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1CROMATOGRAFA DE LQUIDOS DE ALTA EFICACIA (HPLC)
Curso de Anlisis InstrumentalInstituto de Ingeniera QumicaFacultad de Ingeniera - 2007
Juan Bussi
CROMATOGRAFA DE LQUIDOS DE ALTA EFICACIA (HPLC)
Determinacin de compuestos no voltiles (alto Peso Molecular, iones metlicos) o termolbiles.
Ampliamente utilizadaGran sensibilidad
Determinaciones cuantitativas exactas
Aminocidos, protenas, cidos nucleicos, hidrocarburos, carbohidratos, frmacos, terpenoides, plaguicidas, antibiticos, esteroides, etc.
Aplicabilidad a sustancias de inters general (industria, salud, medioambiente).
Interacciones qumicas entre la muestra, la fase mvil y el relleno de la columna, determina el grado de migracin y separacin de componentes contenidos en la muestra.
Solventes como Fase Mvil
Elucin politptica: se combinan varios tipos de tcnicas.
Elucin por gradiente: los distintos analitos son eludoscon incremento de la composicin de la fase mvil en la fase orgnica.
Elucin Isocrtica: composicin constante de la fase mvil
La fase mvil puede ser alterada en el transcurso del anlisis para manipular las interacciones de los componentes de la muestra conla fase estacionaria.
Compuestos con interacciones ms fuertes con la fase mvil que con la fase estacionaria eluirn ms rpidamente de la columna (tiempos de retencin menores).
2Peso
Mo
lecu
lar
106
105
104
103
102
Polaridad crecienteInsoluble en agua Soluble en agua
No Polar Inico
No InicoPolar
Adsorcin Reparto Intercambioinico
(Penetrabilidad sobre gel)
(Filtracin sobre gel)
(Repartoen fase inversa)
(Repartoen fase normal)
Exclusin portamao
APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFA DE LQUIDOS
Distintos mtodos son complementarios.
Coeficiente de distribucin K = cS/cM
Velocidad lineal media v = u x ftVelocidad de migracin u
Factor de capacidad de una especie A:
v = u x 1 + KVS/VM
1
tM
tR tMkA =
kA = KA VS/VM
Definiciones
Tiempo de retencin: tM
Factor de selectividad para dos especies A y B
Altura de plato terico H = 2/LN de platos tericos N = L/H
(tR)A tM(tR)B tM = KB/KA = kB/kA =
Conceptos de Altura de Plato Terico y factores que lo afectan como en otras cromatografias.
Velocidades lineales menores que en CG
Eficacia de columnas para HPLC
H = A + B/u + (CS + CM) u (ecuacin de Van Deemter)
Altura de plato menor que en GC (1 orden de magnitud).
Longitud de columnas menor (25 a 50 cm).
3Efecto del tamao de partcula del rellenoCS y CM dP2
Aumento de eficiencia con disminucin del tamao de partcula (tamao usuales entre 2 y 10 m
Ms notorio en Adsorcin y Reparto
24DM
pipipipi r2uHex =
Reduccin del dimetro de tubos a menos de 2.5 mm.
Debido a diferencias de velocidad entre distintas capas del lquido que se desplaza en tubos de inyeccin, de conexin y detectores.
Ensanchamiento extracolumna
Efecto del tamao de muestra
Gradientes no se compensa por difusin.
4Instrumentacin
Elevadas presiones para alcanzar caudales necesarios.
Equipamiento sofisticado y caro.
Mtodo comn: filtracin a vaco a travs de filtro millipore de tamao de poro muy pequeo (eliminacin de gases disueltos y slidos en suspensin).
Recipientes para una o ms fases mvilesDe vidrio o acero de 0.2 a 1 L
Sistemas de pretratamiento de fases mvilesPara eliminacin de gases disueltos y slidos en suspensin
desgasificacin por vacocalentamiento
agitacin
inyeccin de gas de arrastre de baja solubilidad (Helio).Filtros para polvo y partculas slidas en suspensin.
Mejora de resolucin en tiempos de anlisis ms cortos.
: viscosidad: parmetro adimensional (valor cercano a 500 para
columnas bien empacadas)dP: dimetro de partcula del relleno
Cmara de mezcla para disolventes
Sistemas de bombeo
LuP =
dP2
Ventajas de la elucin con gradiente (relacin variable de volmenes de dos o ms disolventes)
Generacin de presiones superiores a 6000 psi.
Cada de presin en una columna:
5Intervalo de caudales entre 0,1 y 10 mL/min
Flujo libre de pulsaciones (minimizacin de errores de medicin)Variaciones menores a 1% son normales
Caudal = Dimetro Pistn*desplazamiento - *P*V-P*compr.sellos y burbujas.
dP
dV
V
1 =
T
Programacin por microprocesadores que corrige desvos
Control y reproducibilidad de caudal mejor al 0,5%.Cambio de volumen de lquidos y sellos al cambiar la contrapresin:
En sistemas de bombeo por jeringa (250 mL) la compresin del solvente (a 400 atm) puede requerir varios mL de desplazamiento del pistn.
Coeficientes de compresibilidad isotermos de algunos solventes usados en HPLC.
185Dietil ter105cloroformo100Isopropanol100n-octano150n-hexano45Agua120Metanol
(10-11Pa-1)Solvente
vara para mezclas de solventes en anlisis con elucin por gradiente
Altas presiones no suponen riesgo de explosin (s riesgo de incendio).
Componentes resistentes a corrosin (juntas de acero inox o tefln).
Desventajas: flujo con pulsaciones.
Bombas recprocas
Las ms utilizadas
Movimiento cclico de uno o ms pistones con vlvulas de entrada y salida.
Elementos compresibles en el circuito atenan variaciones.
2 Pistones es la opcin ms adecuada
Ventajas: pequeo volumen interno (35 a 400 L), altas presiones (>10000 psi), fcil adaptacin a sistemas por gradiente y caudales constantes e independientes de la contrpresin de la columna y viscosidad del disolvente.
6Prdidas en vlvulas
Apagar la bomba y registrar cada de presin en funcin del tiempo (normal < 2 atm/min)
Funcionamiento normal:prdidas pequeas y constantes
Mayor incidencia a bajos caudales (L/min).Fabricantes suministran diagnsticos para deteccin de prdidas
Test para prdidasReemplazo de columna por una vaca de V=1.5 mL
Llenado con disolvente y tapado.
Prender la bomba hasta que la presin alcanza 300 atm.
Desventajas: capacidad de bombeo limitada (0.25 L), poco prctica para reposicin y cambio de disolvente.
Bombas de desplazamiento
Cmara con un mbolo impulsado por un motor
Ventajas: flujo libre de pulsos, independiente de viscosidad y contrapresin
No sirven para elucin con gradiente.
Programa de Ordenador
Bombas neumticas
Control de caudal
Ventajas: baratasExentas de impulsosDesventajas:Capacidad limitada y de presin de salida.Caudal dependiente de la viscosidad del disolvente y de la contrapresin.
Presiones menores a 2000 psi.
Medicin de caudal mediante cada de presin a travs de un tubo en la salida de la bomba.
Volmenes de bucles entre 0,5 y 500 L.
Sistema de inyeccin de muestra
Volmenes pequeos para evitar ensanchamiento de picos (dcimas de L a 500 L).Inyeccin manual.Sencilla
Evitar despresurizacin (microjeringas capaces de resistir 1500 psi).Inyecciones a flujo detenidoReproducibilidad: dispersin 2%-3% o mayor
Inyeccin con buclesVentajasInyeccin a presiones de hasta 7000psiPrecisin de dcimas por ciento.
7Columnas de alta eficacia de menores dimensiones con hasta 100000 platos/metro.
Columnas
Tubos rectos de acero inoxidable
Tubos de vidrio hasta presiones de 600 psi
Longitud entre 10 y 30 cm
Acoplables
Dimetro interno entre 4 y 10 mm
Tamaos de partculas entre 5 y 10 m
Columnas comunes: longitud 25 cm, dimetro interno 4.6 mm, relleno de partculas de 5 m: 40000 a 60000 platos/metro
Columna termostatizada
Precolumnas
Eliminacin de materia en suspensin y componentes que se unen irreversiblemente al relleno.
Saturacin del solvente con la fase estacionaria (minimiza prdidas de relleno.
Tamao de partcula mayor al de la columna
Entre temp. ambiente y 100-150C.Partculas porosas.
Bolas de vidrio o polmero, no porosas y esfricas con dimetrosentre 30 y 40 m.
Rellenos
Recubrimiento con pelculas orgnicas unidas qumicamente o fsicamente.
Micropartculas porosas con dimetro entre 3 y 10 m.
Ampliamente utilizados en precolumnas
Tratamientos qumicos para mejorar fijacin.
Recubrimiento con una capa delgada y porosa de distintos compuestos y recubrimiento adicional de fase estacionaria lquida y retenida por adsorcin.
Pelicular:
Preparadas por aglomeracin a partir de partculas pequeas.
8slice, almina, resinas de poliestireno. divinilbenceno o carbohidratos.
Materiales ms utilizados como soportes
Parmetros qumicos. Polaridad, acidez-basicidad, estabilidad frente a solventes y pH, reactividad superficial.
Parmetros fsicos: porosidad, tamao de poro, tamao y rigidez de partcula, tamao.
Detectores de diodos permiten recoger el espectro completo en 1 segundo (cromatografa tridimensional.
Detectores
Propiedades de la fase mvil (Indice de Refraccin, constante dielctrica, densidad)Propiedades del soluto (absorbancia, fluorescencia, corriente lmite).
Detectores de absorbancia (71%)Volumen de 1 a 10 L, longitud de 2 a 10 mmPresiones < 600 psi (necesitan reductores de presin)Dispositivos de doble haz (los ms comunes)Seal proporcional al Log I/IoFiltros (longitudes de onda determinados)Monocromadores (redes de difraccin)(UV y Visible)Cromatogramas a una fija o variable segn el analito.Barrido de para un analito con detencin de flujo
9Limitacin: baja transparencia de los disolventes (agua, alcoholes)
Tratamiento previo para dar derivados fluorescentes.
Detectores de absorbancia en el infrarrojoBarrido de entre 2.5 y 15 mCubetas con ventanas de NaCl o CaF2, long. 0,2 y 1,0 mm, volumen 1,5 a 10 L.
Detectores de fluorescenciaDetector colocado perpendicularmente al haz de excitacinFuente de excitacion
de Hg y filtrosXenn y monocromador de redlser sintonizables en desarrollo
Alta sensibilidad (materiales de inters farmacutico, clnico, productos naturales y del petrleo).
10
Menor sensibilidad que otros detectores.
Detectores de ndice de refraccinDetector universalNo dependen del caudalRobustosSensible a cambios de temperatura
Electrodo indicador de platino, oro, carbn vtreo o pasta de carbono, electrodo de referencia y contraelectrodo se colocan ms adelante en el canal de flujo.
Detectores electroqumicosElevada sensibilidad, sencillez, extensa aplicabilidad
11
Espectros de impacto electrnico
Detectores por espectrometra de masas
Sistemas para introduccin de la fase mvil en cmara de vaco
Introduccin directa de una pequea cantidad de lquido
Vaporizacin previa de solvente y posterior desorcin-ionizacin de solutos.
Termovaporizador-ionizador
Aplicable a compuestos termoestables y no voltiles (pptidos, nucletidos.
Efecto de la longitud de cadena en eficacia de columnas de siloxano en fase inversa (Figura 28.15 Skoog).pH
12
Slice hidrolizada con HCl 0.1 M en caliente durante uno o dos dasmol/m2 de grupos OH
Inmovilizacin qumica (90% de rendimiento)
siloxanoorganoclorosilanoslice
OHSi + X Si (CH2)n L OSi Si (CH2)n L
n = 8 o 18
L: metil, amino, carboxil, ciano, diolRecubrimiento mximo 4 mol/m2 de grupos.Silanos residuales se desactivan con clorotrimetilsilano
Relleno polar (agua o trietilenglicol soportado sobre slice o almina y fase mvil apolar.
Solventes no polares (etilter, cloroformo y n-hexano).
Rellenos tipo siloxano para fase normal: amino (C3H6NH2) (los ms polares) diol (C3H6OCH2CHOHCH2OH) (polaridad intermedia) dimetilaminopropil (C3H6N(CH3)2) (polaridad intermedia) ciano (C2H4CN) (los menos polares)
Ecuacin de Soczewinski: ln ki = ln ki(2) Si lnx2X2: fraccin molar del componente de ms polaridad
Competencia del disolvente y del analito por el relleno es determinante de los factores de retencin.
Cromatografa de fase normal
Cambios de solvatacin del analito en el disolvente es determinante de cambios de factores de retencin.
Cromatografa de fase inversaFase estacionaria no polar (hidrocarburo) y fase mvil polar (agua, metanol, acetonitrilo).
Cambio de 2 unidades en P cambio de k en un factor de 10
k1
(P1 P2)/2= 10
k2
Criterios de seleccinPolaridad de la fase estacionaria similar a la de los analitos. (Evitar tiempos de retencin muy altos).Fase mvil con polaridad distinta a la fase estacionaria
Polaridad creciente:
Hidrocarburos < teres < steres < cetonas < aldehdos < amidas < aminas < alcoholes < agua
k (factor de retencin) entre 2 y 5Indice de polaridad P de Synder (J. Chromatog. Sci 1978, 16, 223)Para una mezcla de solventes A y B: P = APA + BPB
A B: fracciones en volumenPA, PB: ndices de polaridad
13
Selectividad En fase inversa se ajusta con 3 disolventes: metanol, acetonitriloy tetrahidrofurano. Agua para ajustar k.En fase normal se ajusta con etilter, cloruro de metileno y cloroformo, nhexano para ajustar k.
Formacin de derivados1) Reduccin de polaridad que haga posible el uso de
cromatografa de reparto2) aumento de respuesta del detector3) aumento de selectividad de la respuesta
Cromatografa de pares inicosFase mvil: agua + disolvente orgnico (metano o acetonitrilo + compuesto inico con contrain de carga opuesta a la del analito.Contrain forma un par inico con el analito: especie neutra retenida por el relleno de fase inversa.
Cromatografa con fases estacionarias quiralesMs apropiada en HPLC que en CGRelleno recubierto con un ismero pticamente activo.
cidos biliares, metabolitos de drogas, extractos de orina, estrgenos.
Medicina clnica
Drogas, venenos, alcohol en sangre, narcticos
Qumica forensePesticidas, herbicidas, fenoles, PCBContaminantes
Aromticos condensados, tensioactivos, propulsores, colorantes
Productos de la industria qumica
Edulcorantes artificiales, antioxidantes, aflatoxinas, aditivos
Productos de alimentacin
Aminocidos, protenas, carbohidratos, lpidos
Bioqumica
Antibiticos, sedantes esteroides, analgsicos
FrmacosMezclas tpicasCampo
Aplicaciones de la Cromatografa de Reparto
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Cromatografa de Adsorcin (Lquido-slido)Fases estacionarias: slice y alminaSeleccin del disolventeFuerza del disolvente 0 (energa de adsorcin por unidad de superficie).0 vara no linealmente con la relacin de volmenes de dos disolventes.
Eleccin de disolventesUn aumento de 0.05 unidades de 0 disminuye k en un factor de 3-4.Cambios de se logran por ensayos previos con distintos disolventes.Ensayos por cromatografa de capa fina Aplicaciones de la cromatografa de adsorcinPara compuestos no polares con masa molecular < 5000Compuestos con solubilidad limitada en disolventes acuososComplementario con RepartoSepara ismeros
Equilibrio de intercambio entre iones de la fase mvil y iones del mismo signo en la superficie de la fase estacionaria (resinas deintercambio).
xRSO3-H+ + Mx+ (RSO3-)x + xH+slido disolucin slido disolucin
xRN(CH3)3 OH- + Ax- [RH(CH3)3+]xAx- + xOH-slido disolucin slido disolucin
Primera etapa: adsorcin de iones en la cabeza de la columnaSegunda etapa: elucin de iones adsorbidos con una disolucin diluida de cido clorhdrico.
Cromatografa inica
[RSO3-H+]s[B+]ac[RSO3-B+]s[H+]ac
KII =
[RSO3-H+]s[H+]ac
= KII[RSO3-B+]s
[B+]ac
[H+]ac y [RSO3-H+]s >> [B+]
CSCM
= KII =[RSO3-B+]s
[B+]ac
Kex alta tiempo de retencin elevadoTl+ >Ag+>Cs+>Rb+>K+>NH4+>Na+>H+>Li+
Ba2+>Pb2+>Sr2+>Ca2+>Ni2+>Cd2+>Cu2+>Cp2+>Zn2+>Mg2+>UO22+
SO42->C2O42->I->NO3->Br->Cl->HCO2->CH3CO2->OH->F-
RellenosPartculas esfricas porosas copolmeros de estireno y divinilbenceno (8%) emulsionados (estables entre pH 0 y 14).Activacin por grupos cidos (sulfnico) o bsicos (aminas cuaternarias).Nuevos desarrollos: partculas esfricas (30 a 40 m), no porosa, de vidrio o polmero, recubierta con resina de intercambio inico (menor difusin)
Fase mvilDisoluciones acuosas con metanol u otros disolventes orgnicos y especies inicas para formar un buffer.
Cromatografa inica con columnas supresorasElectrolito eluyente enmascara la respuesta del Detector de conductividad a los iones del analito.
15
Columna supresora convierte iones de la fase mvil en especies poco ionizadasEjemplo: H+(ac) + Cl-(ac) + Resina+OH-(s) Resina+Cl-(s) + H2O
Na+(ac) + HCO3-(ac) + Resina-H+(s) Resina-Na+(s) + H2CO3 (ac)
Bomba
Eluyente NaOH
NaBrNaOHNaClNaF
HBrH2OHClHF
Columna separadoraResina+OH-(s)
Columna supresoraResina-H+(s)
NaBr, NaCl, NaF, NaOH (diluyente)
Inyector
Detector
Residuos
Con
duct
anci
a
Tiempo
Sistema para separacin de analitos aninicos usando columna supresora
Cromatografa inica con una sola columna: deteccin debida a pequeas diferencias de conductividad entre iones del analito y del eluyente.Mtodo fotomtrico para deteccin de iones no absorbentes (figura 28-24
Regeneracin (cada 8 10 horas)Desarrollo reciente de supresores de membranas supresoras de intercambio inico con regeneracin continua: alta velocidad de intercambio.
Aplicaciones orgnicas y bioquimicasAminocidos, vitaminas, azcares y preparaciones farmacuticas, alimentos. (figura 28-25)Cromatografa de exclusin de iones (para cidos dbiles)Fase mvil: solucin acuosa de HCl diluidoFase estacionaria: resina de intercambio catinico en su forma cidaColumna supresora de resina catinica con Ag para supresin de contribucin inica del eluyente.Para cidos y bases dbiles (y sus sales): coeficientes de distribucin se relacionan inversamente con las constantes de disociacin.Aplicaciones a especies cidas en leche, caf, vino, etc.
16
Para masas moleculares elevadasRelleno: partculas polimricas con una red de poros uniforme (10 m) en los que pueden difundir molculas del soluto y del disolvente.Tiempo de residencia depende del tamao efectivo de las molculas. Molculas ms grandes no se retenidas y eluyen primero.Separacin por tamao, no implica interacciones qumica o fsica con el relleno.
Rellenos de slice: retienen por adsorcin y catalizandescomposiciones. Se modifican por sustituyentes orgnicos (sililacin).Rellenos de copolmeros estireno-divinilbenceno: hidrofbicos.
Cromatografa de exclusin por tamao Propiedades de los rellenos comerciales tpicos para la cromatografa de exclusin por tamao
(0.2 a 5) x 104(0.03 a 1) x 105(0.05 a 5) x 105(5 a 20) x 105
1253005001000
10Slice
700(0.1 a 20) x 104(1 a 20) x 104
(0.1 a 20) x 105(5 a >10) x 106
102103104105106
10Poliestireno-divinilbenceno
Lmite de exclusin en peso molecular
Tamao promedio de
poro, A
Tamao de partculam
Tipo
TeoraVt = Vg + Vi + VoVt: volumen total de la columnaVg: volumen ocupado por matriz slida del gelVi: volumen del disolvente retenidoVo: volumen libre exterior
Volumen de elucin = Vo: analitos no retenidosVolumen de elucin = Vo + K Vi analitos de tamao intermedio (K entre 0 y 1).Lmite de exclusin: peso molecular por encima del que no existe retencin.Lmite de penetracin: peso molecular por debajo del cual las molculas pueden penetrar completamente en los poros.
AplicacionesFiltracin sobre gelDisolventes acuosos y relleno hidroflicosPenetrabilidad sobre gel: disolventes orgnicos no polares y rellenos hidrofbicos.Separacin de productos naturales de alto peso molecular.Separacin de homlogos y oligmerosDeterminacin de la distribucin de pesos moleculares en polmeros o productos naturales (comparacin con patrones).VentajasTiempo de separacin cortos y bien definidos (entre Vo y Vo+Vi)Bandas estrechasNo hay prdida de muestraNo hay desactivacin de la columna
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DesventajasNmero limitado de bandas No diferencia compuestos de tamao semejante (ismeros)
Cromatografa de Capa Fina (cromatografa bidimensional)
Capa delgada de un Soporte inmovilizado sobre una superficie plana de vidrio, plstico o metal.Fase mvil se mueve por capilaridad, por gravedad o por un potencial elctrico.Otras modalidades menos usadas (en papel, electrocromatografa)Caractersticas: Rapidez y Bajo costo. Aplicaciones:Ensayos previos a los de columnaControl de pureza en la industria.