Upload
juliana
View
1.490
Download
4
Embed Size (px)
Citation preview
BIOSENZORI
1. Definitie
2. Elemente biologice
3. Metode de imobilizare a elementului biologic
4. Traductori
5. Aplicatii
Un biosenzor este un dispozitiv format dintr-un element biologic (enzimă, biomoleculă, anticorp, celule microbiane, ţesut, etc) ce este imobilizat în vecinătatea unui traductor (electrochimic, optic, termic, etc) ce transformă un semnalul chimic rezultat în urma interacţiei analitului cu elementul biologic într-un răspuns măsurabil, de obicei într-un răspuns electronic.
Ce este un biosenzor?
Analit / bioreceptor / traductor / procesorAnaliti• microorganisme anthrax, tularemia, E. coli, Candida
• molecule miciglucoza, alcool, CO, CO2, agenti paralizanti, uree, pesticide, aspirina, paracetamol,
penicilina, TNT, colesterol, aminoacizi
• biomacromoleculeDNA, RNA, enzime, proteine, hormoni, virusi
1) ENZIME - cele mai utilizate in constructia biosenzorilor- catalizatori ai unor reactii- se poate utiliza o enzima sau se pot cupla doua sau
mai multe reactii enzimatice cu producerea unui compus ce poate fi determinat prin diverse metode
Elemente biologice
Enzime utilizate in biosenzori- cele mai multe sunt enzime REDOX (reductaze, oxidaze) producatoare /
consumatoare de electroni: detectie amperometrica sau colorimetrica- enzimele hidrolitice (proteaze, lipaze, esteraze) producatoare /
consumatoare de electroni: detectie potentiometrica sau conductometrica- sisteme enzimatice cuplate, cum ar fi peroxidaza cuplata cu luciferaza
ce duce la obtinerea unui produs colorat sau la emisia de fotoni: detectie optica
2) ANTICORPI / ANTIGENI Anticorpii
- proteine ce pot recunoste in mod specific o substanta specifica (antigen) ca mijloc natural de aparare
- caracterizati de interactii extrem de selective si puternice cu antigenii specifici
- pot fi obtinuti anticorpi pentru aproape orice antigen
Antigen binding sites
Light Chain
Heavy Chain
Anticorpii in biosenzori
Avantaje: - selectivitate foarte inalta; realizare de legaturi
puternice
Dezavantaje: - nu prezinta efect catalitic, fiind necesara
determinarea lor indirecta prin marcarea lor cu diversi agenti de marcare
Agenti de marcare: radio-izotopi, enzime, fluorofori, compusi chemiluminiescenti
Obs. In cazul traductorilor Piezoelectrici se poate face o determinare directa datorita modificarilor in frecventa de vibratie a cristalului in urma legarii antigenului
Y Y Y
Y Y Y
Y Y Y
Y Y YY Y Y
Y Y Y
Enzyme Linked Immuno-Sorbant Assay (ELISA)
3) PROTEINE RECEPTOR- proteinele receptor se afla de obicei la suprafata celulei
sau in membrana celulara.
- pot fi utilizate in special la determinarea neuro-transmitatorilor, hormonilor, medicamentelor neuro-active, anestezicelor, etc.
- extrem de selective, dar adesea greu se izolat, putandu-se utiliza si biomembrane intacte sau celule intregi.
4) ACIZI NUCLEICI- ADN-ul si ARN-ul pot fi utilizati pentru realizarea unor senzori in format chip
- biosenzorii bazati pe ADN si ARN se utilizeaza pentru detectia mutatiilor genetice si pentru determinarea nivelurilor de expresie a proteinelor.
5) CELULE / TESUTURI - biosenzorii bazati pe celule sau tesuturi sunt mai putin selectivi
- utilizati in special pentru determinari semicantitative; pentru determinarea indicilor de toxicitate
IMOBILIZARE
Legare covalentă
Legare încrucişată
Fizică
Chimică
Reţinere fizică în spatele unei membrane permeabile pentru molecule mici
Înglobare în reţeaua unui polimer
Adsorbţie
Metode de imobilizare a componentei biologice
Imobilizare eficienta:- orientare corecta a elementului biologic- accesibilitatea analitului la elementul biologic- retinerea activitatii biologice- difuzie usoara a analitului catre elementul biologic- Stabilitate operationala si durata de viata
In cazul imobilizarii chimice este necesara prezenta unor grupari functionale la nivelul elementului biologic sau functionalizarea acestuia.In cazul imobilizarii proteinelor pot fi exploatate urmatoarele grupari functionale ale aminoacizilor
Lizina (NH2) Cisteina (SH) Serina (OH) Acid Aspartic (COOH)
+ Stabilitate marita
+ Un bun control asupra orientarii elementului biologic in cazul imobilizarii covalente
+ In cazul utilizarii unui electrod ca traductor, la imobilizare se poate utiliza un agent de legare conducator de electroni ducand la o eficienta mai mare a semnalului electronic
- Afectarea structurii elementului biologic si pierderea selectivitatii / activitatii catalitice in timpul reactiilor chimice de imobilizare (in special in cazul legarii incrucisate)
- Rezistenta mecanica a sistemului poate fi slaba
+ Nu este afectata structura elementului biologic
+ Limiteaza contaminarea cu proteine prezente in proba
+ Limiteaza biodegradarea elementului biologic
- Difuzia analitului catre elementul biologic poate fi incetinita
- Retinerea unor molecule nedorite (interferente) in spatele membranei sau in reteaua polimerului
- Pierderea elementului biologic
IMOBILIZAREA FIZICA
IMOBILIZAREA CHIMICA
IMOBILIZAREA BAZATA PE AFINITATE BIOLOGICA
Element biologic
Biotina
Avidina (proteina tetramerica)
Biotina
Traductor
1. Sistemul avidina - biotina
Element biologic
Antigen
Anticorp
traductor
2. Sistemul antigen - anticorp
fibronectin tri-peptida RGD (Arg-Gly-Asp) in EMC Peptide RGD
Integrine (factori de atasare)
Celule cu ‘integrine’ de suprafata
Matrice extra-celulara (EMC)
traductor
3. Imobilizarea celulelor bazata pe afinitate biologica
• Adsorbtie 1 zi• Inglobarea in polimer 1 saptamana• Legare incrucisata 3- 4 saptamani• Imobilizare covalenta 4-14 luni• Afinitate biologica saptamani - luni (variabil)
Timp de viata
• se formeaza prin adsorbtia pe suprafete de aur a unor derivati alcan-tiolici X(CH2)nSH
• sunt caraterizate printr-o orientare foarte precisa
Functionalizarea suprafetei traductorilor
1) Monostraturi auto-asamblate (Self-assembled Monolayers - SAMs)
Tiol dizolvat in etanol
Suprafata de aur imersata in solutie
Monostrat auto-asamblat
Grup functional :OH, NH2, COOH
Alcan
SH
2) Silanizarea oxizilor metalici
C2H5O C2H5OC2H5O
+ H2O +
X
C2H5O C2H5OC2H5O
+ H2O +
O O O O
Hidroliza
Condensare
Sticla (SiO2)sau alt oxid metalic
O O O
Grup functional
Alcan
Si
Agenti pentru prevenirea adsorbtiei non-specifice
PEG (poli-etilenglicol)
Fosfocolina - componenta a membranelor biologice
Albumina serica- proteina serica neadeziva
Heparina- Zahar ce previne coagularea sangelui
TRADUCTORI
1. Traductori electrochemici a)Potentiometrici:
- se masoara potentialul celulei electrochimice la curent zero. Potentialul celulei este proportional cu concentratia ionilor.
- in constructia biosenzorilor potentiometrici intra de obicei enzime ce determina schimbari semnificative ale pH-ului: penicilinaza, ureaza, esteraza.
Electrod de referinta
V
Punte de sare
Proba
Electrod de lucru
Enzima imobilizata la suprafata electrodului
b) Amperometrici
- se aplica un potential intre un electrod de lucru si un electrod de referinta, masurandu-se in mod continuu curentul din celula.
- cele mai utilizate enzime sunt oxidoreductazele: glucozoxidaza, colesterol oxidaza, aminoacid oxidaza, etc.
Glucoza Acid gluconic
Oxigen Apa oxigenata
Glucozoxidaza
ELECTRODE
2H+, 2e-
5.4mM
ELECTROD
2H+, 2e-
curentc) Conductometrici
- se masoara conductanta / rezistenta unei solutii- se pot utiliza cand in timpul conversiilor enzimatice sunt generate sarcini electrice (amidase, esterase, kinaze).
Examplu: determinarea ureei (in urina) utilizand ureaza:
Urea + 2H2O 2NH4+ + HCO3
ureaza
+ usurinta in operare+ interfata directa cu sistemul electronic+ posibilitate de miniaturizare - selectivitate limitata, fiind necesara utilizarea mediatorilor pentru imbunatatirea acesteia- poate fi aplicata numai sistemlor la car eparticipa specii electrochimic active
(Dez)avantaje ale biosenzorilor electrochimici
Tehnici optice ce pot fi utilizate in domeniul biosenzorilor:• absorbtia in UV / Vizibil• emisie de fluorescenta (fosforescenta)• Bio-luminescenta• Chemi-luminescenta• Spectroscopie de Reflexie Interna (IRS)• Metode bazate pe dispersia luminii
Despozitive necesare: tuburi fotomultiplicatoare, spectrofotometre, fluorimetre, fibre optice, ghiduri de unda
2. Traductori optici
Proprietatea unor molecule (fluorofori) de a absorbi lumina la o anumita lungime de unda (de obicei in UV) urmata de emisie de lumina la o alta lungime de unda (in Vizibil).
Aplicatii: chip-uri ADN, imunoanaliza
Fluorescenta
FRET consta intr-o interactie, dependenta de distanta, dintre doi fluorofori, in care energia de excitare a unuia (donor) este transferata la celalalt (acceptor) fara emisie de fotoni.
Eficienta FRET este dependenta de distanta intermoleculara si este utila la distante comparabile cu dimensiunea macromoleculelor biologice.
Fluorescenta de transfer a energiei de rezonanta (FRET)
(Dez)avantajele traductorilor optici
+ usurinta in operare+ pot raspunde simultan la analiti diferiti+ precizie mare + posibilitatea utilizarii fibrelor optice pentru un ‘transport al fotonilor’ mai eficient+ extrem de sensibili (in special in cazul celor bazati pe fluorescenta si luminescenta)
- depind de disponibilitatea compusului cu proprietati optice- domeniu dinamic de aproximativ 102 (in cazurile in care se aplica legea Lambert-Beer)- dificultati in miniaturizare- timpul de raspuns poate fi mare- interferenta altor compusi prezenti in matrici complexe- interferenta luminii exteriaore in cazul traductorilor luminescenti
Traductori termici- formarea / ruperea legaturilor chimic in reactiile enzimatice duc la modificari de entalpie- pot fi detectate modificari ale temperaturii solutiilor de 10-3 K - pentru o detectie mai buna reactiile de interes pot fi cuplate cu alte sisteme enzimatice ce produc mai multa caldura (de ex., glucozoxidaza poate fi cuplata cu catalaza)
+ pot fi utilizate pentru majoritatea reactiilor- selectivitate scazuta- dificultati in miniaturizare
anticorp
antigen
Cristal piezo-electric
Frecventa (f) oscilatiilor cristalului depinde de masa cristalului (m) si de cea a oricarui material adsorbit pe suprafata sa (A).
Frecventa oscilatiilor descreste cu masa adsorbita.
Materiale piezolectrice : cuartz, materiale ceramice, polimeri organici
Traductori piezoelectrici
+ extrem de sensibili (determinarea antigenului in domeniul picogramelor) + posibilitate de determinare a antigenilor atat in faza gazoasa, cat si in faza lichida+ portabilitate+ Timp scurt de raspuns+ Nu necesita marcare- adsorbtia nespecifica a proteinelor poate duce la rezultate false
Biosenzori amperometrici bazaţi pe imobilizarea componentei biologice pe / în membrane obţinute prin electro-polimerizare direct la suprafaţa electrodului de lucru.
Membrane conductoare (poli-pirol)
Membrane ne-conductoare (poli-tiramina)
BIOSENZORI BAZAŢI PE ELECTROZI SERIGRAFIAŢI
CEREWE
1 cm
Producţie de serie
Preţ de cost scăzut
Uşor de înlocuit
Necesită volume mici de probă
Potriviţi pentru determinări pe teren
0 0.250 0.500 0.750 1.000-5-0.100x10
0
-50.100x10
-50.200x10
-50.300x10
-50.400x10
-50.500x10
-50.600x10
-50.700x10
E / V
i / A
Voltamograma înregistrată la obţinerea biosenzorului pentru glucoză prin electropolimerizare pe electrozi serigrafiaţi
PERFORMANŢE CERUTE ALE BIOSENZORILOR
1. Precizie
2. Sensibilitate si selectivitate
3. Domeniul de analiză
4. Viteza de răspuns
5. Capacitate de reutilizare
6. Calibrare simplă
7. Robusteţe fizică
8. Preţul de cost
9. Uşurinţa în utilizare
10. Siguranţa produsului
Environmental factors that affect bio- interactions and biosensor performance • Presence of interfering molecules (e.g. enzyme inhibitors)
• Denaturing agents (organic solvents and detergents)
• Hydrophobic surfaces
• Ionic strength, unfavourable pH
• Analyte concentration (Saturation; e.g. all antibody binding sites filled)These factors can significantly affect the selectivity, specificity and tightness of binding.
Hence, analyte solutions commonly need to be prepared prior to analysis (neutral pH, no detergents, certain concentrations).
Test de sarcinaGlucoza
Antrax
• medical glucose, alcohol, DNA, RNA, proteins, hormones, aspirin,paracetamol, penicillin
• industrial bio-processesamino acids, yeast, lactic acid, ethanol, etc.
• environmental pesticides,fertilizers,oestrogen mimicks, CO, CO2
• defense/forensicanthrax, small pox, ricin, nerve agents, TNT, cocaine
Application areas