D O K T O R S K A D I S E R T A C I J A - core.ac.uk · 1 Karakterizacija in optimizacija proizvodnje kefirana iz naravnih kefirnih zrn 79 1.1 Uvod 79 1.2 Metode in materiali 79 1.2.1

UNIVERZA V MARIBORU

FAKULTETA ZA KEMIJO IN KEMIJSKO TEHNOLOGIJO

D O K T O R S K A D I S E R T A C I J A

OPTIMIRANJE BIOPROCESNIH PARAMETROV PROIZVODNJE

ETANOLA IN KEFIRANA Z MIKROBIOTO KEFIRNIH ZRN

JULIJ, 2012 KATJA ZAJŠEK

D O K T O R S K A D I S E R T A C I J A

OPTIMIRANJE BIOPROCESNIH PARAMETROV PROIZVODNJE

ETANOLA IN KEFIRANA Z MIKROBIOTO KEFIRNIH ZRN

D O C T O R A L D I S S E R T A T I O N

OPTIMIZATION OF BIOPROCESS PARAMETERS FOR ETHANOL AND

KEFIRAN PRODUCTION USING MICROBIOTA OF KEFIR GRAINS

Katja Zajšek

Mentorica: izred. prof. dr. Andreja Goršek

Somentorica: red. prof. dr. Irena Rogelj

julij, 2012 UDK klasifikacija: 637.146.21:66.017(043.3)

K. Zajšek – Optimiranje bioprocesnih parametrov proizvodnje etanola in kefirana z mikrobioto kefirnih zrn

I

Katarini


II


III

Z a h v a l a

Raziskovalno delo je financirala Javna agencija za

razvoj Republike Slovenije, za kar se iskreno

zahvaljujem.

Iskrena hvala mentorici prof. dr. Andreji Goršek, za

vodenje in prijazno pomoč, za strokovno svetovanje,

potrpežljivost, vzpodbudo in ideje, povezane z

raziskovalnim delom in nastajanjem tega dela. Hvala tudi

za številne prijateljske nasvete na moji poti v svet

znanosti.

Prof. dr. Ireni Rogelj se zahvaljujem za strokovno

sodelovanje in spodbujajoče ideje pri načrtovanju

raziskovalne naloge.

Mojemu Gregorju bi se rada zahvalila za ljubezen, lepe

skupne trenutke, spodbudo in vsa odrekanja v času

priprave disertacije.

Hvala tudi staršema in sestrini družini, ki so me podpirali

in vzpodbujali na tej poti.

Zahvala tudi vsem ostalim, ki so na kakršenkoli način

pripomogli k nastanku tega dela.


IV


V

I z j a v a

Izjavljam, da sem doktorsko delo izdelala samostojno pod mentorstvom izred. prof. dr. Andreje Goršek in somentorstvom red. prof. dr. Irene Rogelj.

Katja Zajšek


VI


VII

V S E B I N A

POGLAVJE I Uvod 1

1 Predstavitev raziskovalnega področja 3

2 Cilji in teze doktorske disertacije 5

3 Predpostavke in morebitne omejitve 6

POGLAVJE II Kefir in Kefirna zrna – pregled literature 9

1 Uvod 11

2 Kefirna zrna 12

2.1 Mikrobiološke karakteristike 12

2.1.1 Mlečno-kislinske bakterije (MKB) 13

2.1.1.1 Rod Lactobacillus 14

2.1.1.2 Rod Lactococcus 15

2.1.1.3 Rod Streptococcus 15

2.1.1.4 Rod Leuconostoc 15

2.1.2 Kvasovke 16

2.1.3 Ocetno-kislinske bakterije (OKB) 16

2.2 Bioaktivne komponente 17

2.2.1 Eksopolisaharidi 17

2.2.1.1 Kefiran 17

2.2.1.2 Izolacijske metode bakterijskih eksopolisaharidov 19

3 Komercialna proizvodnja kefirja 22

4 Kemijska sestava kefirja 26

4.1 Etanol 27

4.2 Ogljikov dioksid 27

4.3 Mlečna kislina 28

4.4 Aminokisline 28

4.5 Eterične komponente 28

4.6 Maščobe 29

5 Kefir kot živilo 30

5.1 Prebavljivost 30

5.2 Hranilna vrednost beljakovin 30

5.3 Metabolizem laktoze 31

5.4 Vitamini 31

5.5 Kefir – hrana za dojenčke 32

5.6 Ostala uporaba 32

6 Kefir in zdravje 33

6.1 Kefir kot probiotik 33

6.2 Protitumorski učinek pri živalih 33

6.3 Protibakterijske, protiglivične in protivirusne lastnosti kefirja 35

6.4 Metabolizem holesterola 37

6.5 Drugi zdravju koristni učinki 38

POGLAVJE III Etanol – aromatična komponenta kefirja 39

1 Vpliv časa aktivacije kefirnih zrn na vsebnost kvasovk in etanola v kefirju 41


VIII

1.1 Uvod 41

1.2 Metode in materiali 41

1.2.1 Inokulum in fermentacijski medij 41

1.2.2 Laboratorijska oprema 41

1.2.2.1 Reaktor 41

1.2.2.2 In-situ FTIR spektrometer 42

1.2.3 Postopek aktivacije kefinih zrn 42

1.2.4 Postopek izvedbe eksperimentov 42

1.2.5 Analize 42

1.2.5.1 Dinamično merjenje koncentracije etanola v kefirju 42

1.2.5.1.1 Umeritvena krivulja 43

1.2.5.2 Mikrobiološke analize 43

1.2.5.2.1 Priprava vzorcev 43

1.2.5.2.2 Priprava gojišč 44

1.2.5.2.3 Določanje števila kvasovk s štetjem kolonij na trdnem gojišču 44

1.2.6 Matematični eksponentni pH model 45

1.3 Rezultati in razprava 45

1.3.1 Analiza dinamičnega merjenja pH vrednosti kefirja 45

1.3.2 Ovrednotenje zveze med proizvodnjo etanola in populacijo kvasovk v kefirnih zrnih in kefirju 47

2 Matematični model za določitev hitrosti nastajanja etanola med fermentacijo mleka 50

2.1 Uvod 50





2.2.4 Analize 51

2.2.4.1 Gravimetrična določitev prirasti kefrinih zrn 51

2.2.4.2 Dinamično merjenje masne koncentracije etanola v kefirju 51


2.2.5 Kinetični modeli 51

2.2.5.1 Rast populacije kvasovk 51

2.2.5.2 Proizvodnja etanola 52


2.3.1 Grafična analiza rasti mikrobiote kefirnih zrn 52

2.3.2 Analiza proizvodnje etanola 54

2.3.3 Mikrobiološke karakteristike 55

3 Matematično modeliranje proizvodnje etanola kot funkcije temperature in časa 57

3.1 Uvod 57




3.2.3 Analize 58

3.2.3.1 Gravimetrična določitev prirasti kefirnih zrn 58



3.2.3.3.1 Priprava vzorcev 58

3.2.3.3.2 Priprava gojišč 58

3.2.3.3.3 Določanje števila mikroorganizmov s štetjem kolonij na trdnem gojišču 58



IX

3.3.1 Ovrednotenje vpliva temperature 59

3.3.1.1 Analiza vpliva temperature na prirast kefirnih zrn 59

3.3.1.2 Masna koncentracija etanola kot funkcija časovnih in temperaturnih sprememb 60

3.3.1.3 Grafiča analiza dinamičnih pH profilov 62

3.3.1.4 Vpliv temperature na mikrobiološke karakteristike kefirnega zrna in kefirja 62

3.3.2 Aktivacijska energija proizvodnje etanola 64

4 Vpliv časovnega presledka mirovanja mešala oz. pogostosti mešanja na proizvodnjo etanola in

mikrobiološke lastnosti kefirnih zrn in kefirja 68

4.1 Uvod 68




4.2.3 Analize 69





4.3.1 Ovrednotenje vpliva pogostosti mešanja na prirast kefirnih zrn 69

4.3.2 Masna koncentracija etanola kot funkcija pogostosti mešanja fermentacijske zmesi in časa

fermentacije 71

4.3.3 Analiza vpliva pogostosti mešanja na pH vrednost kefirja po 24 h fermentaciji 73

4.3.4 Vpliv pogostosti mešanja na mikrobiološke lastnosti kefirnih zrn in kefirja 74

POGLAVJE IV Kefiran – naravni bakterijski eksopolisaharid 77

1 Karakterizacija in optimizacija proizvodnje kefirana iz naravnih kefirnih zrn 79

1.1 Uvod 79


1.2.1 Inokulum in fermentacijske medij 79


1.2.3 Postopek izvedbe eksperimentov in optimizacija proizvodnje kefirana 79

1.2.3.1 Optimiranje procesnih parametrov 80

1.2.3.1.1 Čas inkubacije kefirnih zrn v svežem UHT mleku 80

1.2.3.1.2 Temperatura fermentacije 81

1.2.3.1.3 Mešanje fermentacijske brozge 81

1.2.3.2 Optimiranje sestave fermentacijskega medija 81

1.2.4 Analize 83


1.2.4.2 Opis postopka izolacije kefirana iz kefirnih zrn 83

1.2.4.3 Kalibracija, hidroliza in derivatizacija izoliranega EPS 84

1.2.4.4 Analiza monosaharidov s kapilarno elektroforezo 84


1.3.1 Karakterizacija vrste, števila in masnega razmerja monosaharidov v vzorcih kefirana 84

1.3.2 Optimiranje procesnih parametrov 85

1.3.2.1 Analiza vpliva časa fermentacije na proizvodnjo kefirnih zrn in kefirana 85

1.3.2.2 Proizvodnja zrn in kefirana pri različnih temperaturah 87

1.3.2.3 Grafična analiza vpliva mešanja na proizvodnjo kefirnih zrn in kefirana 89

1.3.3 Optimiranje sestave fermentacijskega medija 91

2 Procesna shema tehnološkega postopka proizvodnje kefirana 99


X

POGLAVJE V Zaključek 101

POGLAVJE VI Literatura 105

ŽIVLJENJEPIS 117


XI

K A Z A L O P R E G L E D N I C

POGLAVJE II KEFIR IN KEFIRNA ZRNA – pregled literature

Preglednica 2.1 Kemijska sestava različnih vrst kefirja (Farnworth in Mainville, 2003). 26

Preglednica 2.2 Primerjava hranilne vrednosti kefirja Krepko in svežega mleka s 3,5 % mlečne

maščobe.

30

POGLAVJE III ETANOL – aromatična komponenta kefirja

Preglednica 3.1 Pik etanola in njegove bazne linije. 43

Preglednica 3.2 Primerjava ocenjenih vrednosti parametrov eksponentnega pH modela za proces

fermentacije s časovno različno aktiviranimi kefirnimi zrni.

47

Preglednica 3.3 Število kvasovk v kefirnih zrnih in kefirju po 24 h fermentaciji mleka z različno

aktiviranimi kefirnimi zrni.

49

Preglednica 3.4 Rezultati prileganja logistične enačbe k eksperimentalnim podatkom. 53

Preglednica 3.5 Vrednosti kinetičnih parametrov modificiranega Gompertzovega modela za

proizvodnjo etanola med fermentacijo kefirja.

55

Preglednica 3.6 Vpliv časa fermentacije na število kvasovk v kefirju in kefirnih zrnih. 55

Preglednica 3.7 Vrednosti parametrov a, b, c, e in EtOH,m, ocenjene z modificiranim

Gompertzovim modelom (en. (3.9)).

61

Preglednica 3.8 Z Gompertzovim modelom (en. (3.5)) ocenjene vrednosti maksimalne hitrosti

proizvodnje etanola (rEtOH,m), trajanja lag faze (tL), maksimalne masne

koncentracije etanola (EtOH, m) in koeficienta determinacije (R2).

65

Preglednica 3.9 Aktivacijska energija in predeksponentni faktor za proizvodnjo etanola s

kefirnimi zrni.

67

Preglednica 3.10 Vrednosti parametrov g, h, i, j, p, o in EtOH, m, ocenjene z modificiranim

Gompertzovim modelom (en. (3.14)).

72

Preglednica 3.11 Z matematičnim modelom (en. (3.15)) ocenjene vrednosti konstant u in v ter pH

vrednosti kefirja, dosežene po 24 h fermentaciji, izvedeni pri kontinuirnem

mešanju fermentacijske brozge (pH24 h, 0 h).

74

POGLAVJE IV KEFIRAN – naravni bakterijski eksopolisaharid

Preglednica 4.1 Vpliv fermentacijskega časa na prirast kefirnih zrn in donos kefirana, izoliranega

iz kefirnih zrn.

80

Preglednica 4.2 Vpliv temperature na prirast kefirnih zrn in donos kefirana. 81

Preglednica 4.3 Vpliv vrtilne frekvence mešala na prirast kefirnih zrn in donos kefirana. 81

Preglednica 4.4 Vpliv dodatka različnih vrst ogljikovih hidratov na prirast kefirnih zrn in donos

kefirana.

82

Preglednica 4.5 Vpliv dodatka različnih dušikovih spojin na prirast kefirnih zrn in donos kefirana. 82

Preglednica 4.6 Vpliv vitaminov na prirast kefirnih zrn in donos kefirana. 83

Preglednica 4.7 Vpliv mineralov na prirast zrn in donos kefirana. 83

Preglednica 4.8 Določitev razmerja masnega deleža glukoze (wGlc) in galaktoze (wGal) v izolatu iz

zrn in njuno masno razmerje (ζGlc/Gal).

87

Preglednica 4.9 Vpliv temperature na pH vrednost kefirja in monosaharidno sestavo kefirana,

izoliranega iz kefirnih zrn po 24 h fermentaciji.

89

Preglednica 4.10 Vpliv vrtilne frekvence mešala na pH vrednost kefirja in monosaharidno sestavo

kefirana, izoliranega iz kefirnih zrn po 24 h fermentaciji.

90

Preglednica 4.11 Vpliv dodatka ogljikovih hidratov na začetno in končno pH vrednost kefirja in


XII

monosaharidno sestavo kefirana, izoliranega iz zrn po 24 h fermentaciji. 91

Preglednica 4.12 Vpliv dodatka dušikovih spojin na začetno in končno pH vrednost kefirja in

monosaharidno sestavo kefirana, izoliranega iz zrn po 24 h fermentaciji.

94

Preglednica 4.13 Vpliv dodatka vitaminov na začetno in končno pH vrednost kefirja in


97

Preglednica 4.14 Vpliv dodatka mineralov na začetno in končno pH vrednost kefirja in


98


XIII

K A Z A L O S L I K

POGLAVJE II KEFIR IN KEFIRNA ZRNA – pregled literature

Slika 2.1 Kefirna zrna (Farnworth, 2005). 12

Slika 2.2 a) Prevlada bakterij na perifernem delu zrna. b) Kvasovke v središču kefirnega

zrna (Bottazzi in Bianchi, 1980).

13

Slika 2.3 Struktura kefirana (Farnworth, 2005). 18

Slika 2.4 Tehnološki postopek proizvodnje tradicionalnega kefirja (Beshkova idr., 2002). 23

Slika 2.5 Procesni dejavniki, ki vplivajo na karakteristike kefirja (Farnworth, 2005). 25

POGLAVJE III ETANOL – aromatična komponenta kefirja

Slika 3.1 Umeritvena krivulja za etanol. 43

Slika 3.2 Eksperimentalni in z modelom določeni pH profili fermentacij, izvedenih s

časovno različno aktiviranimi kefirnimi zrni.

46

Slika 3.3 Dinamični profil FTIR spektra proizvodnje etanola med fermentacijo mleka z

zrni, aktiviranimi 10 d (eksperiment E10d). Reakcijski pogoji: KZ,0 = 42 g/L, T = 24

°C, fm = 80 rpm in t = 24.

47

Slika 3.4 a) Eksperimentalne vrednosti površine pika proizvodnje etanola v odvisnosti od

časa reakcije. b) Koncentracijski profili etanola med fermentacijami. Reakcijski

pogoji: KZ,0 = 42 g/L, T = 24 °C, fm = 80 rpm, takt. = (1–10) d in t = 24 h.

48

Slika 3.5 Kinetika rasti kefirnih zrn med fermentacijo. 53

Slika 3.6 Nastajanje etanola med 64 h fermentacijo. 54

Slika 3.7 a) Površina pika etanola v odvisnosti od časa fermentacije. b) Eksperimentalni in

z modificiranim Gompertzovim modelom določeni podatki proizvodnje etanola.

Reakcijski pogoji: KZ = 42 g/L, T = 21 °C, fm = 60 rpm.

54

Slika 3.8 Vpliv temperature na prirast kefirnih zrn. 59

Slika 3.9 Koncentracija etanola kot funkcija temperature in časa fermentacije. 61

Slika 3.10 Vpliv temperature na pH profil 24 h fermentacije kefirja. 62

Slika 3.11 Vpliv temperature na število mikroorganizmov v a) kefirnem zrnu in b) kefirju. 63

Slika 3.12 Primerjava med eksperimentalnimi in z Gompertzovim modelom določenimi

vrednostmi masne koncentracije etanola v odvisnosti od časa fermentacije.

65

Slika 3.13 Arrheniusov diagram za proizvodnjo etanola s kefirnimi zrni. 66

Slika 3.14 Vpliv pogostosti mešanja na prirast kefirnih zrn. 70

Slika 3.15 Vpliv pogostosti mešanja fermentacijske brozge in časa fermentacije na

koncentracijo etanola v kefirju.

72

Slika 3.16 Vpliv pogostosti mešanja na pH profil 24 h fermentacije kefirja 73

Slika 3.17 Vpliv pogostosti mešanja na število mikroorganizmov v a) kefirnem zrnu in b)

kefirju.

75

POGLAVJE IV KEFIRAN – naravni bakterijski eksopolisaharid

Slika 4.1 Elektroferogrami standardnih raztopin in kefirana pridobljenih z uporabo 0,1 M

boratnega pufra in 30 % acetonitrila pri pH = 10,5. Standard A: 25 mg/L Xyl, 25

mg/L Glc in 25 mg/L Gal; Standard B: 50 mg/L Xyl, 50 mg/L Glc in 50 mg/L Gal;

Standard C: 100 mg/L Xyl, 100 mg/L Glc in 100 mg/L Gal; Vzorec kefirana D: 25

mg/L Xyl dodane kot interni standard.

85

Slika 4.2 Spremembe rasti kefirnih zrn, pH vrednosti kefirja in masnega deleža kefirana v

zrnih, med fermentacijo mleka z mešano mikrobioto kefirnih zrn, v


XIV

polnomastnem kravjem mleku pri 30 °C. 86

Slika 4.3 Vpliv temperature na prirast kefirnih zrn in masni delež kefirana v kefirnem zrnu

po 24 h fermentaciji.

88

Slika 4.4 Vpliv vrtilne frekvence mešala na prirast kefirnih zrn in masni delež kefirana v

kefirnem zrnu po 24 h fermentaciji, izvedeni pri temperaturi 25 °C.

90

Slika 4.5 Vpliv dodatka ogljikovih hidratov na prirast kefirnih zrn in masni delež kefirana v

zrnu.

91

Slika 4.6 Potek pretvorbe laktoze, glukoze in galaktoze do EPS-ja pri MKB. 92

Slika 4.7 Vpliv dodatka dušikovih spojin na prirast kefirnih zrn in masni delež kefirana v

zrnu.

94

Slika 4.8 Vpliv vitaminov na prirast kefirnih zrn in masni delež kefirana v zrnu. 96

Slika 4.9 Vpliv mineralov na prirast kefirnih zrn in masni delež kefirana v zrnu. 97

Slika 4.10 Tehnološki postopek pridobivanja kefirana iz kefirnih zrn. 100


XV

U P O R A B L J E N I S I M B O L I I N K R A T I C E

KRATICE

ACE angiotensin I-converting enzyme / angiotenzin-konvertaza

ATR Attenuated Total Reflection / zmanjšana totalna refleksija

C vir ogljika

DTH delayed type hypersensitivity / test hipersenzitivnosti zapoznelega tipa

E eksperiment

EC Erlich carcinoma / Erlichov karcinom

EPS exopolysaccharide / eksopolisaharidi

FAO The Food and Agriculture Organization / Organizacija za prehrano in kmetijstvo Združenih narodov

FTIR Fourier Transform Infrared Spectroscopy / Fourierjeva Transmisijska Infrardeča Spektroskopija

Gal D-galactose / D-galaktoza

Glc D-Glucose / D-glukoza

GRAS Generally Recognized As Safe / splošno priznani kot varni

KEF kefir

KZ kefirna zrna

M mineral

MKB mlečno-kislinske bakterije

N dušikova spojina

OKB ocetno-kislinske bakterije

OVA ovalbumin / ovalbumin

S180 Sarcoma 180 / Sarkom 180

SRBC antisheep red blood cell

TCA trichloroacetic acid / trikloroocetna kislina

UHT ultra visoka temperaturna pasterizacija

V vitamin

WHO World Health Organization /Svetovna zdravstvena organizacija

Xyl D-Xylose / D-ksiloza

SIMBOLI

a konstanta (g/L h)

b konstanta (g/L h °C)

c konstanta (h)

c vsota preštetih kolonij na vseh ploščah (KE)

e konstanta (h/°C)

Ea aktivacijska energija (kJ/mol)

Ep entalpija proizvodnje etanola (kJ/mol)

d faktor razredčevanja prve razredčine (/)

fm vrtilna frekvenca mešala (rpm)

g konstanta (g/L h)

h konstanta (h–1

)

H entalpija (J/g)

i konstanta (g/L h)


XVI

j konstanta (h–1

)

k konstanta (g/L)

k konstanta, ki prikazuje spremembo prirasti kefirnih zrn na enoto temperature (g/L °C)

l konstanta (h–1

)

m konstanta (g/L)

mIZOL masa izolata (g)

mKEF masa kefirana v izolatu oz. masa kefirana izoliranega iz zrn (g)

mKZ masa kefirnih zrn (g)

N število mikroorganizmov (KE/g; KE/ml)

n parameter eksponentnega pH modela (1)

n konstanta (h–1

)

n1 število plošč s prvo upoštevano razredčitvijo (/)

n2 število plošč z naslednjo razredčitvijo (/)

pH vrednost pH (/)

pH24h,0h pH vrednost kefirja, dosežena po 24-urni fermentaciji, izvedeni pri nenehnem mešanju fermentacijske brozge (/)

p konstanta (h)

o konstanta (h–1

)

R idealna plinska konstanta (8,314 J/mol K)

R2 korelacijski koeficient (/)

rEtOH,0 predeksponentni faktor (g/L h)

rEtOH,m maksimalna hitrost proizvodnje etanola (g/L h)

S površina pika med dvema valovnima dolžinama (/)

SEtOH površina pika etanola (/)

s parameter eksponentnega pH modela (1)

T temperatura (°C; K)

Ttal. temperatura tališča (°C)

t čas fermentacije (h)

takt. čas aktivacije (d)

tL lag faza oz. čas do pričetka eksponentne proizvodnje etanola (h)

tPM časovni presledek mirovanja mešala oz. pogostost mešanja (h)

u konstanta (/)

V volumen (L)

v konstanta (h)

w masni delež (%)

wGlc masni delež glukoze v izolatu (%)

wGal masni delež galaktoze v izolatu (%)

wKEF masni delež kefirana (Glc + Gal) v izolatu (%)

wKEF/KZ masni delež kefirana v kefirnem zrnu (%)

z parameter eksponentnega pH modela (h–1

)

GRŠKE ČRKE

[]D optična sučnost (°)

C masna koncentracija ogljikovega hidrata (g/L)

EtOH masna koncentracija etanola (g/L)

EtOH,m maksimalna masna koncentracija etanola (g/L)


XVII

KZ končna masna koncentracija kefirnih zrn (g/L)

KZ,0 začetna masna koncentracija kefirnih zrn (g/L)

KZ,m maksimalna masna koncentracija kefirnih zrn (g/L)

M masna koncentracija minerala (g/L)

N masna koncentracija dušikove spojine (g/L)

V masna koncentracija vitamina (g/L)

KZ prirast kefirnih zrn (g/L)

KZ,0°C prirast kefirnih zrn po 24 h pri 0 °C (g/L)

viskoznost (dL/g)

valovna dolžina (cm–1

)

max maksimalna specifična hitrost rasti kefirnih zrn (h1)

Glc/Gal masno razmerje med glukozo (Glc) in galaktozo (Gal) v kefiranu (/)


XVIII


XIX

OPTIMIRANJE BIOPROCESNIH PARAMETROV PROIZVODNJE ETANOLA IN KEFIRANA Z MIKROBIOTO

KEFIRNIH ZRN

P O V Z E T E K

Doktorska disertacija je sestavljena iz dveh sklopov, ki obravnavata področje proizvodnje

tradicionalnega kefirja s kavkaškimi kefirnimi zrni. Prvi je optimiranje bioprocesnih parametrov

proizvodnje etanola med fermentacijo kefirja, drugi pa optimiranje proizvodnje kefirana v kefirnih

zrnih.

Uvodoma smo v disertaciji proučili vpliv časa aktivacije kefirnih zrn na spremembe vrednosti pH

kefirja in na proizvodnjo etanola med fermentacijo kefirja. Upadanje pH vrednosti kefirja smo med 24

h fermentacijo uspešno opisali s predlaganim matematičnim, eksponentnim pH modelom. Poleg tega

smo proučili vpliv časa aktivacije kefirnih zrn na zvezo med številom kvasovk v zrnih in kefirju in

proizvedenim etanolom. Rezultati so pokazali, da zrna, ki jih aktiviramo dalj časa, vsebujejo večje

število kvasovk in proizvedejo več etanola kot zrna, ki so aktivirana le nekaj dni. Število kvasovk v

kefirju je z daljšanjem časa aktivacije zrn naraščalo.

S kinetičnimi modeli, katerih razvoj je vzpodbudila povečana industrijska uporaba fermentacije, lahko

opišemo rast mikroorganizmov, proizvodnjo produktov in porabo substratov tako v naravnih

ekosistemih, kakor tudi pri določenih procesnih pogojih. Tako smo z ne-strukturiranim matematičnim

modelom opisali kinetične osnove proizvodnje etanola med šaržno fermentacijo kefirja. V ta namen

smo proučili kinetiko rasti kefirnih zrn in proizvodnje etanola. Eksperimentalne podatke, pridobljene

s serijo šaržnih fermentacij, izvedenih pri temperaturi 21 °C, začetni masni koncentraciji kefirnih zrn

42 g/L in izbranih časih fermentacije znotraj časovnega intervala (0–89) h, smo uporabili za ocenitev

vrednosti kinetičnih parametrov in potrditev veljavnosti predlaganih sigmoidnih modelov. Rast

kefirnih zrn smo opisali z logističnim modelom, proizvodnjo etanola pa z modificiranim

Gompertzovim modelom. Ugotovili smo, da predlagana modela dobro opišeta kinetiko fermentacije

kefirja glede na rast kefirnih zrn in proizvodnjo etanola in da se lahko uporabita za razvoj in

optimizacijo bioloških procesov proizvodnje etanola.

Nadalje smo razvili matematični model za kinetiko proizvodnje etanola med fermentacijo kefirja kot

funkcijo temperature in časa. Vpliv temperature in časa fermentacije, na vrednost biokinetičnih

parametrov proizvodnje etanola, smo opisali z modificiranim Gompertzovim modelom. Vrednost

bioloških kinetičnih parametrov predlaganega modela smo ocenili z uporabo metode najmanjših

kvadratov na podlagi eksperimentalnih podatkov, pridobljenih s serijo šaržnih fermentacij. Ocenili

smo vpliv temperature na prirast biomase kefirnih zrn ter mikrobiološko sestavo kefirja in zrn.

Temperaturno odvisnost maksimalne hitrosti proizvodnje etanola smo analizirali z uporabo

Arrheniusove zveze, s katero smo ocenili vrednost aktivacijske energije za proizvodnjo etanola pri


XX

fermentaciji mleka s kefirnimi zrni, ki znaša 64,3 kJ/mol. Z razvitim matematičnim modelom lahko

zelo dobro opišemo dinamiko proizvodnje etanola med fermentacijo kefirja.

Prvi raziskovani sklop smo zaključili s proučevanjem vpliva časovnega presledka mirovanja mešala oz.

pogostosti mešanja na proizvodnjo etanola in mikrobiološke lastnosti kefirja in kefirnega zrna. Razvili

smo matematične zveze, ki opišejo razmerje med pogostostjo mešanja in (1) povečanjem prirasti

kefirnih zrn v 24 h, (2) koncentracijskimi spremembami etanola med 24 h fermentacijo ter (3) pH

vrednostjo kefirja po 24 h fermentaciji. Za razvite matematične modele so bile z uporabo metode

najmanjših kvadrotov ocenjene vrednosti funkcijskih parametrov. Ocenili smo tudi vpliv pogostosti

mešanja na število kvasovk, laktobacilov in mezofilnih MK kokov (pretežno laktokokov) v kefirju in

zrnih po 24 h fermentaciji.

Drugi sklop raziskav smo usmerili v raziskovanje bioprocesnih parametrov, ki vplivajo na proizvodnjo

specifičnega eksopolisaharida (EPS) kefirana, značilnega za kefirna zrna. Dokazali smo, da lahko z

vodenjem procesnih pogojev gojenja zrn v mleku (temperatura, vrtilna frekvenca mešala) in sestavo

fermentacijskega medija (ogljikovi hidrati), vplivamo na proizvodnjo EPS. Ugotovili smo, da sta

temperatura in vrtilna frekvenca mešala kritični za proizvodnjo kefirana med 24 h gojenjem zrn v

polnomastnem kravjem mleku; optimalna pogoja sta 25 °C in 80 rpm. Največ kefirana v zrnu (wKEF/KZ =

4,3 %) smo dobili pri obogatitvi osnovnega fermentacijskega medija (mleka) s 50 g/L laktoze, kjer je

bilo masno razmerje med glukozo in galaktozo v kefiranu 1 : 1,1. Maksimalno prirast kefirnih zrn,

KZ = 16,0 g/L, smo dobili z dodatkom 50 g/L laktoze in 5 g/L triptona. Rezultati so pokazali, da lahko

z dodatkom različnih hranil izboljšamo proizvodnjo kefirana in da učinkovita prirast kefirnih zrn ni

nujno ključni faktor za visoko proizvodnjo kefirana v zrnih. Ugotovili smo, da bi bilo za hkratno

proizvodnjo zrn in kefirana iz njih, fermentacijo najprimernejše izvesti pri naslednjih procesnih

pogojih: VMLEKO = 1 L, KZ,0 = 42 g/L, T = 25 °C, fm = 80 rpm, LAKTOZA = 50 g/L. Dobljeni rezultati so bili

osnova za razvoj procesne sheme tehnološkega postopka pridobivanja kefirana iz kefirnih zrn.

Rezultati raziskav doktorske disertacije so potrdili zastavljene teze.

Ključne besede: kefir, kefirna zrna, mikrobiota kefirnih zrn, proizvodnja etanola, eksopolisaharidi,

produkcija kefirana, procesni parametri, optimiranje.

UDK: 637.146.21:66.017(043.3)


XXI

OPTIMIZATION OF BIOPROCESS PARAMETERS FOR ETHANOL AND KEFIRAN PRODUCTION USING

MICROBIOTA OF KEFIR GRAINS

A B S T R A C T

This doctoral dissertation consists of two parts that dealing with the production of traditional kefir

with the Caucasus kefir grains. The first part deals with the optimization of the bioprocess

parameters of ethanol production during kefir fermentation and the second part deals with the

optimization of kefiran production from kefir grains.

As a start the effect of kefir grain activation time on the change in kefir pH value and the effect on

the production of ethanol during kefir fermentation was studied. The drop in the pH value of kefir

was successfully described during a 24 h fermentation process with the suggested mathematical,

exponental pH model. Additionally, the effect of kefir grain activation on the relation between the

produced ethanol and the number of yeasts in the grains and in the kefir was examined. The results

have shown that the more active grains produce more ethanol and contain a larger amount of yeasts

in comparison with the grains that have been activated for only a few days. The number of yeasts in

kefir was increasing in relation with the grain activation time.

The kinetic models, increasingly developed because of the industrial use of fermentation, allow for a

description of microbe growth, product creation and substrate use in natural ecosystems and under

certain process conditions. Using a non-structured mathematical model the kinetic fundamentals of

ethanol production during a batch fermentation of kefir were described. To that end the kinetics of

kefir grain growth and ethanol production were examined. The experimental data, acquired through

a batch fermentation series that was carried out at 21 °C, the start mass concentration of kefir grains

42 g/L and set fermentation times in the time bracket (0–89) h, was used to assess the kinetic

parameter values and to confirm the validity of the suggested sigmoid models. The kefir grain growth

was described using a logistic model. The ethanol production was described using a modified version

of the Gompertz model. It was established that both models offer a good description of the kefir

fermentation kinetics in relation to the kefir grain growth and ethanol production and that they can

be used to develop and optimize the biologic processes of ethanol production.

A mathematical model for ethanol production kinetics during kefir fermentation as a function of

temperature and time was also developed. The influence of temperature and fermentation time on

the value of the biokinetic parameters of ethanol production was described using the modified

Gompertz model. The value of biological kinetic parameters of the suggested model were assessed

using the method of least squares on the basis of the experimental data that was acquired through a

batch fermentation series. The influence of temperature on the growth of kefir grain biomass and

the microbiological composition of kefir and grains was assessed. The temperature dependence of


XXII

the maximum speed of ethanol production was analysed using the Arrhenius equation that was used

to assess the value of activation energy for the ethanol production during the fermentation of milk

with kefir grains (64,3 kJ/mol.) This mathematical model allows for a very good description of the

ethanol production dynamics during kefir fermentation.

The first dissertation part was concluded by examining the effect of time lapses during the mixer

inactivity or the stirring frequency on the ethanol production and the microbiological properties of

kefir and kefir grains. Several mathematical equations were developed that describe the relation of

the stirring frequency and (1) the increase of kefir grain growth in 24 h, (2) the concentration

changes of ethanol during the 24 h fermentation and (3) pH value of kefir after the 24 h

fermentation. The values of the function parameters for all developed mathematical models were

estimated using the method of least squares. The influence of the stirring frequency on the number

of yeasts, lactobacilli, mesophilic cocci, in the kefir and kefir grains after 24 h fermentation was also

estimated.

The second dissertation part was targeted at researching the bioprocess parameters that have an

effect on the production of the specific exopolysaccharide kefiran from kefir grains. It was proven

that by controlling the process condition of growing the kefir grains in milk (temperature, rotational

frequency of the stirrer) and the composition of the fermentation medium (carbon hidrates) can

greatly affect the production of kefiran. It was discovered that the temperature and the rotational

frequency of the stirrer have a critical effect on the production of kefiran during a 24h growth in a

whole cow's milk; the optimal conditions are 25 °C and 80 rpm. The highest gain from kefir grains

(wKEF/KZ = 4,3 %) was reached at the enrichment of the basic fermentation medium (milk) with 50 g/L

of lactose, where the mass ratio between glucose and galactose in kefiran was 1 : 1,1. The maximum

growth of kefir grains, KZ = 16,0 g/L, was achieved by adding 50 g/L of lactose and 5 g/L of tryptone.

The results have shown that by adding different nutrients the production of kefiran can be improved

and that the efficient growth of kefir grains is not necessarily a key factor for a high kefiran efficiency.

It was discovered that the most appropriate process conditions for a simultaneous production of

grains and kefiran from these grains are the following: VMILK = 1 L, KZ,0 = 42 g/L, T = 25 °C, fm = 80 rpm,

LACTOSE = 50 g/L. The achieved results were the basis for the development of a process scheme for a

technological procedure of producing kefiran from kefir grains.

The doctoral dissertation results have confirmed the set hypotheses.

Key words: kefir, kefir grains, kefir grains microbiota, ethanol production, exopolysaccharide, kefiran

production, process parameters, optimization.

UDK: 637.146.21:66.017(043.3)


1

POGLAVJE I UVOD


2


3

1 PREDSTAVITEV RAZISKOVALNEGA PODROČJA

Posledica sodobnega načina življenja, ki ga zaznamujejo predvsem nezdravo prehranjevanje, premalo

gibanja, uživanje alkohola, antibiotikov in drugih zdravil ter stres, je porušeno ravnovesje črevesne

mikrobiote, ki se običajno odraža kot oslabljena imunska odpornost telesa in različne prebavne

težave. Tako normalna mikrobiota kloni pred patogenimi bakterijami, kar prizadene številne

življenjsko pomembne funkcije telesa in vodi v hiter porast sodobnih kroničnih bolezni, kot so

obolenja srca in ožilja, rakava obolenja, povišan krvni tlak, sladkorna bolezen, alergije, bakterijske in

virusne okužbe, avtoimunske in vnetne bolezni (Teskač idr., 2008).

Zaradi pospešenega iskanja alternativ konvencionalnim terapijam za zdravljenje različnih kroničnih

bolezni se je v zadnjih nekaj letih znatno povečala poraba različnih funkcionalnih živil in/ali

prehranskih dopolnil, ki učinkujejo na sestavo in aktivnost mikrobiote prebavnega trakta (Vasiljevic in

Shah, 2008; Pervez idr., 2006). V tej kategoriji izdelkov imajo probiotiki in prebiotiki vodilno vlogo, saj

je sodobna znanost dokazala, da ugodno vplivajo na zdravje ljudi (Sánchez idr., 2009). S kliničnimi

raziskavami so dokazali, da probiotiki in prebiotiki neposredno in/ali posredno pozitivno učinkujejo

na izboljšanje imunske odpornosti, preprečujejo nastanek raka na debelem črevesju, preprečujejo

rotavirusne driske, lajšajo simptome laktozne intolerance, uravnavajo črevesno mikrofloro,

preprečujejo drisko pri zdravljenju z antibiotiki, izboljšujejo presnovo beljakovin in maščob,

zmanjšujejo tveganja za razvoj vnetnih črevesnih bolezni, izboljšajo adsorpcijo vitaminov in mineralov

in še bi lahko naštevali (Shah, 2007; Reid, 2008).

Po definicij, ki sta jo sprejeli Organizacija za prehrano in kmetijstvo Združenih narodov (The Food and

Agriculture Organization – FAO) in Svetovna zdravstvena organizacija (World Health Organization –

WHO), so probiotiki živi mikroorganizmi, ki dokazano pozitivno učinkujejo na zdravje gostitelja, če jih

zaužije v zadostnih količinah (Sánchez idr., 2009; Reid, 2008). Najpogostejše probiotične bakterije so

sevi rodov Lactobacillus in Bifidobacterium, ki sodijo v skupino mlečno-kislinskih bakterij (MKB),

katere človek že tisočletja uživa s fermentiranimi mlečnimi izdelki (Leroy in De Vuyst, 2004; Teskač

idr., 2008). Izbrane probiotične bakterije dodajajo največkrat v jogurt ali druge fermentirane mlečne

izdelke, ki jih uvrščamo v skupino »funkcionalne hrane« (Itsaranuwat idr., 2003). To je hrana, ki poleg

tega, da oskrbuje organizem z osnovnimi hranili, preprečuje obolenja oziroma prispeva k boljšemu

zdravstvenem stanju. Na trgu se pojavlja tudi veliko število prehranskih dopolnil v obliki tablet,

kapsul, praškov in drugih farmacevtskih oblik, ki vsebujejo probiotične bakterije. Zanimivo alternativo

oziroma dopolnilo probiotikom predstavljajo prebiotiki, ki naj bi imeli podobne učinke, kot probiotiki,

to je uravnavanje črevesne mikrobiote. Pripadajo predvsem funkcionalni skupini prehranskih vlaknin

oligo- in polisaharidne narave in so v glavnem rastlinskega izvora. Prebiotiki so neprebavljivi v

zgornjem delu prebavnega trakta in ugodno učinkujejo na gostitelja s tem, da spodbujajo rast in

aktivnosti koristnih črevesnih bakterij. Izdelke, v katerih so prisotni probiotiki in prebiotiki,

imenujemo tudi simbiotični izdelki (Reid, 2008). Med eminentne predstavnike simbiotičnih izdelkov

nekateri prištevajo tudi kefir, ki se po tehnološkem postopku izdelave najbolj razlikuje od ostalih vrst

fermentiranega mleka.

Kefir je fermentiran mlečni napitek s penasto strukturo, rezkim okusom, žametno kislostjo in nizko

vsebnostjo alkohola (Yaman, 2004). Še posebej cenjen je kefir, izdelan po tradicionalnem postopku, s

kefirnimi zrni, ki jih dodajo mleku kot startersko kulturo. Kefirna zrna vsebujejo mešano mikrobioto,

ki je ujeta v snov, sestavljeno iz polisaharida (kefiran). Polisaharid, ki ga izločajo mikroorganizmi, je

povezan z delno razgrajenimi beljakovinami mleka in majhnimi količinami mlečne maščobe.


4

Mikrobioto kefirnih zrn sestavljajo MKB in kvasovke (Simova idr., 2002). Slednje med procesom

fermentacije proizvajajo etanol (0.7–2.5) % in CO2, ter z drugimi metaboliti (mlečna kislina,

acetaldehid, acetoin, diacetil, itn.) prispevajo k značilnemu okusu in aromi izdelka (Dragone idr.,

2009). Vsebnost etanola v kefirju je v veliki meri odvisna od procesnih pogojev, pri katerih je izpeljana

fermentacija. Med najpomembnejše sodijo temperatura, začetna masna koncentracija dodanih

kefirnih zrn, vrsta in kemijska sestava mleka, začetna vrednost pH mleka, aktivnost kefirnih zrn, itd.

Z optimiranjem procesnih pogojev je torej možno izdelati kefir z višjo ali nižjo vsebnostjo alkohola,

kar pomeni možnost razširitve asortimana in pripravo kefirja tudi za določene skupine ljudi, ki kefirja

ne uživajo zaradi vsebnosti alkohola.

Nekateri sevi MKB sintetizirajo naravne ekstracelularne polisaharide (eksopolisaharide–EPS), ki imajo

pomembno vlogo pri oblikovanju teksture fermentiranih mlečnih izdelkov, vse več pa je dokazov o

njihovih pozitivnih zdravstvenih učinkih, saj imajo lastnosti prebiotikov. V zadnjih letih je zato

zanimanje za eksopolisaharide, zaradi njihove potencialne uporabe v prehrambeni, farmacevtski in

kemijski industriji ter zaradi drugih pomembnih funkcij (bioflokulanti, bioabsorbenti, odstranjevalci

težkih kovin,...), močno naraslo (Welman in Maddox, 2003).

Mikrobioto kefirnih zrn poleg lipidov in proteinov obdaja še bakterijski eksopolisaharid kefiran. Za

biosintezo kefirana sta večinoma odgovorni vrsti Lactobacillus kefiri in Lactobacillus kefiranofaciens.

Sintetizirajo pa ga lahko tudi druge, v zrnih prisotne vrste rodu Lactobacillus. Kefiran je vodotopen,

razvejan glukogalaktan, zgrajen iz približno enakih deležev D-glukoze in D-galaktoze. Pogosto ga

uporabljajo kot aditiv v proizvodnji živil, kjer ima funkcijo zgoščevalca, stabilizatorja, emulgatorja,

želirnega sredstva, maščobnega nadomestka in veznika vode. Nekateri raziskovalci navajajo, da

deluje protibakterijsko, protiglivično in antitumorno, kar je največkrat posledica njegovega

prebiotičnega delovanja (Frengova idr., 2002).

Rezultati svetovnih študij so pokazali, da je donos kefirana, ki ga laktobacili kefirnih zrn med

procesom fermentacije sintetizirajo in izločajo v mleko, izredno nizek in se giblje v redu velikosti mg/L

medija (Frengova idr., 2002). Zaradi široke uporabnosti na področju živilske, kozmetične,

farmacevtske in drugih industrij bi bilo smotrno kefiran iz kefirnih zrn izolirati v večjih količinah. Prav

tako so raziskave številnih predhodnih študij (Wang in Bi, 2008; Liu idr., 2002) pokazale, da je donos

eksopolisaharidov MKB močno odvisen od kultivacijskih pogojev (temperatura, sestava medija, čas

inkubacije, vir ogljika, itd.) MKB. Višji donos EPS bi lahko, kljub širokemu spektru v literaturi že

objavljenih kompleksnih in dolgotrajnih metod za izolacijo EPS, dosegli z optimiranjem rastnih

pogojev MKB kefirnih zrn ter razvojem in optimiranjem naprednega, enostavnega in učinkovitega

postopka izolacije kefirana iz kefirnih zrn.


5

2 CILJI IN TEZE DOKTORSKE DISERTACIJE

Glede na perspektivno uporabnost kefirnih zrn smo z vidika vsebnosti aromatičnega etanola,

mikrobioloških karakteristik ter razvoja kinetičnih modelov, ki so nujno potrebni za študij, postavitev

in vodenje fermentacijskih procesov, v okviru doktorske disertacije zastavili naslednje CILJE:

CILJ 1: Proučiti vpliv aktivnosti kefirnih zrn na proizvodnjo etanola in s tem na vsebnost etanola v

fermentiranem mlečnem proizvodu

Za dosego postavljenega cilja smo proučili vpliv časa aktivacije kefirnih zrn na dinamični pH

profil fermentiranega mleka ter vpliv različno aktiviranih zrn na koncentracijo proizvedenega

etanola. Proučili smo tudi odnos med velikostjo mikrobne populacije kvasovk, prisotnih v

kefirnih zrnih in kefirju ter koncentracijo proizvedenega etanola.

CILJ 2: Razviti matematični model za določitev hitrosti nastajanja etanola med fermentacijo

kefirja

Z uporabo ne-strukturiranih kinetičnih modelov smo opisali kinetiko prirasti mase kefirnih zrn

in količine etanola med fermentacijo ter ocenili vrednosti kinetičnih parametrov.

Interpretirali smo značilnosti proizvodnje etanola med fermentacijo kefirja. Prav tako smo

spremljali velikost populacije kvasovk v zrnih in kefirju.

CILJ 3: Matematično modelirati proizvodnjo etanola kot funkcijo temperature in časa

V sklopu zastavljenega cilja smo razvili matematični model za opis vpliva temperature na

prirast mase kefirnih zrn med 24 h fermentacijo ter ocenili vrednosti kinetičnih parametrov.

Razvili smo matematični model za proizvodnjo etanola kot funkcijo temperature in časa ter

ocenili vrednosti kinetičnih parametrov. Nadalje smo ovrednotili vpliv temperature na

dinamični pH profil fermentiranega mleka in mikrobiološko sestavo kefirnih zrn in kefirja. Za

oceno vpliva temperature na maksimalno hitrost proizvodnje etanola smo ocenili vrednost

aktivacijske energije in pred-eksponentnega faktorja proizvodnje etanola.

CILJ 4: Matematično modelirati proizvodnjo etanola kot funkcijo časovnega presledka mirovanja

mešala (pogostosti mešanja kefirja) in časa

Za dosego zastavljenega cilja smo razvili matematični model, s katerim lahko učinkovito

opišemo vpliv pogostosti mešanja kefirja na prirast mase kefirnih zrn med 24 h fermentacijo

ter ocenimo vrednosti kinetičnih parametrov. Prav tako smo razvili matematični model za

proizvodnjo etanola kot funkcijo pogostosti mešanja kefirja in časa fermentacije ter ocenili

vrednosti kinetičnih parametrov. Ovrednotili smo tudi vpliv pogostosti mešanja na končno pH

vrednost kefirja in mikrobiološko sestavo kefirnih zrn in kefirja.

Z vidika široke uporabnosti kefirana v medicini ter farmacevtski, prehrambni in kemijski industriji,

smo si v okviru doktorske disertacije zastavili dva cilja:

CILJ 5: Okarakterizirati sestavo kefirana, izoliranega iz kefinih zrn

V okviru zastavljenega cilja smo določili natančno vrsto, število in masno razmerje

monosaharidov v vzorcih kefirana.


6

CILJ 6: Optimirati proizvodnjo kefirana s kefirnimi zrni

V okviru doseganja tega cilja smo razvili in optimirali metodo za izolacijo kefirana iz kefirnih

zrn, ki bo ob predhodno določenih procesnih pogojih (čas fermentacije, temperatura,

mešanje, pH) omogočila maksimalne izkoristke. Za dosego postavljenega cilja smo proučili

tudi vpliv različnih dodatkov/rastnih faktorjev (ogljikovi hidrati, aminokisline, minerali,

vitamini) na proizvodnjo kefirana.

V sklopu zgoraj predvidenih ciljev smo postavili in preverjali sledeče TEZE:

TEZA 1: Število kvasovk v kefirnih zrnih narašča z daljšanjem časa aktivacije zrn.

TEZA 2: Vsebnost etanola in število kvasovk v kefirju naraščata s stopnjo aktivacije kefirnih zrn.

TEZA 3: Z eksponentnim pH modelom lahko učinkovito določimo optimalni čas aktivacije kefirih zrn,

ki nam poleg ponovljivosti dnevnega prirasta kefirnih zrn pri optimalnih procesnih pogojih

zagotavlja tudi ponovljivost časovnega spreminjanja pH vrednosti kefirja med fermentacijo.

TEZA 4: Kinetične osnove rasti mikrobiote kefirnih zrn in proizvodnje etanola med šaržno

fermentacijo kefirja je mogoče opisati z ne-strukturiranimi matematičnimi modeli.

TEZA 5: Temperatura vpliva na sestavo mikrobiote, prirast in aktivnost kefirnih zrn.

TEZA 6: Temperaturno odvisnost maksimalne hitrosti proizvodnje etanola in pred-eksponentnega

faktorja opiše Arrhenius-ova enačba.

TEZA 7: Mešanje vpliva na sestavo mikrobiote, prirast in aktivnost zrn.

TEZA 8: Masno razmerje monosaharidov D-glukoza : D-galaktoza v kefiranu je 1 : 1.

TEZA 9: Z uspešnim razvojem in optimiranjem izolacijske metode ter obogatitvijo fermentacijskega

medija lahko povečamo dobit kefirana iz kefirnih zrn.

3 PREDPOSTAVKE IN MOREBITNE OMEJITVE

Primarno je potrebno opozoriti, da zaradi raznolike mikrobiološke sestave kefirnih zrn, različnega

izvora, rezultati raziskav disertacije niso splošno veljavni za vse vrste kefirnih zrn, temveč le za

uporabljena zrna kavkaškega izvora, ki jih v svoji proizvodnji uporablja mlekarna Krepko (Kele & Kele

d.o.o., Logatec) in so gojena v UHT mleku s 3.5 % mlečne maščobe (Ljubljanske mlekarne d.d.).

Predvidevamo pa, da smo z razvitimi modeli opisali osnovne značilnosti kompleksnih fermentacijskih

sistemov, v katerih so vključene simbiotsko odvisne mlečno-kislinske bakterije in kvasovke.

Rezultati raziskav, v katerih so vključene naravne mikrobne združbe, so poleg same sestave mikrobne

združbe, ki je variabilna, odvisni od okoljskih dejavnikov, kot so sestava kultivacijskega medija

(mleko), število že prisotnih mikroorganizmov v kultivacijskem mediju, pH itn.

Poglavitni omejitvi, ki sta morebiti lahko vplivali na rezultate raziskav disertacije, sta bili (1) variiranje

kemijske sestave mleka (prehrana, obdobje laktacije, letni čas), uporabljenega za gojitev kefirnih zrn

in izvedbo fermentacij ter (2) variiranje števila posameznih, v kefirnih zrnih in kefirju prisotnih

mikrobnih združb (kvasovke, laktobacili, streptokoki).

Ključno omejitev v okviru proučevanja vpliva časa aktiviranja kefirnih zrn na vsebnost etanola, pH,

fermentacijske profile in število kvasovk v zrnih in kefirju, je nedvomno predstavljalo tudi variiranje


7

števila kvasovk v zrnih in kefirju, ki so odgovorne za proizvodnjo etanola med procesom fermentacije.

Kot morebitno dodatno omejitev pri kvalitativni in kvantitativni analizi mikrobioloških združb v

kefirnih zrnih in kefirju smo upoštevali tudi eksperimentalno napako.

Pri proučevanju kinetike proizvodnje etanola med fermentacijo mleka s kefirnimi zrni smo razvili ne-

strukturirana kinetična modela, s katerima je možno opisati hitrost rasti mikrobiote kefirnih zrn in

hitrost nastajanja etanola med fermentacijo. Pri tem velja opozoriti, da aplikacija razvitih kinetičnih

modelov, zaradi raznolike in specifične mikrobiote kefirnih zrn, najverjetneje ni možna za druge

fermentacijske sisteme, ki so večinoma monokulturni ali nekaj sevni.

Menimo, da so zgoraj navedene predpostavke sicer lahko vplivale na rezultate raziskav, vendar ne do

mere, da bi bili dobljeni rezultati raziskav neveljavni.


8


9

POGLAVJE II KEFIR IN KEFIRNA ZRNA pregled literature


10


11

1 UVOD

Velik pomen pri zagotavljanju uravnotežene prehrane pripisujemo vsakodnevnemu uživanju

fermentiranih mlečnih izdelkov, ki sodijo med najstarejša živila, saj njihov začetek sega tisočletja v

preteklost. Za njihovo proizvodnjo uporabljajo t.i. starterske kulture, ki so sestavljene iz različnih vrst

bakterij, kvasovk, plesni in njihove kombinacije. Glede na prevladujoče mikroorganizme v starterski

kulturi, ki izpeljejo fermentacijo, razdelimo vrste fermentiranih mlečnih izdelkov v tri skupine (Rogelj

in Perko, 2003; Muir idr., 1999):

1. Fermentirani mlečni izdelki, izdelani z mlečno-kislinsko fermentacijo (za fermentacijo so

odgovorne le MKB).

2. Fermentirani mlečni izdelki, izdelani s kombinirano fermentacijo, v kateri poleg MKB

sodelujejo tudi plesni.

3. Fermentirani mlečni izdelki, narejeni s kombinirano fermentacijo (kislinsko-alkoholna

fermentacija) za katero so odgovorne MKB in kvasovke.

Najbolj poznan predstavnik tretje skupine fermentiranih mlečnih izdelkov je kefir.

Kefir ali jogurt 21. stoletja, poznan tudi pod drugimi komercialnimi imeni, kot so kephir, kiaphur,

kefyr, képhir, kéfer, knapon, kepi in kippi, je eden najstarejših tradicionalnih fermentiranih mlečnih

izdelkov, ki vsebuje različne biološko aktivne sestavine s potencialno pozitivnim učinkom na zdravje

(Farnworth, 2005). Od drugih industrijsko izdelanih fermentiranih mlečnih izdelkov se najbolj

razlikuje po tehnološkem postopku izdelave in po mikrobioloških, fizikalno-kemijskih, senzoričnih in

terapevtskih učinkih (Rogelj in Perko, 2003). Je mlečni izdelek s penasto strukturo, rezkim okusom in

žametno kislostjo. Zaradi prisotnosti majhnega odstotka CO2, ki nastane naravno, med procesom

fermentacije, ga uvrščamo med osvežilne mlečne napitke. Beseda kefir izhaja iz turške besede 'keyif'

in pomeni 'prijeten okus' (Yilmaz idr., 2006).

Domovina kefirja so severna pobočja Kavkaza v centralni Aziji, kjer ga tamkajšnja ljudstva, ki slovijo

po svoji aktivni moči in visoki starosti, že stoletja izdelujejo po tradicionalnem postopku v usnjenih

vrečah, glinenih posodah, lesenih čebrih ali hrastovih sodih iz kozjega, kravjega, kameljega, bivoljega

ali ovčjega mleka, ki mu za pospešitev fermentacije dodajo kefirna zrna (Urdaneta idr., 2007; Yilmaz

idr., 2006). Ta naj bi nastala naključno s fermentacijo svežega mleka v vrečah iz kozjih kož, ki so bile

obešene na soncu. Izročilo pravi, da je moral vsakdo, ki je prišel mimo vreče, udariti vanjo, da se je

vsebina premešala. Odvzeto mleko so nadomestili z novim. Prebivalci Kavkaza sicer verjamejo

legendi, ki pravi, da je zrna njihovim prednikom nekoč podaril prerok Mohamed, da bi dolgo živeli in

imeli veliko potomcev. Znanstveniki pa še do danes niso dali razlage o nastanku kefirnih zrn

(Athanasiadis idr., 1999).

Ob koncu prejšnjega stoletja so kefirna zrna prenesli iz Kavkaza še v druge kraje. Prvotno se je

proizvodnja kefirja razširila v vzhodno in srednjo Evropo. Danes je kefir razširjen in poznan povsod po

svetu, še vedno pa ga največ proizvedejo v Rusiji. Zelo popularen je v Jugozahodni Aziji, Severni

Ameriki, državah Severne in Vzhodne Evrope ter v Japonski (Sarkar, 2007). Proizvajajo ga pretežno iz

kravjega mleka, poročajo pa tudi o proizvodnji iz sojinega, ovčjega, kozjega, kameljega in ostalih vrst

mleka (Ismail idr., 1983). Še posebej cenjen je kefir, izdelan po tradicionalnem postopku z naravnimi

kefirnimi zrni.


12

2 KEFIRNA ZRNA

Za izdelavo kefirja so torej značilna kefirna zrna, ki jih dodajajo mleku, da sprožijo fermentacijo.

Kefirna zrna so nepravilno oblikovani, beli ali belo-rumenkasti skupki, z rahlo nagubano, hrapavo

površino. Imajo sluzasto, vendar čvrsto strukturo, ki spominja na majhen cvet cvetače (Güzel-Seydim

idr., 2000; Garrote idr., 1997; Witthuhn idr., 2005; Kwak idr., 1996). Zunanja površina kefirja se

spreminja od zelo gladkih delov do delov z mnogimi raznovrstnimi, nepravilnimi oblikami, kjer je

veliko majhnih, okroglastih, štrlečih izboklin, naključno razpršenih po površini. V premeru merijo

(0,3–3,5) cm (Irigoyen idr., 2005; Rimada in Abraham, 2001), kot prikazuje slika 2.1 (Farnworth,

2005). V vodi in drugih topilih so netopna. V mleku nabreknejo in postanejo bela. Za ohranitev

njihovega preživetja jih je potrebno dnevno prenašati v sveže mleko. Po približno 20 h naj bi se masa

zrn povečala za približno 25 % (Farnworth, 2005).

Slika 2.1: Kefirna zrna (Farnworth, 2005).

Njihova aktivnost se znižuje, kadar jih spiramo z vodo. Priporočljivo je, da se mokra zrna shranjujejo

pri nižjih temperaturah (T = 4 °C), suha pa pri sobni temperaturi. Zrna, hranjena v vodi, obdržijo svojo

aktivnost (8–10) dni, suha ali liofilizirana zrna pa cca. (12–18) mesecev (Garrote idr., 1997).

Zrna vsebujejo raznoliko in kompleksno, s kazeinom in kompleksom sladkorjev združeno mikrobioto,

ki je ujeta v snov, sestavljeno iz eksopolisaharida kefirana, ki predstavlja (24–25) % mase suhih

kefirnih zrn (Marshall idr., 1984). Med fermentacijo nastajajo poleg polisaharidov tudi različni

bioaktivni peptidi (Irigoyen idr., 2005). Kemijsko so zrna sestavljena iz (89–90) % vode, 6 % sladkorjev,

3,2 % proteinov, 0,7 % ogljika in 0,3 % lipidov (Zourari in Anifantakis, 1988; Garrote idr., 2000). (10–

16) % mase suhih zrn sestavljajo beljakovine in ogljikovi hidrati.

2.1 Mikrobiološke karakteristike

Mikrobioto kefirnih zrn, ki je povezana zelo organizirano, sestavlja kompleksna združba mlečno-

kislinskih bakterij (MKB) in kvasovk, ki živijo v medsebojnem sožitju in proizvajajo številne encime,

antioksidante, vitamine, antitumorne substance, biološke stimulanse ter druge metabolite, mleko pa

s kislinsko-alkoholno fermentacijo spreminjajo v živilo, ki je bolj primerno za človeka kot mleko samo

(Leroi in Pidoux, 1993; Simova idr., 2002; Rea idr., 1996; Witthuhn idr., 2004). Pestra sestava

mikrobiote je močno odvisna od izvora kefinih zrn in pogojev skladiščenja, saj se kefirna zrna iz

različnih geografskih območij po sestavi med seboj močno razlikujejo (Witthuhn idr., 2004). Število


13

bakterij v kefirju variira od 6,4 × 104 KE/g do 8,5 × 108 KE/g, kvasovk pa od 1,5 × 105 KE/g do 3,7 × 108

KE/g (Sarkar, 2007). Irigoyen idr. (2005) so poročali, da so po 24 h fermentaciji poleg variabilne

populacije MKB (108 KE/mL) in kvasovk (105 KE/mL) v zrnu prisotne tudi ocetno-kislinske bakterije

(106 KE/mL). Mnogi mikroorganizmi kefirnega zrna so podobni tistim, ki so naravno prisotni v

človeškem telesu in so nujno potrebni za normalno delovanje našega organizma.

V kefirnem zrnu so mikroorganizmi razporejeni zelo nesimetrično. Na neenakomerno oblikovanih in

hrapavih površinah kefirnega zrna prevladujejo pretežno kvasovke, na bolj gladkih pa bakterije.

Kvasovke se močno namnožijo in skoncentrirajo na površini, kjer tvorijo mikro-kolonije, kar se kaže

kot izbočenje (Molska idr., 1980). Nasprotno so Rosi-jeve (Rosi, 1978) študije pokazale, da so

kvasovke locirane pretežno na vhodih v 'pore', ki vodijo v notranjost zrna, občasno pa so naključno

razporejene tudi po kanalih v eksopolisaharidnem matriksu, medtem ko na površju zrna prevladujejo

pretežno bakterije.

Raziskave, opravljene z elektronskim mikroskopom (slika 2.2) so pokazale, da kvasovke prevladujejo

predvsem v središču zrna, ki ima v primerjavi s perifernim delom, ki ga naseljujejo bakterije, veliko

manj številčno mikrobno populacijo (Bottazzi in Bianchi, 1980).

a) b)

Slika 2.2: a) Prevlada bakterij na perifernem delu zrna. b) Kvasovke v središču kefirnega zrna (Bottazzi in Bianchi, 1980).

V osrednjem delu, ki pa ni naseljen izključno s kvasovkami, se nahaja tudi nekaj MKB, zlasti dolgih

paličastih laktobacilov. Prav tako perifernega dela zrn ne naseljujejo izključno kratki paličasti

laktobacili, temveč tudi kvasovke.

2.1.1 Mlečno-kislinske bakterije (MKB)

MKB v fermentiranih mlečnih izdelkih že stoletja predstavljajo normalno sestavino človeške prehrane

in so, poleg kvasovk, industrijsko najpomembnejši mikroorganizmi. Zaradi dolgotrajne

dokumentirane varne uporabe imajo status GRAS (Generally Recognized as Safe/splošno priznani kot

varni). Ker številna poročila potrjujejo njihovo dobrodejno delovanje v prebavnem traktu, se pogosto


14

dodajajo živilom kot probiotiki (Wang idr., 2008; Ruas-Madiedo idr., 2002; Rimada in Abraham,

2006).

(83–90) % mikrobiote kefirnega zrna predstavljajo štirje poglavitni rodovi MKB, in sicer Lactobacillus,

Lactococcus, Streptococcus in Leuconostoc (Simova idr., 2002). Med MKB še uvrščamo rodove

Pediococcus in nekoliko bolj obrobne Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Oenococcus,

Teragenococcus, Vagococcus in Weisella. Po fizioloških lastnostih lahko mednje uvrstimo tudi

genetsko nesoroden rod Bifidobacterium (Stiles in Holzapfel, 1997).

MKB spadajo v skupino po Gramu pozitivnih bakterij. So anaerobni in mikroaerofilni koki (kroglice) in

bacili (palčke) in ne tvorijo spor. Pomembna značilnost, po kateri so dobile ime je, da kot končni

produkt anaerobne fermentacije ogljikovih hidratov (največkrat glukoze) tvorijo mlečno kislino. Glede

na metabolizem jih razdelimo v dve skupini: (1) homofermentativne, ki kot edini in glavni produkt

metabolizma glukoze tvorijo mlečno kislino (70–90) % in (2) heterofermentativne, ki tvorijo enako

množino mlečne kisline, CO2 in etanola (Leroy in De Vuyst, 2004; Berlec in Štrukelj, 2008). Zaradi

tvorbe mlečne kisline pH fermentacijskega medija/gojišča med fermentacijo pada. MKB so relativno

odporne proti nizkim vrednostim pH. Pri večini vrst se rast ustavi pri pH = 4,5. Imajo tudi podobno

temperaturno toleranco in ne preživijo pri temperaturi višji od 45 °C. So avksotrofne za številne

aminokisline, ki jih morajo pridobiti iz okolja. MKB pogosto proizvajajo antibakterijske peptide

bakteriocine, ki zanje predstavljajo prednost, saj so bakterije proizvajalke nanje imune, hkrati pa so

toksični za kompetitivne bakterije (Berlec in Štrukelj, 2008).

2.1.1.1 Rod Lactobacillus

Bakterije tega rodu so najpomembnejša skupina industrijsko uporabnih MKB v živilstvu. Laktobacili so

po Gramu pozitivne, fakultativno anaerobne in mikroaerofilne bakterije. Po obliki so dolge in

kokoidne, negibljive in nesporogene paličice. V okolju z nizko pH vrednostjo postanejo po Gramu

negativne. Energijo pridobivajo s fermentacijo laktoze in drugih sladkorjev v mlečno kislino.

Razmnožujejo se pri temperaturi (2–35) °C (odvisno od vrste), optimum je pri (30–40) °C. Optimalno

rastejo pri pH = (3,0–7,0) (Adamič idr., 2003).

Ugotovili so, da morfološko različni laktobacili prevladujejo predvsem na površinskih, gladkih predelih

kefirnega zrna. Simova idr. (2002) v rezultatih raziskav poročajo, da laktobacili predstavljajo okrog

(24–33) % mikrobiote kefirnega zrna. Od tega naj bi termofilni, homofermentativni bakteriji

Lactobacillus bulgaricus in Lactobacillus helveticus predstavljali (70–87) % vseh izoliranih

laktobacilov, kar se ujema z rezultati raziskave Takizawe idr. (1998), ki poročajo, da je 90 % izoliranih

bakterij rodu Lactobacillus homofermentativnih, preostalih 10 % pa predstavlja heterofermentativni

Lactobacillus kefiri. Nasprotno nekateri avtorji navajajo, da naj bi 80 % vseh laktobacilov v kefirnem

zrnu in kefirju predstavljala heterofermentativna bakterija Lactobacillus kefiri, preostalih 20 % pa

homofermentativne bakterije vrst Lactobacillus kefiranofaciens, Lactobacillus kefirgranum,

Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei ssp. tolerans, Lactobacillus casei ssp. rhamnosus,

Lactobacillus casei ssp. pseudoplantarum, Lactobacillus lactis, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus

acidophilus, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii in Lactobacillus bulgaricus (Sarkar,

2008; Simova idr., 2002; Lopitz-Otsoa idr., 2006; Bosch idr., 2006).

Študije so pokazale, da Lactobacillus kefiri v mleku raste hitreje kot kvasovke vrste Candida kefir in

da laktobacili omenjene vrste nimajo izrazite vloge pri oblikovanju karakteristik začetne kulture in

kefirja (Linossier in Dousset, 1994). V nekaterih študijah poročajo tudi, da vrste rodu Lactobacillus v


15

splošnem predstavljajo od (65–80) % mikrobiote kefirnega zrna (Simova idr., 2002; Witthuhn idr.,

2005).

Od heterofermentativnih laktobacilov se poleg Lactobacillus kefiri v kefirnem zrnu največ pojavljajo

Lactobacillus brevis, Lactobacillus viridescens, Lactobacillus fermentum in Lactobacillus parakefir

(Sarkar, 2008; Bosch idr., 2006).

2.1.1.2 Rod Lactococcus

Iz kefirnega zrna so do danes uspeli izolirati tudi nekatere mezofilne, homofermentativne vrste MKB

rodu Lactococcus, in sicer Lactococcus lactis ssp. lactis, Lactococcus lactis ssp. cremoris,

Lactococcus lactis ssp. diacetylactis in Lactococcus filant (Yüksekdsğ idr., 2004). Laktokoki, po Gramu

pozitivne, kroglaste bakterije, so prisotni v večini mlečnih izdelkov. Rastejo znotraj temperaturnega

intervala (8–40) °C, optimalno med (28–31) °C. S homolaktično fermentacijo laktozo fermentirajo v

mlečno kislino (Adamič idr., 2003).

Nahajajo se na površini kefirnih zrn in prevladujejo v prvih 48 h fermentacije, nakar njihovo število

prične izrazito upadati (García Fontán idr., 2006). Zagotavljajo hitro naraščanje koncentracije mlečne

kisline v prvih urah fermentacije in s tem posledično upad pH vrednosti fermentiranega mleka. Visoka

koncentracija mlečne kisline v kefirju (nizek pH) laktokoke postopno inhibira. Laktokoki tvorijo tudi

druge produkte (vodikov peroksid, acetaldehid, diacetil, acetaldehid, idr.), ki vplivajo na oblikovanje

arome kefirja. Iz kefirnih zrn izolirani sevi vrste Lactococcus lactis (Lac. lactis Z1S, Z2S, Z3S, Z13S) in

Lacticoccus cremoris (Lac. cremoris Z6S, Z9S, Z10S, Z11S, Z14S, Z16S–Z30S) inhibirajo rast bakterije

Staphylococcus aureus. Sevi Lactococcus lactis Z1S in Z2S ter Lactococcus cremoris Z6S inhibirajo

tudi rast Escherichia coli in Pseudomonas aeruginosa (Yüksekdsğ idr., 2004; Rogelj in Perko, 2003).

Homofermentativni laktokoki do določene mere inhibirajo tudi razvoj kvasovk, kar povzroči postopno

in počasno nastajanje alkohola.

2.1.1.3 Rod Streptococcus

Od homofermentativnih MKB rodu Streptococcus, so v kefirnem zrnu prisotne naslednje vrste:

Streptococcus thermophilus, Streptococcus lactis, Streptococcus cremoris in Streptococcus durans

(Yüksekdsğ idr., 2004; Sarkar, 2008; Sarkar, 2007). Gre za okrogle, fakultativno do obvezno

anaerobne koke. Ogljikove hidrate fermentirajo v mlečno, ocetno in metanojsko kislino. Optimalno

se razmnožujejo v temperaturnem območju (0–45) °C in pH vrednosti (4,0–9,6) (Adamič idr., 2003).

Simova idr. (2002) poročajo, da (53–65) % mikrobiote kefirnega zrna predstavljajo

homofermentativni mlečno-kislinski streptokoki. Hitro naraščanje števila streptokokov ob začetku

fermentacije povzroči upad pH vrednosti kefirja, kar vzpodbudi rast laktobacilov in upočasni rast

streptokokov. Sevi vrst Streptococcus thermophilus in Streptococcus durans proizvajajo mlečno kislino

in acetaldehid. Yüksekdsğ idr. (2004) so v svojih raziskavah ugotovili, da inhibirajo rast

Staphylococcus aureus, ne inhibirajo pa rasti seva Escherichia coli NRLL B-704 in Pseudomonas

aeruginosa ATCC 29212. Poleg mlečne kisline in acetaldehida Streptococcus thermophilus, v zelo

nizkih koncentracijah (g/mL), proizvaja tudi vodikov peroksid (Yüksekdsğ idr., 2004).

2.1.1.4 Rod Leuconostoc

V kefirnem zrnu so poleg laktobacilov, laktokokov in streptokokov prisotne tudi mezofilne,

heterofermentativne MKB rodu Leuconostoc (Leuconoctoc mesenteroides), ki so odgovorne za

oblikovanje značilnega okusa in arome kefirja (Rea idr., 1996). Prisotnost kvasovk in laktokokov v


16

mleku stimulira rast vrst Leuconostoc, ki kot čiste kulture v mleku ne rastejo. V primeru močne

namnožitve prispevajo k nastajanju CO2. Vrste rodu Leuconostoc pogosto proizvajajo tudi

ekstracelularne eksopolisaharide. Enostavne monosaharide, pretežno glukozo, fermentirajo v mlečno

in ocetno kislino ter CO2. Iz drugih ogljikovih hidratov proizvajajo acetoin in diacetil. Razmnožujejo se

pri temperaturi (5–30) °C, optimalno pri (20–30) °C (Adamič, 2003; Rogelj in Perko, 2003).

2.1.2 Kvasovke

Kvasovke so najpomembnejša skupina mikroorganizmov, ki jih človek izkorišča v komercialne

namene. So v naravi zelo razširjeni enocelični mikroorganizmi in spadajo med najenostavnejše

evkarionte. Tako kot višji evkarionti, imajo podobno osnovno subcelularno organizacijo s prisotnim

jedrom, mitohondriji, endoplazmatskim retikulumum, golgijevim aparatom, sekretornimi vezikli,

vakuolami in mikrotelesi (Novak Štagoj in Podobnik, 2006). Razmnožujejo se lahko nespolno

(vegetativno) in spolno (generativno). Nespolno se razmnožujejo z brstenjem, s prečno delitvijo, s

fragmentacijo in blastosporami. Spolno se množijo s tvorbo askusov z askosporami, z bazidiosporami

in s tielosporami. So filogenetsko različna skupina organizmov in pripadajo dvem glavnim taksonom

in sicer Ascomycotina in Basidomycotina. Odporne so proti sončni svetlobi in izsuševanju. Rastejo in

razmnožujejo se v širokem območju pH, temperature (20–37) °C (odvisno od vrste), visokem masnem

deležu etanola (do 18 %), nekatere pa tudi ob prisotnosti (50–60) % saharoze. Večina kvasovk lahko

ob prisotnosti kisika oksidira sladkorje z respiracijskim (dihalnim) sistemom v mitohondrijih. Prav tako

je velika večina sposobna pretvoriti sladkor v etanol in CO2 (Adamič idr., 2003).

Kvasovke imajo pri pripravi kefirja pomembno vlogo predvsem z vidika proizvodnje pomembnih

rastnih faktorjev, kot so aminokisline, vitamini, etanol, CO2 in spreminjanja pH vrednosti (Rea idr.,

1996). Prav tako s proizvodnjo drugih metabolitov, ki prispevajo k značilnemu okusu in aromi kefirja,

zagotavljajo primerno okolje za rast bakterij. Kvasovke vplivajo tudi na ohranjanje simbioze med

mikroorganizmi kefirnega zrna (Viljoen, 2001).

Predstavljajo od (10–17) % mikrobiote kefirnih zrn. Od tega je (66–100) % takih, ki niso sposobne

fermentirati laktoze (laktoza-nefermentativne). Med laktoza-nefermentativne kvasovke spadajo:

Saccharomyces cerevisiae, Torulaspora delbrueckii, Saccharomyces unisporus, Saccharomyces

exigus, Torulopsis holmii in Candida colliculosa. V kefirnih zrnih sta najpogosteje prisotni

Saccharomyces cerevisiae in Torulaspora delbrueckii. Poleg laktoza-nefermentativnih so v zrnih

prisotne tudi laktoza-fermentativne kvasovke vrst Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus,

Kluyveromyces fragilis, Torulaspora kefir in Candida kefir (Simova idr., 2002). Lopitz-Otsoa idr.

(2006) navajajo, da je v kefirnem zrnu prisotnih okrog 23 različnih vrst kvasovk, od katerih so

najpogosteje izolirane vrste Kluyveromyces marxianus, Candida kefir in Saccharomyces cerevisiae.

Nasprotno so Kwon idr. (2003) ugotovili, da večina mikroorganizmov, ki so jih izolirali iz kefirnih zrn,

pripada kvasovki vrste Candida kefir in MKB vrste Lactococcus lactis.

Kvasovke, ki so prisotne na površini zrna, fermentirajo laktozo, medtem ko kvasovke v osrednjem

delu zrna te sposobnosti nimajo (Marshall idr., 1984). Iz tega je možno sklepati, da kvasovke, locirane

na različnih predelih zrn, v procesu fermentacije opravljajo različne funkcije (Wyder idr., 1997).

2.1.3 Ocetno-kislinske bakterije (OKB)

V kefirnih zrnih so pogosto prisotne tudi OKB. Gre za gram-negativne, spiralno zvite paličice. Te

bakterije imajo pomembno vlogo pri ohranjanju simbioze mikrobiote kefirnega zrna. Najpogostejša

predstavnika sta Acetobacter aceti in Acetobacter rasens. OKB nepopolno oksidirajo alkohole in


17

sladkorje do organskih kislin. Produkt nepopolne oksidacije etanola je ocetna kislina (Rea idr., 1996).

Študije so pokazale, da OKB izboljšajo konsistenco kefirja, saj povečajo njegovo viskoznost s sluzjo, ki

jo proizvajajo (Rogelj in Perko, 2003).

2.2 Bioaktivne komponente

Mleko in fermentirani mlečni izdelki so vir različnih koristnih hranil in biološko aktivnih sestavin s

potencialno pozitivnim učinkom na zdravje. Med bioaktivne komponente kefirja prištevamo

eksopolisaharid kefiran in bioaktivne peptide.

2.2.1 Eksopolisaharidi

Večina MKB (Streptococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc in Pediococcus) in nekateri sevi

vrst Bifidobacterium (Ruas-Madiedo in de Ios Reyes-Galiván, 2005), so sposobni tvoriti zunajcelične

polisaharide oz. eksopolisaharide (EPS), ki so bodisi rahlo vezani na celično steno ali pa jih celica

izloča v okolje kot sluz (Rogelj in Perko, 2003; Cerning idr., 1994; Duboc in Mollet, 2001). EPS se med

seboj razlikujejo v strukturi in sestavi (Welman in Maddox, 2003).

Glede na kemijsko sestavo jih delimo na homopolisaharide in heteropolisaharide. Homopolisaharidi

so zgrajeni iz ene vrste monosaharida, heteropolisaharidi pa iz ponavljajočih se enot različnih

monosaharidov. -(dekstran, mutan in alternan) in -glukani so homopolisaharidi, zgrajeni iz glukoze.

Homopolisaharide, ki so zgrajeni iz fruktoze, imenujemo fruktani (levan in inulin). Heteropolisaharidi

so zgrajeni iz tri do osem monosaharidnih enot, povečini iz D-glukoze, D-galaktoze in L-ramnoze.

Nekateri heteropolisaharidi pa poleg monosaharidov vsebujejo še N-acetilglukozamin, N-

acetilgalaktozamin, fukozo, glukuronsko kislino in ne-karboksilne substituente (fosfat, acetil in

glicerol). Kemijska sestava, dolžina vezi in struktura njihovih osnovnih gradnikov, skupaj z molekulsko

maso in polmerom zasuka molekule EPS, določajo fizikalne lastnosti in s tem viskozno-ojačitvene

lastnosti EPS. Donos EPS je odvisen predvsem od vrste MKB, sestave fermentacijskega medija in

rastnih pogojev (pH, temperatura, vir dušika in ogljika itd.) (De Vuyst idr., 1998; Raus-Madiedo in de

Ios Reyes-Gavilán, 2005).

Za bakterije, ki jih proizvajajo, predstavljajo celično zaščito pred izsušitvijo, osmotskim stresom,

fagnim napadom, škodljivim delovanjem toksičnih snovi in antibiotikov, pomagajo pri adheziji

bakterijske celice na trdne površine in sodelujejo pri medceličnih interakcijah (Jolly idr., 2002). Sevi

bakterij, ki so sposobni sintetizirati EPS, so tehnološko izredno zanimivi, saj ima izdelek, fermentiran s

takšnimi sevi, večjo viskoznost in boljše reološke lastnosti (Leroy in De Vuyst, 2004; Lin in Chang

Chien, 2007; Duboc in Mollet, 2001). Primerni so predvsem za mlečne izdelke z nižjo vsebnostjo

maščobe, pri katerih so zgoraj navedene lastnosti vedno problematične (Ruas-Madiedo idr., 2002).

Uporabljajo se predvsem v prehrambeni, farmacevtski in kemijski industriji kot bioflokulanti,

bioabsorbenti, odstranjevalci težkih kovin itn. (Wang idr., 2008; Sutherland, 1999). Welman in

Maddox (2003) ter Lin in Chang Chien (2007) poročajo, da imajo bakterijski EPS dobro antitumorno,

imunostimulatorno, makrofagno in limfocitno aktivnost in da znižujejo krvni pritisk.

2.2.1.1 Kefiran

Poleg lipidov in beljakovin mikrobioto kefirnih zrn obdaja še bakterijski EPS kefiran, ki je zgrajen iz

približno enakih deležev D-glukoze in D-galaktoze (Maeda idr., 2004a; Maeda idr., 2004c). Koroleva

(1991) navaja, da kefirno zrno vsebuje do 34 % polisaharida, kefir pa le (0,2–0,7) % (Farnworth in


18

Mainville, 2003). Medtem ko Marshall idr. (1984) poročajo, da kefiran predstavlja (24–25) % teže

kefirnih zrn.

Predmet številnih raziskav so bile MBK, ki naj bi bile odgovorne za biosintezo omenjenega

eksopolisaharida. Tako so La Riviére idr. leta 1967 opravili prve raziskave, v katerih poročajo, da je za

proizvodnjo kefirana odgovorna bakterija Laktobacillus brevis. Kandler in Kunath (1983) sta to vlogo

pripisala bakteriji Lactobacillus kefiri, Toba idr. (1986) vrsti Lactobacillus kefiranofaciens, Yokoi idr.

(1991) pa bakteriji Lactobacillus sp. KPB-167B. Takizawa idr. (1994) poročajo, da sta za sintezo

kefirna odgovorni bakteriji Lactobacillus kefirgranum in Lactobacillus parakefir (Taninguchi idr.,

2001; Micheli idr., 1999; Wang idr., 2008; Frengova idr., 2002). Rimada in Abraham (2001) poročata,

da sta za biosintezo kefirana povečini odgovorni le dve homofermentativni bakterijski vrsti, in sicer

Lactobacillus kefiri in Lactobacillus kefiranofaciens. Sintetizirajo ga lahko tudi druge, še

nedefinirane, v zrnih prisotne vrste rodu Lactobacillus (Frengova idr., 2002; Micheli idr., 1999).

Kemijsko strukturo kefirana, ki je prikazana na sliki 2.3, so določili z jedrsko magnetno resonanco

(NMR) (Farnworth, 2005).

Slika 2.3: Struktura kefirana (Farnworth, 2005).

Kefiran je vodotopen (v vroči vodi), razvejan glukogalaktan (Micheli idr., 1999), zgrajen iz razvejanih

in ponavljajočih se heksa- ali hepta-saharidnih enot, ki so natančneje sestavljene iz reda petih

monosaharidnih enot, na katere sta naključno vezana eden ali dva sladkorna ostanka (Wang in Bi,

2008; Taniguchi idr., 2001, Micheli idr., 1999). Sestava kefirana je zelo odvisna od bakterijske vrste, ki

ga sintetizira. Raziskave so pokazale, da so lahko v strukturi kefirana poleg D-glukoze in D-galaktoze

prisotne tudi, sicer v majhnih količinah, manoza, arabinoza in ramnoza (Frengova idr., 2002).

Farnworth in Mainville (2003) navajata, da je masno razmerje med D-glukozo in D-galaktozo običajno

1 : 1, povprečna molekulska masa M = 1,0 × 106 Da in optična sučnost D = +68,0 °. Mukai idr. (1990)

so uspeli izolirati kefiran z razmerjem D-glukoza : D-galaktoza = 0,9 : 1, optično sučnostjo D = + 54° in

viskoznostjo = (5,4 ± 0,5) dL/g pri 25 °C. Ugotovili so tudi, da bakterijska vrsta Lactobacillus

helveticus sintetizira kefiran s sestavo D-glukoza : D-galaktoza = 2 : 1 (Frengova idr., 2002).

Endotermna entalpija kefirana znaša H = 249,7 J/g, temperatura tališča pa Ttal = 93,38 °C.

Kefiran je odporen proti encimski hidrolizi in v vodnih raztopinah, ki vsebujejo etanol, tvori gele

(Micheli idr., 1999). Ker ima funkcijo zgoščevalca, stabilizatorja, emulgatorja, želirnega sredstva,

maščobnega nadomestka in veznika vode, se uporablja kot aditiv v proizvodnji živil (Rimada in

Abraham, 2006; Yeesang idr., 2008). Micheli idr. (1999) navajajo, da deluje protibakterijsko,


19

protiglivično in protitumorno, kar naj bi bila posledica njegovega prebiotičnega delovanja (Wang in

Bi, 2008). Njegovo zauživanje pomaga uravnavati tudi krvni pritisk in nivo holesterola v krvi (Maeda

idr., 2004a). Rodrigues idr. (2005) poročajo o protimikrobni aktivnosti kefirana.

Ker so rezultati svetovnih študij pokazali, da je donos kefirana, ki ga laktobacili kefirnih zrn med

procesom fermentacije sintetizirajo in izločajo v mleko, izredno nizek in se giblje v redu velikosti mg/L

medija, so številni raziskovalci poskušali najti tak fermentacijski medij in kultivacijske pogoje, ki bi

lahko povečali donos kefirana. Tako so Toba idr. (Taniguchi, 2001) uspeli z bakterijo Lactobacillus

kefiranofaciens proizvesti 80 mg kefirana/L medija, pri čemer so kot fermentacijski medij uporabili

sirotko, obogateno z glukozo in peptonom. Poročali so tudi, da je viskoznost fermentiranih mlečnih

napitkov proporcionalna vsebnosti eksopolisaharida. Pet različnih bakterij, ki so jih iz zrn uspeli

izolirati Yokoi idr. so bile v 1 L sirotke zmožne proizvesti (273–406) mg kefirana (Farnworth in

Mainville, 2003). Yokoi in Watanabe (Farnworth in Mainville, 2003) poročata, da donos kefirana, po 4

dnevni kultivaciji bakterije Lactobacillus sp. KPB-167B v MRS fermentacijskem mediju, obogatenem z

10 % laktoze, znaša 2,04 g/L medija. Tudi Micheli idr. (Farnworth in Mainville, 2003) so uspeli izolirati

nekoliko večje količine kefirana (2 g/L) iz z laktozo obogatenega MRS medija, v katerem so gojili

paličaste bakterije rodu Lactobacillus, ki so jih izolirali iz lokalnih italijanskih kefirnih zrn. Cheirsilp idr.

(2003) ter Tada idr. (2007) poročajo, da je proizvodnja kefirana, v primeru uporabe mešanih kultur

(Saccharomyces cerevisiae in Laktobacillus kefiranofaciens) precej višja.

Rimada in Abraham (2001) navajata, da koncentracija kefirana v deproteinizirani sirotki, ki sta jo

uporabila kot fermentacijski medij, z daljšanjem časa fermentacije narašča. Po 5 dnevni fermentaciji

1 L sirotke z 10 g oz. 100 g kefirnih zrn sta iz medija (sirotke) izolirala 57,2 mg oz. 103,4 mg kefirana.

Prav tako sta ugotovila, da se koncentracija kefirana v fermentacijskem mediju povečuje z

naraščanjem temperature.

2.2.1.2 Izolacijske metode bakterijskih eksopolisaharidov

Izolacija EPS iz fermentacijskega medija je kritičen in nujno potreben korak pri pridobivanju

polisaharidov. Večina izolacijskih metod je dolgotrajnih in v postopku vključuje tveganje za izgubo

polimera, še posebej kadar mikroorganizmi, ki proizvajajo EPS, rastejo v kompleksnem mediju (v

mleku, kjer so polisaharidi lahko ujeti v kazeinu). Poleg tega je ob izolaciji količina EPS v mleku

majhna (v redu velikosti mg/L medija) v primerjavi s prisotno laktozo, ki se giblje v redu velikosti g/L

medija. V literaturi je objavljenih kar nekaj različnih izolacijskih metod (Rimada in Abraham, 2003).

Rimada in Abraham (2003) navajata različne metode, ki so jih raziskovalci uporabljali pri izolaciji

eksopolisaharidov. Tako številni raziskovalci pri izolaciji EPS dodajajo en, dva ali več volumnov

hladnega etanola. Drugi uporabljajo enak postopek, ki ga zaključijo z dializo. Nekateri raziskovalci

dajejo prednost obarjanju s TCA (trikloroocetna kislina), s katerim odstranijo kontaminante (proteine,

polipeptide), v kombinaciji z dializo kot zaključnim korakom. Garcia-Garibay in Marshall (Rimada in

Abraham, 2003) sta uporabila obarjanje s TCA in posamezno obarjanje EPS z dodatkom treh

volumnov hladnega etanola. Nekateri raziskovalci kombinirajo obarjanje s TCA, selektivno obarjanje z

acetonom ali hladnim etanolom in dializo. Marshall idr. (Rimada in Abraham, 2003) so uporabili le

dializo. Tako lahko nekatera nesoglasja različnih avtorjev pri proizvodnji EPS pripišemo uporabi

različni izolacijskih metod.

Na splošno je kompleksnost metode za izolacijo in čiščenje EPS odvisna od sestave fermentacijskega

medija, ki ga uporabljajo za njegovo proizvodnjo. Najpreprostejši izolacijski postopek je dializa


20

fermentacijskega medija (po odstranitvi celic s centrifugiranjem), ki ji sledi liofilizacija. To tehniko so

uporabili za izoliranje EPS sevov bakterije Lb. lactis spp. cremoris iz kemično definiranega medija

(Raus-Madiedo in de Los Reyes-Gavilán, 2005). Obarjanje z etanolom se lahko uporablja za

koncentriranje EPS pred dializo. Ta način so uporabili za izolacijo EPS termofilnih (Lb.delbrueckii spp.

bulgaricus in Strep. thermophilus) ter mezofilnih (laktokoki in laktobacili) sevov MKB (Rimada in

Abraham, 2001). Če je sestava fermentacijskega medija kompleksnejša, so za zmanjšanje vsebnosti

proteinov in drugih sestavin (v končnem pripravku EPS) potrebni dodatni postopki čiščenja. Za ESP,

pridobljene iz medijev z visoko vsebnostjo proteinov (npr. posneto mleko), se običajno uporabljajo

trije pristopi: (1) obarjanje proteinov z različnimi količinami TCA (končna koncentracija od 4 % do 14

%), (2) encimska razgradnja s proteazami ali (3) kombinacija obeh postopkov. Za izolacijo EPS, ki jih

proizvajajo MKB v jogurtih, se pri prvem pristopu uporabi obarjanje proteinov z 12 % TCA, ki mu sledi

dializa in liofilizacija supernatanta (van Marle in Zoon, 1995). Enak postopek so Ruas-Madiedo idr.

(2002) pri izolaciji EPS, ki jih proizvajajo 4 sevi bakterij Lc. lactis spp. cremoris v mleku. Najpogostejši

postopek, ki se uporablja za izolacijo EPS iz kompleksnih fermentacijskih medijev, vključuje obarjanje

s TCA in odstranjevanje beljakovin s centrifugiranjem, ki mu sledi koncentriranje EPS z obarjanjem z

etanolom (Cerning idr., 1994). Redkeje se po obdelavi s TCA za koncentriranje in obarjanje ESP

namesto etanola (De Vuyst idr., 1998)uporablja aceton ali pa aceton skupaj z etanolom (Faber idr.,

2001). Pri drugem pristopu izolirajo EPS MKB po predhodni razgradnji mlečnih beljakovin s pronazo E

(proteaza tipa XIV) iz bakterije Streptomyces griseus, ki ima široko substratno specifičnost. Omenjeni

encim se uporablja za izoliranje EPS, ki jih proizvajajo termofilne jogurtne kulture, mezofilni sevi ter

sev Bifidobacterium longum. Po toplotni inaktivaciji pronaze in koncentriranju z ultrafiltracijo ali

izhlapevanjem, EPS oborimo z etanolom. Uporabljena pa je bila tudi kombinacija obarjanja s TCA in

razgradnje s proteazo pri jogurtnih kulturah (Raus-Madiedo in de Los Reyes-Gavilán, 2005).

Za odstranjevaje beljakovin in obarjanje EPS se lahko uporabljajo tudi drugi postopki. Gre predvsem

za tehnike membranskega filtriranja, kot so mikrofiltracija, ultrafiltracija in diafiltracija (Raus-

Madiedo in de Los Reyes-Gavilán, 2005). V kompleksnih medijih filtracija s sintetičnimi membranami

omogoča ločitev molekul EPS od sestavin z nizko molekulsko težo. Razlike med filtracijskimi postopki

v glavnem temeljijo na različnih velikostih membranskih por (Raus-Madiedo in de Los Reyes-Gavilán,

2005). Tuinier idr. (1999) so uspeli izolirati EPS B40, ki ga v sirotki proizvaja Lc. lactis spp. cremoris.

Po odstranitvi celic s centrifugiranjem je postopek izolacije EPS vključeval mikrofiltracijo

supernatanta preko keramične membrane (velikost pore 1,4 mm; koncentracijski faktor 10),

ultrafiltracijo mikrofiltrata s polisulfonsko membrano in diafiltracijo retentata z isto ultrafiltracijsko

membrano z 20 volumni deionizirane vode, sledila je liofilizacija. Po čiščenju je liofilizat vseboval 63 %

EPS, 18 % beljakovin, 8 % pepela, 6 % materiala, bogatega z mananom, in 5 % vode. Dodatni korak

čiščenja liofilizata z 80 % etanolom (vseboval je 0,1 % formične kisline za raztopitev beljakovin),

kateremu je sledilo končno čiščenje s 96 % etanolom, je povišal vsebnost EPS na 72 % in znižal

vsebnost beljakovin na 6 %. V nekaterih primerih so za povečanje čistosti frakcije EPS uporabili še

druge komplementarne postopke, kot so ionsko izmenjevalna kromatografija, razgradnja DNaze, in

preparativni SDS-PAGE za odstranjevanje beljakovin (Raus-Madiedo in de Los Reyes-Gavilán, 2005).

Rimada in Abraham (2003) sta pokazala, da metoda izolacije EPS močno vpliva na končni donos

pridobljenega EPS. Analizirala sta različne metode za izolacijo EPS, ki jih bakterije kefirnih zrn

proizvajajo v mleku in sirotki. Metode vključujejo en ali dva koraka obarjanja z etanolom; en korak

obarjanja z etanolom, ki mu sledi dializa; neposredna dializa z membranami različnih »cut-off« (1000,

6000 in 12000 Da) vrednosti (mejne velikosti molekul, ki ne prehajajo skozi membrano) in obarjanje s


21

TCA. Pokazala sta, da je toplotna obdelava, kot prvi korak izolacije ESP, ključna za popolno

pridobivanje tega polimera. V vzorcih, pridobljenih brez toplotne obdelave, so bile koncentracije EPS

nižje, kot pri vzorcih, pri katerih so uporabili toplotno obdelavo. To dejstvo lahko pripišemo ločevanju

in raztapljanju polisaharidov, ujetih v celične stene in mlečne proteine ter temu, da toplotna

obdelava inaktivira encime, ki bi lahko razgradili biopolimere. V postopkih brez toplotne obdelave se

tako del polisaharidov, ki so ujeti v celične stene in kazein, izgubi v usedlini pri prvem centrifugiranju.

Pri nekaterih metodah lahko dobimo nepravilne rezultate o donosu EPS, saj metode, ki vključujejo

samo en korak obarjanja z etanolom, ne odstranijo vse preostale laktoze. Metode, ki vključujejo dva

koraka obarjanja z etanolom, en korak obarjanja z etanolom, ki mu sledi dializa in neposredne dialize

(»cut-off« manjši od 6000 ali 8000 Da), dajejo večji donos EPS. EPS se izgubljajo pri dializah z

membranami, ki imajo »cut-off« 12000 Da. Obarjanje proteinov in polipeptidov s TCA daje čistejše

končne vzorce, vendar pa se okrog 50 % EPS izgubi. Tako je ta korak priporočljiv, kadar želimo

pridobivati EPS višje čistoče.


22

3 KOMERCIALNA PROIZVODNJA KEFIRJA

Tradicionalna proizvodnja kefirja se izvaja z neposrednim dodajanjem kefirnih zrn pasteriziranemu,

ohlajenemu mleku. Pri domači proizvodnji kefirja temperature in časa fermentacije ne moremo

natančno nadzorovati. Da bi razumeli pomen bakterij kefirnega zrna pri procesu fermentacije mleka,

so Yuksekdag idr. (2004) raziskovali proces proizvodnje organskih kislin, vodikovega peroksida,

acetaldehida in proteolitsko aktivnost pri 21 vrstah bakterij rodu Lactobacillus, ki so jih izolirali iz

turškega kefirja.

Težave, s katerimi se srečamo pri proizvodnji večjih količin kefirja, predstavljata proces

razmnoževanja kefirnega zrnja in standardna kakovost izdelka. Obstaja kar nekaj različic tehnoloških

postopkov, ki jih uporabljajo pri komercialni proizvodnji kefirja. Sprva so uporabljali klasično metodo

proizvodnje kefirja. Pri tem postopku so mleko, cepljeno s kefirnim zrnjem vlili v steklenice,

fermentirali pri nadzorovani temperaturi, dokler ni nastal čvrst koagulum, nato pa zmes hladili.

Vendar je bil takšen kefir, v primerjavi s kefirjem, ki so ga izdelali v manjšem obsegu po

tradicionalnem postopku, precej manj kakovosten.

Danes proizvajajo kefir v fermentorjih, v katerih poteka fermentacija, koagulacija, zorenje in hlajenje.

Fermentorji so opremljeni z mešali, ki zagotavljajo ustrezno mešanje vsebine v določenih stopnjah

procesa (Koroleva, 1991). Kemijske, organoleptične in mikrobiološke lastnosti končnega izdelka so

odvisne od vrste uporabljenega mleka, geografskega izvora zrn, priprave starterske kulture (pogosto

se uporablja prvi kefir po odstranjevanju kefirnih zrn), trajanja fermentacije, vključitve hlajenja in

zorenja itn. Shematski prikaz tehnološkega postopka izdelave tradicionalnega kefirja (z originalnimi

kefirnimi zrni) prikazuje slika 2.4 (Beshkova idr., 2002).

Tradicionalno izdelujejo kefir tako, da pasterizirano in na sobno temperaturo ohlajeno mleko cepijo z

(2–10) % kefirnih zrn in pustijo, da mleko fermentira približno (22–24) h oz. dokler ni dosežena

določena vrednost pH ali dokler kefir ne doseže želenega okusa in teksture. Fermentacija poteka pri

temperaturi (20–25) °C. Pogosto je v proces proizvodnje kefirja vključen tudi proces zorenja, ki pri

temperaturi (8–10) °C traja približno (15–20) h. Zrna nato ločijo od ostale fermentacijske zmesi in

uporabijo za novo fermentacijo, ali pa jih lahko v svežem mleku shranjujejo (1–7) dni. Če zrna

ostanejo v končnem izdelku, nastane preveč kisline, izdelek pa ima tudi slabši okus (Beshkova idr.,

2003; Hallé idr., 1994).

Za pripravo t.i. »industrijskega kefirja« nekateri uporabijo kot startersko kulturo kefir, proizveden po

tradicionalnem postopku z (2–3) % kefirnih zrn. Pasteriziranemu mleku dodajo (1–3) % matične

kulture kefirja. Mleko nato fermentira (12–18) h pri (20–22)°C. Pri uporabi liofiliziranih starterskih

kultur pripravijo matično kulturo tako, da k 3 L mleka dodajo 1 g liofiliziranih kefirnih zrn (Libudzisz in

Piatkiewicz, 1990). Koroleva (1988) je predlagala, da naj koraku fermentacije sledi počasen korak

hlajenja (na temperaturo od 8 °C do 10 °C) in nato pri (8–16) °C od 10 h do 12 h korak zorenja, ki

omogoča mikroorganizmom zmerno aktivnost in razvoj značilnega okusa in arome kefirja. Korovkina

idr. (Farnworth, 2005) so pokazali, da z dvigom temperature fermentacije iz 19 °C na 28 °C, dosežejo

nižji pH in večjo viskoznost kefirja. Količini proizvedenega CO2 in etanola pa se bistveno ne

spremenita.

Najnovejše proizvodnje »industrijskega kefirja« pa potekjo brez kefirnih zrn, z uporabo čistih kultur,

izoliranih iz kefirnih zrn. Takšen postopek je mnogo enostavnejši, omogoča boljšo kontrolo prisotnih

mikroorganizmov in ima boljšo konsistenco. Glavni problem pri uporabi čistih kultur je poiskati


23

ravnotežje med MKB in kvasovkami, ki bi dajale produkt z značilnostmi tradicionalnega kefirja.

Praktično je to zelo težko, saj na razmerje mikroorganizmov v kefirnih zrnih vpliva mnogo faktorjev.

Brez kultiviranja tradicionalnih kefirnih zrn, se številne naravne lastnosti, ki jih proizvajajo, vsebujejo

in sproščajo v medij le kefirna zrna, v končnem izdelku ne nahajajo. V primeru označevanja izdelka,

kultiviranega z uporabo čistih kultur, kot kefir, gre za zavajanje potrošnika. Lahko bi ga imenovali le

kot mlečni fermentirani izdelek z okusom kefirja (Boštar, 2006).

Slika 2.4: Tehnološki postopek proizvodnje tradicionalnega kefirja (Beshkova idr., 2002).

Mleko 3 % mlečne maščobe

Homogenizacija (12,5–17,5) MPa pri 55 °C

Pasterizacija 92 °C, 15 min

Ohlajanje 22 °C

Inokulacija

Kefirna zrna 3 %

Fermentacija 22 h pri 22 °C

do pH = 4,7; (75 °T)

Ohlajanje in zorenje (8–10) °C; 20 h; pH = 4,5; (91 °T)

Separacija

Kefirna zrna

Tradicionalni kefir

Pakiranje

Skladiščenje 4 °C


24

Koroleva (1988) je poročala o vplivu različnih procesnih spremenljivk na potek fermentacije in na

sestavo inokuluma (matične kulture), ki ga uporabljajo pri proizvodnji »industrijskega kefirja«.

Povečana količina inokuluma (kefirna zrna) v mleku skrajša trajanje fermentacije, ter zmanjša število

heterofermentativnih mlečnokislinskih streptokokov in kvasovk v kefirju. Število glavnih mikrobnih

skupin se z zmanjšanjem količine inokuliranih kefirnih zrn v mleko poveča. Prav tako je od količine

uporabljenega inokuluma odvisna pH vrednost starterske kulture. Garrote idr. (1998) so pokazali, da

je padec pH vrednosti kefirja med fermentacijo večji pri povečanju količine zrn, razmerje zrna/mleko

pa vpliva na viskoznost končnega izdelka. Viskoznost kefirja, proizvedenega z 10 g zrn/L mleka, je bila

največja. Število kvasovk in laktobacilov se v kefirju, proizvedenem z različnimi razmerji zrna/mleko,

ni spremenilo, število laktokokov pa se je s povečanjem števila zrn zmanjšalo.

Število homofermentivnih bakterij (posebej laktobacilov) je bilo pri proizvodnji starterskih kultur pri

temperaturi 25 °C v primerjavi s starterskimi kulturami, pripravljenimi med (18–20) °C, večje.

Fermentacija pri višji temperaturi je povzročila nižji pH, ki je inhibiral rast homofermentivnih in

heterofermentivnih mlečnokislinskih streptokokov in kvasovk. Mešanje fermentacijske zmesi je

preprečilo rast plesni na površini starterske kulture in omogočilo enakomerno porazdelitev

mikroorganizmov in metabolitov. Po mešanju so se homofermentativni mlečnokislinski streptokoki in

kvasovke desetkratno razmnožile, mešanje pa ni vplivalo na število heterofermentativnih

mlečnokislinskih streptokokov, termofilnih laktobacilov in mlečnokislinskih bakterij, niti na količino

hlapnih maščobnih kislin v končni starterski kulturi. Nekateri kefirna zrna operejo z vodo enkrat na

teden. Podatki Koroleve (1988) kažejo, da pranje zrn zmanjša število glavnih skupin starterskih

mikroorganizmov. Ko so v proizvodnji uporabili oprana zrna, se je podaljšal čas fermentacije, končni

izdelek pa je imel slab okus in konsistenco.

Objavljenih je bilo kar nekaj raziskav, ki podrobno opisujejo tehnološki postopek proizvodnje kefirja

na industrijski ravni (Tamime idr., 1999; Hallé idr., 1994; Robinson idr., 2002; Duitschaever, 1989;

Beshkova idr., 2002).

Rossi in Gobbetti (1991) sta opisala podrobnosti kontinuiranega procesa proizvodnje kefirja z

uporabo starterske kulture, sestavljene iz MKB in kvasovk, izoliranih iz kefirnih zrn. Kefir, proizveden

v 30 d časovnem obdobju je imel nižjo viskoznost, vseboval pa ni nekaterih, za kefir značilnih,

hlapljivih komponent.

Pettersson idr. (1985) so navedli razloge, zakaj je za proizvodnjo kefirja primernejša uporaba čistih

starterskih kultur. Kot ključne razloge so navedli: lažjo obdelavo starterske kulture, standardna

aktivnost kulture, manjše tveganje za okužbe in spremembe starterske kulture, standardna kakovost

končnega izdelka, enako število kvasovk in boljša obstojnost med skladiščenjem. Razvili so startersko

kulturo, ki je vsebovala 75 % homofermentativnih streptokokov, 24 % streptokokov s sposobnostjo

fermentacije citrata, 0,5 % laktobacilov in 0,1 % kvasovk. S tako pripravljeno startersko kulturo (v

zamrznjeni obliki) lahko izdelajo kefir z boljšimi senzoričnimi lastnostmi ter podobnimi

karakteristikami (pH, količina mlečne kisline, viskoznost) kot jih ima kefir, proizveden po

tradicionalnem načinu, torej z zrni. Prav tako so ugotovili, da lahko s tako pripravljeno startersko

kulturo izdelajo kefir z bolj stabilno bakterijsko populacijo kot jo ima kefir, izdelan po tradicionalnem

postopku s kefirnimi zrni.

Izvedenih pa je bilo tudi nekaj poskusov, kjer so želeli proizvesti manj kompleksno startersko kulturo,

ki bi lahko pri proizvodnji kefirja zamenjala kefirna zrna. Z dvostopenjsko fermentacijo (uporabili so

bakterije Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus acidophilus, Streptococcus thermophilus,


25

Streptococcus lactis, Leuconostoc spp. in kvasovko Saccharomyces cerevisiae) so naredili izdelke, ki

so v primerjavi s kontrolnim izdelkom imeli drugačne kemijske in mikrobiološke lastnosti (pH,

viskoznost, kislost in število živih kvasovk). Tudi Rossi in Gobbetti (1991) sta s kombiniranjem štirih

vrst MKB in dveh laktoza-nefermentativnih kvasovk, ki sta jih izolirala iz kefirnih zrn, uspela izdelati

multistartersko kulturo, ki jima je omogočila proizvodnjo kefirja s kontinuirnim procesom.

Vse do danes ni še nikomur uspelo izdelati originalnih kefirnih zrn. Le-ta lahko pridobimo le z

razmnoževanjem obstoječih zrn.

Kljub temu, da je kefir moč najti na trgu številnih držav, pa zrna niso komercialno na voljo. Do danes

niso uspeli ugotoviti, ali vsa originalna kefirna zrna izvirajo iz istega geografskega področja.

Očitno je, da na kemijske, mikrobiološke in senzorične lastnosti kefirja, vplivajo starterska kultura in

različne procesne spremenljivke. Slika 2.5 povzema osnovne dejavnike, ki vplivajo na lastnosti

končnega izdelka (Farnworth, 2005).

Slika 2.5: Procesni dejavniki, ki vplivajo na karakteristike kefirja (Farnworth, 2005).

Končne karakteristike kefirja

- aroma

- tekstura

- kemijska sestava

- mikrobiološka sestava

Začetne spremenljivke

- vrsta mleka

- vsebnost maščob

- izvor inokuluma

- oblika inokuluma

- količina inokuluma

Procesni parametri

- temperatura fermentacije

- trajanje fermentacije

- odstranitev zrn

- proces zorenja (trajanje,

temperatura) Končne spremenljivke

- dodatek sadnih/

ne-sadnih arom

- čas skladiščenja


26

4 KEMIJSKA SESTAVA KEFIRJA

Med procesom fermentacije bakterije in kvasovke kot vir hrane in energije izkoriščajo oglikove

hidrate (laktozo). Poleg laktoze so v mleku prisotne še beljakovine, maščobe, vitamini in minerali.

Za razliko od jogurta, v kefirju poleg MKB laktozo fermentirajo tudi nekatere vrste kvasovk.

Komponente, ki dajejo kefirju značilen okus in aromo, ki sta odvisna predvsem od izvora in mikrobnih

karakteristik kefirnih zrn, velikosti in vrste starterske kulture, časa fermentacije, temperature, vrste in

sestave fermentacijskega medija, načina proizvodnje kefirja in številnih drugih dejavnikov, so

predvsem: etanol, CO2, mlečna kislina, acetaldehid, diacetil, acetoin, piruvična kislina, ocetna kislina,

propanojska kislina, mravljična kislina, citronska kislina, sukcinat, itd. (Irigoyen idr., 2005; Sarkar,

2007). V kefirju so še prisotne aminokisline in proste maščobne kisline, ki so rezultat razgradnje

beljakovin in maščob med fermentacijo. V splošnem se pH vrednost kefirja giblje med 4,2 in 4,6

(Farnworth in Mainville, 2003). Preglednica 2.1 prikazuje delež posameznih komponent v različnih

vrstah kefirja (Farnworth in Mainville , 2003).

Preglednica 2.1: Kemijska sestava različnih vrst kefirja (Farnworth in Mainville, 2003).

Komponenta Vsebnost v kefirju

CO2

poljski kefir 24,74 % (v/v)

fermentacija z zrni, 24 h 1,33 g/L

fermentacija, 24 h 0,65 %

Proteini

taivanski kefir (3,16–3,18) %

Maščobe


Laktoza

tradicionalni kefir 2,5 %

vzhodno-evropski kefir (3,7–3,8) %

irski kefir 1,8 %


Etanol

poljski kefir (0,021–0,029) %

tradicionalni kefir (0,5–1,5) %


irski kefir 0,04 %


Mlečna kislina

tradicionalni kefir (0,7–1) % (50 % je L(+) izomera)


irski kefir 0,5 %


27

4.1 Etanol

Za proizvodnjo etanola so odgovorne kvasovke in do 0,25 % heterofermentivnih laktobacilov. Količina

proizvedenega etanola je odvisna tako od fermentacijskega procesa in procesnih pogojev, kakor tudi

od vrste uporabljenega fermentorja oz. posode (trdno zaprta ali ne).

Kefir, ki so ga v bivši Sovjetski zvezi v zgodnjem 20. stoletju proizvajale majhne mlekarne, je vseboval

od (1–2) % etanola. Z današnjimi, modernejšimi metodami proizvodnje je vsebnost etanola v kefirju

mnogo nižja. Morda je k temu prispevalo dejstvo, da se fermentacija zaustavi pri višji pH vrednosti

kefirja kot včasih. Na končno koncentracijo etanola najbolj vpliva število kvasovk v zrnih, ki jih

dodamo mleku, in trajanje fermentacije (Brialy idr., 1995). Proizvodnja etanola se prične proti koncu

fermentacijskega procesa, njegova proizvodnja pa se lahko nadaljuje tudi, ko pH kefirja že pade na

točko, kjer MKB niso več aktivne (Kwak idr., 1996). Koncentracijo etanola je v kefirju možno povečati

z zvišanjem temperature med fermentacijo (Dousset in Caillet, 1993). Kefir, ki so ga v laboratoriju

naredili s pomočjo zrn, je vseboval več etanola ((0,04–0,30) %) kot kefir, ki so ga komercialno

proizvedli v Nemčiji ((0,002–0,005) %) (Farnworth, 2005). García Fontán idr. (2006) so proučevali

mikrobiološke in kemijske spremembe kefirja med fermentacijo kravjega mleka s komercialno

startersko kulturo. Ugotovili so, da se etanol proizvaja v intervalu od (48–168) h in da kefir ob koncu

fermentacije (168 h) vsebuje okrog 0,018 % etanola. Beshkova idr. (2002) navajajo, da kefir,

proizveden s 3 % kefirnih zrn pri 22 °C, vsebuje okrog 0,25 % etanola.

Kwak idr. (1996) so preučevali proizvodnjo etanola v kefirju, proizvedenem z definirano startersko

kulturo, in ugotovili, da je najboljša dvostopenjska fermentacija. Uporabili so laktoza-

nefermentativne kvasovke vrste Saccharomyces cerevisiae in sicer, najprej za fermentacijo glukoze, ki

so jo dodali v mleko in nato za izvedbo mlečno-kislinske fermentacije z uporabo komercialno

pridobljenih laktobacilov, laktokokov, levkonostokov in propionskih bakterij. pH vrednost kefirja je

med alkoholno fermentacijo ostala nespremenjena in je pričela padati šele s pričetkom mlečno-

kislinske fermentacije. Z dodatkom 0,4 % ali 0,5 % glukoze v mleko se je etanol proizvajal samo med

procesom alkoholne fermentacije, tako, da je končni izdelek vseboval od (0,07–0,08) % etanola.

Študije obstojnosti izdelka med skladiščenjem so pokazale, da je najbolj stabilen kefir, proizveden z

dodatkom 0,4 % glukoze. Z dodatkom 1,0 % glukoze se je proizvodnja etanola nadaljevala med

mlečno-kislinsko fermentacijo, količina etanola v končnem izdelku pa je bila 0,24 %.

4.2 Ogljikov dioksid

Kremasta in penasta konsistenca kefirja je odraz vsebnosti CO2, ki se v kefirju giblje med (0,08–0,2) %.

Večino ogljikovega dioksida med fermentacijo proizvedejo kvasovke, nekaj pa tudi

heterofermentativne MKB. Vsebnost CO2 v kefirju med fermentacijo narašča z upadanjem vrednosti

pH. Kadar fermentacija traja dlje kot 24 h, se proizvodnja CO2 zaustavi po približno 48 h (Kuo in Lin,

1999). Proizvajanje plina povzroči tvorbo koaguluma rahle strukture, v ustih pa daje kefir občutek

gaziranosti (Koroleva, 1991). Zaradi plinskih mehurčkov so nekateri kefirju nadeli ime »mlečni

šampanjec«. Raziskave, ki temeljijo predvsem na vsebnosti kvasovk v kefirju so pokazale, da so

kvasovke, izolirane iz kefirnih zrn za komercialno uporabo sposobne fermentirati glukozo, galaktozo,

manozo in saharozo, ne pa laktoze. Fruktozo kvasovke fermentirajo samo po indukcijski periodi

(Thompson idr., 1990). Količina proizvedenega CO2 je odvisna od encimskega sistema kvasovk

(Farnworth in Mainville, 2003).


28

Da bi bolje razumeli dejavnike, ki vplivajo na vsebnost CO2 v kefirju, so Clementi idr. (1989) izvedli

študijo proizvodnje CO2 z uporabo dveh vrst kvasovk. Menili so, da bi morala biti vsebnost CO2 v

takem kefirju približno enaka kot v kefirju, proizvedem s kefirnimi zrni. Uspelo jim je pokazati, da

lahko imobilizirane kvasovke, ki so jih dodali mleku, v 2,5 h proizvedejo količino CO2, ki je primerljiva

količini CO2 v tradicionalnem kefirju, kjer fermentacija poteka 24 h.

Proizvajanje CO2 med fermentacijo in v končnem izdelku predstavlja poseben problem pri pakiranju v

embalažo, saj se lahko embalaža napihne, vsebina pa izteče (Kwak idr., 1996). V nekaterih državah

kefir proizvajajo ali prodajajo v steklenicah. Vendar pa so posode iz polietilenske folije, pokrite z

aluminijevo folijo, ali plastične posode z aluminijasto folijo bolj fleksibilne in se lažje prilagodijo plinu,

ki nastaja po polnjenju.

4.3 Mlečna kislina

Med procesom fermentacije MKB razgradijo mlečni sladkor do mlečne kisline (Shoeverz in Britz,

2003). Zaradi tega se zniža pH vrednost mleka, mleko pa koagulira. Med procesom fermentacije se

običajno razgradi do 30 % laktoze (Kuo in Lin, 1999).

β-galaktozidaza je encim, ki hidrolizira laktozo v glukozo in galaktozo. Encim je značilen za vse MKB in

nekatere kvasovke, zato so mikroorganizmi , prisotni v kefirju, sposobni razgraditi laktozo do obeh

monosaharidov, glukozo pa naprej v mlečno kislino (Fujisawa idr., 1988). Iz laktoze se v mleku tvorita

tako D(−)-mlečna kislina kot L(+)-mlečna kislina, v kefirju pa prevladuje oblika L(+). Vendar pa je

razmerje med oblikama L(+) in D(–) odvisno od izvora in mikrobiološke sestave kefirnih zrn (Rea idr.,

1996). Izpostavljanje visokemu tlaku (>1000 MPa) poveča količino D(–)-mlečne kisline, ki jo

proizvedejo nekatere MKB kefirnih zrn (Jankowska idr., 2001).

Kadar v kefirju prevladujejo mezofilni, homofermentativni mlečno-kislinski streptokoki je proizvodnja

L(+)-mlečne kisline za približno 10 % višja od proizvodnje D(–)-mlečne kisline. Navajajo, da je za

proizvodnjo L(+)-mlečne kisline odgovorna kvasovka Klyveromyces marxianus, za proizvodnjo D(–)-

mlečne kisline pa Leuconostoc mesenteroides. L(+) izomer mlečne kisline je fiziološko pomemben za

ljudi in živali. D(–) izomer pa na celični metabolizem ne vpliva (Sarkar, 2007).

4.4 Aminokisline

V kefirju so običajno prisotne iste aminokisline kot v mleku. Beljakovine kefirja so zaradi kislinske

koagulacije in proteolize mlečnih beljakovin lahko prebavljive. Določene bakterije v prvih urah

fermentacije izkoristijo v mleku prisotne proste aminokisline, nato pa med fermentacijo MKB s

proteolitično aktivnostjo začnejo proteolizo kazeinov. Ko se fermentacija upočasni in kefir preide v

stopnjo zorenja, proteolitska aktivnost drugih mikroorganizmov, pretežno OKB in kvasovk, povzroči

tvorjenje več peptidov in prostih aminokislin.

4.5 Eterične komponente

Na oblikovanje edinstvenega okusa kefirja vpliva tudi količina številnih eteričnih/hlapnih komponent,

ki jih mikrobiota kefirnih zrn proizvaja med fermentacijo. Acetaldehid in diacetil sta poleg

propionaldehida, 2-butanona, n-propanola, isoamilalkohola, etanojske kisline in etanola

najpomembnejši aromatični komponenti, ki vplivata na oblikovanje kefirjevega okusa (Farnworth,

2005). Görner idr. (Farnworth in Mainville, 2003) so opazili, da se količine hlapnih komponent v

kefirju, predvsem etanola, med procesom fermentacije spreminjajo. Podatki o kefirju, proizvedenem


29

v laboratoriju, so pokazali, da zorenje kefirja po fermentaciji zniža pH vrednost in koncentracijo

acetaldehidov, vendar poveča količino mlečne kisline in diacetila (Garrote idr., 1998). Komercialni

kefir, v primerjavi z jogurtom, vsebuje 50 % več orotne kisline, dvakrat več piruvične kisline, devetkrat

več etanojske kisline in približno enako količino sečne kisline. Nekatere vrste kefirjev vsebujejo tudi

propanojsko kislino. Dousset in Caillet (1993) sta med fermentacijo zasledovala koncentracijo sedmih

organskih kislin in ugotovila, da propanojska kislina nastaja samo v zadnji stopnji fermentacije (pH ≤

4,33) ter da dvig temperature med fermentacijo iz 20 °C na 30 °C povzroči povečanje koncentracije

citronske, mlečne, etanojske, propanojske in izobutanojske kisline v končnem izdelku, nivo piruvične

kisline pa se zniža.

Güzel-Seydim idr. (2000) so proučevali proizvodnjo organskih kislin in hlapljivih komponent med

fermentacijo kefirja, proizvedenega v laboratoriju s turškimi kefirnimi zrni. Proizvodnja laktata je bila

sprva počasna, vendar se je koncentracija laktata ob koncu 22 h fermentacije hitro dvignila na

vrednost 6000 μg/g. Koncentracija citrata se je med fermentacijo znižala od 1760 μg/g na 1400 μg/g.

Vsebnost piruvata je med fermentacijo narasla na končno vrednost 18 μg/g. Vsebnost orotata in

urata je tekom 22 h fermentacije upadla, hipurat pa je po 15 h popolnoma izginil. V kefirju pa niso

zasledili etanojske, propanojske, butanojske kisline in diacetila. Koncentracija acetaldehida in

acetoina se je med potekom fermentacije povečevala. Proizvajanje etanola pa se je začela šele po

petih urah fermentacije.

Prav tako so Güzel-Seydim idr. (2000) v kefirju, ki so ga pri 4 °C skladiščili do 21 d, zasledovali

koncentracijo organskih kislin in hlapljivih aromatičnih komponent v kefirju. V kefirju je bila najvišja

koncentracija laktata (> 6000 μg/g), sledil je citrat (1500 μg/g). Količina laktata se je med

skladiščenjem rahlo povečala. Piruvat je bil prisoten le v začetku in je po sedmih dneh, najbrž zaradi

pretvorbe piruvata v etanol in CO2, izginil. Skladiščeni kefir ni vseboval hipurne, etanojske,

propanojske in butanojske kisline ter diacetila. Koncentracija acetaldehida v kefirju se je med

skladiščenjem podvojila (na 11 μg/g), acetoina pa je padla od 25 μg/g na 16 μg/g.

Linossier in Dousset (1994) sta pokazala, da lahko kvasovka Candida kefir, ob prisotnosti bakterije

Lactobacillus kefiri, v mleku proizvaja mlečno, citronsko in piruvično kislino. Koncentracija mlečne,

fumarne in butanojske kisline je bila sicer zelo nizka. Po 70 h fermentaciji pa v kefirju niso več

zasledili citronske kisline. Očitno med kvasovko Candida kefir in bakterijo Lactobacillus kefiri vlada

simbioza, saj se je rast bakterij v fermentacijskem mediju z dodatkom kvasovk povečala. Dodatek

kvasovk Candida kefir (približno 0,5 % celotne mikrobne populacije) je stimuliral rast bakterije

Laktobacillus kefiri.

4.6 Maščobe

Vsebnost maščob v kefirju je odvisna od vrste mleka, ki ga uporabimo za izdelavo kefirja. Kefir, ki ga najdemo na ruskem trgu, vsebuje (0–3,2) % maščobe (Farnworth in Mainville, 2003).

Alm (1982) je pri proučevanju kemijske sestave različnih fermentiranih mlečnih izdelkov ugotovil, da

se vsebnost maščob in sestava kefirja (mono-, di-, trigliceridi, proste maščobne kisline in steroidi) v

primerjavi s čistim mlekom le malo razlikujeta. Dejstvo, da so proste maščobne kisline našli v vseh

analiziranih fermentiranih vrstah mleka (vključno s kefirjem), nakazuje, da med fermentacijo mleka

poteka tudi razgradnja mlečne maščobe. Na podlagi tega je Alm sklepal, da bi lahko bile mlečne

maščobe v fermentiranih izdelkih, v primerjavi z drugimi viri maščob, lažje prebavljive. V kefirju so

našli tudi v lipidih topen koencim CoQ10 (Strazisar idr., 2005).


30

5 KEFIR KOT ŽIVILO

Kefir ima podobno vsebnost beljakovin, maščob in mineralnih snovi kot mleko, iz katerega je narejen,

zato je že po naravi bogat vir beljakovin in kalcija (preglednica 2.2). Nekatere sestavine mleka pa se

med procesom fermentacije spremenijo. Kefir slovi tudi po svojem okusu in dobri prebavljivosti, saj

tudi večje količine zaužitega kefirja ne povzročajo prebavnih motenj (Farnworth, 2005).

Preglednica 2.2: Primerjava hranilne vrednosti kefirja Krepko in svežega mleka s 3,5 % mlečne maščobe.

Hranilna vrednost kefir Krepko s 3,5 % m.m. (Kele & Kele d.o.o)

mleko s 3,5 % m.m. (Ljubljanske mlekarne d.d)

Energijska vrednost (kJ/kcal) 266/64 265/62

Maščobe (g) 3,5 3,5

Beljakovine (g) 3,2 3,2

Ogljikovi hidrati (g) 4,8 4,6

Kalcij (mg) 130 120

5.1 Prebavljivost

Fermentacija povzroči denaturacijo mlečnih beljakovin in hidrolizo nekaterih beljakovin do krajših

peptidov in aminokislin, ki jih želodčni in črevesni sokovi lažje razgradijo. Kefir so uporabljali v

bolnišnicah in sanatorijih bivše Sovjetske zveze kot del diete za bolnike z želodčnimi in črevesnimi ter

metabolnimi boleznimi, hipertenzijo, ishemično boleznijo srca ter alergijami. Evenshtein (1978)

poroča, da so kefir (250 mL/d ) uspešno uporabljali za stimulacijo želodčnega izločanja in tvorjenja

kisline pri bolnikih s pulmonalno tuberkulozo. Kefir je posebej primeren za dojenčke in bolnike z

malabsorpcijskim sindromom, zaradi lahke prebavljivosti, in zato, ker se fermentirani mlečni izdelki

prebavijo brez izločanja velikih količin želodčnih sokov (Kwak idr., 1996).

5.2 Hranilna vrednost beljakovin

Študije, ki so jih na podganah izvedli Vass idr. (1984), so potrdile, da ima kefir višjo biološko vrednost

kot mleko, najbrž zato, ker so njegove beljakovine lažje prebavljive. Zaradi bakterijskega metabolizma

pa sta tako skupna količina dušika, kot količina nebeljakovinskega dušika v kefirju višji od tistih v

mleku, iz katerega je kefir narejen. Schmidt idr. (1984) so sklepali, da je prebavljivost beljakovin v

kefirju, podobno kot v jogurtu, boljša, kar prispeva k višji hranilni vrednosti in večji sposobnosti

regeneracije jetrnega tkiva podgan z delno, 70 % hepatektomijo.

Med fermentacijo in skladiščenjem se količina prostih aminokislin v kefirju poveča; še posebej

količina lizina, prolina, cistina, izolevcina, fenilalanina in arginina (Farnworth, 2005). Bakterije in

kvasovke, ki se uporabljajo za proizvodnjo kefirja, povzročajo izomerizacijo L-aminokislin, sproščenih

iz mlečnih beljakovin, v D-aminokisline, zlasti v D-alanin, D-levcin, D-asparaginsko kislino in D-allo-

izolevcin. D-aminokisline so manj pogoste v jogurtu (Brückner in Hausch, 1990). Z dodatkom

natrijevega kazeinata mleku pa ima kefir še višjo vsebnost beljakovin (do 3,5 %), zaradi česar bi ga

bilo možno uporabiti kot dietetični napitek (Bogdanova idr., 1978).


31

5.3 Metabolizem laktoze

Kefir vsebuje veliko število mikroorganizmov, ki pomagajo pri prebavi laktoze. Ljudje z laktozno

intoleranco imajo prenizko črevesno aktivnost encima β-galaktozidaza (EC 3.2.1.23) ali encima

laktaze, ki je odgovoren za hidrolizo laktoze v glukozo in galaktozo. Zato lahko uživanje fermentiranih

mlečnih izdelkov takšnim bolnikom pomaga, saj mikroorganizmi, ki se uporabljajo pri fermentaciji

mlečnih izdelkov, pomagajo z laktazo pri razgradnji laktoze tudi v črevesju. Ljudem z laktozno

intoleranco priporočajo uživanje jogurta, saj je v jogurtu, zaradi laktazne aktivnosti jogurtnih

mikroorganizmov, nižja tudi vsebnost laktoze. (Sarkar, 2007).

Alm je raziskoval zmanjšanje količine laktoze v različnih fermentiranih mlečnih izdelkih in ugotovil, da

je zmanjšanje količine laktoze v kefirju, v primerjavi z jogurtom, acidofilnim mlekom in izdelkom

bifidus, po fermentaciji in 14 d skladiščenju, manjše (Farnworth, 2005). V študiji s prašiči so de Vrese

idr. (1992) pokazali, da kljub delni β-galaktozidazni aktivnosti kefirnih zrn, kefir te aktivnosti nima.

Galaktozidazna aktivnost je v kefirju, proizvedenem z zrni, v primerjavi z jogurtom, zelo nizka.

Hertzler in Clancy (2003) pa poročata, da uživanje kefirja, ki vsebuje bakterije z β-galaktozidazno

aktivnostjo, zmanjšuje »izdihani vodik« (breath hydrogen), ki je merilo za resnost laktozne

intolerance.

Mlečna kislina je zaradi delovanja homofermentivnih in heterofermentivnih mikroorganizmov

prisotna v vseh fermentiranih mlečnih izdelkih. Obstaja v L(+) ali D(–) izomerični obliki in kot 50/50 DL

racematna mešanica. L(+)-mlečno kislino telo popolnoma metabolizira, D(–)-mlečno kislino pa

porablja počasneje. Odvečna D(–)-mlečna kislina lahko povzroča metabolne motnje. Dokumenti

Svetovne zdravstvene organizacije svarijo pred uporabo prehranskih izdelkov za dojenčke, ki

vsebujejo mešanico D(−) ali DL, čeprav priznavajo, da je za potrditev tega svarila potrebnih več

raziskav. Kefir vsebuje povečini samo L(+)-mlečno kislino, v jogurtu je razmerje L(+) : D(−) približno 58

: 42 (Farnworth in Mainville, 2003; Farnworth, 2005).

5.4 Vitamini

Na splošno velja kravje mleko za dober vir večine vodotopnih vitaminov, razen askorbinske kisline.

Kar nekaj raziskovalcev se je ukvarjalo z določanjem vsebnosti vitaminov v kefirju, z namenom, da bi

ugotovili, ali proces fermentacije vpliva na spremembo njihove količine v mleku. Ena izmed študij je

pokazala, da se količina vitamina B12 v kefirju med fermentacijo in zorenjem zniža (Güzel-Seydim idr.,

2000). Alm (1980) je za proizvodnjo kefirja, ki ima v primerjavi z mlekom povečano vsebnost folne

kisline in zmanjšano koncentracijo vitaminov B6, B12 in biotina, uporabil komercialno dostopna kefirna

zrna.

Med različnimi fermentiranimi mlečnimi izdelki, ki so bili predmet Almovih raziskav, je imel kefir, v

primerjavi z mlekom, najmanjše znižanje vitamina B13 (17 %). V jogurtu se je vsebnost vitamina B13

znižala za 47,8 %. Poročali so tudi o znižanju vsebnosti vitamina A, tiamina, riboflavina, nikotinamida

in vitamina C v kefirju, pripravljenem v laboratoriju (Farnworth, 2005).

Kneifel in Mayer (1991) sta v raziskavah uporabila kefirna zrna iz desetih avstrijskih gospodinjstev.

Poročala pa sta o povišanju vsebnosti piridoksina, vitamina B12 in folne kisline v kefirju. Pri večini

vzorcev kefirja je bila vsebnost folne kisline za več kot 20 % višja, kot pri mleku. Vsebnost tiamina,

riboflavina, niacina, pantotenske kisline in orotne kisline oz. vitamina B13, je bila v končnem kefirju

nižja, kot v začetnem mleku. Pri primerjavi fermentacije različnih vrst mleka (kravje, ovčje, kozje in


32

kobilje) s kefirnim zrnjem, se je v kefirju iz ovčjega mleka največ povišala vsebnost tiamina,

piridoksina in folne kisline, v kefirju iz kozjega mleka pa so vsebnosti tiamina, riboflavina, vitamina

B12, niacina, pantotenske kisline ter orotne kisline, najbolj padle. Vrsta mleka lahko deluje na rast

tistih mikroorganizmov, ki vplivajo na končno vsebnost vitaminov v kefirju.

Mann (Libudzisz in Piatkiewich, 1990) navaja ruske, češke in poljske reference, ki opisujejo poskuse

povečevanja hranilne vrednosti kefirja. Celotno vsebnost beljakovin v kefirju je mogoče povečati z

dodatkom natrijevega kazeinata k mleku. Za povečanje nivoja folne kisline in vitamina B12 je starterski

kulturi mogoče dodati tudi specifične bakterije.

5.5 Kefir – hrana za dojenčke

Študija na nedonošenčkih, ki jo je izvedla skupina ruskih raziskovalcev, je pokazala, da zdravi

nedonošenčki mešanico kefirja in nadomestnega mleka dobro prenašajo, saj ustrezno pridobijo na

telesni teži. Vzorec maščobnih kislin v krvi dojenčkov je bil podoben vzorcu mešanice kefirja in

nadomestnega mleka, s katero so bili dojenčki hranjeni (Farnworth, 2005). Kefir pogosto uporabljajo

v ruskih bolnicah, posebej v porodnišnicah za novorojenčke in matere. Pogosto ga priporočajo kot

prvo hrano za dojenčke po dojenju, saj je lahko prebavljiv. Poročali so, da kefir pri nedonošenčkih ni

povzročil vzpostavitve črevesnih bifidobakterij in prav tako ni zmanjšal števila motenj biocenoze

(Farnworth, 2005). Očitno se je kefir prav tako uporabljal za zdravljenje bolezni žolčevoda, povezanih

z boleznimi trebušne slinavke pri otrocih (Farnworth in Mainville, 2003).

5.6 Ostala uporaba

Kefir so v bivši Sovjetski zvezi uporabljali za zniževanje telesne teže in kot sredstvo za zvišanje vnosa

esencialnih maščobnih kislin pri bolnikih z boleznimi prebavnega trakta (Samsonov in Budagovskaya,

1982). Kefir, obogaten z esencialnimi maščobnimi kislinami, so predpisovali bolnikom z aterosklerozo,

ishemično boleznijo srca, peptičnimi čiri in obolenji jeter ter žolčnika. Odobren je bil japonski patent

za izdelavo zdrave hrane, ki vsebuje kefir in encimske inhibitorje kot sta lipaza ali α-amilaza. Ta

izdelek je namenjen preprečevanju in nadzorovanju debelosti (Tokumaru, 1999).


33

6 KEFIR IN ZDRAVJE

Kefir že od nekdaj velja za zdravilni fermentiran mlečni izdelek. Kefiran in MKB kefirja in zrn so bili

predmet številnih raziskav, saj so raziskovalci želeli prikazati njihove ugodne učinke na zdravje ljudi.

6.1 Kefir kot probiotik

Probiotiki so živi mikroorganizmi, ki ob zaužitju v zadostni količini pozitivno delujejo na zdravje

gostitelja neposredno, ali posredno z okrepitvijo fizioloških oziroma obrambnih mehanizmov

(Guarner in Schaafsma, 1998; Joint FAO/WHO Working Group on Drafting Guidelines for the

Evaluation of Probiotics in Food, 2002). Kefir vsebuje vrsto različnih bakterij in kvasovk. Pri

dolgoročnem krmljenju miši s kefirjem so raziskovalci odkrili, da se je mikrobiološki profil MKB v

tankem in debelem črevesu miši spremenil, medtem ko se je nivo bakterij Enterobacteriaceae in

Clostridium znižal (Marquina idr., 2002). Vendar pa do danes študij, ki bi prikazale zdravilni učinek

mikroorganizmov kefirja, še ni. Klinična študija, v kateri so ljudje uživali madžarsko-ruski tip kefirja,

narejen iz tradicionalnega ruskega kefirja z dodatkom probiotičnih MKB, je pokazala, da je število

bakterij v njihovem blatu in število določenih probiotičnih bakterij po štirih tednih uživanja (0,5 L/d)

naraslo (Figler idr., 2006). Na osnovi rezultatov avtorji predvidevajo, da je kefir, ali ena izmed

njegovih sestavin, prebiotik.

Santos idr. (2003) so poročali, da se nekatere vrste rodu Lactobacillus, ki so jih izolirali iz kefirja,

dobro pripenjajo na celice Caco-2, so odporne proti nizkim vrednostim pH in žolčni kislini in so

protimikrobno aktivne proti enteropatogenim bakterijam, kar je pogost kriterij za probiotične

bakterije. Dodatno pa med fermentacijo lahko proizvedejo metabolite iz sestavin mleka, ki prav tako

dobro vplivajo na zdravje (Farnworth in Mainville, 2003).

6.2 Protitumorski učinek pri živalih

O protitumorskem učinku kefirana so prvič poročali Shiomi idr. (1982). Mišim so dajali v vodi

raztopljen, iz kefirnih zrn izoliran polisaharid, sedem dni pred injiciranjem celic Erlichovega karcinoma

(EC) ter z doziranjem polisaharida nadaljevali še nadaljnih 24 d; ali pa z doziranjem polisaharida začeli

na isti dan, kot z injiciranjem tumorskih celic in nadaljevali še 23 ali 24 d. Pri miših, ki so prejemale

(0,02–0,1) % v vodi raztopljenega polisaharida, se je pokazala (40–59) % inhibicija tumorske rasti.

Pozitivni učinek so opazili pri miših, ki so dobile polisaharid že pred injiciranjem tumorskih celic, ter

pri miših, ki so polisaharid dobile hkrati z injiciranjem tumorskih celic. Drugi eksperiment je imel

podobne rezultate ((30–81) % inhibicija rasti tumorja), mišim pa so injicirali Sarkom 180 (S180).

Skupini miši so intraperitonealno injicirali polisaharid ((0,05–2,0) mg/miš). Polisaharid je bil najprej

injiciran sedem dni pred ali en dan po injekciji tumorskih celic, spet pa se je močno znižala rast

tumorjev EC in S180. Izvedli so tudi teste citotoksičnosti, kjer so celice EC in S180 inkubirali z

raztopino polisaharida (1 mg/mL), pridobljenega iz kefirja, kar pa ni pokazalo učinka, zato so

raziskovalci sklepali, da je protitumorski učinek pogojen z gostiteljem.

Da bi definirali mehanizme protitumorskega delovanja kefirana, je ista skupina raziskovalcev izvedla

še drugo študijo (Murofushi idr., 1983). Pokazali so, da imajo celice tistih miši, ki so jim z

gastrointubacijo ali z vodno raztopino dajali iz zrn izoliran kefiran, enak imunski odziv, kot ga je

izmeril test hipersenzitivnosti zapoznelega tipa (DTH). Že en 5 mg odmerek na kilogram telesne teže

je bil dovolj za velik učinek. Pokazali so, da je ta učinek odvisen od skupne količine injiciranega

odmerka in ne od trajanja ali pogostosti odmerjanja. Ko so tem mišim vcepili celice EC, so imele miši,


34

z zelo nizkim prejemkom (10 mg/kg telesne teže), po 14 dneh tumorje z občutno manjšo težo.

Predlagana je bila tudi uporaba kefirana za zaustavitev rasti tumorja pred ali po začetku tumorske

rasti. Vendar pa bi po vcepljenju tumorja morda bili potrebni večji odmerki polisaharida.

Murofushi idr. (1986) pa so raziskovali vpliv uživanja kefirana na odziv protiteles pri miših. Rezultati

so pokazali, da polisaharid občutno poveča odziv na SRBC (antisheep red blood cell), vendar samo pri

majhni količini antigenov (5×106 SRBC/miš). Najbolj učinkovit je odmerek 100 mg polisaharida na

kilogram telesne teže, podatki pa kažejo, da je polisaharid učinkoval med zgodnjim antigenskim

odzivom. Izostanek učinka pri miših nu/nu, nu/+ in običajnih miših na 2,4-dinitrofenil-alanilglicilglicil-

Ficoll (DNP-Ficoll), pripravljen kot antigen TI-2 ali trinitrofenil (TNP)2.3-lipopolisaharid (TNP-LPS),

pripravljen kot antigen TI-1 je pokazal, da kefiran morda poveča delovanje samo T-odvisnih B celic in

ne B celic, dovzetnih za antigen TI-1 ali TI-2. Z uporabo 3H-označenega polisaharida so uspeli

prikazati, da je telo v 3 h po oralnem zaužitju absorbiralo v vodi raztopljeni saharid. Radioaktivnost je

bila odkrita v vseh glavnih organih, zato so sklepali, da je zaužiti polisaharid dosegel vranico ali

priželjc in aktiviral imunski sistem.

V literaturi je mnogo člankov, ki opisujejo protitumorske lastnosti kefirja. Furukawa idr. (1991a) so

odkrili, da so miši, ki so jim subkutano vcepili Lewisov pljučni karcinom, 2 tedna po vcepitvi tumorja

imele občutno manjše tumorje in 62 % stopnjo tumorske inhibicije. Miši so od prvega do devetega

dne po vcepitvi tumorskih celic dobile želodčno intubacijo pasteriziranega kefirja. Teža vranice in

število levkocitov se je v primerjavi s kontrolnimi mišmi povečala, vendar ne pri miših, ki so zauživale

kefir. Ista skupina je pokazala, da je do šest dni po vcepitvi tumorja, hranjenje miši s kefirjem (2g/kg

telesne teže) povzročilo povečanje odziva hipersenzitivnosti zapoznelega tipa. Vendar pa v času

preživetja kontrolnih miši in miši, ki so zauživale kefir, ni bilo razlike (Furukawa idr., 1991b). Podatki

te skupine so pokazali, da je uživanje kefirja pri normalnih miših občutno povečalo število levkocitov

in hipersenzitivnost zapoznelega tipa, ki so jo izmerili z merjenjem zatekanja podplatov pri miših z

vcepljenim fibrinomom Meth-A. Z uporabo podobnih protokolov in testov so Kubo idr. (1992)

pokazali, da je oralno doziranje kefirja (100 ali 500 mg/kg telesne teže so dozirali 10 d; s pričetkom

doziranja so pričeli en dan po vcepitvi tumorja) občutno zmanjšalo težo tumorja EC in inhibiralo rast

tumorja do 54 %. Ko so miši zauživale kefir skupaj z mitomicinom C, se je povprečna teža tumorja še

dodatno zmanjšala. Miši, ki so zauživale kefir, pripravljen iz kravjega ali sojinega mleka, so pokazale

občutno inhibiranje celic Sarkoma 180. Pozitivnih učinkov fermentiranega sojinega mleka niso

pripisali genisteinu v sojinem kefirju.

Furukawa idr. (1991b) so prav tako raziskovali antimetastazne učinke dveh frakcij kefirana, in sicer v

vodi raztopljenega kefirana in neraztopljenega kefirana. Mlade (5 tednov) in stare (30 tednov) miši

ženskega spola, ki so dobivale v vodi raztopljeno frakcijo, so imele občutno zmanjšanje pljučnih

metastaz Lewisovega pljučnega karcinoma. Frakcija, ki so jo dozirali mladim mišim, tako pred in po

vcepitvi tumorskih celic, je inhibirala rast tumorja. Miši, ki so 9 d pred vcepitvijo celic melanoma B6

dobile v vodi netopno frakcijo, so imele v primerjavi s kontrolnimi mišmi 39 % stopnjo tumorske

inhibicije. Vendar pa v vodi topna frakcija ni ščitila proti izjemno metastaznim celicam (Furukawa idr.,

2000).

Raziskovali so tudi antimutagene lastnosti iz kefirja izoliranih bakterij, da bi pojasnili mehanizme

njihovega delovanja (Honoso idr., 1990). Iz kefirja, proizvedenega v Mongoliji, so izolirali kulture

bakterij Steptococcus lactis, Steptococcus cremoris, Streptococcus faecalis, Lactobacillus plantarum,

Lactobacillus brevis in Leuconostoc dextranicum. Z uporabo vezivnega testa, pri katerem so bile vse


35

bakterije inkubirane z mutagenimi aminokislinskimi pirolizati, so pokazali, da so imele vse bakterije, ki

so jih izolirali iz kefirja, izjemno vezivno sposobnost (> 98,5 %) z mutageni 3-amino-1,4-dimetil-5H-

pirido [4,3-b] indolom in 3-amino-1-metil-5H-pirido [4,3-b] indolom in slabšo vezivno sposobnost z 2-

amino-6-metildipirido [1,2-a:3',2',-d] imidazolom. Hosono idr. (1990) so zaključili, da ta odkritja,

skupaj s podobnimi rezultati pri bakterijah, izoliranih iz jogurta, podpirajo idejo, da ima uživanje

fermentiranih mlečnih izdelkov negativno korelacijo s tveganjem za razvoj raka na debelem črevesu.

Miyamoto idr. (1991) so iz kefirnih zrn in v zahodni Evropi proizvedenega kefirja izolirali 31 bakterij,

pri čemer so imeli 3 izolati Lactococcus lactis ssp. cremoris najmočnejše protimutagene lastnosti.

Cevikbas idr. (1994) so pokazali, da intraperitonealna injekcija 0,5 ml kefirja/d, v obdobju 20 d po

zasidranju vretenastih celic sarkoma, občutno zmanjša velikost tumorjev v miših in celo prepreči

tumoralno nekrozo pri nekaterih živalih.

Yoon idr. (1999) so z Amesovim testom izmerili antimutagene lastnosti bakterij Lactobacillus spp.,

izolirane iz kefirja in jogurta, in pokazali, da je 36 od 40 izolatov v evropskem kefirju in jogurtu ščitilo

bakterijo Salmonella typhimurium TA 98 pred mutagenom 2-nitrofluoren.

Pokazalo se je, da ima kefir pri testu toksičnosti oglikovega tetraklorida (CCl4) višji antioksidativni

učinek kot vitamin E (Guven idr., 2003). Miši, ki so zauživale kefir in bile izpostavljene CCl4, so imele

občutno nižjo vsebnost malondialdehida v ledvicah in jetrih, kot miši, izpostavljene CCl4. Povečani

aktivnosti glutation peroksidaze in glutation S-transeraze v tkivih miši, ki so zauživale kefir, sta morda

prispevali k nižjemu nivoju lipidnih peroksidov. Do danes še ni bilo izvedenih raziskav na človeku, s

katerimi bi potrdili protitumorski učinek kefirja in kefirana.

6.3 Protibakterijske, protiglivične in protivirusne lastnosti kefirja

V študijah, kjer so raziskovali proizvodnjo bakteriocinov z mikrobioto kefirnih zrn, so ugotovili, da

nastaja več tipov bakteriocinov. Študija, v kateri so uporabili 33 različnih virov irskih kefirnih zrn, je

pokazala, da izolati laktokokov proizvajajo vsaj tri različne tipe bakteriocinov (Cogan idr., 1997). Prvi

bakteriocin je bil ozkega spektra in je inhibiral samo laktokoke. Drugi bakteriocin je od vseh bakterij

inhibiral le Lactobacillus casei, Lactobacillus helveticus in Pediococcus pentosaceus. Tretji

bakteriocin je imel širok spekter učinkovitosti in je inhibiral vseh deset testiranih bakterij, skupaj z

drugimi kulturami bakterij Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Steptococcus thermophilus in

Staphylococcus aureus. Bakteriocin, ki ga proizvaja Lactococcus lactis DPC3147, so poimenovali

lakticin 3147 (Ryan idr., 1996). Lakticin se od nizina razlikuje v tem, da je plazmidsko kodiran. Lakticin

3147 in nizin imata podobne inhibicijske lastnosti, lakticin pa je tako kot nizin toplotno obstojen.

Lakticin bi tako lahko bil ključni dejavnik pri ohranjanju mikrobiote kefirnih zrn, saj bi inhibiral rast

tujih organizmov. Študija, ki so jo izvedli Morgan idr. (2000), poroča o protimikrobnem potencialu 38-

ih vrst irskih kefirnih zrn proti patogenima Listeria innocua DPC1770 in Escherichia coli 0157:H45.

Ugotovili so, da 18 vrst zrn popolnoma inhibira rast bakterije Listeria innocua, 13 vrst inhibira rast

delno, 7 vrst pa ni imelo inhibicijskega učinka. 34 vrst zrn je popolnoma inhibiralo rast bakterije E.

coli, 3 vrste so delno inhibirale rast, 1 vrsta zrn pa ni imela inhibicijskega učinka. Inhibicijski učinek

kefirnih zrn proti bakteriji Listeria innocua so pripisali bakteriocinu, ki ga proizvaja mikrobiota zrn.

Vendar pa inhibicijskega učinka proti bakteriji E. coli niso pripisali bakteriocinu, temveč

kombiniranemu učinku kisline in vodikovega peroksida.

Bossi idr. (1986) so testirali inhibicijski učinek v laboratoriju proizvedenega kefirja ter različnih

kombinacij v kefirju prisotnih bakterij proti različnim patogenim črevesnim bakterijam. Kefir je


36

inhibiral rast osmih patogenov, vendar ni bil učinkovit proti dvema sevoma E.coli in enemu sevu

Staphylococcus aureus. Rast sevov E. coli 0157:H7, L. monocytogenes 4b ali Yersinia enterocolitica 03

ni bila zavrta, ko so jih (pri visoki stopnji dodajanja) dodajali h kefirju, proizvedenem samo z zrni ali v

kombinaciji z jogurtom (Gulmez in Guven, 2003).

Kefirna zrna imajo večjo protibakterijsko aktivnost kot kefir, še posebej proti po Gramu pozitivnim

kokom, vključno s stafilokoli in po Gramu pozitivnimi bacili. Pokazalo se je, da je kefir aktiven tudi

proti različnim glivam, kvasovkam in plesnim. Cevikbas idr. (1994) so zaključili, da protibakterijska in

protiglivična aktivnost kefirja pomaga pojasniti široko uporabo kefirja proti infekcijskim in

neoplastičnim boleznim. Pri svojih zaključkih so se oprli na študijo, ki sta jo na ljudeh opravila

raziskovalca Ormisson in Soo (1976). Vendar pa povzetek njunega članka pokaže, da je bila uporaba

kefirja pri otrocih s pljučnico in akutnim bronhitisom za izboljšanje kislinsko-baznega razmerja

neuspešna.

Serot idr. (1990) so uspeli izolirati in delno okarakterizirati dva protimikrobna agensa iz bakterij,

najdenih v kefirnih zrnih. Obe substanci sta bili učinkoviti proti po Gramu pozitivnim in po Gramu

negativnim bakterijam in sta imeli molekulsko težo okrog 1000 DA. Inhibirali so ju nekateri

proteolitski encimi. Zacconi idr. (1995) so pokazali, da piščance, okužene z bakterijo Salmonella

kedougou, ščiti svež kefir, ne pa jogurt ali zakisano mleko. Postopek je bil najbolj uspešen, če so

piščanci kefir dobili hkrati kot okužbo z bakterijo Salmonella, vendar so bili piščanci zaščiteni tudi, če

so kefir zaužili en ali šest dni po okužbi.

Protimikrobna aktivnost svežega kefirja se razlikuje od aktivnosti rekonstituiranega liofiliziranega

kefirja. Sveži kefir je imel sposobnost inhibicije bakterij Staphylococcus aureus, Kluyveromyces lactis,

in E. Coli, vendar ni inhibiral kvasovk Saccharomyces cerevisiae ali Candida albicans; liofilizirani in

nato z destilirano vodo obnovljeni kefir ali obnovljeno mleko v prahu pa je izgubilo protimikrobno

aktivnost. Najboljši način za ohranjanje inhibicijskih lastnosti kefirja po liofilizaciji je dodajanje ribitola

kot zaščitnega sredstva med zamrzovanjem (Brialy idr., 1995).

Protibakterijske lastnosti kefirja gre pripisati kombinaciji dejavnikov med fermentacijo, vključno s

tekmo za hranilne snovi in proizvodnjo inhibicijskih metabolitov, npr. organskih kislin. Garrote idr.

(2000) so opazili, da k protibakterijskim lastnostim kefirja prispevajo tudi mlečna in etanojska kislina,

kljub temu, da so bakterije tiste, ki v kefirju proizvajajo bakteriocin. Supernatant kefirja, ki so ga

proizvedli z argentinskimi zrni, je imel protibakterijski učinek proti po Gramu pozitivnim in po Gramu

negativnim bakterijam, čeprav je bolj učinkoval proti po Gramu pozitivnim bakterijam. Mleko ni

imelo učinka. Analiza supernatantov različnih kefirjev je pokazala, da vsebujejo tako mlečno kot

etanojsko kislino.

Ko so raziskovalci mleku z dodano mlečno in etanojsko kislino dodali bakterijo E. coli, je bil

inhibicijski učinek spet prisoten. Mleko brez dodatka mlečne in etanojske kisline pa ni imelo

inhibicijskega učinka. Mleko s pH-jem, prilagojenim pH-ju fermentiranega kefirja, ali mleko z dodano

citronsko kislino ni imelo inhibicijskega učinka proti E. coli 3. Ker pH vrednost mešanice določa

odstotek kisline v protoniranem ali disociiranem stanju, je pH kefirjevega supernatanta (3,6–3,7)

povzročil, da je bilo 1,5 % mlečne kisline in 0,11 % etanojske kisline v nedisociirani obliki, ki ima višjo

inhibicijsko sposobnost. Garrote idr. (2000) so opomnili, da je prejšnja raziskava pokazala, da je že

tako nizek nivo kislin sposoben inhibirati rast nepatogene bakterije E. coli.

Ruski raziskovalci so uporabili izdelek acipol, ki poleg kefirnih zrn vsebuje še bakterijo Lactobacillus

acidophilus, in ga uporabljajo za zdravljenje antibiotične disbakterioze, ki je stranski učinek


37

antibakterijske terapije (Oleinichenko idr., 1999). Opazovanja so pokazala, da so bolniki z akutno

pljučnico ali kroničnim bronhitisom, ki so jih zdravili z antibakterijskimi sredstvi, pogosto dovzetni za

bakterijske infekcije. Zdravljenje z antibiotiki in acipolom je znižalo frekvenco in resnost

disbakterioze.

Interferoni vzpodbudijo intracelularno proizvajanje različnih vrst antivirusnih beljakovin in tako

posredno povečajo odpornost celic proti virusom. Kefir vsebuje sfingomielin, ki poveča proizvodnjo

interferona beta v celicah MG-63 človeškega osteosarkoma, zdravljenega s kemičnim povzročiteljem

poly I : poly C. Zaznana je bila aktivnost v razponu od 2 μg/mL do 100 μg/mL, maksimalno pa se je

izločanje (14-krat) povečalo pri 25 μg/mL (Osada idr., 1994). Vendar pa v raziskavo ni bilo vključenih

dovolj podrobnosti o postopku eksperimenta, zato kredibilnosti teh ugotovitev ni mogoče

popolnoma ovrednotiti.

Besednova idr. (1997) so kefirju dodali peptid, izoliran iz živčnega tkiva lignjev, in ugotovili, da je ta

mešanica pri laboratorijskih živalih stimulirala celularni in telesni imunski sistem. Pri miših, ki so imele

pomanjkljiv imunski sistem, je mešanica obnovila delovanje imunskega sistema.

Rodrigues idr. (2005) so z metodo difuzijskih diskov izmerili protimikrobno aktivnost kefirja in

kefirana. Oba sta bila učinkovita proti širokemu spektru mikroorganizmov, vendar ne tako učinkovita

kot antibiotiki. Vendar je kefirni gel, ki so ga nanesli na rane podgan, okuženih z bakterijo

Staphyloccus aureus, bolje zdravil rane kot antibiotiki pri kontrolni skupini.

6.4 Metabolizem holesterola

Uživanje fermentiranih mlečnih izdelkov je dolgo časa veljalo kot način zniževanja nivoja serumskega

holesterola. Taylor in Williams (1998) sta povzela rezultate 13 poskusov, ki so jih opravili na ljudeh.

Ugotovila sta, da je zauživanje jogurta v primerjavi s kontrolno skupino: (1) znižalo nivo holesterola v

krvi pri osmih poskusih, (2) da ni imelo učinka pri štirih poskusih in (3) povečalo nivo holesterola v

krvi pri enem poskusu. Pri tem pridejo na misel številni biokemijski mehanizmi, pri katerih bi lahko

predvidevali, da uživanje fermentiranega mleka znižuje nivo holesterola v krvi (St-Onge idr., 2000).

Predvideva se, da lahko probiotične bakterije povzročijo povečanje proizvodnje kratkih maščobnih

kislin, ki znižajo nivo cirkulatornega holesterola, tako, da inhibirajo sintezo holesterola v jetrih ali

redistibuirajo holesterol iz plazme v jetra. Dodatno pa lahko povzročijo tudi dekonjugacijo oz.

hidrolizo žolčne kisline v črevesju. Dekonjugirana žolčna kislina se tako ne absorbira, temveč izloči iz

telesa. To stimulira sintezo žolčne kisline, kar obtoku odvzame še več holesterola.

Vujicic idr. (1992) so preučevali sposobnost kefirnih zrn za absorbiranje holesterola iz mleka med 24 h

inkubacijo pri 20 °C ali po inkubaciji med 48 h skladiščenjem pri 10 °C. Zrna so bila pridobljena v

Jugoslaviji, Madžarski in na Kavkazu. Po koncu fermentacije se je v mleku asimiliralo med 22 % in 63

% holesterola, po koncu 48 h skladiščenja pa med 41 % in 84 %.

Hrčki, hranjeni s hrano, ki je bila obogatena s holesterolom (0,35 %) in je vsebovala liofiliziran kefir,

proizveden iz kravjega ali sojinega mleka, so imeli, v primerjavi s hrčki, ki so jih hranili z 10 %

posnetim mlekom ali liofiliziranim sojinim mlekom, občutno zmanjšan celokupni nivo serumskega

holesterola in aterogenski indeks. Pozitivni učinek so delno pripisali izločanju nevtralnih sterolov in

žolčnih kislin (Liu idr., 2006).

Maeda idr. (2004b) navajajo, da uživanje kefirana morda vpliva na številne mehanizme lipidnega

metabolizma. Prikazali so podatke o podganah, ki so jih hranili z zelo mastno hrano in kjer se je


38

celokupni nivo serumskega holesterola, holesterola LDL in trigliceridov ter jetrnega holesterola,

trigliceridov in fosfolipidov, v primerjavi s kontrolno skupino, nekoliko zmanjšal. Znižan krvni tlak pri

podganah, ki so jih hranili s kefiranom, so pripisali zmanjšani aktivnosti in vivo encima ACE

(angiotensin l-converting enzyme). Quirós idr. (2005) so iz kozjega kefirja izolirali dva peptida z visoko

aktivnostjo inhibicije encima ACE.

Naključni poskus uživanja kefirja je bil izveden na 13 moških s srednje visokim nivojem holesterola

(nivo serumskega holesterola 6,0–10 mmol/L). Moški so mesec dni uživali 500 mL kefirja/d ali enako

količino mleka ter po štirih tednih premora jedli obratno. Z analizo bakterij v vzorcih blata so

raziskovalci pokazali, da je 73 % moških kolonizirala bakterija Leuconostoc ssp., ki jo najdemo v

kefirju. Analiza vzorcev blata je po premoru pokazala, da se je po koncu uživanja kefirja mikrobna

sestava blata vrnila v prvotno stanje. Skupni nivo holesterola, lipoproteinskega holesterola z nizko

gostoto, lipoproteinskega holesterola z visoko gostoto in nivo trigliceridov v krvi se med obdobjem

uživanja kefirja niso spremenili (St-Onge idr., 2002).

6.5 Drugi zdravju koristni učinki

Kefir je tako kot drugi probiotični izdelki najbolj učinkovit pri uravnavanju mikrobiote prebavnega

trakta. Sukhov idr. (1986) so s kefirjem hranili (500 mL, 5-krat/d) 38 bolnikov, obolelih za enteritisom

in odkrili, da v črevesju ni prišlo do občutnih sprememb v populaciji mikrobiote. Ruski raziskovalci so

prav tako uporabili kefir za zdravljenje bolnikov s peptičnimi čiri na želodcu in dvanajstniku (Batinkov,

1971). Japonski raziskovalci so predvidevali, da kefiran in bakterije kefirja morda vplivajo na prehod

prehranskih alergenov v črevesju in tako povzročajo občutljivost za določeno hrano. Miši, ki so jih

hranili s kefirjem in nato z ovalbuminom (OVA), so imele manjše povečanje koncentracije OVA v

plazmi, kar je nakazovalo, da kefiran najbrž preprečuje prehod iz črevesja. Miši, ki so bile krmljene s

kefirjem in beljakovino OVA, so v primerjavi z mišmi, ki so bile krmljene samo z OVA, po dveh tednih

imele znižan nivo anti-OVA IgG (Umeda idr., 2005).

Pred kratkim so japonski raziskovalci pokazali, da so podgane, ki so jih 12 d pred obsevanjem hranili s

kefirjem, imele, v primerjavi s kontrolnimi živalmi, 2 h po obsevanju z 1 Gy radiacije, občutno

zmanjšane indekse apoptoze pri histoloških sekcijah črevesnih žlez (Matsuu idr., 2003). Minimalno

zniževanje apoptoznega indeksa se je nadaljevalo še 6 h po obsevanju.

Povzetek patenta (Weissmahr, 2000) trdi, da lahko prehransko dopolnilo, ki je sestavljeno iz

filtriranega in posušenega mleka, fermentiranega z dvema različnima vrstama kefirnih zrn (prva zrna

so bogata z bakterijami, druga pa s kvasovkami), pomaga pri preprečevanju osteoporoze. Navedeno

je, da lahko dopolnilo uporabimo za preprečevanje in zdravljenje osteoporoze in drugih bolezni, ki jih

povzroča pomanjkanje kalcija, magnezija in kalija.

Kefir morda tudi stimulira imunski sistem sluznice. Pred kratkim so poročali, da so mlade podgane (6

mesecev), ki so jih prosto hranili s kefirjem, in jih nato v dvanajsterniku (CT) imunizirali s toksinom

kolere, imele v primerjavi s kontrolno skupino občutno višji nivo (86 %) serum protiteles anti-CT

(Thoreux in Schmucker, 2001). Ta odziv so pripisali izboljšanemu izločanju protiteles in vitro vzgojenih

limfocitov, ki so jih izolirali iz Peyerjevih ploščic in črevesnih membran. Ta učinek kefirja pri starejših

podganah (26 mesecev) med istim poskusom ni bil opažen. Skupni serumski titri IgA se zaradi

uživanja kefirja prav tako niso spremenili, vendar pa so bili pri mladih in starih podganah anti-CT IgG

titri nižji kot pri živalih, ki so jih krmili s kefirjem. Ena od teorij je, da imunomodulacijski učinek kefirja

povzročajo komponente bakterijskih sten.


39

POGLAVJE III ETANOL aromatična komponenta kefirja


40


41

1 VPLIV ČASA AKTIVACIJE KEFIRNIH ZRN NA VSEBNOST KVASOVK IN ETANOLA V KEFIRJU

1.1 Uvod

Količina aromatičnih komponent v kefirju, med katere prištevamo tudi etanol, je odvisna predvsem

od procesnih parametrov (čas fermentacije, temperatura, koncentracija inokuluma, vrsta mleka,

vrsta mikroorganizmov, itd), pri katerih izvajamo fermenacijo (Shoevers in Britz, 2003; Garrote idr.,

1997; Papapostolou idr., 2008). Ključni dejavnik, ki vpliva na uspešen potek fermentacije mleka s

kefirnimi zrni in posledično na kvaliteto kefirja, je vzdrževanje aktivnosti mikroorganizmov kefirnih

zrn med samim procesom. Aktivnost mikroorganizmov, ki je odvisna od fizikalnih in kemijskih razmer

okolja, vzdržujemo s stalno kultivacijo zrn v mleku. Tudi mirujoča oz. neaktivna kefirna zrna, ki se ne

razmnožujejo, ohranijo sposobnost proizvodnje pravega, tradicionalnega kefirja (Toba idr., 1990).

Vendar pa je taka zrna pred vsakokratno uporabo potrebno ustrezno aktivirati. V literaturi je sicer

objavljenih več različnih postopkov aktivacije kefirnih zrn (Garrote idr., 1997; Tramšek in Goršek,

2007). Tako npr. Shoevers in Britz (2003), kot zadosten postopek aktivacije kefirnih zrn, navajata

klasično, šestdnevno kultivacijo zrn v mleku. Vemo namreč, da so le optimalno aktivni

mikroorganizmi sposobni rasti in se razmnoževati v mleku (Tramšek in Goršek, 2007).

Glavni namen raziskave je bil proučiti vpliv časa aktivacije kefirnih zrn na pH profile kefirja in

proizvodnjo etanola tekom fermentacije mleka z naravnimi kefirnimi zrni. Poleg tega smo raziskali

korelacijo med vsebnostjo etanola in populacijo kvasovk v zrnih in kefirju, po različnih časih aktivacije

kefirnega zrnja. V ta namen smo v RC1 reakcijskem kalorimetru (Mettler Toledo) z različno aktivnimi

zrni, pri enakih procesnih pogojih, izvedli serijo 10-ih eksperimentov. On-line koncentracijske profile

etanola smo zasledovani z uporabo in-situ FTIR spektrometra (ReactIRTMiC10). Kefirna zrna

kavkaškega porekla smo dobili iz lokalne mlekarne, ki industrijsko proizvaja kefir po tradicionalnem

postopku s kefirnimi zrni.

1.2 Metode in materiali

1.2.1 Inokulum in fermentacijski medij

Kefirna zrna, ki smo jih uporabili kot inokulum za izvedbo fermentacij, smo dobili iz mlekarne Kele &

Kele d.o.o. (Logatec, Slovenija). Zrna smo vzdrževali pri sobni temperaturi (T = 23 ± 2 °C) v 1 L

svežega, visoko temperaturno obdelanega (Ultra High Temperature; UHT), polnomastnega kravjega

mleka (Ljubljanske mlekarne d.d., Ljubljana, Slovenija). Kefirno zrno smo ohranjali z vsakodnevnim

prenašanjem v sveže mleko. Mleko istega proizvajalca smo uporabljali tudi kot fermentacijski medij.

Njegova sestava je bila: w = 3,2 % beljakovin, w = 4,6 % ogljikovih hidratov, w = 3,5 % maščobe in

w = 0,13 % kalcija.

1.2.2 Laboratorijska oprema

1.2.2.1 Reaktor

Vsi eksperimenti so bili izvedeni v 2 L steklenem, plaščnem šaržnem reaktorju, natančneje v RC1

reakcijskem kalorimetru z notranjim premerom 120 mm (Mettler Toledo International Inc.,

Greifensee, Švica). Reaktor je obratoval pri atmosferskem tlaku. Homogenost fermentacijske zmesi

smo zagotovili z uporabo steklenega mešala s premerom 108 mm, ki je bilo nameščeno (10–15) mm

nad reaktorskim dnom. Temperaturo in pH smo v reaktorju nadzorovali z uporabo vgrajene


42

standardne on-line temperaturne in pH sonde. Podrobnejše delovanje reakcijskega kalorimetra RC1

je opisano v predhodnih objavah (Hvalec idr., 2004; Zajšek, 2006; Tramšek, 2009).

1.2.2.2 In-situ FTIR spektrometer

In-situ FTIR analize smo izvedli z uporabo ReactIRTMiC10 spektrometra (Mettler Toledo International

Inc., Greifensee, Švica), ki je opremljen z DiCompTM imerzijsko sondo in diamantnim ATR (Attenuated

Total Reflection) kristalom (Mul idr., 2004). S tekočim dušikom hlajeni MTC (Mercur Telluride

Cadmium) detektor smo uporabili znotraj območja valovne dolžine (1950–650) cm Da bi

zmanjšali možnost zamašitve merilne reže (s fermentacijsko brozgo) na sondi, in da bi bili izmerjeni

rezultati natančni in veljavni, smo imerzijsko ATR-FTIR sondo, s katero smo med procesom

fermentacije zasledovali koncentracijske spremembe etanola v kefirju, namestili v območju visokih

hitrosti tekočin oz. blizu konic mešala. Celoten analizni sistem smo upravljali z osebnim

računalnikom, ki sprejema rezultate meritev od merilnega sistema. Programska oprema iC IR Version

1.5.105 (Mettler Toledo International Inc., Greifensee, Švica), nameščena na osebnem računalniku,

omogoča samodejno spremljanje poteka reakcij.

1.2.3 Postopek aktivacije kefinih zrn

Če želimo zagotoviti enakomerno preživetje in aktivnost mikroflore kefirnih zrn ter ponovljivost

dinamičnih pH profilov kefrija med fermentacijo mleka, z različno aktivnimi zrni, morajo biti zrna

optimalno aktivna. 45 g neaktivnih zrn, ki smo jih sprali z mrzlo vodo, smo cepili v 400 mL svežega

UHT mleka. Po 24 h inkubaciji pri sobni temperaturi (23 ± 2) °C smo zrna odstranili iz fermentacijske

brozge s filtriranjem skozi plastično sito. Pred cepljenjem v sveže mleko smo zrna vsakič sprali z mrzlo

vodo. Postopek zmo ponovili deset zaporednih dni.

1.2.4 Postopek izvedbe eksperimentov

Eksperimente, ki so potekali pri enakih procesnih pogojih, s kefirnimi zrni, ki smo jih aktivirali od 2 do

10 dni, takt. = (2, 4, 6, 8, 10) d, smo izvedli po enakem postopku. Najprej smo reaktor napolnili z 1 L

svežega, polnomastnega UHT kravjega mleka, ki smo ga segreli na optimalno delovno temperaturo

24 °C. Po vzpostavitvi temperaturnega stacionarnega stanja, smo v mleko cepili 42 g kefirnih zrn (KZ,0

= 42 g/L). Med potekom 24 h fermentacije smo fermentacijsko brozgo premešali vsako uro za 1 min s

stalno vrtilno frekvenco mešala, fm = 80 rpm. Cepljenje mleka s kefirnimi zrni je povzročilo

fermentacijo mleka, kar se je odražalo v zniževanju pH vrednosti mleka/kefirja, ki smo ga tekom

fermentacije dinamično zasledovali. Po koncu vsakega eksperimenta smo gravimetrično določili

končno masno koncentracijo kefirnih zrn in njihovo dnevno prirast.

1.2.5 Analize

1.2.5.1 Dinamično merjenje koncentracije etanola v kefirju

Med fermentacijami smo spremembo koncentracije etanola v kefirju merili z in-situ FTIR

spektrometrom. Pri eksperimentih smo kot ozadje posneli spekter svežega, polnomastnega UHT

mleka, segretega na izbrano delovno temperaturo. DiCompTM sonda je spektre fermentacijske brozge

beležila s Happ-Genzel-ovo apodizacijsko metodo vsakih 5 min pri resoluciji, = 8 cm–1 v območju

= (1950–650) cm–1. Posamezni spekter je sestavljen iz 256 »združenih« spektrov. Reakcijske profile

etanola smo določili na osnovi površine pika glede na eno bazno točko (preglednica 3.1).


43

Preglednica 3.1: Pik etanola in njegove bazne linije.

*Površina pika (S) med valovno dolžino 1 in 2.

Sondo smo po vsaki uporabi očistili z vodo ter posušili z acetonom in bombažno krpo.

1.2.5.1.1 Umeritvena krivulja

Za pripravo umeritvene krivulje, prikazane na sliki 3.1, smo uporabili standardne raztopine

mleko/etanol z znanimi koncentracijami etanola. Umeritvena krivulja je bila pripravljena pri

temperaturi 24 °C.

Slika 3.1: Umeritvena krivulja za etanol.

Linearno zvezo med masno koncentracijo in površino pika podaja Beer-Lambertov zakon. Na osnovi

omenjenega zakona smo iz naklona umeritvene krivulje določili masni absorpcijski koeficient za pik

etanola in v nadaljevanju izračunali masno koncentracijo etanola v fermentacijski brozgi med

fermentacijo.

1.2.5.2 Mikrobiološke analize

1.2.5.2.1 Priprava vzorcev

Kefir

Vzorec kefirja smo pripravili z 10-kratnim razredčevanjem v sterilni ¼ Ringerjevi raztopini (RR).

Npr. 1 mL kefirja + 9 mL RR = 10-kratna razredčitev (10–1)

Komponenta S (/)

* Bazna linija

1

2

1

Etanol 1050 1035 1088


44

1 mL 10-kratne razredčitve + 9 mL RR = 100-kratna razredčitev (10–2), itd.

Postopek smo ponavljali do željene razredčitve.

Priprava ¼ Ringerjeve raztopine (RR): 1 Ringerjevo tableto (Merck, KgaA, Dermstadt, Nemčija) smo

raztopili v 500 mL mili Q vode, razdelili pripravljeno raztopino po 9,2 mL v epruvete in avtoklavirali 15

min pri temperaturi 121 °C. Uporabili smo jo za 10-kratno razredčevanje mikrobioloških vzorcev pri

mikrobioloških analizah. RR je izotonična raztopina, sestavljena iz NaCl, KCl, CaCl2 in NaHCO3.

Kefirno zrno

Osnovno razredčino smo pripravili tako, da smo oprana in posušena kefirna zrna 10 krat razredčili s

sterilno raztopino natrijevega citrata (Fluka, Chemie GmbH, Deisenhofen, Nemčija), ki smo jo

pripravili po navodilih mednarodnega IDF standarda 122B:1992 (IDF, 1992). Mešanico smo nato 10

min homogenizirali z Rotamix 701 MD homogenizatorjem (Tehtnica, Železniki, Slovenija). Z 10-

kratnim razredčevanjem homogenata smo nadaljevali v sterilni RR:

npr. 10 g kefirnega zrna + 90 mL nartijevega citrata = 10 kratna razredčitev (10–1)

1 mL 10 kratne razredčitve + 9 mL RR = 100 kratna razredčitev (10–2), itd.

Postopek smo ponavljali do želene razredčitve.

Priprava raztopine natrijevega citrata: 20 g tri-natrijevega citrat-dihidrata (Fluka Chemie GmbH,

Deisenhofen, Nemčija) smo raztopili v 1000 mL mili Q vode, naravnali vrednost pH na 7,5 ter

avtoklavirali 15 min pri 121 °C.

1.2.5.2.2 Priprava gojišč

Gojišče jo bilo pripravljeno po navodilih proizvajalca.

Trdno gojišče YGC Agar (Merck, KgaA, Dermstadt, Nemčija)

V 1000 mL destilirane vode smo raztopili 40 g gojišča v prahu. Gojišče smo nato 15 min avtoklavirali

pri temperaturi 121 °C. Gojišče je selektivno za kvasovke pri 5 d inkubaciji, pri 24 °C.

1.2.5.2.3 Določanje števila kvasovk s štetjem kolonij na trdnem gojišču

Uporabili smo tehniko prelivanja petrijevih plošč. Po 1 mL ustrezne razredčitve vzorca smo prenesli

na petrijevo ploščo, prelili z raztopljenim in primerno ohlajenim YGC gojiščem in z rahlimi krožnimi

gibi vzorec premešali z dodanim gojiščem. Ko se je gojišče strdilo, smo plošče inkubirali aerobno, 5 d

pri 24 °C. Po inkubaciji smo prešteli zrasle kolonije. Rezultate smo izrazili kot število kolonijskih enot

na mL kefirja (KE/mL) oz. na gram kefirnega zrna (KE/g). Število kvasovk je bilo določeno v skladu z

mednarodnim IDF standardom 100B:1991 (IDF, 1991).

Po IDF standardu (100B:1991) morajo petrijeve plošče vsebovati več kot 10 in manj kot 300 kolonij.

Število mikroorganizmov (N) na gram kefirnega zrna ali na mililiter kefirja izračunamo iz rezultatov

vsaj dveh razredčin po enačbi 3.1:

dnn

cN

21 0,1

(3.1)

kjer je: N število mikroorganizmov (KE/g; KE/ml),


45

c vsota preštetih kolonij na vseh ploščah (KE),

n1 število plošč s prvo upoštevano razredčitvijo (/),

n2 število plošč z drugo upoštevano razredčitvijo (/),

d faktor razredčevanja prve razredčine (/).

V en. (3.1) moramo n2 pomnožiti z 0,1, ker je druga razredčina 10-krat večja od prve. Rezultat

zaokrožimo na dvomestno število, ki ga pomnožimo z ustrezno potenco števila 10 (IDF, 1991).

1.2.6 Matematični eksponentni pH model

Pri proučevanju šaržne fermentacije mleka s kefirnimi zrni predstavlja pH vrednost fermentacijske

brozge enega izmed najpomembnejših, dinamično merjenih, bioprocesnih parametrov. Z vidika

matematike lahko proces fermentacije uspešno opišemo s tri-parametrično (n, s in z) eksponentno

funkcijo oz. t.i. eksponentnim pH modelom, ki sta ga v predhodnih študijah razvila Tramšek in Goršek

(2007):

)( ztsnt exppHpH (3.2)

kjer je: n, s parametra eksponentnega pH modela (1),

z parameter eksponentnega pH modela (h–1),

t čas fermentacije (h).

Z ne-linearno regresijsko analizo smo predlagani eksponentni pH model prilegali k eksperimentalnim

podatkom. Pri tem smo uporabili komercialno dostopni program SigmaPlot®10.0. Za minimiziranje

funkcije najmanjših kvadratov smo uporabili Levenberg-Marquadt-ov algoritem.

1.3 Rezultati in razprava

1.3.1 Analiza dinamičnega merjenja pH vrednosti kefirja

Kakovost fermentiranih mlečnih izdelkov je močno odvisna od procesnih parametrov, pri katerih

izvajamo fermentacije. Eden izmed ključnih parametrov pri proizvodnji fermentiranih mlečnih

izdelkov je vrednost pH. Ugotovili so (Kwak idr., 1996; Athanasiadis idr., 2004), da na pH vrednost

kefirja vplivajo mlečna, ocetna in druge organske kisline ter etanol in CO2, ki nastanejo med

fermentacijo kot rezultat delovanja mikroorganizmov. Vsekakor na pH vrednost kefirja znatno

vplivata tudi čas fermentacije in koncentracija metabolitov, ki nastanejo med fermentacijo, kot so

eterične/hlapne spojine v kefirju. Slednje vplivajo na oblikovanje senzoričnih lastnosti izdelka

(Athanasiadis idr., 2004).

K eksperimentalno določenim pH vrednostim kefirja, ki so bile dinamično merjene med fermentacijo

mleka, cepljenega z enakimi začetnimi masnimi koncentracijami (KZ,0 = 42 g/L) različno dolgo

aktiviranih (takt. = (1–10) d) kefirnih zrn pri temperaturi 24 °C, smo prilegali eksponentni pH model (en.

3.2). Zvezo med eksperimentalno določenimi pH vrednostmi kefirja, časom fermentacije ter

aktivnostjo kefirnih zrn prikazuje slika 3.2.


46

Slika 3.2: Eksperimentalni in z modelom določeni pH profili fermentacij, izvedenih s časovno različno

aktiviranimi kefirnimi zrni.

Razvidno je, da med 24 h procesom fermentacije pride do zelo izrazitega znižanja pH vrednosti

mleka, iz začetne povprečne vrednosti pH = (6,67 ± 0,02) na povprečno končno vrednost

pH = (4,22 ± 0,04). pH vrednosti kefirja, izmerjene po 24 h fermentacijah so zelo podobne vrednostim

iz literature (Kwak idr., 1996; Athanasiadis idr., 2004), v kateri je navedeno, da se pH vrednost kefirja

giblje od 4,4 (razmerje kefirna zrna : mleko = 1 : 30) do 4,6 (razmerje kefirna zrna : mleko = 1 : 50)

(Farnworth, 2003). Glavni razlog za dokaj enakomerno upadanje pH vrednosti kefirja je proizvodnja

nekaterih organskih kislin, etanola, CO2 in drugih hlapnih spojin. Vzrok za padec pH-ja (ob začetni fazi

razmnoževanja kefirnih zrn) je tudi pH gradient med zrni in mlekom. Kefirna zrna so sama po sebi

nekoliko kisla (še posebej notranjost zrn), zato še dodatno znižajo pH vrednost mleka (Rea idr., 1996).

Iz slike 3.2 je prav tako razvidno, da pH kefirja pada nekoliko hitreje v primeru inokulacije mleka z

zrni, aktiviranimi daljši čas.

Hiter padec pH-ja ni odvisen samo od od števila raznolikih mikrobnih združb (kvasovke, laktobacili,

streptokoki, itd.), prisotnih v kefirnih zrnih in kefirju, ampak tudi od proizvodnje hlapnih spojin.

Ugotovili so namreč, da je prvoten upad pH vrednosti med 24 h fermentacijo kefirja posledica hitrega

razmnoževanja homofermentativnih mlečno-kislinskih streptokokov (Farnworth, 2005). Vendar pa

lahko na podlagi predhodnih eksperimentalnih študij (Kwak idr., 1996; Athanasiadis idr., 2004)

trdimo, da po 24 h nismo dosegli končne pH vrednosti kefirja, saj omenjeni avtorji navajajo končne

vrednosti med 3,0 in 4,1.

Ocenjene vrednosti parametrov eksponentnega pH modela n, s in z za fermentacijo mleka s časovno

različno aktiviranimi kefirnimi zrni so prikazane v preglednici 3.2.

Vrednosti parametrov n, s in z ter korelacijskega koeficienta R2, kot merila učinkovitosti regresije,

smo ocenili z ne-linearno regresijo eksperimentalnih podatkov, s komercialno dostopnim

računalniškim programom SigmaPlot®10.0.


47

Preglednica 3.2: Primerjava ocenjenih vrednosti parametrov eksponentnega pH modela za proces

fermentacije s časovno različno aktiviranimi kefirnimi zrni.

takt. (d) Parameter

R2

n (1) s (1) z (h–1

)

2 2,768 3,717 0,038 0,989

4 2,959 3,551 0,042 0,993

6 2,964 3,539 0,044 0,992

8 2,966 3,548 0,044 0,990

10 2,912 3,616 0,045 0,993

Iz rezultatov v preglednici 3.2 je razvidno, da vrednosti vseh korelacijskih koeficientov (R2) znašajo

približno 0,990, kar pomeni, da lahko padanje pH vrednosti med fermentacijo mleka, s časovno

različno aktiviranimi zrni, opišemo z eksponentnim pH modelom.

1.3.2 Ovrednotenje zveze med proizvodnjo etanola in populacijo kvasovk v kefirnih zrnih in

kefirju

Tekom fermentacij smo poleg proučevanja vpliva uporabe različno aktiviranih zrn na padanje pH

vrednosti mleka študirali tudi vpliv aktivacije zrn na proizvodnjo etanola ter celokupno število

kvasovk v kefirnih zrnih in kefirju.

Potek fermentacij mleka z različno aktiviranimi kefirnimi zrni smo zasledovali z ReactIRTMiC10

analiznim sistemom. In-situ FTIR sonda je spektre fermentacijske brozge tekom eksperimentov

beležila v 5 min časovnih intervalih. Slika 3.3 prikazuje 3D diagram fermentacije mleka, ki smo jo

izvedli z zrni, aktiviranimi 10 d (eksperiment: E10d).

Slika 3.3: Dinamični profil FTIR spektra proizvodnje etanola med fermentacijo mleka z zrni, aktiviranimi 10 d

(eksperiment E10d). Reakcijski pogoji: KZ,0 = 42 g/L, T = 24 °C, fm = 80 rpm in t = 24 h.


48

Iz eksperimentalnih podatkov, prikazanih na sliki 3.3, je razvidno, da se intenziteta pika etanola pri

= (1050–1030) cm–1 med 24 h fermentacijo povečuje.

Za posamezni eksperiment je na sliki 3.4a prikazana površina pika etanola ( = (1050–1035) cm-1) v

odvisnosti od časa fermentacije.

Slika 3.4: a) Eksperimentalne vrednosti površine pika proizvodnje etanola v odvisnosti od časa reakcije. b)

Koncentracijski profili etanola med fermentacijami. Reakcijski pogoji: KZ,0 = 42 g/L, T = 24 °C, fm = 80 rpm,

takt. = (1–10) d in t = 24 h.

Profili, ki prikazujejo proizvodnjo etanola med 24 h fermentacijami mleka, izvedenimi z enakimi

začetnimi masnimi koncentracijami (KG,0 = 42 g/L), različno aktiviranih kefirnih zrn (takt. = (1–10) d), so

bili konstruirani na podlagi izmerjenih profilov absorbance. Profili, ki na sliki 3.4b prikazujejo

spremembe masne koncentracije etanola v kefirju (EtOH), v odvisnosti od časa fermentacije (t), so bili

izračunani z uporabo umeritvene krivulje (slika 3.1). Slednja, v skladu z Beer-Lamberovim zakonom,

kaže linearno zvezo med masno koncentracijo etanola v kefirju in površino pika. Iz slike je razvidno,

da masna koncentracija etanola v kefirju narašča hitreje, kadar uporabimo zrna, aktivirana daljši čas.

Iz profilov na sliki 3.4b je razvidno, da masna koncentracija etanola prvih 5 h po dodatku kefirnih zrn

v mleko rahlo narašča. Enakomerno povečanje koncentracije etanola zasledimo v intervalu (5–24) h.

Končna masna koncentracija etanola znaša, v kefirju eksperimenta E10d (kot inokulum smo uporabili

42 g zrn, aktiviranih 10 d), EtOH = 10,9 g/L. To je približno dvakrat več kot je končna masna

koncentracija etanola v kefirju eksperimenta E2d (EtOH = 5,6 g/L). Vrednosti, ki smo jih dobili v naših

eksperimentih, so v razponu vrednosti (0,01–1,0) %, ki so bile določene v študijah fermentacije kefirja

z zrni različnega izvora (Güzel-Seydim idr., 2000; García Fontán idr., 2006). Na podlagi preliminarnih

študij in eksperimentalnih podatkov lahko trdimo, da (eksperimentalni podatki na sliki 3.4b kažejo, da

končna, stacionarna masna koncentracija etanola ni dosežena po 24 h fermentacije) fermentacija

kefirja ni končana po 24 h.

Število kvasovk v različno aktiviranih kefirnih zrnih (takt. = (1–10) d) in v njim pripadajočih vzorcih

kefirja (vse fermentacije so bile izvedene pri procesnih pogojih:KG,0 = 42 g/L, T = 24 °C, fm = 80 rpm, t

= 24 h) smo ocenili s klasično metodo štetja kolonijskih enot, zraslih na selektivnem YGC gojišču (en.

3.1). Preglednica 3.3 prikazuje število kvasovk v različno aktiviranih zrnih in kefirjih, odvzetih po 24 h


49

fermentacije. Rezultati so podani kot število kolonijskih enot na gram kefirnih zrn (KE/g) oz. na mL

kefirja (KE/mL).

Preglednica 3.3: Število kvasovk v kefirnih zrnih in kefirju po 24 h fermentaciji mleka z različno aktiviranimi

kefirnimi zrni.

Število kvasovk (N)

Eksperiment dan aktiviranja

E2d E4d E6d E8d E10d

Kefirna zrna (KE/g) 8,8 × 107 1,0 × 10

8 2,5 × 10

8 9,8 × 10

8 2,5 × 10

9

Kefir (KE/mL) 7,8 × 106 9,6 × 10

6 1,3 × 10

7 1,4 × 10

7 1,4 × 10

7

Iz rezultatov v preglednici 3.3 je razvidno, da število kvasovk v kefirju in kefirnih zrnih variira z

daljšanjem časa aktivacije. To je posledica razmnoževanja kvasovk v zrnih in kefirju ter prenosa

kvasovk iz zrn v mleko. Število kvasovk v kefirju za eksperiment E10d znaša 1,4 × 107 KE/mL in je

približno 1,8 krat večje kot v kefirju eksperimenta E2d (7,8 × 106 KE/mL). Rezultati v preglednici 3.3

kažejo, da z daljšanjem časa aktivacije narašča tudi število kvasovk v zrnih. Tako je število kvasovk v

kefirnih zrnih, uporabljenih za izvedbo eksperimenta E10d (2,5 × 109 KE/g), okrog 28,5 krat višje kot

število kvasovk v zrnih, uporabljenih za eksperiment E2d (8,8 × 107 KE/g).

Rezultati analiz so pokazali, da kefirna zrna, aktivirana dlje časa, proizvedejo več etanola in vsebujejo

večje število kvasovk kot zrna, ki so aktivirana le nekaj dni. Prav tako se s časom aktivacije povečuje

število kvasovk v kefirju, vendar je prirast populacije kvasovk manjša, kot v zrnu. Znano je, da so v

zrnih in kefirju prisotne različne vrste kvasovk, vendar namen naših raziskav ni bil analizirati vrst,

ampak določiti le njihovo celokupno število. Kvasovke v kefirnih zrnih zagotavljajo primerno okolje za

rast bakterij. Slednje namreč izpeljejo osnovno mlečnokislinsko fermentacijo in proizvajajo

metabolite, ki vplivajo na aromo in okus kefirja. Etanol je le eden izmed mnogih produktov, ki se

tvorijo med procesom fermentacije. Njegovo vsebnost v fermentiranih izdelkih običajno predpišejo

proizvajalci sami. Obstaja namreč več različnih zahtev glede dovoljene vsebnosti etanola v kefirju. Pri

proizvodnji kefirja je namreč zelo pomembno, da vodimo fermentacijo s primerno aktiviranimi

kefirnimi zrni, pri ustreznih procesnih pogojih, ki nam zagotavljajo izdelavo kefirja želenih lastnosti.


50

2 MATEMATIČNI MODEL ZA DOLOČITEV HITROSTI NASTAJANJA ETANOLA MED

FERMENTACIJO MLEKA

2.1 Uvod

Povečana industrijska uporaba šaržne alkoholne fermentacije je spodbudila razvoj različnih kinetičnih

modelov, s katerimi lahko učinkovito opišemo rast mikrobov, nastajanje produktov in porabljanje

substratov med fermentacijo (Song idr., 2008). Kinetično modeliranje je nujen korak pri razvoju

fermentacijskih procesov, saj lahko modele uporabljamo za določitev optimalnih obratovalnih

pogojev proizvodnje želenega metabolita. Za kinetično modeliranje so bili uporabljeni strukturirani in

ne-strukturirani modeli. Čeprav lahko prvi razložijo kompleksne mikrobne sisteme na molekularni

ravni, so bili (praviloma) preprostejši ne-strukturirani kinetični modeli pogosteje praktično

uporabljeni (Luong idr., 1988; García-Ochoa idr., 1990). Ker so ti modeli zelo zanesljivi, jih lahko

uporabljamo za opis proizvodnih procesov pri različnih procesnih pogojih, kot so temperatura, pH,

prezračevanje, mešanje itd. Navsezadnje nam ti modeli omogočajo razumevanje, načrtovanje in

nadzor fermentacijskih procesov. Posamezne ne-strukturirane kinetične modele so uporabili za

opisovanje fermentacije glukoze v etanol, amino kisline, kot npr. citronska, mlečna, in druge vrste

organskih kislin (Roehr idr., 1981; Khan idr., 2005). Vendar pa so do danes izvedli le nekaj kinetičnih

raziskav na področju fermentacijske proizvodnje etanola, z originalnimi kefirnimi zrni, v UHT polno

mastnem kravjem mleku.

V razdelku prikazujemo pristop uporabe ne-strukturiranih matematičnih modelov za opisovanje

kinetike rasti kefirnih zrn in proizvodnje etanola med fermentacijo. V ta namen smo v RC1

reakcijskem kalorimetru (Mettler Toledo), za različne čase fermentacij, izvedli serijo 13-ih

eksperimentov. Eksperimentalne podatke smo uporabili za oceno vrednosti kinetičnih parametrov in

za potrditev veljavnosti izbranih kinetičnih modelov. Obnašanje kvasovk, ki so bistvene za

proizvodnjo etanola med fermentacijo, smo napovedali z uporabo teh modelov. Napovedane modele

smo primerjali z eksperimentalnim podatki. Fermentacijske značilnosti proizvodnje etanola, z

uporabo kefirnih zrn, smo podrobno interpretirali. Nadalje smo ovrednotili zvezo med proizvodnjo

etanola in številom kvasovk v kefirnih zrnih in kefirju. Pričakovali smo, da bodo rezultati naše študije

koristni za razumevanje proizvodnje etanola med fermentacijo kefirja. On-line koncentracijske profile

etanola smo zasledovali z uporabo in-situ FTIR spektrometra (ReactIRTMiC10).



Podrobnejši opis najdemo v poglavju 3 (podpoglavje 1.2.1).


Eksperimetne smo izvajali v avomatiziranem laboratorijskem reakcijskem kalorimetru RC1.

Koncentracijo etanola v kefirju smo tekom fermentacij beležili z ReactIRTMiC10 spektrometrom. Opis

aparatur najdemo v razdelku 1.2.2, poglavja 3.


Vsi eksperimenti, ki smo jih izvedli pri enakih procesnih pogojih in izbranih časih fermentacije, t = (0,

4, 8, 12, 16, 20, 24, 32, 40, 48, 58, 66, 72, 89) h, so potekali po enakem postopku. Najprej smo


51

reaktor napolnili z 1 L svežega, polnomastnega, UHT kravjega mleka, ki smo ga segreli na optimalno

delovno temperaturo, T = 21 °C. Po vzpostavitvi temperaturnega stacionarnega stanja, smo v mleko

cepili 42 g kefirnih zrn (KZ,0 = 42 g/L). Med fermentacijo smo fermentacijsko brozgo premešali vsako

uro za 1 min s stalno vrtilno frekvenco mešala, fm = 60 rpm. Cepljenje kefirnih zrn v mleko je

povzročilo pričetek fermentacije mleka in zniževanje njegove pH vrednosti. Po koncu vsakega

eksperimenta smo gravimetrično določili končno masno koncentracijo kefirnih zrn (KZ) in njihovo

prirast (KZ).

2.2.4 Analize

2.2.4.1 Gravimetrična določitev prirasti kefrinih zrn

Masno koncentracijo kefirnih zrn smo določili z gravimetrično metodo. Po koncu vsake fermentacije

smo kefirna zrna ločili iz fermentacijske brozge tako, da smo le-to precedili skozi plastično sito. Zrna

smo sprali z mrzlo vodo in jih posušili na papiranti krpi. Posušena zrna smo stehtali na analitski

tehnici (PG5002, Mettler Toledo International Inc., Greifensee, Švica). Prirast mase kefirnih zrn (KZ)

smo izračunali iz razlike mase zrn pred in po fermentaciji. Zrna smo nato ponovno prenesli v sveže

mleko, saj smo jih tako ohranili za izvedbo nadaljnih eksperimentov.

2.2.4.2 Dinamično merjenje masne koncentracije etanola v kefirju

Koncentracijo etanola v kefirju smo določali po postopku, opisanem v razdelku 1.2.5.1, poglavja 3.


Postopek izvedbe mikrobioloških analiz je opisan v podpoglavju 1.2.5.2, poglavja 3.

2.2.5 Kinetični modeli

2.2.5.1 Rast populacije kvasovk

Najpogosteje uporabljeni ne-strukturirani modeli za opisovanje rasti mikrobne populacije so

Monodov, logistični in Haldanov kinetični model. Logistični model se vse pogosteje uporablja za

opisovanje rasti mikrobnih populacij v številnih, raznolikih bioloških sistemih, kakor tudi za

napovedovanje inhibicije ali inaktivacije med mikrobno rastjo (Wachenheim idr., 2003). V primerjavi z

modeli, ki temeljijo na Monodovem kinetičnem modelu, logistični model, pri izračunu števila

mikroorganizmov med fermentacijo, ne upošteva porabe substrata (Pazouki idr., 2008; Mu idr., 2006;

Sharifzadeh Baei idr., 2008). Za opis rasti kefirnih zrn med fermentacijo smo uporabili logistično

enačbo:

KZ

KZ max,

KZmax

KZ

d

d

1

t (3.3)

kjer je: KZ,m maksimalna masna koncentracija kefirnih zrn (g/L),

max maksimalna specifična hitrost rasti kefirnih zrn (h1).

Upoštevali smo mejni pogoj, da je pri času t0 = 0, KZ = KZ,0. Z integriranjem en. (3.3) dobimo logistično

enačbo (en. (3.4)), ki predstavlja eksponentno in stacionarno fazo rasti kefirnih zrn:


52

t

t

max

mKZ,

KZ,0

maxKZ,0

KZ

exp

exp

11

(3.4)

Šaržni sistem je zaprt sistem, ki v fermentacijskem mediju, pri določenih okoljskih pogojih, vzdržuje

preživetje mikroorganizmov in spremembe rastnega cikla iz ene faze v drugo. Logistična enačba ne

vključuje faze odmiranja mikroorganizmov.

2.2.5.2 Proizvodnja etanola

Etanol je eden izmed pomembnih produktov fermentacije kefirja. Poleg kinetike rasti kefirnh zrn smo

želeli določiti tudi kinetični model za proizvodnjo etanola med fermentacijo. V zadnjih letih je bilo, za

različne fermentacijske biosisteme, razvitih nekaj matematičnih modelov, s katerimi lahko opišemo

rast mikrobnih populacij in proizvodnjo produktov/ko-produktov. Eden izmed pogosteje uporabljenih

modelov za opis proizvodnje produkta je modificiran, ne-strukturiran Gompertzov model. Ta enačba

je, z vidika statistične točnosti in enostavnosti uporabe, ocenjena kot najboljši model za opis

proizvodnje produktov. Je enostavna in učinkovita. Z omenjenim modelom lahko določimo trajanje

lag faze, specifično hotrost proizvodnje produkta in potencialno maksimalno koncentracijo produkta.

Modificiran Gompertzov model smo uporabili za modeliranje proizvodnje etanola med

fermentacijskim procesom (Mu idr., 2006; Van Ginkel idr., 2001):

1

(1) tt

rL

mEtOH,

mEtOH,

mEtOH,EtOH

expexpexp

(3.5)

kjer je: EtOH masna koncentracija etanola (g/L),

EtOH,m potenciala maksimalna masna koncentracija etanola (g/L),

rEtOH,m maksimalna hitrost proizvodnje etanola (g/L h),

tL lag faza ali čas do pričetka eksponentne proizvodnje etanola (h).

Testiranje logističnega in modificiranega Gompertzovega modela smo izvedli z ne-linearno regresijo

eksperimentalnih podatkov, s komercialno dostopnim računalniškim programom SigmaPlot®10.0. Za

minimiranje funkcije najmanjših kvadratov smo uporabili Levenberg-Marquadtov algoritem.

Statistični kazalec, korelacijski koeficient R2, s katerim lahko ocenimo učinkovitost regresije, smo

pridobili iz statističnih podatkov.


2.3.1 Grafična analiza rasti mikrobiote kefirnih zrn

V prvem delu raziskav smo proučevali rast kefirnih zrn med fermentacijo polnomastnega, UHT

kravjega mleka. Kinetika rasti kefirnih zrn, prikazana na sliki 3.5, opisuje zvezo med masno

koncentracijo kefirnih zrn in časom fermentacije.


53

Slika 3.5: Kinetika rasti kefirnih zrn med fermentacijo.

Na sliki 3.5 so prikazani eksperimentalni podatki in krivulja predlaganega logističnega kinetičnega

modela (en. (3.4)).

Krivulja rasti kefirnih zrn se prične s fazo hitre rasti, kjer masa kefirnih zrn narašča eksponentno. Ko

začne koncentracija hranila v mediju upadati, masa kefirnih zrn ne narašča več eksponentno. Zaradi

kopičenja maščob in ogljikovih hidratov v kefirnih zrnih se masa kefirnih zrn še naprej povečuje.

Sčasoma je doseženo stacionarno stanje. Maksimalna, eksperimentalno določena, masna

koncentracija kefirnih zrn znaša, KZ,m = 54,98 g/L. Vrednosti kinetičnih parametrov smo ocenili s

prileganjem logističnega kinetičnega modela (en. (3.4)) k eksperimentalnim podatkom. Statistični

rezultati in kinetični parametri za rast kefirnih zrn so navedeni v preglednici 3.4.

Preglednica 3.4: Rezultati prileganja logistične enačbe k eksperimentalnim podatkom.

Parameter Ocenjena vrednost S.E. R2

µmax (h–1

) 0,042 0,007

0,967 KZ,0 (g/L) 41,691 0,654

KZ,m (g/L) 55,686 0,786

Rezultati parametrične analize kažejo, da je ocenjena vrednost začetne masne koncentracije kefirnih

zrn, KZ,0 = (41,961 ± 0,654) g/L, približno enaka kot eksperimentalna, KZ,0 = 42 g/L. Za predlagani

kinetični model vrednost korelacijskega koeficienta, ki smo ga ocenili z računalniškim programom

SigmaPlot®10.0, znaša 0,967. Vrednosti eksperimentalnih in statističnih podatkov, prikazanih v

preglednici 3.4 kažejo, da lahko rast kefirnih zrn učinkovito opišemo z logističnim kinetičnim

modelom.


54

2.3.2 Analiza proizvodnje etanola

Nastajanje etanola smo med fermentacijo kefirja zasledovali z ReactIRTMiC10 spektrometrom v 5 min

časovnih intervalih. Eksperimente smo izvedli pri enakih procesnih pogojih in izbranih časih

fermentacije. 3D graf za enega od eksperimentov (eksperiment: t = 64 h) je prikazan na sliki 3.6.

Slika 3.6: Nastajanje etanola med 64 h fermentacijo.

Razlaga spektra je bila izvedena na podlagi vibracij kemijskih vezi, ki so karakteristične za nastali

primarni alkohol etanol. Med fermentacijo kefirja se povečujejo vibracije na karakteristični

alkoholni CO skupini, v območju valovne dolžine (1050–1030) cm–1.

Profil površine pika etanola na sliki 3.7a je bil konstruiran na podlagi končnih vrednosti površine pika

etanola za vsak eksperiment. Eksperimentalne podatke, prikazane na sliki 3.7b, smo izračunali s

pomočjo umeritvene krivulje (slika 3.1).

Slika 3.7: a) Površina pika etanola v odvisnosti od časa fermentacije. b) Eksperimentalni in z modificiranim

Gompertzovim modelom določeni podatki proizvodnje etanola. Reakcijski pogoji: KZ = 42 g/L, T = 21 °C, fm =

60 rpm.


55

Kinetika proizvodnje etanola med fermentacijo kefirja je prikazana na sliki 3.7b in je izražena kot

razmerje med masno koncentracijo etanola in časom fermentacije, vključujoč eksperimentalne

podatke in krivuljo modificirane Gompertzeve enačbe (en. (3.2)). Vrednosti kinetičnih parametrov za

proizvodnjo etanola med fermentacijo kefirja, ki so prikazane v preglednici 3.5, smo ocenili s

pomočjo programske opreme SigmaPlot®10.0.

Preglednica 3.5: Vrednosti kinetičnih parametrov modificiranega Gompertzovega modela za proizvodnjo

etanola med fermentacijo kefirja.

Parameter

rEtOH, m (g/L h) tL (h) EtOH,m (g/L) R

2

Vrednost 0,263 ± 0,016 13,059 ± 1,533 16,373 ± 0,929 0,991

Iz slike 3.7b je razvidno, da masna koncentracija etanola prvih 12 h fermentacije počasi narašča.

Izrazito povečanje koncentracije etanola je zaznati v območju med (12–88) h, kjer povprečna končna

vrednost etanola znaša približno EtOH = 14,6 g/L, kar je okrog 1,5 % in je v skladu z rezultati, ki so jih

objavili García Fontán idr. (2006) in Güzel Seydim idr. (2000). Določili so, da se med postopkom

fermentacije koncentracija etanola, ki je odvisna od izvora kefirnih zrn, giblje v razponu od

(0,01–2,0) % (García Fontán idr., 2006; Güzel Seydim idr., 2000).

Rezultati torej kažejo, da po 24 h fermentacije proizvodnja etanola še ni končana. Razvidno je, da se

etanol proizvaja še pri pH vrednosti fermentacijskega medija, pri kateri mlečno-kislinske bakterije

niso več aktivne. Med fermentacijo se poleg etanola sprošča tudi CO2, ki predstavlja problem pri

embaliranju izdelka. Fermentacija se namreč nadaljuje še takrat, ko je izdelek že embaliran, kar lahko

povzroči bombiranje embalaže ali celo uhajanje vsebine (Farnworth in Mainville, 2003).

Iz vrednosti korelacijskega koeficienta, R2 = 0,991, ugotovimo, da lahko proizvodnjo etanola, med

šaržno fermentacijo mleka s kefirnimi zrni, dobro opišemo z modificiranim Gompertzovim kinetičnim

modelom.

2.3.3 Mikrobiološke karakteristike

Število kvasovk je pomemben parameter, ki vpliva na hitrost nastajanja in količino proizvedenega

etanola med procesom fermentacije. V ta namen smo za vsak eksperiment določili število kvasovk v

kefirnih zrnih in kefirju. Rezultati so prikazani v preglednici 3.6.

Iz teorije je znano, da so v kefirju prisotne iste vrste mikroorganizmov, kot v kefirnih zrnih. Iz

rezultatov v preglednici 3.6 je razvidno, da število kvasovk v zrnih in kefirju med fermentacijo variira.

Preglednica 3.6: Vpliv časa fermentacije na število kvasovk v kefirju in kefirnih zrnih.

Število kvasovk (N) × 106

Čas fermentacije (h)

4 8 12 16 20 24 32 40 48 58 66 72 89

Kefir

(KE/mL) 0,13 0,26 0,30 0,53 3,5 2,5 12 9,5 4,5 14 2,6 1,8 1,9

Kefirna zrna

(KE/g) 160 39 45 220 120 41 60 81 35 64 95 45 14


56

Rezultati kažejo, da 4 h po dodatku zrn v mleko koncentracija kvasovk v mleku naraste na vrednost

okrog 105 KE/mL, kar nakazuje, da pride do prenosa kvasovk iz kefirnih zrn v mleko. Število kvasovk v

kefirju je namreč odvisno od koncentracije kvasovk v zrnih, njihovega prenosa in rasti v mleku ter

najbrž tudi od ponovne adhezije na kefirna zrna. Kinetika rasti populacije kvasovk kaže, da se

stacionarno stanje vzpostavi po 32 h fermentacije (zaradi eksperimentalne napake odstopata meritvi

pri 24 h in 48 h). Število kvasovk v stacionarem stanju doseže območje od (106–107) KE/mL. Po

doseženi maksimalni koncentraciji kvasovk v kefirju med (32–58) h (stacionarna faza), število le-teh

prične počasi upadati. Z analizo podatkov slike 3.7 in preglednice 3.6 je razvidno, da se etanol

proizvaja tekom celotne fermentacije. Po 58 h se število kvasovk v kefirju zniža na končno povprečno

koncentracijo 2,1 × 106 KE/mL.

Spreminjanje števila kvasovk v kefirnih zrnih je, zaradi simbioze z različnimi vrstami laktobacilov in

mlečnokislinskih streptokokov, sicer težje opisati z značilno krivuljo rasti, vendar opazimo logično

obnašanje. Na začetku fermentacije je večina kvasovk prisotnih v zrnih. Z rastjo in cepljenjem zrn pa

se kvasovke začnejo prenašati v kefir in s tem se njihovo število v kefirnem zrnu zmanjša. Splošno so v

kefirnem zrnu kvasovke prisotne v razponu od (108–109) KE/g, kar je več, kot v kefirju (106) KE/mL in

je v skladu z rezultati doslej objavljenih raziskav.


57

3 MATEMATIČNO MODELIRANJE PROIZVODNJE ETANOLA KOT FUNKCIJE TEMPERATURE IN

ČASA

3.1 Uvod

Dejavniki, ki vplivajo na proizvodnjo etanola med procesom fermentacije mleka s kefinimi zrni so pH

medija, začetna masna koncentracija kefirnih zrn in substratov, kemijska sestava substrata, spiranje

zrn, vrsta mleka, itd. (Güzel-Seydim ind., 2005; Shoevers in Britz, 2003; Kebede idr., 2007; Leroi in

Courcoux, 1996). Temperatura je najpomembnejši zunanji procesni dejavnik, ki zaradi direktnega

vpliva na topnost kisika in CO2 v fermentacijskem mediju in zaradi hitrosti prenosa kisika v starterski

kulturi vpliva na potek in hitrost fermentacije kefirja. S tem vpliva tudi na kinetiko rasti/odmiranja

mikrobiote kefirnih zrn in posledično na kinetiko proizvodnje aromatičnih komponent v kefirju

(Sánchez idr., 2004). Hitrost fermentacije se s povečano temperaturo (v optimalnem območju za

mikrobioto kefirnega zrna) pospeši, kar ima za posledico hitrejšo rast mikroorganizmov kefirnih zrn

ter višjo koncentracijo proizvedenih aromatičnih komponent v kefirju. Hitrost rasti mikrobiote in

hitrost proizvodnje aromatičnih komponent v kefirju je namreč pogojena s hitrostjo encimskih

reakcij. Hitrost rasti mikroorganizmov po dvigu temperature nad optimalno vrednost hitro pada

zaradi denaturacije celičnih organelov, zlasti membran.

Ker je vpliv temperature na vrednost kinetičnih parametrov alkoholne fermentacije s kefirnimi zrni še

dokaj neraziskan, smo del raziskav doktorske disertacije usmerili v to smer. Z namenom proučitve

vpliva temperature na potek fermentacije mleka s kefirnimi zrni, smo razvili matematični model za

ponazoritev vpliva temperature na prirast kefirnih zrn in proizvodnjo etanola med 24 h fermentacijo

mleka. Prav tako je bil cilj raziskav preučiti vpliv temperature na mikrobiološko sestavo kefirnih zrn in

kefirja.

Poleg tega smo odvisnost maksimalne hitrosti proizvodnje etanola, rEtOH,m, od temperature pojasnili s

superpozicijo aktivacijske energije proizvodnje etanola. Odvisnost kinetičnih koeficientov proizvodnje

etanola od temperature smo opisali z Arrheniusovo enačbo. Rezultati torej zagotavljajo boljše

razumevanje vpliva temperature na aktivnost mikrobiote kefirnih zrn, kar je bistvenega pomena za

nadaljni razvoj procesa fermentacije kefirja.



Podrobnejši opis najdemo v podpoglavju 1.2.1, poglavja 3.


Šaržne fermentacije smo izvedli v 2 L reakcijskem kalorimetru RC1 (Mettler Toledo) (Hvalec in

Goršek, 2004). Vsi eksperimenti so bili izvedeni pri enakih procesnih pogojih in izbranih reakcijskih

temperaturah, T = (15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31) °C.

Najprej smo reaktor napolnili z 1 L svežega, polnomastnega UHT mleka, ki smo ga segreli na izbrano

reakcijsko temperaturo. Po vzpostavitvi temperaturnega stacionarnega stanja smo v mleko cepili 42 g

kefirnih zrn. Med 24 h fermentacijo smo zmes mleko/kefirna zrna premešali periodično vsako uro za

1 min z vrtilno frekvenco mešala, fm = 60 rpm. Spremembe pH vrednosti kefirja smo med potekom


58

fermentacij dinamično zasledovali z integrirano standardno pH sondo. Po koncu vsakega

eksperimenta smo gravimetrično določili končno masno koncentracijo kefirnih zrn.

Za določitev aktivacijske energije proizvodnje etanola pri fermentaciji mleka s kefirnimi zrni je bilo

potrebno izvesti še štiri dodatne eksperimente pri temperaturah, T = (15, 20, 25, 30) °C.

3.2.3 Analize

3.2.3.1 Gravimetrična določitev prirasti kefirnih zrn

Prirast kefirnih zrn smo določali po postopku, opisanem v podpoglavju 2.2.4.1 tega poglavja.


Koncentracijo etanola v kefirju smo določali po postopku opisanem v podpoglavju 1.2.5.1 tega

poglavja.


Določali smo število laktobacilov, mezofilne MK koke (predvsem laktokoki) in kvasovk v kefirju in

kefirnih zrnih.

3.2.3.3.1 Priprava vzorcev

Vzorce smo pripravili po postopkih, opisanih v razdelku 1.2.5.2.1, poglavja 3.

3.2.3.3.2 Priprava gojišč

Gojišča so bila pripravljena po navodilih proizvajalcev.

Trdno gojišče Rogosa (Fluka, Chemie GmbH, Deisenhofen, Nemčija)

V 1000 mL vrele, destilirane vode smo raztopili 73 g gojišča v prahu. Raztopljenemu gojišču smo

dodali 1 mL Tween 80 (Fluka, Chemie GmbH, Deisenhofen, Nemčija). Z dodatkom 1,32 mL ledne

ocetne kisline smo pH gojišča uravnali na pH vrednost 5,5. Gojišče je selektivno za laktobacile pri (3–

4) d inkubaciji, pri 37 °C.

Trdno gojišče M-17 (Fluka, Chemie GmbH, Deisenhofen, Nemčija)

V 950 mL destilirane vode smo raztopili 50 g gojišča v prahu. Gojišče smo nato 15 min avtoklavirali pri

temperaturi 121 °C. Ohlajenemu gojišču smo dodali 50 mL, 10 % sterilne raztopine laktoze. Gojišče je

selektivno za mezofilne MK koke (predvsem laktokoke) pri (2–3) d inkubaciji, pri 28 °C.

Trdno gojišče YGC (Merck, KgaA, Dermstadt, Nemčija)

V 1000 mL destilirane vode smo raztopili 40 g gojišča v prahu. Gojišče smo nato 15 min avtoklavirali

pri temperaturi 121 °C. Gojišče je selektivno za kvasovke pri 5 d inkubaciji, pri 24 °C.

3.2.3.3.3 Določanje števila mikroorganizmov s štetjem kolonij na trdnem gojišču

Število kolonijskih enot posameznih mikrobnih združb v kefirnih zrnih in kefirju je bilo določeno v

skladu z mednarodnim IDF standardom 100B:1991. Rezultate smo izrazili kot število kolonijskih enot

na gram zrn (KE/g) oz. na mL kefirja (KE/mL).


59


3.3.1 Ovrednotenje vpliva temperature

V prvem delu raziskav smo med procesom fermentacije kefirja proučevali vpliv temperature na

prirast kefirnih zrn, proizvodnjo etanola ter mikrobiološko sestavo kefirja in kefirnih zrn. V ta namen

smo z ReactIRTMiC10 spektrometrom dinamično zasledovali spremembo koncentracije etanola med

fermentacijo. Po koncu vsake fermentecije smo določili prirast kefirnih zrn ter izvedli mikrobiološke

analize po postopkih opisanih v podpoglavju 3.2.3.3 (poglavje 3).

3.3.1.1 Analiza vpliva temperature na prirast kefirnih zrn

Za serijo fermentacij, ki smo jih izpeljali v šaržnem reaktorju, smo kot startersko kulturo uporabili

kefirna zrna z začetno masno koncentracijo, KZ,0 = 42 g/L. 24 h fermentacije smo izvedli pri izbranih

temperaturah. Eksperimentalno določene vrednosti prirasti kefirnih zrn po 24 h fermentacijah v

odvisnosti od temperature so prikazane na sliki 3.8.

Slika 3.8: Vpliv temperature na prirast kefirnih zrn.

Iz rezultatov na sliki 3.8 je razvidno, da je temperatura pomemben procesni dejavnik, saj močno

vpliva na prirast kefinih zrn. Ima namreč pozitivni linearni učinek, saj je povečanje prirasti kefirnih zrn

po 24 h sorazmereno s povišanjem temperature v območju (15–31) °C. Tako lahko razmerje med

povečanjem prirasti kefirnih zrn in temperaturo matematično opišemo z linearno enačbo:

CKZ,0KZ kTT (3.6)

kjer je: T temperatura (°C),

KZ prirast kefirnih zrn po 24 h fermentaciji pri izbrani temperaturi (g/L),

KZ,0°C prirast kefirnih zrn po 24 h pri 0 °C (g/L),


60

k konstanta, ki prikazuje spremembo prirasti kefirnih zrn na enoto temperature

(g/L °C).

S prileganjem en. (3.6) k eksperimentalnim podatkom, pri čemer smo uporabili metodo najmanjših

kvadratov, smo ocenili vrednosti parametrov KZ,0°C in k, ki veljajo v temperaturnem območju

(15–31) °C (slika 3.8).

Ocenjena vrednost za KZ,0°C znaša (-3,866 ± 1,056) g/L, in za k (0,545 ± 0,045) g/L °C. Negativna

vrednost KZ,0°C nakazuje, da začetna masna koncentracija kefirnih zrn, KZ, 0 = 42 g/L, pri temperaturi

0 °C upade za približno (3,866 ± 1,056) g/L. Za predlagano enačbo (en. (3.6)) znaša vrednost

korelacijskega koeficienta (R2), ocenjenega s komercialno dostopnim programom SigmaPlot®10.0,

0,955, kar pomeni, da zgoraj navedena linearna enačba učinkovito opiše temperaturno odvisnost

prirasti kefirnih zrn po 24 h fermentaciji znotraj temperaturnega intervala od (15–31) °C.

3.3.1.2 Masna koncentracija etanola kot funkcija časovnih in temperaturnih sprememb

Ugotovili smo, da lahko proizvodnjo etanola med procesom fermentacije kefirja opišemo z ne-

linearnim Gompertzovim modelom (poglavje 3; podpoglavje 2; en. (3.5)) (Zajšek in Goršek, 2010).

Ker so študije pokazale, da temperatura ne vpliva na EtOH,m, smo predpostavili, da je

vrednostmaksimalne masne koncentracije etanola v kefirju(EtOH, m) konstantna.

Rezultati predhodnih študij (Leroi in Courcoux, 1996; Dragone idr., 2004) kažejo, da je temperatura

pomemben procesni faktor, ki med procesom fermentacije učinkovito vpliva na proizvodnjo etanola.

Ker ima pozitivni linearni učinek (proizvodnja etanola je sorazmerna s povišanjem temperature) lahko

maksimalno hitrost proizvodnje etanola (rEtOH, m) in čas trajanja lag faze (tL) za Gompertzov model

izrazimo kot linearni funkciji temperature:

bTar mEtOH, (3.7)

eTct L (3.8)

kjer je: a konstanta (g/L h),

b konstanta (g/L h °C),

c konstanta (h),

e konstanta (h/°C).

Upoštevajoč en. (3.7) in en. (3.8) lahko EtOH,m izrazimo kot funkcijo fermentacijskega časa in

temperature. Tako lahko en. (3.5) zapišemo v naslednji obliki:

1

exp(1) expexp

mEtOH,

mEtOH,EtOH teTcTba

(3.9)

Proizvodnja etanola med 24 h fermentacijo kefirja je prikazana na sliki 3.9. Slednja prikazuje zvezo

med masno koncentracijo etanola, časom fermentacije in temperaturo, vključujoč eksperimentalne

podatke in z modelom določeno površino (en. (3.9)). Testiranje predlaganega kinetičnega modela

smo izvedli z nelinearno regresijo eksperimentalnih podatkov z računalniškim programom SigmaPlot®

10.0.


61

Slika 3.9: Koncentracija etanola kot funkcija temperature in časa fermentacije.

Iz eksperimentalnih podatkov na sliki 3.9 je razvidno, da med proizvodnjo kefirja trajanje lag faze

variira med (4–10) h, kar je posledica različnih začetnih temperatur fermentacije. Trajanje lag faze je

namreč odvisno od temperature fermentacije. Z daljšanjem fermentacijskega časa se v kefirju in zrnih

povečuje (zaradi mikrobne rasti in razmnoževanja) populacija laktoza-fermentativnih kvasovk in

posledično s tem tudi koncentracija etanola v kefirju. Povečanje hitrosti proizvodnje etanola

zasledimo pretežno med (5–24) h fermentacije.

Iz eksperimentalnih podatkov, prikazanih na sliki 3.9, je prav tako razvidno, da je ob koncu lag faze

vsebnost etanola v kefirju, proizvedenem pri temperaturah 15 °C in 17 °C, približno enaka, medtem

ko koncentracija etanola ob koncu lag faze v kefirju, proizvedenem v temperaturnem intervalu od

(19–31) °C, narašča. Podatki na sliki prikazujejo tudi, da koncentracija etanola v kefirju, proizvedenem

pri temperaturah (23, 25, 27, 29 in 31) °C, naraste od približno 0,1 g/L v lag fazi na končno vrednost

(7,2; 7,6; 8,9; 10,2 in 10,7) g/L.

Najvišja koncentracija etanola (EtOH = 10,7 g/L) je bila dosežena pri temperaturi 31 °C. Razlike v

koncentraciji etanola v kefirjih, proizvedenih pri različnih temperaturah, so posledica sprememb

velikosti in sestave populacije kvasovk v kefirnih zrnih. Vrednost koeficienta determinacije (R2) in

konstant, ocenjenih z uporabo en. (3.9), so podane v preglednici 3.7.

Preglednica 3.7: Vrednosti parametrov a, b, c, e in EtOH, m, ocenjene z modificiranim Gompertzovim modelom

(en. (3.9)).

Parameter

EtOH,m (g/L) a (g/L h) b (g/L h°C) c (h) e (h/°C) R2

Vrednost 13,425± 0,379 0,182 ± 0,025 0,025 ± 0,001 17,044 ± 0,718 0,416 ± 0,026 0,991

Relativno visoka vrednost koeficienta determinacije (R2 = 0,991) kaže, da lahko vpliv temperature in

časa fermentacije na proizvodnjo etanola s kefirnimi zrni v temperaturnem intervalu (15–31) °C in


62

času od (0–24) h uspešno opišemo z uporabo en. (3.9). Običajno se splošni in modificiran(i)

Gompertzov(i) model(i) dobro prilegajo k podatkom, ki prikazujejo proizvodnjo fermentacijskih

produktov, kot npr. v našem primeru etanol.

3.3.1.3 Grafiča analiza dinamičnih pH profilov

Na pH vrednost kefija vplivajo koncentracija etanola, CO2, mlečne, ocetne in drugih organskih kislin,

ki jih mikroorganizmi proizvajajo med procesom fermentacije (Kwak idr., 1996). Proces fermentacije,

ki je močno odvisen od temperature, se kaže v upadanju pH vrednosti kefirja. Ker med potekom

fermentacij nismo zasledovali koncentracije nastalih kislin v kefirju, smo namesto vpliva temperature

na proces fermentacije proučevali vpliv temperature na pH vrednost kefirja. Na sliki 3.10 so prikazani

dinamični pH profili 24 urne fermentacije mleka pri različnih temperaturah. Kot startersko kulturo

smo povsod uporabili enako masno koncentracijo kefirnih zrn, KZ, 0 = 42 g/L.

Slika 3.10: Vpliv temperature na pH profil 24 h fermentacije kefirja.

Pri višjih temperaturah fermentacije pH mleka hitreje upada, kar nakazuje na večjo proizvodnjo kislin,

zlasti mlečne. Med 24 h fermentacijo pH vrednost pri T = 31 °C (pH = 6,65 → 3,82) upade dva krat

hitreje kot pri T = 15 °C (pH = 6,69 → 5,24). Upad pH vrednosti kefirja je sorazmerna povišanju

temperature. Najnižja pH vrednosti kefirja je dosežena pri 31 °C, kar je posledica proteolize in

proizvodnje mlečne kisline, ki jo poroizvajajo MKB, ki se optimalno razmnožujejo in rastejo pri

temperaturi koli 30 °C.

3.3.1.4 Vpliv temperature na mikrobiološke karakteristike kefirnega zrna in kefirja

Slika 3.11 prikazuje vpliv temperature na spremembe števila kolonijskih enot posameznih mikrobnih

združb; natančneje laktobacilov, kvasovk in mezofilnih MK kokov; v kefirnem zrnu in kefirju po 24 h

fermentaciji.


63

Slika 3.11: Vpliv temperature na število mikroorganizmov v a) kefirnem zrnu in b) kefirju.

Rezultati kažejo, da se znotraj izbranega temperaturnega intervala kvasovke in laktobacili kefirnih

zrnih med fermentacijo razmnožujejo v mleku. V kefirnih zrnih je število laktobacilov dokaj

konstantno. Majhno povečanje števila laktobacilov opazimo v pri višjih temperaturah. V kefirju je

število laktobacilov višje pri temperaturah nad 26 °C in nižje pri temperaturi okoli 15 °C. Število

kvasovk v zrnih postopno naraste pri temperaturah (23–25) °C. Na osnovi tega lahko sklepamo, da

nižje temperature upočasnijo metabolizem kvasovk. Pri temperaturah višjih od 25 °C število kvasovk

v zrnih prične postopno upadati, saj se razmnoževanje kvasovk pri višjih temperaturah upočasni.

Število mezofilnih MK kokov (M-17 agar) je v kefirju in zrnih višje v temperaturnem območju med

(17–20) °C. V zrnih je maksimalno število mezofilnih (MK) kokov doseženo pri temperaturi 19 °C.

Mezofilni MK koki se pri temperaturah nižjih od 20 °C, zaradi simbioze s kvasovkami, razmnožujejo in

rastejo hitreje. Upad števila MK kokov je zaznati med (20–23) °C. Število MK kokov je pri


64

temperaturah, višjih od 23 °C, približno konstantno. Manjše število kokov je najverjetneje posledica

inhibicije MK kokov zaradi previsoke koncentracije CO2 in alkohola, ki ga med fermentacijo

proizvedejo kvasovke. Poročali so, da visoke koncenrtacije alkohola v naravno fementiranih mlečnih

izdelkih znižajo hitrost rasti MKB, med katere prištevamo tudi streptokoke (Kebede idr., 2007).

V številnih objavah poročajo o številu mikrobnih združb in specifičnih vrstah mikroorganizmov, ki so

prisotni v kefirju in kefirnih zrnih različnega geografskega porekla. Podatki o proučevanju vpliva

temperature na rast mikrobnih združb, prisotnih v kefrinih zrnih in kefirju, so skopi. Rezultati raziskav

se nanašajo predvsem na število mikroorganizmov v fermentiranih mlečnih izdelkih (končnih

izdelekih), za proizvodnjo katerih se kot starterska kultura uporabijo kefirna zrna (García Fontán idr.,

2006; Güzel-Seydim idr., 2005). Nekatere študije poročajo o vplivu fermentacijske temperature na

preživetje in rast mikrobne populacije med procesom fermentacije (Kebede idr., 2007; Torija idr.,

2003).

V kefirju in kefirnih zrnih (po 24 h fermentaciji, izvedeni pri 23 °C) je bilo število laktobacilov (Rogosa

agar) približno za 1 in 0,5 log enote nižje kot tisto, ki ga je določil Farnworth (2005). Poleg tega je bilo

število kvasovk po 24 h fermentaciji pri 23 °C višje (1,5 log enote za kefir in 0,3 log enote za kefirna

zrna) v primerjavi s tistimi, ki jih je določil isti avtor, čeprav ni natančno definiral fermentacijskih

pogojev.

3.3.2 Aktivacijska energija proizvodnje etanola

Vpliv temperature na proizvodnjo etanola s kefirnimi zrni smo proučevali z namenom določitve

kinetičnih parametrov za proizvodnjo etanola. Slika 3.12 prikazuje, za različne temperature,

eksperimentalne in z modelom določene, spremembe koncentracij etanola v kefirju med procesom

fermentacije.

Eksperimentalni podatki kažejo, da se znotraj temperaturnega območja (15–30) °C maksimalna

hitrost proizvodnje etanola, rEtOH, m, z naraščanjem temperature povečuje. Pri nižji temperaturi (15 °C)

lag faza traja približno 20 h, medtem ko se pri 30 °C skrajša na manj kot 6 h. Lag fazi sledi relativno

kratka eksponentna faza proizvodnje etanola, ki pri eksperimentih, izvedenih pri temperaturah

znotraj temperaturnega intervala (30–15) °C, traja od (2–10) h. Sledi daljša linearna faza proizvodnje

etanola, ki traja (15–80) h. Stacionarna faza proizvodnje etanola sovpada s celotno porabo substrata,

potrebno za rast kvasovk. Maksimalna koncentracija etanola je dosežena po 45 h fermentaciji pri 25

°C.


65

Slika 3.12: Primerjava med eksperimentalnimi in z Gompertzovim modelom določenimi vrednostmi masne

koncentracije etanola v odvisnosti od časa fermentacije.

Matematično smo vpliv temperature (15, 20, 25 in 30 °C) na proizvodnjo etanola med fermentacijo

mleka s kefirnimi zrni opisali z ne-strukturiranim Gompertzovim kinetičnim modelom (en. (3.5)).

Validnost modela smo preverili tako, da smo z ne-linearno regresijo predlagan kinetični model

prilegali k eksperimentalno določenim podatkom. Uporabili smo komercialno dostopni program

SigmaPlot® 10.0. Z omenjenim računalniškim programom smo ocenili vrednosti koeficienta

determinacije R2. Vrednosti R2, ki so podane v preglednici 3.8 kažejo, da se predlagani Gompertzov

kinetični model zelo dobro ujema z eksperimentalnimi podatki. Prav tako smo vpliv temperature na

vrednost bioloških parametrov (preglednica 3.7), ki so potencialna maksimalna masna koncentracija

etanola (EtOH, m), maksimalna hitrost proizvodnje etanola (rEtOH, m) in trajanje lag faze (tL), ocenili z

Gompertzovim kinetičnim modelom (en. 3.5).

Preglednica 3.8: Z Gompertzovim modelom (en. (3.5)) ocenjene vrednosti maksimalne hitrosti proizvodnje

etanola (rEtOH,m), trajanja lag faze (tL), maksimalne masne koncentracije etanola (EtOH,m) in koeficienta

determinacije (R2).

(C)Parameter

EtOH,m (g/L) rEtOH,m (g/L h) tL (h) R2

15 14,215 ± 0,246 0,163 ± 0,008 19,778 ± 2,069 0,995

20 14,092 ± 0,239 0,284 ± 0,019 14,233 ± 1,710 0,994

25 14,757 ± 0,171 0,518 ± 0,022 7,245 ± 0,615 0,997

30 13,312 ± 0,161 0,582 ± 0,022 5,918 ± 0,429 0,998

Omenjeni kinetični model lahko uspešno uporabimo za opis proizvodnje etanola med procesom

fermentacije mleka z originalnimi kefirnimi zrni. Predlagani tri-parametrični kinetični model je

enostaven in zelo uporaben (Zwietering idr., 1990).


66

Vrednosti EtOH, m za proizvodnjo etanola variirajo od (14,215 ± 0,246) g/L do (13,312 ± 0,161) g/L pri

temperaturah 15 °C in 30 °C. Statistična analiza kaže, da temperatura ne vpliva na maksimalno masno

koncentracijo etanola (preglednica 3.7).

Iz rezultatov v preglednici 3.7 je razvidno, da se z naraščanjem temperature povečuje vrednost

maksimalne hirtosti proizvodnje etanola (rEtOH, m), in sicer od (0,163 ± 0,008) g/L h do (0,582 ± 0,022)

g/L h. Najvišja vrednost rEtOH, m je dosežena pri temperaturi 30 °C. To je posledica večje aktivnosti

kvasovk zaradi optimalnejših temperatur.

Trajanje lag faze variira med (5,918 ± 0,429) h in (19,778 ± 2,069) h. Statistična analiza je pokazala, da

se trajanje lag faze pri proizvodnji etanola s kvasovkami kefinih zrn spreminja s temperaturo

fermentacije. Na osnovi ocenjenih vrednosti rEtOH, m, prikazanih v preglednici 3.7, je razvidno, da je

maksimalna hitrost proizvodnje etanola dosežena pri 30 °C. Vpliv temperature na maksimalno hitrost

proizvodnje etanola lahko ocenimo z uporabo Arrheniusove enačbe:

RTEerr p

EtOH,0mEtOH,

(3.10)

kjer je: rEtOH,m maksimalna hitrost proizvodnje etanola (g/L h),

Ep energija proizvodnje etanola (kJ/mol),

T temperatura (K),

R idealna plinska konstanta (8,314 J/mol K)

rEtOH,0 predeksponentni faktor (g/L h).

Eksperimentalnim podatkom, ki na sliki 3.13 prikazujejo maksimalno hitrost proizvodnje etanola v

odvisnosti od temperaturne, smo prilegali en. (3.10).

Slika 3.13: Arrheniusov diagram za proizvodnjo etanola s kefirnimi zrni.


67

Rezultati, doseženi z ne-linearno regresijo eksperimentalnih podatkov, so podani v preglednici 3.8,

kjer je mogoče opaziti, da je vrednost Ep v območju aktivacijskih energij za encimske reakcije, ki

znašajo Ea = (40–80) kJ/mol (Doran, 2004).

Preglednica 3.9: Aktivacijska energija in predeksponentni faktor za proizvodnjo etanola s kefirnimi zrni.

Ep(kJ/mol) rEtOH,0 (g/L h) R2

64,3 8,0 ∙ 1010

0,946

Eksponentni fazi sledi daljša, linearna proizvodnja etanola. Linearna proizvodnja metabolitov je

značilna za fermentacijske procese, nadzorovane s fizikalnimi stopnjami, zato, ker kinetiko

bioprocesov nadzoruje prenos kisika in oskrba s hranili v suspenziji celic. Linearna proizvodnja

etanola se pri eksperimentih, ki so bili izvedeni pri višjih temperaturah, prične prej kot pri

eksperimentih, izvedenih pri nižjih temperaturah; npr. pri 15 °C se linearna proizvodnja etanola

prične po 30 h, pri 30 °C pa po 10 h. Takšno obnašanje lahko pojasnimo z dejstvom, da se topnost

kisika v kulturi zmanjšuje sočasno z naraščanjem temperature. Prav tako se trajanje linearne

proizvodnje etanola z naraščanjem temperature skrajša: npr. pri 15 °C faza traja do 80 h, pri 30 °C pa

ne več kot 15 h, kar lahko pričakujemo, če imamo v mislih, da difuzijski koeficient kisika v mediju in

potemtakem koeficient prenosa kisika narašča eksponentno s temperaturo.


68

4 VPLIV ČASOVNEGA PRESLEDKA MIROVANJA MEŠALA OZ. POGOSTOSTI MEŠANJA NA

PROIZVODNJO ETANOLA IN MIKROBIOLOŠKE LASTNOSTI KEFIRNIH ZRN IN KEFIRJA

4.1 Uvod

Pri procesih fermentacije predstavlja mešanje eno izmed pomembnejših procesnih tehnik, saj v

fermentacijskem mediju omogoča doseganje čim enakomernejše porazdelitve toplote,

mikroorganizmov, substratov, produktov, kisika, CO2, itd.

Poleg tvorbe etanola, mlečne kisline in drugih komponent, spremlja procese fermentacije tudi

sproščanje CO2, ki je odgovorno za »osnovno« mešanje fermentacijske zmesi. V velikih fermentorjih

»vzpenjanje« CO2 mehurčkov proti površini fermentacijske zmesi povzroči turbulenco, ki

mikroorganizme in substrate porazdeli po mediju tako, da zagotovi homogenost zmesi. Intenzivnost

mešanja, ki ga povzročijo CO2 mehurčki, je v glavnem odvisna od velikosti fermentorja, zlasti od

njegove višine, pa tudi od prisotnih mikroorganizmov (vsi ne proizvajajo CO2).

Kadar pa želimo v nekem izbranem fermentacijskem sistemu (v našem primeru fermentacija mleka s

kefirnimi zrni) zagotoviti učinkovito mešanje izbrane fermentacijske zmesi, je poleg »osnovnega«

mešanja, ki ga povzroči sproščanje CO2, potrebno vključiti še mehanski način mešanja. Nezadostno

mešanje se običajno odraža v dveh oblikah, in sicer: (1) v slabi porazdelitvi mikroorganizmov in

substratov v mediju in posledično s tem manjši proizvodnji produktov ter (2) nizkih volumetričnih

koeficientih masnega prenosa, ki lahko močno vplivajo na reakcijsko kinetiko fermentacije.

Tako Schoevers in Britz (2003) v svoji študiji navajata, da mešanje najbrž izboljša »izmenjavo« hranil

med kefirnimi zrni in medijem (mlekom), kar pa ima za posledico aktivnejšo proizvodnjo organskih

kislin in nižjo pH vrednost kefirja. Poročata tudi, da zrna, ki so izpostavljena mešanju, vsebujejo

manjše število MKB in kvasovk.

Na vrednost kinetičnih parametrov fermentacije kefirja poleg temperature, katere vpliv smo opisali v

prejšnjem podpoglavju, vpliva tudi časovni presledek mirovanja mešala oz. v nadaljevanju pogostost

mešanja. Ker je vpliv omenjenega procesnega parametra za izbran fermentacijski sistem

(mleko/kefirna zrna) dokaj neraziskan, smo del raziskav namenili še temu področju. Z namenom, da

bi proučili vpliv pogostosti mešanja fermentacijske zmesi na potek fermentacije mleka z zrni, smo

razvili matematične zveze, s katerimi lahko uspešno opišemo vpliv pogostosti mešanja na (1) prirast

kefirnih zrn po 24 h fermentaciji, (2) koncentracijske spremembe etanola med 24 h fermentacijo, (3)

pH vrednost kefirja po 24 h fermentaciji in (4) mikrobiološko sestavo kefirnih zrn in kefirja po 24 h

fermentaciji.



Podrobnejši opis najdemo v razdelku 1.2.1 poglavja 3.


Šaržne fermentacije smo izvedli v 2 L reakcijskem kalorimetru RC1 (Mettler Toledo) (Hvalec in

Goršek, 2004). Vseh sedem eksperimentov smo izvedli pri enakih procesnih pogojih in izbranih

intervalih pogostosti mešanja feremntacijske brozge, tPM = (0, ½ , 1, 3, 6, 12) h.


69

Najprej smo reaktor napolnili z 1 L svežega, polnomastnega UHT mleka, ki smo ga segreli na

reakcijsko temperaturo, T = 21 °C. Po vzpostavitvi temperaturnega stacionarnega stanja smo v mleko

cepili 42 g kefirnih zrn. Med 24 h fermentacijo smo zmes mleko/kefirna zrna premešali v izbranih

intervalih pogostosti mešanja za 1 min z vrtilno frekvenco mešala, fm = 60 rpm. Spremembe pH

vrednosti kefirja smo med potekom fermentacij dinamično zasledovali z integrirano standardno pH

sondo. Po koncu vsakega eksperimenta smo gravimetrično določili končno masno koncentracijo

kefirnih zrn.

4.2.3 Analize


Prirast kefirnih zrn smo določali po postopku, opisanem v podpoglavju 2.2.4.1 tega poglavja.


Koncentracijo etanola v kefirju smo določali po postopku, opisanem v podpoglavju 1.2.5.1 tega

poglavja.


Določali smo laktobacile, mezofilne MK koke in kvasovke v kefirju in kefirnih zrnih. Postopek izvedbe

mikrobioloških analiz je opisan v razdelkih 1.2.5.2 in 3.2.3.3, poglavja 3.


Med 24 h procesom fermentacije kefirja smo proučevali vpliv pogostosti mešanja fermentacijske

brozge na prirast kefirnih zrn, proizvodnjo etanola, pH vrednost kefirja ter mikrobiološko sestavo

kefirja in kefirnih zrn. V ta namen smo z ReactIRTMiC10 spektrometrom dinamično zasledovali

spremembo koncentracije etanola med fermentacijo. Po koncu vsake fermentecije smo določili

prirast kefirnih zrn in kočno pH vrednost kefirja ter izvedli mikrobiološke analize po postopkih

opisanih v podpoglavju 4.2.3.3.

4.3.1 Ovrednotenje vpliva pogostosti mešanja na prirast kefirnih zrn

Pri seriji fermentacij, ki smo jih izvedli v šaržnem reaktorju, smo kot startersko kulturo uporabili

kefirna zrna z začetno masno koncentracijo, KZ,0 = 42 g/L. 24 h fermentacije smo izvedli pri

temperaturi 21 °C in izbranih intervalih pogostosti mešanja fermentacijske brozge. Eksperimentalno

določene vrednosti prirasti kefirnih zrn po 24 h fermentacijah v odvisnosti od pogostosti mešanja so

prikazane na sliki 3.14.


70

Slika 3.14: Vpliv pogostosti mešanja na prirast kefirnih zrn.

Iz rezultatov na sliki 3.14 je razvidno, da je prirast kefirnih zrn po 24 h fermentaciji močno odvisna od

pogostosti mešanja. Iz eksperimentalnih in z modelom določenih rezultatov je razvidno, da prirast

kefirnih zrn z zmanjševanjem pogostostosti mešanja fermentacijske brozge eksponentno upada. Tako

lahko razmerje med povečanjem prirasti kefirnih zrn v 24 h in pogostostjo mešanja matematično

opišemo z naslednjo matematično zvezo:

PMPM

PMKZ

ntltemekt

(3.11)

kjer je: tPM časovni presledki mirovanja mešala oz. pogostost mešanja (h)

KZ prirast kefirnih zrn po 24 h fermentaciji pri izbrani pogostosti mešanja (g/L),

k konstanta, (g/L),

l konstanta, (h–1),

m konstanta, (g/L),

n konstanta, (h–1).

Vrednosti parametrov k, l, m in n, ki veljajo pri temperaturi 21 °C (slika 3.14), smo ocenili s

prileganjem en. (3.11) k eksperimentalnim podatkom. Uporabili smo metodo najmanjših kvadratov.

Rezultati kažejo, da je prirast kefirnih zrn najnižja za eksperiment, pri katerem smo reakcijsko zmes

med 24 h fermentacijo premešali le dvakrat, in sicer po 12 h in 24 h. To je najbrž posledica nizkega

oksido-redukcijskega potenciala oz. nizke koncentracije kisika v fermentacijski brozgi. Na redoks

potencial najbolj vpliva koncentracija kisika in njegova dostopnost oz. topnost, ki pa se s pogostostjo

mešanja fermentacijske zmesi povečuje. Nekateri mikroorganizmi kefirnih zrn namreč za svojo rast in

razmnoževanje nujno potrebujejo kisik.

Za predlagano enačbo (en. 3.11) vrednost korelacijskega koeficienta (R2), ocenjenega s komercialno

dostopnim programom SigmaPlot®10.0, znaša 0,995, kar pomeni, da zgoraj navedena enačba

učinkovito opiše odvisnost prirasti kefirnih zrn (po 24 h fermentaciji) od pogostosti mešanja

fermentacijske brozge pri temperaturi 21 °C.


71

4.3.2 Masna koncentracija etanola kot funkcija pogostosti mešanja fermentacijske zmesi in časa

fermentacije

Proizvodnjo etanola med procesom fermentacije mleka s kefirnimi zrni opisuje Gompertzova enačba

(en. (3.5); stran 54).

Maksimalna masna koncentracija etanola v kefirju (EtOH,m), ki jo lahko proizvedejo kvasovke kefirnih

zrn (KZ,0 = 42 g/L) iz 46 g ogljikovih hidratov (laktoza), kolikor jih je prisotnih v 1 L polnomastnega,

svežega, kravjega mleka (Ljubljanske mlekarne d.d), je odvisna pretežno od koncentracije laktoze, ne

pa od procesnih parametrov, pri katerih izvajamo fermentacijo. Procesni parametri (temperatura,

mešanje, itd) namreč vplivajo predvsem na hitrost fermentiranja laktoze, sproščanje CO2, tvorbo

etanola in drugih organskih komponent, prisotnih v kefirju, ter na hitrost fermentacije. Zato smo

predpostavili, da je vrednostmaksimalne masne koncentracije etanola v kefirjuEtOH, m, konstantna.

Predhodne študije (Schoevers in Britz; 2003) navajajo, da mešanje med procesom fermentacije

pospeši proizvodnjo etanola med fermentacijo. Ker smo ugotovili, da z zmanjševanjem pogostostosti

mešanja fermentacijske brozge število mikroorganizmov v kefirnih zrnih (oz. prirast kefirnih zrn)

eksponentno upada, lahko maksimalno hitrost proizvodnje etanola (rEtOH, m) in lag fazo (tL) za

Gompertzov model izrazimo kot upadajoči eksponentni funkciji pogostosti mešanja (tPM):

PMPMmEtOH, exp exp jtihtgr (3.12)

PML exp otpt (3.13)

kjer je: g konstanta (g/L h),

h konstanta (h–1),

i konstanta (g/L h),

j konstanta (h–1),

p konstanta (h)

o konstanta (h–1).

Če upoštevamo en. (3.12) in en. (3.13) lahko EtOH izrazimo kot funkcijo časa fermentacije in

pogostosti mešanja fermentacijske brozge. Tako lahko en. (3.5) zapišemo v naslednji obliki:

1exp

exp(1) exp exp expexp PM

mEtOH,

PMPMmEtOH,EtOH totp

jtihtg

(3.14)

Slika 3.15 prikazuje eksperimentalne podatke in z en. (3.14) določeno površino, ki podaja zvezo med

masno koncentracijo etanola, pogostostjo mešanja fermentacijske brozge in časom fermentacije.

Testiranje predlaganega modificiranega Gompertzovega modela (en. (3.14)) smo izvedli z ne-linearno

regresijo eksperimentalnih podatkov, z računalniškim programom SigmaPlot® 10.0.


72

Slika 3.15: Vpliv pogostosti mešanja fermentacijske brozge in časa fermentacije na koncentracijo etanola v

kefirju.

Iz podatkov na sliki 3.15 je razvidno, da se dolžina lag faze z zmanjševanjem pogostosti mešanja

fermentacijske brozge podaljšuje. Za eksperimente, izvedene pri kontinuirnem mešanju brozge in

mešanju na vsake 0,5 h in 1 h, traja dolžina lag faze približno 7 h. Trajanje lag faze je za eksperiment,

pri katerem smo fermentacijsko brozgo premešali vsakih 12 h približno trikrat daljše, kot za

fermentacijo, izvedeno pri kontinuirnem mešanju. Po 24 h fermentaciji je vsebnost etanola najvišja v

kefirju, proizvedenem pri kontinuirnem mešanju, kar je rezultat povečanega prenosa hranilnih snovi

(ogljikovih hidratov) med medijem in mikroorganizmi. Najvišja koncentracija etanola (EtOH = 8,2 g/L)

je bila po 24 h dosežena pri kontinuirnem mešanju fermentacijske brozge. Podatki na sliki

prikazujejo, da koncentracija etanola (po 24 h fermentacije) v kefirju, proizvedenem pri kontinuirnem

mešanju in mešanju na vsake (0,5; 1; 3; 6 in 12) h upade s približno 8,2 g/L na (6,2; 5,4; 4,4; 2,9 in 1,0)

g/L. To je najbrž posledica (1) neenakomerne porazdelitve oglikovih hidratov v fermentacijski brozgi

in (2) temperaturnih razlik v fermentacijski brozgi, ki so odraz neenakomernega mešanja. Vrednosti

konstant in koeficienta determinacije (R2), ki smo jih ocenjenili z uporabo en. (3.14), so podane v

preglednici 3.10.

Preglednica 3.10: Vrednosti parametrov g, h, i, j, p, o in EtOH,m, ocenjene z modificiranim Gompertzovim

modelom (en. (3.14)).

Parameter Vrednost

EtOH,m (g/L) 16,850 ± 0,885

g (g/L h) 0,170 ± 0,013

h (h–1

) 1,531 ± 0,169

i (g/L h) 0,322 ± 0,013

j (h–1

) 0,025 ± 0,008

p (h) 7,733 ± 0,276

o (h–1

) – 0,098 ± 0,002

R2 0,997


73

Visoka vrednost koeficienta determinacije (R2 = 0,997) kaže, da lahko vpliv pogostosti mešanja

fermentacijske brozge in časa fermentacije na proizvodnjo etanola s kefirnimi zrni med (0–24) h

uspešno opišemo z en. (3.14).

4.3.3 Analiza vpliva pogostosti mešanja na pH vrednost kefirja po 24 h fermentaciji

Omenili smo, da Shoevers in Britz (2003) navajata, da mešanje izboljša izmenjavo hranil med

mikroorganizmi kefirnih zrn in rastnim medijem, kar ima za posledico aktivnejšo proizvodnjo

organskih kislin in nižjo pH vrednost kefirja.

Slika 3.16 prikazuje vpliv pogostosti mešanja fermentacijske zmesi na pH vrednost kefirja po 24 h

fermentaciji. Kot inokulum smo pri vseh eksperimentih uporabili enako masno koncentracijo (KZ, 0 =

42 g/L) kefirnih zrn. Vsi eksperimenti so bili izvedeni pri enaki temperaturi, in sicer 21 °C.

Slika 3.16: Vpliv pogostosti mešanja na pH profil 24 h fermentacije kefirja.

Iz eksperimentalnih podatkov na sliki 3.16 je razvidno, da se pH vrednost kefirja, dosežena ob koncu

24h fermentacije, z zmanjševanjem pogostosti mešanja fermentacijske brozge, povečuje

eksponentno. Tako lahko razmerje med pH vrednost kefirja in pogostostjo mešanja matematično

opišemo z naslednjo enačbo:

PMvteut

1h 24h,0PM pH pH (3.15)

kjer je: pH24h, 0h pH vrednost kefirja, dosežena po 24h fermentaciji, izvedeni pri

neprekinjenem mešanju fermentacijske brozge,

u konstanta (/)

v konstanta (h)


74

S prileganjem en. (3.15) k eksperimentalnim podatkom, pri čemer smo uporabili metodo najmanjših

kvadratov, smo ocenili vrednosti parametrov pH24h, 0h, u in v, ki veljajo pri temperaturi 21 °C (slika

3.16) in so prikazani v preglednici 3.11.

Preglednica 3.11: Z matematičnim modelom (en. (3.15)) ocenjene vrednosti konstant u in v ter pH vrednosti

kefirja, dosežene po 24 h fermentaciji, izvedeni pri kontinuirnem mešanju fermentacijske brozge (pH24h, 0h).

Parameter

pH24h, 0h u (/) v (h–1

) R2

Vrednost 4,175 ± 0,037 1,376 ± 0,088 0,207 ± 0,035 0,994

Iz rezultatov na sliki 3.16 je razvidno, da je ob koncu fermentacije pH vrednost kefirja, proizvedenega

pri pogostejšem mešanju, nižja, kar lahko pripišemo dejstvu, da s pogostejšim mešanjem dovedemo

do mikroorganizmov več hranil. Rezultat tega je večja proizvodnja organskih kislin, še posebej

mlečne. Med 24 h fermentacijo je hitrost upadanja pH vrednosti mleka pri temperaturi 21 °C in

kontinuirnem mešanju fermentacijske brozge (pH = 6,67 → 4,18) dva kratvečja kot pri mešanju

fermentacijske brozge na vsakih 12 h (pH = 6,67 → 5,43).

4.3.4 Vpliv pogostosti mešanja na mikrobiološke lastnosti kefirnih zrn in kefirja

Vpliv pogostosti mešanja na spremembe števila kvasovk, laktobacilov in mezofilnih MK kokov v

kefirnem zrnu in kefirju po 24 h fermentaciji prikazuje slika 3.17.

S povečevanjem pogostosti mešanja fermentacijske brozge število kvasovk (YGC agar) v kefirju počasi

narašča, kar je posledica povečane hitrosti rasti in razmnoževanja kvasovk zaradi izboljšane oskrbe s

kvasovk s hranili in vnosa kisika v fermentacijsko brozgo. Povečano rast kvasovk pri pogostejšem

mešanju in posledično s tem pri nizki pH vrednosti kefirja (okoli 4,2; slika 3.16) lahko povežemo z

dejstvom, da kvasovke v splošnem optimalno rastejo pri pH vrednosti okrog 4,0 (Rogelj, 2003).

Povečano število kvasovk pri kontinuirnem mešanju je najverjetneje tudi posledica povečanega

prenosa kvasovk iz zrn v mleko. Kontinuirno mešanje namreč povzroči razbitje kefirnih zrn na manjše

delce, kar poveča površino zrn in dodatno olajša prehod mikroorganizmov iz zrn v mleko hkrati pa so

mikroorganizmi (predvsem tisti, ki so bili v notranjosti velikih zrn) boljše oskrbljeni s hranili. Porast

števila kvasovk v kefirju je zaznati tudi v primeru, kadar fermentacijsko brozgo med 24 h fermentacijo

premešamo le dvakrat (vsakih 12 h), in sicer po 12 h in 24 h fermentacije. Ker se lahko nekatere

kvasovke razmnožujejo tudi v okolju brez kisika, menimo, da je ravno to dejstvo dokaz za povečano

število kvasovk ob zmanjšani pogostosti mešanja. Glede na pogostost mešanja se število kvasovk v

zrnih spreminja podobno kot v kefirju.

S povečevanjem pogostosti mešanja število laktobacilov v kefirnih zrnih upada, kar je posledica

razbitja zrn in prenosa mikrobiote kefirnih zrn v mleko, pa tudi neugodnega vpliva kisika, saj so

laktobacili fakultativno anaerobne oziroma mikroaerofilne bakterije. Iz rezultatov na sliki 3.17 je

razvidno, da je po 24 h fermentaciji število laktobacilov v zrnih, uporabljenih pri fermentaciji z

mešanjem na vsakih 12 h, za približno 2 log enoti višje, kot število laktobacilov v zrnih, uporabljenih

za 24 h fermentacijo s kontinuirnim mešanjem. To je lahko delno tudi posledica povečanega števila

kvasovk v kefirnih zrnih (pri manjši pogostosti mešanja). Kvasovke namreč razgradijo beljakovine in

tvorijo vitamine, potrebne za rast laktobacilov. V kefirju pa število laktobacilov s povečevanjem

pogostosti mešanja narašča, kar je nekoliko nenavadno glede na njihovo občutljivost za višje


75

koncentracije kisika. Ta pojav lahko povežemo z dejstvom, da s povečevanjem pogostosti mešanja pH

vrednost kefirja (slika 3.16) upada, kar selektivno stimulira laktobacile za katere je značilno, da bolje

rastejo pri nižjih pH vrednostih kot ostale populacije bakterij (Rogelj, 2003).

Slika 3.17: Vpliv pogostosti mešanja na število mikroorganizmov v a) kefirnem zrnu in b) kefirju.

Iz rezultatov na sliki 3.17 na moremo zaključiti, da bi sistem mešanja lahko vplival na velikost

populacije mezofilnih MK kokov.


76


77

POGLAVJE IV KEFIRAN naravni bakterijski eksopolisaharid


78


79

1 KARAKTERIZACIJA IN OPTIMIZACIJA PROIZVODNJE KEFIRANA IZ NARAVNIH KEFIRNIH ZRN

1.1 Uvod

Rezultati študij so pokazali, da je donos kefirana, ki ga sintetizirajo MKB kefirnih zrn, v

fermentacijskem mediju, kamor ga delno izločajo, izredno nizek in se giblje v redu velikosti mg/L

medija. Ker je ta naravni, bakterijski EPS široko uporaben na področju živilske, kozmetične in

farmacevtske industrije, bi ga bilo smotrno pridobivati v nekoliko večjih količinah iz kefirnih zrn.

V industrijskem merilu velja izolacija kefirana za precej težaven in drag postopek (Micheli idr., 1999).

Običajno so izolacijske metode zelo dolgotrajne in v samem postopku vključujejo tveganje za izgubo

polimera, še posebej tedaj, kadar mikroorganizmi rastejo v kompleksnem fermentacijskem mediju

(Rimada in Abraham, 2003). Zato je izbira ustrezne izolacijske metode za pridobivanje večjih količin

kakovostnega in čistega EPS bistvenega pomena.

Predhodne študije so pokazale, da je donos bakterijskih EPS močno odvisen od rastnih pogojev.

Poglavitni dejavniki, ki vplivajo na proizvodnjo kefirana so temperatura, sestava fermentacijskega

medija, vrtilna frekvenca mešala, inkubacijski čas, prisotnost rastnih faktorjev v fermentacijskem

mediju, itd. (Cerning idr., 1992; Taniguchi idr., 2001; Liu idr., 2002). Vsekakor pa je proizvodnja

kefirana močno odvisna tudi od kompleksne in zelo variabilne mikrobiote kefirnih zrn, katere sestavo

določa predvsem izvor zrn. Višji donos kefirana lahko torej dosežemo z optimiranjem rastnih pogojev.

Zato je bil glavni cilj raziskave (1) razviti enostavno in učinkovito metodo za izolacijo kefirana iz

kefirnih zrn ter določiti količino in kemijsko strukturo tega specifičnega bakterijskega EPS, (2) proučiti

vpliv časa fermentacije na prirast kefirnih zrn in na pridobitek kefirana iz zrn ter (3) optimirati

proizvodni postopek pridobivanja kefirana iz kefirnih zrn. V okvirju zastavljenega cilja (3) smo

optimirali procesne parametre (temperatura in mešanje), pri katerih smo dobili maksimalne

izkoristke pri proizvodnji kefirana iz kefirnih zrn. Za dosego postavljenega cilja smo optimirali tudi

sestavo (ogljikovi hidrati, dušikove spojine, minerali, vitamini) fermentacijskega medija (mleka).


1.2.1 Inokulum in fermentacijske medij

Podrobnejši opis najdemo v poglavju 3 (podpoglavje 1.2.1).


Podrobnejši opis najdemo v poglavju 3 (podpoglavje 1.2.2.1).

1.2.3 Postopek izvedbe eksperimentov in optimizacija proizvodnje kefirana

Eksperimentalni del raziskave je bil sestavljen iz dveh delov:

1. del: optimiranje procesnih parametrov (temperatura, mešanje) proizvodnje kefirana v kefirnih

zrnih

2. del: optimiranje sestave fermentacijskega medija (dodatek ogljikovih hidratov, dušikovih spojin,

vitaminov in mineralov) za čim višjo proizvodnjo kefirana v kefirnih zrnih

Postopek izvedbe fermentacij je bil pri vseh eksperimentih enak. Posamezni eksperiment smo izvedli

tako, da smo šaržni reaktor (RC1 reakcijski kalorimeter) najprej napolnili s svežim, polnomastnim (3,5


80

% m.m.) UHT mlekom (Ljubljanske mlekarne d.d, Ljubljana, Slovenija), ga segreli na željeno delovno

temperaturo in obogatili z dodatkom izbranih rastnih faktorjev. Po vzpostavitvi stacionarnega

temperaturnega stanja smo v medij cepili aktivna kefirna zrna z masno koncentracijo KZ,0 = 42 g/L.

Dodatek zrn je sprožil fermentacijo mleka. Med posameznim eksperimentom smo zasledovali

temperaturo in spremembo pH vrednosti mleka.

Po koncu vsakega eksperimenta smo celotno fermentacijsko brozgo iztočili iz reaktorja . Kefirna zrna

smo ločili od fermentiranega mleka s precejanjem skozi plastično cedilo, jih očistili pod tekočo, mrzlo

vodo in posušili na papirnati krpi ter določili masno koncentracijo zrn po koncu fermentacije (KZ).

Po določitvi končne masne koncentracije kefirnih zrn je sledil postopek izolacije kefirana iz kefirnih

zrn in analiza monosaharidov kefirana s kapilarno elektroforezo (poglavje 1.2.4).

1.2.3.1 Optimiranje procesnih parametrov

1.2.3.1.1 Čas inkubacije kefirnih zrn v svežem UHT mleku

V 1 L UHT švežega, kravjega mleka s 3,5 % mlečne maščobe, ki smo ga segreli na delovno

temperaturo 30 °C, smo cepili aktivna kefirna zrna z masno koncentracijo 42 g/L. Vse fermentacije

smo izvedli pri enakih procesnih pogojih (T = 30 °C, KZ, 0 = 42 g/L, V = 1 L, zmes smo premešali vsako

uro za 1 min z vrtilno frekvenco mešala fm = 60 rpm) in različnih časih fermentacije (t = (0, 5, 14, 20,

30, 40, 50, 60, 70) h). Rezultati meritev in analiz so podani v preglednici 4.1.

Preglednica 4.1: Vpliv fermentacijskega časa na prirast kefirnih zrn in donos kefirana, izoliranega iz kefirnih

zrn.

Eksperiment t (h) KZ,0 (g/L) KZ (g/L) mIZOL (g) wKEF (%) mKEF (g)

t1 0 42,0 42,0 2,5 63,7 1,6

t2 5 42,0 42,6 2,9 65,7 1,9

t3 14 42,1 48,5 2,6 62,1 1,6

t4 20 42,0 50,2 3,0 67,1 2,0

t5 30 42,0 56,3 2,6 66,6 1,7

t6 40 42,1 56,6 3,1 54,5 1,7

t7 50 42,0 55,4 2,9 67,4 1,9

t8 60 42,0 54,0 2,7 80,8 2,2

t9 70 42,1 53,3 2,8 64,0 1,8

mIZOL – masa izolata (g) wKEF – masni delež kefirana (Glc + Gal) v izolatu (%) mKEF – masa kefirana v izolatu oz. masa kefirana izolirana iz zrn (g)


81

1.2.3.1.2 Temperatura fermentacije

Na željeno delovno temperaturo segreto mleko (V =1 L) smo inokulirali z aktivnimi kefirnimi zrni z

začetno masno koncentracijo 42 g/L. Vse fermentacije smo izvedli pri enakih procesnih pogojih (t = 24

h, KZ, 0 = 42 g/L, V = 1 L, zmes smo premešali vsako uro za 1 min z vrtilno frekvenco mešala fm = 60

rpm) in različnih temperaturah (T = (25, 28, 31, 34, 37, 40, 43) °C). Rezultati meritev in analiz

prikazuje preglednica 4.2.

Preglednica 4.2: Vpliv temperature na prirast kefirnih zrn in donos kefirana.

Eksperiment T (°C) KZ,0 (g/L) KZ (g/L) mIZOL (g) wKEF (%) mKEF (g)

T1 25 42,1 49,2 2,4 57,0 1,4

T2 28 42,1 50,9 2,2 59,8 1,3

T3 31 42,0 52,5 2,1 60,5 1,3

T4 34 42,0 58,4 2,2 55,6 1,2

T5 37 42,1 60,9 2,1 40,2 0,8

T6 40 42,0 56,5 2,1 56,8 1,2

T7 43 42,0 53,3 1,9 49,1 0,9

1.2.3.1.3 Mešanje fermentacijske brozge

V 1 L mleka, segretega na temperaturo (T =25 °C), pri kateri je bil donos kefirana iz zrn največji, smo

cepili aktivna kefirna zrna z masno koncentracijo 42 g/L. Vse fermentacije smo izvedli pri enakih

procesnih pogojih (t = 24 h, T = 25 °C, KZ, 0 = 42 g/L, V = 1 L) in različnih vrtilnih frekvencah mešala,

fm = (0, 40, 80, 120, 160) rpm. Rezultati meritev in analiz so podani v preglednici 4.3.

Preglednica 4.3: Vpliv vrtilne frekvence mešala na prirast kefirnih zrn in donos kefirana.

Eksperiment fm (rpm) KZ,0 (g/L) KZ (g/L) mIZOL (g) wKEF (%) mKEF (g)

F1/1 0 42,0 43,0 2,3 51,1 1,2

F1/2 40 42,0 46,1 2,1 49,9 1,0

F1/3 80 42,1 49,2 2,2 70,2 1,6

F1/4 120 42,1 48,3 2,3 49,4 1,1

F1/5 160 42,0 45,7 2,2 56,1 1,2

1.2.3.2 Optimiranje sestave fermentacijskega medija

Dodatek ogljikovih hidratov

Najprej smo v 1 L mleka, segretega na optimalno temperaturo proizvodnje kefirana (T =25 °C),

raztopili 50 g izbranega ogljikovega hidrata (fruktoza, glukoza, saharoza, laktoza) in nato cepili aktivna

kefirna zrna z masno koncentracijo 42 g/L. Zmes smo kontinuirno mešali pri optimalni vrtilni

frekvenci mešala, fm = 80 rpm. Vse fermentacije smo izvedli pri enakih procesnih pogojih (t = 24 h, T =


82

25 °C, KZ, 0 = 42 g/L, V = 1 L, fm = 80 rpm) in enakih masnih koncentracijah različnih vrst ogljikovih

hidratov (C = 50 g/L). Rezultati meritev in analiz so podani v preglednici 4.4.

Preglednica 4.4: Vpliv dodatka različnih vrst ogljikovih hidratov na prirast kefirnih zrn in donos kefirana.

Eksperiment Ogljikov hidrat C (g/L) KZ,0 (g/L) KZ (g/L) mIZOL (g) wKEF (%) mKEF (g)

C0* / 0 42,1 49,2 2,2 70,0 1,6

C1 fruktoza 50 42,1 49,7 2,3 57,3 1,3

C2 glukoza 50 42,1 53,5 2,5 46,1 1,1

C3 saharoza 50 42,1 50,9 2,3 83,2 1,9

C4 laktoza 50 42,0 54,4 2,6 89,8 2,3

*kontrolni eksperiment brez dodanega ogljikovega hidrata

Dodatek dušikovih spojin

V 1 L mleka, segretega na optimalno temperaturo proizvodnje kefirana (T =25 °C), smo raztopili 50 g

laktoze in 5 g izbrane dušikove spojine (tripton, mesni ekstrakt, amonijev klorid, amonijev nitrat).

Fermentacijski medij smo nato cepili z 42 g aktivnih kefirnih zrn (KZ,0 = 42 g/L). Zmes smo kontinuirno

mešali pri optimalni vrtilni frekvenci mešala, fm = 80 rpm. Vse fermentacije smo izvedli pri enakih

procesnih pogojih (t = 24 h, T = 25 °C, C = 50 g/L,KZ, 0 = 42 g/L, V = 1 L, fm = 80 rpm) in enakih masnih

koncentracijah različnih vrst dušikovih spojin (N = 5 g/L). Rezultati meritev in analiz so podani v

preglednici 4.5.

Preglednica 4.5: Vpliv dodatka različnih dušikovih spojin na prirast kefirnih zrn in donos kefirana.

Eksperiment Dušikova spojina N (g/L) KZ,0 (g/L) KZ (g/L) mIZOL (g) wKEF (%) mKEF (g)

N0* / 0 42,0 50,5 2,0 45,4 0,9

N1 tripton 5 42,0 58,0 2,1 38,2 0,8

N2 mesni ekstrakt 5 42,0 55,8 2,1 37,8 0,8

N3 amonijev klorid 5 42,0 50,5 2,0 32,4 0,6

N4 amonijev nitrat 5 42,0 45,7 1,8 39,4 0,7

*kontrolni eksperiment brez dodane dušikove spojine

Dodatek vitaminov

V 1 L mleka smo raztopili 50 g laktoze in 1 g izbranega vitamina (kvasni ekstrakt, askorbinska kislina,

nikotinska kislina, tiamin) ter tako pripravljen medij segreli na 25 °C. V fermentacijski medij smo nato

cepili 42 g aktivnih kefirnih zrn (KZ,0 = 42 g/L). Zmes smo mešali pri optimalni vrtilni frekvenci mešala,

fm = 80 rpm. Vse fermentacije smo izvedli pri enakih procesnih pogojih (t = 24 h, T = 25 °C, C = 50

g/L,N = 0 g/L,KZ,0 = 42 g/L, V = 1 L, fm = 80 rpm) in enakih masnih koncentracijah različnih vrst

vitaminov (V = 1 g/L). Rezultati meritev in analiz so podani v preglednici 4.6.


83

Preglednica 4.6: Vpliv vitaminov na prirast kefirnih zrn in donos kefirana.

Eksperiment Vitamin V (g/L) KZ,0 (g/L) KZ (g/L) mIZOL (g) wKEF (%) mKEF (g)

V0* / 0 42,0 53,9 2,2 40,8 0,9

V1 kvasni ekstrakt 1 42,0 53,6 2,1 36,5 0,8

V2 askorbinska kislina 1 42,1 51,7 2,2 33,9 0,7

V3 nikotinska kislina 1 42,0 53,3 2,1 32,5 0,7

V4 tiamin 1 42,0 53,6 2,3 38,9 0,9

*kontrolni eksperiment brez dodanega vitamina

Dodatek mineralov

50 g laktoze, 1 g tiamina in 1 g izbranega minerala (KCl, CaCl2, FeCl3, MgSO4) smo raztopili v 1 L mleka,

ki smo ga segreli na 25 °C. V fermentacijski medij smo nato cepili 42 g aktivnih kefirnih zrn (KZ,0 = 42

g/L). Zmes smo mešali pri optimalni vrtilni frekvenci mešala, fm = 80 rpm. Vse fermentacije smo

izvedli pri enakih procesnih pogojih (t = 24 h, T = 25 °C, C = 50 g/L, N = 0 g/L, V = 1 g/L, KZ,0 = 42 g/L,

V = 1 L, fm = 80 rpm) in enakih masnih koncentracijah različnih vrst mineralov (M = 1 g/L). Rezultati

meritev in analiz so podani v preglednici 4.7.

Preglednica 4.7: Vpliv mineralov na prirast zrn in donos kefirana.

Eksperiment Mineral M (g/L) KZ,0 (g/L) KZ (g/L) mIZOL (g) wKEF (%) mKEF (g)

M0* / 0 42,0 53,6 2,3 59,2 1,3

M1 KCl 1 42,0 53,6 2,3 67,1 1,5

M2 CaCl2 1 42,0 50,2 2,2 64,5 1,4

M3 FeCl3 1 42,0 50,1 2,2 71,3 1,6

M4 MgSO4 1 42,0 53,2 2,2 67,1 1,4

*kontrolni eksperiment brez dodanega minerala

1.2.4 Analize


Prirast kefirnih zrn smo določali po postopku, opisanem v razdelku 2.2.4.1, poglavja 3.

1.2.4.2 Opis postopka izolacije kefirana iz kefirnih zrn

Vsebnost kefirana v kefirnih zrnih smo določili na podlagi metod, ki so jih razvili Wang idr. (2008), Lin

in Chang Chien (2007) ter Rimada in Abraham (2003). Omenjene metode smo ustrezno modificirali.

Raztapljanje eksopolisaharida vezanega v kefirnih zrnih

Zatehtano končno masno koncentracijo kefirnih zrn (KZ) smo med stalnim mešanjem (fm = 200

rpm) v 300 mL vrele destilirane vode kuhali 3 h. Vzorec smo nato ohladili na sobno

temperaturo.


84

Odstranitev celic in proteinov

K ohlajenem vzorcu (cca. 300 mL) smo dolili enak volumen (cca. 300 mL) 20 % raztopine

trikloroocetne kisline (TCA) in raztopino mešali čez noč pri vrtilni frekvenci mešala 200 rpm.

Oborjene proteine in celice smo iz vzorca odstranili s centrifugiranjem pri 11000 rpm, 20 min, 4

°C.

Oboritev eksopolisaharida iz supernatanta

K supernatantu smo dodali enak volumen ohlajenega, >99,5 % acetona (4°C) in pustili

raztopino čez noč v hladilniku (cca. 4 °C). Oborjen EPS smo iz vzorca odstranili s

centrifugiranjem pri 11000 rpm, 30 min, 4°C.

Gravimetrična določitev mase iz zrn izoliranega eksopolisaharida

Izolat (EPS) smo sušili 48 h na temperaturi 42°C. Posušen izolat smo stehtali na analitski

tehnici in dali na analizo.

1.2.4.3 Kalibracija, hidroliza in derivatizacija izoliranega EPS

Najprej smo pripravili standardne raztopine monosaharidov, in sicer D-glukoze (Glc), D-galaktoze

(Gal) in D-ksiloze (Xyl)) (Fluka, Chemie GmbH, Deisenhofen, Nemčija) s koncentracijo 1 g/L. Za

kalibracijo smo standardne raztopine redčili z Milli Q vodo. Območje kalibracije je bilo od 10 mg/L do

200 mg/L.

Približno 50 mg izolata smo razredčili s 4 mL Mili Q vode in zmes mešali 24 h. Pred hidrolizo smo

raztopino za 30 min postavili v zvočno kopel s temperaturo 40 °C.

Hidrolizo smo izvedli tako, da smo k raztopini izolata, ki smo jo 40 min segrevali v avtoklavu (CV-

EL12LGS, Certoklav) pri 120 °C, dodali 2 mL H2SO4 (c = 0,5 mol/L). Na sobno temperaturo ohlajen

hidrolizat smo razredčili na končni volumen 50 mL.

Derivatizacijo hidrolizatov smo izvedli preko reduktivne aminacije z natrijevim cianoborohidridom po

postopku, ki so ga razvili Doliška idr. (2009). Vse kemikalije, ki smo jih uporabili za pripravo

standardnih raztopin ter hidrolizo in derivatizacijo vzorcev, smo pred uporabo filtrirali skozi

injekcijske filtre (0,2 m).

1.2.4.4 Analiza monosaharidov s kapilarno elektroforezo

Podrobno obrazložitev in optimizacijo eksperimentov, izvedenih s kapilarno elektroforezo (CE)

opisujejo Dahlman idr. (2000).

Pri našem delu smo separacije izvedli z aparaturo Agilent CE3D Instrument G-1600, opremljeno z

DAD (190–600 nm). Separacije smo izvedli v boratnem pufru (c = 0,1 mol/L), pri pH = 10,5, z uporabo

30 % acetonitrila kot modifikatorja elektroosmotskega toka.

Vzorce smo hidrodinamsko injicirali pri tlaku 50 mbar za 5 s, sledila je zamašitev puferske raztopine

pri tlaku 50 mbar za 2 s. Uporabili smo napetost 25 KV, konstantno temperaturo 20 °C in UV

absorbanco 306 nm.


1.3.1 Karakterizacija vrste, števila in masnega razmerja monosaharidov v vzorcih kefirana

Za karakterizacijo in določitev vrste monosaharidov v izolatu smo uporabili kapilarno elektroforezo.

Vrhove monosaharidov smo okarakterizirali s standardno raztopino npr. glukoze in galaktoze ( = 25


85

mg/L). Koncentracijo monosaharidov v kefiranu smo določili preko umeritvene, ki smo jo pripravili

pred vsako analizo. Ksilozo s koncentracijo = 25 mg/L smo uporabili kot interni standard. Delovno

območje, ki smo ga uporabili za določitev glukoze in galaktoze v kefiranu, je bilo med (20–100) mg/L

Slika 4.1 prikazuje elektroferograme standardnih raztopin glukoze, galaktoze in ksiloze (A, B in C) z

različnimi masnimi koncentracijami, = (25, 50, 100) mg/L ter elektroferogram kefirana D.

Slika 4.1: Elektroferogrami standardnih raztopin in kefirana, pridobljenih z uporabo 0,1 M boratnega pufra in

30 % acetonitrila pri pH = 10,5. Standard A: 25 mg/L Xyl, 25 mg/L Glc in 25 mg/L Gal; Standard B: 50 mg/L Xyl,

50 mg/L Glc in 50 mg/L Gal; Standard C: 100 mg/L Xyl, 100 mg/L Glc in 100 mg/L Gal; Vzorec kefirana D: 25

mg/L Xyl dodane kot interni standard.

V vseh analiziranih vzorcih kefirana sta bili prisotni samo glukoza in galaktoza. Ksiloze in manoze

nismo zasledili v nobenem vzorcu.

1.3.2 Optimiranje procesnih parametrov

1.3.2.1 Analiza vpliva časa fermentacije na proizvodnjo kefirnih zrn in kefirana

Čas fermentacije je eden izmed kritičnih parametrov, ki vpliva na vsebnost, molsko maso in kemijsko

sestavo bakterijskega EPS.

Slika 4.2 prikazuje časovni potek rasti kefirnih zrn, spremembe pH profilov kefirja in proizvodnje

kefirana z mikrobioto kefirnih zrn v šaržnem reaktorju. Kot medij smo pri vseh eksperimentih

uporabili sveže, UHT mleko. Fermentacije smo izvedli pri temperaturi 30 °C. Iz rastne krivulje kefirnih

zrn je razvidno, da zrna rastejo vse do 30 h fermentacije. Zatem opazimo stacionarno fazo, ki traja

okrog 10 h, in sicer med (30–40) h fermentacije. Pri večini bioprocesov je opaziti hiter upad biomase

kmalu po tem, ko je dosežena maksimalna koncentracija biomase. Po 40 h fermentacije prične masa

kefirnih zrn upadati (slika 4.2). To je najbrž posledica odmiranja mikrobne populacije, ki jo sprožijo

kombinirani učinek porabe vira dušika in omejitve pri prenosu snovi zaradi povečane viskoznosti ter

10 14 18 22

t / min

A

B

C

Glc Gal

Xyl

D


86

razgradnje matriksa kefirnih zrn zaradi delovanja sproščenih proteolitičnih encimov. (Giavasis idr.,

2006).

Slika 4.2: Spremembe rasti kefirnih zrn, pH vrednosti kefirja in masnega deleža kefirana v zrnih, med

fermentacijo mleka z mešano mikrobioto kefirnih zrn, v polnomastnem kravjem mleku pri 30 °C.

Prav tako je na sliki 4.2 prikazan proces acidifikacije. pH vrednost čistega mleka pred cepljenjem

kefirnih zrn znaša okrog 6,6. Med procesom fermentacije pH vrednost postopoma upada do pričetka

faze odmiranja (40 h). Končna pH vrednost, dosežena med (40–70) h fermentacije, znaša okrog 3,6.

Eksperimentalni podatki na sliki 4.2 kažejo, da je masni delež kefirana v zrnu (wKEF/KZ), med procesom

fermentacije, približno enak in se giblje med 3,0 in 4,5 %. Vsebnost kefirana se v znih, po 60 h

fermentacije, zniža, kar je najbrž posledica prisotnosti citoplazemskih glikohidrolaz, encimov,

odgovornih za razgradnjo kefirana na osnovne monosaharide (glukoza in galaktoza) (Sutherland

1999; Rimada in Abraham, 2001).

Rezultati analiz izoliranih EPS s kapilarno elektroforezo so podani v preglednici 4.8 in kažejo, da so v

izolatih poleg glukoze in galaktoze (osnovna gradnika kefirana) prisotne še druge komponente, pri

čemer gre najverjetneje za beljakovine, maščobe, vezano vodo in pepel. Tuinier idr. (1999) namreč

navajajo, da je njihov izolat poleg 63 % EPS vseboval še 18 % beljakovin, 8 % pepela, 6 % materiala,

bogatega z mananom, in 5 % vode. Rimada in Abraham (2006) navajata, da sta iz 10 g kefirnih zrn

uspela izolirati 800 mg izolata, ki je vseboval (38 ± 4) % čistega (99 %) EPS.

Glede na to, da sta v izolatih, od monosaharidov, prisotni le glukoza in galaktoza (osnovna gradnika

kefirana), se masni delež kefirana v izolatih giblje od 54,6 % do 80,7 %. Povprečno masno razmerje

med glukozo in galaktozo (ζGlc/Gal), ki sta osnovni strukturni enoti kefirana, znaša približno 1 : 1,7.


87

Preglednica 4.8: Določitev razmerja masnega deleža glukoze (wGlc) in galaktoze (wGal) v izolatu iz zrn in njuno

masno razmerje (ζGlc/Gal).

t (h)

0 5 14 20 30 40 50 60 70

wGlc (%) 23,4 24,7 21,0 25,2 23,5 19,2 23,0 34,9 22,4 wGal (%) 40,3 41,1 41,1 41,9 43,1 35,4 44,4 45,8 41,6 ζGlc/Gal 1 : 1,7 1 : 1,7 1 : 2 1 : 1,7 1 : 1,8 1 : 1,8 1 : 1,9 1 : 1,3 1 : 1,9

wGlc – masni delež glukoze v izolatu (%); wGal – masni delež galaktoze v izolatu (%); ζGlc/Gal – masno razmerje med glukozo in galaktozo v kefiranu

V literaturi je sicer navedeno, da je masno razmerje med glukozo in galaktozo v kefiranu običajno 1 :

1. Nedvomno je razmerje med glukozo in galaktozo v tem kompleksnem bakterijskem EPS odvisno od

MKB, prisotnih v kefirnem zrnu. Frengova idr. (2002) poročajo, da bakterijska vrsta Lactobacillus

helveticus sintetizira EPS z razmerjem glukoza : galaktoza = 2 : 1, bakterija Lactobacillus bulgaricus pa

z razmerjem (1 : 0,91)–(1 : 0,98). De Vuyst idr. (1998) so proučevali sestavo EPS, ki jih sintetizirajo

sevi bakterije Streptococcus thermophilus. Sevi Streptococcus thermophilus 480, Streptococcus

thermophilus BTC in Streptococcus thermophilus Sfi20 so sintetizirali EPS z razmerjem glukoza:

galaktoza = 1 : 3, sev Streptococcus thermophilus LY03 pa z razmerjem 1 : 4. Lin in Chang Chien

(2007) navajata, da se masno razmerje med monosaharidi v EPS, ki ga sintetizira Lactobacillus

delbrueckii ssp. bulgaricus CNRZ 1187 med procesom fermentacije spreminja. Nasprotno pa med

šaržnim procesom fermentacije masno razmerje med monosaharidi v EPS, ki ga sintetizira sev

Streptococcus thermophilus LY03, ostaja nespremenjeno.

1.3.2.2 Proizvodnja zrn in kefirana pri različnih temperaturah

Da bi proučili vpliv fermentacijske temperature na prirast kefirnih zrn in vsebnost kefirana v zrnih,

smo 42 g aktivnih kefirnih zrn 24 h inkubirali v 1 L svežega, polnomastnega kravjega mleka pri

temperaturah znotraj izbranega temperaturnega intervala od (25–43) °C, kjer optimalno delujejo vsi

mikroorganizmi kefirnih zrn (streptokoki, kvasovke, laktobacili, laktokoki). Vpliv temperature na

prirast zrn in masni delež kefirana v zrnu po 24 h fermentaciji prikazuje slika 4.3.

Iz eksperimentalnih rezultatov (slika 4.3) je razvidno, da znotraj temperaturnega intervala (25–37) °C

prirast zrn s povečevanjem temperature narašča, kar je posledica razmnoževanja mikrobiote kefirnih

zrn. Maksimalna prirast zrn, KZ = 18,8 g/L, je dosežena pri 37 °C. V temperaturnem območju (37–

43) °C pa prirast zrn po 24 h fermentaciji prične upadati in pri temperaturi 43 °C znaša 11,2 g/L.

Minimalna prirast zrn je dosežena pri temperaturi 25 °C in znaša 7,2 g/L.


88

Slika 4.3: Vpliv temperature na prirast kefirnih zrn in masni delež kefirana v kefirnem zrnu po 24 h

fermentaciji.

Nasprotno, masni delež kefirana v zrnu z naraščanjem temperature znotraj izbranega

temperaturnega intervala, od (25–37) °C, upada. Vsebnost kefirana se v zrnu giblje med 1,4 % in 2,8

%. Rezultati na sliki 4.3 kažejo, da je pri optimalni temperaturi rasti in razmnoževanja kefirne

mikrobiote (T = 37 °C) proizvodnja kefirana minimalna. Možno je, da se z naraščanjem temperature

kefiran v zrnih raztaplja in prehaja v fermentacijski medij (mleko). Slednje bi lahko potrdili na osnovi

rezultatov raziskave, ki sta jo opravila Rimada in Abraham (2001). Proučila sta vpliv temperature na

proizvodnjo kefirana s kefirnimi zrni, pri čemer sta kot fermentacijski medij uporabila sirotko. Za

razliko od naših raziskav, sta kefiran izolirala iz sirotke. Poročata, da sta donos kefirana v mediju in

zmanjšanje prirasti kefirnih zrn najvišja pri temperaturi T = 43 °C. Na osnovi njunih rezultatov lahko

sklepalmo, da je kefiran zaradi visoke temperature hitreje prehajal v sirotko.

Iz eksperimentalnih podatkov na sliki 4.3 je razvidno, da je masni delež kefirana v zrnu (wKEF/KZ = 2,8

%) največji pri temperaturi 25 °C. Tako smo določili optimalno temperaturo proizvodnje kefirana iz

kefirnih zrn, T = 25 °C. Predvidevamo, da je proizvodnja kefirana pri neoptimalni temperaturi rasti in

razmnoževanja mikrobiote kefirnih zrn (T = 25 °C) večja, kot pa pri optimalni temperaturi predvsem

zaradi tega, ker se mikroorganizmi pred vplivi okolja zavarujejo tako, da povečajo proizvodnjo

kefirana. Možno je tudi, da se z naraščanjem temperature vsebnost kefirana (glede na trend prirasti

kefirnih zrn) ne povečuje, ampak se namnoži le mikroflora kefirnih zrn na račun česar se poveča

prirast zrn. Eno izmed možnih razlag sta podala tudi Vuyst in Degeest (1999), v kateri navajata, da

počasi rastoče celice veliko počasneje biosintetizirajo polimere za izgradnjo celične stene, zato je za

biosintezo EPS na voljo več izoprenoidnih lipidov, kateri služijo kot transportne molekule.

Lastnosti bakterijskega seva, procesni pogoji in vrsta vira ogljika so poglavitni dejavniki, ki vplivajo na

sestavo EPS, ki jih proizvajajo posamezne vrste MKB (Celik idr., 2008). Monosaharidno sestavo

vzorcev kefirana, ki so bili proizvedeni pri različnih temperaturah znotraj izbranega temperaturnega

intervala, (25–43) °C, z mešano, naravno mikrobioto kefirnih zrn v mleku, ki kot edini vir ogljika

vsebuje laktozo, smo po kislinski hidrolizi in derivatizaciji analizirali s kapilarno elektroforezo.


89

Rezultati so podani v preglednici 4.9. V preglednici so za posamezne temperature podane tudi

začetne in končne pH vrednosti fermentacijske brozge.

Preglednica 4.9: Vpliv temperature na pH vrednost kefirja in monosaharidno sestavo kefirana, izoliranega iz

kefirnih zrn po 24 h fermentaciji.

Eksperiment T (°C) wGlc (%) wGal (%) ζGlc/Gal pH

začetni končni

T1 25 24,6 32,3 1 : 1,3 6,6 4,5

T2 28 23,9 35,9 1 : 1,5 6,6 4,4

T3 31 24,6 35,9 1 : 1,5 6,7 4,0

T4 34 22,8 32,8 1 : 1,4 6,7 3,8

T5 37 21,0 29,5 1 : 1,4 6,7 3,8

T6 40 22,7 34,0 1 : 1,5 6,7 3,6

T7 43 21,2 27,9 1 : 1,3 6,7 3,6

Iz rezultatov, prikazanih v preglednici 4.9 je razvidno, da je kefiran zgrajen iz glukoze in galaktoze.

Frengova idr. (2002) navajajo, da laktobacili sintetizirajo biopolimere, ki so zgrajeni iz glukoze in

galaktoze. Rezultati v preglednici 4.9 kažejo, da je vsebnost glukoze ((21,0–24,6) %) v kefiranu nižja

od vsebnosti galaktoze ((27, 9–34,9) %). Največi delež glukoze je vseboval kefiran, proizveden pri 25

°C. Povprečno masno razmerje med glukozo in galaktozo je v kefiranu, proizvedenem pri različnih

temperaturah, približno 1 : 1,4. Frengova idr. (2002) ter Liu idr. (2002) navajajo, da se monosaharidna

sestava kefirana, priozvedenega z bakterijskimi sevi, izoliranimi iz kefirnih zrn različnih geografskih

območij, med seboj precej razlikuje.

1.3.2.3 Grafična analiza vpliva mešanja na proizvodnjo kefirnih zrn in kefirana

Mešanje v fermentorju zagotavlja homogenost fermentacijske zmesi in izenačitev temperature v

reaktorju. V primeru, da mešanje zmesi ni intenzivno, lahko v posameznih delih fermentorja pride do

različnega odvijanja fermentacije, temperaturnih nihanj in razlik v pH vrednosti fermentacijske zmesi.

Da bi proučili vpliv mešanja na proces fermentacije mleka s kefirnimi zrni, smo proučili vpliv vrtilne

frekvence mešala na prirast kefirnih zrn in donos kefirana iz zrn.

Po postopku, opisanem v razdelku 1.2.3.1.3 smo pri T = 25 °C izvedli serijo 24 h fermentacij, katerih

rezultati so prikazani na sliki 4.4. Proučili smo vpliv vrtilne frekvence mešala, fm, na: (1) prirast kefirnih

zrn (KZ), (2) masni delež kefirana v zrnih (wKEF/KZ) in (3) masno razmerje med glukozo in galaktozo

(ζGlc/Gal) v kefiranu. Rezultati meritev in analiz so prikazani na sliki 4.4 in v preglednici 4.10.

Iz eksperimentalnih podatkov, prikazanih na sliki 4.4, je razvidno, da povečanje vrtilne frekvence

mešala (fm), znotraj intervala fm = (0–80) rpm, pospeši rast kefirnih zrn, kar je najbrž posledica

povečanega celotnega masnega prenosa snovi. Maksimalna prirast zrn, KZ = 7,1 g/L, je dosežena pri

vrtilni frekvenci mešala, fm =80 rpm. Pri tej vrtilni frekvenci mešala se mikrobiota kefirnih zrn

razmnožuje in raste optimalno, saj kontinuirno mešanje mikroorganizmom omogoča enakomeren

dostop do hranil. Majhna prirast zrn je pri fm = 0 rpm posledica posedanja in mirovanja zrn na dnu

reaktorja, kar mikrobioti zrn onemogoči enakomeren dostop do hranil. Znotraj intervala fm = (80–


90

160) rpm prične prirast zrn upadati in pri fm = 160 rpm doseže vrednost KZ = 3,7 g/L. Upadanje

prirasti zrn je pri visokih vrtilnih frekvencah mešala posledica močnega razbitja zrn.

Slika 4.4: Vpliv vrtilne frekvence mešala na prirast kefirnih zrn in masni delež kefirana v kefirnem zrnu po 24

h fermentaciji, izvedeni pri temperaturi 25 °C.

Rdeča krivulja na sliki 4.4 prikazuje vpliv vrtilne frekvence mešala (fm) na masni delež kefirana v

kefirnem zrnu (wKEF/KZ) po 24 h fermentaciji. Razvidno je, da povečanje vrtilne frekvence mešala v

intervalu od (0–80) rpm, zaradi razbitja zrn in posledično s tem izboljšane oskrbe mikroorganizmov s

hranili, pospeši proizvodnjo kefirana oz. vpliva na povečanje masnega deleža kefirana v zrnih. Masni

delež kefirana je v zrnih, ki smo jih uporabili za izvedbo eksperimenta brez mešanja (F1/1; fm = 0

rpm), za približno 0,4 % višji kot v zrnih, uporabljenih pri eksperimentu, pri katerem smo

fermentacijsko brozgo mešali z vrtilno frekvenco mešala 40 rpm (F1/2). Rezultati v preglednici 4.10

prikazujejo vpliv vrtilne frekvence mešala na monosaharidno sestavo kefirana, masno razmerje med

posameznimi monosaharidi ter začetno in končno pH vrednost kefirja.

Preglednica 4.10: Vpliv vrtilne frekvence mešala na pH vrednost kefirja in monosaharidno sestavo kefirana,

izoliranega iz kefirnih zrn po 24 h fermentaciji.

Eksperiment fm (rpm) wGlc (%) wGal (%) ζGlc/Gal pH

začetni končni

F1/1 0 28,1 23,1 1 : 0,8 6,8 5,8

F1/2 40 27,0 23,0 1 : 0,8 6,8 4,2

F1/3 80 40,3 29,9 1 : 0,7 6,8 4,2

F1/4 120 26,6 22,8 1 : 0,9 6,8 4,2

F1/5 160 30,7 25,4 1 : 0,8 6,8 4,1


91

Iz rezultatov, prikazanih v preglednici 4.10, je razvidno, da se masna deleža glukoze in galaktoze v

izolatih gibljeta med (26,6–40,3) % in (22,8–29,9) %. Povprečna masna deleža glukoze in galaktoze v

izolatih znašata 30,5 % in 24,8 %. Ostalo najbrž predstavljajo beljakovine, maščobe, vezana voda, itd.

Povprečno masno razmerje med glukozo in galaktozo v kefiranu, proizvedenem pri različnih

frekvencah mešala, znaša približno 1 : 0,8.

1.3.3 Optimiranje sestave fermentacijskega medija

Ker smo želeli poiskati najprimernejši vir ogljika za proizvodnjo kefirana s kefirnimi zrni, smo 42 g

kefirnih zrn, pri predhodno določenih optimalnih pogojih proizvodnje kefirana (T = 25 °C, fm = 80

rpm), 24 h kultivirali v 1 L svežega, UHT mleka, obogatenega s 50 g/L izbranega ogljikovega hidrata.

Kot vir ogljika smo uporabili dva izbrana monosaharida (glukoza in fruktoza) in disaharida (saharoza

in laktoza). Za vsak eksperiment smo določili 24 h prirast zrn (KZ), masni delež kefirana v zrnih (wKEF/KZ)

in masno razmerje med glukozo in galaktozo v EPS, izoliranem iz zrn (ζGlc/Gal). Rezultati analiz so

prikazani na sliki 4.5 in v preglednici 4.11.

Slika 4.5: Vpliv dodatka ogljikovih hidratov na prirast kefirnih zrn in masni delež kefirana v zrnu.

Preglednica 4.11: Vpliv dodatka ogljikovih hidratov na začetno in končno pH vrednost kefirja in


Eksperiment Ogljikov hidrat wGlc (%) wGal (%) ζGlc/Gal pH

začetni končni

C0 / 40,3 29,9 1 : 0,7 6,8 4,2

C1 fruktoza 28,1 29,2 1 : 1 6,6 3,8

C2 glukoza 25,3 20,8 1 : 0,8 6,6 3,8

C3 saharoza 41,7 41,5 1 : 1 6,6 3,8

C4 laktoza 41,6 48,3 1 : 1,1 6,6 3,7


92

Iz rezultatov, prikazanih na sliki 4.5 je razvidno, da je po 24 h fermentaciji prirast kefirnih zrn najvišja

v primeru dodatka laktoze (KZ = 12,4 g/L), sledijo dodatek glukoze (KZ = 11,3 g/L), saharoze (KZ =

8,8 g/L) in fruktoze (KZ = 7,6 g/L). V primeru dodatka glukoze in fruktoze znaša masni delež kefirana

v zrnih wKEF/KZ = 2,1 % in wKEF/KZ = 2,7 %. Donos kefirana iz zrn je najvišji v primeru uporabe obeh vrst

disaharidov (saharoza, laktoza) in v povprečju znaša 4,0 %. Vsebnost kefirana je v zrnih, s katerimi

smo fermentirali mleko, obogateno z laktozo in saharozo, za 1,2 % in 0,6 % višja kot v zrnih, ki smo jih

uporabili za fermentiranje mleka brez dodanega oglikovega hidrata. Rezultati kažejo, da sta prirast

zrn in masni delež kefirana v zrnih najvišja v primeru dodatka laktoze. Verjetna razlaga za to je, da

laktoza selektivno stimulira razmnoževanje bakterij, ki tvorijo kefiran.

Dejstvo je, da (65–80) % miktobiote kefinih zrn predstavljajo bakterije rodu Lactobacillus (Witthuhn

idr., 2005), katerih osnovni vir pridobivanja energije je laktoza. Katabolizem laktoze se prične z

razpadom disaharida na osnovna monosaharida, glukozo in galaktozo. Oba monosaharida pa

sodelujeta pri nadaljni sintezi ATP, nastajanu biomase in biosintezi EPS. Potek porabe laktoze,

glukoze in galaktoze za sintezo EPS-a prikazuje slika 4.6 (Welman in Madox, 2003).

Slika 4.6: Potek pretvorbe laktoze, glukoze in galaktoze do EPS-ja pri MKB.

Literaturni podatki v zvezi z vplivom ogljikovih hidratov na donos kefirana iz kefirnih zrn so precej

skopi. Wang in Bi (2008) sta sicer proučila vpliv dodatka različnih oglikovih hidratov ( = 100 g/L) na

proizvodnjo kefirana v modificiranem MRSL mediju z bakterijo Lactobacillus kefiranofaciens

JCM6985. V rezultatih raziskave navajata, da je masna koncentracija bakterij v mediju najvišja v

primeru dodatka maltoze, sledijo dodatek saharoze, laktoze, glukoze in fruktoze. Prav tako je bila ob


93

koncu fermentacije masna koncentracija kefirana v mediju najvišja v primeru dodatka maltoze, sledili

so dodatek laktoze, glukoze, saharoze in fruktoze. Visoka masna koncentracija oz. masni delež

kefirana v fermentacijskem mediju (oz. v našem primeru v kefirnih zrnih), obogatenem z laktozo, je

najbrž posledica tega, da MKB galaktozo, ki nastane pri hidrolizi laktoze, porabljajo za biosintezo

kefirana. V eni izmed študij so Harta idr. (2004) proučevali vpliv dodatka različnih monosaharidov

(glukoza, fruktoza), disaharidov (saharoza, laktoza in maltoza) in njihovih mešanic, na proizvodnjo

kefirnih zrn. Ugotovili so, da dodatek ogljikovih hidratov močno poveča prirast kefirnih zrn. 24 h

fermentacije so izvajali pri 30 °C. Pri vseh fermentacijah so uporabili sintetični fermentacijski medij (V

= 1 L), ki so ga cepili s kefinimi zrni (KZ,0 = 5 g/L). Ugotovili so, da je proizvodnja zrn po 24 h

fermentaciji največja pri dodatku fruktoze (20,75 g), sledijo saharoza (19,75 g), glukoza (17,50 g),

laktoza (13,87 g) in maltoza (6,37 g). V primeru uporabe mešanic pa je največji prirast dala mešanica

glukoze in saharoze v razmerju 1 : 3 (Harta idr., 2004). Odstopanje med rezultati podobnih raziskav, ki

so jih opravile različne raziskovalne skupine, je zagotovo odvisno predvsem od mikrobiološke sestave

in izvora zrn, aktivnosti kefirnih zrn, kemijske sestave sintetičnega medija, kemijske sestave in vrste

mleka, v veliki meri pa tudi samih eksperimentalnih pogojev.

Rezultati v preglednici 4.11 kažejo, da masni delež kefirana v izolatu, pri dodatku laktoze, znaša 89,9

%. Pri dodatku laktoze je povprečno masno razmerje med glukozo in galaktozo v kefiranu 1 : 1,1.

Masno razmerje med glukozo in galaktozo v primeru dodatka fruktoze in saharoze znaša 1 : 1, kar je v

skladu s podatki, objavljenimi v literaturi (Farnworth, 2005; Sarkar, 2008). Wang in Bi (2008) v svoji

študiji poročata, da je razmerje med glukozo in galaktozo v kefiranu, ki ga v sintetičnem MRLS mediju,

obogatemen s 100 g/L laktoze, proizvaja sev Lactobacillus kefiranofaciens JCM6985, 1 : 4. Navajata

tudi, da je razmerje med glukozo in galaktozo v kefiranu odvisno od koncentracije in vrste dodanega

oglikovega hidrata.

Poleg virov ogljika smo proučevali tudi vpliv dodatka virov dušika na rast kefirnih zrn in proizvodnjo

kefirana. Eksperimente smo izvedli tako, da smo 42 g aktivnih kefirnih zrn 24 h kultivirali v 1 L svežega

kravjega mleka (3,5 % m.m.), obogatenega s 50 g/L laktoze in 5 g/L izbrane dušikove spojine. Proučili

smo vpliv dodatka dveh organskih (tripton in mesni ekstrakt) in dveh anorganskih dušikovih spojin

(amonijev nitrat in amonijev klorid) na 24 h prirast zrn (KZ), masni delež kefirana v zrnih (wKEF/KZ) in

masno razmerje med glukozo in galaktozo v kefiranu, izoliranem iz zrn (ζGlc/Gal). Kontrolni eksperiment

N0 je bil izveden brez dodatka izbrane dušikove spojine. Rezultati meritev in analiz so prikazani na

sliki 4.7 in v preglednici 4.12.


94

Slika 4.7: Vpliv dodatka dušikovih spojin na prirast kefirnih zrn in masni delež kefirana v zrnu.

Preglednica 4.12: Vpliv dodatka dušikovih spojin na začetno in končno pH vrednost kefirja in monosaharidno

sestavo kefirana, izoliranega iz zrn po 24 h fermentaciji.

Eksperiment Dušikova spojina wGlc (%) wGal (%) ζGlc/Gal pH

začetni končni

N0 / 22,5 22,9 1 : 0,8 6,7 4,0

N1 tripton 20,2 17,9 1 : 0,9 6,7 3,9

N2 mesni ekstrakt 21,7 16,1 1 : 0,7 6,7 3,8

N3 amonijev klorid 18,4 13,9 1 : 0,8 6,6 4,0

N4 amonijev nitrat 21,1 18,8 1 : 0,9 6,5 4,1

Iz rezultatov na sliki 4.7 je razvidno, da je prirast kefirnih zrn po 24 h fermentaciji najvišja pri dodatku

organskih dušikovih spojin in sicer triptona (KZ = 16,0 g/L) in mesnega ekstrakta (KZ = 13,8 g/L). V

primeru dodatka organskih dušikovih spojin smo, glede na eksperiment C4 (dodatek laktoze),

pričakovali povišanje prirasti kefirnih zrn, saj se obe izbrani dušikovi spojini pogosto uporabljata kot

hranilni dodatek pri pripravi mikrobioloških gojišč. Pri dodatku obeh anorganskih dušikovih spojin se

je prirast kefirnih zrn zmanjšala. Tako je pri dodatku amonijevega klorida znašala 8,5 g/L, pri dodatku

amonijevega nitrata pa 3,7 g/L. Li idr. (2010) poročajo, da mikrobne celice organske dušikove spojine

absorbirajo lažje kot anorganske, kar se posledično odraža v višji prirasti biomase.

Wang in Bi (2008) sta v svoji študiji preučila vpliv dodatka različnih dušikovih spojin na rast bakterije

Lactobacillus kefiranofaciens JCM6985 in proizvodnjo kefirana v modificiranem MRSL mediju.

Rezultati so pokazali, da je bila ob koncu fermentacije masna koncentracija bakterij v mediju najvišja

pri dodatku kvasa v prahu ((22,12 ± 0,7) g/L), sledili so dodatek kazeina ((21,04 ± 0,3) g/L), peptona

((19,76 ± 0,4) g/L), kvasnega ekstrakta ((18,88 ± 0,3) g/L) in triptona ((17,64 ± 0,5) g/L). Masna

koncentracija bakterije v mediju je bila nekoliko nižja pri dodatku anorganskih dušikovih spojin in


95

sicer sečnine ((15,30 ± 0,4) g/L), amonijevega klorida ((14,70 ± 0,6) g/L) in amonijevega sulfata

((14,30 ± 0,3) g/L).

Pričakovali smo, da bo dodatek dušikovih spojin povečal donos kefirana iz zrn, vendar se je izkazalo

nasprotno. Iz rezultatov na sliki 4.7 je razvidno, da dodatek organskih in anorganskih dušikovih spojin,

glede na eksperiment C4 (dodatek laktoze), kjer je bil masni delež kefirana v zrnu najvišji, ni povečal

donosa kefirana iz zrn. Če primerjamo rezultate eksperimenta C4 in N0 bi pričakovali, da bodo

rezultati dokaj podobni, saj sta bila eksperimenta izvedena pri enakih procesnih pogojih. Variabilnost

rezultatov obeh eksperimentov (C4 in N0) kaže na veliko mikrobiološko variabilnost fermentacijskega

sistema, ki je najbrž vzrok za takšne rezultate. Vpliv na rezultate ima zagotovo tudi sestava mleka, ki

se je, tekom izvedbe eksperimentov, najverjetneje tudi malo spreminjala, kar se odraža v začetnih pH

vrednostih medija. Glede na eksperiment C4 je masni delež kefirana v zrnih, pri eksperimentih N1–

N4, precej nižji in se giblje med 1,3 % in 1,6 %. Rezultati kažejo (slika 4.7), da je povprečni donos

kefirana pri dodatku anorganskih in organskih dušikovih spojin približno enak in znaša wKEF/KZ = 1,4 %.

Malo je literaturnih podatkov v zvezi s proučevanjem vpliva dušikovih spojin na donos kefirana iz

kefirnih zrn. Wang in Bi (2008) navajata, da je donos kefirana najvišji pri dodatku kazeina ((1,78 ±

0,08) g/L), sledijo dodatek peptona ((1,65 ± 0,1) g/L), triptona ((1,64 ± 0,11) g/L), kvasnega ekstrakta

((1,64 ± 0,06) g/L) in kvasa v prahu ((1,48 ± 0,11) g/L). Nekoliko nižji donos kefirana sta zasledila pri

dodatku anorganskih dušikovih spojin in sicer sečnine ((0,89 ± 0,004) g/L), amonijevega klorida ((0,73

± 0,005) g/L) in amonijevega sulfata ((0,69 ± 0,006) g/L). Razlike med rezultati naše študije in študije

Wang-a in Bi-ja (2008) so bile pričakovane, saj je mikrobiota kefirnih zrn, s katerimi smo izvedli

fermentacije, kompleksnejša od izoliranega seva Lactobacillus kefiranofaciens JCM6985, ki sta ga

Wang in Bi (2008) uporabila pri svoji študiji.

Rezultati v preglednici 4.12 kažejo, da se pri dodatku dušikovih spojin delež kefirana v izolatu giblje

med 32,4 % in 45,4 %. Preostanek v izolatu predstavljajo najverjetneje vezana voda, beljakovine,

maščobe, itd. Masna deleža glukoze in galaktoze se v izolatu gibljeta v območju med (18,4–24,5) % in

(13,9–20,9) %. Povprečno masno razmerje me glukozo in galaktozo v kefiranu, izoliranem iz zrn,

uporabljenih pri fermentaciji mleka, obogatenega z izbranimi dušikovimi spojinami znaša okrog 1 :

0,8.

Čeprav prisotnost vitaminov običajno vpliva na hitrost biosinteze številnih metabolitov, je bil vpliv, ki

ga imajo vitamini na rast kefirnih zrn in proizvodnjo kefirana, do danes vseeno slabo raziskan. Pri

optimiranju sestave fermentacijskega medija smo poleg virov ogljika in dušika proučili tudi vpliv

vitaminov na: (1) 24 h prirast kefirnih zrn (KZ), (2) masni delež kefirana v zrnih (wKEF/KZ) in (3) masno

razmerje med glukozo in galaktozo v kefiranu, izoliranem iz zrn (ζGlc/Gal). Izvedli smo serijo petih

eksperimentov, kjer smo 42 g kefirnih zrn, pri predhodno določenih optimalnih pogojih proizvodnje

kefirana iz kefirnih zrn (T = 25 °C, fm = 80 rpm, LAK = 50 g/L, brez dodatka dušikove spojine), 24 h

kultivirali v 1 L svežega kravjega mleka, obogatenega z 1 g/L izbranega vitamina. Izbrali smo naslednje

vitamine: kvasni ekstrakt (kompleks vitaminov B); askorbinska kislina (vitamin C); nikotinska kislina

(vitamin B3) in tiamin (vitamin B1). Rezultati analiz so prikazani na sliki 4.8 in v preglednici 4.13.


96

Slika 4.8: Vpliv vitaminov na prirast kefirnih zrn in masni delež kefirana v zrnu.

Podobno kot rezultati, kjer smo proučevali vpliv dodatka dušikovih spojin na prirast zrn in donos

kefirana, so nas presenetili tudi rezultati povezani s proučevanjem vpliva vitaminov. Če rezultate

eksperimenta C4 primerjamo z rezultati eksperimentov V0–V4 (slika 4.5, slika 4.8, preglednica 4.11 in

preglednica 4.13) opazimo, da obogatitev fermentacijskega medija z izbranimi vitamini ni vplivala na

povečanje prirasti kefirnih zrn in masnega deleža kefirana v zrnu. Takšni rezultati so posledica

mikrobiološke variabilnosti izbranega fermentacijskega sistema, ki je za proučevanje zelo težaven.

Pričakovali smo, da bo dodatek vitaminov povečal prirast zrn in donos kefirana iz zrn. Prirast zrn je v

tem sklopu eksperimentov najvišja pri kontrolnem eksperimentu in znaša 11,9 g/L. Pri dodatku

kvasnega ekstrakta in tiamina sta prirasti zrn skoraj enaki in znašata 11,6 g/L. Nekoliko nižjo prirast

zrn (KZ = 9,6 g/L) je dal dodatek askorbinske kisline.

Iz retultatov na sliki 4.8 je razvidno, da se masni delež kefirana v zrnu giblje v območju med 1,3 % in

1,6 %. Rezultati v preglednici 4.13 kažejo, da se pri dodatku vitaminov delež kefirana v izolatu giblje

med 32,4 % in 40,8 %. V izolatu iz zrn se masna deleža glukoze in galaktoze v kefiranu gibljeta v

območju med (17,4–22,1) % in (15,0–18,7) %. Povprečno masno razmerje med glukozo in galaktozo v

kefiranu, izoliranem iz zrn, uporabljenih pri fermentaciji mleka, obogatenega z izbranimi vitamini

znaša okrog 1 : 0,9.


97

Preglednica 4.13: Vpliv dodatka vitaminov na začetno in končno pH vrednost kefirja in monosaharidno


Eksperiment Vitamin wGlc (%) wGal (%) ζGlc/Gal pH

začetni končni

V0 / 22,1 18,7 1 : 0,8 6,7 4,0

V1 kvasni ekstrakt 19,5 17,0 1 : 0,9 6,7 3,9

V2 askorbinska kislina 18,2 15,7 1 : 0,9 6,7 4,0

V3 nikotinska kislina 17,4 15,0 1 : 0,9 6,3 3,9

V4 tiamin 21,4 17,5 1 : 0,8 6,6 4,0

Za proučevanje učinka mineralnih snovi na 24 h prirast kefirnih zrn in proizvodnjo kefirana iz zrn smo

izvedli serijo eksperimentov, pri čemer smo 42 g kefirnih zrn kultivirali v 1 L polnomasntega kravjega

mleka, katero je poleg 50 g laktoze in 1 g tiamina vsebovalo še 1 g izbrane mineralne snovi (KCl,

CaCl2, FeCl3, MgSO4). Eksperimentalni rezultati so prikazani na sliki 4.9 in v preglednici 4.14.

Slika 4.9: Vpliv mineralov na prirast kefirnih zrn in masni delež kefirana v zrnu.

Med izbranimi mineralnimi snovmi sta najvišjo prirast zrn (11,6 g/L in 11,2 g/L) dala KCl in MgSO4. 24

h prirasti zrn sta za kontrolni eksperiment (brez dodanega minerala) in eksperiment, kjer smo dodali

KCl, enaki in znašata 11,6 g/L. Iz slike 4.10 je razvidno, da je masni delež kefirana v zrnu najvišji (wKEF/KZ

= 3,1 %) pri dodatku FeCl3. Pri oddatku KCl in CaCl2 je masni delež kefirana v zrnu po 24 h fermentaciji

približno enak in v povprečju znaša 2,8 %. Delež kefirana v zrnih je najnižji (wKEF/KZ = 2,5 %) za

eksperiment M0, kjer mleka nismo obogatili z mineralnimi snovmi. Iz preglednice 4.14 je razvidno, da

se končna pH vrednost mleka pri vseh eksperimentih giblje med 3,9 in 4,0, kar je za fermentacije tudi

običajno.


98

Preglednica 4.14: Vpliv dodatka mineralov na začetno in končno pH vrednost kefirja in monosaharidno


Eksperiment Mineral wGlc (%) wGal (%) ζGlc/Gal pH

začetni končni

M0 / 27,5 31,7 1 : 1,1 6,5 4,0

M1 KCl 29,5 37,6 1 : 1,3 6,6 4,0

M2 CaCl2 29,6 34,8 1 : 1,2 6,4 4,0

M3 FeCl3 31,9 39,4 1 : 1,2 6,0 3,9

M4 MgSO4 28,6 38,4 1 : 1,3 6,4 4,0

Rezultati v preglednici 4.14 kažejo, da se pri dodatku mineralov delež kefirana (wGlc + wGal) v izolatu

giblje med 59,2 % in 71,3 %. Analize izoliranih vzorcev kažejo (preglednica 4.14), da so izolati

vsebovali (27,5–31,9) % glukoze in (31,7–39,4) % galaktoze. Masno razmerje med glukozo in

galaktozo (ζGlc/Gal) se giblje od 1: 1,1 do 1 : 1,3. Wang in Bi (2007) v rezultatih študije navajata, da je

donos kefirana po 96 h fermentaciji najvišji (2,6 g/L) pri dodatku 0,2 g/L MnSO4∙4H2O, 1 g/L

MgSO4∙7H2O in 4 g/L KH2PO4 v medij. Opozoriti velja, da je rezultate raziskave nekoliko težje

primerjati z literaturnimi, saj so bili za proučevanje proizvodnje kefirana in rasti kefirnih zrn v

posameznih študijah uporabljeni različni sintetični fermentacijski mediji. Tako so nekateri izmed njih

že v osnovi vsebovali npr. ogljikove hidrate, minerale, vitamine in dušikove spojine, katere smo mi

izbrali kot dodatke k osnovnemu fermentacijskem mediju – mleku. Zato so bila odstopanja rezultatov

naših raziskav od že objavljenih tudi pričakovana. Rezultati, prikazani na sliki 4.9 in v preglednici 4.14

kažejo, da dodatek mineralov, glede na eksperiment C4, ni povečal donosa kefirana iz zrn.

Na osnovi dobljenih rezultatov zaključujemo, da je na povečanje donosa kefirana iz kefirnih zrn

vplival le dodatek 50 g/L laktoze. Presenetilo nas je, da dodatek dušikovih spojin, vitaminov in

mineralov ni povečal donosa kefirana, kar na osnovi rezultatov eksperimentov, ki smo jih opravili,

težko pojasnimo.


99

2 PROCESNA SHEMA TEHNOLOŠKEGA POSTOPKA PROIZVODNJE KEFIRANA

Na osnovi izvedenih eksperimentov in njim pripadajočih rezultatov meritev in analiz, podanih v

prejšnjem razdelku, smo razvili procesno shemo za proizvodnjo kefirana iz kefirnih zrn. Ugotovili smo,

da sta prirast zrn in donos kefirana najvišja pri eksperimentu C4. Procesna shema tehnološkega

postopka pridobivanja kefirana iz zrn je prikazana na sliki 4.10. Shema je sestavljena iz treh ključnih

delov, in sicer 1) Fermentacije; 2) Izolacije kefirana iz zrn in 3) Analize izoliranega kefirana.

Fermentacijo izvedemo tako, da najprej k 1 L polnomastnega mleka (3,5 % m.m) dodamo 50 g

laktoze. Celotno fermentacijsko zmes med fermentacijo kontinuirno mešamo z vrtilno frekvenco

mešala, fm = 80 rpm. Mleko najprej segrejemo na optimalno temperaturo proizvodnje kefirana,

T = 25 °C, in ga cepimo z 42 g aktivnih kefirnih zrn (KZ, 0 = 42 g/L). 24 h fermentaciji sledi separacija

kefirnih zrn iz tradicionalno pridobljenega kefirja.

Fermentaciji sledi postopek izolacije kefirana iz zrn. Zrna, ki smo jih ob koncu femrnetacije ločili od

tradicionalnega kefirja, prelijemo s 300 mL vrele destilirane vode in kuhamo 3 h. Na sobno

temperaturo ohlajenemu vzorcu dodamo 300 mL 20 % trikloroocetne kisline in raztopino pri 200 rpm

mešamo 24 h. Iz raztopine se oborijo proteini in celice, ki jih odstranimo s centrifugiranjem (11000

rpm, 20 min, 4 °C). Oborino zavržemo, supernatantu pa dodamo enak volumen ohlajenega >99,5 %

acetona in raztopino pustimo 24 h v hladilniku. Oborjeni kefiran s centrifugiranjem (11000 rpm, 30

min, 4 °C) ločimo od supernatanta, ki ga zavržemo. Moker kefiran sušimo 48 h na 42 °C. Postopku

izolacije sledi analiza posušenega kefirana. Najprej je potrebno kefiran hidrolizirat s H2SO4. Sledi

derivatizacija hidrolizatov in analiza monosaharidov s kapilarno elektroforezo (podroben opis v

podpoglavju 1.2.4).

Vsekakor pa je eden izmed glavnih ciljev raziskave implementirati laboratorijsko razvit postopek

proizvodnje kefirana iz zrn iz laboratorijskega na industrijski nivo (mlekarna). Rezultate raziskav bi

lahko v mlekarnah uporabili za razširitev asortimana kefirja in nekaterih drugih fermentiranih mlečnih

izdelkov. S tem bi se na tržišču pojavili novi simbiotični mlečni izdelki z izboljšanimi terapevtskimi in

reološkimi lastnostmi, ki bi bili za potrošnike vsekakor zanimivi.

Bistvena pomanjkljivosti razvitega postopka proizvodnje kefirana je 3 h kuhanje, ki za proizvodnjo v

industrijskem merilu (npr. pri fermentaciji s 1000 L mleka) predstavlja velik energetski strošek, hkrati

pa zahteva veliko časa. Omenili smo, da bi lahko proizvajalci izoliran kefiran dodajali jogurtu in

drugim fermentiranim mlečnim izdelkom, da bi razširili asortiman fermentiranih mlečnih proizvodov.

Ker je suh kefiran v mleku netopen, bi ga bilo smotrno dodajati mokrega, s čimer bi se procesna

shema proizvodnje kefirana bistveno poenostavila, saj bi v takšnem primeru lahko del procesne

sheme (od sušenja kefirana naprej) zanemarili, kar bi za mlekarno pomenilo tudi nižje stroške

proizvodnje kefirana.


100

Slika 4.10: Tehnološki postopek pridobivanja kefirana iz kefirnih zrn.

FERMENTACIJA Mleko s 3,5 % m.m (Ljubljanske mlekarne d.d) V = 1 L

Mešanje fm = 80 rpm

Segrevanje T = 25 °C

Fermentacija t = 24 h, T = 25 °C

Separacija

Dodatek hranilnih snovi

LAKTOZA = 50 g/L

Kefirna zrna

KZ, 0 = 42 g/L

Kefirna zrna

Kuhanje t = 3 h, T = 100 °C

Ohlajanje sobna temperatura

Mešanje cca. 24 h, fm = 200 rpm

Centrifugiranje 11000 rpm, 20 min, 4 °C

ali Filtriranje

Supernatant

Postavino v hladilnik cca. 24 h, T = 4 °C

Tradicionalni kefir

Inokulacija

Centrifugiranje 11000 rpm, 30 min, 4 °C

Supernatant zavržemo

Destilirana voda V = 300 mL, T = 100 °C

20 % trikloroocetna kislina V = 300 mL

Proteini in celice

Analiza monosaharidov Kapilarna elektroforeza

Derivatizacija (po postopku Doliške idr. (2009))

Hidroliza s H2SO4

Kefiran suh

Tehtanje

99,5 % aceton V aceton = Vsupernatant, T = 4 °C

Sušenje t = 48 h, T = 42 °C

Kefiran moker

ANALIZA

IZOLACIJA KEFIRANA


101

POGLAVJE V ZAKLJUČEK


102

Rezultate doktorske disrtacije smo predstavili v dveh raziskovalnih sklopih (poglavje 3 in 4), ki

obravnavata klasično proizvodnjo kefirja s kefirnim zrnjem in proizvodnjo kefirana s kefirnimi zrni. Cilj

študije je bil potrditi/ovreči zastavljene teze disertacije.

V prvem sklopu (poglavje 3) smo proučili vpliv procesnih parametrov na proizvodnjo etanola med

fermentacijo kefirja in razvili matematične modele za opis rasti kefirnih zrn in proizvodnjo etanola.

Opravili smo tudi osnovne mikrobiološke študije kefirja in zrn.

Ker kvasovke in bakterije kefinih zrn med fermentacijo proizvajajo različne aromatične komponente,

katere oblikujejo edinstvene senzorične lastnosti kefirja, smo v prvem razdelku poglavja 3 najprej

proučili vpliv časa aktivacije kefirnih zrn na proizvodnjo etanola med 24 h fermentacijo mleka.

Rezultati so pokazali, da je količina proizvodenega etanola odvisna od števila kvasovk, ki v različno

aktivnih kefirnih zrnih precej variira. Pomembno je, da lahko v kefirju, poleg ustrezno izbranih

procesnih pogojev, učinkovito kontroliramo tudi koncentracijo proizvedenega etanola. S

pridobljenimi rezultati smo potrdili teze 1, 2 in 3.

V drugem razdelku poglavja 3 so navedeni izsledki eksperimentalnih raziskav, kjer smo z empiričnima

kinetičnima modeloma proučili rast kefirnih zrn in proizvodnjo etanola med fermentacijo in s tem

potrdili 4. tezo disertacije. Rezultati simulacij so pokazali dobro ujemanje z eksperimentalnimi

podatki. Za opis rasti zrn smo uporabili logistični model, medtem ko je proizvodnja etanola sledila

modificiranemu Gompertzovemu modelu. Oba modela lahko pojasnita fermentacijske značilnosti

kefirnih zrn in razložita njihovo sposobnost proizvodnje etanola.

Ker sestava mikrobiote kefirnih zrn močno variira in je odvisna od izvora zrn, smo proizvodnjo

etanola med fermentacijami skušali povezati z vsebnostjo kvasovk v kefirju in zrnih. Vsebnost

kvasovk v zrnih je znašala 108–109 KE/g, v kefirju pa 106–107 KE/mL. Rezultati raziskave se ujemajo s

tistimi, ki jih je objavil Sarkar (2007), kjer je bilo število kvasovk v zrnih 106–108 KE/g, v kefirju pa 105–

106 KE/mL ter z rezultati, ki so jih objavili Witthuhm idr. (2004), kjer je število kvasovk v zrnih znašalo

105–108 KE/ml.

V tretjem razdelku 3. poglavja smo pri izbranih temperaturah izvedli 24 h fermentacije kefirja. Razvili

smo linearni matematični model, s katerim smo opisali prirast mase kefirnih zrn v odvisnosti od

temperature po 24 h fermentaciji. Prav tako je statistična analiza pokazala, da temperaturni režimi

pomembno vplivajo na proizvodnjo etanola s kefirnimi zrni. S tem smo potrdili tezo 5.

Z modificiranim Gompertzovim modelom smo opisali proizvodnjo etanola (med fermentacijo mleka s

kefirnim zrnjem) v kefirju, kot funkcijo časa fermentacije in temperature. Rezultati so pokazali, da

maksimalna hitrost proizvodnje etanola narašča s temperaturo po Arrheniusovi enačbi, kar potrjuje

tezo 6. Ocenjena vrednost aktivacijske energije za proizvodnjo etanola znaša 64,3 kJ/mol.

V študiji smo pokazali, kako lahko z uporabo matematičnih modelov pojasnimo vpliv časa

fermentacije in temperature na prirast kefirnih zrn in proizvodnjo alkohola. S tem smo vnovič potrdili

tezo 4. To pa nedvomno prispeva k boljšemu razumevanju okoljskih vplivov na aktivnost biomase in

posledično na proizvodnjo bioproduktov.

Na okus kefirja poleg aktivnosti zrn, temperature in časa fermentacije vpliva tudi mehanski način

mešanja fermentacijske zmesi, saj z njim izboljšamo izmenjavo hranil med kefirnimi zrni in medijem

(mlekom), kar posledično vpliva na aktivnost kefirnih zrn in proizvodnjo aromatičnih komponent.


103

Zato smo prvi raziskovani sklop zaključili s proučevanjem vpliva časovnega presledka mirovanja

mešala oz. pogostosti mešanja na proizvodnjo etanola in mikrobiološke lastnosti kefirja in kefirnega

zrna. Z razvitimi matematičnimi zvezami smo opisali vpliv pogostosti mešanja na (1) povečanje

prirasti kefirnih zrn v 24 h, (2) koncentracijske spremembe etanola med 24 h fermentacijo ter (3) pH

vrednost kefirja po 24 h fermentaciji. Ugotovili smo, da prirast kefirnih zrn z zmanjševanjem

pogostosti mešanja fermentacijske brozge eksponentno upada, kar je posledica slabše oskrbe

mikroorganizmov s hranili zaradi počasnejšega razpada kefirnih zrn.Z razvitim, modificiranim

Gompertzovim modelom smo opisali vpliv pogostosti mešanja in časa fermentacije na koncentracijo

etanola v kefirju. Ocenili smo tudi vpliv pogostosti mešanja in navedli dejstva za povečano/zmanjšano

število kvasovk, laktobacilov in mezofilnih MK kokov v kefirju in zrnih po 24 h fermentaciji. Z rezultati

smo potrdili 7. tezo.

Drugi raziskovalni sklop (poglavje 4) smo usmerili v študij vpliva procesnih parametrov in sestave

fermentacijskega medija na donos kefirana iz kefirnih zrn ter razvoj procesne sheme za tehnološki

postopek pridobivanja kefirana iz zrn.

Iz serije izvedenih poskusov, opisanih poglavju 4, smo določi, da so temperatura fermentacije, učinek

mešanja in prisotnost laktoze dejavniki, ki najbolj vplivajo na proizvodnjo kefirana z mlečno-

kislinskimi bakterijami kefirnih zrn. 24 h proizvodnja kefirana iz kefrinih zrn je bila maksimirana pri

temperaturi 25 °C in kontinuirnem mešanju fermentacijske brozge z vrtilno frekvenco mešala 80 rpm.

Največja dobit kefirana iz zrn (wKEF/KZ = 4,3 %) je bila dosežena pri obogatitvi osnovnega

fermentacijskega medija (mleka) s 50 g/L laktoze, kjer je bilo masno razmerje med glukozo in

galaktozo v kefiranu 1 : 1,1. Dodatek dušikovih spojin, vitaminov in mineralov na povečanje donosa

kefirana ni vplival. Maksimalno prirast kefirnih zrn, KZ = 15,97 g/L, smo dobili ob dodatku 50 g/L

laktoze (vir C) in 5 g/L triptona (vir N). Dobljeni rezultati so nas izjemno presenetili, saj smo

pričakovali, da bodo dodatki (dušikove spojine, vitamini in minerali) povečali prirast zrn in donos

kefirana. Takšni rezultati so posledica velike mikrobiološke variabilnosti izbranega fermentacijskega

sistema.

Rezultati študije dokazujejo, da se lahko proizvodnja kefirana iz zrn dramatično poveča z nadziranjem

kultivacijskih pogojev in modificiranjem sestave fermentacijskega medija (mleka). Našteti zaključki so

potrdili tezo 9. Z rezultati analiz, s katerimi smo določili monosaharidno sestavo izolata iz zrn, je

ovrgla 8. tezo disertacije, po kateri je razmerje med D-glukozo in D-galaktozo v kefiranu približno 1 :

1.

Zaključimo lahko, da smo z rezultati raziskav, povezanih s proučevanjem fermentacij, prispevali k

boljšemu razumevanju kinetike razmnoževanja kefirnega zrna v povezavi z velikostjo in aktivnostjo

mikrobiote in procesnimi parametri. Nova znanja bodo omogočila načrtovanje in optimizacijo ciljanih

fermentacijskih procesov za proizvodnjo etanola in kefirana bodisi v smislu funkcionalnih živil ali

učinkovin (kefiran). Z rezultati raziskav smo pripomogli k boljšemu razumevanju vpliva procesnih

dejavnikov na nadaljnji razvoj in optimizacijo različnih fermentacijskih procesov. Nedvomno bodo

rezultati raziskav prispevali k razvoju ter izboljšanju prehranskih in terapevtskih lastnosti nove

generacije funkcionalnih živil, prehranskih dopolnil in farmacevtskih preparatov.


104


105

POGLAVJE VI LITERATURA


106


107

Adamič, J., Smole Možina, S., Jeršek, B. Vloga in pomen mikroorganizmov v živilih in taksonomija. V: Bem, Z., Adamič, J.,

Žlender, B., Smole Možina, S., Gašperlin, L. Mikrobiologija živil živalskega izvora, Ljubljana: Biotehniška fakulteta, 2003, 1-45.

Alm, L. Effect of fermentation on B-vitamin content of milk in Sweden, J. Dairy Sci., 1980, 65, 353–359.

Alm, L. Effect of fermentation on milk fat of Swedish fermented milk products, J. Dairy Sci. , 1982, 65, 521–530.

Athanasiadis, I., Paraskevopoulou, A., Blekas, G., Kiosseoglou, V. Development of a novel whey beverage by fermentation with kefir granules. Effect of various treatments, Biotechnol. Prog., 2004, 20, 1091–1095.

Athanasiadis, I., Boskou, D., Kanellaki, M., Koutinas, A.A. Low-temperature alcoholic fermentation by delignified cellulosic material supported cells of kefir yeast, J. Agric. Food Chem., 1999, 47, 4474–4477.

Batinkov E.L. Use of milk and kefir in peptic ulcer of the stomach and duodenum, Vopr. Pitan., 1971, 30, 89–91.

Berlec, A., Štrukelj, B. Gensko spremenjene mlečnokislinske bakterije kot dostavni sistemi za biološka zdravila, Farm. Vest., 2008, 59, 115–120.

Besednova N.N., Epshtein L.M., Gazha A.K., Borovskaia G.A., Besednov A.L., Rozhzhov I.V., Smolina T.P. Therapeutic-prophylactic milk products with a new immunocorrector of natural origin, Vopr. Pitan., 1997, 3, 31–4.

Beshkova, D.M., Simova, E.D., Frengova, G.I., Simov, Z.I., Dimitrov, Zh.P. Production of volatile aroma compounds by kefir starter culture, Int. Dairy J., 2003, 13, 529–535.

Beshkova, D.M., Simova, E.D., Simov, Z.I., Frengova, G.I., Spasov, Z.N. Pure cultures for making kefir, Food Microbiol., 2002, 19, 537–544.

Bogdanova, E.A., Padaryan, I.M., Lavrenova, G.S., Inozemtseva, V.F. Use of protein concentrates in the manufacture of dairy products, 20

th Int. Dairy Congr., 1978, 1E, 845.

Bosch, A., Golowczyc, M.A., Abraham, A.G., Garrote, G.L., De Antoni, G.L., Yantorno, O. Rapid discrimination of lactobacilli isolated from kefir grains by FT-IR spectroscopy, Int. J. Food Microbiol., 2006, 111, 280–287.

Bossi, M.G., Carminati, D., Bettoni, L. Aspetti nutrizionali e terapeutici di latti fermentati, L’industria latte, 1986, 22, 19–35.

Bottazzi, V., Bianchi, F. A note on scanning electron microscopy of micro-organisms associated with the kefir granule, J. Appl. Bacteriol., 1980, 48, 265–268.

Brialy, C., Rivalland, P., Coiffard, L., de Roeck Holtzhauer, Y. Microbiological study of lyophilised dairy kefir, Folia Microbiol., 1995, 40, 198–200.

Brückner, H., Hausch, M. D-amino acids in dairy products: detection, origin and nutritional aspects. I. Milk, fermented milk, fresh cheese and acid curd cheese, Milchwissenschaft, 1990, 45, 357–360.

Celik, G.Y., Aslim, B., Beyatli, Y. Characterization and production of exopolysaccharide (EPS) from Pseudomonas aeruginosa G1 and Pseudomonas putida G12 strains, Carbohydr. Polymers, 2008, 73, 178–182.

Cerning, J., Bouillanne, C., Landon, M., Desmazeaud, M. Isolation and characterisation of exopolysaccharides from slime-forming mesophilic lactic acid bacteria, J. Dairy Sci., 1992, 75, 692–699.

Cerning, J., Renard, C.M.G.C., Thibault, J.F., Bouillanne, C., Landon, M., Desmazeaud, M., Topisirovic, L. Carbon source requirements for exopolysaccharide production by Lactobacillus casei CG11 and partial structure analysis of the polymer, Appl. Environ. Microbiol., 1994, 60, 3914–3919.

Cevikbas, A., Yemni, E., Ezzedenn, F.W., Yardimici, T., Cevikbas, U., Stohs, S.J. Antitumoural antibacterial and antifungal activities of kefir and kefir grain, Phytother. Res., 1994, 8, 78–82.

Cheirsilp, B., Shimizu, H., Shioya, S., Enhanced kefiran production by mixed culture of Lactobacillus kefiranofaciens and Saccharomyces cerevisiae, J. Biotechnol., 2003, 100, 43–53.

Clementi, F., Gobbetti, M., Rossi, J. Carbon dioxide synthesis by immobilized yeast cells in kefir production, Milchwissenschaft, 1989, 44, 70–74.

Cogan, T.M., Barbosa, M., Beuvier, E., Bianchi-Salvadori, B., Cocconcelli, P.S., Fernandes, I., Gomez, J., Gomez, R., Kalantzopoulos, G., Ledda, A., Medina, M., Rea, M.C., Rodriguez, E. Characterization of the lactic acid bacteria in artisanal dairy products, J. Dairy Res., 1997, 64, 409–421.

Dahlaman, O., Jacobs, A., Liljenberg, A., Olsson, A.I. Analysis of carbohydrates in wood and pulps employing enzymatic hydrolysis and subsequent capillary zone electrophoresis, J. Chromatogr. A, 2000, 891, 157–174.


108

de Vrese, M., Keller, B., Barth, C.A. Enhancement of intestinal hydrolysis of lactose by microbial β-galactosidase (EC 3.2.1.23) of kefir, Br. J. Nutr., 1992, 67, 67–75.

De Vuyst, L., Vanderveken, F., Van de Ven, S., Degeest, B. Production by and isolation of exopolysaccharides from Streptococcus thermophilus grown in a milk medium and evidence for their growth-associated biosynthesis, J. Appl. Microbiol., 1998, 84, 1059–1068.

De Vuyst, L., Degeest, B. Heteropolysaccharides from lactic acid bacteria, FEMS Microbiol. Rev., 1999, 23, 153–177.

Doliška, A., Strnad, S., Ribitsch, V., Stana-Kleinschek, K., Willfor, S., Saake, B. Analysis of galactoglucomannans from spruce

wood by capillary electrophoresis, Cellulose, 2009, 16, 1089–1097.

Doran P.M. Bioprocess engineering principles, Academic press, London, UK, 2004, 265–271.

Dousset, X., Caillet, F. Aspects microbiologiques et biochimiques de la fermentation du kefir, Microbiol. Aliments Nutr., 1993, 11, 463–470.

Dragone, G., Mussatto, S.I., Oliveira, J.M., Teixeira, J.A. Characterisation of volatile compounds in an alcoholic beverage produced by whey fermentation, Food Chem., 2009, 112, 929–935.

Dragone, G., Silva, D.P., de Almeida e Silva, J.B. Factors influencing ethanol production rates at high-gravity brewing, LTW-Food Sci. Technol., 2004, 37, 797–802.

Duboc, P., Mollet, B. Applications of exopolysaccharides in the dairy industry, Int. Dairy J., 2001, 11, 759–768.

Duitschaever, C.L., What is kefir and how can it be made? Mod. Dairy, 1989, 18–19.

Evenshtein, E.M. Use of kefir for stimulation of gastric secretion and acid-formation in patients with pulmonary tuberculosis, Probl. Tuberk., 1978, 2, 82–94.

Faber, E.J., van der Haak, M.J., Kamerling, J.P., Vliegenthart, J.F.G., Structure of the exopolysaccharide produced by Streptococcus thermophilus S3, Carbohydr. Res., 2001, 331, 173–182.

Farnworth, E.R. Kefir-a complex probiotic, Food Sci. Tech., 2005, 2, 1–17.

Farnworth, E.R. and Mainville, I. Kefir: A fermented milk product, in Handbook of fermented functional foods, Farnworth, E.R. (ed) (CRC Press LLC), 2003, 77–111.

Figler, M., Mosik, G., Schaffer, B., Gasztonyi, B., Ăcs, P., Szili, B., Rab, R., Szakăly,S. Effect of special Hungarian probiotic kefir on fecal microflora, World J. Gastroenterol., 2006, 21, 1129–1132.

Frengova, G.I., Simova, E.D., Beshkova, D.M., Simov, Z.I. Exopolysaccharides produced by lactic acid bacteria of kefir grains, Z. Naturforsch.,2002, 57c, 805–810.

Fujisawa, T., Adachi, S., Toba, T., Arihara, K., Mitsuoka, T. Lactobacillus kefiranofacien ssp. Nov. isolated from kefir grains, Int. J. System. Bacteriol., 1988, 38, 12–14.

Furukawa, N., Matsuoka, A., Yamanaka, Y. Effects of orally administered yogurt and kefir on tumor growth in mice, J. Jpn. Soc. Nutr. Food Sci., 1991a, 62, 579–585.

Furukawa, N., Matsuoka, A., Takahashi, T., Yamanaka, Y. Effects of fermented milk on the delayed-type hypersensitivity response and survival day in mice bearing Meth-A, Anim. Sci. Technol., 1991b, 62, 450–453.

Furukawa, N., Matsuoka, A., Takahashi, T., Yamanaka, Y. Anti-metastatic effect of kefir grain components on Lewis lung carcinoma and highly metastatic B16 melanoma in mice, J. Agric. Sci. Tokyo Nogyo Daigaku, 2000, 45, 62–70.

García Fontán, M.C., Martínez, S., Franco, I., Carballo, J. Microbiological and chemical changes during the manufacture of Kefir made from cows’ milk, using a commercial starter culture, Int. Dairy J., 2006, 16, 762–767.

García-Ochoa, F., García-Leó, M., Romero, A. Kinetics modelling of xanthan production from sucrose, Chem. Biochem. Eng., 1990, 35, 15–20.

Garrote, G.L., Abraham, A.G., De Antoni, G.L. Preservation of kefir grains, a comparative study, LWT - Food Sci. Technol., 1997, 30(1), 77 – 84.

Garrote, G.L., Abraham, A.G., de Antoni, G.L. Characteristics of kefir prepared with different grain: milk ratios, J. Dairy Res., 1998, 65, 149–154.

Garrote, G.L., Abraham, A.G., de Antoni, G.L. Inhibitory power of kefir: the role of organic acids, J. Food Prot., 2000, 63, 364–369.


109

Giavasis, I., Harvey, L.M., McNeil, B. The effect of agitation and aeration on the synthesis and molecular weight of gellan in batch cultures of Sphingomonas paucimobilis, Enzyme Microb. Tachnol., 2006, 38, 101–108.

Guarner, F., Schaafsma, G.J. Probiotics. Int. J. Food Microbiol., 1998, 39, 237-238.

Guidelines for the evaluation of probioticsin food: report of a Joint FAO/WHO Working Group on Drafting Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food, London, Ontario, Canada, April 30 and May 1, 2002.

Gulmez, M., Guven, A. Survival of Escherichia coli 0157:H7, Listeria monocytogenes 4b and Yersinia enterocolitica 03 in different yogurt and keifr combinations as prefermentation contaminant, J. Appl. Microbiol., 2003, 95, 631–636.

Guven, A., Guven, A., Gulmez, M., The effect of keifr on the activities of GSH-Px, GST, CAT, GSH, and LPO levels in carbon tetrachloride-induced mice tissues, J. Vet. Med. B., 2003, 50, 412–416.

Güzel-Seydim, Z.B., Seydim, A.C., Greene, A.K., Bodine, A.B. Determination of organic acids and volatile flavor substances in kefir during fermentation, J. Food Compos. Anal., 2000, 13, 35–43.

Güzel-Seydim, Z.B., Wyffels, J.T., Seydim, A.C., Greene, A.K. Turkish kefir and kefir grains: microbial enumeration and electron microscopic observation, Int. J. Dairy Technol., 2005, 58, 25–29.

Hallé, C., Leroi, F., Dousset, X., Pidoux, M. Les kefirs. Des associations bacteries lactique-levures, in Bactéries Lactiques: Aspects Fondamentaux et Technologiques, Vol. 2, de Roissart, H., Luquet, F.M. Eds., Uriage, France, 1994, 169–182.

Harta, O., Iconomopoulou, M., Bekatorou, A., Nigam, P., Kontominas, M., Koutinas, A.A. Effect of various carbohydrate substrates on the production of kefir grains for use as a novel baking starter, Food Chem., 2004, 88, 237–242.

Hertzler, S.R., Clancy, S.M. Kefir improves lactose digestion and tolerance in adults with lactose maldigestion, J. Am. Diet. Assoc., 2003, 103, 582–587.

Hosono A., Tanabe, T., Otani, H. Binding properties of lactic acid bacteria isolated from kefir milk with mutagenic amino acid pyrolyzates, Milchwissenschaft, 1990, 45, 647–651.

Hvalec, M., Goršek, A., Glavič, P. Experimental design of crystallization processes using Taguchi method, Acta Chim. Slov., 2004, 51, 245–256.

Hvalec, M. Eksperimentalno načrtovanje procesov kristalizacije, magistrsko delo, 2004.

IDF (International Dairy Federation), Milk and milk products, Enumeration of microorganisms, Colony count technique at 30 °C. Standard 100B. Brussels, Belgium, 1991.

IDF (International Dairy Federation), Milk and milk products, Preparation of samples and dilutions for microbiological examination. Standard 122B. Brussels, Belgium, 1992.

Irigoyen, A., Arana, I., Castiella, M., Torre, P., Ibáñez, F.C. Microbiological, physicochemical, and sensory characteristics of keifr during storage, Food Chem., 2005, 90, 613–620.

Ismail, A.A., El-Nockfashy, S.A., Khorshid, M.A. A beverage from separated buffalo milk fermented with kefir grains, Int. J. Dairy Technol., 1983, 36, 117–118.

Itsaranuwat, P., Al-Haddad, K.S.H., Robinson, R.K. The potential therapeutic benefits of consuming 'health-promoting' fermented dairy products: a brief update, Int. J. Dairy Techno., 2003, 56, 203–210. Jankowska, A., Krasowska, M., Reps, A., Proszek, A. Effect of high pressure on some properties of lactic acid bacteria present in kefir, Med. Fac. Landbouww. Univ. Gent., 2001, 66/3b, 503–509.

Jolly, L., Vincent, S.J.F, Duboc, P., Neeser, J.R. Exploiting exopolysaccharides from lactic acid bacteria, Antonie van Leeuwenhoek, 2002, 82, 367–374.

Kandler, O., Kunath, P. Lactobacillus kefir sp. nov., A component of the microflora of kefir, Syst. Appl. Microbiol., 1983, 4,286 –294.

Kebede, A., Viljoen, B.C., Gadaga, H., Nervhus, J.A., Lourens-Hattingh, A. The effect of incubation temperature on the survival and growth of yeasts in Sathemi, South African naturally fermented milk, Food Technol. Biotechnol., 2007, 45, 21–26.

Khan, N.S., Mishra, I.M., Singh, R.P., Prasad, B. Modelling the growth of Corynebacterium glutamicum under product inhibition in L-glutamic acid fermentation, Biochem. Eng. J., 2005, 25, 173–178.

Kneifel, W., Mayer, H.K. Vitamin profiles of kefirs made from milks of different species, Int. J. Food Sci. Technol.,1991, 26, 423–428.

Koroleva, N.S. Technology of kefir and kumys, Bull. Int. Dairy Fed., 1988, 227, 96–100.


110

Koroleva, N.S. Products prepared with lactic acid bacteria and yeasts. V: Robinson, R.K. Therapeutic Properties of Fermented Milk, London: Elsevier Applied Science, 1991, 159–179.

Kroger, M. Kefir, Cult. Dairy Prod. J., 1993, 28, 26–29.

Kubo M., Odani T., Nakamura S.,Tokumaru S., Matsuda H. Pharmacological study on kefir—a fermented milk product in Caucasus. I. On antitumor activity (1), Yakugaku Zasshi., 1992, 112, 489–95.

Kuo, C.Y., Lin, C.W. Taiwanese kefir grains: their growth, microbial and chemical composition of fermented milk, Aust. J. Dairy Sci., 1999, 54, 19–23.

Kwak, H.S., Park, S.K., Kim, D.S. Biostabilisation of kefir with a nonlactose-fermenting yeast, J. Dairy Sci., 1996, 79, 937–942.

Kwon, C.S., Park, M.Y., Cho, J.S., Choi, S.T., Chang, D.S. Identification of effective microorganisms from kefir fermented milk, Food Sci. Biotech., 2003, 12, 476–479.

La Riviére, J.W.M., Kooiman, P., Schmidt, K. Kefiran, A novel polysaccharide produced in the kefir grain by Lactobacillus brevis, Arch. Mikrobiol., 1967, 59, 269–278.

Leroi, F., Courcoux, P. Influence of pH, temperature and initial yeast: bacteria ratio on the simulation of Lactobacillus hilgardii by Saccharomyces florentinus isolated from sugary kefir grains, J. Appl. Bacteriol., 1996, 80, 138–146.

Leroi, F., Pidoux, M. Detection of interactions between yeasts and lactic acid bacteria isolated from sugary kefir grains, J. Appl. Bacteriaol., 1993, 74(1), 48–53.

Leroy, F., De Vuyst, L. Lactic acid bacteria as functional starter cultures for the food fermentation industry, Trends Food Sci. Technol., 2004, 15, 67–78.

Li, R., Jiang, X., Guan, H. Optimization of mycelium biomass and exopolysaccharides production by Hirsutella sp. in submerged fermentation and evaluation of exopolysaccharides antibacterial activity, African J. Biotechnol., 2010, 9, 195–202.

Libudzisz, Z., Piatkiewicz, A. Kefir production in Poland, Dairy Ind. Int., 1990, 55, 31–33.

Lin, T.Y., Chang Chien, M.F. Exopolysaccharides production as affected by lactic acid bacteria and fermentation time, Food Chem., 2007, 100, 1419–1423.

Linossier, J.P., Dousset, X. Simulation de la croissance et du metabolisme de Lactobacillus kefir par Candida kefir, Microbiol. Aliment. Nutrit., 1994, 12, 341–351.

Liu, J.R., Chen, M.J., Lin, C.W. Characterization of polysaccharide and volatile compounds produced by kefir grains grown in soymilk, J. Food Sci., 2002, 67, 104–108.

Liu, J.R., Wang, S.Y., Chen, M.J., Chen, H.L., Yueh, P.Y., Lin, C.W. Hypocholesterolaemic effects of milk-kefir and soyamilk-kefir in cholesterol-fed hamsters, Br. J. Nutr., 2006, 95, 939–946.

Lopitz-Otsoa, F., Rementeira, A., Elguezabal, N., Garaizar, J. Kefir: Asymbiotic yeast-bacteria community with alleged healthy capabilities, Rev. Iberoam. Micol., 2006, 23, 67–74.

Luong, J., Mulchandani, A., LeDuy, A. Kinetics of biopolymer synthesis: a revisit, Enzyme Microbial Technol., 1988, 10, 362–332.

Maeda, H., Zhu, X., Mitsuoka, T. Effects of an exopolysaccharide (kefiran) from Lactobacillus kefiranofaciens on blood glucose in KKAy mice and constipation in SD rats induced by a low-fiber diet, Biosci. Microflora, 2004a, 23, 149–153.

Maeda, H., Zhu, X., Suzuki, S., Suzuki, K., Kitamura, S. Structural characterization and biological activities of an exopolysaccharide kefiran produced by Lactobacillus kefiranofaciens WT-2BT, J. Agric. Food Chem., 2004b, 52, 5533–5538.

Maeda, H., Zhu, X., Omura, K., Suzuki, S., Kitamura, S. Effects of an exopolysaccharide (kefiran) on lipids, blood pressure, blood glucose, and constipation, BioFactors, 2004c, 22, 197–200.

Marquina, D., Santos, A., Corpas, I., Munoz, J., Zazo, J., Peinado, J.M. Dietary influence of kefir on microbial activities in the mouse bowel, Lett. Appl. Microbiol., 2002, 35, 136–140.

Marshall, V.M., Cole, W.M., Brooker, B.E. Observation of the structure of kefir grains and the distribution of the microflora, J. Appl. Bacteriol., 1984, 57, 491–497.

Matsuu, M., Shichijo, K., Okaichi, K., Wen, C.Y., Fukuda, E., Nakashima, M., Nakayama, T., Shirahata, S., Tokumaru, S., Sekine, I. The protective effect of fermented milk kefir on radiation-induced apoptosis in colonic crypt cells of rats, J. Radiat. Res., 2003, 44, 111–115.


111

Micheli, L., Uccelletti, D., Palleschi, P., Crescenzi, V. Isolation and characterization of a ropy Lactobacillus strain producing the exopolysaccharide kefiran, Appl. Microbiol. Biotechnol., 1999, 53, 69–74.

Miyamoto, T., Morita, H., Nishioka, K., Kataoka, K., Izumimoto, M., Kuyama, T. Constituent species of lactic acid bacteria from kefir and their desmutagenic properties, Jpn. J. Dairy. Food Sci., 1991, 40, 111–120.

Molska, I., Kocon, J., Zmarlicki, S. Electron microscopy studies on structures and microflora of kefir grains, Acta Aliment. Polon., 1980, 6, 145–154.

Morgan, S.M., Hickey, R., Ross, R.P., Hill, C. Efficient method for the detection of microbially-produced antibacterial substances from food systems, J. Appl. Microbiol., 2000, 89, 56–62.

Mu, Y., Wang, G., Yu, H.Q. Kinetic modelling of batch hydrogen production process by mixed anaerobic cultures, Biores. Technol., 2006, 97, 1302–1307.

Muir, D.D., Tamime, A.Y., Wszolek, M. Comparison of the sensory profiles of kefir, buttermilk and yogurt, Int. J. Dairy Technol., 1999, 52, 129–134.

Mukai, T., Toba, T., Itoh, T., Nimura, T., Adachi, S. Carboxylmethyl kefiran: preparation and viscometric properties, J. Food Sci., 1990, 55, 1483–1484.

Mul, G., Hamminga, G.M., Moulijn, J.A., Operando ATR-FTIR analysis of liquid-phase catalytic reactions: can heterogeneous catalyst be observed?, Vib. Spectros., 2004, 34, 109–121.

Murofushi M., Shiomi M., Aibara K. Effect of orally administered polysaccharide from kefir grain on delayed-type hypersensitivity and tumour growth in mice, Jpn. J. Med. Sci. Biol., 1983, 36, 49–53.

Murofushi M., Mizuguchi J., Aibara K., Matuhasi T. Immunopotentiative effect of polysaccharide from kefir grain, KGF-C, administered orally in mice, Immunopharmacology, 1986, 12, 29–35.

Novak Štagoj, M., Podobnik, M. Kvasovke – tovarne rekombinantnih proteinov, Farm. Vestn., 2006, 57, 235–240.

Oleinichenko, E.V., Mitrokhin, S.D., Nonikov, V.E., Minaev, V.I. Acipole efficacy in prevention of enteric dysbacteriosis due to antibacterial therapy, Anitibiot. Khimioter, 1999, 44, 23–25.

Ormisson, A.A., Soo, T.R. Effect of lactic acid milk and kefir on the indicators of acid-base equilibrium of arterial blood in healthy young children and patients with acute pneumonia and acute bronchitis, Pediatriia, 1976, 10, 37–38.

Osada, K., Nagira, K., Teruya, K., Tachibana, H., Shirahata, S., Murakami, H. Enhancement of interferon-β production with sphingomyelin from fermented milk, Biotherapy, 1994, 7, 115–123.

Papapostolou, H., Bosnea, L.A., Koutinas, A.A., Kanellaki, M. Fermentation efficiency of thermally dried kefir, Biores. Technol., 2008, 99, 6949 –6956.

Pazouki, M., Najafpour, G., Hosseini, M.R, Kinetic models of cell growth, substrate utilization and bio-decolorization of distillery wastewater by Aspergillus fumigatus UB260, Afric J. Technol., 2008, 7, 1369–1376.

Pervez, S., Malik, K.A., Ah Kang, S., Kim, H.Y. Probiotics and their fermented food products are beneficial for health, J. Appl. Microbiol., 2006, 100, 1171–1185.

Petterson, H.E., Christiansson, A., Ekelund, K. Making kefir without grains, Scand. J. Dairy Technol., Know How, 1985, 2, 58–60.

Quirós, A., Hernandez-Ledesma, B., Ramos, M., Amigo, L., Recio, I. Angiotensin-converting enzyme inhibitory activity of peptides derived from caprine kefir, J. Dairy Res., 2005, 88, 3480–3487.

Raus-Madiedo, P., de Ios Reyes-Galiván, C.G. Methods for the screening, isolation, and characterization of exopolysaccharides produced by lactic acid bacteria, J. Dairy Sci., 2005, 88, 843–856.

Rea, M.C., Lennartsson, T., Dillon, P., Drinan, F.D., Reville, W.J., Heapes, M., Cogan, T.M. Irish kefir-like grains: their structure, microbial composition and fermentation kinetics, J. Appl. Bacteriol., 1996, 81, 83–94.

Reid, G. Probiotics and prebiotics – Progress and challenges, Int. Dairy J., 2008, 18, 969–975.

Reuter, G. Present and future of probiotics in Germany and in Central Europe, Biosci. Microflora., 1997, 16, 43–51.

Rimada, P.S., Abraham, A.G. Polysaccharide production by kefir grains during whey fermentation, J. Dairy Res. , 2001, 68, 653–661.

Rimada, P.S., Abraham, A.G. Comparative study of different methodologies to determine the exopolysaccaride produced by kefir grains in milk and whey, Lait, 2003, 83, 79–87.


112

Rimada, P.S., Abraham, A.G. Kefiran improves rheological properties of glucano- -lactone induced skim milk gels, Int. Dairy J., 2006, 16, 33–39.

Robinson, R.K., Tamime, A.Y., Wszolek, M. Microbiology of fermented milks. V: Dairy microbiology handbook: the microbiology of milk and milk products. 3

rd ed. Robinson R.K. (ed.). New York, John Wiley & Sons, 2002, 367–430.

Rodrigues, K.L., Caputo, L.R.G, Tavares Carvalho, J.C., Evangelista, J., Schneedorf, J.M., Antimicrobial and healing activity of kefir and kefiran extract, Int. J. Antimicrob. Agents, 2005, 25, 404–408.

Roehr, M., Zehentgruber, O., Kubice, C.P. Kinetics of biomass formation and citric acid production by Aspergillus niger on pilot plant scale, Biotechnol. Bioeng., 1981, 23, 2433–2445.

Rogelj, I. Mleko. V: Bem, Z., Adamič, J., Žlender, B., Smole Možina, S., Gašperlin, L. Mikrobiologija živil živalskega izvora, Ljubljana: Biotehniška fakulteta, 2003, 515–537.

Rogelj, I., Perko, B. Mlečni izdelki. V: Bem, Z., Adamič, J., Žlender, B., Smole Možina, S., Gašperlin, L. Mikrobiologija živil živalskega izvora, Ljubljana: Biotehniška fakulteta, 2003, 541–578.

Rosi, J. Kefir micro-organisms: yeasts. Scienza e Tecnica Lattiero-Casearia, 1978, 29, 59–67.

Rossi, J. and Gobbetti, M. Impiego di un multistarter per la produzione in continuo di kefir, Ann. Microbiol., 1991, 41, 223–226.

Ruas-Madiedo, P., Hugenholtz, J., Zoon, P. An overview of the functionality of exopolysaccharides produced by lactic acid bacteria, Int. Dairy J., 2002, 12, 163–171.

Ruas-Madiedo, P., de Ios Reyes-Gavilán, C.G. Methods for the screening, isolation and characterization of exopolysaccharides produced by lactic acid bacteria, J. Dairy Sci., 2005, 88, 843–856.

Ryan, W.P., Rea, M.C., Hill, C., Ross, R.P. An application in cheddar cheese manufacture for a strain of Lactococcus lactis producing a novel broad-spectrum bacteriocin, lacticin 3147, Appl. Environ. Microbiol., 1996, 62, 612–619.

Samsonov, M., Budagovskaya, V. The role of fermented dairy drinks as dietary products, Proc. XXI Int. Dairy Congr., Moscow, 1982, 2,140–145.

Sánchez, S., Bravo, V., Moya, A.J., Castro, E., Camacho, F. Influence of temperature on the fermentation of D-xylose by Pachysolen tannophilus to produce ethanol and xylitol, Proc. Biochem., 2004, 39, 673–679.

Sánchez, B., De Los Reyes-Gavilán, C.G., Margolles, A., Gueimonde, M. Probiotic fermented milks: Present and future, Int. J. Dairy Technol., 2009, 62, 472–483.

Santos, A., San Mauro, M., Sanchez, A., Torres, J.M., Marquina, D. The antimicrobial properties of different strains of Lactobacillus spp. isolated from kefir, Syst. Appl. Microbiol., 2003, 26, 434–437.

Sarkar, S. Potential of kefir as a dietetic beverage: a review, British Food J., 2007, 109, 280–290.

Sarkar, S. Biotechnological innovations in kefir production: a review, British Food J., 2008, 110, 283–295.

Schmidt, P., Vass, A., Szakaly, S. Effect of fermented milk diets on regeneration of rat liver, Acta Med. Hung., 1984, 41, 163–169.

Serot, T., Dousset, X., Zucca, J., Torcatis, N. Mise en evidence et purification partielle de substances antibacteriiennes produites par Leuconostoc mesenteroides et Lactobacillus plantarum isoles de grains de kefyr, Micro. Aliments Nutr., 1990, 8, 71–76.

Shah, N.P. Functional cultures and health benefits, Int. Dairy J., 2007, 17, 1262 – 1277.

Sharifzadeh Baei, M., Mahmoudi, M., Yunesi, H. A kinetic model of citric acid production from apple pomace by Aspergillus niger, Afric. J. Biotechnol., 2008, 7, 3487–3489.

Shiomi M., Sasaki K., Murofushi M., Aibara K. Antitumor activity in mice of orally administered polysaccharide from Kefir grain, Jpn. J. Med. Sci. Biol., 1982, 35, 75–80.

Shoevers, A., Britz, T.J. Influence of different culturing conditions on kefir grain increase, Int. J. Dairy Technol., 2003, 56, 183 –187.

Simova, E., Beshkova, D., Angelov, A., Hristozova, T., Frengova, G., Spasov, Z. Lactic acid bacteria and yeasts in kefir grains and kefir made from them, J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 2002, 28, 1–6.

Song, H., Jang, S.H., Park, J.M., Lee, S.Y. Modelling of batch fermentation kinetics for succinic acid production by Mannheimia succiniciproducens, Biochem. Eng. J., 2008, 40, 107–115.


113

Stiles, M.E., Holzapfel, W.H. Lactic acid bacteria of foodsand their current taxonomy, Int. J. Food Microbiol., 1997, 36, 1–29.

St-Onge, M.-P., Farnworth, E.R., Jones, P.J.H. Fermented and non-fermented dairy product consumption: effects on cholesterol levels and metabolism, Am. J. Clin. Nutr., 2000, 71, 674–681.

St-Onge, M-P., Farnworth, E.R., Savard, T., Chabot, D., Mafu, A., Jones, P.J.H. Kefir consumption does not alter plasma lipid levels or cholesterol fractional synthesis rates relative to milk in hyperlipidemic men, BMC Compl. Altern. Med. J., 2002, 2, 1–7.

Strazisar, M., Fir, M., Golc-Wondra, A., Milivojevic, L., Prosek, M. Quantitative determination of coenzyme Q10 by liquid chromatography and chromatography/mass spectrometry in dairy products, J. AOAC Int., 2005, 88, 1020–1027.

Sukhov, S., Kalamkarova, L.I., Il Chenko, L.A., Zhangabylov, A.K. Changes in the microflora of the small and large intestine in patients with chronic enteritis after dietary treatment with cultured milk products, Vopr. Pitan., 1986, 4, 14–17.

Sutherland, I.W. Polysaccharases for microbial exopolysaccharides, Carbohydr. Polymers, 1999, 38, 319–328.

Tada, S., Katakura, Y., Ninomiya, K., Shioya, S. Fed-Batch coculture of Lactobacillus kefiranofaciens with Saccharomyces cerevisiae for effective production of kefiran, J. Biosci. Bioeng., 2007, 103, 557–562.

Takizawa, S., Kojima, S., Tamura, S., Fujinaga, S., Benno, Y., Nakase, T. The composition of the Lactobacillus flora in kefir grains, Syst. Appl. Microbiol., 1998, 21, 121–127.

Takizawa, S., Kojima, S., Tamura, S., Fujinaga, S., Benno, Y., Nakase, T. Lactobacillus kefirgranum sp. nov. and Lactobacillus

parakefir sp. nov., two new species from kefir grains, Int. J. Syst. Bacteriol., 1994, 44, 435–439.

Tamime, A.Y., Muir, D.D., Wszolek, M. Kefir, koumis, Dairy Ind. Int., 1999, 64, 32–33.

Taniguchi, M., Nomura, M., Itaya, T., Tanaka, T. Kefiran production by Lactobacillus kefiranofaciens under the culture conditions established by mimicking the existence and activities of yeast in kefir grains, Food Sci. Technol. Res., 2001, 7, 333–337.

Teskač, K., Hudournik, N., Marinšek-Logar, R., Kristl, J. Pomen probiotikov kot prehranskih dopolnil in zdravil, Farm. Vestn., 2008, 59, 287–292.

Taylor, G.R.J., Williams, C.M. Effects of probiotics and prebiotics on blood lipids, Br. J. Nutr., 1998, 80, 225–230.

Thompson, J.K., Johnston, D.E., Murphy, R.J., Collins, M.A. Characteristics of a milk fermentation from rural Northern Ireland which resembles kefir, Irish J. Food Sci. Technol., 1990, 14, 35–49.

Thoreux, K., and Schmucker, D.L., Kefir milk enhances intestinal immunity in young but not old rats, J. Nutr., 2001, 131, 807–812.

Toba , T., Abe, S., Arihara, K., Adachi, S. A medium for the isolation of capsular bacteria from kefir grains, Agric. Biol. Chem., 1986, 50, 2673–2674.

Tokumaru, S. Healthy Diets, Jpn. Kokai Tokkyo Koho, CODEN: JKXXAF JP 11346717A2 19991221, 1999.

Torija. Ma.J., Rozès, N., Poblet, M., Guillamón, J.M., Mas, A. Effect of fermentation temperature on the strain population of Saccharomyces cerevisiae, Int. J. Food Microbiol., 2003, 80, 47–53.

Toba, T., Arihara, K., Adachi, S. Distribution of microorganisms with particular reference to encapsulated bacteria in kefir grains, Int. J. Food Microbiol., 1990, 10, 219–224.

Tramšek, M., Goršek, A. A novel approach for assuring and following inoculum activity during kefir grains growth studies – application of dynamic pH profiles, Acta Chim. Slov., 2007, 54, 693–699.

Tramšek, M. Načrtovanje kontinuirnih reaktorskih sistemov proizvodnje kefirnih zrn, doktorska disertacija, 2009.

Tuinier, R., Zoon, P., Olieman, C., Cohen-Stuart, M.A., Fleer, G.J., de Kruif, C.G. Isolation and physical characterization of an exocellular polysaccharide, Biopolymers, 1999, 49, 1–9.

Umeda, C., Sonoyama, K., Yamaguchi, N., Saito, R., Akashi, K., Motoshima, H., Kawwabata, J. Oral administration of freeze-dried kefir reduces intestinal permeation of and oral sensitization to ovalbumin in mice, Biosci. Biotechnol. Biochem., 2005, 69, 249–251.

Urdaneta, E., Barrenetxe, J., Aranguren, P., Irigoyen, A., Marzo, F., Ibánez, F.C. Intestinal beneficial effects of kefir-supplemented diet in rats, Nutrit. Res., 2007, 27, 653–658.

Van Ginkel, S., Sung, S., Lay, J.J. Biohydrogen production as a function of pH and substrate concentration, Environ. Sci. Technol., 2001, 35, 4726–4730.


114

van Marle, M.E., Zoon, P. Permeability and rheological properties of microbially and chemically acidified skim-milk gels, Neth. Milk Dairy J., 1995, 49, 47–65.

Vasiljevic, T., Shah, N.P. Probiotics-From Metchnikoff to bioactives, Int. Dairy J., 2008, 18, 714–728.

Vass, A., Szakaly, S., Schmidt, P. Experimental study of the nutritional biological characters of fermented milks, Acta Med. Hung., 1984, 41, 157–161.

Viljoen, B.C. The interaction between yeasts and bacteria in dairy environments, comparative study, Int. J. Dairy. Res., 2001, 69, 37–44.

Vujicic, I.F., Vulic, M., Konyves, T. Assimilation of cholesterol in milk by kefir cultures, Biotechnol. Lett., 1992, 14, 847–850.

Wachenheim, D.E., Patterson, J.A., Ladisch, M.R. Analysis of the logistic function model: derivation and applications specific to batch cultured microorganisms, Biores. Technol., 2003, 86, 157–164.

Wang, Y., Ahmed, Z., Feng, W., Li, C., Song, S. Physicochemical properties of exopolysaccharide produced by Lactobacillus kefiranofaciens ZW3 isolated from Tibet kefir, Int. J. Biol. Macromol., 2008, 43, 283–288.

Wang, M., Bi, J. Modification of characteristics of kefiran by changing the carbon source of Lactobacillus kefiranofaciens, J. Sci. Food. Agric., 2008, 88, 763–769.

Wang, M., Bi, J. Medium optimization for kefiran synthesis by Lactobacillus kefiranofaciens, Ind. Microbiol.., 2007, 4, 36–40.

Weissmahr, J.A. Dietary Supplement Derived from Fermented Milks for Prevention of Osteoporosis, World Intellectual Property Organization, WO 00/60950 PCT/IT00/00130, 2000.

Welman, A.D., Maddox, I.S. Exopolysaccharides from lactic acid bacteria: perspective and challenges, Trends Biotechnol., 2003, 21, 269–274.

Witthuhn, R.C., Schoeman, T., Britz, T.J. Characterization of the microbial population at different stages of kefir production and kefir grain mass cultivation, Int. Dairy J., 2005, 15, 383–389.

Witthuhn, R.C., Schoeman, T., Britz, T.J. Isolation and characterisation of the microbial population of different South African kefir grains, Int. J. Dairy Technol., 2004, 57, 33–37.

Wyder, M.T., Spillmann, H., Meile, L., Puhan, Z. Investigation of the yeast flora in dairy products: a case study of kefir, Food Technol. Biotechnol., 1997, 35, 299–304.

Yaman, H. Isolation of lactobacilli from commercial polish kefir grains, Kefkas Üniv. Vet. Fak. Derg., 2004, 10, 99–102.

Yeesang, C., Chanthachum, S., Cheirsilp, B. Sago starch as a low-cost carbon source for exopolysaccharide production by Lactobacillus kefiranofaciens, World J. Microbiol. Biotechnol., 2008, 24, 119–1201.

Yilmaz, L., Őzcan Yilsay, T., Akpinar Bayizit, A. The sensory characteristics of berry-flavoured kefir, Czech J. Food Sci., 2006, 24, 26–32.

Yokoi, H., Watanabe, T., Fujii, Y., Mukai, T., Toba, T. Adechi, S. Some taxonomical characteristics of encapsulated Lactobacillus sp. KPB-167B isolated from kefir grains and characterization of its extracellular polysaccharide, Int. J. Food Microbiol., 1991, 13, 257–264.

Yoon, Y.H., Cho, J.K., Baek, Y.J., Huh, C.S., Antimutagenic activity of Lactobacillus spp. isolated from kefir and yogurt and non-starter strains, Kor. J. Anim. Sci., 1999, 41, 39–44.

Yuksekdag, Z.N., Beyath, Y., Aslim, B. Metabolic activities of Lactobacillus spp. strains isolated from kefir, Nahrung/Food, 2004, 48, 218–220.

Yüksekdsğ, Z.N., Beyatli, Y., Aslim, B. Determination of some characteristics coccoid forms of lactic bacteria isolated from Turkish kefirs with natural probiotic, Lebensm. Wiss. U. Technol.2004, 37, 663–667.

Zacconi, C., Parisi, M.G., Sarra, P.G., Dallavalle, P., Bottazzi, V. Competitive exclusion of Salmonella Kedougou in kefir fed chicks, Microbiol. Aliments Nutr., 1995, 12, 387–390.

Zajšek, K., Goršek, A. In-situ investigation of sucrose hydrolysis-successful link between design of experiment, RC1 and reactIR system, Rev. Chim., 2008, 59, 1308–1313.

Zajšek, K., Goršek, A. Modelling of batch kefir fermentation kinetics for ethanol production by mixed natural microflora, Food Bioprod. Process, 2010, 88, 56–60.

Zajšek, K. Kinetične študije hitrosti rasti kefirnih zrn, diplomsko delo, 2006.


115

Zourari, A., Anifantakis, E.M. Kefir-Pysicochemical, microbial and nutritional characteristics-Production technology-A review, Lait, 1988, 68, 373–392.

Zwietering, M.G., Jongenburger, I., Rombouts, F.M., Van 'T Riet, K. Modelling of the bacterial growth curve, Appl. Environ. Microbiol., 1990, 56, 1875–1881.


116


117

ŽIVLJENJEPIS

KATJA ZAJŠEK OSEBNI PODATKI

Stalno bivališče: Vurberk 132, 2241 Spodnji Duplek

Telefon: 040 428 622

Elektronska pošta: [email protected]

Državljanstvo: slovensko

Datum, kraj rojstva: 22.11.1982, Maribor

IZOBRAZBA

1989 –1997: Osnovna šola Duplek

1997–2001:III. Gimnazija Maribor

2001–2006:univerzitetni študij kemijske tehnologije, Univerza v Mariboru,

Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, Smer: Biokemijska tehnika

06.09.2006 pridobitev naziva univ. dipl. inž. kem. tehn. (naslov diplomskega

dela: Kinetične študije hitrosti rasti kefirnih zrn)

od 01.11.2006–danes: enovit doktorski študij kemijske tehnologije, smer

kemija in kemijska tehnika, Univerza v Mariboru, Fakulteta za kemijo in

kemijsko tehnologijo(naslov doktorske disertacije: Optimiranje bioprocesnih

parametrov proizvodnje etanola in kefirana z mikrobioto kefirnih zrn)

ZAPOSLITEV

julij 2005–september 2005: obvezna praksa na Centralni čistilni napravi Maribor

(AquaSystems d.o.o)

01.11.2006–danes: mlada raziskovalka na Katedri za kemijsko tehniko (Laboratorij za

procesno sistemsko tehniko in trajnostni razvoj) Fakultete za kemijo in kemijsko

tehnologijo, od 2008 sem habilitirana v naziv asistentke za področje Kemijska tehnika in

tehnična kemija

ZNANJE TUJIH JEZIKOV

angleški jezik, aktivno (B2)

nemški jezik, pasivno (A2)

hrvaški jezik, aktivno (B2)

ŠTIPENDIJE

od 01. 11. 2006, financiranje mladega raziskovalca iz Agencije za raziskovalno

dejavnost Republike Slovenije

IZOBRAŽEVANJA

strokovno izobraževanje »Advanced Separation Technologies in Chemical

Engineering«, TU Berlin, Nemčija – avgust 2007

PROJEKTI

opravljanje raziskav za Mlekarno Krepko (Kele&Keled.o.o, Laze)

sodelovanje pri raziskavah za Lek d.d. in AVL List GmbH

sodelovanje v raziskovalni skupini Procesna sistemska tehnika in trajnostni

razvoj

vodenje vaj pri predmetih Procesna integracija I in Bioreakcijska tehnika

NAGRADE

2007–37. Krkina nagrada za diplomsko delo z naslovom »Kinetične študije

hitrosti rasti kefirnih zrn«

2007–IUPAC nagrada za poster (Application of ReactIRTM

for kinetic studies)

na 12. Avstrijskih kemijskih dnevih v Celovcu

BIBLIOGRAFIJA

dostopna na spletnem naslovu:


118

http://izumbib.izum.si/bibliografije/Y20120628210117-28402.html

PROFESIONALNA ZNANJA

bioreakcijska tehnika, reakcijska tehnika, načrtovanje in optimiranje procesov,

izvajanje in-situ FTIR in mikrobioloških analiz, izolacija naravnih ekspolisaharidov

OSTALA ZNANJA

Word, Excel, Powerpoint, SigmaPlot 10.0, Matlab, CorelDraw, SuperProDesigner

vozniški izpit B kategorije

HOBI

šport, glasba

OSTALO

v zvezi, hčerka Katarina

http://izumbib.izum.si/bibliografije/Y20120628210117-28402.html


119

COBISS Kooperativni online bibliografski sistem in servisi COBISS

KATJA ZAJŠEK *28402+

Osebna bibliografija za obdobje 2006-2012

ČLANKI IN DRUGI SESTAVNI DELI

1.01 Izvirni znanstveni članek

1. ZAJŠEK, Katja, KOLAR, Mitja, GORŠEK, Andreja. Characterisation of the exopolysaccharide kefiran

produced by lactic acid bacteria entrapped within natural kefir grains. Int. j. dairy technol., 2011, vol.

64, issue 4, str. 544-548, doi: 10.1111/j.1471-0307.2011.00704.x. [COBISS.SI-ID 15278870]

2. ZAJŠEK, Katja, GORŠEK, Andreja. Mathematical modelling of ethanol production by mixed kefir grains yeast population as a function of temperature variations. Biochem. eng. j.. [Print ed.], Mar. 2010, vol. 49, iss. 1, str. 7-12, doi: 10.1016/j.bej.2009.11.004. [COBISS.SI-ID 13630486]

3. ZAJŠEK, Katja, GORŠEK, Andreja. Modelling of batch kefir fermentation kinetics for ethanol production by mixed natural microflora. Food bioprod. process., 2010, vol. 88, iss. 1, str. 55-60, doi: 10.1016/j.fbp.2009.09.002. [COBISS.SI-ID 13592086]

4. ZAJŠEK, Katja, GORŠEK, Andreja. Effect of natural starter culture activity on ethanol content in fermented dairy products. Int. j. dairy technol., 2010, issue 1, vol. 63, str. 113-118, doi: 10.1111/j.1471-0307.2009.00549.x. [COBISS.SI-ID 13761046]

5. ZAJŠEK, Katja, GORŠEK, Andreja. A kinetic study of sucrose hydrolysis over Amberlite IR-120 as a heterogeneous catalyst using in situ FTIR spectroscopy. Reaction kinetics, mechanisms and catalysis. [Print ed.], 2010, issue 2, vol. 100, str. 265-276, doi: 10.1007/s11144-010-0154-6. [COBISS.SI-ID 14068758]

6. ZAJŠEK, Katja, GORŠEK, Andreja. In-situ investigation of sucrose hydrolysis - successful link between design of experiment, RC1 and reactIR system. Rev. chim. (Bucur.), 2008, vol. 59, nr. 12, str. 1308-1313. http://www.revistadechimie.ro/pdf/ZAJSEC%20K.pdf. [COBISS.SI-ID 12892438]

1.08 Objavljeni znanstveni prispevek na konferenci

7. ZAJŠEK, Katja, GORŠEK, Andreja. Experimental assessment of the impact of cultivation conditions

on kefiran production by the mixed microflora imbedded in kefir grains. V: PIERUCCI, Sauro (ur.). 9th

International Conference on Chemical and Process Engineering, 8-11 May, 2011, Florence, Italy.

ICheaP-10, (Chemical Engineering transactions, Vol. 24). Milano: AIDIC, 2011, str. 481-486, doi:

10.3303/CET1124081. [COBISS.SI-ID 14955798]

8. ZAJŠEK, Katja, GORŠEK, Andreja. Vpliv bioprocesnih pogojev na proizvodnjo kefirana iz kefirnih zrn = Influence of bioprocess conditions on kefiran production from kefir grains. V: KRAVANJA, Zdravko

http://dx.doi.org/10.1111/j.1471-0307.2011.00704.x

http://cobiss.izum.si/scripts/cobiss?command=DISPLAY&base=COBIB&RID=15278870

http://dx.doi.org/10.1016/j.bej.2009.11.004


http://dx.doi.org/10.1016/j.fbp.2009.09.002


http://dx.doi.org/10.1111/j.1471-0307.2009.00549.x


http://dx.doi.org/10.1007/s11144-010-0154-6


http://www.revistadechimie.ro/pdf/ZAJSEC%20K.pdf


http://dx.doi.org/10.3303/CET1124081



120

(ur.), BRODNJAK-VONČINA, Darinka (ur.), BOGATAJ, Miloš (ur.). Slovenski kemijski dnevi 2011, Portorož, 14-16 september 2011. Maribor: FKKT, 2011, 7 str. [COBISS.SI-ID 15333142]

9. ZAJŠEK, Katja, GORŠEK, Andreja, ROGELJ, Irena. The use of non-structured models for describing the ethanol production during the milk fermentation by natural starter cultures. V: CHISA 2010 : CD-ROM of full texts. Praha: Czech Society of Chemical Engineering, 2010, 10 f. [COBISS.SI-ID 14370582]

10. GORŠEK, Andreja, ZAJŠEK, Katja. Influence of temperature variations on ethanol production by kefir grains - mathematical model development. V: BARDONE, Enrico (ur.), VIGLIA, Aurelio (ur.). 2nd International Conference on Industrial biotechnology, April 11-14, 2010 Padua, Italy. IBIC2010, (Chemical Engineering transactions, Vol. 20, 2010). Milano: AIDIC, cop. 2010, str. 181-186. [COBISS.SI-ID 14065430]

11. ZAJŠEK, Katja, GORŠEK, Andreja. Matematično modeliranje proizvodnje etanola z mikrobioto kefirnih zrn kot funkcijo temperaturnih sprememb = Mathematical modelling of ethanol production by microbiota of kefir grains as a function of temperature variations. V: Slovenski kemijski dnevi 2010, Maribor, 23. in 24. september 2010. [Maribor]: FKKT, [2010], 14 str. [COBISS.SI-ID 14421270]

12. ZAJŠEK, Katja, GORŠEK, Andreja. Determination of reaction rate of sucrose hydrolysis catalysed by heterogeneous catalyst Amberlite IR-120. V: 1st Conference on "Applied Biocatalysis" and 5th Meeting of Students and University Professors from Maribor and Zagreb : May 26th and 27th 2009, Maribor, Slovenia. Maribor: Faculty of Chemistry and Chemical Engineering; Zagreb: Faculty of Chemical Engineering and Technology, 2009, 4 str. [COBISS.SI-ID 13346070]

13. ZAJŠEK, Katja, GORŠEK, Andreja. Importance of inoculum activity for ethanol and yeasts content in fermented dairy product. V: 1st Conference on "Applied Biocatalysis" and 5th Meeting of Students and University Professors from Maribor and Zagreb : May 26th and 27th 2009, Maribor, Slovenia. Maribor: Faculty of Chemistry and Chemical Engineering; Zagreb: Faculty of Chemical Engineering and Technology, 2009, 4 str. [COBISS.SI-ID 13346326]

14. ZAJŠEK, Katja, GORŠEK, Andreja. Matematični model za določitev hitrosti nastajanja etanola med fermentacijo kefirja. V: Slovenski kemijski dnevi 2009, Maribor, 24. in 25. september 2009. [Maribor]: FKKT, [2009], 10 str. [COBISS.SI-ID 13470230]

15. ZAJŠEK, Katja, GORŠEK, Andreja. Analysis of process parameters relative influence on sucrose hydrolysis reaction time - combination of experimental design and up-to-date equipment. V: 18th International Congress of Chemical and Process Engineering, 24-28 August 2008, Praha, Czech Republic. CHISA 2008 : CD-ROM of full texts. Praha: Czech Society of Chemical Engineering, 2008, 13 f. [COBISS.SI-ID 12556310]

16. ZAJŠEK, Katja, GORŠEK, Andreja. Kinetične študije hidrolize saharoze s heterogenim katalizatorjem. V: GLAVIČ, Peter (ur.), BRODNJAK-VONČINA, Darinka (ur.). Slovenski kemijski dnevi 2008, Maribor, 25. in 26. september 2008 : [zbornik referatov]. Maribor: Univerza v Mariboru, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, 2008, [13] str. [COBISS.SI-ID 12619542]

1.09 Objavljeni strokovni prispevek na konferenci

17. ZAJŠEK, Katja, GORŠEK, Andreja. Kinetične študije hitrosti rasti kefirnih zrn. V: GLAVIČ, Peter (ur.),

BRODNJAK-VONČINA, Darinka (ur.). Slovenski kemijski dnevi 2006, Maribor, 21. in 22. september

2006. Maribor: FKKT, 2006, 10 str. [COBISS.SI-ID 10729494]












121

1.12 Objavljeni povzetek znanstvenega prispevka na konferenci

18. ZAJŠEK, Katja, GORŠEK, Andreja. Effect of natural starter culture activity on ethanol content in

fermented dairy product. V: 4th IDF Dairy Science and Technology Week, 20-24 April 2009, Rennes,

Agrocampus, France. Programme, abstracts of oral presentations and posters. *S. l.: Fédération

Internationale de Laiterie: = FIL: Intenrational Dairy Federation: = IDF, 2009, str. 105-106. [COBISS.SI-

ID 13176342]

19. ZAJŠEK, Katja, GORŠEK, Andreja. Application of ReactIR TM for kinetic studies. V: 12. Österrechische Chemietage : September 10-13, 2007, Klagenfurt, Austria : book of abstracts. *Vienna+: Gesellschaft Österreichische Chemiker, 2007, str. PO-71. [COBISS.SI-ID 11646486]

1.13 Objavljeni povzetek strokovnega prispevka na konferenci

20. ZAJŠEK, Katja. Kinetične študije hitrosti rasti kefirnih zrn = Kinetic studies of growth rate of kefir

grains. V: PLEVNIK, Miha (ur.). 37. Krkine nagrade = 37th Krka Prizes, 17. simpozij, Novo mesto, 19.

oktober 2007. 37. Krkine nagrade : zbornik povzetkov : 17. simpozij, Novo mesto, 19. oktober 2007.

Novo mesto: Krka, 2007, str. 69. [COBISS.SI-ID 11786262]

MONOGRAFIJE IN DRUGA ZAKLJUČENA DELA

2.12 Končno poročilo o rezultatih raziskav

21. KRAVANJA, Zdravko, GORŠEK, Andreja, KRAJNC, Majda, NOVAK-PINTARIČ, Zorka, SIMONIČ,

Marjana, KOVAČ KRALJ, Anita, KRAJNC, Damjan, PEČAR, Darja, GLAVIČ, Peter, KASAŠ, Mihael, ZAJŠEK,

Katja, SIMONIČ, Samo. Procesna sistemska tehnika in trajnostni razvoj : letno poročilo o rezultatih

raziskovalnega programa v letu 2011. Maribor: Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, 2012. 1

mapa (loč. pag.). *COBISS.SI-ID 15929366]

22. KRAVANJA, Zdravko, GLAVIČ, Peter, KRAJNC, Majda, GORŠEK, Andreja, KOVAČ KRALJ, Anita, NOVAK-PINTARIČ, Zorka, SIMONIČ, Marjana, PEČAR, Darja, KRAJNC, Damjan, BOGATAJ, Miloš, ZAJŠEK, Katja, KASAŠ, Mihael, ČUČEK, Lidija, KRIŽAN, Janja. Procesna sistemska tehnika in trajnostni razvoj : letno poročilo o rezultatih raziskovalnega programa v letu 2010. Maribor: Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, 2011. 1 mapa (loč. pag.). *COBISS.SI-ID 15929622]

23. KRAVANJA, Zdravko, GORŠEK, Andreja, KRAJNC, Majda, SIMONIČ, Marjana, NOVAK-PINTARIČ, Zorka, KRAJNC, Damjan, PEČAR, Darja, KOVAČ KRALJ, Anita, KASAŠ, Mihael, ZAJŠEK, Katja, ČUČEK, Lidija, BOGATAJ, Miloš, GLAVIČ, Peter. Procesna sistemska tehnika in trajnostni razvoj : letno poročilo o rezultatih raziskovalnega programa v letu 2010. Maribor: Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, 2010. 1 mapa (loč. pag.). *COBISS.SI-ID 15929878]

2.13 Elaborat, predštudija, študija

24. ZAJŠEK, Katja, GORŠEK, Andreja. Določitev procesnih parametrov maksimalne proizvodnje

eksopolisaharida kefirana v kefirnih zrnih med fermantacijo v polnomastnem kravjem mleku : poročilo

o opravljenih raziskavah po pogodbi št. 0605/2010 : raziskovalni sklop I. Maribor: Fakulteta za kemijo

in kemijsko tehnologijo, 2010. 1 mapa (loč. pag.), ilustr. *COBISS.SI-ID 14814486]









122

25. ZAJŠEK, Katja, PEČAR, Darja, GORŠEK, Andreja. Heat capacity analysis of glycol G48 and mobil 0W40. Maribor: Faculty of chemistry and chemical engineering, 2009. 1 mapa (loč. pag.), ilustr. [COBISS.SI-ID 13761302]

26. ZAJŠEK, Katja, TRAMŠEK, Marko, GORŠEK, Andreja. Eksperimentalno ocenjevanje toplotnih efektov sinteze 8-hidroksi-5-nitrokinolina [naročnik: Lek, član skupine Sandoz] : zaključno poročilo raziskav. Maribor: Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, Laboratorij za procesno sistemsko tehniko in trajnostni razvoj, 2007. 1 mapa (loč. pag.), graf. prikazi. [COBISS.SI-ID 11351062]

27. TRAMŠEK, Marko, ZAJŠEK, Katja, GORŠEK, Andreja. Eksperimentalno vrednotenje toplotnih efektov sinteze VENLAFAKSIN HCl soli v RC1 reakcijskem kalorimetru [naročnik: Lek, član skupine Sandoz] : zaključno poročilo raziskav. Maribor: Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, Laboratorij za procesno sistemsko tehniko in trajnostni razvoj, 2007. 1 mapa (loč. pag.), graf. prikazi. [COBISS.SI-ID 11310870]

28. TRAMŠEK, Marko, ZAJŠEK, Katja, GORŠEK, Andreja. Kalorimetrične študije reakcij sinteze ETA v RC1 reakcijskem sistemu [naročnik Lek, član skupine Sandoz] : zaključno poročilo raziskav. Maribor: Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, Laboratorij za procesno sistemsko tehniko in trajnostni razvoj, 2007. 1 mapa (loč. pag.), graf. prikazi. *COBISS.SI-ID 11182870]

29. TRAMŠEK, Marko, ZAJŠEK, Katja, GORŠEK, Andreja. Kalorimetrične študije sinteze Omeprazola: oksidacija PTB z m-CPBA [naročnik Lek, član skupine Sandoz] : zaključno poročilo raziskav. Maribor: Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, Laboratorij za procesno sistemsko tehniko in trajnostni razvoj, 2007. 1 mapa (loč. pag.), graf. prikazi. *COBISS.SI-ID 11244566]

30. ZAJŠEK, Katja, TRAMŠEK, Marko, GORŠEK, Andreja. Kvalitativno vrednotenje toplotnih učinkov tvorbe raztopine HCl/IPA v RC1 reaktorju [naročnik: Lek, član skupine Sandoz] : zaključno poročilo raziskav. Maribor: Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, Laboratorij za procesno sistemsko tehniko in trajnostni razvoj, 2007. 1 mapa (loč. pag.), graf. prikazi. *COBISS.SI-ID 11374358]

31. TRAMŠEK, Marko, ZAJŠEK, Katja, GORŠEK, Andreja. Sinteza Mikofenolat mofetila (MMF) : eksperimentalno določanje reakcijske entalpije tvorbe MPA-Cl [naročnik: Lek, član skupine Sandoz] : zaključno poročilo raziskav. Maribor: Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, Laboratorij za procesno sistemsko tehniko in trajnostni razvoj, 2007. 1 mapa (loč. pag.), graf. prikazi. *COBISS.SI-ID 11956502]

32. ZAJŠEK, Katja, TRAMŠEK, Marko, GORŠEK, Andreja. Vrednotenje toplotnih učinkov sinteze H-DHLSMe v RC1 reaktorju [naročnik: Lek, član skupine Sandoz] : zaključno poročilo raziskav. Maribor: Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, Laboratorij za procesno sistemsko tehniko in trajnostni razvoj, 2007. 1 mapa (loč. pag.), graf. prikazi. *COBISS.SI-ID 11827222]

33. TRAMŠEK, Marko, GORŠEK, Andreja, ZAJŠEK, Katja. Dinamično spremljanje poteka sinteze TMS s FTIR v RC1 [naročnik Lek, član skupine Sandoz] : poročilo o opravljenem delu. Maribor: Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, Laboratorij za procesno sistemsko tehniko in trajnostni razvoj, 2006. 1 mapa (loč. pag.), graf. prikazi. *COBISS.SI-ID 11022358]











123

SEKUNDARNO AVTORSTVO

Pisec recenzij

34. Food chemistry. Zajšek, Katja (pisec recenzij 2009, 2010). *Print ed.+. London: Applied Science

Publishers. ISSN 0308-8146. [COBISS.SI-ID 6385415]

NERAZPOREJENO

35. ZAJŠEK, Katja. Kinetične študije hitrosti rasti kefirnih zrn : diplomska naloga, (Fakulteta za kemijo

in kemijsko tehnologijo, Diplomska dela univerzitetnega študija). Maribor: *K. Zajšek+, 2006. 74 str.,

ilustr. [COBISS.SI-ID 10665238]



Documents

D O K T O R S K A D I S E R T A C I J A - core.ac.uk · 1 Karakterizacija in optimizacija proizvodnje kefirana iz naravnih kefirnih zrn 79 1.1 Uvod 79 1.2 Metode in materiali 79 1.2.1