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www.labelab.it/ravenna2019www.labelab.it/ravenna2019
Contaminanti emergenti nelle
acque: la Watch List europea e i
recenti sviluppi operativi
Busetto, Barreca, Colzani,
Clerici, Dellavedova
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WATCH LIST
La Watch List è una normativa europea che prevede il monitoraggio di
sostanze emergenti, su tutto il territorio europeo, almeno per un
periodo di 4 anni e su un numero ristretto di stazioni significative. Le
sostanze emergenti individuate saranno poi inserite nella lista delle
sostanze prioritarie da monitorare per definire lo stato chimico delle
acque.
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La prima lista è stata emessa nel 2015 e conteneva:
• quattro farmaci (tre antibiotici macrolidi ed un antiinfiammatorio),
• filtro solare (4-metossicinnamato-di 2-etilesile)
• tre estrogeni (sia di sintesi che naturali)
• otto pesticidi/erbicidi (imidacloprid, tiacloprid,
tiametoxam,clotianidin, oxadiazon, triallato e metiocarb)
• antiossidante: BHT (2,6-di-terz-butil-4-metilfenolo)
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La Decisione 840/2018: Conferme e
Cambiamenti
Nel 2018 è stata pubblicata una nuova Watch List che supera la
precedente. Rispetto all’elenco del 2015 sono stati eliminati il BHT ed il
metossicinnammato (che verranno ricercati nei sedimenti), sono stati
introdotti due nuovi antibiotici (amoxicillina, ciprofloxacina) ed un
pesticida, il metaflumizone e sono stati confermati il gruppo dei
neonicotenoidi, il metiocarb e gli estrogeni
Gli ormoni sono stati confermati nella nuova Watch List perché non tutti
gli stati membri sono riusciti a sviluppare metodi in grado di
raggiungere il limite estremamente impegnativo di 0,035 ng/L richiesto
per il 17-α-etinilestradiolo
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La sfida analitica della determinazione degli
ESTROGENI
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La principale difficoltà per la determinazione degli ormoni richiesti dalla
Watch List è quella di raggiungere il limite di 0,035ng/L.
Per riuscire a raggiungere questo limite è stato necessario mettere a
punto un metodo comprensivo di una doppia estrazione.
1L di campione 1° Estrazione
SPE off line
2° Estrazione
SPE on line
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1° Concentrazione
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• Campione acidificato a pH=2 con HCl - stabilizzazione all’arrivo
• 1L di campione caricato su cartuccia SPE stirene/divinilbenzene (tipo WATERS
OASIS HLB 200mg/6mL) precedentemente condizionata con metanolo
• La cartuccia viene lavata con acqua per rimuovere gli interferenti.
• Gli analiti vengono infine eluiti con 10mL di Metanolo
• L’estratto viene ridotto a piccolo volume sotto flusso di azoto e poi ricostituito
con 10 mL di acqua
• 5 mL dell’estratto vengono iniettati nel sistema SPE on-line –UHPLC –MS/MS
(ABISciex 6500)
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2° ConcentrazioneOn-line SPE
• Colonna di concentrazione: Strata C18-E 20 µm, 20x2 mm
• Volume di iniezione: 5mL
• Eluente per la fase di carico: Acqua
• Flusso per la fase di carico: 1,6ml/min
• Eluenti per la fase di lavaggio: Acetone : Isopropanolo: Acetonitrile (1:1:1)
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Cromatogramma Livello 1 della Retta
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Parametri di qualità valutati al livello del LOQ
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AnalitaLOQ
(ng L−1)
Linearità
(ng L−1)R2
Recupero
%
Ripetibilità
CV %
17-α-Etinilestradiolo 0.035 0.035 – 1.12 0.999 96.7 10.5
17-β-Estradiolo 0.1 0.07 - 2.24 0.999 99.9 17.20
Estrone 0.1 0.07 – 2.24 0.999 105.9 17.43
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Novità Amoxicillina, Metaflumizone,
Ciprofloxacina
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Novità Amoxicillina
L'amoxicillina è un antibiotico ad ampio spettro largamente usato
per il trattamento di malattie sia umane che animali e appartiene al
gruppo delle penicillinne (antibiotici β-lattamici) che viene escreto
immodificato nelle urine e nelle feci.
In Italia nel 2001 ne sono state vendute 209 tonnellate.
L’Amoxicillina è molto solubile in acqua (solubilità = 3430 mg/L) e la
ricerca bibliografica ha evidenziato alcune criticità per la sua
determinazione mediante SPE OFF Line
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SPE Recupero
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Cent. Eur. J. Chem. • 11(8) • 2013 • 1343-1351
B. Kasprzyk-Hordern et al.
J. Chromatogr. A 1161 (2007)
132–145
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AMOXICILLINA
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Doppio picco
dell’Amoxicillina in
acqua e solvente
Picco
Amoxicillina in
acqua e solvente
e acido
Aggiungendo una
minima quanità di acidoPicco Amoxicillina in
acqua
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Ciprofloxacina
Ciprofloxacina è un antibiotico sintetico del gruppo dei
fluorochinoloni ed uno degli antibiotici più largamente utilizzati al
mondo.
Nel 2016, in Italia, solo per uso veterinario ne sono state vendute
9,592 tonnellate.
E’ molto solubile in acqua (solubilità = 30 mg/L), ma poco stabile a
pH acidi. (Braschi, et al., 2013; Moarefian et al., 2014)
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STABILITA’
Sebbene diversi studi abbiano riportato la presenza di amoxicillina e ciprofloxacina nelle
acque di scarico ed in quelle superficiali le loro emivite in acqua superficiale sono
relativamente brevi a causa della rapida bio-e-fotodegradazione.
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AMOXICILLINA
Country Source of monitoring data Values (µg/L) Reference
SpainHospital wastewater, and urban WWTP effluent
in Girona 0.218-0.258
Gros et al., 2013
France Seine River 0.068 Dinh et al., 2011
Italy River Po <0.002 Zuccato et al., 2010
Italy River Arno0.006 (mean);
0.010 (max)
Zuccato et al., 2010
Italy WWTP effluents 0.015 – 0.120 Castiglioni et al., 2005
Italy Different WWTP effluents 0.0018 – 0.120 Andreozzi et al., 2004
CIPROFLOXACINA
Spain Ter River downstream WWTP in Girona 0.072 (max) Rodriguez-Mozaz et al., 2015
FranceSeine River;
Charmoise River, downstream WWTP
0.017;
0.135
Dinh et al., 2011
Italy Surface water, River Po 0.009 (mean)Zuccato et al., 2010
Italy Surface water, River Arno 0.019 (mean) Zuccato et al., 2010
France, Greece, Italy, Sweden WWTP effluents 0.060 (median) Andreozzi et al., 2003
Italy Po and Lambro River 0.020 (median); 0.026 (max) Calamari et al., 2003
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Novità, Metaflumizone,
Il Metaflumizone è un insetticida ad ampio spettro, utilizzato nella
difesa delle colture orticole.
Vendita media nazionale (2009-2012) = 4,5 tonnellate/anno
Ha una bassa solubilità in acqua (0.0018 mg/L)
Nelle prove iniziale risultava critica la stabilità del metaflumizone.
Questo perché l’analita precipitava in soluzione acquosa anche
dopo poche ore. Il problema è stato risolto preparando gli standard
delle rette, i quality control ed i campioni aggiungendo una
percentuale di solvente (metanolo) pari al 20%.
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«Whole water analysis»
Durante l’ultimo Workshop tenutosi ad ISPRA ad ottobre 2018, si è
molto discusso sulla opportunità dell’iniezione diretta per la
determinazione di queste sostanze, alla luce del fatto che alcune di loro
potrebbero tendere a rimanere adese al particolato e l’iniezione diretta
è una tecnica che richiede la filtrazione del campione, onde evitare
problemi strumentali.
Sono state quindi condotte delle prove mediante ESTRAZIONE SU
SPE OFF LINE e successiva analisi del campione mediante LC-MS/MS
La natura molto differente delle sostanze in discussione rende però
difficile l’utilizzo di un unico metodo di estrazione, soprattutto a causa di
quelle sostanze che potrebbero tendere a rimanere adese al
particolato, su cui si evidenziano grossi problemi di recupero (cit)
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SPE OFF LINE
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0
20
40
60
80
100
120
140
Analiti a Confronto
Data la natura molto differente delle sostanze, l’utilizzo di un unico metodo
di estrazione risulta critico, soprattutto per Metiocarb ed Amoxicillina, per i
quali si evidenziano bassi recuperi
Sono state testate differenti fasi SPE (polimeriche/C18) con differenti
quantitativi di riempimento (150mg/6mL; 200mg/6mL; 500mg/6mL)
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EMPORE DISK
Viste le difficoltà di mettere a punto un unico metodo di estrazione dato
il differente comportamento delle sostanze in studio si è deciso di
provare ad utilizzare gli empore disk non come sistema per effettuare
un estrazione in fase solida, ma come filtro su cui fermare il particolato
che verrà successivamente eluito con solvente in modo da estrarre
l’eventuale sostanza organica adesa al particolato.
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METODO DI ANALISI DEL CAMPIONE INTERO
100 mL di campione +
standard marcati
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Filtrazione su
EMPORE DISK
Eluizione del
particolato con 20mL
di Metanolo
Recupero del
campione intero
Analisi in LC
MS/MS
Condizionamento del
EMPORE DISK con 10
mL di Metanolo
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METODO DI ANALISI DEL CAMPIONE INTERO
100 mL di campione +
standard marcati
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Filtrazione su
EMPORE DISK
Eluizione del
particolato con 20mL
di Metanolo
Recupero del
campione intero
Analisi in LC
MS/MS
Condizionamento del
EMPORE DISK con 10
mL di Metanolo
Per la determinazione è
necessario acidificare il campione
dell’AMOXICILLINA IL CAMPIONE
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RIVELATORE
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Tutte analisi sono state condotte con il sistema 6500 Plus della Sciex,
che è sistema ibrido: triplo quadrupolo/trappola lineare
Gli analiti sono stati identificati:
• per confronto dei loro tempi di ritenzione
con quelli degli standard interni,
• attraverso le transizioni ione precursore /
ione prodotto.
La quantificazione è stata eseguita mediante
calibrazione con il metodo dello standard
interno.
E’ indispensabile l’utilizzo di standard interni
marcati, fondamentali per correggere l’effetto
matrice.
L’utilizzo del triplo quadrupolo ci permette, perciò, di raggiungere i LOQ (ng/L)
richiesti dalla Watch List.
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MRM Multi-Reaction-Monitoring:
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In questo caso il quadrupolo Q1 è fisso sullo ione molecolare ed il quadrupolo Q3
sullo ione frammento.
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Parametri di qualità valutati al LOQ
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AnalitaLOQ
(ng L−1)
Linearità
(ng L−1)R2
Recupero
%
Ripetibilità
CV %
Azitromicina 19 10 - 500 0,999 116,5 4,9
Claritromicina 19 10 - 500 0,999 100,1 4,0
Eritromicina 19 10 - 500 0,999 95,0 27,0
Metiocarb 2 2 - 500 0,999 126,2 7,6
Imidacloprid 9 5 - 500 0,999 85,7 4,4
Clotianidin 9 5 - 500 0,999 100,4 7,1
Tiametoxam 9 5 - 500 0,999 72,5 14,7
Tiacloprid 9 5 - 500 0,999 72,6 4,2
Acetamiprid 9 5 - 500 0,999 74,8 16,8
Metaflumizone 65 50 - 500 0,999 114,9 2,7
Ciprofloxacina 78 50 - 500 0,999 105,3 8,3
Amoxicillina 89 50 - 500 0,999 84,1 8,6
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CONCLUSIONI
Unico metodo di estrazione (esclusi gli ormoni).
Due metodi di analisi a causa delle differenti condizioni richieste per
l’amoxicillina rispetto agli altri analiti
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