CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA SECRETARÍA

CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA – CONCYT –

SECRETARÍA NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA – SENACYT-

FONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA – FONACYT –

UNIVERSIDAD DEL VALLE DE GUATEMALA

INFORME FINAL

EVALUACIÓN DE LA DEGRADACIÓN DE FUNGICIDAS

EN CAMAS BIOLÓGICAS

PROYECTO FODECYT No. 022-2006

ADRIAN GIL, Ph.D.

Investigador Principal

Guatemala Julio de 2011

Informe Final Evaluación de la degradación de fungicidas en camas biológicas

1

AGRADECIMIENTOS:

La realización de este trabajo, ha sido posible gracias al apoyo financiero dentro del Fondo

Nacional de Ciencia y Tecnología, -FONACYT-, otorgado por La Secretaría Nacional de

Ciencia y Tecnología –SENACYT- y el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología –

CONCYT-.


2

Equipo de investigación:

Licda. Ana Luisa Mendizábal de Montenegro

Licda. Fabiola Prado de Micheo

Br. Rossina Espósito

Dra. María del Pilar Castillo

Dr. Adrián Francisco Gil Méndez

La parte experimental se desarrolló en el Laboratorio de Instrumentación Química

Avanzada del Instituto de Investigaciones de la Universidad del Valle de Guatemala, y el

Laboratorio del Departamento de Toxicología de la Facultad de Ciencias Químicas y

Farmacia de la Universidad de San Carlos de Guatemala.

Los Plaguicidas fueron proporcionados por Agrequima.


3

CONTENIDO

página

Resumen 4

Abstract 5

Parte I

I.1. Introducción 7

I.2. Planteamiento del problema 9

I.2.1 Antecedentes en Guatemala 9

I.2.2 Justificación del trabajo de investigación 10

I.3. Objetivos e Hipótesis 11

I.3.1 Objetivos 11

I.3.1.1 General

I.3.1.2 Específicos

I.3.2 Hipótesis 11

I.4 Metodología 12

I.4.1 Localización 12

I.4.2 Preparación de las camas biológicas escala laboratorio 12

Parte II

Marco Teórico 17

Parte III

III.1 Resultados 33

III.2 Discusión de resultados 53

Parte IV

IV.1 Conclusiones

55

IV.2 Recomendaciones 56

IV.3 Referencias Bibliográficas 57

IV.4 Anexos 61

Parte V

V.1 Informe Financiero

65


4

Resumen

La aplicación de plaguicidas contribuyó significativamente a la mejora en la productividad

agrícola, sin embargo al mismo tiempo ha representado un alto riesgo de contaminación del

suelo y agua. Por esta razón es importante seguir las recomendaciones de buenas

prácticas en el manejo de plaguicidas cuando se trasvasan o diluyen. Sin embargo aún

siguiendo las recomendaciones, es posible que haya pequeños derrames de las soluciones

de plaguicidas en los lugares donde se realizan las diluciones o se trasvasan las mismas.

Una alternativa que se ha planteado es la degradación biológica de los plaguicidas

aprovechando la capacidad que los microorganismos tienen de degradar sustancias

complejas como la celulosa. Para ello se prepara sistema que tiene tierra y broza entre

otros materiales, para promover el crecimiento de microorganismos que contribuyan a la

descomposición de estas sustancias. A estos sistemas se les ha denominado “cama

biológica”. Este efecto se ha comprobado y estudiado especialmente en Suecia. Puesto

que en Guatemala, por las condiciones de temperatura y humedad se utilizan diversos

fungicidas, se presenta la evaluación de la efectividad de “camas biológicas” para la

degradación de bajas concentraciones de fungicidas, utilizando material provenientes del

campo agrícola guatemalteco.

Se estableció el proceso para preparar y caracterizar camas biológicas experimentales a

escala laboratorio. Se determinó la capacidad de retención de agua para posteriormente

tener control sobre la humedad del sistema, también la reproducibilidad en la toma de

muestra y la manera de determinar la actividad biológica mediante la absorción y

cuantificación del dióxido de carbono producido.

Así mismo, se estableció la estrategia analítica para la determinación de Clorotalonil,

Tebuconazol, Captán y Benomyl incluyendo pruebas para extraer los fungicidas

remanentes utilizando diversos solventes, y cuantificando por HPLC. Se determinó que el

Clorotalonil se degradó en un 100% en 6 días y el Tebuconazol se degradó en un 70% en

40 días. Los resultados obtenidos muestran la pronta degradación de los plaguicidas

estudiados hasta la casi desaparición del mismo en pocos días lo que confirma su

efectividad para su uso en la prevención de la contaminación del suelo, durante el proceso

de lavado y trasvase de estos plaguicidas.


5

Abstract

The application of pesticides contributed significantly to improve agricultural productivity.

However, at the same time it has represented a high risk of contamination of soil and water.

Therefore it is important to follow the best practices in pesticide management when

transferred or during the preparation of diluted solutions. Yet even when used as

recommended, there may be small spills of pesticide solutions in places where the dilutions

are made or when the aspersion tanks are filled.

An alternative that has emerged is the biological degradation of pesticides taking advantage

of the capacity that microorganisms have to degrade complex substances such as cellulose.

This systems are prepared with soil, straw and compost to allow the growth of

microorganisms that contribute to the breakdown of these pesticides. These systems have

been called "biological bed." The effect of these systems has been tested and surveyed

especially in Sweden. In Guatemala, because of the temperature and humidity conditions,

various fungicides are used. In this work, we present the evaluation of the effectiveness of

"biological beds" for the degradation of low concentrations of fungicides, using material

from the Guatemalan agricultural field.

The process to prepare and characterize experimental laboratory-scale biological beds was

established; including water holding capacity determination and the reproducibility of

sampling and the determination of the biological activity and quantification by absorbing

carbon dioxide produced.

Likewise, the analytical strategy was established for the determination of chlorothalonil,

tebuconazole, Captan and Benomyl including tests to extract the remaining fungicides

using different solvents and quantified by HPLC. It was found that chlorothalonil was

degraded by 100% in 6 days and tebuconazole was degraded by 70% in 40 days. The

results show the rapid degradation of pesticides studied to the near disappearance in a few

days confirming its effectiveness for use in the prevention of soil contamination during the

washing process and transfer of these pesticides.


6

PARTE I


7

I.1 INTRODUCCIÓN

Los plaguicidas son sustancias o mezcla de sustancias utilizadas con la finalidad de

prevenir, destruir, repeler o controlar cualquier plaga. Estas plagas pueden ser tan diversas

como insectos, animales, hierbas, hongos y virus (EPA 2011). Estas sustancias pueden ser

naturales o sintéticas. Su uso permitió el aumento sustancial en los productos cosechados, a

mediados del siglo pasado. Sin embargo su uso descontrolado propició la generación de

varios problemas, como la resistencia de las plagas a los mismos. Una de las

preocupaciones que surgieron en ese entonces fue el riesgo de la contaminación de agua y

suelo por las sustancias químicas utilizadas; especialmente porque debido a sus estructuras

normalmente complejas, es difícil su degradación.

Para disminuir los riesgos de contaminación se ha trabajado extensamente en la

capacitación para asegurar la correcta aplicación de los plaguicidas, desde el hecho de

aplicar las dosis correctas, el equipo adecuado, y también la correcta manipulación de los

recipientes cuando se cuando se trasvasa o se limpia el equipo.

Existe amplia información acerca de los procedimientos para el buen manejo de los

mismos. Sin embargo, aún cuando se siguen las recomendaciones para el buen manejo de

los plaguicidas, es inevitable que existan pequeños derrames especialmente cuando se

trasvasa el plaguicida a los instrumentos de aplicación, hay que considerar que usualmente

el trasvase se realiza siempre en el mismo lugar por lo que se puede generar una zona de

alta concentración.

Los procesos de degradación de plaguicidas incluyen la acción de la radiación ultravioleta,

el procesamiento en plantas y animales. Pero también desde hace años se conoce la

capacidad de los microorganismos del suelo para degradar los plaguicidas pero hasta

recientemente se han realizado estudios para poder establecer sistemas que contribuyan a

esa degradación.

Es interesante anotar que actualmente al mismo tiempo del interés por propiciar los proceso

de degradación de los plaguicidas en el suelo, existe preocupación por el hecho de que en

los lugares donde se han aplicado plaguicidas, se podría favorecer el crecimiento de

microorganismos que metabolicen muy rápidamente estos compuestos con el riesgo de

disminuir su efectividad en el control de plagas.

Para favorecer la degradación de los plaguicidas, en Suecia se diseñaron sistemas que

contienen una especie de filtro biológico con diversos materiales, incluyendo especialmente

tierra y elementos nutrientes que contribuyan al desarrollo de los microorganismos. Estos

sistemas en general se les ha denominado “biobeds” o camas biológicas. A la fecha ya

existen documentos guía para construir estos sistemas (Fogg 1997).


8

Las camas biológicas son sistemas en los que se favorece el crecimiento de hongos capaces

de degradar los plaguicidas para que si ocurre un derrame, el plaguicida pueda ser

descompuesto y no alcance el manto freático ni se acumule en el suelo. En general las

camas biológicas son construidas utilizando un agujero en el suelo, el cual se rellena con

capas de arcilla, cal y una mezcla de paja-tierra-broza. En la parte superior se siembra

grama para favorecer la distribución de los plaguicidas derramados y regular la humedad.

Existen diversos diseños para las mismas pues se procura reutilizar materiales disponibles

en el área para que su construcción sea de bajo costo.

Estos sistemas se han implementado de manera más o menos empírica en diferentes países,

en Suecia se han desarrollado estudios específicos. En Guatemala, la Asociación del

Gremio Químico Agrícola (Agrequima) ha impulsado su uso y su estudio, dentro de toda

la parte de difusión de buenas prácticas en el uso de plaguicidas.

Actualmente se han realizado numerosas investigaciones sobre el destino de varios

plaguicidas cuando se utilizan camas biológicas. En Guatemala no existen estudios en ese

sentido, por esa razón es que se consideró realizar este estudio, además considerando que

en nuestro campo agrícola se utilizan fungicidas puesto que los hongos son una plaga

importante por las condiciones climáticas propias.

Por esto el trabajo presentado busca evaluar la degradación de fungicidas en nuestro medio,

puesto que estos, están diseñados específicamente para eliminar los hongos presentes, cabe

cuestionar si sus características podrían impedir la degradación de estos compuestos.

Dentro de este estudio se inició con la preparación de camas biológicas a escala laboratorio,

para tener control de la temperatura y humedad. En estos sistemas se utilizó una mezcla de

tierra y broza de caña, para tener composición similar a la que se podría preparar en un

sistema a mayor escala. Puesto que la capacidad de retener agua, depende de la

composición del suelo, se determinó esta capacidad en el suelo y luego en todos los

sistemas se mantuvo la humedad constante.

Puesto que el interés es establecer la acción de los fungicidas en un sistema comparable al

que se utiliza en campo, las concentraciones de fungicidas fueron las utilizadas en la

aplicación de estos químicos.

Se evaluó la actividad biológica, mediante la determinación de la producción de dióxido de

carbono, como indicador de la degradación de materia orgánica por procesos biológicos.

Para ello se capturó el dióxido de carbono en trampas de hidróxido de sodio. Con ello se

pudo observar que la actividad fue mayo en presencia de plaguicidas.

El seguimiento de la degradación se realizó midiendo la cantidad de plaguicida presente en

la “cama biológica” en el tiempo mediante cromatografía, no se realizó el estudio o

caracterización de los metabolitos producidos. Se realizaron pruebas de extracción para

seleccionar los solventes adecuados, y las mejores condiciones para cuantificar la presencia

de los plaguicidas. Los resultados confirman la efectividad de estos sistemas para degradar

plaguicidas.


9

1.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

1.2.1 ANTECEDENTES EN GUATEMALA

Para evitar la contaminación del medio ambiente cuando se utilizan plaguicidas, es

indispensable que los mismos se utilicen a las concentraciones y dosis recomendadas;

además que se sigan cuidadosamente los procedimientos de dosificación y manejo seguro.

Sin embargo, se ha encontrado que en el trabajo normal de la aplicación de plaguicidas,

existe otra fuente de contaminación originada por los pequeños derrames accidentales.

Estos, son los pocos mililitros que se derraman durante el trasvasado de la solución de

plaguicidas o en el lavado de los instrumentos de trabajo. Cuando La alta concentración

facilita que residuos de los plaguicidas alcancen niveles freáticos o se acumulen en el suelo.

En Guatemala, la Asociación del Gremio Químico Agrícola (Agrequima) se ha ocupado de

la implementación de estos sistemas en el campo, desarrollándolos bajo el nombre de

“biodep”; sin embargo no existen todavía datos concretos de su funcionamiento en

nuestras condiciones. Por ejemplo es de importancia conocer el impacto que tiene el uso de

fungicidas, que es distinto que en los países ubicados a mayor latitud.

En Guatemala, Agrequima ha impulsado la construcción de camas biológicas en dos

diseños: uno es llamado propiamente “cama biológica” con su parte superior a ras del

suelo, y otra denominada “mesa biológica con su parte superior elevada, diseñada para

retener los derrames en aspersores, esquemas de ambos diseños se muestran en la figura 1.

Figura 1.

Esquemas de dos diseños de cama biológica

Fuente: Agrequima, 2004


10

I.2.2 JUSTIFICACION DEL TRABAJO DE INVESTIGACION.

En el trabajo de campo es inevitable que existan pequeños derrames cuando se trasvasan los

plaguicidas tanto concentrados para diluir como diluidos para trasvasar a los recipientes que

van a servir para su aspersión. Usualmente el trasvase se realiza en el mismo lugar por lo

que se genera una zona de alta concentración.

En Guatemala, Agrequima se ha ocupado de la implementación de los sistemas de camas

biologicas en el campo, pero no existen todavía datos concretos de su funcionamiento en

nuestras condiciones de suelo y clima, ni tampoco datos del impacto que genera el uso de

fungicidas sobre los hongos que forman las camas biológicas y que actúan en la

degradación de los plaguicidas.


11

I.3 OBJETIVOS E HIPOTESIS.

I.3.1 OBJETIVOS

I.3.1.1 General

Evaluar el funcionamiento de las camas biológicas cuando se utilizan fungicidas.

I.3.1.2 Específicos

Construir camas biológicas experimentales, que sirvan para estudios permanentes.

Establecer la metodología cromatográfica adecuada para el análisis de fungicidas

Revisar el diseño actual de las camas biológicas usadas en Guatemala.

Determinar el porcentaje de recuperación de cinco plaguicidas en camas biológicas.

Elaborar un documento detallado para la construcción y uso de las camas biológicas.

I.3.2 HIPÓTESIS.

Los microorganismos presentes en una cama biológica son capaces de degradar el nivel

normal de utilizado de fungicidas.


12

I.4 Metodología.

I.4.1 Localización

La elaboración de las camas biológicas experimentales así como el monitoreo de la

producción de dióxido de carbono, se llevo a cabo en las instalaciones de la Universidad del

Valle en el edificio C de laboratorios (Latitud 14º 36' 14.54" N; 90º 29' 22.57" O,

elevación 1517msnm. temperatura minima 20 C y máxima 23C y humedad relativa

promedio de 54%)

La parte de análisis químico de los fungicidas se llevo a cabo en las instalaciones del

Laboratorio de Instrumentación Química Avanzada Edificio II1 de la Universidad del Valle

de Guatemala (Latitud 14º 36' 14.54" N; 90º 29' 22.57" O, elevación 1517msnm.)

temperatura minima 20 C y máxima 23C y humedad relativa promedio de 54%) y en el

Laboratorio de Toxicología de la Universidad de San Carlos de Guatemala (Latitud 14º 38'

45.20" N; 90º 30' 44.73" O, elevación 1497.8msnm temperatura minima 20 C y máxima de

27 C con humedad relativa de aprox. 64%).

I.4.2 LAS VARIABLES

I.4.2.1 Variables Dependientes

Temperatura ambiental.

Concentración de hongo en la cama experimental.

I.4.2.2 Variables Independientes

Humedad en las cajas donde se encuentra la cama biológica experimental.

Concentración del fungicida.

I.4.3 Preparación de las camas biológicas escala laboratorio

Se prepararon camas biológicas en recipientes impermeables, colocando cantidad constante

de la mezcla. Se determinó el índice de retención de agua y luego se añadió suficiente agua

para que la tierra tuviera el 60% del valor humedad.

Para a evaluación de la degradación de los plaguicidas, se tomaron porciones de tierra

equivalentes con un muestreador cilíndrico. Se preparó un sistema de referencia al que no

se le agregó plaguicida alguno y se utilizó para establecer la línea base de la producción de

dióxido de carbono y también durante el proceso de extracción y cuantificación de los

plaguicidas.


13

I.4.3.1 Contenido de humedad

(método proporcionado por la Dra. María del Pilar Castillo)

Pesar una cápsula.

Pesar aproximadamente 5 gramos de muestra en la cápsula.

Secar durante la noche a 105 °C

Sacar del horno y colocar en un desecador para dejar enfriar.

Pesar.

(pc+ms). - (pc).

% Materia seca = ______________

(pc+mh).- (pc).

donde:

(pc).= peso de la cápsula

(pc+mh).= peso de la cápsula más el material

húmedo

(pc+ms). = peso de la cápsula más el material

seco

% humedad = 100 - % materia seca

I.4.3.2. Determinación de Water Holding Capacity (WHC)

(método proporcionado por la Dra. María del Pilar Castillo)

Para la determinación del WHC se hace uso de tubos de plástico (3.5 a 4 cm de

diámetro y 6.5 cm de alto) con una net de nylon atada al fondo con una liga.

Se llenan los tubos casi hasta el borde con el suelo.

Para compactar la muestra se golpea el tubo suavemente sobre la mesa unas 5 a 6

veces.

Los tubos con la muestra se colocan en un recipiente con agua por 2 días (altura del

agua 1 – 1.5 cm).

Al cabo de los dos días se trasladan los tubos sobre una pariila y se deja que el agua

escurra por unas 5 horas.

Vaciar el contenido del tubo en una cápsula (pre-pesada) y pesar.

Secar la cápsula mas la muestra a 105°C durante la noche.

Determinar el peso seco.

El peso seco y la humedad de la muestra determinadas a éstas condiciones representan

el 100% de la capacidad de la muestra.

I.4.3 Ensayos químicos:

a. Identificación: Para la identificación de la longitud de onda máxima a utilizar para

el análisis por Cromatografía Líquida (HPLC) de los fungicidas incluidos en el presente

estudio, se determinó el espectro de cada uno en la región Ultravioleta-Visible (UV/VIS).

b. Cuantificación del principio activo: Se buscó estandarizar un procedimiento con el

equipo de HPLC acoplado a un detector UV/VIS según el trabajo a continuación descrito:

se disolvieron los estándares en metanol, luego se tomó una alícuota la cual fue filtrada

a través de un filtro para soluciones orgánicas de 0.2um a un vial previo a su inyección en

el HPLC.


14

I.4.4.1 Determinación de longitud de onda de máxima absorbancia.

De acuerdo a su solubilidad, se prepararon soluciones concentradas de 1 mg/mL de

clorotalonil y tebuconazol en acetona, el captan en diclorometano y el benomyl en

cloroformo. A partir estas, se hicieron diluciones en metanol (0.01mg/mL), usadas para el

análisis UV/VIS, estableciendo los picos de máxima absorbancia en un intervalo de

longitud de onda de 190 a 400 nm.

I.4.4.2 Determinación de las condiciones analíticas para cuantificación.

Para el desarrollo del método analítico empleando HPLC y basado en los datos anteriores,

obtenidos por espectroscopia UV-VIS, así como en la literatura revisada, se prepararon

estándares con cada uno de los fungicidas a estudiar y con esto se probaron diferentes fases

móviles, diferentes columnas y longitudes de onda, tratando de obtener la máxima

respuesta posible para cada uno de ellos y se optimizaron así las condiciones de separación

de los mismos (Tabla 15).

De las soluciones concentradas (1mg/mL), se hicieron diluciones de 0.01 mg/mL de cada

uno de los fungicidas con la fase móvil correspondiente.

De las columnas usadas y fases ensayadas, los mejores resultados obtenidos fueron

empleando la columna C18, hypersil ODS; y de las fases, para la determinación de

clorotalonil acetonitrilo: agua (70:30) a 231 nm, y para tebuconazol acetonitrilo: agua

(50:50) a 223 nm. Para el Benomyl y Captan por razones de tiempo se excluyeron del

estudio.

Al tener ya establecidas las condiciones analíticas, se realizaron estudios de recuperación

fortificando muestras de biomezcla, con 60% de humedad, por separado con cada uno de

los dos fungicidas. También se prepararon curvas de calibración de cada uno de ellos para

obtener los datos de linealidad y cuantificación de las muestras.

Con los fungicidas a usarse en las camas biológicas (clorotalonil y tebuconazol) para

evaluar su degradación; se iniciaron los ensayos de las camas biológicas aplicando cada

uno de ellos por separado; y de acuerdo al plan de muestreo, se hicieron los análisis

correspondientes cada quince días determinando el porcentaje de degradación de los

mismos, tomando como base el resultado obtenido en el primer muestreo al momento de

asperjarlas (tiempo 0). Al mismo tiempo se tomó una muestra control sin los hongos y sin

los fungicidas.

I.4.4.3 Análisis de la biomezcla

Las muestras de biomezcla se pesaron en frascos de vidrio con tapón hermético, se les

agregó el volumen del solvente indicado en las tablas (2 a 14); los frascos se agitaron por

una hora en un agitador rotatorio. Los extractos metanólicos se filtraron a través de sulfato

de sodio anhidro y de filtros de 0.2 um, recibiendo el filtrado en viales sellados y

almacenados en refrigeración hasta el momento de su análisis.

En el caso de los extractos con diclorometano, se llevó a sequedad 1 mL de cada muestra

bajo corriente de nitrógeno a una temperatura inferior a 40˚C y posteriormente se


15

reconstituyo con 1 mL de la fase móvil correspondiente y se filtro a través de membrana de

0.2 um a viales, sellados y almacenados en refrigeración.

Las muestras fueron posteriormente inyectadas en triplicado en el HPLC alternándolas con

los estándares correspondientes.

I.4.5 Análisis estadístico

La prueba estadística que se utilizó en este trabajo fue la de mínimos cuadrados en base a la

cual se calculó la concentración de las muestras y luego promedios y desviación estándar de

las diferentes replicas que se trabajaron.


16

PARTE II


17

MARCO TEÓRICO

Se ha encontrado que en el trabajo normal de la aplicación de plaguicidas, existe otra fuente

de contaminación originada por los pequeños derrames accidentales. Estos, son los pocos

mililitros que se derraman durante el trasvasado de la solución de plaguicidas o en el lavado

de los instrumentos de trabajo. Cuando La alta concentración facilita que residuos de los

plaguicidas alcancen niveles freáticos o se acumulen en el suelo. En la figura siguiente

tomada de una presentación explicativa de las camas biológicas, da una idea de la

contaminación producida por diferentes aspectos del proceso en el trasvase de sustancias y

lado de equipo.

Figura 2 Posibles fuentes de contaminación en el área de trabajo

Fuente: Bayer CropScience Cherwell Study

II.1 Construcción de camas biológicas

Las camas biológicas en su diseño original consisten en un agujero en el suelo de 60 cm. de

profundidad el cual es rellenado por una capa de arcilla al fondo, una biomezcla de paja,

suelo y turba y una capa de grama en la superficie. Se puede incluir una rampa para el

estacionamiento del equipo de aspersión (Fig. 2).


18

Figura 3. Diagrama de una cama biológica

Fuente: (Uppsala BioCenter)

La típica biomezcla sueca consiste de paja, suelo y turba en una proporción de 50-25-25 %

en volumen. El suelo provee de capacidad de retención y de microorganismos degradadores

de pesticidas. La turba provee también con una alta capacidad de retención y mantiene la

humedad del sistema. La capa de grama en la superficie contribuye con el equilibrio de la

humedad por evapo-transpiración y sirve además como un indicador de derrames de

pesticidas ya que mata el césped de la superficie generando zonas decoloradas. (Uppsala

BioCenter)

Existen varios diseños utilizados para la construcción de camas biológicas. Uno de las

diferencias importantes son las camas biológicas selladas y las que son abiertas. En las

abiertas, que es el diseño original desarrollado en Suecia, las sustancias pasan a través del

sistema y el lixiviado se integra directamente en el suelo. En cambio en los sistemas

cerrados la solución que queda en el fondo del sistema debe ser bombeado para extraerlo.

En la figura 3 se muestra la comparación esquemática de estos diseños.

Se ha discutido la conveniencia de que la parte inferior de la cama biológica esté cerrada,

con el objeto de evitar que plaguicidas con alta movilidad puedan atravesar la capa de

arcilla. Sin embargo esto presenta varios problemas ya que se anega fácilmente con la

lluvia, por otro lado si se le protege de la lluvia, la parte superior se vuelve impermeable al

tener poca movilidad de los plaguicidas derramados, evitando su degradación (Fogg P.

2004b). Por esta razón lo recomendable es el diseño de camas biológicas abiertas, pero se


19

hace necesario el monitoreo apropiado para asegurarse que efectivamente los plaguicidas

sean degradados. Otra solución es cubrir parcialmente el sistema y que se encuentre a una

altura un poco superior del nivel del suelo.

Figura 4. Modelo de cama biológica abierta y cerrada

Fuente http://biobed.org

En las camas o mesas biológicas recién construidas, los materiales se hunden como 10 cm

al año; se recomienda entonces, remover la capa de grama, llenar nuevamente con la

mezcla, y luego volver a sembrar la grama. Es necesario reparar cualquier daño que tenga

la cobertura de grama, se sugiere reemplazarla antes de que inicie la temporada de siembra

o de invierno. (Agrequima)

El contenido de humedad es importante. Debe ser lo más alto posible para permitir la

actividad de los microorganismos que degradan los productos químicos, pero no tan alto

que la filtración de productos para la protección de cultivos se vuelva un riesgo. Se ha

encontrado que un contendio de 60% de la capacidad de retención de agua permite el nivel

más alto de disipación de la mayoría de pesticidas. Mientras en pruebas realizadas a 30 y

90 % de la capacidad de retención de agua, dieron como resultado una limitada actividad

microbiana (Castillo M, 2008).

De acuerdo a las experiencias de Suecia, las camas tienen una vida útil entre 5 a 8 años,

luego de este tiempo la mezcla paja-tierra-broza, debe cambiarse. La mejor época para

http://biobed.org/


20

cambiar la mezcla, es inmediatamente antes de que inicie la nueva temporada de

aspersiones. (Agrequima)

El material que se saca de las camas biológicas debe colocarse encima de un plástico

grande, con el propósito de evitar que los posibles residuos de productos para la protección

de cultivos que existan no lleguen al suelo, y para cubrir el material en caso de lluvia.

En este estudio se desarrolló la metodología para el estudio de la degradación de

plaguicidas en camas biológicas a escala laboratorio. Se probó el seguimiento de la

actividad biológica midiendo la generación de dióxido de carbono. Se estableció también

la metodología para la determinación por cromatografía, trazando curvas de calibración,

determinando porcentajes de recuperación con diferentes solventes. El desarrollo de la

metodología para la cuantificación cromatográfica fue la parte más complicada y debido a

ello al final únicamente se pudo establecer completamente la degradación de dos

plaguicidas. Para los otros plaguicidas no fue posible implementar la metodología

apropiada.

Los niveles de degradación encontrados son muy buenos ya que si en otros estudios se hace

el seguimiento de la degradación durante meses, en este caso en pocas semanas ya no era

posible detectar la presencia de los plaguicidas.

II.2 Funcionamiento de las camas biológicas

Figura 5. esquema de la acción de las enzimas en la degradación

Fuente: Adaptado de Hofrichter, M y Papinutti, 2003

Aprovechando la capacidad de degradación de plaguicidas por microorganismos, Desde


21

hace algunos años se ha investigado la disminución en el impacto ambiental de estos

derrames de plaguicidas al utilizar los sistemas llamados “camas biológicas”. Se ha

documentado la degradación de distintos plaguicidas en estos sistemas incluyendo diversos

herbicidas, insecticidas y fungicidas. Algunos estudios han logrado monitorear el

comportamiento de estos sistemas durante varios años (Tortensson, L. 2000)

La degradación de los plaguicidas en el suelo implica diferentes procesos, además de los

procesos de degradación biológica también se desarrollan fenómenos de degradación

abióticos, como procesos de hidrólisis, oxidación, reducción e isomerización, que en

conjunto ayudan a la degradación de los plaguicidas (McBride 1994).

La degradación de plaguicidas por microorganismos es conocida hace algunos años, se ha

tratado de establecer el mecanismo de la degradación, con la identificación de plásmidos de

algunos microorganismos (Don, R. 1981). A pesar de la eficiencia de los

microorganismos por degradar casi cualquier estructura, existen algunas que son

especialmente difíciles de descomponer y permanecen en el ambiente por mucho tiempo,

tal es el caso de los bifenilos policlorinados (PCBs). Esta dificultad para degradar este tipo

de compuestos se atribuye al efecto combinado de su poca solubilidad en agua y que tiene

pocos sitios posibles para el ataque enzimático, aunque la degradación microbiológica de

los mismos ha sido mostrada (Farley, K. 1994), por ejemplo se ha estudiado que la

degradación del tres hidrocarburos cíclicos, fenantreno, pireno y benzopireno siguiendo

conjuntamente los niveles de actividad de la lignina peroxidasa y manganeso peroxidasa

(Wang C. 2009)

Las camas biológicas funcionan por los mecanismos anteriores. Aunque se ha observado

un aumento sustancial en la degradación cuando se ha inoculado el hongo Phanerochaete

chrysosporium (von Wirén-Lehr 2001). Estos hongos producen unas enzimas llamadas

lignina peroxidasas y manganeso peroxidadas; estas enzimas son capaces de degradar la

lignina. El P. chrysosporium, es llamado hongo de descomposición blanca pues al degradar

la lignina de la madera, deja prácticamente intacta la celulosa por lo que queda luego de la

descomposición es blanca. La Lignina tiene una estructura química compleja, tal como se

muestra en la figura. Algunas de las estructuras de los plaguicidas son similares al de la

lignina, quizá por ello el Phanerochaete chrysosporium ha mostrado capacidad para la

descomposición de plaguicidas. Parte de la función de la paja y broza agregada en la

mezcla de la cama biológica tiene la función de proporcionar alimento accesible a los

microorganismos. Por esa razón se ha recomendado dejar reposar la mezcla al ambiente

por varias semanas previo a la preparación de la mezcla (Fogg, P 2004a).

La producción de las enzimas arriba mencionadas no es completamente estable, pero dentro

de las recomendaciones para la buena producción se encuentra que la temperatura debe

estar entre 25 a 39°C, que existan trazas de elementos como hierro, manganeso, calcio,

cinc, cobre; así como asegurar una fuente de nitrógeno y carbono. Se ha utilizado tartrato

de amonio, glucosa o glicerol. El pH que se considera óptimo está entre 4.2 a 6.2.

También se ha mostrado que la producción es mejor cuando el hongo está inmovilizado

(Sing D., 2008)


22

Figura 6. Comparación entre la estructura de la Lignina (a) y dos plaguicidas (b)

carbendazim (c) propineb

a

b

c

Fuente:(Lignin institute 2001)


23

Tabla 1. Plaguicidas degradados en camas biológicas

plaguicida tipo Referencia

dimethoato acaricida b, d

chlorpyrifos acaricida, insecticida, nematicida d

clorotalonil fungicida b, d

epoxiconazol fungicida d

fenpropimorph fungicida a, c

propiconazol fungicida a, c

tolyfluanid fungicida a

diflufenican herbicida c

MCPA herbicida a

mecoprop herbicida a, b, d

metazachlor herbicida a, c

metabenzthiazuron herbicida a. c

terbutilazine herbicida a, c

terbutryn herbicida a

benzatone herbicida a

clopyralid herbicida a

cianazine herbicida a

diclorprop herbicida a

ethofumesate herbicida a

fluroxypyr herbicida a, c

isoproturon herbicida e, d

linuron herbicida a

metsulfuron-methyl herbicida b, d

pendimethalin herbicida d

deltamethrin Insecticida a

esfenvalarate Insecticida c

lambda-cyhalothrin Insecticida a

pirimicarb Insecticida a, c

cifluthrin Insecticida a

a. Torstensson L. 1997

b. Fogg, P. 2004

c. Torstensson L. 2000

d. Fogg. P. 2004b

e. von Wirén-Lehr, S. 2001

La estructura química de los plaguicidas en muchos casos favorece su adsorción en el

sustrato sobre todo en el caso de los plaguicidas que no son completamente solubles en

agua. El hecho de que sean más o menos hidrofóbicos, afecta los coeficientes de partición

y consecuentemente, su distribución en el sustrato, efectos y posterior destino. En el caso

de sustancias sin carga, se ha establecido el parámetro llamado “coeficiente de partición de

carbono orgánico” puesto que la adsorción en la suspensión de suelo es debida al carbono

(Elzerman A. 1987). Por ello es importante establecer un método para asegurarse de la

desorción de cualquier remanente de los plaguicidas.


24

La degradación de tebuconazol y propiconazol ha sido también estudiada en madera de

desecho que originalmente fue tratada con estos plaguicidas, en este caso la degradación es

sumamente lenta, esperado por la alta concentración original (Woo, 2010)

Por otro lado las camas biológicas tienen suelo, normalmente del mismo lugar, que

contribuye con la carga microbiológica, además de sitios adecuados para la retención de

plaguicidas. Es importante para el funcionamiento de las camas biológicas que estas

cuenten con una fuente suplementaria de carbono; se ha probado con diferentes materiales,

sin embargo lo que mejor ha funcionado es la paja del trigo en donde se han realizado los

estudios (Morgan, P. 1993) sin embargo en las pruebas realizadas en latinoamérica, se han

utilizado otros materiales, como caña (Castillo M. 2008).

Las camas biológicas tienen una vida útil de aproximadamente 5 años. Luego de lo que se

debe renovar el material de la misma. El material excavado se coloca sobre plástico

impermeable al aire libre para favorecer la descomposición de los residuos que quedaran

adsorbidos.

Los estudios para la determinación de plaguicidas degradados en camas biológicas son

diversos, y en la tabla 1 se presentan ejemplos de ellos así como el tipo de plaguicida.

II.3 Propiedades de los fungicidas que se estudiarán

II.2.1 Propiedades del Clorotalonil

El clorotalonil es un fungicida de amplio espectro, se utiliza principalmente en agricultura y

también en plantas ornamentales. Los productos en los que se utiliza incluye cítricos,

grosellas, arándanos, fresas, plátano, vid, lúpulo, tomate, verduras, tabaco, café, té, soja,

maní, patatas, cebollas, cereales y remolacha azucarera.

Status: ISO 1750

IUPAC: tetracloroisoftalonitrilo

CAS: 2,4,5,6-tetracloro-1,3-bencenodicarbonitrilo

Reg. No.: 1897-45-6

Formula: C8Cl4N2

Actividad: fungicida (fungicida aromático)


25

Figura 4. Estructura química del Clorotalonil

InChI: InChI=1/C8Cl4N2/c9-5-3(1-13)6(10)8(12)7(11)4(5)2-14

Propiedades Físicas

Peso Molecular : 265.9

Propiedades : Cristales Blancos

Punto de fusión : 250-251 °C

Punto de ebullición : 350 °C

Presión de vapor : < 9.2mmHg/170.4c

Solubilidad (en solución 1 l) :

o Agua : 0.6ppm / 25c

o Acetona : 20g

o Ciclohexano : 30g

o Dimetil formaldehído : 30g

o Dimetil sulfoxido : 20g

o kerosina : menos de 10g

o xileno : 20g(Kg.)

II.2.2 Propiedades del Tebuconazol o Folicur

Status: ISO 1750

IUPAC: (RS)-1-p-clorofenil-4,4-dimetil-3-(1H-1,2,4-triazol-1-ylmetil)pentan-3-ol

CAS: α-[2-(4-clorofenil)etil]-α-(1,1-dimetiletil)-1H-1,2,4-triazol-1-etanol

Reg. No.: 107534-96-3

Formula: C16H22ClN3O

Actividad: fungicida (fungicida conazol )

http://www.alanwood.net/pesticides/class_fungicides.html#conazole_fungicides


26

Figura 5, Estructura química del Tebuconazol

InChI: InChI=1/C16H22ClN3O/c1-15(2,3)16(21,10-20-12-18-11-19-20)9-8-13-4-

6-14(17)7-5-13/h4-7,11-12,21H,8-10H2,1-3H3/t16-/s3

Propiedades

Físicas

Peso molecular: 307.8

Propiedades: Cristales incoloros

punto de fusión es de 102.4 °C

densidad relativa es de 1.25 a 26 °C

Presión de vapor: presión de vapor de 1.7 X 10 -3

mPa a 20 °C

Punto de fusión: 102.4°C

Punto de ebullición: No aplicable

Solubilidad:

o agua a 20ºC 32mg/l a 20 °C.

o diclorometano,

o isopropanol,

o tolueno

o hexano.

Esta sustancia es estable a altas temperaturas.

II.2.3 Propiedades del Captan

Aplicado contra un amplio intervalo de hongos, posiblemente es de los fungicidas más

utilizados. No tiene actividad insecticida ni acaricida.

Status: ISO 1750

IUPAC: N-(triclorometiltio)ciclohex-4-ene-1,2-dicarboximida

CAS:

3a,4,7,7a-tetrahydro-2-[(triclorometil)tio]-1H-isoindol-1,3(2H)-diona

(No. 133-06-2)

Reg. No.: 133-06-2

Formula: C9H8Cl3NO2S

Actividad: fungicida (fungicida ftalamida)


27

Figura 6. Estructura química del Captan

InChI: InChI=1/C9H8Cl3NO2S/c10-9(11,12)16-13-7(14)5-3-1-2-4-

6(5)8(13)15/h1-2,5-6H,3-4H2

Propiedades

Físicas

Peso Molecular: 300.6

Propiedades: sólido cristalino blanco (cuando esta puro) Polvo

amarillo amorfo (material técnico)

Punto de fusión: 178°C cuando tiene una pureza de 93-95% y

técnico 160-170°C.

Presión de Vapor: (volatilidad) De el compuesto puro es de 1 x 10-5

torr a 25°C y del técnico es mucho más alta.

Solubilidad

o Agua es prácticamente insoluble <O.5 mg/l así como en

aceites de petróleo

o Solventes orgánicos comunes 10 y 100 mg/l

Es estable a temperatura normal a excepción cuando está bajo

condiciones alcalinas

Se descompone a aproximadamente 100°C, lentamente en

ambiente seco pero rápidamente en ambiente húmedo.

Es un compuesto no corrosivo pero forma productos de

descomposición que si son corrosivos.

II.2.4 Propiedades del Benomyl

Controla un amplio espectro de hongos en frutas, nueces, vegetales, campos agrícolas y

ornamentales. También es efectivo contra las polillas.

Modo de acción: el benomil y su metabolito principal, carbendazim, se unen a los

microtúbulos, estructuras esenciales de las células, interfiriendo en sus funciones, como la

división celular, transporte intracelular etc.

Status: ISO 1750

IUPAC: metil 1-(butilcarbamoil)benzimidazol-2-ylcarbamato

CAS:

metil [1-[(butilamino)carbonil]-1H-benzimidazol-2-yl]carbamato

(No.17804-35-2)


28

Reg. No.: 17804-35-2

Formula: C14H18N4O3

Actividad:

acaricida (acaricida carbamato)

fungicida (fungicida benzimidazol y benzimidazolilcarbamato)

nematicida (nematicida carbamato)

:

Figura 7. Estructura química del Benomyl

InChI:

InChI=1/C14H18N4O3/c1-3-4-9-15-13(19)18-11-8-6-5-7-10(11)16-

12(18)17-14(20)21-2/h5-8H,3-4,9H2,1-

2H3,(H,15,19)(H,16,17,20)/f/h15,17H

Propiedades

Físicas

Peso Molecular: 290.4

Propiedades: Cristales de ligero color café

Punto de Fusión: 140 °C

Punto de Ebullición:

Presión de Vapor: menor de 5 x 10-6

Pa

Solubilidad:

o Agua a 25 °C y pH 5 3.6 mg/L

o Heptano 40 g/100g solvente a 25 °C

o Cloroformo 9.4 g/100g solvente a 25 °C

Se hidroliza rápidamente en soluciones acuosas diluidas y en el suelo

a isocianato de butilo y a carbendazim.

Se descompone por ácidos y bases fuertes.

Es estable a la luz

II.2.5 Propiedades del Isoproturon

En este estudio, el isoproturon fue utilizado como estándar interno.

Status:

ISO 1750 (published)

IUPAC: 3-(4-isopropilfenil)-1,1-dimetilurea o

3-p-cumenil-1,1-dimetilurea

CAS: N,N-dimetil-N′-[4-(1-methiletil)fenil]urea


29

Reg. No.: 34123-59-6

Formula: C12H18N2O

Activity: algicida

herbicida (herbicida de fenilurea)

estructura:

InChI: InChI=1S/C12H18N2O/c1-9(2)10-5-7-11(8-6-10)13-12(15)14(3)4/h5-9H,1-

4H3,(H,13,15)

(Wood, A. 2010)

En la tabla 3, se muestran algunos otros de los fungicidas de uso frecuente en Guatemala,

junto con su estructura. Se puede apreciar que en general todos contienen nitrógeno en su

estructura, lo que es posible sirva como fuente de este elemento para la síntesis de las

enzimas que conllevan a su degradación por microorganismos.

Tabla 3. Fungicidas de uso común en Guatemala

Fungicidas Grupo funcional estructura

mancoceb Ditiocarbamato polimérico

a

propineb Ditiocarbamato polimérico


30

ziram ditiocarbamato

cimoxanil Nitrógeno alifático

matalaxyl Ácido acilamino

fenamidona imidazol

II.4 Métodos analíticos

II.4.1 Clorotalonil

Las muestras son extraídas con algún solvente orgánico como acetona. En la mayoría de

casos el análisis se realiza utilizando cromatografía gas-liquida utilizando un detector de

captura de electrones. Esto proporciona suficiente sensibilidad para el análisis de trazas de

residuos de clorotalonil a límites hasta 0.01 mg/kg . En algunos casos se determina

utilizando un método multi-resíduo y el porcentaje de recuperación entre 89-104 %.

II.4.2 Tebuconazol

La muestra se extrae utilizando una solución acetona/agua y el compuesto particionado en

diclorometano. Despues de limpiarlo en un acolumna Florisil, el residuo se determina por

GLC utilizando un detector de ionización de llama alcalina. El límite de detección

obtenido es de 0.05 mg/kg con una recuperación de 87.4%.


31

II.4.3 Captan

Se utiliza el cromatografía gas-líquido para la determinación de varios fungicidas,

incluyendo captan, folpet, captafol, vinclozolin e iprodion.

Las muestras han sido estraídas con acetate de etilo en pesencia de ácido fosfórico y

acetato de etilo evaporado y disuelto en diclorometano para limpiarlo por cromatotrafía de

permeación en gel. Luego se continua limpiado con una columna pequeña de Nuchar/silica

gel. El eluato se pasa en una columan de Florisil para tener una solución lista para la

determinación de captan. CEl captan se determino con GLC con un detector fotométrico

en l modo de sulfuro. El límite de detección es cercano a 0.01mg/kg (FAO 1999).

II.4.4 Benomyl

La mayoría de métodos para determinar benomyl y los residuos de sus productos de

degradación en plantas y suelo, involucra la extracción con un solvente orgánico,

purificación del extracto y conversión del residuo a carbendazim. Los residuos pueden

determinarse con el uso de procedimientos cromatografía líquida, HPLC de fase reversa


32

PARTE III


33

III.1 Resultados

III.1.1 Camas Biológicas

Se prepararon camas biológicas a escala laboratorio utilizando recipientes de material

plástico y tierra mezclada con fragmentos de hoja de caña, aunque en los estudios previos,

el material que se utiliza es paja del trigo, en Guatemala el cultivo de trigo es poco, en

cambio el de caña es muy extendido. La tierra fue proporcionada por Agrequima. En este

caso la tierra no fue esterilizada puesto que el hongo no fue inoculado externamente. La

tierra fue homogeneizada mezclándola antes de colocarla en las camas biológicas.

El muestreo se realizó tomando secciones de tierra de la cama biológica, para proceder a la

extracción y posterior cuantificación.

En la foto No. 1 se muestra uno de los sistemas utilizados como cama biológica

experimental.

Foto No. 1 Sistema utilizado para la cama experimental

Fuente: Fodecyt No. 022-2006


34

III.1.2 Capacidad de retención de agua (water holding capacity)

Se determinó la capacidad de retención de agua en la mezcla utilizada para preparar las

camas biológicas, para posteriormente mantener un porcentaje constante de humedad en

ellas. Los valores utilizados se muestran a continuación.

Tabla 2. Capacidad de retención de agua

Capacidad de retención de agua 69.19%

% de Humedad antes de la aspersión 10.244 %

% de Humedad después de la aspersión 63.03%

Cantidad de agua utilizada para la aspersión 5.3 L


III.1.3 Evaluación de la actividad biológica en la mezcla

Una manera de revisar si existe actividad biológica de degradación de materia orgánica en

las muestras es la determinación de la producción de CO2. A continuación se muestra la

gráfica y los datos que resultaron al determinar el CO2 producido en el sistema control, sin

plaguicida comparado con un sistema con Folicur.

Gráfica 1. CO2 generado (acumulado) en sistema sin plaguicida y con plaguicida



35

Con estos resultados se muestra que existe mayor actividad de degradación de materia

orgánica en el sistema al que se agregó Folicur.

Tabla 3. Sistema de cama biológica control

Concentración inicial No se agregó fungicida

Temperatura de mediciones 30 +/- 1 °C

Gramos de muestra utilizados 1.0 +/- 0.0001 g

Fecha mL de HCl

referencia

mL HCl

gastados

Normalidad

NaOH

Mg de

CO2

Mg CO2

acumulados

07 Mayo 5.9 4.90 0.0988 4.3472 4.3472

09 Mayo 5.9 4.60 0.0988 5.65136 9.99856

11 Mayo 5.9 4.00 0.0988 8.25968 13.91104

21 Mayo 5.9 3.90 0.0988 8.6944 16.95408

23 Mayo 5.9 3.90 0.0988 8.6944 17.3888

25 Mayo 5.9 3.80 0.0988 9.12912 17.82352

04 Junio 5.8 3.50 0.0988 9.99856 19.12768

06 Junio 5.8 3.50 0.0982 9.99856 19.9364

08 Junio 5.8 3.30 0.0982 10.868 20.73984

18 Junio 5.8 3.20 0.0982 11.30272 22.03608

20 Junio 5.8 3.20 0.0982 11.30272 22.46816


Tabla 4. Sistema de cama biológica con Folicur

Concentración inicial 50mg /Kg

Temperatura de mediciones 30 +/- 1 °C

Gramos de muestra utilizados 1.0 +/- 0.0001 g

Cantidad de biomezcla en la cama 3 Kg

Cantidad de Folicur asperjado 0.6 mL

Fecha

mL de

NaOH

referencia

mL HCl

gastados

Normalidad

NaOH

Mg de

CO2

Mg CO2

acumulados

07 Mayo 5.9 3.70 0.0988 9.56384 9.56394

09 Mayo 5.9 3.30 0.0988 11.30272 20.8665

11 Mayo 5.9 2.90 0.0988 13.0416 24.34432

21 Mayo 5.9 2.70 0.0988 13.91104 26.95264

23 Mayo 5.9 2.30 0.0988 15.64992 29.56096

25 Mayo 5.9 1.70 0.0988 18.25824 33.90816

04 Junio 5.8 1.30 0.0988 19.5624 37.82064

06 Junio 5.8 0.80 0.0982 21.604 41.1664

08 Junio 5.8 0.50 0.0982 22.9002 44.5042

18 Junio 5.8 0.30 0.0982 23.7644 46.66464

20 Junio 5.8 0.00 0.0982 25.06064 48.82504



36

III.1.2 Desarrollo del método analítico

De los análisis efectuados por espectroscopia UV/VIS se obtuvieron los siguientes datos

para la determinación de la longitud de onda máxima para cada fungicida.

Tabla 5. Determinación longitud de onda de máxima absorbancia

Estándar Longitud de Onda (nm) Absorbancia (AU)

Clorotalonil 217 4.000

221 4.000

224 3.981

231 3.969

215 3.954

Tebuconazol 270 1.648

221 0.703

202 0.647

194 0.571

Captan 210 2.098

249 0.067

Benomyl 217 3.957

240 2.077

275 1.333


Para el desarrollo del método analítico empleando HPLC y basado en los datos anteriores

así como en la literatura revisada, se probaron diferentes fases móviles, longitudes de onda

y columnas, tratando de obtener la máxima respuesta posible en una determinación

simultanea de los compuestos y optimizar las condiciones de separación de los mismos.

Se prepararon los fungicidas en concentraciones de 1 mg/mL, disolviendo estándares puros

en los solventes indicados anteriormente y diluciones finales de 0.01 mg/mL de acuerdo a

la fase móvil empleada.

Las columnas utilizadas se listan a continuación:

Columna C18, hypersil ODS, 200 x 2.2mm, 5um; C18;

Supelcosyl, 150 x 4.6 mm., 5um;

Columnas conectadas en línea: RP 18, Supelcosyl 150x4.6mm, 5um y Chromolit

100 x 4.6 mm, 5um;

Chromolit RP18, 100x4.6mm, 5um (Merck),

De las columnas indicadas anteriormente la que dio los mejores resultados fue la ODS

Hypersil 5µm 200 x 2.1mm; C18 RP, con la que se realizó todo el estudio.

Con respecto a la fase móvil y la longitud de onda, se inicio probando con la fase de

acetonitrilo: Metanol: Acido Acético 0.05M (35:30:35) para todos los fungicidas y a las

longitudes de onda de 210 y 230nm.


37

Posteriormente, según especificaciones de los certificados de análisis de los estándares se

probaron las fases: acetonitrilo: agua (70:30) para clorotalonil a 231nm y acetonitrilo: agua

con 0.04% de acido fosfórico (60:40) para Captan a 210. Y de acuerdo a la literatura se

escogió acetonitrilo: agua (50:50) para tebuconazol a 223 nm; y para benomyl, metanol:

agua (80:20) a 254 nm. Se obtuvieron mejores resultados empleando las fases para los

compuestos individuales.

III.1.3 ENSAYOS DE RECUPERACIÓN

Se realizaron pruebas de recuperación en muestras de biomezcla con un porcentaje de

humedad de 60% fortificándolas individualmente con cada uno de los compuestos, como se

describe a continuación.

III.1.3.1 Ensayos de recuperación para CLOROTALONIL

Condiciones de trabajo.

Detector UV. Longitud de onda:231 nm

Columnas conectadas en línea: RP 18, Supercosyl 150x4.6mm, 5um y Chromolit 100x4.6

mm, 5um.

Fase Móvil: Acetonitrilo/agua (70:30)

Flujo: 06 mL/min

Atenuación: 6

Volumen de inyección: 20 l

CURVA DE CALIBRACIÒN:

Preparación de los estándares a partir de la solución madre de clorotalonil 1mg/mL en

acetona, en concentraciones de 1, 2, 5, 10, 20, y 30 ug/mL en fase móvil.

Resultados del análisis de los datos obtenidos.

Tabla No. 6. Resultados de curva de calibración para clorotalonil

Concentración

g/mL Altura

a: 0.743184

b: 5.864055

r: 0.9998

1 7.22

2 11.86

5 29.25

10 60.54

20 117.68


(Nota, se incluyo un valor de 30 g/mL pero se observó que este ya no cumple con la

linealidad por lo que se eliminó)


38

Gráfica No. 2 Curva de calibración de clorotalonil

Curva de calibración Clorotalonil

y = 5.8641x + 0.7432

R2 = 0.9997

0

20

40

60

80

100

120

140

0 5 10 15 20

Concentración (ug/ml)

Alt

ura

de p

ico

Datos

Lineal (Datos)


7.2.1.a PRIMER ENSAYO.

Se pesaron 10 g de biomezcla con 60 % de humedad en 2 erlenmeyers de 250 mL tratando

cada uno de la siguiente forma:

1- Fortificada con 50 ppm (0.5 mg/10g) de clorotalonil.

2- Fortificada con 5 ppm (0.05mg/10g) de clorotalonil

Se Extrajeron con 25 mL de diclorometano y agitación por 1 hora.

Se Filtraron a través de sulfato de sodio anhidro.

Se transfirieron 3 mL de cada uno a beakers de 10 mL, evaporándolos a sequedad

utilizando para ello un ventilador y una lámpara de calor moderado.

Se reconstituyeron con 3 mL de fase móvil, se filtraron a través de membranas de nylon de

0.45um y se inyectaron en el cromatógrafo líquido (HPLC), bajo las condiciones

establecidas.

Resultados:

Fortificación: 5 ppm

Concentración obtenida: 2.3 ppm.

Recuperación: 46.55 %





39

III.1.3.1.b SEGUNDO ENSAYO.

Se realizó bajo las mismas condiciones descritas en el primer ensayo pero con una

concentración de 30 ppm (0.3mg/10g) y metanol como solvente de extracción.

Resultado:




III.1.3.1.c TERCER ENSAYO

Se pesaron 10 g de biomezcla con 60 % de humedad en 1 erlenmeyers de 250 mL y 4 g de

biomezcla seca (equivalentes a 10 g de biomezcla húmeda) en otro erlenmeyer de 250 mL.

Cada una se fortificó con 50 ppm (0.50 mg/10g) de Clorotalonil.

Se extrajeron con 50 mL de diclorometano y agitación por 1 hora.

Se filtraron a través de sulfato de sodio anhidro

Se transfirieron 4ml de la solución en duplicado de cada muestra: dos evaporados con

nitrógeno a temperatura menor de 50o C y los otros dos con ventilador y lámpara con calor

moderado.



establecidas.

Resultados:

Muestra con 60% de humedad evaporada con calor y ventilación


Concentración obtenida: 28.24 ppm

Recuperación: 56.48%

Muestra Seca evaporada con nitrógeno




Muestra seca evaporada con calor y ventilación



Recuperación: 96 %


40

III.1.3.1.d CUARTO ENSAYO.

Del ensayo anterior (muestra húmeda y seca), se evaporaron 4 mL de los extractos con

calor moderado y ventilación, sin sobresecar.

Se reconstituyeron en 2 mL de fase móvil.

Resultados:

Muestra húmeda




Muestra seca




III.1.3.2 Ensayos de recuperación para TEBUCONAZOL

Condiciones de trabajo:

Detector UV Longitud de onda: 223 nm

Columna: Chromolit RP18, 100x4.6mm, 5um (Merck).

Fase móvil: acetonitrilo/agua, 50:50

Flujo: 0.6mL/min

Atenuación: 6

Tiempo de retención aproximado: 9.2

Volumen de inyección: 20 L

CURVA DE CALIBRACION

Preparación de los estándares a partir de las solución madre (1mg/mL) de tebuconazol en

metanol, en concentraciones: 0.2, 0.5, 1, 2, 5, 10 y 20 ug/mL en fase móvil.


Tabla No. 7. Curva de calibración para tebuconazol

Concentración

ug/mL Altura

a= 0.01457274

b= 19.635607

r= 0.99995

0.2 3.9

0.5 10.1

1 19.7

2 41.3

5 97

10 194

20 394



41

Gráfica No. 3 Curva de calibración para tebuconazol

Curva de calibración Tebuconazol

y = 19.636x + 0.0146

R2 = 0.9999

0

50

100

150

200

250

300

350

400

0 5 10 15 20


Alt

ura

del

pic

o

Datos

Lineal (Datos)


III.1.3.2.a PRIMER ENSAYO:

Se pesaron 10 g de biomezcla con 60 % de humedad en 2 erlenmeyers de 250 mL

Se fortificaron con 50 ppm de tebuconazol (0.5mg/10g)

Se secaron a 50o C en horno convencional.

Se extrajeron en frascos de vidrio de 100 mL con 50mL de diclorometano cerrados

herméticamente y agitando por una hora.

Se les agregaron 5 g de sulfato de sodio anhidro y se filtraron con vacío usando filtros de

porosidad fina.

Se transfirieron 5 mL a beakers de 10 mL y se evaporaron a 50o C bajo corriente de

nitrógeno.



establecidas.

RESULTADOS:





42

III.1.3.2.b SEGUNDO ENSAYO

Se pesaron 3 g de biomezcla con 60 % de humedad en 2 frascos de 100 mL

Se fortificaron con 50 ppm de tebuconazol (0.15mg/3g)

a. Se extrajeron con 20mL de diclorometano, 5g de sulfato de sodio

anhidro y agitando por una hora.

b. Se extrajeron con 20mL de metanol, 5g de sulfato de sodio anhidro y

agitando por una hora

Se filtraron con vacío usando filtros de porosidad fina.

Se transfirieron 2 mL a beakers de 10 mL y se evaporaron a temperatura menor de 40o C

bajo corriente de nitrógeno.

Se reconstituyeron con 2 mL de la fase móvil correspondiente, se filtraron a través de

membranas de nylon de 0.45um y se inyectaron en el cromatógrafo líquido (HPLC), bajo

las condiciones establecidas.

RESULTADOS

Extracción con diclorometano:


Concentración obtenida: 34 ppm.

Recuperación: 68 %

Extracción con metanol:


Concentración obtenida: 32 ppm.

Recuperación: 64 %

Inyección del extracto en metanol sin evaporar:




III.1.3.3. Ensayo de recuperación para CAPTÁN


Detector UV Longitud de onda: 210nm

Columnas conectadas en línea: Supercosil RP18, 150x4.6 mm, 5 m y Lichrospher RP18,

125x4 mm, 5um.

Fase móvil: Acetonitrilo/agua con 0.04 % de ácido fosfórico (60:40)

Flujo: 0.5 mL/min

Atenuación: 6


Volumen de inyección: 20 ul


43

CURVAS DE CALIBRACION

Preparación de los estándares a partir de la solucion madre (1mg/mL) de captan en

diclorometano en concentraciones: 0.2, 0.5, 1, 2, 5, 10 y 20 ug/mL en metanol.


Tabla No. 8. Curva de calibración de captan

Concentración

ug/mL Altura

a= 0.968974051

b= 31.75315715

r= 0.99977

0.2 6.13

0.5 15.43

1 29.94

2 60.95

5 170.42

10 319.22

20 633.54


Gráfica No. 4 Curva de calibración para Captan

Curva de calibración Captán

y = 31.753x + 0.969

R2 = 0.9995

0

100

200

300

400

500

600

700

0 5 10 15 20


Alt

ura

del

pic

o

Datos

Lineal (Datos)



44

III.1.3.3..a PRIMER ENSAYO:

1- Peso de biomezcla en duplicado: 3g con 60% de humedad

Fortificadas con 50 ppm (0.15mg/3g), en frascos de vidrio de 125 mL, con tapadera

hermética, sin llevar las muestras a sequedad.

a- Extracción con 20 mL de diclorometano, 5 g de sulfato de sodio anhidro y agitación por

1 hora.

b- Extracción con 20 mL de metanol, 5 g de sulfato de sodio anhidro y agitación por 1 hora.

Filtración con vacío.

2 mL de cada uno, llevados a sequedad con nitrógeno a 40o C y reconstituidos con 2 mL de

la fase móvil. Se inyectaron las muestras de acuerdo a las condiciones establecidas.

En ninguno de los extractos se detectó la presencia del captán.

Inyección directa de los extractos sin llevarlos a sequedad:

Metanol: captán no detectado

Diclorometano: interfiere con el tiempo de retención del captán.

III.1.3.4. Ensayo de recuperación para BENOMYL


Cromatógrafo HPLC, HP 1050

Detector: UV

Longitud de onda: 217 nm

Columnas conectadas en línea: Supercosil RP18, 150x4.6mm, 5 um y Lichrospher RP18,

125x4mm, 5um.

Fase móvil: Acetonitrilo/agua (70:30).

Flujo: 0.3 mL/min

Atenuación: 7


Volumen de inyección: 20 ul

CURVA DE CALIBRACIÓN:

Preparación de los estándares a partir de las solución madre (1mg/mL), de benomyl en

cloroformo; y a las siguientes concentraciones: 0.2, 0.5, 1, 2, 5, 10 y 20 ug/mL en

metanol.



45

Tabla No. 9. Curva de calibración para benomyl

Concentración

ug/mL Altura a= 4.609452736

b= 10.74875622

r= 0.99972

1 13.3

2 25.6

5 59.9

10 114.6

20 218.1


Gráfica No. 5 Curva de calibración para benomyl

Curva de calibracón Benomyl

y = 10.749x + 4.6095

R2 = 0.9994

0

50

100

150

200

250

0 5 10 15 20


Alt

ura

de p

ico

Datos

Lineal (Datos)


III.1.3.4.a PRIMER ENSAYO:

1- Peso de la biomezcla con 60 % de humedad, en duplicado: 3 g

Fortificadas con 50 ppm (.15mg/3g), en frascos de vidrio de 125 mL con tapadera

hermética.

a- Extracción con 25 mL de diclorometano y agitación por 1 hora.

b- Extracción con 25 mL de metanol y agitación por 1 hora.


46

Adición de sulfato de sodio anhidro, 2 mL del extracto en diclorometano, evaporados a

temperatura ambiente y nitrógeno, reconstituidos con la fase móvil acetonitrilo/agua

(70:30). Inyectado en el cromatógrafo líquido de acuerdo a las condiciones establecidas.

Inyección directa del extracto en metanol.

RESULTADO:

a- Extracción con diclorometano:




b- Extracción con metanol:



Recuperación. 63.33 %

III.1.4. ANÁLISIS DE LA BIOMEZCLA

Para el análisis de la muestra se realizó un acucioso trabajo de laboratorio implicando el

cuidadoso proceso de extracción, de la biomezcla y preparación de las muestras para

inyectar. Se tuvo el cuidado te tener repeticiones de cada lectura obtenida.

A continuación en la tabla 10 se puede observar un ejemplo de la secuencia de toma de

datos en cada experimento.

Muestras 2-06-07 ( se agrega 40ul (40ug) de clotoralonil a muestras 1 a 4 y 40ul (40ug)

de isoproturon a todas) y 15 ml de solvente

inyeccion muestra identificacion peso

tiempo

ret area

tiempo

ret area

470 1-1 control MeOH 5.3217 1.665 47.64310 2.137 107.32387

471 1-2 1.670 53.88868 2.142 112.62553

472 1-3 1.670 52.77863 2.145 112.67017

473 2-1 control MeOH 5.0668 1.670 56.15741 2.145 120.25230

474 2-2 1.670 61.65915 2.145 125.64621

475 2-3 1.670 63.03048 2.142 136.22520

476 3-1 control FM 5.0648 1.665 103.82418 2.140 372.59366

477 3-2 1.665 103.83111 2.142 363.39212

478 3-3 1.665 88.93159 2.143 331.94196

479 4-1 control FM 5.3048 1.666 121.12303 2.142 410.60864

480 4-2 1.663 98.67403 2.136 359.56436

481 4-3 1.663 99.90018 2.139 358.65704


47

482 5-1*

clorotalonil

MeOH 5.1131 1.670 51.03104 2.140 2.35484

483 5-2* 1.665 46.33340 2.150 7.27434

484 5-3* 1.674 48.87279 2.150 2.12823

485 6-1*

clorotalonil

MeOH 5.1632 1.670 47.17229 2.160 8.64984

486 6-2* 1.670 51.02285 2.165 8.88115

487 6-3* 1.670 54.96916 2.169 10.75564

488 7-1 clorotalonil FM 5.222 1.665 73.97864 2.140 4.46492

489 7-2 1.665 94.30045 2.145 5.75883

490 7-3 1.665 78.05051 2.140 5.32309

491 8-1 clorotalonil FM 5.2948 1.665 98.77853 2.131 19.66606

492 8-2 1.670 92.23166 2.135 11.59338

493 8-3 1.670 93.85056 2.140 23.47212

inyección muestra rel de areas

Peso de

muestra/ml

solvente

agregado

Conc. en

mg/ml

(mg/ml

clorotalonil

* ml

solv)/peso

muestra

promedio

de PPM SD

470 1-1 2.25266345 0.35478 0.001888 0.005320 0.00510 0.000194

471 1-2 2.08996639 0.001754 0.004945

472 1-3 2.13476875 0.001791 0.005049

473 2-1 2.141343413 0.337786667 0.001796 0.005318 0.00525 0.000160767

474 2-2 2.037754494 0.001712 0.005067

475 2-3 2.161259124 0.001813 0.005367

476 3-1 3.588698317 0.337653333 0.002982 0.008830 0.00888 0.00028484

477 3-2 3.499838536 0.002909 0.008615

478 3-3 3.732553978 0.003099 0.009180

479 4-1 3.390012948 0.353653333 0.002819 0.007971 0.00832 0.000309888

480 4-2 3.643961435 0.003027 0.008560

481 4-3 3.590154092 0.002983 0.008435

482 5-1* 0.046145248 0.340873333 8.052E-05 0.0002362 0.00032 0.000155604

483 5-2* 0.156999918 0.0001713 0.0005026

484 5-3* 0.043546317 7.839E-05 0.0002299

485 6-1* 0.183366965 0.344213333 0.0001929 0.0005605 0.00056 2.57838E-05

486 6-2* 0.174062209 0.0001853 0.0005383

487 6-3* 0.195666807 0.0002030 0.0005897

488 7-1 0.060354178 0.348133333 9.216E-05 0.0002647 0.00027 1.02063E-05

489 7-2 0.061068956 9.275E-05 0.0002664

490 7-3 0.068200579 9.859E-05 0.0002831

491 8-1 0.199092455 0.352986667 0.0002058 0.0005830 0.00057 0.000145092

492 8-2 0.125698486 0.0001457 0.0004127

493 8-3 0.250101012 0.0002476 0.0007013


48

Promedio total por

solvente SD

Control en Metanol

0.00518 0.000103272

Control en Fase Movil

0.00860 0.000391441

Muestras en Metanol

0.00044 0.000169616

Muestras en Fase

Movil

0.00042 0.000208049

estandar

Concentración

mg/ml rel area

regresión

lineal

1 0.001 1.14577062

Intercepto -0.0521785

2 0.002 2.4245197

pendiente 1221.034823

3 0.004 4.82041794

Correlación 0.999865979

Inicialmente se realizó el estudio considerando la curva de calibración sin utilizar un

estándar interno. Los resultados de este estudio ser resumen en el gráfico que se muestra a

continuación:

III.1.4.1 RESULTADOS OBTENIDOS SIN UTLIZAR ESTÁNDAR INTERNO

Tabla No. 10. Resultados obtenidos para cuantificacion de Tebuconazol

Control en Metanol

Control en Fase Movil

Muestra en Metanol

Muestra en Fase Movil

09-May

Prom 27.8946 15.4141 0.9083 1.7867

SD 25.4833 16.8989 3.0341 0.9299

19-May

Prom 188.22086 197.205 178.42008 35.52052

SD 8.03010693 2.67351858 67.9401636 4.68627988

04-Jun

Prom 91.21828 78.30639 88.12615 44.35185

SD 2.87729882 27.1273598 24.5749853 0.55491338

18-Jun

Prom 154.4765 76.65469 68.07502 80.39664

SD 41.7700845 2.19802935 10.9340876 29.6956733



49

Grafica No. 6. Resultados de cuantificación de tebuconazol sin estándar interno

Tebuconazol sin estándar interno

0

5

10

15

20

25

30

09/05/2007 19/05/2007 04/06/2007 18/06/2007

fecha de muestreo

co

nce

ntr

ac

ión

pp

m

en diclorometano en metanol


En estos resultados se observa una anomalía ya que para las pruebas en las que se utilizó

diclorometano, el primer resultado aparece con menor concentración que el obtenido en la

segunda fecha de muestreo, y en el caso de los resultados con metanol, para el penúltimo

punto se obtuvo una concentración menor que para el último. Por esto, se consideró

trabajar utilizando estándar interno en las determinaciones. Los resultados se muestran a

continuación:


50

III.1.4.2. RESULTADOS OBTENIDOS UTILIZANDO ESTANDAR INTERNO DE

ISOPROTURON

Grafica No. 7. Resultados obtenidos para isoproturon utilizando estándar interno

Tebuconazol con estándar interno

0

5

10

15

20

25

30

09/05/2007 19/05/2007 04/06/2007 18/06/2007

fecha de muestreo

co

nc

en

tra

ció

n d

e

pp

m

en diclorometano en metanol


Figura 9. Porcentaje de degradación de Tebuconazole extracto metanólico



51

Grafica No. 8. Resultados obtenidos para clorotalonil utilizando estándar interno

Degradación de clorotalonil

0.00

1.00

2.00

3.00

4.00

5.00

6.00

7.00

8.00

19/05/2007 22/05/2007 25/05/2007 28/05/2007 31/05/2007 02/06/2007

co

ncen

tració

n p

pm


Gráfica 8 porcentaje de clorotalonil degradado


52

Tabla No. 11. Resultados obtenidos para clorotalonil

Control en Metanol

Control en Fase Móvil

Muestra en Metanol

Muestra en Fase Móvil

19-May

Prom 82.41 63.52 5.85 2.31

SD 0.32 7.59 1.78 0.56

Concentración (ppm) 7.10 3.64

22-May

Prom 95.91 76.68 3.14 1.80

SD 7.41 4.64 0.75 0.49


25-May

Prom 84.05 58.29 0.45 0.37

SD 9.69 0.44 0.11 0.18


28-May

Prom 153.65 116.24 0.08 0.07

SD 12.60 19.99 0.04 0.01


31-May

Prom 127.38 97.21 0.14 0.15

SD 4.10 5.49 0.01 0.05


02-Jun

Prom 67.21 111.37 0.44 0.42

SD 0.99 1.43 0.17 0.21




53

III.2 DISCUSIÓN DE RESULTADOS

III.2.1 Sistema de cama biológica experimental

El diseño inicial para los sistemas experimentales de las camas biológicas consistía en

columnas rellenas de la mezcla considerando que de esa manera se podría colectar el

lixiviado para determinar la cantidad de plaguicida retenido. Sin embargo ese sistema tiene

algunos inconvenientes; especialmente el hecho de la posibilidad de que los plaguicidas

queden adsorbidos en la matriz de suelo y broza por lo que el dato obtenido en el lixiviado

podría conducir a resultados erróneos. Por esta razón, se determinó que para establecer el

nivel de degradación en el suelo la mejor manera es tomando muestras del suelo para

extraer el plaguicida presente y determinarlo. De esa manera también es posible establecer

el porcentaje de degradación en el suelo en función del tiempo.

El diseño de las camas biológicas escala laboratorio permitió fácilmente tomar muestras

para evaluar la degradación de los plaguicidas, de manera reproducible. También fue

posible mantener un buen control de la temperatura y humedad.

El sistema para cuantificar el dióxido de carbono generado, es una buena herramienta para

tener una idea de la actividad biológica que se está desarrollando, puesto que podría

suceder el caso de que el plaguicida aplicado inhibiera la misma. Es interesante observar

que con la presencia de plaguicida, la actividad biológica se incrementó. Para poder tener

un mejor estudio del proceso de degradación, será necesario utilizar otras técnicas de

manera que sea posible introducir marcadores de carbono por ejemplo, para poder

establecer el origen del dióxido de carbono generado.

La parte que resultó más complicada fue el desarrollo del método analítico para la

determinación del contenido de plaguicidas, se realizaron numerosas pruebas tanto de

extracción y de recuperación del suelo con el objeto de tener resultados confiables.

A los pocos días de la aspersión de Clorotalonil en la cama biológica, se encontró una

degradación casi total de este fungicida. Esta prueba se repitió con muestras de una nueva

aspersión con este compuesto, analizando muestras cada tres días e implementando además

el uso de estándar interno (Isoproturón) desde la etapa de extracción.

En el caso de Tebuconazol los análisis utilizando Clorotalonil como estándar interno se

implementaron hasta el tercer muestreo. Utilizando estándar interno, la curva es mejor

definida, sin embargo en ambos casos es posible observar que al cabo de un mes la

concentración del Tebuconazole ha disminuido drásticamente. Sin embargo no se logró

llegar hasta la degradación total. Siempre quedó un remanente de aproximadamente 20%

de lo que originalmente se asperjó en la cama biológica.

Se realizaron diversas pruebas con otros fungicidas, como el Propiconazole, Triadimefon y

Benomyl pero no se consiguió llegar a afinar la metodología de la extracción a partir de

muestras provenientes de las camas biológicas.


54

PARTE IV


55

VI.1. Conclusiones

V.1.1 Se estableció el procedimiento para evaluar el funcionamiento de camas biológicas

escala laboratorio, incluyendo la recuperación de plaguicidas para comprobar su

degradación, la capacidad de retención de agua y la actividad biológica como

dióxido de carbono producido.

V.1.2 En este trabajo se construyeron camas biológicas experimentales a escala de

laboratorio que pueden ser utilizadas para el estudio de la degradación de

plaguicidas por los microorganismos presentes en la tierra con contenido en materia

vegetal.

V.1.3 Se estableció el proceso analítico con porcentaje de recuperación y obtención de

curva de calibración para el Clorotalonil, Tebuconazol, Captan y Benomyl

V.1.4 Se evaluó la capacidad de la biomezcla obtenida localmente para la degradación de

plaguicidas, pero no se realizaron experimentos en camas biológicas a escala

completa.

V.1.5 Solamente se tuvo resultados concretos para dos de los plaguicidas. Para el

Clorotalonil, el 100% de degradación en 6 días y para el Tebuconazol el 70% en 40

días.

V.1.6 Este objetivo no se cumplió al no haber sido posible la construcción de camas

biológicas a escala completa y evaluación.

Confirmación de la hipótesis

“Los microorganismos presentes en una cama biológica son capaces de degradar el nivel

normal de utilizado de fungicidas”

Los resultados obtenidos muestran que los microorganismos presentes naturalmente en la

mezcla utilizada en las camas biológicas preparadas, fueron capaces de degradar los

fungicidas cuando se encuentran en concentraciones iguales a las utilizadas normalmente

en las aplicaciones en el campo, por lo que la hipótesis se acepta


56

VI.2 Recomendaciones

VI.2.1 Aislar hongos están activos en la mezcla. En la literatura se muestra que son

hongos chrysosporium, sin embargo con la diversidad natural de Guatemala es

posible analizar los diferentes hongos presentes.

VI.2.1 Estudiar la capacidad máxima de degradación en las camas biológicas, esto es el

límite de concentración.

VI.2.3 Evaluar el mecanismo de degradación con plaguicidas marcados con carbono-14 lo

que permite un seguimiento de la degradación.

VI.2.4 Construir camas biológicas a escala completa para el estudio de la degradación de

plaguicidas.

VI.2.5 Revisar la metodología analítica en mezcla de plaguicidas.

VI.2.5 Es necesario evaluar los aspectos como diferentes capas de la biomezcla y otros

materiales, el pasto que crece sobre la cama biológica.

VI.2.6 Continuar con la evaluación de la degradación de los distintos plaguicidas utilizados

en Guatemala.


57

IV. 3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Arbeli, Z y Fuentes, C. Accelerated biodegradation of pesticides: an overview of

the phenomenon, its basis and posible solutions and a discusson on the tropical

dimension. Crop Protection, 2007 pp 1733-1746

2. Asociación del Gremio Químico Agrícola (AGREQUIMA) 2004. Camas o mesas

biológicas. http://www.agrequima.com.gt/ visitado el 25/07/05

3. Castillo M., Torstensson, Stenström J. (2008) Bobeds for environmental protection

from pesticide use – a review. Journal of Agricultural and Food Chemmistry.

J.Agric.Food Chem. 2008, 56, 6206-6219

4. Crop Protection Association and Agricultural Industries Confederation (2011)

http://www.biobeds.info/content/default.asp

5. Don, R. y Pemberton J. Properties of six pesticide degradation plasmids isolated

from Alcaligenes paradoxus and Alcaligenes eutrophus. Journal of

Bacteriology. 1981 pp681-686

6. Environmental Protection Agency http://www.epa.gov/pesticides/about/index.htm

7. Elzerman A. and Coates J. Hydrophobic Organica Compounds on Sediments en

Sources and fates of aquatic pollutants. Ed. Hites R. American Chemical

Society 1987

8. FAO. Pesticide Analytical Manual revisado 1999. Pp 251

9. FAO. Pesticide Analytical Manual revisado 1999. Pp 63

10. Fogg P. Guidance on using a lined biobed to dispose of agricultural waste

consisting of non-hazardous pesticide solutions or washings. 2007

11. Fogg P, Boxall ABA, Jukes A and Walker A. (2004)a Effect of Different Soil

Textures on Leaching Potential and Degradation of Pesticides in Biobeds.

J.Agric. Food Chem. 52, 5643-5652

12. Fogg P, Boxall ABA, Jukes A and Walker A. (2004)b. Leaching of Pesticides from

Biobeds: Effect of Biobed Cepth and Water Loading. J.Agric. Food Chem.

52, 6217-6227

13. Fogg P, Boxall ABA, Jukes A and Walker A (2003)c Biobeds Phase3: The

development and evaluation of a biological system for the disposal of pesticide

waste and washings. Cranfield Centre for EcoChemistry Research Report N.

JA3763 for DEFRA (PLO544) and the Crop Protection Association, 61pp

http://www.agrequima.com.gt/

http://www.epa.gov/pesticides/about/index.htm


58

14. Farley, K. Germann, G. Elzermann, A. Differential Weathering of PCB Congeners

in Lake Hartwell, South Carolina. en Environmental chemistry of Lakes and

Reservoirs. Advances in chemistry series tomo 237. Lawrence A. Baker

Editor. 1994. American Chemical Society. Washington.

15. Hofrichter, M.

http://www.kolumbus.fi/ilona.barlund/ilona.barlund/MartinsProjects.html

16. Husby J., Castillo M. del Pilar, Wilde, Tineke. Biobeds. http://biobeds.org

17. IPCS INCHEM International Programme on Chemical Safety (IPCS)

http://www.inchem.org/

18. INCHEM International Programme on Chemical Safety. ENVIRONMENTAL

HEALTH CRITERIA 183

19. IPCS. International Programme on Chemical Safety. Health and Safety Guide

No. 50 CAPTAN

20. Lignin Institute. Lignin and its Properties. Dialoge. July 2001, Volume 9,

Number 1

21. Morgan P. et al. Growth and biodegradation by white-rot fungi inoculated into soil.

Soil Biology and Biochemistry. 1993 pp 279-287

22. McBride, Murray. Environmental Chemistry of Soils. 1994. Oxford University

Press. New York.

23. Papinutti, V, Diorio, L. Forchiassin, F. (2003) Degradación de madera de álamo

por Fomes sclerodermeus: producción de enzimas ligninolíticas en aserrín de

álamo y cedro Revista Iberoamericana de Micología l2003; 20: 16-20

24. Parrilla, P., et al. A restricted access medium column for the trace determination of

triadimefon and tetraconazole in water with large-volumen injection coupled-

column RPLC with UV detection. Analyst, 2000, 125, 1549-1553.

25. Singh, D. y Chen, S. (2008) The white-rot fungus Phanerochaete chrysosporium:

conditions for the production of lignin-degrading enzymes. Applied

Microbiology and Biotechnology (2008) 81:399–417

26. Torstensson, Lennart. Castillo, María del Pilar (1997). Use of Biobers in Sweden to

Minimize Environmental Spillages from Agricultural Spraying Equipment.

Pesticide Outlook. June 1997 24-27

http://www.inchem.org/


59

27. Torstensson, Lennart. (2000) Experiences of Biobeds in Practical use in Sweden.

Pesticide Outlook. October 2000. 206-211

28. Trajkovska, V., S. Petrovska-Jovanovié. Optimization of HPLC conditions for

simultaneous determination of captan, terbumeton and deltamethrin. Bull.

Chem. Technol. Macedonia, 21, 2, 193-197 (2002).

29. Von Wirén-Lehr, Sabine. Castillo, María del Pilar. Tortensson, Lennart. Scheunert,

I. (2001) Degradation of isoproturon in biobeds. Biol.Fertil.Soils (33 ) 535-

540

30. Wang C, et al. Enzyme activities during degradation of polycyclic aromatic

hydrocarbons by white fungus Phanerochaete chrysosporium in soils.

Chemosphere. 2009 pp 733-738

31. Weismahr, K. Houghton, C. Sedklak, D. Analysis of the Dithiocarbamate

Fungicides Ziram, Maneb, and Zineb and the Flotation Agent

Ethylxanthogenate by Ion-Pair Reversed-Phase HPLC. Anal. Chem. 70, 4800-

4804

32. WHO/FAO DATA SHEET ON PESTICIDES

http://www.inchem.org/pages/pds.html

33. Wood, Alan. Compendium of Pesticide Common Names. 2010

http://www.alanwood.net/pesticides/index.html

http://www.inchem.org/pages/pds.html

http://www.alanwood.net/pesticides/index.html


60

IV. ANEXOS


61

Anexo 1

Otros resultados

Como parte del proyecto se tuvo la visita de la Dra María del Pilar Castillo quien tuvo

diferentes reuniones tanto con el equipo de trabajo, como con personal de Agrequima.

Adicionalmente dictó una conferencia abierta al público interesado, relacionado con el tema

de la investigación.

Calendario de actividades cumplido por la Dra. María del Pilar Castillo

Lunes 18 de septiembre

9:30 visita al campus de la Universidad del Valle de Guatemala

10:30 a 14:00 Reunión preliminar con el equipo de trabajo de la UVG

Licda. Fabiola de Micheo


Dr. Adrián Gil

16:00 a 18:00 revisión de documentos relacionados al proyecto

Martes 19 de septiembre

9:30 a 12:00 reunión de trabajo con Br. Rossina Espósito para revisar los detalles

experimentales del proyecto

1 2:30 a 16:00 Reunión con el equipo UVG y Agrequima

Licda. Fabiola de Micheo


Lic Julio Ruano - Agrequima


Miércoles 20 de septiembre

7:00 a 18:00 horas. Visita de campo a los lugares posibles de instalación de camas

biológicas en Laguna de Retana

Jueves 21 de septiembre

10:00 horas Reunión de trabajo con equipo UVG



11:30 horas Visita a los laboratorios de Microbiología de la UVG

13:00 horas almuerzo

14:00 a 17:00 horas reunión de trabajo para revisión detalles experimentales

17:30 a 19:00 horas conferencia “Camas biológicas” uso de la biotecnología en

protección de suelos

Viernes 22 de septiembre

10:00 a Reunión de trabajo y elaboración de documento detallando adecuaciones

experimentales y elaboración de conclusiones.

13:00 horas reunión con el Dr. Rolando Cifuentes, Director de Centreo de Estudios

Agrícolas y Forestales

15:00 a 17:00 horas Reunión con personal de Agrequima


62

Anexo 2

i. Siglas

1. DER Desviación Estándar Relativa

2. HP Hewlett Packard

3. rpm Revoluciones por minuto

4. UVG Universidad del Valle de Guatemala

ii. Abreviaturas de unidades

1. MB Megabyte 1 x 106 byte

2. GB Gigabyte 1 x 109 byte

3. g gramo

4. mg miligramo 1 x 10-3

gramos

5. µg microgramo 1 x 10-6

gramos

6. ng nanogramo 1 x 10-6

gramos

7. ρg picogramo 1 x 10-12

gramos

8. MHz MegaHertz 1 x 106 Hertz

9. l litro

10. mL mililitro 1 x 10-3

litros

11. cm centimetro 1 x 10-2

metro

12. mm milimetro 1 x 10-3

metro

13. µm micrometro 1 x 10-6

metro

14. nm nanometro 1 x 10-9

metro

15. N Newton


63

Anxo 3, muestra de los cromatogramas obtenidos


64

PARTE V


65

V.1 Informe Financiero

AD-R-0013

Nombre del Proyecto:

Numero del Proyecto: 22-2006

Investigador Principal: Dr. Adrián Francisco Gil Méndez

Monto Autorizado: Q150,122.50

Fecha de Inicio y Finalización: 01/06/2006 al 31/05/2007

Menos (-) Mas (+)

1 Servicios no personales

181

Estudios, investigaciones y proyectos de

factibilidad 56,500.00Q 42,374.97Q 14,125.03Q

122 Impresión, encuadernación y reproducción 2,000.00Q 2,000.00Q

133 Viáticos en el interior 1,000.00Q 1,000.00Q

141 Transporte de personas 13,000.00Q 11,618.40Q 1,381.60Q

163

Mantenimiento y reparación de equipo médico,

sanitario y de laboratorio 3,000.00Q 2,699.76Q 300.24Q

196 Servicios de atención y protocolo 7,000.00Q 1,309.20Q 4,141.35Q 1,549.45Q

2 MATERIALES Y SUMINISTROS

223 Piedra, arcilla y arena 100.00Q 100.00Q

224 Pómez, cal y yeso 100.00Q 100.00Q

241 Papel de escritorio 149.50Q 149.50Q -Q

261 Elementos y compuestos químicos 16,600.00Q 3,172.15Q 19,772.15Q -Q

264 Insecticidas, fumigantes y similares 1,000.00Q 1,000.00Q

267 Tintes, pinturas y colorantes 1,114.70Q 1,114.70Q -Q

268 Productos plásticos, nylon, vinil y pvc 7,000.00Q 1,854.67Q 6,795.16Q 2,059.51Q

269 Otros productos químicos y conexos 10,000.00Q 5,026.82Q 4,973.18Q

272 Productos de Vidrio 3,000.00Q 2,433.54Q 566.46Q

274 Cemento 200.00Q 200.00Q

291 Útiles de oficina 45.00Q 45.00Q -Q

295

Útiles menores, médico-quirúrgicos y de

laboratorio 10,000.00Q 7,147.23Q 2,852.77Q

3

PROPIEDAD, PLANTA, EQUIPO E

INTANGIBLES

329 Otras maquinarias y equipos 2,000.00Q 2,000.00Q

914 Gastos no previstos 3,975.00Q 3,975.00Q

GASTOS DE ADMÓN. (10%) 13,647.50Q 13,647.50Q

150,122.50Q 6,336.02Q 6,336.02Q 111,939.26Q 38,183.24Q

MONTO AUTORIZADO 150,122.50Q Disponibilidad 38,183.24Q

(-) EJECUTADO 111,939.26Q

SUBTOTAL 38,183.24Q

(-) CAJA CHICA -Q

TOTAL POR EJECUTAR 38,183.24Q

Ejecutado Renglon Pendiente de

Ejecutar

PRÓRROGA AL 30/09/2007

NOVENA CONVOCATORIA

LINEA FODECYT

En Ejecuciòn

Grupo

TRANSFERENCIA

Nombre del Gasto

Evaluación de la Degradación de Fungicidas en Camas Biológicas

Asignacion

Presupuestaria

Documents

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