Microbiologa General

Aislamiento e identificacin de

Microorganismos

Para qu aislar microorganismos?

Para qu identificar un microorganismo ?

Caracterizacin vs. Identificacin

1. Pruebas bioqumicas Identificacin presuntiva

2. Pruebas Moleculares Identificacin final

Aislamiento e identificacin de microorganismos

Procedencia Caractersticas Expectativas

Mtodos convencionales Mtodos moleculares

Tratamiento inicial

Siembra Aislamiento Identificacin

Tratamiento inicial

Siembra

Enriquecimiento (selectivo o no)

Calentamiento Filtracin Homogeneizacin, etc

Seleccin de medios de cultivo Inculo Observacin microscpica

Agotamiento por estras, diluciones seriadas, etc

Subcultivo

Aislamiento

Criterios de pureza

Cultivo puro

Identificacin

Macroscpicos

Microscpicos

Muestras

Microorganismos indicadores

Coliformes P. aeruginosa

Deteccin de B. cereus en leche en polvo,miel, arroz

Deteccin de S. aureus en alimentos procesados y leche cruda

Aislamiento de Lactobacillus spp de productos fermentados

Agua

Alimentos

Aislamiento de Bacillus cereus de muestras de alimento o suelo

Seleccin de esporas

Calentamiento

Enriquecimiento

Agotamiento por estras Mossel

Colonias aisladas (Man (-), Lecitinasa (+))

Repique

Tinciones

Cultivo puro

Morfologa de las colonias

Forma y tamao de las colonias: Irregular, puntiforme

Bordes: liso, rugoso.

Elevacin: Convexo, elevado, umbonado, liso.

Color: pigmento, opaca, translucida, brillante.

Textura: Mojada, mucosa, seca.

Bacillus subtilis

Forma de la colonia y tamao: irregular

Bordes: ondulado

Elevacin: umbonada

Color: Blanca crema

Textura : seca

Proteus vulgaris

Tpico aspecto sobre la caja de petri

Klebsiella pneumoniae

Pruebas bioqumicas

para la identificacin de

Bacterias

Exoenzimas y Endoezimas

I M Vi C*

Indol

Rojo de Metilo

Vohes Proskauer

Citrato

Identificacin de bacilos entricos

Bacilos cortos, Gram negativos, no formadores de esporas y fermentadores de

glucosa.

Miembros

Patgenos: Salmonella y Shigella

Patgenos ocasionales: Proteus y Klebsiella

Flora normal: Escherichia y Enterobacter

Test de produccin de Indol

Determina la capacidad de un microorganismo de degradar triptfano

Triptofanasa

Triptofano Indol + Acido Piruvico + amoniaco

Butanol

Indol + p-dimetilaminobenzaldehido Halo rojizo en la superficie del tubo

HCl

Reactivo Kovac

positivo negativo

E.coli

Accin de la triptofanasa

El triptofano se adiciona al medio en una

Concentracin 1%. Es una peptona derivada de

la casena. Se adicionan 10 a 12 gotas del reacc. de KOVACS.

Rojo de Metilo

Para identificar bacterias que metabolizan glucosa con produccin de altas concentraciones de cidos.

Sirve para diferenciar E.coli de Enterobacter

El medio tiene glucosa al 10% y Rojo Fenol

E. coli : estabiliza el pH bajo producto de la acidificacin del medio

Enterobacter: Convierte los cidos en productos finales neutros como 2,3 butanediol y acetoina lo que

resulta en una elevacin del pH en in valor de 6.

Positive positive negative control.

pH 4 vira al rojo (test positivo)

pH 6 sigue indicando presencia de

acido pero a una concentracin

insuficiente para producir el viraje

Left: uninoculated control

Right: negative (copper color)

Left: uninoculated control

Right: positive (red color) Left is Barritt's A (alpha-napthol) and right is

Barritt's B (KOH--potassium hydroxide).

Voges-Proskauer (VP)

Para identificar microorganismos capaces de producir acetoina y 2,3butanediol como

resultado de la degradacin de glucosa. Positivo para Enterobacter aerogenes

Barritt's A (alpha-napthol) y Barritt's B (potassium hydroxide) se adicionan al cultivo

y se agita ligeramente. Rojo positivo

Glucosa + O2 piruvato a-acetolactato acetoina 2,3 butanodiol

40% KOH

Acetoina + a-naftol Complejo rosado (creatina + diactetilo)

Etanol Absoluto

Para determinar la capacidad de un m.o. de utilizar la enzima citrato permeasa para usar

como fuente de carbono el citrato nicamente.

Simmon's citrate agar: Es un medio definido que contiene citrato de sodio como fuente carbonada.

Si el citrato se utiliza se producen compuestos que alcalinizan el medio. El indicador de pH , azul

de bromotimol, cambia de verde a pH neutro (6.9) a azul a pH mayores que 7.6.

Citrato

Enterobacter cloacae: positive

Escherichia coli: negative

Klebsiella pneumoniae: positive

Citrato permeasa

Glucosa + O2 Ac. piruvico + Ac. Oxalacetico + CO2

Exceso de Sodio + CO2 + H2O Na2CO3

(producto alcalino que eleva pH

vira de verde a azul)

Catalasa* Para determinar microorganismos que producen la enzima catalasa. Micrococcaceae

como Staphylococcus catalasa positivos, Streptococcaceae, Streptococcus

Enterococcus catalasa negativo.

H2O2 es producido por bacterias aerobias o facultativas mediante reacciones no

enzimticas de reduccin de flavoprotenas o por accin enzimtica de radicales

superxido. H2O2 puede daar las bacterias, la enzima catalasa presente en algunas bacterias lo transforma en agua y oxgeno.

Se adiciona perxido de hidrogeno sobre una gota o ansada de cultivo sobre un porta

objeto. Un burbujeo indica la presencia de la enzima.

2H2O2 2H2O+ O2 Catalasa

Oxidasa*

Para identificar bacterias que contengan la enzima citocromo oxidasa (respiracin).

Oxidase negativa Enterobacteriacae y Pseudomonadaceae, Neisseria oxidasa positiva.

La enzima citocromo oxidasa cataliza el transporte de electrones de un donor hacia el

aceptor final de la respiracin (oxgeno). En este test un donor de electrones artificial

(phenylenediamine) se usa para Reducir la citocromo Oxidasa.

Si la enzima esta presente se observar una coloracin purpura.

El test se debe leer a los 15 segundos pues el reactivo puede cambiar de color con el paso

del tiempo.

oxidasa (+)

Pseudomonas

oxidasa (-)

E. coli

Neisseria

Reduccin de nitrato*

Muestra la capacidad de un m.o. de reducir nitrato (NO3) a nitrito (NO2), nitrgeno

molecular (N2) o amoniaco, usando la enzima nitrato reductasa.

Nitrato (NO3) puede ser reducido por diferentes compuestos incluso por respiracin

anaerobia o por denitrificacin. El medio de cultivo contiene nitrato de potasio como

sustrato.

Determinacin de Nitrito NO2-: Reactivo GRIESS-ILOSVAY

1. Solucin A: acido sulfanico

2. Solucin B: a-naftilamina

Determinacin de Amonio (NH4+): Reactivo de NESSLER

REACCION POSITIVA: aparicin instantnea de una coloracin rojo cereza

Que no se produzca color puede indicar dos cosas: (1) el nitrito no se redujo (2) se redujo

a otros compuestos. Para distinguir esta situacin se adiciona Zinc. Si hay nitrato en el

medio se va a reducir a nitrito y el medio se tornar rojo mostrando una reaccin negativa.

Si al adicionar Zn no sucede nada, se redujo a otros compuestos.

Pseudomonas aeruginosa: no hay cambio de

color, negativo

Escherichia coli: cambio de color a rojo, positivo

Corynebacterium xerosis: no hay cambio de color,

negativo

Test del nitrato

Reagent A: Sulfanilic Acid

Reagent B: alpha-naphthylamine

Triple Sugar Iron Agar (TSI)*

Enterobacterias y otros bacilos intestinales Gram negativos

Para diferenciar bacterias basado en su habilidad para fermentar glucosa, lactosa y/o

sucrosa.

TSI contiene tiosulfato de hierro, sustrato para la produccin de sulfuro de hidrogeno y

sulfato ferroso.

Rojo fenol. Fermentacin de carbohidratos vira de rojo a naranja a amarillo en presencia

de cidos.

Se siembra en profundidad con una aguja y luego se estra el pico de flauta.

Azcar Productos cidos pH (Amarillo)

Peptonas Amoniaco (NH3) pH (Rojo)

Fermentacin (medio cido) + Tiosulfato de Sodio SH2 (gas)

SH2 + iones frricos Sulfuro ferroso (precipitado negro insoluble)

Agar inclinado alcalino (rojo) y superficie

recta acida (amarilla) con o sin produccin

de gas (ruptura o no del agar)

Agar inclinado alcalino (rojo) y superficie

recta alcalina (rojo) o sin cambios

Agar inclinado acido (amarillo) y

superficie recta acida (amarilla) con y sin

produccin de gas (ruptura o no del agar)

nicamente

fermenta glucosa

No ocurre

fermentacin de

carbohidratos

Puede ocurrir

fermentacin de

lactosa o sacarosa

o ambos

Test de la Descarboxilasa

Muestra la capacidad de un m.o. para descarboxilar un aminocido.

En esta reaccin se remueve el grupo carboxilo (COOH) de un aminocido produciendo

amina y dixido de carbono.

El indicador de pH (purpura de bromocresol) es adicionado con unas gotas de aceite

mineral que crean un ambiente de anaerobiosis para promover la fermentacin.

Se necesita un ambiente cido porque la enzima solo funciona en estas condiciones. pH

alcalino el indicador cambia a purpura (positivo).

Prueba de fenilalanina-desaminasa

Para identificar accin de la enzima phenilalanina-deaminasa. Usado para distinguir

Morganella, Providencia, y Proteus (phenilalanina-deaminasa positiva) gneros de otros

miembros de Enterobacteriaceae (phenylalanine deaminase negativa).

El medio contiene el aminocido fenilalanina. La enzima remueve el grupo (NH2) y

libera amonio (NH3). Se obtiene acidofenilpiruvico, que puede ser detectado por la

adicin de un agente oxidante (Cloruro Ferrico al 10%).

Un cambio de color al verde indica una reaccin positiva.

Negativo Positivo

Prueba de ureasa Determinar la capacidad de un microorganismo de desdoblar la urea, formando dos

molculas de amoniaco por accin de la enzima ureasa

Indicador de pH: rojo fenol. Presencia de amoniaco aumenta el pH y vira a rosa oscuro

Urea + 2 H2O CO2 + H2O + 2 NH3 (NH4) CO3

1. No inoculado

2. Proteus vulgaris: Positivo

3. Escherichia coli: Negativo

Prueba de hidrlisis de caseina

Determinar la capacidad de producir enzimas proteilicas capaces de hidrolizarla casena

Agar leche. Contiene caseina la cual le da el color blanco. Algunas bacterias secretan

caseasa, la cual rompe la molcula de casena en pequeos polipentidos los cuales

atraviesan la membrana celular. Esta reaccion de hidrlisis, aclara el area alrededor de la

colonia.

Bacillus subtilis es positivo para la enzima

caseasa.

Prueba de licuefaccin de Gelatina*

Determinar la capacidad de un organismo de producir enzimas de tipo preoteltico

(gelatinasas) que licuan gelatina

Protena + H2O Polipptidos

Polipptidos + H2O Aminocidos individuales

Escherichia coli: negativa (gelatina como solido)

Pseudomonas aeruginosa: positiva (gelatina degradada)

Prueba de hidrlisis de Almidn

Determinar la capacidad de un microorganismo de hidrolizar el almidn mediante

enzimas del tipo amilasas

-amilasa

Almidn dextrinas + maltosa + glucosa

H2O polisacridos disacrido monosacrido

El almidn en presencia de Iodo imparte coloracin azul indicando ausencia de amilasa

(Resultado Negativo)

Si el almidon fue hidrolizado, se vera una zona clara alrededor de las colonias (Resultado

Positivo)

lugol

Fermentacin de carbohidratos (rojo fenol) Se adiciona un azcar al medio: Lactosa, sacarosa o glucosa

Propsito: Se usa para determinar fermentacin de ciertos azcares y produccin de gases.

Se usa para identificar bacterias entricas Gram negativas.

Durante el proceso de fermentacin el aceptor final de electrones es una molcula orgnica.

Un tubo (Durham) es colocado dentro del medio invertido con el propsito de capturar gases

liberados durante la fermentacin.

El indicador cambia al amarillo por debajo de pH 6.8 y cambia al rojo por encima de pH

7.4.

Si el microorganismo no fermenta el carbohidrato pero usa la peptona se va a acumular

amonio, esto elevara el pH.

1- Control sin inocular

2- Amarillo: Utilizacin del azcar, produccin de cido sin gas.

3- Amarillo y produccin de gas.

4- Fermentacin negativa. Oscurecimiento del medio

de cultivo producto de utilizacin de peptonas y liberacin

de amonio.

5- Negativo

orgamismos

1. Control Negative

2. S. aureus Acid

3. P. vulgaris Acid, Gas

4. P. aeruginosa Negative

5. E. coli Acid, Gas

resultados

Fermentacin de glucosa

Identificacin y Caracterizacin

Catalasa Fermentacin de azcares Hemlisis Deteccin de genes de virulencia (toxinas-PCR hblA, B, C, D.)

Aislamiento de Bacillus cereus de muestras de alimento o suelo

Seleccin de esporas

Calentamiento

Enriquecimiento

Agotamiento por estras Mossel

Colonias aisladas (Man (-), Lecitinasa (+))

Repique

Tinciones

Cultivo puro