Concentração mínima inibitória de dez antimicrobianos para

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Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v.53, n.5, p.531-537, 2001. 1

Concentração mínima inibitória de dez antimicrobianos para amostras de Staphylococcusaureus isoladas de infecção intramamária bovina

[Minimum inhibitory concentrations for ten antimicrobial agents againstStaphylococcus aureus from bovine intramammary infection]

M.A.V.P. Brito1, J.R.F. Brito1, M.A.S. Silva1, R.A. Carmo2

1Embrapa Gado de LeiteRua Eugênio do Nascimento, 610

36038-330 – Juiz de Fora, MG2Bióloga, Bolsista de Aperfeiçoamento do CNPq

Recebido para publicação em 9 de novembro de 2000.E-mail: [email protected]

RESUMO

Determinou-se a concentração mínima inibitória (CMI) de ampicilina, cefalotina, eritromicina,gentamicina, neomicina, norfloxacina, oxacilina, penicilina G, tetraciclina e tilosina para 112 amostrasde Staphylococcus aureus isoladas de infecções intramamárias bovina, em 33 rebanhos leiteiros da Zonada Mata do Estado de Minas Gerais. Foram isoladas 24 amostras de infecção clínica, 66 de subclínica e22 de infecção crônica. As amostras de infecção crônica foram isoladas repetidas vezes dos mesmosquartos mamários de nove vacas de um rebanho, no período de 13 meses. A CMI foi realizada em ágarMueller Hinton, com concentrações entre 0,015 e 128µgml-1 de cada antimicrobiano. As amostras daAmerican Type Culture Collection (ATCC) recomendadas para controle de qualidade, S. aureus ATCC29213, Escherichia coli ATCC 25922 e Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, foram incluídas emcada teste. Cem por cento das amostras foram susceptíveis à cefalotina, eritromicina, gentamicina,norfloxacina e oxacilina, 91% à tetraciclina (CMI50: 0,5µgml-1) e à tilosina (CMI50: 2,0µgml-1), 65% àampicilina (CMI50: 0,125µgml-1) e à penicilina G (CMI50: 0,06µgml-1). Todas foram susceptíveis àneomicina (CMI50: 0,5µgml-1) exceto uma amostra que apresentou um padrão intermediário. O nível deresistência para ampicilina e penicilina foi maior nas amostras isoladas de casos clínicos e nas deinfecção subclínica com escores positivos no CMT (P<0,02). Nas isoladas de infecção clínica, o nível deresistência à tilosina foi maior (P<0,02). As amostras que apresentaram CMI≥0,125µgml-1 parapenicilina foram positivas para produção de β-lactamase.

Palavras-chave: Mastite bovina, Staphylococcus aureus, susceptibilidade antimicrobiana, concentraçãomínima inibitória, β-lactamase

ABSTRACT

The minimum inhibitory concentrations (MIC) for ampicillin, cephalothin, erythromycin, gentamicin,neomycin, norfloxacin, oxacillin, penicillin G, tetracycline and tylosin against 112 Staphylococcusaureus strains isolated from bovine intramammary infections were determined. The strains wereoriginated from 33 dairy herds located in the Zona da Mata, Minas Gerais State. Twenty-four strainswere isolated from clinical cases of mastitis, 66 from subclinical infections and 22 from chronicinfections. The chronic infection strains were isolated from the same mammary quarters of nine cows ofone herd over a period of 13 months. The MIC was performed on Mueller Hinton agar andconcentrations, ranging from 0.015 to 128µgml-1, were evaluated for each antimicrobial agent. The

Brito et al.

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American Type Culture Collection (ATCC) recommended quality control strains, S. aureus ATCC29213, Escherichia coli ATCC 25922 and Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, were included oneach batch of test. All strains were susceptible to cephalothin, erythromycin, gentamicin, norfloxacinand oxacillin, 91% were susceptible to tetracycline (MIC50: 0.5µgml-1) and tylosin (MIC50: 2.0µgml-1),65% to ampicillin (MIC50: 0.125µgml-1) and penicillin G (MIC50: 0.06µgml-1). All strains but one in theintermediate pattern, were susceptible to neomycin (MIC50: 0.5µgml-1). The resistance levels toampicillin and penicillin were higher in strains isolated from clinical and subclinical (positive scoreson CMT) cases (P<0.02). The resistance level to tylosin was also higher among the strains isolated fromclinical infections (P<0.02). The strains with MIC≥0.125µgml-1 to penicillin were positive for ß-lactamase production.

Keywords: Bovine mastitis, Staphylococcus aureus, antimicrobial susceptibility, minimum inhibitoryconcentration, β-lactamase

INTRODUÇÃO

Diversos estudos que tratam da susceptibilidade a antimicrobianos de patógenos da mastite bovina noBrasil mostram aumento crescente no padrão de resistência, principalmente para Staphylococcusaureus, o agente mais freqüentemente isolado (Langoni et al., 1991; Brito & Brito, 1996). Os resultadosmostram que o aumento da resistência é maior para os antibióticos β-lactâmicos. A susceptibilidade deS. aureus ou Staphylococcus spp. coagulase positivo para penicilina tem variado de 80% a 1,0% e paraampicilina de aproximadamente 80% a 13% (Ferreiro et al., 1985; Nader Filho et al., 1986; Langoni etal., 1991; Nader Filho et al., 1992).

A utilização de antimicrobianos para o tratamento da mastite clínica ou da mastite subclínica no iníciodo período seco é um componente importante dos programas de controle (Bramley et al., 1996). Aseleção do antimicrobiano apropriado é essencial, tanto do ponto de vista da saúde do animal, quanto daprodutividade da glândula mamária. Os resultados dos testes de susceptibilidade a antimicrobianosajudam o veterinário clínico na escolha do medicamento apropriado (Francis, 1989; Sumano & Ocampo,1992).

A grande maioria dos trabalhos que avaliaram a susceptibilidade a antimicrobianos dos patógenos damastite no Brasil empregou a técnica de difusão do antibiótico em ágar. Esse método está padronizado eapresenta um detalhamento técnico bem definido, demonstrando alto grau de reprodutibilidade entre ouintra laboratórios (Woods & Washington, 1995). Contudo, os critérios de interpretação da medida dohalo de inibição que determinam a susceptibilidade ou resistência são baseados em características dosagentes antimicrobianos observadas no soro ou nos tecidos humanos, e não foram validados para ospatógenos da glândula mamária (Watts & Yancey, 1994; Ziv, 1995).

A susceptibilidade a antimicrobianos é também avaliada por meio da determinação da concentraçãomínima inibitória. Esse método está padronizado, possui detalhamento técnico bem definido e forneceresultados quantitativos (Woods & Washington, 1995; NCCLS, 1997). Os resultados obtidos podem serinterpretados considerando as características farmacológicas e farmacocinéticas dos antimicrobianos e aconcentração mínima a ser alcançada no úbere (Sumano & Ocampo, 1992).

O objetivo deste trabalho foi determinar a concentração mínima inibitória de antimicrobianos usados notratamento de mastite para amostras de S. aureus isoladas de infecção intramamária bovina. Avaliou-setambém a produção da enzima β-lactamase nas amostras que foram inibidas por concentrações depenicilina ≥0,06µgml-1.



MATERIAL E MÉTODOS

Foram avaliadas 112 amostras de S. aureus, isoladas de quartos mamários de vacas pertencentes a 33rebanhos leiteiros localizados na Zona da Mata do Estado de Minas Gerais. Vinte e quatro foramisoladas de casos clínicos de mastite, 25 de quartos mamários com escores negativos no Califórniamastite teste (CMT), 41 de quartos com escores positivos no CMT (três amostras com escore traço, setecom +, cinco com ++ e 26 com +++) e 22 de quartos com infecção crônica. Estas foram isoladas dosmesmos quartos mamários de nove vacas de um mesmo rebanho no período de 13 meses, sendo obtidas12 amostras de quatro vacas e 10 e de cinco vacas.

O isolamento bacteriano foi feito a partir de leite coletado antes da ordenha, após cuidadosa anti-sepsiadas tetas com álcool a 70%. Os jatos de leite foram coletados diretamente em frascos estéreis, colocadosem caixas isotérmicas com gelo e encaminhados imediatamente ao laboratório para processamento.Volumes de 10µl de cada amostra foram semeados com alça calibrada e descartável em cada quadrantede uma placa de ágar-sangue contendo 5% de sangue desfibrinado de carneiro, de acordo com asrecomendações de Harmon et al. (1990). As bactérias identificadas como S. aureus apresentaram reaçãofermentativa no meio de Hugh & Leifson, produção de catalase, coagulase e acetoína (Harmon et al.,1990).

A determinação da CMI foi feita pelo método da diluição dos antimicrobianos em ágar Mueller-Hinton,de acordo com as recomendações do NCCLS (1997). Foram utilizadas placas de vidro circulares de100mm de diâmetro. Antes da esterilização, a parte externa do fundo das placas foi marcada em divisõesquadriculadas de aproximadamente 1,4cm de lado, de modo que cada placa contivesse até 32 quadrados,permitindo a avaliação de até 32 amostras por placa.

Foram avaliadas concentrações de 128 a 0,015625µgml-1 de cada antimicrobiano. As soluções forampreparadas de acordo com as recomendações de Anhalt & Washington (1985).

O meio de cultura foi preparado em volumes de 50ml e esterilizado em frascos individuais. Apósesterilização, a temperatura do meio foi equilibrada entre 48 e 50oC em banho-maria e o volumeapropriado das soluções dos antimicrobianos foi adicionado para se obterem as concentrações desejadas.Foram preparadas duas placas para cada concentração, 18 horas antes da realização do teste. Em todosos testes foram incluídas duas placas sem os antimicrobianos como controle.

A suspensão-inóculo de cada amostra a ser testada foi preparada em solução salina (NaCl p/v 0,85%), apartir de culturas de 18-20 horas em ágar sangue, e a turbidez da suspensão padronizada com o tubo 0,5da escala de MacFarland. As placas foram inoculadas com alças descartáveis, calibradas de 1µl, dentrode 30 minutos de preparo do inóculo.

Os seguintes antimicrobianos foram testados: ampicilina, cefalotina, eritromicina, gentamicina,neomicina, norfloxacina, oxacilina, penicilina G, tetraciclina e tilosina.

As amostras de bactérias da American Type Culture Collection (ATCC) recomendadas como controle dequalidade dos testes de susceptibilidade, Staphylococcus aureus (ATCC 29213), Escherichia coli(ATCC 25922) e Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), foram inoculadas em cada teste.

A leitura foi realizada após 18-20 horas de incubação a 35oC, iniciando-se pelas placas semantimicrobiano, depois pelas amostras-padrão, comparando-se as CMI obtidas às esperadas, seguindo-se

Brito et al.


as amostras em teste. Na determinação do ponto final de inibição, o aparecimento de somente umacolônia ou de crescimento muito leve no local do inóculo, difícil de ser visualizado a olho nu, não foiconsiderado (NCCLS, 1997). A susceptibilidade das amostras foi determinada de acordo com Woods &Washington (1995) e NCCLS (1997), considerando as seguintes CMI: ampicilina, ≤0,25µgml-1,cefalotina, ≤8,0µgml-1, eritromicina, ≤0,5µgml-1, gentamicina, ≤4,0µgml-1, norfloxacina, ≤4,0µgml-1,oxacilina, ≤2.0µgml-1, penicilina G, ≤0,12µgml-1 e tetraciclina, ≤4,0µgml-1. Para neomicina ( ≤8,0µgml-

1), a concentração recomendada para susceptibilidade foi de acordo com o Mastitis Laboratory - NationalVeterinary Institute, Uppsala, Suécia, e para tilosina (≤2,0µgml-1), seguiu-se a recomendação dofabricante (Elanco, comunicação pessoal).As diferenças encontradas na freqüência de amostras susceptíveis entre os diferentes grupos de amostrasforam analisadas pelo teste do qui-quadrado (Wardlaw, 1987).

A produção de β-lactamase foi detectada usando nitrocefina, uma cefalosporina cromogênica,impregnada em bastões (Oxoid, ß-lactamase BR66). Foram testadas todas as amostras que apresentaramCMI≥0,06µgml-1 para penicilina (Woods & Washington, 1995). As colônias em meio de ágar-sojatripticaseína foram tocadas com os bastões contendo o reagente, e a leitura da viragem da coloração paravermelho foi feita de acordo com a recomendação do fabricante.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os resultados da determinação da CMI são apresentados na Tab. 1. Nas colunas CMI50 e CMI90 sãoapresentadas as menores concentrações (em µgml-1) que inibiram 50% e 90% das amostras de S. aureus,respectivamente. As variações observadas nas CMI são apresentadas na quarta coluna. Pode-se observarque 100% das amostras foram susceptíveis à cefalotina, eritromicina, gentamicina, norfloxacina eoxacilina, 91% à tetraciclina e tilosina, 65% à ampicilina e penicilina e 99% à neomicina. Somente umanão foi susceptível à neomicina, a qual apresentou um padrão classificado como intermediário.

Tabela 1. Concentração mínima inibitória (CMI) de 112 amostras de Staphylococcus aureus isoladas de33 rebanhos leiteiros localizados na Zona da Mata do Estado de Minas Gerais

Antimicrobiano CMI501

(µgml-1)CMI90

2

(µgml-1)Variação(µgml-1)

Susceptibilidade (%)

Ampicilina 0,125 1,0 0,03 - 2,0 65Cefalotina 0,25 0,25 0,06 - 0,5 100Eritromicina 0,5 0,5 0,25 - 0,50 100Gentamicina 0,25 0,5 0,06 - 0,50 100Neomicina 0,5 1,0 0,25 – 32 99Norfloxacina 1,0 1,0 0,50 - 2,0 100Oxacilina 0,25 0,25 0,125 - 0,5 100Penicilina G 0,06 0,50 0,015 - 2,0 65Tetraciclina 0,5 1,0 0,25 - 64 91Tilosina 2,0 2,0 0,5 - 4,0 91

1 CMI50: Concentração mínima inibitória para 50% das amostras de S. aureus testadas.2 CMI90: Concentração mínima inibitória para 90% das amostras de S. aureus testadas.

Variação no padrão de susceptibilidade de amostras de S. aureus isoladas de mastite tem sido observadaentre regiões e mesmo entre rebanhos de uma região (Owens & Watts, 1988). Isso dificulta comparar osresultados obtidos neste estudo com outros realizados em outras regiões do Brasil. Além disso, o métodoutilizado difere do empregado em outros trabalhos brasileiros. As amostras avaliadas apresentaram



níveis maiores de susceptibilidade que os relatados por Langoni et al. (1991) e Nader Filho et al. (1992)no Estado de São Paulo. Esses autores encontraram, respectivamente, percentuais de susceptibilidade de23,1% e 15,2% para ampicilina, 72,1% e 66,1% para gentamicina, 13,7% e 1,7% para penicilina e57,2% e 23,7% para tetraciclina. A susceptibilidade de S. aureus isolados no Rio Grande do Sul(Ferreiro et al., 1985) para eritromicina (97,3%) e oxacilina (95,5%) foi mais próxima à encontradaneste estudo, porém para penicilina G (46,4%) e tetraciclina (74,1%), foi menor. Amostras de S. aureusoriginárias da Zona da Mata do Estado de Minas Gerais foram avaliadas anteriormente por Ferreiro &Melo (1981). Os percentuais de susceptibilidade relatados para eritromicina, penicilina e tetraciclinaforam, respectivamente, 99,3%, 61% e 91,6%. Considerando-se esses percentuais, observa-se que houvepequena variação na susceptibilidade para esses antimicrobianos (Tab. 1).

Todas as amostras resistentes à penicilina produziram β-lactamase, enquanto que as susceptíveis foramnegativas. Dentre as amostras testadas, uma apresentou o padrão de produção da β-lactamase indutível,isto é, somente foi positiva após cultivo em presença de penicilina. A maior susceptibilidade à oxacilinae a menor à penicilina G e ampicilina estão de acordo com seus espectros de atividade, isto é, resistênciaàs penicilinases (Yao & Moellering, 1995). Devido à maior estabilidade in vitro, a oxacilina érecomendada para avaliar a susceptibilidade das penicilinas resistentes às penicilinases (meticilina)(Woods & Washington, 1995). Segundo Ziv (1995), enquanto aproximadamente 50% dos S. aureusapresentam resistência à benzilpenicilina, a resistência à meticilina é rara entre aqueles isolados deglândula mamária bovina. Amostras de S. aureus resistentes à meticilina, isoladas de 20 rebanhosleiteiros na Bélgica, apresentaram características homogêneas, indicando serem uma únicaecovariedade, possivelmente de origem humana (Devriese & Hommez, 1975). Ainda no grupo dos β-lactâmicos, o resultado de 100% de susceptibilidade a cefalotina indica que deverá ser obtido para outrascefalosporinas de espectro de atividade mais amplo, de segunda ou terceira geração.

Na Tab. 2 são apresentados os resultados da variação da susceptibilidade para ampicilina, penicilina,tetraciclina e tilosina entre os quatro grupos de amostras. O nível de resistência para ampicilina,penicilina e tilosina foi maior (P<0,02) nas amostras isoladas de casos clínicos. O mesmo foi observadopara ampicilina e penicilina (P<0,02) nas isoladas de mastite subclínica com escores positivos no CMT.Mesmo considerando o pequeno número de amostras avaliadas por grupo, estes resultados indicam queos dois grupos de amostras estão mais sujeitos à pressão seletiva por parte dos antimicrobianos.

Tabela 2. Diferenças nos padrões de susceptibilidade entre amostras de Staphylococcus aureus isoladasde glândulas mamárias bovinas com infecções clínicas, crônicas e subclínicas com escores negativo epositivo no Califórnia mastite teste (CMT)

Casos clínicos Casos crônicos CMT negativo CMT positivoAmpicilina

MIC50 (µgml-1) 0,125 0,125 0,125 0,25MIC90 (µgml-1) 1,0 0,125 1,0 0,50Variação (µgml-1) 0,03 - 2,0 0,06 - 1,0 0,06 - 2,0 0,06 - 2,0Susceptíveis (%) 54 1 91 72 54 1

PenicilinaMIC50 (µgml-1) 0,06 0,03 0,06 0,125MIC90 (µgml-1) 0,5 0,03 2,0 0,5Variação (µgml-1) 0,015 - 1,0 0,015 - 0,5 0,03 - 2 0,03 – 2,0Susceptíveis (%) 54 1 91 72 54 1

TetraciclinaMIC50 (µgml-1) 0,5 1,0 0,5 1,0MIC90 (µgml-1) 32 1,0 1,0 0,5Variação (µgml-1) 0,25 - 64 0,25 - 1,0 0,25 - 64 0,25 - 64Susceptíveis (%) 79 100 92 93

Brito et al.


TilosinaMIC50 (µgml-1) 2,0 2,0 2,0 2,0MIC90 (µgml-1) 4,0 2,0 2,0 2,0Variação (µgml-1) 0,5 - 4,0 1,0 – 4,0 1,0 - 2,0 1,0 - 2,0Susceptíveis (%) 62,5 1 95 100 100

1 Percentual de susceptibilidade menor em relação aos demais grupos (P<0,02)

As amostras isoladas de infecção crônica apresentaram maior percentual de susceptibilidade. Isso,provavelmente, está relacionado aos procedimentos adotados no rebanho com relação ao uso deantimicrobianos para tratamento da mastite. Ziv (1995) observou que o tratamento no início do períodoseco durante 20 anos em alguns rebanhos não levou à seleção de variantes resistentes associadas aotratamento. Este resultado sugere que estudos sobre o padrão de susceptibilidade de patógenos da mastiteem rebanhos, considerando o esquema de tratamento empregado, poderão contribuir com informaçõesúteis para orientar o uso racional de antimicrobianos.

Os resultados mostraram que, apesar do emprego disseminado de antimicrobianos para tratamento damastite, tanto durante a lactação como no início do período seco, a maioria das amostras apresentoususceptibilidade aos antimicrobianos testados. A indicação terapêutica deve levar em consideração osvalores obtidos pelas CMI, pois o tratamento deve proporcionar níveis de antimicrobiano maiores que aCMI no local da infecção. As propriedades farmacocinéticas do composto, incluindo solubilidade emlipídio, constante de dissociação e afinidade de se ligar à proteína, determinam a capacidade depenetração nos tecidos, a distribuição entre sangue e leite e a proporção ativa não ligada a outrassubstâncias no corpo do animal (Francis, 1989; Sumano & Ocampo, 1992). Com essa informação, oveterinário clínico poderá realizar a terapia de maneira racional, de modo a alcançar os benefíciosesperados, tanto para a saúde do animal como para o controle da mastite.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem o apoio financeiro da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais(CAG 2235/96) e ao Dr. Rui da Silva Verneque pelas sugestões dadas para a análise estatística.

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