Upload
others
View
2
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
1
CH 210Chromatography
By Supaporn Sangsrichan
2
ประวต 1906 Michael Tswett แยกสารท�สในพชดวยผงชอลค และวตถ
อ�นๆ เชน แปง น�าตาล polysacharides, sucrose, Indulin
1930s Lederer และกลมวจยอ�นๆ ไดทาการวเคราะห carotenoids, xanthophylls
1937 มหนงสอ Chromatography เลมแรก เขยนโดย ZechMeister
1940s Ion exchange partition and column chro. และ เร�มตนเทคนค gas chromatography
1950s มผลงานของ gas adsorption chr. และ gas liquid Chr. (partition)
partitioning of chromatography โดย Martin and Synge แหง the Wool Industries Research Association, Leeds, England ทาใหไดรบรางวล Nobel Prize สาขา Chemistry ในป 1952
มการพฒนา Paper & column chromatography
3
1960s พฒนาการใชงานของเทคนคโครมาโท-
กราฟ ในดาน เคม ชวเคม การแพทย เภสช ฯลฯ
1969 มเคร�อง HPLC ขายเปนคร �งแรก
มการพฒนาป� ม ชนดของอนภาคบรรจ และตวตรวจวดชนดตางๆ ทาให เทคนคน�เปนท�นยมใชงานไดกวางขวางกวา เทคนค GC
Tiselius (Sweden) ไดรบรางวล Nobel Prize จากงานดาน Electrophoresis
4
ความหมายของโครมาโทกราฟ
Chromatography = Chroma + Graphein ส การเขยน
chromatography ตามคาจากดความของ IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry)
A method used primarily for the separation of components of a sample, in which the components are distributed between two phases, one of which is stationary phase, while the other moves in a definite direction
5
ความหมายของศพททางโครมาโทกราฟ
Stationary phase = เฟสคงท�
Mobile phase = เฟสเคล�อนท�
Elution = ขบวนการชะ พาสารออกจากคอลมน
Eluate = สารท�ถกชะ พาสารออกจากคอลมน
Eluent = สารท�ชะ พาสารออกจากคอลมน
Solid support = อนภาคของแขงท�ชวยยดเฟสคงท�ท�เปนของเหลว
Packings = อนภาคของแขงท�บรรจในคอลมน
Retention time = เวลาท�สารใชในคอลมน
6
การแบงชนดของโครมาโทกราฟ
chromatography
2
7Figure 1 Family tree of chromatographic methods.
Chromatography
Mobile phase
gas Super critical fluid
Liquid
Stationary phase
Solid(GSC)
Liquid(GLC)
Solid(SFC)
Liquid(SFC)
Solid(LC)
Liquid(LLC)
Micelles(MEKC)
Mechanism AdsorptionSize exclusion
Adsorptionpartition
Adsorption Adsorptionpartition
Adsorption(LSC)
Size Exclusion
(LSC)
IonExchange
(IEC)
Affinity(AC)
Bonded phase(BPC)
8
Figure 2 Applications of bonded phases in LC.
Bonded phase(BPC)
Liquid-Solid(LSC)
Size exclusion(SEC)
Reversed Phase(RPC)
Ion exchange(IEC)
Capillary Electrochromatography
(CEC)
Ion Suppression(ISC)
Ion Pair(IPC)
MetalComplexation
(MCC)
Micelles(LSC)
HydrophobicInteraction
(HIC)
9
ทฤษฎโครมาโทกราฟ (Chromatographic Theory)
โครมาโทกราฟ เปนวธแยกองคประกอบของสารผสม โดยอาศยความแตกตางของการกระจายขององคประกอบ ระหวาง 2 วฏภาค คอ วฏภาคคงท� (stationary phase )และวฏภาคเคล�อนท� (mobile phase )
Distribution Coefficient (Kd), Kd = คาคงท�ของการกระจายตว
โมเลกลของสารท�ถกแยกจะกระจายตวในระหวางเฟส 2 เฟส การกระจายตวน�ข�นกบคา สมประสทธ�ของการกระจายตว (Kd)
เฟสคงท� เฟสเคล�อนท�Kd
10
Liquid Chromatography1. Paper chromatography2. Thin layer chromatography3. Open column chromatography
1. ChromatographyLiquid chromatographyGas Chromatography
11
โครมาโทกราฟของเหลวแบบคอลมน(liquid column chromatography )
โครมาโทกราฟของเหลวแบบคอลมนแบงตามกลไกในการแยกสารได 4 แบบ คอ
1. Liquid liquid chromatography (LLC)(partition chromatography)
2. Liquid solid chromatography (LSC) (adsorption chromatography)
3. Ion-exchange chromatography
4. Exclusion chromatography
12
Paper Chromatograpgy
–แบงตามสถานะของเฟสท �งสองเปนโครมาโท
กราฟแบบ Liquid-liquid chromatography
–แบงตามกลไกการแยกคอ partition chromatography
•แบงไดอก 2 ชนด
–Normal phase chromatography
–Reversed phase chromatography
3
13
Normal phase chromatography
Stationary phase มความมข �วมากกวา mobile phase
Stationary phase : น�า ยดเกาะบนเย�อกระดาษ (6-12%)
Mobile phase: Solvent ท�มpolarity < น�า
Reversed phase chromatography
Stationary phase มความมข �วนอยกวา mobile phase
Stationary phase :นากระดาษมาอบไลน�าแลวชบดวยตวทาละลายอ�นๆ
Mobile phase: Solvent ท�ม polarity สงกวา st.ph.
วธทา
1. การ spot สาร ทาใหมขนาดเลกและเขมขน
2. การ Developing นากระดาษกรอง หรอ แผนTLC ท�มสารอย นามาใสลงในโถ Chamberท�มตวอลทท�อ �มตวของไอสารอย
– Ascending development
– Descending development
• 1-dimension
• 2-dimension
15
15
2-dimension PC, TLC
หมน90 °S1
S2
S1
16
3 Detection หลงจากการระเหยตวทาละลายใหแหงแลว สามารถตรวจวดตาแหนงของสารท�ถกแยกโดย
ดวยตาเปลา กรณท�สารมส
ฉายดวยรงส UV
ฉายดวยรงส IR
ฉายดวยรงส Fluorescent เกดสารเรองแสงข�น
ตรวจหาสาร Radio active
ทาปฏกรยากบสารอ�นๆท�ใหส อบดวยไอของไอโอดน
พน ninhydrin เพ�อตรวจหากรด amino
สาร AgNO3 เพ�อตรวจหา sugar
17
วธทา นากระดาษโครมาโทกราฟมาวดระยะหางจากขอบ
ประมาณ 1.5-2.0 ซม.
หยดสารละลายเปนจดเลกๆ
นากระดาษไปจมลงในตวทาละลาย(ระวงอยาใหตวทาละลายถกจดของสาร
ตวอยาง ) ปดฝาภาชนะท�งไวเปนเวลา ประมาณ 15-20นาท
ฝาปดภาชนะ
กระดาษตวทาละลายท�เคล�อนท�
ตวทาละลาย
18
นากระดาษออกมาแลวทาใหแหงวด
ระยะของตวทาละลายและสาร
ตวอยางทเคล�อนท�
นาคาท�ไดมาหาคา Rf ระยะทางทตวทาละลายเคล�อนท�
ระยะทางท�สารเคล�อนท�
4
19
Kd= Cs/Cm
สารท�เกดการแยกจะมคา Kd ท�แตกตางกนสงผลใหความสามารถในการเคล�อนท�ตางกน
การทาคณภาพวเคราะหโดยการเปรยบเทยบคา Rf หรอ คา (Rf)r ของสารตวอยางกบสารมาตรฐาน
(Rf)r : Relative retardation factor คาการหนวงสมพทธ
Rf = ระยะทางท�สารเคล�อนท�ได ระยะทางท�สารมาตรฐานเคล�อนท�
Rf = ระยะทางท�สารเคล�อนท�ได ระยะทางท�ตวทาละลายเคล�อนท�
Rf : Retardation factor
20
a=สารตวอยาง
b=สารมาตรฐาน
X= ระยะทางทตวทาละลายเคล�อนท�
Y= ระยะทางทสารตวอยางเคล�อนท�
Z= ระยะทางท�สารมาตรฐานเคล�อนท�
X
Z
ba
Y
Rf = X
Y
X
ZRf =
Z
X
X
Y
XZX
Y.(Rf)r =
Z
Y
Rf ของสารตวอยาง
Rf ของสารมาตรฐาน
Rf สมพทธ
21
สารท�มคา Rf มาก แสดงวาสารมคณสมบต
• สารเคล�อนท�ไดเรวหรอมาก
• สารถกดดซบไดนอย
• สารละลายไดด
สารมคา Rf นอย แสดงวาสารมคณสมบต
• สารเคล�อนไดชาหรอนอย
• สารถกดดซบไดมาก
• สารละลายไดนอย
สาร 2 ชนดมคา Rf ตางกน < 0.05 จะไมเกดการแยกข�น
22
สมบตของคา Rf • 1. ไมมหนวย• 2. หาไดจากการทดลองเทาน�น • 3. มคาไมเกน 1• 4. ข�นอยกบชนดของสารและชนดของตวทา
ละลาย• 5. เปนคาเฉพาะคาคงท�ของแตละสาร การวเคราะหสารเปนสารชนดเดยวกน ม
หลกการดงน�• 1. มสเดยวกน • 2. มคา Rf เทากน • 3. มระบบการทดลองเดยวกน
23
A B C D E FM
A,B,C,D, E, F = standard of known amount of compoundM= mixture of unknown
การทาปรมาณวเคราะห
24
ประโยชน
• ใชแยกสารท�มปรมาณนอยๆ ได ซ �งวธอ�นแยกไมได
• ใชแยกไดท �งสารมสและไมมส สารไมมสใช วเคราะหชนดของสารและหาปรมาณของสารผสม
• ใชทดลองความบรสทธ�ของสาร
• ใชทดลองหาเฟสเคล�อนท�ท�เหมาะสมกอนการทา HPLC
• ใชกบตวอยางมากๆได ในข �นตอน screening
5
25
Thin layer chromatography
• มหลกการและเทคนคคลาย Paper chromatography ทกประการ ตางกนตรง ชนดของเฟสคงท�
• เปนรปแบบหน�งของ plane chromatography
• เปนจดเร�มตนของการทา column chromatography เน�องจากการแยกเกดข�นเรว ระบบไมยงยาก สามารถทาไดบอยคร�ง
26
เฟสคงท� Stationary phase
เฟสคงท�สามารถเลอกไดหลายชนด เชน ทาใหเกดการแยกโดย adsorption, partition (normal phase, reversed phase), ion exchange size exclusion
Plate มขนาด 5x10, 10x20, 20x20cmความหนาของสารเคลอบ 200-250µm สาหรบอนภาคขนาด 20µm (หรอหนากวาสาหรบ Conventional plates)เกดการแยก ~200 จด ในเวลา 25 min ระยะทาง 12 cmสารอนทรย เชน cellulose powders, starch, sephadex, polyamides และ ion exchange resinสารอนนทรย เชน silica gel, alumina, glass powder และ diatomaceous earth
27
1. ใช capillary tube จด (spot) สารเขมขน 0.01-0.1%
2. หางจากขอบ 1-2cm 3. ขนาดจดสาร 5mm ใชทาคณภาพวเคราะห4. ขนาดจดสาร <5mm ใชทาปรมาณวเคราะห5. ใช Pt-iridium capillary tube ในการจด (spot)6. ใช automatic dispenser system ท�ควบคม
ปรมาตรไดแมนยา
1. การจดสาร
วธการวเคราะหดวยเทคนค TLC
28
29
30
Sample Application as SpotsCamag Linomat IV.
6
31
Sample Application as BandsCamag Nanomat.
32
1. ตองทาการระเหยตวทาละลายกอนทาการแยกสาร2. นาเพลตไปใสในภาชนะปด ภายในบรรจ mobile
phase ท�อ�มตวดวยไอสาร mobile phase (spot สารหามจมใน mobile phase)
3. mobile phase จะเคล�อนท�ผานเพลตดวยแรง capillary force (ในอตราไมคงท�, hyperbolicfunction) การเคล�อนท�ลดลงเม�อระยะทางเพ�มข�น
4. หลงจากตวทาละลายเคล�อนท�ไดประมาณ 2/3 เพลต หยดการ develop ตองทาการระเหยตวทาละลายกอนทาการตรวจวดสาร
2 Plate development
33
Chamber types used for conventional PPC. (A) Unsaturated N-chamber (1, rectangular chamber; 2, chromatographic plate; 3, mobile phase). (B) Saturated N-chamber (4, filter paper soaked with the mobile phase). (C) Unsaturated S-chamber (5, glass cover plate; 6, spacer). (D) Saturated S-chamber (7, facing chromatographic plate, soaked with the mobile phase; 8, second part of the mobile phase). (E) Ultra-micro chamber, a special variety of S-chamber (5, glass cover plate; 9, elastic inert material).
34
1. ถาสารมสมบต luminescence (สารอนทรย fluorescence, สารอนนทรย;phosphorescence phenomena) สามารถตรวจหาการเรองแสงของสารได
2. ใหเตมสาร fluorescence indicator ลงในสารเคลอบ เม�อสารท�ถกตรวจวดท�เปน non fluorescence จะเกดเปนจดจางๆ สารท�ใชเคลอบไดแก pyrene derivatives, fulorescein, morin, rhodamine B
3. พน strong oxidant เชน HNO3, KMnO4, H2SO4 จะเกดเปนจดสดา สาหรบสารอนทรย
3. Detection การตรวจหาตาแหนงของสารบนเพลต
35
4. พนสาร reagent ท�ทาปฏกรยาจาเพาะตอสาร เชน-NH2 ทาปฏกรยากบ ninhydrin-Phenol Fe(III)Cl3-reducing sugar Aniline phthalate-metal complex forming reagent
C
C
O
O
C
OH
OH
RNH2 C
C
O
O
C N
O
O
ninhydrin Blue reaction product
36
densitometer
Light path diagram of the TLC scanner. Key: 1, lamp selector; 2, entrance lens system; 3, monochromator entry slit; 4,monochromator grating; 5, mirror; 6, slit aperture disc; 7, lens system; 8, mirror; 9, beam splitter; 10, reference photomultiplier; 11,scanning object; 12, measuring photomultiplier; 13, photodiode (transmission).
7
37
Separation of pesticides in tap water on an HPTLC silica gel 60 plate by AMD. Multi-wavelength (six
wavelengths) evaluation permits resolution by optical means of fractions insufficiently separated. (Reprinted from Camag literature,
CAMAG, Muttenz, Switzerland.)
38
Open column chromatography
39
40
โครมาโทกราฟของเหลวแบบคอลมน(liquid column chromatography )
โครมาโทกราฟของเหลวแบบคอลมนแบงตามกลไกในการแยกสารได 4 แบบ คอ1. Liquid liquid chromatography (LLC)
(partition chromatography)
2. Liquid solid chromatography (LSC) (adsorption chromatography)
3. Ion-exchange chromatography
4. Exclusion chromatography
41
การแยกโดยโครมาโทกราฟแบบคอลมนแสดงการแยกของสารสองชนด
42
Mobile and Stationary phase
Mobile and Stationary phase
8
43
• ค.ศ. 1960 • ตวบรรจเปนของแขงท�ไมมรพรนเปนแกน เชน glass bead ~ 40 µm และเคลอบดวยแผนฟลมบางๆ(หนา 1-3 µm) • ของแขงมลกษณะเปนรพรน silica gel, alumina, resin หรอ polyamide
อนภาคบรรจ
• ค.ศ.1980 •อนภาคท�ใชบรรจอยในคอลมน คอ microparticulate ซ�งเปนท�นยมใชกนมากในปจจบน •เปนวสดท�บรรจใน guard column เพ�อใหทาหนาท�กรองส�งเจอปนออกจากสารละลายตวอยางและเฟสเคล�อนท�ท�จะผานเขาไปยงคอลมน ทาใหอายการใช งานของคอลมนยาวข�น
44
กลไกในการแยก (• = solute)(a) adsorption chromatography, (b) partition chromatography, (c) ion-exchange chromatography, (d) size exclusion chromatography, and (e) electrophoresis.
(a) (b) (c) (d)
(e)
45
การแลกเปล�ยนไอออน
การแลกเปล�ยนไอออน
46
วธการวเคราะหดวยคอลมนโครมาโทกราฟ
1. การเตรยมคอลมน• แพคคอลมนโดยทาเฟสคงท�ใหเปนสารแขวนลอย• เทลงในคอลมนท�ปดปลายดวยสาล หรอใยแกว• รอใหเฟสคงท�เรยงตวในคอลมน ใหมความสงตามตองการ• ระวง ตองใหมน�าบนผวหนาเฟสคงท�เลกนอย ตลอดเวลา
47
ตวดดซบท�เปนเฟสคงท�ในคอลมนโครมาโทกราฟแบบ นอรมลเฟส
AluminaMagnesiumCharcoalSilica gelCalcium oxideMagnesium carbonateCalcium carbonatePotassium carbonateSodium carbonateStarchCellulose
High polarity
Low polarity
Greatest adsorption
Least adsorption
48
Partial structure of alumina
9
49
Silica gel matrix structure
S i
OO
O
O
H
S iS i
O
O
H
O
50
ตวดดซบท�เปนเฟสคงท�ในคอลมนโครมาโทกราฟแบบ รเวอรสเฟส
•เปนการใชของแขงท�มโพลารตต�า เชน ผงยาง•ใชของแขงซบพอรทท�มของเหลว ท�ไมมโพลารตเคลอบ
* ระวง ตองใหมน�าบนผวหนาเฟสคงท�เลกนอย ตลอดเวลา*
51
2. ใสสารตวอยาง
โดยใชปเปตดดสารตวอยางแลวปลอยใกล เฟสคงท�มากท�สดโดยไมทาลายผวหนาคอลมนและไมตดขางคอลมน
สารตวอยางท�ใชมโพลารตตางกน ถาเปนนอรมลเฟสโครมาโทกราฟ สารท�มโพลารตสงจะอยในคอลมนไดนานท�สด
52
สารท�มฟงกชนนอลกรพตางๆมโพลารตตามลาดบน�
Organic acids (RCOOH), base (NH3, OH-)Alcohols (ROH), Thiol (RSH)Amines (RNH2) Nitro groups (RNO2)Aldehydes (RCHO), Ketones (RCOR)Esters (RCOOR’)Halides (RF, RCl, RBr, RI)Unsaturated hydrocarbons (R-C=C-R’)Saturated hydrocarbons (RCH2-CH2-R’)Perfluorocarbons (CnF2n+2)
High polarity
Low polarity
Longest retention time
Shortest retention time
53
3. ทาการอลท
เปนการเตมสารละลายท�มโพลารตท�เหมาะสมในการชะสารออกจากคอลมนในการชะสารตวอยางท�มโพลารตสงตองใชตวทาละลายท�มโพลารตสงดวย
สารผสมท�มโพลารตแตกตางกนกอาจใชสารชะหลายตวโดยท�เร �มจากตวท�มโพลารตต�ากอน
54
Eluting solvent
10
55
4. เกบสารตวอยาง
• เกบแบบ manual โดยเกบทละ 1-10 mL
• ใชเคร�องเกบ fraction collector
สามารถเกบตวอยางแบบถ�ได โดยไมตองเฝา
5. การวดปรมาณสารท�ออกจากคอลมน• วดโดย Optical method; UV, IR,
Fluorescence
• Electrochemical method; Voltametry, conductivity etc.
56
Fraction Collector
57
58
ขอเสยของ Open column chromatography
• การบรรจอนภาคบรรจ (packing particle)ทาได ชาและเสยเวลา
• ประสทธภาพการแยกต�า
• ตองเกบสารเปนสวนๆ ทาใหใชเวลานาน
ขอเสยของ Thin layer chromatography
• ทาเปนระบบอตโนมตไมได
• การทาซ�าไดผลไมคงท� (low reproducibility)
• ทาปรมาณวเคราะหไดไมด
• เหมาะกบการวเคราะห เตรยมสารเบ�องตน
59
Modern Liquid Chromatography
• มการพฒนาชนด วสดของอนภาคบรรจ
• มการพฒนาป� มหลายแบบ
• มการพฒนาตวตรวจวดหลายชนดข�น
ป คศ 1967 มการประดษฐ HPLC มาใชงานดานการวเคราะหนวคลโอไทด โดย Horvath
60
ขอดของ Modern Liquid Chromatography
• คอลมนท�ใชแยกมประสทธภาพมากข�น โดยสามารถเลอกชนดของเฟสคงท�และระบบของเฟสเคล�อนท�ท�เหมาะสมได
• ตวตรวจวดเปนแบบ non-destructive คอไมทาลายสาร
• คอลมนสามารถใชไดใหมได re-usable
• การวเคราะหเปนแบบอตโนมตได โดยเฉพาะข �นตอนนาสารเขาเคร�องวเคราะห
• มความถกตอง แมนยาสง
11
61
แกสโครมาโทกราฟ (Gas Chromatography)
62
Gas Chromatography (GC) เปนเทคนคการแยกสารพวกท�ม polarity ต�า สารตวอยางตองระเหยเปนแกสหรอไอ ณ จดฉดสาร carrier gas เปน mobile phase พาสารเขาส
คอลมนซ �งม stationary phase
ท�เปน liquid หรอ solid ทาหนาท�แยกสารและถกตรวจวดในสวนของดเทคเตอรตอไป
1. ถา stationary phase เปน active solid เรยกเทคนคน�วา Gas Solid Chromatography (GSC) กลไกการแยกแบบดดซบ (adsorption)
2. ถา stationary phase เปน liquid ท�เคลอบบางๆ บนผวของ inert granular solid support เทคนคน�เรยกวา Gas Liquid Chromatography (GLC) กลไกการแยกแบบแบงแยก (partition)
63
1. Gas Solid Chromatography (GSC)
• ใชหลกการ adsorption โดย stationary phase เปนของแขง ท�สามารถดดซบสารท�เปนแกสหรอไอท�ตองการแยกได ใชแยกสารท�มโมเลกลเลกๆ ท�สามารถเปล�ยนเปนแกสหรอไอ โดยม active solids (adsorptive particles) ท�บรรจอยในคอลมนเปน molecular sieves หรอ porous polymers, silica gel, alumina และ activated carbon
64
2. Gas Liquid Chromatography (GLC)
• ใชหลกการ partition สารผสมท�ตองการแยกอยในสภาพท�เปน แกส หรอไอ เม�อผานเขาสคอลมนจะแยกออกจากกนโดยความแตกตางในการกระจายตวอยใน mobile phase (carrier gas) และ stationary phase ท�เปนของเหลวท�เคลอบอยบนผวของ inert solid support
65
สวนประกอบสาคญของเคร�องแกสโครมาโทกราฟ (GC)
• สวนฉดสาร (Injector)
• เตาอบ (Oven)
• คอลมน (Column)
• ตวตรวจวดสญญาณ (Detector)
• ระบบบนทก และเกบขอมล (Recorder, Integrator)
• ผลท�ไดจะแสดงในรปของ โครมาโทแกรม (Chromatogram)
66
Gas Chromatograph
12
67
องคประกอบพ�นฐานของเคร�อง GC
Fan assisted thermostatically controlled oven
Detector
Computer
Sample injection syringe
Injection port
By pass valve
Gas cylinder
68
A Scheme of gas chromatography.
www.cubic.uni-koeln.de/.../metabolom.html
B Typical chromatogram of a cell extract of C. glutamicum.
69
คณสมบตของ Solid support
• inert
• ม large surface area
• regular shape หรอ uniform size
Solid support ท�นยมใชคอ celite หรออาจใช glass beads
70
แพค คอลมน
• Syringes
– Plunger-in-barrel (5-1000 L)
– plunger-in-needle (0.5 or 1 L) ดดสารเทาไรกไดจนถง 1 L
– 5 L syringe จายสารไดคร �งละ 0.3 L ได
Capillary Columns
อตราเรวของแกส สาหรบ 0.3 mm i.d. wall coatedopen-tubular (WCOT) ประมาณ <2 mL min-1
solvent 1 L มปรมาตร 0.5 mL ท� 250C จะเกดปญหา band broadening ตองมวธการฉดท�แตกตาง
71
Packed GC column
Capillary GC column
72Different Types of Small Bore Columns
13
73
Carrier gas• ทาหนาท�พา volatile component ในคอลมน มคณสมบต
inert ไมทาปฏกรยากบสารตวอยาง หรอ stationaryphase
• ทาหนาท�พา separated component ไปยง detector
แกสพาท�นยมโดยท�วไปไดแก ไนโตรเจน ไฮโดรเจน และฮเลยม
74
คณสมบตของ Carrier gas
• inert ไมทาปฏกรยากบสารท�ตองการแยกหรอ stationary phase
• มการแพรนอยและมน�าหนกโมเลกลต�า
• หางาย ราคาถก
• และมความบรสทธ�สง
• เหมาะกบระบบตรวจวดท�ใช
แกสพาท�ออกจากทอแกสควรทาใหบรสทธ� โดยผานทอท�บรรจดวย molecular sieve เพ�อชวยขจดไอน�าหรอไอน�ามน
75
Sampling Systems
• Gas Samples
– gas-tight syringes
– loop valves (0.1 to 10 mL)
• Solid Samples
• Liquid Samples 0-1L or diluted
• Vaporizing Injector
– injector temperature > bp components และอณหภม สงกวาอณหภม oven สงสด 50C
– injector temperature < อณหภมสงสด stationary phase ท�ทนได
76
การฉด• sample; liquid, gas, solid (solution, pyrolysis)
• Micro syringe แบบ liquid หรอ gas tight syringe
• Sample valve (reproducibility > 0.5%)
• Head space analysis (solid, liquid sample)
• Auto injector
• Autosampler
77
1) Injector
คอ สวนท�สารตวอยางจะถกฉดเขาสเคร�อง และระเหยเปน gas พรอมกบถกทาใหเปนเน�อเดยวกน กอนท�จะเขาส column อณหภมท�เหมาะสมของ injector ควรเปนอณหภมท�สงพอท�จะทาใหสาร ตวอยางสามารถระเหยไดแตตองไมถกทาใหสลายตว (decompose)
• Solvent ท�ใชละลายสารตวอยาง ไดแก ether, heptane หรอ methanol
• อณหภมของ injection port ตองสงพอท�จะทาใหสารตวอยางเกดการกลายเปนไอไดอยางรวดเรว แตตองไมทาใหสารตวอยางสลายตวและสงกวาอณหภมของคอลมน
78
2) Oven
คอ สวนท�ใชสาหรบบรรจ column เอาไว และเปนสวนท�ควบคมอณหภมของ column ใหเปล�ยนไปตามความเหมาะสมกบสารท�ถกฉด ซ�งอณหภมของ oven น�นจะสามารถปรบเปล�ยนได 2 แบบคอ
– isocratic temperature (isothermal)
– gradient temperature (program temperature)
ขอดของการทา gradient temperature คอสามารถใชกบสารตวอยางท�มจดเดอดกวาง (wide boiling range) และยงชวยลดเวลาในการวเคราะห (analysis time ) ลงไดอกดวย
14
79
Temperature programming
Isothermal at 45C
Isothermal at 145C
Programmed temp. at 30-180C
80
3) Detector
คอ สวนท�จะใชสาหรบตรวจวด องคประกอบท�มอยในสารตวอยาง ดวาสารท�เราสนใจน�นมปรมาณอยเทาไร ซ�งความสามารถของการตรวจวดน�นจะข�นอยกบชนดของ detector ท�เลอกใช
สวนประกอบท�สาคญของเคร�องแกสโครมาโทกราฟ คอ detector
detector จะทาการเปล�ยนเปนสญญาณทาง electronic กอนสงไปย งต วป ระมวลผล เพ�อ ท าการ เขยน เ ปนความสมพนธกบเวลาไดออกมาเปน chromatogram ดงน�นการเลอก detector จงตองทาใหเหมาะสมกบสารท�จะวเคราะห
81
สมบตของ Detector
• ความไวเพยงพอ
• เสถยรภาพและแมนยาสง
• ใหสญญาณสมพนธกบความเขมขนสารท�เปนเสนตรงในชวงกวาง
• อณหภมชวง RT - 400C อยางนอย
• เวลาตอบสนองเรว
• มความถกตอง นาเช�อถอ
• มความจาเพาะสง
• ไมทาลายสาร
82
Detector• general detector สามารถตรวจวดสารได
หลายๆ ประเภท • selective detector ซ�งจะสามารถเหน
เฉพาะสารท�มโครงสรางเฉพาะ, ม functional group หรอ atoms ท�จาเพาะเจาะจง
83
Detector ตรวจวดสารท�นยม1. Flame Ionization Detector FID 2. Thermal Conductivity Detector TCD 3. Flame Thermionic Detector
FTD 4. Flame Photometric Detector FPD 5. Electron Capture Detector ECD 6. Photoionization Detector PID 7. Electrolytic Conductivity Detector
ElCD 8. Mass Spectrometer MS 9. Pulsed Flame Photometric Detector
PFPD
84
Schematic diagram of a flame ionization detector for gas chromatography
15
85
1. Flame Ionization Detector (FID)
มคณลกษณะของ GC ดเทคเตอรในอดมคตแทบทกอยาง
หลกการ
การสนดาปไอของสารท�ออกมาจากคอลมนในเปลวไฟของไฮโดรเจนในอากาศหรอออกซเจนและวดไอออนท�เกดข�นจากองคประกอบของพคท�ออกจากคอลมนของ GC ปรมาณท�สามารถตรวจวด ต� าสด (minimum detectable quantity; MDQ) เทากบ 10-11 กรม และชวงของกราฟมาตรฐานท�เปนเสนตรงถง 107
สารประกอบหลายอยางท�ไมสามารถตรวจวดโดย FID เชน ไฮโดรเจน ไนโตรเจน น� า ไฮโดรเจนซลไฟด ซลเฟอรไดออกไซด แอมโมเนยและคารบอนไดออกไซด
สารประกอบไฮโดรคารบอนท�จะตรวจวดโดย FID ไดจะตองสามารถผานกระบวนการออกซเดชนได
86
2. Electron Capture Detector (ECD)
Detector ชนดน�เปน selective detector เฉพาะท�ใชวด Electrophilic compounds อยางเชน Halogens, Nitrates และ conjugated carbonyls องคประกอบหลกของ detector น�คอ 63Ni ซ �งจะให electrons เม�อมกระแสไฟฟาคงท� เม�อสารท�เปน electrophilic compounds เขาไปจบกบ electrons เปนผลใหมการเปล�ยนแปลงของกระแสในการวดสภาพไวสง แต linearity range แคบ
สมการท�เกดข�นในการวด Polychlorinated Biphenyls (PCB) โดยใช Nitrogen gas เปน Make-up gas
87
Schematic diagram of an electron capture detector for gas chromatography
+ve Electrode
-ve Electrode -Emitter
Carrier gas out
Carrier gas in
88
ลกษณะเปรยบเทยบของ GC ดเทคเตอรท�สาคญ
ดเทคเตอร หลกการ ความจาเพาะความวองไว
ชวงเสนตรง
เทอรมลคอนดกทวตดเทคเตอร (TCD)
วดความแตกตางของคาการนาความรอนของแกส
สนองตอบตอสารประกอบทกอยาง
10-10 104
เฟลมไอออนไนเซชนดเทคเตอร (FID)
เผาสารประกอบในเปลวไฟ H2 / O2 ท� 2000 องศาเซลเซยส
สนองตอบตอสารอนทรยท�สามารถถกออกซ
ไดส
10-12 107
อเลกตรอนแคพเจอรดเทคเตอร (ECD)
วดการเปล�ยนแปลงของกระแสอเลกตรอนท�เกดจากปฏกรยาจากสารประกอบอนทรยกบอเลกตรอน
ตอบสนองตอสารประกอบทกอยางท�ทาปฏกรยากบอเลกตรอน
10-14 103
(106 สาหรบ pulsed operati
on)
89
Properties of Some Gas ChromatographySelective Detectors
Detector Selectivity mode Approximation sensitivity (g)
ECD Affinity to low-energy electrons
10-13 – 10-14
Thermionic Nitrogen,
Phosphorous
10-12
10-13
Flame-photometric Sulpher 10-9
Electrolytic conductivity
Halogen compounds 10-11
Ultraviolet Aromatics 10-9
Photoionisation Partially enhanced
response to certain organic molecules as compared with FID (not truly selective)
10-11 – 10-12
การทาคณภาพวเคราะห
เพ�อวเคราะหสารตวอยางวาเปนสารอะไร มก�ชนดและเปนสารใดบาง
1. ใชคารเทนชนไทมของสารตวอยางกบสารมาตรฐาน แตสารตางชนดกนอาจ
ใหคารเทนชนไทมตรงกนกได อาจวเคราะหอกแตสภาวะการแยกตางกน เชน
คอลมน อณหภม อตราการไหล เปนตน
2. เทคนค spiking บอกวาพกไหนเปนของสารใดในสารผสมน�น โดยเตมสารสาร
น�นลงในสารตวอยาง ถาโครมาโทแกรมท�ไดมพกใดท�มพ�นท�ใตพก หรอความ
สงเพ�มข �นแสดงวา พกน�นเปนของสารท�เราเตมลงไป (known compound)
16
91
Quantitative Applications
• พ�นท�ใตพค หรอความสงของพคในการทาคณภาพวเคราะห โดยเทยบกบสารมาตรฐาน
– External standard
– Standard addition
– Area normalisation
ใชในการวเคราะหทางส�งแวดลอม ทางการแพทย ชวเคม การ พสจณหลกฐาน อาหาร หองปฏบตการปโตรเคม
High Performance Liquid Chromatography
เทคนคโครมาโทกราฟของเหลวสมรรถนะสง
93
การทางาน
HPLC เปนเทคนคแยกสารผสมโดยใชเคร�อสบแรงดนสง (high pressure pump) สบของเหลวหรอตวทาละลายซ�งทาหนาท�เปนวฏภาคเคล�อนท� (mobile Phase) พาสารตวอยางท�ถกฉดเขาทางชองฉดสาร (injector) เคล�อนท�ผานอนภาคท�เปนวฏภาคคงท� (stationary phase ) ซ�งบรรจอยในคอลมน (column)
สารผสมเคล�อนท�ผานคอลมนแลวจะถกแยกออกมาในเวลาท�ตางกน ผานเขาสเคร�องตรวจวด (detector) สญญาณท�ตรวจวดไดซ �งอยในรปสญญาณไฟฟาตามเวลาและปรมาณของสารแตละตวท�ตรวจวดได โดยสญญาณจะถกสงไปยงเคร�องบนทกสญญาณแสดงผลออกมาเปนโครมาโทแกรม (chromatogram) ประกอบดวยพค (peaks) ของสารท�เปนองคประกอบของสารผสม
94
สวนประกอบตาง ๆ ของเคร�องมอ HPLC
Mobile phasereservior
Pump
Pressure gauge
Filter
Pressure sensor
Sample injector
Analytical column
Guard column
Detector
Waste
Data systemRecorder
95แผนภาพสวนประกอบตาง ๆ ของเคร�องมอ HPLC
96
การเตรยมโมบายเฟส
• เลอกใช ‘HPLC grade’ หรอคณภาพใกลเคยง
• อาจมการผสมดวยอตราสวนตางๆ หรอเตมบฟเฟอร หรอปรบพเอช
• ตองมการกรองกอนดวยเมมเบรนขนาด 0.5 or 0.8 m filter
• โมบายเฟสตองมการกาจดแกสกอน โดยเฉพาะตวทาละลายท�มข �วสง (น�า สารละลายบฟเฟอร) เน�องจากอากาศละลายไดงาย),
17
97
ภาชนะท�บรรจเฟสเคล�อนท� (mobile phase reservoir)
• เปนขวดสาหรบใสตวทาละลายท�ใชเปนเฟสเคล�อนท� มขนาดประมาณ 1 ลตร
• อาจมอปกรณท�ใชในการไลอากาศท�ละลายอย เชน ออกซเจน (degasser)
98
การอลท
• Isocratic elution เปนการใชสารละลายท�เหมาะสมเพยงตวเดยวตลอดการชะ อาจจะใช เวลานานในการแยก และหรอพกจะมหาง
• Gradient elution โดยทาการโปรแกรมตวทาละลาย คอ การผสมตวทาละลาย (>) 2 ชนด
99
Isocratic vs Gradient
100
อปกรณสาหรบฉดสารตวอยาง (sample introduction devices)
การผานสารตวอยางเขาไปยงคอลมนควรจะอยในลกษณะท�เปนแถบท�แคบมากท�สดเทาท�จะเปนไปได
วธการนยมใช
microsampling valve
microsyringe ฉดสารตวอยางผาน septum
101
CAPILLARY TUBING
• Capillaries (o.d. outer diameter) ขนาด 1/16 น�ว (1.6 mm) เปนท�นยมใชกบคอลมนท�มเสนผาศนยกลางภายใน ขนาด 0.17, 0.25, 0.50 และ 1.0mm
102
ระบบของป� ม (pumping system)
ใน HPLC มความตานทานการไหลของเฟสเคล�อนท�ท�จะไหลผานคอลมนซ �งมอนภาคขนาดเลกบรรจอย ความตานทานจะมากเม�อใชอนภาคเลกๆ และคอลมนมขนาดเลกดวย จงจาเปนท�จะตองใชป� มความดนท�สงดนเฟสเคล�อนท�ใหสามารถไหลได
18
103
หลกการเลอก pumping system• ป� มและสวนประกอบทาดวยวสดท�ทนทานตอการสกกรอน
ดวยตวทาละลายตางๆ ท �งน�รวมท �งทอ fitting และ flow cell เชน ทาดวยเหลกไรสนมคณภาพสง inert polymers เชน polytetrafluoroethylene (PTFE)
• สามารถป� มวฏภาคเคล�อนท�ท�มปรมาณมาก ๆ ไดอยางตอเน�องโดยไมมการขดของ
• ใหความดนไดถง 4,000 – 6,000 psi • ควบคมอตราการไหลไดระดบต�าจนถง 3 มลลลตรตอนาท
เปนอยางนอยและคงท�• ความคลาดเคล�อนของการควบคมการไหลตองไมเกน 1-2
%• มปรมาตรภายในต�าเพ�อความสะดวกและรวดเรวในการ
เปล�ยนวฏภาคเคล�อนท�• ไมมพลส (pulse) หรอมตวท�ใชลดพลส (pulse damper)
104
ชนดของป� ม
• mechanical pump เปนป� มท�ควบคมให อตราการไหลของเฟสเคล�อนท�มคาคงท�
• pneumatic pump เปนป� มท�ควบคมให ความดนของเฟสเคล�อนท�มคาคงท�
105
Syringe pump และ Constant displacement pump
ป� มชนดน�มลกษณะเปนกระบอกสบ (cylinder) ซ�งบรรจตวทาละลายไวแลว มกานสบ (plunger) ซ�งจะเคล�อนท�แบบสกร (screw) ผานกลองเกยร (gear box) โดยม step เปนตวควบคมอตราการไหลของวฏภาคเคล�อนท�โดยจะไปทาใหกานสบเคล�อนท�เรวหรอชาลง
106
ป�มแบบชกลกสบ (reciprocating pumps)
ป� มชนดน�เปนท�นยมใชกนมาก กานสบป� มท�จะเคล�อนท�เขาออกตลอดเวลาการทางาน เม�อลกสบ เคล�อนท� เข าจะ เ ปนการดนวฏภาคเคล�อนท�ใหเขาสคอลมน และเคล�อนท�ออกนอกจะดงเอาวฏภาคเคล�อนท�จาก reservoir เขาสลกสบผาน check valve แสดงดงรปเปนการควบคมการเคล�อนท�กระทาไดโดยการปรบอตราเรวของการชกลกสบผานมอเตอร และคอมพวเตอร
107
108
19
109
reciprocating pumps
ขอด
• มปรมาตรภายในต�า ทาใหการเปล�ยนแปลงตวทาละลายหรอวฏภาคเคล�อนท�ไดงาย
• การสงวฏภาคเคล�อนท�จะอยในลกษณะตอเน�อง
• อตราการไหลของวฏภาคเคล�อนท�คงท�ดโดยไมตองคานงถง back pressure ของคอลมน
ขอเสย
• เกดพลสข �นทาใหความไวของดเทคเตอรบางชนดมขอจากด
• ตองม pulse damper
• ปรมาตรของระบบระหวางป� มกบคอลมนเพ�มข�น
• เกดความยงยากในการเปล�ยนตวทาละลาย
• ไมเหมาะในการทา gradient elution
110
เคร�องตรวจวด (detector)
111
สมบตของเคร�องตรวจวด (detector)
• มสภาพไวสง และใหสญญาณตอบรบ (response) ท�คาดคะเนได
• ใหสญญาณตอบรบไดกบสารทกชนด• ไมมผลตอการเปล�ยนแปลงของอณหภมและ
อตราเรวของการไหลของเฟสเคล�อนท�• เช�อถอไดและงายตอการใชงาน• ความสมพนธของความเขมขนและสญญาณตอบรบ
ของเคร�องตรวจวดควรมสภาพ • เชงเสน (linearity) ในชวงกวาง• ใหขอมลเก�ยวกบคณภาพวเคราะหสาหรบพคท�
ตองการตรวจสอบ
112
ชนดของเคร�องตรวจวดในเคร�องโครมาโทกราฟของเหลวสมรรถนะสง
• แบบ bulk property หรอ general detector เปนการวดการเปล�ยนแปลงคณสมบตทางกายภาพของเฟสเคล�อนท�รวมกบของตวถกละลาย เชน refractive index เปนตน
• แบบ solute property หรอ selective detectors เปนการวดการเปล�ยนแปลงของตวถกละลายเพยงอยางเดยวเทาน�น เชน UV-Vis, fluorescence เปนตน
113
Noise
114
Detection Limit
20
115
Linear detector range
116
Cell Volume
• ปรมาตรของดเทคเตอรตองมคาต�า เพ�อปองกน peak broadening ตองมคาต�ากวา 10% ปรมาตรท�ชะพคทแคบท�สด ปรมาตรมาตรฐานคอ 8 l ถานอยกวาน�จะมผลตอ detection limit
• ปรมาตร < 8 สาหรบ micro-HPLC
117
Liquid
Light
Window Gasket
UV flow cell
118
Performance of LC detectors
LC detectortype LOD
(mass)
gradient Temp. sensitivity
Flow sens.
UV s 100 pg-1 ng Yes Low No
Fluorescence s 1-10 pg Yes Low No
Electrochemical s 10 pg-1 ng No 1.5%/C Yes
RI Gen. 100 ng-1 ug No 10-4/C No
Conductivity s 500 pg-1ngNo 2%/C
Yes
Mass Spect. s 100 pg-1 ng Yes None No
FT-IR s 1 ug Yes Low No
119
อลตราไวโอเลต ดเทคเตอร (Ultraviolet detector)
• สามารถวดแสงไดในชวงความยาวคล�น 190 - 800 nm
• มโมโนโครเมเตอรสาหรบเลอกความยาวคล�น
• สามารถใชตรวจหาสารตวอยางไดท�วไป
• เหมาะสมกบ gradient elution
• ตวทาละลายชนดตางๆ ท�นามาใชเปนเฟสเคล�อนท� (mobile phase) จะไมดดกลนแสงอลตราไวโอเลต
• วเคราะหหาสารท�มปรมาณนอยๆได
• ขนาด 1-10 L เพ�อลด extra-column band broadening
120
สารท�ดดกลนแสงยว
• double bond adjacent to an atom with a lone electron pair, X=Y–Z (เชน vinyl ether);
• bromine, iodine or sulphur;
• a carbonyl group, C=O; a nitro group NO2;
• two conjugated double bonds, X=X-X=X;
• an aromatic ring;
• inorganic ions: Br-, I-, NO3-, NO2
-
21
121
UV detector
• ยว-วสเบล ดเทคเตอร 3 ชนดท�นยมใช ไดแก– 1. Fixed-wavelength UV detector
– 2. Variable UV-Vis detector
– 3. Photodiode-array detector (PDA)
122
1. Fixed-wavelength UV detector
ประกอบดวย flow-through cell และแหลงกาเนดแสง โดยทาเปนลาแสงดวยเลนสท�ทาดวยควอทซใหแสงผานเซลลของสารละลายมาตรฐานและสารตวอยาง แสงท�ผานออกมาจะผานการกรองดวยฟลเตอร จงผานไปยงโฟโตเซลล หรอโฟโตไดโอด 2 ตว
• ดเทคเตอรแบบ Fixed-wavelength แทบไมใชกนแลว หลอดกาเนดแสงใช mercury (254 nm), cadmium (229 nm), และ zinc lamps (214 nm)
123
2. Variable UV-Vis detector
• แหลงกาเนดแสงประกอบดวย D2 และ W lamps
• Deuterium lamps ใหแสงแบบตอเน�อง (-340 nm,
• Tungsten–halogen ใหแสงชวง near-UV และ visible (340–850 nm) มกใชรวมกบหลอดดวท�เรยม
• มโมโนโครเมเตอร เพ�อใชสาหรบเลอกความยาวคล�นตามท�ตองการได
124
3. Photodiode-array detector (PDA)
เปน solid state detector ประกอบดวยโฟโตไดโอดจานวนมาก สามาถวดแสงไดหลายๆ ความยาวคล�นได ในขณะเดยวกน
ระบบทางเดนของแสงจะเปนแบบยอนแสง “ Reverse Option” คอแสงจากแหลงกาเนดหรอจากหลอดยวจะผานไปยง flow-through cell กอนท�จะนาไปยงโมโนโครเตอรหรอเกรตตง
เม�อแสงท�ตกกระทบบนเกรตตงจะกระจายออกเปนความยาวคล�นตางๆกอนตกกระทบบนแผงของโฟโตไดโอด
scan 1msec/spectrum
125
HPLC-UV ท�วไป
126
Principle of a diode array detector.
22
127
ลกษณะของสเปกตรมท�ไดจากการเขยน 3 มต ระหวางการดดกลน ความยาวคล�น และเวลา
128
129
Ion-Exchange Chromatography
By Supaporn Sangsrichan
130
Ion-Exchange Chromatography
• บทนา
• หลกการ
• สมบตของ ion exchangers
• ผลของ mobile phase
• การประยกตใชงาน
131
Ion-Exchange Chromatography
• Ion-exchange chromatography ถกใชในการแยกกรดอะมโน ต �งแตป 1956.
• เทยบไดกบ classical column chromatography ท�ใช silica หรอ alumina แตบรรจเรซน หรอ เจลท�ใชมขนาดใหญ ความดนต�า การแยกสารท�ซบซอนใช
เวลานานหลายวน ดงน�นจงมการพฒนาการแยกท�ให ความรวดเรว คอ HPLC และมการพฒนาเฟสคงท�มากมาย รวมถง ion-exchange chromatography
132
IEC
• เทคนคท�ใชสาหรบแยกสารประกอบท�มประจ สารประกอบท�แตกตวเ ปนไอออนได เชน สารอนทรยท�เปนกรดหรอเบส และสารประกอบท�สามารถเกดอนตรกรยากบ ionic groups
23
133
หลกการ
Ion-Exchange Chromatography เฟสคงท�จะม side-chain ท�ประกอบดวยฟงกชนนลกรปท�มประจ เฟสเคล�อนท�สวนใหญจะประกอบดวย counter ion ซ�งกคอ ไอออนท�มประจตรงขามกนกบ ionic group ท�อยบนผวของอนภาคท�ใช เปน ion-exchanger และ counter ion น�จะอยในสภาวะท�สมดลกบประจท�อยบน resin ในลกษณะของ ion pair
134
สมดลท�เกด
X+ + R-Y+ Y+ + R-X+
Cation exchange:
X- + R+Y- Y- + R+X-
Anion exchange:
X = ไอออนตวอยาง
Y = counter ion
R = exchanger
135
เฟสคงท�
• สารอนนทรย เชน sodium aluminosilicate, montmorillonite
• สารสงเคราะห เชน Zirconium
• copolymerization
• เรซนท�มรพรน ควบคมไดดวย %cross linking (1-12%, 8% นยมใช)
136
CH = CH2
X
styrene
+ Y
Para - Divinylbenzene
-CH — CH2 — CH — CH2 — CH — CH2 — CH -
-CH — CH2 — CH — CH2 — CH — CH2 — CH -
สารโพลเมอรท�สงเคราะหไดจากการทาโพลเมอรไรซ ท�นยมใชคอเรซนท�เตรยมจากการโพลเมอรสารสไตรนกบไดไวนลเบนซน
CH = CH2
CH = CH2
137
สามารถแบงเรซนตามคณสมบตของหมธาตท�ใสเขาไปได 2 ชนด
1 ชนดแลกเปล�ยนแคทไอออน (cation exchange)
คอเรซนชนดท�มหมธาตท�เปนกรดอยในวงอะโรมาตก เตรยมไดโดยนากรดซลฟรก + โพลเมอรของ styrene และ divinylbenzen หม SO3H ดงรป
-CH — CH2 — CH — CH2 -
-CH — CH2 — CH — CH -
SO3- H+
SO3- H+
SO3- H+
-CH — CH2 — CH — CH2 -
138
2 ชนดแลกเปล�ยนไอออนลบ (Anion Exchange)
คอเรซนชนดท�มหมธาตท�เปนเบสอยในวงอะโรมาตก เตรยมโดยทาปฏกรยาเคมระหวางหมของเบสกบโพลเมอรกบไดไวนลเบนซนท�ถกทาคลอโรเมทลเลตแลว
N(CH3)3+OH-
N(CH3)3+OH-
N(CH3)3+OH-
N(CH3)3+OH-
N(CH3)3+OH-
N(CH3)3+OH-
24
139
Cation exchanger
140
การหาสภาวะท�เหมาะสม
• ชนดของ ion exchanger,
• pH ของ mobile phase,
• ionic strength (ความเขมขน) ของ mobile phase
• ชนดของ counter ions ใน mobile phase
141
สมบตของ ION EXCHANGERS
• ion exchangers ท�มใชสวนใหญมช�อยอ ตวแลกเปล�ยนประจท�นยมใชแสดงดงตาราง
• 4 ชนดแรกเปนคายอท�บอกถงชนดของการแลกเปล�ยนประจ
• ช�อยอสวนท�เหลอสมพนธกบหมฟงกชนตางๆ
• หมฟงกชนจะเช�อมตอกบเรซนท�เปนสารอนทรย เชน styrene–divinylbenzene หรอ ผวซลกา
142
คายอท�ใชกบตวแลกเปล�ยนไอออน
Abbreviation Meaning Type
SAX Strong anion exchanger
WAX Weak anion exchanger
SCX Strong cation exchanger
WCX Weak cation exchanger
AE Aminoethyl –CH2–CH2–NH3+ WAX
CM Carboxymethyl –CH2–COO- WCX
DEA Diethylamine –NH(CH2–CH3)2+ WAX
DEAE Diethylaminoethyl –CH2–CH2–NH(CH2–CH3)2+ WAX
DMAE Dimethylaminoethanol –O–CH2–CH2–NH(CH3)2+ WAX
PEI Polyethyleneimine –(NH–CH2–CH2–)n–NH3+ WAX
QA Quaternary amine –NR3+ (R :CH3) SAX
QAE Quaternary aminoethyl –CH2–CH2–N(CH2–CH3)3+ SAX
SA Sulphonic acid –SO3- SCX
143
(a) cation exchanger ท�ไมแตกตวเปนไอออน(b) cation exchanger ท�แตกตวเปนไอออนท �งหมด(c) cation exchanger ท�แตกตวเปนไอออนบางสวน
(a)
(b)
(c)
144
Exchange capacity of a weak cation exchanger with pKa 4.2 (left) and
of a weak anion exchanger with pKa 9.0 (right).
25
145
ส�งท�มผลทาใหเรซนมความประพฤตตางกน
1. ขนาดของเรซน
2. Degree of cross – linking
3. Strength of functional group
4. Number of functional group
146
1. ขนาดของเรซน มผลตออตราเรวในการแลกเปล�ยนไอออนและการซมผานของสารละลายออกจากคอลมน
2. Degree of cross – linking จะมผลทาใหเรซนมความแขง มการพองตว และมขนาดรตางๆ กน
3. Strength of functional group มผลตอคาสมประสทธ�ของการกระจายของไอออนระหวางเรซนกบสารละลาย
4. Number of functional group มผลทาใหเรซนมความจตางๆ กน
147
กฎการเลอก (Selectivity rules)
Ion Exchange Chromatography สามารถแยกไอออนหรอโมเลกลได เน�องจากประจไอออนหรอโมเลกลท�มประจตางกนจงใชเวลาอยในคอลมนตางกนท �งน�ข �นอยกบ
1. ชนดของเรซน
2. ชนดของหมฟงกชน
3. เฟสเคล�อนท�หรอตวอลท
148
ความสามารถดงดดระหวางเรซนกบไอออน สามารถคานวณไดจากกฎของคลอมบ
q(ion) คอ ประจของไอออน
q(resin) คอ ประจของไอออน
r คอ ระยะหางของประจท �งสอง
2sin
221
r
r
qqF
reion
149
1. ในสารละลายน�าท�มความเขมขนของไอออนต�าๆ ไอออนท�มประจสงกวาจะแลกเปล�ยนไอออนกบเรซนไดดกวา
2. ไอออนท�มประจเทากนในสารละลายน�าท�มความเขมขนต�า ไอออนท�ถกน�าไฮเดรทไดนอยกวาจะแลกเปล�ยนไอออนกบเรซนไดดกวา
3. เรซนท�มองศาเช�อมโยงตางกน จะทาใหเกดการเลอกได
4. ความเขมขนสงๆ ความแตกตางของการเลอกไอออนท�มประจตางกนจะลดลง
สรปกฎเกณฑสาหรบควบคมการประพฤต
ของไอออนในการแลกเปล�ยนของเรซนดงน�
150
5. ไอออนของสารอนทรยท�มน�าหนกโมเลกลสงๆ หรอสารประกอบเชงชอนของโลหะตางๆ ท�เปนแอนไอออนสามารถแลกเปล�ยนไอออนไดด
6. ท�อณหภมสงๆ ในสารละลายท�ไมใชน�าหรอสารละลายท�มความเขมขนสงๆ การแลกเปล�ยนไอออนท�มประจเหมอนกนไมเพ�มข�นเม�อเพ�มอะตอมมกนมเบอร
26
151แผนภาพแสดงเคร�องมอสาหรบเทคนคไอออนโครมาโทกราฟ
Mobile phase
reservoir
pump Injector
Separatingcolumn
Stripping column
ConductivitydetectorReadout
152
การประยกตใชงาน
153
Separation of lanthanides by cation exchange. (Reproduced bypermission of Vieweg Publishing from A. Mazzucotelli, A. Dadone, R. Frache and F. Baffi, Chromatographia, 15, 697 (1982).) Conditions: column, 25cm4mm i.d.; stationary phase, Partisil SCX, 10 mm; mobile phase, 1.2 ml min-1 2-hydroxyisobutyric acid in water, gradient from 0.03 to 0.07 M; visible-range detector, 520nm, after derivatization with 4-(pyridylazo)-resorcinol.
154
• Separation of nucleotides and related compounds by anion exchange. (Reproduced by permission of Vieweg Publishing from D. Perrett, Chromatographia,16, 211 (1982).)
• Conditions: stationary phase, APS-Hypersil, 5 mm; mobile phase, A=0.04M KH2PO4 (pH 2.9), B=0.5M KH2PO4 +0.8M KCl (pH 2.9), linear gradient from A to B in 13 min; UV detector, 254 nm