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Clonando o metagenoma do solo: uma estratégia para o acesso à diversidade genética e funcional de microrganismos não cultivados
Introdução Diversidade de microrganismos Métodos tradicionais de cultivo Conceito de METAGENOMA Importância e utilidade dos microrganismos Acesso ao DNA metagenômico do solo Uso de cromossomos artificiais de bactéria (BAC)
Características:
mantém insertos de grande extensão de DNA (> 100 kb)
apresenta poucas cópias (1 ou 2 por célula)
pode ser utilizado para expressar o DNA exógeno
Objetivo Avaliar a diversidade microbiana no ambiente através
da extração e análise do DNA metagenômico
Materiais e Métodos Linhagens de bactérias e plasmídeos:
- Escherichia coli DH10B
- BAC pBeloBAC11
- Bacillus subtilis BR151(pPL608)
Extração de DNA do solo:- coleta do solo
(Estação de pesquisa em Agricultura – Madison, Wis)
Materiais e Métodos Extração de DNA do solo:
- 5g suspendidas em 10 ml de tampão- Incubação a 60°C por 2 hs- Extração do DNA com clorofórmio e precipitação com isopropanol- Dissolução em água (500 μl)- Eletroforese em gel de agarose- Armazenamento em TE + poliaminas overnight
OBS: em numerosos experimentos esta metodologia produziu DNA de tamanho e limpeza apropriados para a clonagem subseqüente
Materiais e Métodos Construção das bibliotecas
- SL1 e SL2 SL1
- DNA X Gelase- Preparação do vetor- Digestão do DNA com Hind III- Ligação- Transformação
URL http://informa.bio.caltech.edu/idx_www_tree.html Rondon et. al (1999)
Materiais e Métodos SL2
- Preparação do vetor (digestão, ligação, gel, seleção e eluição)- DNA metagenômico: eletroforese do tipo pulsed-field (> 50 kb)
- Digestão com Hind III e eletroforese(insertos 40 kb)
- Ligação- Transformação- Armazenamento
Materiais e Métodos Amplificação por PCR, clonagem e seqüenciamento de genes
ribossomais 16S da SL1- PCR: 48 conjuntos de clones(primers específicos + oligonucleotídeo competitivo)- Clonagem - Seqüenciamento (ABI modelo 377)
Seleção de clones- SL1 testes para a detecção da atividade das seguintes enzimas: -lactamase, celulase, protease, queratinase, quitinase, lipase, esterase, amilase e Dnase
DH10B/pBeloBAC11 (controle -) e linhagens ou enzimas purificadas (controle +)
Materiais e Métodos Seleção de clones
- SL2 testes para a atividade hemolítica
OBS: Todos os clones com resultados positivos foram testados novamente
Seleção de atividade antibacteriana- colônias incubadas com B. subtilis BR151(pPL608)
Resultados SL1
- 3.648 clones arranjados em 38 placas de 96 poços- 100 Mb - 2% dos clones (n 8) foram analisados - 97% contém um inserto de DNA (27 kb)
SL2- 24.576 clones em 256 placas- 1000 Mb- 132 (0,5%) clones foram analisados- tamanho médio dos insertos: 44,5 kb (60% > 40 kb)
Considerando-se que em média um gene apresenta 1 kb pode-se dizer que a SL2 contém 1 milhão de genes
Resultados
Esses dados revelam que as melhorias feitas ao método original resultaram numa biblioteca com mais DNA metagenômico e com maiores insertos
Resultados Análise filogenética da SL1
Esses dados mostram que o método utilizado, pelos autores, para extração e clonagem de DNA recuperam o material genético de diversos procariotos, incluindo bactérias gram-positivas
Resultados Seleção da atividade biológica
- SL1 foram encontrados clones para: DNase (1)
lipase (2)
amilase (8)
atividade antibacteriana (1)
- Método que pode ser usado para extrair e identificar informações genéticas úteis de DNA de origem ambiental
- SL2 foram identificados 29 clones para a atividade hemolítica
1 a 8 clones com atividade amilásica, 9 e 10, lipásica
Resultados Caracterização do clone antibacteriano SL1-36C7
- Atividade inibitória para B. subtilis, fracamente inibitória para Staphylococcus aureus e sem atividade contra E. coli
- completamente seqüenciado
Discussão Os resultados mostram a possibilidade de clonar DNA
ambiental em bibliotecas BACs mantidas em E. coli, uma metodologia que é independente de métodos de cultivo e pode ser utilizada em larga escala
Esta técnica permite o estudo de propriedades filogenéticas, físicas e funcionais do metagenoma
Além da avaliação da diversidade no ambiente, esta metodologia possibilita a descoberta de novos grupos de organismos