CITOGENETIČKA DIJAGNOSTIKA.pdf

7/24/2019 CITOGENETIKA DIJAGNOSTIKA.pdf

1/61

MEDICINSKA

CITOGENETIKA


2/61

MEDICINSKA / KLINIKA CITOGENETIKA-Etiologija, incidencija i dijagnoza hromosomskih poremeaja

-Detekcija abnormalnosti hromosoma u osoba s klinikimkarakteristikama genetikog oboljenja

-Reproduktivne posljedice balansiranih preraspodjelahromosoma.

-Citogenetike znaajke, klinike manifestacije i prognozaestih strukturnih i numerikih anomalija hromosma.

-Klinika vanost citogenetikih nalaza u onkologiji.

Genetika informacija


3/61

GENETIKA DIJAGNOSTIKA

NOVO ORUJE U BORBI ZAZDRAVLJE

Zahvaljujui genetikoj

dijagnostici

moemo

biti

ISPRED

bolesti

tj. PREDUHITRITI bolestipravovremenim mjerama SPRIJEITI da

seona

razvije


4/61

GENETIKA DIJAGNOSTIKA:

-

CITOGENETIKA (na hromosomskom) nivou

-

MOLEKULARNA (na nivou gena)

-PREVENTIVNA

-PRENATALNA-POSTNATALNA


5/61

CITOGENETIKA DIJAGNOSTIKA

analiza kariotipa-konstitucijskog:

- prenatalno

-

postnatalno- steenog:

-citogenetika tumora-

genotoksinih efekata


6/61

OBAVEZNO

GENETI

KA INFORMACIJAprije i poslije analize


7/61

CITOGENETIKA

DIJAGNOSTIKA

BIOLOKI MATERIJAL UZORCI:

Najee:

krv

kotana sr

fibroblasti

plodna voda

horionske upice


8/61

PRENATALNA CITOGENETIKA

DIJAGNOSTIKA


9/61

INDIKACIJE ZA PRENATALNUCITOGENETIKU DIJAGNOSTIKU:

1.

Starost majke > 35 godina

2. Hromosomopatije u porodici

3. Aberacije hromosoma kod prethodnoroenog djeteta ili kod roditelja

5. Spontani pobaaji

6. Abnormalnosti otkrivene ultrazvukom7.Pozitivan rezultat kombiniranog probira

8. Druge indikacije


10/61

Citogenetika analiza kariotipa odraslihINDIKACIJE:-

Porodina anamneza-

Neplodnost

-

Primarna i sek. amenoreja-

Abnormalnosti spermatogeneze-

Spontani pobaaji

-

Dijete abnormalnog kariotipa-

Mentalna retardacija (Fragilno X sindrom)

-

Abnormalnosti fenotipa-

Bolest nedefinisane etiologije-

.......


11/61

METODE KLASINE

CITOGENETIKE

(ABERACIJE VELIINE 4-5Mb)

METODE MOLEKULARNE

(CITO)GENETIKE

(osjetljivost 0,5 Mb)

CITOGENETIKA ANALIZA


12/61

Prenatalna citog. dijagnostikabioloki materijal

horionske resice

amnionska tekuina (plodna voda)

fetalna krv

biopsija horionskih resica 9-12 sedmici

amniocenteza 15-19 sedm.

kordocenteza 18-20 sedm.

metode uzorkovanja


13/61

Uzorkovanje fetalnogmaterijala

0,5

1% rizik

pobaaj

OPREZ


14/61

AMNIOCENTEZA


15/61


16/61

PLACENTOCENTEZA

uzorak-

horionske resice


17/61

KORDOCENTEZA

-

Krv iz pupane vene

Kardiocenteza -uzimanje krvi izlijeve komore srca fetusa(samo u izuzetnim sluajevima)


18/61

DIJAGNOSTIKA NASLJEDNIH BOLESTI NA RAZINIHROMOSOMA

KARIOTIPIZACIJA

KARIOTIP OVJEKA46 kromosoma

22 para autosoma1 par gonosoma

ene XX, mukarci XY


19/61

METODE KARIOTIPIZACIJE

DIREKTNA METODA:Stanice se direktno (bez kultivacije)

kariotipiziraju-HORION FRONDOZUM (horionske resice)


20/61

INDIREKTNA METODA:

potrebna je kultivacija stanica

-KRATKOTRAJNA STANINAKULTURA 24-48 sati (krv)

-DUGOTRAJNA STANINA

KULTURA 7-14 dana(STANICE PLODOVE VODE,

STANICE KOE)


21/61

KRATKOTRAJNA STANINA KULTURA

1. UZIMANJE KRVI (KRV + HEPARIN)2. DODAVANJE FITOHEMAGLUTININA I KULTIVIRANJE (48h /37C)3. PREKIDANJE KULTIVACIJE CITOSTATIKOM KOLHICINOM

4. OBRADA KULTUREi pravljenje preparata

5. BOJANJE

-6. ANALIZA


22/61

METODE KLASINE

CITOGENETIKE

(ABERACIJE VELIINE 4-5Mb)

METODE MOLEKULARNE

(CITO)GENETIKE

(osjetljivost 0,5 Mb)



23/61

METODE KLASINECITOGENETIKE


24/61

-

METODE OPRUGAVANJA(BENDIRANJA) KROMOSOMA

-GTG metoda-RBG metoda

-CBG -etoda-QFQ metoda

-NOR metoda

METODE BOJENJA HROMOSOMA:

-RUTINSKO ( gimza bojom)


25/61

METAFAZNA

CITOGENETIKA

Haploidni genom = 2 000 prugaVizualizacija oko 800 pruga

Jedna pruga = 50 gena


26/61

GBG metoda (G pruge)1. 30s u tripsinu (proteolitiki enzim)

2. Bojenje u 20% Giemsa bojitamne G-pruge su bogate A-T


27/61


28/61

CBG metoda (C pruge)selekivno boji konstitutivni heterohromatin u

pericentromerinim regijamacentromerna regija krom.1, 9, 16 i distalni dio q-

kraka hrom. Y


29/61

QFQ metoda (Q pruge)

QUINACRINE (fluorescentna boja),A-T bogata podruja (G-pruge)


30/61

NOR metoda (NOR pruge)

AgNO3 se vee na satelite akrocentrinih hromosoma,

regije nukleolarnih organizatora (NOR) (13,14,15, 21, 22)


31/61

METODE MOLEKULARNECITOGENETIKE


32/61

FLUORESCENTNA IN SITU HIBRIDIZACIJA


33/61

FLUORESCENTNA IN SITU HIBRIDIZACIJA(engl. Fluorescence in situ Hybridization)

In situ hibridizacija (ISH) objedinjuje citogenetike imolekularno genetike tehnike

princip:interakcija fluorohromom obiljeene DNK iliRNK probe (sonde) s komplementarnom

jednolananom (ciljnom) DNK sekvencom

ciljna DNK : u metafaznim hromosomima ili

interfaznoj jezgri

svrha:identifikacija numerikih i strukturnihaberacija hromosoma


34/61

IN SITU HIBRIDIZACIJA


35/61

IN SITU HIBRIDIZACIJAFLUORESCENTNA IN SITU HIBRIDIZACIJA(FISH)

Fluorescentni signal

Ciljna DNK

denaturacija

hibridizacija


36/61

FLUORESCENTNA IN SITUHIBRIDIZACIJA -

PRINCIP


37/61


38/61

Ciljna DNK za FISH

Metafazni hromosom

Metafazni-

FISH

Interfazna DNK

Interfazni

i FISH

Sonde (probe) za FISH


39/61

Sonde (probe) za FISHFISH SONDE ZA CIJELI

HROMOSOM(engl. whole chromosome paintprobes -

WCP)

SONDE ZA p

i q KRAK(partial chromosome paint- PCP)

CENTROMERNE probe(engl. centromere specificprobes)

SONDE ZA MALA PODRUJA

EUHROMATINA (lokusspecifine probe)(engl. Single copy ili uniquesequence probes)

TELOMERNE probe


40/61


41/61

TELOMERNI FISH


42/61

Telomerna proba za 19q

Sonde specifine za odreene regije


43/61

Mikrodelecija 22q11.2

p g jhromosoma

VIEBOJNA KARIOTIPIZACIJA


44/61


SPEKTRALNA

-

SKY, multiplex

M-FISH


45/61


46/61


istovremena vizualizacija svih metafaznihhromosoma u razliitim bojama

temelji se na simultanoj hibridizaciji 24hromosom specifinih proba obiljeenim

razliitim fluorohromima ili kombinacijamafluorohroma

omoguava identifikaciju:marker hromosoma,jednostavnih i sloenih hrom. preureenja

(translokacija)


47/61

Translokacija 19q;21p

P i j d k i j k k ij kl k


48/61

Primjer dokazivanja kromosomskog porijekla markerhromosoma viebojnom FISH metodom

VIEBOJNO MULTIKOLOR OPRUGAVANJE HROMOSOMA


49/61

VIEBOJNO-MULTIKOLOR OPRUGAVANJE HROMOSOMA(engl. Multicolor chromosome banding MCB)


50/61


51/61

-INTERFAZNE JEZGRE

-SAMO TRAENA PROMJENA-OSTATAK GENOMA NEPOZNAT

INTERFAZNI F I S H

Efikasan u detekciji aneuploidija

INTERFAZNI FISH


52/61

INTERFAZNI FISHProbe za hromosome 13, 18, 21, X i Y13zeleno; 21crveno; 18plavo; Xzeleno Y-crveno

13zeleno 21crveno 18plavo Xzeleno Y-crveno

Trisomija 21

COMPARATIVE GENOMIC HYBRIDIZATION (CGH)


53/61


REZOLUCIJA 5 10Mb


54/61

REZOLUCIJA 5-10MbCGH VISOKE REZOLUCIJE (HIGHRESOLUTION) HR-CGH pribl. 3Mb

POTREBNO:-metafazni preparat normalne muke osobe-testna DNK izolirana iz ispitivanog tkiva-referentna DNK normalne osobe-reagensi i oprema za FISH

-analysis system i software



55/61

( )

CGH je FISH tehnika koja omoguava detekciju promjena (gubitak ili

adicija) unutar itavog genoma

SKRINING CIJELOGA GENOMA(ISTOVREMENA HIBRIDIZACIJA NA SVIM METAFAZNIMHROMOSOMIMA)-ZASNIVA SE NA KOHIBRIDIZACIJI ISPITNE I KONTROLNE DNK (KOJESU OBILJEENE RAZLIITIM FLUOROSCENTNIM BOJAMA) ZANORMALNU METAFAZU.-DINAMIKA HIBRIDIZACIJE OVISI O KVANTITATIVNIM RAZLIKAMAIZMEU DVA UZORKA-SEGMENTI GENOMA KOJI SU U ISPITNOJ DNK PRISUTNI U VEEMBROJU KOPIJA U ODNOSU NA NORMALU, INTENZIVNIJE E SEHIBRIDIZIRATI ZA ODGOVARAJUU REGIJU METAFAZNOGHROMOSOMA U ODNOSU NA KONTRONLNU DNK I OBRNUTO.-NORMALNA METAFAZA SLUI ZA IDENTIFIKACIJU REGIJA KOJE SUINTENZIVNIJE VEZALE ISPITNU, ODNOSNO KONTROLNU DNK ODONIH KOJE SU JEDNAKOM DINAMIKOM VEZALE OBJE DNK.-REZULTAT HIBRIDIZACIJE SE OBRAUJE POMOU KOMPJ. PROGR. IPRIKAZUJE KAO OMJER HIBRIDIZACIJE ISPITNE I KONTROLNE DNKUZDU KRAKOVA SVAKOG HROMOSOMA

P i l t ij k tik dij tik PGD


56/61

Preimplatacijska genetika dijagnostika -PGD


57/61

Preimplantacijska genetikadijagnostika -

PGD

Primjenjuje se prije implantacije embrija u

maternicu na jednoj ili dvije stanice

blastomere -

nakon oplodnje in vitroili

biopsijom dobivena polarnog tijela iodreivanjem genotipa oocite


58/61

OPREZ

OBAVEZNA provjera nalazaprenatalnom

dijagnostikom za navedenebolesti



59/61


GENOTOKSINOSTI

Profesionalna i ambijentalna izloenost:

-fizikim mutagenima-

hemijskim mutagenima-

Hromosomske aberacije kao posljedicaaplicirane terapije

-

Eksperimetalno istraivanje

potencijalnogenotoksinih agenasa (npr. odreenihlijekova)

CITOGENETI KI TESTOVI u


60/61

CITOGENETI KI TESTOVI uprocjeni GENOTOKSINOSTI

ANALIZA hromosomskih aberacija

Mikronukleus test: aneugeni i klastogeni

uinci


61/61

Izmjena sestrinskih hromatida

engl. SISTER CHROMATID EXCHANGE

SCEtest procjene oteenja DNK induciranih hemijskim mutagenima

detektira recipronu

izmjenu fragmenataizmeu sestrinskihhromatida(rekombinacijski

popravak)

Documents

CITOGENETIČKA DIJAGNOSTIKA.pdf