CITOMETRCITOMETRÍÍA DE FLUJOA DE FLUJOAPLICACIONES EN APLICACIONES EN

LEUCEMIASLEUCEMIAS

BIOQ. GONZALO OJEDABIOQ. GONZALO OJEDAHEMATOLOGHEMATOLOGÍÍA CLA CLÍÍNICANICA

FaCENAFaCENA –– UNNEUNNE20122012

QUE ES LA CITOMETRIA DE QUE ES LA CITOMETRIA DE FLUJO?FLUJO?

La CitometrLa Citometríía de Flujo es a de Flujo es una tecnologuna tecnologíía que permite a que permite la la medicimedicióónn simultsimultáánea de nea de mmúúltiples caracterltiples caracteríísticas sticas

ffíísicas y qusicas y quíímicas de micas de ccéélulaslulasen suspensien suspensióónn

QUE INFORMACIQUE INFORMACIÓÓN ENTREGA UN N ENTREGA UN CITCITÓÓMETRO DE FLUJO SOBRE UNA METRO DE FLUJO SOBRE UNA

CCÉÉLULA?LULA?

1. Su tama1. Su tamañño.o.2. Su granularidad o complejidad 2. Su granularidad o complejidad interna.interna.

3. Evaluaci3. Evaluacióón de caractern de caracteríísticas sticas ququíímicasmicas

--FluorocromoFluorocromo--Anticuerpos conjugados con Anticuerpos conjugados con

fluorocromosfluorocromos

COMPONENTESCOMPONENTES

•• Sistema de FluidosSistema de Fluidos•• Sistema Sistema ÓÓptico:ptico: Fuente de luz Fuente de luz --SeparaciSeparacióón espectraln espectral

•• Sistema ElectrSistema Electróónico:nico: Control mecControl mecáánico, nico, de luz y detectoresde luz y detectores -- ColecciColeccióón y n y ananáálisis de pulsoslisis de pulsos

•• Sistema InformSistema Informáático:tico: AnAnáálisis y lisis y presentacipresentacióón de datosn de datos

NANOPARTICULAS METABOLITOS

FluorescenciaFluorescencia Proceso por el que una molProceso por el que una moléécula absorbe luz, aumenta su cula absorbe luz, aumenta su

energenergíía y vuelve al estado basal emitiendo un fota y vuelve al estado basal emitiendo un fotóón.n. Parte de la energParte de la energíía se pierde en las transiciones entre los a se pierde en las transiciones entre los

distintos estados por tanto el fotdistintos estados por tanto el fotóón emitido tiene menos n emitido tiene menos energenergíía (mayor longitud de onda) que el que fue absorbido.a (mayor longitud de onda) que el que fue absorbido.

t (t (ss))

EE

11<<22

11

22

FluorescenciaFluorescencia

FSCFSC

FLFL--11

FLFL--22

DETECCIDETECCIÓÓN DE N DE FLUORESCENCIAFLUORESCENCIATC

PerCPQR

Cy5APC

FL-1 FL-2 FL-3 FL-4DetectoresDetectores

FluorocromosFluorocromos

CompensaciCompensacióón de sen de seññalesales Fundamento Fundamento

SuperposiciSuperposicióón de n de espectros de emisiespectros de emisióón. n. Parte de la seParte de la seññal de al de emitida por un emitida por un fluorocromofluorocromo es lees leíída da por el detector de otro por el detector de otro colorcolor

Concepto Concepto sustraccisustraccióón n de una parte de la sede una parte de la seññal al medida en un color a la medida en un color a la seseññal medida en otro al medida en otro colorcolor

FLFL--22 -- %FL1%FL1

excitaciexcitacióónn

medidamedida

Inte

nsid

ad d

e flu

ores

cenc

iaIn

tens

idad

de

fluor

esce

ncia

FLFL--11 FLFL--22

DIGITALIZACION Y ALMACENAMIENTO DIGITALIZACION Y ALMACENAMIENTO DE INFORMACIDE INFORMACIÓÓNN

NN

1122334455667788......

1000010000

FSCFSC

2222334433442222......

SSCSSC

1111222211223388......

FLFL--11

1111334411112211......

FLFL--22

1122331122331122......

FLFL--33

1133334411113344......

FLFL--44

2222333355551122......

TIEMPOTIEMPO

1111111122222222......

Los Los pulsospulsos dede““VoltajeVoltaje””(se(seññalesales analanalóógicasgicas) son ) son transformadastransformadas en en seseññalesalesdigitalesdigitalesLas seLas seññales digitales ales digitales almacenanalmacenan en un soporte informen un soporte informáático en modo tico en modo

listado (almacenamiento listado (almacenamiento multiparammultiparaméétricotrico).).

PROCESO DE INFORMACION

HistogramasHistogramasDiagramasDiagramas biparambiparaméétricostricos

PROCEDIMIENTO STDPROCEDIMIENTO STD••100 100 µµLL de sangre total de sangre total ••10 10 µµLL del del AcAc. conjugado . conjugado ••IncubarIncubar por 10por 10--15 minutos RT 15 minutos RT ••AAññadiradir el el lisadorlisador••LeerLeer en un en un citcitóómetrodemetrode flujoflujo

CITOMETRIA DE FLUJO CITOMETRIA DE FLUJO

PREPARACION DE LA MUESTRAPREPARACION DE LA MUESTRA

Proceso de la informaciProceso de la informacióón n generadagenerada

1.1. RepresentaciRepresentacióón de la informacin de la informacióónn

2.2. SelecciSeleccióón de la informacin de la informacióónn

3.3. ReducciReduccióón de la informacin de la informacióónn

4.4. De la cDe la céélula a la poblacilula a la poblacióón celularn celular

RepresentaciRepresentacióón n monoparammonoparaméétricatrica de datos. de datos. Histogramas. Se representa en cada valor de x Histogramas. Se representa en cada valor de x

(intensidad de fluorescencia) el n(intensidad de fluorescencia) el núúmero de cmero de céélulas lulas que emiten esa intensidadque emiten esa intensidad..

M1

RepresentaciRepresentacióón n biparambiparaméétricatrica en 2Den 2DDiagrama de puntos / dot plot

+

+--

RepresentaciRepresentacióón n simultsimultáánea de dos nea de dos parparáámetros metros XX e e Y Y para un para un conjunto de cconjunto de céélulas.lulas.

XX representa el valor de la representa el valor de la seseññal de un paral de un paráámetrometro. .

YY representa el valor de la representa el valor de la seseññal del otro.al del otro.

++-

-FLFL--11

FLFL-- 22

Diagrama de dot plot density

Usa colores para Usa colores para representarrepresentardensidaddensidad