UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE

„IULIU HAŢIEGANU” CLUJ-NAPOCA

CATEDRA DE MICROBIOLOGIE

TESTAREA SENSIBILITĂŢII LA ANTIFUNGICE A

SPECIILOR DE CANDIDA

REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT

Conducător ştiinţific Doctorand

Prof. Univ. Dr. Lia Monica JUNIE Ioana Alina COLOSI

Cluj-Napoca 2010

CUPRINSUL TEZEI DE DOCTORAT INTRODUCERE .......................................................................................................................................... 3 PARTEA I STADIUL ACTUAL AL CUNOAŞTERII................................................................................ 4 Capitolul 1. Levurile din genul Candida......................................................................................................... 5 1.1 Istoric........................................................................................................................................................ 5 1.2 Taxonomie şi clasificare............................................................................................................................ 5 1.3 Caractere generale..................................................................................................................................... 9 Capitolul 2. Patogenitate .............................................................................................................................. 11 2.1 Factori de patogenitate ai Candida şi factori de apărare ai gazdei............................................................. 12 2.2. Factori de risc asociaţi infecţiei cu Candida............................................................................................ 17 Capitolul 3. Infecţii determinate de Candida ................................................................................................ 19 Capitolul 4. Identificarea speciilor de Candida ............................................................................................. 24 4.1 Examenul microscopic direct................................................................................................................... 24 4.2 Teste fiziologice...................................................................................................................................... 25 4.3 Cultivarea pe medii ................................................................................................................................. 26 4.4 Teste biochimice ..................................................................................................................................... 29 4.5 Teste rapide de identificare a unor specii de Candida............................................................................... 30 4.6 Tehnici moleculare.................................................................................................................................. 32 Capitolul 5. Metodele utilizate pentru testarea sensibilităţii la antifungice a speciilor de Candida ................. 32 5.1 Metoda microdiluţiilor M27-A ............................................................................................................... 34 5.2 Metoda difuzimetrică M44-A .................................................................................................................. 38 5.4 Metoda difuzimetrică Neo-Sensitabs® .................................................................................................... 41 5.3 E-Test® (AB Biodisk, Solna, Suedia)..................................................................................................... 42 5.5 Alte metode comercializate, nestandardizate, pentru testarea sensibilităţii la antifungice a Candida spp. .. 47 PARTEA A II-A CERCETĂRI PERSONALE.......................................................................................... 54 Studiul I: Distribuţia şi testarea sensibilităţii la antifungice a speciilor de Candida din Cluj-Napoca, România şi Grenoble, Franţa........................................................................................................................................ 55 Capitolul 6. Ipoteze, scop şi obiective .......................................................................................................... 55 6.1 Ipoteza cercetării ..................................................................................................................................... 55 6.2 Scopul cercetării...................................................................................................................................... 55 6.3 Obiectivele cercetării............................................................................................................................... 56 Capitolul 7. Material şi metodă .................................................................................................................... 56 7.1 Tulpinile studiate .................................................................................................................................... 56 7.2 Testarea sensibilităţii la antifungice a tulpinilor de Candida spp. izolate .................................................. 69 7.3 Metodele de analiză statistică utilizate ..................................................................................................... 82 Capitolul 8. Rezultate................................................................................................................................... 84 I. Speciile de Candida izolate........................................................................................................................ 84 8.1 Speciile de Candida izolate din diverse produse patologice ..................................................................... 84 8.2 Speciile de Candida izolate de la pacienţi din diferite grupe de risc ......................................................... 98 II. Testarea sensibilităţii la antifungice........................................................................................................ 108 8.3 Testarea sensibilităţii la Fluconazol şi compararea profilului de sensibilitate la Fluconazol a tulpinilor de Candida izolate din Cluj-Napoca şi Grenoble ......................................................................................... 108 8.4 Testarea sensibilităţii la Voriconazol şi compararea profilului de sensibilitate la Voriconazol a tulpinilor de Candida izolate din Cluj-Napoca şi Grenoble ......................................................................................... 115 8.5 Testarea sensibilităţii la Caspofungină şi compararea profilului de sensibilitate la Caspofungină a tulpinilor de Candida izolate din Cluj-Napoca şi Grenoble ......................................................................................... 132 8.6 Testarea sensibilităţii la Amfotericină B a tulpinilor de Candida spp. .................................................... 140 8.7 Testarea sensibilităţii la Itraconazol a tulpinilor de C.krusei................................................................... 143 Capitolul 9. Discuţii ................................................................................................................................... 144 Capitolul 10. Concluzii .............................................................................................................................. 157 Studiul II: Compararea a două metode, E-test® şi metoda difuzimetrică Neo-Sensitabs®, pentru testarea sensibilităţii la antifungice a speciilor de Candida ....................................................................................... 159 Capitolul 11. Ipoteze, scop şi obiective ...................................................................................................... 159 11.1 Ipoteza cercetării ................................................................................................................................. 160

11.2 Scopul cercetării.................................................................................................................................. 160 11.3 Obiectivele cercetării........................................................................................................................... 160 Capitolul 12. Material şi metodă ................................................................................................................ 161 12.1 Tulpinile studiate................................................................................................................................. 161 12.2 Metodele utilizate pentru testarea sensibilităţii la antifungice a tulpinilor de Candida .......................... 161 12.3 Metodele de analiză statistică utilizate ................................................................................................. 168 Capitolul 13. Rezultate............................................................................................................................... 169 13.1 Rezultatele testării sensibilităţii la antifungice a tulpinilor de Candida prin E-test® şi metoda difuzimetrică Neo-Sensitabs® ...................................................................................................................... 169 13.2 Rezultatele testării sensibilităţii la Amfotericină B a tulpinilor de Candida spp. prin E-test® şi metoda difuzimetrică Neo-Sensitabs® ...................................................................................................................... 170 13.3 Rezultatele testării sensibilităţii la Fluconazol a tulpinilor de Candida spp. prin E-test® şi metoda difuzimetrică Neo-Sensitabs® ...................................................................................................................... 172 13.4 Rezultatele testării sensibilităţii la Voriconazol a tulpinilor de Candida spp. prin E-test® şi metoda difuzimetrică Neo-Sensitabs® ...................................................................................................................... 174 13.5 Rezultatele testării sensibilităţii la Caspofungină a tulpinilor de Candida spp. prin E-test® şi metoda difuzimetrică Neo-Sensitabs® ...................................................................................................................... 179 Capitolul 14. Discuţii ................................................................................................................................. 184 Capitolul 15. Concluzii .............................................................................................................................. 187 CONCLUZII GENERALE....................................................................................................................... 188 REFERINŢE............................................................................................................................................. 189

CUVINTE CHEIE

Candida, infecţii fungice, factori de risc,

antifungice: Fluconazol, Voriconazol, Caspofungină, Amfotericină B, Itraconazol,

E-test®, metoda difuzimetrică M44-A, metoda difuzimetrică Neo-Sensitabs®.

Introducere

Infecţiile oportuniste de etiologie micotică se constituie într-o nouă provocare medicală la început de secol 21.

Infecţiile fungice sunt de obicei oportuniste, asociate cu disfuncţii imune şi cu prezenţa unor factori de risc (ex.

utilizarea antibioticelor cu spectru larg). Numărul pacienţilor cu disfuncţii imune a crescut dramatic datorită pandemiei

SIDA, creşterii numărului pacienţilor transplantaţi, chimioterapiei agresive antineoplazice. Fungii sunt de asemenea

recunoscuţi ca importanţi agenţi etiologici ai infecţiilor nosocomiale, determinând infecţii severe la pacienţii

imunodeprimaţi: pacienţi cu arsuri extinse, cateterizaţi, hemodializaţi, pacienţi aflaţi la vârste extreme.

Se impune necesitatea cunoaşterii epidemiologiei (cunoaşterea speciilor implicate), patogeniei (ex. izolarea

Candida nu înseamnă întotdeauna infecţie), formelor clinice şi cunoaşterea aspectelor terapeutice a infecţiilor micotice.

Pentru aceasta, izolarea şi identificarea agentului etiologic precum şi determinarea profilului de sensibilitate la

antifungice sunt esenţiale.

Ajutorul laboratorului în alegerea terapiei este hotărâtor prin precizarea sensibilităţii tulpinii de Candida la

antifungicul utilizat. Astfel, determinarea printr-o metodă standardizată a sensibilităţii la antifungice a Candida spp. este

deosebit de importantă, mai ales în contextul emergenţei speciilor şi tulpinilor de Candida rezistente la antifungice.

Scopul cercetărilor prezentate în teza de faţă l-a constituit determinarea distribuţiei speciilor de Candida

implicate în patologia umană din Cluj-Napoca şi a sensibilităţii acestor specii la antifungice comparativ cu speciile de

Candida izolate din Grenoble, Franţa, precum şi evaluarea unei metode difuzimetrice, uşor de realizat, fiabile şi ieftine

pentru testarea in vitro a sensibilităţii la antifungice a speciilor de Candida.

Stadiul actual al cunoaşterii

Stadiul actual al cunoaşterii a fost structurat în 5 capitole (capitolele 1-5) şi prezintă o sinteză a cunoştinţelor

privind genul Candida, sinteză realizată prin studiul literaturii de specialitate (232 referinţe).

Cercetări personale

Prezentarea contribuţiilor personale a fost structurată în două părţi distincte, corespunzătoare celor două studii

realizate.

Studiul I: Distribuţia şi testarea sensibilităţii la antifungice a speciilor de Candida din Cluj-Napoca, România şi

Grenoble, Franţa, cuprinde capitolele 6-10.

Capitolul 6 expune ipotezele, scopul şi obiectivele studiului. Scopul cercetării a fost determinarea distribuţiei

speciilor de Candida implicate în patologia umană din Cluj-Napoca şi a sensibilităţii acestor specii la antifungice

comparativ cu speciile de Candida izolate din Grenoble, Franţa.

Capitolul 7 prezintă tulpinile de Candida spp. studiate: în perioada iulie 2007- decembrie 2008 s-a realizat

identificarea şi testarea sensibilităţii la antifungice a speciilor de Candida izolate din diverse produse patologice

provenite de la pacienţi spitalizaţi în Clinica de Boli Infecţioase din Cluj-Napoca şi de la pacienţi spitalizaţi în Spitalul

Clinic Universitar din Grenoble, Franţa. Probele prelucrate în laboratorul Clinicii de Boli Infecţioase din Cluj-Napoca

au provenit atât de la pacienţi internaţi în această clinică cât şi de la pacienţi internaţi în alte clinici din Cluj-Napoca,

pacienţi internaţi în secţii chirurgicale, de terapie intensivă, pediatrie sau medicale.

Au fost descrise metodele utilizate pentru testarea sensibilităţii tulpinilor izolate de Candida spp. la antifungice:

pentru Fluconazol şi Voriconazol metoda difuzimetrică M44-A şi E-test®, pentru Caspofungină, Amfotericină B şi

Itraconazol E-test®.

Metodele de analiză statistică a datelor au fost:

- testul Chi-pătrat, testul exact al lui Fisher;

- testul U al lui Mann-Whitney;

- coeficientul de corelaţie (R) al lui Pearson;

Pentru realizarea analizelor statistice şi a modelelor de regresie s-a utilizat programul SPSS 13.0.

Capitolul 8 prezintă rezultatele obţinute în studiul I.

Speciile de Candida izolate

Din Cluj-Napoca s-au identificat 249 tulpini de Candida spp.: C.albicans (45%), C.glabrata (26,1%), C.krusei

(10,04%), C.parapsilosis (5,62%), C.tropicalis (4,82%), C.famata (2,41%), C.guilliermondii (2,01%), C.pelliculosa

(0,8%), C.lipolytica (0,8%), C.kefyr (0,8%), C.sake (0,4%), C.lusitaniae (0,4%), C.inconspicua (0,4%), C.curvata

(0,4%).

Din Grenoble s-au identificat 813 tulpini de Candida spp.: C.albicans (51,91%), C.glabrata (20,66%), C.tropicalis

(6,40%), C.parapsilosis (5,78%), C.krusei (5,41%), C.kefyr (4,43%), C.inconspicua (1,85%), C.lusitaniae (1,72%),

C.guilliermondii (0,98%), C.utilis (0,37%), C.catenulata (0,12%), C.lipolytica (0,12%), C.pulcherima (0,12%).

Din hemoculturi, în Cluj-Napoca, principalele specii izolate a fost C.albicans, C.parapsilosis, C.glabrata,

C.tropicalis, iar în Grenoble C.albicans, C.glabrata, C.parapsilosis şi C.tropicalis. În Cluj-Napoca, din urini,

principala specie izolată a fost C.glabrata. Din Grenoble, din urini, principala specie izolată a fost C.albicans.

În Cluj-Napoca, de la pacienţi internaţi în secţii chirurgicale, pe primul loc ca frecvenţă a izolării s-a situat

C.glabrata, în secţii de boli infecţioase după C.albicans s-a situat C.krusei, iar în secţii de pediatrie după C.albicans s-a

situat C.parapsilosis.

Testarea sensibilităţii la antifungice şi compararea profilului de sensibilitate la antifungice a tulpinilor de Candida

izolate din Cluj-Napoca şi Grenoble

Rezultatele testării sensibilităţii la Fluconazol sunt reprezentate grafic în figurile 83 şi 84.

Nu au fost testate la Fluconazol tulpinile de C.krusei (C.krusei fiind rezistentă la Fluconazol).

În Cluj-Napoca, toate tulpinile testate de C.kefyr, C.lusitaniae, C.lipolytica, C.guilliermondii, C.inconspicua şi

C.curvata au fost sensibile la Fluconazol.

În Grenoble, toate tulpinile de C.tropicalis, C.kefyr, C.guilliermondii, C.utilis, C.lipolytica, C.pelliculosa, C.pulcherima

şi C.catenulata au fost sensibile la Fluconazol.

Diferenţa de sensibilitate la Fluconazol a tulpinilor de Candida spp. izolate din Cluj-Napoca şi din Grenoble a

fost semnificativă statistic (p <<0.001, testul chi-pătrat şi testul Fisher exact).

Riscul relativ (RR) ca o tulpină de Candida spp. izolată din Cluj-Napoca să fie mai rezistentă la Fluconazol decât o

tulpină de Candida spp. izolată din Grenoble a fost 4,038, cu un interval de încredere 95% de [2,191 – 7,444].

57.81%

7.69% 8.33%

16.67%

100%

17.19%

5.41%

83.33%91.67%92.31%93.69%

25%

0,9%0%

20%

40%

60%

80%

100%

C.albica

ns

C.glab

rata

C.parap

silos

is

C.tropic

alis

C.famata

C.sake

RSSDD

100% 100%

78.57%

50%

8.93%0.24%

74.40%

99.53% 97.87%

35.71%

16.67%21.43%

2.13%0.24%0%

20%

40%

60%

80%

100%

C.albic

ans

C.glab

rata

C.tropic

alis

C.parap

silosis

C.kefyr

C.inco

nspic

uaC.lu

sitan

iae RSSDD

Figura 83. Sensibilitatea la Fluconazol a speciilor de Figura 84. Sensibilitatea la Fluconazol a speciilor de Candida din Cluj-Napoca Candida din Grenoble

Rezultatele testării sensibilităţii la Voriconazol sunt reprezentate grafic în figurile 90 şi 91.

În Cluj-Napoca, toate tulpinile testate de C.famata, C.guilliermondii, C.kefyr, C.lusitaniae, C.lipolytica, C.inconspicua,

C.curvata, şi C.pelliculosa au fost sensibile la Voriconazol.

În Grenoble, toate tulpinile de C.parapsilosis, C.tropicalis, C.kefyr, C.inconspicua, C.lusitaniae, C.guilliermondii,

C.utilis, C.lipolytica, C.pelliculosa, C.pulcherima şi C.catenulata au fost sensibile la Voriconazol.

100%

75%

91.67% 88.89%

11.11%8.33%10%

17,5%

5.48%

77,5%

94.52%

15%5%

0%

20%

40%

60%

80%

100%

C.albica

ns

C.glab

rata

C.kruse

i C.pa

rapsil

osis

C.tropic

alis

C.sake

RSSDD

2.27%

99.76%91.67%

100% 100% 97.73% 100%

0.24%5.35% 2.98%

0%

20%

40%

60%

80%

100%

C.albic

ans

C.glab

rata

C.tropic

alis

C.parap

silosis

C.krus

ei

C.kefyr

RSSDD

Figura 90. Sensibilitatea la Voriconazol a speciilor Figura 91. Sensibilitatea la Voriconazol a speciilor de Candida din Cluj-Napoca de Candida din Grenoble

Diferenţa de sensibilitate la Voriconazol a tulpinilor de Candida spp. izolate din Cluj-Napoca şi din Grenoble a

fost semnificativă statistic (p <<0.001, testul chi-pătrat şi testul Fisher exact).

Riscul relativ (RR) ca o tulpină de Candida spp. izolată din Cluj-Napoca să fie mai rezistentă la Voriconazol decât o

tulpină de Candida spp. izolată din Grenoble a fost 6,295, cu un interval de încredere 95% de [3,033 – 13,064].

Caspofungină

Toate tulpinile de Candida testate din Cluj-Napoca au fost sensibile la Caspofungină, cu excepţia unei tulpini de

C.parapsilosis care a fost non-sensibilă la Caspofungină, CMI-ul obţinut pentru această tulpină a fost de 2 µg/ml. Toate

tulpinile de Candida izolate din Grenoble au fost sensibile la Caspofungină.

Diferenţa de sensibilitate la Caspofungină a tulpinilor de Candida spp. izolate din Cluj-Napoca şi din Grenoble fost

nesemnificativă statistic (p = 0.139, testul Fisher exact).

S-a constat că există o diferenţă înalt semnificativă statistic (p<<0.001, testul Mann-Whitney) între CMI-urile

la Caspofungină obţinute pentru tulpinile de Candida spp. izolate din Cluj-Napoca şi Grenoble. CMI-urile obţinute în

Cluj-Napoca s-au încadrat în intervalul 0,032 -2 µg/ml, cu o mediană de 0,25 µg/ml, iar CMI-urile obţinute în Grenoble

la Caspofungină pentru tulpinile testate de Candida spp. s-au încadrat în intervalul 0,004 - 1µg/ml, cu o mediană de

0,064 µg/ml (figura 105).

Rezultatele testării sensibilităţii la Amfotericină B a tulpinilor de Candida spp. (figura 110)

Toate tulpinile de C.albicans, C.inconspicua, C.lusitaniae, C.guilliermondii, C.utilis, C.lipolytica, C.pelliculosa,

C.pulcherima şi C.catenulata testate în Grenoble au fost sensibile la Amfotericină B.

Rezultatele testării sensibilităţii la Itraconazol a celor 32 tulpini de C.krusei izolate din Grenoble: 11 tulpini au

fost rezistente (46,87%) şi 14 SDD (43,75%).

Figura 105. CMI-urile pentru Caspofungină obţinute pentru tulpinile de Candida din Cluj-Napoca şi Grenoble

100% 98.20% 98.08% 95.74%86.36%

97.22%

4.54%1.92%0,6% 2.78%4.26%1,2%9,1%

0%

20%

40%

60%

80%

100%

C.albic

ans

C.glab

rata

C.tropic

alis

C.parap

silosis

C.krus

ei

C.kefyr

RSI

Figura 110. Sensibilitatea la Amfotericină B a speciilor de Candida izolate din Grenoble.

Capitolul 9 interpretează şi discută rezultatele acestei prime părţi a cercetării, prin raportare la cercetări

asemănătoare.

Capitolul 10 prezintă concluziile primei părţi a cercetării. Dintre acestea, menţionez în continuare următoarele: 1. Principalele specii de Candida izolate din Cluj-Napoca şi Grenoble au fost Candida albicans şi Candida glabrata. În

Cluj-Napoca pe locul 3 ca frecvenţă a izolării s-a situat Candida krusei (specie rezistentă la Fluconazol), în Grenoble

situându-se pe locul 5, după Candida tropicalis şi Candida parapsilosis.

2. Tulpinile de Candida spp. izolate din Cluj-Napoca au fost mai rezistente la Fluconazol şi Voriconazol decât tulpinile

de Candida izolate din Grenoble.

3. Valorile concentraţiilor minime inhibitorii la Caspofungină obţinute pentru tulpinile de Candida spp. testate la Cluj-

Napoca au fost mai mari decât cele obţinute la Grenoble.

4. În iniţierea unui tratament antifungic empiric este esenţială cunoaşterea speciilor de Candida dintr-un anumit areal

geografic, respectiv spital şi profilul lor de sensibilitate la antifungice.

5. Diferenţele observate între Cluj-Napoca şi Grenoble subliniază importanţa şi necesitatea unor protocoale pentru

depistarea şi supravegherea pacienţilor la risc, pentru stabilirea diagnosticului etiologic micologic, finalizate cu testarea

sensibilităţii la antifungice.

Studiul II: Compararea a două metode, E-test® şi metoda difuzimetrică Neo-Sensitabs®, pentru testarea

sensibilităţii la antifungice a speciilor de Candida, cuprinde capitolele 11-15.

Capitolul 11 expune ipotezele, scopul şi obiectivele. Scopul cercetării a fost evaluarea unei metode

difuzimetrice, uşor de realizat, fiabile, ieftine pentru testarea in vitro a sensibilităţii la antifungice a speciilor de

Candida. Obiectivul studiului a fost realizarea unei comparaţii între două metode de testare a sensibilităţii la antifungice

a speciilor de Candida: E-test® (AB Biodisk, Solna, Suedia) şi metoda difuzimetrică Neo-Sensitabs® (Rosco

Diagnostica, Taastrup, Denmark) cu tablete de 9 mm diametru. E-test®-ul este o metodă de testare a sensibilităţii

Candida la antifungice standardizată, uşor de realizat dar al cărui principal dezavantaj îl constituie costul ridicat (10

euro/bandeletă), ceea ce îl face inaccesibil pentru majoritatea laboratoarelor clinice, impunându-se astfel găsirea unei

metode care să păstreze avantajele E-test®-ului dar care să fie mai ieftină.

Capitolul 12 prezintă materialul şi metodele utilizate pentru realizarea acestui studiu.

S-a realizat identificarea şi testarea sensibilităţii la antifungice prin E-test® şi prin metoda difuzimetrică Neo-Sensitabs®

a 93 de tulpini de Candida spp. izolate din diverse produse patologice provenite de la pacienţi din Spitalul Clinic

Universitar din Grenoble, Franţa în perioada februarie – aprilie 2009.

S-a determinat procentul concordanţelor calitative dintre rezultatele obţinute prin E-test® şi cele obţinute prin metoda

difuzimetrică Neo-Sensitabs®. Au fost identificate următoarele discordanţe: foarte mari - când o tulpină a fost rezistentă

(R) prin E-test® şi sensibilă (S) cu Neo-Sensitabs®, mari - când o tulpină a fost S prin E-test® şi R cu Neo-Sensitabs®,

minore – când o tulpină a fost S sau SDD printr-o metodă şi SDD sau R prin cealaltă.

Analiza statistică a datelor s-a realizat utilizând modele de regresie liniară şi calculul coeficientului de corelaţie Pearson

(R) dintre valorile liniarizate prin logaritmare ale CMI (exprimate în µg/ml) şi diametrele zonelor de inhibiţie

(exprimate în milimetri) obţinute pentru antifungicele testate, interpretându-se pentru fiecare regresie în parte

coeficientul de corelaţie R al lui Pearson şi nivelul său de semnificaţie statistică. Pentru realizarea modelelor de regresie

s-a utilizat programul SPSS 13.0.

Capitolul 13 prezintă rezultatele obţinute în studiul II.

Pentru Amfotericină B procentul de concordanţă obţinut între E-test® şi metoda difuzimetrică Neo-Sensitabs®

a fost de 90,32%. S-au constatat 6 discordanţe minore (pentru 5 tulpini de C.glabrata şi 1 tulpină de C.albicans) şi 3

discordanţe foarte mari (pentru 2 tulpini de C.glabrata şi 1 tulpină de C.krusei). Coeficientul de corelaţie R, dintre

Log2CMI Amfotericină B şi diametrul zonei de inhibiţie a fost -0,622 (figura 121).

Pentru Fluconazol procentul de concordanţă obţinut între E-test® şi metoda difuzimetrică Neo-Sensitabs® a

fost de 100%. Coeficientul de corelaţie R, dintre Log2CMI Fluconazol şi diametrul zonei de inhibiţie, a fost de -0,654.

Pentru Voriconazol procentul de concordanţă obţinut între E-test® şi metoda difuzimetrică Neo-Sensitabs® a

fost de 100%. Coeficientul de corelaţie R, dintre Log2CMI Voriconazol şi diametrul zonei de inhibiţie, a fost -0,620.

Figura 121. Amfotericină B – reprezentarea grafică Figura 128. Caspofungină – reprezentarea grafică a relaţiei dintre Log2CMI (E-test®) şi diametrul a relaţiei dintre Log2CMI (E-test®) şi diametrul zonei de inhibiţie (Neo-Sensitabs®). zonei de inhibiţie (Neo-Sensitabs ®)

Pentru Caspofungină procentul de concordanţă obţinut între E-test® şi metoda difuzimetrică Neo-Sensitabs® a

fost de 98,92%. S-a constatat 1 discordanţă mare (pentru 1 tulpină de C.krusei). Coeficientul de corelaţie R, dintre

Log2CMI Caspofungină şi diametrul zonei de inhibiţie, a fost de -0,679 (figura 128).

Valoarea tuturor coeficienţilor de corelaţie R a prezentat o înaltă semnificaţie statistică (p<<0,001).

Capitolul 14 - interpretează şi discută rezultatele celui de-al II-lea studiu din contribuţiile personale, prin

raportare la cercetări asemănătoare, subliniind punctele forte, dar totodată şi limitările inerente oricărui studiu.

Capitolul 15 prezintă concluziile celei de-a doua părţi a cercetării personale. Dintre acestea menţionez în

continuare următoarele: 1. E-test® -ul este o metodă de testare a sensibilităţii la antifungice a speciilor de Candida standardizată, uşor de utilizat

în practică, dar valorile concentraţiilor minime inhibitorii (µg/ml) sunt uneori dificil de citit mai ales pentru azoli,

datorită fenomenului de creştere reziduală. Un alt dezavantaj al E-test®-ului este costul ridicat.

2. Zonele de inhibiţie obţinute prin metoda difuzimetrică Neo-Sensitabs® au fost bine delimitate şi măsurarea

diametrului zonelor de inhibiţie s-a realizat cu uşurinţă, fiind unul din principalale avantaje ale metodei. De asemenea,

această metodă este uşor de utilizat în laboratoarele clinice, costul fiind mult mai scăzut decât al E-test®-ului.

3. S-a obţinut o excelentă concordanţă între rezultatele E-test®-ului şi Neo-Sensitabs® pentru Fluconazol, Voriconazol şi

Caspofungină, un nivel mai scăzut de concordanţă obţinându-se pentru Amfotericină B.

CONCLUZII GENERALE

1. Infecţiile fungice rămân afecţiuni grave şi frecvenţa lor a crescut considerabil în ultimii ani. Creşterea numărului de

pacienţi imunodeprimaţi şi explozia intervenţiilor medico-chirurgicale invazive au contribuit în mare măsură la

emergenţa acestei patologii. În faţa acestei modificări epidemiologice posibilităţile terapeutice s-au îmbunătăţit,

cuprinzând Amfotericina B, azolii şi echinocandinele.

2. În iniţierea unui tratament antifungic empiric este esenţială cunoaşterea speciilor de Candida dintr-un anumit areal

geografic, respectiv spital şi profilul lor de sensibilitate la antifungice.

3. Diferenţele observate între Cluj-Napoca şi Grenoble subliniază importanţa şi necesitatea unor protocoale pentru

depistarea şi supravegherea pacienţilor la risc, pentru stabilirea diagnosticului etiologic micologic, finalizate cu

testarea sensibilităţii la antifungice.

4. Cunoaşterea speciilor de Candida implicate în patologie, a distribuţiei acestora şi a sensibilităţii lor la antifungice

este esenţială pentru iniţierea unei terapii optime cât mai precoce, administrarea corectă a antifungicelor după

rezultatul antifungigramei limitând tratamentul empiric al infecţiilor fungice, prevenind selectarea tulpinilor de

Candida rezistente şi eşecul terapeutic.

5. Comparaţia efectuată între metoda difuzimetrică Neo-Sensitabs® şi E-test® pentru testarea sensibilităţii la

antifungice a Candida spp. este al doilea studiu care evaluează performanţele Neo-Sensitabs® pentru Amfotericină

B şi Caspofungină comparativ cu metoda E-test® şi primul studiu care evaluează performanţele Neo-Sensitabs®

pentru Fluconazol şi Voriconazol comparativ cu metoda E-test®.

6. S-a obţinut o excelentă concordanţă între rezultatele E-test®-ului şi Neo-Sensitabs® pentru Fluconazol, Voriconazol

şi Caspofungină.

7. Metoda difuzimetrică Neo-Sensitabs® pentru testarea sensibilităţii la Fluconazol şi Voriconazol a Candida spp.

prezintă multiple similitudini cu metoda standardizată M44-A, putând reprezenta o alternativă uşor de utilizat în

laboratoarele clinice şi mai ieftină decât E-test®-ul, existând posibilitatea unei predicţii a CMI în funcţie de

diametrul zonei de inhibiţie prin realizarea de modele de regresie liniară.

Bibliografie selectivă 1. White TC. Mechanism of resistance to antifungal agents. In Murray PR, editor. Manual of Clinical Microbiology. 8th ed. Washington D.C (USA): ASM PRESS; 2003:p.1869-79. Pfaller MA. Nosocomial candidiasis: emerging species, reservoirs and mode of transmission. Clin Infect Dis 1996;22(suppl.2):89-94. 2. Espinel-Ingroff A, Barchiesi F, Hazen KC, Martinez-Suarez JV, Scalise G. Standardisation of susceptibility testing and clinical relevance. Med Mycol 1998;36:68-78. 3. Pfaller MA. Nosocomial candidiasis: emerging species, reservoirs and mode of transmission. Clin Infect Dis 1996;22(suppl.2):89-94. 4. Mares M, Bazgan O. Diagnosticul de laborator al infecţiilor produse de fungi. În Buiuc D, Neguţ M. Tratat de microbiologie clinică. Ed.Medicală, Bucureşti; 2008. p.953-6. 5. Espinel-Ingroff A, Canton A, Gibbs D, Wang A. Correlation of Neo-Sensitabs tablet diffusion assay results on three different agar media with broth microdilution M27-A2 and disk diffusion M44-A results for testing susceptibilities of Candida spp. and Cryptococcus neoformans to Amphotericin B, Caspofungin, Fluconazole, Itraconazole and Voriconazole. J Clin Microbiol 2007;45(3):858-64. 6. Espinel-Ingroff A, Canton E. Antifungal susceptibility testing of yeasts. In Antimicrobial susceptibility testing protocols. Edited by Schwalbe R, Steele-Moore L, Goodwin AC. CRC Press, Taylor & Francis Group 2007. 7. Pappas PG, Kauffman CA, Andes D, Benjamin DK Jr, Calandra TF, Edwards JE Jr, Filler SG, Fisher JF, Kullberg BJ, Ostrosky-Zeichner L, Reboli AC, Rex JH, Walsh TJ, Sobel JD; Infectious Diseases Society of America. Clinical

practice guidelines for the management of candidiasis: 2009 update by the Infectious Diseases Society of America. Clin Infect Dis 2009;48(5):503-35. 8. Pfaller MA, Boyken L, Hollis RJ, Messer SA, Tendolkar S, Diekema DJ. In vitro susceptibilities of Candida spp. to caspofungin: four years of global surveillance. J Clin Microbiol 2006;44(3):760-3. 9. Thompson GR, Wiederhold NP, Vallor AC, Villareal NC, Lewis JS, Patterson TF. Development of caspofungin resistance following prolonged therapy for invasive candidiasis secondary to Candida glabrata infection. Antimicrob Agents Chemother 2008;52(10):3783-85. 10. Pfaller MA, Diekema DJ. Epidemiology of invasive candidiasis: a persistent public health problem. Clin Microbiol Reviews 2007;20(1):133–63. 11. Ostrosky-Zeichner L, Rex JH, Pappas PG, Hamill RJ, Larsen RA, Horowitz HW, Powderly WG, Hyslop N, Kauffman CA, Cleary J, Mangino JE, Lee J. Antifungal susceptibility survey of 2,000 bloodstream Candida isolates in the United States. Antimicrob Agents Chemother 2003;47(10):3149-54. 12. Pfaller MA, Diekema DJ, Gibbs DL, Newell VA, Meis JF, Gould IM, Fu W, Colombo AL, Rodriguez-Noriega E; Global Antifungal Surveillance Study. Results from the ARTEMIS DISK Global Antifungal Surveillance study, 1997 to 2005: an 8.5-year analysis of susceptibilities of Candida species and other yeast species to fluconazole and voriconazole determined by CLSI standardized disk diffusion testing. J Clin Microbiol 2007;45(6):1735-45.

Dr. Ioana Alina COLOSI Asistent universitar Universitatea de Medicină şi Farmacie “Iuliu Haţieganu” Cluj-Napoca, România Catedra de Microbiologie Str. Louis Pasteur nr. 6, cod 400349, Cluj-Napoca, România Email: ioana.colosi@gmail.com

CURRICULUM VITAE

1. Nume: OPRIŞ, căsătorită COLOSI 2. Prenume: IOANA ALINA 3. Data şi locul naşterii: 27august 1974, Cluj-Napoca 4. Cetăţenie: română 5. Stare civilă: căsătorită

6. Studii: Instituţia Liceul Teoretic

Zalău U.M.F. “Iuliu Haţieganu”, Cluj-Napoca

U.M.F. “Iuliu Haţieganu” Cluj-Napoca

Catedra de Informatică Medicală şi Biostatistică

U.M.F. “Iuliu Haţieganu” Cluj-Napoca Catedra de

Microbiologie Perioada:

sept.1988-iun.1992

oct.1992-sept.1998

nov.2007- iun. 2009 nov.2005-

Grade sau diplome obţinute

Diploma de bacalaureat

Doctor-medic, specializarea

Medicină Generală

Master Metodologia Cercetării în Ştiinţele

Vieţii

Doctorand domeniul Medicină

7. Titlul ştiinţific: MSc, doctorand 8. Experienţa profesională: Perioada:

ian.1999-feb.2000

mar.2001-mar.2003

ian.2003-dec.2007

oct.2004- prezent

Locul: Cluj-Napoca Cluj-Napoca Cluj-Napoca Cluj-Napoca Instituţia: Spitalul

Clinic de Adulţi

Spitalul Clinic de Adulţi

Spitalul Municipal Cluj/U.M.F. “Iuliu Haţieganu”

U.M.F. “Iuliu Haţieganu”,

Cluj-Napoca, Catedra de

Microbiologie Funcţia: Medic stagiar Medic rezident

Medicină de Familie

Medic rezident Medicină de Laborator

Asistent universitar

9. Locul de muncă actual şi funcţia: Universitatea de Medicină şi Farmacie Iuliu Haţieganu Cluj- Napoca, Asistent universitar 10. Vechime la locul de muncă actual: 5 ani 11. Membru al asociaţiilor profesionale: Colegiul Medicilor din România Societatea Română de Micologie Medicală şi Micotoxicologie Societatea Română de Parazitologie 12. Limbi străine cunoscute: engleza, franceza 13. Specializări şi calificări: Medic specialist Medicină de Familie Medic specialist Medicină de Laborator Master UMF Cluj-Napoca, Metodologia Cercetării în Ştiinţele Vieţii doctorand UMF Cluj-Napoca, domeniul Medicină

14. Cursuri postuniversitare: - 2 martie – 10 aprilie 2009 curs de Mycologie Médicale, Institutul Pasteur, Paris, Franţa. - 2 februarie – 27 februarie 2009 - Stagiu în Laboratoire de Parasitologie-Mycologie a CHU de Grenoble, Franţa, bursa ERASMUS - 15 mai - 15 august 2008 – Stagiu în Laboratoire de Parasitologie-Mycologie a CHU de Grenoble, Franţa, bursa ERASMUS - Noiembrie 2007 - Curs „Methods of studying biofilms and hipermutability” organizat în cadrul al 43-lea Simpozion ESCMID, 2007 Palma de Mallorca, Spania. - 2003 Curs de pregătire postuniversitară organizat de UMF Cluj-Napoca- „Noutăţi în pneumologie- Boli caracterizate prin limitarea fluxului aerian” - 2002 Curs de pregătire postuniversitară organizat de UMF Cluj-Napoca- „Tuberculoza- Problemă de sănătate majoră în România” - 2001 Pregătire pedagogică, curs postuniversitar organizat de UMF Cluj-Napoca - 2000 Curs de pregătire postuniversitară organizat de Catedra de Pediatrie III din UMF Cluj- Napoca- „Urgenţe pediatrice” - 2000 Curs de pregătire postuniversitară organizat de Colegiul Medicilor Cluj şi Clinica de Pediatrie II Cluj – „Concepte şi soluţii de tratament şi profilaxie a alergiilor la nou născut şi sugar” ACTIVITATE ŞTIINŢIFICĂ:

Lucrări publicate in extenso 1. Colosi I, Faure O, Lebeau B, Colosi H, Junie M, Pelloux H. Comparison of two methods, E-test® and Neo-Sensitabs® tablet diffusion assay, for testing susceptibility of 93 Candida strains to amphotericin B, fluconazole, voriconazole, and caspofungin. Sc Parasit 2009:1-2:112-22. 2. Colosi I, Costache C, Junie M. Patogenia infecţiilor cu Candida: factorii de patogenitate şi factorii de risc ai infecţiilor cu fungi din genul Candida. Clujul Medical 2009;82(1):30-4. 3. Colosi I, Costache C, Junie M. Rezistenţa biofilmelor de Candida la antifungice. Fungi &Mycotoxins 2009;1(3):242-9. 4. Costache C, Colosi IA, Colosi HA. Immunochromatography versus microscopy for the identification of Giardia lamblia and Cryptosporidium parvum in human feces. Sc Parasit 2009:1-2:26-31. 5. Colosi I. Methods of studying biofilms and hipermutability. Sc Parasit 2008;1:22-4. 6. Christofidou M, Spiliopoulou A, Vamvacopoulou S, Stamoulis V, Dimitracopoulos G, Anastassiou E, Junie LM, Costache C, Colosi I, Ciobanca PT. Species distribution and antifungal susceptibility of Candida isolates collected from hospitalized patients in Romania and Greece. Sc Parasit, 2008;1:61-7. 7. Costache C, Colosi I, Junie M. Specii de Candida izolate din infecţiile micotice. Sc Parasit 2008;1:68-73. 8. Costache C, Colosi I. Metoda difuzimetrică în testarea sensibilităţii la antifungice. Sc Parasit 2008;1:74-8. 9. Costache C, Junie M, Colosi I, Minica F. Incidenţa parazitozelor la pacienţii din Spitalul Clinic Judeţean de Urgenţă şi Clinica de Boli Infecţioase. Sc Parasitol 2007;8(1):39-44. Lucrări publicate în rezumat 1. Colosi I, Faure O, Bourdon C, Dessaigne B, Lebeau B, Pelloux H. Comparison of two methods, Disk diffusion and E-test, for testing susceptibility of 102 filamentous fungi to amphotericin B, itraconazole, voriconazole, caspofungin, and posaconazole. Posterpresentation at the 4th Trends in Medical Mycology (TIMM-4), 18-21 October 2009, Athens, Greece. Mycosis 2009;52(S1):30. 2. Colosi I, Costache C, Junie M, Gocan G. Serologic profile for toxoplasmic infection in pregnant women in Cluj county. Posterpresentation at the X-th European Multicolloquium of Parasitology, Paris, August 24-28, 2008, Abstract book p.183. 3. Costache C, Muresan L, Colosi I. Intestinal parasites in children hospitalized for different pathologies. Posterpresentation at the X-th European Multicolloquium of Parasitology, Paris, August 24-28, 2008. Abstract book p.131.

4. Costache C, Colosi I, Junie M, Colosi H, Boboş C. Antifungal susceptibility testing by disk diffusion on three different media. Posterpresentation at the 7-th European Congress of Chemotherapy and Infection October 19-22, 2005 Florence, Italy. Abstract book p.109. 5. Junie M, Costache C, Colosi I. The molecular basis of resistance phenomenon to antibiotics of Pseudomonas aeruginosa strains isolated from patients with urinary tract infections. Al VI-lea Congres Naţional de Farmacologie, Terapeutică şi Toxicologie Clinică, iunie 2005, Cluj-Napoca. Volum de rezumate p.478-84.

6. Junie M, Ţăţulescu D, Matinca D, Ferke A, Rădulescu A, Colosi I. Pseudomonas aeruginosa strains isolated from urine samples in Hospitals from Romania and Greece. Posterpresentation at the 11th International Congress on Infectious Diseases, Cancun, Mexic, March 3-7 2004.

7. Junie M, Ferke A, Tatulescu D, Radulescu A, Colosi I. “Resistance pattern of Enterobacter species isolated from urine and peritoneal liquid”. 11th International Congress of Infectious Diseases Cancun, Mexic, March 4-7, 2004;Abstract book p.4.

8. Junie M, Tatulescu D, Costache C, Radulescu A, Colosi I. “Identification, clinical and epidemiologic aspects in candidiasis”. Clinical Microbiology and Infection, 13th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ECCMID), Glasgow, UK, May 10-13, 2003;Vol. 9(1):218, (abs).

9. Junie M, Ferke A, Vancea D, Ţăţulescu D, Colosi I. Resistance to beta-lactam antibiotics and to cephalosporins of strains isolated from urine. 13th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ECCMID), Glasgow, UK, May 10-13, 2003; Abstract book p.272.

10. Junie M, Ferke A, Vancea D, Colosi I. Therapeutically aspects in urinary tract infections: the resistance pattern of Gram-negative bacilli to aminoglycosides, quinolones and other antibiotics. 13th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ECCMID), Glasgow, UK, May 10-13, 2003; Abstract book p. 349.

ACTIVITATE DIDACTICĂ Colaborator la cursurile postuniversitare ale Catedrei de Microbiologie: Micologie medicală şi Parazitologie

medicală.

Lucrari practice de Microbiologie cu studenţii Facultăţii de Medicină Generală anul II, III, VI, secţia română şi linia

engleză, studenţii Facultăţii de Medicină Dentară anul II, secţia română şi linia engleză, studenţii Facultăţii de

Farmacie anul II secţia română. Experienţa acumulată în programe/proiecte naţionale/internaţionale:

Programul/Proiectul Funcţia Perioada:

de la - până la CEEX – 78 Constituirea unei reţele naţionale privind studiul unor zoonoze parazitare şi implicaţiilor lor în siguranţa alimentelor.

Membru 2006-2008

CEEX – 99 TRICHID Evaluarea şi optimizarea interdisciplinară a metodelor de screening, diagnostic şi tratament în trichineloza şi echinococoza chistică umană şi animală în centrul şi nord-vestul României.

Membru 2006-2008

CEEX - 151 Constituirea unei reţele naţionale de cercetare a dermatofitozelor la om şi animale.

Membru 2006-2008

CEEX- 98/01.08.2006 Studiul biologic, biochimic, corologic şi bioproductiv al unor specii spontane din genul epilobium (fam. Onagraceae) din Transilvania, în scopul obţinerii unor extracte farmaceutice utilizabile în tratarea adenomului de prostată.

Membru 2006-2008

CNMP-PN2-contract nr. 51013 TOXANOM Optimizarea supravegherii infecţiei cu Toxoplasma gondii la unele specii de animale şi la om, ca problemă de sănătate publică în centrul şi vestul României.

Membru 2007-2010

„Iuliu Haţieganu” University of Medicine and Pharmacy, Cluj-Napoca, Romania Faculty of Medicine, Department of Microbiology

THE SUSCEPTIBILITY TESTING OF CANDIDA SPECIES

TO ANTIFUNGAL AGENTS

PhD THESIS ABSTRACT

Scientific Supervisor PhD Student Prof. Lia Monica JUNIE, MD, PhD Ioana Alina COLOSI, MD, MSc

Cluj-Napoca 2010

Keywords

Candida, fungal infections, risk factors,

Antifungal drugs: fluconazole, voriconazole, caspofungin, amphotericin B, itraconazole,

E-test®, standardized disk diffusion method M44-A, disk diffusion method Neo-Sensitabs®.

Introduction

Opportunistic fungal infections represent a new medical challenge at the beginning of the 21st century.

Fungal infections are usually associated with immune dysfunctions and the presence of risk factors (eg, use of

broad spectrum antibiotics). The number of patients with immune disorders has increased dramatically due to AIDS

pandemic, increasing number of transplant patients, aggressive cancer chemotherapy. Fungi are also known as

important etiologic agents of nosocomial infections, causing severe infections in immunosuppressed patients:

neutropenic patients, patients with extensive burns, patients with indwelling catheters, patients at extreme ages.

There is a need of knowledge regarding epidemiology (species involved), pathogenesis (e.g. Candida

isolation does not always mean infection), clinical forms and knowledge of therapeutic aspects of fungal infections.

Therefore, isolation, identification of etiologic agent, and determining the antifungal susceptibility profile of

Candida are essential.

Laboratory assistance for the choice of therapy is crucial by specifying the susceptibility of Candida strains

to antifungal drugs. Thus, a standardized method to determine the antifungal susceptibility of Candida spp. is very

important, especially in the context of the emergence of Candida strains and species resistant to antifungal drugs.

The aim of research presented in the thesis was to determine the distribution of Candida species involved in

human pathology in Cluj-Napoca, their antifungal susceptibility compared to Candida species isolated in Grenoble,

France, and the evaluation of a tablet diffusion assay, as a reliable and affordable in vitro testing method for

antifungal susceptibility of Candida species.

Literature review

The literature review was structured in 5 chapters (Chapters 1-5) and outlines a synthesis of current

knowledge regarding Candida species, synthesis achieved by studying national and international literature (232

references, up to January 2010).

Personal contributions

Original research was structured into two distinct parts, corresponding to the two studies.

The first study: Distribution and antifungal susceptibility testing of Candida species in Cluj-Napoca, Romania and

Grenoble, France, includes chapters 6-10.

Chapter 6 points out the key assumptions, study aim, and objectives. Research aim was to determine the

distribution of Candida species involved in human pathology in Cluj-Napoca and the antifungal susceptibility of

these species compared to Candida species isolated in Grenoble, France.

Chapter 7 presents the studied Candida spp. strains between July 2007-December 2008. We identified and

performed the antifungal susceptibility testing of Candida species isolated from different pathological products of

patients hospitalized in the Infectious Diseases Clinic from Cluj-Napoca and of patients hospitalized in the

University Hospital of Grenoble, France. Samples processed in the laboratory of Infectious Diseases Clinic of Cluj-

Napoca came from both patients hospitalized in the clinic and patients hospitalized in other clinics of Cluj-Napoca,

patients hospitalized in surgical wards, intensive care units, pediatric units and medical departments.

The methods used for susceptibility testing of isolates of Candida spp. to antifungal agents were also

described: for fluconazole and voriconazole - disk diffusion method M44-A and E-test®, for caspofungin,

amphotericin B, and itraconazole - E-test®.

The following methods of data analysis were used:

- Chi-square test, Fisher's exact test;

- Mann-Whitney U test

- Pearson’s correlation coefficient (R values).

To perform statistical analysis and regression models we used SPSS 13.0.

Chapter 8 describes the results obtained in the first study.

Isolated Candida species

In Cluj-Napoca we identified 249 strains of Candida spp.: C.albicans (45%), C.glabrata (26,1%), C.krusei

(10,04%), C.parapsilosis (5,62%), C.tropicalis (4,82%), C.famata (2,41%), C.guilliermondii (2,01%), C.pelliculosa

(0,8%), C.lipolytica (0,8%), C.kefyr (0,8%), C.sake (0,4%), C.lusitaniae (0,4%), C.inconspicua (0,4%), C.curvata

(0,4%).

In Grenoble we identified 813 strains of Candida spp.: C.albicans (51,91%), C.glabrata (20,66%), C.tropicalis

(6,40%), C.parapsilosis (5,78%), C.krusei (5,41%), C.kefyr (4,43%), C.inconspicua (1,85%), C.lusitaniae (1,72%),

C.guilliermondii (0,98%), C.utilis (0,37%), C.catenulata (0,12%), C.lipolytica (0,12%), C.pulcherima (0,12%).

The main Candida species isolated from blood cultures in Cluj-Napoca were C.albicans, C.parapsilosis,

C.glabrata, C.tropicalis, and in Grenoble the main candida species were: C.albicans, C.glabrata, C.parapsilosis,

and C.tropicalis.

The main Candida species isolated from urine in Cluj-Napoca was C.glabrata, and in Grenoble - C.albicans.

In Cluj-Napoca, the main Candida species isolated from patients hospitalized in surgical wards was C.glabrata,

from patients hospitalised in departments of infectious diseases - C.albicans followed by C.krusei, and from patients

hospitalized in pediatric department - C.albicans followed by C. parapsilosis.

Antifungal susceptibility testing and comparing the antifungal susceptibility profile of Candida strains isolated in

Cluj-Napoca and Grenoble

Fluconazole susceptibility testing results are plotted in figures 1 and 2. C.krusei strains were not tested against

fluconazole (C.krusei is resistant to fluconazole).

In Cluj-Napoca, all tested strains of C.kefyr, C.lusitaniae, C.lipolytica, C.guilliermondii, C.curvata, and

C.inconspicua were susceptible to fluconazole.

In Grenoble, all tested strains of C.tropicalis, C.kefyr, C.guilliermondii, C.utilis, C.lipolytica, C.pelliculosa,

C.pulcherima, and C.catenulata were susceptible to fluconazole.

The susceptibility difference to fluconazole of Candida spp. strains isolated from Cluj-Napoca and Grenoble was

statistically significant (p <<0.001, chi-square and Fisher exact test). The relative risk (RR) of a Candida spp. strain

isolated from Cluj-Napoca to be more resistant to fluconazole than a Candida spp. strain isolated from Grenoble

was 4.038, with a 95% confidence interval [2.191 - 7.444].

57.81%

7.69% 8.33%

16.67%

100%

17.19%

5.41%

83.33%91.67%92.31%93.69%

25%

0,9%0%

20%

40%

60%

80%

100%

C.albic

ans

C.glab

rata

C.parap

silosis

C.tropic

alis

C.famata

C.sake

RSSDD

100% 100%

78.57%

50%

8.93%0.24%

74.40%

99.53% 97.87%

35.71%

16.67%21.43%

2.13%0.24%0%

20%

40%

60%

80%

100%

C.albic

ans

C.glab

rata

C.tropic

alis

C.parap

silos

is

C.kefyr

C.inco

nspic

uaC.lu

sitan

iae RSSDD

Figure 1. The susceptibility to fluconazole Figure 2. The susceptibility to fluconazole of Candida strains isolated from Cluj-Napoca. of Candida strains isolated from Grenoble.

Voriconazole susceptibility testing results are plotted in figures 3 and 4.

In Cluj-Napoca, all tested strains of C.kefyr, C.lusitaniae, C.guilliermondii, C.lipolytica, C.famata,

C.inconspicua, C.curvata, and C.pelliculosa were susceptible to voriconazole.

In Grenoble, all strains of C.parapsilosis, C.tropicalis, C.kefyr, C.inconspicua, C.lusitaniae, C.guilliermondii,

C.utilis, C.lipolytica, C.pelliculosa, C.pulcherima, and C.catenulata were susceptible to voriconazole.

100%

75%

91.67% 88.89%

11.11%8.33%10%

17,5%

5.48%

77,5%

94.52%

15%5%

0%

20%

40%

60%

80%

100%

C.albic

ans

C.glab

rata

C.krus

ei C.pa

rapsilo

sis

C.tropic

alis

C.sake

RSSDD

2.27%

99.76%91.67%

100% 100% 97.73% 100%

0.24%5.35% 2.98%

0%

20%

40%

60%

80%

100%

C.albic

ans

C.glab

rata

C.tropic

alis

C.parap

silosis

C.krus

ei

C.kefyr

RSSDD

Figure 3. The susceptibility to voriconazole Figure 4. The susceptibility to voriconazole of Candida strains isolated from Cluj-Napoca. of Candida strains isolated from Grenoble.

The susceptibility difference to voriconazole of Candida spp. strains isolated from Cluj-Napoca and Grenoble

was statistically significant (p <<0.001, chi-square and Fisher exact test). The relative risk (RR) for a strain of

Candida spp. isolated from Cluj-Napoca to be more resistant to voriconazole than a strain of Candida spp. isolated

from Grenoble was 6.295, with a 95% confidence interval [3.033-13.064].

Caspofungin susceptibility testing and comparing the pattern of susceptibility to caspofungin between

Candida strains isolated in Cluj-Napoca and Grenoble

In Cluj-Napoca, all tested Candida strains were susceptible to caspofungin, except for 1 strain of

C.parapsilosis which was non-susceptible to caspofungin. The MIC obtained for this strain was 2 mg/ml.

In Grenoble, all tested Candida strains were susceptible to caspofungin.

The susceptibility difference to caspofungin of Candida spp. strains isolated from Cluj-Napoca and Grenoble

was statistically insignificant (p = 0.139, Fisher exact test).

A highly significant difference (p <<0.001, Mann-Whitney test) was found between the MICs obtained at

caspofungin for Candida spp. strains isolated from Cluj-Napoca and Grenoble. In Cluj-Napoca, the MICs obtained

at caspofungin for the tested Candida spp. strains were within the range 0.032 -2 mg/ml, with a median of 0.25

mg/ml. In Grenoble, the MICs obtained to caspofungin ranged between 0.004 - 1µg/ml, with a median of 0.064 mg /

ml (figure 5).

Figure 5. The MIC’s to caspofungin obtained for Candida spp. strains in Cluj-Napoca and Grenoble.

Amphotericin B susceptibility testing results for Candida spp. strains are plotted in figure 6.

100% 98.20% 98.08% 95.74%86.36%

97.22%

4.54%1.92%0,6% 2.78%4.26%1,2%9,1%

0%

20%

40%

60%

80%

100%

C.albic

ans

C.glab

rata

C.tropic

alis

C.parap

silosis

C.krus

ei

C.kefyr

RSI

Figure 6. The susceptibility to amphotericin B of Candida strains isolated from Grenoble.

All strains of C.albicans, C.inconspicua, C.lusitaniae, C.guilliermondii, C.utilis, C.lipolytica, C.pelliculosa,

C.catenulata, and C.pulcherima tested in Grenoble were susceptible to amphotericin B.

Itraconazole susceptibility testing results of the 32 C.krusei strains tested in Grenoble: 11 strains were

resistant (46.87%), 7 strains were susceptible (9.38%) and 14 strains were SDD (43.75%).

Chapter 9 interprets and discusses the results of the first study by comparison with similar studies.

Chapter 10 presents the main conclusions for the first part of personal contributions. In this abstract, I will only

mention some of these conclusions:

1. The main species of Candida isolates in Cluj-Napoca and Grenoble were Candida albicans and Candida

glabrata. In Cluj-Napoca, Candida krusei (a fluconazole resistant specie) ranged 3rd in frequency of isolation. In

Grenoble, C.krusei ranged 5th, after Candida tropicalis and Candida parapsilosis.

2. Candida spp. strains isolated from Cluj-Napoca were more resistant to fluconazole and voriconazole than

Candida strains isolated from Grenoble.

3. Minimum inhibitory concentration values obtained to caspofungin for the strains of Candida spp. tested in Cluj-

Napoca were higher than those obtained in Grenoble.

4. The knowledge of Candida species involved in fungal infections for a given geographical area, or hospital, and

their susceptibility profile to antifungal drugs are essential for the initiation of empirical antifungal treatment.

5. The differences observed between Cluj-Napoca and Grenoble underline the importance and need for screening

and surveillance protocols for patients at risk for fungal infections, for an accurate mycological diagnosis,

completed with antifungal susceptibility testing.

The second study, Comparison of two methods, E-test® and Neo-Sensitabs® tablet diffusion assay, for

susceptibility testing of Candida strains to amphotericin B, fluconazole, voriconazole, and caspofungin, includes

chapters 11 through 15.

Chapter 11 points out the assumptions, study aim, and objective. Research aim was to evaluate a tablet diffusion

method, easy to perform, reliable, affordable to test in vitro antifungal susceptibility of Candida species. The

objective was to perform a comparison between two methods of antifungal susceptibility testing of Candida species

to antifungal drugs: E-test® (AB Biodisk, Solna, Sweden) and Neo-Sensitabs® tablet diffusion assay (Rosco,

Denmark). E-test® is a standardized method for testing antifungal susceptibility of Candida, easy to perform, but

whose main disadvantage is the high cost, making it inaccessible for most clinical laboratories, so it is important to

find a cheaper alternative with similar advantages.

Chapter 12 presents the material and methods used to achieve the above goals. Ninety-three strains of Candida

isolated from clinical samples from Grenoble (France) Hospital inpatients were identified and evaluated by E-test®

and Neo-Sensitabs® tablet diffusion assay between February and April 2009.

We determined categorical agreement levels between E-test® MICs and tablet end-points, using the

following disagreement parameters: very major discrepancies - R to E-test® and S to tablet; major discrepancies - S

to E-test® and R to tablet; minor discrepancies - shifts between S and SDD or SDD and R.

Statistical analysis was performed using linear regression analysis and Pearson’s correlation coefficients (R values)

between the log transforms of MICs and the inhibition zone diameters of the antifungal agents. Regression models

were obtained using SPSS 13.0 for Windows.

Chapter 13 describes the results obtained in the second study.

For amphotericin B the categorical agreement between E-test® and Neo-Sensitabs® assay was 90.32%. Six minor

disagreements (5 strains of C.glabrata and 1 strain of C.albicans), and 3 very major discrepancies (2 strains of

C.glabrata and 1 strain of C.krusei) were observed. The correlation coefficient R between Log2 MICs and the

inhibition zone diameters was -0.622 (figure 7).

Figure 7. Amphotericin B – graphical representation Figure 8. Caspofungin – graphical representation of the linear relation between Log2 MIC (E-test®) of the linear relation between Log2 MIC (E-test®) and inhibition zone diameters (Neo-Sensitabs®). and inhibition zone diameters (Neo-Sensitabs®).

For fluconazole, categorical agreement found between E-test® and Neo-Sensitabs® was 100%. The

correlation coefficient R between Log2 MICs and the inhibition zone diameters was -0.654.

For voriconazole, the percentage of categorical agreement between E-test® and Neo-Sensitabs® was 100%.

The correlation coefficient R between MICs and inhibition zone diameters was -0.62.

For caspofungin, the percentage of categorical agreement between E-test® and Neo-Sensitabs® was 98.92%.

One major discrepancy was found (1 strain of C.krusei S by E test® and R by the tablet method). One strain of

Candida glabrata was R (non-susceptible) by both methods, with a MIC> 32 mg/ml respectively, an inhibition zone

diameter of 0 mm. The correlation coefficient R between MICs and inhibition zone diameters was -0.679 (figure 8).

In all above cases the computed R-values exhibited a high statistical significance (p<<0.001).

Chapter 14 interprets and discusses the results of the second part of personal research, by comparison with similar

studies. Advantages as well as inherent limitations of our study were highlighted and discussed.

Chapter 15 presents the main conclusions for the second part of personal contributions, of which here I will only

mention the following three: 1. E-test® is a standardized, easy to use method for testing susceptibility of Candida to antifungal drugs. MIC

values (µg/ml) are sometimes difficult to read (due to the phenomenon of residual growth observed for azoles) and

the method is expensive.

2. The diameters of the inhibition zones obtained using Neo-Sensitabs® are well defined and easy to read, proving

this method to be easy to use. Also, the cost of Neo-Sensitabs® is lower than for E-tests®.

3. Categorical agreement obtained between Neo-Sensitabs® and E-test® for voriconazole, fluconazole, and

caspofungin was excellent, a lower categorical agreement with E-test® was found for amphotericin B.

GENERAL CONCLUSIONS

1. Fungal infections remain a serious threat and their frequency has increased considerably in recent years.

Increasing number of immunocompromised patients and invasive medical or surgical interventions have contributed

to the emergence of this pathology. Faced with these epidemiological changes, therapeutic possibilities were

improved, including amphotericin B, azoles and echinocandins.

2. The knowledge of Candida species involved in fungal infections in a given geographical area, or hospital and

their susceptibility profile to antifungal drugs are essential for the initiation of empirical antifungal treatment.

3. The differences observed between Cluj-Napoca and Grenoble underline the importance and need for screening

and surveillance protocols in patients at risk for fungal infections, for an accurate mycological diagnosis, completed

with antifungal susceptibility testing.

4. The knowledge of Candida species involved in pathology, their distribution and their susceptibility to antifungal

drugs is essential in order to initiate an early and efficient therapy .

5. Comparison between Neo-Sensitabs® tablet diffusion assay and E-test® for antifungal susceptibility testing of

Candida strains is, to our knowledge, the second study which evaluates the performance of caspofungin and

amphotericin B Neo-Sensitabs® tablet method versus E-test®, and it is the first study to evaluate the performance of

fluconazole and voriconazole Neo-Sensitabs® tablet method versus E-test®.

6. Categorical agreement obtained between Neo-Sensitabs® and E-test® for voriconazole, fluconazole, and

caspofungin was excellent, a lower categorical agreement with E-test® was found for amphotericin B.

7. Neo-Sensitabs® tablet diffusion assay for testing susceptibility of Candida strains to fluconazole and voriconazole

presents many similaryties with standard method M44-A and may represent a cost-effective and simple alternative

to E-tests® in clinical laboratories.

8. Based on the diameter of the inhibition zone, there is a possibility of MIC prediction by carrying out linear

regression models.

Selective bibliography

1. White TC. Mechanism of resistance to antifungal agents. In Murray PR, editor. Manual of Clinical Microbiology. 8th ed. Washington D.C (USA): ASM PRESS; 2003:p.1869-79. Pfaller MA. Nosocomial candidiasis: emerging species, reservoirs and mode of transmission. Clin Infect Dis 1996;22(suppl.2):89-94. 2. Espinel-Ingroff A, Barchiesi F, Hazen KC, Martinez-Suarez JV, Scalise G. Standardisation of susceptibility testing and clinical relevance. Med Mycol 1998;36:68-78. 3. Pfaller MA. Nosocomial candidiasis: emerging species, reservoirs and mode of transmission. Clin Infect Dis 1996;22(suppl.2):89-94. 4. Mares M, Bazgan O. Diagnosticul de laborator al infecţiilor produse de fungi. În Buiuc D, Neguţ M. Tratat de microbiologie clinică. Ed.Medicală, Bucureşti; 2008. p.953-6. 5. Espinel-Ingroff A, Canton A, Gibbs D, Wang A. Correlation of Neo-Sensitabs tablet diffusion assay results on three different agar media with broth microdilution M27-A2 and disk diffusion M44-A results for testing susceptibilities of Candida spp. and Cryptococcus neoformans to Amphotericin B, Caspofungin, Fluconazole, Itraconazole and Voriconazole. J Clin Microbiol 2007;45(3):858-64.

6. Espinel-Ingroff A, Canton E. Antifungal susceptibility testing of yeasts. In Antimicrobial susceptibility testing protocols. Edited by Schwalbe R, Steele-Moore L, Goodwin AC. CRC Press, Taylor & Francis Group 2007. 7. Pappas PG, Kauffman CA, Andes D, Benjamin DK Jr, Calandra TF, Edwards JE Jr, Filler SG, Fisher JF, Kullberg BJ, Ostrosky-Zeichner L, Reboli AC, Rex JH, Walsh TJ, Sobel JD; Infectious Diseases Society of America. Clinical practice guidelines for the management of candidiasis: 2009 update by the Infectious Diseases Society of America. Clin Infect Dis 2009;48(5):503-35. 8. Pfaller MA, Boyken L, Hollis RJ, Messer SA, Tendolkar S, Diekema DJ. In vitro susceptibilities of Candida spp. to caspofungin: four years of global surveillance. J Clin Microbiol 2006;44(3):760-3. 9. Thompson GR, Wiederhold NP, Vallor AC, Villareal NC, Lewis JS, Patterson TF. Development of caspofungin resistance following prolonged therapy for invasive candidiasis secondary to Candida glabrata infection. Antimicrob Agents Chemother 2008;52(10):3783-85. 10. Pfaller MA, Diekema DJ. Epidemiology of invasive candidiasis: a persistent public health problem. Clin Microbiol Reviews 2007;20(1):133–63. 11. Ostrosky-Zeichner L, Rex JH, Pappas PG, Hamill RJ, Larsen RA, Horowitz HW, Powderly WG, Hyslop N, Kauffman CA, Cleary J, Mangino JE, Lee J. Antifungal susceptibility survey of 2,000 bloodstream Candida isolates in the United States. Antimicrob Agents Chemother 2003;47(10):3149-54. 12. Pfaller MA, Diekema DJ, Gibbs DL, Newell VA, Meis JF, Gould IM, Fu W, Colombo AL, Rodriguez-Noriega E; Global Antifungal Surveillance Study. Results from the ARTEMIS DISK Global Antifungal Surveillance study, 1997 to 2005: an 8.5-year analysis of susceptibilities of Candida species and other yeast species to fluconazole and voriconazole determined by CLSI standardized disk diffusion testing. J Clin Microbiol 2007;45(6):1735-45.

Dr. Ioana Alina COLOSI Teaching Assistant University of Medicine and Pharmacy “Iuliu Haţieganu” Cluj-Napoca, Romania Microbiology Department Str. Louis Pasteur nr. 6, zip code 400349, Cluj-Napoca, Romania Email: ioana.colosi@gmail.com

CURRICULUM VITAE

1. Last name: OPRIŞ, spoused COLOSI 2. First name: IOANA ALINA 3. Place of birth: August 27th, 1974, Cluj-Napoca 4. Citizenship: Romanian 5. Marital status: married

6. Studies: Institution High School

Zalău U.M.F. “Iuliu Haţieganu”, Cluj-Napoca

U.M.F. “Iuliu Haţieganu” Cluj-Napoca

Medical Informatics and Biostatistics Department

U.M.F. “Iuliu Haţieganu” Cluj-Napoca Microbiology Department

Period: Sept.1988-June 1992

Oct.1992-Sept.1998

Nov.2007- June 2009 Nov.2005-

Diploma High school Diploma

M.D. Licensure Diploma,

profile: Medicine, specialty: General

Medicine

Master in Research Methodology for Life

Sciences

PhD student

7. Scientific title: MSc, PhD student 8. Professional experience:

Period: Jan.1999-Feb.2000

Mar.2001-Mar.2003

Jan.2003-Dec.2007

Oct.2004- present

Place: Cluj-Napoca Cluj-Napoca Cluj-Napoca Cluj-Napoca Institution: Adults

Clinical Hospital

Adults Clinical Hospital

Municipal Hospital Cluj/“Iuliu Haţieganu” U.M.F.

“Iuliu Haţieganu” U.M.F. ,

Cluj-Napoca, Microbiology Department

Function: Intern physician

General Practitioner Resident physician

Laboratory Medicine Resident physician

Teaching Assistant

9. Current work and function: University of Medicine and Pharmacy „Iuliu Haţieganu” Cluj- Napoca, Teaching Assistent 10. Seniority at current workplace: five years 11. Membership in professional and scientific societies: Romanian College of Physicians Romanian Society of Medical Micology and Micotoxicology Romanian Society of Parasitology 12. Language skills: English - very good, French - good 13. Specializations and qualifications: General Practitioner Specialist

Laboratory Medicine Specialist Master in Research Methodology for Life Sciences PhD student, UMF Cluj-Napoca, Domain Medicine 14. Postgraduate courses: - March 2 - April 10, 2009 Course Mycologie Médicale, Pasteur Institut, Paris, France - February 2 - February 27, 2009 - training stage in Laboratoire de Parasitologie-Mycologie CHU de Grenoble, France, ERASMUS program - May 15 - August 15, 2008 - training stage in Laboratoire de Parasitologie-Mycologie CHU de Grenoble, France, ERASMUS program - November 2007 - Course „Methods of studying biofilms and hipermutability”, ESCMID, 2007 Palma de Mallorca, Spain. - 2003 Postgraduate course at the University of Cluj-Napoca, Romania: Updates in pneumology - 2002 Postgraduate course at the University of Cluj-Napoca, Romania: Tuberculosis - a major public health problem in Romania - 2001 Postgraduate course at the University of Cluj-Napoca, Romania: Training course in teaching methods - 2000 Postgraduate course at the University of Cluj-Napoca, Romania: Pediatric emergencies - 2000 Postgraduate course at the University of Cluj-Napoca, Romania: Allergies in new born babies and small children-concepts and solutions for treatment and prophylaxis SCIENTIFIC ACTIVITY:

Papers published in full text 1. Colosi I, Faure O, Lebeau B, Colosi H, Junie M, Pelloux H. Comparison of two methods, E-test® and Neo-Sensitabs® tablet diffusion assay, for testing susceptibility of 93 Candida strains to amphotericin B, fluconazole, voriconazole, and caspofungin. Sc Parasit 2009:1-2:112-22. 2. Colosi I, Costache C, Junie M. The pathogenicity of Candida infections: pathogenic factors and risk factors of infections with Candida species. Clujul Medical 2009;82(1):30-4. 3. Colosi I, Costache C, Junie M. Candida biofilm resistance to antifungal drugs. Fungi &Mycotoxins 2009;1(3):242-9. 4. Costache C, Colosi IA, Colosi HA. Immunochromatography versus microscopy for the identification of Giardia lamblia and Cryptosporidium parvum in human feces. Sc Parasit 2009:1-2:26-31. 5. Colosi I. Methods of studying biofilms and hipermutability. Sc Parasit 2008;1:22-4. 6. Christofidou M, Spiliopoulou A, Vamvacopoulou S, Stamoulis V, Dimitracopoulos G, Anastassiou E, Junie LM, Costache C, Colosi I, Ciobanca PT. Species distribution and antifungal susceptibility of Candida isolates collected from hospitalized patients in Romania and Greece. Sc Parasit, 2008;1:61-7. 7. Costache C, Colosi I, Junie M. Candida species isolated from fungal infections. Sc Parasit 2008;1:68-73. 8. Costache C, Colosi I. Disk diffusion method for antifungal susceptibility testing. Sc Parasit 2008;1:74-8. 9. Costache C, Junie M, Colosi I, Minica F. Incidence of parasitosis in patients from the Emergency County Hospital and Infectious Diseases Clinic from Cluj-Napoca. Sc Parasitol 2007;8(1):39-44. Papers published as abstracts 1. Colosi I, Faure O, Bourdon C, Dessaigne B, Lebeau B, Pelloux H. Comparison of two methods, Disk diffusion and E-test, for testing susceptibility of 102 filamentous fungi to amphotericin B, itraconazole, voriconazole, caspofungin, and posaconazole. Poster presentation at the 4th Trends in Medical Mycology (TIMM-4), 18-21 October 2009, Athens, Greece. Mycosis 2009;52(S1):30. 2. Colosi I, Costache C, Junie M, Gocan G. Serologic profile for toxoplasmic infection in pregnant women in Cluj county. Poster presentation at the X-th European Multicolloquium of Parasitology, Paris, August 24-28, 2008, Abstract book p.183. 3. Costache C, Muresan L, Colosi I. Intestinal parasites in children hospitalized for different pathologies. Poster presentation at the X-th European Multicolloquium of Parasitology, Paris, August 24-28, 2008. Abstract book p.131.

4. Costache C, Colosi I, Junie M, Colosi H, Boboş C. Antifungal susceptibility testing by disk diffusion on three different media. Poster presentation at the 7-th European Congress of Chemotherapy and Infection October 19-22, 2005 Florence, Italy. Abstract book p.109. 5. Junie M, Costache C, Colosi I. The molecular basis of resistance phenomenon to antibiotics of Pseudomonas aeruginosa strains isolated from patients with urinary tract infections. The VI-th National Congress of Pharmacology, Therapeutics and Toxicology, June 2005, Cluj-Napoca. Abstract book p.478-84. 6. Junie M, Ţăţulescu D, Matinca D, Ferke A, Rădulescu A, Colosi I. Pseudomonas aeruginosa strains isolated from urine samples in Hospitals from Romania and Greece. Poster presentation at the 11th International Congress on Infectious Diseases, Cancun, Mexic, March 3-7 2004. 7. Junie M, Ferke A, Tatulescu D, Radulescu A, Colosi I. “Resistance pattern of Enterobacter species isolated from urine and peritoneal liquid”. 11th International Congress of Infectious Diseases Cancun, Mexic, March 4-7, 2004;Abstract book p.4. 8. Junie M, Tatulescu D, Costache C, Radulescu A, Colosi I. “Identification, clinical and epidemiologic aspects in candidiasis”. Clinical Microbiology and Infection, 13th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ECCMID), Glasgow, UK, May 10-13, 2003;Vol. 9(1):218, (abs). 9. Junie M, Ferke A, Vancea D, Ţăţulescu D, Colosi I. Resistance to beta-lactam antibiotics and to cephalosporins of strains isolated from urine. 13th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ECCMID), Glasgow, UK, May 10-13, 2003; Abstract book p.272. 10. Junie M, Ferke A, Vancea D, Colosi I. Therapeutically aspects in urinary tract infections: the resistance pattern of Gram-negative bacilli to aminoglycosides, quinolones and other antibiotics. 13th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ECCMID), Glasgow, UK, May 10-13, 2003; Abstract book p. 349. TEACHING ACTIVITY Collaborator in postgraduate courses of the Department of Microbiology: Medical Mycology and Medical Parasitology. Practical activities of Microbiology with students of the Faculty of Medicine IInd and IIIrd year, Romanian section and English study-line, students of the Faculty of Dentistry IInd year, Romanian section and English study-line, students of the Faculty of Pharmacy IInd year, Romanian section.

Experience in national programs / projects:

Program/Project Function Period:

CEEX – 78 Formation of a national network for study of parasitic zoonoses and their implications for food safety.

Member 2006-2008

CEEX – 99 TRICHID Interdisciplinary evaluation and optimization of screening methods, diagnosis and treatment of human and animal trichinellosis and cystic echinococcosis in central and northwestern Romania.

Member 2006-2008

CEEX - 151 Formation of a national networks for research of dermatophytosis in humans and animals.

Member 2006-2008

CEEX- 98/01.08.2006 Biological, biochemical, and bio productiv study of a wild species of the genus Epilobium (fam. Onagraceae) in Transylvania, in order to obtain pharmaceutical extracts used in treating prostate adenoma.

Member 2006-2008

CNMP-PN2-contract nr. 51013 TOXANOM Optimizing the surveillance of Toxoplasma gondii infection in some species of animals and humans, as public health problem in central and western Romania.

Member 2007-2010