生化科技學系微生物與細胞專題討論 題目: Engineering microbes to sense and eradicate Pseudomonas aeruginosa,

a human pathogen 作者：Nazanin Saeidi, Choon Kit Wong, Tat-Ming Lo, Hung Xuan Nguyen, Hua

Ling, Susanna Su Jan Leong, Chueh Loo Poh and Matthew Wook Chang 文章來源：Molecular Systems Biology 7; Article number 521; 2011 演講人：Chia Chun Hsu 徐嘉駿 B97B02046 指導老師：Chii Shen Yang, PhD 楊啓伸 博士 演講日期：December 27, 2011 演講地點：The 6th Classroom

摘要

合成生物學之目標為系統性地建構生物系統，並藉此在環境、能源及健康問題上

提供可行的解決方法。本研究中，作者建構了一合成基因系統，使大腸桿菌可感

知並藉由釋放膿菌素(pyocin)進而殺死綠膿桿菌這種感染人類呼吸系統之致病菌。此系統由感知、毒殺及胞溶等三部份組成。在建構系統時，組成部份均經過分別

調整，確認每一部份之功效並將其調整至最佳狀態。結果顯示該系統可有效地殺

死 99%以上懸浮性之綠濃桿菌，並可抑制近 90%綠濃桿菌生物膜的形成，使生物膜基質變得更薄且空泛。此結果證實系統的可行性，並以合成生物學之思維，

在抗微生物研究下提供了新的方法。 Keywords：genetic circuits、synthetic Biology、quorum sensing、Pseudomonas aeruginosa、pyocin

前言

w 本研究之重要性 本研究提供了一可行的新方法，利用合成生物學的概念建造可毒殺綠濃桿菌的

生物系統，此系統或可利用在其他致病微生物上。 w 前人作過的研究 綠濃桿菌喜在人類呼吸及消化器官繁殖[1]，使宿主得到囊胞性纖維癥甚至是癌

症[2] [3]。然因其對抗生素等藥物有很好的抗藥性，使得治療綠濃桿菌感染並不

容易。目前治療綠濃桿菌感染主要有抗生素化學法(antibiotic chemotherapy)及噬菌體法(bacteriophage therapy)等兩種療法，但兩種療法都有不同的缺點：抗生素化學法之其非專一性會破壞宿主體內原有之菌相[4]；噬菌體法則因為宿主

產生對輸入噬菌體專一之抗體而無法治療再次感染之患者[5]。 膿菌素是一種物種專一性高的細菌素，可有效抑制綠濃桿菌生長，由綠膿桿菌

本身分泌。與傳統抗生素不同，至今尚未遭遇抗膿菌素基因能在菌與菌間自發

性的傳遞[6]。群體感應(quorum sensing)則是一種微生物接收胞外有機物質為訊號產生的梯瀑反應，其對於微生物生理反應的調控扮演重要的角色[7]。乙醯單

絲氨酸內酯(AHLs, acyl homoserine lactones)即為一類由微生物本身分泌的群體感應自我誘導物(auto inducer)，具高度物種專一性，是族群密度的指示劑[8] [9]。

E7 lysis protein則可有效造成大腸桿菌內膜破裂並啓動磷脂酵素A(phospholipase A)[10]。

w 作者為何要作本研究 由於目前治療綠濃桿菌感染之方法均有其限制及副作用，故作者想要利用原本

就常見於人體內之大腸桿菌作為載具，建構專一性高的治療方法，將副作用減

低。 w 本研究欲完成之項目 有系統地建構一能利用群體感應感知綠濃桿菌之存在、生產並釋放膿菌素至環

境中，能有效抑制綠濃桿菌生長之大腸桿菌菌株。在完成最終系統前，分別測

試其感知綠濃桿菌、製造膿菌素及釋放膿菌素的功能。

材料與方法

w 菌株 E. coli TOP10 (Invitrogen)是一具高轉型效率之大腸桿菌菌株。 P. aeruginosa ln7是一株臨床上分離的綠濃桿菌，對 Pyocin S5敏感。 P. aeruginosa PAO1是一株具 Pyocin S5有抗藥性的的綠濃桿菌。

w 以 3OC12HSL測量 pTetR-LasR-LuxR-GFP之效率 挑取 pTetR-LasR-pLuxR-GFP (Top10)單一菌落，培養至 O.D.600值達 0.5時轉置到 96孔盤，加入不同濃度的 3OC12HSL共十組、三重複。在 37°C下培養三小時，每十分鐘測量一次 GFP合成速率。實驗數據以 Hill Equation作為模型，利用MATLAB Curve Fitting Toolbox (The Mathworks, Natwick, MA, USA)擬合曲線。

Hill Equation: ! = ! + ![!!"]!

!!![!!"]!

w 測量綠濃桿菌分泌 3OC12HSL之效率 將稀釋過的綠濃桿菌持續培養至晚對數期，以 0.22µm濾器後取濾液。利用感知系統(含 GFP版本，pTetR-LasR-pLuxR-GFP)測量 GFP 合成速率，利用已計算出之擬合曲線推得綠濃桿菌分泌 3OC12HSL之效率。

w 以 3OC12HSL測量胞溶系統之效率 挑取 pTetR-LasR-pLuxR-E7 (Top10)單一菌落，培養至 O.D.600值達 0.5時轉置到 96孔盤，加入不同濃度的 3OC12HSL。每十分鐘測量一次 O.D.600，測量時

間六小時。

w 以蛋白釋出量評估胞溶系統之效率 將 pTetR-LasR-pLuxR-S5-pLuxR-E7及 pTetR-LasR-pLuxR-S5之 S5基因尾端加上 6×His。分別培養帶有兩種質體的大腸桿菌(Top10)，O.D.600達 0.7後加入 10-6 M 3OC12HSL持續培養六小時。後以 0.22µm濾器後取得濾液，純化出 S5蛋白質後進行 SDS-PAGE及 Bradford assay。

w 以 3OC12HSL測量最終系統之效率 將稀釋過的綠濃桿菌(ln7)持續培養至 O.D.600=1.0，以 0.22µm濾器取濾液。用其誘導 pTetR-LasR-pLuxR-S5-pLuxR-E7 (Top10)兩小時後再以 0.22µm濾器取濾液。取微量濾液點在 TSA瓊脂膠上乾燥，後在乾燥點上加入預熱且含有 ln7的軟瓊脂膠(soft agar)，在 37°C下培養六小時後觀察。

w 共培養具最終系統之大腸桿菌及綠濃桿菌 將 pMRP9-1(含GFP報導基因)、pAWG1.1(含抗氯霉素基因)轉形到 ln7及 PAO1中。培養 ln7及 PAO1和分別含有 pTetR-LasR-pLuxR-S5、pTetR-LasR-pLuxR-E7、pTetR-LasR-pLuxR-S5-pLuxR-E7之 TOP10至 O.D.600=1.0。將綠膿桿菌及大腸桿菌以 1:4之比例混合培養 15小時後觀察螢光讀值；另將混合菌液培養在含氯霉素之瓊脂膠上 5小時，計算擊落生成單位，最後換算成相對存活率。

w Live and Dead fluorescent microscopy 隔夜培養 ln7及 pTetR-LasR-pLuxR-S5-pLuxR-E7(Top10)，以 0.22µm濾器取 ln7濾液，取等量加入前述之 Top10中，培養 3小時。後再以 0.22µm濾器取得濾液，加入 ln7中，以 bacterial viability kit(Invitrogen)分析細菌存活情況。

w 抑制生物膜分析 將帶有 pAWG1.1之 ln7/PAO1與 pTetR-LasR-pLuxR-S5-pLuxR-E7(Top10)以 1:4之比例共培養至 1.0×108 cfu/mL後轉置至聚苯乙烯微量滴定盤(polystyrene microtiter plate, Iwaki)培養。後以MHB懸浮之並轉入含氯霉素之瓊脂膠培養，計算擊落生成單位，最後換算成相對存活率。

w 利用共軛焦顯微鏡觀察生物膜 將將帶有 pMRP9-1之 ln7/PAO1與 pTetR-LasR-pLuxR-S5-pLuxR-E7(Top10)於一含有玻片之試管內培養。後取出波片，以共軛焦雷射掃描式顯微鏡觀察。

結果與討論

w 基因系統之設計 本系統是以綠膿桿菌的第一類群體感應作為基礎設計。圖一是本系統之設計概

要：大腸桿菌作為載具，內有一質體 pTetR-LasR-pLuxR-S5-pLuxR-E7。tetR啓動子會持續生產 LasR；而 LasR會與綠膿桿菌分泌之乙醯單絲氨酸內酯3OC12HSL結合，結合到下游 luxR啓動子，啓動 S5及 E7之轉錄。達一定濃度後，E7會在大腸桿菌膜上打洞，釋放 S5。S5經擴散作用移至致病菌處並毒殺之。

w 感知裝置之性質

我們以 pTetR-LasR-pLuxR-GFP，透過測量 GFP合成速率觀測感知系統對3OC12HSL的反應，結果以 Hill Equation擬合。結果顯示線性區間落在[3OC12HSL]= 3.3×10-7 ~1.0×10-6 M，GFP最大合成速率為 1.96 RFU/OD×min。超過 1.0×10-6 M時，GFP合成速率急遽下滑(圖二)。

w P. aeruginosa所釋放之 3OC12HSL濃度 取 ln7培養之濾液至前項之 pTetR-LasR-pLuxR-GFP系統中，測量 GFP合成速率。ln7在此系統中的 GFP合成速率為 1.375 RFU/OD×min，對應[3OC12HSL]約為 1.0×10-6 M。

w 胞溶裝置之功效 以不同濃度之 3OC12HSL加至胞溶裝置中。透過 O.D.600來觀察胞溶裝置之效

率。發現在[3OC12HSL] > 1.0×10-6 M 時，胞溶系統會啟動(圖三-a)。另加入1.0×10-6 M之 3OC12HSL到胞溶裝置及最終系統中，透過場發射掃描式電子顯微鏡均能觀察到細胞破裂的現象(圖三-b)。

w S5可被最終系統釋放 以 1.0×10-6 M 3OC12HSL誘導最終系統。與缺乏胞溶裝置的系統(pTetR-pLasR-pLuxR-S5)相比，最後系統可從上清液中純化出 S5(圖四-a,b)，且大腸桿菌會被溶解而死亡。最終系統在誘導兩小時後開始釋放大量 S5。

w 最終系統之性質與功效 利用綠膿桿菌產生的天然 3OC12HSL誘導最終系統，可有效抑制在 TSA瓊脂膠上的綠膿桿菌 ln7(圖五-a)。在 LIVE/DEAD分析中，最終系統可殺死絕大部份的 ln7(圖五-b)。在共培養帶有最終系統之 Top10及 ln7的實驗中，監測 RFU及菌落計量結果顯示超過 99%之 ln7都被殺死(圖五-c, d)。在生物膜實驗實驗中，最終系統可抑制生物膜形成達 90%(圖六)。

參考文獻

1. Fujitani S, Sun H-Y, Yu VL, Weingarten JA (2011) Pneumonia due to Pseudomonas aeruginosa. Chest 139: 909–919

2. Chang W, Small DA, Toghrol F, Bentley WE (2005a) Microarray analysis of Pseudomonas aeruginosa reveals induction of pyocin genes in response to hydrogen peroxide. BMC Genomics 6: 115

3. Small DA, Chang W, Toghrol F, Bentley WE (2007) Comparative global transcription analysis of sodium hypochlorite, peracetic acid, and hydrogen peroxide on Pseudomonas aeruginosa. Appl Microbiol Biotechnol 76: 1093–1105

4. Wright A, Hawkins CH, Änggård EE, Harper DR (2009) A controlled clinical trial of a therapeutic bacteriophage preparation in chronic otitis due to antibiotic-resistant Pseudomonas aeruginosa; a preliminary report of efficacy. Clin Otolaryngol 34: 349–357

5. Häusler T (2006) Viruses vs. Superbugs: A Solution to the Antibiotics Crisis? MacMillan, New York, NY, USA

6. Scholl D, Martin Jr DW (2008) Antibacterial efficacy of R-Type pyocins towards pseudomonas aeruginosa in a Murine Peritonitis Model. Antimicrob Agents Chemother 52: 1647–1652

7. Asad S, Opal SM (2008) Bench-to-bedside review: quorum sensing and the role of cell-to-cell communication during invasive bacterial infection. Crit Care 12: 236

8. Smith C, Song H, You L (2008) Signal discrimination by differential regulation of protein stability in quorum sensing. J Mol Biol 382: 1290–1297

9. Schuster M, UMLGEP (2004) Promoter specificity in Pseudomonas aeruginosa quorum sensing revealed by DNA binding of purified LasR. Proc Natl Acad Sci USA 101: 15833–15839

10. Chak KF, Kuo WS, Lu FM, James R (1991) Cloning and characterization of the ColE7 plasmid. J Gen Microbiol 137: 91–100

圖表

圖一 感知及毒殺系統之示意圖。 luxR啟動子會被 LaR-3OC12HSL活化，啟動 S5及 E7的生產。在 E7濃度超過閾值後，大腸桿菌會溶解，釋放 S5殺死綠膿桿菌。

圖二 將感知裝置與 GFP報導基因耦合分析之結果。 (A) 依時間及[3OC12HSL]不同，GFP合成速率之改變。 (B) 平均時間下不同[3OC12HSL]每個細胞合成 GFP的速率變化，顯示 1.0×10-7 M到 1.0×10-6 M是最佳濃度。平均時間是指 20 min到 80 min的數據平均值。

圖三 胞溶裝置之性質。 (A) 在不同[3OC12HSL]下，持續表達 E7的大腸桿菌生長情形。 (B, C) 透過 FESEM觀察 E7 對大腸桿菌表面形態之影響。游標尺刻度為 1 µm。

圖四 最終系統中胞溶系統之特性。 (A) SDS-PAGE。(i, ii)為全部的胞外蛋白質、(iii-viii)從胞外蛋白質利用 IMAC純化帶有 His抗原的 S5。(i)為 pTetR-LasR-pLuxR-S5(無胞溶裝置)；(ii)為pTetR-LasR-pLuxR-S5-pLuxR-E7(最終系統)；(iii-v)為 pTetR-LasR-pLuxR-S5分別以 3OC12HSL誘導 0、2、4小時後的結果；(iii-v)為 pTetR-LasR-pLuxR-S5-pLuxR-E7(最終系統)分別以 3OC12HSL誘導 0、2、4小時後的結果。可在(vii, viii)明顯看到 57 kDa處有一條 S5的條帶。 (B)最終系統在3OC12HSL誘導後 O.D.600(長條圖)及 S5釋放量(折線圖)的變化。虛線及深灰色的長條代表最終系統；實線及淺灰色代表 pTetR-LasR-pLuxR-S5(無胞溶裝置)。可觀察到最終系統在誘導兩小時後細胞數量大幅減少且 S5量急增，而無胞溶裝置的系統的細胞數量持續增加且無明顯 S5釋放。

圖五 綠膿桿菌的生長被帶有最終系統之大腸桿菌抑制，在綠膿桿菌天然分泌之 3OC12HSL誘導下。 (A) 將長有綠膿桿菌之培養基滴上不同的上清液，只有帶有最終系統的大腸桿菌能有效抑制綠膿桿菌生長(右下) (B) LIVE/DEAD分析結果，與左圖比較，右圖大部份的綠膿桿菌細胞被 PI dye染成紅色，代表細胞死亡。(C) 利用帶有 GFP報導基因之綠膿桿菌的 GFP合成速率監測系統效率。共培養實驗中，只有帶有最終系統的大腸桿菌能降低 GFP合成速率。PAO1為一抗S5菌株，作為負控制組。(D) 透過氯霉素篩選，利用細胞計數監測系統效率。共培養實驗中，只有帶有最終系統的大腸桿菌能有效降低 GFP合成速率。PAO1為一抗 S5菌株，作為負控制組。

圖六 生物膜抑制分析。 (A) 透過氯霉素篩選，利用細胞計數監測最終系統抑制生物膜效率。與複控制組相較，最終系統抑制生物膜上綠膿桿菌細胞生長的效率達 90%。 (B) 利用 CLSM顯微鏡分析生物膜。將綠膿桿菌及大腸桿菌在玻片上共培養 18小時後用 CLSM紀錄螢光讀值。後用 Zeiss 2.5D軟體重建生物膜 Z-stack。游標尺刻度為 50 µm、Z-stack刻度為 40 µm。可觀察到帶有最終系統的大腸桿菌可有效抑制生物膜生成。