidence interval:

]NA ; 5.082958]sample estimates:mean of x - y

0.7702

x1 = kontrolscanningernex2 = citalopramscanningerne

signifikantsniveau = 1%

Paired t-Testdata: x: x1 , and y: x2 t = -2.7585, df = 19, p-value = 0.9937

61

alternative hypothesis: mean of differences is greater than 0 99 percent confidence interval:

[-7.615245 ; NA[ sample estimates:mean of x - y

-3.96505

Paired t-Testdata: x: x1 , and y: x2 t = -2.7585, df = 19, p-value = 0.0063 alternative hypothesis: mean of differences is less than 0 99 percent confidence interval:

]NA ; -0.3148548] sample estimates:mean of x - y

-3.96505

x1 = kontrolscanningernes

x2 = ATDscanningerne

signifikantsniveau = 1%

Paired t-Testdata: x: x1 , and y: x2 t = -3.7728, df = 19, p-value = 0.9994 alternative hypothesis: mean of differences is greater than 0 99 percent confidence interval:

[-10.31204 ; NA[ sample estimates:mean of x - y

-6.1634

Paired t-Testdata: x: x1 , and y: x2 t = -3.7728, df = 19, p-value = 0.0006 alternative hypothesis: mean of differences is less than 0 99 percent confidence interval:

]NA ; -2.01476] sample estimates:mean of x - y

-6.1634

62

x1 = citalopramscanningerne

x2 = ATDscanningerne

signifikantsniveau = 1%

Paired t-Testdata: x: x1 , and y: x2 t = -1.0642, df = 19, p-value = 0.8497 alternative hypothesis: mean of differences is greater than 0 99 percent confidence interval:

[-7.444419 ; NA[ sample estimates:mean of x - y

-2.19835

Paired t-Testdata: x: x1 , and y: x2 t = -1.0642, df = 19, p-value = 0.1503 alternative hypothesis: mean of differences is less than 0 99 percent confidence interval:

]NA ; 3.047719] sample estimates:mean of x - y -2.19835

63

A.2 Oversigt over Brodmann's Areas (BA)

Areas 3, 1&2 Primary Somatosensory Cortex (frequently referred to as Areas 3, 1, 2 by convention)

Area 4 Primary Motor Cortex

Area 5 Somatosensory Association Cortex

Area 6 Premotor cortex and Supplementary Motor Cortex (Secondary Motor Cortex)

Area 7 Somatosensory Association Cortex

Area 8 Includes Frontal eye fields

Area 9 Dorsolateral prefrontal cortex

64

Area 10 Anterior prefrontal cortex (most rostral part of superior and middle frontal gyri)

Area 11 Orbitofrontal area (orbital and rectus gyri, plus part of the rostral part of the superior frontal gyrus)

Area 12 Orbitofrontal area (used to be part of BA11, refers to the area between the superior frontal gyrus and the inferior rostral sulcus)

Area 13&14* Insular cortex

Area 15* Anterior Temporal Lobe

Area 17 Primary visual cortex (V1)

Area 18 Secondary visual cortex (V2)

Area 19 Associative visual cortex (V3)

Area 20 Inferior temporal gyrus

Area 21 Middle temporal gyrus

Area 22 Superior temporal gyrus, of which the caudal part is usually considered to contain the Wernicke's area

Area 23 Ventral Posterior cingulate cortex

Area 24 Ventral Anterior cingulate cortex

Area 25 Subgenual cortex

Area 26 Ectosplenial area

Area 27 Piriform cortex

Area 28 Posterior Entorhinal Cortex

Area 29 Retrosplenial cingulate cortex

Area 30 Part of cingulate cortex

Area 31 Dorsal Posterior cingulate cortex

Area 32 Dorsal anterior cingulate cortex

Area 33 Part of anterior cingulate cortex

Area 34 Anterior Entorhinal Cortex (on the Parahippocampal gyrus)

Area 35 Perirhinal cortex (on the Parahippocampal gyrus)

Area 36 Parahippocampal cortex (on the Parahippocampal gyrus)

Area 37 Fusiform gyrus

Area 38 Temporopolar area (most rostral part of the superior and middle temporal gyri)

Area 39 Angular gyrus, considered by some to be part of Wernicke's area

Area 40 Supramarginal gyrus considered by some to be part of Wernicke's area

Areas 41&42 Primary and Auditory Association Cortex

Area 43 Subcentral area (between insula and post/precentral gyrus)

Area 44 pars opercularis, part of Broca's area

Area 45 pars triangularis Broca's area

65

Area 46 Dorsolateral prefrontal cortex

Area 47 Inferior prefrontal gyrus

Area 48 Retrosubicular area (a small part of the medial surface of the temporal lobe)

Area 52 Parainsular area (at the junction of the temporal lobe and the insula)

(*) Area only found in non-human primates

[27], [28], [29]

A.3 ATD opløsningen

ATD opløsningen består af 75g aminosyre (mængden som er blevet brugt er beskrevet af Young et al., 1985). Denne aminosyre blanding består af 4.1 g L-alanine, 2.4 g glycine, 2.4 g L-histidine, 6.0 g L-isoleucine, 10.1 g L-leucine, 6.7 g L-lysine, 4.3 g L-phenylanlanine, 9.2 g L-proline, 5.2 L-serine, 4.3 g L-threonine, 5.2 g L-tyrosine, 6.7 g L-valine, 3.7 g L-arginine, 2.0 g L-cysteine, 3.0 g L-methionine (SHS International Ltd, Liverpool, UK). Resten af mixturen indeholder samme aminosyrer samt 3.0 g trptophan. Drikkene var blevet lavet med 200ml postevand og frugtessens for smagens skyld.[30]

66