COURSE NOTES Laboratory investigation of the organ non ... · unei anume boli autoimune, ci de multe ori coe-xist ă mai mul Ńi autoanticorpi în aceea şi afec Ńiu-ne. Din cele

Revista Română de Medicină de Laborator Vol. 14, Nr. 1, Martie 2009

COURSE NOTESLaboratory investigation of the organ non-specific

autoimmune diseases

Investigarea de laborator a bolilor autoimune organ-nespecifice

Anca Cristea

Immunology Laboratory, 1st Medical Clinic“Iuliu Ha Ńieganu” University of Medicine and Pharmacy, Cluj-Napoca

Abstract

Autoantibodies have been used extensively as a useful biomarker in many autoimmune diseases. The de-tection of circulating autoantibodies to nuclear antigens in systemic conective tissue diseases or to some of neut-rophil citoplasmatic antigens in vasculitis is an important tool in the diagnosis. Many techniques have been de-veloped to detect these autoantibodies, but the indirect immmunoflurescence is considered to be the standardclinical test to screen sera before other techniques, like ELISA, to define antibody specificity. In the last yearsmultiplexed technologies were developed that have a a high specificity and the capacity of measuring a highnumber of autoantibodies from a single sample. Measurement of autoantibodies is not a replacement for clinicaldiagnosis. This review focuses on tehniques used to asses the autoantibodies and to evaluation of their clinicalsignificance in some disease subsets.

Keywords: antinuclear autoantibodies, ANCA, indirect immunoflurescence

Rezumat

PrezenŃa autoanticorpilor în serul unui pacient a reprezentat întotdeauna un marker de boală

autoimună. EvidenŃierea autoanticorpilor direcŃionaŃi faŃă de structuri nucleare sau faŃă de antigenele citopla-matice ale ntrofilelor polimorfonucleare au constituit elemente de diagnostic, alături de datele clinice. Metodelede identificare au evoluat de-alungul timpului, însă imunofluorescenŃa indirectă ramâne testul standard pentruscreeningul acestora. In ultimii ani se incearcă introducerea pe scară largă a unor tehnici avansate de biologiemoleculară care pot identifica rapid, cu mare sensitivitate şi simultan mai mulŃi autoanticorpi din aceeaşi probă.În cele expuse mai jos încercăm să arătăm cum pot fi evidenŃiaŃi anumiŃi autoanticorpi, că prezenŃa acestora nupoate înlocui diagnosticul clinic, dar că ei sunt esenŃiali în diagnosticul bolilor autoimune de Ńesut conjunctiv şia vasculitelor sistemice.

Cuvinte-cheie: anticorpi antinucleari, ANCA, imunofluorescenŃă indirectă

63


Introducere

Bolile autoimune reprezintă un grup he-terogen de afecŃiuni, caracterizate prin reacŃiiimune faŃă de unul sau mai multe componenteself ale unui individ, cauzând inflamaŃie şi dis-trucŃii ale Ńesuturilor şi organelor.

În ultimii zece ani prezenŃa autoanticor-pilor în serul pacienŃilor a reprezentat unul dincriteriile extrem de importante în diagnosticul şiclasificarea bolilor autoimune sistemice sau or-gan-specifice. PrezenŃa anumitor autoanticorpispecifici pot fi asociaŃi cu un anume diagnostic,cu un anume sindrom sau cu o anumită particu-laritate clinică a bolii. Cu toate acestea, trebuiesă subliniem că în majoritatea bolilor autoimunenu se asociază un singur autoanticorp specificunei anume boli autoimune, ci de multe ori coe-xistă mai mulŃi autoanticorpi în aceeaşi afecŃiu-ne.

Din cele expuse rezultă că laboratorulclinic are un rol fundamental în diagnosticul,monitorizarea şi chiar în prognosticul bolilor au-toimune.

Metodele convenŃionale pentru decela-rea autoanticorpilor serici au constituit punctulesenŃial în diagnosticul acestor afecŃiuni deaproximativ 40 de ani. Printre aceste metodeclasice enumerăm: imunodifuzia, hemaglutina-rea, contraimunelectroforeza, imunofluorescenŃaindirectă, radioimunodozarea, tehnicile ELISA,Western-blot şi chemiluminiscenŃa. Toate acestetehnici au la bază o reacŃie antigen-anticorp încare se caută identificarea autoanticorpului, caurmare este necesară prezenŃa antigenului încauză în postură de reactiv. În ultimii ani datori-tă tehnicilor înalte de purificare a proteinelor,precum şi de obŃinere a multor antigene prin teh-nologii de recombinare ADN, tehnicile ELISAau luat o amploare foarte mare.

ImunoflurescenŃa indirectă a fost şi încăpoate fi considerată testul standard pentru dece-larea anticorpilor antinucleari, ANCA, anti mus-chi neted sau antimitocondriali. Această tehnicănefiind automatizată ci una manuală, citirea este

Introduction

Autoimmune diseases are a heterogen-ous group of disorders characterized by immunereactions against one or more “self” componentsof an individual, that cause inflammation anddestruction of tissues and organs.

In the last ten years, the presence ofautoantibodies in patients’ serum has represen-ted one of the most important criteria in the dia-gnosis and classification of system and organ-nonspecific autoimmune diseases. The presenceof certain specific autoantibodies can be associ-ated with a certain diagnosis, syndrome or clin-ical particularity of a disease. Nevertheless, wemust underline that in most autoimmune dis-orders several autoantibodies can coexist withinthe same disease, rather than one specificautoantibody being associated with a single dis-ease.

These facts reveal the fundamental roleof the clinical laboratory in the diagnosis, monit-oring and even prognosis of autoimmune dis-eases.

For approximately 40 years, convention-al methods for measuring serum autoantibodieshave been the diagnosis keystone in these dis-eases. Among these classical methods we pointout immunodiffusion, hemagglutination,counter-immunoelectroforesis, indirect immuno-fluorescence, radio-immunoassay, ELISA andWestern blot techniques and chemilumines-cence. All these methods rely on an antigen-an-tibody reaction that seeks to identifyautoantibodies and, as such, the presence of therespective antigen as a reagent is required. In thelatter years ELISA techiques have known amarked development due to high-resolution pro-tein purification and DNA recombination tech-nologies.

Indirect immunofluorescence was andcan still be considered the standard test in as-sessing anti-nuclear antibodies, ANCAs, anti-smooth muscle and anti-mitochondrial antibod-ies. Since this technique is not an automated but

Revista Română de Medicină de Laborator Vol. 14, Nr. 1, Martie 2009 65

rather a manual one, its interpretation is subject-ive and requires a certain experience obtainedafter years of practice. There are no objectiveparameters to precisely guide its interpretation.For these reasons, the same test can be inter-preted varyingly among different laboratories.There have been attempts to automate the pro-cess using a fluorescence microscope monitoredby a computer by means of a special analysissoftware that excludes the background of thepreparation and allows a standardization of thereading, but results are still to be expected.

The other techiques mentioned, and es-pecially ELISA, are also not very well standard-ized and there are significant differences in theinterpretation of the results between variousmanufacturers.

In the last two years, autoimmunitylaboratories have become very dynamic due tothe advent of new molecular biology techniquesthat allow simultaneous identification of severalantibodies within a minimal quantity of serum,plasma or cell cuture supernatant over a veryshort period of time (approximately 3 hours) andwith a high sensibility (1-4). Due to the afore-mentioned advantages, these techniques couldbe used as a screening method for autoimmunediseases in risk population groups (5, 6). Thesetechniques use glass, nitrocellulose and poly-styrene or magnetic beads as a solid mediumupon which the antigen of interest is fixed.

One of these techniques is the Luminextechnology, which is based upon flow cyto-metry. It uses polystyrene microspheres as avehicle for immune reactions, that allow finalmeasurements following the principle of flowcytometry. Specific purified autoantigens are at-tached to the spheres, which are specificallystained with fluorochromes ranging from red toorange, and thus each microsphere has a uniqueidentity. After incubation with the patient’s ser-um, a second incubation with a human Ig-G an-tibody marked with a different fluorochromefollows. A laser beam identifies the microspherewith the antigen in question, and a second laserbeam reveals the fluorescent molecule that has

subiectivă şi presupune o anumită experienŃăcare se dobândeşte în ani de exerciŃiu. Nu existăparametri obiectivi care să ghideze cu mareexactitate interpretarea preparatului. Din acestmotiv există discordanŃe în evaluarea aceluiaşitest între diferite laboratoare. S-a încercat o au-tomatizare a citirii la un microscop cu fluoresce-nŃă monitorizat de un computer cu un programde analiză a preparatului, in care să se excludăbackgraund-ul şi să permită o standardizare a ci-tirii, dar rezultatele sunt încă departe.

Nici celelalte tehnici amintite anterior sine referim la cele ELISA, nu sunt foarte binestandardizate, existând diferenŃe semnificative înevaluarea rezultatului de la un producător la al-tul.

În ultimii doi ani laboratoarele de autoi-munitate au devenit foarte dinamice din cauzaapariŃiei de noi tehnologii în biologia molecula-ră, care au permis aplicarea lor şi în acest dome-niu, cu scopul de a identifica simultan mai mulŃiautoanticorpi dintr-o cantitate minimă de ser,plasmă sau supernatant de culturi celulare, într-un timp foarte scurt, de aproximativ 3 ore şi cumare sensibilitate (1-4). Datorită avantajeloramintite aceste tehnici ar putea fi utilizate cuscop de screening pentru boli autoimune in gru-puri de populaŃii cu risc (5, 6). Aceste tehniciutilizează ca şi suport solid (matrice) sticla, ni-troceluloza, bile de polistiren sau magnetice pecare este imobilizat antigenul în cauză.

Amintim tehnologia Luminex, bazatăpe citometria în flux. În această tehnică se utili-zează microsfere de polistiren drept vehiculepentru reacŃiile imune şi care permit in final ma-suratori bazate pe citometria în flux. Bilele colo-rate specific cu un fluorocrom de la roşu la oranjau ataşat autoantigenul specific purificat, deci fi-ecare microsferă reprezintă o identitate unică.După incubarea cu serul pacientului urmează oincubare cu un anticorp anti IgG-uman marcatcu un alt fluorocrom. Un laser va identifica mi-crosfera cu antigenul în cauză si al doilea laseridentifică molecula fluorescentă care a reacŃio-nat cu autoanticorpul fixat de antigen. Deocam-dată tehnica este utilizată pentru identificarea



field. Ions with different masses fly with differ-ent speeds and reach a ion detector in differentamounts of time. The detector measures theflight time, which yields a graph illustrating themass-to-charge ratio of the ions. This techniqueis also known as SELDI-TOF MS, i. e. Surface-Enhanced Laser Desorption/Ionisation-Time ofFlight Mass Spectrometry, a denomination thataccurately describes its principle (Figure 1).

For the time being, these technologiesrepresent only a promise that has yet to prove itsefficiency in clinical practice in a more or lessclose future.

We will present several techniques cur-rently used in clinical immunology laboratories.

Antinuclear antibodies

Antinuclear antibodies (ANA) areautoantibodies directed against certain structuresof the nucleus: nucleic acids, nuclear proteins,histones. ANA is a test that is mandatory to becarried out in persons who are suspected of hav-ing an autoimmune disease, especially collagen-oses, in particular in systemic lupus erythem-atosus (SLE). The standard method in detectingANA is indirect immunofluorescence. Thistechnique consists of the following steps. Thesubstrate, which can be a cell culture (usuallyHEp-2), a rodent liver imprint or rat or mousekidney cryosections, is incubated with the ana-lyzed serum. After succesive rinsing, the sub-strate is incubated with a human Ig-G antibodymarked with fluorescein iso-thiocyanate andrinsed again. The preparation is mounted andexamined with the help of a fluorescence micro-scope. The result includes the morphologic pat-tern of the fluorescence and also the titer. Dilu-tions that are equal to or greater than 1/80 areconsidered positive. Several patterns can be en-countered: homogenous and/or perinuclear,spotted with several appearances, nucleolar andcentromeric. These patterns can be correlatedwith a certain specificity of an antibody andtherefore allow the association with a certaindisease. The homogenous pattern is associated

grafic ce reprezintă raportul masă/sarcină al io-nilor. Tehnica este cunoscuta sub denumirea deSELDI-TOF MS, adică surface-enhanced laserdesorption/ionisation-time of flight mass spec-trometry, denumire ce descrie exact principiultehnicii (Figura 1).

Deocamdată, aceste tehnologii reprezin-tă doar o promisiune, care urmează să-şi arateeficienŃa în practica clinică într-un viitor maimult sau mai puŃin apropiat.

Să revenim la tehnicile utilizate curentîn laboratoarele clinice de imunologie în mo-mentul de faŃă.

Anticorpi anti nucleari

Anticorpii antinucleari (ANA) sunt au-toanticorpi direcŃionaŃi faŃă de diverse structuriale nucleului: acizii nucleici, proteine nucleare,histone. ANA este un test care trebuie executatobligatoriu la o persoană suspectă de o boală au-toimună, în special colagenoză, în mod particu-lar lupus eritematos sistemic (LES). Metodastandard pentru decelarea ANA este imunofluo-rescenŃa indirectă. Tehnica constă în următoa-rele. Substratul, care poate fi cultură de celule,de regulă HEp-2, amprentă de ficat de rozătoaresau criosecŃiuni de rinichi de şoarece sau şobo-

Figure 2. Positive ANA, homogenous andperinuclear pattern – homogenous andperipheric fluorescence of the nuclei

(ANA - aspect omogen şi perinuclear-fluorescenŃa omogenă şi periferică a nucleilor)


with ssDNA and dsDNA and with histones; theperinuclear pattern is associated with nativedsDNA (Figure 2), the spotted one with ribo-nucleoproteins, the nucleolar one with DNA-topoisomerase etc. – see Table 1.

Certain patients may present several pat-terns that differ from one dilution to another, afact that must be mentioned in the report. Theresults guide the examiner towards a much morespecific and precise method of identificationsuch as ELISA, especially in the case of anti-ENA (Extractable Nuclear Antigens) antibodies.The advantage of immunofluorescence is that itallows a targeted choice of specificity for sub-sequent assessment. On many occasions, the res-ults obtained after immunofluorescence, corrob-orated with the values of C3 and especially C4complement and clinical data, may contribute to

lan, se incubează cu serul de cercetat. După spă-lări succesive substratul este incubat cu un anti-corp anti IgG uman marcat cu izotiocianat defluoresceină, urmată apoi de o nouă spălare. Pre-paratul se montează şi este examinat la un mi-croscop cu fluorescenŃă. Rezultatul include as-pectul morfologic al fluorescenŃei (pattern-ul),precum şi titrul. Sunt considerate titruri pozitivediluŃii egale sau mai mari de 1/80. Se pot distin-ge mai multe aspecte: omogen şi/sau perinucle-ar, pătat cu diverse aspecte, nucleolar şi centro-mer, aspecte care se corelează cu o anumită spe-cificitate a anticorpilor şi ca urmare permite aso-cierea cu o anumită boală. Aspectul omogen seasociază cu ADNss şi ds, histone; perinuclear cuADNds (nativ) (Figura 2); aspectul pătat cu pre-zenŃa ribonucleoproteinelor; nucleolar cu ADN–topoizomeraza etc , vezi Tabelul 1.

Table 1. Indirect immunofluorescence – liver imprint and HEp-2 substrate

ANA pattern Specificity Associated disease Subsequent testsNUCLEAR MEMBRANE Homogenous-ring dotted homogenous+nucleoli

A,B,C LaminaNuclear poresRibosomalproteins

HAI I, SLECBPneuropsychic SLE ELISA-Ribosomal

PHOMOGENOUS/PERINUCLEAR

ssDNAdsDNARNAHistonesNUCLEOSOMES

SLESLEOther collagenosesDrug induced SLE-SLE

anti dsADNELISA-Scl-70ELISA-histonesELISA/blot dot

SPOTTED coarse+fine fine-irregular

fine-dense

RNP/SmSS-A(Ro)

SS-B(La)

MCTD/SLESSjogren’s/SLESubacute Lupus Sjogren’s

ELISA-RNP/SmELISA-SS-A

ELISA-SS-BPUNCTIFORM centromere 2-6 nuclear spots > 6 nuclear spots

CENTROMERECOILIN p80

CRESTSj, CBPSLE, Sj, CBP

ELISA-centromere

NUCLEOLAR Different size granulationshomogenous-diffuse

Scl-70

PMScl, Mi2SS-B

Sclerodermia

PM/SclSjogren’s

ELISA-Scl-70

ELISA-PM/Mi2ELISA-SS-B

CYTOPLASMIC Jo-1 PM/Dermato ELISA-Jo-1


certain diagnosis. Next, we will present the in-cidence and the utility of this test (10).

It must be underlined that human HEp-2cell culture is superior to the rodent substrate be-cause it allows the recognition of antigens per-taining to all phases of mitosis and especially ofthose that depend upon the cell cycle, due to thefact that the nucleus dramatically changes dur-ing the phases of the cell cycle. Slides withHEp-2 contain both dividing and resting nucleiin order to encompass the most nuclear antigens.They are sold by various companies and theirquality varies among manufacturers.

ANA incidence: SLE 95%, rheumatoidarthritis 25-30%, juvenile rheumatoid arthritis20%, Sjogren’s syndrome 50-70%, scleroderma60-90%, MCTD 95%, polymyositis-dermatomy-ositis 10-50%, nodous periarteritis 10%, myas-

AnumiŃi pacienŃi pot avea diverse pat-tern-uri care diferă de la o diluŃie la alta, şi caretrebuiesc menŃionate în buletinul de analiză. Re-zultatele orientează examinatorul spre o metodăde identificare mult mai specifică şi mai precisă,mai ales pentru anticorpii anti antigene nucleareextractibile (ENA), cum ar fi o tehnică ELISA.Avantajul imunofluorescenŃei constă în faptul căalegerea specificităŃii pentru o dozare ulterioarăeste Ńintită. De multe ori rezultatele obŃinute laimunofluorescenŃă si coroborate cu valorile fra-cŃiunilor de complement C3 şi mai ales C4, pre-cum şi datele clinice pot contribui la un diagnos-tic cert. MenŃionăm în cele ce urmează incidenŃaşi utilitatea testului (10).

Trebuie sa specificăm că utilizarea cul-turii celulare HEp-2, de origine umană, este su-perioară substratului de rozătoare întrucât permi-

Tabelul 1. ImunofluorescenŃa indirectă - substrat amprentǎ ficat şi HEp-2

ANA pattern Specificitate Boala asociatǎ Teste ulterioareMEMBRANANANUCLEARǍ omogenǎ-inelarǎ punctatǎ omogenǎ+nucleoli

Lamina A,B,CPori nucleariProteine riboso-male

HAI I, SLECBPSLE neuropsihic ELISA-Ribosomali

POMOGEN/PERINUCLEAR

DNAssDNAdsRNAHistoneNUCLEOSOMI

SLESLEalte colagenozeSLE-medicamentosSLE

anti ADNdsELISA-Scl-70ELISA-histoneELISA/blot dot

PǍTAT grosolan+fin fin-neregulat

fin-dens

RNP/SmSS-A(Ro)

SS-B(La)

MCTD/SLESjogren/SLELupus subacutSSjogren

ELISA-RNP/SmELISA-SS-A

ELISA-SS-BPUNCTIFORM centromer 2-6 pete nucleare > 6 pete nucleare

CENTROMERCOILIN p80

CRESTSSj, CBPSLE, SSj, CBP

ELISA-centromer

NUCLEOLAR granulaŃii mǎrimi diferite omogen-difuz

Scl-70

PMScl, Mi2SS-B

Sclerodermie

PM/SclSSjogren

ELISA-Scl-70

ELISA-PM/Mi2ELISA-SS-B

CITOPLASMATIC Jo-1 PM/Dermato ELISA-Jo-1


thenia gravis with thymoma 30-50%, drug-in-duced SLE 100% (hydralazine, procainamide,anticonvulsants), type I autoimmune hepatitis80%, primary antiphospholipidic antibody syn-drome 20%.

ANA as diagnostic criteria: SLE 100%,MCTD 100%, autoimmune hepatitis 90%.

ANA useful in monitoring or prognosis:SLE, juvenile rheumatoid arthritis, Raynaud’sphenomenon.

ANA not useful in diagnosis: multiplesclerosis, idiopathic thrombocytopenia, thyroiddisease, discoid lupus erythematosus, infections,malignant diseases, close relatives of patientswith autoimmune diseases.

ANA without clinical significance: 3-10% of normal individuals may have titersbetween 1/80 and 1/160, very rarely 1/320 andthe titer rises with age, 20% of the relatives ofthe patients with autoimmune diseases, 50% ofsenior citizens.

● Anti-native dsDNA antibodies

Anti-dsDNA antibodies appear almostexclusively in SLE and have nephritogenic po-tential. Their presence allows for a certain dia-gnosis of SLE. However, only 30-40% of SLEpatients have anti-dsDNA antibodies. These an-tibodies are highlighted either by indirect im-munofluorescence using as a substrate thehemoflagellate Crithidia luciliae, which has akinetoplast that consists entirely of circulardsDNA (Figure 3a ,b), or through ELISA tech-niques. ELISA and RIA can yield false positivevalues due to DNA denaturation during purifica-tion, and thus the incidence of these antibodiesmight be overevaluated (11).

Pathologic values: indirect immuno-fluorescence - titers>1/10; ELISA: > 60U in act-ive SLE, especially in florid and glomeruloneph-ritis forms – their presence can predict the floridform; very rarely in severe rheumatoid arthritis.

● Antinucleosome antibodies

They are antichromatin antibodies andappear to be responsible for LE. These antibod-

te recunoaşterea antigenelor din toate fazele mi-tozei şi mai ales a antigenelor dependente de ci-clul celular întrucât aspectul nucleului se schim-bă dramatic în fazele ciclului celular. Lamele cucelule HEp-2 conŃin nuclei atât în diviziune catşi în repaus pentru a cuprinde cat mai multe anti-gene nucleare. Ele sunt comercializate de diver-se firme şi calitatea lor diferă de la furnizor lafurnizor.

IncidenŃa ANA: LES 95%, poliartrităreumatoidă 25-30%, artrită reumatoidă juvenilă20%, Sindrom Sjogren 50-70%, sclerodermie60-90%, BMTC 95%, polimiozită-dermatomio-zită 10-50%, periarterită nodoasă 10%, miaste-nia gravis cu timom 30-50%, LES indus medi-camntos 100% (hidralazină, procainamidă, anti-convulsive), hepatită autoimună tip I 80%, sin-drom antifosfolipidic primar 20%.

ANA în criterii de diagnostic: LES100%, BMTC 100%, hepatită autoimună 90%.

ANA utili pentru monitorizare sauprognostic: LES, ARJ, fenomen Raynaud.

ANA nu sunt utili în diagnostic: sclero-ză multiplă, trombocitopenie idiopatică, boli ti-roidiene, lupus discoid, infecŃii, boli maligne,rude apropiate ale pacienŃilor cu boli autoimune.

ANA fără semnificaŃie clinică: 3-10%din idivizii normali pot avea titruri cuprinse între1/80 şi 1/160, foarte rar 1/320 şi titrul creşte cuvârsta, 20 din rudele pacienŃilor cu boli autoimu-ne, 50% din vârstnici.

● Anticorpi anti ADNds ( nativ)

Anticorpii anti ADNds sau se formeazăaproape exclusiv în LES şi au potenŃial nefrito-gen. PrezenŃa lor permite un diagnostic cert deLES. Cu toate acestea numai 30-40% din pacie-nŃii cu LES au anticorpi anti ADNds. Aceştia seexecută prin inmunofluorescenŃă indirectă utili-zând ca substrat hemoflagelatul Crithidia luci-liae care conŃine un kinetoplast exclusiv dinADNds circular (Figura 3a ,b) , sau prin tehniciELISA. Tehnicile ELISA şi RIA pot da valorivalori fals pozitive datorită denaturării ADN-ului în timpul purificării, astfel încât incidenŃa


ies do not react neither with histones nor withDNA and are highlighted through ELISA or im-munodot assay. The substrate used is obtainedby extracting chromatin from the nucleus of calfthymus cells and contains DNA and core his-tones, excluding H1 (12). Immunofluorescencepattern is mostly homogenous. These antibodiesare present in 40% of SLE patients, are nephrito-genic and their presence indicates active lupusand lupic nephritis (13). These patients do nothave anti-dsDNA or antihistone antibodies. Thetiter correlates with the activity of the disease.

● Antihistone antibodies

These antibodies have an incidence of95% in drug-induced SLE (procainamide, hy-dralazine etc.) Their pattern is exclisvely a ho-mogenous one. They can be found also inrheumatoid arthritis with or without complica-tions, Felty syndrome and juvenile rheumatoidarthritis.

● Anti-ENA (Extractable Nuclear Antigens)antibodies

These are a group of antibodies directedagainst nuclear antigens that can be extracted us-ing saline solutions other than DNA, histonesand nucleoli. These antihens include SS-A(Ro),SS-B(La), RNP (Ribonucleoproteins), Sm

acestor anticorpi poate fi supraevaluată (11).Valori patologice: IF indirectă-

titruri>1/10; ELISA: > 60U în LES activ, în spe-cial forme fluoride şi cu glomerulonefrită, preze-nŃa lor poate prezice forma fluoridă, foarte rar înPR forma severă.

● Anticorpi anti nucleosomali

Sunt anticorpi anti cromatină. Par a fiprincipalii responsabili de fenomenul LE. Nudau reacŃie nici cu histonele şi nici cu ADN. Seexecută prin tehnici ELISA sau imunodot, sub-stratul fiind obŃinut prin extracŃia cromatinei dinnucleul celular din timus de viŃel şi conŃine com-plexul ADN plus histonele de “core”, minus H1(12). Aspectul la IF este mai mult de tip omo-gen. 40 % din pacienŃii cu LES au aceşti anticor-pi, sunt nefritogeni si prezenŃa lor indică lupusactiv şi nefrită lupică (13), fără a avea însă antiADNds sau histone . Titrul se corelează cu acti-vitatea bolii.

● Anticorpi anti histone

Acesti anticorpi au o incidenŃă de 95%în LES indus medicamentos cu procainamidă,hidralazină etc. Patternul este numai omogen.Pot fi întâlniŃi şi în PR cu sau fără complicaŃii,sindrom Felty, artrită reumatoidă juvenilă.

Figure 3 . Anti dsDNA antibodiesa. positive – fluorescent kinetoplast

b. negative – no fixation on nucleus orkinetoplast

Figura 3. Anticorpi anti ADNdsa. pozitiv - kinetoplastul fluorescent

b. negativ - ser normal – nu fixeaza nici nucleul,nici kinetoplastul

3. a 3. b


(Smith), Sclero-70 (ADN-topoisomerase), Jo-1(hystidil RNA synthetase). The presence ofautoantibodies against these antigens is sugges-ted by a spotted immunofluorescence patternwith certain particular aspects that can be as-sessed by a specialist. The identification can bedone by using ELISA screen techniques, i.e.primary tests that identify the presence of anti-bodies without discriminating their specificity.In a subsequent step, or by bypassing the ENAtest, and depending upon the suspected diagnos-is and the pattern obtained, an individual test forone or more specificities is carried out as fol-lows:

- anti SS-A(Ro): Primary Sjogren’ssyndrome > 70%, SLE with renal complications30-40%, subacute cutaneous lupus 10%, rheum-atoid arthritis with Sjogren’s syndrome 9%, pho-tosensitivity, neo-natal SLE with atrioventricularblock 20%. A fine granular pattern (Figure 4) ora granular pattern with 1-2 conspicuous nucleolimay be encountered in indirect immunofluores-cence;

- anti SS-B(La): Primary Sjogren’s syn-drome 30-60%, Sjogren’s syndrome associatedwith scleroderma 10%, they do not appear inrheumatoid arthritis with Sjogren’s syndrome. Afine granular spotted pattern or 1-2 conspicuousnucleoli with granular or clear nucleoplasm maybe significant;

- anti Sm (Smith): 25-30% of SLE pa-tients, they are 100% specific for SLE, with acoarse spotted pattern and clear nucleoli in im-munofluorescence (Figure 5);

- anti RNP: they are specific and haveraised titers in MCTD, with the same pattern asanti Sm, but C3 and C4 levels are never low;

- anti Sclero-70: they appear exlusivelyin diffuse progressive systemic scleroderma andthey correlate with the extent of visceral and cu-taneous involvement. Their prognosis is worsethan that of anti-centromere antibodies. Theseantibodies are frequent in pulmonary sclero-derma and are seldomly encountered in patientswith Raynaud’s syndrome. They predict an un-favorable prognosis. A nucleolar immunofluor-

● Anticorpi anti antigene nucleare extractibi-le (ENA)

Sunt o categorie de autoanticorpi dire-cŃionaŃi faŃa de antigene nucleare care pof fi ex-tractibile cu soluŃii saline şi sunt altele decâtADN, histone şi nucleoli. Acestea includ SS-A(Ro), SS-B(La), RNP (Ribonucleoproteine),Sm (Smith), Sclero-70 (ADN-topoizomeraza),Jo-1 (histidil ARN sintetaza). PrezenŃa autoan-ticorpilor faŃă de aceste antigene este sugerată laimunofluorescenŃă de un pattern pătat, cu anu-mite particularităŃi sesizate de un specialist înexaminarea preparatului. Identificarea se poateface cu tehnici ELISA screen, adică un test pri-mar prin care se identifică prezenŃa anticorpilor,fără însă a se descrimina specificitatea. În a douaetapă, sau evitându-se testul ENA şi în funcŃiede diagnosticul presupus şi patternul obŃinut, seexecută un test individual pentru una sau maimulte specificităŃi, după cum urmează:

- anti SS-A(Ro): Sindrom Sjogren pri-mar > 70%, LES cu complicaŃii renale 30-40%,lupus subacut cutanat 10%, PR cu sindrom Sjo-gren 9%, fotosensibilitate, LES neonatal cu blocatrio-ventricular 20%. Aspectul pătat fin granu-lar (Figura 4) sau granular cu câte 1-2 nucleolievidenŃi, poate caracteriza patternul la IF indi-rectă ;

- anti SS-B(La): Sindrom Sjogren pri-mar 30-60%, sindrom Sjogren asociat cu sclero-dermie 10%, nu apar în sindrom Sjogren asociatcu PR . Aspectul pătat fin granular, sau cu câte1-2 nucleoli fluorescenŃi şi nucleoplasma granu-lară, sau destul de liberă poate caracteriza patter-nul şi pot fi semnificativi, dar

- anti Sm (Smith): 25-30% din pacie-nŃii cu LES, sunt specifici 100% pentru LES cuaspect pătat grosolan, cu nucleolii liberi la imu-nofluorescenŃă (Figura 5);

- anti RNP: sunt specifici şi au titruri ri-dicate în BMTC, cu patternul identic ca şi antiSm, dar întodeauna C3 şi C4 nu sunt scăzute;

- anti Sclero-70: sunt exclusiv în scle-rodermia sistemică progresivă şi difuză, se core-


escence pattern suggests the presence of theseantibodies;

- anti Jo-1 are seen in approximately30% of polymyositis patients, especially in theforms with pulmonary involvement andRaynaud’s phenomenon. They disappear in re-mission, and are therefore useful in monitoringthe disease.

We must stress that the most extractableantigens are Jo-1 and SS-A. Therefore, ELISAtests are recommended to be carried out in orderto confirm the diagnosis, in particular inpolymyositis and subacute cutaneous lupus.

● Anti-centromere antibodies

Anti-centromere (or kinetocore) anti-bodies are markers of the CREST syndrome.They have prognostic value and are encounteredin 30% of patients with Raynaud’s phenomenon,12-15% of systemic scleroderma patients and20% of patients with primary biliary cirrhosis.

● Anti-ribosomal P protein antibodies

They are encountered particularly in pa-tients with active SLE and psychosis, but are ab-sent in psychotic patients without SLE.

Anti-C1q antibodies

These antibodies are directed against the

lează cu extinderea afectării viscerale şi cutana-te. Au prognostic mai puŃin favorabil decât anti-corpii anti centromer. Frecvent în sclerodermialocalizată pulmonar. Se întâlnesc la o minoritatedin pacienŃii cu sindrom Raynaud, prezic unprognostic nefavorabil. Patternul nucleolar de laIF indirectă sugerează exact prezenŃa acestor an-ticorpi;

- anti Jo-1 se întâlnesc la aproximativ30% din pacienŃii cu polimiozită, în special for-mele cu afectare pulmonară şi fenomen Ray-naud. Dispar în remisia bolii, deci utili în moni-torizare.

Trebuie să remarcăm faptul că cele maiextractibile antigene sunt Jo-1 şi SS-A. Ca ur-mare, este indicat pentru confirmarea diagnosti-cului a se executa teste ELISA, mai cu seamă înpolimiozită şi în lupusul subacut cutanat.

● Anticorpi anti centromer

Anticorpii anti centromer sau kinetocorsunt markeri pentru sindromul CREST. Anticor-pii au valoare prognostică. Se întâlnesc la 30%din pacienŃii cu fenomen Raynaud, la 12-25% cusclerodermie sistemică şi 20% în ciroza biliarăprimitivă.

● Anticopi anti ribosomali P

Se întâlnesc mai cu seamă la pacienŃiicu LES activ cu psihoză. Nu se întâlnesc la paci-enŃii cu psihoză şi fără LES.

Figure 4. ANA, Anti SS-A(Ro) – finely granular,irregular spotted pattern

ANA aspect pătat fin granular anti SS-A (Ro)

Figure. 5. ANA, Anti Sm/RNP – coarse granularspotted pattern in nucleoplasm

Anti Sm/RNP- aspectul pătat grosolan alnucleoplasmei şi nucleolii liberi


C1q component of the classic complement path-way, have a nephritogenic role, are present in ahigh percent of hypocomplementemic vascu-litides, in patients with SLE and their presencecorrelates with episodes of acute nephritis. Theycan only be assessed using ELISA (14, 15).

Anti-CCP (Cyclic Citrullinated Proteins)

The antibodies that recognize citrullin-ated proteins derived from those with arginineresidues following the apoptosis of the extracel-lular matrix proteins in articulations are specificindicators of incipient rheumatoid arthritis. Cit-rullination occurs under the influence of an en-zyme, the peptidyl-arginine deiminase, that de-termines the apparition of cryptics against whichantibodies are formed. Anti-CCP antibodies areuseful in preclinical diagnosis of rheumatoidarthritis and have also a prognostic role. Theyare assessed through ELISA.

Anti-Neutrophil Cytoplasmic Antibodies(ANCA)

ANCA are autoantibodies primarily dir-ected against the enzymes in primary granula-tions of neutrophil granulocytes. They have apathogenetic role, are useful in diagnosing andmonitoring vasculitides and are important intheir classification. They are assessed by indirectimmunofluorescence using as a substrate normalpolymorphonuclears isolated by density gradientcentrifugation and fixated with ethanol. Immun-ofluorescence pattern can be: cytoplasmic (c-ANCA) (Figure 6) wherein a granular cytoplas-mic fluorescence can be observed and the anti-gen is Proteinase 3 (PR3); periunclear (p-ANCA) (Figure 7), in which a homogenous per-inuclear fluorescence is seen and the major anti-gen is Myeloperoxidase (MPO), but also lacto-ferrin, elastase, cathepsin G; atypical ANCApattern, that appears as a rule when antinuclearantibodies are present. Screening dilution of theanalyzed serum is 1:10 (16). These antibodies

Anticorpi anti C1q

Sunt direcŃionaŃi faŃă de componentaC1q a căii clasice a complementului, au rol ne-fritogen, sunt prezenŃi în procent mare în vascu-litele hipocomplementemice, la pacienŃii cu LESşi se corelează prezenŃa lor cu episoadele activede nefrită. Se determină numai prin tehnica ELI-SA (14, 15).

Anticorpi anti proteine ciclic citrulinate(anti-CCP)

Autoanticorpii care recunosc proteinelecitrulinate derivate din cele cu reziduri de argini-nă în urma procesului de apoptopză a proteinelorextracelulare de matrice de la nivelul articulaŃii-lor sunt indicatori specifici pentru poliartritareumatoidă incipientă. Citrulinarea are loc subinfluenŃa unei enzime, peptidilarginin deimina-ză, în urma acŃiunii căreia apar criptici faŃă decare se formează autoanticorpi. Anti-CCP suntutili în diagnosticul preclinic al PR, şi au rolprognostic în severitatea bolii. Se execută printehnici ELISA.

Anticorpi anti citoplasmă neutrofil(ANCA)

ANCA sunt autoanticorpi direcŃionaŃi cupreponderenŃă faŃă de enzime din granulaŃiileprimare ale granulocitelor neutrofile. Au rol pa-togen, sunt utili în diagnosticul şi monitorizareavasculitelor şi au importanŃă în clasificarea aces-tora. Se execută prin imunoflurescenŃă indirectăutilizând ca substrat PMN normale, izolate princentrifugare în gradient de densitate şi fixate cuetanol. Aspectul imunoflurescenŃei poate fi: ci-toplasmatic (c-ANCA) (Figura 6) unde se ob-servă o fluorescenŃă granulară a citoplasmei, an-tigenul fiind Proteinaza 3 (PR3); periunclear(p-ANCA) (Figura 7) unde fluorescenŃa esteomogen perinucleară şi antigenul major este Mi-


can be assessed also by ELISA but only for thetwo major specificities. Despide their high spe-cificity for vasculitides, the screening of theseantibodies is not recommended. Small titers mayalso appear in infections. When she suspicion ofvasculitides arises, their assessment is recom-mended.

The diseases associated with the c-ANCA pattern are: Wegener’s granulomatosis(>95%), microscopic polyangiitis, Churg-Strauss syndrome and polyarteritis. p-ANCApattern is associated with primary vasculitides:pauci-immune rapidly progressive glomer-ulonephritis, microscopic poliangiitis, Churg-Strauss syndrome, polyarteritis nodosa (17). Ap-ANCA pattern can also be encountered in cer-tain collagenoses such as sindrom Felty’s syn-drome, SLE, rheumatoid arthritis and Sjogren’ssyndrome, as well as in certain inflammatorygastrointestinal diseases: ulcerative colitis,Crohn’s disease and primary sclerosingcholangitis. In the latter diseases, the antigensare cathepsin G, elastase and lactoferrin.

Anti-GMB (Glomerular Basement Mem-brane) Antibodies

These antibodies are directed against

eloperoxidaza (MPO), dar şi lactoferina, elasta-za, catepsina G; aspectul atipic-ANCA careapare de regulă în contextul prezenŃei anticrpilorantinucleari. DiluŃia screening a serului de testateste de 1:10 (16). Se execută şi prin tehnici ELI-SA, numai pentru cele două specificităŃi majore.Nu se recomandă screening pentru aceşti anti-corpi, in ciuda specificităŃii mari pentru vasculi-te. Pot apare titruri mici şi în infecŃii. Se reco-mandă efectuarea lor când există suspiciunepentru vasculite.

Bolile asociate aspectului c-ANCAsunt: granulomatoza Wegener în (>95%), po-liangeita microscopică, Sindrom Churg-Straussşi poliarterita. Aspectul p-ANCA este asociat cuvasculite primare: glomerulonefrita rapid pro-gresivă pauci imună, poliangeita microscopică,sindrom Churg Strauss, poliarterita nodoasă

(17). Aspectul p-ANCA mai poate fi întâlnit înanumite colagenoze ca sindrom Felty, LES, PRsi sindrom Sjongren, precum şi în anumite boliinflamatorii gastro-intestinale: colita ulcerativă,boala Crohn şi colangita sclerozantă primară. Inacestea din urmă, antigenele sunt catepsina G,elastaza şi lactoferina.

Figure 6. c-ANCA (cytoplasmic ANCA) -granular fixation of the cytoplasm

c- ANCA (citoplasmatic-ANCA)- fixareagranulară a citoplasmei

Figure 7. p-ANCA (perinuclear ANCA) –homogenous perinuclear fixation of the

cytoplasmp- ANCA (perinuclear -ANCA)- fixarea omogen

perinucleară a citoplasmei


glomerular and alveolar basement membranesand are characteristic for Goodpasture’s syn-drome. They recognize the noncollagen domain(NC1) of the collagen IV α3 chain. They arepathogenetic, are usually of IgG isotype, areconfirmed by renal biopsy by their linear fixa-tion pattern and are useful in monitoring cyto-toxic and plasmapheretic therapy. Usually theyare assessed through ELISA, but they can alsobe highlighted through immunofluorescence,case in which the mandatory substrate is repres-ented by monkey kidney.

As a conclusion, we make the folowingobservations. Antibody identification does notreplace the diagnosis of autoimmune disease un-less there are clinical data to sustain this dia-gnosis. Nevertheless, once their presence is con-firmed, the diagnosis can dramatically change.The presence of antibodies must be interpretedin the context of clinical data, patient’s age andantibody titer.

Anticorpi anti membran ă bazală glome-rular ă (anti -GBM)

Anticorpii sunt direcŃionaŃi faŃă demembranele bazale glomerulare şi alveolare fi-ind caracteristici pentru sindromul Goodpasture.Recunosc domeniul non-colagen (NC1) al lanŃu-lui α3 al colagenului IV. Sunt patogeni şi de re-gulă izotip IgG. Sunt confirmaŃi prin biopsie re-nală cu aspectul liniar de fixare al acestora. Suntutili în monitorizarea terapiei cu agenŃi citoto-xici şi plasmafereză. Se identifică de regulă printeste ELISA, dar e posibil şi prin imunofluores-cenŃă indirectă, unde substratul este obligatoriurinichi de maimuŃă.

Ca şi concluzie, facem următoarele ob-servaŃii. Identificarea autoanticorpilor nu înlocu-ieşte diagnosticul de boală autoimună dacă nuexistă şi date clinice care să susŃină diagnosticul.Cu toate că odată ce prezenŃa lor este confirma-tă, diagnosticul poate fi schimbat în mod drama-tic. PrezenŃa anticorpilor trebuie interpretată încontextul datelor clinice, a vârstei pacientului şial titrului anticorpilor.

References (Bibliografie)

1. Gonzales-Buitrago J.M., Gonzales C.Present and future of autoimmunity laboratory.Clin Chim Acta 2006, 365, 50-572. Tozzoli R. Recent advances in diagnostictechnologies and their impact in autoimmunediseases. Autoimmun Rev 2007, 6, 334-3403. Plebani M., Pittoni M., Celadin M et al. Recentadvances in diagnostic technologies for autoimmunedisease. Autoimmun Rev 2009, 8, 238-2434. Villalta D., Tozzoli R., Tonutti E et al. Thelaboratory approach to the diagnosis of autoim-mune diseases: is the time to change? Autoim-mun Rev 2007, 6, 359-365

5. Rose N. R. Predictors of autoimmune disease:autoantibodies and beyond. Autoimmunity 2008, 41(6), 419-428 6. Bizzaro N. The predictive significance ofautoantibodies in organ-specific autoimmune dis-eases. Clin.Rev Allergy Immunol 2008, 34 (3), 326-3317. Desplat-Jego S., Bardin N., Larida B et al. Eval-uation of the BioPlex2200 ANA Screen for detec-tion of antinuclear antibodies and comparison withconventional methods. Ann NY Acad Science 2007,1109 Issue Autoimmunity, 245-2558. Kaul R., Johnson K, Scholz H et al . Perform-ance of BioPlex2200 Autoimmune Vasculitis kit.


Autoimmunity Rev 2009, 8, 224-2279. Joos T.O., Schrenk M., Hopfl P. et al. Autoanti-gen microarray enzyme-linked immunosorbent as-say for autoimmune diagnostics. Electrophoresis2000, 21, 2641-5010. Cristea A. Explorări imunologice. In :Brudaşcă I., Cristea A. Ghid de laborator. Ed. Med-icală Universitară “Iuliu HaŃieganu” Cluj-Napoca2005, p 121-174 11. Haugbro K., Nossent J.C., Winkler T et al.Anti ds DNA antibodies and disease classifica-tion in antinuclear antibody positive patients.The role of analytical diversity. Ann RheumDis 2004, 63, 386-39412. Goetz J. Anticorps anti-nucleosome.GEAI L’INFO No 2, Juillet 1999, 5-8

13. Amoura Z., Koutouzov S, Chabre H et al. Pres-ence of antinucleosome autoantibodies in a restric-ted set of connective tissue diseases.Arthritis&Rheum 2000, 43, 76-8414. Sinico R. A., Radice A., Ikehata M. et al. AntiC1q autoantibodies in lupus nephritis: prevalenceand clinical significance. Ann NY Acad Sci. 2005,1050, 193-20015. Kallenberg C. G.M. Anti C1q autoantibodies.Autoimmunity Rev 2008, 7, issue 8, 612-61516. Cristea A., Badea T, Bodizs G. Clinicalevaluation of antineutrophil cytoplasmicautoantibodies in ANCA associated diseases.J.Clin Lab Immunol 1995, 46, 85-9417. Viik A. Rational us of ANCA in the diagnosisof vasculitis. Rheumatology 2002, 41, 481-483

Documents

COURSE NOTES Laboratory investigation of the organ non ... · unei anume boli autoimune, ci de multe ori coe-xist ă mai mul Ńi autoanticorpi în aceea şi afec Ńiu-ne. Din cele