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COLEGIO DE BIOQUIMICOS DE LA PROVINCIA DE BUENOS AIRES

PLASMA RICO EN PLAQUETAS OBTENIDO CON DIFERENTES

ANTICOAGULANTES Y SU EFECTO SOBRE EL NÚMERO DE

PLAQUETAS Y EL COMPORTAMIENTO IN VITRO DE LAS

CÉLULAS DEL ESTROMA MESENQUIMATOSO

Ronaldo José Farias Corrêa do Amaral, Nemias Pereira da Silva, Natália Ferreira Haddad, Luana Siqueira Lopes, Fábio Dias Ferreira, Ricardo Bastos Filho, Paola Alejandra Cappelletti, Wallace de Mello, Eric Cordeiro-Spinetti, y Alex Balduino. Volume 2016, Article ID 7414036, 11 pages http://dx.doi.org/10.1155/2016/7414036.

INTRODUCCIÓN El plasma rico en plaquetas (PRP) es un producto derivado de la sangre en el cual las plaquetas son concentradas en el plasma al menos 5 veces respecto del estado basal de la sangre entera (1). Se está investigando el PRP como un producto autólogo que puede mejorar la reparación de tejidos en diferentes condiciones y lesiones, especialmente del tejido muscular esquelético, lesiones condrales (2-4), tendinopatías (5-7), fibras musculares (8,9) y óseas (10,11). Además de estas aplicaciones clínicas, el PRP puede ser usado como un eficiente sustituto del suero fetal bovino en cultivos celulares (12-15). Su potencial terapéutico se basa mayormente en los factores de crecimiento presentes en los gránulos α de las plaquetas (16), el factor de crecimiento β (TNF β) (17), el factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF) (18) y el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) (19), que ya se ha demostrado el importante papel que cumplen en la reparación tisular. Cuando las plaquetas son concentradas y activadas, se espera que la concentración de factores liberados sea de tres a cinco veces mayor que en el plasma (16). La metodología rutinaria para obtener PRP involucra la recolección de sangre entera con anticoagulante seguida de una o dos centrifugaciones. Luego de una centrifugación a baja velocidad, las plaquetas concentradas en el plasma libre de eritrocitos, se recuperan para centrifugarse luego a alta velocidad. El plasma pobre en plaquetas es descartado y las plaquetas

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remanentes en el sedimento son homogeneizadas para obtener el PRP (16). Algunos aspectos de este método se discuten, tal como el número de centrifugaciones, la presencia de leucocitos, el uso de activador plaquetario y el anticoagulante usado (20). Si no se usa anticoagulante, se forma un coágulo, se obtiene el suero sin enriquecimiento plaquetario (21). Si se quiere obtener PRP, se debe evitar la coagulación con un anticoagulante para poder concentrar las plaquetas. Para fines transfusionales, la sangre se colecta en bolsas con una solución de citrato fosfato dextrosa adenina (CPDA) como anticoagulante (22,23), de la cual se pueden obtener plaquetas concentradas por una doble centrifugación de la sangre entera o aféresis. Las plaquetas concentradas de esta manera pueden ser usadas para promover la reparación tisular (24). Por otro lado, formulaciones recientes de preparación para PRP utilizan tubos con solución de citrato, en la forma de citrato de sodio (SC) (25-29) o ACD (30-32), éste último, está presente en la mayoría de los equipos comerciales disponibles (33,34). En otros casos, se usa heparina (35,36) o EDTA (37). Para investigación clínica, se usa con frecuencia EDTA para pruebas hematológicas, citrato de sodio para pruebas de coagulación y ACD para la medición de derivados de plaquetas en plasma (38). Nuestro objetivo fue analizar cómo la elección del anticoagulante para la recolección de sangre puede influir en la preparación de PRP y su efecto sobre cultivos celulares de células del estroma mesenquimatoso.

2-MATERIALES Y METODOS

2-1 Declaración ética Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados con el comité de ética del hospital Pro-Cardíaco de Río de Janeiro (CAAE: 14878813.4.0000.5533) y todos los donantes firmaron el consentimiento informado.

2-2 Obtención de PRP El PRP se obtuvo como se describió previamente con mínimas modificaciones (39). Se obtuvo sangre venosa de 9 voluntarios (6 hombres y 3 mujeres) usando tubos comerciales con vacío con solución de SC (Vacutainer, Ref: 369714; BD Biosciences, San Jose, CA), con EDTA (Vacutainer, Ref: 367861; BD Biosciences) y ACD (Vacutainer, Ref: 364606; BD Biosciences). La sangre anticoagulada con ACD se dividió en 3 alícuotas en tubos de polipropileno sin anticoagulante (Falcon, Ref: 352063; BD Biosciences) denominado ACD-2. Los tubos fueron centrifugados a 300 g por 5 minutes (Megafuge40, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). El plasma sobrenadante se denomina PRP1, se transfieren a tubos de polipropileno sin anticoagulantes. En el caso de los tubos con ACD se denominan ACD1. Luego del recuento de plaquetas el PRP1 se mezcló para realizar el siguiente experimento. El PRP1 se centrifugó a 700 g por 17 minutos. Se separó el sobrenadante denominado PPP, parte se usó para resuspender el sedimento plaquetario, para obtener el PRP2 y obtener una concentración del orden 10

6 plaquetas/𝜇L. Las plaquetas en el PRP2 se activaron con CaCl2 1M (concentración

final de 20mM) y se incubó a 37∘C por 1 hora. Luego de la obtención del coágulo los tubos fueron mantenidos a

4∘C durante 16 horas para permitir la retracción del coágulo. Finalmente los tubos se centrifugaron a 3000 g por 20 minutos y se separó el sobrenadante denominado PRPr que se conservó a -80∘C hasta el momento de usarlo.

2.3 Análisis hematológico El conteo de plaquetas, hematíes, leucocitos y del volumen plaquetario medio (MPV) se determinó en sangre entera, PRP1, PRP2 y PPP con un contador hematológico Mindray BC 2800 (Perdizes, SP, Brasil). La recuperación de plaquetas luego de la primera centrifugación expresada como porcentaje, se calculó dividiendo el número total de plaquetas en PRP1 por el número de platulocitos en sangre entera y multiplicándolo por 100.

2.4 Cuantificación de factores de crecimiento El TGF-𝛽1 y el VEGF derivado del PRP1 se cuantificó por el método ELISA (Ref: KAC1688 y Ref: KHG0111; Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. La absorbancia fue leída utilizando lectores de microplaca (Multiskan GO, Thermo Fisher Scientific).

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2.5 Células del estroma mesenquimatoso extraídas de médula ósea (BMMSC). Aislamiento y cultivo. Se obtuvieron 120 ml de médula ósea de dos donantes (una mujer de 41 años cuyas células fueron usadas para pruebas de viabilidad y un hombre de 60 años cuyas células fueron usadas para pruebas de expresión génica). Las células mononucleares se separaron usando el sistema Sepax (Biosafe, Eysins, Suiza), de acuerdo con las instrucciones del fabricante y colocadas 4 ×10

5 células/cm

2 en medio esencial mínimo modificado alfa (alpha

MEM Cultilab, Campinas, SP, Brasil) suplementado con 10% de albúmina fetal bovina (FBS) en 150 cm

2 de frascos de cultivo (Corning Incorporated, Corning, NY) y mantenidos en 5% de CO2

incubado a 37∘C. luego de 5 días se cambió el medio y se descartaron las células no adheridas. Luego se cambió el medio cada dos días y que se denominó “cultivo primario”. Luego de 10 días entre el 70-80% de células confluyentes se trataron usando solución de tripsina al 0.05% (Gibco, Thermo Fisher Scientific) y reubicadas en otro frasco de cultivo con una densidad de 8 × 10

3 células/cm

2. Luego del primer tripsinado el

cultivo se denominó “pasaje #1.” Se repitió el procedimiento cinco veces obteniendo el “pasaje# 5”.

2.6 Ensayo de viabilidad celular El análisis de viabilidad se realizó adicionando bromuro Azul de tiazolil tetrazolium (MTT assay) (Sigma Aldrich, Sao Paulo, SP, Brasil). Células del “pasaje # 3” se ubicaron con una densidad 5 × 10

3 cells/cm

2 por duplicado en

48 pocillos del plato(Corning Incorporated) en alfa MEM (Cultilab) suplementado con 10% FBS (Gibco), 1% PRPr, 2.5% PRPr, o 5% PRPr. Se usaron 4 diferentes donantes de PRPr. En otro grupo se realizó un POOL con las 4 muestras con igual proporción de cada donante, denominado PRPr MIX. Luego de 8 días de cultivo se

agregó 0.5mg/ml de MTT. El medio se renovó cada 4 horas de incubación y se agregó 400 𝜇L/pocillo de DMSO para disolver los productos de formazán reducido. El volumen de los 48 pocillos se dividió hasta completar los 96 pocillos. Finalmente, se leyó la placa en un lector de microplacas (Multiskan GO, Thermo Fisher Scientific) a 570 nm. El medio de cultivo no fue cambiado durante el experimento.

2.7 Evaluación de la expresión de genes Células (pasaje #5) fueron cultivadas en alfa MEM (Cultilab) suplementada 10% FBS (Gibco), 1% PRPr, 2.5% PRPr, o 5% PRPr. Luego de 5 días de cultivo, se extrajo RNA usando TRIZOL (Ambion, Thermo Fisher Scientific). La concentración de RNA fue determinada usando un Nanodrop 2000UV-Vis spectrophotometer

(Thermo Fisher Scientific) y 2 𝜇g se transcribió en forma reversa en DNA complementario (cDNA) usando el

sistema SuperScript First-Strand Synthesis por RT-PCR (Invitrogen, #11904-018) en un volumen total de 20 𝜇L, siguiendo las instrucciones del fabricante. Los oligonucleótidos y sondas para PCR en tiempo real con equipos Biosystems (TaqMan Gene Expression Assay, #4331182): HPRT1 (Hs02800695 m1), el cual fue analizado como un gen casero, SOX9 (Hs00165814 m1), RUNX2 (Hs00231692 m1), PPARG (Hs01115513 m1), and POU5F1 (Oct-4) (Hs0099634 9H). Las reacciones se hicieron por PCR en tiempo real en Applied Biosystems 7500

Standard Time PCR System en 20 𝜇L de volumen de reacción usando TaqMan Universal MasterMix II, con UNG (Applied Biosystems, #4440038), de acuerdo a las indicaciones del fabricante. El análisis se realizó usando el método ΔΔCt [40].

2,8 Análisis estadístico Los datos fueron analizados usando la prueba t-Student para datos pareados del análisis hematológico de los grupos de donantes con diferentes anticoagulantes. En el caso de la cuantificación de los factores de crecimiento y experimentos con cultivos celulares no fue necesario parear las muestras, se utilizó el test de t-Student de dos colas con datos no pareados. Se consideró una significación estadística cuando el 𝑝 < 0.05.

3. RESULTADOS 3.1 Efecto de diferentes anticoagulantes en el recuento de plaquetas inicial y en la recuperación plaquetaria. Las muestras fueron tomadas de 5 donantes en tubos que contenían EDTA, SC, o ACD y las plaquetas fueron contadas en un contador hematológico. Las muestras tomadas con EDTA presentaron un rendimiento mayor de

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plaquetas, seguido por SC y ACD (Figure 1(a)). En promedio, el recuento plaquetario usando SC fue16.28% menor que con EDTA, mientras que con ACD fue 23.01% menor que con EDTA y 7.94% menor que con SC. Sin embargo la recuperación plaquetaria luego de la primera centrifugación, el número total de plaquetas fue mayor usando SC comparada al uso de EDTA u ACD. La recuperación plaquetaria promedio con EDTA y SC fue de 76.15% y 81.21% respectivamente. Sorprendentemente la recuperación en muestras utilizando ACD fue solamente de 45.71%, casi la mitad de la que se consigue utilizando los otros dos anticoagulantes. Los tres anticoagulantes utilizados fueron los disponibles en forma comercial. Los tubos comerciales que contenían ACD eran más altos y anchos que los de los otros dos anticoagulantes. Con el fin de verificar si éste tema tuvo incidencia en la recuperación plaquetaria, se utilizaron tubos del mismo tamaño que los que contenían EDTA y SC (ACD-2). La recuperación plaquetaria mejoró (49.82%) pero permaneció por debajo del rendimiento de los

otros dos anticoagulantes. Las diferencias fueron estadísticamente significativas cuando se usó SC (𝑝 < 0.05)

pero no cuando se usó EDTA (𝑝 > 0.05) (Figura 1(b)). Si lo analizamos en forma separada, se puede observar que la recuperación plaquetaria aumenta en tres de los cinco donantes cuando se usaron tubos ACD-2 en vez del tubo ACD, especialmente en el donante 2, en el que se incrementó a 63,74%, mientras que disminuyó en dos donantes, especialmente el 1, que descendió a 25.48% cuando se colectó la sangre en los tubos pequeños

(Figura 1(c)). En promedio, la concentración plaquetaria en el PRP2 1,009 ± 57 ×103/𝜇L en muestras con EDTA,

582 ± 108 × 103/𝜇L, 726 ± 200 × 10

3/𝜇L con ACD, y 664± 170 × 10

3/𝜇L en muestras con ACD-2 . Todos los

valores fueron estadísticamente similares entre cada anticoagulante (𝑝 > 0.05), excepto entre EDTA y SC (𝑝 <0.05) (datos no mostrados). Aunque la el volumen plaquetario medio (MPV) está relacionado con el tamaño de las plaquetas e indica su grado de activación, fue similar en sangre entera (WB) usando cualquier anticoagulante, incrementándose progresivamente con las dos centrifugaciones en el grupo de donantes en los que se usó EDTA ( un incremento promedio de 11.60% luego de la primera centrifugación y un incremento adicional de 2.84% luego de la segunda centrifugación, en total 14.44% de incremento comparado con la sangre entera). Esto no se observó en WB cuando el anticoagulante usado fue SC ó ACD (Figure 2).

3.2. La liberación de TGF-𝛽1 y VEGF liberado en el PRP con diferentes anticoagulantes Sobre este punto, está claro que el anticoagulante tiene un impacto sobre la recuperación plaquetaria luego de la centrifugación. Sin embargo, cuestionamos si se podría cambiar la liberación de factores plaquetarios. Para esto,

cuantificamos los niveles de TGF-𝛽1 y VEGF por ELISA. La concentración fue similar entre los anticoagulantes

(𝑝 > 0.05) para TGF-𝛽1 y VEGF. La concentración de TGF-𝛽1 fue de 18,146.99 ± 2,370.33 pg/mL con EDTA; 48,559.10 ± 12,839.86 pg/mL con SC; y 30,786.15 ±6,654.49 pg/mL con ACD (Figura 3(a)). La concentración de VEGF fue de 278.88 ± 71.78 pg/mL con EDTA, 143.65 ± 71.63 pg/mL con SC, y 362.70 ± 77.95 pg/mL con ACD (Figura 3(b)).

3.3. Cultivo de las células derivadas del estroma mesenquimatoso de la médula ósea Para demostrar el efecto de los factores de crecimiento liberados de las plaquetas usando diferentes anticoagulantes en la modulación de la expansión celular in vitro, usamos el ensayo MTT de viabilidad celular para analizar la proliferación BM-MSC en presencia de diferentes concentraciones de PRPr. El medio fue suplementado con FBS (Figure 4). El PRPr fue probado separadamente y mezclado (MIX). Todas las concentraciones probadas de PRPr de todos los donantes fueron similares in vitro. Como esperamos, la concentración más alta probado (5%) estimuló la velocidad de proliferación in vitro, independientemente del anticoagulante usado. Sin embargo, para estas concentraciones, en promedio fue menor usando EDTA, comparado con los otros dos anticoagulantes (Figura 4). Además, las células conservaron su morfología independientemente del anticoagulante usado.

3.4. Modulación de la expresión de genes del cultivo de las células derivadas del estroma mesenquimatoso de la médula ósea por el PRP. Analizamos la expresión de genes de la expansión celular in vitro (Figura 6). Se probaron sólo células cultivadas en PRP 5% PRPr. Se usó como referencia el medio con 10% de FBS, aumentó la expresión del gen RUNX2 en

el grupo con EDTA y disminuyó en el grupo con SC. El PPAR𝛾2 aumentó levemente el grupo con EDTA y disminuyó en los grupos con SC y ACD. El gen SOX9 disminuyó su expresión en todos los grupos. El Oct-4 elevó su regulación en el grupo con EDTA y ACD, disminuyó el grupo SC. Aunque en general, la expresión de genes fue similar entre el grupo con PRPr, especialmente cuando se observan los máximos y mínimos de la cuantificación relativa de expresión de los genes, el grupo con SC presentó las menores variaciones comparadas con el grupo control, analizando la expresión relativa promedio de los 4 genes en el grupo PRPr

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comparado con el grupo FBS. En promedio, la expresión relativa de genes con SC fue de 24.73%, 46.79% en el grupo con EDTA y 29.74% con ACD.

4. Discusión El plasma rico en plaquetas (PRP) es normalmente una de las estrategias que se utilizan para la reparación de lesiones del tejido muscular. Existen en la literatura diversos informes que evidencian su potencial en pruebas clínicas [2–11] como así también en análisis realizados in vitro [12–15]. Los factores de crecimiento autólogos son una buena fuente y económica, de producir la proliferación y diferenciación de células madre, actualmente se han incrementado las investigaciones como un suplemento adyuvante terapéutico [41–45]. Sin embargo, la falta de estandarización de la metodología para obtener y usar PRP entre diferentes grupos, puede mejorar el desarrollo de esta tecnología [20]. Un tema importante es el uso de anticoagulantes para recolectar la sangre. El presente trabajo ayudó al estudio de la obtención de PRP con tres tipos de tubos provisto por la industria con diferentes tipos de anticoagulantes: EDTA, SC, y ACD. El recuento plaquetario en sangre entera fue mayor utilizando los tubos que contenían EDTA, seguido por los tubos con SC y ACD. Previamente se había demostrado que el recuento plaquetario utilizando EDTA era superior al citrato como anticoagulante [46]. Además cuando se adiciona EDTA a tubos con citrato para colectar la sangre puede aumentar el recuento plaquetario [47]. La recuperación plaquetaria luego de la primera centrifugación disminuyó cuando se usaron tubos con ACD. Además, se encontró una mayor concentración de PDGF-BB en PRP obtenido con EDTA comparado con el ACD [48]. En nuestro caso, hemos tratado de mejorar la recuperación plaquetaria usando ACD dividiendo el contenido de los tubos grandes en tubos pequeños (12 × 75mm × 5mL). Aunque no se detectaron diferencias estadísticamente significativas entre estas dos formas de tubos con ACD, la separación de sangre en tubos pequeños resultaron en una recuperación plaquetaria similar a cuando se utilizó el EDTA. Como los tubos comerciales con ACD son más grandes (16 × 100mm × 8.5 mL) que los de EDTA (13 × 75mm × 4.0 mL) y SC (13 × 75mm × 4.5 mL), es posible que la baja recuperación plaquetaria no se deba solamente al anticoagulante sino también al formato de los tubos. Particularmente, la forma de los tubos puede tener una influencia mayor en la centrifugación debido a la mayor viscosidad de la muestra [49]. Para los siguientes experimentos hemos decidido mezclar ACD y ACD-2 PRP1 del mismo donante y se centrifugó para obtener e PRP2 con los mismos tipo de tubo que todos los grupos analizados. Con el objetivo de verificar si los pasos de centrifugación tienen influencia en la morfología plaquetaria, medimos el MPV en sangre entera, PRP1, y PRP2 obtenidos con diferentes anticoagulantes. El MPV en el grupo con EDTA se incrementó luego de los pasos de centrifugación, pero no con SC ni ACD, lo que podría indicar activación plaquetaria [50, 51]. Se esperaba un mayor MPV en sangre entera cuando se utilizó EDTA comparando con las muestras recibidas sobre citrato [46]. Además el EDTA puede cambiar la morfología plaquetaria de discoide a una esfera irregular [52]. El uso de EDTA también conlleva un aspecto ético y ambiental ya que produce polución ambiental [53] y su prohibición en algunos países [54]. El ACD y el citrato-teofillina-adenosina-dipiridamole (CTAD) es más eficiente en mantener la morfología plaquetaria que la heparina y el SC. En tal caso, se demostró que el PRP obtenido ACD y CTAD

obtuvo mayor concentración de TGF𝛽-1 y la inducción de la proliferación de MSC [55]. En otro estudio previo se usó, EDTA, SC, y ACD para comparar la respuesta como inductor de la agregación plaquetaria. El ACD fue el que mostró mayor capacidad de mantener las señales de transducción intraplaquetarias durante la preparación de PRP [56]. Posteriormente el mismo grupo, mostró que el ACD era capaz de mantener la función plaquetaria por lapsos superiores al SC [57]. En nuestro caso, no pudimos encontrar ninguna diferencia en la capacidad de activar las plaquetas y formar el coágulo del PRP2 obtenido con tres anticoagulantes. El siguiente paso fue evaluar el efecto del PRP sobre el cultivo celular. Para esto, se normalizó la concentración plaquetaria ideal a

1000 × 103/𝜇L en todos los grupos, en una forma que no resultara de la concentración plaquetaria y sí del tipo

de anticoagulante usado. Esta concentración plaquetaria se indicó como una concentración terapéutica in vivo [1]. Para uso en problemas óseos por ejemplo, concentraciones menores no resultan satisfactorias y por otro lado concentraciones mayores son inhibitorias para promover la reparación tisular [11]. La única diferencia estadísticamente significativa en la concentración plaquetaria en PRP2 fue entre los grupos con EDTA y SC. Los valores más bajos en el grupo SC, podrían ser atribuidos a la dificultad para resuspender el sedimento. Los concentrados plaquetarios preparados con ACD contiene más agregados que los preparados con EDTA [52]. El efecto del PRPr sobre el cultivo celular siempre fue comparado contra el medio suplementado con 10% FBS. A

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pesar de ser un suero xenogénico y presentar cuestiones éticas y científicas [58], el FBS se sigue usando ampliamente en cultivo celulares [59] y expansión in vitro de MSC [60]. En nuestro estudio, no encontramos diferencias significativas en las concentraciones de TGF𝛽-1 y VEGF entre los anticoagulantes. En promedio, la

concentración de TGF-𝛽1 varió desde 18.15 ng/mL con EDTA a 48.56 ng/mL con SC. La bibliografía reporta concentraciones superiores a nuestros hallazgos: 120 ng/mL [61], 169 ng/mL [62], y 89 ng/mL en PRP con concentraciones plaquetarias de 4.69 veces superior a la concentración plaquetaria basal en sangre entera pero 20 ng/mL en el PRP con concentraciones plaquetarias 1.99 veces superior al estado basal [63]. La concentración de VEGF varió desde 143.65 pg/mL con SC a 362.70 pg/mL con ACD. Otros reportes mostraron concentraciones que varían desde 50 pg/mL [64] a 155 ng/mL [61]. En ningún caso, nuestros resultados fueron superiores a equipos comerciales disponibles [65]. Como se esperaba, el PRPr indujo proliferación celular. Aunque hubo variaciones comparando la proliferación celular entre donantes, posiblemente debido a diferencias inherentes a los factores de crecimiento contenidos en los gránulos plaquetarios apareció un patrón: un 5% PRPr en el cultivo celular fue suficiente para inducir una proliferación celular equivalente a 10% FBS. Además, el PRPr derivado de SC y ACD presentó mayores efectos sobre la proliferación que con EDTA. La morfología celular no presentó cambios entre los grupos. Las BM-MSC mantuvieron su morfología independientemente del anticoagulante. Aunque persisten controversias en la literatura sobre los efectos del PRP sobre la diferenciación de las BM-MSC, hay consenso sobre su efecto como inductor de la proliferación celular [66]. Como análisis final del efecto del PRPr sobre las BM-MSC, hemos observado una leve modulación en la expresión de los genes osteogénicos (RUNX2), adipogénicos (PPAR𝛾2), y condrogénicos (SOX9) [67], así como el gen Oct-4, relacionado con la diferenciación de células madre [68, 69]. Particularmente, disminuyó la expresión del gen SOX9. Existe una discusión en la literatura con respecto a los efectos en la condrogénesis del PRP, con algunos grupos defendiendo sus efectos inductores [70, 71] y otros sus efectos inhibitorios [72, 73]. Recientemente nuestro grupo mostró que el efecto puede ser concentración de PRP dependiente, con bajas concentraciones en el medio se induce la condrogénesis y con altas concentraciones se inhibe [74]. La expresión de Oct-4 presenta mucha variabilidad, con un aumento de la regulación con el uso de EDTA y ACD y una baja en la regulación cuando se usa SC. Al margen que pueda ser o no un estimulador del mantenimiento del crecimiento es un tema que debe ser más investigado. En general, la expresión de genes fue similar entre los grupos, aunque el grupo SC fue el que presentó menores variaciones comparado con el cultivo con 10% FBS, evidenciando que las células presentan ligeros cambios en el fenotipo con el tratamiento.

5. CONCLUSIONES La literatura muestra una variedad de metodologías para obtener PRP. La primera variación en la técnica consiste en la utilización del anticoagulante con que se colecta la muestra. En este informe, analizamos los efectos de tres anticoagulantes comercialmente disponibles. Aunque no hubo cambios en la cantidad de factores de crecimiento liberados, algunos aspectos pueden ser señalados. La recolección de la sangre en tubos que contienen EDTA mostró un mayor rendimiento plaquetario. Sin embargo, se acompañó de un incremento del MPV con los pasos de centrifugación, lo que indica un cambio en la morfología plaquetaria. Por otro lado, el uso de tubos que contienen soluciones de citrato resultó en una inducción mayor de la proliferación de las MSC. Particularmente, la sangre recibida sobre citrato mostró una mayor recuperación plaquetaria luego del primer paso de centrifugación. Si se usa ACD, la reducción del tamaño de los tubos incrementa la recuperación plaquetaria. Además, el PRP obtenido con SC presentó las menores variaciones en la expresión de genes de los cultivos de las MSC comparados frente a los cultivos control con 10% de FBS. Con el fin de obtener una mayor cantidad de plaquetas e inducir la proliferación de las MSC sin cambios importantes en el fenotipo, sugerimos el uso de SC como anticoagulante.

AMPLIACIÓN Las células mesenquimatosas o embrionarias pueden tener forma irregular, estrellada o fusiforme. Son células de citoplasma claro, basófilo, que se encuentran suspendidas en una matriz gelatinosa y que poseen prolongaciones citoplasmáticas que se unen entre sí (embrión). Las células mesenquimatosas (totipotenciales o pluripotenciales) dan origen a las células del tejido conectivo fibroso, células musculares lisas, células adiposas y células sanguíneas. En la vida postnatal, algunas de estas células conservan suficiente potencialidad mesenquimatosa como para poder convertirse, diferenciarse y restituir el tejido

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conectivo y los vasos sanguíneos dañados toda vez que sea necesario; entonces reciben el nombre de pericitos, células adventiciales, células mesenquimatosas indiferenciadas o células perivasculares. Los pericitos conservan suficiente potencialidad del mesénquima en la vida adulta como para dar origen a los fibroblastos y a las células del músculo liso. Se sitúan generalmente alrededor de los capilares. En el estroma endometrial se observan células morfológicamente similares a las células mesenquimatosas.

Las sondas TaqMan son sondas de hidrólisis diseñadas para incrementar la especificidad de la de Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) cuantitativa, se basa en la actividad exonucleasa 5'-3 'de la Taq polimerasa para escindir una sonda marcada ya hibridada a la secuencia diana. Esta escisión de la sonda permite la emisión de fluorescencia, que, al igual que en otros métodos de PCR cuantitativa, permite obtener una medida cuantitativa de la acumulación del producto durante los ciclos La gran ventaja de la sonda TaqMan es que aumenta significativamente la especificidad de la detección. Por lo tanto, la fluorescencia detectada en el termociclador de la PCR cuantitativa es directamente proporcional a la del fluoróforo liberado y la cantidad de ADN molde presente en la PCR. Se trata de un método específico cuyo objetivo es la cuantificación de la expresión de genes.

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