Cromatografa de exclusin molecular o filtracin en gel:

Objetivo: Separacin de protenas por cromatografa en columna segn el tamao y la forma. Fundamento: La cromatografa es una tcnica que permite la separacin de molculas diferentes presentes en una misma muestra. El mtodo est basado en la circulacin de una fase mvil (que arrastra a la mezcla de compuestos a separar), a travs de una fase estacionaria. Dependiendo de la afinidad relativa que por ambas fases tengan los distintos compuestos presentes en la mezcla resultar su separacin. La cromatografa de exclusin molecular (a menudo tambin llamada filtracin en gel o de tamiz molecular) es una tcnica empleada en la separacin de protenas y cidos nucleicos. Este tipo de cromatografa se realiza en columnas cilndricas rellenas con algunos de los geles que se fabrican con este fin y que pueden ser de varios tipos: dextranos con enlaces cruzados (sephadex), poliacrilamida, agarosa, difiriendo cada uno de ellos en el valor de su lmite de exclusin, siendo stos entre 0,7 y 800 kD, 0,2 y 400 kD y hasta 40.000 kD respectivamente. Todos estos geles (fase estacionaria) se hallan constituidos por grnulos de un material esponjoso hidratado, que contiene poros con un dimetro determinado. Cuando se hace pasar una mezcla de molculas de distinto tamao, a travs de una columna de filtracin en gel; aquellas molculas con un tamao mayor que el dimetro de los poros de las partculas, slo podrn moverse en su camino, a travs de la fase estacionaria, en el espacio que queda entre las partculas; y por lo tanto, no se vern retrasadas en su descenso. En cambio aquellas molculas capaces de penetrar en las partculas se vern retrasadas por la fase estacionaria; en mayor medida, cuanto menor sea su tamao. Por lo tanto, las molculas eluyen en este tipo de cromatografa por orden decreciente de tamao molecular. Tcnica: Se empaqueta el gel dentro de la columna: con la columna cerrada se coloca una pequea cantidad de un buffer adecuado (pH 7) y luego se aade lentamente la cantidad necesaria del gel previamente hidratado en el mismo buffer, evitando la formacin de burbujas de aire dentro de la columna. Colocando un recipiente debajo, se lava la columna y se regula la velocidad de flujo. A continuacin, se marcan diferentes tubos en los que se recoger la muestra eluda y se procede a la elucin de la columna. Para ello, se deja que la columna gotee hasta eliminar el buffer de la parte superior del gel y, posteriormente, se siembra la muestra sobre el mismo, previamente teida con un colorante apropiado, con pipeta Pasteur dejando gotear nuevamente hasta que toda la solucin del analito ingrese en el gel. Por encima de la siembra se deja goteando el solvente de elucin desde una ampolla de decantacin para lograr la corrida de la muestra y evitar la deshidratacin de la fase estacionaria.

Se recogen las distintas fracciones del eludo en los tubos numerados, logrando as la separacin por tamao de las molculas contenidas en la muestra. Debemos recordar que previo a realizar la experiencia con nuestra muestra problema se debe llevar a cabo la calibracin de la columna cromatogrfica. Esto se hace con una elucin que contenga molculas de peso molecular conocido, coloreadas y con el buffer a utilizar.

a) Grnulo del gel, puntos rosados: partculas pequeas. Puntos azules: Partculas de mayor tamao.

b) Sembrado de la muestra. c) Y d) Elucin de las partculas segn su tamao. d) Diagrama de elusin: cromatograma.

Factores que influyen en la separacin: - Longitud de la columna. La capacidad de separacin de sustancias de diferente tamao aumenta con la longitud de la columna. - Flujo. La resolucin de la separacin disminuye al aumentar el flujo del lquido con que son arrastradas las molculas a lo largo de la columna. Normalmente el flujo oscila entre 2 y 10 cm h-1. - El volumen de la muestra a cromatografiar debe ser pequeo comparado con el volumen total de la columna. Las mejores separaciones se obtienen aplicando volmenes de muestra iguales o menores al 5% del volumen total. - Empaquetado del gel en la columna. Las propiedades separadoras del gel se alteran profundamente, e incluso desaparecen, cuando un gel no est empaquetado homogneamente en la columna o se encuentra excesivamente comprimido.

Interpretacin de resultados: Puede caracterizarse cuantitativamente el comportamiento de una molcula sobre una columna de gel particular. Si : VX =volumen ocupado por los grnulos del gel. V0 =volumen vacio (volumen de disolvente del espacio que rodea los grnulos). Vt =volumen del lecho total de la columna Vt = V0 + Vx V0 es tpicamente 35% de Vt aproximadamente. El volumen de elucin de un soluto determinado Ve es el volumen del disolvente necesario para eluir el soluto desde la columna luego de ser sembrado. El volumen vaco de una columna se mide como volumen de elucin de un soluto cuya masa molecular es mayor que el lmite de exclusin del gel. Por lo tanto, la relacin Ve/V0 (volumen de elucin relativo) es caracterstica de cada soluto sobre un gel determinado, ya que dicha relacin es independiente de la columna utilizada. Una vez recogidas todas las muestras, se mide su absorbancia en el espectrofotmetro, calculando con esto la concentracin (ley de Lambert- beer). Luego se realiza el cromatograma, indicando en el eje de las abscisas el volumen de elucin y en el eje de las ordenadas la concentracin.

Aplicaciones: Determinacin del peso molecular de protenas: al existir una relacin lineal entre el volumen de elucin relativo de una sustancia y el logaritmo de su masa molecular en un intervalo considerable de masas moleculares, pueden graficarse dichos valores para una determinada columna de filtracin con gel empleando macromolculas de masas moleculares conocidas y as determinar la masa molecular de una sustancia desconocida por su posicin en la curva. La precisin de esta tcnica depende de la validez de la hiptesis implcita de que las macromolculas, la conocida y la desconocida, tienen forma idntica.

Desalado de protenas: una protena precipitada, por ejemplo, con sulfato de amonio puede liberarse con facilidad de la sal por disolucin del precipitado en un volumen mnimo de buffer adecuado y sembrando esta solucin en una columna de gel con un lmite de exclusin inferior al de la masa molecular de la protena. As, por elucin de la columna, la protena preceder al sulfato de amonio pudiendo as separarlos.

Purificacin de macromolculas: esta tcnica es til durante la etapa final de los procesos de purificacin de protenas, por ejemplo.

Separacin de sustancias de diferentes pesos moleculares. Bibliografa: Biochemistry Voet-Voet Principios de Bioquimica Lehninger

Integrantes: Almeyda Daiana, Boccadelli Barbara, Buzzatto Micaela, Dinni Florencia, Echeverria Carla, Jimenez Elisa, Nabaes Mercedes, Nacir Amira, Peucelle Carla, Ponce Eliana, Rodriguez Catherine, Valdez Joaqun.