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São Paulo 2015
Tese apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Biologia Celular e
Tecidual do Instituto de Ciências
Biomédicas da Universidade de São
Paulo para obtenção do Título de Doutor
em Ciências.
CARLA LETÍCIA BANDEIRA
CRIPTO1: Expressão e Possíveis Ações sobre as Células
Citotrofoblásticas Extravilosas Humanas
São Paulo
2015
Tese apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Biologia Celular e
Tecidual do Instituto de Ciências
Biomédicas da Universidade de São
Paulo para obtenção do Título de Doutor
em Ciências.
Área de Concentração: Biologia Celular e
Tecidual
Orientadora: Prof. Dra. Estela Maris
Andrade Forell Bevilacqua
Versão Original
CARLA LETÍCIA BANDEIRA
CRIPTO1: Expressão e Possíveis Ações sobre as Células
Citotrofoblásticas Extravilosas Humanas
Aos meus queridos pais, Maria Cleni e Walter Eugênio Bandeira, meus maiores
exemplos de dignidade e força - os “gigantes” que me fizeram ser quem sou. Com
eterno amor e gratidão - por vocês e a vocês - eu dedico esta tese!
À minha orientadora Prof. Dra. Estela Bevilacqua,
"Cada pessoa que passa em nossa vida passa sozinha,
é porque cada pessoa é única e nenhuma substitui a outra.
Cada pessoa que passa em nossa vida passa sozinha, mas não nos deixa sós,
Porque deixa um pouco de si e leva um pouquinho de nós.
Essa é a mais bela responsabilidade da vida, e a prova
de que as pessoas não se encontram por acaso”.
Meu eterno carinho, gratidão e admiração para a pessoa que nos últimos anos foi
minha orientadora, mãe, e amiga acima de tudo. Que muitas vezes, além de me
ensinar o caminho da pesquisa, também me ensinou o caminho da vida; o presente de
Deus sem o qual eu não teria conseguido superar muitos obstáculos encontrados longe
de casa. À ti, sempre, minha sincera amizade e respeito.
AGRADECIMENTOS
“Se consegui ver mais longe é porque estava em ombros de gigantes”, célebre
frase de Isaac Newton me soa muito bem ao escrever estes agradecimentos. O grande
pesquisador nunca teria desenvolvido seu trabalho sem o trabalho prévio de outros
físicos; eu certamente nunca teria desenvolvido o que sou sem meus amigos e
colegas. Nesses anos, muitas pessoas queridas fizeram parte do meu dia a dia,
algumas muito, outras nem tanto, mas todas adicionaram um pouco de si à minha
história, e por isso, eu agradeço do fundo do coração!
Obrigada meu grande amigo Fábio Siviero, pelas conversas, risadas e
conselhos. Se uma tese tivesse co-autoria, ela certamente seria sua! Você é meu irmão
do coração; meus dias são melhores quando você está por perto!
Obrigada aos meus colegas e amigos do Trofo’s Lab – Ying, Simone, Jusciele,
Karen, Karla, Aline Carvalho, Carolzinha, Aline Paixão, Aline Lorenzon, Rodrigo, Prof.
Sérgio, Sônia, Mara, Elaine... sem vocês este trabalho não teria se concretizado! Em
especial, meu muito obrigada à duas pessoas maravilhosas, que me ensinaram a ter fé
– na vida, em Deus, em mim – Sara e Rosangela Farias, vocês são dádivas para mim!
Obrigada aos meus irmãos, que mesmo longe, sempre torceram pelo meu êxito.
Amo vocês Camila e Rafael Bandeira.
Obrigada Douglas Zago, por sempre estar disposto a sanar dúvidas histológicas
com um primor inigualável. Suas explicações eram sempre “SHARPES”!
Obrigada, e mais e mais obrigada ao meu grande amigo Rubens Harbs Bollos,
que além de cuidar da minha saúde, cuidou da minha alma. Posso dizer, sem dúvida
nenhuma, que meu amigo Rubens é um dos responsáveis por eu ter crescido e me
tornado uma pessoa melhor. Rubens, minha sincera gratidão à você!
Obrigada às duas “vizinhas” mais especiais que alguém poderia ter: Gláucia e
Paula. Vocês fizeram a minha pós-graduação, tantas vezes enfadonha, muito mais
colorida. Obrigada pela amizade, pelos conselhos metodológicos e por me abrigarem
em seu laboratório tantas vezes. Meu agradecimento também aos demais amigos do
laboratório de biologia celular, em especial ao Evandro, Marcel, Marlene, Jorge, Adam,
Bia e Bianca.
Obrigada à meus mais novos colegas e amigos da Igenomix, que me receberam
mesmo em vésperas de fim de tese, e que sempre me deram apoio nos momentos em
que precisei me ausentar. Juciane, Érika, Márcia, Bruno e Mariane, é muito bom poder
conviver com vocês! Em especial, gostaria de deixar meu agradecimento ao Bruno e à
Mariane, dois professores excepcionais, que têm me feito aprender não apenas sobre
laboratório clínico, mas sobre companheirinsmo.
Obrigada aos meus amigos de toda a vida, Juliana, Morgana e Eduardo – vocês
são a certeza de que amizades verdadeiras nunca acabam, mesmo à dsitância.
Obrigada aos meus amigos queridos do “Altos” – vocês foram uma grata
surpresa nesse ano de 2014, verdadeiros presentes. Tati, Alex, Ana, George, Rogério,
Rafa e Luis, a gente não faz amigos, reconhece-os. Sou mais completa por ter amigos
como vocês! Em especial, gostaria de agradecer à ajuda do Rafael, que
exaustivamente me ajudou com a correção das referências bibliográficas dessa tese –
obrigada Nego!
Obrigada à Sra. Tereza, a “Teca da biblioteca”, por ter me recebido fora do seu
horário e por toda paciência e dedicação na correção desta tese.Também agradeço à
dedicação da Mônica.
Por fim, agradeço ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e
Tecidual do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo (ICB-USP),
aos demais funcionários da Biblioteca do ICB, pelo trabalho para que nossas teses
sejam finalizadas, e ao CNPq pelo auxílio financeiro.
A todos que direta ou indiretamente contribuíram para que este trabalho fosse
realizado, meus sinceros agradecimentos.
“Se consegui ver mais longe é porque estava em ombros de gigantes”.
Isaac Newton
RESUMO
BANDEIRA, C. L. CRIPTO1: Expressão e Possíveis Ações sobre as Células
Citotrofoblásticas Extravilosas Humanas. 2015. 118 f. [Tese (Doutorado em Biologia
Celular e Tecidual)]. Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, São
Paulo, 2015.
CRIPTO1 (CR1) é um membro da família de proteínas de fatores de crescimento
epidermal-CRIPTO-1/FRL-1/Cryptic (EGF-CFC) que desempenha funções específicas
durante o desenvolvimento embrionário e tumoral. No primeiro caso, atua como co-
receptor obrigatório para Nodal no correto estabelecimento de eixos embrionários. No
segundo, constatou-se que é secretado em altos níveis por diversos tipos de cânceres
humanos (cólo, mama, pulmão, testículo, ovário, pâncreas e estômago entre outros),
mas está ausente ou é pouco expresso em tecidos saudáveis. Nesse sentido, este
estudo buscou verificar a presença de CR1 em placentas saudáveis e com distúrbios
de invasividade, visto que o desenvolvimento do trofoblasto na interface materno fetal
assemelha-se em muitos aspectos ao processo oncogênico. Nossos resultados
mostraram um padrão de expressão distinto entre primeiro e terceiro trimestre de
gestação, com a presença de CR3 e CR1, respectivamente. Coriocarcinomas também
foram imunorreativos para a proteína, que ainda mostrou ter uma relação positiva com
o acretismo placentário. Nossos estudos in vitro mostraram que CR1 recombinante tem
ação indutora em células HTR8/SV-neo, aumentando significativamente a invasão e
migração, sendo este último processo expressivamente abolido na presença de RNA
de interferência. Concluindo, CRIPTO1 está expresso principalmente em células
citotrofoblásticas extravilosas na gestação normal no primeiro e terceiro trimestre de
gestação. No primeiro trimestre a distribuição desta expressão em células em processo
de diferenciação em células invasivas sugere uma participação nesses processos. Em
placentas acretas com aumento da invasividade trofoblástica além dos limites
endometriais, há um aumento da expressão desse fator, que também é encontrado em
células citotrofoblásticas malignas em coriocarcinomas. A imunolocalização de
CRIPTO1 nessas amostras sugere fortemente a participação desse fator em atividades
funcionais das células trofoblásticas, tais como invasividade e diferenciação. O
aumento da migração dessas células após tratamento com CRIPTO1 e a atenuação
desse processo em células com o gene CRIPTO silenciado experimentalmente
corroboram a ação dessa proteína sobre as células trofoblásticas. Este estudo contribui
para a identificação de fatores associados com a invasividade trofoblástica em
condições normais e patológicas.
Palavras-chave: Placenta. Trofoblasto. CRIPTO1. Acretismo Placentário. Coriocarcinoma. Invasão.
ABSTRACT
BANDEIRA, C. L. CRIPTO1: Expression and Possible Actions on Human
Extravillous Cytotrophoblastic Cells. 2015. 118 p. [Ph.D. thesis (Cell and Tissue
Biology)]. Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, São Paulo,
2015.
CRIPTO1 is a member of the family of proteins of the epidermal growth factor -
CRIPTO1 / FRL1 / Cryptic (EGF- CFC) that performs specific functions during
embryonic development and tumor. In the first case, it acts as required co-receptor for
Nodal in the correct establishment of embryonic axys. In the second case, it was found
that it is secreted at high levels by a variety of human cancers (colon, breast, lung,
testis, ovary, pancreas and stomach etc.), but is absent or is weakly expressed in
normal tissues. Therefore, this study was to ascertain the presence of CR1 in healthy
placenta and those with invasiveness disorders, since the development of trophoblast in
maternal fetal interface resembles in many ways the oncogenic process. Our results
showed a pattern of distinct expression between first and third trimester of pregnancy,
with the presence of CR3 and CR1, respectively. Choriocarcinoma were also
immunoreactive for the protein, which still showed a positive relationship with the
placenta acreta. Our in vitro studies have shown that recombinant CR1 has inducing
action in HTR8/SV-Neo cells, significantly increasing the invasion and migration, the
latter process is significantly abolished in the presence of RNA interference. In
conclusion, CRIPTO1 is expressed mainly in extravillous cytotrophoblast cells in normal
pregnancy in the first and third trimester of pregnancy. In the first trimester the
distribution of this expression in the process of differentiation in cells in invasive cells
suggests a role in this process. In placenta acreta with the increased of the
trophoblastic invasiveness besides the endometrial limits, there is an increased
expression of this factor, which is also found in malignant choriocarcinoma
cytotrophoblast cells. The immunolocalization of CRIPTO1 in these samples strongly
suggests the involvement of this factor in functional activities of trophoblast cells, such
as invasiveness and differentiation. The increase in migration of these cells after
treatment with CRIPTO1 and the attenuation of this process in cells with CRIPTO gene
silenced confirm experimentally the action of this protein in the trophoblastic cells. This
study contributes to the identification of factors associated with trophoblast invasiveness
in normal and pathological conditions.
Keywords: Placenta. Trophoblast. CRIPTO1. Placenta Acreta. Choriocarcinoma.
Invasion
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Esquema da estrutura da proteína CRIPTO 1 humana. ..........................................26
Figura 2. - Ação parácrina de CR1 sobre a angiogênese tumoral. ...........................................29
Figura 3. Imunolocalização de CRIPTO 1 em Placentas de Primeiro Trimestre e
Coriocarcinoma Placentário ......................................................................................................63
Figura 4 - Caracterização Histológica de Placentas Saudáveis e Acretas ................................65
Figura 5 - Imunolocalização de CRIPTO1, Citoqueratina7 e Vimentina em Placentas a Termo
de Gestações Saudáveis ..........................................................................................................67
Figura 6 - Imunolocalização de CRIPTO 1, Citoqueratina7 e Vimentina em Placentas Acretas69
Figura 7 - Expressão Gênica e Proteica de CRIPTO 1 e 3 em Células Placentárias Primeiro e
Terceiro Trimestre de Gestação ................................................................................................71
Figura 8. Imunolocalização de CRIPTO nas Células HTR8-SVneo ..........................................72
Figura 9. Expressão Gênica de CRIPTO em Células HTR8-SVneo Tratadas com CR1
Recombinante ...........................................................................................................................74
Figura 10. Efeito da Depleção do Soro sobre a Expressão Proteica de CRIPTO1 ...................75
Figura 11 - Efeito de CRIPTO1 Recombinante Sobre a Proliferação de Células HTR8 ............76
Figura 12 – Efeito do Tratamento com CRIPTO Recombinante sobre Morte e Viabilidade das
Células HTR8/SV-neo ...............................................................................................................78
Figura 13 – Efeito de CRIPTO1 Recombinante sobre a Migração das Células HTR8 ..............80
Figura 14 – Efeito do Tratamento com CRIPTO1 Recombinante sobre a Atividade Invasiva das
Células HTR8 ...........................................................................................................................81
Figura 15 – Gel Representativo do dos Produtos de PCR após o Silenciamento do Gene
CRIPTO ....................................................................................................................................82
Figura 16 – Efeito do Silenciamento de CRIPTO sobre a Migração das Células HTR8/SVneo 84
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Classificação das DTGs segundo a Organização Mundial da Saúde .......................36
Tabela 2 - Primers utilizados para a reação em cadeia da polimerase e condições de ciclagem
.................................................................................................................................................50
LISTA DAS PRINCIPAIS ABREVIATURAS E SIGLAS
ALK4/7 - Quinase do Linfoma Anaplásico 4/7
BMP – Proteína morfogênica Óssea
CSF-1 – Fator estimulador de colônia
c-Src - Tirosina-quinase citoplasmática c-Src
CR1/3 – CRIPTO1/3
CTBs – Células citotrofoblásticas de vilo de segundo trimestre de gestação
CTEVs – Células trofoblásticas extravilosas
DEPC – Dietilpirocarbonato
DTT - Ditiotreitol
EDTA - Ácido etilenodiamino tetra-acético
EGF – Fator de crescimento epidermal
EMT – Transição epitélio mesenquimal
GCNF - fator nuclear de células germinativas
GDF – Fator de crescimento e diferenciação
GPI-anchor – âncora de Glicosilfosfatidilinositol
GRP78 – Proteína-78 relacionada à glicose
GSK3β - Quinase 3--glicogênio sintase
HIF1α – Fator induzido por hipóxia
IGF I/II – Fator de crescimento semelhante à insulina I/II
LIF – Fator inibidor de leucemia
LPR 5/6 - Proteína 5/6 relacionada a receptor de lipoproteína de baixa densidade
MAPK - Poteína quinase ativada por mitógeno
MET – Transição mesenquimo-epitelial
NP-40 – Nonyl phenoxylpolyethoxylethanol hCG – Hormônio gonadotrofina coriônica humana
PBS – Tampão fosfato salina
PCR – Reação em cadeia da polimerase
PI3K – Fosfatidilinositol 3 quinase
PGDF – Fator de crescimento derivado de plaqueta
PlGF – Fator de crescimento placentário
PMSF – Phenylmethylsulfonyl fluoride
RE – Retículo Endoplasmático
RNAse – Ribonuclease
SBF – Soro Bovino Fetal
SDS - Dodecil sulfato de sódio
TDGF1 – Fator derivado de teratocarcinoma 1
TGFβ1 - fator de transformação de crescimento beta 1
TBS – Tampão tris fosfato salino
TRIS - Tris(hidroximetil) aminometano
TTBS - Tampão tris fosfato salino + 0,1% Tween 20
uNK – Células Natural Killers uterinas
VEGF – Fator de cresimento endoltelial vascular
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ........................................................................................................... 23
1.1 O fator de crescimento derivado de teratocarcinoma TDGF1 ou CRIPTO1:
Histórico ....................................................................................................................... 24
1.2 Efeitos biológicos associados à expressão de CR1 .......................................... 26
1.3 Vias de Sinalização associadas a CRIPTO 1 ...................................................... 30
1.4 A Placenta como objeto de estudo ...................................................................... 32
1.4.1 Estrutura placentária ............................................................................................ 32
1.4.2 A placenta acreta ................................................................................................. 34
1.4.3 Coriocarcinoma .................................................................................................... 36
2 OBJETIVOS ............................................................................................................... 39
2.1 Objetivo geral ........................................................................................................ 40
2.2 Objetivos específicos ........................................................................................... 40
3 MATERIAIS E MÉTODOS ......................................................................................... 41
3.1 Procedências ......................................................................................................... 42
3.2 Parte 1. Imunolocalização de CRIPTO1 em placentas saudáveis e
comprometidas com distúrbios de invasividade ..................................................... 43
3.2.1 Obtenção das Amostras ....................................................................................... 43
3.2.2 Blocos de Parafina oriundos de Arquivo Médico .................................................. 43
3.2.3 Amostras de Placentas Humanas de Primeiro Trimestre ..................................... 44
3.2.4 Imunolocalização de CRIPTO1, Citoqueratina e Vimentina em Placentas
Saudáveis e Patológicas ............................................................................................... 44
3.2.5 Análise Quantitativa das Reações Imunoistoquímicas ......................................... 45
3.2.6 Análise Estatística ................................................................................................ 46
3.3 Parte 2. Expressão de CRIPTO1 e CRIPTO3 em células do citotrofoblasto
extraviloso de placentas saudáveis e em linhagem de células citotrofoblásticas
HTR8/Sv-neo ................................................................................................................ 46
3.3.1 Obtenção das amostras ....................................................................................... 46
33..33..11..11 OObbtteennççããoo ddee ccéélluullaass ddoo cciittoottrrooffoobbllaassttoo eexxttrraavviilloossoo ddee ppllaacceennttaass aa tteerrmmoo
ssaauuddáávveeiiss ...................................................................................................................... 46
33..33..11..11..11 AApprroovvaaççããoo ddoo pprroottooccoolloo eexxppeerriimmeennttaall ppoorr CCoommiissssõõeess ddee ÉÉttiiccaa.. .................... 46
33..33..11..11..22 CCrriittéérriiooss ddee iinncclluussããoo ee eexxcclluussããoo.. .................................................................... 46
33..33..11..11..33 CCoolleettaa ddaass aammoossttrraass. ..................................................................................... 47
33..33..11..11..44 PPrroocceessssaammeennttoo ddaass AAmmoossttrraass.. ....................................................................... 47
33..33..11..11..55 IIssoollaammeennttoo ddaass ccéélluullaass ddoo CCTTEEVV ddee ppllaacceennttaass aa tteerrmmoo. ................................ 47
33..33..11..11..66 CCéélluullaass cciittoottrrooffoobblláássttiiccaass eexxttrraavviilloossaass ddee pprriimmeeiirroo ttrriimmeessttrree .......................... 48
33..33..11..11..77 CCuullttuurraa ddee CCéélluullaass ddaa LLiinnhhaaggeemm TTrrooffoobblláássttiiccaa HHTTRR88 SSVV--nneeoo........................ 48
3.3.2 Análise da expressão gênica por RT-PCR seguida de PCR ................................ 49
3.3.3 Produto de RealTime q-PCR (Quantitative Polymerase Chain Reaction) ............ 52
3.3.4 Análise da expressão proteica por Western Blotting ............................................ 52
3.3.5 Análise da expressão proteica de CRIPTO1 nas células HTR8 por
imunoistoquímica .......................................................................................................... 54
3.4 Parte 3. Possíveis ações de CR1 nas células HTR8/SVneo por meio de
ensaios de invasão, migração e sobrevivência utilizando a proteína
recombinante CR1 e o silenciamento de CR1 com RNA de interferência. ............. 55
3.4.1Tratamento das culturas de células HTR8-Sv-neo com CRIPTO1........................ 56
3.4.2 Silenciamento do gene CRIPTO1 nas células HTR8 ........................................... 56
3.4.3 Expressão genica para controle do silenciamento ............................................... 57
. ..................................................................................................................................... 57
3.4.3 Estudo da proliferação celular na presença de CR1 recombinante ..................... 57
3.4.5 Estudo da viabilidade, morte e ciclo celular na presença de CR1 recombinante . 58
3.4.6 Análise estatística ................................................................................................ 59
3.4.7 Estudo da migração e invasão das células HTR8 sob o tratamento com CR1
recombinante ................................................................................................................ 59
3.4.8 Estudo da migração e invasão das células HTR8 após silenciamento da
expressão gênica de CRIPTO1 ..................................................................................... 60
4 RESULTADOS........................................................................................................... 61
4.1 Parte 1. Imunolocalização de CRIPTO1 em Placentas Saudáveis e
Comprometidas com Distúrbio Trofoblástico de Invasividade ............................... 62
4.1.1 - Imunolocalização de CR1 em Placentas Normais de Primeiro Trimestre e em
Coriocarcinomas ........................................................................................................... 62
4.1.2 Imunolocalização de Citoqueratina em Placentas Normais de Terceiro Trimestre e
em Placentas Acretas ................................................................................................... 64
4.1.3 Imunolocalização de CRIPTO1 em Placentas Normais de Terceiro Trimestre e em
Placentas Acretas ......................................................................................................... 66
4.2 Parte 2. Expressão de CRIPTO em Células do Citotrofoblasto Extraviloso de
Placentas Saudáveis e em Células Linhagem de Célula Citotrofoblástica HTR8/Sv-
neo ................................................................................................................................ 70
4.2.1 Expressão Gênica de CRIPTO 1 e CRIPTO 3 ..................................................... 70
4.2.2 Expressão Proteica de CRIPTO por Western Blot e Imunoistoquímica ............... 72
4.3 Parte 3. Possíveis Ações de CRIPTO1 nas Células HTR8/SVneo por meio de
Ensaios de Invasão, Migração e Sobrevivência Utilizando a Proteína
Recombinante CR1 e o Silenciamento de CR1 com RNA de Interferência. ........... 73
4.3.1 Tratamento das Culturas de Células HTR8-Sv/neo com CRIPTO1 ..................... 73
4.3.2 Estudo da Proliferação de Células HTR8 na Presença de CR1 Recombinante ... 76
4.3.3 Análise da Viabilidade e Morte das Células HTR8 na Presença de CRIPTO1
Recombinante ............................................................................................................... 77
4.3.4 Ensaios de Migração e Invasão Celular na Presença de CRIPTO1 Recombinante
...................................................................................................................................... 79
4.3.5 Migração das Células HTR8 após Silenciamento da Expressão Gênica de
CRIPTO ......................................................................................................................... 82
4.3.5.1 Silenciamento do gene CRIPTO nas células HTR8 .......................................... 82
4.3.5.2 Migração das Células HTR8.............................................................................. 83
5 DISCUSSÃO .............................................................................................................. 85
5.1 CRIPTO1 em Placentas de Terceiro Trimestre e em Placentas Acretas .......... 86
5.2 CRIPTO1 em Placentas de Primeiro Trimestre e em Coriocarcinoma
Placentário ................................................................................................................... 90
5.3 Expressão de CRIPTO em Células do Citotrofoblasto Extraviloso em
Placentas Saudáveis e em Células da Linhagem Trofoblástica HTR8/SV-neo ...... 92
5.4 Possíveis Ações de CRIPTO1 nas Células HTR8/SVneo por meio de Ensaios
de Invasão, Migração e Sobrevivência Utilizando a Proteína Recombinante CR1 e
o Silenciamento de CR1 com RNA de Interferência. ................................................ 93
6 CONCLUSÕES .......................................................................................................... 98
REFERÊNCIAS .......................................................................................................... 100
1 INTRODUÇÃO
24
1.1 O fator de crescimento derivado de teratocarcinoma TDGF1 ou CRIPTO1: Histórico
O cDNA de CRIPTO, ou oficialmente TDGF1 (fator de crescimento derivado de
teratocarcinoma), foi casualmente isolado em 1989, durante a busca pelo gene da
glicose-6-fosfato desidrogenase em uma linhagem celular indiferenciada de
teratocarcinoma embrionário humano. O gene descrito presumidamente codificava uma
proteína de 188 aminoácidos, com peso preditivo de cerca de 20 kDa e possuía
domínios de ligação semelhantes a fatores de crescimento da família dos EGFs – fato
que fez com que CR1 fosse erroneamente agrupado como um membro da família EGF-
TGFα (CICCODICOLA et al., 1989).
A análise da estrutura genômica de CR1 mostrou que o gene era constituído por
6 éxons e 5 íntrons, possuía uma região UTR terminal típica para a codificação de
moléculas de RNA mensageiro de rápido turnover, com alta instabilidade e vida
relativamente curta. Além disso, dois dos três loops de cisteínas duplas do domínio
EGF de CR1, são truncados, o que impede sua ligação com o receptor de EGF
(BRANDT et al., 1994) ou receptores tirosino-kinases do tipo I da família ErkB, o que
sugere que CR1 não pertence à superfamília EGF (KANNAN et al., 1997). A presença
de um pseudogene transcrito, CRIPTO 3, o qual traduzido, difere de CR1 por apenas 6
aminoácidos também foi descrito (BRANDT, 1994, CICCODICOLA et al., 1989; DONO
et al., 1991).
Em 1993 a forma equivalente de CR1 humano foi descrita em camundongo -
uma proteína preditiva de 177 aminoácidos, com alta homologia em relação ao CR1
humano, porém, associada ao desenvolvimento embrionário (DONO et al., 1993). Na
sequencia desse achado, as proteínas nativas e recombinantes de CR1 (humano e de
camundongo) foram isoladas mostrando modificações pós traducionais - possivelmente
por miristilação, fosforilação e glicosilação. A essas proteínas foi atribuído um papel
mitogênico para células epiteliais mamárias, malignas ou não transformadas (BRANDT
et al., 1994).
Em 1995 foi descoberto o gene FRL1 (“Forming related gene in Leukocytes”),
codificando uma proteína presente durante a gastrulação e estágios iniciais do
desenvolvimento embrionário de Xenopus, hoje conhecido como homólogo de CR1
25
nesses animais, e renomeado como “XCR1”. Como particularidade, o XCR1
apresentou o mesmo domínio “EGF-Like” observado em CR1, além de ativação
mediada por receptores de fatores de crescimento de fibroblastos (FGFR), sem no
entanto, pertencer a classe de ligantes FGF (KINOSHITA et al., 1995).
Shen e colaboradores (1997) identificaram em embriões de camundongo a
presença de um novo gene, “Cryptic”, assim nomeado pela alta similaridade da
proteína preditiva com CR1, propondo então a criação de uma nova família nomeada
“CFC” (Cripto, Frl1 e Cryptic). A inclusão na família CFC era baseada nas similaridades
encontradas nos domínios “EGF-like” e na presença de um segundo domínio
conservado composto por uma região rica em cisteínas (não encontrada em nenhum
outro grupo de proteínas) (SHEN et al., 1997).
Desde sua descoberta até o momento, 6 pseudogenes de CR1 já foram
descritos (SCOGNAMIGLIO et al., 1999; National Center for Biotechnology Information
- NCBI) e estão localizados nos cromossomos 2, 3, 6, 8, 19 e X. Dentre esses, apenas
CR3 (ligado ao cromossomo X) possui ambas regiões UTRs, configurando assim, um
retrogene funcional capaz de traduzir uma proteína com atividade equivalente a de
CR1 em tumores (SUN et al., 2008).
A presença de um domínio EGF-like (domínio EGF modificado), a presença de
um domínio CFC rico em cisteínas, um peptídeo sinal NH2-terminal e um COOH-
terminal pequeno e hidrofóbico contendo pequenas sequências para o ancoramento e
clivagem de glicosilfosfatidilinositol (GPI), são as particularidades da família hoje
denominada “família do fator de crescimento epidermal/CR-1-FRL-1-Cryptic”, ou
simplesmente, família EGF-CFC (BIANCO et al., 2010; SALOMON et al., 2000), que
inclui, além do CRIPTO1 (Figura 1) e CRYPTIC humanos, o Cripto 1 de macacos,
Cripto 1 (Cr1 ou Cfc2) e Cryptic (Cfc1) de camundongo, Cripto 1 de galinha, one-eyed
pinhead (Oep) de zebrafish, e XCR1/FRL-1, XCR2 e XCR3 de Xenopus (CASTRO et
al., 2011). Em humanos, CR1 apresenta duas isoformas, 1 e 2, esta última formando-
se a partir de um splicing alternativo do RNA mensageiro, que origina uma forma mais
curta da proteína (com 172 aminoácidos) (NCBI). Recentemente também se evidenciou
a presença de genes homólogos em invertebrados basais, como o ouriço do mar,
26
indicando que a origem da família EGF-CFC é muito mais antiga do que se pensava,
acumulando pequenas mudanças evolutivas que permitiram a existência de formas
funcionais que se sobrepõem, embora com papéis distintos (RAVISANKAR et al.,
2011).
Figura 1 – Esquema da estrutura da proteína CRIPTO 1 humana.
Figura 1 - Esquema da estrutura da proteína CRIPTO 1 humana. Modificado de Castro et al.,
2011.
1.2 Efeitos biológicos associados à expressão de CR1
A proteína CR1 desempenha um importante papel na regulação de diferentes
processos do desenvolvimento embrionário, além de regular importantes eventos
durante a progressão de determinados tumores (DONO et al., 1993; BIANCO et al.,
2005; MORKEL et al., 2003; STRIZZI et al., 2005). Sua forma cis, ancorada à
membrana, tem ação autócrina e é encontrada em “lipid-rafts” e endossomos. Sua
forma trans, solúvel pela clivagem da âncora GPI por ação da enzima GPI-fosfolipase
27
D, tem ação parácrina. Ambas as moléculas são metabolicamente ativas
(KLAUZINSKA et al., 2014; SALOMON et al., 2000; WATANABE 2007a, 2007b).
Em camundongos, a proteína Cr1 participa de processos de transição epitélio-
mesenquimal (EMT) e mesenquima-epitelial (MET), para formação da mesoderme e
estabelecimento da endoderme, respectivamente. Ainda em camundongos, durante a
formação da linha primitiva, Cr1 apresenta-se sob a forma de um gradiente assimétrico,
que se espraia para o mesoderma embrionário em formação e define um padrão
corporal antero-posterior. O duplo nocaute (Cr1-/-) é letal nos estágios mais iniciais do
desenvolvimento, apresentando ausência de mesoderme e endoderme, com graves
falhas na gastrulação e no estabelecimento de eixos corporais (BIANCO et al., 2010;
DING et al., 1998; DONO et al., 1993; LIGUORI et al., 2008; MORKEL et al., 2003).
Em roedores, ainda no estágio embrionário, o fator Cripto 1 foi localizado no
cone ectoplacentário, sugerindo um papel para Cr1 nos estágios iniciais da placentação
(JOHNSON et al., 1994). Nosso grupo também verificou a expressão de Cr1 em células
trofoblásticas, não apenas no início da placentação, mas em todos os estágios
placentários desde a sua formação até o termo, sugerindo um papel crucial para o fator
no estabelecimento da interface materno fetal (dados não publicados).
Ainda em camundongos, a formação cardíaca pela diferenciação de células-
tronco em cardiomiócitos mediada por Cr1, foi demonstrada in vitro e in vivo.
Experimentos utilizando células-tronco mutantes Cr1-/- foram incapazes de se
transformar em cardiomiócitos funcionais. O fenótipo celular dos cardiomiócitos,
entretanto, foi restituído quando o gene Cr1 foi reintroduzido à linhagem celular
(PARISI et al., 2003). Nesses experimentos também foram identificadas moléculas alvo
da via de sinalização ativada por Cr1, como a via Smad2 (PARISI et al., 2003) e a
regulação positiva de Cr1 pelo fator HIF1α, ligante das regiões de elementos
responsivos à hipóxia (HREs), presentes tanto no promotor do gene de camundongos,
quanto de humanos (BIANCO et al., 2009), a apelina e o receptor acoplado à proteína
G, APJ (D’ANIELLO et al., 2009; XU et al., 1998, 1999).
28
Johnson e colaboradores (1994) observando os padrões de distribuição de Cr1
em embriões de camundongo inferiu sua atuação como um fator de indução ou
sinalização na organogênese cardíaca principalmente em regiões de septos e válvulas.
Similarmente, pacientes com defeitos no septo ventricular apresentaram mutações
específicas no gene CR1 (WANG et al., 2011), denotando uma possível correlação
entre os diferentes modelos estudados em relação à ação proteica.
Estudos também apontam a associação de Cr1 e Nodal no bloqueio da
formação da neuroectoderma em roedores. Diversos autores demonstraram a
diferenciação espontânea em neurônios, in vivo e in vitro, de células tronco Cr1-/- ou
tratadas com peptídeo de bloqueio para Cr1, tornando CR1 um alvo terapêutico para o
tratamento do mal de Parkinson (LIGUORI et al., 2003, 2009; LONARDO et al., 2010;
PARISI et al., 2003; PARISH et al., 2005; SONNTAG et al., 2005).
Trabalhos recentes também demonstraram que a forma solúvel de CR1 liga-se
na membrana celular à proteína 78 regulada pela glicose (GRP78), resultando na
manutenção de células tronco hematopoiéticas, mamárias adultas e fetais (MIHARADA
et al., 2011; SPIKE et al., 2014).
A expressão de Cr1 foi evidenciada nas células mesenquimais precursoras dos
botões terminais das glândulas mamárias em formação (STRIZZI et al., 2008). Na vida
adulta, o gene Cr1 está expresso em baixos níveis em órgãos como o baço, pulmão,
coração e cérebro, e com níveis relevantes nas mamas, onde atua na formação e
ramificação dos ductos mamários durante o período de lactação (ADAMSON et al.,
2002; DONO et al., 1993). Nestes processos, Cr1 participa da transição epitélio
mesenquimal que confere plasticidade às células epiteliais mamárias, assim como, nos
processos de hiperplasia destas células. Camundongos transgênicos MMTV-CR-1, que
expressam a proteína CR1 humana sob o controle transcricional do promotor MMTV
(Mouse Mammary Tumor Vírus), desenvolvem hiperplasias epiteliais na glândula
mamária, evidenciando o papel de CR1 em processos tumorais desse órgão. Em
humanos, CR1 está presente entre as proteínas do leite e expresso de forma
pronunciada em tumores ductais de mama (BIANCO et al., 2001; KENNEY et al., 1995;
SUN et al., 2005; WECHSELLBERGER et al., 2001).
29
Nos processos patológicos, CR1 está intimamente ligado a processos tumorais e
relacionado com um mal prognóstico em cânceres gástricos, de mama, de pulmões e
de bexiga (GONG et al., 2007; XU et al., 2014; ZHONG et al., 2008; WEI et al., 2014).
A superexpressão de CR1 é observada em diversos tipos de cânceres, como o de
mama, pulmões, pâncreas, ovários, endométrio, testículo, cervicais, gástricos, e de
cólon, sugerindo-lhe um papel tumorigênico (ADAMSON et al., 2002; CIARDIELLO et
al., 1991; D’ANTONIO et al., 2002; ERTOY et al., 2000; FRIESS et al., 1994;
FONTANINI et al., 1998; QI et al., 1994; SAEKI et al., 1992; SALOMON et al., 2000)
Dada às ações conhecidas de CR1 têm se sugerido que atue em eventos múltiplos
como na proliferação celular, migração, invasão, transição epitélio mesenquimal (EMT)
e angiogênese tumoral (de CASTRO et al., 2010; KLAUSINSKA et al., 2014). Nesse
contexto, destaca-se o trabalho de Watanabe e colaboradores (2007a) que
demonstraram a ação parácrina do CR1 na angiogênese tumoral. A proteína CR1
secretada pelas células tumorais promoveu a migração direcionada de células
endoteliais peritumorais (Figura 2).
Figura 2. - Ação parácrina de CR1 sobre a angiogênese tumoral.
30
Figura 2. Ação parácrina de CR1 sobre a angiogênese tumoral. A proteína Cripto-1 atua sobre
as células endoteliais fazendo com que estas percam sua capacidade de adesão e migrem em
direção ao tumor. Esquema retirado e modificado de Watanabe et al., 2007a. (GPI-PLD:
glicosilfosfatidilinositol fosfolipase D; EGF: fator de crescimento epidermal; LPA: lipoproteína,
Lp(a).
1.3 Vias de Sinalização associadas a CRIPTO 1
Em condições normais, CR1 desempenha funções chave ao longo do período
embrionário e posteriormente declina seus níveis de expressão de forma abrupta nos
tecidos adultos, com exceções como é o caso do tecido mamário em desenvolvimento
durante a gravidez e lactação (SALOMON et al., 2000), e na interface materno-fetal,
como demonstrado por nosso grupo (BANDEIRA et al., 2014). Cripto também é
expresso, juntamente com outros genes marcadores de células tronco, em células
adultas e diferenciadas que retornam à condição de pluripotência por indução (iPSCs)
(AASEM et al., 2008; AOI et al., 2008), sendo neste contexto, considerado um
marcador de células tronco (BIANCO et al., 2010). Em condições patológicas a re-
expressão de CR1 é observada nos distúrbios de invasividade placentária (BANDEIRA
et al., 2014) e em processos tumorais onde promove proliferação, migração, invasão,
transição epitélio-mesenquimal e angiogênese tumoral (RANGEL et al., 2012). A
diversidade de efeitos biológicos apresentada por CR1 deve-se a sua capacidade de
interação com diversas moléculas, desencadeando diferentes vias de sinalização.
CR1 modula a sinalização dos membros da família do fator de crescimento
transformador beta (TGFβ), incluindo NODAL e GDF-1/3 via: i) receptores de treonina
– serina quinases do tipo I (AL4/ALK7) e o complexo de receptores de Activina do tipo
II, para a ativação de vias de sinalização que envolvem SMAD 2, 3 e 4; ii) interação
com Activinas A/B e TGFβ1, interferindo na ligação destes aos seus receptores e
diminuindo sua resposta em diferentes tipos celulares (BIANCO et al., 2005;
KLAUZINSKA et al., 2014; MINCHIOTTI et al., 2001). Ativinas e TGFβ1 são potentes
inibidores do crescimento celular, especula-se que o antagonismo desses fatores pelo
CR1 é um dos mecanismos pela qual regula e promove a tumorigênese (SHANI et al.,
2008); iii) receptor de superfície celular Glipican, o que leva à fosforilação da tirosina-
31
quinase citoplasmática c-Src e a ativação de MAPK, fosfatidilinositol 3 quinase (PI3K) e
proteína quinase B (Akt), vias de sinalização que regulam a proliferação celular,
motilidade e sobrevivência celular (BIANCO et al., 2005; RANGEL et al., 2012).
O envolvimento de CR1 com as vias de sinalização Src/MAPK, PI3K/AKT e
SMAD2/3 também se dá por meio da ligação com GRP78. Interferências na ligação
CR1/GRP78 atenua os efeitos de CR1 sobre a sinalização das Activinas A e B, TGFβ1
e Nodal, além de inibir a ativação das vias de sinalização c-Src, Erk/MAPK e PI3K/Akt
(GRAY, VALE, 2012; KELBER et al., 2009).
CRIPTO1 ainda realiza cross-talk com as via WNT/β-catenina/Tcf na medida em
que se liga aos receptores de lipoproteínas de baixa densidade, LRP5 e 6, facilitando
sua ligação à WNT3A (NAGAOKA et al., 2013).
Postovit e colaboradores (2007) também demonstraram a regulação de NODAL -
correceptor obrigatório de CR1 – por NOTCH4, evidenciando a ligação entre as vias
Notch e NODAL/CR1. Em uma via paralela, CR1 regula a expressão do receptor de
NOTCH por ligar-se à forma ancorada do receptor presente no retículo
endoplasmático/complexo de Golgi, promovendo sua clivagem e translocação para a
membrana plasmática, com potencialização da via de sinalização NOTCH e,
consequentemente, da expressão gênica de NODAL, alvo primário desta via em
diferentes modelos celulares (WATANADE et al., 2009).
Embora CR1 não tenha a capacidade de ligação a receptores do tipo tirosina
quinase (EGFR, ErbB2, ErbB3 e ErbB4) devido à modificação existente em seu
domínio EGF, uma possível interferência de CR1 na sinalização de ErB4 tem sido
sugerida, contando ainda, com a participação da molécula Tomorregulina 1 (BIANCO et
al., 1999; SRINIVASAN et al. 2000).
Por fim, CR1 também modula a via de sinalização Apelina e seu receptor APJ
durante a embriogênese cardíaca, sendo ambos genes alvos “downstream” da
sinalização mediada por CR1.
Na literatura diversos fatores já foram descritos regulando a expressão/ação de
CR1, dentre eles destacam-se TGFβ1, Wnt/β-catenina, Nanog, OCT4 e HIF1α,
32
positivamente, e Caveolina 1, BMP4, netrina 1 e GCNF, negativamente (NAGAOKA et
al., 2011; RANGEL et al., 2012).
1.4 A Placenta como objeto de estudo
A implantação do embrião no estroma uterino é um evento biológico de
fundamental importância para o desenvolvimento do embrião humano e de roedores.
Nestas espécies, a implantação inclui uma ação invasiva por parte de células
trofoblásticas, que revestem externamente o embrião/feto por toda a gestação e que
medeiam toda e qualquer comunicação materno-fetal (AMOROSO, 1955; RED-
HORSE, 2004).
A atividade invasiva das células trofoblásticas assemelha-se em muitos aspectos
à invasão tumoral, porém, sendo espacial e temporalmente contida durante a gestação.
Muitos fatores de restrição invasiva do trofoblasto têm sido descritos na literatura nas
últimas décadas e incluem fatores endócrinos, parácrinos e inúmeras outras moléculas
de sinalização. Apesar desses estudos, os mecanismos reguladores deste processo
ainda não foram completamente elucidados (BISCHOF, CAMPANA, 2000; TACHI et
al., 1970).
A presença de CR1 na interface materno-fetal em humana pode ser mais um
desses fatores que contribuem para a regulação da atividade invasiva do trofoblasto
como ocorre em tumores de modo geral. Neste contexto, o estudo da expressão de
CR1 em células trofoblásticas como modelo de estudo para a compreensão de seus
efeitos (migratórios, invasivos e angiogênicos), torna-se ainda mais relevante na
medida em que pode adicionar informações para a compreensão de processos de
regulação da gestação, seja ela normal ou patológica (com distúrbios de invasividade).
1.4.1 Estrutura placentária
A placenta humana é um órgão formado por estruturas de diferentes origens,
morfologia e funções: o cório frondoso (porção fetal) e a decídua basal, parte da
mucosa uterina que também contem células trofoblásticas invasivas.
Este órgão desempenha múltiplas críticas funções durante a gestação. São
exemplos do seu papel vital: i) o redirecionamento do sistema endócrino materno com
33
consequente alteração das condições uterinas e metabólicas para a continuidade da
gestação (VAUSE, SAROYA, 2005); ii) ativação de mecanismos de tolerância
imunológica sistêmica ou local, no ambiente materno-placentário (THELLIN, HEINEN,
2003); iii) estabelecimento de um circuito vascular onde células trofoblásticas
substituindo células endoteliais mantém contato direto com o sangue materno, com
quem realizam trocas metabólicas e gasosas (PLAISIER, 2010); iv) diálogo materno-
embrionário que se estabelece a partir da secreção de numerosas substâncias pela
unidade placentária, tais como hormônios, fatores de crescimento, citocinas,
eicosanóides e outras moléculas bioativas sintetizadas (RED-HORSE et al., 2004).
Estruturalmente as regiões de trocas estão representadas pelo cório frondoso,
constituído por ramificações digitiformes da placa coriônica, as vilosidades coriônicas.
Estas estruturas são revestidas por trofoblasto (sinciciotrofoblasto em posição mais
externa e citotrofoblasto mais internamente), que descansa sobre um mesênquima rico
em macrófagos (células de Hofbauer) e vasos fetais.
A maioria das vilosidades coriônicas é flutuante e está em intimo contato com o
sangue materno presente no espaço entre estas estruturas, o espaço interviloso. Nas
extremidades livres destas estruturas (vilosidades terminais) abundam capilares fetais,
enquanto que nas demais, vasos de diferentes complexidades (BENIRSCHKE et al.,
2006; BOYD, HAMILTON, 1970). O sangue arterial materno entra na placenta pelas
artérias uterinas espiraladas. Na interface de contato com a placenta estes vasos
terminam como canais abertos, extravasando o sangue diretamente nos espaços
intervilosos. O sangue interviloso retorna à circulação materna, drenado por veias
uterinas, também em contato com o interstício placentário.
Algumas vilosidades aderem à placa basal na face voltada para o endométrio,
sendo denominadas de vilosidades de ancoragem. Nestes locais ocorre a proliferação
das células citotrofoblásticas que ultrapassam os limites da vilosidade, invadem o
estroma endometrial e assumem diferentes funções, sendo referidas em conjunto como
citotrofoblasto extraviloso (BENIRSCHKE et al., 2006). Esta interface caracteriza a
porção materna da placenta que também contêm células deciduais, células
imunológicas e componentes vasculares.
34
Essa invasão do tecido uterino pelas células do citotrofoblasto extraviloso inicia-
se no endométrio alcançando o terço superior do miométrio. Estas células alcançam o
leito vascular arterial, onde promovem o remodelamento das artérias espiraladas
uterinas, substituindo a musculatura lisa e células endoteliais. Essa atividade invasiva
das células trofoblásticas contribui para a diminuição da resistência vascular na
placenta e limita a atividade de fatores vasoativos nos domínios placentários, condição
relevante para a manutenção de suprimento nutricional e gasoso na interface vilosa de
trocas materno-fetais.
1.4.2 A placenta acreta
Segundo dados da Organização Mundial de Saúde (OMS), cerca de 290 mil
mulheres morreram no mundo, no ano de 2010, por complicações durante a gestação
ou após o parto. Desse valor, 99% dos casos ocorreram em países em
desenvolvimento, com uma incidência de 240 mortes a cada 100 mil nascimentos, em
sua maior parte devido ao severo sangramento ocorrido no pós-parto (WHO, 2012).
A placentação anormal é uma das complicações gestacionais mais
frequentemente associada a casos de hemorragia pós-parto. Nessa categoria, inclui-se
também o acretismo placentário como um fator de extrema relevância e responsável
pelas histerectomias adotadas como medida profilática. Placentas acretas são
responsáveis pela considerável morbidade desses casos (BAUER; BONANNO, 2009;
DASKALAKIS et al., 2007; HOFFMAN et al., 2010; SHELLHAAS et al., 2009).
O acretismo, condição apenas diagnosticada após 1930 (IRVING; HERTIG,
1937), apresentou um aumento de 10 vezes na sua incidência até 1980 (1:2.510)
(PRIDJIAN et al., 1991) e foi ainda maior em 2002 (1:533) (WU et al., 2005). Esse
aumento tem se correlacionado ao aumento nas taxas de partos com intervenção
cirúrgica (cesárea), que juntamente com a placentação prévia representa o maior fator
de risco no desenvolvimento do acretismo (CLARK; SILVER, 2011; MILLER et al.,
1997; SOFIAH; FUNG, 2009; USTA et al.,2005).
Placentas acretas são histologicamente caracterizadas pela ausência de
decídua, com contato direto do tecido viloso com o miométrio subjacente
(BENIRSCHKE et al., 2006) e por isso, consideradas entre muitos autores como uma
35
patologia totalmente iatrogênica (JAUNIAUX; JURKOVIC, 2012). A etiologia da doença
é atribuída à consequente falta de modulação direta das células deciduais sobre as
células trofoblásticas extravilosas (EVTs) (IRVING et al., 1937; MILLER et al., 1959;
FOX, 1972; HUTTON et al., 1983). Corroborando essa hipótese, estudos
demonstraram que a probabildade de desenvolvimento da placenta acreta aumenta na
presença de placentação prévia (CLARK et al., 1985; SILVER et al., 2006), a qual tem
sua inserção em pontos uterinos onde a decidualização é menos intensa (KHONG,
2008). Essa probabilidade aumenta ainda de forma expressiva quando o fator “placenta
prévia” é associado à existência de uma cicatriz uterina anterior, região que tampouco
apresenta decidualização (MILLER et al., 1997).
Por outro lado, trabalhos relevantes também sugerem que uma invasão
excessiva pelas células trofoblásticas pode contribuir para essa patogenia (CRAMER et
al.,1987; KIM et al., 2004; STANEK et al., 2007). Em suma, o que se verifica é uma
patogenia complexa que inclui a interação de fatores – uma decidualização com
deficiências ou inexistente, juntamente com a atividade invasiva atípica por parte do
trofoblasto, promovendo o estabelecimento de uma vascularização uteroplacentária
aberrante e uma placenta aderida de forma anormal ao útero (BENIRSCHKE et al.,
2006; KHONG; ROBERTSON, 1987). A invasão anormal do miométrio é acompanhada
de neovascularização placentária típica de placentas acretas, onde o remodelamento
vascular exacerbado geralmente atinge as artérias radial, arqueada e parametriais,
vasos que pelo aumentado calibre dificilmente retornarão à homeostasia após o
descolamento da placenta (CHOU et al., 2002; KHONG; ROBERTSON, 1987; SHIH et
al., 2002; TSENG et al., 2006).
Atualmente o acretismo é caracterizado de acordo com o grau de invasão das
células trofoblásticas extravilosas na camada miometrial, sendo a inserção superficial,
profunda ou ultrapassando a serosa - podendo até alcançar estruturas adjacentes,
como bexiga e ureteres – gerando as denominações placenta acreta, increta ou
percreta, respectivamente (BELFORT, 2010; BENIRSCHKE et al., 2006; FOX; SEBIRE,
2007).
36
1.4.3 Coriocarcinoma
O termo coriocarcinoma foi cunhado pela primeira vez por Ewing em 1910, que
agrupava todas as doenças placentárias conhecidas sob a denominação de “corioma”
(HUI, 2011). Atualmente, as “Doenças Trofoblásticas Gestacionais” (DTGs)
reconhecidas pela Organização Mundial da Saúde (WHO) contemplam uma gama
heterogênea de condições originárias do desenvolvimento anormal do tecido
placentário, com variados níveis de proliferação, tanto não neoplásicas, quanto
neoplásicas – também chamados tumores trofoblásticos (Tabela 1) (BENIRSCHKE et
al., 2006).
Tabela 1 - Classificação das DTGs segundo a Organização Mundial da Saúde
Molas hidatiformes Neoplasias trofoblásticas
Lesões trofoblásticas não neoplásicas e não molares
Mola completa Mola parcial Mola invasiva Mola metastática
Coriocarcinoma
Tumor trofoblástico
de sítio placentário
Tumor trofoblástico
epitelióide
Nódulo e Placa de sítio placentário
Sítio placentário exagerado
Fonte: Tavassoli et al., 2003 in Benirschke et al., 2006
Dentro do espectro de doenças trofoblásticas gestacionais diferenciam-se as
neoplasias trofoblásticas gestacionais (NTGs), lesões malignas e metastáticas oriundas
das DTGs e que representam um sério risco de morte quando não tratadas
adequadamente, sendo o coriocarcinoma a mais agressiva destas lesões (BUZA; HUI,
2010; KANEHIRA et al., 2013).
O coriocarcinoma é um tumor maligno altamente agressivo, porém
extremamente responsivo à quimioterapia, caracterizado por expressivo grau de
invasividade. Geralmente, sua manifestação é precedida pela condição gestacional,
seja ela normal, com feto natimorto, ectópica, com aborto espontâneo, ou gestação
37
molar, sendo esta última condição responsável pelo aumento significativo (1000-2000
vezes) na probabilidade de desenvolvimento do coriocarcinoma (ALTIERI et al., 2003;
BUCKELY, 2006; MORGAN; LURAIN 2008). Percentuais de incidência são descritos
na literatura atribuindo 50% de chances de desenvolvimento de um coriocarcinoma
após uma mola hidatiforme, 25% após um aborto espontâneo, 22,5% após uma
gestação normal e 2,5% após uma gravidez ectópica (BENIRSCHKE, 2006; BENTLEY,
2003). Casos de coriocarcinoma intraplacentário também são relatados, onde o tumor
apresenta-se rodeado por uma estrutura vilosa aparentemente normal; no entanto, o
diagnóstico pré- e pós-natal é fundamental para evitar possíveis metástases na mãe e
feto (BENIRSCHKE, 2006; LIU; GUO, 2006). Em um estudo de caso, a análise
genética do tumor intraplacentário demonstrou o compartilhamento de 10 loci
polimórficos entre o tecido tumoral e o restante da placenta, descartando uma origem
não gestacional derivada de células germinativas (KANEHIRA et al., 2013). O período
de manifestação de um coriocarcinoma após a gestação varia de meses a anos – um
dos casos reportados mais impressionante é o de uma senhora de 73 anos que
desenvolveu o tumor 23 anos após o último parto (DESAI et al., 2010; HUI, 2011).
Coriocarcinomas não gestacionais também são encontrados, oriundos de células
germinativas femininas ou masculinas; esses tumores, entretanto, são resistentes à
quimioterapia e tem mal prognóstico (NOGALES et al., 2003). Microscopicamente o
tumor apresenta-se como uma rede intrincada de células, com células citotrofoblásticas
dispostas em cordões rodeados por aglomerados de sinciciotrofoblasto. Além disso, o
coriocarcinoma apresenta grande heterogeneidade nuclear; mitoses são frequentes
nas células do citotrofoblasto. Durante o estabelecimento do tumor, as células
trofoblásticas invadem o miométrio e erodem vasos, produzindo intensa hemorragia, o
que explica a presença de proeminentes zonas hemorrágicas e necrose tecidual
encontrada nos casos de coriocarcinoma. Não há a formação de vilosidades,
diferenciando o coriocarcinoma das molas hidatiformes. A alta capacidade imunogênica
deste tumor é uma de suas principais características, assim como a não
responsividade destas células à ação inibitória de TGFβ1 e de moléculas da matriz
38
extracelular do tipo decorim (BAGSHAWE, 1969; BENIRSCHKE et al., 2006; GENEST
at el., 2003; GOLDSTEIN; BERKOWITZ, 1982; OBER et al., 1971).
A intensa vascularização desses tumores favorece a formação de metástases,
com sítios preferenciais nos pulmões e cérebro (OBER et al., 1971) com o agravante
de provocarem hemorragias também nestes órgãos (ACOSTA-SISON, 1958; HUI,
2011; SMITH et al., 2005). Metástases atribuídas ao coriocarcinoma podem ser
“transmitidas” pela doação de órgãos (BRAUN-PARVEZ et al., 2010).
Embora existam controvérsias nos estudos epidemiológicos que apontam fatores
de risco para o desenvolvimento do coriocarcinoma (dentre eles, dieta, paridade,
contribuição paterna de alelos, imprinting gênico, idade materna, uso de contraceptivos
orais e gestações molares prévias), um fator parece ser consenso entre os
pesquisadores – o genético (BENIRSCHKE, 2006; HUI, 2011; SLIM et al., 2011; SMITH
et al., 2003). A taxa de incidência da doença varia de população para população. Na
Europa e Estados Unidos, por exemplo, o coriocarcinoma afeta 1 a cada 40.000
gestações, sendo a população afro-descendente mais afetada do que a caucasiana
(HERTIG et al., 1956; SMITH et al., 2003).
O diagnóstico de coriocarcinoma normalmente inclui episódios de sangramento
vaginal recorrentes sem motivo aparente e titulações muito aumentadas de β-hCG,
produzido pelas células trofoblásticas em molas hidatiformes e coriocarcinomas. A
confirmação do diagnóstico, entretanto, depende de exames de raios-X e ressonância
magnética. O tratamento envolve curetagem, quimioterapia e na maioria das vezes,
histerectomia (LURAIN, 2011; SOPER et al., 2004;).
39
2 OBJETIVOS
40
2.1 Objetivo geral
Nosso trabalho pretende verificar a presença e o padrão da expressão de
CRIPTO em placentas normais e com distúrbios de invasividade, e ainda, avaliar uma
possível associação entre os efeitos desencadeados pela expressão da proteína e os
processos celulares de invasão, migração e proliferação nas células da linhagem
trofoblástica humana HTR8-SVneo.
2.2 Objetivos específicos
Este estudo visa especificamente:
1. Verificar a localização tecidual de CR1 em placentas humanas de primeiro
trimestre e a termo e em placentas com distúrbios de invasividade (placentas
acretas e coriocarcinoma) (localização tecidual).
2. Verificar a expressão de CRIPTO1 e CRIPTO3 em células do citotrofoblasto
extraviloso de placentas saudáveis e em linhagem de célula citotrofoblástica
humana HTR8/Sv-neo
3. Analisar possíveis ações de CR1 sobre as células HTR8/Svneo com ensaios
de invasão, migração e sobrevivência utilizando a proteína recombinante CR1
e o silenciamento de CR1 com RNA de interferência.
41
3 MATERIAIS E MÉTODO
42
3.1 Procedências
Ambion – Ambion®, Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA
Amersham – Amersham Pharmacia, GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido
Applied Biosystems – Applied Biosystems®, Life Technoloiges, Carlsbad, CA, EUA
BioAmerica - BioAmerica Inc., Miami, FL, USA
BD – BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA
Biodinâmica - Biodinâmica Química e Farmacêutica LTDA, PR, Brasil
Bio-Rad – Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA
Carl Zeiss – Carl Zeiss Microscopy, NY, USA
Cell Marque – Cell Marque Corporation, CA, USA
Cell Signaling – Cell Signaling Technology Inc, Danvers, MA, EUA
Cultilab - Cultilab Meios para Cultivo Celular Ltda, Campinas, SP, Brasil
Dako – Dako, Glostrup, Dinamarca
Eppendorf – Eppendorf AG, Hamburgo, Alemanha
Falcon – Falcon, Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ, EUA
Fermentas – Fermentas, Thermo Scientific, Pittsburgh PA, EUA
GE – GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido
Gibco – Gibco®, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA
Guava – Guava Technologies Inc., Hayward, USA
GraphPad – GraphPad Software, Inc. , La Jolla, CA, USA
IDT – Integrated DNA Technologies, Iowa, EUA
Invitrogen – InvitrogenTM, Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA
KPL – KPL, Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Washington DC, USA
Merck – Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha
Millipore – Merck Millipore, Billerica, MA, EUA
43
Pierce – Pierce, Thermo Scientific, EUA
Promega – Promega Coorporation, Madison, WI, EUA Roche
R&D – R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, USA
Santa Cruz – Santa Cruz Biotechnology Inc, Santa Cruz, CA, EUA
Sigma – Sigma Aldrich, St Louis, MO, USA
Spring – Spring Bioscience Inc, Pleasanton, CA, USA
Thermo – Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE, USA
TPP – TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen , Switzerland
Vector – Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, USA
Zymo – Zymo Research, Orange, CA, USA
3.2 Parte 1. Imunolocalização de CRIPTO1 em placentas saudáveis e
comprometidas com distúrbios de invasividade
3.2.1 Obtenção das Amostras
3.2.2 Blocos de Parafina oriundos de Arquivo Médico
A partir do levantamento de casos existentes nos últimos dez anos no banco de
dados do Departamento de Obstetrícia do Hospital das Clínicas da Universidade de
São Paulo (HC-USP), foram selecionados casos de gestações saudáveis e com
distúrbios de invasividade. Com esses dados, blocos de parafina dessas placentas
pertencentes ao acervo da Divisão de Patologia do HC-USP foram obtidos e utilizados
para a imunolocalização de CRIPTO. Todas as amostras submetidas a reações
imunohistoquímicas ou simplesmente coradas rotineiramente pela hematoxilina e
eosina foram checadas pela patologista Dra Regina Schultz (Faculdade de Medicina,
USP) quanto a presença de invasividade trofoblástica. Foram utilizados blocos de
parafina de nove placentas saudáveis, de 6 placentas acretas, de 10 placentas
incretas, de 15 placentas percretas e, de 5 coriocarcinomas placentários.
44
3.2.3 Amostras de Placentas Humanas de Primeiro Trimestre
Blocos de parafina de placentas humanas de primeiro trimestre foram gentilmente
cedidos pelo Dr. Martin Knofler, do “Department of Obstetrics and Fetal-Maternal
Medicine”, da Universidade Médica de Viena. Todas as amostras coletadas foram
provenientes de abortos eletivos e sem complicações, entre a 6ª e 12ª semana de
gestação, na clínica Gynmed, contando com consentimento legal e assinatura de termo
de consentimento livre e esclarecido por parte das pacientes. O comitê de ética da
Universidade Médica de Viena, em processo existente na Unidade de Biologia da
Reprodução dessa Universidade, aprovou o uso destas placentas, as quais foram
utilizadas respeitando os princípios éticos, práticos e de biossegurança das leis
internacionais.
3.2.4 Imunolocalização de CRIPTO1, Citoqueratina e Vimentina em Placentas
Saudáveis e Patológicas
A partir dos blocos provenientes do acervo da Divisão de Patologia do HC-USP
foram obtidos cortes de 5 µm de espessura. Estes espécimes, recolhidos em lâminas
histológicas silanizadas (Biodinâmica) foram desparafinizados, hidratados e submetidos
à coloração de rotina (Hematoxilina e Eosina) (Sigma) e à reações imunohistoquímicas
para a localização de CRIPTO 1 (Santa Cruz), Citoqueratina-7 (marcador para células
trofoblásticas, Cell Marque) e Vimentina (marcador de células de origem mesenquimal,
Cell Marque) seguiu os seguintes procedimentos:
1. Bloqueio da peroxidase endógena - 10% de peróxido de hidrogênio (H2O2,
Sigma) diluído em tampão fosfato-salina (PBS, Sigma) 0,1M (v/v), por 10
minutos a temperatura ambiente (T.A.).
2. Três lavagens consecutivas com PBS por 5 minutos a T.A.
3. Bloqueio dos sítios antigênicos inespecíficos - incubação com albumina sérica
bovina (BSA, Sigma) 3% em PBS (m/v) por 1 hora (T.A.), seguido por de uma
incubação adicional de mais uma hora (T.A.) com BSA 3% em PBS 0,1M +
tampão de bloqueio SuperBlock (Pierce) na proporção de 1:1 (v/v), em câmara
úmida.
45
4. Incubação com o anticorpo primário policlonal (coelho) anti-CRIPTO 1 humano
(Santa Cruz), na concentração de 1:50 em solução de PBS/BSA 3%, overnight a
4° C, em câmara úmida.
5. Três lavagens consecutivas com PBS (5 min, T.A.)
6. Incubação com o anticorpo secundário anti IgG de coelho (cabra) conjugado
com peroxidase (KPL), na concentração de 1:100 em PBS (v/v), por 1 hora
(T.A.), em câmara úmida.
7. Três lavagens consecutivas com PBS (5 min, T.A.)
8. Revelação da atividade enzimática com 3,3’-diaminobenzidina utilizando kit
Sigma Fast TM (Sigma) o reagente segundo as recomendações do fabricante.
9. Lavagem em água corrente por 5 minutos.
10. Contracoloração com hematoxilina de Mayer (Sigma) por 1 minuto (T.A.)
11. Montagem da lâmina com lamínula de vidro e Entellan® (Merck)
12. Fotodocumentação em microscópio de luz convencional Axioshop 2 (Carl Zeiss),
acoplado ao sistema de captura Axio Vision 4.7 (Carl Zeiss).
A imunolocalização de citoqueratina-7 e vimentina seguiu os mesmos passos
descritos para CRIPTO1, exceto que foram submetidas a resgate antigênico utilizando-
se o kit Trillogy (Cell Marque), de acordo com as instruções do fabricante. Os
anticorpos primários utilizados foram anti-citoqueratina 7 (Cell Marque) e anti-vimentina
(Cell Marque) humanos, na concentração de 1:350 e 1:250, respectivamente, em
solução de PBS/BSA 3%, por 1 hora à T.A., em câmara úmida. Este material foi então
incubado com os reagentes do kit “Reveal” (Spring), de acordo com as instruções do
fabricante.
3.2.5 Análise Quantitativa das Reações Imunoistoquímicas
As imagens adquiridas foram capturadas com uma objetiva × 10, com 1388 x
1040 pixels e uma resolução de quatro pixels/μm2. A quantificação foi realizada em
cinco imagens de cada amostra a partir de cinco blocos de parafina selecionados
aleatoriamente para cada grupo, resultando em 25 imagens por grupo. A análise
quantitativa foi realizada utilizando-se o software ImageJ 1.43 (NIMH, NHI, Bethesda,
MD, EUA, http://rsweb.nih.gov/ij/). As áreas de imunoreativas foram segmentadas em
46
diferentes canais utilizando-se o pluggin Color Deconvolution (Gabriel Landini,
http://www.dentistry.bham. ac.uk/landinig/software/software.html), estimando-se assim
o número de pixels contido dentro do perímetro segmentado, os quais foram
normalizados e expressos em micrômetros quadrados (µm2).
3.2.6 Análise Estatística
Resultados foram expressos como media ± desvio padrão. A análise estatística foi
realizada utilizando-se o teste não paramétrico ANOVA (Kruskal–Wallis) e pós-teste de
Dunn para múltiplas comparações, por meio programa PRISM Graph Pad para
Windows (versão 5). O nível de significância foi estabelecido para p < 0,05.
3.3 Parte 2. Expressão de CRIPTO1 e CRIPTO3 em células do citotrofoblasto extraviloso de placentas saudáveis e em linhagem de células citotrofoblásticas HTR8/Sv-neo
3.3.1 Obtenção das amostras
3.3.1.1 Obtenção de células do citotrofoblasto extraviloso de placentas a termo
saudáveis
3.3.1.1.1 Aprovação do protocolo experimental por Comissões de Ética..
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Pesquisa Humana das Instituições
envolvidas: Instituto de Ciências Biomédicas (ICB-USP), HU-USP e HC-FMUSP (em
anexo). As pacientes foram previamente informadas e as amostras obtidas utilizadas
sob o expresso consentimento destas (assinatura do termo de doação de material
biológico para pesquisa) em formulário próprio de acordo com o Ministério da Saúde.
33..33..11..11..22 CCrriittéérriiooss ddee iinncclluussããoo ee eexxcclluussããoo..
Foram consideradas elegíveis para o delineamento do estudo: i) mulheres que não
apresentaram histórico de uso de drogas terapêuticas durante a gestação e, com
reações sorológicas negativas para HIV, sífilis e hepatite B; ii) gestantes que realizaram
acompanhamento pré-natal a partir da 28a semana de gestação e parto na Divisão de
Obstetrícia do HU-USP ou HC-USP. Foram critérios de exclusão: gestação gemelar,
prematuridade extrema (parto antes da 28a semana de gestação) e qualquer patologia
associada ou não à gestação, seja esta de caráter auto-imune, infeccioso ou genético.
47
3.3.1.1.3 Coleta das amostras.
A coleta das amostras respeitou os princípios éticos, práticos e de biossegurança
estipulados pelo Ministério da Saúde e condizentes com as exigências impostas pela
Comissão de Ética em Pesquisa Humana de todas as Instituições envolvidas. As
considerações éticas foram baseadas no uso do material para fins científicos, com
sigilo da identidade do paciente, sem que estes venham a constranger instituições ou
pessoas envolvidas. As coletas respeitaram os protocolos técnicos do hospital e dos
médicos envolvidos.
Foram selecionadas placentas de dez gestantes saudáveis durante o período
desse estudo. As placentas a termo de gestações saudáveis (38 a 40 semanas de
gestação) foram obtidas no Hospital Universitário (HU-USP) por cesárea eletiva e
utilizadas desde que os recém-nascidos fossem saudáveis.
Após a remoção cirúrgica da placenta, amostras representativas da interface
materno-placentária (decídua e trofoblasto) foram imediatamente coletadas e mantidas
em tampão fosfato-salina (PBS) 0,1M estéril. Ainda em sala anexa ao centro obstétrico,
essas amostras eram recortadas em fragmentos menores que foram então
transportados em recipientes termicamente isolados contendo tampão PBS 0,1 M
estéril em condições assépticas, até o Laboratório de Estudos da Biologia do
Trofoblasto no Instituto de Ciências Biomédicas da USP, onde eram processadas.
33..33..11..11..44 PPrroocceessssaammeennttoo ddaass AAmmoossttrraass..
As amostras de placentas com distúrbios de invasividade diagnosticadas clínica e
laboratorialmente foram encaminhadas para análise anátomo patológica para
confirmação de diagnóstico e inserção no grupo desse estudo.
33..33..11..11..55 IIssoollaammeennttoo ddaass ccéélluullaass ddoo CCTTEEVV ddee ppllaacceennttaass aa tteerrmmoo..
A obtenção de células trofoblásticas extravilosas a partir da placa basal de
placentas a termo saudáveis e com acretismo placentário seguiu o protocolo descrito
por Borbely e colaboradores (2014). Resumidamente, amostras de placentas a termo
de gestantes saudáveis foram dissecadas sob estereomicroscópio para a obtenção de
áreas de placenta fetal. Estas amostras foram sucessivamente lavadas com PBS para
remoção de coágulos e eritrócitos e submetidas à digestão enzimática com colagenase
48
tipo II (Sigma) diluída em PBS. O sobrenadante foi então coletado e a ação enzimática
inativada com soro (SBF, Cultilab) a 10% em DMEM-F12 (Gibco). A suspensão de
células foi sequencialmente centrifugada e os precipitados coletados. As células
presentes no pellet final foram suspensas e fracionadas por gradiente contínuo de
densidade em solução isotônica de PercollTM Plus (Sigma). As células trofoblásticas
obtidas nas densidades entre 1.048 e 1.062 (gradientes entre 60% e 30%) foram
colhidas e imediatamente centrifugadas, contadas em câmaras hematológicas. As
taxas de viabilidade foram determinadas pela técnica de exclusão de células mortas
pelo azul de Trypan (Sigma).
As células citotrofoblásticas isoladas foram armazenadas a -80° C em tampão
RIPA ou em Trizol® (Invitrogen) para a análise proteica e de expressão gênica,
respectivamente.
33..33..11..11..66 CCéélluullaass cciittoottrrooffoobblláássttiiccaass eexxttrraavviilloossaass ddee pprriimmeeiirroo ttrriimmeessttrree
Amostras de cDNA de placentas humanas de primeiro trimestre foram gentilmente
cedidos pelo Dr. Martin Knofler, do “Department of Obstetrics and Fetal-Maternal
Medicine”, da Universidade Médica de Viena. Assim como os blocos de parafina, todas
as amostras coletadas foram provenientes de abortos eletivos e sem complicações,
entre a 6ª e 12ª semana de gestação, na clínica Gynmed, contando com consentimento
legal e assinatura de termo de consentimento livre e esclarecido por parte das
pacientes.
33..33..11..11..77 CCuullttuurraa ddee CCéélluullaass ddaa LLiinnhhaaggeemm TTrrooffoobblláássttiiccaa HHTTRR88 SSVV--nneeoo
Células da linhagem HTR8 SV-neo derivadas de células citotrofoblásticas humanas
de primeiro trimestre (gentilmente cedidas pelo Dr. Charles Graham, Queen’s
University, Kingston, Ontario, Canada) foram plaqueadas na concentração de 2x106
células/poço (placa 24 poços, TPP) em meio padrão: DMEM-F12 (Gibco) acrescido de
10% de SBF, 100 UI/mL de penicilina, 1 µg/mL de estreptomicina, 25 µg/mL de
anfotericina B e 5 µg/mL de gentamicina (Sigma) e mantidas em estufa úmida a 37° C
contendo 5% de CO2. As culturas eram mantidas até a confluência quando eram
repicadas e replaqueadas.
49
3.3.2 Análise da expressão gênica por RT-PCR seguida de PCR
Para a analise da expressão gênica, as amostras previamente congeladas foram
homogeneizadas em Trizol (Invitrogen), utilizando-se tubos CK14 (Precellys® Kit CK14)
contendo microesferas de cerâmica para homogeneização mecânica no equipamento
Precellys® (BioAmerica) em 2 ciclos de 20 segundos. Utilizou-se cerca de 1x105 células
para cada 300 µL de Trizol. O RNA total foi isolado de acordo com as instruções do
fabricante, seguidas da precipitação do RNA com etanol gelado.
O precipitado foi diluído em água livre de RNase (DEPC, Sigma) e cerca de 1 µg
de RNA total foi tratado com DNase I (Invitrogen, a 25ºC por 15 min), recebendo então
1 µL de EDTA (do inglês ethylenediamine tetraacetic acid ou ácido etilenodiamino tetra-
acético, Sigma), e submetido à 70° C por 10 minutos para a inativação da enzima). O
RNA extraído foi quantificado em um espectrofotômetro (Nano-Drop ND1000
Spectrophotometer, Thermo). Os valores aceitos foram aqueles em concordância com
Sambrook et al. (2001).
Para a geração de cDNAs, alíquotas de 1 μg do RNA total previamente
purificado e tratado com DNAse I foram submetidas a reação de transcrição reversa na
presença, utilizando-se: 2 µL do tampão específico para a atividade da enzima
transcriptase reversa (10x RT Buffer), 0,8 µL da mistura de dNTP, 2 µL de random
primers e 1 µL da enzima transcriptase reversa, todos do kit High Capacity cDNA (Life
Technologies) por 10 min a 25˚C, 120 min a 37˚C e 5 s a 85˚C, no termociclador
Eppendorf Mastercycler Ep. (Eppendorf). As amostras sempre correram em triplicata e
os experimentos foram repetidos pelo menos três vezes em diferentes ocasiões. Todas
as amostras foram quantificadas (Nadrop) e permaneceram a -20˚C até suas etapas
seguintes de uso.
Após a transcrição reversa, realizou-se a reação em cadeia da polimerase (PCR)
para detectar a expressão do RNA mensageiro de CRIPTO1 e CRIPTO3; para o
controle endógeno, foi utilizado GAPDH (Gliceraldeido-3-fofato desidrogenase). Os
primers utilizados e condições de ciclagem estão apresentados na Tabela 2. Para a
amplificação do cDNA utilizou-se: 18,30 μL de água Milli-Q, 2,5 μL de tampão de
reação 10X, 0,5 μL de dNTP, 1,50 μL MgCl2 (1,5 mM), 1 μL cDNA, 0,5 μL primer sense
50
e 0,5 μL primer anti-sense e 0,2 μL da enzima Taq DNA polimerase (2,5 U, Invitrogen,
Carlsbad, CA, USA). O procedimento foi iniciado com 94° C por 3 minutos. A
amplificação foi realizada com 40 ciclos de 94° C por 45 segundos (desnaturação), 45
segundos de anelamento a temperatura específica de cada primer (ver Tabela 2) e 72°
C por 1 min (extensão).
O cDNA amplificado foi submetido a separação eletroforética em gel de agarose
1%, utilizando-se um marcador de peso molecular de DNA de 100 pares de bases
(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) para a confirmação do tamanho dos produtos
amplificados. O gel de agarose foi corado com 3 μL de brometo de etídio (Invitrogen)
para a visualização da imagem em transluminador G-Box Chemi (Syngene, Frederick,
MD, EUA) e análise densitométrica das bandas obtidas utilizando-se o programa
GeneSnap (Syngene, Frederick, MD, EUA). Os dados obtidos foram analisados quanto
a sua significância estatística (p ≤ 0,05) pelo teste ANOVA com pós-teste de Turkey no
software Prism® (GraphPad).
Tabela 2 - Primers utilizados para a reação em cadeia da polimerase e condições de
ciclagem
51
Gene Alvo Primers Ciclagem
CRIPTO 1
(Teratocarcinoma-derived Growth factor1)
776pb
Sense: GCTACGACCTTCTGGGGAAAACG
Anti-sense: CTGGTCATGAAATTTGCATG
95° C – 3 minutos
95° C – 45 segundos
64° C – 45 segundos
72° C – 1 minuto
72° C – 10 minutos
CRIPTO 3 (Teratocarcinoma-derived
Growth factor 1 pseudogene 3) 431 pb
Sense: GCGTGTGCTGCCCATGGGA
Anti-sense: CGGGTCATGAAATTTGCATA
95° C – 3 minutos
95° C – 45 segundos
64° C – 45 segundos
72° C – 1 minuto
72° C – 10 minutos
GAPDH (Gliceraldeido-3-
fofato desidrogenase) 102 pb
Sense: CAAGAGCACAAGAGGAAGAGAG
Anti-sense:
CTACATGGCAACTGTGAGGAG
95° C – 3 minutos
95° C – 45 segundos
60° C – 45 segundos
72° C – 1 minuto
72° C – 10 minutos
CRIPTO (TDGF1 – primer qPCR)
Sense: CTGCCCAAGAAGTGTTCCCCT
Anti-sense: CGAGGTTGCTCATCCATCACA
95° C – 10 minutos
95° C – 15 segundos
60° C – 60 segundos
Curva de dissociação
YWHAZ (primer qPCR)
Sense: GCCACAATGTTCTTGGCCCATCAT
Anti-sense:
TGGTTGGTGACAAGACAGAAGGCT
95° C – 10 minutos
95° C – 15 segundos
60° C – 60 segundos
Curva de dissociação
40X
40X
40X
40X
40X
52
3.3.3 Produto de RealTime q-PCR (Quantitative Polymerase Chain Reaction)
Para a verificação da padronização da cultura de HTR8-SVneo (conforme
descrito no item 3.4.1, adiante), utilizamos também a técnica de qPCR. Após a geração
de cDNA, de acordo com protocolo já descrito no item 3.3.3), reações de PCR
quantitativo, ou real time-PCR, foram efetuadas utilizando o reagente SYBR Green
PCR Master Mix (Applied Biosystems) no equipamento StepOnePlus (Applied
Biosystems). Os primers foram utilizados na concentração de 10 pmols/µL foram
obtidos pela IDT. Os primers específicos para esta técnica estão descritos na tabela 2.
Para todos os experimentos também foi amplificado o gene endógeno Ywhaz
(tyrosine3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein zeta
polypeptide), padronizado para amostras de placenta (MELLER et al., 2005, MURTHI
et al., 2008).
As amostras foram submetidas a 95° C por 10 min (desnaturação inicial), 40 ciclos de
15s a 95° C, 60 s a temperatura de anelamento específico para as oligossondas
conforme Tabela 2. Após a ciclagem, as amostras foram imediatamente submetidas à
curva de dissociação (Melt Curve): 95° C por 15 s, 60° C por 1 min e 15s para cada
intervalo de 0,3° C até 95° C. Os resultados foram analisados utilizando o software
StepOnePlus v2.1 (Life Technologies, EUA). O teste paramétrico de análise de
variância ANOVA (One-way ANOVA) com pós-teste de Turkey foi aplicado aos dados
amostrais através do software Prism® (GraphPad, San Diego, CA, EUA). Os valores
foram considerados estatisticamente relevantes quando p≤ 0,05.
3.3.4 Análise da expressão proteica por Western Blotting
Para a extração proteica, células previamente congeladas em freezer a - 80° C
foram imersas e maceradas em tampão RIPA (1% NP-40, 0,25% Na-desoxicolato,
1mM NaF , 150 mM NaCl, 1mM EDTA , 1mM PMSF , 1mM Na3VO4 , 50mM Tris-HCl ,
pH7,4, Sigma) acrescido do coquetel de inibidores de protease (150 mM de NaCl, 50
mM de Tris, 2 mM de EDTA, 1% NP-40, 1x Protease Mix, Sigma), de acordo com as
instruções do fabricante em tubos CK14 (BioAmerica) contendo microesferas de
53
cerâmica, para homogeneização mecânica no equipamento Precellys® (BioAmerica)
em 2 ciclos de 20 segundos. As amostras foram então centrifugadas a 12.000 rpm, a 4°
C e o sobrenadante coletado. A concentração de proteína total foi determinada com o
auxílio de um espectrofotômetro (ELX 800, Bio-Tek Instruments, Inc., VT, USA) com
filtro de 595 ƞm, utilizando-se o método Bradford (Bio-Rad) segundo indicações do
fabricante (BRADFORD, 1976).
Após a determinação da concentração protéica 30 g de proteína de cada
amostra foram diluídas em tampão,). Após a quantificação, 30 μg de proteína total de
cada amostra foi diluída em 20 μL de tampão de amostra (85 mM Tris contendo 40 mM
DTT, 17% glicerol, 0,1% SDS e 0,4% azul de bromofenol diluídos em água milliQ, Bio-
Rad) e 0,05% de β-mercaptoetanol (Amersham), onde permaneceram por 5 min a 100
° C em placa de banho seco (DB-2A, TECHNE, Bibby Scientific Limited, Staffordshire,
UK), para desnaturação proteica. Em seguida, as amostras foram submetidas à
separação eletroforética em mini gel de poliacrilamida 12,5% (BioRad) com SDS-
PAGE, a uma voltagem de 100 V e corrente de 25 mA durante cerca de 2 horas em um
aparelho Mighty Slim SX 250 Power supply (Hoefer, San Francisco, CA, USA). Como
padrão de peso molecular, utilizou-se o padrão comercial Kaleidoscope (Bio-Rad, CA,
USA). Posteriormente, as proteínas separadas no gel foram transferidas para
membranas de nitrocelulose (Immobilon, 0,45 µm, Millipore) em tampão de
transferência (0,1 M glicina, 0,02 M Tris, 0,003 M SDS, 20% metanol e água MilliQ), a
uma voltagem constante de 100 V por 1 hora à 4° C em um equipamento de
transferência úmida (Bio-Rad, CA, USA).
Após a transferência, realizou-se o bloqueio de sítios inespecíficos; a membrana
foi então incubada com 5% leite desnatado (Molico) diluído em TBS-T (tampão tris-
salina-Twin-20, 0,05 M TRIS, 0,1 M NaCl, pH=7,6 e 0,1% Twin-20, Sigma), sob
agitação por 1 h, a T.A. Na sequência, a membrana foi incubada com TBS-T-5% leite e
a imunoglobulina de coelho (policlonal) anti-CRIPTO 1 humano (Santa Cruz), na
concentração de 1:1.000, sob rotação a 4° C, durante uma noite. Após lavagens em
TBS, a membrana foi incubada com o anticorpo secundário anti IgG de coelho (cabra)
54
conjugado com peroxidase (KPL), na concentração de 1:2.000 em TBS-T, por 1 hora
(T.A.).
A membrana foi então revelada utilizando-se o Kit ECL (AdvanceTM Western
Blotting Detection, GE), seguindo as recomendações do fabricante. A detecção da
reação imunoquímica por quimioluminescência foi realizada em um transiluminador G-
Box Chemi HR (Syngene, Frederick, MD, EUA) com o auxílio do programa GeneSnap
(Syngene, Frederick, MD, EUA).
Em todos os experimentos, as membranas foram reutilizadas para incubação
com o anticorpo anti-β-actina, que foi utilizado como controle. Para isso, as membranas
foram então submergidas por 30 min a 50 ° C em uma solução contendo 2% SDS, 100
mM mercaptoetanol e 62,5 mM Tris-HCl para a remoção dos anticorpos anteriormente
incubados. Na seqüência, estas foram incubadas com: i) IgG de camundongo anti--
actina (Sigma, USA), na diluição 1:10.000 em TBS-T, por 1 hora a temperatura
ambiente; ii) IgG de cabra anti-IgG de camundongo conjugado a peroxidase (Sigma,
USA) na diluição 1:1000 em TTBS, por 1 hora à temperatura ambiente. A revelação foi
realizada da mesma forma descrita acima para a proteína CRIPTO1.
As bandas detectadas pelo método de quimioluminescência para CRIPTO 1 e β-
actina foram densiometricamente mensuradas pelo software ImageJ 1.43 (NIMH, NHI,
Bethesda, MD, EUA). Os dados foram expressos como média desvio padrão,
normalizados em relação a expressão de β-Actina e analisados quanto a sua
significância estatística (p ≤ 0,05) pelo teste ANOVA com pós-teste de Turkey
utilizando-se o programa GraphPad Prism para Windows (versão 3.0). Adotou-se o
limite de 5% para a significância estatística (p<0,05).
3.3.5 Análise da expressão proteica de CRIPTO1 nas células HTR8 por
imunoistoquímica
A imunomarcação para CR1 foi realizada em células cultivadas sobre lamínulas
(1,6x105 células/poço). O controle negativo deu-se pela omissão do anticorpo primário,
com substituição por soro do animal doador do anticorpo. Após o cultivo de 24 horas,
55
as células HTR8-SVneo em lamínulas foram fixadas em paraformoldeído 3% por 20
minutos à T.A., e seguiram-se as seguintes incubações:
1. Três lavagens consecutivas com PBS pH 7.4 por 2 minutos à T.A
2. Incubação por 10 minutos à T.A. com 10mM de NH4Cl
3. Três lavagens consecutivas com PBS pH 7.4 por 2 minutos à T.A
4. Bloqueio de sítios antigênicos inespecíficos. com 2,5% de soro normal de
burro / 0,2% tween-20 em PBS pH7.4, por 15 minutos à T.A
5. Bloqueio de sítios antigênicos inespecíficos com gelatina de pele de peixe
peixe (fish skin gelatin) / 0,2% tween-20 em PBS pH7.4, por 15 minutos à T.A
6. Incubação com anticorpo primário anti-CRIPTO 1 humano na
concentração de 1:50, diluído na solução de bloqueio descrita no item 4,
overnight à 4° C, em câmara úmida
7. Três lavagens consecutivas com PBS pH 7.4 por 5 minutos à T.A
8. Incubação do anticorpo secundário anti IgG de coelho conjugado com
peroxidase e desenvolvido em cabra, na concentração de 1:100 em PBS (v/v), por 1
hora à T.A., em câmara úmida.
9. Três lavagens consecutivas com PBS pH 7.4 por 5 minutos à T.A.
10. Revelação da atividade enzimática utilizando o reagente “DAB Peroxidase
Substrate” segundo as recomendações do fabricante.
11. Três lavagens consecutivas com PBS pH 7.4 por 5 minutos à T.A.
12. Contracoloração com hematoxilina de Mayer (Sigma) por 1 minuto à T.A.
13. Montagem da lâmina com lamínula de vidro e Entellan®
14. Fotodocumentação em microscópio de luz convencional Axioshop 2,
acoplado ao sistema de captura Axio Vision 4.7
15. Confecção de pranchas morfológicas utilizando-se o Software Adobe
Photoshop CS5 versão 12.0
3.4 Parte 3. Possíveis ações de CR1 nas células HTR8/SVneo por meio de ensaios de invasão, migração e sobrevivência utilizando a proteína recombinante CR1 e o silenciamento de CR1 com RNA de interferência.
56
3.4.1Tratamento das culturas de células HTR8-Sv-neo com CRIPTO1
Antecedendo o tratamento das células HTR8 com CR1 foi analisado o efeito da
depleção de soro sobre a expressão de CR1 por essas células. Esta avaliação é
imprescindível, uma vez que SBF não pode ser utilizado durante as técnicas de
silenciamento gênico e/ou o uso da proteína recombinante. Watanabe e colaboradores
(2007) mostraram que o SBF pode atuar como agente indutor da clivagem da âncora
GPI da proteína CRIPTO1, levando a resultados funcionais equivalentes ao uso de
proteína administrada exogenamente (proteína recombinante nas concentrações de
100 e 200 ng/mL).
Células HTR8 na concentração de 1x105 células/placa foram cultivadas por 18
horas em meio e condições padrão (conforme descritos no item 3.5.3), após o que o
meio foi substituído por outro similar, porém sem SBF; as culturas permaneceram cerca
de 6 horas nesse meio e então receberam CR1 recombinante (R&D), por adicionais 24
e 48 horas. Culturas controle foram mantidas com meio com soro bovino fetal.
Os grupos definidos nesses experimentos foram os seguintes: 1) células HTR8
cultivadas por 24 horas na presença de SBF 10% (controle); 2) células HTR8 cultivadas
por 18 horas na presença de SBF 10% e adicionais 6 horas com depleção total de
soro; 3) células HTR8 cultivadas por 18 horas na presença de SBF 10% e adicionais 6
horas com depleção total de soro e adicionais 24 horas de tratamento com CR1
recombinante na dose de 100ng/m; 4) células HTR8 cultivadas por 18 horas na
presença de SBF 10% e adicionais 6 horas com depleção total de soro e adicionais 48
horas de tratamento com CR1 recombinante nas doses de 0, 50,100 e 200 ng/mL.
Amostras foram então colhidas para análise proteica e gênica de CRIPTO 1 por
Western blot e/ou RT-PCR/PCR e qPCR, respectivamente, conforme descrito
anteriormente (itens 3.2.2 e 3.3.3).
3.4.2 Silenciamento do gene CRIPTO1 nas células HTR8
O silenciamento do gene CRIPTO1 foi realizado em culturas de células HTR8
apresentando cerca de 80% de confluência utilizando-se RNA de interferência,
conforme instruções do fabricante (Silencer® siRNA, Ambion, cat#AM16708 siRNA-ID:
138834). Brevemente, as células HTR8 foram cultivadas em placas de 24 poços com
57
meio DMEM-F12 padrão sem antibióticos. Após 24 horas, o meio de cultivo foi
substituído por OptiMEM® (Life technologies) e as culturas transfectadas com o
oligonucleotídeo de interesse ou com o oligonucleotídeo scramble por um período de
24 horas. A lipofectamina (Life Technologies). foi utilizada nesses experimentos como
carreadora da transfecção. Após o período de transfecção, o meio de cultivo foi trocado
por meio DMEM-F12 padrão completo (acrescido de 10% SBF e antibióticos) e
mantidas em estufa úmida com 5% de CO2, a 37° C, por adicionais 24 horas. As
células foram então tripsinizadas e plaqueadas de acordo com os experimentos de
interesse (que se seguem descritos) ou armazenadas em 300 µL tampão RIPA ou em
Trizol (para extração proteica e de RNA total, respectivamente, conforme já descrito
nos itens 3.2.2 e 3.3.3)
3.4.3 Expressão genica para controle do silenciamento
Para o controle do silenciamento gênico as amostras foram submetidas aos
procedimentos já descritos no item 3.3.4 para o ensaio de RT-PCR seguida de PCR
utilizando-se o primer para CR3 e o controle endógeno GAPDH, utilizado como
normalizador da reação. Após a reação de amplificação, os produtos amplificados
foram submetidos a separação eletroforética em gel de agarose 1%, utilizando-se um
marcador de peso molecular de DNA de 100 pares de bases (Invitrogen, Carlsbad, CA,
USA) para a verificação da presença ou não de bandas..O gel de agarose foi corado
com 3 μL de brometo de etídio (Invitrogen) para a visualização da imagem em
transluminador G-Box Chemi (Syngene, Frederick, MD, EUA) e análise densitométrica
das bandas obtidas utilizando-se o programa GeneSnap (Syngene, Frederick, MD,
EUA). Os dados obtidos foram analisados quanto a sua significância estatística (p ≤
0,05) pelo teste ANOVA com pós-teste de Turkey no software Prism® (GraphPad).
3.4.3 Estudo da proliferação celular na presença de CR1 recombinante
A proliferação celular foi avaliada pela incorporação da 5-bromo-2’-deoxy uridina
(BrdU), utilizando-se o kit 5-bromo-2’-deoxy uridine labeling and detection Kit I (Roche,
#11296736001). As células HTR8 foram plaqueadas na concentração de 1x105
células/placa (seguindo os mesmos padrões descritos no item 3.4.1) em lamínulas
58
redondas de 13 mm de diâmetro acondicionadas em placas de cultivo de 24 poços. As
células foram tratadas com CR1 recombinante nas doses 0, 50, 100 e 200 ng/mL (n=3)
por 23 e 47 horas. Após esses períodos o meio de cultivo foi substituído por DMEM-
F12 puro contendo BrdU na concentração final de 10 µM, seguindo as orientações do
fabricante. As culturas permaneceram então em estufa úmida com 5% de CO2 a 37° C,
por 1 hora.
As lamínulas contendo as células HTR8 foram então removidas do sistema de
cultivo, cuidadosamente lavadas com PBS e fixadas com etanol/ácido acético na
proporção de 3:1 (v/v) por 15 minutos. Seguiram-se então lavagens e incubações de
acordo com o protocolo estabelecido pelo fabricante para o ensaio de
imunofluorescência para a detecção da BrdU incorporado ao DNA celular.
As lamínulas de vidro foram então montadas em lâminas histológicas com meio
de montagem contendo DAPI (Vectashield, Vector) e o material analisado em
microscópio de fluorescência Axioshop 2b (Carl Zeiss), acoplado ao sistema de captura
AxioVision 4.7.
Foram capturadas 5 imagens de cada amostra. Células BrdU reativas foram
quantificadas por meio do programa programa ImageJ. A taxa de proliferação celular foi
expressa pela relação número de células BrdU reativas/ número total de células por
campo microscópico multiplicado por 100. Os dados foram comparados frente os
diferentes tratamentos do estudo por ANOVA seguida de pós teste de Turkey com nível
de significância de 5% (p≤0,05).
3.4.5 Estudo da viabilidade, morte e ciclo celular na presença de CR1 recombinante
Células HTR8 foram cultivadas em placas de 24 poços e tratadas com CR1
recombinante conforme descrito nos itens anteriores (3.4.1) nas concentrações de 50,
100 e 200 ng/mL, pelo período de 24 e 48 horas. As células foram então retiradas da
placa de cultivo por tripsinização e após inativação da tripsina com meio de cultura
DMEM-F12 completo, transferidas para tubos e centrifugadas por 8 minutos à 300 g.
As células precipitadas foram então ressuspendidas em 1 mL de PBS, ao qual foi
adicionado 3 mL de metanol absoluto a 4° C para fixação; as células permaneceram na
solução fixadora acomodadas em gelo por 1 hora.
59
Após esse período as células foram novamente centrifugadas diversas vezes para
a remoção do metanol, nas mesmas condições citadas acima e resuspendidas em uma
solução contendo 200 µL de iodeto de propídeo (10 µg/mL). A solução foi
cuidadosamente agitada e os tubos acomodados em gelo por mais 1 hora.
Para a verificação da viabilidade, morte e ciclo celular, o DNA de cada amostra foi
quantificado em citômetro de fluxo EasyCyte MINI (Guava Technologies), utilizando
osoftware Cytosoft (Data Acquisition ans Analysis Software) versão 4.2.1 (Millipore). Os
ensaios foram realizados em triplicatas e em cada análise, um total de 10.000 eventos
foram analisados.
3.4.6 Análise estatística
Para os experimentos de citometria os dados foram gerados pelo software
Cytosoft (Data Acquisition ans Analysis Software) versão 4.2.1 (Millipore) (Promega,
EUA) e foram analisados quanto a sua significância estatística (p ≤ 0,05) pelo teste
ANOVA com pós-teste de Turkey no software Prism®.
3.4.7 Estudo da migração e invasão das células HTR8 sob o tratamento com CR1 recombinante
O efeito de CR1 sobre a atividade migratória e invasiva das células trofoblásticas
das linhagens HTR8-SVneo foi avaliado utilizando-se câmaras bipartites (Transwell,
BD), utilizando filtros com poros de 8 μm em placas de 6 poços cobertos com Matrigel
(ensaios de invasão) ou não (ensaios de migração).
Brevemente, após 18 horas de cultura com meio de cultivo DMEM-F12 completo e
6 horas em meio depletado de SBF (item 3.4.1) as células HTR8-SVneo apresentando
cerca de 80% de confluência foram tripsinizadas e contadas. Um total de 0,5 x 105
células/mL foram colocadas na porção superior do transwell diretamente sobre a
membrana com poros. Nos ensaios de invasão, a membrana porosa foi previamente
coberta com 15 µL de Matrigel (BD, diluído em DMEM-F12 puro gelado na proporção
1:1, v/v).
Em ambos os ensaios, o compartimento superior foi completado com 200 µL e o
inferior com 300 µL de meio DMEM-F12 completo, porém sem soro bovino fetal. No
compartimento superior juntamente com as células HTR8 foi também adicionada a
60
proteína CR1 recombinante nas doses de 0 (veículo de diluição da proteína
recombinate: 0,1% de BSA), 50, 100 ou 200 ng/mL.
Células migratórias/invasivas atravessam a membrana porosa e ficam localizadas
na sua face inferior ou no interior do Matrigel, respectivamente. Dessa forma, 24 horas
após o tratamento, os transwells tiveram o meio removido do compartimento superior e
a face antes em contato com esse meio, delicadamente limpa com um cotonete. As
células migratórias/invasivas na face inferior ou na membrana de Matrigel foram então
fixadas em metanol gelado por 20 minutos. Após este período, as membranas foram
recortadas, coradas com DAPI (Vectashield), depositadas em lâminas histológicas e
recobertas por lamínulas de vidro. O material foi analisado sob o microscópio de
fluorescência Axioshop 2, acoplado ao sistema de captura Axio Vision 4.7. Foram
adquiridas imagens de 5 campos microscópicos de cada amostra, tendo sido cada
experimento realizado em triplicata (n=3 para cada dose testada). A quantificação das
células migratórias foi realizada por meio do programa ImageJ.
Os valores obtidos (número de células por membrana) foram expressos como
média de cada grupo experimental associado ao desvio padrão e comparados
estatisticamente por análise de variância (ANOVA), seguido pelo teste de comparações
múltiplas Bonferroni e/ou Mann-Whitney U-test utilizando-se o Graph Pad Prisma,
versão 3 para Windows (Graph Pad Software, San Diego, CA, USA). Adotou-se o limite
de 5% para a significância estatística (p<0,05).
3.4.8 Estudo da migração e invasão das células HTR8 após silenciamento da expressão gênica de CRIPTO1
À semelhança do tratamento com CRIPTO 1 recombinante, o efeito do siRNA
para CR1 (ver detalhamento do silenciamento no item 3.4.2) sobre a atividade
migratória das células trofoblásticas das linhagens HTR8-SVneo foi avaliado utilizando-
se câmaras bipartites do tipo Transwell, conforme descrito no item 3.4.7. Nestes
experimentos, células HTR8 silenciadas para o gene CRIPTO1 foram inseridas no
compartimento superior do transwell nas mesmas condições anteriormente descritas.
61
4 RESULTADOS
62
4.1 Parte 1. Imunolocalização de CRIPTO1 em Placentas Saudáveis e
Comprometidas com Distúrbio Trofoblástico de Invasividade
Fez parte dos resultados referentes a detecção da proteína CRIPTO1 em
placentas saudáveis e comprometidas com distúrbios de invasividade, a
imunolocalização em placentas saudáveis de 1º e 3º trimestre de gestação, em
placentas acretas (placentas acreta, percreta e increta) e em amostras de
coriocarcinoma. Os resultados obtidos com as placentas saudáveis e acretas estão
publicados no manuscrito “Tumorigenic Factor CRIPTO-1 Is Immunolocalized in
Extravillous Cytotrophoblast in Placenta Creta”, autores: Carla Letícia Bandeira,
Alexandre Urban Borbely, Rossana Pulcineli Vieira Francisco, Regina Schultz, Marcelo
Zugaib e Estela Bevilacqua, no periódico BioMed Research International, 2014: ID
892856, 9 páginas, 2014. Doi 10.1155/2014/892856 262-270. O acesso ao artigo pode
ser obtido na página da internet: http://dx.doi.org/ 10.1155/2014/892856.
Para a análise de áreas similares da interface materno-fetal nas diferentes
amostras, as amostras foram coradas com a Hematoxilina e Eosina (não mostrado) e
caracterizadas pela imunolocalização de vimentina (filamento intermediário peculiar de
células de origem mesenquimal), citoqueratina 7 (filamento intermediário peculiar a
células de origem endodérmica e ectodérmica; particularmente a citoqueratina 7 é
predominantemente encontrada em células trofoblásticas) e CRIPTO 1 em preparados
histológicos semi-seriados.
4.1.1 Imunolocalização de CR1 em Placentas Normais de Primeiro Trimestre e em
Coriocarcinomas
Células trofoblásticas tumorais foram evidenciadas pela imunocoloração com
citoqueratina 7, como pode ser observado na Figura 3A,C. Em preparados histológicos
semiseriados foi também possível observar a forte reatividade à proteína CRIPTO1
nessas células (Figura 3B,D).
Nas placentas de primeiro trimestre de gestação, observou-se que a
imunomarcação de CRIPTO1 (Figura 3F) localizou-se preferencialmente nas células
do citotrofoblasto viloso e extraviloso (identificadas pela reatividade a citoqueratina 7,
Figura 3E). No endométrio também foram observadas células reativas ao anticorpo.
63
Figura 3. Imunolocalização de CRIPTO 1 em Placentas de Primeiro Trimestre e
Coriocarcinoma Placentário
Figura 3. Imunolocalização de Citoqueratina7 (A,C,E) e CRIPTO1 (B,D,F) em
coriocarcinoma placentário (A-D) e em placentas de primeiro trimestre (E-F). Cabeças de
seta indicam células reativas aos anticorpos (coloração marrom: em A,C,E, citoqueratina 7,
biomarcador de células trofoblásticas, em B,D,F, CRIPTO1) em secções histológicas semi-
seriadas. O asterisco indica células não trofoblásticas reativas ao CRIPTO1. (v, vilosidade
coriônica; e, endométrio; CTEV, citotrofoblasto extraviloso, tt, células trofoblásticas tumorais).
64
4.1.2 Imunolocalização de Citoqueratina em Placentas Normais de Terceiro Trimestre e
em Placentas Acretas
A imunolocalização de citoqueratina 7 em secções da face uterina da interface
materno-fetal de placentas normais e acretas permitiu a identificação das células do
citotrofoblasto extraviloso (Figura 4). Nas placentas saudáveis a termo, estas células
espalhadas ou em ninhos no tecido materno apresentaram forma poligonal e diferentes
dimensões (Figura 4a-d). Via de regra, estas células exibiram características de
células sinteticamente ativas com núcleos eucromáticos e nucléolos evidentes. Células
citoqueratina reativas foram comuns ao redor ou revestindo vasos maternos (Figura
4a). Nas placentas com acretismo, células citoqueratina positivas foram encontradas
entre as células miometriais e diferiram das células das placentas saudáveis. Estas
células geralmente se organizaram em grupos compactos de células morfologicamente
homogêneas que lembravam colônias celulares (Figuras 4-g), embora células
esparsamente distribuídas também pudessem ser observadas (Figuras 4h-j). Muitas
dessas células mostraram características de células migratórias (forma estrelada e
longas projeções) (Figuras 4h-j).
65
Figura 4 - Caracterização Histológica de Placentas Saudáveis e Acretas
Figura 4. Caracterização Histológica de Placentas Saudáveis e Acretas. Secções
histológicas representativas dos diferentes grupos revelaram células citoqueratina 7 positivas
(coradas em castanho) no leito placentário de gestações a termo saudáveis (36 semanas de
gestação) (a-d) e de placentas com acretismo (e-j: placentas acretas; acreta e,g,i; percreta:
f,h,j). Notar nas placentas saudáveis (a-d), que as células reativas à citoqueratina 7 estão
dispostas como grupos de grandes células poligonais que aparentemente não mantêm contato
com células adjacentes. Na figura b notar uma típica célula trofoblástica multinucleada. Nas
amostras de placentas acretas (e-j), as células citoqueratina-positivas estão organizados como
grupo de células compactas (e-g) ou como células isoladas em forma de estrela (i-j). As setas
66
indicam células trofoblásticas multinucleadas (h). Revelação por imunoperoxidase,
contracoloração por hematoxilina de Mayer. Modificado de Bandeira et al., 2014.
4.1.3 Imunolocalização de CRIPTO1 em Placentas Normais de Terceiro Trimestre e em
Placentas Acretas
Células citoqueratina-reativas exibindo características morfológicas de células do
citotrofoblasto extraviloso (CEVT) (Figuras 5b,e,h) também foram fortemente reativas
ao anticorpo anti-CRIPTO 1 (Figura 5c,f,i) na interface materno fetal de placentas de
gestações saudáveis obtidas de 36 a 40 semanas de gestação. Poucas células
endometriais vimentina-positivas (Figuras 5a,d,g) mostraram correspondência nas
imunorreações para CRIPTO1 (Figuras 5c,f,i).
67
Figura 5 - Imunolocalização de CRIPTO1, Citoqueratina7 e Vimentina em Placentas a
Termo de Gestações Saudáveis
Figura 5. Imunolocalização de CRIPTO 1, Citoqueratina7 e Vimentina em Placentas a
Termo de Gestações Saudáveis. Cortes histológicos representativos demonstrando a
imunolocalização de vimentina (Vm: a,d), citoqueratina (CK: b,e) e CRIPTO-1 (CR-1: c,f) em
leito placentário de placentas saudáveis de36 (a,c ) e 38 (d,f) semanas de gestação. As setas
indicam células reativas à citoqueratina e CRIPTO-1 em cortes histológicos semi-seriados. Os
asteriscos identificam áreas vasculares coradas para vimentina e CRIPTO-1 (a,c), mas não
68
para citoqueratina (b). (g-i) Controle negativo das reações imunoistoquímicas, nos quais o
respectivo anticorpo primário foi omitido. Revelação por imunoperoxidase, contracoloração por
hematoxilina de Mayer. w: semanas de gestação; d: decídua; cabeças de setas: células
trofoblásticas extravilosas; *, ***, **: áreas vasculares imunorreativas para CR1, vimentina e
não reativas para citoqueratina, respectivamente. Figura modificada de Bandeira et al., 2014.
A interface materno-fetal nas placentas acretas (Figura 6) caracterizou-se por
hemorragia, presença de infiltrado leucocitário, áreas de edema e/ou necrose e quase
total ausência de células deciduais. Neste estudo, a análise da imunoreatividade a
CRIPTO1 nessas amostras foi realizada na área de transição entre o endométrio e o
miométrio nas placentas acretas e no miométrio nas placentas incretas e percretas.
Células endoteliais, leucócitos e fibroblastos mostraram-se reativos à vimentina
(Figuras 6A, g-i). Células citotrofoblásticas citoqueratina-positivas foram observadas
permeando células musculares (Figuras 6A, a-c). Nas placentas incretas as células
trofoblásticas atingiram as camadas mais profundas do miométrio, enquanto que nas
percretas, essas células foram também observadas revestindo externamente o
perimétrio. Agregados de células citoqueratina positivas também revestiam ou
circundavam vasos uterinos. A imunomarcação para CRIPTO1 colocalizou-se com a
maioria das grandes células citoqueratina positivas (Figura 6A, d-f) em todas as
amostras analisadas, embora a expressão de CR1 não tenha sido exclusiva desta
população. Células endoteliais e miometriais também foram reativas ao anticorpo anti–
CRIPTO1.
Não houve imunoreatividade detectável em nenhuma das reações controle, nas
quais o anticorpo primário foi omitido (Figuras 5j-l, 6j-l)
A quantificação das células reativas à citoqueratina e CR1 na interface materno-
fetal mostrou significativo aumento de reatividade para CR1 (13,67 ± 1,55, p=0,001) e
para a relação CR1/citoqueratina (1,61 ± 0,53, p=0,02), mas não para citoqueratina
(10,46 ± 4,97) em placentas acretas em comparação com o grupo controle (Figura 6B).
A intensidade de reatividade foi maior para CR1 do que para citoqueratina nas
placentas incretas e percretas (Figura 6C, 12,54 ± 2 vs. 9,09 ± 3,11, p=0,008 and 18,22
69
± 4,26, p=0,04) e também maior do que a reatividade para CR1 nas amostras controles
(p<0,05). A relação CR-1/citoqueratina foi cerca de 2 vezes maior nas placentas
patológicas (increta, 1,47 ± 0,35 e percreta, 1,65 ± 0,54, p<0,05) do que nas placentas
controle.
Figura 6 - Imunolocalização de CRIPTO 1, Citoqueratina7 e Vimentina em Placentas
Acretas
Figura 6. Imunolocalização de CRIPTO 1, Citoqueratina7 e Vimentina em Placentas
Acretas. (A) cortes histológicos representativos demonstrando a imunolocalização de
citoqueratina (CK: a-c), CRIPTO-1 (CR-1: d-f) e vimentina (VM: g-i) em casos de placentas
acretas (a,d,g,j), incretas (b,e,h,k) e percreta (c,f,i,l). As cabeças de setas indicam células
reativas à citoqueratina e CRIPTO-1 em cortes histológicos semiseriados. As setas
representam as células vimentina-positivas. (C, j-l) Controle negativo das reações
imunoistoquímicas em que o respectivo anticorpo primário foi omitido. Revelação por
imunoperoxidase, contracoloração por hematoxilina de Mayer. (B-C) Quantificação da
70
imunorreatividade (pixels /µm2) para as proteínas citoqueratina (CK) e CRIPTO-1 (CR-1) na
interface materno-fetal de placentas de mães saudáveis (36ª semana de gestação) e placentas
acretas (B), e de placentas saudáveis (38ª semana de gestação) e placentas incretas e
percretas (C). Letras diferentes sobrescritas acima das barras indicam o grupo estatístico
analisado, e os números distintos mostram diferenças estatísticas, p <0,05, ao passo que os
números semelhantes não diferem estatisticamente. Os asteriscos indicam diferenças
significativas em relação à CK no mesmo grupo (p <0,05). Figura modificada de Bandeira etal.,
2014.
4.2 Parte 2. Expressão de CRIPTO em Células do Citotrofoblasto Extraviloso de
Placentas Saudáveis e em Células Linhagem de Célula Citotrofoblástica
HTR8/Sv-neo
4.2.1 Expressão Gênica de CRIPTO 1 e CRIPTO 3
Os RNAm de placentas de primeiro trimestre e de suas células citotrofoblásticas
isoladas cultivadas ou não, e de células citotrofoblásticas extravilosas isoladas de
placentas de terceiro trimestre e de células da linhagem citotrofoblásticas HTR8 foram
avaliados por RT-PCR. A Figura 7, representativa das análises realizadas, mostra um
gel de agarose contendo o produto da PCR amplificado com primers específicos para
CRIPTO 1 e 3.
Como pode ser observado a expressão do gene CRIPTO 1 foi exclusivamente
observada nas amostras de células citotrofoblásticas extravilosas obtidas de placentas
a termo. Nas demais amostras, o que incluiu células citotrofoblásticas de primeiro
trimestre e células da linhagem citotrofoblástica HTR8, também de primeiro trimestre,
apenas o RNAm de CRIPTO 3 foi detectado (Figura 7A).
71
Figura 7 - Expressão Gênica e Proteica de CRIPTO 1 e 3 em Células Placentárias
Primeiro e Terceiro Trimestre de Gestação
Figura 7. Expressão Gênica de CRIPTO 1 e 3 em Células Placentárias de Primeiro e
Terceiro Trimestre de Gestação. (A) Geis de agarose representativos dos produtos de PCR
amplificados a partir de cDNA obtidos de placentas de primeiro trimestre (PL, 1-3), células
citotrofoblásticas isoladas de vilosidades coriônicas de primeiro trimestre (CT1Ti, 4-6), células
citotrofoblásticas isoladas de vilosidades coriônicas de primeiro trimestre diferenciadas em
células migratórias em cultura (CTEV 1Ti, 7-9), células trofoblásticas isoladas de placentas de
terceiro trimestre (CTEV 3T, 10-12) e células da linhagem HTR8 (HTR8, 13-15). Como controle
endógeno da reação, utilizou-se o gene GAPDH. PM: padrão de peso molecular; CR1:
CRIPTO-1; CR3: CRIPTO-3; GAPDH: gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase; pb: pares de
bases. CTEV: citotrofoblasto extra viloso. (B) Gel de poliacrilamida-SDS representativo do
imunobloting com o anticorpo anti CR1. Observa-se a presença da proteína com cerca de 50
kDa em células CTEV e HTR8-SVneo. kDa: quilodaltons.
72
4.2.2 Expressão Proteica de CRIPTO por Western Blot e Imunoistoquímica
Níveis proteicos de CRIPTO foram encontrados nas células citotrofoblásticas
extravilosas isoladas de placentas a termo e em células da linhagem HTR8 obtidas a
partir de células citotrofoblásticas de primeiro trimestre gestacional, avaliados pela
técnica de Western blot com anticorpo específico anti-CRIPTO (Figura 7B).
Por meio de técnicas imunoistoquímicas também foi possível localizar a
distribuição de CRIPTO nas células HTR8-SVneo. A imunoreatividade citoplasmática
perinuclear sugere a localização da ancorada de CRIPTO (Figura 8).
Figura 8. Imunolocalização de CRIPTO nas Células HTR8-SVneo
Figura 8. Imunolocalização de CRIPTO nas Células HTR8-SVneo. Fotomicroscopia
representativa de uma reação de imunofluorescência para a localização de CRIPTO nas
células HTR8-SVneo. Marcador nuclear: DAPI; marcador de CRIPTO: FITC. Observar a
localização citoplasmática, com regiões perinucleares.
73
4.3 Parte 3. Possíveis Ações de CRIPTO1 nas Células HTR8/SVneo por meio de
Ensaios de Invasão, Migração e Sobrevivência Utilizando a Proteína
Recombinante CR1 e o Silenciamento de CR1 com RNA de Interferência.
4.3.1 Tratamento das Culturas de Células HTR8-Sv/neo com CRIPTO1
O efeito do tratamento com CRIPTO 1 recombinante na expressão gênica da
própria proteína pelas células HTR8-SVneo foi realizada por RT-qPCR. Para esse fim,
utilizou-se um iniciador que, além de permitir avaliações quantitativas, reconhece as
duas formas do fator CRIPTO – CRIPTO 1 e CRIPTO 3. Também foi avaliada a
interferência do soro bovino fetal na expressão proteica de CRIPTO por estas células.
Células HTR8-SVneo mantidas em cultura por 48 horas na presença de CR1
recombinante humano nas doses de 0, 50, 100 e 200 ng/mL mostraram um aumento
significativo nos níveis do RNA mensageiro de CRIPTO nas doses de 50 e 100 ng/mL,
conforme observado na Figura 9. Os níveis de CRIPTO observados nas células
tratadas com CR1 na dose de 200 ng/mL, apesar de superiores ao controle,
apresentam-se diminuídos em relação às demais concentrações utilizadas (50 e 100
ng/mL).
74
Figura 9. Expressão Gênica de CRIPTO em Células HTR8-SVneo Tratadas com CR1
Recombinante
Figura 9. Expressão Gênica de CRIPTO por RT-qPCR em Células HTR8-SVneo Tratadas
com CRIPTO 1 Recombinante. Notar o incremento nos níveis de CRIPTO em relação ao
controle. Asteriscos indicam dados significativamente aumentados em comparação com os
controle: (*) p<0,002; (**); p<0,05.
As células HTR8 mostraram uma diminuição significativa dos níveis proteicos de
CRIPTO após 6 horas de depleção de soro bovino fetal do meio de cultura (p<0,006).
Esses níveis, no entanto, se restabeleceram após 24h de cultura na presença de
CRIPTO1 recombinante, tornando-se mais acentuado após 48h de tratamento (p=0,032
em relação ao controle e p=0,004 em relação ao controle sem soro, Figura 10).
75
Figura 10. Efeito da Depleção do Soro sobre a Expressão Proteica de CRIPTO1
Figura 10. Efeitos da Depleção do Soro sobre a Expressão Proteica de CRIPTO1.
(A) Imunoblotting para CRIPTO das amostras de células HTR8-SVneo obtidas nas seguintes
condições de cultivo: SBF - 24 horas de cultivo com SBF 10%; SS - 18 horas de cultivo com
SBF 10% + 6 horas em depleção de soro; CR24 – 18 horas de cultivo com SBF 10% + 6 horas
em depleção de soro + 24 horas de tratamento com CR1 100ng/mL; CR48 - 18 horas de
cultivo com SBF 10% + 6 horas em depleção de soro + 48 horas de tratamento com CR1
100ng/mL. Bandas inferiores (P) foram coradas com Ponceau e utilizadas para a normalização
dos dados. (B) Densitometria das bandas obtidas (n=3) mostrando a redução da expressão de
CRIPTO endógeno na ausência de soro e o aumento de CRIPTO nas culturas tratadas com
esse fator de crescimento.
76
4.3.2 Estudo da Proliferação de Células HTR8 na Presença de CR1 Recombinante
Os efeitos de CRIPTO sobre a proliferação celular foi estimado a partir da
incorporação de 5-bromo-2’-deoxy uridina (BrdU). O número de células BrdU reativas
aumentou após 48h de cultura em todos os grupos analisados, inclusive nos grupos
controle (Figura 11B). Não houve diferenças estatisticamente significativas entre os
grupos experimentais (Figura 11).
Figura 11 - Efeito de CRIPTO1 Recombinante Sobre a Proliferação de Células HTR8
Figura 11 - Efeito de CRIPTO1 Recombinante Sobre a Proliferação de Células HTR8. (A-
D, a-d) Imagens representativas das reações imunoistoquímicas para a detecção de
bromodeoxiuridina (BrdU). Em A-D, núcleos corado pelo DAPI. Em a-d, imunofluorescência
(FITC) mostrando núcleos BrdU reativos. Aumento 20X. (E) O gráfico mostra as taxas de
células BrdU reativas nos diferentes tratamentos com CRIPTO 1 recombinante.
E
77
4.3.3 Análise da Viabilidade e Morte das Células HTR8 na Presença de CRIPTO1
Recombinante
A viabilidade celular e morte por apoptose foi analisada nos diferentes
tratamentos com CRIPTO1 recombinante por meio da incorporação de iodeto de
propídeo e análise em citometria de fluxo. Os efeitos da proteína recombinante no
período de 24 e 48 horas de cultura não demonstraram diferenças estatísticas
significativas em relação ao controle em nenhum dos parâmetros analisados: apoptose
(Figura 12A) e viabilidade celular (Figura 12B).
78
Figura 12 – Efeito do Tratamento com CRIPTO Recombinante sobre Morte e
Viabilidade das Células HTR8/SV-neo
Figura 12 – Efeito do Tratamento com CRIPTO Recombinante sobre Morte e Viabilidade
das Células HTR8. Representação gráfica dos resultados obtidos a partir da citometria de
fluxo. (A) Porcentagem de células em apoptose e (B) porcentagem de células viáveis por cada
10.000 eventos analisados. (C) Gráfico representativo da distribuição das células analisadas
pelas diferentes fases do ciclo celular. M1: células haplodiplóides (em apoptose); M2: fases
G0/G1; M3: fase de síntese; M4: fases G2/mitose. As células viáveis compreendem aquelas
distribuídas entre os períodos M2, M3 e M4.
79
4.3.4 Ensaios de Migração e Invasão Celular na Presença de CRIPTO1 Recombinante
Os ensaios de migração celular foram realizados em câmaras bipartite
(transwells) pelo período de 24 e 48 horas. Os resultados demonstraram um
incremento na atividade migratória das células HTR8-SVneo tratadas com CRIPTO1
em relação ao controle para todos os grupos analisados no período de 24 horas, assim
como, um aumento ainda mais substancial na atividade migratória compreendendo o
período de 48 horas (Figura 13).
Durante as primeiras 24 horas do ensaio as doses de 50, 100 e 200 ng/mL não
apresentaram diferenças estatísticas entre si, apenas em relação ao controle (p<0.05).
Após 48 horas, uma diferença significativa foi observada entre o grupo que recebeu
200 ng/mL de CRIPTO1 recombinante e os grupos que receberam 50 e 100 ng/mL de
CR1 recombinante (p<0.01). Os grupos tratados com CRIPTO1 recombinante por 48
horas também apresentaram diferenças significativas em relação ao controle, com
p<0.02 para os grupos de 50 e 100 ng/mL, e p<0.001 para o grupo de 200 ng/mL
(Figura 13A).
80
Figura 13 – Efeito de CRIPTO1 Recombinante sobre a Migração das Células HTR8
Figura 13 – Efeito de CRIPTO1 Recombinante sobre a Migração das Células HTR8
(A) Representação gráfica dos resultados obtidos a partir dos ensaios de migração realizados
com câmaras bipartites. Notar o aumento no número de células migratórias em os grupos
tratados com CRIPTO1 (CR1) em relação ao controle em ambos os tempos de cultura, 24 e
48h. No período de 48 horas, diferenças estatísticas são observadas entre o grupo tratado com
CR1 200 ng/mL e as demais condições experimentais. *p<0.05; **p<0.01; #p<0.001. (B)
Fotomicrografias da porção inferior da membrana da câmara bipartite, evidenciando os núcleos
de células migratórias. Coloração: DAPI. Aumento: 20X.
81
Os resultados dos ensaios de invasão celular, também realizado em câmaras
bipartites (do tipo transwell), porém na presença de uma camada de Matrigel também
mostraram diferenças estatísticas entre os grupos tratados com CRIPTO1 e o controle
(Figura 14). Nas primeiras 24 horas do ensaio houve um aumento significativo entre o
grupo controle e o tratado com 100 ng/mL de CR1 recombinante (p<0.03), assim como
entre este e o grupo tratado com 50 ng/mL de CR1 recombinante (p<0.03) (Figura
14A). Após 48 horas de tratamento, os dois grupos tratados com CRIPTO1
recombinante (50 ng/mL e 100 ng/mL) mostraram maiores índices de invasão das
células HTR8 (p<0.003 e p<0.01, respectivamente) (Figura 14B).
Figura 14 – Efeito do Tratamento com CRIPTO1 Recombinante sobre a Atividade
Invasiva das Células HTR8
Figura 14 – Efeito do Tratamento com CRIPTO1 Recombinante sobre a Atividade Invasiva
das Células HTR8. (A-B) Representação gráfica dos resultados obtidos a partir dos ensaios de
invasão com câmaras bipartites. Notar o aumento nas taxas de invasão celular nos grupos
*, **
*
*
82
tratados com 100 ng/mL de CRIPTO1 após 24h de cultivo (p=0,03) e com 50 (p=0,003) e 100
ng/mL (p=0,001) após 48 h de cultivo, em relação aos respectivos controles. (C-E)
Fotomicrografias evidenciando os núcleos de células que invadiram a película de Matrigel e
alcançaram a porção inferior da membrana da câmara bipartite, em experimentos em que as
culturas de células HTR8 foram tratadas com 0 (C), 50 (D) e 100 (E) ng/mL de CRIPTO1
recombinante. Coloração nuclear: DAPI. Aumento: 20X.
4.3.5 Migração das Células HTR8 após Silenciamento da Expressão Gênica de CRIPTO
4.3.5.1 Silenciamento do gene CRIPTO nas células HTR8
As células HTR8-SVneo submetidas ao tratamento com RNA de interferência e
cultivadas por um período de 48 horas tiveram seu conteúdo de RNA mensageiro
avaliado por RT-PCR seguida de PCR e eletroforese em gel de agarose. O iniciador
que reconhece CRIPTO1 e 3 foi utilizado para a amplificação dos produtos, no entanto
conforme resultados anteriormente descritos, HTR8 expressa apenas CRIPTO3.
Diferentes concentrações e tempos para a transfecção do RNA de interferência foram
testados (dados não mostrados). A dose que se mostrou mais efetiva, com a quase
total ausência da mensagem de CRIPTO nas células tratadas com o siRNA alvo, foi a
de 90 nM, com um tempo de transfecção de 24 horas (Figura 15).
Figura 15 – Gel Representativo do dos Produtos de PCR após o Silenciamento do
Gene CRIPTO
Figura 15 - Gel Representativo do dos Produtos de PCR após o Silenciamento do
Gene CRIPTO. Notar a quase total ausência de mensagem para o gene CRIPTO nas
83
células tratadas com RNA de interferência (A e C) por 48 horas em relação ao controle
transfectado com o controle “scramble” (RNA de interferência sem complementaridade
com mensagens existentes em células mamíferas, B e D). (a-d) Controle endógeno das
reações, GAPDH. PM: padrão de peso molecular; CR3: CRIPTO3; GAPDH: gliceraldeído-
3-fosfato desidrogenase.
4.3.5.2 Migração das Células HTR8
A influência do silenciamento de CRIPTO sobre a migração das células HTR-
Sneo foi avaliada por ensaio com câmara bipartite, por 48 horas, após a transfecção. O
silenciamento da expressão de CRIPTO levou a uma significativa diminuição na
migração das células HTR8 (p=0,002), em relação às células transfectadas com a
sequência “scramble”. Os resultados estão representados na Figura 16.
84
Figura 16 – Efeito do Silenciamento de CRIPTO sobre a Migração das Células
HTR8/SVneo
Figura 16 - Efeito do Silenciamento de CRIPTO sobre a Migração das Células
HTR8. Ensaios de migração em câmaras bipartites foram usados para a verificação dos efeitos
da ausência de CRIPTO sobre a migração celular. (A-B) Fotomicrografias da porção inferior da
membrana da câmara bipartite, evidenciando os núcleos das células migratórias corados com
DAPI nos experimentos tratados com o RNA de interferência (A) e o RNA “scramble” (B). (C)
Gráfico representativo onde se evidencia a diminuição significativa das taxas de migração nos
experimentos tratados com o RNA de interferência em relação ao tratado com o RNA
“scramble” (controle) (p<0,002).
85
5 DISCUSSÃO
86
CRIPTO1 é considerado um fator tumorigênico, uma vez que se encontra
ausente ou pouco expresso em tecidos saudáveis, mas, é secretado em altos níveis
por diferentes tumores, como cânceres de cólo, mama, pulmão, testículo, ovário,
pâncreas e estômago, entre outros (MALLIKARJUNA et al., 2007; NORMANNO et al.,
2004; SALOMON et al., 2000). Nesse estudo, objetivamos verificar a presença de
CRIPTO1 na interface materno fetal, em células trofoblásticas de gestações saudáveis
e patológicas, com alterações nos processos de invasão dos tecidos uterinos pelas
células trofoblásticas.
Os mecanismos celulares que regem a homeostase da interface materno fetal
no que diz respeito à regulação da atividade invasiva e migratória do trofoblasto ainda
não foram totalmente elucidados, apesar da ampla gama de moléculas de sinalização e
reguladoras já descritas na literatura (FRANK; KAUFMANN, 2006; KNÖFLER, 2010).
Esse processo invasivo, temporal e espacialmente regulado em condições normais,
compartilha inúmeras similaridades com a invasão tumoral (BISCHOF; CAMPANA,
2000; TACHI et al., 1970) e torna o estudo do fator tumorigênico CRIPTO1 nas células
trofoblásticas, um tema de promissor interesse.
5.1 CRIPTO1 em Placentas de Terceiro Trimestre e em Placentas Acretas
Este estudo mostrou a expressão do fator CRIPTO1 (CR1) na interface materno
fetal, particularmente nas células morfologicamente caracterizadas como células
citotrofoblásticas extravilosas (CTEV) no leito placentário de placentas oriundas de
gestações saudáveis ou com acretismo. Células reativas ao CR1 também foram
morfologicamente semelhantes a populações celulares vimentina- positivas
encontradas em placentas normais, morfologicamente caracterizadas como células
endoteliais, leucócitos, fibroblastos e células deciduais. Nas placentas patológicas
padrão semelhante foi observado, com exceção às células deciduais, praticamente
ausentes nas placentas acretas. A imunorreatividade para CR1 nas células não
trofoblásticas pode estar associada a múltiplas atividades celulares. Em processos
tumorais, por exemplo, a forma solúvel da proteína age sobre a migração endotelial
contribuindo dessa forma com a angiogênese local (WATANABE et al., 2007a), em
87
cardiomiócitos e células nervosas, age estimulando ou inibindo a diferenciação celular
(CHAMBERY et al., 2009; PARISI et al., 2003) e em células mamárias, ativa a
sobrevivência celular (NIEMEYER et al., 1998).
Em placentas de terceiro trimestre de gestações saudáveis, houve uma relação
positiva entre o número de células citoqueratina e células CR1 reativas, ambas
apresentando as mesmas características morfológicas, durante os períodos estudados
(36, 38 e 40 semanas de gestação). Ao longo da gestação normal, a expressão de CR1
acompanhou a expressão de células citoqueratina positivas, com uma expressão
progressivamente menor nas fases mais adiantadas da gestação. Estes achados
sugerem um papel funcional relevante para o CRIPTO na biologia dessas células, mas
provavelmente não associado aos mecanismos de parto. As ações atribuídas ao fator
CRIPTO 1 incluem ativação de migração, proliferação e sobrevivência celular (BIANCO
et al., 2005; KLAUZINSKA et al., 2014) atividades que estão francamente diminuídas
ou ausentes nas células trofoblásticas nas fases pré-parto (FRANK; KAUFFMAN,
2006).
Placentas acretas são histologicamente caracterizadas pela ausência de
decídua, apresentando as vilosidades coriônicas em contato direto com o miométrio
subjacente (BENIRSCHKE et al., 2006), motivo pelo qual diversos autores atribuem a
etiologia da doença a essa consequente falta de modulação das células deciduais
sobre as células trofoblásticas extravilosas (CTEV) (FOX, 1972; HUTTON et al., 1983;
IRVING et al., 1937; MILLER et al., 1959). Corroborando essa hipótese, diferentes
autores demonstraram que a probabilidade de desenvolvimento do acretismo
placentário aumenta na presença de placenta prévia (CLARK et al.,1985; SILVER et
al., 2006), quando a inserção da placenta ocorre em sítios uterinos de discreta ou
ausente decidualização (KHONG, 2008). Além disso, esses índices aumentam quando
a presença de placenta prévia está também associada a existência de uma cicatriz
uterina anterior, região que tampouco apresenta decidualização (MILLER et al., 1997).
Por outro lado, mulheres primigestas podem desenvolver acretismo placentário
(DASSARI et al., 2010) o que levanta a possibilidade de participação de uma invasão
88
excessiva pelas células trofoblásticas contribuindo para essa patogenia (CRAMER et
al.,1987; KIM et al., 2004; STANEK et al., 2007). Neste contexto, o acretismo
placentário é considerado uma patogenia multifatorial, aonde são fatores de relevância:
a decidualização ausente e/ou deficiente, a interação anormal entre células
trofoblásticas e a decídua com consequente estabelecimento de uma vascularização
uteroplacental atípica, a invasão exacerbada das células CTEVs no tecido uterino, e
consequentemente, a aderência anormal da placenta (BENIRSCHKE et al., 2006;
KHONG; ROBERTSON, 1987).
Placentas acretas mostraram um padrão de distribuição de células
citotrofoblásticas extravilosas distinto do padrão disperso apresentado nas placentas
normais. Nessas placentas, as células CTEVs apresentaram-se com alto grau de
confluência, formando cordões difusos ou grandes conglomerados. Esses achados
estão de acordo com os resultados encontrados por Kim e colaboradores (2004). Nas
camadas musculares mais profundas (miométrio e/ou perimétrio), prevaleceu a
presença de células mono ou multinucleadas, com nucléolo evidente e formato irregular
com frequente presença de projeções citoplasmáticas. Células poliploides de grandes
dimensões, mono ou multinucleadas, com baixa ou nenhuma atividade invasiva são
características do terceiro trimestre (FRANK; KAUFMANN, 2006), contudo,
diferentemente das observadas nas placentas acretas, essas células apresentam forma
bastante regular sem a presença de projeções citoplasmáticas. Essas diferenças
sugerem a expressão de um fenótipo invasivo nessas células nos processos
patológicos, o que também foi sugerido por Kim e colaboradores (2004).
A expressão de CR1 nas placentas acretas acompanhou o aumento de células
citoqueratina positivas. Além disso, as três formas de acretismo estudadas (acreta,
increta e percreta) apresentaram níveis mais elevados dessa proteína em relação às
placentas normais, indicando uma relação positiva entre a expressão de CRIPTO 1 e
essas patologias. Nas placentas acretas, as células trofoblásticas extravilosas
apresentam-se em número aumentado, embora a análise da atividade proliferativa
realizado por Kim et al. (2004) não tenha detectado atividade proliferativa nessas
89
células. No entanto, é possível que o aumento da atividade proliferativa dessas células
tenha ocorrido em fases anteriores à estudada por Kim e colaboradores. Neste
contexto, é possível que o número aumentado de células CTEVs, citoqueratina reativas
observado nesse estudo, seja a consequência de atividades proliferativas em fases
anteriores da gestação. Uma vez que este estudo ateve-se a análise de placentas a
termo, não é possível inferir qualquer participação do fator CRIPTO1 nessa atividade
trofoblástica.
O aumento de células reativas ao anticorpo anti-CRIPTO1 nas células do CTEV
das placentas acretas em relação às placentas normais, ou seja em placentas em que
a decidualização ocorre de forma inadequada, pode indicar um mecanismo de
regulação dos níveis de CRIPTO1 por parte das células deciduais. Em tumores,
CRIPTO1 induz invasão celular na medida em que inibe a atividade anti
migratória/invasiva desencadeada pelo TGFB1, ligando-se diretamente a este fator de
crescimento ou aos seus receptores (GRAY et al., 2006). A produção de TGFB1 pela
decídua e seu papel repressor da atividade invasiva das células trofoblásticas tem sido
demonstrada em diferentes estudos (IRVING; LALA, 1995; LALA; HAMILTON, 1996;
LASH et al., 2005). Desta forma, a atividade invasiva observada do CTEV em
gestações normais, pode resultar do balanço entre fatores intrínsecos e extrínsecos
indutores no trofoblasto (como o CRIPTO1) e fatores reguladores impostos pela
decídua, como por exemplo, o TGFB1. Neste contexto, a ausência dos fatores
deciduais pode ser um fator preponderante na ação de CRIPTO1 na invasividade
trofoblástica das placentas acretas.
A via de sinalização de CRIPTO1 em atividades invasivas esta relacionada a
ligação desse fator a outros conhecidos cofatores, como por exemplo WNT3A
(BIANCO et al., 2005; KLAUZINSKA et al., 2014), também expresso nas células CTEVs
(POLLHEIMER et al., 2006). A ligação WNT3A-CRIPTO1 pode desencadear a via
canônica da B-catenina, ligada a expressão de fatores como VEGF, MMP2, MMP9, IL-
6, COX2 e do próprio CR1, acarretando, dentre outras respostas, no aumento de
invasividade celular. Isso poderia, em parte, explicar os níveis aumentados de invasão
90
tecidual pelas células trofoblásticas nas placentas acretas e corroborados por nossos
experimentos in vitro (descritos adiante).
Ainda, nesse estudo pudemos observar células citotrofoblásticas poligonais de
grandes dimensões com características de células migratórias nas placentas acretas a
termo. Estas células são comumente encontradas em fases inicias em gestações
normais enquanto que nas fases finais prevalece a presença de células multinucleadas
gigantes, poliploides, de baixa ou nenhuma atividade invasiva, descritas na literatura
como produto da fusão de células trofoblásticas extravilosas em forma de fuso
presentes no início da gestação Ao contrário, nas placentas acretas estas células foram
pouco numerosas (FRAKN; KAUFFMAN, 2006; KNÖFLER, 2010). Essa discrepância
nos fenótipos dessas células em relação ao tempo de gestação parece indicar a
prevalência de tipos celulares (ou de estágios funcionais) característicos de fases
precoces da gestação quando a invasão das células citotrofoblásticas é bastante ativa
em relação ao termo.
5.2 CRIPTO1 em Placentas de Primeiro Trimestre e em Coriocarcinoma
Placentário
Durante o desenvolvimento da placenta, durante o primeiro trimestre, células
citotrofoblásticas (CTBs) presentes nas extremidades das vilosidades de ancoragem
proliferam, formando colunas a partir das quais, células periféricas diferenciam-se
principalmente em células citotrofoblásticas intersticiais (CTEVi) e células
citotrofoblásticas endovasculares (CTEVe), ambas com elevada capacidade migratória
e invasiva (FRANK; KAUFFMAN, 2006; KNÖFLER, 2010). Quando analisamos a
expressão de CRIPTO1 em placentas de primeiro trimestre, observamos que CRIPTO
1 foi principalmente imunolocalizado nas colunas de células citotrofoblásticas dos vilos
de ancoragem, com maior intensidade nas células mais periféricas. Algumas células
deciduais também se mostraram reativas.
A diferenciação das células citotrofoblásticas com intensa atividade proliferativa
nas extremidades vilosas para células citotrofoblásticas extravilosas é orquestrada por
diversos fatores parácrinos e autócrinos (KNÖFLER, 2010). Evidências apontam para a
existência de uma programação intrínseca de diferenciação fortemente ativada nessas
91
células (FISHER et al., 1989; WELLS, 2007), além dos fatores de crescimento
associados à modulação dos processos invasivos e migratórios dessas células, tais
como: o fator de crescimento epidermal (EGF), vEGF, LIF, PDGF, PlGF, CSF-1, IGF-I,
IGFII (BISCHOF et al., 2000; BURTON et al., 2007; FERRETTI et al., 2007; LALA;
HAMILTON, 1996; POLLHEIMER; KNÖFLER et al., 2005) entre outros como citocinas
e quimiocinas (HANNAN; SALAMONSEN, 2007; JOKHI et al., 1997). O grande número
de fatores associados a invasividade trofoblástica indicam um processo de regulação
complexo e multifatorial.
Nossos achados sugerem que a presença de CRIPTO1 nas células
citotrofoblásticas em diferenciação - CTBs em células CTEVs - também pode estar
associada à programação intrínseca desse processo, modulando a migração e invasão
destas células através da decídua. Ainda, neste contexto, a presença de CRIPTO1 nas
células deciduais, pode indicar uma ação parácrina desse fator sobre as CTBs.
Nosso estudo também se estendeu à análise de amostras de coriocarcinoma
placentário, determinando se a expressão de CRIPTO poderia estar associada ao tipo
maligno de invasão trofoblástica. O coriocarcinoma é um câncer de etiologia ainda
desconhecida, onde inúmeros fatores de risco parecem estar associados, tais como:
paridade, dieta, contribuição paterna de alelos e imprinting gênico, idade materna, o
uso de anticontraceptivos orais e gestações molares prévias. Um dos fatores já
demonstrado e que se mostrou preponderante é o fator genético (BENIRSCHKE, 2006;
HUI, 2011; SLIM et al., 2012; SMITH et al., 2003). Nossos achados confirmaram nossa
hipótese inicial. Células citotrofoblásticas malignas coraram-se fortemente pelo
anticorpo anti-CRIPTO1, por toda a extensão uterina em que estas células foram
encontradas. Células circunvizinhas não trofoblásticas também foram CRIPTO reativas.
Concluindo, CRIPTO1 está expresso principalmente em células citotrofoblásticas
extravilosas na gestação normal no primeiro e terceiro trimestre de gestação. No
primeiro trimestre a distribuição desta expressão em células em processo de
diferenciação em células invasivas sugere uma participação nesse processo. Em
placentas acretas com aumento da invasividade trofoblástica além dos limites
endometriais, há um aumento da expressão desse fator, que também é encontrado em
92
células citotrofoblásticas malignas em coriocarcinomas. A imunolocalização de
CRIPTO1 nessas amostras sugere fortemente a participação desse fator em atividades
funcionais das células trofoblásticas, tais como invasividade e diferenciação.
5.3 Expressão de CRIPTO em Células do Citotrofoblasto Extraviloso em Placentas Saudáveis e em Células da Linhagem Trofoblástica HTR8/SV-neo
Sete formas do gene CRIPTO são conhecidas até o momento: gene CR1 e
pseudogenes presumidos de CR2 a CR7, dentre as quais o CR3 figura como o único
pseudogene que possui um quadro de leitura aberta (ORF) intacto e que difere da
proteína codificada pelo gene CR1 em apenas seis aminoácidos (DONO et al., 1991;
SCOGNAMIGLIO et al., 1999; SUN et al., 2008). Essa alta similaridade entre os
produtos proteicos faz com que todas as mensagens traduzidas encontradas nos
diferentes modelos de trabalho sejam atribuídas a apenas CR1 (SUN et al., 2008).
CRIPTO 3, uma possível retrotransposição de DNA complementar (cDNA) do
cromossomo 3 para o cromossomo X, é ainda considerado um pseudogene, embora
trabalhos demonstrem sua transcrição e tradução (HENTSCHKE et al., 2006; SUN et
al., 2008). A expressão de ambos os transcritos, CR1 e CR3 tem sido identificada em
modelos distintos. Sun e colaboradores (2008) demonstraram a presença majoritária do
transcrito codificante CR3 em diversos tipos tumorais, enquanto que a expressão do
transcrito codificante CR1 foi basicamente restrita a tecidos saudáveis. Dorey e Hill
(2006) identificaram a expressão de XCR1 e XCR3 (presentes em Xenopus e
homólogos às formas humanas) em um padrão diferenciado durante a embriogênese,
sendo XCR1 necessário para a formação anterior e neural do embrião, enquanto que
XCR3 mostrou-se essencial para a especificação da mesoderme durante a
gastrulação.
A partir dessas informações, verificamos o padrão de expressão de CR1 e CR3
em células citotrofoblásticas de primeiro e terceiro trimestre de gestação e nas células
da linhagem citotrofoblástica HTR8/SV-neo. Nossos resultados sugerem que a
expressão de CR1 e CR3 na gestação normal é temporalmente regulada, na medida
em que a expressão de CR1 foi exclusivamente encontrada em células trofoblásticas
extravilosas isoladas de placentas de terceiro trimestre, enquanto que todas as
93
amostras de primeiro trimestre expressaram a forma CR3. Embora os anticorpos
comerciais disponíveis no momento não permitam a identificação proteica de cada uma
dessas formas de CRIPTO isoladamente, a presença de bandas reativas em
imunoblots, em todas as amostras indica que ambos os genes foram traduzidos. Neste
contexto, em consistência com os achados de Dorey e Hill (2006) e de Sun e
colaboradores (2008), nossos resultados também sugerem que CR3 deva ser uma
isoforma do gene CRIPTO e não um pseudogene.
Além disso, o padrão de expressão temporal distinto de ambas as formas, sendo
CR3 restrito ao primeiro trimestre da gestação e CR1 ao terceiro trimestre, sugere
ações diferentes para os dois genes durante o estabelecimento da interface materno
fetal. Nos estudos de Dorey e Hill (2006) a expressão sobreposta de CR1 e CR3
potencializou os efeitos da via NODAL/SMAD2 durante a embriogênese. Nossos
resultados sugerem uma substituição da expressão de CR3 por CR1 nas células
citotrofoblásticas, seguido pela também substituição de um perfil altamente proliferativo
e invasivo para um em que estas atividades declinam gradativamente com a
proximidade das fases finais da gestação (FRANK; KAUFFMAN, 2006). Este achado,
também corrobora diferentes atividades funcionais para ambas as isoformas de
CRIPTO, e nos faz pensar na possibilidade de essas duas formas estarem presentes
ao mesmo tempo em algum ponto da transição observada.
Células da linhagem citotrofoblástica HTR8 seguem um perfil de expressão de
CRIPTO semelhante ao observado no primeiro trimestre, expressam CRIPTO 3. Esse
achado permite a realização de ações e procedimentos para a avaliação funcional de
CRIPTO1 nas células trofoblásticas, em ensaios in vitro.
5.4 Possíveis Ações de CRIPTO1 nas Células HTR8/SVneo por meio de Ensaios de Invasão, Migração e Sobrevivência Utilizando a Proteína Recombinante CR1 e o Silenciamento de CR1 com RNA de Interferência.
Inúmeros estudos demonstram que CRIPTO 1 é uma proteína bastante versátil,
capaz de modular diferentes vias de sinalização, atuando desta forma na regulação de
processos distintos, como a transição epitélio mesenquimal, proliferação, sobrevivência
e invasão (ver revisão de KLAUZINSKA et al., 2014). Além disso, CR1 modula a
94
própria expressão por retroalimentação positiva através da ativação direta ou indireta
da via WNT/β-catenina (maiores detalhes podem ser encontrados na revisão de
Klauzinska et al., 2014).
Nesta etapa do estudo, verificamos inicialmente a se mecanismos de
retroalimentação estavam presentes nas células HTR8/SV-neo selecionadas para
estudos de avaliação funcional da atividade mediada por CRIPTO. Nossos resultados,
obtidos a partir da PCR quantitativa mostraram que células tratadas com CR1
recombinante modulam positivamente a expressão gênica do próprio CRIPTO em
todas as concentrações utilizadas. Atente-se ao fato de que a isoforma expressa
parece ser o CR3, uma vez que análises prévias (item 5.3) não mostraram a expressão
gênica da forma CR1. A expressão de CR3 mediada pelo tratamento com CR1
recombinante seguiu um padrão aparentemente dose-dependente, sendo que as doses
de 50 e 100 ng/mL mostraram um aumento gradativo dos níveis de RNA mensageiro
em relação ao controle. No entanto, apesar do aumento observado na dose de 200
ng/mL ter também ocorrido em relação ao controle, esta foi muito inferior às doses de
50 e 100 ng/mL sugerindo uma fase de declínio para a indução de CR1.
Watanabe e colaboradores (2007) demonstraram que em culturas de células
que expressam CR1, a presença de 10% de soro bovino fetal (SBF) pode atuar como
agente indutor da clivagem da âncora GPI da proteína CRIPTO1 ancorada à
membrana celular. Esta clivagem libera a forma solúvel da proteína e leva a resultados
funcionais equivalentes ao uso de concentrações mais altas da proteína recombinante
(100 e 200 ng/mL). Como uma forma de evitar a sobreposição dos efeitos, este estudo
foi delineado na ausência de SBF. Além disso, a presença de soro de alguma forma
também estimula a expressão de CR1. Omitindo este suplemento nos meios de cultura
das células HTR8, também controlamos, mesmo que parcialmente, a expressão
mediada por fatores séricos. A queda na expressão de CR1 na ausência de SBF foi
evidenciada em nossos experimentos, sendo restabelecida e aumentada apenas após
a introdução de CR1 recombinante ao sistema experimental.
95
Os mecanismos propostos como mediadores da indução autócrina para a
expressão de CRIPTO1 inclui: i) a inativação da quinase 3--glicogênio sintase (GSK-
3) por CR1, na medida em que se liga aos co-receptores de WNT, LPR 5 e 6,
facilitando a ligação destes à WNT (NAGAOKA, et al., 2013) e, ii) por meio de uma via
indireta, a ativação de PI3-K/AKT, o que pode desencadear vias de sinalização
alternativas que se comunicam com a via WNT (BIANCO et al., 2005). Ambas, no
entanto, parecem levar ao acúmulo de -catenina e a sua associação ao complexo de
fatores de transcrição Tcf/Lef-1 que translocado ao núcleo funciona como fator de
ativação da transcrição de genes envolvidos na sobrevivência celular, proliferação e
migração celular (POLAKIS, 2000). Há a possibilidade de mecanismos semelhantes
ocorrerem nas células citotrofoblásticas, uma vez que a presença do fator WNT3A
modulando a migração e diferenciação de um fenótipo invasivo nas células
trofoblásticas humanas pela da via WNT--catenina já foi demonstrada em Pollheimer
et al. (2006).
Considerando a) o mecanismo de retroalimentação positiva demonstrado na
literatura para CRIPTO1, e b) nossos resultados com céluals HTR8/SV-neo
estimuladas por CR1 recombinante em cultura, é possível que este mecanismo de
retroalimentação possa também ser extendido para a forma CR3 (a única detectada no
tipo celular em questão).
Neste estudo também verificamos o efeito de CR1 recombinante nas células
HTR8/SV-neo sobre os processos de morte e viabilidade celular. Utilizando a marcação
nuclear com iodeto de propídeo seguida da leitura em citômetro observamos: i) células
haplodiplóides, com conteúdo de DNA inferior ao observado em G1 (2n) e que foram
consideradas células em processo de apoptose; ii) células nas fases G0/G1, de síntese
e, iii) células em G2/mitose, que foram consideradas viáveis. Nossos resultados não
revelaram diferenças estatísticas entre os grupos tratados e controles para nenhum dos
tempos verificados, nem em relação à morte celular, nem em relação à viabilidade.
Inferimos assim que as condições de tratamento às quais as células foram submetidas
não foram citotóxicas para as células HTR8/SV-neo
96
Em relação às respostas biológicas desencadeadas por CR1 recombinante no
cultivo celular, analisamos as atividades proliferativas, migratórias e/ou de invasão das
células HTR8/SV-neo.
Nossos ensaios de proliferação pela incorporação da 5-bromo-2’-deoxy uridina
(BrdU) não mostraram diferenças estatísticas entre os grupos controle e tratados nos
períodos de 24 e 48 horas. Incrementos substanciais foram vistos no grupo analisado
após 48 horas em relação ao grupo analisado em 24 horas, ressaltando a atividade
proliferativa típica destas células (GRAHAM et al., 1993). Uma vez que a proteína
recombinante para CR3 não se encontra disponível no mercado, e portanto, não foi
testada isoladamente em experimentos específicos para este fim, só podemos concluir
que CR1 não tem a capacidade de induzir uma atividade proliferativa nas células
citotrofoblásticas HTR8/SVneo.
Os ensaios de invasão também foram realizados utilizando-se a proteína
recombinante CR1 em células HTR8/SV-neo, que expressam CR3. No entanto, à
despeito dos resultados da proliferação, os ensaios de invasão utilizando as doses de
50 e 100 ng/mL de CR1 recombinante mostraram um incremento estatisticamente
significativo nos grupos tratados em relação aos controles. O fato da proteína
recombinante CR1 atuar em células que produzem primordialmente CR3, induzindo
resposta biológica faz aventar possibilidades mostradas em Xenopus por Dorey e Hill
(2006), quando a presença de XCR1 e XCR3 induziu a ativação de NODAL durante o
desenvolvimento em Xenopus com a potencialização da via NODAL/SMAD-2, o que
diferia em muitos aspectos à sinalização induzida pelas formas 1 e 3 isoladamente. As
vias mediadas por SMAD podem funcionar como vias de repressão ou ativação. (SHI;
MASSAGUE, 2003). A forma fosforilada de SMAD2 foi encontrada em cerca de 90% de
amostras de cânceres de mama estudados por Xie e colaboradores (2002). Além disso,
a indução da transição epitélio mesenquimal que facilita a metástase de cânceres de
origem epitelial, é induzida pela via de sinalização TGFβ/Activina (SHI; MASSAGUE,
2003) e NODAL, superexpressas em diversas linhagens celulares de câncer de mama
e melanoma (NORMANNO et al., 2004; TOPCZEWSKA et al., 2006).
97
Interessantemente, NODAL é expresso na interface materno fetal (ROBERTS et al.,
2003) e apresenta uma ação anti-proliferativa sobre células HTR8/SV-neo in vitro
(MUNIR et al., 2004). Introduzindo no sistema de cultivo a presença de CR1 associada
a expressão intrínseca de CR3 pelas células HTR8/SV-neo podemos ter ativado
mecanismos similares que, sem alterar a proliferação, induzem a atividade invasiva
dessas células.
Nossos ensaios de migração confirmaram os achados sobre a invasividade
dessas células frente a CR1. Todas as doses de CR1 recombinante utilizadas (50, 100
e 200 ng/mL) foram capazes de estimular um incremento na migração celular em
relação ao controle, em ambos os períodos de 24 e 48 horas. Estes resultados foram
corroborados pelo silenciamento gênico de ambas as formas de CRIPTO: CR1 e CR3,
que mostraram que nestas condições há uma redução significativa na migração das
células HTR8, enfatizando uma vez mais a participação deste fator em atividades
migratórias.
98
6 CONCLUSÕES
99
Nosso trabalho demonstrou pela primeira vez a presença do fator CRIPTO na interface
materno fetal. Dentre os resultados obtidos, podemos concluir:
1) CRIPTO está presente na interface materno fetal de placentas saudáveis e acretas
de terceiro trimestre de gestação, localizando-se principalmente em células
trofoblásticas extravilosas.
2) Placentas acretas apresentam numericamente mais células trofoblásticas que
placentas saudáveis de terceiro trimestre de gestação, e em consequência, o conteúdo
proteico de CRIPTO encontrado por área é também aumentado.
3) CRIPTO está presente na interface materno fetal de placentas de primeiro trimestre
de placentas saudáveis e em coriocarcinomas, localizando-se em células trofoblásticas
vilosas, extravilosas e em células deciduais no primeiro caso, e em células
trofoblásticas malignizadas no segundo.
4) Placentas de primeiro trimestre, células trofoblásticas extravilosas isoladas destas
placentas e a linhagem HTR8/SV-neo apresentam a forma CRIPTO3, enquanto que
células extravilosas de placentas de terceiro trimestre apresentam CRIPTO1.
5) CRIPTO 3 é transcrito e traduzido na interface materno fetal no primeiro trimestre de
gestação, representando em nosso modelo de estudo uma isoforma de CRIPTO e não
um pseudogene.
6) A proteína CR1 recombinante é capaz de aumentar significativamente a atividade
migratória e invasiva de células HTR8-SVneo in vitro.
7) A proteína CR1 recombinante é incapaz de modular a atividade proliferativa de
células HTR8/SVneo in vitro.
8) Células HTR8/SVneo transfectadas com siRNA para CR3 apresentam diminuição
significativa na atividade migratória.
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