8
! "#$ % & ’#! ( ! " !" #$ $%& ( % # $#% )* + " % %% * + *,* %-+ %% "* & " % & * * * * % & + + %% % * *& % * *** * + " % % -" .)/01 ** & + % + %- 2( .345-2(1 & & * )/0 + % *** * + & *& % *% + 3 + + * * + 345-2( ** & " % & + * "* % & + * * % % % 6% & ) % * * + !3-70! ,* 0 % )/0 ** * & 345-2( + % * + % & 8* 8 !3-70! & % 8 * & % * % & & -& ** * * + 345-2( 345-2( % )/0 ** & 9 * * *** * 8 % * (") ) 0 3* 345- 2( ) #(! *! +, - , %.& /0! +, - , 1& 2!322 ! "# $$ %

Chondrogenic Differentiation of Human ADSC in TGF-beta3 in Pellet Culture System

Embed Size (px)

DESCRIPTION

Chondrogenic Differentiation of Human ADSC in TGF-beta3 in Pellet Culture System

Citation preview

������������������� ����������������� ������������������������������������������ ��!�"�#�$����%������&�'����#��!�����(����������

������������� ���������������������������������

��������������� ��������� ���������������

���������� ���������������������� ��!���������� ��"����

�������������������������� �!� �"���#$������$�%�� ��&������� �'��������������� ���� �����

(�������������%������

�#�� ���$#%������

) *��� ����� ����� +��� ���� ��"� � %���� %%������ ���*���� +��� ����� *�,*�� ������� ��� ���%-����+� �� �

%%��������� ���� "���*�� ������&���� ��"�� ���� ��������� %��� ���� ������&� �� � ���*�� ����������� �*����

� ����� ���*�� �� ��� ����������� ��*��� �%�������&���� ����� �����+���+ �� %%���������� ��������� %���

���*������������������������������* &������� �����������%�����*�����*�*�����*��� ��������*��+����

�"������� � %��� ��� ������ ��������� �%� � ����- ��"� � ����� ����� .)/�0�1� �� ������� *��*��� �&�����

������ �+�������%���������+���%����-�2(�.345-2(1��

&��� �������&������

�*���� )/�0�� +���� ������ � %���� �*�*�����*�� � ����� ���*�� �� � ����� � +��� ����������� �&��� ���

���*��&�������� ����� � %��� ���� �*�%��� �������� +��� ���� �� �� ��� ��� ������� �� ���� ������ 3���

������ ������+���������� �+������ �������� *����*��������� �+���345-2(����������*��*����&�����

�� ����"���� ��%������� �&��������������������+���*�� � ����"��*���� �������������%���������&����+���

����� ��*��� ���*������������ ����� � ���%���� � %��� ���� ����������� �%� �������6���%� �&��� ���

���������� ����������)��������� ��������%����*�����*�����+�������� �!3-70!�����,*���

'�������

0��� ��������� �%� )/�0�� �� ������� *��*���� � *� � �&� 345-2(� ���+��� %������ ���������� �� �

��*������������ ����� �� ���+� � �������� �%� �&���� �������� �8������*���� ����8� ���������� ��

���������!3-70!�����&����%�������������8���������*����� �&���������������� ������������������%��� �

����� *�����%�������� ��&��������&��������- ����&�*��*���*�������*������+���345-2(����

����������

345-2(�������� ���� ����������%�)/�0����������*��*����&������9���*������������*�����*�*�����*��

� ����������������*� �����8��������� �����%������������������*������������

(�"�� ��)) ������0��� ��������������������3��*�������������345-�2(�

������������ ���������������������� ���������������� ��������������������� �����������)���� ���������#(��!��*�!�+,��-����,���%�.&�/�0!�+,��-����,���1��&��2��!� ��������32���2��������

������������ ��������������������������������� ������� ���� ���������������� ��������������������� �����������

!�������� ��"�#�� ��$$�����%���������� ���������������� ��������������������� ������������

��

��������������� ��������� ������������������ ��!�������

������������� ������������������������������ ���

��� ��������0�������� ���*�� ������ ���� �������+��� + ��

���������%����&�������� .�1��:���������������

�� ���*��� �%� ������� �� ���� ���*���� �������� ��

���� ����� ������ �*��� �%� �����&�� �%����

���*������ ��������"��;���� ���������

0�������� ���*�� �� ��� �"��*����� ���*����

���*��+������� �����&�%������%-�������.�1��

0*������ ��������������� �� %����������� ���*��

�;*������* ����� �������"�����*���� ����

������� ���*�� ��� ������� ���%���*��� �%�

���� �*���� ���� ������ ��������������� �%�

�*������*���� � ��������� �������� ����

���%���� 3��� ����� ������ ����� ����������

%��� ��� ���*���� �������� ������ �� ��� ������

���� ������%���*���+���������*���� ����

����� �� ��� �������� ��� ���*����� ��������

������������ .(1�� 9���� ����� �%� ������

���������� ���+� �������� ���&� ��� � ���

%�������� �%� %���*�� ���*��� ���������� �� �

%*������ �������� ����������� .<-=1�� ���

� ���� ���� ������ � ���*�� �� ������

�*�������� ��>�� ���� ����������

�����������%�����������*���������������� ���

�����������������-������*������.?1���

!�����&����&��%%�������"�������*� ����>���

��� ������ ���*���� �������� ������� �&�

����������������%��*������*����� ��&�����)�

��;��� �������� �%� �*���� ��� ��&���� ��

*��*���������������������%� � %%�����������

��� � ����� �*������*�� ��� ��&���

��������������� ���� ����� ������� � +���

���%���� ����-���� ���� �&� �� � ����

��������%�������������������� �� ���� ;����

.�1�� 3�*��� ��� ��������"�� ���� ��*��� ��

�������&�%��������������%�����������

������&���� ����� ����� .��0�1����" �� ��

��*���%���%���������� �����%� %%����������

.@�� ��1�� ���������"�� �� ��� .��1� �� � ����

������&�.��1��3������������������������������

��0�� ��� ��� ������ � %���� "���*�� � *���

������&���� ���*��� �*�� ��� ����� �����+�

.�(1���������*��.�<1���&��"*��.�A1���>�������

�*���� .�=1�� � ����� ���*�� .�?1�� ����� .��1��

���� �.�@1��� ������*���������.��1��

������&��������������+������ ������

��������� ���� �������� �� ���&� ���*��� �%� ����

�� &��3������%������ ��������*����������*����

�������� ���*���� �*� � ��� ���"���� ����&� ��

������ ,*������� +��� ������ �������&� �%�

���� �&� �� � ���%����� �����&� .��1�� ���

� ����� ���� *�������� � �� &��-���� �

�������� ���� *���� ��>�� � ����� ���*�� ���

������"����*���%���������������� �������

�%������&������� �����*������ �����.��1��

3���� *�����%���� ����������%�)/�0��

�������� ��� ��,*��� �� ��*� � � ���� ������

����*��� ������� *��*��� ��� �� (-/��������� .(-

/1� �& ������ .�(1�� 7������ *��*��� �&����� �����

+��� �������&� ����� � ��� �� ����� � %���

���"������ ���� ������&�� �� *������ �%�

��� ��&���� ��� ������ .�<1� ����+�� ���-� ����

����������� �������*�� ��� ������ ����� �*�� ��

����������� �� �������� *���� ����&���

�"���������.�A1��

��+�"���� ���� ���� ��%�*������ �� ����

�*%%����%�������� *�����%���� ����������

3��� ��� ������ %%���������� �%� ����

)/�0�� ��,*�� � ���� ������ ����"�� %�������

���&���* �����"�����+�������"���*�����+���

%������ �*�� ��� ����������������� ������-��

�� �-(�.�=���?1����+������������%���������+���

%����-B�� �� � B�� .���� �@1� ��� � *��

������&���� ����� ����� ��� %%��������� ����

��� ��&����*� ���������*��*����� ������

3��� �����%������ ���+��� %����-B(� �� ����

��������� ���+��� %����� %��� ���������

��� ��������� ��� ����� .(�1�� 3��� ���+���

%����� ���� ���%����&� ������ � ��8-@�

�8�������C� ��+�"���� 345-� B(� ������ ������

� *��� �*���� ����� �����+- ��"� � �����

����� ���� ������� � ��� ��&��� .(�1�� 3���

�%%��� �%� 345-� 2(� ��� ��� ��������� �%�

)/�0�� �� ������� *��*��� �&����� ���� ���� &���

����� ���� � �� 3����%����� �� ���� ��* &� +��

� � ������������� �*��*��������*�*�����*��

� ����� ��"� � ����� ����� �� � �"��*����

��� ������ %%���������� ��������� �%�

)/�0�����������*��*����&������*����345-�2(��

&��� �������&������������������ ��

�*���� �*�*�����*�� � ����� ���*�� +���

������ � %���� ������&� ������ .�D��C� ���E� �<-

A�1�*� ����������������*����&���) ��������*��+������ ����������������

.�-�� ��(1�� +���� � +��� ���������-�*%%��� �

������ .7��1� �� � ����� � +��� ��A� ��� �%������������ �&��� ����������%� %��� ���*�� %���=����� ��� (?

� F0�� +��� ����*�*�� ���>���� 3���

��

*������������#�������

������������� ���������������������������������

%�������� ��&������������ �%��������������������� %������� �&��*������ ����%*������� �� �+�������������!� ����� ������+��������"� ��*���� �&��� �*%%���� �������� ����� �*��� � �&�����&���������� ������ �+���(��������G�

��

�� ���*�� *��*��� %���>�� �������� /�$�����H� 5���� �H� 7�����-��������&�� �� ��*���� ����(?�

F0��AH�0:�� �� ������)%����

�<�����+�����������%��� *������� ������������ ��� � ���

0*��*����� �� ������ ��"��&��-(� �&���� �����*��*��������+� �����������H���%�*�������%������&��� ������� �����������

�������������� � ���� ������ ���������������������������)����*���� ���� �������� �%� )/�0��+��� ���� ���� ���� � ������� ��� ������ �*�%���� �*�� ���� ��� ��� ������� �� ������ ����� %*���������*��&����������* &�*�� �%��� ��������%������*�%������������

0�������>�����%������������ ������������0/(<�� 0/<A�� �� �������&���� �������>����0/<<�� 0/��A�� ��������� �%� �&��*������� �� �345-2(�+�����"������� �������"��&�

0������%�������������<������ �����"���������� ����+��*�����������������%�*�����3��&�+���� +���� � ����� +��� 7��� �+�� ����� �� �%8� �+���<H�7����%����� ��& ��%����������3�������&�+���� �+���7������ ��*���� ���������� �� � ����� ���*�� %��� (�� ��� ��� �������������*���� 7����&� ����� ��� %��� 0/(<��0/<<�� 0/<A� �� � 0/��A� ���>���� ./)':�0&��������� /�����>1� +���� ����� � %�����������=�� ��� ��� (?

� F0� �� � ����� +���� � +��� 7����

3����!7-������� ����� ��&������ &������ �%��� �� ���� ��� (?�

F0�� %����+� � �&�+������+���

7����/������� ��+���*�� � %�����������0�*����������� �%� ����� +��� ���� *����������8&���.���>��4�����&1��

�������������������������)/�0�� %���� ���� �������� <�� ���"���� � +�����&���-$/3)��� ��I��

A�����G�������%*�� ����

�<��� ���� %��� ����� �� �� �A���� ���&����&���������� �*���� 3���� ����� +���� ���*���� � � ����� ������ �� *�� .0�1�� �������� �%�/�$�-���� 4�*���� .4��1�� �H� ��*��-�����%�����-�����*�� .����1�� ���A� ��G�����"������*�����*���.����1��A���G���������� � .����1�� A�� ��G��� ��������-�-����������.����1�� �H� ������-��������&�� .4��1��

�� � ��� ��G��� �����%������ ���+��� %����-2(�.����1��)%�����������������%*����������<�������%�����������������+����*��"��� ����(?

�F0��

AH� 0:��%��� ��� �&��� 3��� �� *�� ����� �

�"��&� (� �&��� �� � ���� ����� �� *�� +���*��345-�2(�*�� ����������������

������������� ��� ���������������������������)%���� ��� �&�� �%� *��*����� �������� +�������"���� �� %8� � �� ��� H� %������� %��� �� ����� ��& ���� � +��� ��������� ����� � +��� 8&������ � %����&� ���� � � �� ����%%��� 3����� ���&������� � ��� A� J�� ��>����� %��� ������8&����� � ����� .�-$1� �������� �*�%��� ���&��������&���� .4)41�+���� ������� � �&��������*�����������

���*������������ ����� � %��� �"��*�����

�%��&���������������� ���������+������%���� ��

���%�&�� ���� ���*�� ������� +���� �����%%� � ��

������ � +��� ��&���� %��� (�� ��� ��� %�������

����� &�������3�����(H��& ����������8 ����

�������� %��� (�� ��� +��� � � � ��� �*������� ����

�� �����*�� ����8 ���� ��"�&�� ����������

����� ���������� �&��������������.������1��� �

�������� .������1�+���� ����� � �� � ����+� � ���

����� %��� �"������� ��� <�F0�� ������� �*���� �

+��� ���� ���� ��&� ����� &�� ������ ���-��*���

��*������*���./)':�0&����������/�����>1�

%���=������� � �����8�������%����������&������

��*�� �������� �� ���� �8������*���� ����8� +���

��"���� ��

��������������

3����� ���*���� !�)� ������ � �&� !�K-��*��

���*���� .0���4��� ��� ����1�� 5���� ����� �

�����������&� /�)� ./�)1� �&����� � �

%���� �� J�� ������ !�)� *���� ����. �1� ��� ��

�������� �!�"����) �3��5���-����� �/�)�

�&������� >�� .5���������1�� ��� ��� ��� ����

���*%��*���L�� ����*������ �*���,*���� 70!�

���%���� ���� %����+�E���A�J�� /�)���K�70!�

�*%%��������J�� �37�����J���%�����������

����.3������1���� ���*���G��A�����������3�,�

/�)� 7��&������� .5��������1�� )���%�����

�� �����+���E������ ����*���������@A�F0�%���A�

���� %����+� � �&� (�� &���� �%� ����*������ �������

@A�F0�%���(������������������A=�

F0�%���<A������ �

�8������� ��� ?��F0� %��� <A� ���� 3��� ��� *���

����& � � ��� �H� �������� ���� �� � "�*�� � � �&�

��� *������ ����������

��

��������������� ��������� ������������������ ��!�������

������������� ������������������������������ �(�

3����������,*������%� %%�������������+����*�� �%���!3-70!����

7�� *��� ����,*������%��������������%�������

(A�����5-�)44)4440344))0))43)00�

����!-�44)443443))3300)444))0)�)�������

(?���������������5-�0)4430))4)34430�

���������������!-�330)40)00343030)00)�0�����������

=��������������5-�44403403333))0303443��������!-�40)443333303)4)044�

4)7/��

'�����������������)%���� �� �&�� �%� *��*���� �� � ��� ���� %����������� �%� �� *��� ��� ��� ������� ������&������%���������-�>�������������� ��������%���>�+���������"� �.5�*����1��)%�����������(� �&��� ���� ���� *��*��� ����� � ��� ��%�*�����0����� �� ���� �������� <� ���+� � *�%����������&���.5�*����1��� ���� � ������8�����&��� +��>� ��� ����� ��H� ��%�*����� $8��� � �������&�������������� ����&� ���������&�����������*�������+���+���*�%����&������"��%��� ����������� �������� �*�� ��� ���� ����&������������������������>���.0/(<1�.5�*���(1�� ���� ��*>�&��� ������ ������� .0/<A1�.5�*���<1��3�������0��+��������"��%����&������0� 6� ������ � ��������� �8�������� �� ��������%��� 345-B(� .�� ������ 0/��A1� .5�*��� A1�� �� ������&��*��������������.0/<<1�.5�*���=1��

�������������������������) ����6 ��"� � ������&���� ����� ����� ������ �������� <�+���� ��&��� � � ��� ����� %�������� �*�%��� �%� %���>�� *��*�� � %��� ��� �&�� �����6 ����&� �&����� �� � ������ �+���345-B(��3��� ���*��� � ��� *���� �������� �� ������������� � +��� ����� ����� �� ��� �� �������������� � �I��

-(� �� �� +����� .5�*��� ?1�� 3���

��� ����������������%�)/�0��������� � �����������&��&��-$��� ��������*������������

��

5�*��� ��� �*���� �*�*�����*�� � ����- ��"� � �����

������������&�*��*����%������ �&��.I<�1��

3��� ���������� ������� ���+� � ����� ��&��-�>�� ���� ���������&� +�������� � �� ��*���� .5�*��� �1�� 5*�������������������%������������+� ������*�*�������%��8������*��������8��5������+��������8�������%� ��������&���� �� �8������*���� ����8������������� �������+��� ����� ��*�� *�� ��� ��������*������ ��� �����8��%������������������ .5�*��� @1�� 3�� ��%��� ���� ���*�������*������������.��01�����&���%����&�������������� �� � �������� ���� � �*�� *�������������-���%� ����� &�� 7���"����*��������� +��� �����"� � �� ������� �� ����� �8������ �%� �&��� ��� �������� �� � ����������"���� �.5�*����������1��

�������3�����!�)�+��� �8����� � %������������ ��� ���� �&� ���� ����� �&��� ��� �������� �� � ���������!�)� �8�������� +���� ����� � �� ��������*��*��� �%���� ��� �&�� .5�*��� ��1�� ��� ������������� +���� ���� ������ � �&� 345-2(�� �&��� ����������� �� � �������� �!�)� +���� ���� ���� �� ��� � ���� ������+��� ��� �8���������%���� ��&��-����%���������)/�0��%��������������&���*��*���.5�*�����1��

:"������ ���� ���*���� ���+� � ��������� ��������� �%� �*�*�����*�� � ����� ���������� +��� � *� � +��� 345-� 2(� �� �������*��*����&���������

5�*������) ����- ��"� �������������"������� ���H�

��%�*������������������<��0��������+�*�%����������

��������&���*��*���.I<�1��

��

*������������#�������

������������� �������������������������������<�

���

���

5�*��� (�� ���*��&�������� ����� � ���+�� �����

)/�0�� +���� ���� �8������ � 0/(<�� �� �����������

���>������*������������ �+���������8&���.I<��1��

��

5�*��� <�� ���*��&�������� ����� � ���+�� �����

)/�0��+���������8������ �0/<A������*>�&���������

�����������*������������ �+���������8&���.I<��1��

���

5�*��� A�� ���*��&������������� � ���+��)/�0��

�8������0/��A����>���� �����%������ ���+��� %����-B(�

��������.I<��1��

��

��

5�*��� =�� ���*��&������������� � ���+��)/�0��

�8������0/<<����>�����&��*��������������.I<��1��

��

��

5�*��� ?�� 4����� ���������� �%� �����*�� �%���� �� �&��

����������+���345-B(�����������*��*����&�����.I<�1��

��

��

5�*��� ��� 3��� ������ �%� ���� ���*��� � �����*���

0��� ��&������������� �����*���.�-$1�.I<��1���

���

5�*��� @�� )���� ��*�� ������� �%� ���*��� � ���*���

$8������ �%� ������������ �8������*���� � ����8� � ��

���*��+�����"���� �.I���1��

���

5�*��� ���� ���*������������ ����� � ��"���� �

�8������ �%� �������� �� �8������*���� ����8� �%����

��� ������� *����.I<��1�����

��

��������������� ��������� ������������������ ��!�������

������������� ������������������������������ �A�

������������������0��������345-�2(��

��

5�*��� ���� ���*������������ ����� � ��"���� �

�8�������%��&�����������������8������*��������8��%����

��� ������� *����.I(��1��

����������)�� ���� �������� ��* &�� +�� ��%��� � ����

��� ������ ����&� �%� )/�0�� �� ����

�������� �%� 345-� 2(�� )/�0�� +���� ������ �

%���� ���� �*���� � ����� ���*�� ����� ������ �

%���� �������� �*����&�� 7��"�*�� ��* ���

������� � � )/�0�� �� � ��"���� � �����

)/�0����"���*���6� ������������������*��� ��

������ ��* ��� %��� ���*�� ������ � �� ����

����*�����*����&�.�?��(���(�1��

0������� ����� �%� ��0�� ���� �����

���%���� � *���� ���� �8�������� �%� ���� 6�

���%����������� �0/����>����.�?��((��(<1��

9�� ���+� � ����� �>�� ��0��� )/�0� �����

�8������ 0/<<�� 0/��A� ���>���� �*��� �� ����

�8������ ���� 0/(<� �� � 0/<A� ��������� :*��

���*���� ���������� � ����� �*����&� ���� *���

�� �����%%�����������*�%������>�����

���&� ���������� ��"�� ���+�� ����� ����

��������� �� ����� %��� ��� ��������� %����

�*������0��������(-/�*��*���������� ����&�

����*��*������ ��������+���%������.�?���?��(���

(�1��

7������ ��� �������� *��*��� �&����� +���

�������&� ����� � ��� �� ����� � %���

���"������ ���� ������&�� �� *������ �%�

��� ��&���� .�<1�� ���� ���� ���� *���� �%�

�������� *��*��� �&����� �&� ��������� ��� �

.�?1�� �������� ��"�� *�� � � ���� �&����� %���

%%������ �*�������� ����� ����������� ��"��

*�� � ���� *��*��� �&����� ��� �"��*���� ����

��� ����������������%���������������� ��&�

%%������ ����� �� .(A�� (=1�� :������ *�� � �� ���

��* &� ���� ����� �%� ��������*���� �*�� ���

345-2� %���&� �� ��������� ��� ������

%%����������.(?��(�1��

�����������������������

���)4!�

����� � � � ����0:M�����

�� � � ��������

�����������������4)7/����

��

5�*��� ���� !3-70!� ���*���� ���+� � �8�������� �%�

�������� ���%�����*����� �������� .)4!1��� � �&���

��� �������� .0:M1� �� 345-B(� ������ � ���*��� 4)7/��

*�� ������*��>�������������

:*�� �"��������� ���+� � ����� ���� �������

��"��������*��*�� ������ �������� *��

�*��������� � +��� 345-2(� %��� ��� �&���

%%�������� � ���� ���*�� ������ � �%�

��� ��&��-�>�� ����� �� � �� �����&� �%�����8�

�*�*���� ��������������

���� �����������6���%�����*����+����

��� *� � �� �������� ��� �" ��� � �&�!3-70!�

�� � ��*������������ ����� ��� +��

���* � �������������*���*� �������������

N*>� ��� � ������ � ������� � �����������

����� .7M)1� %���� �*���� � ����� ���*�� �� �

� *� � ����� ���� � ������� ����������

��� ������ �� � ��*������ ������� ������

)����� ���&� *�� � 345-� 2�� %��� ��� ������

%%���������� �� �������� *��*���� *�������

�� +��>�� .�?1�� +���� �� ���� �������� ��* &� +��

*�� � 345-2(� ���+��� %������ �� �� ��� ��� ��

��� ������ � *���� %��� ���� %���� ���� ��

�������*��*���� *����(�+��>���

����� ����������� ����� �"������� �

��� ������ ��������� �%� �*���� � ����-

��"� ������������*�� ����+���%������%�345-�

2�����������*��*����&��������"���*����%%�� ��

.�(��(@��<�1��

$������� �������*�����* � ���� ��������

�%�)/�0�� �%�*��� �+���345-2(� �� �������

���+��� %������ ��� �������� ��%%�� �� *���������

�� +��>� .(�1�� ��+�"���� +�� � ���� *�� � ��&�

��%%�� ����*����* &��

��� ��� � �� ���?� ���������� � ����� �*����

)/�0��*� ����� *� �������� ��&��-�>��

������&��� �� ������� *��*��� �&����� *����

�*����345-�B�� ���������� ��������� .(�1��3��&�

*�� �345-B��+����+��*�� �345-�B(����+���

%������ ��� � ���� ��� ��� ���� ���+� � ����

��

*������������#�������

������������� �������������������������������=�

�8���������%�������� ��&������>������������

?� �� � �<� �&�� �%� ���� � *���� �*��� �� �*��

��* &� ���� �8�������� �%� �������� ���%-�

������+�����"���� ��%������� �&���%�� *�����

3�� �*�� >��+�� ���� ���� �� ���� %���� �������

����� 345-2(� ��� � *�� %%���������� �%�

)/�0�� ���� ���� ��� ��&��� �� ������� *��*���

�&�������

������������� �*����&�� �*�� ��* &� ���������� � ����

��� ��������� �%� �*���� �*�*�����*��

� ����- ��"� � ����� ������ � *� � �&�����

345-2(��������������*��*����%�������%��������

�� ������ 3����%����� )/�0��� � *� � +���

����������� ���+��� %������� ��&� ���"�� ��� ��

"��*����� ��*��� �%� ����&� ��������

������&���� ����� ������ %��� ��� *��� �����

���� ��"� ����������

��+�������������3��� �*������ +�*� � �>�� ��� �8������ �����

�����* �� ��� ������-0��������� %���!�������

�%� ��%�����O�"����&� �%��� ���������� ���

/�� 7�&���� ) ��� /��� ���������� :��������

�� �4&������������������������� ��������

�� � ���� )�* ������ ���������� ���������&�

�������%��������>� ���������������

'�� ����������)���&��*���7��"�������� �������%����������&������� ������&-O����@�@-�@@���������������9>�&�!���

�@@=C���E(?(-(?�������

��� � �9����P��'��O��� ������� /���'������'������/M�� ��� ����� �������� ���*�� ����������+��� (/� ����*��

�,*��*�- ��"� ���>���%%�� ��� �������&����������������������������AC��=E?���-?�@<��

(�� � 4�����&� �/�� ��������� ���>�*��� 3�� 3��������� �%� ���*���� �������� �%���� �%� ���� >���� +��� �*������*��

��� ��&�����������������:�������������7�&��3�����@@�C���E�<�-�A����

<����5*�*>�+��3��$&���/!��'� �����4��������������������* �����������������������*�%�����8����������

�%����������������>������������������*���)���@��C�=�E?@-�@��

A�� � ����������� ���������%����*�������������� ����-���*����%���*��������������0���:������!�����!������<C�

=�E=��-=(<��

=��� �3�+��!��'+���)7�������)��3�����������)�����09��3������������%����*����������������8����������

+�*� ��E�������%�����������)������!��*������C�<(�E��A-��A���

?���������3������������0*������������������������������%����*������������ �%�����:�������@@?C���EA�A-A(���

����M����/���+����:��'���9���������7����&�*��*�� ���� ��&�����%� %%������������������ � %%������&������������

�-545��� �345-B����M%�����@@?C�=�E�@(-�@@��

@�����>&������*�������3��M�������M��7��>���/�������������������%���������&��*����� *�������������%���������

�����+�������� �%����������,*�����%����*������ �����*�����"����� *������� ����������7��������)� ���

O�)������C�@@E<(@?-<<�����

�������>&�����M�������M���*�������3��0*��4��7��>���/���) ������ %%�����������%��*����� *�������������

%��������������+��������.��0�1��������������!�������<C��@E�A=-�=<��

�����9�>�������������'����������P��������3��'�+�������)��0����������E��������*�����%��� ����� �>����

%����+��� �����������%������ ���� �*�����%� �������8���� ����+����&��*����&��� ������������:������������

0������������C���E<��-<�?��

��������+� �$����������)M��7��"���9������>��4$��3������������%��������-�������������*��������������������%�

�������������������������Q�!� ���:������"������@@@C�?E�<@-�A@��

�(���7��>���/��������+���������������������������%��������������������*����������@@?C�<���?=E?�-?<��

�<���5*>*�����3�����������9�����&���)��5� �����������!����� �44��0���"���0)��������0����� ��%%�����%�

��*��-�>�� ���+��� %����-�� �� � �����%������ ���+��� %����-������ ��� ���������� ������&���� ����� *����

��� ������������������:������������0�����������(C���EAA-=<��

�A���/������0��/���L)��5��3&� ���+�>�7��M*&����57���*���������������&��������������%����� *����*����

�&��"�������������)�������!��*������C�<<E�@��-�@<���

�=���0�������N�����������>�+�>�!���'�*�������>� �+�����/���&����������0*��������$�����&����R*-7��������

N���*�� �����*�������������� %%���������������������������������*���������&�������������������0����

�������(C�AE=<�-=<=��

�?���N*>��7)��N�*�����)��;���7��/��O�������/)���*���������� *�������������)���*����� ��������*��������*���

�%��*����������������������������0���������C��(E<�?@-<�@A��

����P�*��� ��$�� ������� �3)�����&� �!)���* ���� � ��� 5��& � � �)����+>��� �'�� ��� �����*���� �����"�� ��*��������

������&�������������������������������������"�����*����%��>��������*������ � ����� ��"� �%����%������

� *������ �������� �������)����!������C��=<EA�-=���

�@���N"�%�������������"�-�*��%��"��M��) ����4��$ +�� ��0������������*������)������!���������&����

���*�������������������� ��%��������� " *�����)������!��������C��E<??-<����

��

��������������� ��������� ������������������ ��!�������

������������� ������������������������������ �?�

�������S���O��:�& >��)���3*��!���>�>�����/��������'4��3*���!����*���������������&���� %%����������

����������%��*���������*��������- ��"� ���������:������!��������C���E��=�-��=@��

������9�>�������4����3��7�� ������P�*���!4�������*������0������)���4�� ���������������&�������-���� �

�������%��������%*��-��>����� �%�����%����*��������������������������*���)���@@<C�?=EA?@-A@���

�����:� �&��;����-����������"�����������'���������������� �������'���-�*��� �������*����3$��!�������

"����������5���) ��������*�- ��"� �������&�������������&�� ��� ����+�������������������%%��� ��&�

�������*�-���"���������� *����0&��������&����=C��E�==-�??��

�(����)+� ��)��9>�����R��M� &��)��4���������4*��>�5��0��� ������ %%�����������%�� ����- ��"� �

� *����������������������������������� ����������%%�� �����������������<C��AE(���-(�����

�<�� � ���� ��� ��� )������ ��� M���� ��� ���� ��� ��� 3��� ����� �%� ������&�� ������ �&� %%�������� � ����� ��� �����

� %%�����������%���������������7��������)� ���O�)��@=�C�<=E�A((-�A<����

�A�����5��������0��%�����������%������+���������.9�����-������1�����������������7�&�����@�AC�<�E<�?-<A@����������

�=�� � ��;*� ��� �'�� 9���� $�� ������ $)�� ��7-�� �� � ��7-@� ��������� ��� ������ %%���������� �%� �*����

�*�����������������&����������� ��"�����������������&��%%����%��M-�����0����7�&��������C���@E�?A-��<��

�?�����������������������3���0������)���4�� ���������P����O������������� ����������%�����������+� ��"� �

������&��������������������$8��0����!����@@�C��(�E��=A�-�?���

��������>�&�)�����>��0���*���&���������&�57��0��������0:��7���������5��0��� ������ %%�����������%�

*��*�� ��*����������&��������������%���������+�3��*��$����@@�C�<E<�A-<����

�@�������*��������0������7��$����)�������&��� ������*�� ������%�������&����������������������� ����� �

����!��������C�((E���-��?���

(������ ��+���������0����4��3� �>�������������M���:��*������3������3���������)����+���%��������������

%������ ������� *����%�����*����������&������������������������&��!���0���*������<C�(��E@�<-@�@��

(��� � ���K����*��P���N�����'��9������� �*�K/��M�*��R������������� %�������� %������� %%�������� ��*����

� ����� ��"� �������������""���)���7��������������?C���E==(-=?���

(����$������3��9*�)9��4*��>�5��7������� *�����%���� ��&�� %%�����������%��*����� ����- ��"� �� *���

�����������&�������������������������=��)��������!��*�����=CA<E����-��(���

((�����* ����7������+� ��0��������/����&���+������$����������������� �������"��+����*�������������

�����*�%�������������������@@?C���E��A-�(A��

(<���7����������5����>�&��)�����>���0�����+����!'��/�*������!���������/����������*�������������������%�

� *����*����������&���������������������@@@��C���<E�<(-�<?���

(A�� ��*�����4*��N��K���K��M*����M*�K��3����7�������������%���*��������+�������&����������������&���

��"����� �������������� �������0��������(C���EA�?-A(A��

(=���$������;� ������>��� ���)��3���&���M���� ���������*������*�����������&�������������������� �

�&���+� ����&������&�*��*����&������/�"�4��+���/%%������=C�<�E(=�-(?���

(?�� � ��>&�� ��� 0������ /0�� 7��>���/��� ��7-=� �������� ��� ��������� �� �� �*����*������ �%� �*���������+�

������������������������&��!���0���*������C���<E<��-<����

(������>&�����M�������M���*�������3��!�����!M��7��>���/���0����������%��%%����%����7-���-<���� �-=������������

��������%���������%��*����� *�������������%��������������+���������0����3��*��!������AC�(��E�=@-�?=���(@�� � M��� � !���'�� � �0�� 0��� � ���� '�� ���� 0��� � ���� �*�� �'3�� 0������� ����� �� � �8�������� ����&��� �%�

������&��������������%�����*��������������+��� �� ������3��*��0����7�&�������������<C��<E(��-(�<��<��� �$�>����4!��4����� ����5���>���/���!���$�)+� � ����4*��>� �5��0��� ����������������%� � �����

���*�- ��"� ������������������������ ��������������������&��!���0���*������C��@�E?=(-?=@��