ผลการทดลอง

การทดสอบประสิทธิภาพของสารสกัดจากเปลือกผลทบัทิม ท่ีสกัดด้วยแอลกอฮอล์ 95 เปอร์เซ็นต์ ในการยบัยัง้การเจริญของโคโลนีของเชือ้รา Colletotrichum gloeosporioides ท่ีอายุการทดลอง 3 วนั 5 วนั และ 7 วนั ท าการตรวจสอบผลการทดลอง โดยการวดัการเจริญของเส้นใยเชือ้รา C. gloeosporioides ท่ีเจริญบนอาหาร PDA ผสมสารสกดัจากเปลือกผลทบัทิมโดยการวดัเส้นผา่ศนูย์กลางของโคโลนีท่ีเจริญในแนวราบ เปรียบเทียบกบัเชือ้ในจานอาหารควบคมุ (ตารางท่ี 1 และ ภาพท่ี 1 2 และ 3)

ตารางท่ี 1 เปรียบเทียบการเจริญเติบโตของเชือ้รา Colletotrichum gloeosporioides บนอาหาร PDA ผสมสารสกดัจากเปลือกผลทบัทิมท่ีความเข้มข้นตา่ง ๆ

คา่เฉล่ียเส้นผ่าศนูย์กลางโคโลนี (ซม.)1

3วนั 5วนั 7วนั

0 ppm 4.25 e 7.25 e 9 e

20000 ppm 3.5 d 5.71 d 7.03 d

40000 ppm 2.7 c 4.21 c 5.34 cd

60000 ppm 2.37 bc 3.62 abc 4.82 abc

80000 ppm 1.95 ab 2.88 ab 3.64 ab

100000 ppm 1.77 a 2.54 a 3.25 a

mencozeb 1.8 a 3.81 bc 6.02 cd

F-test ** ** **

C.V. (%) 1.9 3.08 3.62

1 = คา่เฉล่ียจากตวัอย่างทดลอง 5 ซ า้

Treatment

ภาพท่ี 1 การเจริญเตบิโตของเชือ้รา Colletotrichum gloeosporioides บนอาหาร PDAท่ีผสม สารสกดัจากเปลือกผลทบัทิมเป็นเวลา 3 วนั A: 20,000 ppm. B: 40,000 ppm. C: 60,000 ppm. D: 80,000 ppm. E: 100,000 ppm. F: mancozeb 1,600 ppm.

control

A

B

D E

A C

F

ภาพท่ี 2 การเจริญเติบโตของเชือ้รา Colletotrichum gloeosporioides บนอาหาร PDA ท่ีผสม สารสกดัจากเปลือกผลทบัทิมเป็นเวลา 5 วนั A: 20,000 ppm. B: 40,000 ppm. C: 60,000 ppm. D: 80,000 ppm. E: 100,000 ppm. F: mancozeb 1,600 ppm.

control

A B C

D E F

ภาพท่ี 3 การเจริญเตบิโตของเชือ้รา Colletotrichum gloeosporioides บนอาหาร PDA ท่ีผสม สารสกดัจากเปลือกผลทบัทิมเป็นเวลา 7 วนั A: 20,000 ppm. B: 40,000 ppm. C: 60,000 ppm. D: 80,000 ppm. E: 100,000 ppm. F: mancozeb 1,600 ppm.

control

B C A

D E F

control

หาค่าเปอร์เซ็นต์การยับยัง้การเจริญเตบิโตของเชือ้รา พบว่าท่ีอาย ุ5 วนั สารสกดัจากเปลือกผลทบัทิมท่ีระดบัความเข้มข้น 100,000 ppm สามารถยบัยัง้การเจริญของเชือ้รา C. gloeosporioides ได้ดีท่ีสดุคือ 64.97% และรองลงมาคือ 80,000 ppm สามารถยบัยัง้ได้ 60.28% เม่ือเปรียบเทียบกบั mancozeb พบว่าท่ีอาย ุ3 วนั มีความสามารถในการยบัยัง้การเจริญของโคโลนีของเชือ้รา C. gloeo sporioides ได้ดีท่ีสดุ 57.65% รองลงมาคือวนัท่ี 5 และ 7 มีเปอร์เซ็นต์การยบัยัง้เท่ากบั 47.45 และ 33.11% ตามล าดบั (ตารางท่ี 2 และ ภาพท่ี 4) ตารางท่ี 2 เปอร์เซ็นต์การยบัยัง้การเจริญเติบโตของเชือ้รา Colletotrichum gloeosporioides

บนอาหาร PDA ผสมสาร สกดัจากเปลือกผลทบัทิมท่ีความเข้มข้นตา่งๆ

%การยบัยัง้การเจริญเตบิโตของเชือ้รา C.gloeosporioides 1

3วนั 5วนั 7วนั

0 ppm 0 e 0 e 0 e

20000 ppm 17.47 d 21.24 d 21.89 d

40000 ppm 36.48 c 41.85 c 40.67 abc

60000 ppm 44.25 bc 50.12 abc 46.44 abc

80000 ppm 54.05 ab 60.24 ab 59.56 ab

100000 ppm 58.34 a 65 a 63.89 a

mencozeb 57.65 a 47.45 bc 33.11 bc

F-test ** ** **

C.V. (%) 3.03 4.42 5.92 1 = คา่เฉล่ียจากตวัอย่างทดลอง 5 ซ า้

Treatment

0

10

20

30

40

50

60

70

%กา

รยับย

ัง้

3 5 7จ านวนวัน

0 ppm

20000 ppm40000 ppm

60000 ppm

80000 ppm100000 ppm

mencozeb

ภาพท่ี 4 คา่เปอร์เซ็นต์การยบัยัง้การเจริญเติบโตของเชือ้รา Colletotrichum gloeosporioides ท่ีอายกุารทดลอง 3 วนั 5 วนั และ 7 วนั

จากนัน้เปล่ียนคา่เปอร์เซ็นต์การยบัยัง้เป็นคา่ Probit น าคา่ probit ของสารสกดัมาเขียนกราฟกบัคา่ log ของความเข้มข้น พบว่าท่ีระยะเวลา 3 วนั คา่ ED 50 เท่ากับ 69,180 ในขณะท่ีอายกุารทดลอง 5 วนั ค่า ED 50 เท่ากบั 54,950 และท่ีอายุการทดลอง 7 วนั คา่ ED 50 เท่ากบั 58,880 ดงันัน้สารสกดัจากเปลือกผลทบัทิมท่ีอายกุารทดลอง 5 วนั จะมีประสิทธิภาพดีท่ีสดุ ในการยบัยัง้การเจริญเติบโตของเชือ้รา C. gloeosporioides จะเห็นว่าค่า ED 50 ของวนัท่ี 5 มีคา่ต ่าท่ีสุด รองลงมาคือวนัท่ี 7 และวนัท่ี 5 ตามล าดบั (ภาพท่ี 5)

ภาพท่ี 5 D.R. curve ของสารสกดัจากเปลือกผลทบัทิมจากการทดสอบประสิทธิภาพ ของสาร

สกดัตอ่การเจริญของเชือ้รา Colletotrichum gloeosporioides

3

4

5

6

7

4.3 4.6 4.7 4.9 5 log of concentration (ppm)

Dose

3 7

5

Probit of inhibition

ทดสอบการยังยัง้การงอกของสปอร์ด้วยวิธี spore germination test จากการทดสอบประสิทธิภาพของสารสกดัจากเปลือกผลทบัทิมในการยบัยัง้การงอกของสปอร์ของเชือ้รา C. gloeosporioides โดยหยด spore suspension เชือ้รา C. gloeosporioides และสารสกดัจากเปลือกผลทบัทิม ปริมาตร 0.02 มิลลิลิตรเท่ากนั ลงบนแผ่นสไลด์พร้อมกนั หลงัจากนัน้ 24 ชัว่โมง สงัเกตการงอกของสปอร์เชือ้รา C. gloeosporioides พบว่าสารสกดัท่ีระดบัความเข้มข้น 100000 ppm สามารถยบัยัง้การงอกชองสปอร์ของเชือ้รา C. gloeosporioides ได้ดีท่ีสดุโดยการวดั ความยาวของ germ tube พบว่าสารสกัดท่ีความเข้มข้น 20,000 40,000 60,000 80,000 และ100,000 ppm วดัความยาวของ germ tube ได้ 286.2 216.2 115.6 109.8 และ 83.4 ตามล าดบั (ตารางท่ี 3 และ ภาพท่ี 6และ 7)

ตารางท่ี 3 ประสิทธิภาพของสารสกดัในการยบัยัง้การงอกและการพฒันาเป็น germ tubeของสปอร์เชือ้รา Colletotrichum gloeosporioides

Treatment ลกัษณะของ germ tube

(ppm) %1 germ tube (µm) 2

Control 100 c 3 355.5 e 4 Germ tube เจริญปกติ

20000 84 bc 286.2 d Germ tube เจริญช้ากวา่เล็กน้อย

40000 81 b 216.2 c บริเวณปลาย Germ tube โป่งพอง เส้นใยแตกแขนง

60000 81 b 115.6 b บริเวณปลาย Germ tube โป่งพอง เส้นใยแตกแขนง

80000 79 b 109.8 b บริเวณปลาย Germ tube มีการแตก

100000 73 b 83.4 b บริเวณปลาย Germ tube โป่งพอง

mancozeb 0 a 0 a -

1 เปอร์เซ็นต์ยบัยัง้การงอกของเชือ้รา Colletotrichum gloeosporioides โดยใช้สตูร

เปอร์เซ็นต์การยบัยัง้ = [(A-B) / A] x 100 A คือคา่เฉล่ียของจ านวนสปอร์เชือ้ราท่ีงอกบนอาหารเลีย้งเชือ้ราชดุเปรียบเทียบ

B คือคา่เฉล่ียของจ านวนสปอร์เชือ้ราท่ีงอกบนอาหารเลีย้งเชือ้ราผสมสารสกดั

2 คา่เฉล่ียความยาว Germ tube ท่ีพฒันาเป็นเส้นใย รวมทัง้แขนงของเส้นใยทัง้หมดท่ีงอกออกมาจากสปอร์ท่ี 24 ชัว่โมง หลงัจากหยดสารสกดัจากผลทบัทิม 3 คา่เฉล่ียเปอร์เซ็นต์การงอกของสปอร์เชือ้รา Colletotrichum gloeosporioides ท่ี 24 ชัว่โมง หลงัจากท าการหยดสารสกดัจากผลทบัทิม 4 คา่เฉล่ียท่ีตามหลงัด้วยตวัอกัษรท่ีเหมือนกนัในแนวตัง้ ไมมี่ความแตกตา่งกนัอยา่งมีนยัส าคญัทางสถิติตามวิธี Ducan’s multiple range tests

การงอก ความยาว germ tube

ภาพท่ี 6 กลไกการยบัยัง้การงอกและเจริญเป็น germ tube ของเชือ้รา C. gloeosporioides โดยหยดสปอร์แขวนลอยของเชือ้รา C. gloeosporioides และเซลล์แขวนลอยของ สารสกดัจากเปลือกผลทบัทิมลงไปบน depression slide พร้อมกนั

a; เส้นใยเจริญเป็นปกต ิ b; เส้นใยมีขนาดใหญ่ขึน้ และเกิดการโป่งพอง c; สปอร์มีขนาดใหญ่ขึน้ germ tube สัน้ d; สปอร์งอกเล็กน้อย e; เส้นใยขนาดใหญ่ขึน้ และคดงอ f; เส้นใยขนาดใหญ่ขึน้ มีข้อปล้องเพิ่มมากขึน้ g; สปอร์ไมง่อก

control 20000 ppm

40000 ppm 60000 ppm

a

b

a

f e

ภาพท่ี 7 กลไกการยบัยัง้การงอกและเจริญเป็น germ tube ของเชือ้รา C. gloeosporioides โดยหยดสปอร์แขวนลอยของเชือ้รา C. gloeosporioides และเซลล์แขวนลอยของ สารสกดัจากเปลือกผลทบัทิมลงไปบน depression slide พร้อมกนั

a; เส้นใยเจริญเป็นปกต ิ b; เส้นใยมีขนาดใหญ่ขึน้ และเกิดการโป่งพอง c; สปอร์มีขนาดใหญ่ขึน้ germ tube สัน้ d; สปอร์งอกเล็กน้อย e; เส้นใยขนาดใหญ่ขึน้ และคดงอ f; เส้นใยขนาดใหญ่ขึน้ มีข้อปล้องเพิ่มมากขึน้ g; สปอร์ไมง่อก

control 80000 ppm

Mancozeb 100000 ppm

a

d g

c

ทดสอบประสิทธิภาพของสารสกัดจากเปลือกผลทับทิมในการยับยัง้การเจริญเป็นเส้นใย โดยหยดสปอร์แขวนลอยของเชือ้รา C. gloeosporioides ปริมาตร 0.02 มิลลิลิตร ลงบนแผ่นสไลด์ทิง้ไว้ 8 ชัว่โมง จงึหยดสารสกดัจากเปลือกผลทบัทิมลงไป หลงัจากนัน้ 24 ชัว่โมง จึงน ามาตรวจดูภายใต้กล้องจุลทรรศน์ สงัเกตการเจริญของเส้นใย พบว่าท่ีความเข้มข้นของสารสกัดจากเปลือกผลทบัทิมท่ีระดบั 100,000 ppm สามารถยบัยัง้การเจริญของเส้นใยได้ดีท่ีสดุ มีความยาวของเส้นใย 42 ไมโครเมตร รองลงมาคือความเข้มข้น 80,000 และ 60,000 ppm มีความยาว 60.6 และ 118 ไมโครเมตร (ภาพท่ี 8) โดยท าให้เกิดอาการผิดปกติกบัสปอร์เชือ้รา เช่น มีการเจริญเติบของเส้นใยลดลง เส้นใยขนาดใหญ่ขึน้และเกิดการโป่งพอง มีการแตกแขนง ท าให้มีข้อปล้องเพิ่มขึน้ ความยาวของ germ tube มีขนาดสัน้ลง (ภาพท่ี 9)

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

contro

l

2000

0ppm

4000

0ppm

6000

0ppm

8000

0ppm

1000

00pp

m

man

coze

b

ภาพท่ี 8 ประสิทธิภาพของสารสกดัในการยบัยัง้การเจริญเป็นเส้นใยของเชือ้รา Colletotrichum gloeosporioides

ความยาว getm tube (ไมโครเมตร)

Treatment

ภาพท่ี 9 ตวัอยา่งประสิทธิภาพของสารสกดัจากเปลือกผลทบัทิมในการยบัยัง้การเจริญของ เส้นใยเชือ้รา C. gloeosporioides

control

20000 ppm