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CLASIFICACIÓN MOLECULAR DE LAS ENFERMEDADES HUMANAS
Exógenas: infecciones, intoxicaciones, nutricionales....
Complejas o multifactoriales: en parte exógenas y en parte genéticas
Genéticas
Según el tipo de célula GerminalesSomáticas (cáncer)
Según el tipo de alteración
Génicas
Cromosómicas numéricasestructurales
Mutaciones puntualesInserciones y deleciones
Según el genoma y cromosoma afectados
nucleares autosómicasLigadas al sexo
mitocondrial
Archibald Garrod
Orina negra ocronosis
ALCAPTONURIA
Proyecto Genoma HumanoProyecto HapMap
Proyecto 1000 Genomes (next-generation sequencing)
1990-20042002-2008-
técnica de PCRMullis1985
técnicas de secuenciación del DNAMaxam y Gilbert/Sanger1977/1980
técnicas de DNA recombinantevarios1960-80
estructura de doble hélice del DNAWatson y Crick1953
bases moleculares de la anemia falciforme
Pauling e Ingram1949
Hipótesis "un gen-un enzima"Beadle y Tatum1945
estudios sobre la alcaptonuriaA. Garrod1902
Tipos de enfermedades genéticas. Patrones de herencia.
Cromosomopatías
Enfermedades monogénicas o de herencia mendeliana
autosómicas recesivas
autosómicas dominantes
ligadas al sexo.
Enfermedades complejas o multifactoriales
Enfermedades producidas por mutaciones inestables (expansión de tripletes)
Genes con impronta genética y disomías uniparentales
Enfermedades de DNA mitocondrial
Cáncer hereditario
CROMOSOMOPATIAS
Se definen como cambios que resultan en una alteración visiblede los cromosomas
Son muy frecuentes (1% de recién nacidos, principal causa deabortos espontáneos, recién nacidos muertos...)
Se producen por una mala reparación de cromosomas rotos o dañados opor fallos en la recombinación o en la segregación de los cromosomasdurante mitosis o meiosis
Se clasifican en :alteraciones numéricasalteraciones estructurales
Se identifican por observación de los cromosomas del paciente mediante distintas técnicas: bandeo cromosómico con distintos colorantes, FISH, CGH...
Preparación de los cromosomas y análisis
Obtención de muestra (eg: sangre)
Tratamiento de las células con mitógenos (eg: PHA) mínimo 3 días
Adición de colchicina para arrestar a las células en metafase
Fijar las células
Tratamiento con tripsina y Giemsa u otros colorantes
Caracterización de los cromosomas
Técnicas citogenéticasG bands (Giemsa)C bands (centrómero)Q bands (quinacrina, fluorescenteequivalente a G)R bands (patrón opuesto a G y Q)Bandeo de alta resolución (>400 bands)FISH (fluorescent in situ hybridization)
CROMOSOMOPATÍAS
• ALTERACIONES NUMÉRICAS
– POLIPLOIDIA (triploidia: 69XXX, XXY ó XYY) LETAL(Causa: dos espermatozoides o fallo en la 1ª división cigótica)
– ANEUPLOIDIA• AUTOSÓMICAS• CROMOSOMAS SEXUALES(Causas: edad avanzada, mala segregación en meiosis o mitosis)
Alteraciones numéricas autosomicas
Características generales:
Retraso mentalRetraso en el crecimientoAnomalías congénitas múltiplesViabilidad baja, alta letalidadAsociadas a abortos espontáneosdiagnóstico prenatal posible
Monosomía: letal
Trisomía:usualmente letal (dosis génica)Excepciones:
Trisomía 21 - Down Syndrome (1:1000)
Trisomía 13 - Patau Syndrome (1:20.000)
Trisomía 18 - Edward Syndrome (1: 8.000)
Alteraciones numéricas autosómicas
Alteraciones numéricas de loscromosomas sexuales
Características generales:Retraso en el crecimientoproblemas reproducciónviabilidad altaAsociadas a abortos espontáneosdiagnóstico prenatal posible
Ejemplos: Monosomía X: Síndrome de Turner (45, X)
Trisomía (47, XXY): S. de KlinefelterTrisomía (47, XYY)
QUANTITATIVE FLUORESCENT PCR (QF-PCR)
CUANTIFICACIÓN RELATIVA MICROSATÉLITES PARA DETERMINAR DOSIS GÉNICA
• amplificación microsatélites seleccionados con primers fluorescentes • separación por tamaños mediante electroforesis capilar • cuantificación relativa del área de los picos
APLICACIONES:Diagnóstico prenatal de aneuploidias más comunes en 24 h: trisomia 21 (Down), trisomia 13 (Patau), trisomia 18 (Edwards),S. Turner (X), S. Klinefelter (XXY)
QF-PCR chr. 18:detección de una trisomia
Chromosomopatías
Alteraciones estructuralesDeleciones e.g.46,XY, del(4) (p16.3)Translocaciones e.g.46,XX, t(2;6) (q35;p21.3)Inversiones e.g.46,XY, inv(11) (p11p15)Duplicaciones e.g.46,XX, dup(1) (q22q25)Cromosomas en anillo e.g.46,XY, r(7) (p22q36)Isocromosomas (se pierde 1 brazo, crom. Simétricos)
Causas: reparación defectuosa de roturas en el DNA, o fallosen la recombinación)
Efectos: variables, según punto de ruptura y pérdida o ganancia de material genético)
break break
21 2114 14
14 21 14/21
Translocación Robertsoniana(se fusionan dos cromosomas)
ENFERMEDADES GENÓMICAS (GENOMIC DISORDERS)
-Producidas por reordenamientos genómicos
-Se caracterizan por la presencia de duplicaciones segmentarias flanqueantes(>1kb, >90% identidad)que son sustrato de recombinación homóloga no alélica(NAHR) lo que origina deleciones, duplicaciones e inversiones
-Pueden dar lugar a enfermedades mendelianas, predisponer a enfermedades complejas o ser polimorfismos neutros (CNV)
-Patogénesis: dosis génicainterrupción génicafusión de genesefecto posicionalmanifestación de mutaciones recesivas (para deleciones)
SINDROMES DE MICRODELECIÓN
Cri du chat 5p14
Williams-Beuren 7q11.23 (elastina)
Prader-Willi/Angelman 15q11-q13
Rubinstein-Taybi 16p13.3
DiGeorge 22q11.21-q11.23
DUPLICACION
Charcot-Marie-Tooth 17p12 (mielina)
INVERSION
Hemofilia A Factor VIII
FISH:FLUORESCENCE IN SITU HYBRIDIZATION
mFISH: multiplex FISHOtra técnica: Spectral karyotyping (SKY)
COMPARATIVE GENOMIC HYBRIDIZATION (CGH)
ARRAY CGH
COMPARATIVE GENOMIC HYBRIDIZATION
region A
region A
region B
region B
HIBRIDACION
LIGACION
PCR
SONDAS
MULTIPLEX LIGATION PROBE AMPLIFICATION: MLPA
•Análisis y cuantificación por electroforesis capilar
•Cuantificación relativa a una muestra control
•Areas de los picos normalizadas con la suma de todas las areas de esamuestra
Fragment Analysis
Sample
Control
MLPAwww.mlpa.com
deletion
EJEMPLO:
DETECCION DE TRISOMIAS
Current applications of MLPA:
• Detection of aneuploidy of chromosomes 13, 18, 21, X and Y
• Detection of large chromosomal deletions or duplications: DiGeorgesyndrome, Williams syndrome, CMT1 / HNPP, Pelizaeus-Merzbacherdisease, Spinal Muscular Atrophy (SMA), subtelomeric regions etc
• Detection of gains and losses of genes in cancer tissues: Her2-neu (ERBB2), TP53, MYC etc.
• Detection of deletions / duplications of single exons: BRCA1 and 2, MSH2, MLH1, VHL, SHOX, MECP2, APC and NF2, PAH.
MLPAwww.mlpa.com
ENFERMEDADES MONOGÉNICAS
frecuencia estimada de 10:1000
Defecto en un único gen
Se clasifican según el patrón de herencia en :autosómicas recesivasautosómicas dominantesligadas al sexo
Enfermedad autosómica recesiva(el individuo heterocigoto o portador no se distingue del homocigoto normal)
Padres portadores con fenotipo normal75% probabilidad de hijos normales25% probabilidad de hijos afectados50% de probabilidad de hijos portadoresHombres y mujeres afectados en igualproporciónGeneralmente enzimasA veces asociadas con regionesgeográficas o grupos étnicosConsanguinidad entre los padres
Enfermedades AR en grupos étnicosy geográficos
fibrosis císticaTay-SachsAnemia falciformeThalasemias
CaucasianosJudíos Ashkenazi AfricanosMediterraneo
SIMBOLOS MAS COMUNES EMPLEADOS EN LOS PEDIGREES
VARÓN
HEMBRA
SEXO DESCONOCIDO
AFECTADOS (ENFERMOS)
NO AFECTADOS
PORTADORES (Enf. AR o XR)
Matrimonio consanguineo
Muerto
Pedigree ARPATRON HORIZONTAL
EJEMPLOS: ENF. AR
Autosómica Dominante (AD)(el individuo heterocigoto es enfermo)
Un progenitor afectado y el otronormal50% probabilidad de hijosnormales50% de probabilidad de hijosafectadosHombres y mujeres afectados en igual proporción
PenetranciaExpresividad o variabilidadfenotípica
Pedigree ADPATRON VERTICAL
EJEMPLOS: ENF. AD
Enfermedades AD: ejemplos
Marfan’s SyndromeOsteogenesis imperfectaNeurofibromatosisBraquidactilia
RetinoblastomaTuberous sclerosisMultiple polyposis of colon
ENFERMEDADES LIGADAS AL SEXO(AL CROMOSOMA X)
riesgo distinto según el sexo
Las mujeres pueden ser homocigotas o heterocigotas para el alelo mutantey pueden tener una expresión recesiva o dominante (aunque variable por la inactivación del cromosoma X)
Los hombres muestran el fenotipo completo
Ausencia de herencia de hombres a hijos varones
Todas las hijas de un hombre afectado heredan el alelo mutante
Hombres no afectados no transmiten al enfermedad
Enf. Ligada al X recesiva (XR)
Madre portadora normal
Padre normal
50% probabilidad de varones afectados
50% probabilidad de varones normales
100% probabilidad de niñas normales
50% portadora
50% homocigotas normales
Hombre y mujeres TIENEN DISTINTO RIESGO
Padre afectado y madre normal: 100% hijas portadoras
100% varones normales
Pedigree XRPATRON OBLICUO
EJEMPLOS: ENF. XR : Hemofilia, Lesh-Nyhan, def. piruvato DH…)
Enf. Ligada al X dominante (XD)
Padres afectados:100% probabilidad de hijas afectadas0% riesgo de varones afectados
Madres heterocigotas afectadas:50% probabilidad de varonesafectados50% probabilidad de hijas afectadas
EJEMPLOS: ENF. XD • Raquitismo resistente a Vitamina D• Albright’s hereditary osteodystrophy
FACTORES QUE PUEDEN COMPLICAR LOS PATRONES DE HERENCIA
• MUTACIONES NUEVAS
• MOSAICISMO DE LINEA GERMINAL
• RETRASO EN LA EDAD DE APARICION
• NO PENETRANCIA
• EXPRESIVIDAD VARIABLE
• PLEIOTROPIA DE EFECTOS
• HETEROGENEIDAD DE LOCUS
• NMD (nonsense mediated mRNA decay)
NMD : nonsense mediated mRNA decay
PTC:premature termination codonEJC:exon junction complex
Enfermedades complejas o multifactoriales:
-Causadas por >1 gen
-Influencia de factores ambientales
-Cada gen implicado puede tener un efecto pequeño
-No hay una herencia clara en familias
-Posibles interacciones entre los genes implicados (epistasis)
-Posibles interacciones ambiente-genes
-“medida” de la enfermedad (fenotipo) a veces dificil
Efecto acumulativo: los alelos de varios loci interaccionan de manera que el efecto de la combinación de alelos es la suma de los efectosindividuales.
epistasis: interaccion entre genes en la que un gen interfiere con al expresión del otro. En general, el efecto combinado de alelos en másde un locus es diferente de lo esperado segúnsus efectos
Evidencias de que hay un componente genéticoen una enfermedad compleja:
• estudios familiares• estudios de concordancia en gemelos• estudios en hijos adoptados
Enfermedad G.Monocigoticos G. DicigóticosConcordancia %
Cleft lip 35 5Type I diabetes 50 5Type II diabetes 100 10Multiple sclerosis 20 6Rheumatoid arthritis 50 8Tuberculosis 51 22Alcoholism 40 20Autism 60 7Schizophrenia 44 16
Estudios en gemelos:
% de hijos adoptadosPadres biológicos muestra (n) alcohólicos
Padre alcohólico 89 39,4Madre alcohólica 42 28,6
Padre no-alcohólico 723 13,6Madre no alcohólica 1029 15,5
34,0%
14,6%
Bonham 1978
Estudios en hijos adoptados:
Riesgo relativo: el cociente entre la frecuencia de una enfermedad compleja para un familiar de unapersona afectada y la frecuencia de la poblacióngeneral
λr = frecuencia de los familiares del enfermofrecuencia en la población
r = el grado de parentesco
(λr =5-10% para familia directa)
Es un riesgo empírico
Enfermedad RIESGO (según grado de parentesco)Población 1º 2º 3º
Cleft lip/palate 1/1000 35x 7x 3xCongenital dislocation/hip 1/1000 40x 4x 1.5xPyloric stenosis 1/1000 20x 5x 2xClubfoot 1/1000 20x 5x 2xAnencephaly/spina bifida 1/500 8x 2x
Riesgo relativo en familiares. Ejemplos:
Enfermedades producidas por expansión de tripletes(mutaciones inestables)
• Descubierto en 1991• Causadas por expansión de trinucleótidos por encima de un
número• Por encima de ese numero los tripletes son inestables y se
expanden (aumenta el nº de copias o repeticiones)• No se transmite el mismo nº de repeticiones a los hijos sino un
nº mayor (mutaciones dinámicas)• El nº de repeticiones está relacionado con la severidad y edad
de aparición de los síntomas: anticipación
La edad de aparición de la enfermedad es menor y la severidad de la enfermedad peor en generaciones sucesivas, lo que se correlacionacon el aumento del nº de tripletes
ANTICIPACION
Nº repeticiones
Eda
d ap
aric
ión
sínt
omas severidad
Gatchel JR, Zoghbi HY (2005) Nature Reviews Genetics 6: 743-754.
Disomía uniparental
ambos cromosomas homólogos provienen del mismo progenitor
Usualmente el origen está en una recuperación o compensación de una trisomía que sería letal
Disomia uniparental
modificaciones del material genético(silenciamiento génico) que ocurren dependiendo de si el alelo proviene del padre o de la madre
Resultan en una expresión diferencial según sea la copia materna o paterna
identificados en mamiferos y plantas superiores
Mutaciones en los genes con impronta genetica danun patron inusual de herencia
Puede deberse a presión evolutiva en genes implicados en crecimiento y desarrollo????
IMPRONTA GENETICA
deleción 15q11-13 :PWS resulta de unadeleción en el cromosomapaterno
AS resulta de una deleciónen el cromosoma materno
CAUSAS DE LA ENFERMEDADES DE PW Y S. ANGELMAN
•Pérdida de función de genes en el cromosoma 15 que sólo se expresan del cromosoma paterno (PW) o materno (Angelman)•La pérdida de función puede deberse a deleciones, disomias uniparentales, mutaciones o errores en la impronta.
CAUSAS DE LA ENFERMEDADES DE PW Y S. ANGELMAN
disomia uniparental :
PWS resulta de dos crom. 15 maternos
AS resulta de dos crom. 15 paternos
El genoma mitocondrial no es autónomo
OTRAS PROTEÍNAS NUCLEARES: LAS IMPLICADAS EN REPLICACIÓN, TRANSCRIPCION Y TRADUCCIÓN
mtDNA
DNA nuclear
- En el la matriz mitocondrial
- cada mitocondria puede contener 2-10 copias de mtDNA
- Hay miles de copias de mtDNA por célula
Genoma mitocondrial
37 genes:
22 tRNAs2 mt rRNA
13 mRNAs
Enfermedades del DNA mitocondrial
Herencia maternaHeteroplasmia = diferente % de mitocondrias normales y mutantes en cada célulao tejido. Las células reciben diferentes poblaciones de mitocondrias normales y mutantes
~ 1/15000 adultos
•Los síntomas se manifiestan sobre todo a nivel de tejidos muydependientes de energía en forma de ATP - cerebro, corazón, músculo, oído…
•Muy variables genética y clínicamente (el mismo síndrome pudedeberse a diferentes mutaciones o el mismo defecto genéticotener una presentación clínica diferente)
•el fenotipo dependerá de:gen(es) implicadostipo de mutación (missense/nonsense/deleción)% mitocondrias normales vs anormalestejido implicado
CaracterCaracteríísticassticas de de laslas enfermedadesenfermedades mitocondrialesmitocondriales
SOLO 20% DE LOS PACIENTES DEFICIENTES EN OXPHOS TIENEN MUTACIONES EN mtDNA
El resto de pacientes tienen defectos en genes nucleares:
Defectos en genes estructurales de los complejos
Defectos en la comunicación entre genomas nuclear y mt
Defectos en ensamblaje, homeostasis o importe de las proteínas de loscomplejos
The genetics and pathology of oxidative phosphorylation. Smeitink et al (2001) Nat Rev Genet 2: 342-352
Mitochondrial disease-its impact, etiology and pathology. McFarland et al (2007) Curr Topics in Dev Biol77: 113-143.