1

Contractor: Universitatea Babeş-Bolyai Programul: IDEI Tipul proiectului: Proiecte de cercetare exploratorie Cod proiect: ID_501 Denumirea proiectului: Studii spectroscopice si teoretice pe sisteme moleculare complexe de interes biomedical Fază unică 2009: Modelare teoretică a moleculelor cu proprietati de recunoastere cationica DFO, EDTA, PAR, Cromazorol, Eriochrome black T şi a compuşilor de interes biomedical amlodipina-besylat, 5-para-nitro-benziliden-2-tion-4-ona(5p-NBTT); Studiul compozitiei unor compusi bioactivi prin spectrometrie de masa (MS) cuplata cu cromatografie (GC-MS) din uleiuri volatile utilizate in tratament (aromoterapie) si alimentatie (menta, busuioc, lavanda, trandafir, citrice, etc.);

Articole publicate şi lucrări comunicate în cadrul fazei

1. L. Szabó, V. Chiş, A. Pîrnău, N. Leopold, O. Cozar, Sz. Orosz, Spectroscopic and theoretical study of amlodipine besylate, Journal of Molecular Structure, 924-926 (2009) 385-392 2. Adrian Pîrnău, Vasile Chiş, Laszlo Szabo, Onuc Cozar, Mihai Vasilescu, Ovidiu Oniga, Richard A. Varga, Experimental and theoretical investigation of 5-para-nitro-benzylidene-thiazolidine-2-thione-4-one molecule, Journal of Molecular Structure, 294-296 (2009) 361-370 3. N. Leopold, L. Szabó, A. Pîrnău, M. Aluaş, L.F. Leopold, V. Chiş, O. Cozar, Raman spectroscopic and DFT theoretical study of 4-(2-pyridylazo)resorcinol and its complexes with zinc(II) and copper(II), Journal of Molecular Structure, 919; 94-99; 2009 4. A. Iordache, M. Culea, C. Gherman, O. Cozar, Characterization of Some Plant Extracts by GC-MS, Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section B, (2009) vol .267, 338-342 5. M. Culea, S. Gocan, Flavonoids determination in herbs by GC and GC/MS, Journal of Environmental Protection and Ecology- JEPE ,10(2) 461-468 6. Cornelia Mesaros, Andreea Iordache, Monica Culea, Cora Crăciun, Onuc Cozar, Radu Fechete, Eugen Culea, SEA BUCKTHORN OIL STUDY BY GC/MS AND IR, Studia, 2009, in press. Amlodipină-besilat Amlodipina (2-etil-5metil -2(2-aminoetoximetil) -4-(2-clorofenil) -1,4-dihidro -6-metil -3,5-piridindicarboxilat) este utilizată singură sau în combinaţie cu alte medicamente pentru tratarea presiunii sanguine crescute şi a anginelor pectorale, ea făcând parte din grupa compuşilor denumiţi dihidropiridine blocatoare ale canalelor de calciu. S-a demonstrat că amlodipine besylate (AM) îndeplineşte cel mai bine toate cerinţele legate de biocompatibilitate.

2

Fig. 1 Structura moleculară şi schema de numerotare a atomilor pentru molecula amlodipine besylate.

Folosind metoda semiempirică AM1, pornind de la geometrii care diferă prin orientarea relativă a lanţului lateral faţă de inelul benzenic central au fost folosite diferite geometrii de start. Geometria optimă arătată în Fig.1 corespunde conformerului cu energia cea mai scăzută; mai mult, toate celelalte puncte staţionare găsite corespund unor conformeri cu energie foarte apropiată de cea din Fig. 1 (aproximativ cu 4kJ/mol) şi de asemenea, numerele de undă calculate şi modurile normale sunt foarte asemănătoare pentru minimele locale energetice obţinute [1]. Energia de interacţiune dintre cationul de amlodipină şi anionul

benzen sulfonat, definită ca diferenţa dintre energia întregului sistem (ECA) şi suma energiilor cationului (EC+) şi anionului (EA-) a fost calculată la nivel B3LYP/6-31+G(d,p) şi valoarea ei este de –493.4 kJ/mol.

După corecţia de punct zero a energiei şi după eliminarea erorii suprapinerii seturilor de bază energia finală de interacţiune ∆EZPE,BSSE este –466.7 kJ/mol. Pe baza calculelor de optimizare a geometriei moleculei s-au obţinut parametrii geometrici corespunzători. Din calculele efectuate rezultă pentru lungimile de legătură dintre CC din inele o valoare cuprinsă între 1.36-1.53 Å. Lungimea de legătură CC din celelalte grupări este în jurul a 1.5 Å. Lungimile de legătură dintre NC au valori în jurul a 1.37-1.45 Å, valori care comparate cu alte date teoretice sunt în acord calitativ foarte bun. Lungimea legăturilor CO variază în funcţie de tipul sau de gruparea de care se leagă, astfel: când este implicat într-o legătură dublă este de 1.22 Å şi când se leagă lanţul de carboni este de 1.35-1.434 Å. Lungimea legăturii CCl calculate cu metoda B3LYP este de 1.76 Å. Lungimea legăturii SOl calculate cu metoda B3LYP este de 1.5 Å, iar

Fig. 2. Spectrele FT-IR (a) şi FT-Raman (b) experimentale şi simulate pentru molecula amlodipine besylate la temperatura

camerei.

3

valoarea medie a legăturilor CH este de 1.09 Å, acesta variind puţin în funcţie de grupul de care aparţin. Spectrele experimentale şi cele simulate pe baza calculelor DFT sunt prezentate în Fig.2. Vibraţia de întindere asimetrică a grupului amino se găseşte la 3300 cm-1 în spectrul FT-IR experimental iar corespondentul său calculat la 3376 cm-1 . Vibraţia de întindere simetrică pentru acelaşi grup o găsim la 2800 cm-1 in spectrul Raman experimental şi în perfect acord cu numărul de undă calculat la 2804 cm-1. Vibraţia de tip „umbrela” a grupării NH3

+ calculată la 1391 cm-1 corespunde benzilor observate în spectrele experimentale FT-IR şi FT-Raman la 1384 respectiv 1382 cm-1. O vibraţie wagging predominantă a aceluiaş grup este estimată la 1265 cm-1 în perfect acord cu benzile experimentale de la 1265 cm-1 în FT-IR şi 1270 cm-1 în Raman. Vibraţiile de întindere asimetrică νas(CH3) contribuie la modurile asociate benzilor de la 3020 cm-1 şi 3001 cm-1 din spectrul Raman experimental valorile calculate corespunzătoare fiind 3011 cm-1 şi 2991 cm-1. Banda corespunzătoare vibraţiei de întindere simetrică νs(CH3) este la 2949 cm-1 în spectrul Raman şi la 2948 cm-1 în FT-IR iar corespondenta calculată este la 2946 cm-1. Deformaţiile asimetrice ale grupurilor metil din amlodipine besylate sunt asociate cu un grup de trei benzi cu intensităţi variabile, acestea fiind observate în spectrul experimental FT-IR la 1470, 1445 şi 1432 cm-1. Vibraţiile de întindere ale grupurilor carbonil sunt de asemenea foarte bine reproduse de calculele teoretice: cele două benzi foarte intense din spectrul FT-IR la 1699 şi 1675 cm-1 corespund vibraţiilor ν(C13O) şi ν(C18O) cu valorile numerelor de undă calculate la 1709 şi 1681 cm-1. Cea mai intensă bandă din spectrul Raman experimental se observă la 1650 cm-1 (1653 cm-1 în spectrul IR) şi corespunde vibraţiilor de întindere C=C din inelul piridinic. Acest mod este calculat cu cea mai mare activitate Raman, cu numarul de undă puţin mai mic, la 1624 cm-1. Cea mai intensă bandă din spectrul FT-IR este la 1206 cm-1 , având ca şi corespondent o bandă distinctă în spectrul Raman cu aceeaşi valoare. Calculele dau o valoare teoretică la 1206 cm-1 vibraţie atribuită unui mod complex care conţine o întindere asimetrică a grupului SO3

- şi este perfect reprodus ca intensitate şi poziţie. O altă bandă caracteristică a acestui grup SO3

- se observă în spectrul FT-IR la 1092 cm-1 cu valoarea calculată la 1086 cm-1 şi corespunde unei vibraţii de întindere simetrică. Banda foarte intensă din spectrul Raman la 997 cm-1 este atribuită unei vibraţii out-of plane CH bendings in inelul 3, valoarea calculată fiind în foarte bun acord cu cea experimentală. Vibraţia ν(CCl) contribuie la modul care are banda la 704 cm-1 în spectrul Raman şi 702 cm-1 în spectrul IR şi valoarea calculată la 713 cm-1 în bun acord cu cele experimentale. Acordul foarte bun între numerele de undă experimentale şi cele calculate, precum şi identificarea frecvenţelor grupurilor caracteristice a moleculei amlodipine besylate, confirmă atribuirea corectă a spectrelor IR şi Raman a acestui compus. Mai mult, benzile caracteristice observate pentru următoarele grupuri: SO3

- (1206 cm-1 (νas(SO3)) şi 1093 cm-1 (νs(SO3-)); NH3+ (3300 cm-1 (νas(NH3

+)), 1616 cm-1 (δas(NH3

+)); 1206 şi 1125 cm-1 (ρ(NH3+)) confirmă structura sub formă cation-anion a

moleculei amlodipine besylate. Deoarece spectrul 1H RMN poate furniza informaţii valoroase despre structura compusului investigat, am folosit în studiul de faţă, pe lângă spectroscopia vibraţională şi spectroscopia 1H RMN şi 13C RMN, cuplată cu calculul GIAO/DFT al tensorilor de ecranare. Măsurătorile RMN pentru AM au fost efectuate pe probe lichide folosind DMSO-d6 ca solvent. Spectrul RMN calculat corespunde geometriei AM optimizate în fază gazoasă folosind trei seturi de bază: 6-31G(d), 6-31+G(d,p) la care au fost adăugate funcţiile de polarizare pentru atomii de hidrogen, precum funcţiile difuze pentru atomii grei şi setul cc-pVDZ. Cea mai bună performanţă în reproducerea spectrului 1H RMN pentru molecula AM este oferită de către setul de bază 6-31G(d) pentru care deviaţia absolută medie (MAE) între valorile deplasărilor chimice experimentale şi calculate este 0.28 ppm. Setul de bază 6-31G+(d,p) cu deviaţia absolută (MAE) 0.36 nu arată îmbunătăţiri semnificative pentru valorile deplasărilor chimice pentru 1H RMN. Menţionăm că pentru amlodipina în formă liberă, deplasările chimice a protonilor din grupul NH2 calculate cu metoda B3LYP/6-31G(d) sunt 0.38 şi -0.14 ppm în totală contradicţie cu observaţiile experimentale. Acest rezultat confirmă prezenţa complexului amlodipine-cation-benzenesulfonat-anion în soluţie DMSO la fel ca şi în stare solidă.

4

Pentru spectrul 13C RMN este evident din că setul de bază cc-pVDZ consistent la corelare este mai performant în calculul valorilor deplasărilor chimice decât celelalte două seturi de bază. Deviaţia absolută medie (MAE) cu acest set de bază este 2.22 ppm, în timp ce pentru 6-31G(d) şi 6-31+G(d,p) aceste valori sunt 3.71 respectiv 3.09 ppm. 5pN-BTT Oxazolidinonele reprezintă o clasă interesantă de compuşi cu proprietăţi antibacteriene, cu un mecanism unic de inhibiţie a sintezei proteinelor bancteriene, care conţin în structura lor o unitate similară linezolid-ului. Rezultate recente arată că compusul 5-para-nitro-benziliden-tiazolidin-2-tion-

4-ona (5pN-BTT) este un antibiotic eficient care prezintă o activitate eficientă, superioară ampicilinei. Pentru studiul acestui compus au fost folosite metode experimentale (FT-IR, Raman, RMN şi difracţia de raze X) şi metode teoretice de tip DFT, cu scopul de a caracteriza structura sa electronică şi moleculară [Pir09]. Studiul de difracţie de raze X arată că acest compus cristalizează cu o moleculă de solvent de tetrahidrofuran, formând un complex de forma 1:1 5pN-BTT:THF, în grupul spaţial monoclinic C2/c, cu 8 molecule pe celula elementară, parametrii celulei fiind: a = 29.496(9) Å, b = 7.276(2) Å, c = 14.873(4) Å, a = 90.0o, b = 95.161(6)o şi c = 90.0o (vezi Fig.3). Parametrii geometrici obţinuţi experimental au fost calculaţi folosind un model care să ţină cont de

interacţiunea 5pN-BTT cu moleculele de solvent şi s-a obţinut un acord excelent între datele experimentale şi cele teoretice. In plus, pe cale teoretică (B3LYP/6-31+G(d,p)) s-a obţinut o estimare mult mai bună a lungimilor legăturilor care implică atomi de hidrogen. Astfel, valoarea calculată a legăturii N-H este de 1.04 Å, iar a legaturilor C-H este de aproximativ 1.08Å. Medoda difracţiei de raze X arată că inelul benzilidenic cu substituentul (NO2) nu este coplanar cu inelul tiazolidinic, unghiul diedru dintre cele două plane fiind de 26.56(14)o. Totuşi, metodele teoretică arată un aranjament coplanar al celor două inele, în contrast cu observaţiile experimentale, aceasta

Tabelul 1. Energiile relative în kcal/mol) şi momentele de dipol (în Debye, rândul doi) calculate la nivel B3LYP/6-31G(d) pentru cei trei tautomeri ai 5pN-BTT în gaz, soluţie de apă şi soluţie de DMSO

Fig.3. Diagrama ORTEP a compusului 5pN-BTT_THF (a)şi împachetarea cristalului 5pN-BTT_THF în lungul axelor cristalografice b (b) şi c (c).

5

discrepanţă fiind pusă pe seama interacţiunilor suplimentare rezultate ca urmare a efectelor de împachetare a cristalului, interacţiuni care nu pot fi incluse în modelele teoretice folosite. Pentru caracterizarea legăturilor de hidrogen în care sunt implicate moleculele 5pN-BTT în soluţie de DMSO a fost folosit un model care constă din complexul 5pN-BTT : 2DMSO. Exceptând unghiurile diedre, toţi parametrii geometrici ai legăturilor de hidrogen au fost reproduşi foarte bine de calculele teoretice. Aceasta

arată faptul că geometria complecşilor nu se modifică substanţial la trecerea din faza solidă în faza lichidă. In plus, aceste calcule arată faptul că legăturile de hidrogen intermoleculare au un caracter electrostatic, fiind de intensitate medie spre puternică, comparativ cu alţi compuşi similari. Aşa cum am arătat în studii precedente pe compuşi similari, aceşti derivaţi de tip BTT pot exista sub forma unor conformeri sau tautomeri diferiţi, cei mai importanţi din acest punt de vedere fiin tautomerii, tion, tiol şi respectiv enol. Pentru caracterizarea stabilităţii celor trei tautomeri diferiti au fost folosite metode de calcul, testându-se stabilitatea lor în vid sau în soluţii de apă, respectiv de DMSO. Pentru modelarea efectelor de solvent s-au folosit metoda SCRF-PCM. Conform cu rezultatele teoretice, în fază gazoasă, dar şi în cele două soluţii, tautomerul de cea mai joasă energie este forma tionică a 5pN-BTT. Cei doi tautomeri tiolici posibili sunt mai puţin stabili energetic decât tautomerul tion cu 14.67 kcal/mol, iar tautomerul enolic este mai instabil energetic cu 15.78 kcal/mol (corecţia ZPVE inclusă). Rezultatele complete ale acestei analize energetice sunt date în Tabelul 1. Spectrul RMN al acestui compus a fost analizat în soluţie de DMSO, fiin calculat de asemenea, pentru fiecare dintre cei trei izomeri. Pentru analiza influenţei interacţiunilor prin legături de hidrogen intermoleculare a fost calculat şi spectrul RMN al complexului 5pN-BTT : 2DMSO. Principalele rezultate ale acestei investigaţii constau în atribuirea corectă a spectrelor 1H şi 13C RMN ale compusului şi determinarea echilibrului tautomeric în soluţie. Astfel, am determinat faptul că în soluţie de DMSO, protonul legat de atomul de azot în cazul tautomerului tionic poate migra la atomul de sulf, obţinându-se tautomerul tiolic. Spectrul RMN arată un peak la 3.37 ppm pentru protonul H(S). Mai mult, atât rezultatele teoretice cât şi cele experimentale arată faptul că cei doi tautomeri coexistă în soluţie, şi în plus, tautomerul tionic este implicat în legături de hidrogen puternice prin intermediul protonului H(N) cu moleculele de solvent (Fig. 3). Experimental, deplasarea chimică asociată acestui proton este găsită la 14.05 ppm. Menţionăm că modelele continue de solvatare nu pot reproduce observaţiile experimentale. Spectrele FT-IR şi Raman ale compuslui au fost înregistrate pentru proba sub formă de pulbere la temperatura camerei şi au fost atribuite pe baza calculelor efectuate cu funcţionala B3LYP şi setul de bază 6-31G(d). Câteva benzi caracteristice ale acestor spectre, cu modurile normale de vibraţie asociate sunt: ν(NH) la 3415 cm-1, calculată la 3459 cm-1, ν(C=O) la 1717 cm-1, vibraţiile ν(CC) la 1607, 1588 şi 1533 cm-1. Cea mai intensă bandă din spectrul IR este observată la 1344 cm-1, în timp ce calculele B3LYP o prezic la 1340 cm-1. Această bandă este datorată deformărilor δ(NO2) în plan, cuplate cu vibraţii δ(CH). In spectrul Raman, cea mai intensă bandă apare la 1584 cm-1 şi în conformitate cu calculele corespunde modurilor de vibraţie de tip ν(CC) şi δ(CH). Valoarea corespunzătoare calculată B3LYP este la 1583 cm-1, ea având cea mai mare activitate Raman calculată. Intregul spectru Raman a fost reprodus la nivel B3LYP/6-31G(d) cu o deviaţia standard de 16.2 cm-1, valoare ce confirmă o atribuire sigură şi corectă a spectrului compusului 5pN-BTT. PAR PAR (4-(2-Pyridylazo) resorcinol monosodium salt monohydrate) este un compus folosit pe scară largă ca reactiv colorimetric pentru ionii metalici deoarece formează cu majoritatea metalelor de tranziţie compuşi foarte stabili, solubili în apă şi coloraţi intens.

Fig.3 Geometria optimizată a complexului 5pN-BTT : DMSO, calculată la nivel B3LYP/6-31+G(d,p) şi folosită pentru calculul spectrului 1H RMN în soluţie

6

Fig. 4 Spectrul FT-Raman al moleculei PAR (jos). Spectrele SERS ale moleculei PAR şi a complexului Zn(PAR)2 în

rapoartele molare: PAR:ZnSO4 3:1, 2:1, 1:1.

Pentru testarea folosirii acestui compus ca şi moleculă cu proprietăţi de recunoaştere a ionilor metalici am optimizat mai întâi geometria moleculei, am calculat potenţialul electrostatic molecular pentru a determina site-urile de reactivitate a acestuia şi apoi am înregistrat şi am atribuit spectrele vibraţionale FT-IR şi Raman, pe baza calculelor teoretice [3]. Pentru obţinerea spectrelor SERS a moleculei PAR

şi a compuşilor pe care îi formează cu ionii Fe3+, Zn2+, Cu2+, a fost preparat mai întâi coloidul de argint redus cu hidroxilamină la care s-a adăugat analitul. Spectrul FT-Raman este dominat de câteva benzi atribuite inelului piridinic de la 636, 1390, 1446, 1562 cm-1 şi inelului benzenic de la 532, 995, 1479, 1597, 1618 cm-1. Comparând spectrul Raman cu spectrul SERS din figura 4, se observă o importantă creştere a intensităţii Raman pentru benzile datorate vibraţiilor legăturilor simple: C-N, C-O şi C-C în regiunea spectrală 1100-1400 cm-1.

În schimb, o creştere mai puţin semnificativă se observă în regiunea spectrală a legăturilor duble 1550-1600 cm-1. Cea mai amplificată bandă este cea a vibraţiei de respiraţie a inelului benzenic aflată la 1000 cm-1.Trebuie notat faptul că nu este exclusă o posibilă legare a moleculei PAR cu ionii reziduali de Ag+. Prin urmare spectrul SERS al ligandului PAR poate fi modificat de formarea unor complecşi cu ionii de argint. Potenţialul molecular electrostatic arată că valorile cele mai negative sunt asociate cu atomii de azot si oxigen. Prin urmare, adsorbţia acestei specii moleculare pe suprafaţa particulelor coloidale de Ag este posibilă prin intermediu acestor atomi. Spectrul SERS al complexului Zn(PAR)2 obţinut din PAR-ZnSO4 în raport molar 3:1, conţine caracteristici atât ale moleculei PAR cât şi ale complexului Zn(PAR)2, arătând că atât moleculele PAR cât şi complecşii Zn(PAR)2, sunt adsorbiţi la suprafaţa de argint. Banda vibraţiei de respiraţie a inelului benzenic apare la 1009 cm-1 specific complexului Zn(PAR)2, dar se poate distinge foarte bine un umăr la numere de undă mai mici care este atribuit moleculei PAR adsorbită la suprafaţa de argint. Acest umăr este mai puţin evidentă în spectrul SERS al complexului realizat prin amestecul PAR-ZnSO4 in raport molar 2:1. Diverşi complecşi PAR-metal pot fi diferenţiaţi prin caracteristicile spectrale SERS. Fiecare spectru SERS al complecşilor PAR-metal prezintă o amprentă spectrală caracteristică. Anumite benzi sunt

reprezentative pentru fiecare complex PAR-metal, acestea fiind prezentate în tabelul 2. Prezenţa benzilor marker, pentru fiecare complex PAR-metal, reprezintă o caracteristică deosebit de utilă în detecţia ionilor metalici. Astfel, folosind ionoforul PAR ca agent de chelatare şi technica SERS

7

ca metodă traductoare, pot fi identificaţi ionii metalici pe baza amprentei spectrale. În continuare am testat posibilitatea folosirii moleculei PAR pentru determinarea ionilor metalici din probe de mediu folosind metoda SERS. S-au preparat complecşi metalici ai ionoforului PAR cu ionii Zn(II), Cu(II), Fe(III), Mn(II) şi Pb(II) la concentraţia 10-3 M. Complecşii metalici sunt bidentaţi, adică se formează sub formă de dimeri în sensul că două molecule PAR leagă un ion metalic. Pentru a asigura complexarea integrală a ionilor metalici, amestecurile au fost preparate în raport stoichiometric 1:1, probele de mediu fiind prelevate din zona zona Copşa Mică, judeţul Sibiu. Pentru analiza solului, au fost efectuate extracţii ale metalelor din sol folosind apă distilată, acid clorhidric 1 M şi 0.1 M, şi acid azotic 0.1 M Figura 5 prezintă spectrele SERS ale extractelor din sol. Spectrele SERS ale extraselor din sol efectuate cu apă, acid clorhidric, sau acid azotic prezintă profile spectrale foarte asemănătoare cu spectrul SERS al complexului Zn(PAR)2. Spectrul SERS al extractului din sol efectuat cu apă prezintă o concordanţă excelentă cu spectrul SERS al complexului Zn(PAR)2. Poziţia şi profilul benzilor marker de la 1010 am-1 şi 1335 cm-1 sunt în foarte

bună concordanţă cu cele ale spectrului etalon. De asemenea, benzile marker în extractele cu acid clorhidric şi acid azotic apar la 1018 şi 1336 cm-1 respectiv 1016 şi 1330 cm-1. Deplasarea benzilor de la 1009 cm-1 la valori mai mari (1018 cm-1 respectiv 1016 cm-1) este pusă pe seama mediului mai acid în care au fost înregistrate, dar nu este exclusă posibilitatea contribuţiei şi a altor complecşi metalici extraşi din sol, desigur întro cantitate mult mai micădecât a zincului. De asemenea trebuie menţionat că profilul spectral al spectrelor SERS al extractelor de sol efectuate cu HCl şi HNO3 sunt în excelentă concordanţă cu profilul spectrului SERS etalon. Prin spectroscopie UV-Vis a fost dedusă cantitativ concentraţia de Zn din probele de sol prelevate (390 mg/kg sol). Rezultatele SERS şi UV-Vis au fost confirmate şi prin spectroscopie de fluorescenţă de raze X Studiul compozitiei unor compusi bioactivi prin spectrometrie de masa (MS) cuplata cu cromatografie (GC-MS) din uleiuri volatile utilizate in tratament (aromoterapie) si alimentatie (menta, busuioc, lavanda, trandafir, citrice) Stabilirea metodelor de extractie a compusilor activi cu actiune terapeutica Studiile pentru obtinerea unor metode de extractie cat mai eficienta a compusilor organici dintr-o matrice biologica sunt de mare importanta. In acest sens metodele trebuie sa aiba randament de extractie ridicat, precizie si consum mic de solventi si de timp. Pentru stabilirea metodei de extractie optime s-a comparat: metoda de extractie lichid-lichid (LLE) cu doua metode diferite de extractie pe faza solida (SPE pe 300 mg RP-18 silicagel legat de C-18 si SPE pe 300 mg TCS sau „amestec de faze”), metoda de extractie prin microunde (MWE) si extractia prin ultrasunete (USE), utilizandu-se un amestec etalon de compusi organici in cantitate cunoscuta. Procedura de extractie nu trebuie sa afecteze structura moleculara a compusilor. Aparatura experimentală: S-a utilizat un cromatograf de gaze cuplat cu un spectrometru de masă (GC/MS), Thermo-Quest, Finnigan, Trace GC-Trace DSQ. Compuşii amestecului au fost separaţi pe o coloană capilară Rtx-5MS, 30m x 0.25 mm, 0,25 µm. Programul de temperatură: 50oC ( timp de 1

Fig. 5 Spectrele SERS ale extractelor din sol din

regiunea Copşa-Mică.

8

min), apoi crestere cu viteza de 8oC/min la 300oC (10 min). Temperatura interfaţei GC/MS şi a sursei de ioni: 250oC. Energia electronilor : 70 eV, curentul de emisie al electronilor : 100µA. Procedura de extractie: S-au utilizat diferite proceduri de extractie: antrenare cu vapori sau extractie lichid-lichid (LLE), SPE, USE, MWE. Solventii utilizati in efectuarea studiului (metanol , clorura de metil (DCM), hexanul, acetat de etil , acetona) au provenit de la Chimopar Bucuresti si au fost purificati prin distilare , cand afost necesar. Identificarea componentilor separati cromatografic s-a facut prin comparare cu spectrele de masă din biblioteca de spectre NIST si Wiley. Pentru a obtine o sensibilitate cat mai buna, insertia de sticla a injectorului s-a dezactivat prin tratare cu 5% dimetildiclorsilan, in toluen. 100 µl din compusii urmatori, exceptand heptenona, au intrat in compozitia amestecului astandard (A) utilizat in determinarea compusilor bioactivi: 1. 3-Hepten-2-one utilizat ca si standard extern, 2. 1,8-cineole (eucalyptol) (sintetizat la SC Natex SRL) 3.linalool (Fluka , Suedia), 4. geraniol (Fluka , Suedia) , 5. alpha-terpinyl acetate (Fluka, Suedia) , 6. geranyl acetate (Fluka , Suedia) , 7. amyl salicylate (sintetizat la SC Natex SRL) , 8.myristic acid (C14:O, Polyscience Corporation , Evantson , Ilinois , USA), si 10.stearic acid (C18:O, Polyscience Corporation , Evantson, Ilinois, USA). Puritatea standardelor si solventilor utilizati a fost testata prin GC/MS. 3-Hepten-2-one a fost adaugat seoarat , dupa extractie. Cartusul de 300 mg RO-18 si TC au fost obtinuti din Merck. Procedura de extractie lichi-lichid (LLE) Solventul A este format din acetat de etil: hexan: clorura de metilen, in proportie de 5:1:1 , v/v/v. Se amesteca 30 µl amestec standard A cu 0.9 ml solutie apa distilata : etanol (1:1 , v/v) (sau 0.9 ml extract hidroalcoolic) cu 0.9 ml apa distilata si 0.3 ml solvent A , 3:3:1 , v/v/v. Amestecul se agita timp de 1.5 minute iar apoi este centrifugat 2 minute. O cantitate d e1 µl se injecteaza de doua ori in cromatograf. Procedura de extractie pe faza solida (SPE) Faza solida se conditioneaza cu 3 ml metanol si 3 ml apa distilata. Dupa ce se aplica proba , faza solida se spala si se usuca la vid timp de 10 minute iar apoi urmeaza elutia probei cu 3 x 0.3 ml solvent. Solventul utilizat in cazul cartusului RP-18 cu sicagel legat cu C-18 este solventul A, iar in cazul cartusului TSC (amestec de faze) solventul este cloroform : acetona 1:1 , v/v. Eluentul este obtinut si se adauga 1µl standard intern , iar apoi o cantitate de 1µl se injecteaza in cromatograf cu ajutorul unei siringimicrometrice. Fiecare proba este injectata de doua ori. Procedura de extractie cu microunde (MWE) Metoda de extractie cu microunde se realizeaza la o frecventa de 2.45 GHz timpde 4 secunde , la o temperatura de 60 0C , intr-o fiola cu capac rezistenta la temperatura si presiune (de 3 ori cate 4 secunde , cu recire cu apa rece a fiolei). Cantitatea de 30 µl din amestecul standard A este adaugata la 0.9 ml solutie hidraulica , 0.9 apa distilata si 0.3 ml solvent A.Noul amestec este extras la microunde. Apoi 1µl 3-hepten-2-one , standard intern , este adaugat supernatantului si injectat de doua ori in cromatograf. Procedura de extractie cu ultrasunete (USE) Metoda de extractie se realizeaza cu ultrasunete iradiate printr-o tija introdusa in proba de extractie, intr-un timp de 1 minut , astfel ca temperatura sa nu depaseasca 60 0 C. Proba de analizat se aseaza intr-un vas care contine 30 µl amestec standard A , 0.9 ml solutie hidroalcoolica , 0.9 ml apa distilata si 0.3 ml solvent A. Dupa extractie , 1µl 3-hepten-2-one se adauga la supernatant si se analizeaza de doua ori. Validarea metodelor Cromatograma de separare a compusilor studiati este prezentata in Fig.3, unde A, B si C reprezinta solventii si compusii lor de impuritate pentru esterii metili utilizati in amestecul standard A. Randamentul metodei a fost determinat printr-o calibrare externa cu standardul 3-hepten-2-one , iar rezultatele obtinute in acest caz sunt prezentate in tabelul 1. Valorile medii au rezultat din doua sau trei proceduri de extractie si doua injectari din fiecare extract. Valorile deviatiilor standard relative pentru fiecare procedura de extractie sunt mai mici de 3 % , astfel ca precizia de analiza este foarte buna. Tabelul 3 prezinta valorile medii ale randamentului fiecarei metode de extractie a compusilor bioactivi studiati. Cele mai bune rezultate ale randamentului s-au obtinut in cazul MWE (103%) si USE (101%) , umate de SPE(85.5%) pe cartus RP-18 si LLE(80.8%).

9

Eucaliptolul este component terapeutic present in salvie, menta 5%,isop, dafin 50%. Linaloolul este component important in coriandru 70%,dafin 20%, magheran 30%, salvie, oregan, melisa. Geraniolul se intalneste in ulei de trandafir, coriandru 3%. Metoda de extractie lichid-lichid (LLE) 3:3:1 , v/v/v se utilizeaza I analiza

compusilor bioactivi din plantele medicinale. Deviatiile standard relative in cazul celor patru proceduri diferite de extractie utilizate in cazul analizarii compusilor bioactivi din plante, au fost mai mici de 5%, fiecare extract fiind injectat de doua ori in cromatograf. Identificarea compusilor s-a realizat prin GC/MS. Aceasta metoda a fost aplicata intr-un studiu care pezenta analiza comparativa a compusilor bioactivi din diferite sorturi de plante apartinand aceleaiasi specii. Diferntele cantitative si calitative care se observa se pot datora diferitelor soiuri, procedurilor de uscare, climei , modului de pastrare, etc. Comparatia intre diferitele metode de extractie s-a dovedit utila pentru caracterizarea compusilor bioactivi din plante medicinale. Studiul unor principii active din plante prin GC/MS Plantele sunt tot mai mult studiate pentru efectul lor benefic terapeutic. Componentele lor bioactive sunt de o mare varietate si deosebit de pentru sanatatea umana. Extractele de plante sunt folosite pentru efectul lor terapeutic, antiparazitar, antifungic si citostatic. S-a utilizat microextractia lichid-lichid (LLE) din ceai medicinal (musetel sau menta), agitand timp de 15 minute 1gram planta cu 2 ml etanol: apa ditilata , 1/1 , v/v , intr-o baie de apa la 45 0C. Dupa racire se face o extractie 3:3:1, v/v/v , extract, apa ditilata si solvent A (acetat de etil : clorura de metilen :hexan ) intr-o fiola de 2 ml cu capac. Se agita 2 minute, iar după centrifugare se injecteaza 1 µl din supranatant in GC/MS. Se poate utiliza extractia pe faza solida ca la punctul b de mai sus. Hibridul natural Mentha piperita (Labiatae), cunoscuta si ca peppermint, creste in zonele temperate si este compusa din Menta aquatica / Menta de apa si Menta Spicale / Spearmint. Sunt trei varietati de Mentha piperita L: -varietatea vulgaris sole ( Mitcham) , cea mai raspindita in lume -varietatea sylvestris sole (Ungaria) -varietatea officinalis sole. Speciile de menta cultivate sunt menta neagra si menta alba. Cea mai cultivată specie de menta este menta neagra, Mentha piperita officinalis rubescens camus. Aceasta specie are o recolta de ulei voltil mai mare decat menta alba. Efectul terapeutic al mentei s-a observat in efectul antispastic si antiinflamator, in tulburarile digestive, efect ce este atribuit componentelor esentilale. Substantele naturale bioactive din uleiul de menta demonstreaza inhibitia acetilcolinesterazei. Acidul citric cu mentol are un efect antiacneic si mentonele cu mentol au un efect antialergic. Alte utilizari ale compusilor din plante sunt in cosmetica si industria alimentara datorita proprietatilor active a componentelor lor si pentru activitatile lor genotoxice. Metoda e precisă si rapida pentru stabilirea componenţilor activi ce caracterizeaza diferite genotipuri de plante. Puritatea solutiilor si solventilopr a fost testata de GC/MS. Mentha piperita L eupiperita var. officinale fam. Rubescens camus , “menta neagra” si Mentha crispa L sin Mentha spicata au fost obtinute de la Institutul Agronomic Cluj-Napoca, uleiul esential obtinut prin distilare umeda a fost obtinut de la HOFIGAL SA Bucuresti. S-a utilizat procedura de extractie LLE si aparatura prezentata mai sus. Extract hidroalcolic: 1 gram planta uscata si zdrobita a fost amestecata cu 20 ml ethanol si 20 ml apa distilata si lasata la macerat la temperatura camerei timp de 2 zile.

10

Pentru experiment am folosit florile si tulpinile , dupa care o cantitate de 0.6 ml din macerat s-a amestecat cu 0.6 ml de apa distilata si 0.2 ml solvent A (acetat de etil :hexane:methylen choricle, 5:1:1 , v/v/v). Noul amestec a fost agitat 2 minute si 4µl a fost injectat in cromatograf. Analiza GC si GC/MS a fost facuta imediat dupa extractia. Componentele au fost identificate cu spectrometrul de masa. Procedura de extractie a amestecului standard a fost : 30 µl amestec standard in 0.9 ml solutie compusa din : etanol (1:1 v/v) , 0.9 ml apa distilata si 0.3 ml solvent. Toate acestea au fost amestecate timp de 2 minute dupa care a fost adaugat 1 µl 3-hepten-2-one la solutia obtinuta iar 1µl a fost injectat folosind un injector cu autosampler. Extractia de amestec standard (n=4) a fost folosita pentru o cat mai mare precizie a procedurii de extractie. Mentha piperita a fost extrasa din frunze pe trei cai: 1 gram de planta uscata a fost pusa in 20 ml ethanol timp de 1 ora la 45 0C si 3 µl au fost injectati in GC si analizat de GC/MS 1 gram de planta uscata a fost pusa in 40 ml solutie (apa, ethanol ) pentru 1 ora la 45 0C si apoi 0.9 ml extract cu 0.9 ml apa distilata si 0.3 ml solvent A au fost amestecate asa cum am descris mai sus. 3 µl au fost analizati de GC/MS 1 gram planta uscata a fost pus in 20 ml solutie clorura de metilen: acetona (1:1, v/v) la 45 0C pentru 1 ora si apoi 3 µl au fost injectate si analizate de GC/MS. Mentha crispa L a fost extrasa din frunze in 40 ml ethanol , apa distilata si s-a tinut 1 ora la 45 0C, apoi a urmat extractia in solvent, cum s-a aratat inainte. Rezultate experimentale Pentru analiza au fost folosite diferite tipuri de menta. Dintre acestea cinci au fost cumparate uscate din piata: P1 de la un magazin privat de ierburi , P2 de la un magazin de stat de ierburi, P3 –menta alba a fost culeasa din padure , P4 -menta neagra a fost culeasa din padure si P5 de la o gradina privata. P6 Mentha piperita L. piperita “menta neagra” si P7 Mentha crispa L. au fost cultivate la Intitutul Agronomic Cluj-Napoca. S-a determinat că ca cei mai importanti componenti din uleiul de trandafir sunt fenetolul si nerolul, in uleiul de busuioc componentul important este estragolul, uleiul de lavanda are componeti importanti linalool, linalil acetat, camfor, eucaliptol, iar componentul cei mai intens in citrice este limonenul.

1. L. Szabó, V. Chiş, A. Pîrnău, N. Leopold, O. Cozar, Sz. Orosz, Spectroscopic and theoretical study of amlodipine besylate, Journal of Molecular Structure, 924-926 (2009) 385-392 2. Adrian Pîrnău, Vasile Chiş, Laszlo Szabo, Onuc Cozar, Mihai Vasilescu, Ovidiu Oniga, Richard A. Varga, Experimental and theoretical investigation of 5-para-nitro-benzylidene-thiazolidine-2-thione-4-one molecule, Journal of Molecular Structure, 294-296 (2009) 361-370 3. N. Leopold, L. Szabó, A. Pîrnău, M. Aluaş, L.F. Leopold, V. Chiş, O. Cozar, Raman spectroscopic and DFT theoretical study of 4-(2-pyridylazo)resorcinol and its complexes with zinc(II) and copper(II) , Journal of Molecular Structure, 919; 94-99; 2009 4. A. Iordache, M. Culea, C. Gherman, O. Cozar, Characterization of Some Plant Extracts by GC-MS, Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section B, (2009) vol .267, 338-342 impact factor 0.999 5. M. Culea, S. Gocan, Flavonoids determination in herbs by GC and GC/MS, Journal of Environmental Protection and Ecology- JEPE ,10(2) 461-468 6. C. Mesaros, M. Culea, A. Iordache, O. Cozar, C. Cosma, GC-MS analysis of flavonoids in Orthosiphon stamineus Benth, Bulletin UASVM, nr. 66 (1-2)/2009, Agriculture, Print ISSN 1843-5246; Electronic ISSN 1843-5386) in press. 7. C. Mesaros, M. Culea, A. Iordache, O. Cozar, GC-MS characterization of the compounds in some essential oils, Bulletin UASVM, nr. 66 (1-2)/2009, Agriculture, Print ISSN 1843-5246; Electronic ISSN 1843-5386) in press. 8. Cornelia Mesaros, Andreea Iordache, Monica Culea, Cora Crăciun, Onuc Cozar, Radu Fechete, Eugen Culea, SEA BUCKTHORN OIL STUDY BY GC/MS AND IR, Studia, 2009, in press. 9. Andreea Maria Iordache, Monica Culea and Onuc Cozar, Characterization of some extracts for therapeutic use by GC/MS, PIM-2009, 26-28 sept,2009, Cluj-Napoca (JPCS) 10. C. Mesaros, M. Culea, A. Iordache, O. Cozar, C. Cosma, GC-MS analysis of flavonoids in Orthosiphon stamineus Benth, The International Symposium “PROSPECTS FOR THE 3rd MILLENNIUM AGRICULTURE, Cluj-Napoca, 7-10 oct 2009 (Bulletin UASVM, nr. 66 (1-2)/2009, Agriculture, Print ISSN 1843-5246; Electronic ISSN 1843-5386) 11. C. Mesaros, M. Culea, A. Iordache, O. Cozar, GC-MS characterization of the compounds in some essential oils, The International Symposium “PROSPECTS FOR THE 3rd MILLENNIUM AGRICULTURE, Cluj-Napoca, 7-10 oct 2009(Bulletin UASVM, nr. 66 (1-2)/2009, Agriculture, Print ISSN 1843-5246; Electronic ISSN 1843-5386) Director de proiect Prof.dr. Onuc Cozar