COMPARACIÓN DE TÉCNICAS DE MICROPROPA- -GACIÓN EN Coffea arabica

 

Rolando Macías MorenoA00988401Daniel Muñoz MayorgaA00988085Rolando Piña FloresA00987927Betzaira del C. Aceves MuñozA01062852

Introducción Estimulante del sistema nervioso,

debido a la alta concentración de la cafeína.

Fuente de antioxidantes fenólicos. Industrialmente muy rentable.

- Pulpa- Cáscara- Residuos industriales

Introducción Uno de los principales cultivos

económicos de Centroamérica. De gran importancia económica para

México gracias condiciones climáticas. Elevar rendimientos, seleccionar

variedades apropiadas, mejores sistemas de cultivo, mantener adecuado control de insectos y protección contra las enfermedades (UDLAP,2012).

Introducción Principal fuente de ingreso para casi

cuatro millones de mexicanos. Cultivado en 4,500 comunidades. 5% del Producto Interno Bruto (PIB) y el

14% de las exportaciones agrícolas. (Saharrea., 2007)

Introducción Importancia de tener un proceso

estandarizado para el cultivo de café.- libre de patógenos- sano- optimización de recursos - mejor calidad- reducción del tiempo de cultivo

Introducción Necesidad de implementación de las

técnicas de cultivo de tejidos vegetales. - Estimulación de yemas axilares o adventicias.- Embriogénesis (directa o indirecta)

Reguladores de crecimiento Fitohormonas: pueden inhibir o

promover algunos procesos en los vegetales.

4 Grupos:AuxinasGiberelinasCitocininas  Etileno.

Auxinas Estimulan la elongación de las células.

(Universidad Politécnica de Valencia, 2003)- ANA (ácido naftalenacético)- IBA (ácído indolbutírico)- 2,4-D (ácido 2,4 diclorofenoxiacético)- NOA (ácido naftoxiacético)- 2,4-DB (ácido 2,4 diclorofenoxibutilico)- 2,4,5,-T (ácido 2,4,5 triclorofenoxiacético)

Citoquininas Gobiernan división celular y

diferenciación en tejidos vegetales. Control del desarrollo y la senescencia. Se adicionan a los medios de cultivo

para estimular la división celular, inducir la formación de vástagos e inhibir la formación de raíces. (Universidad Politécnica de Valencia, 2003)

Efecto de las hormonas El tipo de morfogénesis que ocurra en un

tejido vegetal depende de la concentración y la relación auxinas/citoquininas en el medio de cultivo.

Las relaciones son las siguientes:- Citoquinina/Auxina elevada, da

lugar a la formación de tallos.Citoquinina/Auxina baja, da lugar a la

formación de raíces. (Buchanan, 2000)

Vitaminas Necesarias por las células vegetales

como productos intermedios esenciales o catalizadores metabólicos.

Células y tejidos de plantas son deficientes productores en algunos factores; por esta razón es necesaria la adición de vitaminas al medio de cultivo. (Sarkar, 2009)

Vitaminas Las vitaminas que serán utilizadas para el

cultivo in vitro de coffea arabica son:

Mioynositol, estimula el crecimiento de cultivos de células determinadas. (P.T., 2003)

La tiamina es una serie de elementos clave del metabolismo de carbohidratos y la biosíntesis de algunos aminoácidos. (Sigma-Aldrich, 2012)

Aminoácidos Cisteína: desempeña un papel indirecto

muy importante de la protección de las células del estrés oxidativo. (Sigma-Aldrich, 2012)

Antecedentes La utilización del café data del año 800

d.C. El primer registro histórico del café se

sitúa en la región etíope de Kaffa, en torno al siglo X.

Los primeros documentos atribuían a la planta del cafeto propiedades curativas. (Club Salvador, Maestros del Café, 2011)

Antecedentes En el siglo XVI se cnvierte en la bebida

social por excelencia del mundo árabe y posteriormente en América y Asia. (Club Salvador, Maestros del Café, 2011)

El café llegó a México en 1795, su cultivo se concentró en el estado de Veracruz, para luego expandirse a Chiapas y Oaxaca durante el siglo XIX. (Reyes-Loperena, 2008)

Antecedentes

Primer informe registrado sobre tejido de cultivos de coffea arabica realizado por Staritsky (1970).

Usó segmentos de entrenudos de los tallos jóvenes como explantes.

Obtención de rápido crecimiento de callo utilizando una versión modificada Linsmaier y Skoog (1965) suplementado con sacarosa (30 gL-1), tiamina HCl (1 mg.L-1), L-cisteína HCl (10 mg.L-1), mioinositol (100 mg.L-1), kinetina (0,1 mg.L-1), ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D, 0,1 mg.L-1) o naftaleno acético (NAA, 1 mg. L-1). (Staritsky, 1970)

Antecedentes Sharp et al. (1973) establecieron callo a partir de

semillas, tallos, hojas y las anteras de Coffea arabica Encontraron condiciones como ausencia de iluminación y

una temperatura de 28 ° C en la que las células proliferan callos de manera más eficiente. (Sharp, et al., 1973)

Mónaco y colaboradores (1974) obtuvieron una rápida proliferación celular en la superficie de los explantes de las frutas en desarrollo con semillas inmaduras de Coffea arábica y Coffea stenophylla que fueron cultivadas en la oscuridad a 25-28 ° C y en un medio utilizado por Staritsky (1970), pero en ausencia de 2,4-D. (De los Santos, 2006).

Antecedentes Herman y Haas (1975) obtuvieron la

propagación clonal de C. arabica mediante la formación de callos.

Söndahl y Sharp (1977, 1979) establecieron las condiciones para la formación de embriones somáticos a partir de callos de hoja inducida por auxinas. (De los Santos, 2006).

Antecedentes Base para el desarrollo y la optimización de

las técnicas de cultivo de tejidos vegetales en las especies de café. (De los Santos, 2006)

Otros trabajos: Dublin 1981, Pierson 1983, Yasuda 1985, García and Menéndez 1987, Hatanaka et al.1991, Neuenschwander and Bauman 1991, Bieysse et al, 1993, Menéndez and Nieto 1994, Menéndez and García 1997.

Antecedentes No se ha logrado estandarizar un

protocolo general para el cultivo de las especies de café

Justificación El cultivo in vitro tiene un rol muy importante en

la mejora agrícola mundial. Multiplicación de café por semillas, da como

resultado una redistribución de los genes en la progenie que conduce a la heterogeneidad considerable y una pérdida de las características de la planta seleccionada.

Hasta hace poco, la multiplicación idéntica a gran escala, de una selección de los árboles de café con una estructura genética híbrida era imposible. (Vásquez, 1997)

Justificación Con el cultivo in vitro, un conjunto de

variedades se pueden presentar en menos de 10 años.

Velocidad es esencial cuando la aparición de nuevas enfermedades tiene que ser contrarrestada. (CIRAD, 2008)

A partir de fragmentos de hojas simples tomadas de los árboles seleccionados, la embriogénesis somática genera enormes cantidades de los llamados “embriones somáticos”.(CATIE, s.f.)

Justificación Obtención de híbridos de café con

características deseables en cuanto a calidad de bebida, productividad, tolerancia a enfermedades ha impulsado al desarrollo de técnicas de clonación,

Si no se contarán con este tipo de herramientas biotecnológicas, el tiempo de desarrollo de nuevos híbridos bajo el método de multiplicación por semilla podría ser de 30 a 35 años.

Objetivo general Determinar mediante embriogénesis

indirecta, inducción de brotes y germinación in vitro las condiciones más efectivas para propagar Coffea arabica, estableciendo la concentración ideal de hormonas que debe contener el medio para el desarrollo óptimo de la planta de café.

Objetivos específicos Obtención de una planta de Coffea arabica para

extraer diversos explantes. Establecimiento del protocolo para obtener

plantas de Coffea arábica mediante los métodos de embriogénesis indirecta, indicción de brotes y germinación in vitro.

Preparación de medios de cultivo necesarios para cada técnica utilizando las concentraciones y barridos hormonales necesarios.

Siembra de explantes en cada técnica.

Métodos Desinfección y definición de medio de

cultivo para aplicar: germinación in vitro, generación de brotes y generación de callo.

Medio MS Basal

Tabla 1 . Composición de sales del medio de cultivo MS basal.

Medio MS Basal Al medio MS fue suplementado con:

- 10 ml de Hierro-EDTA.- 10 ml de vitaminas esenciales.- 10 ml de inositol.- 40 gr de sacarosa.

Germinación in vitro Medio de cultivo a 50% sin hormonas (De García y Rafael,

1989). Sumergir en H2SO4 durante 25 segundos y enjuagar con

agua destilada. Colocar en un papel filtro y lavar en agua destilada con

agitación por 30 minutos. Desinfectar usando 50 ml de agua destilada con 3 gotas de

Mycrodin por 25 minutos en agitación. Transferir a 50 ml de etanol al 70% por 2 minutos en

agitación continua. Transferir a NaOCl al 20% con 3 gotas de Tween 80 durante

15 minutos en constante agitación. Colocar en un frasco con medio de cultivo e incubar.

Generación de brotes Barrido hormonal de BA y ANA. Identificación de concentración ideal de

ambas hormonas para el óptimo desarrollo de brotes.

Generación de brotes Explante a partir de corte de hoja sana,

de aproximadamente 7mm2 o 1cm2 y que no incluyó nervadura central, para evitar la propagación de bacterias.

No se usó etanol ya que es tóxico para las plantas de Coffea arabica (Söndhal, 1985).

Generación de brotes Preparación de una solución hipoclorito

de sodio al 20% (v/v). Añadir 3 gotas de detergente Tween 80

por cada 200 ml de agua destilada. Mantener los explantes en agitación

suave durante 20 minutos. Colocar en cajas Petri con medio de

cultivo e incubar.

Generación de callo Diferentes tipos de medio de acuerdo

con la etapa en la que se encuentre el proceso.

Para obtención de callo es necesario añadir al medio de cultivo hormona KIN a una concentración de 20 μM y 2,4-Diclorofenoxiacético a una concentración de 0.05 μM (Söndhal, 1985).

Generación de callo Los callos deben ser transferidos a un

medio similar al de inducción de callo, pero con ANA y KNO3 en las combinaciones mostradas en la Tabla 3 (Moncada, Vielma & Mora).

Tabla 3 . Combinación de tratamientos para diferenciación en embriones.

Generación de callo Los embriones somáticos diferenciados

deben ser transferidos a un medio de cultivo con las mismas características que el de inducción de callo, pero con sacarosa 20 g / l y sin reguladores de crecimiento, con 16 horas de fotoperiodo (Moncada, Vielma & Mora).

Resultados Monitoreo de cajas Petri. Las cajas se pesaron al inicio y al final

del periodo de incubación. Contaminación por hongos y bacterias

en algunas cajas.

Generación de brotes

Generación de brotes

Generación de callo

Interpretación de resultados

Cotización

Conclusiones

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Bioquímica y Biología Molecular de Plantas, Centro de Investigación Científica de Yucatán. http://www.scielo.br/pdf/bjpp/v18n1/a15v18n1.pdf)

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