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i
CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA -CONCYT-
SECRETARIA NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA -SENACYT-
FONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA -FONACYT-
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACIA
UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA-USAC-
INFORME FINAL
EVALUACIÓN DE DAÑO PRIMARIO AL ADN, POR ENSAYO COMETA EN
CÉLULAS SANGUÍNEAS DE RATAS EXPUESTAS A PIRETROIDES CON
DIESEL COMO DISOLVENTE, QUE SE UTILIZAN PARA CONTROL DE
VECTORES EN GUATEMALA.
PROYECTO FODECYT No. 21-2010
AMARILLIS SARAVIA GÓMEZ Ph.D.
Investigador Principal
GUATEMALA, ABRIL DE 2014
ii
AGRADECIMIENTOS:
La realización de este trabajo, ha sido posible gracias al apoyo financiero dentro del Fondo
Nacional de Ciencia y Tecnología, -FONACYT-, otorgado por la Secretaría Nacional de
Ciencia y Tecnología -SENACYT- y al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología -
CONCYT-
iii
OTROS AGRADECIMIENTOS:
Adicionalmente se agradece a la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia de la
Universidad de San Carlos de Guatemala.
Biografía académica de los autores:
Amarillis Saravia Gómez Ph.D.
Química Farmacéutica, Doctorado en Farmacia con énfasis en Farmacología de la
Universidad de Clermont-Ferrad, Francia, Internado de Farmacia Hospitalaria en Hospital
de Vichy. Francia. Catedrática y Jefa de departamento de Farmacología y Fisiología y
Directora del Bioterio desde 1980 a la fecha, cuenta con más de 60 publicaciones nacionales
e internacionales, es miembro activa en más de 20 instancias académicas y científicas
nacionales e internacionales, asesora y revisora de más de 60 tesis ad gradum, expositora en
diversos foros, congresos y ponencias internacionales. Medalla de investigadora
internacional Toledo España.
Lic. Rodrigo Vargas
Químico Farmacéutico graduado de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia de la
Universidad de San Carlos de Guatemala, con estudios de maestría en Biotecnología,
especialización en Nanotecnología en el 2009 y Biología Molecular y Genética en el 2013,
así como capacitaciones en procedimientos experimentales en ratas y ratones, por la
asociación chilena de animales de laboratorio en 2012, cuenta con más de ocho
investigaciones realizadas con fondos concursables, participando como investigador
principal y asociado, recibiendo en 2010 el reconocimiento a la investigación relevante
como investigador principal por la Dirección General de Investigación, USAC. Catedrático
en la Facultad de Ciencias de la Salud de la Universidad Mariano Gálvez, cuenta con dos
publicaciones internacionales y varias nacionales.
Licda. Dulce Saldaña
Química Farmacéutica graduada de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia de la
Universidad de San Carlos de Guatemala en 2007, Tiene una especialización en
Toxicología Experimental y Manejo de Animales de Laboratorio en la Universidad de la
Habana, 2009. Investigadora del Centro de Información y Asesoría Toxicológica (CIAT) en
2007, y del Herbario de la Universidad de San Carlos de Guatemala (USCG-CECON) en
2007, Becaria de la Facultad Latinoamericana de Ciencias Sociales (FLACSO) en 2008.
Catedrática Titular en la Facultad de Ciencias Médicas y de la Salud de la Universidad
Mariano Gálvez desde 2010. Ha participado como investigadora principal y asociada en
proyectos de cofinanciamiento. Cuenta con publicaciones nacionales e internacionales, entre
las que destaca “Plantas Tóxicas de Guatemala” publicada por el Instituto Nacional de
Biodiversidad de Costa Rica (INBio) 2010.
El equipo de investigación agradece muy especialmente la participación y apoyo
incondicional del Br. Cristian López, quien funge como técnico de bioterio y auxiliar de
investigación en el Bioterio de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia, USAC.
También agradece al M.Sc. Gerardo Arroyo Del Departamento de Citohistología de la
escuela de Química Biológica. Y al Departamento de Patología de la Facultad de
Veterinaria y Zootecnia, por su apoyo durante la fase experimental del presente trabajo de
investigación.
iv
Equipo de investigadores del proyecto FD 21-2010
De derecha a izquierda:
Licda. Dulce Saldaña, Lic. Rodrigo Vargas, Ph.D. Amarillis Saravia y Br. Cristian López.
Bioterio Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia
v
CONTENIDO
Índice RESUMEN _________________________________________________________ 1
ABSTRACT ________________________________________________________ 2
PARTE I _____________________________________________________________ 3
I.1. INTRODUCCIÓN _______________________________________________ 3
I.2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA _________________________________ 4
I.2.1. Antecedentes en Guatemala_____________________________________ 5
I.2.2. Justificación del trabajo de investigación __________________________ 7
I.3. OBJETIVOS E HIPÓTESIS _________________________________________ 8
I.3.1. Objetivos ____________________________________________________ 8
I.3.1.1.Objetivo General ______________________________________________ 8
I.3.1.2. Objetivos Específicos ___________________________________________ 8
I.3.2. Hipótesis ____________________________________________________ 8
I.4. METODOLOGÍA: ________ _______________________________________9
I.4.1. Localización (coordenadas geográficas) _________________________________ 9
I.4.2.Variables _____________________________________________________ 9
I.4.2.1.Variables dependientes _________________________________________ 9
I.4.2.2.Variables independientes_____________________________________ 9
I.4.3. Indicadores __________________________________________________ 9
I.4.4.Estrategia metodológica _________________________________________ 9
I.4.4.1. Población y muestra ________________________________________ 9
I.4.5.Método ______________________________________________________ 9
I.4.6. Tratamiento estadístico ________________________________________ 11
PARTE II ____________________________________________________________ 12 II.1. MARCO TEÓRICO _____________________________________________ 12
PARTE III ___________________________________________________________ 29 III.1. RESULTADOS ________________________________________________ 29
III.2. DISCUSIÓN DE RESULTADOS ____________________________________ 39
PARTE IV ___________________________________________________________ 49 IV.1. CONCLUSIONES ______________________________________________ 49
IV.2. RECOMENDACIONES ___________________________________________ 50
IV.3. BIBLIOGRAFÍA _____________________________________________ 51
PARTE V ____________________________________________________________ 53 V.1. INFORME FINANCIERO ___________________________________ 53
vi
Índice de Gráficas
Gráfica No. 1 Comportamiento del peso según sexo durante el ensayo 403__________ 29
Gráfica No. 2 Comportamiento del peso según sexo durante el ensayo 412__________ 31
Gráfica No. 3Ensayo cometa rata expuesta a deltametrina, aceite mineral___________ 34
Gráfica No. 4 Ensayo cometa grupo control _________________________________ 35
Gráfica No. 5 Ensayo cometa grupo mediano expuesto a deltametrina, diesel_________ 36
Gráfica No. 6 Ensayo cometa grupo bajo expuesto a deltametrina, diesel____________ 37
Gráfica No. 7 Ensayo cometa grupo alto expuesto a deltametrina, diesel____________ 38
Índice de Tablas
Tabla No. 1 Distribución de grupos experimentales___________________________ 29
Tabla No. 2 Efectos predominantes de la toxicidad inhalatoria No. 403_____________ 30
Tabla No. 3 Efectos predominantes histológicos del ensayo No. 403______________ 31
Tabla No. 4 Efectos predominantes de la toxicidad inhalatoria No. 412_____________ 32
Tabla No. 5 Efectos predominantes histológicos del ensayo No. 412______________ 33
Índice de Fotografías
Fotografia No. 1 Efectos visibles de exposición en ensayo 403___________________30
Fotografía No. 2 Equipo de exposición inhalatoria, CH Technologies Inc.___________ 41
Fotografia No. 3 Electroforesis en gel de células individuales ___________________ 45
Fotografia No. 4 Extracción de sangre periférica_____________________________ 46
Fotografia No. 5 Microscopio de campo oscuro del Depto. de Citohistología_______ 48
vii
Índice de Imágenes
Imagen No. 1Daño al ADN_____________________________________________ 24
1
RESUMEN
El objetivo primario de este trabajo fue evaluar el daño genotóxico en células sanguíneas de
ratas expuestas al piretroide deltametrina, utilizado ampliamente en el territorio nacional, tanto
dentro como fuera de las viviendas en el control de vectores, a fin de obtener información
sobre el riesgo en la utilización de este piretroide empleado en conjunto con diesel como
disolvente.
Para evaluar el daño primario al ADN se utilizó la técnica de electroforesis para células
individuales, conocida como ensayo cometa. Este es un ensayo genotóxico utilizado para
evaluar células expuestas a diversos contaminantes ambientales, su fundamento se basa en el
potencial del agente químico de unirse a macromoléculas como el ADN y provocar
modificaciones en la información genética, esta prueba específica mide las roturas de las
cadenas del ADN por unidades arbitrarias en cada célula.
La investigación se desarrolló realizando el test de toxicidad inhalatoria aguda de la
Organization for Economic Cooperation and Development OECD, guía 39 y 403, el cual
permite reducir el número de animales de experimentación y obtener datos sobre letalidad del
piretroide y el diesel como disolvente del mismo, obteniendo que los machos son más sensibles
al compuesto químico y por lo tanto se descartó la utilización de hembras en las siguientes fases
del estudio.
También se realizó el test de la Guía 412 de la OECD para toxicidad inhalatoria sub aguda a
dosis repetidas por 28 días, para esto se realizaron cuatro grupos; tres grupos, cada uno con una
diferente concentración utilizando deltametrina con diesel como disolvente y un grupo de
deltametrina con aceite mineral como disolvente, como comparación. A estos grupos se les
realizó el ensayo cometa obteniendo resultados significativos de daño primario al ADN en las
tres concentraciones, y sin daño para el grupo en el que se utilizó aceite mineral como
disolvente. Adicionalmente los animales fueron sacrificados y evaluados histológicamente en la
unidad de patología de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, donde se encontró
daño en hígado, riñón y pulmón de todos los animales expuestos a diesel como disolvente,
comparado con los animales expuestos a deltametrina con aceite mineral como disolvente, que
presentaron daño menor, y los animales control que no presentaron daño aparente.
2
Summary
The primary objective of this study was to evaluate the genotoxic damage in single cells of
rats exposed to deltamethrin, used inside and outside homes in vector control, in order to obtain
information on the damage caused by using this pyrethroid diesel is used together with solvent.
The primary damage to DNA was evaluated used electrophoresis technique was used for
individual cells, known as comet assay. This is a test used to assess genotoxic cells exposed to
environmental pollutants, its foundation is based on the potential of the chemical to bind to
macromolecules such as DNA and cause changes in the genetic information specific test
measures the strand breaks of DNA in each cell arbitrary units.
The research evaluated the acute inhalation toxicity test of the organization for economic
cooperation and development OECD, guide 39 and 403, which reduces the number of
experimental animals and obtain data on lethality of pyrethroid and diesel as a solvent of the
same, obtaining that males are more sensitive to the chemical and therefore discarded females
using the following phases of the study.
We used test OECD 412 Guide for acute inhalation toxicity repeated dose for 28 days, for
this there were four groups, three groups, each with a different concentration using deltamethrin
with diesel as a solvent and a group of deltamethrin mineral oil as solvent comparison. These
groups underwent significant comet assay results obtained primary DNA damage in the three
concentrations and without damage to the group in which mineral oil was used as solvent.
Additionally, the animals were sacrificed and evaluated its organs pathology unit of the Faculty
of Veterinary Medicine, where damage was found in liver, kidney and lung of all animals
exposed to diesel as a solvent, compared to animals exposed to deltamethrin with mineral oil as
a solvent, which had minor damage, and control animals showed no damage.
3
PARTE I
I.1. INTRODUCCIÓN
Guatemala es un país endémico en vectores de malaria, dengue, entre otros, por lo cual el
uso de plaguicidas que controlen a estos vectores es común, así como necesario, y son
utilizados en todos los departamentos del país exceptuando a Totonicapán.
Desde hace muchos años en Guatemala como en otros países de la región se utilizan piretroides
para estos fines, como es el caso de la deltametrina, que se combina con diesel como disolvente,
aunque de acuerdo a los fabricantes este piretroide puede mezclarse otros disolventes oleosos
como el aceite mineral, e incluso el agua, pero en concentraciones que no se consideran
efectivas para el combate de los vectores en las condiciones nacionales. (Ficha técnica).
Estos plaguicidas han sido sujetos de desconfianza por algunos sectores de la población, y
en un estudio epidemiológico anterior se evidencia un factor de riesgo estadístico en el
desarrollo de la Leucemia Linfoblástica Aguda, si se está expuesto a estos plaguicidas, sin
embargo estos datos deben ser confirmados experimentalmente (Vargas, 2009).
El presente estudio fue un estudio experimental donde se evaluó el riesgo a exposición de
deltametrina en animales de laboratorio, permitiendo evaluar la existencia de daño primario al
ADN en células sanguíneas de las ratas; se llevaron a cabo dos ensayos toxicológicos en donde
se comparó el uso de diesel y el aceite mineral como disolventes.
Aunque el diesel es considerado por la IARC un compuesto cancerígeno, este es
considerado de esta manera en combustión, no en usos como disolvente por lo que no es posible
inferir la extrema toxicidad de este disolvente, sin embargo el fabricante no recomienda el uso
del mismo, por lo que sugiere utilizar aceite mineral.
En Guatemala, el uso de diesel como disolvente representa una mala práctica en el uso de
deltametrina, sin embargo con este estudio tuvo como objetivo determinar el riesgo al estar
expuestos a dicha mezcla.
Para este fin, se seleccionó como método de exposición la de cuerpo completo del animal,
siendo necesaria la utilización de una cámara de biocontención, con capacidad para grupos de 5
animales, donde a través de un colisionador fue administrado el plaguicida con disolvente en
forma de aerosol, administrándose de manera constante por 4 y 6 horas, durante 14 y 28 días
respectivamente; con un flujo continuo de 6 litros de aire por minuto.
El ensayo cometa consistió en extraer sangre periférica de la cola de cada animal, realizando a
cada uno por triplicado el ensayo utilizando electroforesis en gel, observándose en microscopía
de fluorescencia con bromuro de etidio, analizando de forma individual. Las células
encontradas mostraron daño, siendo proporcional según la concentración utilizada, el grupo que
fue expuesto al plaguicida con aceite mineral como disolvente no mostro daño primario al ADN
en las células individuales.
4
I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
En Guatemala el combate a los vectores de dengue y malaria es constante a través de
compuestos químicos piretroides que se aplican dentro y fuera de las viviendas donde se
reportan mayor incidencia de casos de este tipo.
El control de estos vectores ha sido satisfactorio en Guatemala donde aunque los casos son
endémicos existe una fumigación constante a manera de prevención de estas enfermedades.
La aplicación dentro y fuera de las viviendas de estos plaguicidas se realiza disolviendo el
piretroide en diesel, la concentración de estos varía en función del lugar, sin embargo la
etiqueta señala que la concentración debe ser 1 parte de deltametrina por 65 partes de
disolvente.
Sin embargo estas aplicaciones de plaguicidas han conllevado a dudas por parte de la
población, puesto que no existen estudios en Guatemala que confirmen la inocuidad de estos
compuestos químicos que se aplican recurrentemente.
En Guatemala un estudio realizado en Quetzaltenango reporto que hay un riesgo 11.5 veces
mayor de desarrollar LLA, al estar expuesto a plaguicidas cerca del hogar, en este estudio se
reporta que el 50% de las fumigaciones cercanas al hogar provenían de piretroides utilizados en
el control de vectores con diesel como disolvente (Vargas, 2009).
El ensayo cometa es un ensayo genotóxico que permite evaluar in vivo el daño primario al
ADN, por exposición a contaminantes en el ambiente. Este ensayo se utilizó en ratas Wistar,
previamente expuestas a piretroides con disolvente diesel y aceite mineral, bajo un estudio de
toxicidad inhalatoria de cuerpo completo del animal.
5
I.2.1. ANTECEDENTES
La existencia de estudios toxicológicos de plaguicidas en Guatemala es nula, sin embargo
existen investigaciones que evidencian el uso inadecuado de plaguicidas en el país, y valores de
colinesterasa en personas que utilizan plaguicidas como medida de seguridad laboral
(PLAGSALUD).
En un estudio donde se realizaron determinaciones en muestras de orina, este como una
propuesta de un método no invasivo para medir la exposición a formulaciones con deltametrina,
particularmente aquellas que contienen xileno y mesitileno como solventes. Obteniendo
resultados no tóxicos obtenidos a través de la orina y al test de mutagenicidad (Moretti, 1997)
En otro estudio indica que la deltametrina, en la presencia de la activación metabólica
(+S9), es capaz de inducir daño al ADN (rotura simple y doble de las cadenas, sitios lábiles
alcalinos y sitios de reparación por escisión abiertos) como se observó por el incremento de los
valores del momento de cola observados con un incremento de las dosis (Villarini, 1998).
Se realizó un estudio experimental en el cual se estableció que la asociación entre
deltametrina y los efectos en la infertilidad se observaron en los ratones Swiss, observaron una
pérdida de la post-implantación a dosis medias y altas de deltametrina. Al igual observaron un
ligero incremento en la tasa de mutaciones letales dominantes esto asociado al aumento de
dosis de deltametrina en semanas tempranas, pero que disminuía en semanas tardías, por lo que
aparentemente no se observó una dosis respuesta (Shukla, 2000).
Un estudio experimental observó que los grupos tratados con deltametrina decreció
significativamente comparada con el grupo control; llegando a la conclusión que la exposición
a altas dosis de deltametrina en ratas hembras en estado de lactancia puede disminuir la
actividad de NOS en el cerebro y retardar el desarrollo neuronal y comportamiento de las crías
(Li, 2006).
Incluso se adjudica que los diferentes piretroides afectan de diversas formas, en el estudio
se demostró que la liberación y captación de DA son afectadas diferencialmente por el tipo I y
el tipo II de piretroides indicando que el circuito dopaminérgico, la DA estriatal en particular,
puede ser por un piretroide objetivo y que los piretroides pueden estar actuando en la DA
estriatal por múltiples mecanismos (Hossain, 2006).
Además de los efectos que se describen también se adjudican alteraciones en el sistema
endocrino, la cual puede originarse por una exposición simultánea a diferentes insecticidas
ocasionando componentes disruptores que contribuyen al deterioro observado en la salud
reproductiva masculina (Kilian, 2007)
Por medio del ensayo cometa se observó que la exposición del etilmetanosulfonato y
acrilamida inducen un incremento significativo en el daño al ADN, esto se observó en múltiples
tejidos de ratas y ratones. Este estudio en base a sus resultados indica que el ensayo cometa
provee mayores resultados compresivos de compuestos potencialmente genotóxicos (Recio,
2009).
6
Por otro lado un estudio realizado con anterioridad establece un riesgo estadístico de
OR=11.5 a desarrollar Leucemia Linfocítica Aguda por exposición a plaguicidas dentro y fuera
del hogar. Siendo los principales plaguicidas a los que se refiere el estudio, el piretroide
utilizado por control de vectores en Guatemala (Vargas, 2009).
En relación a la neurotoxicidad, un estudio publicó que la elevada exposición de un cerebro
inmaduro a los piretroides puede proveer una consecuencia de toxicidad a largo plazo, como
también una a corto plazo (Kim, 2010).
7
I.2.2. JUSTIFICACIÓN DEL TRABAJO DE INVESTIGACIÓN
La exposición de contaminantes ambientales y sus consecuencias en salud pública, es una
de las preguntas que deben responderse siguiendo un criterio científico.
En Guatemala, un país donde se utilizan plaguicidas para el control de vectores de manera
constante, es importante utilizar estos de la manera más adecuada, uno de los plaguicidas
utilizados es el piretroide deltametrina para el control del dengue, siendo ampliamente utilizado
en los 22 departamentos del país. Este piretroide debe utilizarse con un vehículo idealmente un
solvente oleoso, sin embargo observaciones de campo refieren que este plaguicida es
combinado con diesel como disolvente, lo que genera una pregunta de investigación respecto a
su toxicidad inhalatoria en conjunto, debido a que existe evidencia científica que refiere un
riesgo toxicológico de este plaguicida, al aplicarse inadecuadamente en combinación con agua,
aceite mineral y otros solventes oleosos; sin embargo, en asociación con otras sustancias como
el diesel que actualmente es catalogado por la IARC como cancerígeno, no existen estudios
que determinen si existe o no un riesgo en su uso.
Por lo anterior se realizó el ensayo cometa el cual es una técnica para evaluar el daño
primario al ADN por exposición a diversos contaminantes ambientales. El ensayo cometa es un
método útil y práctico para evaluar aspectos genotóxicos, como la rotura en las cadenas de
ADN derivadas por exposición a uno o varios contaminantes ambientales.
El presente estudio de genotoxicidad, es la continuidad a los estudios epidemiológicos
anteriores que señalan la posible implicación de estos activos en patologías como la LLA,
siendo el principal cáncer que afecta a niños entre 0 y 14 años en Guatemala.
La importancia de la realización de estudios experimentales que concluyan la existencia de
daño primario al ADN, es la posibilidad de prevenir posibles patologías que se presenten en
guatemaltecos expuestos, y así contribuir a la salud preventiva, por medio del rigor científico, a
través de recomendaciones a los aplicadores de estos plaguicidas, basados en datos de este
estudio.
8
I.3. OBJETIVOS E HIPÓTESIS
I.3.1. Objetivos
I.3.1.1. Objetivo General
Determinar y evaluar el daño primario al ADN, por ensayo cometa en células sanguíneas
de ratas expuestas a piretroides con diesel como disolvente, que se utilizan para control de
vectores en Guatemala.
I.3.1.2. Objetivos Específicos
Determinar y evaluar el daño primario al ADN, por ensayo cometa en células sanguíneas
de ratas expuestas a piretroides con diesel como disolvente, que se utilizan para control de
vectores en Guatemalay comparar el daño primario ocasionado con otros disolventes de
elección.
Determinar y evaluar la dosis letal 50 DL50, en ratas expuestas a piretroides con
disolvente diesel y agua.
Exponer y evaluar ratas a piretroides con disolvente diesel y agua por medio del ensayo
de toxicidad inhalatoria a dosis repetida OECD No.412.
Determinar y evaluar el daño al ADN en células sanguíneas por medio del ensayo cometa
en ratas expuestas a piretroides.
Comparar resultados obtenidos entre los grupos y determinar el grado de daño primario al
ADN por exposición a estos piretroides en dependencia al tipo y concentraciones de los
disolventes utilizados.
I.3.2. Hipótesis
La exposición inhalatoria a dosis repetidas de piretroides utilizados en Guatemala, con
diesel como disolvente ocasiona un daño genético en células sanguíneas en ratas.
9
I.4. METODOLOGÍA
I.4.1. Localización:
El presente estudio fue llevado a cabo en la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia,
en la Universidad de San Carlos de Guatemala, en las instalaciones del Bioterio del
Departamento de Farmacología de la Escuela de Química Farmacéutica. En dichas
instalaciones se llevó a cabo la fase experimental de la toxicidad inhalatoria hasta la toma de
muestra sanguínea de los animales.
El análisis celular del ensayo cometa fue llevado a cabo en el Área de Microscopía del
Departamento de Citohistología de Escuela de Química Biológica, situado en el segundo nivel
del Edificio T-11, Ciudad Universitaria.
El análisis histopatológico de los sujetos expuestos fue llevado a cabo en el Departamento
de Patología de la Facultad de Veterinaria y Zootecnia. Primer nivel, Edificio M-5, Ciudad
Universitaria.
I.4.2. Variables:
I.4.2.1. Variables dependientes: Daño primario al ADN
I.4.2.2. Variables independientes:
Exposición a piretroides
I.4.3. Indicadores:
I.4.3.1. Concentración del piretroide en la cámara de exposición
I.4.3.2. Informes histopatológicos
I.4.3.3. Signos presentes en los animales de experimentación
I.4.3.4. Medición del daño al ADN por el largo de la cola del cometa (ensayo cometa)
I.4.4. Estrategia metodológica:
I.4.4.1. Población y muestra: Ratas Wistar, hembras y machos escogidos aleatoriamente.
I.4.5. Método:
I.4.5.1. Toxicidad Inhalatoria Aguda, Protocolo No. 403(OECD, 2009)
Animales de Experimentación: Ratas Wistar.
Selección de especie: Al comienzo del estudio la variación de pesos entre los animales no
excedió del ± 20 % de la media.
Número y sexo: 10 animales (5 hembras y 5 machos) para cada grupo de prueba. Las hembras
fueron nulíparas y no-preñadas. Se retiró un animal del estudio por afecciones severas.
Acondicionamiento y alimentación (antes y después de la exposición): la temperatura de
la habitación en la que se encontraron los animales fue de 22º C (±3º C) y la humedad relativa
10
fue del 50 al 60%. La luz es artificial la secuencia de 12 horas luz, 12 horas oscuridad. Para la
alimentación, la dieta convencional se utilizó con agua y comida ilimitada. Los animales se
encontraban en grupos por sexo; no interfiriendo con la observación clara de cada animal.
Equipamiento: los animales fueron sometidos en un equipo de inhalación diseñado con
flujo dinámico de aire de 12 a 15 cambios por hora y se aseguró el contenido de oxígeno
adecuado y una exposición distribuida adecuadamente en la atmósfera. La cámara mantuvo una
ligera presión negativa interna que previno que la sustancia se libere en el área circundante. Se
utilizó un sistema de inhalación dinámico con un control analítico de concentración.
Procedimiento: ambos grupos fueron expuestos a la sustancia prueba a una concentración
de 1:1 durante 14 días por 4 horas diarias. Se observaron continuamente los efectos presentados
por los animales: comportamiento, peso, ingesta de la dieta, efectos (persistencia, disminución
o aumento de los mismos), posteriormente se realizó la necropsia y el análisis histopatológico.
I.4.5.2. Toxicidad Inhalatoria Subaguda: Protocolo No.412 (OECD, 2009)
Animales de Experimentación: Ratas Wistar.
Selección de especie: Al comienzo del estudio la variación de pesos entre los animales no
excedió del ± 20 % de la media.
Número y sexo: 5 animales (machos) para cada grupo de prueba haciendo un total de 20
animales. Se utilizó un grupo satélite de 4 animales (machos) con una alta concentración, no se
observó reversibilidad, y una persistencia de los efectos.
Acondicionamiento y alimentación (antes y después de la exposición): la temperatura de
la habitación en la que se encontraron los animales fue de 22º C (±3º C) y la humedad relativa
fue del 50 al 60%. La luz es artificial la secuencia de 12 horas luz, 12 horas oscuridad. Para la
alimentación, la dieta convencional se utilizó con agua y comida ilimitada. Los animales se
encontraban en grupos por sexo; no interfiriendo con la observación clara de cada animal.
Equipamiento: los animales fueron sometidos en un equipo de inhalación diseñado con
flujo dinámico de aire de 12 a 15 cambios por hora y se aseguró el contenido de oxígeno
adecuado y una exposición distribuida adecuadamente en la atmósfera. La cámara mantuvo una
ligera presión negativa interna que previno que la sustancia se libere en el área circundante. Se
utilizó un sistema de inhalación dinámico con un control analítico de concentración.
Procedimiento: ambos grupos fueron expuestos a la sustancia prueba a una concentración
de 1:65, 3:65, 0.5:65 de deltametrina: diesel y 1:65 de deltametrina: aceite mineral durante 28
días por 6 horas diarias. Se observaron continuamente los efectos presentados por los animales:
comportamiento, peso, ingesta de la dieta, efectos (persistencia, disminución o aumento de los
mismos), posteriormente se realizó la necropsia y el análisis histopatológico.
I.4.5.3. Daño primario al DNA por Ensayo Cometa Mediante la técnica descrita por
Collins, A.R., et al en 1997 (Dhawan, 2006)
Se obtuvo la muestra de sangre. Se preparó el microgel: los linfocitos son colocados en un
portaobjetos con una solución de agarosa 0.5-1%. Se produce una lisis celular con Tritón X-
100, y NaCl 2.5M.
11
El desenrrollamiento del DNA se realiza por incubación alcalina al supercoloide de DNA
con 0.3 M NaOH, 10 mM EDTA y posteriormente se realiza una electroforesis a 0.8V/cm por
30 minutos. Se neutralizaron todas las muestras y se tiñeron con Bromuro de Etidio EtBr.
Observándose en el microscópico y realizando el conteo individual de las células.
Registrándose fotográficamente como constancia de realización del análisis.
I.4.6. Tratamiento estadístico:
Los resultados observados de los ensayos de toxicidad inhalatoria aguda y subaguda
fueron registrados en el programa Epidat versión 4.6
Los resultados obtenidos del ensayo cometa fueron sometidos a un análisis mediante el
software Casp 1.2.2
Se utilizó estadística descriptiva, chi-cuadrado para determinar la asociación entre los
efectos genotóxicos y la concentración del plaguicida.
Se realizaron correlaciones tanto crudas como parciales.
12
PARTE II
II.1. Marco Teórico
Control de enfermedades transmitidas por vectores: uso de plaguicidas en ambientes
domiciliares
Los agentes patógenos transmitidos por vectores o que tienen huéspedes intermediarios se
encuentran entre las principales causas de enfermedad y muerte en muchos países tropicales y
subtropicales. Esas enfermedades, entre las que se incluyen la enfermedad de Chagas, el
dengue, la leishmaniasis, la filariasis linfática y la malaria, son un importante obstáculo al
desarrollo económico y social (WHOPES, 2001).
La lucha contra vectores desempeña un papel fundamental en la prevención y el control
de las principales enfermedades transmitidas por vectores, como la enfermedad de Chagas, el
dengue y la malaria, y a menudo constituye la primera línea de defensa ante las epidemias de
estas enfermedades (WHOPES, 2001).
El control de vectores es un componente importante en los programas de control de
diversas enfermedades ocasionadas por vectores. Esta implementación incluye objetivos,
métodos disponibles de sitios específicos, predicción en viabilidad técnica y operacional,
recursos e infraestructura. Estos deben ser aplicados de acuerdo con los principios integrados
del contexto local, racionalizando el uso de los métodos y de los recursos de control del vector
y acentúa la implicación de las comunidades (WHO, 2006).
Los plaguicidas utilizados para fines de salud pública son inocuos, costo eficaces y
operacionalmente aceptables. Los plaguicidas con los que se cuenta en el mercado de hoy,
deben de seguir una serie de requisitos para ser aceptados y utilizados para el programa de
control de vectores. Éstos requieren la selección adecuada; tanto el uso de ciertos principios
activos como las formulaciones, deben ser las más apropiados para la plaga (en cuanto a
resistencia del vector) y la modalidad de aplicación a las que estén destinados, garantizando la
seguridad de la población (WHOPES, 2002; WHO, 2010).
El control de vectores en Guatemala es importante ya que forma parte de las estrategias
de la salud preventiva. Para este programa se utilizan distintos plaguicidas, siendo el más
importante la deltametrina, un piretroide que se utiliza para el rociamiento de interiores, ya que
es un insecticida de acción residual (Vargas, 2009).
13
Piretroides:
Los piretroides son un grupo de pesticidas artificiales desarrollados para controlar
preponderantemente las poblaciones de insectos plaga. La obtención de piretrinas sintéticas
(denominadas piretroides, es decir, “semejantes a piretrinas”), se remonta a la fabricación de la
Aletrina en 1949. Desde ese entonces su uso se ha ido ampliando en la medida en que los
demás pesticidas eran acusados de alta residualidad, bioacumulación y carcinogénesis
(organoclorados) y por otra parte el alto efecto tóxico en organismos no plaga y en mamíferos
(carbamatos y organofosforados) (INCAP, Hayes, 1995).
Los piretroides, en cambio, no poseen estas desventajas y debido a las bajas cantidades
de producto necesarias para combatir las plagas su costo operativo es más que conveniente.
Debido a las ventajas antes señaladas, los piretroides son actualmente el plan con mayor
ventaja en el combate y control de vectores. Sus cualidades en este último campo, son su alto
poder de volteo y su baja acción en el hombre. Su acción, como casi todos los insecticidas, es a
nivel sistema nervioso, generando una alteración de la transmisión del impulso nervioso
(INCAP, Hayes, 1995).
Al contrario de los organoclorados, los carbamatos y los organofosforados, no existen
muchos casos de resistencia de insectos a piretroides. Sin embargo, como con todos los
insecticidas, recomiendan el uso moderado de los mismos alternando los distintos tipos de
insecticidas y usando las cantidades mínimas necesarias (INCAP, Hayes, 1995).
Los signos y síntomas de la toxicidad de los piretroides están divididos en dos grupos:
tipo I (conducta agresiva, hipersensibilidad por estímulos externos, temblores del cuerpo
completo, postración) que corresponden para piretroides como la aletrina, bioaletrina,
resmetrina, fenotrina. El grupo tipo II (patadas, salivación profusa, temblores fuertes,
coreoatetosis1, convulsiones clónicas) para piretroides como la deltametrina, fenvalerato,
cipermetrina, cihalotrina. Siendo el mismo mecanismo de acción en mamíferos como en
insectos, provocando una disrupción en el voltaje de los canales de sodio; los piretroides se
enlazan a la subunidad alfa de los canales de sodio y enlentecen la activación (apertura), como
también la tasa de inactivación (cierre) de los canales de sodio, dejando un estado
hiperexcitable de forma estable. Los canales de sodio se abren y son potencialmente
hiperpolarizados, y se mantienen abiertos durante más tiempo, permitiendo que más iones sodio
crucen y despolaricen la membrana neuronal (Curtis, 2008).
1Síndrome que se caracteriza por la presencia de movimientos incontrolados e involuntarios en
varias zonas corporales, con carácter de atetosis (posturas retorcidas, proximales y frecuentemente alternantes) y de corea (movimientos involuntarios, breves y finalidad aparente, especialmente de la cara y las extremidades distales). Está provocado por un trastorno de las vías motoras extrapiramidales.
14
Deltametrina
De acuerdo a la ficha técnica la deltametrina corresponde el nombre químico (IUPAC)
de: S-alpha-ciano-3-fenoxibenzil (1R)-cis-3-(2,2-dibromovinil)-2,2-dimetilciclopropanocarboxi
lato. Su fórmula química es C22H19Br2NO3 de masa molecular de 505.2g. N° CAS 52918-
63-5. En caso de incendio se desprende humos (o gases) tóxicos e irritantes. Deltametrina
es un piretroide compuesta de un isómero individual de 8 estereoisómeros preparados
selectivamente por la esterificación de ácido 2,2-dimetil-3-ciclopropanocarboxílico con -
alcohol o -alfa-ciano-3-fenoxibencil o por recristalización selectiva de los ésteres racémicos
obtenidos por esterificación del ácido con el racémico o-alcohol.
Es uno de los insecticidas más populares y ampliamente utilizados en el mundo y se han
convertido en muy popular con los operadores de control de plagas y de los individuos en los
Estados Unidos. Este material es un miembro de una de las clases más seguras de plaguicidas:
los piretroides sintéticos. Este pesticida es altamente tóxico para los organismos acuáticos,
especialmente el pescado, y por lo tanto se debe utilizar con extrema precaución en torno al
agua. Aunque generalmente se considera seguro para usar alrededor de los humanos, todavía es
neurotóxico para los seres humanos. Este es capaz de pasar de la piel de una mujer a través de
su sangre y en la leche materna.
Hay muchos usos para deltametrina, que van desde los usos agrícolas para el control de
plagas en casa. Ha sido fundamental en la prevención de la propagación de enfermedades
transmitidas por los perros de los sitios infestados con garrapatas, roedores y otros animales de
madriguera. Es útil en la eliminación y prevención de una amplia variedad de plagas
domésticas, especialmente arañas, pulgas, garrapatas, hormigas carpinteras, abejas de
carpintero, cucarachas y chinches. Es también uno de los ingredientes principales en tiza
hormiga.
Como se mencionó anteriormente, este pesticida, juega un papel clave en el control de
vectores, y se utiliza en la fabricación de mosquiteros insecticidas de larga duración. Se utiliza
como uno de una batería de insecticidas piretroides en el control de los vectores de la malaria,
en particular Anopheles gambiae, y siendo a la vez el insecticida piretroide más empleado, se
puede utilizar en conjunto con, o como una alternativa a permetrina, cipermetrina y otros
organofosforados basado insecticidas, como el malatión. La resistencia a la deltametrina es
ahora muy extendida y amenaza el éxito de los programas de control de vectores en todo el
mundo. La resistencia se ha caracterizado en varios insectos, entre ellos importantes vectores de
la malaria como el mosquito Anopheles gambiae, así como plagas no conductoras de
enfermedades como los chinches de cama.
15
Un determinante en el uso de la deltametrina, como control de vectores, fue que mostró
un mayor efecto en la disminución de índices de picadura intra y peridomiciliares y en los
índices de reposo en superficies rociadas en comparación con los otros dos insecticidas
(malatión y DDT). El análisis de costos indicó que la aplicación en bajo volumen de
deltametrina y malatión fue 2.56 veces mayor y 0.89 veces menor, respectivamente, que el
costo de la aplicación de DDT en forma adicional. El ahorro en costos, anudado a la eficacia y
utilidad práctica de esta técnica de rociado, la convierten en una alternativa viable para el
control de vectores (Vaca-Marín MA y col., 1991).
En el transcurso del uso de la deltametrina se han estudiado mecanismos de resistencia
ante su uso. Los métodos de resistencia incluyen el engrosamiento de la cutícula del insecto
para limitar la penetración del insecticida, la resistencia metabólica a través de la
sobreexpresión de metabolizar P450 glutatión-S-transferasa mono-y oxigenasas, y la resistencia
desmontables mutaciones del canal de sodio que hacen que la acción de los insecticidas
ineficaces, incluso cuando se administran conjuntamente con butóxido de piperonilo. La
caracterización de las diferentes formas de resistencia de los mosquitos se ha convertido en una
prioridad en los grupos de estudio de la medicina tropical, debido a la alta mortalidad de los que
residen en las zonas endémicas.
La deltametrina posee efectos nocivos a la salud tanto humana como al ecosistema, los
síntomas por exposición de acuerdo con la ficha técnica de seguridad, por inhalación provoca
una sensación de quemazón, tos, vértigo, dolor de cabeza, náuseas. Por contacto en piel,
presenta enrojecimiento, sensación de quemazón, picor. Por contacto en ojos, presenta
enrojecimiento, dolor. Si llegase a ingerirse pueden presentar dolor abdominal, vómitos.
Los efectos de exposición de corta duración: irrita los ojos, la piel y el tracto
respiratorio. Puede causar efectos en sistema nervioso, dando lugar a sensaciones faciales tales
como, picores, quemazón, punzadas.
Mientras que la deltametrina es fácil de usar y en algunos casos muy eficaz, siempre debe
ser tratado con precaución. Se debe aplicar de acuerdo a las instrucciones que vienen con el
insecticida. Cuando no se tiene cuidado, se puede producir intoxicación deltametrina. Debido a
que es una neurotóxica, ataca temporalmente el sistema nervioso de cualquier animal con el que
entra en contacto. Al tener contacto con la piel puede causar hormigueo o enrojecimiento de la
piel local a la aplicación. Si se toma a través de los ojos o la boca, un síntoma común es la
parestesia facial, que puede sentirse como diferentes sensaciones anormales, incluyendo,
entumecimiento parcial, "alfileres y agujas" quema la piel, gatear, etc. No hay informes que
indican que la intoxicación crónica de insecticidas piretroides causa daño neuronal motora o
enfermedad de la motoneurona. Sin embargo, en 2011, un caso fue publicado que demostró
patológicamente probado la muerte de las neuronas motoras en una mujer japonesa después de
la ingestión aguda masiva de pesticidas que contienen piretroides y organoclorados.
Recientemente, en Sudáfrica, se encontraron residuos de deltametrina en la leche materna, así
como el DDT, en un área que utiliza el tratamiento DDT para el control de la malaria, así como
los piretroides en la agricultura a pequeña escala. No existen antídotos y el tratamiento debe ser
sintomático, tal como fue aprobado por un médico. Con el tiempo, deltametrina es
16
metabolizado, con una rápida pérdida de toxicidad, y se hace pasar desde el cuerpo. Un centro
de control de envenenamiento se debe contactar en caso de un envenenamiento accidental.
Los casos de toxicidad han sido observados en el ganado, tras el uso de la preparación
de deltametrina agrícola en aplicación externa en el control de garrapatas. Los síntomas
aparecen 36 horas después de la aplicación, y se incluyen temblores musculares que conducen a
decúbito 12 horas después. Después de 12 horas, se produjo una recuperación espontánea y el
animal podría levantarse de nuevo, a pesar de los temblores musculares persistieron. La
temperatura de su cuerpo era entonces 38.3C.
Experimentación en animales de laboratorio
Como animal de laboratorio se entiende por cualquier animal vertebrado (ej., animales de
laboratorios tradicionales, animales de granja, animales silvestres y acuáticos) utilizado en
investigación científica, enseñanza o pruebas de laboratorio. Cuando es oportuno se hacen
excepciones o énfasis específicos sobre los animales de granja. Generalmente, cuando se utiliza este
término no incluyen específicamente los animales de granja empleados en investigación científica
agrícola o enseñanza superior, los animales silvestres o acuáticos estudiados en sus ámbitos
naturales ni tampoco a los animales invertebrados utilizados en investigación científica
(ILARCLSNRC, 1999).
La experimentación en los animales de laboratorio comienza en el momento en que se
inicia la preparación de un animal para su utilización y termina cuando ya no se va a hacer
ninguna observación ulterior. El uso de animales conducen a despejar incertidumbres y
desarrollar la ciencia, muy encaminada al mejoramiento de la salud humana (Saravia, 2005).
La manipulación de los animales que se utilizan en investigación se rige por normas
éticas las cuales están encaminadas al principio de Las Tres Erres: reemplazo, refinamiento y
reducción. Motivo por el cual, para el científico no es un requerimiento tener una muestra
estadísticamente significativa, sin dejar de lado el respeto al animal con que se trabaja,
reduciendo al mínimo el estrés o dolor causado, administrando un sacrificio menos doloroso
(OECD, 1996).
El uso de animales requiere de la constante observación de parámetros dentro del bioterio,
como puede ser el alojamiento, el espacio destinado para cada animal dentro de las jaulas, la
frecuencia de limpieza y el tipo de material del alojamiento. Deben de ser controladas las
fluctuaciones de luz, aire, ruido que pueden interferir en los resultados de las investigaciones.
Además de cumplir con el control de ingesta de alimentos y agua.
17
Los principios éticos internacionales que guían la investigación biomédica con
animales aplicados:
1. El avance del conocimiento biológico y el desarrollo de mejores medios para la
protección de la salud y el bienestar, tanto del hombre como del animal, requieren
recurrir a experimentación en animales vivos intactos de una gran variedad de especies.
2. Siempre que sean apropiados, deben usarse métodos tales como modelos matemáticos,
simulación en computador y sistemas biológicos in vitro.
3. La experimentación en animales solamente se debe realizar después de estudiar su
importancia para la salud humana o animal y para el avance del conocimiento biológico.
4. Los animales seleccionados para la experimentación deben ser de una especie y calidad
apropiada, y utilizar el mínimo número requerido para obtener resultados
científicamente válidos.
5. Los investigadores y demás personal nunca deben dejar de tratar a los animales como
seres sensibles y deben considerar como un imperativo ético el cuidado y uso apropiado
y el evitar o minimizar el desconfort, la angustia y el dolor.
6. Los investigadores deben presumir que procedimientos que causarían dolor en seres
humanos también causan dolor en otras especies de vertebrados, aún cuando todavía
falta mucho por saber sobre la percepción del dolor en los animales.
7. Todo procedimiento que pueda causar en los animales más que un dolor o una angustia
momentánea o mínima, debe ser realizado con sedación, analgesia o anestesia apropiada
y conforme con la práctica veterinaria aceptada. No se deben realizar procedimientos
quirúrgicos o dolorosos en animales no anestesiados paralizados por agentes químicos.
8. Cuando se requiera apartarse de lo establecido, la decisión no debe ser tomada
solamente por el investigador directamente involucrado, sino que debe ser tomada por
un cuerpo revisor convenientemente constituido. Estas excepciones no deben hacerse
solamente con fines de demostración o de enseñanza.
9. Al final del experimento, o cuando sea apropiado durante el mismo, los animales que
puedan sufrir dolor crónico o severo, angustia, desconfort, o invalidez que no pueda ser
mitigada, deben ser sacrificados sin dolor.
10. Los animales mantenidos con propósitos biomédicos deben tenerse en las mejores
condiciones de vida posibles. Normalmente el cuidado de los animales debería estar
bajo la supervisión de veterinarios con experiencia en la Ciencia de Animales de
Laboratorio. En todo caso se debe disponer de cuidado veterinario cuando sea
requerido.
11. El director del instituto o del departamento donde se usen animales es el responsable de
asegurar que los investigadores y demás personal tengan calificación apropiada o
experiencia para realizar procedimientos en animales. Debe proporcionar oportunidades
adecuadas de entrenamiento en servicio que incluyan la preocupación por un trato
humano y apropiado para con los animales que están bajo su cuidado.
18
Organizaciones Internacionales que rigen el uso con animales de laboratorio
Existen diversas instituciones a nivel internacional que dictan lineamientos a cumplir para
el trabajo con animales de experimentación, entre ellas podemos mencionar:
Se puede encontrar la “Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio,
auspiciada por el National Institutes of Health (NIH), USA, en sus diferentes versiones (la
última edición fue publicada por The National Academy Press, USA, 1996).
La “Directiva 86/609/CEE relativa a la Aproximación de las Disposiciones Legales,
Reglamentarias y Administrativas de los Estados Miembros de la Comunidad Económica
Europea respecto a la Protección de los Animales Utilizados para Experimentación y otros fines
Científicos”
La convención ETS 123 para la protección de animales vertebrados usados para
experimentación y otros propósitos científicos, adoptada por el Consejo de Europa, el cual tiene
fuerza de recomendación.
La UNESCO en París se proclamó en 1978 la “Declaración Universal de los Derechos de
los Animales”, cuyo texto fue revisado en 1989 por la Liga Internacional de los Derechos del
Animal.
Existen Recomendaciones Internacionales relacionadas específicamente con la Seguridad
en Trabajos con Animales como por ejemplo las descriptas en las publicaciones: ILAR/NRC,
USA, “Occupational Health and Safety in the Care and Use of Research Animals”, National
Academy Press, Washington, D.C., 1997 y CDC/NIH, USA, “Biosafety in Microbiological and
Biomedical Laboratories” 4th
Ed., US Government Printing Office, Washington, D.C., 1999.
Existen sobre categorización y educación y entrenamiento mínimo requerido por todas
las personas relacionadas con el cuidado y uso de animales de laboratorio, como por ejemplo
las elaboradas por la Federación Europea de Asociaciones de Ciencia de Animales de
Laboratorio (FELASA).
19
Guías de la OECD
En este proyecto se aplicaron las normas y pautas que regula la OECD a través de las
Guidelines for Testing of Chemical (OECD, 1996) además de respetar los principios éticos para
el uso de animales.
Por sus siglas en inglés Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económico
OCDE, es una organización intergubernamental en la que los representantes de los 30 países
industrializados de América del Norte, Europa y la región de Asia y el Pacífico, así como la
Comisión Europea, se reúnen para coordinar y armonizar las políticas, discutir temas de interés
común, y trabajar juntos para responder a los problemas internacionales. La mayor parte del
trabajo de la OCDE se lleva a cabo en más de 200 comités especializados y grupos de trabajo
compuestos por delegados de los países miembros. Los observadores de varios países con
estatuto especial en la OCDE, y de las organizaciones internacionales interesadas, asistir a
muchos de los talleres y otras reuniones de la OCDE. Comités y grupos de trabajo son
atendidas por la Secretaría de la OCDE, con sede en París, Francia, que se organiza en
Direcciones y divisiones. En Medio Ambiente, División de Salud y Seguridad Pública
documentos libres de cargo de cada diez series diferentes : Pruebas y Evaluación; buenas
prácticas de laboratorio y verificación de su conformidad; Plaguicidas y Biocidas; Gestión de
Riesgos; Armonización de la vigilancia reglamentaria en biotecnología; Seguridad de Nuevos
Alimentos y Piensos; Accidentes Químicos; Contaminantes y Registros de Transferencia;
Documentos de escenarios de emisiones y la seguridad de los nanomateriales fabricados.
Las directrices de la OCDE son revisados periódicamente a la luz de las consideraciones
de los avances científicos y de bienestar animal. El desarrollo de un método de inhalación
aguda de clase tóxica (ATC) para la inhalación, se consideró apropiado tras la adopción del
método ATC bucal revisado previamente. En diciembre de 2001 y la posterior supresión de la
pauta oral aguda tradicional prueba 401. La alternativa TG N º 436 sobre "Toxicidad aguda por
inhalación Agudo Clase Método-ATC Toxico" ofrece refinamiento y reducción mediante la
aplicación de medidas de serie y las concentraciones objetivo fijo para clasificar la toxicidad
artículo de prueba para la clasificación y el etiquetado, de acuerdo con el Sistema de las
Naciones Unidas Globalmente Armonizado (SGA) de clasificación y etiquetado de productos
químicos.
20
OECD Toxicidad Inhalatoria Aguda
Los estudios de toxicidad aguda por inhalación son los medios ideales para la
caracterización de los peligros agudos de inhalación, pero hay circunstancias en las que
requieren un estudio de toxicidad por inhalación no se justifica por razones humanitarias,
científicas o prácticas. Pruebas en GHS categoría 5 es generalmente desalentada y sólo debe
considerarse cuando hay una fuerte probabilidad de que los resultados de una prueba de este
tipo tendría una relevancia directa para la protección de la salud humana. Por regla general, las
pruebas deben hacerse a menos que existan razones de peso para no probar. La decisión de
probar o no probar debe considerarse sobre una base caso por caso, utilizando un enfoque de
ponderación de la evidencia. Pruebas agudas por inhalación no es necesario si la forma física
de un artículo de prueba, como se comercializa o se utiliza, se opone a cualquier exposición a la
inhalación humana (por ejemplo, el bloque sólido de metal, gránulos no friables, materiales
elásticos compuestos). Sin embargo, la toxicidad asociada con los efluentes de la termólisis o la
combustión de los productos de otro modo no inhalable puede estar sujeto a prueba.
Consideraciones Éticas en Animales de laboratorio: Ensayos de Toxicidad Aguda
Las consideraciones éticas deben de velar por que el diseño y realización de los procedimientos
además de tener relevancia para la salud humana y animal, proveer un avance en el
conocimiento y dar un bien de la sociedad (ILARCLSNRC, 1999), se debe garantizar que:
1. El uso de las especies, calidad y número apropiados de animales.
2. El evitar o reducir al mínimo la incomodidad, diestrés y dolor, siempre y cuando sea
compatible con una buena ciencia.
3. El uso apropiado de sedación, analgesia y anestesia
4. El establecimiento de metas y objetivos en el experimento
5. Brindar un manejo apropiado a los animales, dirigido y realizado por personas
calificadas
6. La conducción de experimentos en animales vivos sólo por, o bajo la, estricta
supervisión de personas calificadas y con experiencia
Existe la preocupación ética por el bienestar de los animales de laboratorio, que incluye el
alivio de la tensión y el sufrimiento. Además de permitir que para la clasificación de los
estudios de toxicidad aguda por inhalación que pueden proporcionar información importante
acerca de los peligros potenciales que pueden estar asociados con el uso de los productos de
consumo (por ejemplo, los biocidas de interior, latas de spray multiusos, productos de limpieza
en aerosol, incienso repelente de insectos, entre otros). Para este fin, los puntos finales no
letales en el extremo inferior de la curva de concentración - respuesta pueden ser tan útiles
21
como puntos finales letales. Siempre que este objetivo se puede lograr mediante el uso de
métodos de ensayo alternativos, que utilizan menos animales, dentro de lo posible debe
mantenerse y optar por este enfoque.
La guía revisada 403 utiliza menos animales que la versión de la 403 de 1981 y todos
ellos contienen un requisito para seguir la guía N º 19 de la OECD sobre puntos finales, lo que
debería reducir el sufrimiento total de animales utilizados en aguda pruebas de toxicidad por
inhalación. La guía 403 utiliza un estudio preliminar para reducir al mínimo el número de
animales necesarios.
En la utilización de animales de experimentación estos que muestren signos graves y
duraderos de angustia o dolor deberán ser sacrificados humanitariamente como se describe en la
Guía de la OCDE Documento No. 19. Al exponer los animales a un artículo de la prueba con
propiedades irritantes o corrosivos fuertes donde las concentraciones buscadas no deben inducir
irritación / efectos corrosivos severos, sin embargo, suficientes para extender la curva de
concentración - respuesta a los niveles que alcanzan el objetivo normativo y científico de la
prueba. Artículos de prueba que son irritantes para los ojos / de la piel también pueden ser
irritantes de las vías respiratorias a concentraciones de exposición altos. Debido a
marcadamente diferentes enfoques metodológicos, los resultados de las pruebas de
corrosividad para los ojos / de la piel no se pueden traducir fácilmente a concentraciones de
exposición por inhalación reales entregados en un período de tiempo especificado. Por lo tanto,
los artículos de prueba corrosivos deben ser evaluados y probados siguiendo la opinión de
expertos en un términos comparables en caso por caso.
Exposición de animales de laboratorio en técnicas de toxicidad inhalatoria
Los animales que sean utilizados en estas técnicas se seleccionan al azar, marcados para
su identificación individual y se mantienen en sus jaulas durante al menos 5 días antes del
comienzo de la prueba para permitir que se aclimaten a las condiciones de laboratorio. Aunque
varias especies de mamíferos de prueba se pueden usar, la especie preferida es la rata.
Se recomienda uso de cepas comunes de laboratorio. Si se utiliza otra especie de
mamíferos, el experimentador usualmente debe proporcionar una justificación de su selección.
Al comienzo de un estudio, ratas adultas jóvenes - deben utilizarse (aproximadamente 8 12
semanas de edad)
El intervalo de tiempo entre los grupos de tratamiento se determina por la aparición,
duración y gravedad de los signos tóxicos. Inicio de una exposición debe retrasarse hasta que
uno es razonablemente seguro del resultado de los animales tratados con anterioridad. La
exposición de los animales en la próxima baja o más alta concentración se debe basar en la
experiencia previa y el juicio científico.
22
Los animales deben ser observados con frecuencia durante el período de exposición. Tras
la exposición, las observaciones clínicas cuidadosas deben hacerse por lo menos dos veces en
el día de la exposición, o con mayor frecuencia si así lo indica la respuesta de los animales para
el tratamiento, y por lo menos una vez al día a partir de entonces durante el período posterior a
la exposición. Observaciones adicionales si los animales siguen presentando signos de
toxicidad. Las observaciones incluyen cambios en la piel y el pelo, los ojos y las membranas
mucosas, del aparato respiratorio, circulatorio, los sistemas nerviosos autónomo y central, la
actividad somato -motriz y patrones de comportamiento. La atención debe ser dirigida a la
observación de temblores, convulsiones, salivación, diarrea, letargo, sueño y coma.
El principio del ensayo de Toxicidad Inhalatoria a dosis repetida que dictamina la OECD
No. 403 y No.412 consisten en exponer diversos grupos de animales de experimentación
diariamente en un periodo definido para probar la sustancia en concentraciones graduales, una
concentración por grupo, por un período de 14 o 28 días respectivamente. Donde un vehículo es
usado para ayudar a generar una concentración apropiada de la sustancia en la atmosfera, se
utilizan un grupo control del vehículo. Durante el periodo de administración los animales son
observados diariamente para detectar signos de toxicidad.
Abordaje a la toxicología general
La toxicidad aguda se debe a la presencia de los efectos inmediatos o mediatos por dosis
altas o dosis repetidas en un breve lapso de tiempo, pueden desembocar en la muerte o en una
incapacidad grave. No obstante, en algunos casos la intervención puede producir efectos
transitorios y totalmente reversibles. El resultado estará determinado por la dosis o por la
gravedad de la exposición (Curtis, 2008).
Cuando se administra una dosis única y elevada, algunas sustancias químicas no
presentan el mismo mecanismo de toxicidad que cuando se administran repetidamente en dosis
bajas pero tóxicas, comprendiendo como una toxicidad crónica. Cuando se administra una dosis
única y elevada cabe siempre la posibilidad de que se supere la capacidad de la persona para
destoxificar o excretar la sustancia, y ello puede provocar una respuesta tóxica distinta de la que
se produce cuando se administran repetidamente dosis más bajas. Un buen ejemplo a este
respecto es el alcohol, a dosis altas de alcohol producen efectos primarios en el sistema
nervioso central, mientras que la repetición de dosis más bajas (crónico) produce lesión
hepática (DeMarini & Huff, 2001).
Los plaguicidas organofosforados, por ejemplo, tienen en su mayoría escasa toxicidad
para los mamíferos hasta que son activados metabólicamente, sobre todo en el hígado. El
principal mecanismo de acción de los organofosforados es la inhibición de la acetilcolinesterasa
(AChE) en el cerebro y el sistema nervioso periférico. La AChE es la enzima que normalmente
pone fin a la estimulación provocada por el neurotransmisor acetilcolina. La inhibición leve de
la AChE a lo largo de un período prolongado no se ha asociado con efectos adversos. A niveles
23
de exposición altos, la incapacidad de poner fin a esa estimulación neuronal produce una
sobreestimulación del sistema nervioso colinérgico, lo que en última instancia provoca toda una
serie de síntomas, como parada respiratoria a la que sigue la muerte si no se trata (Watanabe,
2001).
La DL (dosis letal) es la dosis que produce una mortalidad del 50 % en una población
animal. La DL50solía considerarse en la bibliografía más antigua como una medida de la
toxicidad aguda de las sustancias químicas. A mayor DL50, menor toxicidad aguda. De una
sustancia química muy tóxica (con una DL50baja) se dice que es potente. No hay una
correlación necesaria entre la toxicidad aguda y la toxicidad crónica. La DE (dosis efectiva) es
la dosis que produce en el 50 % de los animales un efecto específico no letal.
Nociones de genética toxicológica:
La genética toxicológica o genotoxicología, es una rama de la toxicología que evalúa los
efectos de diversos agentes químicos y físicos en el material hereditario AND y en los procesos
genéticos de células vivas. Existen diversas metodologías que evalúan directamente la
interacción de los agentes con el ADN e indirectamente como pueden ser mutaciones genéticas
o alteraciones cromosómicas. Todos los cambios sufridos en el ADN tienen impactos directos
en la salud que se evidencian en la salud humana como alteraciones o desordenes genéticos que
pueden ser desde defectos al nacer y cáncer (Curtis, 2008).
La toxicología genética es, por definición, el estudio de la forma en que agentes químicos
o físicos afectan al complejo proceso de la herencia. Las sustancias químicas genotóxicas son
compuestos capaces de modificar el material hereditario de las células vivas. La probabilidad
de que una determinada sustancia cause un daño genético depende inevitablemente de diversas
variables, como el nivel de exposición del organismo a la sustancia, la distribución y retención
de ésta una vez que ha penetrado en el cuerpo, la eficiencia de los sistemas de activación
metabólica y/o destoxificación en los tejidos diana y la reactividad de la sustancia o de sus
metabolitos con macromoléculas críticas de las células. La probabilidad de que el daño genético
produzca una enfermedad depende en última instancia de la naturaleza del daño, la capacidad
que posee la célula de reparar o amplificar el daño genético, la oportunidad de expresar
cualquier alteración que se haya inducido y la capacidad del cuerpo de reconocer y suprimir la
multiplicación de células aberrantes (Misra & Walkees, 2001).
24
Mecanismos de inducción de alteraciones genéticas:
Los mecanismos que inducen alteraciones genéticas pueden darse por daño directo al
ADN por radiaciones ionizantes y no ionizantes, luz ultravioleta agentes químicos y endógenos,
que pueden llegar a producir roturas de una o las dos hebras, cruce entre las bases del ADN o
entre las bases y las proteínas, adiciones de elementos químicos en las bases del ADN
(aductos), producción de especies de oxígeno reactivo (superóxido, radicales libres de
hidróxido y peróxido de hidrógeno). Pueden presentarse daños en el momento de la reparación
del ADN dañado, durante la reparación si el daño al ADN es extensivo la célula muerte por
apoptosis. Si el daño es menos severo puede ser reparado por una serie de procesos que forman
parte de una respuesta al daño al ADN
que lleva al ADN a un estado sin daño,
llevado a cabo por familias de
polimerasas. Pero que al fallar esta
respuesta puede generar la formación
de mutaciones genéticas que pueden
ser en células somáticas (aberraciones
cromosómicas estructurales, cambios
en el número de cromosomas, cambios
en las cromátidas hermanas), o en
células germinales, que presentan
cambios similares a las células
somáticas. (Curtis, 2008).
Las primeras teorías sobre la
forma en que las sustancias químicas
interactúan con el ADN se remontan a
los estudios que se realizaron durante
el desarrollo del gas mostaza con fines
bélicos. Se amplió después el
conocimiento de estos procesos
cuando se trató de identificar agentes
anticarcinógenos que detuvieran
selectivamente la replicación de
células tumorales en rápida división.
La mayor preocupación de la opinión
pública por los peligros ambientales ha
impulsado nuevas investigaciones sobre los mecanismos y consecuencias de la interacción de
sustancias químicas y material genético (Misra & Walkees, 2001).
25
Existen diversos ensayos para detectar las alteraciones genéticas que van desde la
caracterización de las mutaciones genéticas hasta las ensayos que evalúan un punto final único
(por ejemplo existen ensayos donde se evalúa la reserción del triptófano WP2 de la E. coli
(Curtis, 2008).
Medición del daño primario al ADN:
Se trata de evaluar la capacidad que tienen los agentes de inducir cualquiera de los tres
tipos generales de cambios (o mutaciones) que puede sufrir el material genético (ADN):
cambios génicos, cromosómicos y genómicos. En organismos como los humanos, los genes se
componen de ADN, que consta de una serie de unidades llamadas bases de nucleótidos. Los
genes están organizados en estructuras físicas discretas que se denominan cromosomas. La
genotoxicidad puede producir efectos importantes e irreversibles sobre la salud humana. El
daño genotóxico es un paso crítico en la inducción del cáncer y puede intervenir también en la
inducción de defectos de nacimiento y muerte fetal. Las tres clases de mutaciones que se han
mencionado pueden producirse en cualquiera de los dos tipos de tejidos que poseen los
organismos como el ser humano: los espermatozoides y óvulos (células germinales) y el tejido
restante (células somáticas).
Los ensayos que miden la mutación génica son los que detectan la sustitución, adición o
supresión de nucleótidos en un gen. Los ensayos que miden la mutación cromosómica son los
que detectan rupturas o reordenaciones cromosómicas en las que intervienen uno o varios
cromosomas. Los ensayos que miden la mutación genómica son los que detectan cambios en el
número de cromosomas, fenómeno que se denomina aneuploidía. La evaluación de la toxicidad
genética ha cambiado mucho desde que Herman Müller desarrolló en 1927 el primer ensayo de
detección de agentes genotóxicos (mutágenos). Desde entonces se han desarrollado más de 200
ensayos que miden las mutaciones del ADN; no obstante, no llegan a diez los que normalmente
se utilizan hoy para evaluar la toxicidad genética.
Existen tres razones fundamentales que justifican la preocupación por la exposición del
hombre a los agentes mutagénicos.
Primero, el incremento en el grado de mutación de las células germinales (óvulos,
espermatozoides y sus precursores) lo cual puede provocar un aumento de la incidencia de las
enfermedades genéticas en futuras generaciones. Segundo, la existencia de una estrecha
relación entre la inestabilidad genómica de células somáticas con el cáncer y las enfermedades
degenerativas crónicas. Tercero, el origen ambiental del cáncer. Ello orienta a la utilización de
ensayos a corto plazo los cuales, informan en poco tiempo acerca de la actividad mutagénica de
dichas sustancias y en algunos casos brindan información suficiente para establecer los niveles
de seguridad para el hombre (Arencibia, 2003).
26
Fundamento del ensayo cometa
Ostling y Johanson en el año 1984, fueron los primeros en desarrollar una técnica de
electroforesis en microgeles para detectar el daño al ADN a nivel de células individuales. En
esta técnica las células son embebidas en agarosa y son añadidas en láminas de microscopio
para ser sometidas a una electroforesis neutral, tras la lisis en presencia de sales y detergentes.
Las células que tienen una elevada frecuencia de rupturas de doble cadena se movían
significativamente hacia el ánodo. En general el principio básico del ensayo, es la migración del
ADN en una matriz de agarosa bajo condiciones de electroforesis. Luego, al ser observada la
célula al microscopio (por fluorescencia, en el caso de este experimento), presenta la apariencia
de un cometa, con una cabeza (región nuclear) y cola (formada por fragmentos nucleares que
han migrado en dirección del ánodo) por lo que este ensayo es también conocido como ensayo
Cometa, debido al patrón de migración del ADN que se produce en las células dañadas. La
detección de la migración del ADN alterado depende de varios parámetros, tales como: la
concentración de la matriz de agarosa, el pH, la temperatura y duración del desenrollamiento,
voltaje, amperaje y duración de la electroforesis. El protocolo de este ensayo ha sufrido
diversas modificaciones a través del tiempo, y su objetivo establecido es para detectar daño al
ADN, específicamente aquellos producidos por las rupturas de cadena, la formación de sitios
lábiles al álcali, los entrecruzamientos ADN-ADN y ADN-proteínas y más recientemente para
la evaluación de los mecanismos de reparación de daño oxidativo en el ADN en células
eucariotas obtenidas tanto de estudios in vivo como in vitro.
Comparado con otros ensayos de genotoxicidad, el ensayo Cometa se distingue por su
(Arencibia, 2003):
1. Demostrada sensibilidad para detectar bajos niveles de daño al ADN (0.01 Gy),
2. Rápida realización (resultados en pocos días),
3. Análisis de los datos a nivel de células individuales,
4. Requiere un pequeño tamaño de muestra (pocas células),
5. Flexibilidad y bajo costo,
6. Aplicable a cualquier población de células eucariotas.
Este ensayo cometa, se utiliza la electroforesis comúnmente utilizada para el estudio de
proteínas y ácidos nucleicos, técnica que ayuda en el estudio del movimiento de biomoléculas
con una carga neta a través de un campo eléctrico. En la electroforesis la migración depende de
la forma, tamaño, carga y composición química; es utilizada para analizar y determinar el peso
molecular de diferentes tipos de biomoléculas. Existen diversos tipos de electroforesis cuya
diferencia radica en los distintos tipos de medios de soporte: lso geles de celulosa son usados
para moléculas de bajo peso molecular como los aminoácidos y los carbohidratos, los geles de
poliacrilamida y agarosa se utilizan para moléculas de mayor peso molecular (ADN, ARN y
proteínas). Los geles de electroforesis pueden ser horizontales, verticales o cilíndricos. Son
27
útiles para lograr la separación de componentes de mezclas complejas. Se aplican pequeñas
cantidades de la disolución de proteínas a un soporte sólido, que se impregna con una solución
de tampón. Los soportes son en general polímeros y forman un gel poroso que restringe el
movimiento de las moléculas a través del medio durante la electroforesis y disminuyen los
flujos de convección del solvente. Como soportes han sido utilizados papel (celulosa), almidón,
poliacrilamida, agarosa, acetato de celulosa, etcétera (Morales & Gallo, 2006).
Este método tiene gran poder resolutivo (técnica electroforética) porque se aplica una
cantidad pequeña de proteína a una zona estrecha, mientras que la longitud del trayecto es
mucho mayor que la zona de aplicación. El equipamiento requerido es simple (fuente de poder
y cubeta vertical u horizontal donde se coloca el soporte y 2 electrodos). Con el desarrollo de la
ciencia se han diseñado y existen diversos equipos automatizados de electroforesis. Además
existen diversos factores que deben de tomarse en cuenta para realizar la técnica de
electroforesis, siendo algunos parámetros: Diferencia de potencial (V): este potencial se mide
en voltios y es lo que define el campo eléctrico, cuanto mayor sea, mayor será la velocidad de
migración; las electroforesis se consideran de bajo voltaje si se realizan entre 10-500 voltios (la
mayoría) y de alto voltaje si se realizan entre 500-10,000 voltios. La intensidad (I) que se mide
en amperios y cuantifica el flujo de carga eléctrica, está relacionada con la diferencia de
potencial por la Ley de Ohm: V=IR y para una diferencia de potencial dada, su valor
(normalmente entre 5-50mA) viene determinado por la resistencia del soporte, por lo que, en
última instancia, da cuenta de la distancia recorrida por las moléculas. La resistencia (R) que se
mide en ohmios y cuanto mayor sea la resistencia del soporte, menor será la movilidad
electroforética (ya que la intensidad ha de ser menor para que se cumpla la Ley de Ohm),
depende de la naturaleza del soporte, sus dimensiones (anchura, longitud y sección) y de la
concentración del tampón de electroforesis. La temperatura, por el efecto Joule, el paso de una
corriente eléctrica produce calor, y este efecto será tanto mayor cuanto mayor sea la diferencia
de potencial y la resistencia del sistema; este debe controlarse de forma estricta, puesto que
puede afectar a la muestra (desnaturalizándola), al soporte e incluso al equipo electroforético
(Morales & Gallo, 2006).
El ensayo del cometa ha demostrado ser una técnica muy sensible a la hora de evaluar
daño en el DNA en una amplia variedad de células, dañadas por distintos agentes tanto físicos
como químicos, detectando entre 50 y 15000 rupturas por células. Este permite establecer
relaciones dosis-respuesta a bajas dosis, es capaz de detectar daño genético y su reparación en
moléculas de ADN altamente compactadas con eficacia y exactitud. Este ensayo se puede
medir en un gran número de células y en diferentes tejidos, los datos son obtenidos a nivel
individual donde pueden generar información sobre la heterogeneidad de una muestra (Zúñiga,
2009).
El ensayo cometa es una prueba que permite evaluar el daño primario al ADN,
evaluando la ruptura de las cadenas de ADN por exposición a contaminantes ambientales, este
ensayo permite evaluar si existe un daño primario al ADN por exposición a piretroides que
28
utilizan diesel como disolvente y enseguida comparar el daño producido entre los piretroides
utilizados con diesel versus el daño provocado utilizando un solvente adecuado según la
etiqueta. El ensayo cometa es un ensayo que mide la alteración al ADN visiblemente como una
cola de cometa en el microscopio de fluorescencia en campo oscuro, la ruptura de cadenas
como lo es el daño primario al ADN es el punto de partida para un daño clastogénico expresado
a nivel celular como aberraciones cromosómicas. (Dhawan, 2008; Valverde, 2009)
Es ampliamente utilizado para evaluar el daño genotóxico inducido por distintos
agentes, y su atención en mutagénesis y biomonitoreo ambiental parece incrementarse con el
desarrollo de las continuas mejoras que se van implementando. No obstante, uno de los puntos
críticos es la no uniformidad de la electroforesis que aporta variabilidad a los resultados y
también por la preparación de los microgeles respectivos (Crespo, 2011).
29
PARTE III
III.1. Resultados
TABLA No.1
Distribución de Grupos Experimentales
Ensayo Grupo Concentración
403
Macho 1 parte deltametrina: 1 parte de diesel
Hembra 1 parte deltametrina: 1 parte de diesel
412
Alta 3 partes de deltametrina: 65 partes
del diesel
Media 1 partes de deltametrina: 65 partes
del diesel
Baja 0.5 partes de deltametrina: 65 partes
del diesel
Control 1 partes de deltametrina: 65 partes de
aceite mineral
Fuente: Fodecyt 21-2010
GRÁFICA No. 1
Comportamiento del peso según sexo durante Ensayo 403
Fuente: Fodecyt 21-2010
30
TABLA No. 2
Efectos predominantes de la Toxicidad Inhalatoria No. 403
Grupo Observaciones
Machos
Respiración anormal, agotamiento, ligera salivación, letargia, pelaje
erizado del dorso, hiperventilación, lesiones oculares. Al día 7 lesiones
en piel, caída de pelo. Al día 13 un sujeto presenta incapacidad para
caminar con un deterioro evidente.
Hembras Descoordinación de los movimientos, salivación, respiración anormal,
letargia, ojos con edema, poca movilidad.
Fuente: Fodecyt 21-2010
Fotografía No. 1
Efectos visibles de exposición en Ensayo 403
Fuente: Fodecyt 21-2010
31
TABLA No. 3
Efectos predominantes histológicos del Ensayo No. 403
HÍGADO RIÑÓN PULMÓN
degeneración hialina dentro de
hepatocitos, degeneración hidrópica y
áreas focales de esteatosis con ruptura de
paredes celulares, formando cavidades,
perivasculitis con infiltración
mononuclear, área hemorrágica
degeneración tubular en
zona cortical, zona de
esteatosis
áreas atelectásicas,
infiltración
mononuclear, enfisema,
áreas pequeñas de
hemorragia
Degeneración hidrópica a nivel tubular,
dilatación del penacho glomerular,
hialinización. Hiperplasia de células de
conductos biliares (colangitis). Focos de
hemorragia
degeneración hidrópica,
cariomegalia, congestión,
dilatación de penacho
glomerular, hialinización
enfisema severo, leve
edema, en algunas áreas
hay hiperplasia de pared
alveolar
infiltración grasa, esteatosis
algunos túbulos con
degeneración hidrópica, leve
hialinización
enfisema
Fuente: Fodecyt 21-2010
GRÁFICA No. 2
Comportamiento del peso según sexo durante Ensayo 412
Fuente: Fodecyt 21-2010
32
TABLA No. 4
Efectos predominantes de la Toxicidad Inhalatoria No. 412
Grupo Observaciones
Media
Irritación ocular. Al día 11 respiración irregular, agrupamiento,
patas lastimadas. Al día 23 hiperactivos, lesiones en orejas,
ojos, piel y cola.
Alta
Problemas de locomoción, sofocación, agrupamiento
inmediato, respiración irregular, nariz y ojos lastimados,
evidente estrés. Día 14 se retira un animal. Hiperactividad,
autolimpieza, caída de pelo, ojos irritados, lesiones en ojos,
patas y cola.
Baja
Curiosidad normal, comportamiento agitado, agrupados, ojos
cerrados, respiración anormal, se alejan del sitio donde sale el
aerosol. Al día 8 con efectos pero no tan marcados, con mayor
movimiento al ingreso, tratan de escaparse, hiperactivos, ojos
lastimados, caída de pelo.
Aceite
Respiración normal al inicio, agrupados, después de 3 días
respiración irregular, no hay caída de pelo, recuperación rápida
fuera de la cámara, al abrir intentan escapar, agotados,
respiración irregular, pelaje húmedo y amarillento al día 14,
hiperactividad, poca caída de pelo al día 22, poco pelaje en la
cabeza día 27.
Fuente: Fodecyt 21-2010
33
TABLA No. 5
Efectos predominantes histológicos del Ensayo No. 412
GRUPO HÍGADO RIÑÓN PULMÓN
MEDIA
algunos hepatocitos con
cariomegalia, infiltración de
mononucleares alrededor
de algunos canalículos
biliares, degeneración
hidrópica, esteatosis, leve
hemorragia
Hialinización,
degeneración hidrópica
de túbulos, degeneración
hidrópica tubular.
enfisema, infiltración de
neutrófilos, hiperplasia
de células de pared
alveolar
ALTA
infiltración grasa,
esteatosis, degeneración
hidrópica, algunos
hepatocitos con
cariomegalia, infiltración de
mononucleares alrededor de
canalículos biliares,
hepatocitos con
cariomegalia
hialinización, dilatación
del penacho glomerular,
algunos penachos
glomerulares en necrosis
leve edema, hiperplasia
de células de la pared
alveolar, enfisema
BAJA
degeneración hidrópica,
degeneración grasa
multifocal, cuerpos hialinos
degeneración hidrópica
tubular, hiperemia,
degeneración grasa
multifocal
Enfisema, inflamación
linfoplasmocitaria,
hiperemia, algunos
eosinófilos.
ACEITE
degeneración hidrópica,
cuerpos hialinos, áreas de
congestión
(tumefacción turbia y
degeneración hidrópica)
Hiperemia, enfisema,
áreas de inflamación
focal, áreas
hemorrágicas.
Fuente: Fodecyt 21-2010
34
Gráfica No.3
Ensayo Cometa: rata expuesta a deltametrina y disolvente aceite mineral
Programa Casp 1.2.2
Fuente: Fodecyt 21-2010
35
Gráfica No.4
Ensayo Cometa: Grupo control
Programa Casp 1.2.2
Fuente: Fodecyt 21-2010
36
Gráfica No. 5
Ensayo Cometa: Grupo Mediano expuesto a deltametrina y disolvente diesel
Programa Casp 1.2.2
Fuente: Fodecyt 21-2010
37
Gráfica No. 6
Ensayo Cometa: Grupo Bajo expuesto a deltametrina y disolvente diesel
Programa Casp 1.2.2
Fuente: Fodecyt 21-2010
38
Gráfica No. 7
Ensayo Cometa: Grupo Alto expuesto a deltametrina y disolvente diesel
Programa Casp 1.2.2
Fuente: Fodecyt 21-2010
39
III.2. Discusión de Resultados
Se evaluó el daño primario al ADN por ensayo cometa, en células sanguíneas de ratas
expuestas al piretroide deltametrina combinado con diesel como disolvente, a través de la
técnica de electroforesis para células individuales, este piretroide es utilizado para el control de
vectores en Guatemala.
El piretroide deltametrina fue el piretroide seleccionado para el estudio, esto debido a
que es el piretroide que se ha utilizado en los últimos 8 años en el control de vectores,
independientemente de las diferentes marcas comerciales utilizadas, el nombre genérico ha sido
deltametrina. (PLAGSALUD)
La etiqueta de estos productos señala las concentraciones a las cuales deben manejarse y
los disolventes recomendados, para el caso de la deltametrina señala que debe utilizarse aceite
mineral como disolvente y que puede utilizarse inclusive agua. Este disolvente fue descartado
debido a que las condiciones el estudio no aplicaba el uso; la literatura indica que se puede
utilizar agua cuando se trabaja en bajas concentraciones siendo utilizado frecuentemente en
áreas abiertas, razón por la que fue seleccionado el aceite mineral como adecuado para el
propósito del plaguicida.
Estudios señalan que se observa la utilización de deltametrina en combinación con diesel como
disolvente, lo cual fue constatado por el equipo de investigación.
Para evaluar la genotoxicidad de este plaguicida en combinación con el diesel, se realizo
los ensayos 403 y 412 de la OECD “Toxicidad Inhalatoria a dosis Repetidas” aguda y
subaguda.
III.2.1 Evaluación de la Toxicidad aguda por inhalación (Datos sobre DL50) (OECD 403,
2009).
Para la determinación de la dosis letal 50, se utilizó el protocolo establecido número
403 de la OECD, mismo que generó datos útiles para la reducción de animales.
Para este ensayo, se utilizaron como especie animal la rata Wistar, hembras nulíparas y machos,
ambos adultos jóvenes. Cumpliendo con un peso promedio con ± 20 de desviación. Ninguno de
los sujetos estudio fue expuesto ni utilizado en otro estudio. Se llevó a cabo un proceso de
aclimatación al equipo por breves espacios de tiempo previo a iniciar el estudio. La temperatura
del salón de bioensayo se mantuvo a una temperatura promedio de 21ºC ±2º C y la humedad
relativa se mantuvo dentro del rango permitido (30 a 70%). La alimentación y el agua fueron ad
libitum y la secuencia de iluminación fue de 12 horas luz/ 12 horas oscuridad.
La dosis utilizada para dicho ensayo indicada en la tabla No. 1 fue basada en la dosis
máxima establecida para deltametrina de diversas casas comerciales y de la literatura oficial,
por lo cual se utilizó esta misma dosis 1:1; la selección de dicho ensayo fue por diversos
propósitos, además de corroborar la DL50 se utilizó para lograr una reducción del número de
animales en el estudio e identificar si existía sensibilidad predominante por sexo (OECD 309,
2009).
40
Posterior al cumplimiento de todos los aspectos en cuanto al animal de experimentación,
se seleccionó el equipo de exposición, basándose una serie de ventajas y desventajas sobre el
uso de equipo entre el de solo nariz versus el de cuerpo completo (OECD 39, 2009). Se
seleccionó el equipo de cuerpo completo, debido a que por la duración del estudio (403 y 412,
con 4 y 6 horas de exposición respectivamente) permitía el movimiento con libertad dentro de
la cámara disminuyendo el estrés.
Los factores que se controlaron dentro del equipo de exposición, fueron el flujo de aire,
el cual se controló a través del flujómetro, este nos permitía un recambio de 5L por minuto,
evitando con esto una sobreexposición por la atmosfera saturada del aerosol. La dispersión de
las partículas se obtuvo por medio del colisionador que lograba dispersar el líquido en
partículas pequeñas (aerosol). La concentración de la muestra fue monitoreada por la diferencia
de peso del papel filtro que se ubicaba en una salida de la cámara.
Los animales fueron expuestos durante 4 horas diarias por 14 días cada grupo,
observándose respuestas clínicas, los efectos principales en ambos sexos se muestran en la
tabla No. 2; siendo evidente la salivación, la alteración de la respiración, el pelo erizado.
Además de la alteración en cuanto a sus movimientos, se observó un daño evidente a la piel de
los sujetos en exposición, que se observaron desde la caída del pelaje, apariciones de heridas en
el dorso, y en todos los animales se observó lesiones de la piel alrededor de los ojos. En el
grupo de ratas macho, el deterioro de los animales fue evidente con el transcurrir de los días, la
observación fue constante razón por la que el estudio culminó el día 13, para evitar un estrés y
sufrimiento de los animales. Estos efectos se observaron en el grupo de las ratas hembra pero en
menor magnitud. Por lo que se concluyó que la rata macho es más sensible que la rata hembra,
por medio de los signos observados.
La relación del peso con el tiempo del desarrollo del estudio se presenta en la gráfica
No.1 observándose que las hembras fueron los animales que mayor peso perdieron,
aproximadamente 150g y los machos un promedio de 75g ambos grupos cambian la tendencia
del comportamiento normal de una rata, misma que se observa con el grupo control, de
aumentar peso conforme pasan las semanas, observando una tendencia significativa en la
pérdida de peso durante la realización de la experimentación.
El ensayo finalizó el día 13, debido a que por razones de estrés y evidente deterioro de
la salud de los animales se suspendió por decisión unánime. Se procedió a realizar la eutanasia
de los animales siguiendo el método de administración de pentobarbital, el cual es un método
validado y aprobado por diferentes entidades en investigación preclínica; este método, permite
una muerte sin estrés y sin dolor para los animales. La necropsia fue realizada a los animales,
realizando una evaluación visual de los órganos principales, de los cuales se destaca lesiones a
simple vista como se observa en la gráfica No. 2. Se realizaron los informes histológicos donde
se observó una alteración en los tejidos celulares en pulmón, hígado y riñón. En el resumen de
los informes histológicos que se presenta en la tabla No. 3, se puede observar que los efectos
predominantes son mayores en el grupo de los machos que las hembras, siendo importante la
presencia de hemorragias tanto en riñón como en pulmón. La mayoría de daños histológicos
corresponden a alteraciones degenerativas que conllevan a muerte celular. Se observó al igual la
disminución de esteatosis; la acumulación de grasa, que esto se observa asociado a la pérdida
de peso en los animales.
41
Por las observaciones de los signos y los informes histopatológicos se concluye que la
rata macho es más sensible que la hembra, a los efectos de la mezcla deltametrina: diesel.
Siendo importante para la reducción del número de animales, para el desarrollo del ensayo 412.
En cuanto al comportamiento de la mezcla utilizada deltametrina: diesel en la
concentración indicada en la tabla No.1 es importante destacar la presencia de formación de
precipitado, los cuales provocaban taponamiento en los agujeros del colisionador, mismo que
era necesario limpiarlo periódicamente durante las cuatro horas de exposición. Esto es
importante debido a que a esas concentraciones, y si extrapolamos el uso, a una bomba de
aspersión utilizada para fumigar hogares, este tipo de mezcla reduciría la vida útil de las
bombas, provocando un gasto adicional sumado a los posibles problemas que pueden derivar
del uso de esta mezcla a esa dosis.
Fotografía. No.2. Equipo de exposición inhalatoria. CH Technologies Inc.
Fuente: Fodecyt 21-2010
III.2.2 Ensayo 412 Toxicidad sub aguda por inhalación 28 días de estudio
Luego de realizar el ensayo 403 de toxicidad inhalatoria de la OECD, y estimar que los
machos fueron el grupo más sensible a la exposición, se seleccionaron los primeros cinco
animales machos para el ensayo 412, así como los animales para el grupo control.
Para el estudio se sugieren la selección de 3 concentraciones diferentes y un grupo con
disolvente distinto además del grupo control.
Para cada grupo se seleccionaron cinco animales machos, adultos saludables entre 8 y 9
semanas de edad, cuyos pesos no variaran en un ± 20% entre ellos mismos, se colocaron en el
equipo de exposición durante 4 días para lograr su aclimatación a un nuevo ambiente.
El biocontenedor donde fueron colocados los animales fue diseñado por
CHtechnologies Inc., los cuales son expertos en fabricación de equipos de evaluación
toxicológica, el biocontenedor funciona con un flujo de 5 litros por minuto, para asegurar 10
cambios de volumen en una hora y el colisionador proporciona una humedad relativa de 50 a
60%. Ver figura No.1.
42
La técnica empleada fue una exposición de cuerpo completo, la cual es utilizada para
evaluar signos y toxicidad en piel y ojos, que no pueden observarse bajo técnicas de solo nariz
(nose only) (OECD 39, 2009), como se expuso anteriormente.
Concentración alta:
Para el ensayo se preparó una mezcla de deltametrina y diesel en una concentración de
3:65 y se colocó en el colisionador del equipo de exposición. Se expuso a los animales durante
6 horas diarias por 28 días, durante los cuales se monitoreo su comportamiento. (OECD 412,
2009)
Bajo el método de exposición a cuerpo completo se observo que las cinco ratas macho,
presentaron problemas de locomoción, evidentes signos de sofocación y respiración irregular,
se observaron ojos y nariz lastimados. En el día 14 un animal es retirado del estudio por
observarse signos de dolor, todos los animales presentaron pérdida de pelo e irritación en piel,
ojos, patas y cola. Ver tabla No 4.
Todo lo anterior muestra una evidente toxicidad al plaguicida y el diesel a la
concentración elevada con la que se evaluaron, la pérdida de peso fue homogénea para los 4
animales que concluyeron el estudio, y fue similar a la del grupo de concentración normal y
diesel que también perdieron peso. Al comparar el grupo control se observó que este grupo
por el contrario ganó peso durante los 28 días que fueron monitoreados. Ver Gráfica No. 3
3 ratas expuestas fueron sacrificadas luego del ensayo cometa, y fueron enviadas a
patología para un informe histopatológico, y una rata fue dejada viva para grupo satélite y fue
evaluada 14 días después no mostrando ninguna mejoría por lo que fue sacrificada 28 días
después, mostrando un informe histopatológico similar al resto del grupo.
Efectos en Hígado, Riñón y Pulmón
A dosis alta de deltametrina con diesel las ratas sacrificadas presentaron en su informe
histopatológico inflamación de hígado y riñón, destacando también un edema en los pulmones
y enfisema e hiperplasia de las células de la pared alveolar, ver tabla No. 5.
A esta concentración no es posible distinguir si los efectos fueron causados por el
plaguicida o por el diesel, pero la combinación de ambos a esta concentración refleja una seria
toxicidad aguda para mucosas y órganos.
Concentración Media
Fue colocado en el colisionador del equipo una concentración media de deltametrina y
diesel 1:65, esta concentración es la sugerida por el fabricante, el fabricante también sugiere
utilizar solventes como el aceite mineral, sin embargo el objeto del estudio fue evaluar el
disolvente que es actualmente utilizado en Guatemala, el diesel. Ver tabla No.4
Los cinco animales fueron expuestos y observados durante los 28 días de exposición,
encontrando irritación en ojos de los cinco animales, adicionalmente lesiones en piel, cola y
orejas. Las lesiones no diferían de la concentración alta, la caída de pelo fue evidente desde el
tercer día de exposición, una diferencia con la exposición a alta concentración fue que en
43
concentración media todos los animales terminaron el ensayo. La pérdida de peso fue evidente
al terminar el ensayo, comparado con el grupo control que ganó peso, comparativamente el
peso perdido por el grupo a concentración media fue muy similar del grupo que fue expuesto a
concentración alta. Ver tabla No.4
Efectos en Hígado, Riñón y Pulmón
Los cinco animales presentaron en hígado una leve hemorragia e inflamación en hígado
y riñón, además de enfisema pulmonar e hiperplasia, evidenciando un aumento de tamaño en
los tejidos, y consecuentemente una toxicidad aguda a la exposición a la concentración
expuesta.
La toxicidad se relaciona con la combinación del piretroide con el diesel, puesto que no
es posible asegurar que a esta concentración la toxicidad se deba al solvente o al piretroide.
Una rata fue dejada sin sacrificar y evaluada luego de 14 días, donde se observo caída
de pelo, no mostro aumento de peso ni mejora de los daños en ojos, nariz y orejas, luego se
observo una progresiva mejoría de las patas y cola así como la piel. Ver tabla No.5
Concentración Baja
La concentración más baja fue de 0.5:65 deltametrina: diesel, a esta concentración se
observaron ligeras diferencias respecto a los grupos con concentración alta y media, en cuanto
al peso esta bajo ligeramente manteniéndose prácticamente igual, sin embargo el grupo control
subió de peso. La diferencia respecto a los grupos expuestos a concentración alta y media fue
que estos bajaron de peso significativamente. Ver tabla No. 4
Los animales mostraron respiración irregular al igual que los demás grupos, sin
embargo esta no fue al tercer día sino al octavo día en adelante, también mostraron ojos
lastimados y caída de pelo.
Efectos en Hígado, Riñón y Pulmón
Los efectos observados en el informe histopatológico reflejan enfisema pulmonar, e
inflamación linfoplasmocitaria, también se encontró hiperemia debido a una sobre estimulación
de los órganos y respiración anormal que ocasionó falta de oxigeno en el órgano, sin embargo
no mostró una inflamación similar a los órganos de los animales expuestos a concentraciones
elevadas y media de deltametrina. Ver tabla No.5
Concentración Media: aceite mineral
Para comparar la toxicidad inhalatoria aguda del diesel, se realizo un cuarto grupo a
dosis repetidas, en esta concentración se utilizó la indicada por el fabricante 1:65 para esta se
utilizó deltametrina y aceite mineral como sustitución al diesel. Ver tabla No. 4
En la Gráfica No. 3 se observa el aumento de peso de los cinco animales utilizados, lo
que demuestra una diferencia significativa respecto a los otros grupos.
44
En la tabla No. 3 se detallan las observaciones de cada grupo, donde para el grupo
donde se utilizo aceite mineral se muestran que al igual que en la concentración baja, los signos
se observaron a partir del tercer día sin embargo estos fueron en gran medida mucho menos
evidentes, los ojos también se mostraron lastimados y caída de pelo en poca cantidad. La
respiración de los animales fue una diferencia significativa puesto que la respiración fue
irregular pero en menor medida a los otros grupos, la cola, piel y patas no mostraron daño
semejante a los otros grupos.
Efectos en Hígado, Riñón y Pulmón
El informe histopatológico evidenció áreas de congestión en el hígado, inflamación del
riñón y pulmones, así como enfisema en pulmón. Ver tabla No.5
Los efectos de este grupo fueron tóxicos al igual que en lo grupos con diesel a diferentes
concentraciones, sin embargo hubo diferencias muy significativas, que pudieron ser observadas
por el método de exposición a cuerpo completo, el peso fue el más sobresaliente conjuntamente
con los efectos observados durante los 28 días.
Una rata fue dejada sin sacrificar y se observó una recuperación en pelo y ojos.
III.2.3. Electroforesis en células individuales, Ensayo cometa.
La genotoxicidad es el resultado dañino de la interacción de agentes químicos o físicos
con el material genético, manifestándose a través de alteraciones y/o cambios en el material
genético del individuo, que además pueden incorporarse en generaciones celulares subsecuentes
conocidas como mutaciones. La determinación genotóxico de contaminantes ambientales o de
compuestos naturales con fines terapéuticos, resultan una herramienta útil para la identificación
de riesgos (Curtis, 2009).
Existen una gran variedad de bioensayos útiles para evaluar genotoxicidad, entre ellos
se encuentra la electroforesis unicelular en gel, llamado comúnmente ensayo cometa, el cual en
este caso fue a través de un método microscópico fluorescente rápido y sensible, que permitió
examinar el daño al ADN en células de forma individual, analizándose 50 células para cada
caso. El fundamento de este ensayo para detectar daños al ADN producidos por un
rompimiento simple o doble en la cadena, daño exudativo inducido y entrecruzamiento de
ADN-ADN/ADN-proteína, se basa en la fragilidad que poseen los sitios dañados; al ser
sometidos a un pH superior a trece y su comportamiento en una electroforesis. Los fragmentos
de ADN, producto de la acción de la sustancia a probar, afectados por el pH alcalino, migran a
una velocidad diferente del resto del material nuclear formando la cola del “cometa”, entre más
larga sea esta porción mayor es el daño ocasionado al ADN (Curtis, 2009).
La toma de muestra sanguínea para el ensayo cometa se realizó un día posterior al día
28, obteniéndose un volumen de 0.5mL por cada espécimen mediante la extracción de sangre
en la cola. Se realizó el ensayo cometa por triplicado para cada individuo. Sirviendo de base el
protocolo establecido para electroforesis en gel unicelular desarrollado por Singh. Utilizando
las células sanguíneas en agarosa y realizando una electroforesis en condiciones alcalinas (pH
45
mayor a 13), seguido de la cuantificación individual de 50 células para cada individuo bajo un
microscopio con campo de fluorescencia, utilizando bromuro de etidio (Dhawan, 2006).
El daño al ADN fue realizado por la fijación del ADN con el bromuro de etidio usando
un objetivo de 40x. Se realizó un registro fotográfico de los individuos para ser analizados a
través del software CASP el cual permite la evaluación cuantitativa del daño al ADN, medido a
través del largo de la migración del ADN y el porcentaje de migración del ADN, además del
porcentaje de ADN presente en la cabeza del cometa.
Fotografía .3. Electroforesis en gel de células individuales
Fuente: Fodecyt 21-2010
Los individuos del ensayo 412 fueron sometidos a evaluación del daño de ADN por
ensayo cometa, de acuerdo a los datos obtenidos por el grupo expuesto a deltametrina y aceite
mineral en la concentración recomendada por la literatura (1 parte de deltametrina por 65 de
disolvente), el resultado promedio del largo de la cabeza del cometa fue de 117 el largo de la
cola fue de 3, mientras que el largo total del cometa fue de 120. Obteniéndose un porcentaje de
ADN en la cabeza de 99% y en la cola un 1%, observándose en el microscopio células casi
normales, ver la gráfica No. 4. Con estos datos se infiere que no existe daño significativo al
ADN en células sanguíneas en ratas expuestas a deltametrina disuelto en aceite mineral. Esto se
anuda a la evidencia registrada con los signos manifestados por el ensayo de toxicidad
inhalatoria y los hallazgos histopatológicos.
Por lo anterior, se indica que la mezcla deltametrina/aceite mineral es una forma adecuada
de poder trabajar con el plaguicida, presentando un grado bajo de riesgo a la salud.
46
Fotografía. 4. Extracción de sangre periférica
Fuente: Fodecyt 21-2010
De los individuos seleccionados como el grupo control, el resultado promedio del largo
de la cabeza del cometa fue de 167, el largo de la cola fue de 27, mientras que el largo total del
cometa fue de 194. Obteniéndose un porcentaje de ADN en la cabeza de 94% y en la cola un
6%, observándose en el microscopio células normales, sin aparente daño, ver gráfica No. 5.
Con estos datos se infiere que no existe daño significativo al ADN en células sanguíneas en
ratas control, las cuales estuvieron en las mismas condiciones que los grupos experimentales.
Esto se anuda a la evidencia registrada con los signos manifestados por el ensayo de toxicidad
inhalatoria y los hallazgos histopatológicos, los cuales manifestaron pocas alteraciones en los
órganos principales. Por lo anterior, se verifica que las condiciones tanto del bioterio como las
condiciones en que se realizó el ensayo cometa son satisfactorias; evidenciando con estos
resultados que la técnica utilizada para el ensayo cometa, tanto la solución de lisis como la
electroforesis fueron aceptables debido a que no generaron mayor daño por la lisis efectuada.
Los individuos que fueron evaluados con el ensayo 412 con diesel, fueron sometidos a
evaluación del daño de ADN por ensayo cometa, de acuerdo a los datos obtenidos por el grupo
expuesto a deltametrina y diesel a la concentración recomendada por la literatura (1 parte de
deltametrina por 65 partes de diesel), el resultado promedio del largo de la cabeza del cometa
fue de 61, el largo de la cola fue de 49, mientras que el largo total del cometa fue de 110.
Obteniéndose un porcentaje de ADN en la cabeza de 45% y en la cola un 55%, observándose
en el microscopio células con un daño. Con estos datos se infiere que existe un daño
significativo al ADN en células sanguíneas en ratas expuestas a deltametrina disuelto en diesel.
Esto se anuda a la evidencia registrada con los signos manifestados por el ensayo de
toxicidad inhalatoria y los diversos hallazgos histopatológicos, que evidencian el daño que
ocasiona el uso de estos compuestos, tanto en piel como a los órganos principales. Por lo
anterior, se indica que la utilización de la mezcla deltametrina/diesel a dosis mediana (1 parte
de deltametrina: 65 parte de diesel) representa un riesgo alto a la salud.
47
De los grupos que fueron evaluados con el ensayo 412 con diesel, fueron sometidos a
evaluación del daño de ADN por ensayo cometa, de acuerdo a los datos obtenidos por el grupo
expuesto a deltametrina y diesel a una concentración baja (0.5 parte de deltametrina por 65
partes de diesel), el resultado promedio del largo de la cabeza del cometa fue de 109, el largo de
la cola fue de 48, mientras que el largo total del cometa fue de 157. Obteniéndose un porcentaje
de ADN en la cabeza de 77% y en la cola un 23%, observándose en el microscopio células con
un daño. Con estos datos y anudado a la evidencia registrada con los signos manifestados por el
ensayo de toxicidad inhalatoria y los diversos hallazgos histopatológicos, que evidencian el
daño que ocasiona el uso de estos compuestos, tanto en piel como a los órganos principales, se
infiere que existe un daño significativo al ADN en células sanguíneas en ratas expuestas a
deltametrina disuelto en diesel. Por lo anterior, se indica que la utilización de la mezcla
deltametrina/diesel a dosis baja (1 parte de deltametrina: 65 parte de diesel) representa un
riesgo a la salud.
El último grupo que fue evaluado con el ensayo 412 con diesel, fue sometido a
evaluación del daño de ADN por ensayo cometa, de acuerdo a los datos obtenidos por este
grupo expuesto a deltametrina y diesel a una concentración alta (3 partes de deltametrina por 65
partes de diesel), el resultado promedio del largo de la cabeza del cometa fue de 177, el largo de
la cola fue de 254, mientras que el largo total del cometa fue de 431. Obteniéndose un
porcentaje de ADN en la cabeza de 48% y en la cola un 52%, observándose en el microscopio
células con un evidente daño. Con estos datos se infiere que existe un daño significativo al
ADN en células sanguíneas en ratas expuestas a deltametrina disuelto en diesel. A esto se añade
la evidencia registrada con los signos manifestados por el ensayo de toxicidad inhalatoria y los
informes histopatológicos, en los cuales se observaron signos de daño y alteraciones en los
tejidos al ser analizados en él microscopio. Por lo anterior, se indica que la utilización de la
mezcla deltametrina/diesel a dosis alta (3 partes de deltametrina: 65 parte de diesel) representa
un riesgo grave a la salud.
El propósito del plaguicida puede alcanzarse según datos experimentales del fabricante
con una concentración de 1:65 sin embargo el solvente ideal para este debe ser una alternativa
al actualmente utilizado en Guatemala, como lo puede ser el aceite mineral, el agua puede ser
otra alternativa sin embargo la concentración sugerida con agua como disolvente resultaría ser
inadecuadamente baja para el propósito del plaguicida.
48
Fotografía. 5. Microscopio de campo oscuro del Departamento de Citohistología
Fuente: Fodecyt 21-2010
49
PARTE IV
IV.1 Conclusiones
IV.1.1. Se determinó que existe un daño significativo al ADN en las células sanguíneas de
ratas expuestas a deltametrina con diesel, presentando un aumento del daño al
incrementar la concentración de deltametrina en la solución. Se observó un mayor daño
al ADN cuando se empleo diesel como disolvente a diferencia del aceite mineral.
IV.1.2. La dosis letal 50 fue reemplaza por el ensayo de exposición aguda, donde se estableció
que la concentración del plaguicida y disolvente fue en una relación 1:1, además en este
ensayo se evidenció que los machos fueron los sujetos más sensibles ante la exposición
inhalatoria del plaguicida con el disolvente.
IV.1.3. Se observaron signos y evidencias histológicas del daño ocasionado por la exposición
de las ratas macho al ser sometidas al ensayo de toxicidad inhalatoria, existiendo un
daño significativo cuando fueron expuestas al disolvente diesel. Con el aceite mineral
presentaron daños menores al ser sometidas al mismo ensayo.
IV.1.4. Se determinó que existe un daño primario al ADN significativo en las células
sanguíneas de las ratas expuestas a deltametrina con diesel como disolvente.
IV.1.5. El grupo expuesto a la solución de deltametrina y aceite mineral (1:65) presentó un
grado bajo de daño al ADN, mientras que los individuos sometidos a la solución de
deltametrina y diesel (1:65) presentaron un grado alto de daño primario al ADN. El
daño primario al ADN en las células es directamente proporcional con la
concentración de deltametrina disuelta en diesel.
IV.1.6. La utilización de deltametrina con el aceite mineral, como disolvente, no presentó
daños a las células individuales, es decir, que la utilización de esta mezcla , es la
idónea ya que no se evidenció riesgo de dañar al ADN; sin embargo, la exposición
continua a esta sustancia se observaron lesiones en hígado, riñones y pulmones.
IV.1.7 .El piretroide utilizado, deltametrina, combinado con el disolvente recomendado por la
casa fabricante, siendo el aceite mineral; posee una toxicidad inhalatoria subaguda
significativamente menor que con el disolvente diesel.
IV.1.8. El propósito del plaguicida puede alcanzarse según datos experimentales del fabricante
con una concentración de 1:65 sin embargo el solvente ideal para este debe ser una
alternativa al actualmente utilizado en Guatemala, como lo puede ser el aceite mineral,
el agua puede ser otra alternativa sin embargo la concentración sugerida con agua como
disolvente resultaría ser inadecuadamente baja para alcanzar la concentración del
plaguicida y que este logre su propósito.
50
IV.2. Recomendaciones
IV.2.1. Utilizar el ensayo cometa para evaluar el daño primario en ADN en poblaciones
humanas expuestas a piretroides, con el fin de establecer un panorama de riesgo de la
población guatemalteca.
IV.2.2. Reemplazar los ensayos de dosis letal 50 en estudios experimentales, por ensayos
específicos que pueden proporcionar mayor información y no solo la determinación de
la dosis.
IV.2.3. Recomendar la utilización de otro vehículo (disolvente) para la dispersión de los
plaguicidas con el fin de minimizar el riesgo de daño al ADN en la población
guatemalteca.
IV.2.4. Divulgar los resultados a las instituciones de interés, tanto científico como social, que
la utilización del diesel como disolvente o vehículo de la deltametrina, conlleva a un
mayor riesgo que el beneficio en el control de vectores.
IV.2.5. El grupo expuesto a la solución de deltametrina y aceite mineral (1:65) presentó un
grado bajo de daño al ADN, mientras que los individuos sometidos a la solución de
deltametrina y diesel (1:65) presentaron un grado alto de daño primario al ADN. El
daño primario al ADN en las células es directamente proporcional con la
concentración de deltametrina disuelta en diesel.
IV.2.6. Reemplazar la utilización de la deltametrina por un control de vectores orgánico,
debido que independientemente del disolvente; este siempre conlleva a un riesgo en su
utilización, sobretodo sino se utiliza a la concentración recomendada, no utilizando el
equipo adecuado y las recomendaciones proporcionadas por el fabricante.
IV.2.7. La exposición a piretroides conlleva un riesgo amplio por el uso inadecuado, razón por
la cual deben de divulgarse los resultados de este estudio, realizar estudios
poblacionales, concientizar a los trabajadores de las instancias de salud y educar a la
población en cumplir con las medidas de seguridad para evitar una exposición ante
sustancias químicas, que desencadenan problemas en salud a largo plazo.
51
IV.3. Referencias Bibliográficas
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53
Parte V
V.1. INFORME FINANCIERO AD-R-0013
Nombre del Proyecto:
Numero del Proyecto: 021-2010
Investigador Principal y/o Responsable del Proyecto: DRA. AMARILIS SARAVIA GÓMEZMonto Autorizado: Q346.643,00 01/02/2011
Plazo en meses 18 meses
Fecha de Inicio y Finalización: 01/02/2011 al 31/07/2012 PRÓRROGA AL 31/12/2012
Menos (-) Mas (+)
1 Servicios no personales
181
Estudios, investigaciones y proyectos de
factibilidad 132.070,00Q 130.955,00Q Q 1.115,00
181
Estudios, investigaciones y proyectos de
factibilidad (Evaluación Externa de Impacto) 8.000,00Q Q 8.000,00
191 Primas y gastos de seguros y fianzas 887,00Q 887,00Q Q -
2 MATERIALES Y SUMINISTROS
212 Alimentos para animales 8.000,00Q 7.889,00Q Q 111,00
214
Productos agroforestales, madera, corcho y
sus manufacturas 360,00Q 260,00Q 100,00Q Q -
233 Prendas de vestir 998,00Q 998,00Q Q -
241 Papel de escritorio 500,00Q 282,15Q Q 217,85
243 Productos de papel o cartón 168,60Q 200,00Q 31,40Q Q -
244 Productos de artes gráficas 1.000,00Q 1.500,00Q Q 2.500,00
261 Elementos y compuestos químicos 40.000,00Q 22.484,56Q 14.578,22Q Q 2.937,22
262 Combustibles y Lubricantes 200,00Q 800,00Q 255,00Q Q 745,00
264 Insecticidas, fumigantes y similares 1.000,00Q 750,00Q 250,00Q Q -
266 Productos medicinales y farmaceúticos 1.000,00Q 979,20Q 20,80Q Q (0,00)
267 Tintes, pinturas y colorantes 1.000,00Q 750,00Q 1.130,00Q Q 620,00
268 Productos plásticos, nylon, vinil y pvc 10.000,00Q 60,00Q 6.303,34Q Q 3.636,66
272 Productos de vidrio 2.000,00Q 1.000,00Q 2.416,56Q 3.416,56Q Q -
283 Productos de metal 5.000,00Q 5.000,00Q 8.950,00Q 8.950,00Q Q -
291 Útiles de oficina 30,00Q 26,26Q Q 3,74
292 Útiles de limpieza y productos sanitarios 2.000,00Q 2.500,00Q 3.213,05Q Q 1.286,95
295
Útiles menores, médico-quirúrgicos y de
laboratorio 2.000,00Q 8.050,72Q 10.048,64Q Q 2,08
298 Accesorios y repuestos en general 1.120,00Q 1.120,00Q Q -
299 Otros materiales y suministros 1.000,00Q 1.000,00Q Q -
3
PROPIEDAD, PLANTA, EQUIPO E
INTANGIBLES
323 Equipo médico-sanitario y de laboratorio 100.000,00Q 499,92Q 4.000,00Q 103.500,08Q Q -
GASTOS DE ADMÓN. (10%) 31.513,00Q 31.513,00Q Q -
346.643,00Q 32.202,28Q 32.202,28Q 325.467,50Q 21.175,50Q -Q
MONTO AUTORIZADO 346.643,00Q Disponibilidad 21.175,50Q
(-) EJECUTADO 325.467,50Q
SUBTOTAL 21.175,50Q
(-) CAJA CHICA
TOTAL POR EJECUTAR 21.175,50Q
Pendiente de
Ejecutar Ejecutado
FICHA DE EJECUCIÓN PRESUPUESTARIA
LINEA:
FODECYT
"Evaluación de daño primario al ADN, por ensayo cometa en células sanguíneas de ratas
expuestas a piretroides con diesel como disolvente, que se utilizan para control de vectores
en Guatemala"
Orden de Inicio (y/o Fecha primer pago):
Grupo Renglon Nombre del Gasto Asignacion
Presupuestaria
TRANSFERENCIA
40