Chapter 5. 미생물과 산업

1. 미생물과 유전공학

- DNA 분자 modification -> genetic engineering -> Biotechnology

1) Pharmaceutical products(제약)

InsulinInsulin

(lac operon PM-signal sequence-Insulin)

인체세포의 insulin 유전자 확보

대장균의 plasmid vector 에 삽입

대장균에 삽입 (transformation)

대장균 증식 및 insulin 생산

HGH(human growth hormone)HGH(human growth hormone)

대장균에서 발현시킬 때signal sequence가 문제됨

유전공학에 의해 해결

불필요한 부분 제거 후재조합 cDNA 합성

Chapter 5. 미생물과 산업

Chapter 5. 미생물과 산업

2) Antisense molecules (안티센스분자)

- mRNA(sense)와 결합-> 단백질합성을 저해하는 RNA분자(antisense)

Antisense technology and AIDSAntisense technology and AIDS

- Coat protein mRNA 등의 inactivation

Chapter 5. 미생물과 산업

3) Biotech Vaccines

Anti-HIV vaccineAnti-HIV vaccine

- Vaccines : 미생물체, 불활성화된 virus, 미생물단편 -> 부작용 문제-> antigen protein 주사를 이용한 항체형성 유도 -> 문제 해결

HIV 외막단백질 gp120, gp41

유전자클로닝-> 대장균에서 생산

환자주사

gp120과 gp41에 결합하는 항체 생성

Chapter 5. 미생물과 산업

4) DNA Vaccines

- 항원단백질 유전자를 함유한 plasmid- 감염성, 복제능 없이 특정단백질만을 생산- 현탁액 주사로 면역성유발

5) DNA Analysis and Microbial Detection

- DNA probe와 PCR 이용- DNA probe :

- ss 합성 DNA로서 세포물질 속 상보가닥 DNA 위치 추적- 방사성동위원소로 label - target 유전자의 mRNA 단편 분리->reverse transcriptase에 의해 cDNA 합성->PCR

PCRPCR

Chapter 5. 미생물과 산업

6) DNA Fingerprinting

- 1985년, Jeffreys -> 유전자들 사이에서 여러 번 반복되는 DNA 단편 발견(intron에 존재)

- 사람에 따라 반복정도에 차이

- variable-number tandem repeats, VNTRs(vinters)로 불림

- 제한효소로 VNTRs 가장자리 절단-> 개인별 특이양상 발현

- 유전자검사, 법의학분야에 적용

Chapter 5. 미생물과 산업

7) Methods of Biotechnology

A. 올바른 유전자 확보

- mRNA 분리 : Cellulose-linked poly-T DNA ->poly-A tail 에 결합 mRNA 분리

- mRNA 회수 -> cDNA 합성에 이용

- Reverse transcriptase : mRNA 주형으로 cDNA 합성

- DNA polymerase : cDNA를 주형으로 상보적 DNA 합성

Chapter 5. 미생물과 산업

B. Vector에 삽입 :

- marker 유전자 : 항생제 내성유전자 동시 부착으로 selection 용이

- retrovirus : 유용한 vector,

- RNA-containing virus-> 숙주세포에서 DNA 합성-> 숙주세포 염색체 삽입

C. Host cell의 선택 :

- 일반적으로 대장균이용 : 배양용이, 도입유전자 발현빈도 높음, 독성가능성

- 비병원성 세균 (Bacillus subtilis), 효모(Saccharomyces cerevisiae) 등 사용

- 동물세포 : 세포배양 어려움, 고비용

D. 유전자 발현조건 제공

- 재조합유전자 제조 시 : PM 종류, 구조유전자의 배열 등 고려

- inducer 사용 여부

C. Products의 회수

- signal sequence 부착 : 유전자산물 세포외로 분비

- poly tag 부착 -> affinity chromatography 이용 가능

Chapter 5. 미생물과 산업

2. 미생물과 산업

- 생명공학과 미생물을 이용한 Biotechnology industry

1) Industrial Enzymes

- cellulase : stone-washed jean- amylase : 제빵, 맥주제조, 전분분해- protease : 밀가루 글루텐분해(제빵)

- 육류연화제, 세제- rennin : 치즈제조- pectinase : 과일즙 펙틴분해 -> clear juice

2) 유기산, 비타민, 기타

- 구연산(citric acid) : 음료, 캔디, 포도주, 피혁가공- lactic acid : 식품향료, 보존제- lysine : 제빵 식품첨가제- glutamic acid : MSG(조미료)- steroid : 콜레스테롤, 성호르몬, 관절염치료제- 향료- 다양한 항생제

Chapter 5. 미생물과 산업

1) Nitrogen Connection

- nitrogen :

- 아미노산을 포함하는 유기물의 필수구성성분

- 세포건조중량의 9-15%

- 미생물 : 년간 200만톤의 질소화합물 생산

- 동물, 식물 : 미생물의 질소고정에 의존 -> 미생물이 없으면?

- nitrogen fixation :

- 미생물의 nitrogenase에 의해

- 질소순환의 연결고리

- 비공생 질소고정균 : Azotobacter, Beijerinckia, Clostridium, Nostoc, Anabaena

- 공생 질소고정균 : Rhizobium, Beijerinkickia -> 콩과식물 뿌리에 공생

- nitrogen -> 질소고정세균 -> 암모니아->

-> 아미노산-> 콩과식물-> 젖소 -> 우유, 소괴기

3. 미생물과 농업

- 젖소, 목초, 등등등..

Chapter 5. 미생물과 산업

Nitrogen CycleNitrogen Cycle

- Nitrogen fixation

- nitrification (질산화)

- 암모니아 -> 질산염으로 변환

- Nitrosomonas, Nitrobacter

- denitrification (탈질산화)

- 질산이온 분해-> 질소가스

- yeast, Cyanobacteria

Chapter 5. 미생물과 산업

☞ 질소고정관련 생물공학적 과제

- 질소고정유전자의 Agrobacterium 세균에서 발현

- 담배, 페튜니아, 토마토 식물조직에 서식

- 비콩과식물과 공생관계를 갖는 Rhizobium 종 개발-> 자체 질소고정 가능

- 질소고정유전자를 동물에게 이전하면?

2) Ruminants (반추동물)

- 섭취한 탄수화물보다 더 많은 단백질 생산 -> 어떤 비밀?

- 소의 제 1위(rumen, 혹위) : fermentation tank

- 일정온도, 약산성, 무산소환경

- cellulase 생산 혐기성미생물 서식

- cellulase 분해 -> 포도당, cellobiose 로 분해

- 포도당분자 이용 유기산 생성 : propionic acid, acetic acid, methane, CO2

- urea 이용 단백질 합성

- 미생물자체는 또 다른 단백질원

- 맹장동물 : 말, 토끼, 돼지 등

- 맹장 내 미생물 -> rumen의 미생물 역할

- 토끼 : 자기 배설물 섭취-> 되새김질 대신 음식물을 두번 소장 통과시킴-> 분식증

반추위의 생화학반추위의 생화학

Microbes and RumenMicrobes and Rumen

Chapter 5. 미생물과 산업

3) 낙농공장에서

- 젖소가 생산한 우유 : 유지방, 유당, 유단백질, 무기염류

- 유당 : 미생물에 의해 lactic acid로 발효

- Sour cream : 크림의 숙성으로 생산

- Yogurt : Lactobacillus, Streptococcus의 젖산 발효

- Acidophilus milk : 살균된 우유에 L. acidophillus 배양액 첨가 혹은 짧은시간 발효

- Kefir : Lactobacillus, Streptococcus, Saccharomyces kefir 등을 혼합사용

- 발효 중 산, 알코올, 발효가스 생성

- Butter 숙성 : Streptococcus, Leuconostoc -> 산생성, diacetyl 생성-> 독특한 향기

- 치즈 : casein의 응고와 숙성

- rennin, 미생물유래 응고효소 사용

- 다양한 숙성미생물-> 다양한 치즈

- Roquefort cheese : Penicillium camemberti -> blue vein 생성

Chapter 5. 미생물과 산업

4. Biotechnology on the Farm

1) 식물세포로 DNA 도입

- 식물세포배양기술 발전 : 단일식물세포로부터 성체식물 생산

- 식물세포 유전자를 변형시킨 후 성장-> transgenic plant (형질전환식물)

- 식물세포로 DNA 단편 주입

-> microinjection (미세주입법), Biolistic (gene shotgun)

-> Agrobacterium tumefaciens의 Ti plasmid(Tumor-inducing) 이용

-> 식물세포에 Ti plasmid 방출-> 식물세포염색체로 삽입-> crown gall 형성

-> Ti plasmid : 세균증식 자극단백질 유전자(종양유전자) 함유

-> 종양유전자 제거 후 외래유전자 도입 -> 세균에 도입 후 식물에 접종

Ti plasmid in Agrobacterium tumefaciensTi plasmid in Agrobacterium tumefaciens

Chapter 5. 미생물과 산업

2) Bacterial insecticide(세균살충제)

- 미생물살충제의 요건 : 특정해충에만 작용, 빠르게 작용, 환경안정성, 생분해성, 저가

- 1900 초 Bacillus thuringiensis 가 나방유충 살해 확인

-> 내생포자 형성 시 독성단백질 생산 -> 모충 장내에서 장벽세포 파괴

-> 식물, 대다수 동물에는 무해

-> 포자형성 초기 세균-> 분말형태로 건조 식물체에 살포

-> 빗물에 유실-> 살균효과 제한적

-> 식물세포에 Bt 유전자 직접 삽입시도 -> GMO 옥수수, GMO 목화

-> Bt 독소 내성 유충발현

GMO 목화Sporulating B. thringiensis

Chapter 5. 미생물과 산업

3) 농업생명공학 연구결과들

(1) 곤충 내 자살유전자(suicide gene) 도입

- 유전자 활성화 후-> 곤충에 치명적 산물 생산 효소 발현

(2) ice-nucleating bacteria(빙핵세균) : 0oC에서 식물체에 얼음결정 형성 관여-> 서리형성

- Pseudomonas syringae

- 얼음형성 관여단백질 유전자 제거(ice-minus bacteria)-> 얼음형성온도 낮춤

- 현장살포-> 빙핵세균 점차 제거(균총변화)-> 식물의 성장기간 증가 -> 생산성 향상

Chapter 5. 미생물과 산업

(3) 제초제 저항성

- Glyphosate : 제초제 주성분-> 엽록체에서 필수아미노산 합성효소 저해

- 대장균 내 동일활성 유전자 : glyphosate에 대한 높은 저항성

-> 유전자클로닝 후 Ti vector 이용 담배, 콩에 도입-> 제초제저항성 GMO 식물

미국내 제초제저항성 GMO 콩의 재배면적

Chapter 5. 미생물과 산업

(4) Pharm animal (약용동물)

- 유전자변형 미생물의 산물을 처리한 동물

- 1983, BGH(bovine growth hormone) 대장균에서 생산 -> 식용소, 젖소에 주사

-> 뼈 근육 성장 촉진, 우유 25% 이상 생산 증가

-> 돼지 근육의 지방 양 감소

(5) Genetically Modified Food (GMF)

- FlavrSavr 토마토 : 썩음 지연 유전자 함유

- 토마토 썩음 : polygalacturonase(PG)에 의한 세포벽 pectin 분해가 원인

-> 토마토 내 PG 유전자 확인 후 활성억제

(6) Veggie vaccines

- 미생물백신 전달자로 야채와 과일 이용

-> 저장비용 저렴, 백신필요지역에서 생산, 무기한 공급, 오염된 주사기 노출방지

-> 요리 도중 일부 파괴의 문제점

- 토마토 : 짧은 생육기간, - 바나나: 아이들용, 요리필요없음

- 해결해야 할 문제 : 소장효소로부터 보호, 알러지반응유도?, 활성성분의 충분한양

Chapter 5. 미생물과 산업

FlavrSavr 토마토 개발FlavrSavr 토마토 개발