crzp.uniag.skcrzp.uniag.sk/Prace/2011/L/2AF4EC9D17194DC8BC6D3200EB6… · Web viewSýtosť leptín signalizuje účinkom orexigenických peptidov na sekréciu neuropeptidu Y (NPY),

SLOVENSKÁ POĽNOHOSPODÁRSKA UNIVERZITA V NITRE

NÁZOV FAKULTYNÁZOV VYSOKEJ ŠKOLY

3132815

DIZERTAČNÁ PRÁCA

2011 Ing. Zuzana LIESKOVSKÁ

SLOVENSKÁ POĽNOHOSPODÁRSKA UNIVERZITA V NITRE

FAKULTA AGROBIOLÓGIE A POTRAVINOVÝCH ZDROJOV

GENETICKÉ MARKERY PORÚCH METABOLIZMU

LIPIDOV A VÝŽIVY ĽUDÍ

DIZERTAĆNÁ PRÁCA

Študijný program: Výživa

Pracovisko (katedra/ústav): Katedra genetiky a plemenárskej biológie

Vedúci dizertačnej práce: doc. Ing. Anna Trakovická, CSc.

Nitra 2011 Ing. Zuzana LIESKOVSKÁ

Čestné vyhlásenie

Podpísaná Zuzana Lieskovská vyhlasujem, že som záverečnú prácu na tému

„Genetické markery porúch metabolizmu lipidov a výživy ľudí“ vypracovala

samostatne s použitím uvedenej literatúry. Som si vedomá zákonných dôsledkov

v prípade, ak uvedené údaje nie sú pravdivé.

V Nitre 30. júna 2011

......................................

Poďakovanie

Ďakujem svojej školiteľke, doc. Ing. Anne Trakovickej, CSc. za vytvorenie

podmienok pre úspešné riešenie dizertačnej práce a konzultantovi Ing. Michalovi

Gáborovi, PhD. za odborné rady a nápady. V neposlednom rade chcem poďakovať

mojej rodine, priateľom a kolegom za celkovú podporu pri dokončení mojej dizertačnej

práce.

Abstract

Cieľom dizertačnej práce bola analýza génov LEP, LEPR a GHSR, ako

genetických markerov porúch metabolizmu lipidov a výživy ľudí.

Polymorfizmus génov bol identifikovaný metódami PCR-RFLP a HRM. Asociačné

štúdie boli zamerané na hodnotenie vplyvu génov LEP, LEPR a GHSR na body mass

index a hladinu cholesterolu, HDL cholesterolu, LDL cholesterolu, triacylglyceridov

a glukózy v krvi .

Pri polymorfizme LEP génu (G-2548A) bol analyzovaný fragment s veľkosťou

242 bp. V experimentálnej skupine bola frekvencia alely A 0,46 a frekvencia alely G

0,54. Asociačné štúdie zamerané na sledovanie vplyvu genotypu na biochemické

parametre potvrdili, že ľudia s genotypom AG mali hladiny biochemických parametrov

v referenčnom intervale. Genotyp GG mal negatívny vplyv na hodnotu body mass

indexu (+2,0499), hladinu triacylglyceridov (+0,1445) a hladinu glukózy (+0,3971).

Pri polymorfizme LEPR génu (Gln223Arg) bol analyzovaný fragment s veľkosťou

416 bp. Frekvencia alely A aj alely G bola 0,50. Asociačné štúdie zamerané na

sledovanie vplyvu genotypu na biochemické parametre potvrdili, že ľudia s genotypom

AG mali hladiny biochemických parametrov v referenčnom intervale. Asociačnými

štúdiami zameranými na vplyv genotypu na biochemické parametre sme zistili

negatívny vplyv pri genotype GG, pretože zvyšuje hodnotu body mass indexu

(+1,2774), hladinu celkového cholesterolu (+0,1266), hladinu LDL cholesterolu

(+0,1108), triacylglyceridov (+0,0229) a glukózy (+0,3133).

V prípade polymorfizmu GHSR génu (T171C) bol analyzovaný fragment s

veľkosťou 593 bp. Frekvencia alely T bola 0,51 a prevažovala nad frekvenciou alely C,

ktorá bola 0,49. Asociačnými štúdiami v populácii bol zistený negatívny vplyv

genotypu CC, nakoľko zvyšuje biochemické parametre na hodnotu body mass indexu

(+2,8442), hladinu celkového cholesterolu (+0,2598), hladinu HDL cholesterolu

(+0,0123), LDL cholesterolu (+0,2902) a glukózy (+0,3766). Pri genotype TC boli

hodnoty biochemických parametrov v referenčnom intervale.

Analýzou polymorfizmov génov a asociačnými štúdiami bol potvrdený vplyv

genotypov na výživový stav organizmu, preto ich môžeme považovať za kandidátske

gény porúch metabolizmu lipidov a vzniku obezity.

Táto práca bola vytvorená realizáciou projektu „Excelentné centrum ochrany

a využívania agrobiodiverzity“ ITMS: 26220120015, na základe podpory operačného

programu Výskum a vývoj financovaného z Európskeho fondu regionálneho rozvoja

a projektu VEGA – 1/0061/10.

Kľúčové slová: genetické markery, LEP, LEPR, GHSR,

Abstract

The aim of the thesis was to analyze the LEP, LEPR and GHSR genes as

markers for genetic disorders of lipid metabolism and human nutrition. Polymorphism

of genes was identified by PCR-RFLP and HRM. Association studies were aimed at

assessing the impact of genes LEP, LEPR and GHSR on body mass index and

cholesterol, HDL cholesterol, LDL cholesterol, triacylglycerids and blood glucose.

In the LEP gene polymorphism (G2548A) was analysed 242 bp lenght fragment.

In a experimental group was frequency of allele A 0.46 and frequency of allele G 0.54.

Association studies aimed at monitoring the impact of genotype on biochemical

parameters confirmed that people with genotype AG had biochemical parameters in the

reference interval. GG genotype had a negative impact on the value of body mass index

(+2.0499), level of triacylglycerides (+0.1445) and glucose (+0.3971).

In LEPR gene polymorphism (Gln223Arg) was analysed 416 bp lenght

fragment. Frequency of allele A also allele G was 0.50. Association studies aimed at

monitoring the impact of genotype on biochemical parameters confirmed that people

with genotype AG had biochemical parameters in the reference interval. On the basis of

association studies focused on the impact of genotype on biochemical parameters, we

found a negative influence of the GG genotype, because it increased the body mass

index (+1.2774), total cholesterol (+0.1266), LDL cholesterol (+0.1108)

triacylglycerides (+0.0229) and glucose (+0.3133).

In the event of GHSR gene polymorphism (T171C) was analysed fragment with

length 593 bp. Frequency of allele T was 0.51 and it was in majority over frequency of

allele C, which was 0,49. Association studies in population presented negative effects of

genotype CC as it increases the value of biochemical parameters to body mass index

(+2.8442), total cholesterol (+0.2598), HDL cholesterol (+0.0123), LDL cholesterol

(+0.2902) and glucose (+0.3766). When genotype TC values were biochemical

parameters in the reference interval.

Analysis of gene polymorphisms and association studies of genotypes was

confirmed by the impact of the nutritional condition of the body, so they can be

considered as candidate genes of lipid metabolism disorders and obesity.

This work has been supported by the Excellence Center for Agrobiodiversity

Conservation and Benefit project ITMS: 26220120015 implemented under the

Operational Programme Research and Development financed by European Fund for

Regional Development and VEGA project 1/0061/10.

Key words: genetic markers, LEP, LEPR, GHSR

Obsah

Obsah.................................................................................................................................8Zoznam skratiek a značiek..............................................................................................10Úvod................................................................................................................................131 Súčasný stav riešenej problematiky doma a v zahraničí............................................15

1.1 Výživa a zdravie..................................................................................................151.2 Metabolizmus lipidov..........................................................................................16

1.2.1 Poruchy metabolizmu lipidov ľudí..............................................................171.3 Obezita a metódy jej merania a vyjadrenia.........................................................21

1.3.1 Fyziologická regulácia príjmu potravy a výdaja energie............................211.3.2 Genetická determinácia obezity..................................................................24

1.4 Genetická determinácia porúch metabolizmu lipidov.........................................281.5 Genetické markéry...............................................................................................29

1.5.1 Jednonukleotidový polymorfizmus – SNP- Single nukleotid polymorphism.................................................................................................................................30

1.6 Gény obezity a metabolizmu lipidov....................................................................311.6.1 Leptín a leptínový receptor..........................................................................32

1.6.1.1 Biologická funkcia leptínu a leptínového receptoru......................................321.6.1.2 Polymorfizmus leptínu a leptínového receptoru............................................361.6.1.3 Leptín a lipidový metabolizmus....................................................................38

1.6.2 Ghrelín a ghrelínový receptor......................................................................381.6.2.1 Biologická funkcia ghrelínu a ghrelínového receptoru.................................381.6.2.2 Polymorfizmus génov ghrelínu a ghrelínového receptoru............................421.6.2.3 Ghrelín a lipidový metabolizmus..................................................................44

1.7 Metódy molekulovej diagnostiky......................................................................441.7.1 PCR - Polymerázová reťazová reakcia........................................................451.7.2 RFLP - Polymorfizmus dĺžky restrikčných fragmentov.............................491.7.3 PCR – RFLP................................................................................................501.7.4 Real- time PCR............................................................................................501.7.5 HRM - High Resolution Melting.................................................................51

2 Cieľ.............................................................................................................................523 Materiál a metodika....................................................................................................53

3.1 Študovaná populácia..........................................................................................533.2 Metódy molekulovo-genetickej analýzy.............................................................55

3.2.1 Izolácia DNA...............................................................................................553.2.1.1 Izolácia DNA vysoľovacou metódou (Miller et al., 1988)...........................553.2.1.2 Izolácia DNA komerčným kitom NucleoSpin Blood....................................563.2.1.3 Overenie prítomnosti DNA.................................................................................573.2.1.4 Meranie koncentrácie a čistoty vzoriek...............................................................57

3.2.2 Polymerázová reťazová reakcia a jej modifikácie.........................................583.2.2.1 Leptín (LEP)..................................................................................................583.2.2.2 Leptínový receptor (LEPR)..........................................................................603.2.2.3 Ghrelínový receptor (GHSR).......................................................................62

3.2.3 Elektroforéza.................................................................................................633.3 Biochemická analýza...........................................................................................633.4 Matematicko – štatistické vyhodnotenie výsledkov............................................64

3.4.1 Genetická štruktúra.......................................................................................643.4.2 Variabilita biochemických parametrov a asociačné štúdie.........................66

8

4 Výsledky a diskusia....................................................................................................674.1 Analýza génu LEP...............................................................................................68

4.1.1 PCR-RFLP analýza.....................................................................................684.1.2 PCR-HRM analýza......................................................................................694.1.3 Genotypová štruktúra podľa génu LEP.......................................................704.1.4 Vplyv génu LEP na variabilitu biochemických parametrov........................724.1.5 Vyhodnotenie genetickej záťaže na základe genotypovej hodnoty..............74

4.2 Analýza LEPR génu............................................................................................754.2.1 Genotypová štruktúra podľa génu LEPR.....................................................764.2.2 Vplyv génu LEPR na variabilitu biochemických parametrov.....................784.2.3 Vyhodnotenie genetickej záťaže na základe genotypovej hodnoty.............79

4.3 Analýza GHSR génu...........................................................................................804.3.1 Genotypová štruktúra podľa génu GHSR....................................................814.3.2 Vplyv génu GHSR na variabilitu biochemických parametrov....................834.3.3 Vyhodnotenie genetickej záťaže na základe genotypovej hodnoty.............85

4.4 Analýza diferencií medzi skupinami...................................................................854.4.1 Korelačná analýza.......................................................................................87

5 Záver...........................................................................................................................906 Návrh na využitie výsledkov......................................................................................92Zoznam použitej literatúry..............................................................................................93Prílohy...........................................................................................................................115

9

Zoznam skratiek a značiek

A, G, T, C, U dusikaté bázy (adenín, guanín, tymín, cytozín, uracil)

ACD antikoagulačný roztok

ACTH adrenokortikotropný hormón

AFLP Amplified Fragment Lenght Polymorphism –

polymorfizmus dĺžky amplifikovaných fragmentov

AgRP Agouty-related Proteín – agouti-súvisiaci proteín

AMK aminokyselina

ARC arcuate nucleus

ATP adenozín trifosfát

BE tlmivý roztok

BMI body mass index

bp base pairs – bázový pár

BSA bovinný sérový albumín

CHOL cholesterol

CTP cytozín trifosfát

db diabetes

DGGE denaturačná gradientová gélová elektroforéza

DMSO dimetylsulfoxid

DNA deoxyribonukleová kyselina

dNTP doexyribonukleotid trifosfát

GHRL ghrelínový gén

GHSR ghrelínový receptor

GLU glukóza

GTP guanín trifosfát

Hae III reštrikčný enzým

HCl kyselina chlorovodíková

HhaI reštrikčný enzým

HpaII reštrikčný enzým

HRM High Resolution Melting – analýza teploty topenia pri

vysokom rozlíšení

HVI hmotnostnovýškový index

EDTA kyselina etyléndiamíntetraoctová

10

ETL lokusy ekonomických znakov

HDL high density lipoprotein – lipoproteín s vysokou hustotou

Hinf I reštrikčný enzým

HVI hmotnosť výškového indexu

kb kilo base pairs – počet bázových párov

KHCO3 hydrogénuhličitan draselný

LDL low density lipoprotein – lipoproteín s nízkou hustotou

LEP leptín

LEPR leptínový receptor

LweI reštrikčný enzým

MAS marker assisted selection – markermi podporovaná

selekcia

MC4R melanokortínový receptor 4

Mg2+ horečnatý katión

MspI reštrikčný enzým

NaCl chlorid sodný

NaOH hydroxid sodný

NH4Cl chlorid amónny

NHT normálna hmotnosť tela

NPY neuropeptid Y

ob obezita

PCR Polymeraze Chain Reaction – Polymerázová reťazová

reakcia

POMC pro-opiomelanokortín

QTL lokusy kvantitatívnych vlastností

RAPD Random Amplified Polymorphic DNA – polymorfizmus

náhodne amplifikovanej DNA

RFLP Restriction Fragment Lenght Polymorphism –

Polymorfizmus dĺžky reštrikčných fragmentov

RHT relatívna hmotnosť tela

SDS sodná soľ dodecylsulfátu

SNP Single Nucleotid Polymorphism – polymorfizmus jedného

nukleotidu

11

SSCP Single strand conformational polymorphism – analýza

jednovlákonového konformačného polymorfizmu

TAE elektrolyt

TAG triacylglyceridy

Taq polymeráza

TBE vodivý roztok

TE elučný roztok

TGGE teplotná gradientová gélová elektroforéza

Tm temperature of melting – teplota topenia

Tris tris-hydroxymetyl aminometán

TTP tymín trifosfát

VLDL very low density lipoprotein – lipoproteín s veľmi nízkou

hustotou

WHR pomer obvodu pásu a bokov

12

Úvod

Úvod

Vo výžive organizmov platia všeobecné zákony, ktoré sa uplatňujú aj vo výžive

človeka. Ich poznanie je základným predpokladom poznania existencie životných dejov

života samotného. Podľa nich možno poznať povahu dejov, zaradiť ich do jednotlivých

kategórií a využiť k prospechu zvierat a človeka. Aby bolo možné jednotlivé deje

skúmať, je potrebné poznať najprv činitele, ktoré ich ovplyvňujú, podmieňujú a určujú.

Výživa je súbor nevyhnutných látok na rast, vývoj, stavbu a obnovu tkanív, na

zabezpečovanie a udržiavanie fyziologických funkcií organizmu. Výživou organizmy

dostávajú energiu potrebnú na vykonávanie životných funkcií.

Veľký vplyv na vznik chorôb má výživa, životospráva, životné prostredie, ale aj

infekčné choroby a lieky.

Choroby ontogenetické sú nadobudnuté počas prenatálneho vývoja a počas post

natálneho života človeka, sú súčasťou fenotypu človeka. Veľká časť nadobudnutých

chorôb sa nededí z dôvodu, že ich nositelia sú postihovaní vysokou chorobnosťou

(morbiditou), neplodnosťou (sterilitou) alebo včasnou úmrtnosťou (mortalitou).

Hlavným predpokladom fungovania organizmu je prijímanie potravy v súlade

s geneticky danými požiadavkami druhu a organizmu podľa jeho veku, pohlavia,

činnosti, zdravotného stavu a prostredia, v ktorom žije.

Obezita v súčasnosti predstavuje globálny celospoločenský problém. Ide

o nadmerné ukladanie energetických zásob v podobe tuku z rôznych príčin. Dochádza

k nej ak je príjem energie väčší ako výdaj. Obezita je fenoménom modernej doby a patrí

medzi multifaktoriálne ochorenia, pričom na jej vzniku sa podieľa aj genetika.

Charakteristická je etiopatogenetická zložitosť obezity, jej nenápadný a pomalý priebeh

s ničivými zdravotnými dôsledkami. Výskumami sa zistilo, že významnú úlohu

v regulácii príjmu a výdaja energie zohrávajú molekuly hormonálnej povahy ako leptín,

ghrelín a iné.

Tukové tkanivo nie je len zásoba nadbytočnej energie. Je to plnohodnotný orgán,

ktorý úzko komunikuje s mozgom a zásadne zasahuje do celkového metabolizmu

organizmu. Čím je toto tkanivo väčšie, tým viac narušuje fyziologickú rovnováhu vo

viacerých systémoch a tým sa stáva rizikovejším pre organizmus ako celok.

13

Úvod

Leptínový gén bol identifikovaný v roku 1994 pomocou pozičného klonovania.

Jeho mutácia sa pokladá za podklad fenotypu extrémnej obezity a neplodnosti ob/ob

myší. Po klonovaní leptínového génu myší, potkanov a ľudí, boli vyklonované viaceré

homológy niektorých cicavčích druhov, vrátane domácich zvierat. Väčšina výskumu,

ktorý nasledoval po objavení tohto hormónu, sledoval úlohu leptínu v regulácii telesnej

hmotnosti, zameriavajúc sa na objasnenie patofyziológie obezity.

Ghrelín popísali japonskí vedci v roku 1999 ako fyzický ligand z "orphan"

receptoru GHS1a, ktorý je špecifický pre skupinu syntetických peptidov (rastový

hormón secretagogues - GHS) stimulujúci sekréciu rastového hormónu. Plazmatické

hladiny ghrelínu odrážajú krátkodobé zmeny príjmu potravy, rovnako ako dlhodobé

zmeny vo výživovom stave organizmu. Bolo potvrdené, že sa znížili po príjme potravy

u zdravých jedincov. U obéznych ľudí a tiež u pacientov s mentálnou anorexiou sú

zvýšené počas hladovania. Plazmatické hladiny ghrelínu človeka negatívne korelujú s

indexom telesnej hmotnosti, množstvom telesného tuku, veľkosťou adipocytov a

plazmatickou hladinou inzulínu, glukózy a leptínu. Preto ghrelín zrejme hrá úlohu ako

metabolický signál hladu.

14

Súčasný stav riešenej problematiky doma a v zahraničí

1 Súčasný stav riešenej problematiky doma a v zahraničí

1.1 Výživa a zdravie

Organizmus človeka potrebuje pre svoje fungovanie sedem základných

komponentov: bielkoviny, sacharidy, tuky, vitamíny, minerálne látky, stopové prvky

a voda, ktoré plnia rôzne funkcie.

Kaput (2006) popísal, že nutričný stav je komplexný fyziologický a morfologický

stav, ktorý je podmienený genetickou výbavou, fyziologickou aktivitou a množstvom

a kvalitou prijatej stravy.

Už vyše 20 rokov je v oblasti verejného zdravia problém, ktorý spôsobuje

ochorenia vyplývajúce z nekvalitnej stravy, nadmerného kalorického príjmu a sedavého

spôsobu života. Z toho dôvodu vyplýva nutnosť nutričného výskumu. Rýchly vývoj

v oblasti prírodných vied, predovšetkým genetiky, vytvorili významné príležitosti pre

výživu.

Napriek mnohým významným pokrokom, vnímanie verejnosti je jedným

z konfliktných a mätúcich výživových a zdravotných správ, ktoré môžu naďalej

zhoršovať nepodložené zdravotné tvrdenia ohľadom funkčných potravín a doplnkoch

stravy (Hooper, 2006; Howard, 2006) a nedostatočné nároky na osobné zdravie

(Janssens, 2008; Katsanis, 2008).

Rovnako ako výskum v úlohe výživy v prevencii chorôb (Green, 2003), je rastúci

záujem o úlohu výživy v optimalizácii zdravia vo všetkých fázach života a s tým

súvisiace nástroje potrebné pre riadne vyčíslenie zdravia s cieľom preukázať blahodárny

vplyv diétnych zmien. Nutričný stav vyvoláva nepatrné zmeny vo funkciách organizmu,

ktoré sú ťažko odhaliteľné. Tieto malé rozdiely sú však extrémne dôležité v určovaní

rizika chronických ochorení v dlhšom časovom horizonte. V dôsledku toho značné

úsilie bolo vyvinuté na charakterizovanie vzťahu stravy a zdravia prostredníctvom

rozvoja pohybu a ostatných funkčných biomarkerov (Williams, 2008).

15


1.2 Metabolizmus lipidov

Lipidy sú najdôležitejšou energetickou rezervou organizmu a podieľajú sa až 50%

na získavaní energie v biologických oxidáciách. Denne sa metabolizuje 100g lipidov, z

ktorých sa uvoľňuje 3760 kJ (900 kcal). Asi polovica tukov organizmu je uložená v

podkožnom tkanive, ďalej sa nachádzajú okolo obličiek, v brušnej dutine (omentum), v

oblasti pohlavných orgánov a vo svaloch (Zadák, 2002).

Lipidy sú dôležitou zložkou všetkých buniek a majú významnú úlohu ako stavebné

látky tela. Popri bielkovinách a sacharidoch patria k základných výživným látkam,

ktorými naše telo kryje spotrebu svojej energie. Odhliadnúc od esenciálnych mastných

kyselín, ktoré sa musia privádzať stravou, príjem tukov nie je bezpodmienečne

potrebný, pretože ich môžu nahradiť sacharidy. Denný príjem tukov závisí vo veľkej

miere od výživy, preto je individuálne veľmi rozdielny (Burkhardtová, 2007).

Lipidy sa neustále obmieňajú, uvoľňujú zo zásob, transportujú krvou a

metabolizujú, alebo sa opäť ukladajú do iných tukových tkanív. Ľudský organizmus ich

uskladňuje vo veľkom množstve, na rozdiel od malých zásob glykogénu. Uvoľňujú

najväčšie množstvo energie, ale aj napriek tomu sú po sacharidoch druhým

bezprostredným zdrojom energie pre človeka (Zadák, 2002).

Periférny metabolizmus lipidov riadi hypotalamus cez sympatický nervový

systém, a tieto akcie sú nezávislé od príjmu potravy (Diéquez, 2011).

Lipidy ľudského organizmu sa rozdeľujú na triacylglyceroly (neutrálne tuky),

fosfolipidy a cholesterol.

Triacylglyceroly slúžia predovšetkým ako energetická zásoba, fosfolipidy a

cholesterol sa zúčastňujú na výstavbe bunkových membrán, hormónov a iných

funkčných molekúl. Organizmus človeka je schopný syntetizovať väčšinu vyšších

karboxylových kyselín, okrem tých, ktoré majú v molekulách prítomnosť dvojitých

väzieb. Sú to esenciálne vyššie karboxylové kyseliny, ktoré sa využívajú pri syntéze

dôležitej skupiny lipidov prostaglandínov. Z vyšších karboxylových kyselín sa v

potrave človeka vyskytujú najčastejšie kyselina stearová C18, kyselina palmitová C 16 a

nenasýtená kyselina olejová s C18 (Zadák, 2002).

Cholesterol, látka podobná tuku, je dôležitý stavebný prvok bunkových membrán,

vytvára základnú konštrukciu pre niektoré hormóny. Najväčšia časť cholesterolu sa

tvorí v pečeni. Vyskytuje sa predovšetkým v živočíšnych tukoch. Tvorbu ďalšieho

cholesterolu spúšťajú výlučne nasýtené mastné kyseliny (Burkhardtová, 2007).

16

http://sk.wikipedia.org/w/index.php?title=Kyselina_olejov%C3%A1&action=edit&redlink=1

http://sk.wikipedia.org/wiki/Kyselina_palmitov%C3%A1

http://sk.wikipedia.org/w/index.php?title=Kyselina_stearov%C3%A1&action=edit&redlink=1

http://sk.wikipedia.org/wiki/Karboxylov%C3%A1_kyselina

http://sk.wikipedia.org/wiki/Horm%C3%B3n

http://sk.wikipedia.org/wiki/%C4%8Clovek

http://sk.wikipedia.org/wiki/Sacharid

http://sk.wikipedia.org/wiki/Glykog%C3%A9n

http://sk.wikipedia.org/wiki/Krv

http://sk.wikipedia.org/wiki/Sval

http://sk.wikipedia.org/wiki/Pohlavn%C3%A9_org%C3%A1ny

http://sk.wikipedia.org/w/index.php?title=Omentum&action=edit&redlink=1

http://sk.wikipedia.org/wiki/Obli%C4%8Dka


Lipoproteíny možno izolovať z krvi a stanoviť ich koncentráciu (množstvo)

rôznymi laboratórnymi metódami. Medzi najčastejšie používané techniky patrí

ultracentrifugácia pri vysokých otáčkach a elektroforéza. Podľa použitej techniky sa

lipoproteíny aj označujú. V súčasnosti prevláda označenie podľa ultracentrifugačného

delenia, a preto sa stretávame s pojmami lipoproteíny s veľmi nízkou, nízkou alebo

vysokou hustotou a pod. (Kopecká et al., 2003).

Lipidy sú jednou z tried veľkých biologických molekúl. Sú to estery vyšších

karboxylových kyselín (nasýtených alebo nenasýtených) a alkoholov, respektíve ich

derivátov. Patria do skupiny nepolárnych molekúl biogénneho pôvodu. Tieto zlúčeniny

zdieľajú jednu dôležitú vlastnosť: majú malú alebo žiadnu afinitu k vode. Hydrofóbne

chovanie lipidov je založené na ich molekulovej štruktúre. Napriek tomu môžu mať

niektoré polárne väzby spojené s kyslíkom, preto sa skladajú väčšinou z uhlovodíkov.

I keď sú menšie ako skutočné (polymérne) makromolekuly, sú lipidy vysoko

rozmanitou skupinou, líšiacou sa ako v tvare, tak vo funkcii. Medzi lipidy zaraďujeme

vosky a niektoré pigmenty (Campbell a Reece, 2006).

Vysoký príjem tukov stravou je veľmi vážny výživový problém vo väčšine

vyspelých štátov sveta.

1.2.1 Poruchy metabolizmu lipidov ľudí

Najdôležitejšou poruchou metabolizmu lipidov sú hyperlipidémie, ktoré sa

vyznačujú:

1. zvýšením hodnoty jednej alebo viacerých sérových frakcií lipidov (sérové

frakcie lipidov sú : cholesterol, triacyglyceroly, estery cholesterolu, fosfolipidy)

2. zmenou ich väzby na proteínový nosič. Táto väzba je veľmi dôležitá, v nej

spočíva podstata metabolickej poruchy. Pre hyperlipidémie sa preto zvyčajne

používa výstižnejší názov hyperlipoproteinémie.

Hyperlipoproteinémie sa delia na primárne a sekundárne.

1.Primárne hyperlipoproteinémie sú geneticky podmienené a väčšina z nich sa

vyskytuje familiárne (familiárne hyperlipoproteinémie).

2.Sekundárne hyperlipoproteinémie vznikajú druhotne pri niektorých iných

ochoreniach.

Primárne hyperlipoproteinémie sú veľmi častou metabolickou poruchou, u nás

postihujú asi 5% obyvateľstva. Sú významným rizikovým faktorom predčasného vzniku

17


aterosklerózy. Poznanie spôsobu ich dedičnosti má veľký preventívny význam, pretože

klinické a laboratórne vyšetrenie členov rodiny pacienta umožní zistiť ich prípadné

postihnutie často už v predklinickom štádiu ochorenia a uplatniť u nich preventívne

opatrenia (Kopecká et al., 2003).

Tuk je organická látka, ktorú orgány tela využívajú na zabezpečenie energie pre

svoju činnosť. Rezervný telesný tuk má veľký energetický potenciál, a preto je pre

organizmus veľmi významný. Tuky sa zúčastňujú aj na tvorbe štruktúr orgánov

a zabezpečovaní ich funkcie, sú nosičmi iných látok, ktoré sú v nich rozpustné (napr.

vitamíny), ovplyvňujú imunitu, inflamáciu, karcinogenézu a iné fyziologické

a patologické procesy (Beňo, 2008).

Tuk uložený v tukovom tkanive je výnimočný systém energetickej zásoby, ktorý

môže byť použitý na látkovú premenu, ak si to bude vyžadovať momentálna situácia,

napríklad pri dlhotrvajúcom hladovaní. Za normálnych podmienok existuje rovnováha

medzi tukovými zásobami a energetickými požiadavkami organizmu.

Môžeme rozlišovať dva typy tuku:

Biely tuk: je bohatý na TAG, uložený v podkoží a okolo orgánov ľudského tela.

Má ochrannú úlohu a slúži ako zásobáreň energie

Hnedý tuk: chudobný na TAG. Je uložený na určitých miestach organizmu ako

šija, pazuchy, medzi lopatkami a rebrami. Je významný pre tvorbu tepla s cieľom

udržať telesnú teplotu v normálnom rozmedzí (Covisa, 2006).

Tuk vytvorený z nasýtených kyselín označujeme ako nasýtený tuk. Väčšina

živočíšnych tukov je nasýtená ich mastné kyseliny nemajú dvojité väzby. Nasýtené

živočíšne tuky, ako napríklad masť alebo maslo, sú pri izbovej teplote pevné. Naopak

rastlinné a rybie tuky sú obvykle nenasýtené, čo znamená, že sú vytvorené z jedného

alebo viacerých typov nenasýtených mastných kyselín. Pretože sú pri izbovej teplote

obvykle tekuté, sú označované rybie a rastlinné tuky ako oleje – napríklad kukuričný

olej alebo olej z treščích pečienok. Ohyby, v ktorých sa nachádzajú dvojité väzby,

zabraňujú molekulám aby sa k sebe tesne priblížili, a stali sa tak pri izbovej teplote

tuhými. Termín „hydrogenované rastlinné oleje“ na štítkoch potravín znamená, že

nenasýtené oleje boli synteticky premenené na nasýtené tuky pridaním vodíkov.

Arašidové maslo, margarín a mnohé ďalšie produkty sú hydrogenované, aby lipidy

neboli schopné premeny na tekutú (olejovú) formu (Campbell a Reece 2006).

Diéta bohatá na nasýtené tuky je jedným z niekoľkých faktorov, ktoré môžu

prispievať ku kardiovaskulárnemu ochoreniu známemu ako ateroskleróza. Pri tejto

18


chorobe sa na vnútornej výstelke krvných ciev vytvárajú usadeniny označované ako

pláty, čím bránia prietoku krvi a znižujú pružnosť ciev (Campbell a Reece, 2006).

Cholesterol je lipid zo skupiny steroidov. Sumárny vzorec je C27H45OH. Jeho

názov pochádza z gréčtiny: chole znamená žlč a stereos znamená pevný, pretože

cholesterol prvýkrát izolovali zo žlčových kameňov.

Cholesterol je bežnou zložkou membrán živočíšnych buniek a slúži tiež ako

prekurzor, z ktorého sú syntetizované ostatné steroidy. Cholesterol je významnou

molekulou u živočíchov, pretože jeho vysoká hladina v krvi môže viesť k ateroskleróze.

Cholesterol sa nachádza v bunkovej membráne eukaryotických buniek. V ľudskom

tele sa nachádza vo všetkých tkanivách vrátane krvi. Väčšina telesného cholesterolu

nepochádza zo stravy, ale syntetizuje sa priamo v organizme. Najväčšia koncentrácia

cholesterolu je v tkanivách, kde sa cholesterol syntetizuje (pečeň), alebo kde sa

nachádzajú pevnejšie bunkové membrány (mozog, miecha).

Cholesterol je známy v súvislosti s kardiovaskulárnymi ochoreniami spojenými so

zvýšenou hladinou LDL v krvi (ateroskleróza, hypercholesterolémia) (Campbell

a Reece, 2006).

Cholesterol hrá niekoľko štrukturálnych a metabolických rolí, ktoré sú v ľudskej

biológii životne dôležité. Hoci sa cholesterol šíri po celej plazmatickej membráne

bunky, kde sa moduluje fluidita, tiež sa koncentruje v špecializovaných

sfingolipidových doménach (Podar, Anderson, 2006). Okrem toho, cholesterol je

substrátom pre steroidné hormóny (Pasqualini, 2005). Príliš veľa cholesterolu

v bunkách môže mať patologické dôsledky. To platí najmä pre bunky v stenách tepien,

kde nahromadenie cholesterolu spúšťa aterosklerotické kardiovaskulárne ochorenie

(Yuan et al., 2006).

19

http://sk.wikipedia.org/wiki/Hypercholesterol%C3%A9mia

http://sk.wikipedia.org/wiki/Ateroskler%C3%B3za

http://sk.wikipedia.org/wiki/Miecha

http://sk.wikipedia.org/wiki/Mozog

http://sk.wikipedia.org/wiki/Pe%C4%8De%C5%88

http://sk.wikipedia.org/wiki/Tkanivo

http://sk.wikipedia.org/wiki/Krv

http://sk.wikipedia.org/wiki/Cytoplazmatick%C3%A1_membr%C3%A1na

http://sk.wikipedia.org/wiki/%C5%BDl%C4%8D

http://sk.wikipedia.org/wiki/Steroid

http://sk.wikipedia.org/wiki/Lipid


Obrázok 1: Štruktúra cholesterolu

(prekreslené podľa Campbell a Reece, 2006)

HDL je skratka pre anglický názov "high density lipoprotein" a znamená

lipoproteín s vysokou hustotou. HDL cholesterol je odborný názov pre "dobrý"

cholesterol a v krvi je transportovaný HDL lipoproteínmi z jednotlivých buniek do

pečene, kde sa vylučuje do žlče a premieňa na žlčové kyseliny potrebné pri trávení

tukov (Kollár, 1996).

LDL je skratka pre anglický výraz "low density lipoprotein" a v preklade znamená

lipoproteín s nízkou hustotou. LDL cholesterol je odborný názov pre "zlý" cholesterol,

ktorý je transportovaný LDL lipoproteínmi k jednotlivým bunkám. Lipoproteíny sú

častice, ktoré sú rozpustné v krvi. Cholesterol ich potrebuje, aby mohol putovať v krvi,

je nimi obalený, pretože sám je v krvi nerozpustný. Z VLDL vzniká LDL. Obsah

triglycerolov v LDL je 10 %. Vysoké hodnoty LDL znamenajú vysoké hodnoty

cholesterolu v krvi (Kollár, 1996).

VLDL (veľmi nízka hustota lipoproteínov) sú tvorené pečeňou a transportujú

tuky, ktoré sa do pečene dostali s chylomikrónmi, k iným orgánom a tkanivám. VLDL

obsahujú 65 % triglycerolov a 15 % cholesterolu (Kollár, 1996).

Triglyceridy (neutrálne tuky) slúžia bunkám ako palivo na získavanie energie.

Prijímajú sa potravou (mäso, údeniny, mlieko, syry, orechy, rastlinné oleje) alebo sa

tvoria z alkoholu a sacharidov v tele. Hodnoty triglyceridov sú teda závislé od vnútornej

regulácie metabolizmu tukov a od vonkajších vplyvov. Pri výžive bohatej na tuky sa

trigylceridy čiastočne usadzujú ako zásoba energie v tukovom tkanive a v pečeni.

K zvýšeniu (hypertriglyceridémia) dochádza pri výžive bohatej na tuky, nadváhe,

zvápenatení ciev, cukrovke, zníženej činnosti štítnej žľazy, ochoreniach obličiek

a podžalúdkovej žľazy, zdedených poruchách metabolizmu tukov a nadmernom

používaní alkoholu. K zníženiu môže dôjsť pri zvýšenej činnosti štítnej žľazy

(Burkhardtová, 2007).

Tabuľka 1: Hodnoty lipidov v mmol.l-1 a rizikových indexov (Beňo, 2008)

N R L

Celkový cholesterol (T-CH) <5,2 5,2 – 6,2 6,2 <

20


Celkové triacylglyceroly (T-TAG) <1,7 1,7 – 2,2 2,2 <

Cholesterol LDL (LDL-Ch) <2,6 2,6 – 3,4 3,4<

Cholesterol HDL (HDL-Ch) >1,3 1,3 – 1,0 1,0 >

Index T-Ch: HDL-Ch N< 5,2< L

Index LDL-Ch : HDL-Ch N < 3,5< L

Hodnota: N – normálna, R – riziková, L – vyžaduje liečbu

1.3 Obezita a metódy jej merania a vyjadrenia

Obezita je metabolické ochorenie charakterizované nadmernou hmotnosťou tela

a vyvolané pozitívnou bilanciou energie, pričom sa extrémne zvyšuje množstvo

zásobného tuku v podkoží (subkutánne) a vnútrobrušne (intraabdominálne). Následkom

pozitívnej dusíkovej bilancie môže byť súčasne aj nárast svalovej hmoty, najmä

u mužov (Beňo, 2008).

Obezita je výsledkom kombinovaného účinku génov, životného prostredia

a životného štýlu (Kopelman, 2000).

1.3.1 Fyziologická regulácia príjmu potravy a výdaja energie

Obezita sa stala hlavným problémom verejného zdravia ako dôsledok narastajúcej

prevalencie a je významnou príčinou morbidity a mortality vo väčšine rozvinutých

krajín sveta. Vzniká ako dôsledok porušenej rovnováhy medzi príjmom potravy

a výdajom energie organizmu. Udržiavanie energetickej rovnováhy je komplexne

regulovaný proces, na ktorom sa zúčastňujú neuróny syntetizujúce široké spektrum

neurotransmiterov (Kalra et al., 1999; Berthoud, 2002). Neurálna kontrola a regulácia

príjmu potravy a výdaja energie spočíva v troch úzko prepojených procesoch: vstup –

integrácia – výstup. Vstup predstavuje prísun informácií z periférie do mozgu, a to

humorálnou a nervovou cestou prostredníctvom signálnych látok akými sú inzulín,

ghrelín, leptín. Experimentálne práce ukázali, že mozog nie je schopný bez týchto

signálov samočinne regulovať energetické pomery v organizme. Integrácia je zložitý

proces, v ktorom majú významnú úlohu viaceré nervové okruhy vychádzajúce z

21


rôznych oblastí mozgu, ktoré spracúvajú množstvo informácií. Výstup je odpoveď

regulačného centra smerom k periférii, pričom cieľom výstupu je aktivácia takých

regulačných a kompenzačných mechanizmov na periférii, aby sa v daných podmienkach

dosiahol čo najoptimálnejší stav energetických pomerov v organizme (Bell et al., 2005).

Predpokladá sa, že hlavným regulačným centrom pre reguláciu príjmu potravy a

výdaja energie je hypotalamus (Kalra et al., 1999; Wilding, 2002). Zo 40 štruktúr

hypotalamu má významnú úlohu v regulácii príjmu potravy a výdaja energie najmenej 5

oblastí: nucleus arcuatus, nucleus paraventricularis, nucleus ventromedialis, nucleus

dorsomedialis a laterálny hypotalamus (Kalra et al., 1999; Berthoud, 2002). Tieto

oblasti obsahujú neuróny, ktoré na základe účinku na reguláciu príjmu potravy možno

rozdeliť na dve veľké skupiny, orexigenické a anorexigenické. Orexigenické neuróny

syntetizujú orexigenicky pôsobiace látky agouti-podobné proteíny - AgRP a

neuropeptid Y - NPY, ktoré zvyšujú príjem potravy, a tým aj telesnú hmotnosť.

Anorexigenické neuróny syntetizujú anorexigenické látky (pro-opiomelanokortín –

POMC, a kokaínu a amfetamínu podobné transkripty - CART), ktoré pôsobia opačne

(Obrázok 2).

22


Obrázok 2: Schématické znázornenie regulácie príjmu potravy a výdaja energie

(prepracované podľa Bell et al., 2005)

Najväčší význam pri vzniku obezity majú faktory prostredia (Obrázok 3), kam

radíme prísun vysoko energetickej potravy, nesprávne stravovacie návyky ľudí,

používanie jedla na zvládanie stresu a podobne. Hoci sa faktory prostredia podieľajú na

vzniku obezity až 75%, genetické faktory majú takisto značný podiel na jej vzniku

(Ichihara a Yamada, 2008).

23


Obrázok 3: Vplyv genetických a negenetických faktorov na vznik obezity

(upravené podľa Heather Dodds, 2007)

1.3.2 Genetická determinácia obezity

Podľa typu dedičnosti delíme obezitu na monogénnu, syndrómovú a polygénnu.

Monogénna obezita vyplýva z alterácie jedného génu. Viaceré monogénne formy

ľudskej obezity boli identifikované vďaka objavu mutácií homologických segmentov

spôsobujúcich obezitu myší. Medzi najvýznamnejšie mutácie spájané s monogénnou

obezitou patria mutácie leptínu (LEP), leptínového receptora (LEPR), ghrelínu (GHRL)

a ghrelínového receptora (GHSR), pro-opiomelanokortínového génu (POMC),

melanokortínového receptora 4 (MC4R), prohormón konvertázy 1 (PC1), mutácia

SIM1 a neurotropného tyrozín-kinázového receptora 2 (Bell et al., 2005).

Monogénová obezita je podmienená mutáciou v jednom z 11 doteraz známych

génov (Farooqi et al., 2008; Tolston et al., 2010). Patofyziológia excesívneho ukladania

tuku u monogénových obezít je pomerne dobre objasnená: v dôsledku mutácie

dochádza k narušeniu leptín-melanokortínovej osi (Hochberg et al., 2010; Bochukova et

al., 2010), ktorá zohráva veľmi dôležitú úlohu v neuronálnej kontrole pocitu sýtosti

a hladu, teda udržiavaní energetickej homeostázy organizmu (Coll et al., 2007; Lee

24


2009). Podľa Farooqi (2008) a Ichiharu a Yamada (2008) možno na základe miesta

porušenia leptín-melanokortínovej osi rozdeliť obezitu na obezitu spôsobenú:

1.Mutáciou génu leptín a mutáciou leptínového receptora

2.Mutáciou POMC (proopiomelanokortín)

3.Mutáciou PC1 ( prohormón konvertáza 1)

4.Mutáciou MC4R (melanokortínový receptor 4)

5.Mutáciou BDNF (mozgový neurotropný faktor) a jeho receptora

TrkB (tyrozín kinázový receptor B)

Podľa odhadov sa monogénovo podmienená obezita vyskytuje u 3-4% všetkých

obéznych pacientov (Farooqi et al., 2005; Ranadive a Vaise, 2008).

Za syndrómovú obezitu považujeme obezitu, ktorá sa vyskytuje v kontexte

rôznych iných klinických príznakov, akými sú napríklad mentálna retardácia, vývinové

abnormality a iné. V dnešnej dobe je známych viac ako 20 rôznych syndrómov

charakterizovaných obezitou, ktoré súvisia s genetickými poruchami, chromozómovými

aberáciami, môžu byť autozomálne aj gonozomálne. Najčastejšie sa vyskytujú Prader-Williemsov, Cohenov, Alströmov a Bardet-Biedlov syndróm (Ichihara a Yamada, 2008; Lee, 2009 ).

Posledným typom je polygénna obezita, ktorá je spôsobená poruchou viacerých génov súčasne, pričom tieto gény jednotlivo majú iba malý efekt na telesnú hmotnosť (Willer et al., 2009; Hinney et al., 2010). Kumulatívny efekt génov sa stáva signifikantný vtedy, keď je prítomná interakcia s faktormi prostredia (prejedanie sa, redukcia telesnej aktivity, hormonálne zmeny a socioekonomické faktory predisponujúce k ich fenotypovej expresii) (Willer et al., 2009; Hinney et al., 2010; Hetherington a Cecil, 2010).

Obezita je rizikovým faktorom pre hypertenziu, diabetes mellitus II. typu,

hyperlipidémiu, aterosklerózu, ako aj obličkové a žlčníkové kamene. Nadváha o viac

ako 40 % je spojená s dvojnásobnou pravdepodobnosťou predčasnej smrti. Príčiny

obezity sú málo známe. U dvoch kmeňov myší s extrémnou obezitou a diebetes mellitus

II. typu boli objavené po jednom defektnom géne pričom defektný gén ob[obezita],

ktorý je exprimovaný iba v bielom tukovom tkanive, potom v plazme chýba proteín

leptín s molekulovou hmotnosťou 16 kDa kódovaný práve génom ob. Injekcie leptínu

myšiam s homozygotnou mutáciou génu ob normalizuje symptómy génového defektu,

25


podaním normálnym myšiam vedie k ich chudnutiu. Ak je naproti tomu mutovaný gén

db, je defektný leptínový receptor v hypotalame. V plazme síce cirkulujú vysoké

koncentrácie leptínu, ale hypotalamus na ne nereaguje. U niektorých obéznych ľudí je

defektný tiež gén pro leptín, u väčšiny ostatných je však zvýšená koncentrácia leptínu

v plazme. U týchto ľudí sa predpokladá prerušená spätnoväzbová reťaz za leptínom.

Predpokladajú sa nasledujúce možnosti defektu :

Leptín už nemôže prechádzať hemato-encefalickou bariérou

Je porušený inhibičný účinok leptínu na sekréciu neuropeptidu Y (NPY)

v hypotalame, ktorý stimuluje príjem potravy a znižuje spotrebu energie

Leptín nevyvoláva v hypotalame uvoľnenie α-MSH (hormón stimulujúci α-

melanocyty = melanokortínu), ktorý tam pôsobí prostredníctvom receptorov MCR4

a má opačný účinok než NPY (Silbernagl a Lang, 2001).

Body Mass Index (BMI)

Bežne užívaný parametra BMI vyjadruje jednoduchý prepočet hmotnosti jedinca

na štvorcový meter jeho povrchu. Je najčastejšie používaným parametrom v diagnostike

nadváhy a obezity u detí aj dospelých. WHO stanovilo určité hraničné hodnoty BMI,

ktoré sú spätá s vyššou morbiditou a mortalitou prípadne metabolickými

a kardiovaskulárnymi chorobami a ďalšími pridruženými ochoreniami (Bienertová-

Vaškú, 2009).

Tabuľka 2: Doporučená klasifikácia podváhy, nadváhy a obezity podľa BMI

Klasifikácia BMI [kg.m-2]podváha < 18,50

normálna hmotnosť 18,50 – 24,99

ľahká nadváha 25,00 – 29,99

obezita I. triedy 30,00 – 34,99

obezita II. triedy 35,00 – 39,99

obezita III. triedy ≥ 40,00

Zdroj: podľa WHO

26


Hodnoty BMI nemusia bezprostredne zodpovedať stupňu akumulácie tukového tkaniva

u niektorých populácii rôznych etník. Na základe rôznej telesnej konštitúcie môžu byť

medzi etnikami rozdiely vzájomnom pomere tukového a netukového tkaniva a ich

celkovom podiele na hmotnosti organizmu. Bolo potvrdené, že asociácia medzi BMI,

percentom telesného tuku, distribúciou telesného tuku a kardiovaskulárnym rizikom sa

medzi populáciami líši napr. v ázijskej populácii pri BMI hlboko pod 25 kg.m-2 je

vysoký výskyt diabetes mellitus II. typu a kardiovaskulárnych chorôb, pričom

v černošskej populácii nie je tento vzťah pozorovaný ani pri zvýšenom BMI

(Eisenmann et al.,2004).

V praxi sú využívané aj ďalšie indexi:

Rohrerov ponderálny index (Rohrerov index RI alebo ponderálny index PI)

definovaný ako hmotnosť.výška-3. Jeho použitie je časté v neonatológii.

Benneov index definovaný ako hmotnosť/výškap, kde je p populačný špecifický index

nezávislý na výške (Chinn et al., 1992; Poskitt, 1995).

Podľa relatívnej hmotnosti tela (RHT) vypočítanej kalkuláciou z hmotnostno-

výškového indexu (HVI) alebo z hmotnostno-výškových tabuliek, pričom normálna

hmotnosť tela NHT = 100 %, sa obezita klasifikuje do 3 stupňov.

Tabuľka 3: Relatívna hmotnosť tela a klasifikácia obezity (Beňo, 2008)

Stupeň RHT[%] Obezita

I 120-140 ľahkáII 140-200 výraznáIII viac ako 200 chorobná

Podľa distribúcie tuku zistenej na základe pomeru obvodu pásu a obvodu bokov (WHR)

sa rozlišuje obezita:

androidná (viscerálna, abdominálna) s tukom lokalizovaným predovšetkým na

trupe a v abdominálnej (viscerálnej) oblasti,

27


gynoidná (periférna) s tukom lokalizovaným najmä v oblasti bedier a stehien,

teda v gluteofemorálnej oblasti (Beňo, 2008).

1.4 Genetická determinácia porúch metabolizmu lipidov

Genetická informácia organizmu uložená v jadre sa nazýva genóm. Ľudský genóm

je zložený z 23 chromozómových párov a ich analýzou sa zaoberá Projekt ľudského

genómu, ktorý bol zahájený v roku 1990. Jedná sa o medzinárodný vedecký výskumný

projekt s hlavným cieľom zmapovať celý ľudský genóm, hlavne určiť úplné

nukleotidové sekvencie DNA na každom ľudskom chromozóme. V roku 2003 bolo

oficiálne ukončené sekvenovanie ľudských chromozómov. Napriek tomu ale do

dnešného dňa nie je známy presný počet génov. Predpokladaný počet je 30 000 – 40

000, potvrdených bolo 19 533 proteín-kódujúcich sekvencií a identifikovaných bolo

ďalších 2 188 úsekov DNA, pri ktorých je predpoklad, že sa tiež jedná o kódujúce

sekvencie. Tento počet je oveľa nižší než sa predpokladalo pred Projektom ľudského

genómu (Little, 2005).

Z celého genómu tvoria kódujúce oblasti len 2%, ostatné časti sú tvorené

nekódujúcimi sekvenciami, intrónmi, pseudogénmi, ktoré majú význam z hľadiska

ochrany genómu a regulačnými úsekmi, ktoré kontrolujú expresiu génov (Makałovski,

2001).

Obrázok 4 : Schéma rôznych častí sekvencií v ľudskom genóme ( Makałovski, 2001)

28


Obrázok 5: Karyotyp a Idiogram človekaZdroj: bioweb.genezis.eu

1.5 Genetické markéry

Súčasný rozvoj molekulovej genetiky a rastúce množstvo poznatkov

o polymorfizme DNA vedie k uplatňovaniu molekulovo-genetických metód

v diagnostike porúch metabolizmu. Základná cesta vedie cez identifikáciu genetických

markérov, ktoré ovplyvňujú základné metabolické dráhy (Trakovická et al., 2005).

Genetický markér je molekulárna charakteristika na úrovni DNA, ktorou sa dajú

jedinci rozlíšiť. Vykazuje monogénnu dedičnosť a je v asociácii s genetickou

variabilitou fyziologického alebo morfologického znaku (Bežo et al., 2010).

V súčasnosti sa metódy molekulovej genetiky využívajú predovšetkým na

testovanie a vyhľadávanie genetických markérov (mapovanie génov a QTL, asociačné

vzťahy), ktoré v spojení s fyziologickou funkciou génov. Takéto informácie sú

významným zdrojom k skvalitneniu diagnostiky ukazovateľov zdravia a nutričného

stavu organizmu (Sršeň a Sršňová, 2005).

Podľa Knoll a Urban, (2002) sú pre využívanie genetických markérov

v diagnostike dôležité ich základné charakteristiky:

- musia byť tvorené sekvenciami báz na špecifickom mieste genómu (lokus), ktoré

vykazujú individuálnu variabilitu

- môžu byť súčasťou exónovej alebo intrónovej časti genetickej informácie

- majú kodominantný typ dedičnosti, na základe ktorej možno rozlíšiť homozygota od

heterozygota

29


- možno ich testovať bez ohľadu na vek a fyziologický stav organizmu a pohlavie

Z uvedených dôvodov sa do popredia dostávajú nové typy genetických

markérov, ktoré boli v minulosti označované ako markéry I a III. typu

- SNP (Single Nucleotid Polymorphism): jedná sa o polymorfizmus jednotlivých

nukleotidov, ktorý je výsledkom bodových mutácií. SNP sekvencie sú ľahko

detekovateľné a zvyčajne sa vyskytujú v rámci kódujúcich sekvencií funkčných génov

(Čepica, 2002).

- EST (Expressed Sequence Tags) predstavujú krátke jedinečné sekvencie cDNA

používané na identifikáciu exprimovaného génu a jeho sekvencií. V budúcnosti sa

predpokladá využitie EST pre štúdium organizácie a regulácie génov, ako aj pre rýchlu

selekciu zvierat v rannom veku (Webb, 2000).

Gén, pri ktorom sa predpokladá významný vplyv na fyziologickú vlastnosť je

označovaný ako kandidátny gén.

Kandidátne gény sú sekvencie úsekov DNA, pri ktorých je známy

polymorfizmus (vyskytujú sa vo viacerých formách v populácii), ich transkripčný

(mRNA) alebo translačný produkt (proteín, enzým, hormón) sa priamo alebo nepriamo

podieľa na fenotypovom prejave znaku resp. vlastnosti organizmu. Pri výbere

kandidátnych génov je dôležité poznať ich fyziologickú a biochemickú funkciu. Pri

využívaní kandidátnych génov vychádzame z porovnávacích štúdií príbuzných druhov

(Trakovická et al., 2005; Miluchová et al., 2009).

1.5.1 Jednonukleotidový polymorfizmus – SNP- Single nukleotid polymorphism

Jednonukleotidové polymorfizmy (Single Nucleotide Polymorphisms – SNPs)

predstavujú najfrekventovanejší typ polymorfizmu vyskytujúcich sa každých 50 až 500

bp. Početné zastúpenie a vysoká variabilita SNP markérov v genóme organizmov

umožňuje ich použitie pri identifikácii ľudí a zvierat (Syvänen, 2001). Vznikajú

bodovou mutáciou. SNP sú najčastejšie bialelické avšak môžu byť aj tri- alebo tetra-

alelické avšak sú veľmi zriedkavé. K mutáciám, ktoré podmieňujú vznik SNPs patria

30


tranzície (výmena C za T, G za A), tranverzie ( C za G, A za T, C za A, T za G) a

inzercie/delécie (vloženie/ strata nukleotidu) (Duran et al., 2009).

SNP genotypizácia je meranie genetických variácií jednonukleotidových

polymorfizmov (SNPs) medzi členmi druhu. SNP je jediná mutácia bázových párov na

konkrétne miesto, zvyčajne sa skladá z dvoch alel (kde frekvencia alely je > 1%). SNP

je možné zistiť, že etiológia mnohých ľudských chorôb je stále predmetom osobitného

záujmu vo farmakogenetike. SNPs boli zachované v priebehu evolúcie a boli navrhnuté

ako markery pre použitie lokusov kvantitatívnych vlastností (QTL) analýzy a asociačné

štúdie v mieste mikrosatelitov. Použitie SNP je rozšírené v projekte HapMap, ktorý má

za cieľ poskytnúť minimálnu sadu SNP potrebných ku genotypovaniu ľudského

genómu. SNP môžu tiež slúžiť ako genetický odtlačok pre použitie testovania identity

(Rapley a Harbron, 2004).

Zvýšený záujem o SNP sa odrazil v rýchlom vývoji rôznorodých metód SNP

genotypizácie.

1.6 Gény obezity a metabolizmu lipidov

Systém regulácie metabolických dráh lipoidov a udržiavanie telesnej hmotnosti si

vyžaduje integráciu periférnych signálov a ich centrálnu koordináciu v mozgu. Klúčové

postavenie v tomto systéme má hypotalamus, ktorý funguje ako centrálny regulátor.

Informácie o energetickom stave organizmu sa dostávajú do hypotalamu cestou

neuronálnou a cestou humorálnych signálov (Bell et al., 2005).

Kľúčovú úlohu humorálnej signalizácii zabezpečujú gény leptín a jeho receptor

a ghrelín a jeho receptor.

31


Tabuľka 4: Gény súvisiace s obezitou a metabolizmom lipidov (Bell et al., 2005; Ichihara a Yamada, 2008)

Gén Lokus Polymorfizmus Popis dbSNP

Angiotensin-converting enzyeme (ACE) 17q23 240 A-T súčasť metabolizmu

angiotenzinogénu rs4291

Β2-Adrenergic receptor (ADRB2)

Β3-Adrenergic recptor (ADRB3)

5q31-q32

9p12

Arg16GlyGln27Glu

znižujú aktivitu receptoru

rs1042713rs1042714

rs4994

Ghrelín (GHRL) 3p26 Gln90LeuLeu72Met

reguluje príjem potravy a telesnú váhu,

ovplyvňuje žalúdočnú motilitu

rs4684677rs696217

Ghrelín receptor (GHSR) 3p26 171 T-C reguluje príjem potravy a telesnú váhu rs495225

Leptín (LEP) 7q31.3 G2458Aovplyvňuje výšku BMI, je spájaný s nadváhou a

obezitours7799039

Leptín receptor (LEPR) 1p31 Gln223Arg ovplyvňuje výšku BMI a množstvo tuku rs1137101

Melanocortine receptor 4 (MC4R) 18q22 Arg7Cys

podieľa sa na centrálnej regulácii energetickej homeostázy a telesnej

hmotnosti

rs1047214

Proopiomelanocortin (POMC) 2p23.3 G7013T

podieľa sa na regulácii energetického príjmu a

vedie k obezite

rs121918111

Tumor necrosis factor-α (TNFA) 6p21.3 308A-G mení transkripčnú

aktivitu rs1800629

Uncoupling protein 1 (UCP1)Uncoupling protein 2 (UCP2)Uncoupling protein 3 (UCP3)

4q28-q31

11q1311q13

3826A-G866G-A55C-T

ovplyvňujú váhu, BMI, WHR a sú spájané s

obezitou

rs1800592rs659366rs1800849

1.6.1 Leptín a leptínový receptor

1.6.1.1 Biologická funkcia leptínu a leptínového receptoru

Leptín ako signál pocitu nasýtenia – saturácie tukových zásob organizmu, je

produkovaný najmä bunkami bieleho tukového tkaniva, ale bola zistená syntéza leptínu

aj v iných tkanivách, napríklad v placente. Koncentrácia leptínu v krvnej plazme myší a

ľudí koreluje s triglyceridovou saturáciou tukových buniek, množstvom tukového

tkaniva a teda s výživným stavom alebo so stavom telesnej kondície. Koncentrácia

leptínu klesá pri zníženom príjme potravy a stúpa pri jeho zvýšení. Koordinová zmena

sekrécie a koncentrácie leptínu s hladinou inzulinémie a úrovňou látkovej výmeny

organizmu poukazuje na to, že jeho syntéza a inkrécia je regulovaná hormonálne

32


(inzulín, glukokortikoidy, inzulínu podobné rastové faktory IGF-I a pravdepodobne aj

rastový hormón) a metabolicky (Maraček et al., 2004).

Leptín je tiež známy svojou úlohu v rôznych častiach tela, ako sú mužské

a ženské pohlavné orgány, prsné žľazy, minerálna kostná denzita (hustota), imunitný

systém, črevá, obličky a pľúca (Baratta, 2002).

Jeho opis bol publikovaný v roku 1994, ale už v roku 1950 bola popísaná génová

mutácia v leptínovom géne (ob gén) u myší, ktorá viedla k rozvoju morbídnej obezity

a diabetu už v skorom veku. Leptín má v organizme radu receptorov. Dlhá forma

leptínového receptoru má v intracelulárnej doméne 303 aminokyselinových zvyškov,

zatiaľ čo krátka forma iba 34. Extracelulárne domény oboch receptorov sú zhodné

(Bronsky a Průša, 2008).

Mechanizmus účinku leptínu je známy na centrálnej a periférnej úrovni. Leptín

produkovaný bunkami tukového tkaniva sa prostredníctvom väzobných a transportných

proteínov dostáva krvným obehom do ventromediálneho jadra (nucleus ventromedialis)

hypotalamu, kde pomocou receptorov signalizujú dobrú saturáciu tukovými zásobami.

Sýtosť leptín signalizuje účinkom orexigenických peptidov na sekréciu neuropeptidu Y

(NPY), melanín-koncentrujúci hormón, AgRP, galanín a orexín, pričom menšia časť

leptínu sa dostáva aj do periférnych tkanív ako je pankreas, pečeň a svalstvo (Sahu et al.

2003, Maraček et al., 2004). Anorexigenické peptidy, ktorých expresia je ovplyvňovaná

leptínom sú pro-opimelanokortín (POMC), kortikotropín – uvoľňujúci hormón

a neurotenzín (Klok et al., 2006).

V súčasnom období je už dostatočne zrejmé, že hypotalamus zodpovedá za

reguláciu príjmu potravy a neuroendokrínnu reguláciu homeostázy energie. Ale

vzájomný vzťah medzi leptínom a ostatnými hypotalamickými mediátormi regulácie

hmotnosti tela nie sú dostatočne objasnené (Soares a Guimaraes, 2001).

Leptín je proteín produkovaný v adipocytoch. Krvou sa transportuje do mozgu,

kde pôsobí na leptínové receptory a reguluje tým apetít. Nesie v sebe informáciu o stave

tukových zásob (význam v prípade nadbytku), indukuje redukciu príjmu jedla a zvyšuje

energetický výdaj. Leptínový receptor je exprimovaný hlavne v oblastiach mozgu, ktoré

regulujú príjem jedla – neuróny oblúkovitého jadra v hypotalame a tu stimuluje

produkciu anorexigenických peptidových hormónov (Lönngvist, 1996; Bray a York,

1997; Fried et al., 2000).

33


Niekoľko štúdií ukázalo, že diétou u obéznych je znížená schopnosť leptínu

aktivovať primerané signalizácie v hypotalame (Van Heek et al., 1997; El-Haschimi et

al., 2000; Munzberg et al., 2004).

Leptín tiež zvyšuje aktivitu sympatika na netermogénne tkanivá, vrátane obličiek

a nadobličiek (Dunbar et al., 1997). Obličky majú dôležitú úlohu v kontrole krvného

tlaku a stimuláciu sympatika, ktoré aktivuje procesy v obličkách čo vedie ku zvýšeniu

krvného tlaku (DiBona, 2004).

Leptín má zrejme priamy vplyv na krvný obeh. Leptín podporuje nahromadenie

krvných doštičiek a trombóz v mieste poranenia cievy (Nakata, 1999; Konstantinides,

2001), a indukuje oxidačný stres v rôznych endoteliálnych bunkách in vitro

(Bouloumie, 1999; Yamagishi, 2001). Obezita je spojená so zrýchlením aterotrombózy

a so zvýšeným systémovým oxidačným stresom. Je preto možné tvrdiť, že vysoká

hladina leptínu zistená u obéznych jedincov môže mať patologický efekt na cievy,

najmä ak cievny systém nie je schopný rezistencie. Preto budú potrebné ďalšie štúdie k

úplnému pochopeniu účinku leptínu a rezistencie leptínu na vaskulárne funkcie.

Ľudský LEP gén je lokalizovaný na 17. chromozóme v regióne 7q31.1 (Zhang et

al., 1994). Mammès et al. (1998) zistili, že v populácii ľudí je v promótorovom géne pre

leptín polymorfizmus G ―› A lokalizovaný na lokuse 2548. Ni et al., (2009) potvrdili

súvis polymorfizmu G2458A s nárastom BMI a WHR u ľudí s alelou G a alela A bola

frekventovanejšia u chudých ľudí.

Leptín, ako kandidátny gén pre signál pocitu nasýtenia je využívaný aj v šľachtení

hospodárskych zvierat. Expresia a sekrécia leptínu je preukazne korelovaná s reguláciou

príjmu potravy, energetickým metabolizmom a hmotnosťou tela (Campfield et al.,

1995; Remesar et al., 1997), preto je LEP gén využívaný ako markér pre hrúbku

chrbtovej slaniny, spotrebu krmiva a prírastok hmotnosti u ošípaných a hovädzieho

dobytka.

Leptínový receptor hrá dôležitú úlohu v oblasti ľudského zdravia, preto je spájaný

najmä s energetickou homeostázou, kde je jeho funkcia veľmi dôležitá. Leptínový

receptor súvisí s obezitou u ľudí. Mutácia, ktorá vedie k strate transmembránovej

a intracelulárnej domény receptora, je dávaná do súvislosti s fenotypom, ktorý zahŕňa

morbídnu obezitu a neplodnosť (Clement et al., 1998).

Okrem zapojenia leptínového receptoru do obezity, je zvýšená koncentrácia

leptínového receptoru spojená so spánkovým apnoe, nezávisle od BMI (Manzella,

34


2002). Výrazne nízka koncentrácia leptínu je pozorovaná u žien s endometriózou (Muy-

Rivera, 2005).

Pri mapovaní ľudského genómu bol LEPR lokalizovaný na chromozóme 1 v

oblasti 1p31 a má najmenej 5 izoforiem. Extracelulárne a transmembránové domény sú

zhodné medzi krátkou a dlhou izoformou, rozdiely sú spôsobené zmenami dĺžky

cytoplazmatickej domény. Dlhá forma (LEPR1) má 302 cytoplazmatických zvyškov

v porovnaní s krátkou formou (LEPRs), ktorej cytoplazmatické zvyšky majú rozmedzie

32 až 40 aminokyselín. Iná forma leptínového receptoru, rozpustná forma (LEPRe),

pozostávajúca z extracelulárnej domény receptoru by mala obsahovať nonintracelulárne

alebo transmembránové reziduá (Houseknecht a Prtocarrero, 1998). Baratta (2002)

identifikoval izoformy receptorov vo viacerých tkanivách, ako je hypofýza, mužské

a ženské reprodukčné orgány, prsné žľazy, imunitný systém, črevá, obličky a pľúca.

Štúdie vykonávané na myšiach ukázali, že dlhá forma by mala byť najdôležitejšia pre

prenos leptínového signálu do buniek, ktoré sa nachádzajú prevažne v hypotalame a nie

vo väčšine iných tkanív (Schwartz, 1996), zatiaľ čo krátka forma sa nachádza v celom

tele, najmä v obličkách, pľúcach a choroid plexus (Tartaglia et al., 1995). Štruktúra

leptínového receptoru je podobná ako u špirálových cytokínových receptoroch (1.

trieda). Homodimérová forma leptínového receptoru, je schopná aktivovať Janus

kinázy. Janus kináza potom začína aktiváciu transkripčnej rodiny. Leptínovú

signalizáciu pomocou Janusových kináz – štart aktivácie transkripčného systému je do

značnej miery spojená s formou LEPR 1 (Watowich a Socolovsky, 1996).

Leptínový receptor je členom rodiny cytokínov prvej triedy, tiež známy ako gp130

receptor rodiny. Na rozdiel od iných členov rodiny leptínový receptor nevytvára

oligoméry s gp130 (Nakashima et al., 1997).

35


Obrázok 6: Biologická funkcia leptínu

1.6.1.2 Polymorfizmus leptínu a leptínového receptoru

Polymorfizmus leptínu a jeho receptora je najlepšie preštudovaný pri druhoch

mus muscullus, sus scrofa, homo sapiens.

V géne humánneho LEP boli popísané dva typy mutácií, pričom polymorfizmus

v nekódujúcej 5´ oblasti je v asociácii s nižšou koncentráciou leptínu a tým aj

s obéznym fenotypom (Mammès et al., 2000).

Je známe, že sekrécia leptínu je veľmi úzko spojená s množstvom telesného tuku

u myší, prežúvavcov a u ľudí. Existuje pozitívny vzťah medzi cirkulujúcim leptínom

a obsahom tuku (Brockman et al., 2000).

Polymorfizmus LEP génu ošípaných je známy vo viacerých substitúciách: C/T,

A/G, C/T, G/T, A/T, T/C a G/A na pozíciach 867, 1112, 3469, 3714, 2845, 3996 a 2728

(Stratil et al., 1997; Robert et al., 1998; Jiang a Gibson, 1999; Kennes et al., 2001).

Stepien-Poleszak et al. (2009) identifikovali LEP gén s využitím reštrikčného

enzýmu HinfI v pozícii 3469 pomocou PCR-RFLP. U LEP génu identifikovali 2 alely T

(0,94) a C (0,06), ktoré mali za následok dva genotypy : TC (0,12) a TT (0,88).

Metódou hybridizácie somatickej bunky bol v roku 1996 gén pre leptín

lokalizovaný na 18. chromozóme ošípanej (Neuenschwander et al., 1996). Úplnú

nukelotidovú sekvenciu leptínového génu ošípanej ako prvý popísali Ramsay et al.,

(1998).

36


Amills (2008) uvádza, že C3469T mutácia na exóne 3 prasačieho LEP génu bola

u rozličných plemien prasiat kontroverzná vzhľadom na spojitosť s rastom, tučnotou

a úmrtnosťou. Hlavným cieľom ich práce bolo zistiť či koncentrácia leptínovej plazmy

sa líši u prasiat v závislosti od C3469T a Lepr HpaII RFLP genotypou. S týmto cieľom

boli merané hladiny plazmy leptínu 160 dní u prasiat s rozličnými Lep C3469T a Lepr

HpaII RFLP genotypomi. Ani Lep (TT: 11,68 ng.ml-1, TC: 10,71 ng.ml-1) ani Lepr (AA:

12,6 ng.ml-1, AB: 10,93 ng.ml-1, BB: 11,74 ng.ml-1) genotypy zásadne neovplyvnili

koncentráciu plazmy leptínu. Nenašli ani žiadnu spojitosť medzi Lep a Lepr genotypmi

a fenotypová odchýlka v raste a tučnote v bežnej populácii prasiat plemena Landrace.

Významné sú polymorfizmy Lys109Arg a Gln223Arg v géne leptínového

receptoru, ktoré majú typický efekt na extracelulárnu časť receptora a ktoré nevedú

k strate funkcie (van Rossum et al., 2003; Takahashi-Yasuno et al., 2004).

Mutácia Q223R bola spojená s obezitou, priberaním na váhe, zvýšením telesného

tuku aj zvýšením abdominálneho tuku (Chagnon a Wong, 2000; Wauters et al., 2001;

Yiannakouris et al., 2001; van Rossum et al., 2003; Guizar-Mendoza et al., 2005), aj

keď asociácie s obezitou v iných štúdiách potvrdené neboli (Considine et al., 1996;

Silver et al., 1997; Heo et al., 2002). Okrem toho, polymorfizmus Q223R leptínového

receptoru v kombinácii s mutáciou leptínu, bol spojený so zvýšeným výskytom non-

Hodgkinového lymfómu (Skibola et al., 2004). Polymorfizmus Q223R je tiež spojený

so zvýšenou kostnou denzitou (Koh et al., 2002), zatiaľ čo polymorfizmus A861G

súvisí s osifikáciou chrbtice (Tahara et al., 2005).

Štúdie polymorfizmu leptínového receptoru (Gln223Arg) u ľudí preukázali

spojenie s obezitou a predpovedajú variabilitu malého percenta telesnej hmotnosti a

zloženia tela v geneticky homogénnej populácii (Quinton et al., 2001; Yiannakouris et

al., 2001; van Rossum et al., 2003; Ni et al., 2009).

Analýza polymorfizmu Gln223Arg preukázala vyššiu frekvenciu genotypu GG

(69,1%) v celej sledovanej populácii. V populácii obéznych a neobéznych mužov a žien

bola vyššia frekvencia genotypu GG (Ni et al., 2009).

V asociačnej štúdii polymorfizmu Gln223Arg pre leptínový receptor Guízar-

Mendoza et al., (2005) potvrdili výrazne vyššiu frekvenciu alely G (0,70) nad alelou A

(0,30) v skupine obéznych a v skupine s normálnou hmotnosťou bola tiež potvrdená

vyššia frekvencia alely G (0,63) nad alelou A (0,38). Hodnota BMI bola v tejto štúdii

zvýšená u jedincov s genotypom GG (27,1 kg.m-2) a potvrdila sa aj vyššia hladina

glukózy (4,8 a 5,0 mmol.l-1) v krvi u obéznych jedincov.

37


Richert et al. (2007) potvrdili v štúdii polymorfizmu malých chlapcov vyššiu

frekvenciu alely G (0,70) nad alelou A (0,30), hodnota BMI boli pre genotyp AG

najvyššia (16,1%), pre genotyp GG (15,9%) a pre genotyp AA bola hodnota najnižšia

(15,5%).

V pozorovaní starších mužov pre polymorfizmus Gln223Arg bola najvyššia

hodnota BMI pre genotyp AA (26,1), AG (25,9) a najnižšia hodnota bola pre genotyp

GG (25,4) (Crabbe et al., 2006).

Leptínový receptor je dôležitý aj v živočíšnej výrobe. U ošípaných polymorfizmus

génu leptínového receptoru bol spojený s veľkosťou vrhu, hrúbkou chrbtovej slaniny

a konverziou krmiva (Chen, 2004; Mackowski, 2005). Pri dojniciach polymorfizmus

leptínového receptoru súvisí s koncentráciou leptínu v neskorej gravidite (Liefers,

2004).

1.6.1.3 Leptín a lipidový metabolizmus

Bolo zistené, že leptín má vplyv na lipidy, ktoré môžu byť čiastočne nezávislé na

centrálne sprostredkovaných účinkoch na energetickú bilanciu (Riedy a Webwe, 2000;

Bjorbaek a Khan, 2004). Niekoľko štúdií potvrdilo účinok leptínu na metabolizmus

tukov u zvierat (Silver et al., 1999; Silver et al., 2000; Wiegman et al., 2003) aj u ľudí

(Faroogi et al., 2002).

Leptín je silný stimulátor lipolýzy a oxidácie mastných kyselín v adipocytoch a

ďalších bunkových typov. V dôsledku toho je Leptín regulátorom bunkového obsahu

triacylglyceridov (Reidy a Webwe, 2000).

Štúdia Prierue et al., (2008) naznačuje, že podávanie leptínu v krátkom období má

účinky na metabolizmus tukov.

1.6.2 Ghrelín a ghrelínový receptor

1.6.2.1 Biologická funkcia ghrelínu a ghrelínového receptoru

Ghrelín popísali japonskí vedci v roku 1999 ako fyzický ligand z "orphan"

receptoru GHS1a, ktorý je špecifický pre skupinu syntetických peptidov (rastový

hormón secretagogues - GHS) stimulujúci sekréciu rastového hormónu. Ghrelín je

multifunkčný peptidový hormón produkovaný bunkami sliznice žalúdka.

38


Plazmatické hladiny ghrelínu odrážajú krátkodobé zmeny príjmu potravy,

rovnako ako dlhodobé zmeny vo výživovom stave organizmu. Bolo potvrdené, že sa

znížili po príjme potravy u zdravých jedincov. U obéznych ľudí a tiež u pacientov s

mentálnou anorexiou sú zvýšené počas hladovania. Plazmatické hladiny ghrelínu

človeka negatívne korelujú s indexom telesnej hmotnosti, množstvom telesného tuku,

veľkosťou adipocytov a plazmatickou hladinou, glukózy, inzulínu a leptínu. Ghrelín

hrá úlohu ako metabolický signál hladu (Bronský et al., 2004).

Vzhľadom k tomu, že úrovne ghrelínu v plazme sú úplne závislé na nedávnom

príjme potravy, tento hormón hrá zásadnú úlohu v chuti do jedla. Nedostatok spánku

podporuje tvorbu hormónu ghrelínu a tlmí produkciu hormónu leptínu. Funkciou

ghrelínu je dávať signály o príjme potravy do mozgu. Úroveň sekrécie sa zvyšuje pred

jedlom a klesá po príjme jedla. Zohráva úlohu pri vzniku obezity stimuláciou chuti do

jedla, a s tým súvisiacou zvyšujúcou sa hmotnosťou (Lakar a Fundazioa, 2009a).

Ghrelín je zložený z 28 zvyškov aminokyselín, v ktorom tretia aminokyselina,

zvyčajne serín, ale pri niektorých druhoch treonín, je modifikovaná mastnými

kyselinami; táto úprava je potrebná pre fungovanie ghrelínu. Uvoľňovanie GH z

hypofýzy môže byť regulované nielen GH uvoľňujúcim hormónom z hypotalamu, ale

aj ghrelínom pochádzajúcim zo žalúdka (Kojima et al., 1999). Ghrelín je produkovaný

na viacerých miestach, napr. v enteroendokrinných bunkách žalúdka a čriev, v

pankrease, obličkách, placentárnom tkanive štítnej žľazy, hypotalame a hypofýze. V

ľudskom organizme, ghrelín stimuluje sekréciu rastového hormónu, prolaktínu a

ACTH. Ghrelín má tiež orexigenickú činnosť (zvýšenie príjmu potravy), ovplyvňuje

spánkový cyklus, žalúdočnú motilitu a sekréciu, kardiovaskulárne funkcie, reguluje

endokrinné funkcie pankreasu, metabolizmus glukózy a má antiproliferatívny účinok.

Zohráva významnú úlohu pri energetickej homeostáze, glukózovom a lipidovom

metabolizme, reprodukcii, kardiovaskulárnej funkcii a imunite (Buczkowska, 2005).

Ghrelín je dôležitým regulátorom v rámci homeostázy v organizme a prepája

neuroendokrínne a metabolické reakcie organizmu na hladovanie, a je považovaný za

antagonistu leptínu.

Ghrelín je peptidový hormón produkovaný bunkami žalúdka, ktorý povzbudzuje

chuť do jedla tým, že pôsobí na arcuate nucleus, čo je oblasť kontrolujúca príjem

potravy. Jedná sa o orexigén, ktorý za podmienok hladu cirkuluje v krvi. To naznačuje,

že odovzdáva signál hladu z periférií do centrálneho nervového systému. Ghrelín hrá

39


dôležitú úlohu pre udržanie uvoľňovania a energetickej homeostázy stavovcov (Kojima

a Kangawa, 2008).

Stimulácia ghrelínom v mozgu, vedie k zvýšenému apetítu a tiež podporuje

ukladanie tukov vo viscerálnych tukových tkanivách, ktoré sú lokalizované

v abdominálnej časti tela. Zvýšené riziko vzniku diabetes mellitus II. typu, zvýšenie

krvného tlaku, zvýšenie triglyceridov, hypercholesterolémia a vznik metabolického

syndrómu súvisí so zvýšeným ukladaním tukových zásob práve v abdominálnej oblasti

(Lakar a Fundazioa, 2009b).

Po príjme glukózy alebo jedla s vysokým obsahom tuku, výrazne klesá hladina

ghrelínu. Bielkoviny na výšku hladiny ghrelínu nemajú vplyv (Greenman et al., 2004).

Patterson et al., (2005) zistil, že u jedincov s normálnou hmotnosťou postupné

zníženie hladinu ghrelínu spôsobuje zvýšenie kalorickej hodnoty potravín.

Ghrelínový gén sa skladá zo štyroch exónov a troch intrónov a vytvára

rôznorodosti orexigenických peptidov rovnako ako des-acyl ghrelín a obestatin, ktoré

vykazujú vlastnosti spôsobujúce anorexiu. Ghrelín stimuluje syntézu neuropeptidu Y

(NPY) a agouti-súvisiaci proteín (AgRP) arcuate nucleus v hypotalame a zadnom

mozgu prostredníctvom svojho receptora (GHSR).

Ghrelínový receptor produkujúce neuróny modulujú činnosť orexigénnych NPY /

AgRP a anorexigénnych POMC / CART pro-opiomelanocortin neurónov (Kojima

a Kangawa, 2008).

Apetít je stimulovaný pozitívnym účinkom na NPY/AgRP neuróny, ktoré

exprimujú ghrelínové receptory. Pôsobí kratšie ako leptín a inzulín. Ghrelínové

receptory sú situované v hypofýze (sprostredkujú uvoľňovanie rastového

hormónu), v hypotalame na NPY neurónoch (stimulujú príjem potravy) a tiež v srdci

a svaloch. Jeho sérové hladiny sa zvyšujú medzi jedlami, tesne pred jedlom stúpa a po

jedle prudko klesá (Bouchard et al., 1993; Cummings a Schwartz, 2003; Cowley a

Grove, 2004).

Úloha ghrelínu ako stimulantu chuti do jedla sa opiera o súčasné výsledky

potvrdené u potkanov, ktoré odhalili zrušenie cirkulácie endogénneho ghrelínu

s neutrálnymi protilátkami, a taktiež bola pozorovaná znížená chuť do jedla a príjem

potravy (Zorrilla et al., 2006).

Ghrelínový receptor sprostredkováva signalizáciu prechodu cez hematoencefalickú

bariéru a týmto spôsobom môže mať ghrelín vplyv v oblasti mozgu, ktorá je chránená

hematoencefalickou bariérou (Banks et al. 2002).

40


Periférny účinok ghrelínu sa realizuje prostredníctvom svojho pôsobenia na

blúdivý nerv (leRoux et al., 2005).

Ghrelín a leptín nie sú len molekuly schopné ovplyvniť činnosť neurónov

NPY/AgRP v ARC, ale ghrelín je jediný známy periférny signál, ktorý stimuluje chuť

do jedla a zvýšenie príjmu potravy, t.j. orexigenický efekt sprostredkovaný týmito

neurónmi. Avšak pridaním leptínu vzniká anorexigenický efekt týchto neurónov

sprostredkovaný pri niekoľkých ďalších metabolických signáloch, napr. glukóza,

inzulín, cholecystokonín, pankreatický polypeptid (PP), peptid YY (PYY) a leptín

(Tung et al., 2001; Traebert et al., 2002; Abizaid a Horváth, 2008).

V posledných štúdiách sa uvádza, že podávaný ghrelín zvyšuje vyprázdňovanie

žalúdka pri normálnej hmotnosti zdravého človeka (Levin et al., 2006).

Rovnaké pozorovania boli zaznamenané u osôb s diabetom a idioplastickou

gastroparézou (Murray et al., 2005; Tack et al., 2005). Okrem toho, plazmická

koncentrácia endogénne acetylovaného ghrelínu bola negatívna a koreluje s polčasom

vyprázdňovania žalúdku. Zaujímavé je, že toto spojenie nebolo pozorované u obéznych

jedincov a že akcia ghrelínu by sa mohla zmeniť v závislosti od úrovne obezity (Valera

et al., 2005).

Bolo potvrdené, že podávaný ghrelín (0,33µg.kg-1) nemal významný vplyv na

zmeny v objeme žalúdku pred a po jedle. Tiež nebol zistený vplyv na vyprázdňovanie

žalúdka u obéznych alebo pri jedincoch s normálnou hmotnosťou (Cremonini et al.,

2006). Rozpory v týchto výsledkoch by mohli byť závislé v množstve podávaného

ghrelínu. Väčšina publikovaných štúdií sa zaoberá úlohou ghrelínu v regulácii pohybov

a sekrécie žalúdočnej kyseliny. Avšak účinky ghrelínu sa môžu líšiť u obéznych

jedincov v porovnaní s osobami s normálnou telesnou hmotnosťou.

Funkcia ghrelínu je najlepšie preštudovaná na experimentálnych zvieracích

modeloch. Napríklad u potkanov ako žalúdočný hormón reguluje príjem potravy

a energetický metabolizmus prostredníctvom centrálneho mechanizmu, ale významne

zoslabuje diferenciáciu preadipocytov do adipocytov tukového tkaniva (Zhang et al.,

2004).

Štúdiom genómov stavovcov (myš, potkan) bolo potvrdené, že účinok GRHL a

GHSR je spojený s obezitou alebo celým radom metabolických syndrómov a

metabolizmom lipidov (Kissebah et al., 2000; Wu et al., 2003).

41


Tieto zistenia a poznanie biologickej funkcie týchto proteínov predurčujú gény

kódujúce ghrelín a ghrelínový receptor, za kandidátske gény pre štúdium obezity

a chorobami súvisiacimi s poruchami metabolizmu lipidov.

1.6.2.2 Polymorfizmus génov ghrelínu a ghrelínového receptoru

Gén ghrelínu je lokalizovaný na chromozómovom lokuse 3p26-p25, prekurzor

proteínového hormónu je kódovaný 4 exónmi, ktoré majú dĺžku 5kb a obsahuje 20 bp

nekódujúceho prvého exónu (Seim et al., 2007; Marger, 2008).

Obrázok 7: Gén ghrelínu a obestatínu (chromozóm 3p25.3) (prerobené podľa

Gueorguiev et al., 2009)

Gén ghrelínového receptoru je lokalizovaný na krátkom ramene 3. chromozómu

v lokuse 3p26.

Pre gén ghrelínového receptoru boli pozorované viaceré genetické varianty

(obrázok 8). Bolo nájdených 7 variant, z ktorých 5 bolo jednonukleotidového

polymorfizmu (SNPs), ktorým sa nemenil aminokyselinový kód bielkovín. Týchto 5

mutácií sa nespája s obezitou alebo s rastom. Avšak, boli nájdené dve genetické

varianty, ktoré spôsobujú zmenu poradia aminokyselín vo funkčnom proteíne a majú za

následok zníženie aktivity receptora. Mutácia Ala204Glu vplývala na rozvoj morbídnej

obezity a Phe279Leu mala vzťah k retardácii rastu u detí (Wang et al., 2004; Pantel et

al., 2006).

42


Obrázok 8: Ghrelínový receptor (chromozóm 3q26.2) (prerobené podľa Gueorguiev, 2009)

Vartainen et al., 2004 vo svojej štúdii potvrdili pre polymorfizmus 171C >T vyššiu

frekvenciu alely T (68,5). Hodnota BMI bola najvyššia v genotype CC a najnižšia

v genotype CT, rovnako ako hladina HDL cholesterolu v krvi bola najvyššia pri

genotype CC a najnižšia pri genotype TC.

Na základe jednonukleotidového polymorfizmu identifikovali mutáciu

polymorfizmu 171T/C Wang et al., (2004) a Miyasaka et al., (2006).

Analýzu mutácie Phe279Leu v géne ghrelínového receptora popísal Holst et al.,

(2004). Uvádzajú, že aminokyselina 279 je lokalizovaná v ligande väzbového klbka

v receptore a hrá kľúčovú úlohu v jeho aktivite. Z uvedeného vyplýva, že mutácia

Phe279Leu významne ovplyvňuje konštruktívnu aktivitu ghrelínového receptora.

Wang et al., (2004) potvrdil vplyv alely T na nárast telesnej hmotnosti a vysoké

BMI.

Miyasaka et al., (2006) uvádzajú, že vplyv mutácie T v polymorfizme 171T/C na

rozvoj bulímie, a asociácia s anorexiou a poruchami príjmu potravy nebola potvrdená.

Autori uvádzajú až 45,4% v testovanej skupine malo rizikový genotyp TT.

Gueorguiev et al., 2009 vo svojej štúdii nepotvrdili žiadne významné asociácie

polymorfizmu rs 495225 s hladinou insulinémie a glykémie.

Vyššiu frekvenciu alely T (0,70) nad alelou C (0,30) pre polymorfizmus

ghrelínového receptoru 171T/C potvrdila aj štúdia Campa et al., (2010).

43


Campa et al., (2010) zrovnávacou štúdiou českej a nemeckej populácie obéznych

pacientov potvrdili asociáciu polymorfizmov rs27647 a rs35683 (GHSR a GHRL)

s vysokým rizikom vzniku rakoviny. Významným bol predovšetkým polymorfizmus

rs27647 pričom má uplatnenie v ochrane pred iniciáciou karcinogenézy.

Hubáček et al., (2007) analyzovali ghrelínový polymorfizmus Arg51/Gln

a Leu72/Met metódou PCR, a hodnotili asociáciu identifikovaných mutácii s body

mass indexom (BMI). Okrem toho hodnotili albumín ako marker malnutrície a plazmu

lipidov ako rizikový faktor pre aterosklerózu pacientov s hemodyalýzou, u ktorých

malnutrícia a intenzívna ateroskleróza prináša komplikácie. Zistili, že nositeľ najmenej

jednej Gln51 a Met72 alely stráca telesnú hmotnosť rýchlejšie ako Arg51Gln, Leu72Met

homozygot. Nositeľ Gln51 alely bol vo vyššom riziku rozvinutia vysokej hladiny

cholesterolu.

1.6.2.3 Ghrelín a lipidový metabolizmus

Nezávisle od zmien v príjme potravy bol zistený účinok ghrelínu na zvyšovanie

telesného tuku (Tschop et al., 2001).

Aj autori Muccioli et al., (2002), Ukkola (2003), Van Der Lely et al., (2004),

Chanoine a Wong (2004), a Gauna et al., (2004) potvrdili významný vplyv ghrelínu na

metabolizmus lipidov a glukózy.

Ghrelín má špecifický účinok na metabolizmus lipidov, ktorý bol potvrdený aj pri

liečbe hlodavcov (AG), u ktorých nastalo zvýšenie obsahu tuku nezávisle od prijatého

množstva krmiva (Tschop et al., 2001; Lall et al., 2001; Tschop et al., 2002; Korbonits,

2004).

1.7 Metódy molekulovej diagnostiky

Metódy molekulovej diagnostiky sa zameriavajú na vyhľadanie rozdielov

v sekvenciách DNA a identifikáciu polymorfizmu v celej genómovej, chromozómovej,

mitochondriálnej, chloroplastovej alebo plazmidovej DNA alebo polymorfizmus

špecifických génov, prípadne ich častí. Za predpokladu, že rozdiely v sekvencii DNA

ovplyvňujú určité fenotypové znaky, môžu tieto metódy nahradiť iné diagnostické

techniky (napr. biochemické alebo sérologické). Zámerom použitia jednotlivých metód

44


je spravidla identifikácia alebo typizácia študovaných vzoriek, ktoré môžu poskytnúť

informácie dôležité pre rozlíšenie jedincov, liečbu chorôb, vyhľadanie zdroja

patogénnych organizmov, uskutočnenie preventívnych opatrení alebo fylogenetické

štúdie. Metódy založené na analýze DNA majú na rozdiel od fenotypových metód

100% typovateľnosť, pretože všetky organizmy DNA obsahujú. Genotypové

diagnostické metódy sú rýchle a často nevyžadujú kultiváciu buniek (Šmarda et al.,

2005) .

1.7.1 PCR - Polymerázová reťazová reakcia

Polymerázová reťazová reakcia (PCR – Polymerase Chain Reaction) je

v súčasnosti jednou z najpoužívanejších techník v molekulovej biológii a v molekulovej

genetike. Využíva sa na amplifikáciu t. j. namnoženie špecifických úsekov DNA

pomocou enzymatickej syntézy in vitro (Trakovická et al., 2005). Výhodou PCR je to,

že umožňuje získať požadovanú a špecifickú sekvenciu genómovej DNA bez

predchádzajúceho klonovania vo vektoroch (Šmarda et al., 2005).

Metóda PCR (Polymerase Chain Reaction) bola vyvinutá americkým vedcom K.

B. Mullisom v roku 1986, za čo bol ocenený Nobelovou cenou za chémiu v roku 1993.

Podstatou PCR metódy je in vitro syntéza definovaného úseku DNA vo veľkom

množstve kópií. Množí sa iba definovaný úsek do takého množstva kópií, ktoré je

potom možné elektroforeticky identifikovať.

Princípom PCR metódy je syntéza DNA rýchlou zmenou teploty reakčnej zmesi

cyklickým opakovaním. Jeden cyklus sa skladá z nasledovných krokov: denaturácia

DNA, annealing (hybridizácia oligoprimerov) a polymerizácia (syntéza DNA na

matrici).

V prvom kroku sa pôvodná dvojvláknová molekula DNA denaturuje na jednotlivé

vlákna. V druhom kroku sa znížením teploty primery (špecifické oligonukleotidové

sekvencie) selektívne hybridizujú podľa princípu komplementarity s denaturovanou

jednovláknovou DNA. Rýchlosť a špecifickosť hybridizácie závisí od veľkosti primerov

a hybridizačnej teploty. Hybridizačná teplota je volená na základe špecifických

vlastností konkrétnych primerov. V treťom kroku sa pri zvýšení teploty stáva vzniknutý

komplex substrátom pre DNA polymerázu, ktorá syntetizuje dvojvláknovú DNA

identickú s pôvodnou DNA. Novosyntetizované PCR produkty následne slúžia ako

45


templáty, takže počet molekúl sa za optimálnych podmienok v každom cykle

zdvojnásobí (Griffiths et al., 2002).

PCR reakcia si vyžaduje tieto nevyhnutné zložky:

Templátová DNA: na amplifikáciu špecifického úseku stačí malé množstvo DNA

s nízkou kvalitou, izolovaná z periférnej krvi, semena, chlpov alebo sterov z ústnej

dutiny. Čistota DNA zvyšuje špecifitu reakcie. Používaná DNA nesmie byť

kontaminovaná a krvné vzorky musia byť bez hemoglobínu (proteolýza, extrakcia

organickými rozpúšťadlami), ktorý inhibuje PCR (Higuchi, 1989).

Taq DNA polymeráza: termostabilná DNA polymeráza je kľúčovou zložkou úspešnej

PCR reakcie. Predstavuje vysoko aktívnu, 5´→3´ DNA závislú DNA polymerázu, ktorá

katalyzuje postupné pripájanie nukleotidov k templátu (denaturovaná jednovláknová

DNA). Rýchlosť polymerizácie je 60 – 150 nukleotidov za sekundu, pričom

polymerizačná rýchlosť závisí od teplotných a chemických podmienok. Reakčné

optimum vykazuje Taq DNA polymeráza v intervale 70 - 80 oC, pri 37 oC nemá 5

´exonukleázovú aktivitu (Tindal a Kunkel, 1988).

Horčík (MgCl2): koncentrácia horčíkových iónov má výrazný vplyv na špecifitu

amplifikácie. Optimálnou koncetráciou je spravidla 1 - 2 mM (pre 200 μM dNTP a 1 -

2 U enzýmu). Nadbytok horčíkových iónov vedie k akumulácii nešpecifických

produktov, nízka koncentrácia redukuje alebo úplne eliminuje výťažnosť PCR reakcie

(Petruska a Goodman, 1988). Výsledná koncentrácia Mg2+ sa pre každý templát a pár

primerov stanovuje empiricky. Potrebné je zohľadniť fakt, že dNTP viažu ióny horčíka,

preto by mala byť koncentrácia Mg2+ vyššia ako koncentrácia dNTP (o 0,5 – 1,0 mmol).

Nukleotidy (dNTP): sú zmesou voľných deoxyribonukleotidov: ATP, GTP, TTP, CTP.

Optimálna koncentrácia dNTP sa pohybuje v rozmedzí 50 - 200 μM. Nadmerná

koncentrácia vedie k vyššej miere chybného zaradenia (Petruska a Goodman, 1988).

Zvyšovanie koncentrácie nukleotidov v reakčnej zmesi je neopodstatnené. Ak by bola

koncentrácia každého nukleotidu 0,2 mmol-1 postačovalo by to na syntézu až 12,5 g

DNA, pričom by sa inkorporovala iba polovica nukleotidov a zároveň inhibovala

aktivita Taq DNA polymerázy (Gefland, 1989).

Primery: vymedzujú amplifikovaný úsek templátovej DNA, pričom priamy primer

(FOR) sa viaže na jedno vlákno, spätný primer (REV) na druhé vlákno podľa princípu

komplementarity. Veľkosť primerov sa pohybuje v rozsahu 15 - 30 nukleotidov, s

46


rovnakým obsahom GC párov. Vhodná koncentrácia primerov v PCR reakčnej zmesi je

10 -100 pmol.

Základné požiadavky na primery zosumarizovali Saiki a Gefland (1988):

1. primery musia hybridizovať na jednotlivých reťazcoch 3´ koncami oproti

sebe, aby tak ohraničili úsek určený na amplifikáciu. Optimálna dĺžka na

amplifikáciu je 300 bp, max. do 1500 bp

2. vhodná dĺžka primera je 18 - 25 báz. Kratšie primery môžu hybridizovať na

inom úseku, dlhšie primery sa reasociujú dlhšie a teplota annelingu musí byť

vyššia, čo nie je výhodné

3. teplota topenia (Tm – melting point) obidvoch primerov by mala byť

rovnaká, aby zabezpečila hybridizáciu v rozsahu teplôt 45 - 60 oC, ale

zároveň uchovala hybrid stabilný (72 oC)

4. obsah G a C párov by mal byť zhodný a mal by sa pohybovať v rozsahu 40 -

60 %

5. prísne komplementárne k sekvencii templátu na 3´ konci primeru (počiatok

polymerizácie), na 5´ konci naopak môžu byť modifikované. Doporučuje sa

aby 3´ koniec obsahoval 2 - 3 G alebo C nukleotidy

6. primery nesmú tvoriť slučku, sekundárne útvary, diméry a pod.

7. pri výbere miesta hybridizácie na templáte DNA je vhodné zvoliť na jeho 3´

konci prvú, alebo druhú polohu AK kodónu, lebo v týchto miestach čítacieho

rámca je vyššia pravdepodobnosť konzervácie bázy

Teplotný a časový režim: úspešnosť amplifikácie závisí od vhodného teplotného

režimu, zahŕňajúceho denaturačnú, hybridizačnú a polymerizačnú teplotu. Denaturačná

teplota má byť čo najvyššia, no nesmie inaktivovať enzým (90 - 95 oC).

Vysokomolekulárna DNA vyžaduje o niečo vyššiu denaturačnú teplotu, dlhšiu dobu,

aby bola zaistená kompletná denaturácia, (napr. pre DNA eukaryí 95 oC po dobu 5 min.)

(Saiki a Gelfand, 1988). Hybridizačná teplota sa vypočítava z Tm (teplota topenia,

melting temperature) pre konkrétne sekvencie primerov a pre dané reakčné podmienky.

Platí čím menšia je komplementarita medzi primermy a templátovou DNA, tým nižšia

je hybridizačná teplota v porovnaní s vypočítanou Tm (Petruska a Goodman, 1988).

Polymerizačná teplota je 72 - 75 oC.

Špecifita amplifikácie: je určovaná predovšetkým výberom primerov. Primery dlhšie

ako 18 báz by mali teoreticky zaistiť dostatočnú špecifitu amplifikovaného úseku

v rámci DNA eukaryí. Použitie čo najnižšej koncentrácie primerov a čo najvyššej

47


teploty annealingu zabraňuje nešpecifickej hybridizácii primerov (mispriming).

Zníženie koncentrácie solí a množstva enzýmu má tiež obdobný vplyv. Zdrojom

nešpecifických produktov môže byť aktivita Taq DNA polymerázy pri laboratórnej

teplote, kedy pred PCR vznikajú rôzne artefakty, pretože pri nízkej teplote sa viažu na

rôznych miestach templátu. Uvedený jav eliminuje horúci štart (hot start), pri ktorom sa

niektoré kľúčové zložky pridávajú až pri dosiahnutí teploty blízkej denaturačnej.

Reakcia teda nemôže začať skôr ako sú dosiahnuté optimálne podmienky. Pre zvýšenie

špecifity amplifikácie sa vo veľmi dôležitých prípadoch používajú jeden alebo dva tzv.

vnútorné primery (nested primer), ktoré zabezpečia namnoženie vnútorného úseku

cieľovej sekvencie. Teplotný režim je upravený tak, že najprv sa hybridizujú len

vonkajšie primery, v ďalších cykloch len vnútorné primery, (Grankvist, 1992; Zazziet a

Romano, 1992).

V prípade slabého výsledku je možné do reakčnej zmesi pridať špecifické

enhancery, napr. glycerol, formamid, BSA, DMSO alebo PEG, ktoré zvyšujú špecifitu

reakcie (Mullis, 1990). V dnešnej dobe je PCR metóda považovaná za základnú metódu

pre takmer všetky molekulovo-genetické analýzy (RFLP, RAPD, AFLP, SSCP, DGGE,

HRM a iné).

Identifikácia a analýza PCR produktov

Kvalitatívna analýza sa uskutočňuje elektroforézou v agarózovom géli, farbením

etídium bromidom (EtBr) a vizualizáciou UV žiarením. Koncentrácia agarózových

gélov závisí od dĺžky separovaných DNA molekúl. Platí, že so zmenšujúcou sa

veľkosťou DNA fragmentov, priamoúmerne narastá koncentrácia gélu (Maniatis, 1982).

V prípade veľmi malých fragmentov (približne 50 bp) je vhodnejšie použitie 10-

12% polyakrylamidového gélu.

Tabuľka 5: Vzťah koncentrácie agarózového gélu k veľkosti separovanej molekuly DNA (Sambrook a Russel, 2001)

48


Koncentrácia agarózového gélu(%[w/v])

Veľkosť separovanej molekuly DNA(kb)

0,3 5-60

0,6 1-20

0,7 0,8-10

0,9 0,5-7

1,2 0,4-6

1,5 0,2-4

2,0 0,1-2

1.7.2 RFLP - Polymorfizmus dĺžky restrikčných fragmentov

Metóda RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) využíva existenciu

reštrikčných endonukleáz, ktoré štiepia polynukleotidový reťazec prerušením

fosfodiesterových väzieb v určitých špecifických sekvenciách. V dôsledku uvedeného

sa DNA rozpadne na fragmenty rôznej dĺžky. Ak na štiepnom mieste dôjde k zámene

báz, enzým neštiepi, alebo vzniká nové štiepne miesto, čím dochádza k zmene dĺžky

fragmentov. Fragmenty DNA možno podľa veľkosti rozdeliť pomocou elektroforézy na

agarózovom géle a vizualizovať etídium bromidom pod UV svetlom (Sambrook et al.,

1989).

Štiepením PCR produktu RFLP metódou a následným elektroforetickým delením

fragmentov môžeme alely skúmaného génu, ako v homozygotnom, tak

i v heterozygotnom stave identifikovať.

Klasickou RFLP je genomická DNA štiepená endonukleázou a vzniknuté

fragmenty sa po elektroforetickej separácii blottingom prenášajú na pevnú membránu

(Southern blotting). Polymorfizmus vo veľkosti fragmentov možno zistiť po

hybridizácii značenou sondou.

Podstatou RFLP sú buď mutácie, ktoré vedú k vytvoreniu alebo k strate

rozpoznávacích miest pre reštrikčnú endonukleázu, alebo vznikajú ako dôsledok

prítomnosti rôzneho počtu repetitívnych sekvencií, delécií, inzercií alebo prestavieb

v špecifických oblastiach chromozómov (Šmarda et al., 2005).

Analýza RFLP je dôležitým nástrojom na mapovanie genómu, lokalizáciu

genetických ochorení génov, stanovenie rizika pre ochorenia, genetické mapovanie a

testovanie otcovstva.

49

http://216.239.59.132/translate_c?hl=sk&sl=en&u=http://en.wikipedia.org/wiki/Parental_testing&prev=/search%3Fq%3DPCR-RFLP%26hl%3Dsk%26sa%3DG&rurl=translate.google.sk&usg=ALkJrhhHhslOhENZhGafOyfq-JR18lZp6Q

http://216.239.59.132/translate_c?hl=sk&sl=en&u=http://en.wikipedia.org/wiki/Genetic_fingerprint&prev=/search%3Fq%3DPCR-RFLP%26hl%3Dsk%26sa%3DG&rurl=translate.google.sk&usg=ALkJrhj0nX3oZld0g5TqNK0lV8BWCuhJUQ

http://216.239.59.132/translate_c?hl=sk&sl=en&u=http://en.wikipedia.org/wiki/Genetic_testing&prev=/search%3Fq%3DPCR-RFLP%26hl%3Dsk%26sa%3DG&rurl=translate.google.sk&usg=ALkJrhhlYplDaLt6djrl02CXAA632jeirg

http://216.239.59.132/translate_c?hl=sk&sl=en&u=http://en.wikipedia.org/wiki/Genetic_disorder&prev=/search%3Fq%3DPCR-RFLP%26hl%3Dsk%26sa%3DG&rurl=translate.google.sk&usg=ALkJrhizZxse4KvIq7f4kXi0q6mpqEUD3g

http://216.239.59.132/translate_c?hl=sk&sl=en&u=http://en.wikipedia.org/wiki/Genome_mapping&prev=/search%3Fq%3DPCR-RFLP%26hl%3Dsk%26sa%3DG&rurl=translate.google.sk&usg=ALkJrhitroTeVajKiSCqJOG4j44Mz5Fnzg


1.7.3 PCR – RFLP

PCR-RFLP je modifikácia štandartnej PCR používaná pre typizáciu cieľovej

sekvencie, obvykle určitého génu, obsahujúceho sekvenčný polymorfizmus.

V závislosti na voľbe primerov môže byť prevedená analýza akéhokoľvek génu. Táto

sekvencia o dĺžke až 5 kb sa amplifikuje za prísnych podmienok pomocou primerov

pripájajúcich sa ku koncovým konzervovaným oblastiam. Výsledkom amplifikácie sú

produkty PCR o rovnakej dĺžke, ktoré sa detekujú elektorforeticky. Amplifikované

produkty sú štiepené reštrikčnou endonukleázou a potom sú znova analyzované

elektroforézou na agarózovom alebo polyakrylamidovom gély (Šmarda et al., 2005).

PCR-RFLP metóda sa využíva napríklad na analýzu geneticky podmienených

chorôb v humánnej i veterinárnej medicíne, na detekciu onkogénov, pri mapovaní

génov, pri štúdiu asociačných vzťahov kandidátnych génov k ukazovateľom

úžitkovosti.

Pri identifikácii polymorfných génov sa používajú i ďalšie metódy:

konformačný polymorfizmus jednoreťazcovej DNA (SSCP), denaturačná gradientová

gélová elektroforéza (DGGE), teplotná gradientová gélová elektorforéza (TGGE) a i

(Trakovická et al., 2005).

1.7.4 Real- time PCR

PCR-RT (Real-time PCR) predstavuje modernú metódu umožňujúcu sledovanie

priebehu PCR reakcie v reálnom čase na základe sledovania intenzity fluorescenčného

signálu. Využíva sa pre kvantitatívnu PCR, pre stanovenie bodu topenia (Tm) a pre

priamu detekciu genotypu. Technika vyžaduje nákladné zariadenie (Knoll a Urban,

2002). Bolo vyvinutých veľa modifikácii tejto metódy s hlavným dôrazom na to aby

bola viac kvantitavívna. Napríklad môžeme analyzovať známe množstvo študovanej

RNA za účelom stanovenia pomeru medzi RNA vstupujúcej do analýzy a DNA

získanej ako výsledok reakcie. Vďaka znalosti tohto pomeru môžeme znížiť množstvo

DNA, vytvorenej z experimentálnej vzorky, na množstvo RNA, ktoré bolo prítomné

v tejto vzorke na začiatku (Snustad a Simmons, 2009).

50


1.7.5 HRM - High Resolution Melting

Táto metóda bola po prvýkrát predstavená v roku 2002 a svoje uplatnenie našla pri

genotypovaní a detekcii známych aj neznámych mutácií prevažne v humánnej medicíne.

Ide o metódu vhodnú pri identifikácii kandidátskych génov, DNA fingerpritingu,

analýze DNA metylácie, detekcii mutácií, DNA mapovanie alebo skríning LOH.

Vzorky sú analyzované na základe ich správania sa počas denaturácie vysokou teplotou,

kedy sa dvojvláknová DNA mení na jednovláknovú, dáva oveľa viac informácií ako

prístroje predtým. Využívajú sa pri tom špeciálne fluorescenčné saturačné farbivá

(SYBER green, EvaGreen,...), ktoré vysielajú signál v prostredí jednovláknovej DNA.

Farbivá sa pridávajú do PCR amplifikačnej reakcie. Pri zvyšujúcej sa teplote, kedy

DNA denaturuje a rozpadáva sa dvojvláknová štruktúra, je toto farbivo postupne

uvoľňované z DNA. HRM prístroj s vysokou presnosťou zachytáva uvoľnený signál

a vzniká krivka. Keďže každá genetická sekvencia reaguje trochu odlišne, vznikajú

rôzne krivky, ktoré môžu byť medzi sebou porovnávané a teda detegované mutácie

(Montgomery et al. , 2007).

Obrázok 9: Schématické znázornenie HRM krivkyZdroj: prekreslené podľa http://www.gene-quantification.de/hrm-protocol-cls.pdf

51

http://www.gene-quantification.de/hrm-protocol-cls.pdf

Cieľ

2 Cieľ

Štúdia o súčasnom stave riešenej problematiky predstavuje východisko pre

formulovanie cieľov doktorandskej práce.

Leptín, leptínový receptor a ghrelínový receptor sú kandidátske gény, ktoré

významne vstupujú do regulácie príjmu potravy a výdaja energie a podieľajú sa na

metabolizme lipidov. Vykazujú polymorfizmus, a preto ich identifikácia a určenie

genotypu jedinca môže byť využitý na formulovanie preobezitogénneho efektu, ako

hlavného efektu porúch metabolizmu lipidov v dôsledku jednonukleotidových

polymorfizmov v ich génoch.

Cieľom práce bolo identifikovať jednonukleotidové polymorfizmy (SNPs) v

génoch LEP, LEPR a GHSR, ktoré sa podieľajú na regulácii metabolizmu lipidov,

apetítu alebo determinujú niektorý z fenotypických znakov obezity a analyzovať ich

vplyv na vybrané ukazovatele nutričného stavu.

Práca bola riešená v nasledovných čiastkových cieľoch:

1.Optimalizácia molekulovo-genetických metód PCR-RFLP a HRM pre

diagnostiku polymorfizmu v génoch LEP, LEPR a GHSR .

2. Vyhodnotenie polymorfizmov v génoch LEP, LEPR a GHSR na základe

génovej a genotypovej frekvencie a vyhodnotenie genetickej záťaže v sledovanej

populácii z hľadiska mutácií génov podmieňujúcich poruchy metabolizmu lipidov.

3. Vyhodnotenie vplyvu génov LEP, LEPR a GHSR na variabilitu vybraných

ukazovateľov nutričného stavu organizmu človeka (BMI, CHOL, HDL, LDL, TAG

a GLU).

52

Materiál a metodika

3 Materiál a metodika

3.1 Študovaná populácia

Pre molekulárno-genetickú analýzu LEP, GHSR a LEPR génov bol použitý

biologický materiál získaný z krvi humánnych vzoriek. Krv bola opakovane odobratá

po podpísaní informovaného súhlasu so zaradením do výskumu nameraných

biochemických parametrov a molekulovo-genetických analýz. Po odbere bola krv

rozdelená do dvoch skúmaviek, jedna na rozbor biochemických parametrov a druhá na

molekulovo-genetickú analýzu. Biochemické analýzy na celkový cholesterol, HDL

cholesterol, triglyceridy a glukózu boli vykonané na katedre Výživy ľudí.

Sledovaná populácia bola rozdelená na skupiny podľa pohlavia a podskupiny

podľa BMI.

Tabuľka 6: Pozorované skupinyPohlavie Priemerný vek Skupina Počet

Muži(29)

38,24

športovci 12normálna váha 13ľahká nadváha 8

obezita 8

Ženy(27)

44,85

športovci 0normálna váha 7ľahká nadváha 7

obezita 12

Tabuľka 7: Rozpätie biochemických parametrov v celej populácii (n=56)Parameter Minimum Maximum

BMI kg.m-2 18,60 40,40

Vek 19,00 63,00

CHOL mmol.l-1 2,93 7,61

HDL mmol.l-1 0,89 2,54

LDL mmol.l-1 0,93 4,92

TAG mmol.l-1 0,44 4,52

GLU mmol.l-1 3,52 7,02

53


Tabuľka 8: Rozpätie biochemických parametrov podľa pohlaviaPohlavie Parameter Minimum Maximum

Muži (29)

BMI kg.m-2 20,02 36,39Vek 19.00 63.00CHOL mmol.l-1 2,93 7,43HDL mmol.l-1 0,89 2,24LDL mmol.l-1 0,93 4,02TAG mmol.l-1 0,67 4,52GLU mmol/l 4,63 7,02

Ženy (27)

BMI kg.m-2 18,60 40,40Vek 21.00 60.00CHOL mmol.l-1 3,50 7,61HDL mmol.l-1 1,55 2,54LDL mmol.l-1 1,25 4,92TAG mmol.l-1 0,44 2,20GLU mmol.l-1 3,52 6,83

Rozpätie diagnostikovaných biochemických parametrov bolo nasledovné.

V skupine športovcov bola nadlimitná hodnota u jedného jedinca a to pri glukóze

(6,32) toto zvýšenie mohlo byť spôsobené konzumáciou jedla pred odberom.

V skupine ľudí s normálnou váhou s BMI od 20 do 25 bolo zvýšenie glukózy

(6,32) a triglyceridov (3,18) u mužského pohlavia. Zvýšená hladina cholesterolu bola

nameraná aj u jedného muža (6,11) a u dvoch žien (6,23;6,82). Pri HDL cholesterole

boli namerané aj zvýšené aj znížené hodnoty. Zvýšenie bolo pri štyroch ženách (2,14;

2,47; 2,23 a 2,23) a jednom mužovi (2,23). Veľmi nízke hodnoty boli pri štyroch

mužoch (0,92; 0,94; 0,95 a 0,89). Takto nízke hodnoty HDL svedčia o zvýšenom riziku

vzniku aterosklerózy.

V pozorovanej skupine ľudí s ľahkou nadváhou a hodnotou BMI od 25 do 30 sme

zistili nasledovné hodnoty: LDL cholesterol bol zvýšený u dvoch žien (4,14 a 4,53)

zároveň u týchto dvoch žien bol zvýšený aj celkový cholesterol (6,8 a 7,18) a okrem

nich mal celkový cholesterol zvýšený aj ďalších päť žien (5,91; 6,08; 6,2; 5,53 a 6,48).

Pri HDL cholesterole sme spozorovali mierne zvýšenie u troch žien čo nenesie so sebou

zdravotné riziko (2,08; 2,3 a 2,19). Len v jednom prípade bola nameraná zvýšená

hladina glukózy u muža a to 6,48.

V súbore obéznych osôb s BMI nad 30 sme zistili nadlimitné hodnoty: celkový

cholesterol malo zvýšený z 20 pozorovaných (8 mužov a 12 žien) až 18 jedincov a to 7

mužov a 11 žien. LDL cholesterol mali zvýšený 2 muži a 7 žien, triglyceridy mali

54


zvýšené 3 muži a HDL cholesterol 5 žien a 1 muž. Pri glukóze boli zvýšené hodnoty u 4

mužov a u 7 ženách.

3.2 Metódy molekulovo-genetickej analýzy

3.2.1 Izolácia DNA

DNA bola izolovaná z periférnej krvi pomocou izolačného setu NucleoSpin Blood

od firmy Macherey – Nagel podľa priloženého protokolu. Použitá bola tiež klasická

vysoľovacia metóda.

3.2.1.1 Izolácia DNA vysoľovacou metódou (Miller et al., 1988)

Vysoľovacia metóda izolácie DNA sa skladá z lýzy buniek a odstránenia

hemoglobínu zo vzorky, precipitácie proteínov, precipitácie DNA, premývanie DNA,

sušenia a rozpustenia DNA v elučnom roztoku.

Lýza buniek:

1. 300µl krvi + 1000µl RBC sme inkubovali 1-3 min. pri laboratórnej teplote.

2. Centrifugovali sme pri 13 000 otáčkach 2 minúty a odstránili sme supernatant.

3. Vzorky sme premiešali na vortexe 10-20 sekúnd, kým sme nezískali homogénny

roztok.

4. Pridali sme 600 µl lyzačného roztoku a pipetovaním lyzovali.

Precipitácia (zrážanie) proteínov:

1. Pridali sme 200 µl roztoku na precipitáciu proteínov.

2. Vzorky sme premiešali na vortexe.

3. Centrifugovali sme pri 13 000 otáčkach pri teplote 20-25ºC po dobu 20 minút,

čím precipitované proteíny vytvorili pevný tmavohnedý pelet na dne.

Precipitácia DNA:

1. Supernatant s DNA sme odliali do čistej eppendorfky, v ktorej je 600µl 100%

izopropanolu.

2. Vzorky sme premiešali.

3. Centrifugovali sme 5 minút pri 13 000 otáčkach, DNA bola viditeľná ako malý

biely pelet.

55


4. Odpipetovali sme supernatant a pridali sme 600 µl 70% etanolu.

5. Po 5 minútovom centrifugovaní pri 13 000 otáčkach sme dôkladne odpipetovali

etanol.

6. Vzorky sme vysušili v termostate pri 37 ºC 10-15 minút.

Rozpustenie DNA:

1. Pridali sme 30µl 10nM Tris-HCl pH 8,5.

2. Inkubovali sme 30-60 minút pri teplote 65 ºC.

Použité roztoky:

Roztok na lýzu červených krviniek - 5x RBC roztok

0,77M NH4Cl

0,046M KHCO3

0,01M EDTA pH 8.0

Sterilizované filtráciou

Lyzačný roztok

50mM Tris-HCl pH 8,0

100mM EDTA pH 8,0

100mM NaCl

1% SDS

H2O MilliQ

Roztok na precipitáciu proteínov

10M CH3COONH4

Roztok na rozpúšťanie DNA

10mM Tris- HCl pH 8,5

3.2.1.2 Izolácia DNA komerčným kitom NucleoSpin Blood

DNA bola izolovaná z krvi pomocou izolačného kitu NucleoSpin Blood od firmy

Machery-Nagel podľa priloženého protokolu.

Pred začatím izolácie sme nastavili inkubátor na 70 oC a zohriali tlmivý roztok

BE na 70 oC.

Lýza buniek:

Do 1,5 ml epedorfiek sme dali 200 μl krvi, 25 μl proteinázy K a 200 μl lyzačného

roztoku B3 a vortexovali 10 – 20 s. Následne sme vzorky inkubovali 15 min. pri 70 oC.

56


Úprava podmienok na naviazanie DNA:

Po skončení inkubácie sme pridali 210 μl 96 % etanolu a vortexovali.

Naviazanie DNA na silikátovú membránu:

Vzorky sme preniesli do separačnej kolónky vloženej do 2 ml skúmaviek

a centrifugovali 1 min. pri 11 000 g.

Premytie silikátovej membrány:

Následne sme kolónky vybrali a vzorky preložili do nových 2 ml skúmaviek.

Do separačnej kolónky sme pridali 500 μl premývacieho roztoku BW

a centrifugovali 1 min pri 11 000 g. Po centrifugácii sme kolónky vybrali a vložili do

nových skúmaviek, pridali 600 μl premývacieho roztoku B5 a centrifugovali 1 min. pri

11 000 g.

Sušenie silikátovej membrány:

Vzorky sme opäť centrifugovali 1 min. pri 11 000g.

Uvoľnenie DNA zo silikátovej membrány:

Do separačných kolóniek sme pridali 100 μl tlmivého roztoku BE (predhriateho na

70 oC) a vložili do uzatvárateľných 1,5 ml ependorfiek. Vzorky sme inkubovali 1 min.

pri laboratórnej teplote. Potom sme ich centrifugovali 1 min. pri 11 000 g. Koncentrácie

a čistotu získanej DNA sme premerali na prístroji NanoPhotomerTM (Implen, Nemecko)

a uskladnili pri teplote 4 oC. Pre dlhodobejšie uskladnenie sme použili teplotu -20 oC.

3.2.1.3 Overenie prítomnosti DNA

Po skončení izolácie DNA sme izoláciu overili elektroforeticky. Vzorky (4 µl) sme

zmiešali s brómfenolovou modrou a nanášali ich na 1% agarózový gél s prídavkom

interkalačného činidla GelRed (Biotium). Elektroforéza prebieha v prostredí 0,5 x TBE

pufru, pri elektroforetickom napätí 130V, po dobu 20 – 30 minút.

3.2.1.4 Meranie koncentrácie a čistoty vzoriek

Princípom spektrofotometrického merania koncentrácie a čistoty DNA je prechod

UV žiarenia meranou vzorkou, pričom časť žiarenia je absorbovaná nukelovými

kyselinami. Detektor meria množstvo svetla, ktoré prejde vzorkou. Čím viac UV svetla

sa vo vzorke zachytí, tým je koncentrácia nukleových kyselín vyššia. Absorbcia sa

57


meria pri vlnovej dĺžke 260/280 nm (DNA absorbuje žiarenie s vlnovou dĺžkou 260 nm,

proteíny žiarenie s vlnovou dĺžkou 280 nm). V tabuľke 9 sú uvedené pomery absorbcie

a množstvo DNA a proteínov po meraní na spektrofotometri (NanoPhotometer,

Implen).

Tabuľka 9: Vzťah absorbancie (A260/280) k čistote vzorky (Sambrook a Russel, 2001)A(260/280) % nukleových kyselín % proteínov

2 100 01,98 90 101,91 60 401,81 60 40

Platí, že ak sa hodnoty A260/280 rovnajú dvom, vo vzorke sa nachádza RNA. Ak

dosahuje A260/280 hodnotu 1,80 vo vzorke je čistá DNA a ak hodnota klesne pod 1,80

vzorka je kontaminovaná proteínmi a je potrebné vzorku purifikovať.

3.2.2 Polymerázová reťazová reakcia a jej modifikácie

Základom identifikácie polymorfizmu v génoch LEP, LEPR a GHSR bola

polymerázová reťazová reakcia. Získané PCR produkty boli následne analyzované

metódami PCR-RFLP (gén LEP, gén LEPR a gén GHSR) a HRM (gén LEP).

3.2.2.1 Leptín (LEP)

Po vyizolovaní DNA zo vzoriek prebehla optimalizácia PCR reakcie. Použili sme

oligonukleotidové primery prevzaté z práce Mammès et al., (1998). PCR reakcia

prebehla v objeme 25µl, v prístroji MJ Mini – Personal Thermal Cycler (Bio-Rad).

LEP FOR: 5´ - TTTCCTGAATTTTCCCGTGAG – 3´

LEP REV: 5´ - AAAGCAAAGACAGGCATAAAAA - 3´

Zloženie reakčnej zmesi je uvedené v tabuľke 10. Teplotný a časový profil PCR

použitý pre optimalizáciu analýzy bol nasledovný:

1. 94oC – 3 minúty

58


2. 94oC – 10 sekúnd

3. 60oC - 30 sekúnd 30 cyklov


5. 72oC - 5 minút

6. 15 oC – chladenie

Tabuľka 10: Zloženie reakčnej zmesi PCR reakcie LEP génu

Zložka PCR zmesiKoncentráci

aMnožstvo na 1 vzorku

10X PCR pufor (NH4)2SO4 1x 2,5 µlMgCl2 (Fermentas) 1,7 mM 1,7 µldNTP (Fermentas) 0,2 mM 0,5 µlPrimer FOR a REV (KRD) 20 pM 2 µlTaq polymeráza (Fermentas) 1U 0,2 µlDNA 100 ng 2 µlSuperčistá voda do objemu 25 µl

Prítomnosť PCR produktu bola overená elektroforeticky na 2% agarózovom géle

s prídavkom interkalačného farbiva GelRed a vo vodivom roztoku TBE.

Po úspešnom získaní PCR produktu, sme tento štiepili 10U reštrikčného enzýmu

HhaI (Fermentas) pri teplote 37oC, cez noc. Charakteristika enzýmu a štiepiacej zmesi

je uvedená v tabuľkách 11 a 12 . Následne sme štiepenú DNA vizualizovali na 2%

agarózovom géle.

Tabuľka11: Charakteristika enzýmu HhaI

Enzým Zdroj Štiepne miesto

HhaIHaemophilus haemolyticus

5´...GC G↓C...3´

3´...C↑G CG...5´

Tabuľka 12: Zloženie štiepiacej zmesi RFLP s objemom 25 µl

Množstvo na 1 vzorkuSterilná voda(Milli Q)

12 µl

Pufor 2 µlEnzým HhaI 1 µlPCR produkt 10 µl

59


Ďalšou metódou, ktorú sme použili k štúdiu polymorfizmu LEP génu bola PCR-

HRM analýza. Použili sme oligonukleotidové primery prevzaté z práce Mammès et al.,

(1998). PCR-HRM reakcia prebehla v objeme 25µl, v prístroji RotorGene 6000

(Corbett), ktorý bol zakúpený s finančnou podporou projektu Excelentného centra

ochrany a využívania agrobiodiverzity. Zloženie reakčnej zmesi je uvedené v tabuľke

13.

Tabuľka 13: Zloženie reakčnej zmesi PCR-HRM reakcie LEP génu

Zložka PCR zmesiKoncentrácia

Množstvo na 1 vzorku

HRM SensiMix (Biotium) 1x 12,5 µlEvagreen (Biotium) - 1µlPrimer (KRD) 10 pM 0,8 µlDNA 50 ng.µl-1 1 µlSuperčistá voda do objemu 25 µl

Teplotný a časový profil PCR, použitý pre optimalizáciu HRM analýzy pozostával

z amplifikácie fragmentu, ktorého koncentrácia bola meraná použitím fluorescenčného

farbiva Evagreen (Biotium) a následnej analýzy topenia amplifikovaného PCR

produktu. Presný popis teplôt a časov je nasledovný :

Preamplifikácia:





HRM analýza:

5. 75 – 86 oC – meranie po 0,2 oC, doba načítania 2 sekundy

3.2.2.2 Leptínový receptor (LEPR)

DNA, získaná z krvi bola použitá pre PCR reakciu s celkovým objemom 25 µl.

Boli použité nasledovné primery (Guízar – Mendoza et al., 2005):

LEPR FOR: 5´ - ACCCTTTAAGCTGGGTGTCCCAAATAG - 3´

60


LEPR REV: 5´ - AGCTAGCAAATATTTTTGTAAGCAATT- 3´

Zloženie reakčnej zmesi uvádza tabuľka 14, teplotný a časový profil reakcie bol

nasledovný:





5. 72oC - 5 minút

6. 15 oC - chladenie

Tabuľka 14: Zloženie reakčnej zmesi PCR reakcie LEPR génu

Zložka PCR zmesiKoncentrácia

Množstvo na 1 vzorku

10x PCR pufor (NH4)2SO4 1x 2,5 µlMgCl2 (Fermentas) 1,5 mM 1,5 µldNTP (Fermentas) 0,2 mM 0,5 µlPrimer FOR (KRD) 5 pM 0,5 µlPrimer REV (KRD) 5 pM 0,5 µlTaq polymeráza (Fermentas) 1U 0,2 µlDNA 100 ng 1 µlSuperčistá voda do objemu 25 µl


s prídavkom interkalačného činidla GelRed a vodivého roztoku TBE.

Na analýzu LEPR génu sme použili reštrikčný enzým FastDigest HpaII

(Fermentas). PCR produkt sme štiepili pri teplote 37oC po dobu 5 minút. Charakteristika

enzýmu a štiepiacej zmesi je uvedená v tabuľkách 15 a 16. Výsledok štiepenia sme

vizualizovali na 2% agarózovom géle.

Tabuľka 15: Charakteristika enzýmu HpaII


HpaII Haemophilus parainfluenzae

5'...C↑C G G...3'3'...G G C↑C...5'

61



Množstvo na 1 vzorkuSterilná voda

(Milli Q)12 µl

Pufor 2 µlEnzým HpaII 1 µlPCR produkt 10 µl

3.2.2.3 Ghrelínový receptor (GHSR)

DNA, ktorá bola získaná z krvi bola použitá pre PCR reakciu s celkovým

objemom 25 µl. Pre tento gén boli použité primery prevzaté z práce Wang et al., (2004):

GHSR FOR: 5´ - CGGGGTTCAACCTCACACT - 3´

GHSR REV: 5´ - AGAGCGCACCGCAAACTC - 3´

Zloženie reakčnej zmesi uvádza tabuľka 17, teplotný a časový profil reakcie bol

nasledovný:





5. 72oC - 5 minút

6. 15 oC - chladenie

Tabuľka 17: Zloženie reakčnej zmesi PCR reakcie GHSR génu

Zložka PCR zmesiKoncentráci

aMnožstvo na 1 vzorku

10X PCR pufor (NH4)2SO4 1x 2,5 µlMgCl2 (Fermentas) 1,5 mM 1,5 µldNTP (Fermentas) 0,2 mM 0,5 µlPrimer FOR (KRD) 5 pM 0,5 µlPrimer REV (KRD) 5 pM 0,5 µlTaq polymeráza (Fermentas) 1U 0,2 µlDNA 100 ng 1 µlSuperčistá voda do objemu 25 µl

62



s prídavkom interkalačného činidla GelRed a v roztoku TBE.

Pre reštrikčnú analýzu GHSR génu bol použitý enzým 5U LweI (Fermentas) vo

forme FastDigest. PCR produkt bol štiepený pri teplote 37oC po dobu 10 minút.

Charakteristika enzýmu a zloženie štiepiacej zmesi je uvedená v tabuľkách 18 a 19.

Výsledok štiepenia sme následne vizualizovali na 3% agarózovom géle.

Tabuľka 18: Charakteristika enzýmu LweI


LweI E. coli5´...GCATC(N)5 ↓...3´

3´...CGTAG(N)9↑...5´


Množstvo na 1 vzorkuSterilná voda(Milli Q)

12,5 µl

Pufor 2 µlEnzým LweI 0,5 µlPCR produkt 10 µl

3.2.3 Elektroforéza

Identifikácia a analýza produktov po izolácii, amplifikácii a štiepení sa

uskutočňuje elektroforetickou separáciou. Horizontálna gélová elektroforéza prebieha v

TBE tlmiacom roztoku. Koncentrácia agarózy sa volí podľa očakávanej veľkosti

fragmentov. Elektroforéza prebieha pri elektrickom napätí 80-120 V po dobu 30 - 90

minút. Gél môže obsahovať interkalačné činidlo GelRed. Po skončení elektroforézy sa

naštiepené PCR produkty detekujú pod UVtransiluminátor

3.3 Biochemická analýza

V rámci biochemickej analýzy boli sledované nasledovné parametre: celkový

cholesterol, HDL cholesterol, LDL cholesterol, triglyceridy a glukóza.

63


Merania boli realizované štandardnými metodickými postupmi na Katedre Výživy

ľudí, preto uvádzame referenčné rozpätie normálnych fyziologických hodnôt.

Tabuľka 20: Referenčné hodnoty sledovaných biochemických parametrov

ParameterReferenčný interval

[mmol.l-1]CHOL 4,2-5,2HDL 1,4-2LDL 0,9-3,9TAG 0,4-2,2GLU 3,5-6,1

Hodnoty LDL [mmol.l-1] boli vypočítané podľa Friedewaldovej rovnice (Friedewald et

al., 1972)

LDL = CHOL – (TAG/2,2) – HDL

Hodnoty BMI [kg.m-2] boli vypočítané vzťahom

BMI=hmotnosť ( kg )výška2 ( m2 )

3.4 Matematicko – štatistické vyhodnotenie výsledkov

3.4.1 Genetická štruktúra

Na základe PCR-RFLP analýzy sme stanovili genotypovú štruktúru populácie

a vypočítali sme frekvenciu alel a genotypov. Významnosť rozdielov medzi

experimentálne pozorovanou a teoreticky očakávanou frekvenciou genotypov sme

overili χ2 – testom.

Frekvencie alel pre dvojalalický systém:

pA = (2.AA + AB) : 2N qB= (2.BB + AB) : 2N

pA, qB – frekvencia jednotlivých alel

N – celkový počet jedincov

64


Overenie genotypovej rovnováhy χ2 - testom:

e – pozorovaný počet genotypov t – teoretický počet genotypov n – počet genotypových tried

Heterozygótnosť lokusu (He) podľa Nei, (1978); Trakovická et al.,( 2005)

He = 1 - ∑(p2 – q2)

Polymorfný informačný obsah lokusu (PIC) podľa Botstein et al., (1980); Trakovická et al., (2005)

1

1 1

2222 2)(1n

i

n

ijji ppqpPIC

Úroveň polymorfnosti lokusu (ENA) podľa Crow a Kimura, (1970); Trakovická et al., (2005)

22

1qp

ENA

Homozygotnosť v lokuse (Ca) podľa Trakovická et al., (2005)

Ca = ∑ pi2

Variabilita realizovanej premenlivosti v lokuse (V) podľa Trakovická et al., (2005)

(%)10011

1

N

CV a

65


3.4.2 Variabilita biochemických parametrov a asociačné štúdie

Základné variačno-štatistické analýzy údajov sme vykonali s podporou programu

SAS Enterprise Guide 3.0. Pre vyhodnotenie vzťahov medzi sledovanými

biochemickými parametrami sme použili korelačnú analýzu. Na testovanie rozdielov

priemerných hodnôt daných ukazovateľov medzi hodnotenými skupinami sme použili

Studentov T-test.

Na základe molekulovo-genetických analýz a matematicko-štatistických výpočtov

sme uskutočnili asociačné štúdie. Pre stanovenie vplyvu genotypov LEP, LEPR

a GHSR na variabilitu biochemických parametrov a BMI boli vypočítané genotypové

hodnoty (G) jednotlivých genotypov.

Genotypová hodnota (G) vyjadruje veľkosť aditívneho efektu alel a varianciu

efektu dominancie alel bez epistatického účinku (Templeton, 2006).

G = a (p-q) + 2pq.d

a – genotypová hodnota homozygotovd – genotypová hodnota heterozygotovp,q – frekvencie alel príslušného lokusu (LEP, LEPR, GHSR)

Aditívna variancia (VA) vyjadruje aditívne pôsobenie alel príslušného lokusu

na variabilitu znaku.

VA = 2pq [ a+d(p+q)]

66

Výsledky a diskusia

4 Výsledky a diskusia

Na izoláciu DNA sme použili dve rôzne metódy, vzhľadom na kvalitu

biologického materiálu. Jednou z metód bola klasická vysoľovacia metóda a druhá

bola izolácia pomocou komerčného kitu NucleoSpin Blood od firmy Machery-

Nagel.

Obrázok 10: Vizuálne hodnotenie kvality extrahovanej DNA na 1 % agarózovom gél.

Tabuľka 21: Meranie koncentrácie a čistoty DNA spektrofotometricky:

Číslovzork

y

Koncenrácia DNA(ng . µl -1)

Čistota

1 253,9 1,772 111,8 1,363 312,9 1,544 21,35 1,815 117,9 1,416 268,9 1,667 85,67 1,688 91,37 1,629 258,3 1,6510 232,6 1,4211 21,96 1,5312 190,2 2,03

Meranie koncentrácie a čistoty sme vykonali na prístroji NanoPhotomter TM (IMPLEN) .

67


4.1 Analýza génu LEP

4.1.1 PCR-RFLP analýza

Pre polymorfizmus LEP génu (G-2548A) sme zvolili PCR-RFLP metódu a HRM

analýzu. Pri optimalizácii PCR reakcie sme vychádzali z práce Mammès et al., (1998).

Použili sme nimi navrhnuté primery aj teplotný profil, ktorý sme následne

optimalizovali na naše podmienky. Na rozdiel od Mammès et al., (1998) sme znížili

počiatočnú teplotu z 95oC na 94oC a tiež sme znížili počiatočný čas z 5 minút na 3

minúty. V 30 cykloch sa striedali nasledovné kroky : denaturácia pri 94oC po dobu 10

sekúnd, v annealingu bola teplota zvýšená z 50 oC na 60 oC a jeho doba bola znížená z 1

minúty na 30 sekúnd, polymerizácia mala teplotu 72oC a doba sa znížila z 1 minúty na

45 sekúnd a koncová elongácia 72oC po dobu 5 minút. PCR bola realizovaná v prístroji

MJ Mini Personal Thermal Cycler (Biorad) v objeme 25 µl. Zloženie reakčnej zmesi je

uvedené v kapitole „Materiál a metodika“.

Po PCR analýze sme získaný PCR produkt štiepili 10U reštrikčného enzýmu HhaI.

V analyzovanej skupine sme identifikovali všetky tri genotypy: AA, AG a GG.

V prípade genotypu AA, ktorý nebol štiepený enzýmom vznikol jeden štiepny fragment

s dĺžkou 242 bp, pri genotype AG boli tri fragmenty s dĺžkou 242 bp, 181 bp a 61 bp

a v prípade genotypu GG nám vznikli dva fragmenty s dĺžkou 181 bp a 61 bp. (Obrázok

11).

Obrázok 11: Fotodokumentácia PCR-RFLP (HhaI) génu LEPVýsledky PCR – RFLP analýzy LEP na 2% agarózovom géle

1 – PCR produkt (242 bp), 2 - DNA ladder 50 bp, 3 – genotyp AA ( 242 bp), 4 – genotyp AG (242 bp, 181bp, 61bp), 5 – genotyp GG (181bp, 61bp)

68


L100 PCR GG AG AA

Obrázok 12: Schématické zobrazenie štiepnych fragmentov LEP génu 242 bp pomocou reštrikčného enzýmu HhaI

L100 – DNA ladder 100bp, PCR – PCR produkt (242 bp), GG – (181bp, 61bp), AG – 242bp, 181bp, 61bp), AA – (242 bp)

4.1.2 PCR-HRM analýza

Pri optimalizácii amplifikácie sme vychádzali z protokolu kitu SensimixTM.

Prvotnú amplifikáciu v optimalizácii teploty hybridizácie primerov sme vykonali

v gradientovom termocykléri C1000TM (Biorad). Pri optimalizácii časového rozhrania

jednotlivých krokov cyklovania sme vychádzali z protokolu kitu SensimixTM (Biotium)

Po optimalizácii sme použili DNA s koncentráciou 50 ng.µl-1 a koncentrácia primerov

bola 10 pM. Následne sme upravili teplotný a časový profil : počiatočná denaturácia pri

95oC – 10 minút, následne sa v 40 cykloch striedali tri kroky – denaturácia pri 95 oC –

10 sekúnd, annealing pri 54 oC – 20 sekúnd a polymerizácia s meraním nárastu

fluorescencie pri 70 oC – 30 sekúnd. Konečnú elongáciu sme vynechali. Pri uvedenom

profile sme dosiahli dostatočnú amplifikáciu do 45 cyklu, čo je znázornené na obrázku

13.

69


Obrázok 13: Fotodokumentácia HRM analýzy LEP génu : Amplifikácia PCR produktu

Následne prebehla HRM analýza. Vykonali sme ju v rozmedzí teplôt od 75-90 oC.

Vzhľadom na veľkosť PCR produktu a obsahu A-G párov, bolo potrebné hornú teplotu

znížiť 75 - 86 oC. Na obrázku je znázornená normalizovaná krivka HRM analýzy troch

vzoriek s rôznym genotypom (Obrázok 14).

Obrázok 14: Reprezentatívne výsledky HRM analýzy LEP génu

4.1.3 Genotypová štruktúra podľa génu LEP

Po identifikácii genotypov, sme vyhodnotili genotypovú štruktúru. Identifikovali

sme tieto genotypy: genotyp AA 14 jedincov z toho 4 mužov a 10 žien, genotyp AG

24 jedincov z toho 17 mužov a 7 žien a genotyp GG 18 jedincov z toho 8 mužov a 10

žien. Zistili sme prevahu genotypu AG nad genotypom GG a nízku frekvenciu genotypu

70


AA. Z toho vyplýva aj vyššia frekvencia alely G (0,5357) nad alelou A (0,4642) čo je

uvedené aj v tabuľke 22. Vyššiu frekvenciu alely G potvrdila aj štúdia Ni et al., (2009).

Tabuľka 22: Genetická štruktúra populácie génu LEP

GÉN

LEP

Genotypy (n=56) Alelyχ2

d.f. = 2AA AG GG A G

Muži

N= 29

4 17 8 0,4311±0,0639

0,5689±0,0639

1,1044 –

5,3879 14,2241 9,3879

Ženy

N=27

10 7 10 0,5000±0,0680

0,5000±0,0680 6,2592 +++

6,7500 13,5000 6,7500

Spolu

N=56

14 24 18 0,4642±

0,0470

0,5357±

0,04701,0736 –

12,0714 27,8571 16,0714

P<0,05-, P >0,05+, P>0,01++, P>0,001+++

Obrázok 15: Realizovaná homozygótnosť a heterozygótnosť populácie v % podľa génu LEP

Nami testovanej populácii bola vyššia frekvencia alely G čo potvrdzujú aj štúdie

Mendoza et al., (2005), ktorý uvádza, že alela G mala vyššiu frekvenciu aj u obéznych

(0,70) aj u neobéznych (0,63) osôb. Podobné frekvencie uvádzajú Snoussi et al., (2006),

ktorý zistili v sledovanej populácii frekvenciu alely G (0,554; 0,662) a Richter et al.,

(2007) uvádzajú významne vyššiu frekvenciu alely G (0,700) nad alelou A (0,300).

Rozdiel medzi očakávanými a pozorovanými frekvenciami genotypov sme overili

χ2 – testom, kde výsledná hodnota (1,0736) nie je štatisticky preukazná, teda

71

7

30

14

18

13

18

05

101520253035404550

AA AG GG

muži ženy


v analyzovanej populácii sa realizoval rovnovážny stav. Štatisticky významné

vychýlenie z genotypovej rovnováhy môžeme konštatovať iba v skupine žien.

Tabuľka 23: Efektívnosť pôsobenia alel génu LEP Alely He PIC Ca ENA V%

Muži A,G 0,4905 0,3702 0,5095 1,9627 49,14

Ženy A,G 0,5000 0,3750 0,5000 2,000 50,00

Spolu A,G 0,4951 0,3725 0,5049 1,9805 49,60

Efektívnosť pôsobenia alel pre LEP gén je uvedená v tabuľke 23.

Heterozygotnosť lokusu v populácii bola (0,4951), čo potvrdzuje aj zvýšený koeficient

homozygotnosti (0,5049). Hodnota polymorfného informačného obsahu lokusu

(0,3725) sa blíži k hraničnej hodnote rovnovážnej populácie, čo je dôsledok takmer

vyrovnanej frekvencie alel. Potvrdzuje to aj hodnota úrovne polymorfnosti lokusu, ktorá

vyjadruje počet efektívnych alel (1,98). Stupeň realizácie možnej premenlivosti mal

hodnotu 49,60%. Ideálny rovnovážny stav bol zistený v skupine žien. Takáto populácia

je vhodná na asociačné štúdie a odhad priemerného účinku génov.

4.1.4 Vplyv génu LEP na variabilitu biochemických parametrov

V analyzovanej populácii sú priemerné hodnoty sledovaných ukazovateľov v

rozpätí optimálnych hodnôt normálneho nutričného stavu. Zvýšenie bolo zistené iba pri

celkovom cholesterole pri genotype AA(5,87) a GG(5,53). Tieto genotypy sa javia ako

negatívne ovplyvňujúce celkový cholesterol v krvi. Pri genotype GG je hodnota BMI

(29,67) blížiaca sa k 30, čo predstavuje riziko vzniku obezity. Zo zistených výsledkov

môžeme konštatovať, že vo všeobecnosti sa najvyššie hodnoty nami sledovaných

parametrov vyskytujú u homozygotných genotypoch GG a AA a najnižšie boli

u heterozygotného genotypu AG. Z toho hľadiska sa javí najvhodnejší genotyp AG

a predstavuje najnižší dopad na zdravie ľudí.

72


Tabuľka 24: Priemerné hodnoty biochemických parametrov celej populácie pre LEP gén

Parameter GenotypyAA (n = 14) AG (n = 24) GG (n = 18)

BMI kg.m-2 27,57 26,45 29,67CHOL mmol.l-1 5,87 5,10 5,53HDL mmol.l-1 1,92 1,69 1,72LDL mmol.l-1 3,34 2,76 3,08TAG mmol.l-1 1,27 1,47 1,61GLU mmol.l-1 5,28 5,20 5,78

Spojitosť alely G s nárastom telesnej hmotnosti a s obezitou potvrdila aj štúdia Ni

et al., (2009), na základe T-testu mali jedinci pri tomto genotype zvýšené hodnoty BMI

25,66±5,86 kg.m-2. Asociačné analýzy medzi GG genotypom v polymorfizme G2548A

LEP génu u jedincou, ktorý mali nadváhu vo francúzskej a americkej populácii robili aj

Mammès et al., (2000); Jiang et al., (2004). V samostatnej štúdii, potvrdil výrazné

spojenie alely G s obezitou v Taiwane aj Wang et al., (2006). Autori uvádzajú, že alela

G zároveň preukazne znižuje hladinu leptínu u mužov, čím možno vysvetliť asociáciu

alely G s nadváhou u obéznych jedincov. Vzhľadom k tomu sa leptín podieľa na znížení

chuti do jedla a zvýšení energetického výdavku Wang et al., (2006), konštatujú, že

nízka úroveň leptínu znižuje účinnosť energetického príjmu, vrátane regulácie chuti do

jedla a metabolizmu a to vedie k rozvoju obezity.

Tabuľka 25: Priemerné hodnoty biochemických parametrov pre LEP gén podľa pohlavia

Parametre

GenotypyMuži Ženy

AA(n = 4)

AG(n = 17)

GG(n = 8)

AA(n = 10)

AG( n = 7)

GG(n = 10)

BMI kg.m-2 28,46 26,73 26,61 27,22 25,78 32,11CHOL mmol.l-1 5,57 4,92 4,62 5,99 5,55 6,26HDL mmol.l-1 1,56 1,57 1,31 2,06 1,98 2,04LDL mmol.l-1 3,30 2,59 2,52 3,36 3,18 3,53TAG mmol.l-1 1,38 1,75 1,75 1,22 0,80 1,50GLU mmol.l-1 6,04 5,27 5,70 4,98 5,05 5,85

V sledovanej populácii rozdelenej podľa pohlavia sme porovnávali priemerné

hodnoty sledovaných ukazovateľov. BMI bolo zvýšené nad 30 u žien s genotypom GG

73


(32,11). Podobné zistenia uvádzajú aj Vaškú et al., (2006) a Ni et al., (2009). Alela G je

spojená podľa Li et al., (1999) s obezitou. V hodnotení T-testom pri getopype GG bol

štatisticky preukazný rozdiel pri HDL cholesterole (0,0004), celkovom cholesterole

(0,0059), LDL cholesterole (0,0248) a BMI (0,0266) v prospech mužov. Pri ostatných

genotypoch je BMI zvýšené nad 25 čo predstavuje miernu nadváhu, a tým predstavuje

zvýšené riziko rozvoja obezity a s tým spojené zdravotné riziko. Celkový cholesterol

bol zvýšený u mužov v genotype AA (5,57) a u žien vo všetkých troch genotypoch AA

(5,99), AG (5,55) a GG (6,26). U žien s genotypom AA (2,06) a AG (2,04) je zvýšená

hladina HDL cholesterolu čo je telu prospešné pretože zvýšené hladiny HDL v krvi

chránia ľudí pred aterosklerózou. V T-teste bol preukazný rozdiel v géne LEP pri

glukóze v prospech genotypu AG (0,0123), pri tomto genotype bol štatisticky

preukazný (0,0045) HDL cholesterol v prospech mužov a pri triglyceridoch (0,0012)

v prospech žien. V znaku TAG (triglyceridy) je preukazný rozdiel medzi AA a GG

genotypom v prospech AA genotypu (0,0339). Pri genotype AA (0,0248) bol preukazne

vyšší obsah HDL cholesterolu u žien.

4.1.5 Vyhodnotenie genetickej záťaže na základe genotypovej hodnoty

Na základe nameraných biochemických ukazovateľov pre jednotlivé genotypy

bola stanovená ich genotypová hodnota a vyjadrený aditívny účinok a efekt dominancie

alel. Genotypové hodnoty sú uvedená v tabuľke 26. Aditívne hodnoty a efekty

dominancie sú uvedené v prílohe.

Tabuľka 26: Genotypová hodnota biochemických parametrov pre LEP génLEP BMI CHOL HDL LDL TAG GLUAA -0,0419 +0,4773 +0,1714 +0,3653 -0,1998 -0,1069AG -1,1649 -0,2865 -0,0591 -0,2149 +0,0031 -0,1828

GG +2,0499 +0,1381 -0,0261 +0,0981+0,144

5+0,3971

Pre genotyp AA bol potvrdený vplyv na zvyšovanie CHOL v krvi (+0,4773)

a v súvisloti s ním aj hladiny LDL cholesterolu (+0,3653) oproti ostatným genotypovým

kombináciám. Pre ostatné sledované biochemické parametre bol zistený negatívny

vplyv genotypu GG, pri ktorom boli zistené významne vyššie hodnoty BMI, TAG

a glukózy. Aj Mammès et al., (2000) v géne humánneho LEP pri štúdiu dvoch typov

74


mutácií zistili, že polymorfizmus A/G je v asociácii s nižšou koncentráciou leptínu a

tým aj s obéznym fenotypom. Podobne Van Rossum, (2003) a Guizar-Mendoza, (2005)

poukázali na spojenie tejto mutácie s obezitou, zvýšením telesného tuku aj

abdominálneho tuku. Asociácie s obezitou v niektorých štúdiách potvrdené neboli

(Considine, 1996; Silver, 1997; Heo, 2002), ale A/G mutácia leptínu v kombinácii

polymorfizmu Q223R leptínového receptoru, spôsobovala zvýšený výskyt non-

Hodgkinového lymfómu (Skibola, 2004).

Pre mutáciu A/G možno konštatovať, že sledované biochemické parametre majú

zhoršujúcu sa tendenciu a u ľudí s genotypom GG možno u nich predpokladať riziko vo

vzťahu k civilizačným ochoreniam. V analyzovanej populácii biochemické parametre

zodpovedajúce referenčnému rozpätiu boli stanovené u jedincov s genotypom AG.

4.2 Analýza LEPR génu

Pre polymorfizmus LEPR génu (Gln223Arg) sme zvolili PCR-RFLP metódu. Pri

optimalizácii PCR reakcie sme vychádzali z práce Guízar – Mendoza et al., (2005).

Použili sme nimi navrhnuté primery aj teplotný profil, ktorý sme následne

optimalizovali na naše podmienky. Na rozdiel od Guízar – Mendoza et al., (2005) sme

zvýšili počiatočnú teplotu z 94oC na 95oC po dobu 3 minúty. V 30 cykloch sa striedali

nasledovné kroky : denaturácia pri 95oC kde sme skrátili dobu zo 45 sekúnd na 10

sekúnd, v annealingu bola teplota zvýšená z 55 oC na 59 oC a jeho doba bola skrátená

zo 45 sekúnd na 30 sekúnd, polymerizácia mala teplotu 72oC a dobu sme skrátili z 90

sekúnd na 35 sekúnd a koncová elongácia 72oC, doba sa skrátila z 10 minút na 5 minút.

PCR bola realizovaná v prístroji C1000 ThermalCycler (Biorad), v objeme 25 µl.

Zloženie reakčnej zmesi je uvedené v kapitole „Materiál a metodika“.

Po PCR analýze sme získaný PCR produkt štiepili reštrikčným enzýmom HpaII

(FastDigest). V analyzovanej skupine sme identifikovali všetky tri genotypy: AA, AG

a GG. V prípade genotypu AA, ktorý nebol štiepený enzýmom vznikol jeden štiepny

fragment s dĺžkou 416 bp, pri genotype AG boli tri fragmenty s dĺžkou 416 bp, 291bp,

125 bp a v prípade genotypu GG nám vznikli dva fragmenty s dĺžkou 291bp, 125 bp.

(Obrázok 16).

75


Obrázok 16: Fotodokumentácia PCR-RFLP (HpaII) génu LEPRVýsledky PCR – RFLP analýzy LEPR na 2% agarózovom gélePCR produkt (416 bp), DNA ladder 100 bp, genotyp AA ( 416 bp), genotyp AG (416 bp, 291bp, 125bp), genotyp GG (291bp, 125 bp)

L100 PCR GG AG AA

Obrázok 17: Schématické zobrazenie štiepnych fragmentov LEPR génu 416 bp pomocou reštrikčného enzýmu HpaII

L100 – DNA ladder 100bp, PCR – PCR produkt (416 bp), GG – (291bp, 125 bp), AG – 416 bp, 291bp, 125 bp), AA – (416 bp)

4.2.1 Genotypová štruktúra podľa génu LEPR

V pozorovanej skupine 56 ľudí bolo 29 mužov, kde sme identifikovali s

genotypom AA - 6 jedincov, pri genotype GG - 9 jedincov a pri genotype AG bolo

pozorovaných 14 jedincov. Žien bolo 27 a pri nich sme identifikovali tiež všetky tri

genotypy. S genotypom AA bolo 8 žien, s genotypom GG bolo 5 žien a najviac bolo

s genotypom AG – 14. Frekvencia genotypov A a G bola rovnaká (0,50), u žien bola

vyššia frekvencia genotypu A (0,5555) a u mužov bola vyššia frekvencia genotypu G

(0,5517), čo potvrdila aj štúdia Ni et al., (2009).

76


Tabuľka 27: Genetická štruktúra populácie génu LEPR

GÉN

LEPR

Genotypy (n=56) Alely χ2

d.f. = 2AA AG GG A G

Muži

N= 29

6 14 9 0,4482±0,0690

8

0,5517±0,0690

8

0,0167 –

5,8275 14,3448 8,8275

Ženy

N=27

8 14 5 0,5555±0,6762

0,4444±0,6762

0,0675 –

8,333 13,333 5,333

Spolu

N=56

14 28 14 0,50±0,05

0,50±0,05

0 –

14,0 28,0 14,0

P<0,05-, P >0,05+, P>0,01++, P>0,001+++

Obrázok 18: Frekvencie genotypov na základe génu LEPR v sledovanej populácii v %

Efektívnosť pôsobenia alel pre LEPR gén je uvedená v tabuľke 28. Očakávaná

heterozygotnosť populácie bola (0,5000) tak isto ako ja koeficient homozygotnosti

(0,5000). Hodnota polymorfného informačného obsahu lokusu (0,3725) sa blíži

k hraničnej hodnote rovnovážnej populácie, čo je dôsledok vyrovnanej frekvencie alel.

Potvrdzuje to aj hodnota úrovne polymorfnosti lokusu, čo vyjadruje počet efektívnych

alel (2,0000). Stupeň realizácie možnej premenlivosti mal hodnotu 50,00%. Takáto

pozorovaná populácia je vhodná na asociačné štúdie a odhad priemerného účinku génu.

77

11

2516

14

25

9

05

101520253035404550

AA AG GG

muži ženy


Tabuľka 28: Efektívnosť pôsobenia alel génu LEPR v sledovanej populáciiAlely He PIC Ca ENA V%

Muži A,G 0,4947 0,3723 0,5053 1,9790 49,56

Ženy A,G 0,4938 0,3719 0,5062 1,9755 49,47

Spolu A,G 0,5000 0,3750 0,5000 2,0000 50,00

4.2.2 Vplyv génu LEPR na variabilitu biochemických parametrov

Priemerné hodnoty sledovaných ukazovateľov LEPR génu boli v celej populácii

zvýšené pri celkovom cholesterole pri všetkých troch genotypoch AA (5,39), AG (5,39)

aj GG (5,56). Ostatné sledované ukazovatele mali hodnoty v rozsahu referenčného

intervalu. Hodnoty BMI preukázali miernu nadváhu, dokonca pri genotype GG (29,04)

je hodnota na hranici s obezitou (Tabuľka 29).

Tabuľka 29: Priemerné hodnoty biochemických parametrov celej populácie pre LEPR gén

ParameterGenotypy

AA (n = 14) AG (n = 28) GG (n = 14)BMI kg.m-2 28,29 26,87 29,04

CHOL mmol.l-1 5,39 5,38 5,56

HDL mmol.l-1 1,74 1,80 1,68

LDL mmol.l-1 3,02 2,95 3,12

TAG mmol.l-1 1,38 1,40 1,69

GLU mmol.l-1 5,52 5,19 5,72

Aj pri LEPR géne sú priemerné hodnoty celkového cholesterolu zvýšené u žien pri

genotypoch AA (5,84), AG (5,73) a GG (6,86). Hodnota HDL cholesterolu je zvýšená

pri všetkých troch genotypoch AA(2,03), AG (2,03) a GG (2,03).

Pri géne LEPR bola zvýšená priemerná hodnota GLU pri ženách s genotypom GG

(6,17). Pri genotype GG bola zvýšená aj hodnota LDL cholesterolu (4,28), čo môže

viesť k vzniku poruchy metabolizmu tukov. Priemerné hodnoty BMI sú aj pri LEPR

géne v kategórii miernej nadváhy čo predstavuje možné riziko rôznych zdravotných

problémov spojených s nadváhou. Guízar-Mendoza et al., (2005) v štúdii tiež potvrdili

78


zvýšenú hodnotu BMI u jedincov s genotypom GG (27,1 kg.m-2) a potvrdili aj vyššiu

hladinu glukózy (4,8 a 5,0 mmol.l-1) v krvi u obéznych jedincov.

Pri analýze deferencii medzi pohlaviami pre genotyp AG zistená štatistická

preukaznosť v obsahu HDL cholesterolu (0,0046) v prospech mužov a pri triglyceridoch

(0,0305) v prospech žien. Pri GG genotype bol preukazne vyšší obsah HDL

cholesterolu (0,0038), celkového cholesterolu (0,0070) a LDL cholesterolu (0,0057)

u žien. Preukazne vyšší obsah HDL cholesterolu (0,0022) bol zistený pre genotyp AA

u žien.

Tabuľka 30: Priemerné hodnoty biochemických parametrov pre LEPR gén podľa pohlavia

Parametre

GenotypyMuži Ženy

AA(n = 6)

AG(n = 14)

GG(n = 9)

AA(n = 8)

AG(n = 14)

GG(n = 5)

BMI kg.m-2 26,66 25,71 29,03 29,51 28,02 29,07

CHOL mmol.l-1 4,80 5,03 4,84 5,84 5,73 6,86

HDL mmol.l-1 1,34 1,57 1,49 2,03 2,03 2,03

LDL mmol.l-1 2,82 2,73 2,48 3,17 3,17 4,28

TAG mmol.l-1 1,42 1,65 1,96 1,35 1,15 1,20

GLU mmol.l-1 5,79 5,38 5,47 5,32 5,01 6,17


Z biochemických ukazovateľov pre jednotlivé genotypy sme stanovili ich

genotypovú hodnotu a vyjadrili sme účinok aditívnej hodnoty a efekt dominancie.

Genotypové hodnoty sú uvedené v tabuľke 31. Aditívne hodnoty a efekty dominancie

sú uvedené v prílohe.

Pre sledované biochemické parametre bol pozorovaný vplyv genotypu GG pri

ktorom boli zistené významne vyššie hodnoty BMI (+1,2774), zvýšená hladina

cholesterolu v krvi (+0,1266), LDL cholesterolu (+0,1108) TAG (+0,0229) a glukózy

(+0,3133).

V asociačnej štúdii polymorfizmu Gln223Arg pre leptínový receptor Guízar-

Mendoza et al., (2005) potvrdili výrazne vyššiu frekvenciu alely G (0,70) oproti alele A

(0,30). V populácii obéznych aj neobéznych mužov a žien bola vyššia frekvencia

79


genotypu GG (Ni et al., 2009). V skupine obéznych a v skupine s normálnou

hmotnosťou bola tiež potvrdená vyššia frekvencia alely G (0,63) nad alelou A (0,38).

Hodnota BMI bola v tejto štúdii tiež zvýšená u jedincov s genotypom GG (27,1 kg.m-2)

a potvrdila sa aj vyššia hladina glukózy (4,8 a 5,0 mmol.l-1) v krvi u obéznych jedincov.

Pre genotyp GG možno konštatovať, že sledované biochemické parametre majú

zhoršujúcu sa tendenciu. U ľudí s týmto genotypom možno predpokladať zdravotné

riziko.

V analyzovanej populácii najlepšie biochemické parametre boli stanovené pre

jedincov s genotypom AG a AA.

Tabuľka 31: Genotypová hodnota biochemických parametrov pre LEPR génLEPR BMI CHOL HDL LDL TAG GLU

AA +0,5225 -0,0369 -0,0183 +0,0055 -0,0884 +0,1147

AG -0,8999 -0,0448 +0,0444 -0,0582 -0,0673 -0,2141

GG +1,2774 +0,1266 -0,0705 +0,1108 +0,0229 +0,3133

4.3 Analýza GHSR génu

Pri analýze polymorfizmu GHSR génu (171T/C) sme vychádzali z práce Wang et

al., (2004). V PCR reakcii boli použité nimi navrhnuté primery. Teplotný a časový

profil bol nasledovný: počiatočná denaturácia 94 oC po dobu 3 minút, denaturácia 94 oC

po dobu 45 sekúnd, annealing 60 oC, 45 sekúnd, polymerizácia 72 oC, 60 sekúnd

a elongácia 72 oC, 5 minút. Reakcia bola optimalizovaná na 30 cyklov v objeme 25 µl.

Zloženie reakčnej zmesi je uvedené v kapitole „Materiál a metodika“. Veľkosť PCR

produktu bola 593 bp a PCR produkt bol vizualizovaný na 2% agarózovom géle.

Po PCR reakcii sme produkt štiepili reštrikčným enzýmom LweI. V analyzovanej

skupine sme identifikovali všetky tri genotypy: CC, TC aj TT. Pri genotype CC nám

vznikli fragmenty s dĺžkou 567 bp, 26 bp, pri genotype TC vznikli po štiepení tri

fragmenty s dĺžkou 593bp, 567bp a 26bp a posledný z pozorovaných genotypov TT,

nebol štiepený enzýmom, preto vznikol iba jeden fragment s dĺžkou 593 bp (Obrázok

19).

80


Obrázok 19: Fotodokumentácia PCR-RFLP (LweI) génu GHSRVýsledky PCR – RFLP analýzy GHSR na 2% agarózovom gélePCR produkt (593bp), DNA ladder 100bp, genotyp CC ( 567bp, 26bp), genotyp TC (593bp, 567bp, 26bp), genotyp TT (593bp)

L100 PCR TT TC CC

Obrázok 20: Schématické zobrazenie štiepnych fragmentov GHSR génu 593bp pomocou reštrikčného enzýmu LweI

L100 – DNA ladder 100bp, PCR – PCR product (593bp), TT – (593 bp), TC – (593 bp, 567 bp, 26 bp), CC – (567 bp, 26 bp)

4.3.1 Genotypová štruktúra podľa génu GHSR

Na základe molekulovo-genetických analýz, sme v nami sledovanej populácii

vyhodnotili nasledovnú genotypovú štruktúru. Identifikovali sme všetky tri genotypy.

S genotypom CC sme identifikovali 19 jedincov, z toho bolo 11 mužov a 8 žien.

Genotyp TT bolo zistený u 20 jedincov a z toho bolo 9 mužov a 11 žien. Najmenej

jedincov bolo s genotypom TC a to 9 mužov a 8 žien.

Pre porovnanie uvádzame, že v štúdii Miyasaka et al. (2006) bola najväčšia

frekvencia genotypu TC (46,8%), genotyp TT (45,4%) a genotyp CC (7,7%) čo

korenšponduje s našimi výsledkami. Výsledky štúdie Wang et al. (2004, 2006) vo

81


všetkých pozorovaných skupinách potvrdzujú najvyššiu frekvenciu genotypu TT

(55,5%) potom nasleduje genotyp TC (39,0%) a najnižšiu frekvenciu mal genotyp CC

(5,5%). Frekvencia alely C (0,5344) bola vyššia u mužov a alela T (0,5555; 0,5089)

prevažovala u žien a v celom sledovanom súbore.

Porovnateľné frekvencie uvádzajú aj Vartainen et al., (2004) a to vyššiu

frekvenciu alely T (0,68). Campa et al., (2010) potvrdili tiež vyššiu frekvenciu alely T

(0,70) čo je tendencia aj v nami testovanej skupine žien a v celom sledovanom súbore.

Pri porovnaní medzi očakávanými a pozorovanými frekvenciami genotypov χ2 – testom

boli výsledné diferencie hodnôt štatisticky preukazné (Tabuľka 32).

Tabuľka 32: Genetická štruktúra populácie génu GHSR

GÉN

GHSR

Genotypy (n=56) Alely χ2

d.f. = 2CC TC TT C T

Muži

N= 29

11 9 9 0,5344±0,0643

0,4655±0,0643

4,1074++

8,2844 14,4310 6,2344

Ženy

N=27

8 8 11 0,4444±0,0675

0,5555±0,0675

4,3199++

0,5333 13,3333 8,3333

Spolu

N=56

19 17 20 0,4910±0,0471

0,5089±0,0471

8,6343+++

13,5044 27,9910 14,5044

P<0,05-, P >0,05+, P>0,01++, P>0,001+++

Obrázok 21: Frekvencie genotypov na základe génu GHSR v sledovanej populácii v %

82

20 16 16

1414

20

05

101520253035404550

CC TC TT

muži ženy


Efektívnosť pôsobenia alel pre GHSR gén je uvedená v tabuľke 33. Očakávaná

heterozygotnosť populácie bola (0,4998) podobne ako koeficient homozygotnosti

(0,5002). Hodnota polymorfného informačného obsahu lokusu (0,3749) sa blíži k

hraničnej hodnote rovnovážnej populácie, čo je dôsledok takmer vyrovnanej frekvencie

alel. Potvrdzuje to aj hodnota úrovne polymorfnosti lokusu, ktorá vyjadruje počet

efektívnych alel (1,9992). Stupeň realizácie možnej premenlivosti mal hodnotu 50,00%,

čo je ideálny rovnovážny stav. Takáto populácia je vhodná na asociačné štúdie a odhad

priemerného účinku génov.

Tabuľka 33: Efektívnosť pôsobenia alel génu GHSR v sledovanej populáciiAlely He PIC Ca ENA V%

Muži C,T 0,4976 0,3738 0,5024 1,9990 49,98

Ženy C,T 0,4938 0,3719 0,5062 1,9755 49,47

Spolu C,T 0,4998 0,3749 0,5002 1,9992 50,00

4.3.2 Vplyv génu GHSR na variabilitu biochemických parametrov

Pri géne GHSR v celej sledovanej populácii bola zvýšená priemerná hodnota BMI

pre genotypy CC (30,15). Tento genotyp bol v štúdii Miayasaka et al., (2006) spojený

s bulímiou. Ostatné genotypy TC a TT majú však hodnoty BMI v kategórii miernej

nadváhy. Tiež sme zaznamenali zvýšenú priemernú hodnotu celkového cholesterolu

pri genotype CC (5,62) a TT (5,45).

Tabuľka 34: Priemerné hodnoty biochemických parametrov celej populácie pre GHSR gén

ParameterGenotypy

CC (n = 19) TC (n = 17) TT (n = 20)BMI kg.m-2 30,15 26,17 26,86Chol mmol.l-1 5,62 5,19 5,45HDL mmol.l-1 1,77 1,75 1,74LDL mmol.l-1 3,20 2,64 3,14TAG mmol.l-1 1,43 1,73 1,28GLU mmol.l-1 5,74 5,23 5,25

Tak ako v celej populácii tak aj v populácii rozdelenej podľa pohlavia je zvýšená

priemerná hodnota BMI u žien s genotypom CC (31,52). Naopak v štúdii Bienertova-

83


Vašku et al., (2009) uvádzajú hodnoty BMI vyššie v skupine mužov. V prípade CC

genotypu bola zvýšená aj priemerná hodnota celkového cholesterolu na (6,04), ale

zvýšené hodnoty boli u žien aj pri genotype TC (5,79) a TT (6,06) a u mužov

s genotypom CC (5,32). U žien boli zvýšené hodnoty aj pri HDL cholesterole

s genotypom TC (2,13) a TT (2,06) čo nie je rizikové. Genotyp TC mal hodnoty

biochemických parametrov v referenčnom intervale.

V T-teste GHSR génu bol vplyv genotypu TC štatisticky preukazný rozdiel

(0,0049) v prospech mužov pri HDL cholesterole. Pri genotype TT bol vysoko

preukazný rozdiel HDL cholesterolu (0,0002), celkového cholesterolu (0,0014) a LDL

cholesterolu (0,0014) v prospech mužov.

Asociáciu alely T s nárastom telesnej hmotnosti a vysokým BMI potvrdili Wang et

al., (2004). Naopak Miyasaka et al., (2006) neuvádzajú vplyv alely T, v polymorfizme

171T/C, na rozvoj bulímie ani s anorexiou a poruchami príjmu potravy. Autori však

uvádzajú až 45,4% jedincov v testovanej skupine malo rizikový genotyp TT.

V rozsiahlej štúdii Gueorguiev et al., (2009) nepotvrdili žiadne významné

asociácie polymorfizmu rs 495225 v géne GHSR s hladinou insulinémie a glykémie.

Tabuľka 35: Priemerné hodnoty biochemických parametrov pre GHSR gén podľa pohlavia

Parametre

GenotypyMuži Ženy

CC(n = 11)

TC(n = 9)

TT(n = 9)

CC(n = 8)

TC(n = 8)

TT(n = 11)

BMI kg.m-2 29,16 25,08 26,08 31,52 27,39 27,50

Chol mmol.l-1 5,32 4,66 4,71 6,04 5,79 6,06

HDL mmol.l-1 1,67 1,42 1,36 1,90 2,13 2,06

LDL mmol.l-1 2,94 2,30 2,71 3,56 3,03 3,50

TAG mmol.l-1 1,58 2,05 1,50 1,23 1,37 1,10

GLU mmol.l-1 5,61 5,38 5,47 5,91 5,07 5,06


84


Na základe nameraných biochemických ukazovateľov pre jednotlivé genotypy

bola stanovená ich genotypová hodnota a vyjadrený účinok aditívnej hodnoty a efekt

dominancie. Genotypové hodnoty sú uvedená v tabuľke 36. Aditívne hodnoty a efekty

dominancie sú uvedené v prílohe.

Zo sledovaných biochemických parametrov bol zistený vplyv genotypu CC. Pre

tento genotyp boli zistené významne vyššie hodnoty BMI (+2,8442), zvýšená hladina

cholesterolu v krvi (+0,2598), HDL cholesterolu (+0,0123), LDL cholesterolu

(+0,2902) a glukózy (+0,3766).

Vartainen et al., (2004) vo svojej štúdii tiež potvrdili najvyššiu hodnotu BMI

v genotype CC a najnižšiu v genotype TC, rovnako ako hladina HDL cholesterolu

v krvi bola najvyššia pri genotype CC a najnižšia pri genotype TC.

Z tohto vyplýva u ľudí s genotypom CC riziko vzniku zdravotných komplikácii.

V populácii boli optimálne biochemické parametre stanovené pri jedincoch

s genotypom TC a TT.

Tabuľka 36: Genotypová hodnota biochemických parametrov pre GHSR génGHSR BMI CHOL HDL LDL TAG GLU

CC +2,8442 +0,2598 +0,0123 +0,2902 -0,1104 +0,3766TC -1,1385 -0,1717 -0,0010 -0,2626 +0,1888 -0,1239

TT -0,4510 +0,0895 -0,0096 +0,2366 -0,2615 -0,1113

4.4 Analýza diferencií medzi skupinami

V sledovanej populácii bola vyhodnotená variabilita biochemických

ukazovateľov nutričného stavu: celkový cholesterol, LDL cholesterol, triglyceridy,

glukózu a BMI. Vyhodnotené boli medziskupinové diferencie a korelácie podľa

pohlavia a podskupiny podľa BMI.

85


Obrázok 22: Grafické porovnanie pozorovaných skupín a jednotlivých biochemických parametrov

Pri analýze minimálnych a maximálnych nameraných hodnôt boli zistené

výnimočne podlimitné aj nadlimitné hodnoty.

Tabuľka 37: Variabilita biochemických parametrov a BMI populácie (n=56)Parameter SD SE V [%]

BMI kg.m-2 27,77 5,09 0,68 25,99CHOL mmol.l-1 5,43 1,27 0,16 1,61

HDL mmol.l-1 1,75 0,44 0,05 0,20LDL mmol.l-1 3,01 1,01 0,13 1,03

TAG mmol.l-1 1,47 0,67 0,09 0,46

GLU mmol.l-1 5,41 0,83 0,11 0,69

86

0

5

10

15

20

25

30

35

40

CHOL HDL LDL TAG GLU BMI

športovci

normálna váha

ľahká nadváha

obezita


Tabuľka 38: Variabilita biochemických parametrov a BMI podľa pohlaviaPohlavie Parameter SD SE V[%]

Muži (29)

BMI kg.m-2 26,94 4,64 0,86 21,58CHOL mmol.l-1 4,92 1,11 0,20 1,23HDL mmol.l-1 1,50 0,42 0,07 0,18LDL mmol.l-1 2,67 0,88 0,16 0,78TAG mmol.l-1 1,70 0,73 0,13 0,54GLU mmol.l-1 5,49 0,67 0,12 0,45

Ženy (27)

BMI kg.m-2 28,66 5,49 1,05 30,15CHOL mmol.l-1 5,97 1,22 0,23 1,49HDL mmol.l-1 2,03 0,27 0,05 0,073LDL mmol.l-1 3,38 1,03 0,19 1,07TAG mmol.l-1 1,22 0,51 0,09 0,26GLU mmol.l-1 5,32 0,98 0,18 0,96

Z našich výsledkov vyplýva že ženy majú oveľa viac nadlimitných hodnôt a to

hlavne pri celkovom cholesterole čo je veľmi veľké riziko vzniku kardiovaskulárnych

ochorení. Zvýšené hodnoty boli aj pri LDL cholesterole, ktorý nazývame aj ako „zlý“.

Ženy mali vysoké hodnoty glukózy a to hlavne tie, ktoré mali zvýšené BMI nad 30 čo

predstavuje riziko vzniku cukrovky, preto sa týmto ľuďom odporúča konzumácia

polysacharidov, zníženie obsahu tukov a zvýšiť podiel vlákniny v strave. Zvýšené

hodnoty triglyceridov boli zase namerané u mužov. Jeden z nich mal zvýšené všetky

hodnoty zisťovanou biochémiou, čo u neho predstavuje vysoké zdravotné riziko.

T-test populácie v porovnaní mužov a žien s jednotlivými parametrami vyšiel

vysoko preukazný rozdiel (<0,0001) v obsahu HDL v prospech žien. Preukazne vyšší

obsah celkového cholesterolu (0,0014), triglyceridov (0,0070) a LDL (0,0083) bol

u žien.

4.4.1 Korelačná analýza

Pre celý sledovaný súbor sa touto analýzou potvrdili nasledovné štatistické

preukaznosti. Medzi hladinou HDL cholesterolu a hladinou celkového cholesterolu je

veľmi vysoká štatistická závislosť, čo nám hovorí o tom, že zvýšením hladiny HDL sa

zvyšuje aj celkový cholesterol. Pri zvýšení hladiny HDL je štatisticky preukazné

(0,0047), že sa zvyšuje aj hladina LDL cholesterolu. Tak isto pri zvýšení HDL

cholesterolu rastie aj hodnota BMI. Pri celkovej hladine cholesterolu a glukózy je

štatistická závislosť (0,0026), z čoho vyplýva, že keď sa zvyšuje hladina cholesterolu

87


zvyšuje sa aj hladina glukózy. Silná pozitívna závislosť (<0,0001) je zaznamenaná pri

hodnotení celkového cholesterolu s LDL a s BMI, čo znamená, že s narastajúcou

hladinou celkového cholesterolu narastá aj hladina LDL cholesterolu a zvyšuje sa aj

BMI.

Tiež sa potvrdila štatistická preukaznosť (0,0017) pri parametri glukózy s LDL,

takže s narastajúcou hladinou glukózy rastie aj hladina LDL cholesterolu. Pozitívna

štatistická závislosť (<0,0001) je medzi GLU a BMI. Potvrdili sa aj štatistické

preukaznosť medzi LDL a BMI (0,0005) a aj pri TAG a BMI (0,0043), keď rastie LDL

cholesterol a TAG zvyšuje sa BMI.

Tabuľka 39: Korelácie pre celý súbor (n=56)

SPOLU HDL CHOL TAG GLU LDL BMI

HDL 1,00000 0,63769<0,0001

-0,092110,4995

0,034610,8001

0,372840,0047

0,362150,0061

CHOL 1.00000 0,126510,3529

0,394640,0026

0,91581<0,0001

0,59329<0,0001

TAG 1,00000 0,198610,1423

-0,099080,4675

0,375730,0043

GLU 1,00000 0,409620,0017

0,58639<0,0001

LDL 1,00000 0,452590,0005

BMI 1,00000

V sledovanej skupine žien (27) sme pozorovali štatistickú preukaznosť medzi

nasledovnými parametrami. Celkový cholesterol s triglyceridmi (0,0003) a celkový

cholesterol s glukózou (0,0004). Silná štatistická preukaznosť sa realizovala medzi

celkovým cholesterolom a LDL cholesterolom (<0,0001). Z našich výsledkov tiež

môžeme povedať, že tak ako v celom súbore aj tu platí, že s nárastom hladiny

celkového cholesterolu sa zvyšuje aj BMI. Štatisticky preukazný bol aj vzťah medzi

triglyceridmi a LDL cholesterolom (0,0037). Silná štatistická preukaznosť (<0,0001)

sme zistili medzi triglyceridmi a výškou BMI, a tak isto aj pri glukóze a BMI. Bola

potvrdená pozitívna závislosť medzi hladinou LDL cholesterolu a BMI.

88


Tabuľka 40: Korelácie pre ženy (n=27)

ŽENY HDL CHOL TAG GLU LDL BMI

HDL 1,00000 0,266860,1784

-0,008810,9652

0,116470,5629

0,061370,7611

-0,032820,8709

CHOL 1,00000 0,64653

0,00030,635750,0004

0,96436<0,000

1

0,598130,0010

TAG 1,00000 0,370800,0569

0,538780,0037

0,73546<0,0001

GLU 1,00000 0,632420,0004

0,71209<0,0001

LDL 1,00000 0,543600,0034

BMI 1,00000

V skupine mužov sme zistili najmenej štatisticky preukazných hodnôt. Štatistická

preukaznosť (<0,0001) bola stanovená medzi HDL cholesterolom a celkovým

cholesterolom. Tiež bol potvrdený preukazne (0,0004) aj vzťah medzi HDL

cholesterolom a BMI. Podobne, ako aj u žien, sme stanovili kladný (< 0,0001) vzťah

medzi celkovým cholesterolom a LDL cholesterolom v krvi. V skupine mužov aj u žien

rastúca hladina celkového cholesterolu v krvi súvisela so zvyšujúcimi sa hodnoty BMI.

Bolo preukázané, že s rastúcou hladinou cukru v krvi dochádza k nárastu hodnoty BMI.

Tabuľka 41: Korelácie pre mužov (n=29)

MUŽI HDL CHOL TAG GLU LDL BMI

HDL 1,00000 0,73801<0,0001

0,236780,2162

0,14966

0,4384

0,340740,0705

0,609680,0004

CHOL 1,00000 0,10908

0,5732

0,27136

0,1545

0,83337<0,0001

0,565630,0014

TAG 1,000000,0119

60,9509

-0,352810,0605

0,304530,1082

GLU 1,00000

0,243430,2032

0,472390,0097

LDL 1,00000 0,27458

89


0,1494

BMI 1,00000

90

Záver

5 Záver

V súlade s vytýčeným cieľami dizertačnej práce sme optimalizovali PCR-RFLP

metódu pre identifikovanie a genotypovanie LEP, LEPR a GHSR génov a HRM

analýzu pre LEP gén. Pre štúdium polymorfizmu vybraných génov sme použili krv

z ktorej sme si vyizolovali DNA.

Na základe molekulovo-genetických analýz sme vyhodnotili genetickú štruktúru

populácie a uskutočnili sme aj asociačné štúdie zamerané na vplyv genotypu

a biochemické parametre.

V prípade LEP génu sme v populácii zaznamenali prevahu heterozygotneho

genotypu AG nad ostatnými genotypmi, najnižšie zastúpenie mal genotyp AA. Z toho

vplýva aj prevaha alely G nad alelou A. Pre mutáciu A/G možno konštatovať, že

sledované biochemické parametre majú zhoršujúcu sa tendenciu u ľudí s genotypom

GG. V analyzovanej populácii biochemické parametre zodpovedajúce referenčnému

rozpätiu boli stanovené u jedincov s genotypom AG. Rozdiel medzi očakávanými

a pozorovanými frekvenciami genotypov sme overili χ2 – testom a zistili sme, že

sledovaná populácia bola v genetickej rovnováhe.

Pri LEPR géne sme tiež zaznamenali prevahu heterozygotneho genotypu AG nad

ostatnými genotypmi. Homozygotny genotyp AA a GG boli v tejto populácii zastúpené

rovnakým počtom, z čoho vyplýva aj rovnaká frekvencia genotypov. Frekvencia

genotypov A a G bola rovnaká. Ženy mali vyššiu frekvenciu genotypu A a muži mali

vyššiu frekvenciu genotypu G. V analyzovanej populácii najlepšie biochemické

parametre boli stanovené pre jedincov s genotypom AG a AA. Na základe výsledkov χ2

– testu, ktorým sme overili rozdiely medzi očakávanými a pozorvanými frekvenciami

genotypov bola populácia v genetickej rovnováhe.

V genetickej štruktúre génu GHSR bolo najviac jedincov s genotypom TT

a najmenej bolo heterozygotneho genotypu TC. Frekvencia alely T bola v prevahe nad

frekvenciou C. V populácii boli optimálne biochemické parametre stanovené pri

jedincoch s genotypom TC a TT. Populácia bola v genetickej rovnováhe, čo sme zistili

91

Záver

overením rozdielov medzi očakávanými a pozorovanými frekvenciami genotypov χ2 –

testom.

Vrámci sledovaných skupín mali skupina športovcov a skupina s normálnou váhou

priemerné hodnoty sledovaných parametrov v rozmädzí referenčného intervalu.

S nárastom BMI sa zvyšovali aj priemerné hodnoty sledovaných biochemických

parametrov. Najrizikovejšia vyšla skupina s BMI nad 30, kde sem mali najviac

nadlimitných hodnôt sledovaných biochemických parametrov.

Korelačnou analýzou sa potvrdilo, že u mužov a v celom súbore medzi hladinou

HDL cholesterolu a celkového cholesterolu je vysoká štatistická preukaznoť a u žien sa

preukaznosť nepotvrdila. Vo vzťahu TAG a HDL cholesterolom sa nepotvrdila

štatistická preukaznosť. U žien medzi hladinou celkového cholesterolu a hladinou TAG

sa potvrdila štatistická preukaznosť. V celom súbore a u žien sa potvrdila preukaznosť

vo vzťahu celkového cholesterolu a glukózy. Medzi hladinou LDL cholesterolu a HDL

cholesterolu bol štatisticky preukazný vzťah iba celom súbore v skupine žien a mužov

sa štatistická preukaznosť nepotvrdila. Silná štatistická preukaznosť sa potvrdila vo

všetkých troch skupinách medzi hladinou LDL cholesterolom a celkových

cholesterolom. V skupine žien sa potvrdila preukaznosť vo vzťahu LDL cholesterolu

a TAG. Štatistická preukaznosť sa potvrdila v skupine žien a celom súbore medzi

hladinami GLU a TAG. Preukaznosť sa potvrdila u mužov a v celom súbore medzi

hladinou HDL cholesterolu a hodnotou BMI.Vo všetkých troch sledovaných skupinách

sa potvrdila preukaznosť medzi hladinou celkohého cholesterolu a hodnotou BMI

a hladinou glukózy a BMI. V skupine žien sa potvrdila silná štatistická preukaznosť

medzi hladinou TAG a BMI. V celom sledovanom súbore a u žien sa potvrdila

preukaznosť mezdi hodnotou BMI a hladinou LDL cholesterolu.

Touto analýzou sa potvrdil vplyv pohlavia na jednotlivé biochemické parametre. A

vybrané gény sú významné z hľadiska metabolizmu tukov a glukózy u ľudí .

92

Návrh na využitie výsledkov

6 Návrh na využitie výsledkov

Výsledky dizertačnej práce poskytujú informáciu o genetickom polymorfizme

sledovanej populácie v rámci LEP, LEPR a GHSR génov. Získané informácie

poukazujú aj na to, že tieto vybrané gény sú kandidátskymi génmi porúch metabolizmu

lipidov a vzniku obezity Na základe získaných výsledkov odporúčame pomocou

optimalizovaných molekulovo-genetických metód:

Rozšíriť sledovanú populáciu a doplniť získané poznatky o vplyve

genotypu vybranných génov na hladiny biochemických markerov

a nutričný stav organizmu. V experimentoch zohľadňovať vplyv pohlavia

a veku pri hodnotení nutričného stavu a tvorbe diétneho režimu ľudí

Využiť získané informácie o polymopfizme génov LEP, LEPR a GHSR pre

hodnotenie nutričného stavu jedincov a zohľadňovať vplyv týchto génov

pri substitučnej liečbe alebo individuálnej diéte

Pre nutrigenomické štúdie analyzovať ďalšie polymorfizmy génov LEP,

LEPR, GHSR, GHRL, MC4R, POMC, TNF α, UCP 1, UCP 2, UCP 3

a realizovať asociačné štúdie s cieľom charakterizovať ich vplyv na

nutričný a zdravotný stav človeka

Pre nutrigenetické štúdie rozšíriť analýzy asociácií nami sledovaných

génov v populácii a rozšíriť sledovanú populáciu, analyzovať cielene

diagnostikované skupiny. Pre asociačné štúdie využiť skupiny ľudí

z uskutočnených experimentov a sledovať aj skupiny s fenotypom

zodpovedajúcim poruche metabolizmu lipidov

93

Zoznam použitej literatúry


1. ABIZAID, A. – HORVATH, T.L. 2008. Brain circuits regulating energy

homeostasis. In Regulatory Peptides, vol. 149, 2008, no. 1-3, p.3-10. ISSN:

0167-0115.

2. AMILLS, M. – VILLALBA, D. – TOR, M. – MERCADÉ, A. – GALLARDO,

D. -CABRERA, B. – JIMENEZ, N. – NOGUERA, J.L. – SÀNCHEZ, A. –

ESTANY, J. 2008. Plasma leptin levels in pigs with different leptin and leptin

receptor genotypes In: Journal of Animal Breeding and Genetics, vol. 125, 2008,

no. 4, p. 228-233. ISSN: 0931-2668.

3. BANKS, W.A. – TSCHÖP, M. – ROBINSON, S.M. – HEIMAN, M.L. 2002.

Extent and direction of ghrelin transport across the blood-brain barrier is

determined by its unique primary structure. In Journal of Pharmacolgy and

Experimental Therapeutics, vol. 302, 2002, no. 2, p.822-827. ISSN: 1521-0103.

4. BARATTA, M. 2002. Leptin – from a signal of adiposity to a hormonal

mediator in peripheral tissues. In Medical Science Monitor, vol.8, 2002, p. 282-

292. ISSN: 1234-1010.

5. BELL, C.G. – WALLEY, A.J. – FROGUEL, P. 2005. The genetic of human

obesity. In Nature Reviews Genetics, vol. 6, 2005, p.221-234. ISSN: 1471-0064.

6. BEŇO, I. 2008. Náuka o výžive. 2. vyd. Martin : Osveta 2008, s. 66-67. ISBN

80-8063-126-3.

7. BERTHOUD, H.R. 2002. Multiple neural systems controlling food intake and

body weight. In Neuroscience and Biobehavioral Reviews, 26, 2002, p.393–428.

ISSN:0149-7634

8. BEŽO, M. – RAŽNÁ, K. – BEŽOVÁ, K. 2010. Všeobecná genetika. 3. vyd.

Nitra : SPU. 207 s. ISBN 978-80-552-0477-2.

9. BIENERTOVÁ-VAŠKÚ, J. 2009. Potenciál variability v genech kódujícich

adipokiny v neurobehaviorálním řízení příjmu potravy u české obézni a neobézni

populace : dizertačná práca. Brno: Masarykova univerzita, 2009. 118 s.

10. BIENERTOVÁ-VAŠKÚ, J. – BIENERT, P. – SABLIKOVA, L. –

SLOVACKOVA, L. – FOREJT, M. – PISKACKOVA, Z. – KUCEROVA, L. –

HECZKOVA, K. – BRAZDOVA, Z. – VASKU, A. 2009. Effect of ID ACE

gene polymorphism on dietary composietion and obesity-related anthropometric

94


parameters in the Czech adult population. In Genes and Nutrition, vol. 4, 2009,

p.207-213. ISSN:1555-8932.

11. BIOWEB.GENEZIS.EU Genetika základné pojmy. [on-line].[cit. 2010-02-23].

Dostupné na internete: <http://www.bioweb.genezis.eu/index.php?cat=7&file=p

ojmy>

12. BJORBAEK, C. – KAHN, B.B. 2004. Leptin signaling in the central nervous

system and the periphery. In Recent Progress in Hormone Research, vol. 59,

2004, p. 305-331. ISSN:0079-9963.

13. BOCHUKOVA, E.G. – HUANG, N. – KEOGH, J. 2010. Large, rare

chromosomal deletions associated with severe early-onset obesity. In Nature,

vol. 463, 2010, p.666-670. ISSN: 0028-0836.

14. BOTSTEIN, D. – WHITE, R.L. – SKOLNIK, M. – DAVIS, R.W. 1980.

Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment lenght

polymorphism. In The American Journal of Human Genetics, vol. 32, 1980, p.

314-331. ISSN:0002-9297.

15. BOUCHARD, C.- DESPRÉS, J.P.- MAURIEGE, P. 1993. Genetic and

nongenetic determinants of regional fat distribution. In: Endokrine Reviews, vol.

14, 1993, no. 1, p. 72-89. ISSN: 0163769X.

16. BOULOUMIE, A. – MARUMO, T. – LAFONTAN, M. – BUSSE, R. 1999.

Leptin induces oxidative stress in human endothelial cells. In The FASEB

Journal, vol. 13, 1999, p. 1231-1238. Online ISSN: 1530-6860.

17. BRAY, G.A.- YORK, D.A. 1997. Leptin and clinical medicine: a new piece in

the puzzle of obesity. In Journal of Clinical Endokrinology and Metabolism,

vol. 82, 1997, no. 9, p. 2771-2776. ISSN: 0021972X.

18. BROCKMANN, G.A. – KRATZSCH, J. – HALEY, C.S. 2000. Single QTL

effects, epistasis and pleiotropy account for two-thirds of the phenotypic F(2)

variance of growth and obesity in DUGixDBA/2 mice. In Genome Research.,

2000, no. 10 p. 1941-1957. Online ISSN: 1549-5469.

19. BRONSKÝ, J.- KOTASKA, K.-PRŮŠA, R. 2004. Ghrelin- structure and

clinical applications In Československá Fyziologie, roč. 53, 2004, č.2, s. 80-85

ISSN: 1210-7875.

20. BRONSKÝ, J.- PRŮŠA, R. 2008. Biochemické markery v regulaci nutričního

stavu. In Klinické Biochemie a Metabolismus, vol. 16, 2008 no. 37, p. 6-13

ISSN: 1210 – 7921.

95


21. BUCZKOWSKA, O.A. 2005. The role of ghrelin in the regulation of energy

homeostasis. In Endokrynol. Diabetol. Chor. Przemiany, vol. 1, 2005, no. 1,

p.39-42.

22. BURKHARDTOVÁ, D. 2007. Laboratórne hodnoty. Bratislava : NOXI, 2007,

s. 71-72. ISBN 978-80-89179-59-6.

23. CAMPA, D. – PARDINI, B. – NACCARATI, A. – VODICKOVA, L. –

NOVOTNY, J. – STEINKE, V. – RAHNER, N. – HOLINSKI-FEDER, L. –

MORAK, M. – SCHACKERT, H.K. – GÖRGENS, H. – KÖTTING, J. – BETZ,

B. et al. 2010. Polymorphism of genes coding for ghrelin and its receptor in

relation to colorectal cancer risk: a two-step gene-wide case-control study. In

BMC Gastroenterology, vol. 112, 2010, no. 10, p.1-6. ISSN: 1471-230X.

24. CAMPBELL, N. A. – REECE, J.B. 2006. Biologie. Brno : Computer Press,

2006, s. 68 – 71, ISBN: 80-251-1178-4.

25. CAMPFIELD, L. A. – SMITH, F. J. – GUISEZ, Y. – DEVOS, R. – BURN, P.

1995. Recombination mouse OB protein: evidence for a peripheral signal linking

adiposity and central neural networks. In Science, vol. 269, 1995, p. 546–549.

ISSN: 0036-8075.

26. CHAGNON, Y.C. – WILMORE, J.H. – BORECKY, I.B. – GAGNON, J. –

PERUSSE, L. – CHAGNON, M. – COLLIER, G.R., LEON, A.S. – SKINNER,

J.S. – RAO, D.C. – BOUCHARD, C. 2000. Associations between the leptin

receptor gene and adiposity in middle-aged Caucasian males from the Heritage

family study. In Journal of Clinical Endokrinology and Metabolism, vol. 85,

2000, p. 29-34. ISSN: 0021972X.

27. CHANOINE, J.P. – WONG, A.C. 2004. Ghrelin gene expression is maredly

highter in fetal pancreas compared with fetal stomach:effect of maternal fasting.

In Endocrinology, vol. 145, 2004, p. 3813-3820. Online ISSN: 1945-7170.

28. CHEN, C.C. – CHANG, T. – SU, H.Y. 2004. Characterization of porcine leptin

receptor polymorphisms and their association with reproduction and production

traits. In Animal Biotechnology 15, 2004, p. 491-495. ISSN: 1532-2378.

29. CHINN, S. – RONA, R. – GULLIFORD, M.C. HAMMOND, J. 1992. Weight-

for-height in children aged 4-12 years. A new index compared to the nermalised

body mass index. In European Journal of Clinical Investigation, vol. 46, 1992,

p.489-500. ISSN: 1365-2362.

96


30. CLEMENT, K. – VAISSE, C. – LAHLOU, N. – CABROL, S. – PELLOUX, D.

– CASSUTO, D. – GOURMELEN, M. – DINA, C. – CHAMBAZ, J.-

LACORTE, J.M. – BASDEVANT, A. – BOUGNERES, P. – LEBOUC, Y. –

FROUGEL, P. – GUY-GRAND, B. 1998. A mutation in the human leptin

receptor gene causes obesity and pituary dysfunction. In Nature, vol. 392, 1998,

p. 398-401. ISSN: 0028-0836.

31. COLL, A.P. – FAROOQI, S. – O´RAHILLY, S. 2007. The hormonal control of

food intake. In Cell, vol. 129, 2007, p. 251-262. ISSN: 0092-8674.

32. CONSIDINE, R. V. – CONSIDINE, E. L. – WIILIAMS, C. J. – NYCE, M. .R.

1996. Mutation screening and identifiacation of a sequence Variation in the

human OB gene codin region. In Biochemical and Biophysical Research

Communications, vol. 220, 1996, p. 735–739. ISSN: 0006-291X.

33. COVISA, J.V. 2006. Praktická zdravoveda. 2. vyd. Mladé letá, 2006, s. 355-

363, ISBN 80-10-01114-2.

34. COWLEY, M.A. - GROVE, K.L. 2004. Ghrelin-Satisfying a hunger for the

mechanism. In Endocrinology, vol. 145, 2004, no. 6, p. 2604-2606. ISSN:

0013-7227.

35. CROW, J.F. – KIMURA, M. 1970. An Introductio to Population Genetic

Theory. In New York: Harper and Row, 1970.

36. CUMMINGS, D.E. - SCHWARTZ, M.W. 2003. Genetics and pathophysiology

of human obesity. In Annual Review of Medicine, vol. 54, 2003, p. 453-471.

ISSN: 0066-4219.

37. ČEPICA, S. 2002. Současná genomika hospodářských zvířat. In Sb. XX

Genetické dny. Brno : MZLU, 2002, s.12–18. ISBN 80-7157-607-7.

38. CRABBE, P., - GOEMAERE, S. – ZMIERCZAK, H. – VAN

POTTERLBERGH, I. – DE BACQUER, D. 2006. Are serum leptin and the the

Gln223Arg polymorphism of the leptin receptor determinants of bone

homeostasis in elderly men. In European Journal of Endocrinology, vol. 154,

2006, p. 707- 714. ISSN: 0804-4643.

39. CREMONINI, F. – CAMILLERI, M. – VAZQUEZ ROQUE, M. – MCKINZIE,

S. – BURTON, D. – DAXTER, K. – ZINSMEISTER, A.R. 2006. Obesity does

not increase effects of synthetic ghrelin on human gastric motor functions. In

Gastroenterology , vol. 131, 2006, no. 5, p. 1431-1439. ISSN: 0016-5085.

97


40. DIBONA, G.F. 2004. The sypathetic nervous system and hypertension: recent

developments. In Hypertension, vol. 43, 2004, p. 147-150. ISSN: 0194911X.

41. DIÉQUEREZ, C. – VYZQUEZ, M.J. – ROMERO, A. – LOPEZ, M. –

NOQUEIRAS, R. 2011. Hypothalamic Control of Lipid Metabolism: focus on

Leptin, Ghrelin and Melanocortins. In Neuroendocrinology, 2011. p.1-11, ISSN:

0028-3835.

42. DUNBAR, J.C. – HU, Y. – LU, H. 1997. Intracerebroventricular leptin increases

lumbar and renal sympathetic nerve activity and blood pressure in normal rats.

In Diabetes, vol. 46, 1997, p. 2040-2043. Print ISSN: 0012-1797; Online ISSN:

1939-327X.

43. DURAN, CH. – APPLEBY, N. – EDWARDS, D. – BATLEY, J. 2009.

Molecular genetic markers: discovery, applications, data storage and

visualisation. In Current bioinformatics, vol. 4, 2009, p. 16-27. ISSN: 1574-

8936.

44. EISENMANN, J.C. – HEELAN, K.A. – WELK, G.J. 2004. Assessing body

composition among 3-to 8-years old children: anthropometry, BIA and BXA. In

Obesity Research, vol. 12, 2004, p. 1633-1640. ISSN: 1930-7381.

45. EL-HASCHIMI, K. – PIERROZ, D.D. – HILEMAN, S.M. – BJORBAEK, C. –

FLIER, J.S. 2000. Two defects contribute to hypothalamic leptin resistance in

mice with diet-induced obesity. In Journal of Clinical Investigation, vol. 105,

2000, p. 1827-1832. ISSN: 00219738.

46. FAROOQI, I.S. – MATARESE, G. – LORD, G.M. – KEOGH, J.M. –

LAWRANCE, E. – AGWU, C. – SANNA, V. – JEBB, S.A. – PERNA, F. –

FONTANA, S. – LECHLER, R.I. – DEPAOLI, A.M. – O´RAHILLY, S. 2002.

Beneficial effects of leptin on obesity, T cell hyporesponsiveness, and

neuroendocrine/metabolic dysfunction of human congenital leptin deficiency. In

Journal of Clinical Investigation, vol. 110, 2002, p.1093-1103. ISSN:

00219738.

47. FAROOQI, S. – O´RAHILLY, S. 2005. Monogenic obesity in humans. In

Annual Review of Medicine, vol. 56, 2005, p.443-458. ISSN: 0066-4219.

48. FAROOQI, S. 2008. Monogenic human obesity. In Frontiers of Hormone

Research, 36, 2008, p.1-11. ISSN: 0301-3073.

98


49. FAROOQI, S. – O´RAHILLY, S. 2008. Mutations in ligands and receptors of

the leptin-melanocortin pathway that lead to obesity. In Nature Clinical Practice

Endokrinology and Metabolism, vol. 18, 2008, p.569-577. ISSN: 1759-5029.

50. FRIED, S.K. - RICCI, M.R. - RUSSELL, C.D. - LAFERRE, B. 2000.

Regulation of leptin production in humans. In Journal of Nutrition, vol. 130,

2000, p. 3127-3131. ISSN: 0022-3166.

51. FRIEDEWALD, W.T. – LEVY, R.I. – FREDRIKSON, D.S. 1972. Estimation

of the concentration of low-density lipoprotein cholesterol in plasma, without

use of the preparative ultracentrifuge. In Clin Chem, 18, 1972, p.499-502.

52. GAUNA, C. – MEYLER, F.M. – JANSSEN, J.A. – DELHANTY, P.J. –

ABRIBAT, T. – VAN KOETSVELD, P. – HOFLAND, L.J., BROGLIO, F. –

GHIGO, E. – VAN DER LELY, A.J. 2004. Administration of acylated ghrelin

reduces insulin sensitivity, whereas the combination of acylated plus unacylated

ghrelin strongly improves insulin sensitivity. In Journal of Clinical

Endocrinology and Metabolism, vol. 89, 2004, p. 5035-5042. ISSN: 0021972X.

53. GEFLAND, H. 1989. Taq polymerase. In PCR technology: principles and

application for DNA amplification. New York : Stockton Press, 1989, p. 17-22.

54. GRANKVIST, O. 1992. Improved Detection of HIV-2 DNA in clinical Samples

Using a Nested Primer-Based Polymerase Chain Reaction. In Journal of

Acquired Immune Deficiency Syndromes, vol. 5, 1992, p. 286-293. Online ISSN:

1077-9450.

55. GREEN, M.R. – VAN DER OUDERAA, F. 2003. Nutrigenetics : Where next

for the foods industry? In Pharmacogenomics Journal, vol. 3, 2003, p.191-193.

ISSN: 1470-269X.

56. GREENMAN, Y. – GOLANI, N. – GILAD, S. et al. 2004. Ghrelin secretion is

modulated in a nutrient- and gender-specific manner. In Journal of Clinical

Endocrinology, vol. 60, 2004, p. 382-388. ISSN: 0021-972X

57. GRIFFITHS, A.J.F. – GELBART, W.M. – LEWONTIN, R.C. – MILLER, J.H.

2002. Modern Genetic Analysis. 1. vyd. New York : Freeman, 2002, p.185-264.

ISBN: 0-7167-4382-5.

58. GUEORGUIEV, M. – LECOEUR, C. – MEYRE, D. – BENZINOU, M. –

MEIN, CH.A. – HINNEY, A. – VITIN, V. – WEILL, J. HEUDE, B. –

HEBEBRAUND, J. – GROSSMAN, A.B. – KORBONITS, M. – FROGUEL, P.

99


2009. Association Studies on Ghrelin and Ghrelin Receptor Gene Polymorphism

with Obesity. In Obesity, vol. 17, 2009, p.745-754. ISSN: 1930-7381.

59. GUIZAR-MENDOZA, J.M. – AMADOR-LICONA, N. – FLORES-

MARTÍNEZ, S.E. – LÓPEZ-CARDONA, M.G. – AHUATZIN-TRÉMARY, R.

– SÁNCHEZ-CORONA, J. 2005. Association analysis of the Gln223Arg

polymorphism in the human letptin receptor gene, and traits related to obesity in

Mexican adolescents. In Journal of Human Hypertension, vol. 19, 2005, p.341-

346. ISSN: 0950-9240.

60. HEATHER D. Obesity factors. 2007 [online]. [cit. 2010-05-10] Dostupné na:

<http://louisville.edu/medschool/familymedicine/images/wtmgmt_4.jpg/view˃.

61. HETHERINGTON, M.M. – CECIL, J.E. 2010. Gene-environment interactions

in obesity. In Forum of Nutrition, vol. 63, 2010, p.195-203. ISSN: 1660-0347.

62. HEO, M. – LEIBEL, R.L. – FONTINE, K.R. – BOYER, B.B. – CHUNG, W.K.

– KOULU, M. – KARVONEN, M.K. – PERSONEN, U. – RISSANEN, A. –

LAAKSO, M. – UUSITUPA, M.I. – CHAGNON, Y. – BOUCHARD, C. –

DONOHOUE, P.A. – BURNS, T.L. – SHULDINER, A.R. – SILVER, K. –

ANDERSEN, R.E. – PEDERSEN, O. – ECHWALD, S. – SORENSEN, T.I. –

BEHN, P. – PERMUTT, M.A. – JACOBS, K.B. – ELSTON, C. – HOFFMAN,

D.J. – GROPP, E. – ALLISON, D.B. 2002. A meta-analytic investigation of

linkage and association of common leptin receptor (LEPR) polymorphisms with

body mass index and waist circumference. In International Journal of

Obesesity, vol. 26, 2002, p.640-646. ISSN: 0307-0565.

63. HIGUCHI, R. 1989. Rapid efficient extraction from cell or blood. In

Amplifications Perkin Elmer Newsletter, vol. 2, 1989, p. 1–3.

64. HINNEY, A. – VOGEL, C.I. – HEBEBRAND, J. 2010. From monogenic to

polygenic obesity: recent advances. In European Child and Adolescent

Psychiatry, vol. 19, 2010, p. 297-310. ISSN: 1435-165X.

65. HOCHBERG, I. – HOCHBERG, Z. 2010. Hypothalamic obesity. In Endocrine

Development, vol. 17, 2010, p.185-196. ISSN: 1662-2979.

66. HOLST, B. – HOLLIDAY, N.D. – BACH, A. – ELLING, C.E. – COX, H.M –

SCHWARTZ, T.W. 2004. Commov structural basis for constitutive activity of

the ghrelin receptor family. In The Journal of Biological Chemistry, vol. 279,

2004, no. 51, p. 53806-53817. ISSN: 0021-9258.

100


67. HOOPER, L. – THOMPSON, R.L. – HARRISON, R.A. – SUMMERBELL,

C.D. – NESS, A.R. – MOORE, H.J. – WORTHINGTON, H.V. –

DURRINGTON, P.N. – HIGGINS, J.P.T. – CAPPS, N.E. – RIEMERSMA,

R.A. – EBRAHIM, S.J.B. – VEY SMITH, G. 2006. Risks and benefits of omega

3 fats for mortality, cardiovascular disease, and cancer: systematic review. In

British Medical Journal, vol. 332, 2006, p.752-760. ISSN: 0959-8138.

68. HOUSEKNECHT, KL. – PORTOCARRERO, CP. 1998. Leptin and its

receptors:regulators of whole-body energy homeostasis. In: Domestic Animal

Endocrinology, vol. 15, 1998, p. 457-75. ISSN: 0739-7240.

69. HOWARD, B.V. – VAN HORN, L. – HSIA, J. – MANSON, J.E. –

STEFANICK, M.L. – WASSERTHEIL-SMOLLER, S. – KULLER, L.H. –

LACROIX, A.Z. – LANGER, R.D. – LASSER, N.L. – LEWIS, C.E. –

LIMACHER, M.C. – MARGOLIS, K.L. – MYSIW, W.J. – OCKENE, J.K. –

PARKER, L.M. – PERRI, M.G. – PHILLIPS, L. – PRENTICE, R.L. et al. 2006.

Low-fat dietary pattern and risk of cardiovascular disease: the Women´s Health

Initiative Randomized Controlled Dietary Modification Trial. In The Journal of

the American Medical Association (JAMA), vol. 295, 2006, p. 655-666. EISSN:

15383598.

70. HRM – Hight Resolution Melt Assay Design and Analysis 2006. [online]. [cit.

2010-03-25]. Dostupné na:<http://www.gene-quantification.de/hrm-protocol-

cls.pdf˃.

71. HUBAČEK,J.A. – BLOUDÍČKOVÁ, S. – BOHUSLAVOVÁ, R. –

TÁBORSKÝ, P. – POLAKOVIČ, V. et al. 2007. Ghrelin variants influence

development of body mass index and plasma levels of total cholesterol in

dialyzed patients In Clinical Chemistry and Laboratory Medicne, vol. 45, 2007,

no. 9, p. 1121-1123. ISSN: 1434-6621.

72. ICHIHARA, S. – YAMADA, Y. 2008. Genetic factors for human obesity. In

Cellular and Molecular Life Sciences, vol. 65, 2008, p.1086-1098. ISSN: 1420-

9071.

73. JANSSENS, A.C. – GWINN, M. – BRADLEY, L.A. – OOSTRA, B.A. – VAN

DUIJIN, C.M. – KHOURY, M.J. 2008. A critical appraisal of the scientific basis

of commercial genomic profiles used to assess health risks and personalize

health interventions. In Journal of Human Genetics, vol. 82, 2008, p. 593-599.

ISSN: 1435-232X.

101


74. JIANG, J.B. – WILK, I. – BORECKI, S. – WILLIAMSON, A.L. – DE

STEFANO, G. – XU, J. – LIU, R.C. – ELLISON, M.P. – MYERS, R.H. 2004.

Common Variants in the 5´ Region of the Leptin Gene Are Associated with

Body Mass Index in Men from National Hear, Lung and Blood Institute Family

Heart Study. In The American Journal of Human Genetics, vol. 14, 2004, p.

220-230. ISSN: 0002-9297.

75. JIANG Z.H. – GIBSON, J.P. 1999. Genetics polymorphisms in the leptin gene

and their association with fatness in four pig breeds In Mammalian Genome,

vol.10, 1999, p. 191-193. e-ISSN: 1432-1777.

76. KALRA, S.P. - DUBE, M.G. - PU, S. - XU, B. – HORVATH, T.L. – KALRA,

P.S. 1999. Interacting appetite-regulating pathways in the hypothalamic

regulation of body weight. In Endocrine Reviews, vol. 20, 1999, p.68–100.

ISSN: 0163-769X.

77. KAPUT, J. – RODRIGGUES, R.L. 2006. Nutritional genomics : Discovering

the path to personalized nutrition. 1. vyd. New Jersey : John Wiley, 2006. 504 p.

ISBN: 978-0-471-68319-3.

78. KATSANIS, S.H. – JAVITT, G. – HUDSON, K. 2008. Public health. A case

study of personalized medicine1. In Science, vol. 320, 2008, p. 53-54. ISSN:

0036-8075.

79. KENNES, Y.M. – MURPHY, B.D. – POTHEIR, F. – PALIN, M.F. 2001.

Charakterization of swine leptin (LEP) polymorphism and their association with

production traits. In Animal Genetics, vol. 32, 2001, p. 215-218. Online ISSN:

1365-2052.

80. KISSENBAH, A.H. – SONNENBERG, G.E. – MYKLEBUST, J. –

GOLDSTEIN, M. – BROMAN, K. – JAMES, R.G. – MARKS, J.A. –

KRAKOWER, G.R. – JACOB, H.J. – WEBER, J. – MARTIN, L. –

BLANGERO, J. – COMUZZIE, A.G. 2000. Quantitative trait loci on

chromosomes 3 and 17 influence phenotypes of the metabolic syndrome. In

Proceedings of the National Academy Science USA, vol. 97, 2000, no. 26, p.

14478-14483. ISSN: 0027-8424.

81. KLOK, M.D. – JAKOBSDOTTIR, S. – DRENT, M.L. 2006. The role of leptin

and ghrelin in the regulation of food intake and body weight in humans:

a review. In Obesity, vol. 8, 2006, p. 21-34. EISSN: 1930-739X.

102


82. KNOLL, A. 1998. Detekce polymorfismu ve vztahu k mapovaní QTL u prasat :

diserteční práce. Brno : MZLU, 1998. 151 s.

83. KNOLL, A. – URBAN, T. 2002. Aktuální metody používané v molekulárni

genetice zvířat. In Sb. XX. Genetické dny, Brno : MZLU, 2002, s.12–18. ISBN:

80-7157-607-7.

84. KOH, J.M. – KIM, D.J. – HONG, J.S. – PARK, J.Y. – LEE, K.U. – KIM, S.Y. –

KIM, G.S. 2002. Estrogen receptor alpha gene polymorphism PvuII and XbaI

influence association between leptin receptor gene polymorphism (Gln223Arg)

and bone mineral density in young men. In European Journal of

Endocrinology, vol. 147, 2002, p. 777-83. e-ISSN: 1479-683X.

85. KOJIMA, M. – HOSODA, H. – DATE, Y. – NAKAZATO, M. – MATSUO, H.

– KANGAWA, K. 1999. Ghrelin is a growth-hormone-releasing acylated

peptide form stomach. In Nature, vol. 402, 1999, p.656-660. ISSN: 0028-0836.

86. KOJIMA, M. – KANGAWA, K. 2008. Structure and function of ghrelin. In

Results and Probllems in Cell Differenciation, vol. 46, 2008, p. 89-115. ISSN:

0080-1844.

87. KOLLÁR, J. 1996. Lipidy a lipoproteíny. Košice : Olympia, 1996, s.17-24.

ISBN 80-967388-7-9.

88. KONSTANTINEDES, S. – SHAFER, K. – KOSCHNICK, S. – LOSKUTOFF,

D.J. 2001. Leptin-dependent platelet aggregation and arterial thrombosis

suggests a mechanism for atherothrombotic disease in obesity. In Journal of

Clinical Investigation, vol. 108, 2001, p. 1533-1540. EISSN: 15588238.

89. KOPECKÁ, K. – KOPECKÝ, P. 2003 Zdravie a klinika chorôb. Martin :

Osveta, 2003, s. 356-357. ISBN: 80-8063-117-4.

90. KOPELMAN, PG. 2000. Obesity as a medical problem. In Nature, vol. 404,

2000, p. 635-643. ISSN: 0028-0836.

91. KORBONITS, M. – GOLDSTONE, A.P. – GUERGUIEV, M. et al. 2004.

Ghrelin a hormone with multiple functions. In Frontiers in neuroendocrinology,

vol. 25, 2004, p. 27-68

92. LALL, S. – TUNG, L.Y. – OHLSOON, C. – JANSSON, J.O. – DICKSON, S.L.

2001. Growth hormone (GH)-in-denendent stimulation of adiposity by GH

secretagogues. In Biochemical and Biophysical Research Communications, vol.

280, p. 132-138. ISSN: 0006-291X.

103


93. LAKAR, O. - FUNDAZIOA, E. 2009a. Action of ghrelin hormone increases

appetite and favors accumulation of abdominal fat. [on-line] [cit. 2010-05-15].

Dostupné na: <http://hplusmagazine.com/2009/05/20/action-ghrelin-hormone-

increases-appetite-and-favors-accumulation-abdominal-fat/>.

94. LAKAR, O. – FUNDAZIOA, E. 2009b. Appetite increased by action of ghrelin

hormone leading to accumulation of abdominal fat. [on-line] [cit. 2010-05-21].

Dostupné na: <http://www.medicalnewstoday.com/articles/150962.php>.

95. LEE, Y.S. 2009. The role of leptin-melanocortin system and human weight

regulation: lessons from experiments of nature. In Annals Academy of Medicine

Singapore, vol. 38, 2009, p.34-41. ISSN: 0304-4602.

96. LE ROUX, C.W. – NEARY, N.M – HALSEY, T.J. – SMALL, C.J. –

MARTINEZ-ISLA, A.M. – GHATEI, M.A. – THEDOROU, N.A. – BLOOM,

S.R. 2005. Ghrelin does not stimulate food intake in patients with surgical

procedures involving vagotomy. In The Journal of Clinical Endocrinology and

Metabolism, vol. 90, 2005, no. 8, p.4521-4524. Online ISSN: 1945-7197

97. LEVIN, F. – EDHOLM, T. – SCHMIDT, P.T. – GRYBÄCK, P. –

JACOBSSON, H. – DEGERBLAD, M. – HÖYBYE, C. – HOLST, J.J. –

REHFELD, J.F. – HELLSTRÖM, P.M. – NÄSLUND, E. 2006. Ghrelin

stimulates gastric emptying and hunger in normal-weight humans. In The

Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, vol. 91, 2006, no. 9, p.

3296-3302. Online ISSN: 1945-7197.

98. LIEFERS, S.C. – VEERKAMP, R.F. – TE PAS, M.F. – DELAVAUD, C. –

CHILLIARD, Y. – VAN DER LENDE, T. 2004. A missense mutation in the

bovine leptin receptor gene is associated with leptin concentrations during late

pregnancy. In Animal Genetics, vol. 35, 2004, p. 138-41. Online ISSN: 1365-

2052.

99. LITTLE, P.F.R. 2005. Structure and junction of the human genome. In Genome

Research, vol. 15, 2005, p. 1759-1766. ISSN: 1549-5469

100. LŐNNQVIST, F. 1996. The obese (ob) gene and its product leptin-a new

route toward obesity treatment in man? In Q J Medicine, vol. 89, 1996, p. 327-

332. ISSN: 0033-5622.

101. MACKOWSKI, M. – SZYMONIAK, K. – SZYDLOWSKI, M. –

KAMYCZEK, M. – ECKERT, R. – ROZYCKI, M. – SWITOVSKI, M. 2005.

Missense mutation in exon 4 of the porcine LEPR gene encoding extracelular

104

http://www.medicalnewstoday.com/articles/150962.php

http://hplusmagazine.com/2009/05/20/action-ghrelin-hormone-increases-appetite-and-favors-accumulation-abdominal-fat/

http://hplusmagazine.com/2009/05/20/action-ghrelin-hormone-increases-appetite-and-favors-accumulation-abdominal-fat/


domain and their association with fatness traits. In Animal Genetics, vol. 36,

2005, p. 135-137. ISSN: 1365-2052.

102. MAGER, U. – KOLEHMAINEN, M. – MELLO, V.D.F. – SCHWAB,

U. – LAAKSONEN, D.E. – RAURAMAA, R.- GYLLING, H. – ATALAY,M. –

PULKKINEN, L. – UUSITUPA, M. 2008. Expression of ghrelin gene in

preripheral blood mononuclear cells and plasma ghrelin concentrations in

patients with metabolic syndrome In European Journal of Endocrinology, vol.

158, 2008, p. 499-510. e-ISSN: 1479-683X.

103. MAKAŁOWSKI, W. 2001. The human genome structure and

organization. In Acta Biochimica Polonica, vol. 48, 2001, no. 3, p. 587-598.

ISSN:0001-527X.

104. MAMMÈS, O. – BETOULLE, D. – AUBERT, R. et al. 1998. Novel

polymorhisms in the 5, region of the LEP gene:association with leptin levels and

response to low-calorie diet on human obesity. In Diabetes, vol. 47, 1998, p.

487–489. Online ISSN: 1939-327X.

105. MAMMES, O. – BETOULLE, D. – AUBERT, R. – HERBETH, B. –

SIEST, G. – FUMERON, F. 2000. Association of the G2548A polymorphism in

the 5´region of the LEP gene with overwieght. In Annals of Human Genetics,

vol. 64, 2000, p. 391–394.

106. MANIATIS, T. 1982. Molecular cloning : a laboratory manual. New

York : Cold Spring Laboratory Press, 1982.

107. MANZELLA, D. – PARILLO, M. – RAZZINO, T. – GNASSO, P. –

BUONANNO, S. – GARGIULO, A. – CAPUTI, M. – PAOLISSO, G. 2002.

Soluble leptin receptor and insulin resistance as determinant of sleep apnea. In

International Journal of Obesity and Related Metabolic Disordes, vol. 26, 2002,

p. 370-5. ISSN: 1476-5497.

108. MARAČEK, I. – STANÍKOVÁ, A. – DANKO, J. 2004. Fyziológia

leptínu a jeho význam v prevencii porúch plodnosti prežúvavcov. In Slovenský

chov, 2004, s. 48. ISSN: 1335-1990.

109. MILLER, S. – DYKES, D. – POLESKY, H. 1988. A simple salting out

procedure for extracting DNA from human nucleated cells. In Nucleid Acid

Research, vol. 9, 1981, no. 4, p.5931-5947. Online ISSN: 1362-4962.

105


110. MILUCHOVÁ, M. – TRAKOVICKÁ, A. – GÁBOR, M. 2009.

Genetické markéry kvality mlieka a zdravia hovädzieho dobytka. Nitra : SPU.

71s. ISBN 978-80-552-0281-5.

111. MIYASAKA, K. – HOSOYA, H. – SEKIME, A. – OHTA, M. –

AMONO,H. – MATSUSHITA, S. – SUZUKI, K. – HIGUCHI, S. –

FUNAKOSHI, A. 2006. Association of ghrelin receptor gene polymorphism

with bulimia nervosa in Japanese population. In Journal of Neural Transmision,

vol. 113, 2006, p.1279-1285. ISSN: 1435-1463.

112. MONTGOMERY, J. – WITTWER, C.T. – PALAIS, R. – ZHOU, L.

2007. Simultaneous mutation scanning and genotyping by high resolution DNA

melting analysis.In Nature Publishing Group, vol. 2, 2007, p. 59-66. EISSN:

1750-2799.

113. MUCCIOLI, G. – TSCHOP, M. – PAPOTTI, M. – DEGHENGHI, R. –

HEIMAN, M. – GHIGO, E. 2002. Neuroendocrine and peripheral activities of

ghrelin: implications in metabolism and obesity. In European Journal of

Pharmacology, vol. 404, 2002, p. 235-254. ISSN: 0014-2999.

114. MULLIS, K. B. 1990. The unusual origin of the Polymerase Chain

Reaction. In Scientific American, vol.. 262, 1990, no. 4, p. 36-43. ISSN: 0036-

8733.

115. MUNZBERG, H. – FLIER, J.S. – BJORBAEK, C. 2004. Region-specific

leptin resistance within the hypothalamus of diet-induced-obese mice. In

Journal of Endocrinology, vol. 145, 2004, p. 4880-4889. ISSN (electronic):

1479-6805.

116. MURRAY, C.D.R. – MARTIN, N.M. – PATTERSON, M. – TAYLOR,

S.A. – GHATEI, M.A. – KAMM, M.A. – JOHNSTON, C. – BLOOM, S.R. –

EMMANUEL, A.V. 2005. Ghrelin enhances gastric imptying in diabetic

gastroparesis: a double blind, placebo controlled, crossover study. In Gut, vol.

54, 2005, no. 12, p. 1693-1698. ISSN: 1468-3288.

117. MUY-RIVERA, M. – NING, Y. – FREDERIC, I.O. –

VADACHKORIA, S. - LUTHY, D.A. – WILLIAMS, M.A. 2005. Leptin,

soluble leptin receptor and leptin gene polymorphism in relation to preeclampsia

risk. In Physiological Research, vol. 54, 2005, p. 167-74. ISSN 1802-9973.

118. NAKASHIMA, K. – NARAZAKI, M. – TAGA, T. 1997. Leptin receptor

(OB-R) oligmerizes with itself but not with its closely related cytokine signal

106


transducer gp130. In FEBS Letters, vol. 403, 1997, p. 79-82. ISSN: 0014-5793.

ISSN: 1939-327X.

119. NAKATA, M. – YADA, T. – SOEJIMA, N. – MARUYAMA, I. 1999.

Leptin promotes aggregation of human platelets via the long form of its receptor.

In Diabetes, vol. 48, 1999, p. 426-429. ISSN: 1939-327X.

120. NEI, M. 1978. Estimation of average heterozygosity and genetic distance

from a small number af individuals. In Genetics, vol. 89, 1978, p.132. ISSN:

1943-2631.

121. NEUENSCHWANDER, S. – RETTENBERG, G. – MEIJERINK, E. –

JORG, H. – STRANZINGER, G. 1996. Partial characterization of porcine

obesity gene (OBS) and its localization to chromosome 18 by somatic cell

hybrids. In Animal Genetics, vol. 27, 1996, p. 275-278. ISSN: 1365-2052.

122. NI, K.Y. – SHEK-YI, Y. – TIN, L.L. – HONG, R.L.L. 2009. Genotyping

Candidate Genes Related to Obesity in UCSI University Student Cohort. In

Journal for the advancement of science and Arts, vol. 1, no. 1, 2009, p. 29-42.

ISSN: 1823-903X.

123. PANTEL, J. – LEGENDRE, M. – CABROL, S. – HILAL, L. – HAJAJI,

Y. – MORISSET, S. – NIVOT, S. – VIE-LUTON, M. – GROUSELLE, D. – DE

KERDANET, M – KADIRI, A. – EPELBAUM, J. – LE BOUC, Y. –

AMSELEM, S. 2006. Loss of constructive activity of the growth hormone

secretagogue receptor in familial short stature. In Journal of Clinical

Investigation, vol. 116, no. 3, 2006, p.760-768. EISSN: 15588238.

124. PASQUALINI, J.R. 2005. Enzymes involved in the formation and

transformation of steroid hormones in the fetal and placental compartments. In

Journal of Steroid Biochemisry and Molecular Biology, vol. 97, 2005, p. 401-

415. ISSN: 0960-0760.

125. PATTERSON, M. – VINCENT, R.P. – HUNT, C. et al. 2005.

Postprandial plasma ghrelin is supressed proportional to meal caloric content in

normal-weight but not obese subjects, In The journal od clinical endocrinology

and metabolism, vol. 90, 2005, no. 2, p. 1068-1071. ISSN: 0021972X.

126. PETRUSKA, J. – GOODMAN, M. F. 1988. Comparison between DNA

melting thermodynamics and DNA polymerase fidelity. In Proceedings of the

National Academy Science USA, vol. 85, 1988, p. 6252–6256. ISSN: 0027-8424

107


127. PODAR, K. – ANDERSON, K.C. 2006. Caveolin-1 as a potentioal new

therapeutic target in multiple myeloma. In Cancer Letters, vol. 233, 2006, p. 10-

15. ISSN: 0304-3835.

128. POSKITT, E.M. 1995. Defining childhood obesity: the relative body

mass index (BMI). In Acta Paediatrica, vol. 84, 1995, p. 961-963. ISSN: 1651-

2227.

129. PRIEUE, X. – TUNG, L.Y.C. – GRIFFIN, J.L. – FAROOQI, S.I. – O

´RAHILLY, S. 2008. Leptin Regulates Peripheral Lipid Metabolism Primaly

through Central Effects on Food Intake. In Endocrinology, vol. 149, 2008, no.

11, p. 5432-5439. ISSN: 1945-7170.

130. QUINTON, N.D. – LEE, A.J. – ROSS, R.J. – EASTELL, R. –

BLAKEMORE, L. 2001. A single nucleotide polymorphism (SNP) in the leptin

receptor is associated with BMI, fat mass and leptin levels in postmenopausal

Caucasian women. In Human Genetics, vol. 108, 2001, p. 233-236. ISSN: 1432-

1203.

131. RAMSAY, T. G. – YAN, X. – MORRISON, C. 1998. The obesity gene

in swine: sequence and expression of porcine leptin. In Journal of Animal

Science, vol. 76, 1998, p. 484–490. ISSN: 0021-8812.

132. RAPLEY, R. – HARBRON, S. 2004. Molecular Analysis and Genome

Discovery. Chichester : Johnr Wiley, 2004. 388 p. ISBN: 9780470020203.

133. RANADIVE, S.A. – VAISSE, C. 2008 Lessons from extreme human

obesity: monogenic disorders. In Endocrinology Metabolism Clinics of North

America, vol. 37, 2008, p.733-751. ISSN: 08898529.

134. REIDY, S.P. – WEBWE, J. – 2000. Leptin: an essential regulator of lipid

metabolism. In Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular

and Integrative Physiology, vol. 125, 2000, p. 285-298. ISSN: 1095-6433.

135. REMESAR, X. – RAFECAS, I. – FERNANDEZ-LOPEZ, J. A. –

ALEMANY, M. 1997. Leptin. In Medicinal Research Rewiews, 17, 1997, p.

225–234. ISSN: 1098-1128.

136. RICHTER, L. – CHEVALLEY, T. – MANEN, D. – BONJOUR, J.P. –

RIZZOLI, R. – FERRARI, S. 2007. Bone Mass in Prepubertal Boys Is

Associated with a Gln223Arg Amino Acid Substitution in the Leptin Receptor.

In The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, vol. 92, 2007, no. 11,

p. 4380-4386. ISSN: 0021972X.

108


137. ROBERT, C. – PALIN, M.F. – COLOMBE, N. – ROBERGE,C. et al.

1998. Backfat thickness in pigs is positively associated with leptin mRNA

levels. In Canadian Journal of Animal Science, vol. 78, 1998, p. 473-482. ISSN:

0008-3984.

138. SAHU, A. 2003. Leptin signaling in the hypothalamus: emphasis on

energy homeostasis and leptin resistence. In Frontiers in Neuroendocrinology,

vol. 24, no. 4, 2003, p. 225-253, ISSN (electronic): 1095-6808. ISSN: 0091-

3022.

139. SAIKI, R. K. – GELFAND, D. H. et al. 1988. Primer directed enzymatic

amplification of DNA with thermostable DNA polymerase. In Science, vol. 239,

1988, p. 487–491. ISSN: 1095-9203.

140. SAMBROOK, J. – RUSSEL, D.W. 2001. Cold Spring Horbor

Laboratory Press. New York : Cold Spring Harbor, 2001. ISSN: 1559-6095.

141. SAMBROOK, J. – FRITZ, E. F. – MANIATIS, T. 1989. Molecular

cloning: A laboratory manual. 2nd ed., Cold Spring Harb. Lab. Press, USA,

1989Shahin, K. A. and R. T. Berg, 1985. Growth patterns of muscle, fat and

bone, and carcass composition of double muscled and normal cattle. In

Canadian Journal of Animal Science, vol. 65, 1989, p. 279-293. ISSN:

00083984.

142. SAS Institute Inc. 1999-2005. SAS Enterprise Guide 3.0.2.446.

143. SCHWARTZ, M.W. – SEELEY, R.J. – CAMPFIELD, L.A. 1996.

Identification of targets of leptin action in rat hypothalamus. In Journal of

Clinical Investigation, vol. 98, 1996, no. 5, p. 1101-1106

144. SEIM, I. – COLLET, CH. – HERINGTON, A.C. – CHOPIN, L.K. 2007.

Revised genomic structure of the human ghrelin gene and identification of novel

exons, alternative splice variants and natural antisense transcripts In BMC

Genomics, vol. 8, 2007, p. 298. ISSN: 1471-2164.

145. SILBERNAGEL, S.- LANG, F. 2001. Atlas patofyziologie člověka.

Praha, 2001, s. 26. ISBN 80-7169-968-3.

146. SILBERNAGEL, S – DESPOPOLOUS, A. 2004. Atlas fyziologie

člověka, Praha 2004, 282 s. ISBN 80-247-0630-X.

147. SILVER, K. – WALSTON, J. – CHUNG, W.K. – YAO, F. – PARIKH,

V.V. – ANDERSEN, R. – CHESKON, L.J. – ELAHI, D. – MULLER, D. –

LEIBEL, R.L.SHULDINER, A.R. 1997. The Gln223Arg and Lys656Asn

109


polymorphisms in the human leptin receptor do not associate with traits related

to obesity. In Diabetes, vol. 46, 1997, p. 1898-900. ISSN: 1939-327X.

148. SILVER, D.L. – JIANG, X.C. – TALL, A.R. 1999. Increased high

density lipoprotein (HDL), defective hepatic catabolism of ApoA-I and ApoA-

II, and decreased ApoA-I mRNA in ob/ob mice. Possible role of leptin in

stimulation of HDL turnover. In Journal of Biological Chemistry, 274, 1999, p.

4140-4146. ISSN: 1083-351X.

149. SILVER, D.L. – WANG, N. – TALL, A.R. 2000. Defective HDL

particle uptake in ob/ob hepatocytes causes decreased recycling, degradation,

and selective lipid uptake. In Journal of Clinical Investigation, vol. 105, 2000, p.

151-159. EISSN: 15588238.

150. SKIBOLA, S.F. – HOLLY, E.A. – FORREST, M.S. – HUBBARD, A. –

BRACCI, P.M. – SKIBOLA D.R. – HEGEDUS, C. – SMITH, M.T. 2004. Body

mass index, leptin and leptin receptor polymorphism, and non-hodgkin

lymphoma. In Cancer Epidemiolology, Biomarkers and Prevention, vol. 13,

2004, p. 779-86. ISSN: 1538-7755.

151. SNUSTAD, D.P. – SIMMONS, M.J. 2009. Genetika.1. vyd. Brno :

Masarykova univerzita, 2009, s. 423-460. ISBN 978-80-210-4852-2.

152. SOARES, M. A. M. – GUIMARAES, S. E. F. 2001. The role of leptin

and its receptors in fat metabolism. In Second International Virtual Conference

on Pork Quality, November, 05 to December, 06 2001.

153. SNOUSSI, K. – STROSBERG, D.A. – BOUAOUINA, N. – AHMED,

S.B. – HELAL, A.N. – CHOUCHANE, L. 2006. Leptin and leptin receptor

polymorphisms are associated with increased risk and poor prognosis of breast

carcinoma. In BMC Cancer, vol. 38, 2006, no.6. ISSN: 1471-2407

154. SRŠEŇ, Š. – SRŠŇOVÁ, K. 2005. Základy klinickej genetiky a jej

molekulárna podstata. 4. vyd., Martin : Osveta, 2005. ISBN: 80-8063-185-9.

155. STEPIEN-POLESZAK, D. – PIETRUSZKS, A.- KAWECKA, M. 2009.

Effect of Leptin Gene Polymorphism on Fattening and Slaughter Value of Line

990 Gilts. In Acta Veterinaria Brno, vol. 78, 2009, p. 267-272. ISSN: 1801-

7576.

156. STRATIL, A.- PEELMAN, L. – VAN POUCKE, M. – ČEPICA, S.

1997. A HinfI PCR-RFLP at the porcine leptin (LEP) gene. In Animal Genetics,

vol. 28, 1997, p. 371-372. ISSN: 1365-2052.

110


157. SYVÄNEN, A.C. 2001. Accessing Genetic Variation: Genotyping Single

Nucleotide Polymorphism. In Nature, 2, 2001, p. 30-42. ISSN: 1365-2052.

158. ŠMARDA, J. – DOŠKAŘ, J. – PANTŮČEK, R. – RŮŽIČKOVÁ, V. –

KOPTÍKOVÁ, J. 2005. Metody molekulární biologie. 1. vyd. Masarykova

univerzita v Brne, 2005, s. 54-85. ISBN 80-210-3841-1.

159. TACK, J. – DEPOORTERE, I. – BISSCHOPS, R. – VERBEKE, K. –

JANSSENS, J. – PEETERS, T. 2005. Influence of ghrelin on gastric emptying

and meal-related symptoms in idiopathic gastroparesis. In Alimentary

Pharmacology and Therapeutics, vol. 22, 2005, no. 2009, p. 847-853. ISSN:

1365-2036.

160. TAHARA, M. – AIBA, A. – YAMAZAKI, M. – IKEDA, Y. – GOTO, S.

– MORIYA, H. – OKAWA, A. 2005. The extent of ossification of posterior

longitudinal ligament of the spine associated with nucleotide porophosphatase

gene and leptin receptor gene polymorphisms. In Spine, vol. 30, 2005, p. 877-80.

ISSN: 1528-1159.

161. TAKAHASHI-YASUNO, A. – MASUZAKI, H. – MIYAWAKI, T. –

MATSUOKA, N. – OGAWA, Y. – HAYASHI, T. – HOSODA, K. –

YOSHIMASA, Y. – INOUE, G. – NAKAO, K. 2004. Association of Ob-R gene

polymorphism and insulin resistance in Japanese men. In Metabolism, vol. 53,

2004, p. 650-654.

162. TARTAGLIA, L. A. – DEMBSKI, M. – WENG, X. – DENG, N. –

CULPEPPER, J. – DEVOS, R. et al. 1995. Identification and expression cloning

of a leptin receptor, OB-R. In Cell, vol. 83, 1995, p. 1263-1271.

163. TEMPLETON, A. R. 2006. Population genetics and microevolutionary

theory. Published by John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, New Jersey, 716 p.,

ISBN: 978-0-471-40951-9.

164. TINDAL, K. R. – KUNKEL T. A. 1988. A fidelity of DNA synthesis by

the Thermus aqaticus DNA polymerase. In Biochemistry, vol. 27, 1988, p. 6008-

6013.

165. TOLSON, K.P. – GEMELLI, T. – GAUTRON, L. 2010. Postnatal Sim1

deficiency causes hyperphagic obesity and reduces Mc4r and oxytocin

expression. In Journal of Neuroscience, vol. 30, 2010, p. 3803-3812. ISSN:

0270-6474.

111


166. TRAEBERT, M. – RIEDIGER, T. – WHITEBREAD, S. – SCHARRER,

E. – SCHMID, H.A. 2002. Ghrelin acts on leptin-responsive neurones in the rat

arcuate nucleus. In Journal of Neuroendocrinology, vol. 17, 2002, no. 7, p.580-

586. ISSN: 1365-2826.

167. TRAKOVICKÁ, A. – BEŽOVÁ, K. – ANGELOVIČOVÁ, M. –

KÚBEK, A. – TURJANITSA, I. – KAČÁNIOVÁ, M. – CHLEBO, R. –

MINDEK, A. – ŽIDEK, R. – POKORÁDI, J. – MILUCHOVÁ, M. – GÁBOR,

M. Genetické markéry a kvalita produktov špeciálnych odvetví živočíšnej

výroby. Nitra : SPU, 2005. 178 s. ISBN 80-8069-633-0.

168. TSCHOP, M.- WEYER, C. – TATARANNI, P.A. – DEVANARAYAN,

V. – RAVUSSIN, E. – HEIMAN, M.L. 2001. Circulating ghrelin levels are

decreased in human obesity. In Diabetes, vol. 50, 2001, p. 707-709. ISSN: 1939-

327X.

169. TSCHOP, M. – STATNICK, M.A. – SUTER, T.M. – HEIMAN, M.L.

2002. GH-releasing peptide – 2 increases fat mass in mice lacking NPY:

indication for a crucial mediating role of hypothalamic agouti-related protein. In

Endocrinology, vol. 143, 2002, p. 558-568. ISSN: 1945-7170.

170. TUNG, Y.C. – HEWSON, A.K. – DICKSON, S.L. 2001. Actions of

leptin on growth hormone secretagogue-responsive neurones in the rat

hypothalamic arcuate nucleus recorded in vitro. In Journal of

Neuroendocrinology, vol. 13, 2001, no, 2, p.209-215. ISSN: 1365-2826.

171. UKKOLA, O 2003. Ghrelin and insulin metabolism. In European

Journal of Clinical Investigation, vol. 33, 2003, p.183-185.ISSN: 1365-2362.

172. VALERA MORA, M.E. – SCARFONE, A – VALENZA, V. –

CALVANI, M. – GRECO, A.V. – GASBARRINI, G. – MINGRONE, G. 2005.

Ghrelin does not influence gastric emptying in obese subjects. In Obesity

Research, vol. 13, 2005, no. 4, p.739-744. EISSN: 1930-739X.

173. VAN DER LELY, A.J. – TSCHOP, M. – HEIMAN, M.L. – GHIGO, E.

2004. Biological, physiological, pathophysiological and pharmacological aspects

of ghrelin. In Endocrine Reviews, vol. 25, 2004, p. 426-457. ISSN: 0163769X.

174. VAN HEEK, M. – COMPTON, D.S. – FRANCE, C.F. - TEDESCO,

R.P. – FAWZI, M.P. – GRAZIANO, M.P. – SYBERTZ, E.J. – STRANDER,

C.D. – DAVIS, H.R. Jr. 1997. Diet-induced obese mice develop peripheral, but

112


not central, resistance to leptin. In Journal of Clinical Investigation, vol. 99,

1997, p. 385-390. EISSN: 15588238.

175.VAN ROSSUM, C.T. – HOEBEE, B. – VAN BAAK, M.A. – MARS, M. –

SARIS, S.W. – SEIDELL, J.C. 2003. Genetic variation in the leptin receptor

gene, leptin, and weight gain in young Dutch adults. In Obesity Research, 2003,

no.11, p. 377-86. EISSN: 1930-739X.

176. VARTAINEN, J. – PŐYKKŐ, S.M. – RÄISÄNEN, T. – KESÄNIEMI,

Y.A. – UKKOLA, O. 2004. Sequencing analysis of the ghrelin receptor (growth

hormone secretagogue receptor type 1a) gene. In European Journal of

Endocrinology, 150, 2004, p.457-463.

177. VAŠKÚ, J. A.B. – VAŠKÚ, A. - DOSTÁLOVÁ, Z. – BIENERT, P.

2006. Association of Leptin Genetic polymorphism-2548 G/A with Gesttional

Diabetes Mellitus In Genes and Nutrition, vol. 1, 2003, no. 2, p. 117- 124. ISSN:

1555-8932.

178.WANG, H.J. – GELLER, F. – DEMPFLE, A. – SCHÄUBLE, N. – FRIEDEL,

S. – LICHTNER, P. – FONTENLA-HORRO, F. – WUDY, S. – HAGEMANN,

S. – GORTNER, L. – HUSE, K. – REMSCHMIDT, H. – BETTECKEN, T. –

MEITINGER, T. – SCHÄFER, H. – HEBEBRAND, J. – HINNEY, A. 2004.

Ghrelin receptor gene: Identification of several sequence variants in extremely

obese children and adolescents, healthy normal-weight and underweight

students, and children with short normal stature. In Journal of Clinical

Endokrinology and Metabolism, vol. 89, 2004, no. 1, p.157-162. ISSN:

0021972X.

179. WANG, T.N. – HUANG, M.C. – CHANG, W.T. – KO, A.M. – TSAI,

E.M. – LIU, C.S. – LEE, C.H. – KO, Y.C. 2006. G-2548A polymorphism of the

leptin gene is correlated with extreme obesity in Taiwanese aborigines. In

Obesity, vol. 14, 2006, p.183-187. EISSN: 1930-739X.

180. WATOWICH, SS. – WU, H. – SOCOLOVSKY, M. et al. 1996.

Cytokine receptor signal transduction and the control of hematopoietic cell

development. In Annual Review of Cell and Developemental Biology, vol. 12,

1996, p. 91-128. ISSN: 15308995.

181. WAUTERS, M. – MERTENS, I. – CHAGNON, M. – RANKONEN, T.

– CONSIDINE, R.V. – CAHGNON, Y.C. – VAN GAAL, L.F. – BOUCHARD,

C. 2001. Polymorphisms in the leptin receptor gene, body composition and fat

113


distribution in overweight and obese women. In International Journal of Obesity

and Related Metabolic Disordes, vol. 25, 2001, p. 714-20. ISSN: 0307-0565.

182. WHO – Body mass index-BMI. 2011 [online]. [cit. 2010-04-05]

Dostupné na <http://www.euro.who.int/en/what-we-do/health-topics/disease-

prevention/nutrition/a-healthy-lifestyle/body-mass-index-bmi˃.

183. WIEGMAN, C.H. – BANDSMA, R.H. – OUWENS, M. – VAN DER

SLUIJS, F.H. – HAVINGA, R. – BOER, T. – REIJNGOUD, D.J. – ROMIJN,

J.A. – KUIPERS, F. 2003. Hepatic VLDL production in ob/ob mice is not

stimulated by massive de novo lipogenesis but is less sensitive to the suppressive

effects of insulin. In Diabetes, vol. 52, 2003, p.1081-1089. ISSN: 1939-327X.

184. WILDING, J.P.H. 2002. Neuropeptides and appetite control. In Diabetic

Medicine, vol.19, 2002, no. 8, p. 619-627. ISSN: 1464-5491.

185. WILLIAMS, CH.M. – ORDOVAS, J.M. – LAIRON, D. – HESKETH, J.

– LIETZ, G. – GIBNEY, M. – VAN OMMEN,B. 2008. The challenges for

molecular nutrition research 1: linking genotype to healthy nutrition. In Genes

and Nutrition, vol. 3, 2008, p.41-49. ISSN: 1555-8932.

186. WILLER, C.J. – SPELIOTES, E.K. – LOSS, R.J. 2009. Six new loci

associated with body mass index highlight a neuronal influence on body weight

regulation. In Nature Genetics, vol. 41, 2009, p. 25-34. EISSN : 1546-1718.

187. WEBB, J. 2000. New Opportunities for Genetic Change in Pigs. In

Advances in Pork Production, vol. 11, 2000, p. 83–95. ISSN: 1489-1395.

188. WU, X. – COOPER, R.S. – BOERWINKLE, E. – TURNER, S.T. –

HUNT, S. – MYERS, R. – OLSHEN, R.A. – CURB, D. – ZHU, X. – KAN, D. –

LUKE, A. 2003. Combined analysis of genomewide scans for adult height:

results from the NHLBI family blood pressure progream. In European Journal

of Human Genetics, Vol. 11, 2003, no. 3, p.271-274. EISSN: 1476-5438.

189. YAMAGISHI, S.I. – EDELSTEIN, D. – DU, X.L. – KANEDA, Y. –

GUZMAN, M. – BROWNLEE, M. 2001. Leptin induces mitochondrial

superoxide production and monocyte chemoattractant protein-1 expression in

aortic endothelial cells by increasing fatty acid oxidation via protein kinase A. In

Journal of Biological Chemistry, vol. 276, 2001, p. 25096-25100. ISSN: 1083-

351X.

190. YIANNAKOURIS, N. – YANNKOULIA, M. – MELISTAS, L. –

CHAN, J.L. – KLIMAS-ZACAS, D. – MANTZOROS, C.S. 2001. The Q223R

114


polymorphism of the leptin receptor gtene is significantly associated with

obesity and predicts a small percentage of body weight and body composition

vyraibility. In Journal of Clinical Endokrinology and Metabolism, vol. 86, 2001,

p. 4434-9. ISSN: 1945-7197.

191. YUAN, G. – WANG, J. – HEGELE, R.A. 2006. Heterozygous familial

hypercholesterolemia: an underrecognized cause of early cardiovascular disease.

In Canadian Medical Association Journal, vol. 174, 2006, p. 1124-1129.

EISSN: 14882329.

192. ZADÁK, Z. 2002. Výživa v intenzivní péči. Praha : Grada Publishing,

2002. 487 s. ISBN 80-247-0320-3.

193. ZAZZIET, M. – ROMANO, L. 1992. Low Human Immunodeficiency

Virus Titer and Polymerase Chain Reaction False-negativites. In Journal of

Infection Diseases, vol. 165, 1992, p. 779-780. ISSN: 0036-5548.

194. ZHANG, Y. – PROENCA, R. – MAFFEI, M. et al. 1994. Positional

cloning of the mouse obese gene and its huma homologue. In Nature, vol. 372,

1994, p. 452-432. ISSN : 0028-0836.

195. ZHANG, W. – ZHAO, L. – LIN, T.R. – CHAI, B – FAN, Y. – GANTZ,

I. – MULHOLLAND, M.W. 2004. Inhibition of Adipogenesis by Ghrelin In

Molecular Biology of the Cell, vol. 15, 2004, p. 2484 – 2491. ISSN: 1059-1524.

196. ZORRILLA, E.P. – IWASAKI, S. – MOSS, J.A. – CHANG, J. –

OTSUJI, J. – INOUE, K. – MEIJLER, M.M – JANDA, K.D. 2006. Vaccination

against weight gain. In Proceedings of the National Academy of Sciences USA,

vol. 103, 2006, no. 35, p.13226-13231. ISSN:0027-8424.

115

Prílohy

Prílohy

116

Prílohy

Obrázok 1: Genotypová hodnota triglyceridov pre LEP gén

Obrázok 2: Genotypová hodnota HDL pre LEP gén

117

Prílohy

Obrázok 3: Genotypová hodnota LDL pre LEP gén

Obrázok 4: Genotypová hodnota celkového cholesterolu pre LEP gén

118

Prílohy

Obrázok 5: Genotypová hodnota glukózy pre LEP gén

Obrázok 6: Genotypová hodnota BMI pre LEP gén

119

Prílohy

Obrázok 7: Genotypová hodnota triglyceridov pre LEPR gén

Obrázok 8: Genotypová hodnota HDL pre LEPR gén

120

Prílohy

Obrázok 9: Genotypová hodnota LDL pre LEPR gén

Obrázok 10: Genotypová hodnota celkového cholesterolu pre LEPR gén

121

Prílohy

Obrázok 11: Genotypová hodnota glukózy pre LEPR gén

Obrázok 12: Genotypová hodnota BMI pre LEPR gén

122

Prílohy

Obrázok 13: Genotypová hodnota triglyceridov pre GHSR gén

Obrázok 14: Genotypová hodnota HDL pre GHSR gén

123

Prílohy

Obrázok 15: Genotypová hodnota LDL pre GHSR gén

Obrázok 16: Genotypová hodnota celkového cholesterolu pre GHSR gén

124

Prílohy

Obrázok 17: Genotypová hodnota glukózy pre GHSR gén

Obrázok 18: Genotypová hodnota BMI pre GHSR gén

125

Prílohy

Obrázok 19: Korelačné závislosti medzi HDL, CHOL, TAG, GLU hodnotené za celý súbor, ženy a mužov

Obrázok 20: Korelačné závislosti medzi HDL, TAG, LDL a BMI hodnotené za celý súbor, ženy a mužov

126

0,63769

0,12651

0,19861

0,26686

0,64653

0,3708

0,73801

0,10908

0,011960

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

HDL : CHOL CHOL : TAG TAG : GLU

spolu ženy muži

-0,09211 -0,09908

0,45259

-0,00881

0,53878 0,5436

0,23678

-0,35281

0,27458

-0,4

-0,3

-0,2

-0,1

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

spolu ženy mužiHDL : TAG TAG : LDL LDL : BMI

Prílohy

Obrázok 21: Korelačné závislosti medzi HDL, BMI, GLU a LDL hodnotené za celý súbor, ženy a mužov

Obrázok 22: Korelačné závislosti medzi TAG, BMI, CHOL a LDL hodnotené za celý súbor, ženy a mužov

127

0,36215

0,58639

0,40962

-0,03282

0,71209

0,632420,60968

0,47239

0,24343

-0,1

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

spolu ženy muži

HDL : BMI BMI : GLU GLU : LDL

0,37573

0,59329

0,91581

0,73546

0,59813

0,96436

0,30453

0,56563

0,83337

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

TAG : BMI BMI : CHOL CHOL : LDL

spolu ženy muži

Prílohy

Obrázok 23: Korelačné analýzy medzi CHOL, GLU, HDL a LDL hodnotené za celý súbor, ženy a mužov

128

0,39464

0,03461

0,37284

0,63575

0,11647

0,06137

0,27136

0,14966

0,34074

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

CHOL : GLU GLU : HDL HDL : LDL

spolu ženy muži

Documents

crzp.uniag.skcrzp.uniag.sk/Prace/2011/L/2AF4EC9D17194DC8BC6D3200EB6… · Web viewSýtosť leptín signalizuje účinkom orexigenických peptidov na sekréciu neuropeptidu Y (NPY),