Coefficiente di ripartizione KCoefficiente di ripartizione K

1

2

S

SK

Un sistema cromatografico è sempre Un sistema cromatografico è sempre composto da due composto da due fasifasi immiscibili tra loro immiscibili tra loro– Fase mobileFase mobile– Fase stazionariaFase stazionaria

La fase mobile è definita tale perché si La fase mobile è definita tale perché si muove rispetto alla fase stazionariamuove rispetto alla fase stazionaria

Affinché il processo cromatografico Affinché il processo cromatografico avvenga, gli analiti da separare devono avvenga, gli analiti da separare devono presentare affinità per entrambe le fasipresentare affinità per entrambe le fasi

Il processo di separazione è basato Il processo di separazione è basato sulla diversa affinità degli analiti per sulla diversa affinità degli analiti per le due fasile due fasi

Gli analiti sono trasportati fuori dal Gli analiti sono trasportati fuori dal sistema cromatografico e rivelati.sistema cromatografico e rivelati.

I componenti più affini alla I componenti più affini alla fase fase mobilemobile usciranno usciranno primaprima. Quelli più . Quelli più affini alla affini alla fase stazionariafase stazionaria, , dopodopo

L’affinità più o meno forte degli L’affinità più o meno forte degli analiti per la fase stazionaria è analiti per la fase stazionaria è basata sui seguenti fenomeni:basata sui seguenti fenomeni:– Adsorbimento Adsorbimento – RipartizioneRipartizione– Scambio ionicoScambio ionico– Esclusione dimensionaleEsclusione dimensionale

FM

FS

FM

FS

Principio cromatograficoPrincipio cromatograficoTipo di Tipo di fase fase

mobilemobile

Tipo di Tipo di apparatoapparato

Tecnica Tecnica cromatograficacromatografica

AdsorbimentoAdsorbimento

competizione tra un adsorbente competizione tra un adsorbente solido e la fase mobilesolido e la fase mobile

GasGas ColonnaColonna Cromatografia gas-solido GSCCromatografia gas-solido GSC

LiquidoLiquido

ColonnaColonnaCromatografia liquida LCCromatografia liquida LC

Crom. Liq. ad alte prestazioni Crom. Liq. ad alte prestazioni HPLCHPLC

PlanarePlanareCromatografia a strato sottile Cromatografia a strato sottile TLCTLC

Cromatografia su carta PCCromatografia su carta PC

RipartizioneRipartizione

competizione tra fase fissa e competizione tra fase fissa e mobile liquidemobile liquide

GasGas ColonnaColonnaCromatografia gas-liquido GLCCromatografia gas-liquido GLC

Cromatografia supercritica SFCCromatografia supercritica SFC

LiquidoLiquido ColonnaColonnaCromatografia liquida LCCromatografia liquida LC

Crom. Liq. ad alte prestazioni Crom. Liq. ad alte prestazioni HPLCHPLC

Scambio ionicoScambio ionico

Competizione tra una resina Competizione tra una resina scambiatrice di ioni e la fase scambiatrice di ioni e la fase mobilemobile

LiquidoLiquido ColonnaColonnaCromatografia a scambio Cromatografia a scambio ionico IECionico IEC

Cromatografia ionica ICCromatografia ionica IC

Esclusione molecolareEsclusione molecolare

Competizione sterica tra una Competizione sterica tra una matrice polimerica e la fase matrice polimerica e la fase mobilemobile

Liquido Liquido ColonnaColonna Cromatografia ad esclusione Cromatografia ad esclusione molecolare GPCmolecolare GPC

timestarttempo morto tR1 tR2

time

w

w½start

t0 o tm t’r

tr

Picco di una sostanza non

trattenuta

Tempi di ritenzioneTempi di ritenzione– tt00 = tempo morto, tempo che impiega un = tempo morto, tempo che impiega un

composto non trattenuto ad arrivare al rivelatorecomposto non trattenuto ad arrivare al rivelatore– ttrr = tempo di ritenzione totale, t = tempo di ritenzione totale, t00 + tempo + tempo

trascorso nella fase stazionariatrascorso nella fase stazionaria– t’t’rr = tempo di ritenzione netto, il tempo trascorso = tempo di ritenzione netto, il tempo trascorso

nella fase stazionarianella fase stazionaria Picco cromatograficoPicco cromatografico

– WWbb = larghezza del picco alla base = larghezza del picco alla base– WW½½ = larghezza del picco a metà altezza = larghezza del picco a metà altezza– A = area del piccoA = area del picco

Se il flusso (F=V/t) di fase mobile Se il flusso (F=V/t) di fase mobile è costante:è costante:– Volume di ritenzioneVolume di ritenzione == VVrr ==

FF..ttrr

– Volume di r. nettoVolume di r. netto == V’V’rr ==FF..t’t’rr

– Volume mortoVolume morto == VVMM ==FF..ttMM

CCss= concentrazione nella fase stazionaria= concentrazione nella fase stazionaria

CCMM= concentrazione nella fase mobile= concentrazione nella fase mobile

Se KSe KC C è grande la sostanza è affine alla fase è grande la sostanza è affine alla fase stazionaria, se è piccolo è affine alla fase stazionaria, se è piccolo è affine alla fase mobilemobile

M

SC C

CK

Il successo di una separazione Il successo di una separazione cromatografica si verifica cromatografica si verifica attraverso una differenza dei attraverso una differenza dei tempi di ritenzione degli analititempi di ritenzione degli analiti

Il Il fattore di separazione fattore di separazione definisce il rapporto tra i tempi di definisce il rapporto tra i tempi di ritenzione di due sostanzeritenzione di due sostanze

A

B

A

B

rA

rB

K

K

k

k

t

t

'

'

Il Il fattore di separazione fattore di separazione rappresenta rappresenta il primo parametro che deve essere il primo parametro che deve essere soddisfatto per la separazionesoddisfatto per la separazione

Esso dipende dal tipo di colonna Esso dipende dal tipo di colonna utilizzato ma non dalle sue utilizzato ma non dalle sue caratteristiche geometrichecaratteristiche geometriche

L’effettiva separazione di due L’effettiva separazione di due sostanze dipende invece dalla sostanze dipende invece dalla risoluzione Rrisoluzione R

La banda cromatografica tende ad La banda cromatografica tende ad allargarsi durante il tragitto in colonnaallargarsi durante il tragitto in colonna

L’entità di tale allargamento dipende L’entità di tale allargamento dipende da diversi fattori: da diversi fattori: caratteristiche caratteristiche della colonna (lunghezza, tipo, della colonna (lunghezza, tipo, qualità), flussoqualità), flusso

La capacità di ridurre al minimo La capacità di ridurre al minimo l’allargamento è indice di l’allargamento è indice di efficienzaefficienza

L’unità di misura dell’efficienza L’unità di misura dell’efficienza cromatografica è il cromatografica è il numero di piatti numero di piatti teorici Nteorici N

Tale unità di misura deriva dal concepire una Tale unità di misura deriva dal concepire una colonna come se fosse costituita da una colonna come se fosse costituita da una serie di piccole sezioni (serie di piccole sezioni (piattipiatti) nei quali si ) nei quali si raggiunge per un’istante l’equilibrio raggiunge per un’istante l’equilibrio dell’analita tra fase mobile e fase stazionariadell’analita tra fase mobile e fase stazionaria

In realtà tale equilibrio non viene mai In realtà tale equilibrio non viene mai raggiunto perché la fase mobile è in raggiunto perché la fase mobile è in movimento continuomovimento continuo

L’efficienza cromatografica L’efficienza cromatografica specifica è definita dal parametro specifica è definita dal parametro HH o o altezza equivalente del altezza equivalente del piatto teoricopiatto teorico

È utile per comparare colonne con È utile per comparare colonne con caratteristiche diversecaratteristiche diverse

N

LH

L‘altezza del piatto teorico L‘altezza del piatto teorico HH dipende, oltre che dalle dipende, oltre che dalle caratteristiche costruttive della caratteristiche costruttive della colonna, dalla colonna, dalla velocità lineare velocità lineare mediamedia della fase mobile della fase mobile

Per una data velocità lineare il Per una data velocità lineare il flussoflusso, espresso come , espresso come mL/minmL/min, , dipenderà dalla sezione della dipenderà dalla sezione della colonna colonna

t

w1 w2