TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINHKHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NHẬP MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Bài báo cáo:

ĐIỆN DI GEL AGAROSE VÀ ỨNG DỤNG

Giảng viên : TS Võ Minh Trí Danh sách nhóm: Phan Duy Luân MSSV: 0853010470 Đoàn Thị Thiên Trang MSSV: 0853010961

TP Hồ Chí Minh, ngày 28, tháng 10, năm 2010

1

MỤC LỤCI. GIỚI THIỆU CHUNG 1.Điện di 2. Phân loại 3. Nguyên tắc thực hiện

II. ĐIỆN DI TRÊN AGAROSE GEL 1.Giới thiệu về agarose 2. Agarose gel 3. Các yếu tố ảnh hương đến tốc đô dich chuyên điện di trong agarose gel   3.1. Kích thươc cua phân tư   3.2. Nồng đô agarose   3.3. Câu hinh cua DNA   4.Thành phần thực hiện điện di 4.1. Agarose 4.2. Lược 4.3. Khuôn gel 4.4. Máy điện di 5. Phương pháp điện di agarose gel   5.1. Đệm pH   5.2. Chuân bi agarose gel   5.3. Nhuôm DNA trong agarose gel   5.4. Thu hồi DNA tư agarose gel   5.4.1. Dùng agarose có nhiệt độ nóng chảy thấp (low melting temperature)   5.4.2. Ly tâm   5.4.4. Dùng hạt thủy tinh   5.4.3. Điện di vào bẫy   6. Các bước thực hiện 6.1. Chuân bi gel agarose 6.2. Tiến hành điện di 6.3. Nhuôm DNA băng EtBr   6.4. Kiểm tra băng AND

III.ỨNG DỤNG

2

1. Những trường hợp sử dụng điện di gel agarose 2.Tinh sạch và thu nhận mẫu 3. Đinh tính và đinh lượng thô nucleic acid 4. Môt số ví dụ

I. GIỚI THIỆU CHUNG

1.Điện di: - Là hiện tượng dịch chuyển các vật thể mang điện tích dưới tác động của điện trường. Sự dịch chuyển này do phần lực điện trong lực Lorentz. Điện di trên gel (gel electrophoresis) áp dụng trong sinh học phân tử DNA, RNA, Protein dựa trên các đặc điểm vật lý của chúng như kích thước, hình dạng hay điểm đẳng tích (isoelectic point). Kĩ thuật này sử dụng một dung dịch đệm (buffer) để dẫn điện và tạo điện trường đều. Một bản gel đóng vai trò là thể nền để phân tách các phân tử, và các chất chất nhuộm khác nhau (ethumdromide, xanh coomassie, bạc…) để phát hiện vị trí các phân tử gel sau khi điện di. - Điện di là ky thuật được dùng để phân tách và đôi khi để tinh sạch các đại phân tử đặc biệt là các protein và các nucleic acid trên cơ sơ kích thước khôi lượng, điện tích và cấu hình của chúng.   - Khi các phân tử tích điện được đặt trong một điện trường, chúng sẽ dịch chuyển hướng đến cực dương (+) hoặc cực âm (-) tùy theo điện tích của chúng. Ngược với protein, loại phân tử có điện tích thực hoặc dương hoặc âm, các nucleic acid có một điện tích âm không đổi nhờ khung phosphate của mình, và vì thế chỉ dịch chuyển hướng đến cực dương.   - Các phân tử protein và nucleic acid có thể được chạy điện di trên một khuôn đỡ (support matrix) như giấy, cellulose acetate, gel tinh bột, agarose hoặc polyacrylamide gel. Trong đó gel của agarose và polyacrylamide được sử dụng phổ biến nhất. Thông thường, gel là một khuôn đúc dạng phiến mỏng có các giếng để nạp (loading) mẫu. Gel được ngâm trong đệm điện di cung cấp các ion để dẫn truyền dòng điện và một vài loại đệm để duy trì pH ơ một giá trị không đổi tương đôi.

2. Phân loạiGel được cấu tạo bơi các chuỗi cao phân tử được liên kết chéo với nhau tạo thành một hệ thông mạng lưới với kích thước các mắc lưới tùy thuộc vào nồng độ chất cao phân tử và phản ứng tạo liên kết chéo. Các kiểu điện di:

Điện di trên gel agarose: khả năng phân tách gel 50bp – 20kb Điện di trên gel polyacrylamide : khả năng phân tách gel 5bp – 1kb Ngoài ra còn điện di trong trường xung (PFGE _ Pulse Field Gel

Electrophonesic)

3

3. Nguyên tắc thực hiện- Kĩ thuật điện di hoạt động nhờ vào lực kéo của điện trường tác động vào các phân tử tích điện và kích thướt lỗ của thể nền (gel). - Các phân tử âm hay dương trong một điện trường sẽ di chuyển trong gel với vận tôc khác nhau nhờ vào sự khác nhau của:

Lực điện trường tác động lên chúng(nếu các phân tử tích điện khác nhau) Kích thước của phân tử so với kích thước của lỗ gel Hình dạng, độ cồng kềnh của phân tử

II. ĐIỆN DI TRÊN GEL AGAROSE

1.Giới thiệu về agarose - Agarose (polysaccharide) có khôi lượng phân tử xấp xỉ 120.000 Da là một trong hai thành phần chính của agarose chiếm khoảng 70%, phần kia là agaropectin chiếm khoảng 30%. Agarose là một polymer mạch thẳng không bị sulphate hóa chứa hai gôc xen kẽ nhau là D-galactose và 3,6-anhydro-L-galactose. Agarose gel là một chất trong suôt (transparent) hoặc trong mờ (transluent) giông như agar, được tạo thành khi hỗn hợp agarose và nước (hoặc đệm điện di) được đun nóng tới >100oC và sau đó được làm lạnh; dạng gel xuất hiện ơ khoảng 40-45oC. Agarose gel được ứng dụng rộng rãi để làm giá thể cho các nucleic acid trong ky thuật điện di ngang (horizontal electrophoresis) hoặc làm giá thể cho môi trường nuôi cấy bacteriophage (top agarose). - Agarose được tách ra ơ dạng thạch từ một sô loài biển đỏ tảo, hoặc rong biển , được tìm thấy tại California và miền đông châu Á. Agar, một thuật ngữ có nguồn gôc từ chữ thạch agar-Malay, có nghĩa là sữa ong chúa, là thường bắt nguồn từ các chi Gelidium rong biển. Nó bao gồm cả phân tử agarose và agaropectin và cung cấp hỗ trợ cho các thành tế bào trong tảo biển.Agar được sử dụng như một chất làm đặc thức ăn, giông như gelatin, hoặc một phương tiện cho vi khuẩn phát triển, nấm, hoặc các vi sinh vật khác.

Hình : Câu trúc phân tư cua agarose. Đơn vi agarobiose (ví dụ: hai phân tư đường) là môt monomer trong

agarose polymer. Có khoảng 400 monomer trên môt chuỗi polymer.

4

2. Agarose gel - Agarose gel là một loại gel thông dụng nhất, một phần do thao tác đơn giản, thường dùng để phân tách những đoạn có kích thước trong khoảng 0.5 – 20 kb. Gel được đổ trên một giá thể nằm ngang và được điện di được thực hiện theo phương nằm ngang. - Các phân tử nucleic acid có khôi lượng và điện tích khác nhau được tách ra khi di chuyển từ cực âm sang cực dương của hệ điện di trong một điện trường có điện thế và cường độ thích hợp. Ky thuật này đơn giản và thực hiện nhanh. Hơn nữa, vị trí của DNA trong gel được xác định trực tiếp: các băng DNA trong gel được nhuộm ơ nồng độ thấp của thuôc nhuộm huynh quang ethidium bromide (EtBr) và có thể phát hiện dưới ánh sáng tử ngoại (ultraviolet-UV). - Mặt khác, để ước lượng kích thước các trình tự nucleic acid trong gel agarose, người ta sử dụng một yếu tố đánh dâu trọng lượng phân tư (monocular weigth marker – MWN). Đó là một trình tự DNA có kích thước đã biết (thang DAN – DNA ladder), thông thường người ta sử dụng thang DNA là thực thể được thủy giải bơi enzyme giới hạn HindIII

3. Các yếu tố ảnh hương đến tốc đô dich chuyên điện di trong agarose gel  

3.1. Kích thươc cua phân tư   Các phân tử DNA mạch thẳng sợi đôi đi qua bản gel ơ các tôc độ ty lệ nghịch với hàm log10 của khôi lượng phân tử của chúng. Do đó, các phân tử DNA có kích thước càng lớn (khôi lượng phân tử lớn) thì tôc độ dịch chuyển càng chậm. 

5

3.2. Nồng đô agarose   Đoạn DNA mang kích thước nhất định sẽ dịch chuyển ơ các tôc độ khác nhau qua các bản gel chứa các nồng độ agarose khác nhau. Như vậy, dùng gel ơ các nồng độ khác nhau có thể phân tách được các đoạn DNA có kích thước khác nhau). Nồng độ agarose cao có khả năng phân tách các đoạn DNA nhỏ, trong khi đó nồng độ agarose thấp lại cho phép phân tách các đoạn DNA lớn hơn. 

 Bang: Các thông số điện di DNA băng agarose gel

3.3. Câu hinh cua DNA   Các DNA dạng vòng đóng (form-I), vòng đứt (form-II) và mạch thẳng (form-III) có cùng một khôi lượng phân tử sẽ dịch chuyển trên agarose gel ơ các tôc độ khác nhau. Nhìn chung, DNA của các plasmid mạch vòng dịch chuyển nhanh hơn DNA của plasmid cùng loại nhưng có dạng mạch thẳng. Hầu hết plasmid mạch vòng chứa ít nhất hai dạng DNA có cấu trúc không gian khác nhau là dạng vòng đóng (siêu xoắn) và vòng đứt.

4.Thành phần thực hiện điện di

4.1. Agarose Agarose là dẫn xuất polysaccharide từ agar (thạch) có độ tinh khiết cao. Có rất nhiều loại agarose khác nhau về độ điện môi, nhiệt độ nóng chảy, độ trong, độ cứng. agarose thường được cung cấp dưới dạng bột khô. Khi cho vào đệm sôi nó sẽ tan và giữ được trạng thái lỏng cho đến khi tạo gel khi nhiệt độ hạ xuông khoảng 40°C. Khi đã đông gel ổn định ơ nhiệt độ thấp hơn. Kích thước mạng lưới và đặc tính sàn lọc phụ thuộc vào nồng độ agarose trong gel. Nồng độ càng cao, mạng lưới càng nhỏ. Nồng độ thích hợp là 0,4% đến 4%. 4.2. Lược Dùng để tạo ra các giếng trong bản gel 4.3. Khuôn gel:

6

Nơi đổ gel lên

Hinh: Thành phần thực hiện điện di

4.4. Máy điện di - Buồng đệm được tạo nên bằng cách tách hai bản kính giữa hai thanh spacer (tạo bề dày) ơ hai đầu, sau đó trám các đầu và đáy gel để tạo buồng kín (H. 1.4). Gel bản có kích thước từ 2,5 cm2 (giữa hai lamen của kính hiển vi) đến 30.15 cm2 và độ dày từ <0,05 mm đến > 10 mm. - Điện cực. - Máy điện di

7

Hinh ảnh về thiết bi điện di agarose

5. Phương pháp điện di agarose gel  

5.1. Đệm pH   Một sô đệm điện di thích hợp cho DNA sợi đôi thường được dùng là Tris-acetate-EDTA (TAE), Tris-borate-EDTA (TBE) và Tris-phosphate-EDTA (TPE) ơ nồng độ khoảng 50 mM và pH 7,5-7,8. Thường do thói quen, TAE được sử dụng nhiều nhất, nhưng khả năng đệm của nó lại thấp. Đệm TBE và TPE đều có khả năng hòa tan tôt các đoạn DNA và có khả năng đệm cao hơn một cách rõ rệt. Các đoạn DNA sẽ dịch chuyển với các tôc độ hơi khác nhau một chút trong ba loại đệm trên do sự khác nhau về cường lực ion của đệm. Đệm không những thiết lập một giá trị pH, mà còn cung cấp các ion để hỗ trợ cho độ dẫn (conductivity). Nếu chúng ta dùng nước thay vì là đệm trong quá trình điện di, thì sẽ không có sự dịch chuyển cần thiết của DNA trong gel. Ngược lại, nếu sử dụng đệm nồng độ đậm đặc (ví dụ: dung dịch stock ×10), thì nhiệt độ trong gel có thể tăng cao và làm nóng chảy nó. 5.2. Chuân bi agarose gel   Có nhiều loại agarose khác nhau thích hợp để chạy điện di, loại agarose dùng tôt nhất trong thí nghiệm là type-II-agarose có nội thẩm thấu thấp (low-endo-osmotic). Nó dê dàng chảy ra và tạo thành một dung dịch trong suôt, kết quả là gel đàn hồi thậm chí ơ các nồng độ thấp. Tuy nhiên, type-II-agarose dê bị bẩn bơi sulphate

8

polysaccharides (SP), hơn nữa SP còn ức chế các enzyme như ligase, polymerase và RE. Vì thế, các đoạn DNA dung ly từ những gel như thế phải được làm sạch cẩn thận trước khi chúng được dùng như là các khuôn mẫu hoặc cơ chất cho các enzyme này.  

5.3. Nhuôm DNA trong agarose gel Phương pháp quan sát DNA trong agarose gel thuận lợi nhất là dùng thuôc nhuộm huynh quang EtBr. EtBr được dùng để phát hiện DNA sợi đôi và RNA sợi đơn. Tuy nhiên, ái lực (affinity) của thuôc nhuộm đôi với nucleic acid sợi đơn là tương đôi thấp và có hiệu suất huynh quang không cao. Sau khi nhuộm, EtBr sẽ xen vào giữa các base của nucleic acid và cho phép phát hiện dê dàng chúng ơ trong gel. Mặc dù tính linh động điện di của DNA sợi đôi mạch thẳng giảm khi có mặt thuôc nhuộm (khoảng 15%), nhưng khả năng xác định gel trực tiếp dưới ánh sáng UV trong suôt quá trình điện di hoặc ơ giai đoạn cuôi có ưu thế rõ rệt. Tuy nhiên, nếu cần có thể chạy điện di gel không có EtBr và chỉ nhuộm DNA hoặc RNA sau khi điện di xong. 45Gel được ngâm trong đệm điện di hoặc H2O chứa EtBr (0,5 phút ơ nhiệt độ phòng).  

Chú y : Ethidium bromide là môt tác nhân gây đôt biến manh, chât đôc gây ung thư, vi vậy cần luôn luôn đeo găng tay khi cầm gel hoăc dung dich chưa thuốc nhuôm,tránh tiếp xúc trực tiếp vào cơ thể và phải có nơi đựng chât thải riêng sau khi sư dụng, không được thải ra ngoài môi trường khi chưa được xư ly thích hợp.

 

Câu trúc ethidium bromide

5.4. Thu hồi DNA tư agarose gel   Nhiều phương pháp đã được xây dựng để thu hồi DNA từ agarose gel, nhưng không có phương pháp nào là hoàn toàn tôi ưu. Có hai vấn đề chính: thư nhât đa sô các loại agarose đều bị nhiêm bẩn bơi sulphate polysaccharides, các sản phẩm sau đó được chiết từ gel cùng với DNA, chúng là nhân tô ức chế có hoạt tính của nhiều loại

9

enzyme (RE, ligase, kinase, polymerase) dùng trong các bước tạo dòng tiếp theo sau; thư hai hiệu suất chiết DNA từ agarose gel phụ thuộc vào khôi lượng phân tử của nó, các đoạn DNA có chiều dài <1 kb có thể được thu hồi hoàn toàn, khi khôi lượng phân tử của DNA tăng thì hiệu suất chiết giảm, các đoạn DNA có kích thước >20 kb được thu hồi kém (khoảng hơn 20% sản lượng). Có nhiều phương pháp thu hồi và tinh sạch DNA từ agarose gel, dưới đây là một vài phương pháp chính:

5.4.1. Dùng agarose có nhiệt đô nóng chảy thâp (low melting temperature) Mẫu agarose gel có nhiệt độ nóng chảy thấp chứa đoạn DNA quan tâm được cắt ra khỏi bản gel và cho vào trong đệm với ty lệ 1:1, bổ sung muôi đến nồng độ 0,5 M, sau đó được nóng chảy ơ 70oC để hòa tan hoàn toàn trong đệm. Dung dịch gel có DNA được chiết bằng phenol/chloroform và kết tủa. Lưu ý DNA được tách chiết bằng phương pháp này không thích hợp cho mọi phương thức thao tác tiếp theo, do sự hiện diện của các nhân tô ức chế trong agarose.  5.4.2. Ly tâm   Mẫu agarose gel có chứa băng DNA quan tâm được cắt ra và cho vào đệm chiết, làm nóng để hòa tan hoàn toàn, sau đó cho dung dịch gel lên trên một lớp (màng) bông thủy tinh đã silicon hóa đặt trong một cột lọc nhỏ loại 0,5 mL (còn gọi là spin column). Cột này được cho vào một tube vi ly tâm loại 1,5 mL và được ly tâm ơ tôc độ cao 10.000-15.000 rpm trong 10-15 phút. DNA sẽ liên kết với màng còn dung dịch đệm sẽ đi qua lớp bông thủy tinh vào tube vi ly tâm. Cho đệm rửa vào cột và rửa cột vài lần bằng cách ly tâm nhanh. Thay tube vi ly tâm mới, cho đệm hòa tan DNA vào cột và ly tâm để dung ly (elution) DNA ra khỏi màng vào tube. Dung dịch DNA thu được có thể được tinh sạch thêm nếu cần. Cũng có thể đông lạnh mẫu gel trước khi dùng phương pháp ly tâm để cải thiện hiệu suất thu hồi DNA.  5.4.3. Điện di vào bẫy Một cái rãnh nhỏ được cắt trong agarose gel ngay phía trước của băng DNA quan tâm. Rãnh này được làm đầy bằng glycerol và gel được điện di nhanh trơ lại để chuyển DNA từ gel vào trong dung dịch glycerol (quá trình điện di có thể được kiểm soát bằng UV). Dung dịch glycerol-DNA sau đó được chiết bằng pipette. Hoặc sau khi điện di, một khe nhỏ được cắt trong gel ngay phía trước băng DNA quan tâm và đặt trong khe một mẫu giấy loại NA-45. Gel sau đó được điện di trơ lại và băng DNA quan tâm sẽ dịch chuyển vào trong mẫu giấy. Mẫu giấy sau đó được rửa và DNA được dung ly trong đệm bằng cách đun nóng mẫu giấy tới 70oC. DNA sau đó có thể được tách chiết bằng phenol và kết tủa.  5.4.4. Dùng hat thuy tinh

10

Mẫu gel quan tâm được hòa tan trong dung dịch muôi NaI (một loại chaotropic salt) ơ nồng độ khoảng 4M. Các hạt thủy tinh sau đó được bổ sung vào dung dịch để liên kết hiệu quả với các đoạn DNA được phóng thích ơ nồng độ đã cho của NaI. RNA, protein và các tạp chất khác không liên kết với các hạt thủy tinh. Tiếp theo là các chu ky rửa và kết tủa tiểu thể, DNA tinh sạch được dung ly khỏi hạt thủy tinh trong đệm muôi thấp. Tuy nhiên, phương pháp này mặc dù nhanh và hiệu quả nhưng lại có phạm vi tôi ưu hẹp. Thu hồi các đoạn DNA nhỏ (500-800 bp) là không hiệu quả lắm và các đoạn lớn (>15 kb) có thể liên kết với các hạt thủy tinh khác nhau và các sợi DNA có thể bị phá vỡ trong suôt các chu ky rửa.

6. Các bước thực hiện

6.1. Chuân bi gel agarose- Cho lượng thích hợp agarose và dung dịch đệm vào bình tam giác.- Gia nhiệt bằng cách hấp 5 phút trong nồi hấp cao áp ơ 115 °C hoặc bằng vi sóng. Chú ý khi dùng lò vi sóng cần quan sát để tránh trào gel ra ngoài, nên chờ đến khi gel

11

sôi thì cắt điện, lấy ra (coi chừng bỏng) lắc đều rồi cho vào làm sôi lần nữa. Lặp lại ba lần cho agarose tan hoàn toàn.- Cho vào chậu bảo ôn ~50°C cho đến khi dịch gel đạt đến khoảng 50 -60 °C (tay chạm vào được) thì cho vào gel một lượng dung dịch ethidiumbromide để có hàm lượng cuôi cùng của chất màu này là 50 μg/ml. (Nếukhông cho ethidium bromide vào gel lỏng trước khi rót gel vào khuôn thìngâm bản gel vào dung dịch này sau khi đã điện di).- Rót gel vào khuôn đã được chắn hai đầu bằng băng dán hoặc bằng kẹp, đã cài sẵn lược và đặt trên mặt phẳng- Chờ cho đến khi gel rắn hoàn toàn thì cẩn thận tháo lược ra khỏi gel.

6.2. Tiến hành điện di - Tháo bản gel ra khỏi kẹp hoặc băng chắn, đặt khuôn gel trong chậu điện di ngang, rót dung dịch đệm vào cho ngập gel, chú ý đầu có lỗ lược nằm ơ phía cathode. - Pha nucleic acid cần điện di với dung dịch màu tải mẫu (điện di) 6× hoặc bằng hợp chất màu tương tự. Dịch màu có ty trọng cao này giúp nucleic acid không bị xáo động bơi dòng đôi lưu của dung dịch nên khi tải vào lỗ răng lược thì nằm gọn trong đó và có màu rõ ràng. Dung dịch màu tải mẫu 6× (dịch nạp mẫu) chứa 30% glycerol, 0,25% bromophenol blue (BPB) và 0,25% xylencyanol (XC). - Bằng micropipet hút mẫu DNA nhỏ vào lỗ răng lược.

12

- Bật điện một chiều để thực hiện điện di. Cường độ dòng điện khoảng 50 đến 150 V tùy loại thiết bị điện di. Thời gian điện di thay đổi phụ thuộc vào độ lớn của DNA, nồng độ agarose của gel và cường độ dòng điện. Chú ý lượng DNA có thể điện di trong mỗi lỗ răng lược nhiều ít tùy kích thước răng lược, nếu quá nhiều sẽ xuất hiện hiện tượng "tailing" (kéo đuôi) khó phân li.

13

6.3. Nhuôm DNA băng EtBr   Sau khi chạy điện di xong lấy nhẹ bản gel ra khỏi khuôn và ngâm vào dung dịch EtBr nồng độ 0,5 gian 30-45 phút, tôt nhất trên một máy lắc nhẹ (độ 10 vòng/phút ). Đổ dịch nhuộm EtBr vào một bình riêng để xử lý và rửa bản gel bằng cách ngâm trong nước cất hai lần, mỗi lần 15-20 phút. EtBr thường pha sẵn ơ dạng đậm đặc 5 mg/mL và giữ ơ 4oC trong tôi.  

6.4. Kiểm tra băng ADN - Bản gel sau khi nhuộm EtBr được quan sát dưới ánh = 302 nm. Dùng thiết bị chuyên dụng để phân tích và lưu trữ hình ảnh DNA (Gel Documentation System).Chú y:  không nhin vào ánh sáng tư ngoai nếu không có kính lọc thích hợp.- Nếu điện di DNA trong gel có pha sẵn ethidium bromide thì chiếu tia tử ngoại (UV) nucleid acid sẽ hiện hình dưới dạng những vạch màu đỏ cam.

14

- Nếu không cho trước ethidium bromide thì sau khi điện di cần ngâm gel30 - 60 phút trong dung dịch thuôc nhuộm này ơ nồng độ 0,5 μg/ml.- Nếu cần chụp ảnh lưu tư liệu thì có thể dùng máy ảnh pollaroid với ôngkính có phin lọc ánh sáng thích hợp với film pollaroid 667, hoặc dùng thiếtbị phân tích gel sô hóa (gel documentation system).Chú y: Đèn tư ngoai (UV) có hai loai bưc xa vơi bươc sóng 254 nm(UV sóng ngắn) và 366 nm (UV sóng dài). UV sóng ngắn giúp quan sát rõDNA nhưng làm tổn hai câu trúc chât này, cho nên nếu cần thu hồi DNAtư gel thi không nên áp dụng

Hệ thống chụp ảnh điện di geldoc XP cua Biorad

15

A. Kết quả điện di trên gel agarose chụp băng ánh sáng UV

B. Kết quả Western blot chụp băng ánh sáng trắng

III. ỨNG DỤNG

- Agarose gel điện là một phương pháp sử dụng rộng rãi việc chia tách các phân tử trên cơ sơ tính phí điện, kích thước và hình dạng. Phương pháp này đặc biệt hữu ích trong việc tách các phân tử sinh học tính quan trọng như DNA (deoxyribonucleic acid), RNA (ribonucleic acid), và protein.

- Agarose gel là một chất được sử dụng trong khoa học cho điện gel và sắc ký loại trừ kích cỡ. Sử dụng agarose gel để tách và phân tích protein và DNA . Phương tiện bao gồm một bột agarose tinh khiết đã được đun sôi trong một dung dịch đệm và sau đó làm lạnh.

1. Những trường hợp sử dụng điên di gel agarose:  

- Ước lượng kích thước của các phân tử DNA sau khi thực hiện phản ứng cắt hạn chế (ví dụ: lập bản đồ hạn chế của DNA được tạo dòng...).  - Phân tích các sản phẩm PCR (ví dụ: trong chẩn đoán di truyền phân tử hoặc in dấu di truyền...).  - Phân tách DNA hệ gen đã được cắt hạn chế trước khi thẩm tích Southern, hoặc RNA trước khi thẩm tích Northern.  

16

Ưu điểm của phương pháp này là gel được rót dê dàng, không gây biến tính mẫu, và bền vững vật lý hơn polyacrylamide. Mẫu cũng dê thu hồi. Nhược điểm là agarose gel có thể bị nóng chảy trong quá trình điện di, đệm có thể bị tiêu hao, và các dạng khác nhau của nucleic acid có thể chạy không ổn định.

2. Tinh sạch và thu nhận mẫu

Nguyên tắc: Dựa vào sự thay đổi hướng điện trường trong quá trình điện di. Mỗi lần hướng điện trường thay đổi thì phân tử DNA phải tự định hướng lại. Sau khi điện di các vạch tương ứng với DNA cần tinh sạch được phát hiện và thu nhận lại theo một trong những phương pháp:

Phương pháp 1: phần agarose chứa các vạch đó được cắt ra và DNA được thu nhận sau khi đã khuếch tán phân tử gel agarose vào một dung dịch đệm thích hợp.

Phương pháp 2: một “giếng” nhỏ được khoét trong agarose ngay trước vạch DNA. “giếng” này được bơm đầy dung dịch đệm và điện trường được tái lập. DNA di chuyển vào giếng chứa đầy dung dich đệm và được thu nhận lại.

Phương pháp 3: Điện di được thực hiện trong một gel agarose đặc biệt (như Nusieve hay Seaplaque) có điểm nóng chảy rất thấp (65°). Sau điện di vạch DNA được cắt ra, ủ trong một dung dịch đệm ơ 65°. Khi agarose đã hoàn toàn tan chảy, DNA được thu nhận lại sau nhiều công đoạn tách chiết và tủa.

3. Đinh tính và đinh lượng thô nucleid acid

Sau khi thu nhận nucleid acid ơ dạng sạch, người ta tiến hành phân tích định tính và định lượng chúng:

Định tính: sự hiện diện, cấu hình phân tử, kích thướt… Định lượng: hàm lượng tương đôi so với thang hàm lượng

4. Môt số ví dụ

4.1. Ví dụ 1 :

Điện di trên gel agarose 1% kiểm tra ADN tổng sô tách từ các chủng B. THURINGIENSIS var. kurstaki phân lập: từ kênh (1-10) theo thứ tự (47S, 50S, H22, H15, 29S, T58, H8, H3, 28S, H13 ).

17

Qua ảnh điện di các mẫu ADN tổng sô tách được từ 10 chủng B. thuringiensis kurstaki phân lập đều có một dải băng sáng tập trung rõ nét ơ phía trên của bản gel, không có các vạch phụ, các mẫu ADN tách được là nguyên vẹn và không bị đứt gãy, đảm bảo chất lượng cho các nghiên cứu tiếp theo.

4.2.Ví dụ 2:

Điện di trên gel agarose 1% để kiểm tra các plasmid tái tổ hợp mang sản phẩm PCR đặc hiệu của gen cry1Ab cắt bằng EcoR I.

Chú thích:

Kênh 1: Sản phẩm PCR của đoạn ADN đặc hiệu của gen cry1AbKênh 2,3,5: Plasmid cắt bằng EcoR I Kênh 4: Slasmid của khuẩn lạc xanh Kênh 6: Chỉ thị phân tử (ADN cắt bằng Hind III và EcoR I , từ trên xuông 21226, 5148, 4973, 4277, 3530, 2027, 1904, 1584, 1330, 983, 831, 564 bp).

Kết quả ơ hình cho thấy khi plasmid tái tổ hợp được cắt bơi enzym EcoR I đoạn ADN đặc hiệu của gen cry1Ab được tách ra khỏi plasmid có kích thước đúng bằng với sản phẩm PCR của đoạn ADN này ( Kênh 1 và 2, 3, 5). Kênh 2 cho thấy plasmid của khuẩn lạc xanh không mang đoạn ADN ngoại lai, và chỉ có một băng duy nhất có kích thước vào khoảng 3,9kb là trọng lượng phân tử của plasmid.

18

19