Upload
sudhakaranmahendran
View
146
Download
1
Embed Size (px)
Citation preview
1AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
2AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Cursus LC-MS-2001
1. Introductie massaspectrometrie2. Problematiek LC-MS3. Historisch overzicht LC-MS4. Electrospray5. APcI6. Bespreking MS toepassing AO-MO-CHROM7. Aanhalen praktische problemen
3AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Sir Joseph John Thomson (1856 - 1940)
‘I feel sure that there are many problems in chemistry which could be solved with far more greater ease by this than by any other method. The method is surprisingly sensitive, requires an infinitesimal amount of material and does not require this to be specially purified…’
Statement about the technique of mass spectrometry, made by J.J.Thomson in 1913
4AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Deel 1
1.1 Wat is MS?1.2 Instrumentatie1.3 Ionisatie1.4 Quadrupoolfilter1.5 Tandem massaspectrometrie
5AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
1.1 Wat is MS?
MS is een analysetechniek die ionen in de gasfase bestudeert.Toepassingen:
Kwalitatief en kwantitatiefOrganisch en anorganischStructuuropheldering van onbekende verbindingen
Eerste massaspectrometersir Francis William Aston (1877-1945)Cambridge, 1919
6AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Eerste MS in 1919
7AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Eerste MS spectrum
8AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
1.2 Opbouw MS
InlaatsysteemBronMassa-analysator in vacuümsysteemDetector
9AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Inlaatsystemen
Doel: moleculen introduceren in de bronHoe:
Direct Insertion ProbeGCCE, CECLC
10AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Bron
Doel: moleculen ioniserenHoe:
Electron Impact (EI)Chemische Ionisatie (CI)Desorptie Chemische Ionisatie (DCI)Field Desorption (FD)Fast Atom Bombardment (FAB)Fast Ion Bombardment (FIB)Thermospray (TSP)Thermal Desorption Laser Desorption (LD)Matrix Assisted Laser Desorption (MALDI)
11AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Bron
Electrospray (ES)Atmospheric Pressure Chemical Ionisation (APcI)
Atmospheric Pressure Photon Ionisation (APPI)Sonic Spray Ionisation (SSI)
12AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Analysator
Doel: ionen scheiden op basis van m/zm/z = massa over lading = Thomson (Th)
Hoe:Quadrupoolfilter (Q of q)Iontrap (IT)Magneet Sector (M)Time of Flight (TOF)Fourrier Transform Ion Cyclotron (FTMS)
13AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Parameters van de analysator
Resolutie (R) R= m/∆m10% valley ofwel 50% (FWHM)
Massa-accuraatheidMassa-bereikGevoeligheidScan snelheidPrijs
14AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Vacuümsysteem
Waarom vacuümsysteem?Ionen in de gasfase botsen met luchtmoleculenfragmentatie, verlies van gevoeligheid, verlies van resolutie
Hoe?Vacuümpompen
Voorvacuümpompen (tot 10-3 mb)– rotatievoorvacuümpompen
Hoogvacuümpompen (tot 10-9 mb)– Turbomoleculaire pompen
– Oliediffusiepompen
– Cryogene pompen
15AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Detectoren
Doel: omzetten van ionen in een meetbare stroomHoe?
Electron multipliers (EM)Korte levensduur (enkele jaren)
Photonmultipliers (PM)Lange levensduur (10 jaar)Vnl Q
16AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Werking Detector
17AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Detectoren
Array detectoren (AD)Uiterst gevoeligKlein lineair bereikKwetsbaar en duurMagneet SectorTOFVb: MCP (Q-TOF)
18AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Detectoren: MCP
19AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Detectoren: MCP
20AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Schema electrospray bron
21AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Schema ES bron
22AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Schema APcI bron
23AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
1.3 Ionisatie
Gemiddeld Moleculair Gewicht (Average MW)MW berekend met behulp van de gewogen gemiddelden van de natuurlijke isotopen van elk atoom (bvb zoals vermeld in MI, stoechiometrische berekeningen, ed)
Mono-isotopische Moleculair Gewicht (Nominal MW)
MW berekend met behulp van de massa van het meestvoorkomend isotoop van elk atoom (zoals gemeten met een Q)
24AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Moleculair gewicht (MW)
Exacte Moleculair Gewicht (Exact MW)Is het mono-isotopisch MW, rekening gehouden met de massa-defecten (wordt gemeten via een hoge resolutie MS)
Voorbeeld voor 3 moleculen:Azijnzuur (C2H4O2; 60.0211)Ureum (CH4N2O; 60.0324)2-propanol (C3H8O; 60.0575)
25AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Moleculair gewicht (MW)
Isobaren zijn moleculen met hetzelfde mono-isotopisch MW
Massa-eenheid: u of Da=1/12 van de massa van het 12C atoom=1/NA (NA=6.022 1023 mol-1)=1.66043 10-27 kg
12C = 12.000u
26AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Moleculair gewicht (MW)
N
O
N
N
N
NOO
O
N
Cl
N N
Cl R051211 C-06.79.19.00 MW 705.64 Factor 1C35H38Cl2N8O4(+-)-(CIS)CDU : 3906 mg, 3 unitsITRACONAZOLE
27AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Moleculair gewicht (MW)
Voorbeeld R051211Average MW: 705.6436Mono-isotopisch MW: 704Exact MW: 704.2393
28AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Stikstofregel
Even MW: geen of een even aantal N-atomenOneven MW: oneven aantal N-atomenVoorbeeld R051211:mono-isotopisch MW 704, dus even aantal N-atomen (8)
29AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Ionisatie (beperkt tot ES)
Positief of negatief:M → (M+H)+
M → (M-H)-
Nevenreacties (clustervorming)[M+NH4]+, [M+Na]+, [M+K]+
30AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Fragmentatie (zeer beperkt)
Ion → ion + neutraal door toevoegen van extra inwendige energie
Extra spanningsveldBotsingsenergie (CID, CAD, …)
31AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Massa spectrum
Curve van relatieve intensiteit (RI) in fuctie van m/z
Voorbeeld: R051211MW=704
[M+H]+=705m/z=705
32AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Massa spectrum R051211
33AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Isotopen
Hoofdpiek → mono-isotopisch→ alleen meest voorkomende isotopen
Koolstof: 12C (98.9%) en 13C (1.1%)Voorbeeld: R051211 (C35H38Cl2N8O4)
1x 13C in het skelet →signaal bij 704+1+1=706intensiteit: 1.1% x #C-atomen
2x 13C in het skelet →signaal bij 704+1+1+1=707intensiteit: 1.1% x 1.1% x 35 →verwaarloosbaar
34AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Isotopen
Wat met Cl?35Cl (75.77%) en 37Cl (24.23%)algemeen 3:1voor R051211: piek bij 707Intensiteit: 3:1 x 3:1 = 9:6:1
35AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Isotopen R051211
36AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Isotopen
Wat met Br?79Br (50.69%) en 81Br (49.31%)algemeen 1:1twee Br-atomen in de moleculeIntensiteit: 1:1 x 1:1 = 1:2:1
37AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Isotopen
38AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Isotopen
39AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Clustervorming
Naast [M+H]+
soms ook[M+NH4]+, [M+Na]+, [M+K]+
Voor- en nadeelvoordeel: duidt gemakkelijk MW aannadeel: verlies intensiteit [M+H]+
40AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Massa spectrum R051211
41AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Quizvraag
42AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Meervoudig geladen ionen
OorsprongVoorbeeld R051211: [M+2H]2+
m/z bij (704+1+1)/2 = 353Scheiding 12C en 13C 0.5 uScheiding 35Cl en 37Cl 1 u
43AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Meervoudig geladen ionen
15:19:4502-Oct-1998
AdministratorOpl1
150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000m/z0
100
%
FKC-222-001-002 621 (32.117) Cm (619:625-(610:611+632:633)) 1: Scan ES+ 9.15e7705.5
91495072
353.418687148
256.44453118
325.53254019
354.513249136
671.55920441
707.570918080
708.527327742
727.418685352
729.513366653
730.55518147
44AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Interpretatie MS
API gekendMeten onbekende
verschil → info over onbekendevb: verschil=+16hydroxy of N-oxF → Cl[M+Na]+ → [M+K]+
vb: verschil=+14methyleringCH2 →C=O
Verschil discrete waardenvb: verschil 11?
45AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
1.4 Quadrupoolfilter
º1953, Paul ( Nobelprijs 1989) en SteinwedelRelatief goedkoopEenvoudig en gebruiksvriendelijkResolutie = eenheidScan, gebaseerd op electrostatische velden
46AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Quadrupoolfilter
47AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Quadrupoolfilter
48AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Quadrupoolfilter
DC en RF spanningEnkel DC: blokkageEnkel RF: geen filtering, wel focusScannen?
49AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Scan technieken
Twee verschillende: full-scan en SIR(M)Full-scaninstelling scan van laag naar hoogideaal voor identificatie werkSIRslechts 1 ion, voor- en nadeelvoordeel: enorm gevoelig (100x)nadeel: geen structuur informatie
Te vergelijken met Single Wavelength en PDA
50AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
1.5 Tandem massaspectrometrie
Combinatie van ‘2 MS’Techniek waarbij fragmentatie spectrum bekomen wordt van een ‘precursor’
Precursor ion (parent ion)Product ion (daughter ion)
Zowel in space als in timeVoorstelling:
MS1 selecteert precursorBotsingscel (fragmenten opwekken)MS2 bepaald fragmentatie spectrum
Voorbeelden zijnQqQ, QqTOF, BqQ, BqB, BqTOF, BqIT, IT, FTMS, QqQqQ, …
51AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
1.5 Tandem massaspectrometrie
Gebruik:Structuur ophelderingQuantificatie!!!!
Voordeel:Uitzonderlijk selectiefZeer gevoelig
Nadeel:Bijzonder duur (uitgenomen IT)Ingewikkeld?
52AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
1.5 Tandem massaspectrometrie
Enkele voorbeelden:Zonder noemenswaardige voorscheiding:
Geef het zuivere massa spectrum van verbinding ZGeef alle verbindingen die fragment Y bevatten (Precursor Scan)Geef alle verbindingen die X verliezen (Constant Neutral Loss scan)vb: alle Cl-verbindingen opsporen, verlies van water, verlies van MeOH, …
53AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
1.5 Tandem massaspectrometrie
54AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
1.5 Tandem massaspectrometrie
Kwantificatie:Kiezen twee ionen (overgang)
55AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Deel 2: Problematiek LC-MS
2.1 Waarom koppeling HPLC met MS?
2.2 Vloeistof → gas2.3 Polaire moleculen2.4 Niet-vluchtige buffers
56AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
2.1 Waarom koppeling met MS?
57AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
2.2 Vloeistof →gas
Algemene gaswet leert:0.1 mL/min →135 cm3 gas bij 1 atmMS onder hoog vacuumvacuumpompen maar 5 cm3 gas bij 1 atmOplossingionisatie bij atmosferische drukdifferentieel pompen!Vloeistofstroom splitten!
58AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
2.3 Polaire moleculen
HPLC = ideale scheidingstechniek voor polaire moleculenPolaire moleculen zijn meestal thermolabiel Zachte ionisatie techniek gebruikenES, APcI, (APPI, SSI), …
59AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
2.4 Niet-vluchtige buffers
Worden gebruikt om HPLC methode te optimaliserenTe vermijden bij LC-MS
contaminatie ionenbron en MSsignaal onderdrukking (ion supression) MS spectrum
Beter met moderne ionenbronnen (Z-spray)Vluchtige buffers te prefereren
60AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Niet-vluchtige buffersystemen
Vluchtige buffers:Ammonium acetaat, ammonium formiaat, ammonium carbonaatMierenzuur, azijnzuur, TFA
Te vermijden bij LC-MSAlle fosfaten, boraten en sulfatenZwavelzuur, fosforzuur
Opletten met modifiers, zoalsHPβCD, DEA, TEA, TRIS, …
61AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Deel 3
Historisch overzicht LC-MS
62AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Historisch overzicht LC-MS
Koppeling met gaschromatografie en massaspectrometrie reeds in 1958(gas, apolaire moleculen, laag moleculair gewicht, geen buffers, …)Vanaf ’70 koppelingspogingen HPLC en MSMeest succesvol en meest verbreid: ES (’90)
63AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Historisch overzicht LC-MS
Moving belt: EI en CI (MacFadden, 1976)(Janssen 1983 -1986)Direct Liquid Introduction (1974)Thermospray (Marvin Vestal, 1983)(Janssen 1986 -1994)Particle Beam (Willoughby, 1984, EI en CI)Dynamic FAB (Caprioli, 1986)(Janssen 1994 -1996)
64AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Historisch overzicht LC-MS
Electrospray (1984, Doyle & Fenn)(Janssen 1994 - )APcI (1974, Horning, opvolger thermospray, doorbraak ’90)(Janssen 1997-)APPI en SSI (eind ’90)nog niet commercieel
65AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Deel 4: Electrospray
4.1 Algemene kenmerken4.2 Reden van succes4.3 Principe4.4 Experimentele gegevens
66AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
4.1 Algemene kenmerken
Electrospray is een fysisch verschijnsel beschreven in 1917 door Zeleny:door het aanleggen van een hoog-electrisch veld op een vloeistof in een capillair wordt een spray van geladen druppels gevormdWordt dagdagelijks toegepast in de verfindustrie (autolak)Dole, 1968, ionisatie-techniekFenn, 1984, introductie electrospray
67AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
4.1 Algemene kenmerken
Ionisatie gebeurt bij atmosferische druk en in de vloeistof faseZachte ionisatie techniek
Weinig inwendige energieLage kinetische energieDus weinig kans op fragmentatie
Ionisatie gebeurt bij lage temperatuur (<100°)Ideaal voor polaire, thermolabiele producten
68AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
4.1 Algemene kenmerken
Debiet vanaf 30 nL/min (nano-ES) tot 1 mL/minES is een ‘concentratiegevoelige’ detector, zoals UV, dus splitten mag!Bepalen van kleine moleculen (MW<100) tot macromoleculenrecord is het tetrameer van een hemoglobineachtige verbindingMW~4 000 000
69AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
4.1 Algemene kenmerken
Bij grotere moleculen meervoudige ladingen mogelijkKan gecombineerd worden met alle MS analysatorenZowel + als –Vb: HHM
70AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
4.1 vb: HHM
71AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
4.2 Reden van succes
Analyse van proteïnenZeer gevoeligGebruiksvriendelijkRobuustRelatief goedkoop
72AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
4.3 Principe
Aanleggen van een hoog electrisch veld (106 V/m, 3kV op een metalen tip van 100 µm)Spray van geladen druppels wordt gevormd Analyt-ion wordt gevormd in de vloeistoffase (klassieke zuur-base chemie)Geladen druppels verkleinen door solvent evaporatie
73AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
4.3 Principe
74AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
4.3 Theorie
Ion-evaporation model (Iribarne and Thomson)Druppel verkleint, Coulomb afstoting vergrootRaleigh limiet overschreven, druppel explodeert: ion in de gasfase (alleen kleine moleculen)
Mechanisme van Doyledoor solvent-evaporatie blijft uiteindelijk alleen ion over (alleen grote moleculen)
75AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
5.0 APcI
5.1 Algemene kenmerken5.2 Principe
76AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
5.1 Algemene kenmerken
Toepasbaar voor moleculen die apolairder zijn en minder ioniseerbaar dan deze voor ESMW<2000Vloeistof debiet 1 tot 2 mL/minMassa-gevoelig (kolom splitting reduceert gevoeligheid)In combinatie met alle massa-analysatorenIonisatie bij hoge temeratuur (~400°C)dus geen zachte ionisatie techniek
77AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
5.1 Algemene kenmerken
Ionisatie gebeurt in de gasfase, echte CIIonisatie gebeurt bij atmosferische druk+ en - ionenToepasbaar voor pesticiden, hormonen, …
78AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
5.2 Principe
Er wordt geen electrisch veld aangelegd aan de tipHoog vloeistofdebiet (1 mL/min – 2 mL/min)Een spray wordt gevormd door het eluens sterk te verhittenIonisatie van de solvent moleculen gebeurt dmv een onladingselectrodeDe geïoniseerde solvent moleculen ondergaan zuur – base reacties in de gasfase
79AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
5.2 Principe
80AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
5.2 Principe
81AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
6 Algemene toepassingen
6.1 Methode Ontwikkeling: SCM6.2 Methode Validatie: specificiteit6.3 Forced Degradation Studies6.4 Troubleshooting: identificatie onzuiverheden/afbraakproducten6.5 Gebruik van MS als supportieve techniek
82AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
6.1 Overzicht HPLC MO
Pro-Active Method
Development - Method Validation
Phase 1- Phase 2 methods
"Locked method"
Phase 3 Method
Development and validation
Supportive methods
Final Method
Development and
Validation
Secondarymethods
83AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Gedetailleerd overzicht
(4)InitialBatchStress
samples (17)Placebo Stability
Excipients (9) ReportStress
(1) (5) solutionNotification of Method screening Optimization Optimization Method descriptionDevelopment Experiments Phase 1 - 2 Method Method is "Locked"
(6) Stress MV level 1 - 2 (16)dry (12)
Peak purity (10) Selectivity SamplesLC-MS/PDA
(7) (15)Retain
Plan PMD the samples Identification/Peak purity ID Sheetstudy (11) LC-MS/PDA/NMR/Others
(3) (13) (14)
(8) Supportive method(s) HPLC CE TLC LC-MS CE-MS etc…
(2)
"Teamleader" co-ordinates the Method Development Process
84AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Screeningsmodule deel 1
85AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Purity bepalingen
Op basis van PDAOp basis van MS
86AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Purity met PDA
Via MassLynx routineEerst integrerenPeak Purity berekenen
0<P<100
Interpretatie P !!!P > 95 OK?
87AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Purity met PDA
Visueel (via overlay)Op basis van 3 PDA spectra
Up-slopeApexDown-slope
88AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Purity met MS
Visueel (via overlay)Op basis van 3 MS spectra
Up-slopeApexDown-slope
89AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Purity met MS
Via MassLynxBepalen van RIC/TIC
90AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
RIC/TIC
RIC = som van alle ionen die product gerelateerdzijnproduct + fragmenten + clustersTIC = som van alle ionenook achtergrond ionen + onbekende ionen + ...
RIC/TIC ≅ 1 (of 100%)
91AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
BPI
BPI = curve van alle basis ionen in de spectraIs soms beter dan TICVb: R149524
92AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
BPI
93AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Identificatie
Beperkte mogelijkhedenInstrumentatieAfspraak spectro
94AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Toepassing SCM deel 1
PurityVoorbeeld R184798
95AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Chemische structuur R184798
HO
O
NO O
O
Cl
HN
OH
96AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Voorbeeld van een sample list in SCM deel I
97AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
R184798 chromatogram
AO-053017:54:37
05-Oct-2000pH=10; 70 gradenSample stress WJAN
0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00Time-1
100
%
MO-90-R184798-1-1-4-16 2: Diode Array 230 1.00Da
1.06e612.35
13.27
98AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
R184798 purity
AO-053017:54:37
05-Oct-2000pH=10; 70 gradenSample stress WJAN
12.00 12.10 12.20 12.30 12.40 12.50 12.60 12.70 12.80 12.90Time0
100
%
MO-90-R184798-1-1-4-16 Sm (Mn, 2x3) 2: Diode Array 230 1.00Da
1.01e6Area
Area%100.00
Area220117.77
Height1005566
Time12.36
12.36;99%;220118
99AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
R184798 PDA-spectra
AO-053017:54:37
05-Oct-2000WJANpH=10; 70 gradenSample stress
200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400nm0
100
%
0
100
%
0
100
%
MO-90-R184798-1-1-4-16 1490 (12.568) Cm (1490-1441) 2: Diode Array 6.26e5210.0
MO-90-R184798-1-1-4-16 1465 (12.360) Cm (1465-1441) 2: Diode Array 2.11e6214.0
296.0
MO-90-R184798-1-1-4-16 1454 (12.268) Cm (1454-1441) 2: Diode Array 5.60e5210.0
100AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
R184798 PDA-spectra overlay
AO-053017:54:37
05-Oct-2000WJANpH=10; 70 gradenSample stress
200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400nm0
100
%
MO-90-R184798-1-1-4-16 1490 (12.568) Cm (1490-1441) 2: Diode Array 6.26e5210.0
101AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Screeningsmodule deel 2
102AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Toepassing SCM deel II
Purity en IdentificatieVoorbeeld R184798
103AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Voorbeeld van een sample list in SCM deel II
104AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
R184798 chromatogram peak purity
AO-053019:36:29
14-Nov-2000stress pH 2, 70C, 28 dagensample LVOS
12.00 12.10 12.20 12.30 12.40 12.50 12.60 12.70 12.80 12.90 13.00Time0
100
%
MO-90-009-008 Sm (Mn, 2x3) 3: Diode Array 230 1.00Da
8.47e5Area
Area%100.00
Area181795.14
Height845203
Time12.44
12.44;100%;181795
105AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
R184798 PDA overzicht
AO-0530stress pH 2, 70C, 28 dagensample LVOS 15-Nov-2000
200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400nm0
100
%
0
100
%
0
100
%
MO-90-009-030 1497 (12.582) Cm (1497-1451) 3: Diode Array 7.25e5210
MO-90-009-030 1474 (12.390) Cm (1474-1451) 3: Diode Array 2.00e6212
295
MO-90-009-030 1462 (12.290) Cm (1462-1451) 3: Diode Array 8.08e5210
106AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
R184798 PDA overlay
AO-0530stress pH 2, 70C, 28 dagensample LVOS 15-Nov-2000
200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400nm0
100
%
MO-90-009-030 1497 (12.582) Cm (1497-1451) 3: Diode Array 7.25e5210
107AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Overzicht massa spectra
AO-0530stress pH 2, 70C, 28 dagensample LVOS 15-Nov-2000
200 300 400 500 600 700 800 900 1000m/z0
100
%
0
100
%
0
100
%
MO-90-009-030 340 (12.739) Cm (340-326x2.000) 2: Scan ES+ 1.78e6427
411409130
171 213229
294 341
429
430 465 875853
569500585
669663693
837775728
877 998995921
MO-90-009-030 332 (12.434) Cm (332-326x2.000) 2: Scan ES+ 3.63e6427
409130
294182 186213393
296
429
430
853449 487 569528
747693571674
758 855 891 997975
998
MO-90-009-030 329 (12.320) Cm (329-326x2.000) 2: Scan ES+ 2.01e6427
409130
154 258193 296 341391
429
430 853465 569500 571 689679704
757772
819875
899 995939 997
108AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Overlay massaspectra
AO-0530stress pH 2, 70C, 28 dagensample LVOS 15-Nov-2000
200 300 400 500 600 700 800 900 1000m/z0
100
%
MO-90-009-030 340 (12.739) Cm (340-326x2.000) 2: Scan ES+ 1.78e6427
411409130171 213
229294 341
429
430449
465 875853
467 569500585
669663693
837775728
877 998995921
109AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
RIC/TIC
Via MassLynx(vrij ingewikkelde) procedure
110AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
RIC/TIC
AO-053019:44:24
15-Nov-2000LVOSstress pH 2, 70C, 28 dagensample
150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000m/z0
100
%
MO-90-009-030 331 (12.396) Cm (327:331-317:322x2.000) 2: Scan ES+ 1.97e5427.2
409.2
294.2186.2 217.2267.8
393.3378.9
302.4
428.2
449.1
853.3
451.1
465.1
467.1
487.1 500.1 569.0 689.3586.6
822.6770.0
855.3
875.3
877.3
878.4
995.1900.1
111AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
RIC/TIC
Sample Name: MO-90-009-030 Sample ID: sample
# Name RT Area1 RIC4 12.396 540242 RIC3 12.473 1787453 RIC2 12.396 1722274 RIC1 12.473 35829655 TIC 12.473 3955590
112AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Opstellen van ID-sheets
Doel: bundelen van gegevensOnzuiverheden APIAfbraakproducten
Start bij AO-MO-CHROMAO server-Applications-ID-sheetsVroeger: overdracht SpectroNu: MO-CHROM blijft verantwoordelijk
Voorbeeld: R184798
113AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Voorbeeld ID-sheet R184798
114AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Voorbeeld ID-sheet R184798
115AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Voorbeeld ID-sheet R184798
116AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Eindresultaat R184798
117AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
6.2 Methode validatie: Specificiteit
SpecificiteitVoorbeeld Galantamine
118AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Specificiteit
Specificity is the ability to assess unequivocally the analyte in the presence of components which may be expected to be present. Typically, these might include impurities, degradation products, matrices, etc…
119AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Acceptatie criteria
All placebo and blank peaks should be separated from degradants, impurities and the main compoundAll specified and selectivity related substances should be separated from the main compoundAll specified degradants should be separated from each otherAll selectivity degradants and impurities should be separated from the specified degradants and impurities
120AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Acceptatie criteria
All specified impurities should be separated from the degradants and preferably be separated from each otherThe PDA spectra and the ES-MS peak purity analysis should confirm that the API peak is indeed pureThe PDA spectra are comparableThe ES-MS spectra are comparable
121AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Sample list van de specificiteitsstudie van
Galantamine
122AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
6.3 Forced Degradation Study(FDS)
Momenteel nieuwe richtlijnen op komst
123AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
6.3 Forced Degradation Study (FDS)
FDS is an experiment in which the stability indicating power of the assay/purity method for DP has to be demonstrated
124AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
6.3 Forced Degradation Study (FDS)
Wordt meestal uitsluitend toegepast voor HPLC Is geen stabiliteitstudie!Wordt uitgevoerd door de ontwikkelaar zelf
125AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
6.3 Forced Degradation Study(FDS)
Zowel placebo als DP in oplossingTijdsduur experiment: 7 dagen4 meetpunten:
0 en 7 dagenTwee intermediairen
Maximale afbraak 15% na 7 dagenWelke condities?
126AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
6.3 Forced Degradation Study (FDS)
0.01N HCl 70°C 0.01N NaOH 70°C0.03% H2O2 25°CLicht Xe-lamp (cfr. ICH)
127AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
6.3 Forced Degradation Study (FDS)
Peak purity APIPeak purity gespecifieerdeonzuiverheden/afbraakproductenIdentificatie ‘belangrijkste’ onbekenden
128AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
6.3 Forced Degradation Study(FDS)
LC-MS apparatuurPDA 200 - 400 nmMS:
ES ⇔ APcI+ ⇔ -Enkel Q
129AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
6.4 Troubleshooting
Identificatie van onzuiverheden, afbraakproducten, ….
Relatief beperkt (Q) ⇒ hulp SpectroLC-MS niet afhankelijk van UV-chromofoor!
130AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
6.5 Supportieve methode LC-MS
Bepaling van palmitinezuur in project R092670 d.m.v. ES negatief
131AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
R092670
ProbleemPalmitinezuur geen UV-absorptiePalmitinezuur ES neg respons
Aantonen mogelijk?Semi-kwantitatief?
Afbraakproduct na bestraling?Afbraak in stabiliteit DP?
132AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
UV + MS chromatogram palmitinezuur
AO-039517:17:57
22-Jun-20000.5% palmitinezuur lot 00310275
WJAN
5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00 60.00 65.00Time1
100
%
-9
100
%
palm_40 2: Diode Array 275 1.00Da
9.59e31.13
palm_40 1: Scan ES- TIC
4.86e651.86
133AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
UV + m/z 255 van MR092670PUA021
AO-039502:06:36
23-Jun-2000MR092670PUA021
WJAN
5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00 60.00 65.00Time-5
100
%
0
100
%
R092670B 1: Scan ES- 255 1.00Da
1.26e351.98
19.5314.01
11.319.335.691.51
7.71
18.24
34.8623.28
26.13
30.83
29.01
44.8537.11
39.50
46.4350.07
58.3754.0355.38
60.72
R092670B 2: Diode Array 275 1.00Da
6.47e3
11.85
8.732.40
24.88
17.8441.31
37.53
55.95
48.16
134AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
UV + m/z 255 van ZR092670EXA002
AO-039503:22:30
23-Jun-2000ZR092670EXA002
WJAN
5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00 60.00 65.00Time-3
100
%
0
100
%
R092670C 1: Scan ES- 255 1.00Da
4.48e351.98
16.7812.93
7.144.732.21 9.63
34.3319.4932.0828.7623.11
44.8337.20 40.65 50.5648.25 54.18 56.90
R092670C 2: Diode Array 275 1.00Da
8.04e3
24.8413.38
2.38 8.5317.77
19.52
37.53
34.78
29.35
41.30
39.42
46.55
48.15
55.91
54.31
52.49
135AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
UV + m/z 255 van 00J16/F10
AO-053019:17:43
24-Nov-200000J16/F10 start
LVOS
5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00 60.00 65.00Time-1
100
%
1
100
%
MO-8-003-004 1: Scan ES- 255 1.00Da
6.61e651.90
4.191.03 9.036.69 14.5611.76 21.7918.16 43.7025.66 33.1329.16 37.56 40.13 47.56 49.9060.9054.67 57.63 64.03
MO-8-003-004 2: Diode Array 275 1.00Da
1.09e4
13.29
11.618.37
40.9634.60
23.6419.8237.26
46.24
54.4647.67
136AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
SIR m/z 255
137AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
UV van ZR92670EXA005 + SIR m/z 255
138AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
7. Enkele praktische problemen
139AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Voorbeeld 1
Opletten met het gebruik van cyclodextrinen in stabiliteitsstalen
140AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
HPβCD
141AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Voorbeeld 1:UV-chromatogramR160371
AO-053014:48:38
12-Oct-2000pH=6; 70 graden
WJAN
2.50 5.00 7.50 10.00 12.50 15.00 17.50 20.00 22.50 25.00 27.50 30.00 32.50 35.00Time-20
100
%
MO-R160371-1-1-005-3 2: Diode Array 230 1.00Da
5.00e424.04
1.14
142AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Voorbeeld 1:UV+MS chromatogram R160371
Stress sample
AO-053014:48:38
12-Oct-2000pH=6; 70 graden
WJAN
2.50 5.00 7.50 10.00 12.50 15.00 17.50 20.00 22.50 25.00 27.50 30.00 32.50 35.00Time8
100
%
-81
100
%
MO-R160371-1-1-005-3 2: Diode Array 230 1.00Da
1.25e424.041.14
MO-R160371-1-1-005-3 1: Scan ES+ TIC
5.09e97.03
6.13
4.781.28
3.43
2.83
8.088.48
24.08
23.7317.98
34.08
143AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Voorbeeld 1: MS spectrum
AO-053014:48:38
12-Oct-2000WJANpH=6; 70 gradenStress sample
150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000m/z0
100
%
MO-R160371-1-1-005-3 140 (7.026) 1: Scan ES+ 6.18e7279.1
221.0
203.0
185.0
155.2
222.0
441.1
383.1
280.1337.0
325.0
384.0
385.1
603.0
545.0
499.0
442.1
487.2
500.1546.1
557.0
823.2661.2
604.1
605.0
765.1
662.2
719.3
663.4
766.2
767.0
985.3
881.2824.2
927.4
882.2928.2
986.2
144AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Voorbeeld 2: fosfaat buffer
Opletten met het gebruik van fosfaatbuffer in stabiliteitsstalen
145AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Voorbeeld 2: fosfaat buffer massaspectrum
146AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Voorbeeld 3: polymeren
Gebruik van polymeren in formuleringen, zoals OpaDry (PEG)
147AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Voorbeeld 3: polymeren
148AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Voorbeeld 4: modifiers en zouten
Modifiers beperken in concentratieS/N daalt (ion supression)Organische zouten kunnen bepaald worden
149AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Voorbeeld 4: modifiers en zouten
Voorbeeld: T002187DEA gebruikt in de HPLC methode
150AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Voorbeeld 4: modifiers en zouten
151AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Voorbeeld 4: modifiers en zouten
152AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Voorbeeld 4: modifiers en zouten
153AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Voorbeeld 4: Na-acetaat
154AO-MO-CHROM - 14 februari 2001 – cursus LC-MS 2001 - WJAN
Besluit
MS toegevoegde waarde MO-CHROMOnafhankelijk van UV-chromofoorZeer gevoeligSemi-kwantitatief (Q)Koppeling met GC,LC,CE,CEC,…MS/MS
identificatiekwantificatieverhoogde selectiviteit (HR)