CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y ESTUDIOS … · 2012-10-30 · centro de investigaciÓn y estudios avanzados del instituto politÉcnico nacional unidad de biotecnologÍa e ingenierÍa

CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y ESTUDIOS AVANZADOS

DEL INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

UNIDAD DE BIOTECNOLOGÍA E INGENIERÍA GENÉTICA DE PLANTAS

DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGÍA Y BIOQUÍMICA

CAMPUS GUANAJUATO

Caracterización molecular de fructanos en Agave y Dasylirion spp.,

identificación de fructosiltransferasas y su expresión en Pichia pastoris

T E S I S

QUE PRESENTA

M.C. Norma Alejandra Mancilla Margalli

COMO REQUISITO PARCIAL PARA OBTENER EL GRADO DE

DOCTOR EN CIENCIAS

EN LA ESPECIALIDAD DE BIOTECNOLOGÍA DE PLANTAS

Irapuato, Guanajuato, México, 2006

ii

Este trabajo titulado Caracterización molecular de fructanos en Agave y Dasylirion spp.,

identificación de fructosiltransferasas y su expresión en Pichia pastoris fue realizado en el

Laboratorio de Química de Productos Naturales del Departamento de Biotecnología y Bioquímica

del Centro de Investigación y de Estudios Avanzados Campus Guanajuato, bajo la asesoría de la

Dra. Mercedes G. López.

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AGRADECIMIENTOS

A la Dra. Mercedes G. López, por su asesoría, por e y especialmente por su inmensurable apoyo

(científico, moral y económico). Oportuno que dirigió el

A los sinodales Dr. Luis E. González de la Vara, Dr. John Paul Délano F, Dra. Ana Paulina Barba

de la Rosa y Dr. Edgar Quero Gutiérrez, por sus valiosas aportaciones que enriquecieron el

presente trabajo.

Al CONACyT, por apostarle a la ciencia y ayudar económicamente a estudiantes que desean un

México competitivo.

A todo el personal del Cinvestav-Guanajuato, al área administrativa (Dora Elia Anguiano), de

intendencia (Daniel y Bertha) y de biblioteca (Mary Carmen Ruíz) por su trato amable y su trabajo

siempre oportuno y eficiente.

Al Prof. Sjef Smeekens, de la Universidad de Utrecht, Holanda, por brindarme amablemente la

oportunidad de explorar en su laboratorio un campo científico nuevo para mí.

A Tita Ritsema por sus finas atenciones y la paciencia con la que compartió y dirigió parte de este

trabajo.

Al Gobierno de los Países Bajos por el otorgamiento de la Beca Huygens que me permitió realizar

una estancia doctoral en la Universidad de Utrecht.

Al CONACyT por el otorgamiento de una beca mixta, que sin lugar a dudas, fue de bastante

provecho para la calidad de la presente investigación.

A la Dra. Petra Mischnick de la Universidad Técnica de Braunschweig, Alemania, por su apoyo y

asesoría en la química de carbohidratos.

iv

A la Dra. Ana Paulina Barba de la Rosa del Instituto Potosino de Investigaciones Científicas y

Tecnológicas, por la oportunidad de hacer mil intentos en su laboratorio.

A mis amigos del laboratorio: Lulú Macías, Blanca Aguilar, María Luisa Martínez, Tere Carrillo,

Isadora Jiménez, Octavio Carrillo, Claudia y Judith Urias, por su apoyo y entusiasmo contagiante.

A Tita Ritsema, Auke Verhaar, Fatima Rahmani, Anja van Dijken, Marcel Proveniers, Jolanda

Schuurmas, Anika Wiese, Henriette Schluepmann y Bas Dekkers, por su hospitalidad, por

mostrarme las maravillas de su país y por hacerme sentir como en casa en un lugar con una

cultura diferente

A mis cubanos Lázaro Hernández, Yanetsi Borroto, Yanet Tambara, José Angel y Rolando, porque

su hermandad y cariño me han servido de soporte.

A mis amigos de siempre Lorena, Jimmy, Isis, Pedro y Lulú, por su longeva amistad.

A mis papás, José Trinidad y Norma Ofelia, por su gran cariño y apoyo incondicional.

A mis hermanos, Popo, Pity, Betito y Kiko, por toda la vida recorrida.

A mi esposo, Juan, por todo su amor y por los momentos compartidos.

A mis abuelitos, tíos y primos.

A la pequeña Ana y Caellou, por llenar de alegría nuestras vidas.

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ÍNDICE Página

I. RESUMEN 1 II. INTRODUCCIÓN 2 III. OBJETIVOS 5 IV. ANTECEDENTES

AGAVES Y DASYLIRION 1.1. Clasificación taxonómica 6 1.1.1. Agavaceae 7 1.1.2. Nolinaceae 8 1.2. Distribución 10 1.3. Descripción de los géneros y características delimitantes de las familias Agavaceae y Nolinaceae 13 1.3.1. Agave 14 1.3.1.1. Agave tequilana Weber var. azul 15 1.3.1.2. Agave angustifolia Haworth 15 1.3.1.3. Agave potatorum Zuccarini 16 1.3.1.4. Agave cantala 16 1.3.1.5. Agave fourcroydes 16 1.3.2. Dasylirion 17 1.4. Importancia económica y científica

1.4.1. Usos tradicionales 18 1.4.2. Usos ornamentales 18 1.4.3. Obtención de fibras naturales 18 1.4.4. Obtención y caracterización de fitoquímicos 19 1.4.5. Elaboración de bebidas alcohólicas 19 1.4.5.1. Bebidas fermentadas 20 1.4.5.2. Bebidas destiladas 20 1.4.6. Elaboración de edulcorantes fructosados 22 1.4.7. Utilización del bagazo 22 1.4.8. Propagación in vitro 24

1.5. Influencia de la zona geográfica en los agaves 25 1.6. Adaptación de los agaves 29

1.6.1. Adaptación morfológica 30 1.6.1. 1. Hojas 30 1.6.1.2. Raíces 31 1.6.1.3. Tallo 33 1.6.2. Adaptación fisiológica 33 1.6.2.1. Metabolismo ácido de las crassulaceas (CAM) 33 1.6.2.2. Bioquímica del metabolismo ácido de las crassulaceas (CAM) 34 1.6.2.3. Acumulación de fructanos 39 FRUCTANOS 2.1. Estructura 40 2.1.1. Métodos analíticos 43 2.1.2. Especificidad estructural 44 2.2. Metabolismo 45

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2.2.1. Complejidad metabólica 50 2.2.2. Caracterización bioquímica 50 2.2.3. Caracterización molecular 55 2.2.4. Familia GH32 57 2.3. Fisiología de los fructanos 60 2.3.1. Carbohidratos de reserva 60 2.3.2. Desarrollo vegetal 60 2.3.3. Defoliación 62 2.3.4. Descarga apoplástica 64 2.3.5. Ajuste osmótico 64 2.3.6. Tolerancia al frío 64 2.3.7. Tolerancia a sequía 67 2.3.8. Defensa contra patógenos 69 2.4. Potencial biotecnológico de los fructanos 71

V. JUSTIFICACIÓN 73 VI. HIPÓTESIS 73 VII. MATERIALES Y MÉTODOS 74

A) Material Biológico 1. Regiones 74 2. Edad 74 3. Muestreo 74 B) Metodología 1. Comparación y caracterización estructural de carbohidratos de almacén en agaves y dasylirion 1.1. Determinación espectrofotométrica 1.1.1. Extracción de carbohidratos totales 77 1.1.2. Determinación de carbohidratos totales 77 1.1.3. Determinación de D-glucosa, D-fructosa y sacarosa 77 1.1.4. Determinación de fructanos 79 1.1.5. Determinación de almidón 81 1.2. Extracción de fructanos 82 1.3. Caracterización de fructanos 1.3.1. Cromatografía en capa fina 82 1.3.2. Cromatografía líquida de alta resolución 83 1.3.3. Derivatización de fructanos a alditol acetatos parcialmente metilados 84 1.4. Caracterización de fructanos de Agave tequilana 88 1.4.1. Espectrometría de masas por ionización/desorción por láser asistida por una matriz-tiempo de vuelo (MALDI-TOF-MS) 88 1.4.2. Resonancia magnética nuclear de carbono 13 88 1.4.3. Resonancia magnética nuclear de protón 89 2. Identificación de actividades enzimáticas involucradas en el metabolismo de

fructanos 2.1. Extracción de proteínas 89 2.2. Estrategias de purificación 89 2.2.1. Cromatografía de afinidad 90 2.2.2. Cromatografía de intercambio aniónico 90

vii

2.2.3. Cromatografía de hidroxiapatita 91 2.2.4. Cromatografía de exclusión en gel 91 2.3. Cuantificación de proteínas 92 2.4. Ensayos enzimáticos 92 2.5. Separación electroforética 92 3. Identificación y aislamiento de secuencias codificantes de enzimas del

metabolismo de fructanos de agave y su expresión en Pichia pastoris 3.1. Aislamiento e identificación de secuencias codificantes 3.1.1. Extracción de ácido ribonucleico (ARN) 93 3.1.2. Geles de agarosa 94 3.1.3. Electroforesis en “microchip” 94 3.2. Obtención de secuencias complementarias por transcripción reversa 95 3.2.1. Diseño de oligonucleótidos iniciadores 95 3.2.2. Amplificación de secuencias complementarias 95 3.2.3. Elución y purificación de ácido desoxiribonucleico (ADN) a partir de bandas de agarosa 97 3.2.4. Preparación de células competentes 97 3.2.5. Clonación y transformación 99 3.2.6. Purificación de plásmidos 99 3.2.7. Confirmación de la secuencia en el plásmido 101 3.2.8. Identificación de las secuencias 101 3.3. Aislamiento de ADNc completo de la secuencia 101 3.3.1. Amplificación rápida del extremo 5´ del ADN complementario (5´-RACE) 102 3.3.2. Amplificación rápida del extremo 3´ del ADN complementario (3´-RACE) 104 3.3.3. Ligación y clonación del ADNc completo 104 3.4. Expresión en Pichia pastoris 104 3.4.1. Eliminación del péptido señal y secuencia de terminación 106 3.4.2. Propagación del vector 106 3.4.3. Transformación de Pichia pastoris y análisis de expresión 107

VIII. RESULTADOS 1. Comparación y caracterización estructural de carbohidratos de almacén en agaves y dasylirion 1.1. Patrón de carbohidratos no estructurales 108 1.2. Factores ontogénicos 109 1.3. Influencia del ambiente en el patrón de carbohidratos no estructurales 110 1.4. Función de los fructanos en la sequía 113 1.5. Presencia de almidón 114 1.6. Perfil cromatográfico de fructanos 1.6.1. Cromatografía en capa fina 116 1.6.2. Cromatografía líquida de alta resolución 118 1.7. Análisis de enlaces por derivatización 121 1.7.1. Cuantificación de los glicosil-derivados 126 1.7.2. Significancia de la diversidad estructural de fructanos 129 1.8. Caracterización de fructanos de A. tequilana 130 1.8.1. Espectrometría de masas por ionización/desorción por láser asistida por una matriz-tiempo de vuelo (MALDI-TOF-MS) 130 1.8.2. Resonancia magnética nuclear de carbono 13 130

viii

1.8.3. Resonancia magnética nuclear de protón 135 1.9. Estructuras propuestas para fructanos en Agave y Dasylirion 138 1.10. Posibles implicaciones de la presencia de fructanos en agaves y dasylirion 139

2. Identificación de actividades metabólicas involucradas en el metabolismo de fructanos de agave y dasylirion 2.1. Estrategia Cromatográfica I 141 2.1.1. Cromatografía de afinidad 141 2.1.2. Cromatografía de intercambio aniónico 143 2.1.3. Cromatografía de hidroxiapatita 145 2.1.4. Cromatografía de exclusión en gel 148 2.1.5. Identificación putativa de enzimas involucradas en el metabolismo de fructanos 149 2.2. Estrategia Cromatográfica II 151 2.2.1. Extracto crudo 151 2.2.2. Cromatografía de intercambio aniónico 155 2.2.3. Cromatografía de afinidad 160 2.2.4. Actividades fructosiltransferasas identificadas en agaves y dasylirion 161 3. Aislamiento e identificación de secuencias codificantes de enzimas del metabolismo de fructanos de agave y su expresión en Pichia pastoris 3.1. Extracción de ácido ribonucleico 163 3.2. Amplificación de fragmentos de ácido desoxiribonucleico complementario (ADNc) a través de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) 163 3.3. Identidad de los fragmentos amplificados 165 3.4. Amplificación del ADNc completo de la fructosiltransferasa de Agave tequilana (atft) 3.4.1. Amplificación de los extremos terminales 3´ y 5´ 172 3.4.2. Determinación de la orientación de los insertos en el vector 174 3.4.3. Ligación del ADNc completo de atft 176 3.5. Análisis de la secuencia atft 178 3.5.1. Uso de codones del ADNc de atft 180 3.5.2. Identificación de la proteína madura 180 3.5.3. Glicosilhidrolasa 32 186 3.6. Expresión heteróloga de atft 188 3.6.1. Construcción del vector pGAPZαC-atft 188 3.6.2. Análisis de expresión 189 3.6.3. Identidad de la AtFT 192 IX. CONCLUSIONES 195 X. PERSPECTIVAS 196 XI. APÉNDICES A.- Preparación de soluciones 198 B.- Análisis de fragmentación de alditol acetatos parcialmente metilados (PMAA) 200 C.- Desplazamientos químicos de 13C-fructanos 207 D.- Secuencias aisladas 212 XII. REFERENCIAS 217

ix

ÍNDICE DE FIGURAS Página Figura 1. Mayahuel 6 Figura 2. Clasificación taxonómica de Agave y Dasylirion 8 Figura 3. Características morfológicas de miembros de la familia Agavaceae y Nolinaceae 11 Figura 4. Distribución de las familias Agavaceae y Nolinaceae 12 Figura 5. Edulcorante fructosado Naturel 23 Figura 6. Influencia de factores abióticos en la asimilación de CO2 en A. lechuguilla 26 Figura 7. Influencia de la temperatura en la asimilación de CO2 en A. tequilana 27 Figura 8. Áreas óptimas, subóptimas y marginales para el cultivo de A. tequilana en Jalisco 28 Figura 9. Cambios en la velocidad de respiración durante sequía en raíces de lluvia y

establecidas en A. deserti 32 Figura 10. Diferencia de temperatura entre el área foliar (de maíz o agave) y el aire circundante 33 Figura 11. Metabolismo ácido de las crassulaceas 35 Figura 12. Estrategias de flujo de carbono propuestas para especies CAM 38 Figura 13. Unidades estructurales de los fructanos 42 Figura 14. Rango de grados de polimerización (DP) en especies que acumulan fructanos 45 Figura 15. Diferentes vías biosintéticas de fructanos en plantas superiores 48 Figura 16. Regulación de la actividad de fructosiltransferasas 54 Figura 17. Alineamiento de proteínas pertenecientes a las familias GH32 y G68 57 Figura 18. Mecanismos catalíticos de las glicosilhidrolasas 59 Figura 19. Papel de las fructosiltransferasas en el desarrollo de plantas superiores 61 Figura 20. Efecto de la defoliación en el metabolismo de fructanos 63 Figura 21. Metabolismo de fructanos en Avena sativa bajo estrés por frío 66 Figura 22. Fructanos en estrés por sequía 68 Figura 23. Modelo propuesto de la participación de fructanos en la resistencia a patógenos 70 Figura 24. Esquema general de trabajo 76 Figura 25. Programa de elución utilizado en la separación cromatográfica de fructanos de Agave y Dasylirion 83 Figura 26. Metodología de derivatización de carbohidratos a PMAA 85 Figura 27. Diseño de oligonucleótidos degenerados 98 Figura 28. Vector pGEM-T Easy 100 Figura 29. Amplificación de los extremos de ADNc mediado por ARN ligasa (RLM-RACE) 102 Figura 30. Mapa del vector pGAPZαC 105 Figura 31. Contenido de carbohidratos no estructurales solubles 109 Figura 32. Presencia de almidón en especies de Agave y Dasylirion 115 Figura 33. Cromatografía en capa fina de fructanos de Agave y Dasylirion 117 Figura 34. Perfil cromatográfico (HPAEC-PAD) de fructanos de agave comparados con fructanos de achicoria (tipo inulina) y cebolla (neofructanos) 119 Figura 35. Perfil de elusión, utilizando cromatografía de gases, de fructanos de Agave y Dasylirion derivatizados a alditol acetatos parcialmente metilados 122 Figura 36. Comparación de fructanos derivatizados en tres especies vegetales 123 Figura 37. Cuantificación de los glicosil-derivados en fructanos de las especies analizadas 127 Figura 38. Espectro de masas MALDI-TOF-MS de fructanos de A. tequilana 131 Figura 39. Espectro de 13C-RMN de fructanos de A. tequilana 131 Figura 40. Espectros de 13C-RMN de fructanos en Asparagales 135 Figura 41. Espectro de 1H-RMN de sacarosa y fructanos de Dahilia variabilis y Agave tequilana 136 Figura 42. Estructuras propuestas para fructanos presentes en Agave y Dasylirion 139 Figura 43. Cromatografía de afinidad a concanavalina A 142

x

Figura 44. Cromatografía de intercambio aniónico 144 Figura 45. Cromatografía de hidroxiapatita 146 Figura 46. Cromatografía de exclusión en gel 148 Figura 47. Electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante 150 Figura 48. Perfil cromatográfico de fructanos sintetizados por el extracto crudo de A. potatorum 152 Figura 49. Cromatografía de intercambio aniónico 156 Figura 50. Actividades hidrolíticas de la fracción Q0 157 Figura 51. Perfil cromatográfico de productos del ensayo enzimático de las fracciones de intercambio aniónico de A. potatorum 158 Figura 52. Productos de la acción enzimática de las fracciones afines a concanavalina A 160 Figura 53. Modelo propuesto para la biosíntesis de fructanos en Agave y Dasylirion 162 Figura 54. Extracción de ARN 164 Figura 55. Amplificación de fragmentos con oligonucleótidos degenerados 165 Figura 56. Análisis de restricción de productos amplificados con oligonucleótidos degenerados 166 Figura 57. Dendograma de secuencias alineadas de fructosiltransferasas 168 Figura 58. Alineamiento de los fragmentos amplificados de A. tequilana con enzimas

relacionadas al metabolismo de fructanos 170 Figura 59. Amplificación rápida de los extremos del DNAc de atft mediado por la ARN ligasa 173 Figura 60. Orientación de los insertos At5´- y At3´-RACE en el vector pGEM-T Easy 175 Figura 61. Estrategia de clonación para la obtención del plásmido pGEM T-atft 177 Figura 62. Digestión y análisis de restricción 178 Figura 63. Árbol filogenético sin raíz de enzimas del metabolismo de fructanos 179 Figura 64. Predicción del péptido señal en AtFT 182 Figura 65. Alineamiento de AtFT con Inv-V y FT 184 Figura 66. Perfil cromatográfico de productos generados de AtFT excretada al medio

Extracelular 190 Figura 67. Perfil cromatográfico de los productos generados de AtFT contenida en la fracción

celular 192

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ÍNDICE DE TABLAS

Página Tabla 1. Clasificación de subgéneros y grupos de Agave 9 Tabla 2. Composición del aguamiel y pulque 21 Tabla 3. Productividad anual de agaves y otras plantas CAM 25 Tabla 4. Rangos de temperatura para el cultivo de A. tequilana en Jalisco 29 Tabla 5. Tolerancia de agaves y dasylirion a frío extremo 29 Tabla 6. Susceptibilidad a la cavitación de A. tequilana y A. deserti sometidos a sequía 31 Tabla 7. Comparación de parámetros fisiológicos de Zea mays y Agave americana 34 Tabla 8. Clasificación taxonómica y comportamiento CAM de algunas especies estudiadas 37 Tabla 9. Ocurrencia de fructanos en Angiospermas 41 Tabla 10. Predominancia estructural de fructanos según la especie 46 Tabla 11. Propiedades cinéticas de distintas fructosiltransferasas 51 Tabla 12. Muestreo de especies de Agave y Dasylirion 75 Tabla 13. Determinación enzimática de D-glucosa, D-fructosa y sacarosa 78 Tabla 14. Secuencia de los oligonucleótidos utilizados 96 Tabla 15. Identificación de fructanos eluídos en un sistema cromatográfico intercambio aniónico de alta resolución (HPAEC-PAD) 120 Tabla 16. PMAA en fructanos de Agave y Dasylirion spp., Dahlia variabilis y Allium cepa 125 Tabla 17. Contribución relativa de compuestos derivatizados en los fructanos 128 Tabla 18. Correlación entre diferentes compuestos derivatizados 128 Tabla 19. Desplazamientos químicos de 13C-RMN de fructanos 133 Tabla 20. Desplazamientos químicos de 1H-RMN de fructanos 137 Tabla 21. Calibración de la columna de exclusión y estimación de pesos moleculares de las

fracciones proteínicas 149 Tabla 22. Productos formados en los bioensayos con fracciones Q y usando sacarosa o 1-

kestotriosa como sustrato 153 Tabla 23. Secuencias de enzimas relacionadas al metabolismo de fructanos 167 Tabla 24. Uso de codones en el ADNc de atft 181

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ABREVIATURAS UTILIZADAS DEPC Dietil pirocarbonato d.i. Diámetro interno dATP Adenosin desoxitrifosfato dCTP Citocin desoxitrifosfato dGTP Guanidin desoxitrifosfato DMSO Dimetil sulfóxido dNTP Mezcla de dATP, dCTP, dGTP y dTTP dTTP Tiamin desoxitrifosfatos DTT Ditiotreitol e.r.c. Respuesta efectiva de carbono (effective response of carbon) EPI Índice productivo ambiental (environmental productive index) FOS Fructo-oligosacáridos GC-FID Cromatografía de gases acoplado a detector de ionización en flama (gas

chromatography coupled to flame ionization detector) GC-MS Cromatografía de gases acoplado a espectrometría de masas (gas

chromatography coupled to mass spectrometry) GH Glicosilhidrolasa HPAEC-PAD Cromatografía de intercambio aniónico de alta resolución acoplado a detector de

pulso amperométrico (high performance anionic exchange chromatography-pulse amperometric detector)

HPLC Cromatografía líquida de alta resolución (high performance liquid chromatography) Inv-CW Invertasa de pared celular (invertase-cell wall) Inv-V Invertasa vacuolar IOS Inulo-oligosacáridos KD Coeficiente de distribución de la masa molecular Kh Conductividad hidráulica 1-KES 1-Kestotriosa (O-α-D-Glcp-(1-2)-O-β-D-Fruf-(2-1)-β-D-Fruf) 6-Kes 6-Kestotriosa (O-α-D-Glcp-(1-2)-O-β-D-Fruf-(6-2)-β-D-Fruf) 6G-Kes 6-Glucosa-kestotriosa o neokestosa (O-β-D-Fruf-(2-6)-O-α-D-Glcp-(1-2)-β-D-Fruf) 6-KES 6-Kestosa exohidrolasa PAHBAH Hidracida del ácido p-hidroxibenzoico PAR Radiación fotosintéticamente activa (photosynthetically active radiation) PCR Reacción en cadena de la polimerasa (polymerase chain reaction) PH “Process hardiness” PMAA Alditol acetato parcialmente metilado (partially methylated alditol acetate) RMN Resonancia magnética nuclear

TAE Buffer Tris-HCl 40 mM, ácido acético 20 mM, EDTA 1mM TE Buffer Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8.0. TFA Ácido trifluoroacético (Trifluoroacetic Acid) TLC Cromatografía en capa fina (thin layer chromatography)

1

I. RESUMEN

Los agaves son parte del 15% de plantas superiores que almacenan fructanos, polímeros de

fructosa sintetizados a partir de la acumulación de sacarosa en la vacuola. Existen cinco tipos

estructurales de fructanos, según la manera en que los residuos β-D-fructofuranosa son

transferidos por las fructosiltransferasas, enzimas involucradas en su metabolismo. La

acumulación de algún tipo de fructanos parece depender de la especie, y la presencia de éstos se

sugiere importante en la tolerancia a distintos tipos de estrés abiótico.

En el presente trabajo se caracterizó la estructura de fructanos y se comparó el patrón de

carbohidratos no estructurales en varias especies de agave, crecidas en distintas regiones

climáticas; incluyendo, además, a Dasylirion spp., una especie poco estudiada pero morfológica y

taxonómicamente relacionada con los agaves. El contenido de fructanos en los tallos de agave

fue superior al 60% (peso seco) y dasylirion acumuló solo el 17%; mientras que, el almidón en

estas especies no representó más del 2%. Las diferencias entre especies fueron cuantitativas más

que cualitativas, encontrándose una correlación de la concentración de fructanos y aquellos

involucrados en su metabolismo (fructosa, glucosa, sacarosa) con las condiciones ambientales

donde estas plantas fueron colectadas (por ejemplo, más fructosa en plantas colectadas en

regiones áridas). La diversidad de fructanos fue evidenciada por técnicas cromatográficas (TLC,

HPAEC-PAD) y espectroscópicas de alta resolución (NMR, MALDI-TOF-MS), que permitieron

proponer estructuras complejas, hasta ahora no reportadas, que hemos denominado “agavinas”.

La diversidad estructural coincidió perfectamente con las diferentes actividades fructosiltransferasa

identificadas en un extracto proteínico de Agave tequilana, que utilizando sacarosa como único

sustrato, produjo un perfil de fructanos semejante a lo observado in vivo. A través de distintos

pasos cromatográficos se llegó a un enriquecimiento de la actividad de enzimas involucradas en

el metabolismo de fructanos en agaves.

Finalmente, se aisló un ADNc de Agave tequilana con una mayor homología a la enzima

fructan:fructan-6-glucosa-fructosiltransferasa (6G-FFT) reportada en espárrago y cebolla; sin

embargo, su expresión en el sistema de expresión de Pichia pastoris, evidenció una principal

actividad de 1-fructan:fructan fructosiltransferasa (1-FFT). Éste constituye el primer ADNc aislado

en la importante familia Agavaceae y el primer 1-FFT del orden Asparagales.

2

II. INTRODUCCIÓN

Los fructanos son carbohidratos de reserva sintetizados por solo el 15% de las plantas superiores,

y aunque han sido tópico de investigación desde hace 200 años aproximadamente, hay aspectos

estructurales, fisiológicos y evolutivos que aún faltan por ser elucidados. La presencia de fructanos

en agaves es reportada desde la década de los años 50 y 70; sin embargo, estos estudios son

limitados a Agave vera cruz, una especie que crece en la región de Asia y actualmente está casi

extinta. Solo recientemente, la investigación de fructanos en agave ha resurgido, enfocándose

principalmente a Agave tequilana, especie de gran relevancia industrial en nuestro país, debido a

que la hidrólisis de sus fructanos constituye el sustrato fermentable en la producción de tequila.

Los fructanos son polímeros de fructosa que se sintetizan en la vacuola como respuesta a una

acumulación de sacarosa en este organelo. Las fructosiltransferasas (FT), enzimas que participan

en su metabolismo, adicionan residuos de β-D-fructofuranosa a una unidad de sacarosa utilizada

como aceptor inicial. Los cinco tipos estructurales de fructanos descritos hasta ahora, son

resultado de las distintas formas en que las diversas enzimas transfieren los residuos de fructosa.

La 1-sacarosa:sacarosa-fructosiltransferasa (1-SST), es la enzima inicial que transfiere una unidad

de fructosa de una molécula de sacarosa a otra. La 1-kestotriosa así formada (G-F-F), es el

metabolito central utilizado por las demás FT en la síntesis de fructanos superiores. La 1-

fructan:fructan-fructosil-transferasa (1-FFT) elonga el polímero mediante enlaces β(2-1),

generando el fructano conocido como inulina; la 6-SFT sintetiza levanos, esto es, polímeros

lineales con enlaces β(2-6) o introduce este tipo de enlace en una molécula de inulina existente,

produciendo los graminanos o fructanos ramificados; por su parte, la fructan:fructan-6-glucosa-

fructosiltransferasa (6G-FFT) transfiere residuos de fructosa al carbono 6 de la glucosa, generando

los denominados neofructanos (inulina- o levano-neoserie, dependiendo del enlace),

caracterizados por tener una unidad de glucosa entre dos moléculas de fructosa. Finalmente, en el

metabolismo de estas biomoléculas, además participan la fructan exohidrolasa (FEH) y la

invertasa vacuolar (Inv-V). La primera enzima degrada los polímeros hidrolizando la fructosa

localizada en un extremo; mientras que el papel de la Inv-V es controversial en el análisis

metabólico de estos carbohidratos, ya que es capaz de sintetizar o hidrolizar algunos fructanos

dependiendo de las condiciones de reacción.

3

La acumulación de un tipo específico de fructanos parece seguir un patrón que depende de la

especie, por lo que se ha sugerido que la determinación estructural de fructanos puede utilizarse

como criterio adicional en la clasificación taxonómica de las especies. Por otra parte, aunque no

hay un mecanismo completamente entendido, existen evidencias experimentales que sugieren la

importancia de los fructanos en la tolerancia de algunas especies a distintos tipos de estrés

abiótico, como sequía, frío o salinidad, o en una mayor resistencia contra organismos patógenos,

como los hongos Thyphula incarnata, T. ishikariensis y Microdochimm nivale.

Las implicaciones evolutivas de los fructanos y de su diversidad estructural están lejos de ser

claras; sin embargo, algunos autores coinciden que la disponibilidad limitada de agua, fue el

principal factor climático que dio origen a las plantas que acumulan este tipo de carbohidratos. El

orden Asparagales, donde se incluye a las familias Agavaceae y Nolinaceae, contiene especies

sintetizadoras de fructanos ampliamente distribuidas en distintos ecosistemas. Este orden no es

considerado altamente evolucionado, como los demás órdenes que almacenan fructanos.

Adicionalmente, los restos más antiguos de plantas que sintetizan estos polímeros, corresponden

a una flora que parece ser el ancestro de los agaves actuales.

La sorprendente capacidad de los agaves para desarrollarse en ambientes hostiles, además de las

características morfológicas (hojas suculentas) y fisiológicas (metabolismo CAM) especializadas

para la supervivencia en condiciones de sequía, permite la especulación de que el metabolismo

de fructanos pudo haber sido un factor adicional importante en la adaptación de la flora ancestral,

y que actualmente sigue jugando un papel destacado en el desarrollo de los agaves en ambientes

áridos, caracterizados por una limitación importante de agua.

En el intento de lograr un mejor entendimiento de la fisiología de los fructanos y su implicación en

el mecanismo de tolerancia al estrés abiótico de la sequía en agaves, en el presente trabajo se

determinaron las características estructurales de los fructanos almacenados por cinco especies de

agave crecidas en distintas regiones geográficas de la República Mexicana, con la finalidad de

encontrar una posible correlación entre la concentración y tipo de fructanos con las características

climáticas donde se establecen las especies estudiadas. Se incluyó además, especies silvestres

de Dasylirion (de la familia Nolinaceae), para buscar una posible distinción estructural debida a la

diferencia de géneros. De acuerdo a nuestro conocimiento, es la primera vez que la presencia y

caracterización de fructanos en Dasylirion spp. es analizada a profundidad. Así mismo, se

identificaron las principales actividades enzimáticas involucradas en la síntesis de fructanos y se

4

aisló el ADNc de una fructosiltransferasa, en el primer intento de encaminar las futuras

investigaciones al estudio de la regulación del metabolismo de fructanos en Agavaceae.

Un mejor conocimiento de la estructura de fructanos y la regulación de su metabolismo en Agave y

Dasylirion, pueden generar perspectivas en el conocimiento científico y en sus aplicaciones

biotecnológicas.

5

III. OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL

Caracterizar los fructanos presentes en especies de Agave y Dasylirion spp,, identificar las

principales enzimas involucradas en su metabolismo y aislar sus secuencias codificantes.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1. Caracterizar y comparar la estructura de carbohidratos de almacén en cinco especies de

Agave y Dasylirion spp. y correlacionarla con las características climáticas de las regiones

donde crecieron las plantas.

2. Identificar las principales actividades enzimáticas involucradas en el metabolismo de

fructanos en estas especies.

3. Aislar el ADNc de las principales enzimas involucradas en el metabolismo de fructanos de

Agave tequilana Weber var. azul.

6

IV. ANTECEDENTES

1.- AGAVES Y DASYLIRION

Los agaves y algunos miembros de la familia Nolinaceae, como Dasylirion spp., son plantas que

han acompañado al hombre a lo largo de su historia y evolución, desde los primeros pobladores

mesoamericanos hasta la actualidad. En tiempos prehispánicos, metl (agave en náhuatl, que

también incluye a Dasylirion y especies relacionadas, Gentry, 1998) fue considerado como un

regalo de los dioses, la primera planta que éstos habían creado y su importancia para estas

sociedades, es evidente en su legado de códices y pinturas rupestres, donde Mayahuel, la diosa

del agave, es fácilmente identificable por sus pencas, su inflorescencia estilizada y el espumoso

pulque sobre su cabello o en una vasija entre sus manos (Figura 1) (Gentry, 1998). Agave y

Dasylirion han sido cultivos claves, componentes primarios de productividad en virtualmente

cualquier tipo de zona agrícola, desde tierras altas, productivas y de alta humedad, hasta aquellas

zonas secas e infértiles donde en ocasiones son cultivos dominantes o exclusivos (Parsons y

Darling, 2000).

1.1. CLASIFICACIÓN TAXONÓMICA

Los miembros de las familias Agavaceae y Nolinaceae presentan un alto grado de convergencia

morfológica, lo que dificulta el estudio de su evolución y taxonomía (Eguiarte, 1995).

Figura 1. Mayahuel. Representación prehispánica de la deidad del agave. Mayahuel representa la fertilidad, una diosa que alimenta con sus 400 pechos a sus 400 hijos, todos ellos dioses de la embriaguez.

7

La divergencia evolutiva de los agaves parece haber sucedido hace 60 millones de años, durante

el Eoceno; mientras que la separación entre Agavaceae sensu stricto y Nolinaceae habrá ocurrido

hace 47 millones de años, se calcula que su dispersión fue hace 35 millones de años, y que sus

tallos y hojas suculentas son características más recientemente adquiridas (Eguiarte, 1995; Nobel,

1998).

1.1.1. AGAVACEAE

Carlos Linneo estableció el género Agave en 1753 describiendo cuatro especies: A. americana, A.

vivipara, A. foetida (ahora en el género Furchraea) y A. virginica (ahora en el género Manfreda)

(Gentry, 1998). La familia Agavaceae fue creada en 1836 por el botánico australiano Stephen

Endlicher incluyendo el género Agave y Furcraea. Richard A. Salisbury en 1866 dividió la familia

en dos secciones: agaves con ovario súpero donde el género Yucca estaba incluido y aquellos con

ovario ínfero, donde se incluyeron a los géneros Agavaea, Furcraea, Littaea, Manfreda y

Polianthes. Sin embargo, como lo manifestó en 1871 Joseph Hooker, la familia ha sido difícil de

clasificar, dada la amplia distribución, presencia de híbridos, tardanza de la emergencia floral (8-50

años) y variabilidad de estas especies dependiendo de la geografía y el clima (Peña-Álvarez et al.,

2004). Una discrepancia en la clasificación esta dada por la semejanza en la estructura floral,

propiedades de tejido y compuestos químicos con algunos miembros de la familia Amaryllidaceae

(sábila), Alliaceae (cebolla) y Asparagaceae (espárrago) (Nobel, 1998).

Actualmente, la clasificación reportada por Dahlgren, Clifford y Jeo (1985) es la más aceptada. En

un análisis de monocotiledóneas basado en el número cromosomal, análisis anatómico, químico,

biogeográfico y cladísitico, proponen al orden Asparagales con 30 familias, incluyendo Agavaceae,

Nolinaceae, Asparagaceae, Dracaenaceae, Alliaceae y Amarallidaceae (Figura 2). Describen a la

familia Agavaceae como restringida al continente americano y dividida en dos subfamilias:

Yuccoideae, con ovario súpero (Yucca y Hesperalöe) y Agavoideae con ovario ínfero (Agave,

Beschorneria, Furcraea, Manfreda, Polianthes y Prochnyanthes). Esta clasificación es apoyada por

análisis palinológicos y secuencias del ADN cloroplástico del gen rbcL (subunidad grande de la

Rubisco) (Ojeda y Ludlow, 1995; Eguiarte, 1995).

En la subfamilia Agavoideae, el género Agave es el más importante y fue dividido por Gentry

(1982) en dos subgéneros y grupos de acuerdo a su inflorescencia (Tabla 1): Littaea, con un

órgano floral espigado y Agave, cuya inflorescencia es paniculada y con ramificaciones (Figura 3).

8

1.1.2. NOLINACEAE

La familia Nolinaceae fue propuesta en 1936 por el botánico japonés Takenoshin Nakai, pero ésta

no fue aceptada hasta 1985, cuando Dahlgren y col. reconocieron dicha separación e incluyeron

en la familia Nolinaceae a los géneros Beaucarnea, Calibanus, Dasylirion y Nolina (Figura 2),

todos ellos con ovario súpero y al parecer, ésta es una familia de origen monofilético, actualmente

con 55 especies y 60 taxa.

DIVISIÓN Angisoperma CLASE Liliopsida Magnoliopsida (Monocotiledonae) (Dicotiledonae) ÓRDEN Asparagales Otros órdenes FAMILIA Agavaceae Nolinaceae Otras 28 familias* SUBFAMILIA Agavoideae Yuccoideae GÉNERO Beschorneria Yucca Beucarnea Furcraea Hesperalöe Calibanus Manfreda Nolina Polianthes Dasylirion Prochynathes Agave SUBGÉNERO Littaea (8 secciones) Agave (12 secciones) Figura 2. Clasificación taxonómica de Agave y Dasylirion. Clasificación propuesta por Dahlgren, Clifford y Jeo en 1995. *Alliaceae, Amaryllidaceae, Anthericaceae, Aphyllanthaceae, Asparagaceae, Asphodelaceae, Asteliaceae, Blandfordiaceae, Calectasiaceae, Convallariaceae, Cyanastraceae, Dasypogonaceae, Dracaenaceae, Doryanthaceae, Eriospermaceae, Funkiaceae, Hanguanaceae, Hemerocallidaceae, Herreriaceae, Hyacinthaceae, Hypoxidaceae, Ixioliriaceae, Luzuriagaceae, Philesaciae, Phormiaceae, Ruscaceae, Tecophilaeaceae, Xanthorrhoeaceae.

9

Tabla 1. Clasificación de subgéneros y grupos de Agave. Subgénero Grupos Características No.

especies Ejemplos

Littaea Amolae* acaulescentes 8 attenuata, bakeri, pedunculifera, chrysoglossa, ocahui, vilmoriniana, yuccaefolia

Choritepalae* especies pequeñas, tepalos separados

3 bracteosa, ellemeetiana, guiengola

Filiferae* hojas largas filíferas, limitados a la Sierra Madre Occidental

7 colimana, felgeri, filifera, geminiflora, multifilifera, ornithobroma, schidigera

Marginatae pequeñas flores, largos tepalos

21 albomarginata, ensifera, ghiesbreghtii, horrida, kerchovei, lechuguilla, lophanta, pelona, pumilla

Parviflorae pequeñas flores altamente especializada alto contenido de sapogeninas

4

parviflora, polianthiflora, schotti, toumeyana

Polycephalae* hojas y flores de suave suculencia, dientes pequeños

5 celsii, chiapensis, pendula, polyacantha, warelliana

Striatae* hojas aserradas, flores y tepalos pequeños

3 dasyliroides, striata, stricta

Urcerolate tamaño pequeño, flores pequeñas en forma de urna

2 arizonica, utahensis

Agave Americanae flores amarillas de pedicelo largo

6 americana, franzosini, lurida, oroensis, scabra, scaposa

Campaniflorae* rosetas cortas, hojas largas verdes

3 aurea, capensis, promontorii

Crenatae márgenes mamilados, panícula estrecha

7 bovicornuta, calodonta, cupreata, hookeri, inaequidens, jaiboli, maximiliana

Deserticolae hojas rígidas fibrosas, lanceoladas, y dientes débiles, panícula delgada

10 avellanidensis, cerulata, deserti, gigantensis, margaritae, mckelveyana, moranni, sobria

Ditepalae panícula abierta, tepalos cortos dimórficos

10 applanata, chrysantha, colorata, flexispina, fortiflora, murpheyi, palmeri

Hiemiflorae flores agrupadas en forma esférica en una panícula delgada

12 atrovirens, congesta, hiemiflora, hurteri, lagunae, pachycentra, potatorum

10

Marmoratae* pocas hojas escabrosas, espina pequeña

4 gypsophila, marmorata, nayaritensis, zebra

Parryanae roseta globosa, compacta, hojas cortas, anchas, dientes conspicuos hacia la hoja

6 gracilipes, guadalajarana, havardiana, neomexicana, parrasana, parryi

Rigidade hojas delgadas rígidas, dispuestas en espiral, bracteas pequeñas, abiertas poco ramificadas

12 aktites, angustifolia, cantala, fourcroydes karwinskii, macroacantha, tequilana

Salmianae largas rosetas verdes suculentas forma piramidal en la base de la panícula

5 macroculmis, mapisaga, salmiana, tecta, ragusae

Sisalanae hojas lanceoladas, carnosas, verdes

5 desmettiana, kewensis, neglecta, sisalana, weberi,

Umbelliflorae Panícula umbelada sostenida por un tallo suculento

2 shawii, sebastiana

Clasificación propuesta por Gentry (1982), * grupos endémicos de México de acuerdo a García-Mendoza (1992).

1.2. DISTRIBUCIÓN

Los agaves son de gran significancia para México, pues éste se considera centro de origen,

evolución y diversificación del género. Aproximadamente el 87% (272) de las especies descritas,

se encuentran ampliamente adaptadas y distribuidas en los diversos ecosistemas de nuestro

territorio; además de la presencia de especies menos evolucionadas y endémicas (López et al.;

2003). La familia Agavaceae se distribuye desde el sur de Canadá, Estados Unidos, México,

Centroamérica y norte de Sudamérica, siguiendo la cadena montañosa de los Andes, hasta

Bolivia, Paraguay e islas del Caribe (Figura 4) (García-Mendoza y Galván, 1995). A pesar de que

estas plantas son nativas de regiones áridas y semiáridas, crecen en distintas elevaciones, desde

el nivel del mar hasta más de 2100 m, y en habitats tan variados como bosques, colinas secas,

planicies áridas y a la orilla del mar (Irish, 2000). La distribución de los géneros Beschcorneria,

Furcraea, Polianthes y Prochnyanthes está restringida a México (Ojeda y Ludlow, 1995). La

presencia de algunos agaves en Asia y en el Mediterráneo se considera como dispersión de la

especie por la mano del hombre.

Por su parte, la distribución de Nolinaceae es aún más restringida. Sus cuatro géneros son

endémicos del sur de Norteamérica (Carolina, Georgia, Florida, Colorado, Texas), México y parte

de Centroamérica (Guatemala, Belice, Honduras). De aproximadamente 55 especies, en México

11

Figura 3. Características morfológicas de miembros de la familia Agavaceae y Nolinaceae.

12

Figura 4. Distribución de las familias Agavaceae y Nolinaceae. Modificada de García-Mendoza y Galván 1995.

13

se encuentran 49 (89%) (Figura 4) (García-Mendoza y Galván, 1995), siendo la distribución de

Beaucarnea restringida en nuestro país (Ojeda y Ludlow, 1995).

1.3. DESCRIPCIÓN DE LOS GÉNEROS Y CARACTERÍSTICAS DELIMITANTES DE LAS

FAMILIAS AGAVACEA Y NOLINACEAE

Las familias Agavaceae y Nolinaceae son monocotiledóneas con similitud entre ellas y con otros

miembros del orden Asparagales, en el crecimiento de sus hojas en forma de roseta, número de

hojas de 20 hasta más de 200, ramilletes florales de seis flores con 6 estambres y 6 tepalos (este

último término refiere a la combinación de 3 pétalos y 3 sépalos indistinguibles uno de otro).

Cuando las plantas alcanzan su madurez, la inflorescencia emerge de la roseta con ovarios

segmentados en tres cámaras. A pesar de dichas similitudes, estas familias difieren en algunos

puntos. Análisis citológicos de los agaves han determinado un número cromosomal x = 30 y una

haploidía que oscila entre diploíde y hexaploíde (tequilana, 2x = 60) (Ruvalcaba-Ruiz y Rodríguez-

Garay, 2002), con 5 cromosomas largos y 25 cortos. En contraste, la familia Nolinaceae tiene 19

cromosomas, todos del mismo tamaño. Los agaves tienen flores perfectas, es decir, la parte

masculina y femenina se encuentran en la misma planta; mientras que las de Nolinaceae son

dioicas, las flores masculinas y femeninas se encuentran en distintas plantas. Las flores de las

Agavaceae son de colores y tamaños variados (al menos de 2.5 cm de largo), mientras que las

Nolinaceae son invariablemente de color crema y pequeñas (menores de 2.5 mm) (Figura 3). En

las de Agavaceae, algunos géneros como Agave y Furcraea son monocárpicas, es decir, las

rosetas mueren después de florecer; mientras que las de Nolinaceae son policárpicas y sus

rosetas producen inflorescencia en múltiples años. Con algunas excepciones, los frutos de las

Agavaceae son dehiscentes con múltiples semillas planas y negras (con fitomelanos) contenidas

en lóculos de tres cavidades que se dispersan en la madurez; mientras que los frutos de las

Nolinaceae son indehiscentes con 1 a 6 semillas redondas y cafés (sin fitomelanos) que

permanecen en el fruto (García-Mendoza, 1992). A pesar de esto, es importante mencionar que

dada las similitudes compartidas entre estos dos géneros, muchas veces Dasylirion y Agave son

comparadas e incluso estudiadas juntas.

14

1.3.1. AGAVE

Los agaves se consideran plantas perennes, pues su ciclo de crecimiento y floración toma más de

una estación de crecimiento. Sus hojas generalmente son duras y rígidas (Figura 3), aunque

también hay especies de hojas laxas. Muchos agaves, en sus hojas contienen una espina terminal

y/o prominentes dientes marginales rectos o curveados, minúsculos o largos y planos o

redondeados, siendo todas estas características útiles en la clasificación taxonómica; aunque el

color de los dientes y las espinas pueden variar con la edad, medioambiente o condición fisiológica

de la planta (Gentry, 1998; Irish, 2000). Sus tallos generalmente son pequeños, muchas veces son

sólo una base escondida entre la masa de hojas que de éste emergen, y son raras las especies

que forman troncos de tamaño considerable. La inflorescencia emerge del tallo de manera

espectacular cuando la planta llega a la madurez, alcanzando 1.8 m en especies pequeñas y

hasta 12 m en las más grandes. Ésta tarda en emerger dependiendo de la especie: A. tequilana

toma de 8 a 10 años, A. fourcroydes lo hace alrededor de 15 años y en A. deserti sucede cuando

la planta alcanza la edad aproximada de 55 años (Nobel, 1987). El largo tiempo en que la planta

comienza a florecer favorece que la propagación de la especie sea principalmente asexual a

través de la generación de rizomas o hijuelos. Sin embargo, la edad y frecuencia con que los

agaves comienzan a producir hijuelos también es variable: a A. tequilana le toma 3 años y A.

deserti los produce después de los 13 años (Nobel y Quero, 1986). Por otro lado, algunas

especies producen rizomas de manera prolífica, mientras que otros llegan a producir uno o dos

rizomas en toda su vida. Las flores establecidas comienzan a abrir desde la base hasta la punta

del tallo floral; sus 6 tépalos son duros, sostenidos en dos grupos de tres, en algunos casos con

una disposición de ramillete o fusionados con el tejido ovárico. Las flores de las formas

paniculadas son más resistentes y duraderas que las formas espigadas, influyendo esto en el tipo

de animales que las polinizan, siendo murciélagos y pájaros en el primer caso y pequeños

insectos en el segundo (Figura 3).

Variedades distintas de agave tienen diferentes propiedades y características; algunas por

ejemplo, son mejores productoras de savia, otras son mejores en la obtención de fibras y otras

tantas se desarrollan mejor en suelos con ciertas características. El orígen para la diversidad

botánica de estas especies se sugiere como resultado de una selección prehistórica humana con

el fin de incrementar cualidades específicas, aumentando así el sistema productivo del agave

diversificado y especializado (Parsons y Darling, 2000).

15

1.3.1.1. Agave tequilana Weber var. azul

A. tequilana es una planta suculenta de tallo grueso y corto que alcanza de 30 a 50 cm en la

madurez. El órgano floral mide de 5 a 6 m y es densamente ramificado con 20 a 25 umbelas

largas con flores verdes de 68 a 75 mm de largo, sostenidas sobre pequeños pedicelos

bracteolados. Las pencas se extienden radialmente con una longitud de 90 a 120 cm de largo por

8 a 12 cm de ancho, son lanceoladas, acuminadas, fibrosas, cóncavas, más anchas en medio,

volviéndose angostas y más gruesas hacia la base; presentan un color azul verdoso que le da

nombre a su variedad, con un margen regularmente dentado y espinas aplanadas de 1 a 2 cm de

largo. A. tequilana alcanza su madurez fisiológica entre los 8 y 12 años. Para fines comerciales, la

inflorescencia se corta cuando comienza a emerger; de esta manera los carbohidratos destinados

a la emergencia floral son ahora acumulados en el tallo.

1.3.1.2. Agave angustifolia Haworth

El tamaño y forma de A. angustifolia es altamente variable, su roseta puede ser de 1 a 1.5 m de

alto y de 2 a 2.4 m de ancho; la formas varigatas son mucho más pequeñas. Las plantas producen

numerosos hijuelos, por lo que raramente son plantas solitarias. Sus hojas lanceoladas son

numerosas y rígidas, de 2.5 a 10 cm de ancho y de 0.6 a 1.2 m de largo, planas en la superficie,

convexas hacia la punta, angostas y gruesas hacia la base. El color de sus pencas varía de verde

a verde grisáceo, con pequeños dientes curveados y espaciados cada 1.3 a 3.8 cm y una espina

terminal corta, generalmente color café o de color granate o negro. La inflorescencia paniculada de

A. angustifolia es de 3 a 5 m de largo con 10 a 20 ramificaciones con flores verdes a amarillas.

Esta es la especie más ampliamente distribuida en Norteamérica. Generalmente se le encuentra

cerca del litoral, sabana tropical, bosques de espinas y bosques tropicales caducos; se distribuye

en elevaciones que van desde el nivel del mar (desierto sonorense con precipitación media anual

de 250 mm) hasta los 1500 msnm o más (zona montañosa de bosque de encino de Uruapan,

Mich. con precipitación anual de 1680 mm) (Gentry, 1998). La especie tolera cualquier condición y

tipo de suelo (Irish, 2000), aunque durante su establecimiento la plántula es sensible a altas

temperaturas del suelo, por lo que generalmente requiere una planta nodriza como arbustos o

árboles para crecer bajo su sombra.

16

1.3.1.3. Agave potatorum Zuccarini

A. potatorum, tobala o papalometl es una especie pequeña y solitaria. Existen aproximadamente

33 variedades de acuerdo a las características de sus hojas, las cuales se encuentran entre 30 y

80, dispuestas simétricamente alrededor de un tallo pequeño para formar una roseta abierta. Las

hojas varían en forma y color, desde ovaladas, cuadriculadas o cortas lanceoladas, de 9 a 18 cm

de ancho y de 25 a 40 cm de largo y de color verde grisáceo hasta blanca. El margen de las hojas

presentan protuberancias (margen mamilado), así como dientes de 0.6 a 1.3 cm de largo y

espaciados por 1.3 a 2.5 cm, con una espina terminal afilada de 2.5 a 4.4 cm de largo y de forma

sinuosa o torcida. La inflorescencia de A. potatorum puede ser un racimo o una panícula de 3 a 6

m de largo, con flores verde-amarillo y matices rojos; su reproducción es por semillas. Esta planta

se distribuye principalmente en tierras altas y semiáridas de Oaxaca y Puebla a elevaciones entre

1350 y 2250 msnm (Irish, 2000).

1.3.1.4. Agave cantala

A. cantala presenta rosetas verdes de 2 a 2.5 m de largo; hojas de 1.5 a 2 m, acuminadas,

redondeadas hacia la base, de color verde claro u oscuro, orilla lisa en la punta, rugosa en la base,

dientes cafés pequeños de 3 a 4 mm de largo con frecuencia cada 2 o 3 cm y espina terminal

pequeña de 5 a 15 mm de largo. La panícula es de 6 a 8 m de largo, bulbífera con alrededor de 20

umbelas difusas en la parte superior, flores verdosas con tintes morados o rojizos de 70 a 85 mm

de largo; ovario fusiforme de 32 a 42 mm de largo (Gentry, 1998).

1.3.1.5. Agave fourcroydes

A. fourcroydes o henequén desarrolla un tronco de 1 a 1.7 m de largo. Sus hojas largas, delgadas,

angostas y lanceoladas son de color verde grisáceo, de 8 a 13 cm de ancho y de 1.2 a 1.8 m de

largo; con espinas oscuras espaciadas y una espina terminal redondeada de 2 a 2.5 cm de largo.

El ciclo de esta especie toma de 20 a 25 años y al final del mismo, se forma la inflorescencia

panículada de 5 a 6 m de largo con 10 a 18 ramificaciones. En sus flores verdes o amarillas, se

han observado malformaciones genéticas en sus gametos, adjudicadas a su naturaleza

pentaploide (5x = 30), por lo que los granos de polen son estériles o de baja fertilidad y su

propagación es principalmente por rizomas o bulbillos. Sin embargo, en el Centro de Investigación

Científica de Yucatán (CICY) se determinó que el potencial germinativo puede ser de hasta el

17

93%, abriendo con esto una alternativa para favorecer la variabilidad genética de esta población

(Barredo-Pool et al., 2004). La distribución de A. fourcroydes es común en Yucatán, Veracruz y

Tamaulipas. Es una especie susceptible al frío, una temperatura de -2 °C ocasiona serios daños a

las hojas (Irish, 2000).

1.3.2. DASYLIRION

Dasylirion, de los vocablos griegos dasys, grueso y lily, lirio es la palabra propuesta por Zuccarini

(1838) para describir la forma de ”penacho” de uno de los géneros predominantes del desierto

Chihuahuense (Figura 3). Cuando las plantas de Dasylirion son pequeñas, su crecimiento en

roseta es similar a los agaves; sin embargo cuando las plantas maduran, el tallo se vuelve

prominente, tomando forma de tronco que raramente alcanza 1 m de altura, siendo D.

quadrangulatum una excepción notable al presentar un tronco de hasta 5 m al envejecer. Las

hojas de Dasylirion son largas, lineales, flexibles y su color varía entre verde amarillento, verde

oscuro o azul-grisáceo. Su margen es rayado con largos dientes pequeños, ganchudos,

apuntando hacia la base y de color amarillo a café. Entre los espacios de estos dientes se

encuentran otros diminutos, formando así un margen serrado.

Una de las especies más abundantes es D. wheeleri conocida también como sotol o cuchara del

desierto, dado que sus hojas largas, hasta 1 m de longitud, delgadas y fibrosas se ensanchan

hacia la base (de 0.9 a 3 cm) dando una forma de cuchara. A diferencia de los agaves, las hojas

de Dasylirion son suaves y deshiladas formando un follaje azul verdoso que se torna oscuro al

madurar. Las flores masculinas de Dasylirion presentan estambres amarillos protuberantes,

mientras que las femeninas son blanco-verdoso, seguidas por semillas en el interior de cápsulas

aladas. La madurez de la planta, la disponibilidad de agua y probablemente la longitud del día, son

factores que inducen la formación del tallo floral, que llega a tener dimensiones entre 1.8 y 5.2 m.

Dasylirion es una planta bien adaptada a condiciones áridas, temperaturas extremas y también a

cualquier tipo de suelo. No hay evidencias científicas que indiquen el tiempo de vida de Dasylirion

pero hay quienes sugieren que 150 años es una edad posible.

18

1.4. IMPORTANCIA ECONÓMICA Y CIENTÍFICA

1.4.1. USOS TRADICIONALES

Algunas comunidades, en la actualidad, emplean los agaves como lo hacían las antiguas

civilizaciones: sus raíces, tallos, pencas y espinas se utilizan en la obtención de hilos, fibras,

material para construcción, jabón, calzado, vestimenta, alimentos, medicinas, bebidas alcohólicas

étnicas, ornamentos y miel (Gentry, 1998).

1.4.2. USOS ORNAMENTALES

La belleza, múltiples formas y variedades de los agaves, así como su endemismo regional, las han

hecho ser consideradas como plantas exóticas que llegan a cotizarse a precios elevados. Este

hecho ha favorecido la dispersión del género desde tiempos de la conquista. Al parecer los

españoles y portugueses llevaron algunas especies como A. americana a Azores e Islas Canarias;

A. angustifolia, A. cantala y otras especies fueron llevadas a Asia y África; A. americana, A. lurida

y otras especies se dispersaron en las costas del Mediterráneo, alcanzando su esplendor en el

siglo XIX, cuando los agaves se volvieron populares como especies ornamentales y exóticas en

los jardines públicos y privados de Europa (Gentry, 1998).

1.4.3. OBTENCIÓN DE FIBRAS NATURALES

Indicios arqueobotánicos en Oaxaca (cueva de Güilá Naquitz) sugieren que el hombre utilizaba las

fibras de agave desde 10800 a.C., iniciándose el trabajo textil hacia los años 1300 a 800 a.C.

(Palma, 2000). Después de la conquista, algunas especies como A. angustifolia, A. fourcroydes y

A. sisalana fueron introducidas en áreas tropicales como Indonesia, Tanzania, Filipinas y algunos

países africanos para la producción comercial de fibras (Irish, 2000; Jin et al., 2004). En México,

para la obtención de fibra se utilizan A. fourcroydes y A. sisalana, especies cultivadas en el Golfo

de México y Península de Yucatán. En algunas regiones de Oaxaca, la elaboración de productos

basados en fibras de agave es la segunda actividad agroindustrial más importante (Palma, 2000).

Otras especies productoras de fibra son A. lechuguilla y A. peacockii encontradas en el Valle de

Mezquital y el Valle de Tehuacán, respectivamente. Por la composición química de las fibras, con

alto contenido de celulosa y bajo porcentaje de hemicelulosa, son poco asimilables a los

microorganismos y por lo tanto más durables; mientras que el elevado contenido de lignina,

permite que las fibras soporten la acción mecánica a las que se someten durante procesos de

19

tensión (Palma, 2000). El auge de su comercialización y exportación se dio a principios del siglo

XX; sin embargo, la competencia de las fibras sintéticas ha cambiado la perspectiva económica de

las zonas desérticas donde se cultivan este tipo de agaves.

Las fibras obtenidas de Dasylirion también han sido utilizadas en la elaboración de canastas,

marcos, muñecas y brochas. En la fiesta folklórica del norte de México conocida como “la flor del

sotol”, se hacen creaciones artísticas a partir de la fibra para la decoración de postes, crucifijos,

arcos de iglesias, tumbas y cementerios (Irish, 2000).

1.4.4. OBTENCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE FITOQUÍMICOS

Investigaciones realizadas en algunas especies de agave, han demostrado que estas plantas son

fuente natural de sapogeninas (hecogenina, smilagenina, tiogeninas), saponinas (clorogenina),

esteroles, terpenos, vitaminas y otros principios medicinales. En los años 50 varias compañías

farmacéuticas y el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA), cuantificaron el

contenido de sapogeninas en algunas especies, encontrándose niveles entre 0.5 y 4.5% en

especies como A. vilmoriana, A. cerulata, A. lechuguilla, A. lophanta, A. colimani y A. schidigera;

mientras que las especies con alto contenido de fibra como A. sisalana, A. fourcroydes y A.

angustifolia presentan menor cantidad (de 0 a 0.5%; Gentry, 1998).

En la medicina tradicional mexicana, por ejemplo, se han hecho uso de A. lechuguilla como

antirreumático, antiinflamatorio, desinfectante en mordeduras de víboras y remoción de coágulos

sanguíneos; A. intermixta, se utiliza como antiartrítico, antituberculoso y anticarcinógeno (Sáenz,

et al., 2000); las pencas de A. americana y A. salmiana se utilizan como expectorante, cicatrizante,

diurético, para dolores estomacales, cardiacos y escorbuto; A. vilmoriana se usa como

antiinflamatorio y antifúngico, y de esta especie, recientemente, se caracterizaron dos esteroles

denominados agamenósido y agavegenina (Jin et al., 2004). D. wheeleri también presenta algunas

propiedades medicinales como antitusivo y en tratamientos de cefaleas (Gioanetto y Franco,

2004).

1.4.5. ELABORACIÓN DE BEBIDAS ALCOHÓLICAS

Las diversas variedades de agave encontradas en territorio mexicano, se han usado desde

tiempos inmemoriales en la elaboración de bebidas alcohólicas. Los factores que afectan las

características de los agaves, como temperatura, humedad, ciclo natural y precipitación pluvial,

20

hacen que los productos obtenidos en cada región sean de propiedades únicas (Iñiguez-

Covarrubias et al., 2001a). De acuerdo al proceso, las bebidas alcohólicas pueden ser

fermentadas o destiladas.

1.4.5.1. BEBIDAS FERMENTADAS

El pulque es la bebida fermentada más conocida. Algunos códices mexicanos manifiestan que los

Aztecas elaboraban el pulque (octli) durante su migración al Valle de México entre 1172 y 1291

d.C. y era un componente importante en ritos religiosos y ceremoniales (Gentry, 1998). Esta

bebida se prepara de la savia que emana del agave, que al llegar a la madurez y antes de que

emerja la inflorescencia, se le hace una incisión. El drenado conocido como aguamiel es dulce y

cuando se fermenta, produce el pulque. Esta bebida se hace a partir de un número limitado de

especies como A. salmiana, A. mapisaga, A. atrovirens, A. hookeri y A. americana (Irish, 2000),

cuyos jugos muchas veces son mezclados y fermentados por un complejo de levaduras y

bacterias (Bacterium, Lactobacillus, Leuconostoc, Pseudomonas, Streptococcus, Diplobacter,

Bacillus, Saccharomyces y Pichia, entre otros) que producen etanol y otros compuestos químicos

que dan sabor y consistencia viscosa a la bebida (Gentry, 1998). El pulque es fuente importante

de hierro (hasta 1.1 mg/mL) y ácido ascórbico (60 mg/L). Adicionalmente, en esta bebida se han

identificado riboflavina y otras vitaminas B (Tabla 2), así como saponinas biológicamente activas

(Backstrand, et al., 2002).

1.4.5.2. BEBIDAS DESTILADAS

Dentro de las bebidas destiladas, destaca el tequila, símbolo de fusión cultural, pues fueron los

españoles quienes a su arribo, introdujeron la práctica de destilación al proceso de fermentación

que ya practicaban las culturas prehispánicas (Mancilla-Margalli, 2000). Esta bebida ha pasado

por un proceso histórico, cultural, económico, social y tecnológico, hasta llegar a la actualidad en

la que se le considera como bebida representativa de México, con reconocimiento mundial y

protegido por una denominación de origen.

El tequila se produce exclusivamente con A. tequilana Weber var. azul, cuyos tallos cortados en

mitad son cocidos y su jugo es extraído por desgarramiento de la pulpa. Si el tequila es mixto, se

le adiciona hasta un 49% de azúcares de otras fuentes (caña o melaza) o solo los azúcares

propios del agave si la bebida es 100%. Para la fermentación, se inocula la levadura

21

Saccharomyces cerevisiae (20 a 50 × 106 células/ mL) y posteriormente el mosto obtenido, es

destilado una primera vez (destrozamiento) en alambiques de cobre para separar las vinazas

(levaduras, azúcares no fermentables, minerales, sólidos) de otros compuestos, y una segunda

vez (rectificación), para concentrar los alcoholes en el cuerpo del destilado (45 a 50 °GL) y separar

las cabezas y colas. Este producto es envasado como tequila blanco o puede ser reposado en

barriles de roble blanco o encino por un año o más para producir respectivamente, el tequila

reposado o añejo (Cedeño, 1995; Bautista-Justo et al., 2001; López y Dufour, 2001).

Otras bebidas alcohólicas provenientes del destilado de jugos de agaves fermentados, incluyen

mezcal, bacanora, sotol y, recientemente, henequén. El bacanora se produce en un lugar de

Sonora del cual deriva su nombre. A. angustifolia y A. palmeri son las especies que más se

utilizan. Para la elaboración del mezcal, las especies más usadas son A. angustifolia, A.

potatorum, A. cantala y A. karwinskii. Por su parte, el sotol se produce principalmente en

Chihuahua a partir de plantas silvestres del género Dasylirion; mientras que, la producción del

henequén se realiza a partir de A. fourcroydes.

Tabla 2. Composición de aguamiel y pulque.

nr, no reportado. Los valores indicados corresponden a aquellos encontrados en una muestra. Datos tomados de Gentry, 1998.

Compuesto Aguamiel Pulque Agua (g/100 g) 94.0 98.3 Cenizas (g/100 g) 0.4 0.2 Proteínas (g/100 g) 0.30 0.37 Extracto no-nitrogenoso (g/100 g) 5.30 1.13 Ca (mg/100 g) 20 11 P (mg/ 100 g) 9 6 Fe (mg/100 g) nr 0.70 Tiamina (mg/100 g) 0.02 0.02 Riboflavina (mg/100 g) 0.03 0.03 Niacina (mg/100 g) 0.40 0.35 Ácido ascórbico (mg/100 g) 6.7 5.1 N (g/100 mL) nr 0.14 Lisina (g/100 mL) nr 16.2 Triptofano (g/100 mL) nr 2.7 Histidina (g/100 mL) nr 4.7 Fenilalanina (g/100 mL) nr 11.2 Leucina (g/100 mL) nr 10.5 Tirosina (g/100 mL) nr 6.4 Metionina (g/100 mL) nr 0.7 Valina (g/100 mL) nr 6.6 Arginina (g/100 mL) nr 10.9

22

El proceso de elaboración de estas bebidas es similar al tequila (cosecha, cocimiento, molienda,

fermentación, destilación y envasado), pero el proceso de elaboración es más rudimentario. Las

piñas se cocen en hornos rústicos consistentes en hoyos en el suelo cubiertos de carbón, piedras

refractarias y bagazo de piñas. La molienda se realiza con una tahona, molino rústico que consiste

en una piedra plana redonda jalada por un caballo o por maceración con un mazo de madera. A la

botella de mezcal generalmente se le adiciona un gusano (Hypopta agavis), que naturalmente

ataca a la planta, dándole un sabor distintivo a la bebida. Esta bebida está en un proceso de

crecimiento y consolidación en el mercado nacional e internacional (Gentry, 1998). Actualmente se

reconoce con una denominación de origen que autoriza a seis estados de la república para su

explotación, incluyendo Oaxaca, Guerrero, Zacatecas, Durango, San Luis Potosí y Tamaulipas.

Por otra parte, la gran aceptación del sotol en la región norte del país, ha encaminado los

esfuerzos de industriales y productores para lograr la denominación de origen de esa bebida en

dicha región.

1.4.6. ELABORACIÓN DE EDULCORANTES FRUCTOSADOS

Un hecho importante de destacar, es el otorgamiento de una patente a investigadores de la

Universidad de Guadalajara, quienes desarrollaron un procedimiento para la producción de

jarabes fructosados a partir de plantas de agave. Dicho proceso consiste en la aplicación de una

inulinasa comercial (1 a 1.5 g/L) a un extracto de agave, rico en fructanos y libre de material sólido.

La hidrólisis enzimática de los fructanos se lleva a cabo de 4 a 5 h en un rango de temperatura de

40 a 50 °C, produciendo un jarabe rico en fructosa. Este producto ha empezado a comercializarse

en tiendas naturistas de México bajo el nombre de “Naturel” o “Sweetrel” (Figura 5) por la

Industrializadora Integral de Agave, S.A. de C.V. (productora de Tequila Orendain). Naturel es un

producto que presenta un 68% (w/v) de fructosa y 5% de glucosa (López-Munguía, 2004), y

constituye una alternativa edulcorante saludable con algunas ventajas sobre la sacarosa.

1.4.7. UTILIZACIÓN DE BAGAZO

Durante la molienda de piñas para la obtención del jugo que será fermentado, se genera el

bagazo, producto de desecho que representa hasta el 40% del peso de las piñas. Este material

altamente fibroso, se deja en los campos o de manera empírica, se mezcla con arcilla en la

elaboración de ladrillos o se seca al sol para la obtención de material de empaque. Ante el

23

reconocimiento internacional del tequila, la Universidad de Guadalajara, visionando un problema

ecológico creciente, realizó una investigación encaminada al uso de este material (Iñiguez-

Covarrubias et al., 2001a y b). Se mostró que la alimentación de borregos Pelibuey con una dieta

basada en bagazo de agave, tiene la misma eficiencia en ganancia de peso que el rastrojo de

maíz comúnmente utilizado, con la ventaja que el bagazo esta disponible cualquier época del año

(Iñiguez-Covarrubias et al., 2001a). Por otra parte, tablas fabricadas con bagazo de agave, son

más resistentes a la humedad que aquellas fabricadas de álamo, además de presentar una

resistencia mecánica superior a lo establecido por las normas de calidad (Iñiguez-Covarrubias et

al., 2001a). También se ha ensayado el uso del bagazo en la elaboración de aglomerados, billetes

bancarios, filtros, absorbentes, geotextiles y junto con la copra de coco para la elaboración de

sustratos sin suelo en la siembra de cultivos como maíz.

Figura 5. Edulcorante fructosado Naturel. Elaborado a partir de la hidrólisis de fructanos en agave, ofrece ventajas saludables sobre el consumo de sacarosa. Tomada de López-Munguía, 2004.

24

1.4.8. PROPAGACIÓN in vitro

A pesar de la generación de una gran cantidad de semillas durante la reproducción sexual de los

agaves (de 7,000 a 30,000 semillas/inflorescencia), el gran porcentaje de depredación y en

ocasiones las inadecuadas condiciones de germinación, hacen que la manera más común de

propagación de estas plantas sea asexual, a través de hijuelos que son cortados por el hombre y

sembrados en nuevos campos. Esta manera de reproducción pone en riesgo la variabilidad

genética de estos cultivos (Gil-Vega et al., 2001) y los expone a una gran devastación en el caso

de plagas o enfermedades.

Otro tipo de propagación vegetativa es a través de bulbillos, hijuelos pequeños que emergen del

quiote; sin embargo además de su menor incidencia, también presentan bajos índices de

supervivencia (Nikam et al., 2003). Una alternativa viable ha sido la propagación in vitro, y

actualmente existen numerosos reportes en donde utilizando segmentos de tallos, rizomas,

bulbillos, fragmentos de semillas, callos y explantes de hojas, han logrado la propagación y

regeneración de agaves de importancia comercial como A. sisalana o agaves amenazados como

A. victoria-reginae (Nikam et al., 2003). Aunque esta técnica pone en riesgo la variabilidad

genética de las plantas, entre sus ventajas destaca la obtención de un gran número de plántulas

homogéneas de características genotípicas deseables, aceleramiento de la propagación

vegetativa, aseguramiento de la calidad y certificación de que las plántulas que se llevan al campo

están sanas. Esto ha sido de gran significancia en el caso de A. tequilana, que con la gran

demanda mundial del tequila a finales de los años 90 propició escasez de plantas, aunado a que

las enfermedades propias del cultivo empezaban a devastar grandes extensiones de cultivo. El

reto de propagación in vitro a nivel industrial fue superado con creces, produciendo 2 y 4.5

millones de plántulas en el 2002 y 2003, respectivamente. Actualmente, en el campo hay más de

500 mil plantas de A. tequilana propagadas, con un desempeño agronómico sobresaliente,

superando incluso, al mejor material de siembra tradicional (Bosch-Guha, 2004).

La propagación in vitro de A. fourcroydes también logró rendimientos superiores a la propagación

por rizomas; los agaves crecen más rápido y producen mayor cantidad de hojas grandes (Herrera

et al., 2004). Para A. potatorum, A. cupreata y A. parrasana, la propagación in vitro es

especialmente valiosa, ya que estas plantas no forman rizomas y su reproducción sexual o por

bulbillos es ineficiente (Santacruz-Ruvalcaba et al., 1999; Salazar et al., 2004).

25

1.5. INFLUENCIA DE LA ZONA GEOGRÁFICA EN LOS AGAVES

El rendimiento de los agaves, el tiempo en que llegan a su madurez, contenido de carbohidratos y

sus características morfológicas, son altamente influenciadas por factores abióticos como tipo de

suelo, temperatura, humedad y elevación. En algunos agaves como A. deserti, A. salmiana (Nobel

y Meyer, 1985), A.lechuguilla (Nobel y Quero, 1986) y A. tequilana (Ruiz-Corral et al., 2002), se ha

determinado un valor denominado índice productivo medioambiental (EPI), que correlaciona tres

factores ambientales: estatus hídrico, temperatura y radiación fotosintéticamente activa (PAR) con

la fijación de CO2 por parte de la planta, medida como ganancia en peso seco (donde un valor de

1 indica condiciones no limitantes (Figura 6).

En A. lechuguilla se observó que el EPI tiene una mayor relación con el estatus hídrico del suelo

(r2 =0.97), seguido del índice PAR (r2 = 0.25) y que la temperatura no tiene efecto (r2 =0.00) sobre

la productividad. Un valor EPI de 0.38 kg m−2 año-1 para esta especie sembrada en campo, es

bajo comparado con cultivos agrícolas de alto rendimiento como trigo y maíz (1-2 kg m−2 año-1);

sin embargo, este valor es cuatro veces mayor cuando se compara con otras plantas que viven en

ecosistemas desérticos (≈ 0.1 kg m−2 año-1) (Nobel y Meyer, 1985). La medición mensual del EPI

se correlaciona con el número mensual de hojas nuevas y estima la productividad de la planta

(Figura 6D y Tabla 3) (Quero y Nobel, 1987), pudiendo dar una idea confiable sobre los meses

mas favorables para la cosecha y factores ambientales que influyen sobre dicha productividad

(Nobel, 1984).

Tabla 3. Productividad anual de agaves y otras plantas CAM.

Especie Productividad (kg/m-2 año-1)

A. deserti 1.06 A. fourcroydes 1.60* A. salmiana 1.05 A. lechuguilla 0.38 Opuntia ficus-indica 1.36* Ananas comosus 1.2*

*, productividad reportada en cultivos comerciales bajo condiciones donde el agua no es factor limitante. Para efectos de comparación, se reporta un rango de productividad de 3 a 7 kg/m2/año en cultivos como alfalfa, caña y de 1 a 2 kg/m2/año para trigo y maíz en condiciones no limitantes. Datos tomados de Nobel y Meyer, 1985.

26

Figura 6. Influencia de factores abióticos en la asimilación de CO2 en A. lechuguilla. Recuadros sombreados indican tiempo de oscuridad (noche). ψ, potencial hídrico. A) Estatus hídrico: las plantas fueron regadas semanalmente (-Ο-, ψsuelo -0.5 MPa) o sometidas a sequía (ψsuelo < -0.5 MPa) durante 7 (--) y 13 días (-� -); B) Temperatura, los números indican temperaturas día/noche; las plantas fueron irrigadas semanalmente; C) PAR, distintos grupos de plantas fueron sometidas por 10 días a un valor PAR (mol m-2) como se indica; D) Productividad, valores mensuales de EPI calculado a partir de la fijación de CO2 bajo las condiciones bióticas A), B) y C) como indicador predictivo de la ganancia en peso seco mensual (número promedio de hojas desplegadas por planta). Modificada de Nobel y Quero, 1986 y Quero y Nobel, 1987.

En A. tequilana por ser una especie de gran importancia económica, ha sido posible llevar un

registro de sus plantíos y con esto su ecofisiología ha sido más estudiada. En esta especie se

observó que la temperatura nocturna influye más que la diurna para la fijación de CO2 (Figura 7) y

27

que la actividad fotosintética se favorece con un bajo índice PAR, bajo contenido de humedad en

el suelo y temperaturas nocturnas frescas (12 a 16 °C). En base a lo anterior se estableció para el

estado de Jalisco, regiones óptimas, subóptimas y marginales para este cultivo (Figura 8 y Tabla

4), considerándose como óptimas, regiones con una elevación entre 1100 y 2800 msnm y climas

subtropical templado y subtropical semicálido (Ruiz-Corral et al., 2002). A. tequilana cultivado en

zonas óptimas y manejo agrícola adecuado, presenta tasas de fotosíntesis comparable a plantas

C3 y C4 (921 mmol CO2 m-2 día-1 en clima subtropical templado y 763 mmol CO2 m-2 día-1 en clima

subtropical semicálido), pero con una menor velocidad de transpiración. Esto no sólo significa

mayor cantidad de CO2 fijado, sino que un aumento en la superficie cultivada con esta planta

puede representar efectos ecológicos benéficos, dada su capacidad de secuestrar carbono, en

tiempos de larga sequía cuando pocas plantas con metabolismo C3 o C4 lo pueden hacer

(Pimienta-Barrios et al., 2001 y 2004).

Figura 7. Influencia de la temperatura en la asimilación de CO2 en A. tequilana. La fijación de CO2 fue negativa en la mayor parte del día, incrementándose al final del día. La fijación máxima nocturna fue de 17 µmol m-2 s-1 (267 mmol m-2 d-1) para plantas en un régimen de temperatura de 25°C/15°C, 14 µmol m-2 s-1 (298 mmo m-2 d-1) en temperaturas de 15°C/5°C y sólo 6 µmol m-2 s-1 (84 mmol m-2 d-1) cuando las plantas tienen ciclos de 35°C/25°C. Modificada de Nobel et al., 1998.

28

Figura 8. Áreas óptimas, subóptimas y marginales para el cultivo de A. tequilana en el estado de Jalisco. Se indica el área potencial para el cultivo de esta planta, que corresponde a casi 10 veces el área cultivada actualmente. Los municipios valorados son indicados en los números superiores. Tomada de Ruíz-Corral et al., 2002.

29

1.6. ADAPTACIÓN DE LOS AGAVES

El adjetivo noble o admirable con que Linneo describió a las plantas de agave, refiere a su

capacidad para crecer en ambientes hostiles y soportar temperaturas extremas, que van desde -

20°C hasta más de 38°C (Tabla 5). Esta capacidad puede ser resultado de las adaptaciones

morfológicas y fisiológicas que presentan estas plantas.

Tabla 4. Rangos de temperatura para el cultivo de A. tequilana en Jalisco.

Variable Óptima Subóptima Marginal

Temperatura nocturna (°C) 10 a 16 5 a 10 ó 16 a 25 <5 ó >25

Temperatura diurna (°C) 15 a 25 10 a 15 ó 25 a 35 <10 ó >35

Probabilidad de heladas < 0.10 - >0.10

Tomada de Ruíz-Corral et al., 2002.

Tabla 5. Tolerancia de agaves y dasylirion a frío extremo. Especie Temperatura Especie Temperatura

A. americana - 9 °C A. parryi - 29 °C A. angustifolia - 4 °C A. parviflora - 12 °C A. attenuata - 2 °C A. pelona - 7 °C A. bovicornuta - 7 °C A. salmiana - 15 °C A. cerulata - 12 °C A. scabra - 12 °C A. chrysantha - 8 °C A. schidigera - 9 °C A. datylio - 4 °C A. schotti - 12 °C A. deserti - 9 °C A. shawii - 4 °C A. desmettiana - 4 °C A. sisalana - 4 °C A. filifera - 8 °C A. striata - 9 °C A. fourcroydes - 4 °C A. tequilana - 4 °C A. geminiflora - 4 °C A. toumeyana - 12 °C A. havardiana - 23 °C A. utahensis - 23 °C A. lechuguilla - 18 °C A. victoriae-reginae - 12 °C A. lophantha - 12 °C A. vilmoriana - 6 °C A. macrocantha - 4 °C A. weberi - 11 °C A. marmorata - 4 °C A. zebra - 7 °C A. murpheyi - 12 °C D. acrotriche - 9 °C A. neomexicana - 29 °C D. leiophyllum - 18 °C A. ocahui - 9 °C D. quadrangulatum - 9 °C A. palmeri - 12 °C D. texanum - 15 °C A. parrasana - 9 °C D. wheeleri - 18 °C

Tomada de Irish, 2000.

30

1.6.1. ADAPTACIÓN MORFOLÓGICA

1.6.1.1. HOJAS

La suculencia de sus pencas es una de las características más peculiares de los agaves; éstas

contienen un parénquima esponjoso especializado de paredes delgadas, gran cantidad de

cloroplastos y vacuolas prominentes. Estas células almacenan agua y ayudan a amortiguar los

cambios de disponibilidad de agua en el suelo. Por su gran capacidad de almacenamiento, la

longevidad de las pencas (hasta 15 años o muchas veces durante toda la vida de la planta) le

confiere al agave la ventaja de contener suficientes provisiones para el florecimiento (Irish, 2000).

La proporción volumen:área foliar es un índice útil que indica la capacidad de almacenar agua en

las hojas; pencas con gran volumen y pequeña área foliar tienen más agua disponible para la

transpiración. Así, el distintivo tamaño de los agaves influye en el uso eficiente de agua (ganancia

de peso seco por unidad de transpiración) que finalmente afecta su distribución: los agaves de

mayor tamaño se encuentran en la región sur-centro de México, zona con mayor humedad que la

región norte (Woodhouse et al., 1983; Linton y Nobel, 2001).

Por otra parte, la disposición en roseta de las hojas, le permiten a los agaves colectar el agua de

lluvia hacia el tallo; además que la sombra formada por las mismas, reduce la evaporación y

protege el órgano floral (Gentry, 1998). El número de estomas en la epidermis es 10 veces inferior

a las dicotiledóneas e incluso a otras monocotiledóneas. Aunque esto disminuye la frecuencia de

intercambio gaseoso, también decrece la pérdida de agua por transpiración (Nobel, 1988). La

cutícula cerosa que cubre las pencas, es otra adaptación para prevenir la pérdida excesiva de

agua. Otro tipo de adaptación morfológica de los agaves es el pequeño diámetro de sus vasos

conductores y su baja densidad en las hojas, confiriéndole la característica de baja conductancia

hidráulica (Kh) (6 mmol m-2 día-1 en A. deserti vs 33-94 mmol m-2 día-1 en árboles leñosos) y mayor

susceptibilidad a la cavitación, es decir, al bloqueo de los vasos del xilema con aire o vapor de

agua. Este fenómeno disminuye la Kh y el potencial hídrico de la planta, que finalmente provoca el

cierre estomatal y disminución en la pérdida de agua (Linton y Nobel, 2001). En un experimento de

estrés hídrico por 100 días en A. tequilana y A. deserti, se evidenció que la primera es más

susceptible a la cavitación (Tabla 6), observada como un mayor decremento en la Kh. Esto fue

explicado por una menor proporción volumen:área foliar (2.3 vs 3.3), traducido como hojas más

delgadas, mayor velocidad de transpiración y un subsecuente decremento mayor de su potencial

hídrico foliar (ψfoliar). Como en otras especies, en este caso también existe una correlación entre la

31

Tabla 6. Susceptibilidad a la cavitación de A. tequilana y A. deserti sometidos a 100 días de sequía. Sequía (días)

1ψψψψsuelo (MPa)

ψψψψfoliar (MPa) A.

tequilana

Decremento en 2Kh (%) A. tequilana

Transpiración (mol m-2día-1) A. tequilana

ψψψψfoliar (MPa)

A. deserti

Decremento en Kh (%) A. deserti

Transpiración (mol m-2día-1) A. deserti

0 -0.02 -0.58 0 11.6 -0.64 0 6.2 20 3nr -0.76 10 2.4 -0.76 2 1.6 40 Nr -1.62 43 0.8 -0.83 nr 0.5 60 Nr -2.28 60 nd -1.09 21 4nd 80 Nr -2.90 84 0.4 -1.58 32 0.4 100 -4.00 -3.42 85 0.3 -1.96 41 0.3

1ψ, potencial hídrico; 2Kh, conductancia hidráulica foliar; 3nr, no reportado; 4nd, no determinado.. Datos tomados de Linton y Nobel, 2001.

vulnerabilidad a la cavitación, tolerancia a sequía y características ambientales: A. deserti es

predominante en el noreste del desierto de Sonora con un promedio pluvial anual de 240 mm,

mientras que A. tequilana en la región de Jalisco, recibe un promedio anual de 1000 mm (Linton y

Nobel, 2001).

1.6.1.2. RAÍCES

Las características de las raíces en los agaves también resultan de importancia para la

supervivencia de estas especies en lugares secos. Sus células epidermales contienen un

parénquima lignificado que reduce la pérdida de agua (Palta y Nobel, 1989). Aunque menos

estudiada, la morfología de la raíz de Dasylirion, también se ha observado en estas especies, un

sistema radicular fibroso con una endodermis esclerificada rodeada por una corteza gruesa de

células parenquimatosas. Las plantas jóvenes presentan de 2 a 3 raíces fusiformes contráctiles,

mientras que las mayores presentan un sistema radicular densamente disperso (Bogler, 1995).

Al igual que otras plantas desérticas perennes, y en una estrategia para eficientar la presencia de

agua, cuando hay indicios de humedad en el suelo, A..deserti produce raíces finas (raíces de

lluvia) en forma de ramificaciones sobre un sistema radicular establecido. Estas raíces de lluvia

incrementan el área de absorción y la captura de agua y nutrientes, haciendo un contacto efectivo

de suelo-raíz. Sin embargo, durante sequías, el potencial hídrico del suelo decrece por debajo del

de las raíces y las raíces de agua son eliminadas, probablemente por un costo respiratorio y

conductividad hidráulica mayor a las raíces establecidas (Figura 9).

32

Figura 9. Cambios en la velocidad de respiración durante sequía en raíces de lluvia y establecidas en A. deserti. Símbolos blancos indican la velocidad medida durante el día y los símbolos oscuros denotan los datos obtenidos durante la noche. En condiciones iniciales, la velocidad de respiración para las raíces establecidas fue de 2.15 µmol CO2 kg-1 s-1 y 4.55 µmol CO2 kg-1 s-1 durante la noche y el día, respectivamente; mientras que para las raíces de lluvia fue de 6.20 µmol CO2 kg-1 s-1 y 14.5 µmol CO2 kg-1 s-1 para la noche y el día respectivamente. Se observó un decremento mayor y más rápido en las raíces de lluvia alcanzando un valor 0 a los 6 días (ψsuelo = -0.9 MPa), condición que solo causó una reducción en la respiración para las raíces establecidas. Modificada de Palta y Nobel, 1989. El encogimiento de las pequeñas raíces en sequía provoca en el suelo huecos que disminuyen la

conductividad hidráulica y aumenta la resistencia de la raíz a movimientos de agua (hasta 100

veces, según cálculos) (Schulte y Nobel, 1989). Las raíces de lluvia, además, no se recuperan

después de una rehidratación, probablemente por diferencias en la presión osmótica y una menor

conductividad hidráulica de las raíces establecidas que son capaces de mantener una respiración

basal a ψsuelo = -1.3 MPa. Esto minimiza la pérdida de agua y ayuda a prevenir la muerte de las

raíces establecidas, cuya recuperación es completa después de que cesa la sequía (Palta y Nobel,

1989).

33

1.6.1.3. TALLO

Durante tiempos de sequías severas, los tallos llegan a encogerse, provocando delgadas fisuras

en el suelo alrededor de la base de la planta. Esto incrementa la utilidad de la forma de roseta al

canalizar el agua cuando llueve (Irish, 2000).

1.6.2. ADAPTACIÓN FISIOLÓGICA

1.6.2.1. METABOLISMO ÁCIDO DE LAS CRASSULACEAS (CAM)

Indudablemente uno de los factores fisiológicos de mayor importancia para el desarrollo de los

agaves en ambientes áridos, es el uso del metabolismo fotosintético del ácido de las crassulaceas,

conocido como metabolismo CAM. Tan notable característica fue descrita para A. americana a

finales de los 60 (Iñiguez-Covarrubias et al., 2001). Parte de los resultados reportados por Ehrler

(1969) se muestran en la Figura 10 y Tabla 7, donde se compara el comportamiento fisiológico del

maíz y A. americana, y se evidencia que esta especie sigue un patrón típico de plantas con

metabolismo CAM.

Figura 10. Diferencia de temperatura entre el área foliar (de maíz o agave) y el aire circundante. Los recuadros indican tiempo de oscuridad en la medición realizada en invernadero. La diferencia de temperatura durante el día marca una respuesta distinta de ambas plantas a una misma condición ambiental. Durante la noche, la menor diferencia de temperatura entre las hojas de agave y el aire, indica una apertura estomatal nocturna. Modificado de Ehrler, 1969.

-4

-2

0

2

4

6

8

10

0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00

Hora

Dife

ren

cia

de

Te

mp

era

tura

(°C

)

Agave americana

Zea mays

34

Tabla 7. Comparación de parámetros fisiológicos de Zea mays y Agave americana. Zea mays Agave americana

Transpiración (g m-2 h-1) 5.96 90.0 30.0 14.6 Resistencia foliar a difusión (s cm-1)

93.0 7.1 17.1 239.0

Frecuencia estomatal (estomas cm-2)

Epidermis inferior 9247

Epidermis superior

5077

Epidermis inferior 3717

Epidermis superior

4850 Pérdida de agua (g)* 9407 2228 Ganancia de peso seco (g)* 69.4 34.4 Eficiencia de uso de agua (ganancia en peso/transpiración)*

0.007 0.015

El patrón de transpiración y resistencia foliar es inverso en ambas especies, indicando un tiempo de apertura estomatal diferente. Los valores indican el promedio de la medición de tres plantas independientes. El símbolo * representa la medición en un período de 10 semanas. El cuadro rayado indica tiempo de oscuridad. Modificado de Ehrler, 1969. En contraste al metabolismo C3 y C4, las plantas CAM reducen la pérdida de agua por

transpiración, al abrir los estomas para la asimilación de CO2 durante la noche, cuando la

diferencia de concentración de vapor de agua entre el tejido foliar y el ambiente circundante es

menor (López et al., 2003). La pérdida de agua por parte de la planta sucede a una velocidad dos

veces mayor que la toma de agua; sin embargo, se alcanza un balance positivo porque la pérdida

de agua por transpiración sucede por la noche, mientras que la toma de agua a través de las

raíces ocurre durante las 24 h del día (Nobel, 1997).

1.6.2.2. BIOQUÍMICA DEL METABOLISMO ÁCIDO DE LAS CRASSULACEAS (CAM)

En general, el metabolismo CAM se caracteriza por una movilización masiva de carbohidratos

durante el período de oscuridad (Figura 11), que a través de la glicólisis produce fosfoenolpiruvato

(PEP). Este compuesto se carboxila por la fosfoenolpiruvato-carboxilasa (PEPC, E.C. 4.1.1.31)

usando bicarbonato (HCO3-) como sustrato (Trípodi y Podestá, 1997). El oxaloacetato formado de

esta reacción, se reduce rápidamente a malato por una NAD(P)-malato deshidrogenasa de origen

citosólico y/o mitocondrial (Hopkins, 1995). El malato-2 formado se mueve pasivamente hacia la

vacuola a través de un canal específico, acoplado a un transporte activo de protones (una bomba

H+-ATPasa vacuolar) (Dood et al., 2002). En A. deserti la acumulación nocturna de ácidos en la

vacuola del clorénquima, aumenta el potencial osmótico y genera un gradiente que favorece la

adquisición de agua por el tejido parenquimatoso.

35

Figura 11. Metabolismo ácido de las crasuláceas. Durante el período de oscuridad, los estomas abiertos permiten la asimilación de CO2 mediante la producción de malato que es almacenado en la vacuola. Durante el día, el cierre de los estomas reduce la pérdida de agua, mientras que el malato es descarboxilado y fosforilado en el citoplasma para la síntesis de carbohidratos en el ciclo de Calvin. T-P, triosa-fosfato; OAA, ácido oxalacético; MAL, malato; PEP, fosfoenolpiruvato; PYR, piruvato; a, PEP-carboxilasa; b, malato deshidrogenasa; c, enzima descarboxilasa. Modificado de Hopkins, 1995. Existe la controversia, si estos cambios osmóticos son suficientes para la adquisición de agua del

suelo; sin embargo, son significativos para mantener el turgor de las células del clorénquima y la

apertura de los estomas durante tiempos de sequía (Schulte y Nobel, 1989). La actividad de la

PEPC es regulada por una fosforilación reversible a un residuo de serina mediada por la PEP

carboxilasa cinasa (PPCK), cuya expresión responde a un ritmo circadiano o al estatus de carbono

indicado por la concentración de malato (Kingston-Smith, 2001; Dood et al., 2002).

Durante el período de luz, cuando los estomas se encuentran cerrados, las enzimas

descarboxilasas liberan el CO2 a partir de la descarboxilación del malato (Figura 11). El CO2

liberado se difunde hacia el cloroplasto donde se fija por la ribulosa 1,5-difosfato carboxilasa-

oxigenasa (RUBISCO, E.C. 4.1.1.39) e incorporado al ciclo de reducción del carbono fotosintético

Cloroplasto

36

(ciclo de Calvin) para formar carbohidratos de almacén mediante la gluconeogénesis (Cushman y

Bohnert, 1999).

La fuente de carbono que produce PEP durante el período de oscuridad, varía dependiendo de la

especie. Algunas plantas CAM degradan glucanos o almidón cloroplástico, mientras que otras lo

hacen a partir de fuentes extracloroplásticas (Trípode y Podestá, 1999). Por otra parte, también se

ha mostrado plasticidad en plantas CAM en cuanto al uso de la principal enzima descarboxiladora:

unas especies presentan principalmente actividad de PEP carboxicinasa (PEPCK, E.C.4.1.1.49),

mientras que en otras esta actividad no es suficiente para explicar la decarboxilación del ácido

málico y presentan actividad importante de las enzimas descarboxilasas málico-NAD de origen

mitocondrial (NAD-ME, E.C. 1.1.1.39) y málico-NADP dependiente de origen citosólico (NADP-ME,

E.C.1.1.1.40). Se ha sugerido una correlación taxonómica en base a la principal enzima

descarboxilasa y al carbohidrato de reserva degradado en la formación de PEP; sin embargo,

Christopher y Holtum (1996) demostraron que esto no siempre es así (Tabla 8), y en un análisis de

distintas especies, postularon distintas vías CAM en base a la estrategia que presentan en la

conservación de carbohidratos de reserva, la compartamentalización de las principales

descarboxilasas y de los transportadores de membrana involucrados en su metabolismo:

i).- Especies que usan descarboxilasas ME y que producen almidón cloroplástico. En estas

especies, el cloroplasto importa piruvato (PYR) del citoplasma y exporta PEP a través de un

transportador cloroplástico del tipo Pi/triosa-P que intercambia PEP por triosa-P. Esta acción

puede promover la acumulación de triosa-P en el cloroplasto y favorecer la síntesis y almacén de

almidón y glucanos en dicho organelo (Figura 12A).

ii).- Especies que usan descarboxilasa PEPCK y que producen almidón cloroplástico. El

metabolismo de estas especies puede ser explicado por un intercambio de triosa-P (a la vacuola)

por Pi (al citoplasma) a través de un transportador de Pi. Este último metabolito puede provenir del

pirofosfato (PPi) producido durante la polimerización del almidón (Figura 12B).

iii).- Especies que usan descarboxilasa PEPCK y que producen carbohidratos extracloroplásticos.

En estas especies el PEP producido en el citosol vía malato deshidrogenasa y PEPCK, puede

estar disponible para las enzimas gluconeogénicas citosólicas que promueven la acumulación de

hexosas o polisacáridos en el citosol y/o vacuola (Figura 12C).

iv).- Especies que usan decarboxilasas ME y que producen carbohidratos extracloroplásticos. En

este caso, la exportación de PEP del cloroplasto al citoplasma puede no involucrar un intercambio

37

por triosa-P, como en el caso de las especies ME que almacenan almidón, sino un intercambio por

Pi, proveniente quizá de un proceso extracloroplástico de polimerización de hexosas (Figura 12D).

A. guadalajarana presenta este tipo de metabolismo (Tabla 8).

En A. sisalana, la relación inversa entre el contenido de fructanos y ácido málico, sugiere que

estos carbohidratos suministran el sustrato para la síntesis de ácido málico durante la noche;

mientras que durante el día, los fructanos sen sintetizan a partir de la acumulación de sacarosa en

la vacuola (Izaguirre-Mayoral et al., 1995). Bajo condiciones ambientales favorables muchas

plantas CAM fijan CO2 durante el día a través de la RUBISCO y por la noche usando la PEPC por

la vía CAM (Graham y Nobel, 1996). Hartsock y Nobel (1976) mostraron que un constante riego en

A. deserti fuerza a estas plantas a asimilar CO2 durante el día, sin una diferencia significativa

Tabla 8. Clasificación taxonómica y comportamiento CAM de algunas especies estudiadas. Clasificación Principal

Decarboxilasa No.

especies analizadas

Principal Carbohidrato de almacén

Especies analizadas

Magnoliopsida (Dicotiledónea)

Aizoaceae ME 3 Almidón Mesembryantheum crystallinum

Cactaceae ME 5 Almidón Opuntia aurantiaca Portulacaceae PEPCK 1 Clusiaceae PEPCK 1 Fru/Glc Clusia rosea Crassulaceae ME 9 Almidón Kalanchoe tubiflora,

pinnata, daigremontiana Cucurbitaceae nd Almidón Xerosicyos danguyi Euphorbiaceae PEPCK 4 Asteraceae PEPCK 5 Asclepiadaceae PEPCK 3 Almidón Hoya carnosa PEPCK Almidón Stapelia gigantea Liliopsida (Monocotiledónea)

Agavaceae ME 3 No almidón Agave guadalajarana nd Fructanos Fourcroya humboldtiana Dracaenaceae ME 2 Suc Sansevieria hahnii Asphodelaceae PEPCK 5 Almidón/Glc Aloe vera PEPCK Galactomanano Aloe arborescens Orchidaceae ME 2 Almidón Vanilla planifolia Bromeliaceae PEPCK 16 Almidón Portea petropolitana PEPCK Fru/Glc/Suc Ananas comosus

nd, no determinado. Modificado de Christopher y Holtum, 1996.

38

Figura 12. Estrategias de flujo de carbono propuestas para especies CAM. A) Especies ME que almacenan almidón cloroplástico, B) Especies PEPCK que almacenan almidón cloroplástico, C) Especies PEPCK que almacenan carbohidratos extracloro-plásticos. a, NADP-ME citoplásmica o mitocondrial; b, piruvato-Pi-dicinasa; c, enolasa y fosfogliceromutasa; d, transportador Pi-triosa-P; e, PEPCK; MAL, malato; OAA, ácido oxalacético; PYR, piruvato; PEP, fosfoenol piruvato; T-P, triosa-fosfato. En D) Especies ME que almacenan carbohidratos extracloroplásticos; se ejemplifica para los que almacenan fructanos en la vacuola: GFFm, fructanos; GF, sacarosa; G, glucosa; F, fructosa; FBP, fructosa 1,6-difosfato; a, fructan exohidrolasa; b, invertasa; c, aldolasa; d, piruvato cinasa; e, glicólisis; f, PEPC; g, malato deshidrogenasa; h, canal específico para el transporte de MAL a la vacuola; i, transportador tipo Pi/TP; j, enzima málica. Modificado de Christopher y Holtum, 1996.

39

cuando utilizan el metabolismo CAM (0.63 vs 0.57 nmol cm-2 s-1); sin embargo, A. tequilana parece

ser una planta con metabolismo CAM obligado, desde que plantas micropropagadas no cambian

su funcionalidad estomatal (Santamaría et al., 1995).

Las ventajas del metabolismo CAM son evidentes cuando se mide la proporción de transpiración

(moles de agua transpirados/moles de CO2 fijados). Este parámetro toma un valor de 50 a 100

para plantas CAM, 200 a 350 para plantas C4 y de 500 a 1000 para plantas C3. Esto significa que

el proceso fotosintético puede continuar en plantas CAM después de extensos períodos de sequía

que pueden causar un cese completo de fotosíntesis en plantas C3 y restringir severamente la

fijación de CO2 en plantas C4 (Hopkins, 1995).

1.6.2.3. ACUMULACIÓN DE FRUCTANOS

El principal producto fotosintético de los agaves son fructanos, compuestos oligoméricos o

poliméricos constituidos por unidades β-fructofuranosil que se acumulan principalmente en su tallo

(López et al., 2003). El primer reporte de la presencia de este carbohidrato en agaves fue en 1888

(Suzuki, 1993), y aunque no existen evidencias científicas que comprueben la contribución de este

compuesto en la adaptación de los agaves en condiciones hostiles, investigaciones en otras

plantas modelo lo sugieren.

40

2. FRUCTANOS

En el reino vegetal, la mayoría de los carbohidratos se encuentran como polisacáridos de elevado

peso molecular; algunos son constituyentes estructurales y otros almacén de energía y carbono

(Mancilla-Margalli, 2000). El almidón es el carbohidrato de reserva más ampliamente distribuido,

seguido de sacarosa, glucomananos y fructanos, siendo este último de gran interés en el

desarrollo del presente trabajo.

Los fructanos se aislaron por primera vez en 1804 por el científico alemán Rose a partir de un

extracto de Inula helenium como una sustancia soluble que precipita con alcohol. Thomson (1818)

denominó inulina a esta sustancia que fue descrita en otras especies como Dahlia variabilis,

Helianthus tuberosus (1864), Hordeum vulgare (1878), Phleum pratense (1887), Agave (1888) y

microorganismos como Bacillus levaniformans (1901). Tanret (1891-1893) descubrió que la

hidrólisis de esta molécula produce principalmente unidades de fructosa (Fru) y sólo una pequeña

cantidad de glucosa (Glc) (Susuki, 1993).

En la actualidad se reconoce que los fructanos se encuentran en el 15% de plantas superiores

(≈45,000 especies), representados principalmente por familias altamente evolucionadas (Tabla 9).

Además, los fructanos también se encuentran en algunos hongos (Aspergillus, Penicillium y

Fusarium), algas (Acetabularia) y en varios taxa bacterianos (Bacillus, Erwinia, Pseudomonas,

Aceobacter, Streptococcus y Actynomices) (Vijn y Smeekens, 1999).

2.1. ESTRUCTURA

Con el establecimiento de la química moderna de carbohidratos, el grupo británico de Norman

Haworth (Premio Nobel de Química 1937) realizó estudios para determinar la estructura de la

inulina y sus derivados, concluyendo que está constituida por moléculas de Fru unidas por los

carbonos 1 y 2. En 1950 Hirst demostró que la Glc es parte de la molécula y no un contaminante

como se creía anteriormente. En la actualidad se sabe que los fructanos presentan estructuras

variadas y de acuerdo al comité de nomenclatura del Primer Simposio Internacional de Fructanos

(Alemania, 1988) se definió a los fructanos como moléculas con uniones β-furanosilfructosa

principalmente, y donde la Glc no necesariamente es parte de la definición.

Las unidades estructurales básicas de los fructanos se forman por la transferencia de una Fru a

uno de los tres hidroxilos primarios presentes en la sacarosa (Suc, Figura 13). Los trisacáridos

formados (DP3) se denominan kestotriosas en honor al lugar donde su potencial industrial fue

41

reconocido (Kingston, Inglaterra) (Suzuki, 1993). La transferencia de una Fru al oxígeno del C1 o

C6 de la Fru en una molécula de Suc genera la 1-kestotriosa (1-Kes) y 6-kestotriosa (6-Kes),

respectivamente, de acuerdo a la nomenclatura propuesta por Waterhouse y Chatterton (1993);

mientras que la adición de una Fru al oxígeno del C6 de la Glc, genera la neokestosa (6G-Kes).

La 1 y 6-kestotetraosa (o bifurcosa) por su parte, es un tetrasacárido (DP4) ramificado, es formado

por la transferencia de una Fru al grupo hidroxilo disponible del carbono 6 o 1 en la Fru interna de

la 1-Kes o 6-Kes, respectivamente (Figura 13). La subsecuente transferencia de Fru a cualquiera

de estos isómeros forman polímeros que de acuerdo al tipo de enlace se clasifican como sigue:

Tabla 9. Ocurrencia de fructanos en Angiospermas.

Se indica la distribución de estas especies. Modificada de Hendry y Wallace, 1993.

Familias Especies estimadas

Región de mayor distribución

Monocotiledóneas Poales Gramineae 8,000 Frío-templado cálido Asparagales Amaryllidadeae 1,100 Templado cálido-tropical Agavaceae 700 Semiárido-tropical Haemodoraceae 100 Tropical-subtropical Iridaceae 1,800 Cosmopolita Alliaceae 3,500 Cosmopolita Xanthorrhoeaceae 60 Árido subtropical Dicotiledóneas Asterales Compositae 25,000 Cosmopolita Campanulales 1,800 Templado Stylidiaceae 150 Semiárido Goodeniaceae 300 Semiárido Dipsacales Calyceraceae 60 Semiárido Polemoniales Boraginaceae 2,000 Templado-subtropical Menyanthaceae 40 Cosmopolita-acuática Polemoniaceae 300 Cálido-templado frío Ericales Pyrolaceae 40 Templado frío-subtropical Clethraceae 120 Subtropical-tropical Total ≈45,000

42

Figura 13. Unidades estructurales de los fructanos. Las kestotriosas se forman por la transferencia de una β-fructosil-transferencia a cualquiera de los hidroxilos primarios de la sacarosa. El tetrasacárido ramificado, bifurcosa, se genera por transferir una fructosa a una kestotriosa.

i).- Inulina, polímero lineal de unidades D-Fruf con enlaces β(2-1) y una Glc en el extremo (G1-

2F1-2). Esta molécula se encuentra principalmente en dicotiledóneas y ha sido más estudiada en

Asteraceae como achicoria (Cichorium intybus), alcachofa Jerusalem (Helianthus tuberosus),

alcachofa (Cynara scolymus), diente de león (Taraxacum officinale), dalia (Dahlia variabilis) y

yacon (Polymnia sonchifolia) (Van Laere y Van den Ende, 2002).

ii).- Levano (o específicamente fleína cuando se refiere a plantas), es un polímero lineal con

enlaces β(2-6). Su unidad estructural es la 6-Kes (G1-2F6-2Fn). Se encuentra en pastos como

Phleum pratense y Dactylis glomerata. En general, las bacterias productoras de fructanos

presentan este tipo de estructura, con pocas excepciones como Streptococcus mutans que

produce inulinas.

43

iii).- Graminano, fructano que contiene ambos tipos de enlace. Generalmente son estructuras

ramificadas con bifurcosa como unidad básica. Se encuentra en algunas Poaceae como trigo

(Triticum aestivum) y cebada (Hordeum vulgare) (Pavis et al., 2001).

iv).- Inulina neoserie, estructuralmente basada en la 6G-Kes (mF2-1F2-6G1-2F1-2Fn). Es un

polímero formado por adiciones de Fru a uno o ambos extremos de la 6G-Kes mediante enlaces

β(2-1). Las Asparagaceae como espárrago (Asparagus officinalis) y cebolla (Allium cepa) son

algunos ejemplos (Ritsema et al., 2004).

v).- Levano neoserie, polímero similar a la inulina neoserie pero sus enlaces son de tipo β(2-6).

Este es el fructano menos común, se presenta en pocas especies de Poales como avena (Avena

sativa) y Lolium spp. (Pavis et al., 2001a).

vi).- La serie inulo-n-osa (donde n indica el número de unidades de Fru, inulobiosa, inulotriosa, etc,

hasta n=18), se ha encontrado en algunas especies de Asteraceae. Pensando que podrían ser

productos de hidrólisis, se buscó sin éxito la presencia de alguna α-glucosidasa y sólo

recientemente se ha evidenciado que forman parte del metabolismo de los fructanos (Van den

Ende et al., 1996b).

2.1.1. MÉTODOS ANALÍTICOS

Las estructuras de fructanos se han elucidado con técnicas analíticas que separan y/o identifican

los diferentes isómeros. La cromatografía en papel y en capa fina (TLC), fueron las primeras

técnicas usadas en la identificación de fructanos. Dependiendo de la fase estacionaria

(generalmente silica gel) y el sistema de eluyentes, pueden resolverse fructo-oligosacáridos (FOS)

hasta de 14 unidades o grado de polimerización (DP) e incluso es posible identificar los tres

isómeros de kestotriosa (Sims et al., 1992; Cairns et al., 1999). La cromatografía líquida de alta

resolución (HPLC) también ha sido utilizada con columnas de silica aminada y de fase reversa C8

y C18 usando agua para eluir los carbohidratos (Bancal et al., 1993).

El pKa de los OH en los carbohidratos, oscilante entre 12 y 13, se aprovecha en la separación de

fructanos en soluciones alcalinas, a través de la cromatografía de intercambio aniónico de alta

resolución acoplado generalmente, a un detector de pulso amperométrico (HPAEC-PAD).

Utilizando las columnas PA1 (preparativa) o PA100 (analítica), los fructanos se eluyen con un

gradiente creciente de acetato de sodio, manteniendo constante el NaOH cuya concentración

determina la resolución de los compuestos. En esta cromatografía, el ión acetato se intercambia

44

por el anión carbohidrato, desplazando así a los diferentes fructanos. Por su parte, la detección del

PAD se basa en la medición de la corriente producida por la oxidación de los carbohidratos en un

electrodo de oro (Bancal et al., 1993).

En la caracterización de fructanos, una herramienta concurrida es la resonancia magnética nuclear

(NMR), principalmente de 13C y con menor frecuencia de H, donde los desplazamientos químicos

de Suc, inulina, levanos y graminanos han sido determinados (Carpita et al., 1991; Praznik et al.,

1992; Shiomi, 1993; Pavis et al., 2001a; Sims, 2003). Esta técnica no destructiva generalmente se

complementa con la cromatografía de gases (GC) de fructanos derivados a alditol acetato

parcialmente metilados (PMAA). En esta técnica los OH libres de la molécula son completamente

metilados por la adición de CH3I y posteriormente hidrolizados, generando monosacáridos con

nuevos grupos OH que son reducidos y acetilados (Carpita y Shea, 1989). Los PMAA son

separados en un GC acoplado a un espectrómetro de masas (MS) para su identificación o a un

detector de ionización en flama (FID) para fines cuantitativos (Addison y Ackman, 1968; Jorgensen

et al., 1990).

2.1.2. ESPECIFICIDAD ESTRUCTURAL

Los fructanos se encuentran en las plantas como una mezcla polidispersa de variados DP,

pudiendo presentar distintas estructuras aún en el mismo tejido. A pesar de esta diversidad, se ha

determinado que cada especie acumula fructanos con una estructura e intervalo de DP

característico (Figura 14A). Por ejemplo, las dicotiledóneas generalmente almacenan inulina

(Vergauwen et al., 2003) y dentro de éstas, achicoria y cardo (Echinops ritro), pertenecientes al

orden Asteracea, presentan fructanos de distinta longitud, hasta 20 y 45 DP, respectivamente

(Figura 14B). Esta diferencia se atribuye a diferentes propiedades cinéticas de las

fructosiltransferasas (FT), enzimas involucradas en el metabolismo de fructanos. Las FT de

achicoria tienen mayor afinidad a los inulo-oligosacáridos (IOS), mientras que las de cardo lo son a

inulinas de mayor DP (Hellwege et al., 1998; Vergauwen et al., 2003).

De igual manera, la diversidad de estructuras presente en monocotiledóneas parece seguir un

patrón taxonómico (Cairns y Ashton, 1993). Bonnet et al. (1997) propusieron que la determinación

estructural es un criterio confiable en la clasificación de las tribus que conforman a la familia

Poaceae (Tabla 10); por ejemplo, la tribu Triticeae con los géneros Triticum, Secale, Hordeum,

Elytrigia presentan graminanos, en tanto que la tribu Aveneae, con los géneros Avena y Lagurus,

45

contienen predominantemente levanos y neofructanos en menor cantidad. Este criterio es apoyado

por la identificación de estructuras de fructanos en miembros del orden Asparagales (Sims et al.,

2001; Sims, 2003). En estas especies se encuentra una diversidad de estructuras, siendo más

parecidas aquellas en especies taxonómicamente más relacionadas; por ejemplo, especies de

Phormium tenax y P. cookianum (familia Phormiaceae), Cordyline australis (Asteliaceae) y Agave

vera cruz (Agavaceae) contienen fructanos basados en 1-Kes, 6G-Kes y bifurcosa; mientras que

géneros más alejados como Allium cepa (Alliaceae) y Asparagus officinalis (Asparagaceae)

presentan estructuras lineales predominantemente con Glc interna (Sims et al., 2001).

2.2. METABOLISMO

Los fructanos se sintetizan en la vacuola como respuesta a la acumulación de sacarosa (Suc) en

este organelo, por la acción de una serie de enzimas conjuntamente denominadas

fructosiltransferasas (FT). De acuerdo al modelo clásico de Edelman y Jefford (1968), la síntesis

de inulina en H. tuberosus, inicia con la enzima sacarosa:sacarosa 1-fructosiltransferasa (1-SST,

Figura 14. Rango de grados de polimerización (DP) en especies que acumulan fructanos. A) Porcentaje acumulativo de DP (modificado de Van Loo et al., 1995); B) Patrón cromatográfico HPAEC-PAD característico de achicoria y cardo. G, Glc; F, Fru; S, Suc; K, 1-Kes; N, Nys; F2, inulobiosa; F3, inulotriosa; F4, inulotetraosa; los números indican los DP de la serie inulina. Modificado de Vergauwen et al., 2003.

46

Tabla 10. Predominancia estructural de los fructanos según la especie. Especie Estructura Rango promedio DP Referencia

ASTERALES 2-19 20-40 >40 Cichorium intybus Inulina, inulo-n-osa 55 18 17 157, 201 Helianthus tuberosus Inulina, inulo-n-osa 74 20 6 157, 58 Taraxacum officinale Inulina, inulo-n-osa 41 31 28 157, 58 Cynara scolymus Inulina - 13 87 157, 76 Dahlia variabilis Inulina 31 21 40 157 POALES Tribu Triticeae Triticum aestivum graminanos/ramificados 20 Hordeum vulgare graminanos/ramificados 20 Tribu Bromeae Bromus tectorum graminanos/ramificados 20 Tribu Aveneae Avena sativa Levanoneoserie 20, 224 Lagurus ovatus Levanoneoserie 20 Tribu Poeae Lolium rigidum Inulina, inulineoserie, graminanos,

levanos 20, 148

Lolium perenne Inulina, neofructanos, levanos, ramificado

148

Dactylis glomerata levanos 20, 148 ASPARAGALES Alliaceae Allium sativa Inulineoserie 30 40 30 215 Allium cepa Inulineoserie 100 - - 215 Allium amploprasum Inulineoserie 80 16 4 215 Asparagaceae Asparagus officinalis Inulineoserie 180 Agavaceae Agave vera cruz Ramificado 51 Agave deserti Inulina, neofructano 228 Phormiaceae Phormium tenax Inulina, neofructano, ramificado 182 Phormium cookianum Inulina, neofructano, ramificado 182 Bulbinella hookeri Inulina* 183

*, primer reporte de una especie miembro del orden Asparagales que contiene inulina como fructano predominante.

E.C.2.4.1.99) que transfiere irreversiblemente unidades de Fru de una molécula de Suc donadora

a otra Suc receptora a través de un enlace β(2-1) (Gupta y Kaur, 2000; Figura 15):

G-F + G-F → G-F-F + G

donadora receptora

47

Una segunda enzima, la fructan:fructan 1-fructosiltransferasa (1-FFT, E.C.2.4.1.100), elonga la

cadena transfiriendo reversiblemente unidades de Fru de un fructano a otro o incluso a Suc, que

también actúa como aceptor de Fru:

G-(F)m + G-(F)n ⇔ G-(F)m-1 + G-(F)n+1

donde m > 1 y n > 0

De la diversidad estructural en monocotiledóneas, es evidente la participación de otras FT en la

síntesis de enlaces β(2-6) y ramificaciones. Satyanarayana (1976a) reportó actividad 1-SST en

una fracción cromatográfica de Agave vera cruz, y la presencia de 1-FFT fue también sugerida

para explicar la síntesis in vitro de 1,1-kestotetraosa (DP4 inulina o Nys) e IOS superiores

formados después de tiempos mayores de incubación (Satyanarayana, 1976b); sin embargo,

durante el ensayo enzimático no hubo formación de fructanos basados en 6G-Kes ni estructuras

con enlaces β(2-6) ni moléculas ramificadas como se observa in vivo (Satyanarayana, 1976c).

Dorland et al. (1977) discutieron la posible actividad para una fructosil-transferencia al C6 de la Glc

de 1-Kes o fructanos superiores (formación de neofructanos). Este tipo de actividad denominada

fructan:fructan 6-glucosa-fructosiltransferasa (6G-FFT) fue primeramente descrita en cebolla

(Henry y Darbyshire, 1980) y ajo (Darbyshire y Henry, 1981), y posteriormente purificada de raíces

de espárrago (Shiomi 1981; 1982). La actividad característica de esta enzima es la formación de

FOS con residuos de Glc interna por la transferencia de Fru de la 1-Kes o IOS a Suc o IOS

formando un enlace β(2-6) sobre el C6 de la Glc (Ritsema y Smeekens, 2003; Ueno et al., 2005).

Esta reacción es reversible: la 6G-FFT transfiere Fru de la 6G-Kes a la Suc formando 1-Kes,

aunque a una velocidad mucho menor (Shiomi, 1982):

G-F-Fm + G-Fn ⇔ G-Fm-1 + F-G-Fn+1

m, n ≥1

Los enlaces β(2-6) de graminanos y levanos presentes en Poaceae, se forman por acción de la

sacarosa:fructan 6-fructosiltransferasa (6-SFT, E.C. 2.4.1.10). Esta enzima utiliza Suc como

donador de Fru a una amplia variedad de fructanos de diferente estructura y DP, formando

exclusivamente enlaces β(2-6). La 6-SFT a diferencia de la 1-FFT, usa fructanos como fructosil-

48

Figura 15. Diferentes vías biosintéticas de fructanos en plantas superiores. En plantas que sintetizan fructanos, la acumulación vacuolar de sacarosa induce la síntesis de novo de la 1-SST y acumulación de 1-kestotriosa. La acción de diferentes fructosiltransferasas sobre este metabolismo genera la diversidad estructural encontrada de manera específica en cada especie.

49

aceptores pero no como donadores (Duchateau et al., 1995); esta característica no es trivial, ya

que la fructosil-transferencia de Suc a fructanos es exergónica e irreversible (Figura 15).

Al parecer, la 1-Kes es el metabolito central a partir del cual se forman las diversas estructuras por

acción de distintas FT, lo que implica que la 1-SST es ubicua en las plantas que almacenan

fructanos. Sin embargo, la presencia de 6-Kes principalmente en gramíneas, ha sugerido la

existencia de una 6-SST, actividad aún no confirmada. Chatterton y Harrison (1997) apoyaron esta

idea al observar que Poa ampla crecida en un régimen de 10/5°C día/noche presentó

exclusivamente levanos pero nunca 1-Kes. Por otra parte, la expresión heteróloga de la 6-SFT en

tabaco (Sprenger et al., 1995 y 1997) evidenció que en presencia únicamente de Suc, la 6-SFT

actúa como invertasa (78%) pero también usa la Suc como aceptor formando la 6-Kes (20%) e

incluso también actúa como 1-SST al sintetizar 1-Kes (15%). La característica de transferasa de

esta enzima cambia significativamente de acuerdo al sustrato (Duchateau et al., 1995;

Hochstrasser et al., 1998):

G-F + G-F-F → G-F(F)-F + G

donador 1-Kes 1y 6-kestotetraosa (bifurcosa) Actividad 6-SFT

G-F + G-F → G + G-F-F

donador aceptor 6-Kes Actividad 6-SST

G-F + H2O → G + F

donador aceptor Actividad β-fructosidasa

En el proceso de degradación de fructanos participan la 1-FFT y las fructan exohidrolasas (FEH,

E.C.3.2.1.80). La 1-FFT transfiere Fru de fructanos a la Suc o fructanos con DP menor; mientras

que las FEH con actividad exolítica hidrolizan la Fru del extremo reductor del sustrato,

disminuyendo en uno su DP (De Roover et al., 1999; Van den Ende et al., 2004):

G-F-(F)m + H2O → G-(F)m-1 + F

m ≥1

Basado en la diferencia de energía libre de los enlaces glicosídicos, las FEH exhiben especificidad

de sustrato, por lo que se clasifican como 1-FEH o 6-FEH si hidrolizan preferentemente enlaces

β(2-1) o β(2-6), respectivamente (Henson y Livingston, 1996). Recientemente, se caracterizó en

trigo la 6-kestosa exohidrolasa (6-KEH), una FEH altamente específica a la 6-Kes, y a diferencia

de todas las demás, no es inhibida por Suc (Van den Ende et al., 2005). Así mismo, en achicoria

existen isoformas (1-FEH I, 1-FEH IIa, 1-FEH IIb) con diferentes puntos isoeléctricos (pI) (Tabla

50

11), propiedades cinéticas y patrón de expresión. La clasificación de las FEH como E.C.3.2.1.80

es inexacta, pues esto refiere a las β-fructofuranosidasas, enzimas capaces de hidrolizar fructanos

y Suc; mientras que las FEH son inactivas ante Suc e inactivadas por este mismo metabolito (De

Coninck et al., 2005). Algunas FEH son solubles en la vacuola mientras que otras insolubles

interactúan con la pared celular. Hasta hace poco se creía que la FEH asociada a la pared celular

no tenía contacto con su sustrato; sin embargo, Livingston y Henson (1998) demostraron la

presencia de fructanos en el apoplasto de avena.

2.2.1. COMPLEJIDAD METABÓLICA

El modelo 1-SST/1-FFT propuesto por Edelman y Jefford (1968), fue severamente criticado por la

posible presencia de artefactos en ensayos enzimáticos (la invertasa puede sintetizar los DP3),

con frecuencia los fructanos sintetizados in vitro no corresponde con aquellos presentes en los

tejidos e incompatibles características cinéticas de las enzimas con condiciones de sustrato in vivo

(Cairns y Ashton, 1991; Cairns, 1993). La purificación a homogeneidad de algunas enzimas

(Koops y Jonker, 1996; Van den Ende and Van Laere, 1996b; Van den Ende et al., 1996a,b,c;

Lüscher et al., 1996; 2000) y la expresión heteróloga de sus ADNc (Tabla 11) han permitido la

validación del modelo y una caracterización refinada; encontrándose que el metabolismo es

complejo, las enzimas tienen actividades traslapadas que dependen de la concentración y tipo de

sustrato, sus propiedades cinéticas pueden ser solo estimadas, un mismo factor induce una

actividad e inhibe otra. Las enzimas anabólicas, catabólicas y sus sustratos se encuentran en el

mismo compartimento vacuolar, lo que implica un control enzimático altamente regulado.

2.2.2. CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA

La acumulación de Suc en la vacuola es un punto de control en el metabolismo de fructanos; ésta

induce la síntesis de novo de la 1-SST e inhibe al mismo tiempo a la FEH, indicando una

regulación transcripcional de ambos genes de manera opuesta (Asega y Machado, 2004). La

concentración umbral de Suc que induce la síntesis de fructanos depende de la especie e incluso

del tejido (Pavis et al., 2001b); por lo general el valor de la Km de 1-SST es alto y el de la FEH es

bajo (Tabla 11), hecho crítico para que ambas reacciones se lleven a cabo en el mismo organelo.

Aunque el metabolismo puede ser distinto en cada especie, se ha mostrado en trigo, achicoria,

yacon y Lolium temulentum la actividad simultánea de estas dos enzimas, sugiriendo que la FEH

51

Tabla 11. Propiedades cinéticas de distintas fructosiltransferasas. Enzima Origen 1P.M.

(kDa)

2pI 3pH op

4T° op

Donador Aceptor Producto Comentario Referencia

1-SST Helianthus tuberosus

55 y 27

3.5-5 20-25

Suc Suc DP3>DP4 102

1-SST5 Hordeum vulgare

50 y 22

4.93 & 4.99

nd nd Suc 1-Kes

Suc Agua

1-Kes Suc + F

113

1-SST5 Helianthus tuberosus

59 y 26

4.89, 4.94, 4.98, 5.02, 5.09

Suc 1-Kes

Suc Agua 1-Kes

1-Kes>Nys >DP5 Suc Nys>DP5

112

1-FFT Cichorium intybus

52 y 17

4.3 5.5-6.5

0 1-Kes Km 13 mM > 1-Kes Km 119 mM > DP4 Km 152 mM > DP5 < fructanos DP < DP+1

Suc > 1-Kes > Nys > FOS > Fructanos DP+1

1-Kes DP4-7 DP + 1 DP + 1 DP + 1

206

6-SFT5,6 Hordeum vulgare

49 y 23

4.9 & 5.1 Suc

Suc > Agua 1-Kes

6-Kes+Fru Fru + Glc Bifurcosa

53

6G-FFT Allium cepa

52 y 25

5.68 nd 1-Kes, Km 83 mM 6G-Kes

1-Kes Suc Suc

6G-Kes, DP4-6 neo & inulina 6G-Kes 1-Kes

59

6G-FFT6

Asparagus officinalis

68 5.4 5.3 1-Kes Suc, IOS 6G-Kes, Neo >>IOS

201

1-FEH Triticum aestivum

70 4.9 213

1-FEH II Cichorium intybus

64 5.2 5.5 35 β(2-1)>β(2-6) Agua DP-1 + Fru Inhibición por Suc, Ki 5.9 mM

48

52

1-FEH IIa Cichorium intybus

5.2 Inhibición por Suc, Ki 6 mM

6-FEH Dactylis glomerata

57 5.5 levano Km 91 mM > graminano > inulina

agua DP-1 + Fru

6-FEH Lolium perenne

69 4.7 5.1-5.6 levano bifurcosa > inulina > Suc

agua DP-1 + Fru DP-1 + Fru Glc + Fru

Inhibición por Suc 119

6-FEH7 Beta vulgaris

36, 20, 19 5.0 30 levanos neolevanos levanbiose 6-kes, Km77mM

agua DP-1 + Fru Inhibición por Suc, Ki, 134 mM 213

6-KEH6,7 Triticum aestivum

72 4.9 nd nd 6-Kes Km, 29 alta/específico

agua Suc + Fru

No inhibida por Suc 215

1-FEH Triticum aestivum

70 4.9 212

6-FEH AtcwINV3

Arabidopsis thaliana

~ 72 5.4 Levanos agua levano-1 + Fru

45

1,6-FEH AtcwINV6

Arabidopsis thaliana

~ 72 4.9 levanos > inulina agua DP-1 + Fru

45

1, Peso molecular; 2, punto isoeléctrico; 3, pH óptimo de reacción; 4, temperatura óptima de reacción;5, isoformas; 6, funcionalidad ensayada en sistemas heterólogos; 7, localización apoplástica.

53

también influye en el patrón de fructanos acumulados (Itaya et al., 2002; Van den Ende et al.,

2003a).

En trigo, la Suc induce la 1-SST y 6-SFT comportamiento totalmente abolido en presencia de

cordicepina o cicloheximida, inhibidores de la transcripción y traducción, respectivamente,

indicando una regulación a estos niveles (Figura 16A) (Martinez-Nöel et al., 2001). En presencia

de un inhibidor de invertasa vacuolar (2,5-dideoxi-2,5-imino-D-manitol. Dim) la Suc aún induce la

expresión, indicando que esta acción se debe a ésta y no a sus productos de degradación (Müller

et al., 2000), al parecer esto es independiente de hexocinasas y quizás a través de una cascada

de transducción de señales que involucra receptores de membrana, segundos mensajeros,

proteín-cinasas y factores de transcripción (Figura 16B) (Müller et al., 2000; Martinez-Nöel et al.,

2001) ). Probablemente, al ser la Suc citosólica la pequeña fracción de Suc total (la mayor parte

se almacen en la vacuola como fructanos) responde a pequeños cambios citosólicos regulando la

expresión de estos genes (Nagaraj et al., 2004). Sin embargo, la regulación de los transcritos 1-

SST y 6-SFT parece ser distinta: la acumulación de Suc induce la expresión inmediata de 1-SST y

acumulación de 1-Kes, y solo después de una fase lag se observa la expresión de 6-SFT y la

síntesis de sus productos (Figuras 16C y 16D); además también se ha observado que el ARN de

la 6-SFT decrece con el tiempo a pesar de que la Suc se mantiene constante (Lu et al., 2002). Por

su parte, la actividad constitutiva de 1-FFT participa en la flexibilidad metabólica de los fructanos a

través de su naturaleza reversible, elongando o acortando las moléculas de acuerdo a la

concentración de los sustratos, de la misma enzima y de la relación (1-SST+1-FFT)/Suc (Van den

Ende y Van Laere, 1996c). Las propiedades cinéticas de la 1-FFT que la hacen más afín a un

sustrato o a otro son específicas para cada especie (Hellwege et al., 1998; 2000), aunque el

patrón de los fructanos también depende de la concentración de las FT: a mayor concentración de

enzima se sintetizan fructanos de mayor DP (Van den Ende y Van Laere, 1996a). La Suc no es

donador para la 1-FFT pero puede ser un buen aceptor (Km 0.2-6 mM), formándose rápidamente

la 1-Kes seguido de una fase lag para la síntesis de fructanos superiores, por lo que una

concentración umbral de 1-Kes/Suc debe alcanzarse para que la 1-Kes compita eficientemente

como aceptor (Van den Ende et al., 1996b). Cuando esta relación alcanza un valor de 1.5

(determinada in vitro en achicoria) la 1-SST actúa como 1-FFT y sintetiza IOS hasta DP5 (Van den

Ende et al., 1996c).

54

Figura 16. Regulación de la actividad de fructosiltransferasas. En A) y B) las hojas de trigo fueron cortadas y puestas en oscuridad en una solución de Suc 0.5 M o de Suc más el inhibidor indicado: A) C, control (agua); S, Suc 0.5 M; CHX, cicloheximida 5 µg/mL (inhibidor de la traducción); COR, cordicepina 200 µg/mL (inhibidor de la transcripción). B) S, Suc 0.5 M; G, genisteína 100 M (inhibidor de tirosin-proteín cinasa); TFP, trifluoroperazina 200 µM (inhibidor de la estimulación dependiente de calcio de la 3´:5´-nucleótido cíclico fosfodiesterasa); W7, N-(6-aminohexil)-5-cloro-1-naftaleno sulfonamida 200 µM (antagonista de calmodulina); ST, staurosporina 2 M (inhibidor de proteín-cinasas dependdiente de calcio; OA, ácido okadaico 1 µm (inhibidor de proteín fosfatasas). En C) y D) hojas de cebada cortadas fueron expuestas a luz para inducir la acumulación de fotosintatos; C) Actividades de 1-SST y 6-SFT; D) Expresión de los transcritos de 1-SST y 6-SFT; el transcrito de ubiquitina es utilizado como referencia. Modificada de Martinez-Noel et al., 2001 y Nagaraj et al., 2004.

55

La Inv-V (E.C.3.2.2.26 G-F → G + F) está involucrada también en el metabolismo de fructanos.

Esta enzima no solo se localiza en la vacuola y regula el nivel de Suc, sino que además compite

por este sustrato con alta afinidad (Km 2-34 mM para actividad Inv vs 100-500 mM para actividad

FT), hidroliza los DP3 y en alta concentración de Suc los sintetiza (Km 100-300 mM) (Cairns y

Ashton, 1991; Kingston-Smith et al., 1999); mientras que en baja concentración de sustrato y

temperaturas altas, las FT actúan como Inv-V (Van den Ende et al., 1996c). La activación de la

Inv-V disminuye la concentración de Suc e induce la actividad de la FEH. La Fru acumulada por el

ataque exolítico de fructanos inhibe a su vez a la Inv-V (Ki 2.5 mM en L. temulentum y 118 mM en

H. vulgare) (Kingston-Smith et al., 1999; Wang et al., 2000) y en Asteraceae, ésta es aceptor de 1-

FFT (Km 199 mM), formándose la serie inulo-n-osa observada en estas especies durante el

invierno o en el florecimiento (Van den Ende et al., 1996b). La acumulación de Suc o Fru

desplazan el equilibrio de la 1-FFT hacia el catabolismo, acortando el DP de los polímeros al usar

la Fru o Suc como fructosil-aceptores (Van den Ende et al., 1996b).

Una actividad intrínseca de 1-FFT ha sido confirmada recientemente en la 6G-FFT de cebolla

(Fujishima et al., 2005) y de Lolium perenne (Lasseur et al., 2006). La expresión de sus

respectivos ADNc en sistemas heterólogos mostró que estas enzimas sintetizan IOS a partir de 1-

Kes (Vijn et al., 1997; Ritsema et al., 2003; Lasseur et al., 2006). En células de tabaco, la 6G-FFT

produjo un patrón de fructanos similar a lo encontrado en el tejido usando 1-Kes como único

sustrato, por lo que Ritsema et al. (2003) proponen que en cebolla, un sistema de dos enzimas (1-

SST/6G-FFT) es suficiente para la síntesis de fructanos. Fujishima et al. (2005) refuerzan esta

idea al caracterizar la enzima purificada. Este sistema parece diferente en espárrago, cuya enzima

presenta alta especificidad de 6G-FFT sin otra actividad aparente; su alta actividad relativa 1-

FFT/6G-FFT, sugiere que esta especie presenta un sistema de tres enzimas (1-SST/1-FFT/6G-

FFT). La 6G-FFT purificada de Lolium spp., no es capaz de sintetizar DP>6 ni explicar la

presencia nativa de neolevanos de alto peso molecular (St John et al., 1997); sin embargo la

caracterización molecular de la 6G-FFT en Lolium perenne, demostró una actividad 1-FFT para

esta enzima (Lasseur et al., 2006).

2.2.3. CARACTERIZACIÓN MOLECULAR

El primer ADNc aislado de una FT vegetal fue la 6-SFT de cebada (Sprenger et al., 1995), seguido

de muchas otras. La caracterización molecular de estos ADNc han deducido algunas

56

generalidades para las FT: los heterodímeros que conforman a estas enzimas se codifican en un

solo marco de lectura (ORF) traducido en un producto de ≈85 kDa que es procesado

postraduccionalmente en un subunidad larga N-terminal de ≈60 kDa y una subunidad pequeña C-

terminal de ≈25 kDa (Altenbach et al., 2004). En sistemas heterólogos, los ADNc expresados no

se procesan en dos subunidades como ocurre in planta, pero su análisis funcional sugiere que

este hecho no es necesario para la actividad (Lüscher et al., 2000). Aunque se sabe poco del

mecanismo de regulación de las FT, durante el mapeo del gen de la 6-SFT en distintas variedades

de cebada, se observó que a pesar de una alta homología, existe polimorfismo en regiones

codificadoras y principalmente intrónicas, que pueden contribuir a regular la expresión del gen y

determinar la variación estructural y cuantitativa de los fructanos presentes en gramíneas (Wei et

al., 2000).

La similitud de actividades en Inv-V y FT es confirmado por la alta identidad de aminoácidos entre

estas enzimas (del 42 a 56% de identidad) (ver más adelante), despertando el interés de posibles

relaciones moleculares y evolución funcional (Kawakami y Yoshida, 2002). Se sugiere que las FT

derivaron de las Inv-V por pequeños cambios mutacionales en su secuencia codificadora, hecho

sugerido porque la levansucrasa de Bacillus subtilis cambia sus actividades de polimerasa a

hidrolasa con una única sustitución de arginina-331 en su secuencia (Chambert y Petit-Glatron,

1991).

A diferencia de las FT, se han aislado pocos ADNc de FEH: 1-FEH I, IIa y IIb de achicoria,

Campanula rapunculoides, 6-FEH y 6-KEH de trigo y también sorprendentemente de especies que

no sintetizan fructanos como la 6-FEH de betabel y dos de Arabidopsis thaliana (AtcwINV3 es una

6-FEH y AtcwINV6 hidroliza ambos enlaces) (De Coninck et al., 2005). El análisis de aminoácidos

muestra que dichas enzimas, tienen mayor similitud a las invertasas de pared celular (Inv-cw) (43

a 59%) que a Inv-V (40 a 41%). Van den Ende et al. (2004) especulan que las FEH evolucionaron

a partir de β-fructosidasas extracelulares de bajo pI que degradaban Suc y fructanos, como

algunas enzimas microbianas actuales, y cuya especialización se dio para evitar interferencias en

acciones hidrolíticas de la FEH con procesos de carga y descarga de la Suc al floema. Las FT

pudieron dar lugar a las FEH vacuolares por la fusión de una señal de dirección vacuolar a una

FEH extracelular preexistente.

57

2.2.4. FAMILIA GH32

Las enzimas glicosilhidrolasas (GH), se clasifican en ≈90 familias en base a la similitud de su

secuencia de aminoácidos que implica una relación mecanística y en estructura tridimensional

(3D). Las Inv, Suc-6-fosfato-hidrolasas, inulinasas, levanasas, FT de hongos y vegetales están

clasificadas en la familia GH32 (Figura 17); mientras que las FT bacterianas e invertasas de la

bacteria Zymomonas mobilis y Bacillus sp. pertenecen a la familia GH38. Estas dos familias se

agrupan en el clan GH-J y junto con el clan GH-F (familias GH43 y 62) forman la superfamilia β-

furanosidasa (Pons et al., 2004).

. I II

Gd-LsdA APHAAD---TPQWRPVLHFSPAAYWMNDPNGPILLDGVYHLFYQYAPGSMTWGHPSWGHA 89

Bs-Lev ADAADSSYYDEDYRPQYHFTPEANWMNDPNGMVYYAGEYHLFYQYHPYGLQWGPMHWGHA 81

Tm-Inv -----------MFKPNYHFFPITGWMNDPNGLIFWKGKYHMFYQYNPRKPEWGNICWGHA 49

Dc-Inv PSYPWTNDMLSWQRTSFHFQPQENWMNDPNGPLFHMGWYHLFYQYNPDSAIWGNITWGHA 177

Ao-Inv GQYPWTNKMLSWQRTGFHFQPEKNWMNDPNGPLYYKGWYHFFYQYNPNAAVWGDIAWGHA 164

Ac-6GFFT -EFPWTNDMLAWQRCGFHFRTVRNYMNDPSGPMYYKGWYHLFYQHNKDFAYWGNITWGHA 117

. : ** . :****.* : * **:***: ** ****

III

Gd-LsdA TSTDLLHWTEHGVAIAATP--GEEIFSGSLVPDPLNRSGLGSTDAPPLLAFHTSVFHDNP 147

Bs-Lev VSKDLVTWEHLPVALYPDE--KGTIFSGSAVVDKNNTSGFQTGKEKPLVAIYT------- 132

Tm-Inv VSDDLVHWRHLPVALYPDDETHG------------VFSGSAVEKDGKMFLVYTY--YRDP 95

Dc-Inv ISRDLINWLHLPFAMQPDQ--WYDING-------VWTGSATILPDGKIVMLYTG--DTDD 226

Ao-Inv VSKDLLSWRHLPLAMVPDR--WYDING-------VWTGSATILPDGRIIMLYTG--ATNE 213

Ac-6GFFT VSRDLINWQHLPVAVGPDH--WYDISG-------VWTGSIIVVSEDRVVMLFTG--GTKS 166

* **: * . .*: . ..: . .. :. ..* .

IV

Gd-LsdA AHPDGTQAQSVSVSHDGGFTWRPYAH-NPVLTLHPDSR--QFRDPSVFWYQD-GGC.... 199

Bs-Lev QDREGHQVQSIAYSNDKGRTWTKYAG-NPVIP-NPGKK--DFRDPKVFWYEK-EKK.... 183

Tm-Inv THNKGEKETQCVAMSENGLDFVKYDG-NPVISKPPEEGTHAFRDPK---VNRSNGE.... 147

Dc-Inv LVQVQNLAYPANLSDPLLLDWIKYPD-NPVMFPPPGIGSTDFRDPTTAWIGP-DGK.... 280

Ao-Inv SVQVQNLAVPADLSDPLLLEWTKVDDANPILVPPPGVGATDFRDPTTAWFEPSDST.... 269

Ac-6GFFT FDQSINLAEAADPSDPLLLKWIKYDN-NPILWPPPGIVRDDFRDPNPIWYNASEST.... 221

: **:: * ****.

V VI

Gd-LsdA WLDHGADQYATTLFA... 320 ..... EVALHLVVDRASVELFANDGVLRMTDLIFPP 507

Bs-Lev WTDYGRDFYAAVSWS... 295 ..... KVKLRIFVDRSSVEVFGNDGKQVITDIILPD 484

Tm-Inv LLDHGTDFYAAQTFF... 246 ..... --RIRAFLDSCSVEFFFNDS-IAFSFRIHPE 407

Dc-Inv RLDYG-KYYASKTFY... 402 ..... SLSMRLLVDHSIVESFAQGGRTVITSRVYPT 619

Ao-Inv RYDLG-KFYASKTFY... 396 ..... TLSLRILVDHSIVESFAQGGRASATSRVYPT 615

Ac-6GFFT RYDWG-KFYASRTFF... 354 .... TFAVRILVDHSVIESFAMGGRTSATSRAYPT 572

:: .:* . :* * .. : *

* . **: : .

Figura 17. Alineamiento de proteínas pertenecientes a las familias GH32 y GH68. En las cajas negras se muestran las secuencias conservadas en estas proteínas. Gd-LsdA, levansucrasa de Glucanoacetobacter diazotrophicus (GH68); Bs-Lev, levansucrasa de Bacillus subtilis (GH68); Tm-Inv, invertasa de Thermotoga maritima; Dc-Inv, invertasa de Daucus carota (GH32); Ao-Inv, invertasa de Asparagus officinalis (GH32); Ac-6GFFT, fructosiltransferasa de Allium cepa (GH32); (http://afmb.cnrs-mrs.fr/~pedro/CAZY/ghf-32.html)

58

La catálisis de las GH sucede a través de uno de dos mecanismos, según si la ruptura del enlace

glicosídico resulta en la retención o inversión de la configuración del sustrato. Las GH que retienen

la configuración anomérica del sustrato (enzimas de retención), en las que se incluyen las GH32 y

68, siguen un mecanismo de doble desplazamiento que involucra un intermediario covalente

glicosil-enzima (Figura 18). Por su parte, las enzimas de inversión actúan en un solo paso: una

molécula de agua es desprotonada y activada (nucleófilo) por un residuo básico. Un residuo ácido

protona al oxígeno del grupo glicosil-saliente al mismo tiempo que sucede la ruptura (Withers y

Aebersold, 1995).

El análisis 3D de cristales ayuda al entendimiento del mecanismo catalítico. Sin embargo, en el

caso de las GH32 la elucidación catalítica se ha realizado primordialmente por comparación de las

propiedades cinéticas de las enzimas después de bloquear residuos presuntamente importantes o

a través de mutaciones puntuales, y solo recientemente se ha cristalizado la Inv bacteriana de

Termotoga maritima (Alberto et al., 2004) y la FEH de C. intybus (Verhaest et al., 2004 y 2005), así

como la levansucrasa de Bacillus subtilis y Gluconoacetobacter diazotrophicus SRT4 de la familia

GH68 (Martínez-Fleites et al., 2004). Se asume que la donación de protones y el ataque

nucleófilico son realizados por grupos carboxilos de aminoácidos conservados. En el clan J existen

dominios que presentan los residuos ácidos aspártico y glutámico (Figura 16): el dominio RDP

(caja IV) y el motivo EC (caja VI). El bloque I es el llamado “caja de unión a Suc” con un consenso

determinado como H-X-X-[PTV]-X-X-X-X-[LIVMA]-[NSCAYG]-[DE]-P-[NDSC]-[GA].En Inv, este

dominio fue inicialmente reconocido como esencial para la unión a Suc y presenta un motivo β-

fructosidasa más variable de acuerdo a la actividad enzimática (Ritsema et al., 2004, 2005).

Análisis de mutación en algunas enzimas GH32, muestran que es el ácido glutámico (EC caja VI)

quien dona un protón al oxígeno del glicósido saliente, mientras que el ácido aspártico (bloque I)

es el nucleófilo que ataca al C2 de la Fru, formando un intermediario covalente fructosil-enzima

con la liberación del grupo saliente. En un segundo paso, el ácido glutámico sustrae un protón de

una molécula de agua, permitiendo que el OH- así formado, desplace a la Fru y se restauren los

residuos del centro activo (Reddy y Maley, 1996; Batista et al., 1999; Pons et al., 2004) (Figura

17). Por su parte, en la familia GH68 podría ser un poco diferente, pues la caja I es mucho menos

conservada. Song y Jacques (1999) después de observar pérdida completa de actividad en una

FT de Streptococcus salivarius, en la mutación D309S de la caja IV y solo una reducción cuando la

mutación se realizó en el ácido aspártico del bloque I, sugieren que este residuo en el motivo RDP

59

es el nucleófilo, en tanto que el ácido aspártico en el motivo β-fructosidasa no interactúa

directamente con el sustrato sino que estabiliza un giro β-plegada en esta región.

Figura 18. Mecanismos catalíticos de las glicosilhidrolasas. A) Mecanismo de retención (doble desplazamiento), un aminoácido del sitio activo actúa como ácido protonando al oxígeno glicosídico, mientras que otro residuo actúa como nucleófilo atacando el C2 de la fructosa, para formar un intermediario covalente fructosil-enzima y liberar el grupo saliente. En un segundo paso, el primer aminoácido u otro diferente actúa como base, desprotonando el agua y el OH- formado, desplaza la fructosa para regenerar el sitio activo; B) Mecanismo de inversión (desplazamiento directo), un aminoácido del sitio activo actúa como base, desprotonando la molécula de agua nucleofílica, mientras que otro aminoácido que actúa como ácido, protona el oxígeno glicosídico al mismo tiempo que sucede la ruptura; esta reacción sucede a través de un estado de transición oxo-carbanión. Modificada de Withers y Aebersold, 1995.

60

Finalmente, se ha reconocido la importancia de algunos aminoácidos altamente conservados en

las secuencias de estas familias, ya sea en el mantenimiento de la orientación o el valor de pKa de

residuos claves, generando así el ambiente esencial para la catálisis; entre ellos, el ácido aspártico

(bloque RDP) y la cisteína (bloque EC) y el residuo aromático (triptófano, fenilalanina o tirosina)

presente en la caja de unión a Suc.

2.3. FISIOLOGÍA DE LOS FRUCTANOS

Los fructanos constituyen una extensión del metabolismo de Suc, regulando su concentración

citoplasmática por debajo de niveles que conllevan a la inhibición fotosintética (Pollock et al., 2003)

y contribuyendo en procesos donde la implicación de Suc ha sido demostrada, como expresión de

genes y distribución de fotosintatos. El papel de los fructanos como carbohidrato de reserva fue

sugerido desde 1922 por Collin y Belval; sin embargo, las investigaciones de las últimas décadas

han dado cabida a especular que estas moléculas, están implicadas, además, en la fisiología del

desarrollo de las plantas así como en procesos de adaptación a distintos tipos de estrés.

2.3.1. CARBOHIDRATO DE RESERVA

Los fructanos como carbohidratos de reserva a largo plazo, son localizados en órganos de

almacén como tubérculos (alcachofa Jerusalem y dalia), raíces (achicoria y diente de león), bulbos

(cebolla, ajo, tulipán), discos florales (alcachofa) y tallos (agave); en gramíneas se almacenan en

los internodos de tejidos vegetativos, en semillas y principalmente en las vainas de las hojas

maduras (Morvand-Bertrand et al., 2001). Como reserva a corto plazo, éstos se almacenan en el

mesófilo de órganos autotróficos como hojas y tejidos florales. La síntesis y movilización diaria de

este tipo de almacén contrasta con el de largo plazo, donde estos procesos pueden estar

separados por meses, indicando que la cinética y mecanismo de regulación deben ser diferentes.

2.3.2. DESARROLLO VEGETAL

Como carbohidrato de reserva, los fructanos suministran carbono y energía en el proceso de

crecimiento y desarrollo de la planta (Orthen y Whermeyer, 2004). Los cambios en el patrón de

fructanos a lo largo de un ciclo fenológico se deben entre otros factores, a las características

ambientales estacionales: la alta irradiancia y largos fotoperíodos característicos del verano,

promueven la fijación de carbono, la consiguiente síntesis y acumulación de fructanos. En el

61

otoño, la senescencia de los órganos aéreos reduce la síntesis de fructanos e induce en algunas

plantas el inicio de la dormancia que se consuma en el invierno, caracterizado por lluvias escasas

y reducción de temperatura y fotoperíodo, con la movilización de carbohidratos de las partes

aéreas hacia los órganos de almacén. Finalmente en primavera, la movilización masiva de

fructanos de los órganos de almacén cubre las necesidades energéticas para los nuevos brotes y

tejidos (Machado y Dietrich, 1993). En Asteraceae como achicoria, alcachofa y Vernonia

herbaceae se ha estudiado el cambio metabólico de fructanos. En un principio se presenta un

proceso de optimización del aparato fotosintético con la activación de 1-SST y acumulación de

fructanos; mismos que decrecen durante la emergencia de brotes o durante la generación de

órganos florales con la activación de la FEH (Figura 19). En esta etapa los órganos de almacén, se

convierten de tejidos consumidores a proveedores. Un incremento de fructanos vuelve a

observarse durante un intenso crecimiento vegetativo o durante la dormancia (Gupta y Kaur,

2000).

La remoción de fructanos de órganos de almacén también se observa durante el florecimiento de

Hemerocallis spp. (Bieleski, 1993), Phippsia algida (Solhaug y Aares, 1994) y Campanula

rapunculoides (Vergauwen et al., 2000). La alta producción de hexosas, provenientes de este

proceso, disminuye el potencial osmótico y mantiene la presión de turgor necesaria para el

crecimiento celular.

Figura 19. Papel de las fructosiltransferasas en el desarrollo de plantas superiores. A) Actividad enzimática y acumulación de fructanos en tubérculos de Polymnia

sonchifolia (Asteraceae); B) Expresión de fructosiltransferasa en distintos tejidos de

Triticum aestivum (Poaceae). Modificada de Itaya et al., 2002 y Van den Ende et al.,

2005.

62

En achicoria a pesar de la alta actividad de FEH durante el florecimiento no hay acumulación de

Fru; ésta puede ser dirigida al citoplasma para su conversión a Suc (Gupta y Kaur, 2000) o

participar en la síntesis de inulo-n-osas observadas durante el florecimiento de C. rapunculoides

(Vergauwen et al., 2000). En cereales, los fructanos se acumulan durante el crecimiento del tallo,

pero su concentración declina durante la producción de granos, con la acumulación de mono- y di-

sacáridos (De Gara et al., 2003).

2.3.3. DEFOLIACIÓN

El efecto de defoliación en el metabolismo de fructanos ha sido más estudiado en pastos, dada la

frecuencia de prácticas de poda y pastoreo en estas especies. La reducción en el área foliar y

producción de fotosintatos, provoca la activación de la 1-FEH y remoción de los fructanos

almacenados en la región basal (región de elongación celular) y las vainas de hojas maduras que

la cubre (Figura 20A y B). Hay un flujo de carbono de las vainas (que almacenan hasta el 70% de

los fructanos) hacia la zona de elongación, favoreciendo el flujo de carbono hacia el meristemo

foliar con un decremento transitorio en los tejidos de la raíz.

La síntesis de fructanos marcados por la administración de 13C-Fru después de la defoliación,

indica un metabolismo activo de síntesis y degradación de fructanos, pues al mismo tiempo hay

una demanda consumidora del tejido de elongación para regular el carbono necesario para la

refoliación (Amiard et al., 2003a).

En achicoria y Vernonia herbaceae, la pérdida del tejido fotosintético por defoliación, promueve en

la raíz un cambio abrupto de tejido consumidor a proveedor. La 1-SST decrece y después de un

período lag, la FEH se activa hidrolizando los fructanos almacenados para proveer la energía

requerida en el mantenimiento y respiración celular (Figura 19C y D). Al reestablecerse la

capacidad fotosintética de las hojas hay un incremento de hexosas y Suc en la raíz y síntesis de

fructanos con la activación de 1-SST y decremento de la FEH. A partir de este momento la raíz es

otra vez órgano consumidor (Gupta y Kaur, 2000; Asega y Machado, 2004). La máxima actividad

de invertasa en V. herbacea se ha registrado durante la fase lag, antes de la activación de la FEH,

sugiriendo que al igual que los fructanos, la hidrólisis de Suc provee energía en la restauración de

tejido fotosintético y/o la hidrólisis de este metabolito es necesaria para proveer las condiciones

vacuolares ideales para la actividad de FEH (Suc inhibe a la FEH) (Asega y Machado, 2004).

63

Figura 20. Efecto de la defoliación en el metabolismo de fructanos. A) Actividades enzimáticas en la vaina (v) y células en elongación (e) de Lolium perenne después de la defoliación; B) Concentración de carbohidratos en células de elongación; C) Actividades enzimáticas del metabolismo de fructanos en plantas de Cichorium intybus control (c) y después de la defoliación (d); D), Comparación de la concentración de carbohidratos en plantas control (c) y después de la defoliación (d). Modificada de Morvan-Bertrand et al., 2001 y de Roover et al., 1999.

Después de la defoliación, la producción de células con paredes celulares más delgadas, es

consecuencia del preferente flujo de carbono proveniente de fructanos, al meristemo del vástago.

El estatus de carbono (cantidad de fructanos almacenados en la base de las hojas) en pastos

antes de la defoliación, influye en la primera fase de la restauración del tejido fotosintético

(rendimiento en el vástago), pero no en la segunda fase, cuando los fotosintatos son de nuevo la

principal fuente de carbono (Morvan-Bertrand et al., 1999).

64

2.3.4. DESCARGA APOPLÁSTICA

La compartamentalización del metabolismo primario de carbono se ha mostrado en gramíneas,

donde diferentes concentraciones de carbohidratos solubles se observan en células epidermales,

mesofílicas y haces vasculares. Los fructanos son metabolizados en estos dos últimos tipos

celulares. Al parecer, sin embargo, son regulados de manera distinta, pues en cebada por

ejemplo, aunque el nivel de transcrito de 6-SFT en el mesófilo es mayor, hay más acumulación de

fructanos en los haces vasculares, probablemente debido a una menor concentración umbral de

Suc para su síntesis. Esta característica responde a la función y posición anatómica de estas

células, encargadas de la carga de Suc del apoplasto o simplasto a los haces vasculares. Los

fructanos contribuyen así, a mantener un gradiente de Suc entre el floema y los tejidos

consumidores (Koroleva et al., 1998; Lu et al., 2002; Asega y Machado, 2004). La posible

presencia de fructanos y sus enzimas metabólicas en apoplasto y tejidos vasculares (Wang y

Nobel, 1998; Livingston y Henson, 1998) refuerza la idea de la participación activa de los fructanos

en este proceso.

2.3.5. AJUSTE OSMÓTICO

A diferencia del almidón que es insoluble, los fructanos son solubles y pueden contribuir al

potencial osmótico de la vacuola. La participación de fructanos como osmolitos se demostró en la

geofita Lachenalia minima, donde la acumulación de FOS en la capa interna del bulbo disminuyó

el potencial osmótico de la planta y estableció un gradiente hídrico entre las capas interna, media y

externa, facilitando la toma de agua del suelo, preferentemente en la capa interna donde se lleva a

cabo la expansión celular (Orthen, 2001).

En gramíneas, se observa claramente en las hojas un gradiente de concentración de fructanos,

siendo mayor en la región basal donde se lleva a cabo la división y elongación celular. Se sugiere

que la síntesis de fructanos en estas células es un punto de control en la concentración de Suc

para mantener el potencial osmótico adecuado en el proceso de elongación (Morvan-Bertrand et

al., 2001; Pavis et al., 2001b).

2.3.6. TOLERANCIA AL FRÍO

Las bajas temperaturas limitan el crecimiento más que el proceso fotosintético; sin embargo, la

acumulación de fotosintatos y sus intermediarios fosforilados llegan a inhibir la fotosíntesis a corto

65

plazo a través de la inhibición de los genes fotosintéticos o por el secuestro de fosfato,

respectivamente (Hjelm y Ögren, 2003), por lo que la síntesis vacuolar de fructanos puede ser una

ventaja que evita dicha inhibición en las células autotróficas.

En plantas resistentes al frío, la reducción de temperatura induce un proceso de aclimatación

esencial para la supervivencia. En 1935, Tumenov definió este evento como “process hardiness”

(PH) (Livingston y Henson, 1998). Éste ha sido más estudiado en cereales como trigo y avena, y

muestra que la capacidad de soportar el frío esta dado por características multigénicas de cada

variedad. La primera etapa (1PH) sucede a temperaturas superiores a 0°C, con la inducción de 1-

SST y 6-SFT y acumulación de fructanos y Suc en la corona (Van den Ende et al., 2005); mientras

que en la 2PH, cuando se observa una resistencia a temperaturas inferiores, los fructanos son

hidrolizados por FEH e Inv, con la acumulación de carbohidratos solubles y expresión de genes

relacionados con el estrés (Figura 21) (Tabaei-Aghdaei et al., 2003).

La actividad FEH apoplástica, evidenciada por primera vez por Livingston y Henson (1998),

cuestionó el exclusivo metabolismo vacuolar de los fructanos, y aunque esta actividad puede ser

resultado de daño celular o de exocitosis, se sugiere que la presencia apoplástica de FEH, FOS y

monosacáridos es determinante para la resistencia a frío (Livingston y Henson, 1998; Tabaei-

Aghdaei et al., 2003).

La acumulación de FOS en el apoplasto no es significativa para disminuir el punto de congelación;

sin embargo, su mecanismo protector parece no estar restringido a las propiedades coligativas.

Estos compuestos se acumulan en regiones discretas donde pueden, entre otras cosas,

interactuar con las membranas plasmáticas con proteínas claves en la supervivencia al frío,

prevenir la adhesión de hielo y/o actuar como osmoprotectantes evitando la deshidratación de los

tejidos (Livingston y Henson, 1998; Orthen y Whermeyer, 2004).

Los fructanos, además, confieren ventajas durante inviernos prolongados con nieve, donde las

condiciones de hipoxia (≈ 3% O2, 44% CO2, medido en plántulas de trigo sometidas a -5 °C

durante 5 d) conllevan a reemplazar la fosforilación oxidativa por la fermentación, un proceso

ineficiente (2 ATP/mol Glc vs 32 en la respiración) que provoca la rápida reducción de las reservas

de carbono. Phleum pratense es tolerante a la hipoxia, con una menor velocidad metabólica y una

actividad fotosintética basal (Bertrand et al., 2003). Se especula que esto se debe a los costos

energéticos, pues aunque se calcula que por cada Fru incorporada a la cadena de fructanos se

necesita 1.5 ATP para reciclar la Glc generada como subproducto, puede haber un ahorro

66

Figura 21. Metabolismo de fructanos en Avena sativa bajo estrés por frío. A) Concentración de carbohidratos en la corona; B) Concentración de carbohidratos en el fluido apoplástico de la corona; C) Actividad de FEH; D) Actividad de invertasa. Control, 5 semanas a 13 °C; 1PH, 3 semanas a 2 °C; 2PH, 3 días a -3 °C. Modificada de Livingston y Henson, 1998.

energético si se considera que la síntesis vacuolar de fructanos mantiene un gradiente de Suc con

el citoplasma, evitando la necesidad del uso de un transporte activo de Suc o gradientes de pH

(Van Laere y Van den Ende, 2002). Otra hipótesis sugiere que la disminución del potencial

osmótico, por hidrólisis de fructanos, facilita algunos procesos metabólicos. Por otra parte, el frío

también genera especies reactivas de oxígeno que dañan la función de algunas enzimas y la

integridad de la membrana celular. Estos síntomas se reducen en plantas de tabaco transgénicas

que expresan fructanos, confirmando la observación de que plantas aclimatadas al frío adquieren,

67

además, tolerancia a la generación de radicales libres (Parvanova et al., 2004). Finalmente, la

presencia del metabolismo de fructanos confiere ventajas sobre aquellas que no lo hacen, al

facultarlas de un rápido crecimiento cuando se reestablecen las condiciones ambientales (Vijn y

Smeekens, 1999).

2.3.7. TOLERANCIA A SEQUÍA

Hendry (1987) propuso que la aparición de taxa que acumulan fructanos, correspondió a un

cambio climatológico de sequías estacionales y que la distribución actual de plantas que sintetizan

estos carbohidratos, corresponde a esta misma característica. Por otra parte, Pilon-Smit et al.,

(1995) evidenciaron que la acumulación de fructanos en tabaco transgénico confiere resistencia al

estrés hídrico impuesto por la adición de polietilenglicol. Por tal motivo, los fructanos son

moléculas candidatas en el mecanismo de tolerancia a sequía. Sin embargo, se reportan

diferentes respuestas de estos carbohidratos. Dependiendo de la especie, los fructanos se

acumulan, decrecen o modifican su DP durante el estrés (Amiard et al., 2003b).

En gramíneas como trigo, Festuca arundinacea, Phleum pratense y Lolium perenne, se ha

reconocido la contribución de la hidrólisis de fructanos al ajuste osmótico de estas especies

durante un déficit hídrico (Figura 22A-D). En condiciones de hidratación, Festuca arundinacea

presenta en su zona de elongación foliar un potencial de soluto (ψs) de ~ -1.5 MPa, donde los

fructanos (DP<5) explican el 13%. Esta contribución disminuye durante el estrés hídrico, en donde

el ψs de -3.2 MPa es principalmente atribuido a la acumulación de hexosas. A pesar del arresto en

el crecimiento foliar y decremento de materia seca proporcional a la pérdida de fructanos, este

valor es suficiente para mantener el turgor, indicando que el estrés hídrico limita más el uso de

carbono que la toma de agua. La acumulación de hexosas, además, constituye un sustrato

disponible en el citoplasma para la fosforilación enzimática o para la glicólisis, siendo una ventaja

sobre especies que almacenan almidón, donde las hexosas disminuyen durante el estrés por daño

a la actividad sucrolítica (Spollen y Nelson, 1994). Además de la acumulación de monosacáridos,

en una respuesta más retardada, se observa la acumulación de fructanos, siendo éstos

marcadores moleculares interesantes para determinar la tolerancia a estrés salino, pues la mayor

acumulación de fructanos se observa en especies de trigo más tolerantes (Kerepesi y Galiba,

2000).

68

Figura 22. Fructanos en estrés por sequía. A-D) Cambios en la concentración de carbohidratos en el tejido foliar de Lolium perenne sujeto a 14 días de sequía seguido de rehidratación (línea discontinua) o plantas control (línea continua); E) Efecto protector en liposomas de fosfatidilcolina (FC) de inulina de achicoria (∆), dalia (€) o hidroxietil almidón (HEA) (•), medido como porcentaje de retención de carboxifluoresceína; F) Barrido FTIR de los grupos –CH2- de lipososmas de FC para medir la temperatura de transición de la fase cristalina a la fase de gel (tm) en presencia de inulina de achicoria 1:1 (FC:inulina, tm 8 °C), 1:2 (tm 7 °C), HEA(1:2) o FC control (tm 29 °C). La tm se mide como el punto medio de cada curva como se indica con las flechas. Modificada de Hincha et al., 2000 y Amiard et al., 2003b.

69

Aunque se discute si la acumulación de fructanos en plantas estresadas es un mecanismo de

protección o solo resultado de un uso disminuido de fotosintatos de una planta con crecimiento

limitado, hay evidencias de la interacción de fructanos con la membrana durante procesos de

desecación; por lo que el papel de la posible presencia apoplástica de fructanos sea una

protección celular a través de la estabilización de la membrana (Van Laere y Van den Ende, 2002).

En un estado deshidratado, la membrana se encuentra en fase de gel (Lβ) y al rehidratarse ésta

vuelve a la fase líquida-cristalina (Lα); sin embargo, durante la transición hay daños en la

integridad celular que provocan la fuga de moléculas internas. Experimentalmente, la presencia de

fructanos disminuye la temperatura de transición Lα-Lβ (tm) (Figura 22 E-F) y aumenta la

temperatura del proceso inverso Lβ-Lα (tg) (Hincha et al., 2000; Vereyken et al., 2003a). De

acuerdo a métodos espectrofotométricos, los fructanos interactúan con las cabezas lipídicas de las

membranas, desplazando moléculas de agua y provocando una rigidez en las cabezas y mayor

movilidad en las colas (acilos) (Vereyken et al., 2003b). Dicha interacción se favorece cuando los

lípidos son pequeños y los fructanos de mayor DP (Hincha et al., 2002; Vereyken et al., 2003a). Lo

anterior indica una interacción hidrofóbica, pues además, los fructanos son capaces de interactuar

con las membranas aún en condiciones de hidratación aunque de manera menos pronunciada

(Vereyken et al., 2003b). El efecto de un levano de ~125 DP es equivalente a una inulina de ~15

DP; esta diferencia es atribuida a una menor flexibilidad conformacional del levano, donde los

anillos furanosa son parte del esqueleto molecular (Vereyken et al., 2003a).

2.3.8. DEFENSA CONTRA PATÓGENOS

En trigo se ha observado que variedades resistentes a frío son más susceptibles a infecciones por

hongos y viceversa, y aunque no hay una hipótesis satisfactoria para explicar este hecho, es clara

la participación de los fructanos. Kawakami y Yoshida (2002) mostraron una expresión diferencial

de los genes de la 1-SST y la 6-SFT en trigo. Las variedades tolerantes a frío muestran una

regulación negativa en la expresión de estos genes durante 2PH relacionada con la disminución

de fructanos, en tanto que, en los cultivares resistentes al hongo hay un incremento persistente en

el transcrito de ambos genes y una síntesis activa de fructanos, por lo que se cree que estos

carbohidratos son una fuente de carbono menos disponible para los hongos, comparado a FOS

(DP9-11), mono- y di-sacáridos predominantes en variedades resistentes a frío.

70

Figura 23. Modelo propuesto de la participación de fructanos en la resistencia a patógenos. La reducción del crecimiento y demanda de carbohidratos por bajas temperaturas (1) inducen la acumulación de monosacáridos fosfato (2), los cuales generan Suc (3a) y monosacáridos (3b). Los niveles citosólicos de monosacáridos son percibidos por hexocinasas (4) que activan la expresión de genes de respuesta de defensa (5). La acumulación intracelular de Suc induce la formación y acumulación de fructanos en la vacuola (6). Parte de la Suc es transportada a la corona (tejido consumidor) y también almacenada como fructanos. Durante el transcurso del invierno, los fructanos son metabolizados en fructosa (7) que en equilibrio con los monosacáridos fosfato y Glc mantienen el umbral citosólico para la expresión continua de los genes de defensa. La acumulación de carbohidratos solubles concomitante con la pérdida de agua (8) causa un decremento en el potencial osmótico limitando el crecimiento del patógeno. Modificada de Gaudet et al., 1999. Por otra parte, también se maneja la hipótesis de que un decremento en el potencial hídrico de la

planta causado por la acumulación de carbohidratos solubles limita el crecimiento de patógenos; y

finalmente, se considera la posible participación de fructanos en la expresión de genes de

resistencia como proteínas relacionadas a patogénesis (quitinasas, β-glucanasas) a través de su

catabolismo a azúcares simples (Figura 23) (Gaudet et al., 1999).

La presencia de FEH en plantas que no almacenan fructanos como betabel y Arabidopsis, sugiere

la participación de esta enzima como mecanismo de defensa contra patógenos o microbios

71

endofíticos que sintetizan este tipo de carbohidrato. Mientras que en trigo, especie que produce

fructanos, la altamente específica 6-KEH puede prevenir la síntesis de levanos de origen

microbiano en el apoplasto (Van den Ende et al., 2005).

2.4. POTENCIAL BIOTECNOLÓGICO DE FRUCTANOS

Desde 1935, la inulina se ha utilizado clínicamente para la medición de la velocidad de filtración

glomerular en ensayos de función renal; mientras que en la década de los 80 creció el interés del

uso de los fructanos para aplicaciones industriales.

La inulina puede ser químicamente modificada con fines específicos; por ejemplo, los ésteres de

inulina tienen propiedades adecuadas de viscosidad para ser utilizados como surfactantes,

revestimentos y cosméticos; mientras que la dicarboxil-inulina es buen acomplejante de calcio

para dispersar las actividades del CaCO3 en la producción de detergentes.

En el campo médico se ha propuesto el uso de hidrogeles de inulina como agente acarreador de

fármacos con acción específica en el colon, o la utilización de estas moléculas como protectores

de fórmulas farmacéuticas en procesos de liofilización (Vereyken et al., 2003b).

A principios de los 90, Bélgica y Holanda comenzaron la extracción industrial de inulina utilizando

achicoria como materia prima y, recientemente, esto se ha extendido a Alemania y Estados

Unidos. En la última década, la producción industrial de inulina creció exponencialmente (de 1,000

a 100,000 ton/año) casi exclusivamente para fines alimentarios (Van Laere y Van den Ende,

2002). Los fructanos con alto DP confieren a los alimentos una consistencia cremosa; mientras

que los fructanos de bajo DP presentan mayor poder edulcorante que la Suc, por lo que el uso de

fructanos empieza a extenderse en la elaboración de mayonesas, cremas, postres y chocolates no

cariogénicos y de bajo valor calórico (Archer et al., 2004).

Las investigaciones de las últimas décadas destacan a los fructanos como ingredientes

funcionales, es decir, ingredientes que además de aportar un valor nutricional a los alimentos,

mejoran la salud del consumidor. Dada su estructura química, los fructanos resisten la hidrólisis de

enzimas digestivas pasando intactos al colon donde son sustrato específico para bacterias

benéficas, principalmente del género Lactobacillus, Bifidobacteria y Enterococcus (Roberfroid,

2002). El crecimiento de estas bacterias desplaza aquellas de efectos tóxicos como Escherichia y

Clostridium. Además, como parte del metabolismo de fructanos, estas bacterias generan ácidos

72

grasos de cadena corta (SCFA, ácidos acético, propiónico, butírico y láctico) que tienen efectos

sistémicos (Delzenne, 2003).

Aunque los mecanismos aún están por determinarse, dentro de los efectos benéficos del consumo

de prebióticos (fructanos o FOS), probióticos (Lactobacillus o Bifidobacteria) o ambos (simbióticos)

puede enlistarse un mejoramiento en la respuesta inmunológica, disminución sérica de colesterol y

triglicéridos, absorción de minerales como Ca y Mg, tolerancia a la lactosa, mejor respuesta de la

insulina a la glucosa y prevención de cáncer (Kaur y Gupta, 2002).

73

V. JUSTIFICACIÓN

La presencia de fructanos en plantas evolucionadas indica una ventaja sobre otras formas de

almacenamiento de carbono. El agave es un ejemplo de plantas que almacenan fructanos; sin

embargo, a pesar de ser uno de los pocos cultivos cuyos fructanos son utilizados industrialmente,

su relevancia bioquímica y fisiológica ha sido escasamente estudiada. La protección de fructanos

a plantas bajo estrés abiótico, fuertemente apoyada por la resistencia observada en plantas

transgénicas, sugiere una importante implicación de este carbohidrato en la notable capacidad de

los agaves para crecer en ambientes hostiles.

Para un mejor entendimiento del metabolismo de fructanos y su papel en agaves es importante

establecer primeramente las características estructurales de estos carbohidratos, las enzimas

implicadas en su síntesis y la regulación de estas últimas.

VI. HIPÓTESIS

La estructura de fructanos en Agave y Dasylirion es especie específica y está determinada

fuertemente por el desarrollo de la planta y las condiciones geoclimáticas. La estructura de los

fructanos, puede relacionarse estrechamente con las actividades fructosiltransferasas presentes

en extractos proteínicos y la expresión de los genes que codifican a estas enzimas.

74

VII. MATERIALES Y MÉTODOS

A. MATERIAL BIOLÓGICO

1. Regiones

En la Tabla 12 se muestra las cinco especies de agave y dasylirion analizadas en el presente

trabajo. Además, se indican las regiones donde se realizó el muestreo y las características

climáticas de cada lugar, de acuerdo a lo reportado por el INEGI (http//www.inegi.gob.mx). Los

agaves fueron cosechados de campos cultivados por productores de bebidas alcohólicas

elaboradas a partir de estas plantas, mientras que las especies de Dasylirion, se colectaron de

forma silvestre en la región de la sierra de Chihuahua, siguiendo el método que se realiza por

parte de los productores de la bebida sotol, teniendo como único criterio de selección el tamaño de

la planta y presencia del órgano floral.

2. Edad

La edad calculada de los agaves colectados fue de 6 años, tiempo al cual la mayoría de las

especies aquí consideradas, alcanzan su madurez, y el órgano floral emergente había sido

cortado; por lo que se asume que la mayor parte de los carbohidratos destinados al desarrollo de

este órgano se encontraban acumulados en el tallo (o la piña). Aunque se desconoce con certeza

la edad de las especies de Dasylirion, por la presencia de la inflorescencia, se asume que las

plantas eran maduras. La colecta de estas especies fue lo más homogénea posible basada en el

tamaño de la planta y la presencia de su órgano floral.

3. Muestreo

El muestreo de todas las plantas se realizó en la primavera del 2002, excepto para A. tequilana de

la región de Guanajuato (At-G), que fue colectada durante el otoño. Se jimaron tres plantas de

cada especie, siempre durante las primeras horas de la mañana (entre 10 y 12 h) y fueron

almacenadas a - 20 °C al llegar al laboratorio. At-G fue congelado en nitrógeno líquido

inmediatamente después de colectado y fue almacenado en el laboratorio a – 80 °C. Todas las

piñas fueron trituradas en un procesador, pulverizadas con nitrógeno líquido en un mortero con

pistilo y liofilizadas o procesadas en fresco según se indica.

75

Tabla 12. Muestreo de especies de Agave y Dasylirion. Se indica las características geoclimáticas de las regiones donde estas plantas fueron colectadas. La abreviación que se indica, es la que se utilizará en adelante en el texto.

Región LosAltos, Jalisco

Pénjamo, Guanajuato

Ures, Sonora

Matatlán, Oaxaca

SolaVega, Oaxaca

SolaVega, Oaxaca

Mérida, Yucatán

Pegüis, Chihuahua

Especie tequilana tequilana angustifolia angustifolia potatorum cantala fourcroydes Dasylirion

Abreviatura At-J At-G Aa-S Aa-O Ap-O Ac-O Af-Y Dsp-C Latitud norte 20° 32' 20° 26' 29° 26' 16° 52' 16° 30' 16° 30' 20°58' 29° 30' Longitud oeste 103° 40' 101° 43' 110° 23' 96° 23' 97° 59' 97° 59' 89° 37' 104 ° 30' m sobre el nivel del mar

2000 1780 380 1740 1440 1440 10 800

Rango promedio de temperatura anual (°C)

8-22 18 – 24 22-26 26-28 12-18 12-18 24-28

máximo 43, mínimo -23

Precipitación pluvial (mm)

705-870 700-800

<400 800-2000 600-1500 600-1500 700-1110 100-300

Tipo de clima templado subtropical,

verano lluvioso

semicálido subhúmedo,

verano lluvioso

cálido, muy seco

cálido subhúmedo,

verano lluvioso

templado subhúmedo,

verano lluvioso

templado subhúmedo,

verano lluvioso

cálido subhúmedo,

verano lluvioso

semicálido, muy seco

76

Figura 24. Esquema general de trabajo.

MMaatteerriiaall BBiioollóóggiiccoo

AAggaavvee tteeqquuiillaannaa ((JJaalliissccoo,, GGuuaannaajjuuaattoo)) AA.. aanngguussttiiffoolliiaa ((SSoonnoorraa,, OOaaxxaaccaa)) AA.. ccaannaattaallaa ((OOaaxxaaccaa))

AA.. ppoottaattoorruumm ((OOaaxxaaccaa)) AA.. ffoouurrccrrooyyddeess ((YYuuccaattáánn)) DDaassyylliirriioonn sspppp.. ((CChhiihhuuaahhuuaa))

DDeetteerrmmiinnaacciióónn ddee ccaarrbboohhiiddrraattooss nnoo eessttrruuccttuurraalleess

EExxttrraacccciióónn yy ccaarraacctteerriizzaacciióónn ddee ffrruuccttaannooss ((TTLLCC,, HHPPAAEECC--PPAADD,, PPMMAAAA))

CCaarraacctteerriizzaacciióónn ddee ffrruuccttaannooss eenn AA.. tteeqquuiillaannaa

MMAALLDDII--TTOOFF,, HH--,, 1133CC--NNMMRR

EExxttrraacccciióónn yy ppuurriiffiiccaacciióónn ppaarrcciiaall ddee pprrootteeíínnaass ppoorr ppaassooss ccrroommaattooggrrááffiiccooss

EEnnssaayyooss ddee aaccttiivviiddaadd eennzziimmááttiiccaa

IIddeennttiiffiiccaacciióónn eelleeccttrrooffoorrééttiiccaa

EExxttrraacccciióónn yy aammpplliiffiiccaacciióónn ddee sseeccuueenncciiaass ggeennóómmiiccaass

AAiissllaammiieennttoo ddeell AADDNNcc ccoommpplleettoo ppoorr RRLLMM--RRAACCEE

EExxpprreessiióónn hheetteerróóllooggaa ddee AADDNNcc ddee ffrruuccttoossiillttrraannssffeerraassaa eenn PPiicchhiiaa ppaassttoorriiss

Determinación Estructural de Fructanos, Identificación de sus Actividades Enzimáticas y Expresión de sus ADNc en Pichia pastoris

CCaarraacctteerriizzaacciióónn ddee

ccaarrbboohhiiddrraattooss IIddeennttiiffiiccaacciióónn

eennzziimmááttiiccaa AAiissllaammiieennttoo ddee AADDNNcc yy ssuu eexxpprreessiióónn

hheetteerróóllooggaa

77

B. METODOLOGÍA

La Figura 24 muestra el esquema general de trabajo desarrollado durante la presente

investigación. Dicho esquema se describe detalladamente en las siguientes secciones.

1. COMPARACIÓN Y CARACTERIZACIÓN ESTRUCTURAL DE CARBOHIDRATOS DE

ALMACÉN EN AGAVES Y DASYLIRION

1.1. DETERMINACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA

1.1.1. EXTRACCIÓN DE CARBOHIDRATOS TOTALES

Los carbohidratos totales se extrajeron a partir de 100 mg de material liofilizado y 50 mL de

solución etanólica al 80%. La suspensión se agitó durante 30 min a 80 °C, se filtró con papel

Wathman No.1 y el remanente sólido se sometió a extracción dos veces más, en un medio acuoso

por 15 min. Los tres sobrenadantes se juntaron y se aforó hasta un volumen final de 250 mL.

1.1.2. DETERMINACIÓN DE CARBOHIDRATOS TOTALES

Veinticinco µL de esta solución se llevó hasta 1 mL con agua desionizada y se utilizó para la

determinación de carbohidratos totales con el método de Dubois et al. (1956). La curva de

calibración se hizo con una solución estándar de Fru (Sigma) 1 mM, diluida en un rango de

concentración de 0 a 50 µg/mL.

A 1 mL de cada muestra contenidas en tubos de ensaye se le adicionó 1 mL de fenol al 5%,

seguido de 5 mL de H2SO4, que para una buena reproducibilidad del método, se adicionó rápida y

directamente sobre la superficie del líquido. Los tubos reposaron 10 min a temperatura ambiente,

se agitaron y se colocaron 20 min a baño María de 20 °C. La absorbancia se leyó en un

espectrofotómetro visible (Spectronic 20) dentro de los próximos 30 min a λ490 nm.

1.1.3. DETERMINACIÓN DE D-GLUCOSA, D-FRUCTOSA Y SACAROSA

La determinación de Suc, Glc y Fru se realizó simultáneamente a través de ensayos enzimáticos,

utilizando un kit comercial (Boehringer Mannheim), según se muestra en la Tabla 13.

El contenido de Glc se determinó mediante la actividad enzimática de la hexocinasa, que cataliza

la fosforilación de este carbohidrato por parte del ATP con la formación simultánea de ADP,

D-Glc + ATP → Glc-6-P + ADP

78

Tabla 13. Determinación enzimática de D-Glucosa, D-Fructosa y Sacarosa. Blanco para D-

Glc y D-Fru Determinación de D-Glc y D-Fru

Blanco para Suc

Determinación de Suc

- Solución I

- Muestra

-

-

-

33 µL

66 µL

-

66 µL

33 µL

Las soluciones se mezclaron suavemente y se incubaron 5 min a 37 °C

- Solución II

- Agua

330 µL

600 µL

330 µL

600 µL

330 µL

600 µL

330 µL

600 µL

Las soluciones se mezclaron suavemente y la absorbancia se leyó a λ340 nm en los próximos tres minutos

(A1)

- Suspensión III 6 µL 6 µL 6 µL 6 µL

Las soluciones se mezclaron suavemente y después de 15 min se leyó la absorbancia a λ340 nm (A2)

- Suspensión IV 6 µL 6 µL - -

Las soluciones se mezclaron suavemente y después de 15 min se leyó la absorbancia a λ340 nm (A3)

Solución I, buffer de citratos pH 4.6 y β-fructosidasa (720 U); Solución II, buffer de trietanolamina pH 7.6, 110 mg de NADP, 260 mg de ATP y MgSO4; Suspensión III, hexocinasa (320 U), glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (160 U); Suspensión IV, fosfoglucosa isomerasa (420 U). La Glc-6-fosfato se oxida en presencia de Glc-6-P-deshidrogenasa a gluconato-6-P por el NADP,

el cual a su vez se reduce a NADPH.

Glc-6-P + NADP → D-Gluconato-6-P + NADPH H+

El NADPH se relaciona estequiométricamente a la cantidad de Glc, por lo que a través de su

medición espectrofotométrica a λ340 nm se cuantificó la Glc presente en las muestras. Las

diferencias de absorbancias A2 y A1 entre la muestras y el blanco, (A2 – A1)D-Glc – (A2 – A1)blanco D-Glc

(Tabla 13) dio un valor correspondiente al NADPH generado por la presencia de Glc libre (∆AGlc).

Para determinar la concentración de Glc se aplicó la ecuación I:

i).- DETERMINACIÓN DE D-GLUCOSA

c = V × MW . × ∆A (I) ε × d × v × 1000

donde c, concentración (g/L),

v, volumen final de reacción (mL) MW, peso molecular (g/mol) V, volumen de la muestra (mL) ε, coeficiente de extinción del NADPH a λ340 nm (6.3)

79

d, longitud de la celda espectroscópica ∆A, el cambio de absorbancia

El valor resultante se multiplicó por el factor de dilución (0.1).

ii).- DETERMINACIÓN DE D-FRUCTOSA

Al igual que para la cuantificación de Glc, la determinación de Fru se hizo mediante su fosforilación

por parte de la hexocinasa,

D-Fru + ATP → Fru-6-P + ADP

En presencia de fosfoglucosa isomerasa, la Fru-6-P es convertida a Glc-6-P y se oxida a

gluconato-6-P como se indicó anteriormente,

Fru-6-P → Glc-6-P

El ∆A2 de D-Glc/D-Fru (Tabla 13) (∆A2blanco - ∆A2muestra) corresponde únicamente al NADPH

formado después de la oxidación de Glc-6-P proveniente de la Glc libre, y sólo en la reacción

subsecuente, la fosfoglucoisomerasa isomerizó la Fru-6-P a Glc-6-P, por lo que la absorbancia

medida posteriormente (A3) correspondió al NADPH generado por ambos carbohidratos. La

concentración de Fru en las muestras se determinó por la diferencia de ambos valores delta (∆A3 -

∆A2) aplicando la ecuación I.

iii).- DETERMINACIÓN DE SACAROSA

La Suc presente en las muestras fue hidrolizada por una invertasa a Glc y Fru,

Suc + H2O → D-Glc + D-Fru

Después de esta reacción, la Glc fue determinada como se indica anteriormente, y la

concentración de Suc en las muestras fue calculada a partir de la diferencia de concentraciones de

la Glc antes y después de la hidrólisis.

El ∆A2 de Suc (A2blanco – A2muestra) incluye el NADPH debido a la Glc libre y aquella proveniente de

la hidrólisis de Suc. Esta absorbancia se restó a aquella debido únicamente a la Glc libre (∆A2 D-

Glc/D-Fru) generando un valor ∆ASuc, que fue utilizado para calcular la concentración de Suc por la

aplicación de la ecuación I.

1.1.4. DETERMINACIÓN DE FRUCTANOS

La determinación de fructanos se realizó con el kit comercial “Fructan Assay Procedure”

(Megazyme), siguiendo el método referido en la AOAC con el número 999.03 (McCleary et al.,

2000). Se pesaron 100 mg de muestra liofilizada que fueron suspendidos en 40 mL de agua

80

destilada caliente. Para la extracción de fructanos, las muestras se agitaron 15 min a 80 °C, se

enfriaron a temperatura ambiente, se aforaron a 100 mL y se filtraron con papel Whatman No. 1.

Para la remoción de Suc, almidón y azúcares reductores, alícuotas de 200 µL se incubaron a 40

°C por 30 min con 200 µL de una mezcla de sacarasa (100 U), β-amilasa (500 U, de Bacillus

subtilis), pullulanasa (100 U, de Klebsiella pneumoniae) y maltasa (1000 U, de levadura). Los

monosacáridos así formados, fueron reducidos a alcohol azúcares con la adición de 200 µL de

NaHB4 e incubando 30 min a 40 °C. La reacción se paró y el exceso de borohidruro formado se

eliminó adicionando 500 µL de ácido acético 100 mM. Este ácido además, ajustó el pH a un valor

~ 4.5. Alícuotas de 200 µL de la solución anterior se colocaron en nuevos tubos de ensaye y se

adicionó 100 µL de fructanasa (exo-inulinasa), mezclando el contenido en un vórtex, e incubando

la reacción 20 min a 40 °C para asegurar la completa hidrólisis de los fructanos a Fru y Glc.

Finalmente, para cuantificar los azúcares reductores recién formados, las muestras fueron tratadas

con 5 mL de PAHBAH e incubados en un baño de agua hirviendo por exactamente 6 min,

enfriados en agua fría (18-20 °C) durante 5 min y su absorbancia fue leída en los 10 min

siguientes a λ410 nm.

Doscientos µL de una solución estándar de Fru (1.5 mg/mL) se diluyó con 900 µL de buffer de

acetato de sodio 100 mM (pH 4.5). Cuatro réplicas de 200 µL de esta solución (que contiene 54.5

µg de Fru) se trataron con la hidracida del ácido p-hidroxibenzoico (PAHBAH) como se indica

anteriormente y su valor de absorbancia fue utilizado como factor de conversión a µg (54.5 µg de

Fru/absorbancia de 54.5 µg de Fru). Fructanos de dalia y Suc liofilizada, contenidos en el kit, se

utilizaron para la validación del método.

El contenido de fructanos se determinó según la ecuación II:

Fructano (% w/w) = ∆E × F × 5 × V × 1.1 × 100 × 1 × 162 (II) 0.2 W 1000 180 Donde, ∆E, absorbancia de la reacción leída contra el blanco F, factor de conversión de 54.5 µg de Fru a su absorbancia 5, factor para convertir los 200 µL ensayados a 1 mL V, volumen utilizado en la extracción de fructanos (100 mL) 1.1 , para considerar que se tomaron 200 µL de 1.1 mL de la digestión 0.2 enzimática W, peso de la muestra en mg (100 mg) 100 , factor para expresar el contenido de fructanos en % de peso

81

W 1 , factor para convertir de µg a mg 1000 162 , factor para convertir Fru libre, como es determinada, a fructosa 180 anhídra, como se encuentra en los fructanos

1.1.5. DETERMINACIÓN DE ALMIDÓN

La presencia de almidón en especies de Agave y Dasylirion se determinó con el kit comercial

“Total Starch Assay Procedure” (Megazyme), adoptado por la AOAC en el método 996.11

(McCleary y Monaghan, 2002). Cien mg de muestra liofilizada se humedecieron en un tubo de

ensaye con 200 µL de etanol al 80% agitando en vórtex. El almidón presente en las muestras fue

parcialmente hidrolizado con 3 mL de α-amilasa termoestable (300 U), disuelta en buffer MOPS

50 mM (pH 7.0) e incubando en baño de agua hirviendo por 6 min y con agitación vigorosa cada 2

min. Para la hidrólisis de las dextrinas remanentes y liberación de Glc, los tubos se colocaron en

un baño María a 50 °C, se adicionó 4 mL de buffer de acetato de sodio 200 mM (pH 4.5) y 100 µL

de amiloglucosidasa (20 U) y se incubó 30 min agitando vigorosamente con frecuencia. El

contenido de los tubos se aforó a 10 mL y se tomaron triplicados de 100 µL en tubos de ensaye

limpios. A cada triplicado, se añadió 3 mL de reactivo de determinación de Glc (GODOP) y se

incubó a 50 °C durante 20 min. La absorbancia se leyó a λ510 nm.

Durante la optimización de la técnica, para cuantificar la posible presencia de almidón resistente a

la hidrólisis, después de humedecer las muestras con etanol al 80% se añadió 2 mL de DMSO, los

tubos se agitaron y se colocaron en baño de agua hirviendo por 5 min. Sin embargo, la

absorbancia de las muestras así tratadas no fue diferente a aquellas tratadas como se indica

anteriormente. Por lo tanto, se asumió que los tallos de agave y dasylirion no almacenan almidón

resistente y los triplicados se determinaron como se describió en un principio. Una solución

estándar de Glc (100 µg/100 µL) se utilizó como factor de conversión de absorbancia a µg (100

µg de Glc/absorbancia de 100 µg de Glc). Almidón de maíz de alta pureza (98%), contenido en el

kit, se utilizó para validar el método.

El contenido de almidón se determinó según la ecuación III:

Almidón (% w/w) = ∆E × F × 1000 × 100 × 1 × 162 (III) W 1000 180 Donde, ∆E, absorbancia de la reacción leída contra el blanco F, factor de conversión de 100 µg de Glc a su absorbancia

82

1000, volumen de corrección (alícuotas de 100 µL se tomaron de 10 mL) W, peso de la muestra en mg (100 mg) 100 , factor para expresar el contenido de almidón en % de peso W 1 , factor para convertir de µg a mg 1000 162 , factor para convertir Glc libre, como es determinada, a Glc 180 anhídra, como se encuentra en el almidón

1.2. EXTRACCIÓN DE FRUCTANOS

Los fructanos fueron extraídos de acuerdo a la metodología optimizada en nuestro laboratorio para

agaves y dasylirion (López et al., 2003). Se pesaron 30 g de muestra liofilizada y los fructanos se

extrajeron con 100 mL de etanol al 80%, en un baño con agitación a 75 °C, durante 1 h y

manteniendo el pH a 7.5-8.0 para evitar la hidrólisis ácida. Las muestras se filtraron y fueron re-

extraídas dos veces más con 50 mL de agua por 30 min. Los filtrados se juntaron y se lavaron con

cloroformo para eliminar los residuos orgánicos, reposando la muestra toda la noche a 4 °C para

lograr una mejor separación de fases. La fase acuosa se recuperó y su volumen se redujo a un

10% en un rotavapor al vacío y un baño a 65 °C. Los fructanos de alto peso molecular (HMF, <

DP10) fueron precipitados con la adición de 100 mL de etanol absoluto; mientras que los fructanos

de bajo peso molecular (LMF, > DP10) permanecieron en el sobrenadante. Las muestras

reposaron toda la noche a 4 °C. El etanol fue eliminado de cada fracción y los fructanos fueron

concentrados en un rotavapor, se disolvieron en agua desionizada, se liofilizaron y se

almacenaron en desecadores hasta su análisis.

1.3. CARACTERIZACIÓN DE FRUCTANOS

1.3.1. CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA (TLC)

Se prepararon soluciones de fructanos al 10% y 1 µL de cada solución fue analizado en placas

analíticas de silica gel con soporte de aluminio (10 × 10 cm, Alldrich). Las placas se desarrollaron

de 3 a 5 veces, según se indica, en un sistema de solventes de butanol:propanol:agua (3:12:4,

v/v/v). Las placas se asperjaron con un reactivo de anilina-difenilamina-ácido fosfórico en base de

acetona (Anderson et al., 2000) y reveladas horneándolas a 80 °C por 15 min. Este reactivo

produce un color grisáceo en presencia de aldosas, mientras que las cetosas producen un color

rosado. Una mezcla de 1-Kes, Nys y DP5 (Megazyme) y Fru, Glc y Suc (Sigma) fue utilizada como

estándar.

83

1.3.2. CROMATOGRAFÍA DE ALTA RESOLUCIÓN DE INTERCAMBIO ANIÓNICO ACOPLADO

A DETECTOR DE PULSO AMPEROMÉTRICO (HPAEC-PAD)

Las muestras de fructanos se disolvieron al 1% en agua millipore; 50 µL de esta solución fue

filtrada en una membrana PVDF (hidrofóbica, 0.22 µm), centrifugando a 3500 rpm por 2 min. La

solución filtrada se transfirió a un vial de HPLC. Se inyectó 1 µL de esta solución en un sistema

Dionex HPAEC-PAD y las muestras se separaron en una columna analítica PA 100. El sistema de

elución consistió en las siguientes soluciones: i) solución A, agua millipore; ii) solución B, NaOH

0.5 M, en estado líquido y grado HPLC; iii) solución C, acetato de sodio 1 M. En la Figura 25 se

muestra el programa de elución: T0min = 80% A, 20% B; T5min = 50% A, 50% B; T15 min, 40% A, 50%

B, 10% C; T20min = 33% A, 50% B, 17%C; T35min, 50% B, 50% C.

La identidad de los compuestos se determinó con estándares o por comparación del patrón de

elución de fructanos de otros cultivos que se corrieron bajo condiciones similares (Shiomi et al.,

1991; Ritsema et al., 2003).

Figura 25. Programa de elución utilizado en la separación cromatográfica de fructanos de Agave y Dasylirion.

84

1.3.3. DERIVATIZACIÓN DE FRUCTANOS A ALDITOL ACETATOS PARCIALMENTE

METILADOS (PMAA)

Se pesaron 10 mg de fructanos liofilizados y se colocaron en reactiviales de 4 mL. Se añadieron

500 µL de DMSO (Sigma), agitando y sonicando toda la noche o hasta la disolución completa de

la muestra. La derivatización de carbohidratos a PMAA se hizo de acuerdo al método de Ciucanu y

Kerek (1984) con algunas modificaciones. Los pasos de este proceso se muestran

esquemáticamente en la Figura 26 (tomando como ejemplo a la 6-Kes).

i).- METILACIÓN

La metilación se realizó por adiciones subsecuentes de NaOH pulverizado finamente y en fresco,

seguido de CH3I. La cantidad de NaOH añadida se calculó en base a lo siguiente:

- Número de moles del monosacárido anhidro base (MW 162 mg/mmol)

Cantidad de muestra ÷ 162 mg/mmol.

- El número de moles se multiplicó por el número de grupos –OH disponibles para la metilación en

el polímero (en el caso de los fructanos, 3 para cada residuo de fructosa). Con el número de moles

se calculó la masa de NaOH correspondiente y se multiplicó por tres para tener un exceso de

reactivo y asegurar una metilación completa. Por su parte, el CH3I se adicionó en una cantidad

molar equivalente al NaOH considerando la densidad de este agente metilante (2.275 mg/µL).

Este proceso se realizó durante 3 días, adicionando los reactivos en intervalos de 4 a 5 h y

manteniendo la agitación constante y las condiciones anhidras. El ión CH3SOCH2-Na+, generado

como producto secundario, formó una suspensión lechosa que dificultó la agitación de la

suspensión e indicó el final de la metilación.

ii).- EXTRACCIÓN DE PRODUCTOS METILADOS

El contenido de los reactiviales se vació en un tubo con rosca de 30 mL, enjuagando los

reactiviales dos veces con agua destilada y una más con CH2Cl2. Se adicionaron 5 gotas de

Na2S2O3 al 5% para reducir los iones yoduro que se generan con frecuencia. La fase orgánica se

recuperó, mientras que la acuosa se extrajo dos veces más con CH2Cl2, recuperando y juntando la

fase orgánica. La fase orgánica se lavó con suficiente agua para eliminar reminiscencias de

DMSO. Cuando la formación de las dos fases no fue muy clara, se adicionó una pequeña cantidad

de NaCl para facilitar la separación de las fases.

85

i) Metilación

ii) Hidrólisis

iii) Reducción

iv) Acetilación

Figura 26. Metodología de derivatización de carbohidratos a alditol acetatos parcialmente metilados (PMAA).

86

A la fase orgánica se le agregó perlas de CaCl2 para retirar la humedad y después de un tiempo

suficiente, las muestras se pasaron por columnas de Na2SO4 anhidro y se llevaron a completa

sequedad con N2 (g). La eficiencia de la metilación se verificó por análisis de infrarojo, donde la

desaparición de la banda correspondiente al grupo alcohol, en el rango de 3700 a 3100 cm-1,

indicó una completa metilación.

iii).- HIDRÓLISIS

A los fructanos permetilados, contenidos en reactiviales de 4 mL, se les adicionó 900 µL de ácido

trifluoroacético (TFA) 0.5 M. La hidrólisis se realizó a 90 °C por 1 h. El reactivial se dejó enfriar.

Las muestras se llevaron a completa sequedad con N2 (g) con adición de tolueno para formar una

mezcla azeotrópica. Una vez que las muestras se secaron, se añadió 1 mL de tolueno y se

llevaron de nuevo a completa sequedad.

iv).- REDUCCIÓN

La reducción se llevó a cabo con 5 mg de borohidruro de sodio deuterado (NaBD4) disueltos en

500 µL de NH4OH 1N, a 60 °C por 1 h. Una vez que se enfriaron los reactiviales, se adicionó

cuidadosamente 5 gotas de ácido acético para destruir el exceso de NaBD4. Las muestras se

evaporaron hasta 1/3 de su volumen original, añadiendo una solución metanólica de ácido acético

al 15% (manteniendo siempre una temperatura inferior a 40 °C). Este paso se repitió dos veces

para asegurar la eliminación de boratos que pueden interferir en la acetilación o favorecer la

producción de difructosa anhidra. Las muestras se llevaron a completa sequedad en presencia de

metanol.

v).- ACETILACIÓN

A las muestras hidrolizadas y reducidas, se adicionó 500 µL de anhídrido acético y 250 µL de

piridina como catalizador. La acetilación se llevó a cabo por 2 h a 90 °C. Después de que las

muestras se enfriaron, la reacción se neutralizó añadiendo, con cuidado y lentamente, unas gotas

de solución saturada de NaHCO3, esperando que poco a poco la solución dejara de producir CO2.

87

vi) EXTRACCIÓN DE ALDITOL ACETATOS PARCIALMENTE METILADOS

El reactivial conteniendo los PMAA se lavó dos veces con solución saturada de NaHCO3 y dos

veces más con CH2Cl2, pasando la muestra a un recipiente de 30 mL. La fase orgánica se

recuperó, mientras que la fase acuosa se lavó dos veces más con CH2Cl2, recuperando y juntando

la fase orgánica. La fase orgánica se lavó dos veces más con agua y otra tercera con HCl 0.1 M

frío para destruir la piridina remanente. La fase orgánica se secó con CaCl2 anhidro y después de

un tiempo, los PMAA se filtraron en una columna de Na2SO4 anhidro y se llevaron a completa

sequedad con N2 (g).

vii) IDENTIFICACIÓN DE DERIVADOS POR CROMATOGRAFÍA DE GASES ACOPLADA A

ESPECTROMETRÍA DE MASAS (GC-MS)

Las muestras fueron disueltas en 4 mL de CH2Cl2. Para la separación cromatográfica se inyectó 1

µL, en un modo “splitless”, en un cromatógrafo de gases (Hewlett Packard 5890 Series II)

acoplado a un espectrómetro de masas (Hewlett Packard 5972 Series) como detector. Se utilizó

una columna capilar de fenil metil silicon al 5% (HP-5, 25 m × 0.31 mm d.i. × 0.52 µm de grosor) y

helio (He) como gas acarreador a una velocidad de flujo de 2 mL/min, sosteniendo una presión de

5 psi. La temperatura inicial del horno fue de 60 °C sostenida por 3 min, seguida de una rampa de

temperatura de 4 °C/min hasta 160 °C por un min, 0.5 °C/min hasta 180 °C por 1 min y

finalmente, 20 °C/min hasta 300 °C por 10 min. La temperatura del inyector y del detector fue de

300 °C. En el detector de masas, las muestras vaporizadas se ionizaron en alto vacío por

bombardeo electrónico con una energía de ionización de 70 eV. Suc (Sigma), 1-Kes, Nys, DP5

(Megazyme) y fructanos extraídos de tubérculos de cebolla y dalia fueron derivatizados como se

indica anteriormente. La identificación de los derivados se hizo de acuerdo a su patrón de masas,

comparaciones con los estándares y según lo reportado en la literatura (Carpita y Shea, 1990;

Bancal et al., 1993).

viii) CUANTIFICACIÓN DE DERIVADOS POR CROMATOGRAFÍA DE GASES ACOPLADA A

UN DETECTOR DE IONIZACIÓN EN FLAMA (GC-FID)

Para la cuantificación de los derivados, 1 µL de las muestras se inyectó en un cromatógrafo de

gases Hewlett Packard (5890) operado bajo las mismas condiciones que se describieron

anteriormente. Se utilizó un detector FID, que por su gran sensibilidad y su respuesta uniforme y

88

proporcional al número de compuestos formados en la combustión, sigue siendo el detector de

elección para análisis cuantitativos. Una mezcla de H2 (combustible) y aire (oxidante) fue utilizada

para la combustión. El área de los compuestos, registrada en un graficador Hewlett Packard

(HP3396 Series II), fue corregida en base a una respuesta efectiva de carbono (e.r.c.), según los

parámetros determinados por Sweet y col (1975) para este tipo de compuestos. Una vez corregida

el área de los derivados, éstos fueron cuantificados en base a porcentaje de área.

1.4. CARACTERIZACIÓN DE FRUCTANOS DE A. tequilana Weber var. azul (JALISCO)

Los fructanos de plantas de A. tequilana Weber var. azul proveniente de la región de Los Altos,

Jalisco fueron caracterizados con métodos espectroscópicos de mayor resolución, mismos que a

continuación se describen.

1.4.1. ESPECTROMETRÍA DE MASAS POR IONIZACIÓN/DESORCIÓN POR LÁSER ASISTIDA

POR UNA MATRIZ-TIEMPO DE VUELO (MALDI-TOF-MS)

En el análisis de masas por ionización/desorción por láser asistida por una matriz (MALDI-TOF-

MS) se utilizó un sistema Hewlett-Packard LDI AOOXP MS en un modo ión positivo. El voltaje de

aceleración fue de 30 kV y el voltaje de extracción fue de 9 kV. Se usó una presión de vacío de

2.1×10-6 Torr. Las muestras se ionizaron con láser de nitrógeno (λ337 nm) con un pulso de 4 a 7.5

J y un ancho de pulso de 3 ns. Las muestras se disolvieron en agua y co-cristalizadas con ácido

2,5-dihidroxibenzoico, utilizado como matriz asistente. Las muestras se introdujeron a la sonda y

rápidamente se secaron al vacío. La solución de la muestra se seco serialmente con la matriz para

obtener una sensibilidad óptima. Una mezcla de maltooligosacáridos se usó como estándar de

calibración.

1.4.2. RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR DE CARBONO 13

Este análisis fue realizado en colaboración con el Dr. Guillermo Mendoza-Díaz de la Facultad de

Ciencias Químicas de la Universidad de Guanajuato. Cinco mg de fructanos de A. tequilana

liofilizados, fueron disueltos en 500 µL de agua deuterada (D2O). El espectro de 13C-RMN fue

registrado con un equipo Varian de 300 MHz, utilizando 32 barridos. La muestra se analizó a 30

°C, con un tiempo de adquisición de 3.5 s y un pulso de 90°. Las señales se asignaron por

comparación con los ajustes químicos presentados por Suc (Sigma), 1-Kes, Nys, DP5

89

(Megazyme), utilizados como estándares, y por valores reportados en la literatura (Liu et al., 1991;

Sims et al., 2001 y otros). El tetrametil silano fue utilizado como referencia externa.

1.4.3. RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR DE PROTÓN

Cinco mg de fructanos de A. tequilana liofilizados se disolvieron en 500 µL de D2O. El espectro de

1H-RMN fue generado con un equipo Varian de 300 MHz en un modo de transformada de Fourier,

usando 32 barridos. Las muestras fueron analizadas a 30 °C con un tiempo de adquisición de 3.5

s con un pulso de 90°.

2. IDENTIFICACIÓN DE ACTIVIDADES ENZIMÁTICAS INVOLUCRADAS EN EL

METABOLISMO DE FRUCTANOS

2.1. EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS

Todo el proceso de extracción de proteínas se llevó a cabo a 4 °C utilizando en cada lote de

extracción 250 g de muestra molida. Este material se pulverizó con N2 líquido y las proteínas se

extrajeron con buffer McIlvaine (2 mL/g) adicionado con β-mercaptoetanol 1 mM (Apéndice A). La

suspensión se agitó constantemente durante 2 h, se filtró con un cedazo y después se centrifugó a

18000 rpm por 30 min. El sobrenadante se saturó con sulfato de amonio al 20% y se dejó reposar

por 2h. El precipitado obtenido después de centrifugar, se descarto y el sobrenadante, de nuevo

se saturado con sulfato de amonio al 80%, dejándolo precipitar toda la noche. Las proteínas

recuperadas por centrifugación se disolvieron con buffer de afinidad (buffer McIlvaine adicionado

con CaCl2 1 mM, MnSO4 1 mM y NaCl 0.5 M) y centrifugadas. El material precipitado fue

eliminado. Al sobrenadante se le denominó extracto crudo.

2.2. ESTRATEGIAS DE PURIFICACIÓN

En la identificación de las enzimas involucradas en el metabolismo de fructanos en agave y

dasylirion, se intentaron dos estrategias de purificación, cuyos resultados se muestran en el

presente trabajo. En la primera estrategia se utilizó cromatografía de afinidad, de intercambio

aniónico, de exclusión y resina de hidroxiapatita y los productos generados fueron identificados por

TLC. Mientras que, en la segunda estrategia de purificación, se utilizó la cromatografía de

intercambio aniónico, seguido de cromatografía de afinidad; los productos se identificaron con TLC

90

y/o HPAEC-PAD. A continuación se describen las condiciones cromatográficas que se utilizaron

en ambas estrategias.

2.2.1. CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD

Se utilizó una columna de vidrio con resina de afinidad concanavalina A (Amersham Pharmacia

Biotech; (16.5 × 1.2 cm)) equilibrada con 130 mL de buffer de afinidad (Apéndice A). El extracto

crudo se cargó a la columna a una velocidad de flujo de 0.5 mL/min y se recuperó la fracción que

no interactuó con la resina. La columna se lavó con buffer de afinidad hasta una lectura

espectrofotométrica (λ280 nm) menor de 0.01 (≈ 3 vol. de columna). La muestra se eluyó con 1.5

vol. de α-metil-manopiranósido 150 mM disuelto en buffer de afinidad, colectando fracciones de 3

mL. Las fracciones con absorbancia se juntaron y al igual que la fracción sin interacción con la

resina, se dializaron contra agua por 16 h con cambios continuos y agitación suave. Se realizó una

diálisis posteriormente contra buffer McIlvaine, utilizando membranas de diálisis (Sigma) de 12

kDa de corte. A esta fracción que se denominó ConA, se le determinó concentración proteínica por

el método de Bradford (1976) y se hicieron ensayos enzimáticos. La muestra se liofilizó.

2.2.2. CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO ANIÓNICO

La muestra diluida en 3 mL de buffer de intercambio aniónico (Apéndice A) fue cargada en una

columna de vidrio (12 × 1.2 cm) con resina de intercambio aniónico Mono Q Sepharose Fast Flow

(Amersham Pharmacia Biotech), previamente equilibrada con 3 vol. de buffer. Se recuperó la

fracción que no interaccionó con la resina, denominándosele fracción Q0. La columna se lavó con

este mismo buffer hasta λ280 nm < 0.01 (3 vol.) utilizando un flujo de 0.5 mL/min. Las proteínas

se eluyeron con un gradiente continuo de 100 mL de NaCl (0 a 600 mM) disuelto en buffer de

intercambio aniónico, colectando fracciones de 3 mL. Las fracciones con absorbancia se juntaron

en grupos y, junto con la fracción que no presentó interacción con la resina, se dializaron contra

agua por 16 h con cambios continuos y agitación suave y posteriormente con buffer McIlvaine. A la

muestra Q0 y las denominadas Q1, Q2, etc. se les determinó concentración proteínica y se ensayó

su actividad enzimática. Las muestras se liofilizaron.

91

2.2.3. CROMATOGRAFÍA DE HIDROXIAPATITA

Las fracciones Q provenientes de la cromatografía de intercambio aniónico fueron cargadas en

una columna de vidrio (1.5 × 1.7 cm) con resina de hidroxiapatita (Bio Rad). La resina se equilibró

con 3 vol. de columna (9 mL) de buffer Bis-Tris-HCl 20 mM (pH 6.0). La muestra disuelta en este

buffer (de 200 a 500 µL) se cargó a la columna. La columna se lavó con 3 mL de buffer,

recuperando esta fracción denominada HA-L (hidroxiapatita-lavada). La muestra que interaccionó

con la resina, se eluyó con 3 vol. de buffer NaH2PO4 300 mM (pH 5.6) y colectada en dos

fracciones. Estas muestras se denominaron HA-E1 y HA-E2, respectivamente (hidroxiapatita-

eluida). Cada una de las fracciones se dializó contra agua durante 5 h y se liofilizó. Las muestras

se disolvieron en buffer McIlvaine y se realizó el ensayo enzimático.

2.2.4. CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN (FILTRACIÓN EN GEL)

Para la cromatografía de exclusión, se utilizó una columna de vidrio (60 × 2.6 cm) empacada con

resina Sephacryl S-200 (Amersham Pharmacia). La columna se equilibró con buffer de exclusión

(Apéndice A). Para determinar el volumen vacío se cargó azul dextran (2000 kDa) a la columna, a

una concentración de 1 mg/mL; mientras que para calibrar la columna se corrieron los siguientes

estándares: catalasa (232 kDa), γ-globulina (158 kDa), seroalbúmina (66 kDa) y lisozima (14.3

kDa). La determinación del volumen vacío y la calibración de la columna se hicieron por triplicado.

La muestra liofilizada se diluyó en 3 mL de buffer de exclusión, se cargó en la columna y se eluyó

con este mismo buffer a una velocidad de 0.8 mL/min, colectando fracciones de 2 mL. El

coeficiente de distribución (KD) de la masa molecular de las proteínas eluídas se calculó de

acuerdo a la ecuación IV:

KD = Volumen de elución muestra - Volumen vacío (IV)

Volumen de columna - Volumen vacío

Las fracciones con absorbancia se juntaron por grupos, se dializaron contra agua con cambios

continuos y agitación suave, y posteriormente dializadas contra buffer McIlvaine. Se realizaron

ensayos enzimáticos.

92

2.3. CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

La concentración de proteínas en cada fracción fue determinada por el método de Bradford (1976),

basado en el cambio de color del Coomassie de rojo a azul, después de que este colorante

interacciona con las proteínas. Aunque las proteínas usadas para este ensayo son

desnaturalizadas irreversiblemente, este método es preferido por rápido y sensible (25 a 200

µg/mL). Los extractos de proteínas disueltos en buffer McIlvaine se llevaron a un volumen final de

100 µL, se añadió 1 mL de buffer Bradford (Apéndice A) y se agitó en vórtex. Para la

cuantificación de proteínas en cada determinación se hizo en paralelo, una curva de calibración

usando albúmina de suero bovino (BSA) como proteína estándar.

2.4. ENSAYOS ENZIMÁTICOS

La actividad enzimática de cada una de las fracciones eluídas de las distintas columnas

cromatográficas, fueron ensayadas en buffer McIlvaine, en presencia de Suc 200 mM, 1-Kes 50

mM o fructanos de agave al 1%, incubando a 0 ó 30 °C, según se indica. Se tomaron alícuotas

periódicamente para ser analizadas por TLC o HPAEC-PAD. Las enzimas se inactivaron a 90 °C

durante 5 min.

2.5. SEPARACIÓN ELECTROFORÉTICA

La separación electroforética de proteínas se llevó a cabo en geles de poliacrilamida (PAGE) al

10% (resolución para proteínas de 18 a 75 kDa), en condiciones desnaturalizantes en presencia

del detergente SDS. El reservorio interno y externo de la cámara electroforética se llenó con buffer

de electroforesis (Tris 25 mM, glicina 192 mM). Las muestras se mezclaron con buffer de muestra

5×, se calentaron 10 min a 100 °C, se concentraron con un breve pulso en una microfuga y se

cargaron en cada carril del gel concentrador. Las proteínas se separaron con una corriente de 200

V. Las proteínas separadas por geles de electroforesis se visualizaron con azul de Coomassie.

Los geles se transfirieron en pequeños contenedores con 20 mL de solución de tinción (Apéndice

A) y agitación suave. Los geles fueron desteñidos con solución de desteñido hasta la visualización

clara de las bandas de proteínas.

93

3. AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIAS CODIFICANTES DE ENZIMAS DEL

METABOLISMO DE FRUCTANOS DE AGAVE Y SU EXPRESIÓN EN Pichia pastoris

3.1. AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIAS CODIFICADORAS

3.1.1. EXTRACCIÓN DE ÁCIDO RIBONUCLEICO

Aproximadamente 50 mg de material de agave o dasylirion almacenado a -80 °C fueron colocados

en un tubo eppendorf de 2 mL de capacidad, inmersos en un tanque con N2 líquido y pulverizados

en un desmembrador (B. Biotech International, Alemania) por 2 min a 2800 rpm, usando dos

perlas de vidrio de 2 mm y dos de 4 mm de diámetro. Se probaron distintos métodos de extracción

de ARN buscando las condiciones óptimas de rendimiento y calidad de acuerdo a las

características del material en estudio:

i) MÉTODO DE PRECIPITACIÓN CON CLORURO DE LITIO

Al tejido pulverizado se agregaron 500 µL de buffer de extracción (Apéndice A) y se agitó en el

desmembrador. Se adicionaron 500 µL de mezcla fenol:cloroformo: alcohol isoamílico (v/v/v,

50:49:1), se agitó en el desmembrador, se le adicionó 40 µL de acetato de sodio 3 M (pH 5.2) y se

agitó de nuevo en el desmembrador. Las muestras reposaron en hielo por 15 min y se

centrifugaron a 4 °C a 13000 rpm por 15 min. La suspensión se transfirió a un tubo eppendorf

nuevo y se desecharon los restos de tejidos. La muestra se centrifugó a 13000 rpm por 20 min y

se transfirió la fase acuosa (superior) a un eppendorf. Se añadió 500 µL de isopropanol frío y se

dejó reposar 20 min a – 80 °C. La muestra se centrifugó y la pastilla se lavó con 1 mL de etanol

absoluto centrifugando a 10000 rpm durante 5 min. El precipitado se secó poniendo primero el

tubo invertido sobre un papel filtro por 1 min en la campana y luego se dejó secar en hielo.

La pastilla se resuspendió en 200 µL de agua estéril tratada con DEPC, eliminando el material

insoluble por centrifugación. El ARN se precipitó con 100 µL de LiCl 8M durante toda la noche a -

20 °C, recuperándose al día siguiente por centrifugación a 13000 rpm durante 20 min. La pastilla

se lavó con etanol al 75%, resuspendiéndola posteriormente con cuidado. Se centrifugó de nuevo

a 7500 rpm por 20 min. El ARN se resuspendió en agua desionizada y se almacenó a - 20 °C

hasta su análisis.

94

ii).- MÉTODO DE TRIZOL (Gibco, BRL)

Al tejido pulverizado se agregó 1 mL de reactivo Trizol (solución monofásica de fenol pH 8 e

isotiocianato de guanidina). El rompimiento del tejido se hizo en el desmembrador agitando a 2800

rpm durante 2 min. Las muestras se dejaron reposar por 5 min a temperatura ambiente para

disociar completamente el complejo nucleoprotéico y después se centrifugaron a 13000 rpm por

20 min, transfiriendo la suspensión a un eppendorf limpio y eliminando los restos de tejido. La

muestra se centrifugó de nuevo a 13000 rpm por 20 min. Se recuperó la fase acuosa (superior),

transfiriéndola a un tubo nuevo. Se adicionó alcohol isopropílico frío y se dejó reposar 15 min a

temperatura ambiente. El ARN se recuperó por centrifugación. La pastilla se lavó con etanol frío al

75%, resuspendiéndola y centrifugándola de nuevo a 7500 rpm por 15 min. El ARN se

resuspendió en 20 µL de agua desionizada y se almacenó a -20°C hasta su análisis.

3.1.2. GELES DE AGAROSA

Para el análisis de la integridad del material genómico y la verificación de algunos productos, se

corrieron geles de agarosa. La agarosa se disolvió en buffer TAE con bromuro de etidio (Apéndice

A). Se mezcló 2 µL de muestra con 2 µL de buffer de carga y se aplicaron individualmente en

cada pozo del gel de agarosa. Las corridas se efectuaron en buffer TAE a 2 mV/min. La

visualización de las bandas de ácidos nucleicos se hizo mediante luz ultravioleta.

3.1.3 ELECTROFORESIS EN “MICROCHIP”

La calidad y concentración del ARN se midió en un aparato de electroforesis Agilent 2100

bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) que funciona en base a microchips (RNA 6000

Nano LabChip kit). Se adicionó una serie de colorantes a 1 µL de cada una de las muestras de

ARN, las cuales se depositaron dentro de unas microceldas contenidas en una placa de chips. La

placa se agitó por 1 min y se colocó dentro del lector. Adicional a las muestras, se corrió 1 µL de

marcador de ARN como control positivo. La señal emitida consistió en un electroferograma que

puede traducirse en una imagen de gel de agarosa.

95

3.2. OBTENCIÓN DE SECUENCIAS COMPLEMENTARIAS (ADNc) POR TRANSCRIPCIÓN

REVERSA

Una vez obtenido ARN de calidad aceptable, se dispuso a la síntesis de las cadenas

complementarias (ADNc) a través de reacciones de transcripción reversa, utilizando el kit RT-PCR

Superscript II (Gibco BRL). En un tubo eppendorf libre de nucleasas, se colocó 1 µL de oligo-dT12-

18 (500 µg/mL), 2 µL de ARN total, 1 µL de mezcla de dNTP (10 mM de cada uno dATP, dGTP,

dCTP y dTTP) y agua estéril hasta un volumen final de 12 µL. La mezcla de reacción se calentó a

65 °C por 5 min para destruir cualquier estructura secundaria del ARN que pudiese causar error

en la transcripción reversa. Inmediatamente se colocó la mezcla en hielo y se añadió 4 µL de

buffer de transcripción (Apéndice A), 2 µL de DTT 0.1 M y 1 µL de inhibidor recombinante de

ribonucleasas RNaseOUT (40 U/µL). El contenido del eppendorf se mezcló suavemente, se

incubó 2 min a 42 °C y posteriormente se añadió 1 µL (200 U) de transcriptasa reversa

Superscript II (purificada de cepas de E. coli que expresan el gen pol del virus de la leucemia,

Moloney murine). La reacción se incubó 50 min a 42 °C y se inactivó a 72 °C durante 15 min. Para

eliminar restos de ARN complementario al ADNc se adicionó 1 µL (2 U) de RNasa H de E. coli y la

reacción se incubó 20 min a 37 °C.

3.2.1. DISEÑO DE OLIGONUCLEÓTIDOS INICIADORES

En las reacciones de amplificación mediada por la enzima ARN polimerasa (PCR), se utilizaron

oligonucleótidos degenerados como iniciadores (o “primers”) (Tabla 14). Estos fueron diseñados

en base a regiones altamente conservadas de secuencias de ADNc, reportadas en el banco de

datos (www.ncbi.nhl.gov/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val) como involucradas en el

metabolismo de fructanos. Se incluyeron secuencias de Inv-V y diversas FT de origen vegetal

(Figura 27). Como control positivo de la reacción de PCR se utilizaron oligonucleótidos

pertenecientes a secuencias conocidas de ARN ribosomal de algunos agaves como A. americana

y A. striata (Tabla 14).

3.2.2. AMPLIFICACIÓN DE SECUENCIAS COMPLEMENTARIAS

La mezcla de ADNc sintetizados por transcripción reversa fue utilizada como templado en la

reacción de amplificación por PCR, usando distintas combinaciones de los oligonucleótidos

degenerados (AtFT1-AtFT2; AtFT3-AtFT4 y AtFT1-AtFT4). Para un volumen final de reacción de

96

50 µL, en un tubo de PCR se adicionó 5 µL de buffer de PCR 10× adicionado con MgCl2 25 mM,

0.5 µL de mezcla de dNTP 20 mM, 0.5 µL de cada oligonucleótido iniciador 100 µM, 0.5 µL de

enzima Taq polimerasa (Thermophilus aquaticus, 5 U/µL), 41.5 µL de agua y 2 µL de ADNc. Las

condiciones de amplificación fueron como se indican: temperatura inicial de desnaturalización 95

°C por 2 min, seguido de 30 ciclos con una temperatura de desnaturalización de 95 °C por 1 min,

temperatura de alineamiento de 50 °C por 30 s y temperatura de extensión de 72 °C por 1.5 min;

posteriormente se utilizó una temperatura final de extensión de 72 °C por 10 min. Los productos

de PCR se analizaron por geles de agarosa al 0.8%.

Tabla 14. Secuencia de oligonucleótidos utilizados. Oligonucleótido Secuencia Dirección At-Ctr1 5´-TTGAGGCCCGAACGG-3´ Directa (control) At-Ctr2 5´-TATTGCAGGATCGCA-3´ Reversa (control) At-FT1 5´-TWYCATTTYCARCC-3´ Directa (degenerado) At-FT2 5´-GGGTCNCKGAARTC-3´ Reversa (degenerado) At-FT3 5´-TGGGGCCAYGCNGTVTCC-3´ Directa (degenerado) At-FT4 5´-TCVAYRCAYTCCCACAT-3´ Reversa (degenerado) 5ÁtRACEOuter 5´-TGGATTGGGGTCCCTGAAGTCCT-3´ Reverso (gen especí-

fico; externo) 5ÁtRACEInner 5´-AGCCACCGCAAGATTGACGAC-3´ Reverso (gen especí-

fico; interno) 3´ AtRACE 5´-CGGGCTCAGTTGCGGTATTA-3´ Directo (gen especí-fico) 5´RACE Adapter 5´-GCUGAUGGCGAUGAAUGAACAC

UGCGUUUGCUGGCUUUGAUGAAA-3´ 5Ádaptador (Ambion)

5´RACE Outer 5´-GCTGATGGCGATGAATGAACAC TG-3´

Directo (Ambion)

5´RACE Inner 5´-CGCGGATCCGAACACTGCGTTTG CTGGCTTTGATG-3´

Directo (Ambion)

3´RACE Outer 5´-GCGAGCACAGAATTAATACGAC T-3´

Reverso (Ambion)

PpAt-FT1 5’-TTACCGCAATCGGAATCGATTTT GGGTGAG-3´

Directo (se indica el sitio Cla I)

PpAt-FT2 5’ GGAGTTTTGAGTGTCTAGATGAG CTTTCAG-3´

Reverso (se indica el sitio Xba I)

De acuerdo al código IUB: W= A + T; Y= C + T; R, A + G; N= A + C + T + G; K= T + G; V= A + C + G

97

3.2.3. ELUCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ADN A PARTIR BANDAS DE AGAROSA

La separación de los productos de PCR por electroforesis fue visualizada por UV y aquellas

consideradas promisorias de acuerdo a su tamaño (kb), fueron eluidas y purificadas del gel, con

un kit comercial (GFX PCR DNA and gel band purification kit, Amersham). La banda cortada del

gel se colocó en un tubo eppendorf, se adicionó 300 µL de buffer de captura (buffer de acetato

con agentes caotrópicos), se agitó y se incubó a 60 °C por 15 min o hasta que la agarosa se

disolvió completamente. La suspensión se cargó en una columna empacada con matriz de fibra de

vidrio. Después de centrifugar 30 s a 13000 rpm, el ADN quedó retenido en la matriz de vidrio,

mientras que proteínas y sales contaminantes fueron eliminadas en el sobrenadante. El ADN se

lavó con buffer de lavado (TE con etanol absoluto a una concentración final del 80%),

centrifugando 30 s a 13000 rpm. A la columna se le adicionó 50 µL de agua desionizada,

reposando por 2 min. Posteriormente el ADN fue eluido por centrifugación a 13000 rpm durante 2

min. El ADN purificado se concentró hasta sequedad total por sublimación al vacío (en un “maxi-

dry”) a temperatura ambiente.

3.2.4. PREPARACIÓN DE CÉLULAS COMPETENTES

Las células de E. coli DH5α se utilizaron para propagar las secuencias amplificadas. Se tomó una

sola colonia de esta cepa, se inoculó en 5 mL de medio Luria Bertani líquido (LB) y se incubó toda

la noche a 37 °C con agitación moderada. Al día siguiente, se tomaron 2.5 mL de esta suspensión

celular y se inoculó a 500 mL de medio LB contenido en un matraz Erlenmeyer de 2 L. Las células

crecieron en agitación constante a 37 °C hasta una densidad óptica a λ600 nm de 0.5 a 0.6. Las

células se dejaron reposar 15 min en baño de hielo y se transfirieron a un recipiente de centrífuga

previamente enfriado. Los procesos subsecuentes se llevaron a cabo a 4 °C. Las células se

centrifugaron a 4200 rpm durante 20 min, desechando el sobrenadante y resuspendiendo la

pastilla en 5 mL de agua fría. Se añadieron 500 mL de agua destilada fría, agitando hasta una

suspensión homogénea. Las células se centrifugaron de nuevo, descartando el sobrenadante

inmediatamente. Las células se resuspendieron con el líquido remanente. El paso anterior se

repitió, eliminando inmediatamente el sobrenadante y resuspendiendo la pastilla bacteriana en

glicerol estéril al 10%. Las células se centrifugaron, el sobrenadante se eliminó y el precipitado se

resuspendió en 4 mL de glicerol al 10%. Se hicieron alícuotas de 100 a 200 µL de células en tubos

eppendorf, se congelaron inmediatamente en N2 líquido y se almacenaron a – 80 °C.

98

Figura 27. Diseño de oligonucleótidos degenerados. Diversas secuencias de fructosiltransferasas e invertasas reportadas en el banco de datos, fueron alineadas. Sitios conservados fueron utilizados para el diseño de oligonucleótidos degenerados. De acuerdo al código IUB: W= A + T; Y= C + T; R, A + G; N= A + C + T + G; K= T + G; V= A + C + G. Para abreviaturas Ac-1SST y otras, ver Tabla 22.

99

3.2.5. CLONACIÓN Y TRANSFORMACIÓN

La clonación se realizó en un sistema pGEM-T Easy Vector (Promega) (Figura 28), usando la

enzima T4 DNA ligasa (del bacteriófago T4, Promega). En un tubo eppendorf se colocó 1 µL de

buffer de ligación 10x, 1 µL de enzima T4 DNA ligasa (3 U Weiss*/µL, *cantidad de enzima que

cataliza el intercambio de 1 nmol de 32P de pirofosfato en [γ, β-32P]-ATP en 20 min a 37 °C), 3 µL

de agua desionizada y 5 µL de ADN. La mezcla se incubó a 4 °C por un tiempo variable de 24 a

48 h o a 16 °C toda la noche. El sistema pGEM-T Easy consiste en un vector abierto con un par

de timinas en sus extremos, que facilita la clonación de un producto de PCR después de que la

enzima Taq en el proceso de amplificación, adiciona en los extremos del producto un par de

adeninas.

La transformación se realizó por electroporación usando células competentes E. coli DH5αF’.

Estas células se colocaron en una celda de electroporación, se adicionó de 2 a 5 µL de la mezcla

de clonación y se dejó reposar en hielo por 15 min. La transformación se realizó con un pulso

breve de 2.5 V, una resistencia de 200 ohms y una capacitancia de 25 µF.

Inmediatamente se adicionó a la celda 1 mL de medio LB. Esto se transfirió a un tubo de ensaye

estéril y se incubó en agitación a 37 °C por 1 h para la recuperación de las células. Las células

transformadas se sembraron en distintos volúmenes dispersándolas con una varilla de vidrio en

placas de LB agar (15 g/L) que contenía IPTG como inductor de la expresión del plásmido,

carbenicilina (50 µg/mL) como factor de selección y X-Gal (40 mg/mL disuelto en dimetil-

formamida) como sustrato de la enzima β-galactosidasa (Figura 28). Las placas se incubaron toda

la noche a 37 °C. Las colonias que desarrollaron un color blanco después de crecer, se

recuperaron con la ayuda de una punta estéril, se estriaron en placas LB con carbenicilina y las

puntas se transfirieron a tubos de ensaye con 1 mL de LB con antibiótico. Los tubos se incubaron

toda la noche en agitación a 37 °C.

3.2.6. PURIFICACIÓN DE PLÁSMIDOS (MINIPREPARACIONES)

Las células crecidas en medio LB con antibiótico fueron recuperadas por centrifugación a 13000

rpm por 20 min. La purificación del ADN plasmídico (mini-preps) se realizó con un kit (Quiagen). La

pastilla celular se resuspendió en 200 µL de buffer P1 (con RNAasa), se adicionó 350 µL de

A)

100

B)

Figura 28. Vector pGEM-T Easy. A) Mapa del vector. Se muestra el origen de replicación para E. coli (ori), el gen para la β-lactamasa que confiere resistencia a la familia de la ampicilina (Ampr) y el sitio de clonación múltiple que interrumpe el gen lac Z. T7 y SP6 son regiones promotoras. B) Secuencia promotora y de la región de clonación múltiple. En el sitio de clonación se encuentra un segmento corto de ADN de E. coli que codifica los primeros 146 aminoácidos de la enzima β-galactosidasa (del operon lac). Su expresión depende de la capacidad de la célula huésped de codificar la porción C-terminal de dicha enzima. En presencia del inductor IPTG, la célula traduce ambos fragmentos que se asocian por α-complementación, generando una proteína activa. Las bacterias Lac+ resultantes de esta complementación generan colonias azules en presencia del sustrato cromogénico X-Gal; mientras que la inserción de una secuencia de ADN en el sitio de clonación, resulta en la formación de un fragmento N-terminal incapaz de complementación por lo que forman colonias de color blanco.

101

buffer de lisis y se incubó a temperatura ambiente por 5 min. Se añadió 350 µL de solución de

neutralización. La suspensión se centrifugó a 13000 rpm por 10 min. El sobrenadante se cargó en

una columna que se centrifugó a 13000 rpm por 2 min. La resina se lavó con una solución de

lavado por centrifugación. A la resina se adicionó 50 µL de agua desionizada y se incubó 5 min a

temperatura ambiente. El ADN plasmídico se eluyó por centrifugación a 13000 rpm por 2 min.

3.2.7. CONFIRMACIÓN DE LA SECUENCIA EN EL PLÁSMIDO

Para confirmar la presencia de la secuencia en el plásmido se hicieron reacciones de amplificación

(PCR), utilizando la combinación de oligonucleótidos degenerados utilizados anteriormente (Tabla

14) y utilizando el plásmido como templado.

Por otra parte, se realizó un análisis de restricción, usando las enzimas Eco RI (5´-G↓AATTC-3´) o

Not I (5´-GC↓GGCCGC-3´) que reconocen las secuencias palindrómicas que flanquean la región

de clonación multiple del vector (Figura 27). En un tubo eppendorf se adicionó 1 µL de buffer O+

(MBI Fermentas) 3.5 µL de agua desionizada, 0.5 µL de enzima de restricción (Eco RI o Not I) y 5

µL de ADN plasmídico. La reacción se incubó a 37 °C por 2 h. Como control negativo se utilizó

una reacción sin enzima. El producto de la reacción se corrió en geles de agarosa para confirmar

la presencia del inserto. Después de una cuantificación espectrofotométrica a λ260 nm, se

tomaron de 200 a 500 ng de ADN plasmídico que contenía el inserto y se secuenció.

3.2.8. IDENTIFICACIÓN DE LAS SECUENCIAS (Blast)

Los fragmentos de nucleótidos correspondientes a los resultados de secuenciación, se

compararon contra una base de datos (www.ncbi.nih.gov/blast) para determinar las mayores

homologías y proponer una posible función a la secuencia codificadora.

3.3. AISLAMIENTO DEL ADNc COMPLETO DE LA SECUENCIA CODIFICANTE

Una vez conocidos pequeños segmentos de las secuencias codificadoras, se diseñaron

oligonucleótidos específicos para aislar el ADNc completo (Tabla 14), a través de la rápida

amplificación de los extremos del ADNc mediados por la RNA ligasa (RLM-RACE, Ambion). En

reacciones independientes, se amplificó los extremos 5´(5-RACE) y 3´(3-RACE), de acuerdo al

esquema que se presenta en la Figura 29.

102

3.3.1. AMPLIFICACIÓN RÁPIDA DEL EXTREMO 5´ DEL ADN COMPLEMENTARIO (5´-RACE)

i).- ELIMINACIÓN DE ARNm TRUNCADOS O INCOMPLETOS

En un tubo eppendorf se colocó 2 µL de buffer CIP 10×, 2 µg de ARN total, 1 µL de fosfatasa

intestinal de ternera (CIP) y agua hasta un volumen de 10 µL. La reacción se incubó a 37 °C por 1

h. La enzima CIP hidroliza los fosfatos expuestos del ARNm incompletos o truncados. Después de

terminada la reacción, se purificó el ARN adicionando 500 µL de fenol:cloroformo:alcohol

isoamílico (50:49:1, v/v/v). Se centrifugó y se recuperó la fase acuosa (superior). El ARN se

precipitó con 500 µL de alcohol isopropílico, incubando a – 20 °C por 20 min. El ARN se recuperó

por centrifugación a 13000 rpm por 20 min y se lavó con etanol frío al 75%, resuspendiendo la

pastilla y finalmente centrifugando a 7500 rpm por 10 min. La pastilla final se resuspendió en 10

µL y se cuantificó espectrofotométricamente a una absorbancia de λ260 nm.

Figura 29. Amplificación de los extremos de ADNc mediado por ARN ligasa (RLM-RACE). Método según Ambion. CIP, fosfatasa intestinal de carnero; TAP, fosfatasa ácida de tabaco; OGE 5ý 3´, oligonucleótido gen específico para el extremo 5ý 3´, respectivamente (5´- y 3´-AtRACE); rectángulo negro, los adaptadores y en rectángulo a cuadros oligonucleótidos suministrados en el kit.

103

ii).- HIDRÓLISIS DE LA ESTRUCTURA CAP DE LOS ARNm

En un tubo eppendorf se colocó 2 µL de buffer TAP 10×, 2 µL de ARN purificado de la reacción

anterior, 1 µL de fosfatasa ácida de tabaco (TAP) y agua hasta un volumen final de 10 µL. La

reacción se incubó a 37 °C por 1 h. La enzima TAP hidroliza la estructura CAP (CH3-GpppNpNp-)

de los ARNm, dejando expuestos los grupos fosfato.

iii).- LIGACIÓN CON EL ADAPTADOR 5-RACE

Una vez expuesto los grupos fosfato de los ARNm se les adaptó al extremo 5´ una secuencia

conocida o adaptador 5-RACE (Tabla 14) En un tubo eppendorf se colocó 2 µL de buffer de ligasa

10×, 2 µL de la reacción anterior, 1 µL de enzima ligasa y agua hasta un volumen final de 10 µL.

La reacción se incubó a 37 °C por 1 h.

iv).- TRANSCRIPCIÓN REVERSA

La transcripción reversa para la síntesis de ADNc se realizó con el kit comercial RT-PCR

Superscript II (Invitrogen), de acuerdo a las instrucciones de la sección 3.2. Como templados se

utilizaron hexámeros al azar.

v).- AMPLIFICACIÓN POR PCR

La reacción de PCR se realizó con las siguientes condiciones: temperatura inicial de

desnaturalización de 95 °C por 2 min; 30 ciclos de amplificación consistente en una temperatura

de desnaturalización de 95 °C por 1 min, temperatura de alineamiento de 50 °C por 30 s y

temperatura de extensión de 72 °C por 2 min. La temperatura final de extensión fue de 72 °C por

10 min. Para la amplificación, se utilizó el oligonucleótido suministrado en el kit (5´RACE Outer,

Tabla 14) para amplificar el extremo 5´ y el oligonucleótido gen específico (5ÁtRACEOuter) para

amplificar la secuencia en el sentido inverso. Se realizó una segunda reacción de PCR (de

anidamiento) bajo las mismas condiciones, utilizando el oligonucleótido gen específico (5ÁtRACE

Inner) y el oligo 5-RACE Interno suministrado en el kit (5´RACE Inner). Los productos de PCR se

analizaron por geles de agarosa al 1% para verificar el tamaño de los fragmentos. Las bandas se

eluyeron y se purificaron.

104

3.3.2. AMPLIFICACIÓN RÁPIDA DEL EXTREMO 3´ DEL ADN COMPLEMENTARIO (3´-RACE)

En la amplificación del ADNc en su extremo 3´, la fracción del ARNm se enriqueció a partir del

ARN total, mediante su purificación en una resina de secuencia poli-A. Para la síntesis del ADNc,

la transcripción reversa se realizó con el kit RT-PCR Termo Script (Invitrogen), utilizando oligos dT

adaptados a una secuencia conocida (3´RACE Adapter, Ambion). La temperatura de la

transcripción se llevó a cabo a 55 °C. La amplificación del extremo 3’ del ADNc recién sintetizado,

se llevó a cabo mediante un PCR, utilizando un oligonucleótido con una secuencia poli A para

amplificar el extremo 3´ (3´RACE Outer, Ambion) y un oligonucleótido específico diseñado a partir

de la secuencia conocida (3ÁtRACEOuter, Tabla 14). Las condiciones de la reacción de PCR

fueron como se describe para la amplificación del extremo 5´. Los productos se corrieron en un gel

de agarosa al 1% para verificar el tamaño de los fragmentos.

3.3.3. LIGACIÓN Y CLONACIÓN DEL ADNc COMPLETO

Cada uno de los extremos del ADNc se clonaron de manera independiente en el vector pGEM-T

Easy y se utilizaron para la transformación de células competentes de E. coli DH5α. Se hizo un

escrutinio de colonias blancas, purificación de plásmidos y verificación del ADNc por

secuenciación. Cada uno de los fragmentos fue caracterizado por un análisis de restricción para

determinar la orientación de los insertos. Se diseñó una estrategia de clonación para lograr la

ligación de ambos extremos en la dirección correcta, utilizando un sitio de restricción único (Bsh TI

o Age I, 5´-A↓CCGGT-3´) en la región donde ambos fragmentos se traslapan. El ADNc completo y

contenido en el vector, se utilizaron para transformar células competentes de E. coli DH5α. Las

colonias blancas obtenidas se recuperaron, se purificaron los plásmidos y el inserto se caracterizó

a través de análisis de restricción y finalmente por secuenciación.

3.4. EXPRESIÓN EN Pichia pastoris

La levadura Pichia pastoris cepa silvestre X-33 fue el hospedero de elección para la expresión

heteróloga del ADNc con el objetivo de investigar la especificidad de sustrato y el modo de acción

de la enzima codificada. Como vector de expresión se empleó el plásmido pGAPZαC (Figura 30)

que confiere resistencia a zeocina (expresión del gen sh ble) y permite la expresión constitutiva del

transgen bajo el promotor GAP (gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa). Dado que el plásmido

105

pGAPZαC no contiene un origen de replicación de levadura, las células transformantes se

generan a partir de una recombinación homóloga entre el plásmido y el genoma de la levadura.

Figura 30. Mapa del vector pGAPZααααC. La expresión del vector se encuentra bajo la región promotora del gen constitutivo de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (pGAP, 1-483 pb); factor α (493-759 pb), secuencia señal derivada de Saccharomyces cerevisiae que transporta la proteína traducida al espacio extracelular; sitio de clonación múltiple con sitios de restricción que permiten la inserción del ADN heterólogo (760-828 pb); epítope myc (827-856 pb), EQKLISEEDL, facilita la detección de la proteína heteróloga con el anticuerpo Anti-myc; región His (872-889 pb), codifica 6 histidinas para la purificación de la proteína heteróloga por afinidad; AOX1 TT (893-1233 pb), región de terminación del gen aox1 que procesa eficientemente el ARNm, incluyendo la poliadenilación y la estabilidad de la molécula; pTEF1 (1234-1644 pb), promotor del factor de transcripción de S. cerevisiae que dirige la expresión del gen Sh ble en P. pastoris que confiere resistencia a zeocina; pEM7 (1645-1712 pb), promotor eucariótico sintético que dirige la expresión constitutiva de Sh ble en E. coli; Sh ble (1713-2405 pb), región codificadora para el gen Sh ble de Streptoalloteichus hindustanus que codifica para la resistencia a zeocina; CYC1 (2088-2405 pb), región de terminación de la transcipción del gen CYC1 de S. cerevisiae que permite la eficiente terminación del gen Sh ble; pUC ori (2416-3089 pb), permite la replicación y mantenimiento del plásmido en E. coli.

106

3.4.1. ELIMINACIÓN DEL PÉPTIDO SEÑAL Y SECUENCIA DE TERMINACIÓN

Las FT vegetales son sintetizadas como proteínas precursoras con 2 péptidos señales

consecutivos en el extremo N-terminal que se escinden durante la entrada de la enzima al retículo

endoplasmático y su posterior transporte a la vacuola, respectivamente. El empleo del programa

SignalP (versión 3.0; www.cbs.dtu.dk/services/SignalP) indica la presencia del péptido señal en la

proteína deducida del ADNc aislado. Para deducir el posible inicio de la proteína madura se realizó

un alineamiento múltiple de secuencias de la proteína deducida del ADNc con diferentes Inv y FT,

cuyos sitios de procesamiento proteolítico se han determinado experimentalmente. Se diseñaron

los oligonucleótidos PpAt-FT1 y PpAt-FT2 (Tabla 14) con la finalidad de eliminar la secuencia

señal y la secuencia de terminación del ADNc aislado. Así mismo, con el uso de estos

oligonucleótidos se introdujo en la secuencia, los sitios de restricción Cla I (Bsu 1 5I, 5´-

AT↓CGAT-3´) en el extremo 5´ y Xba I (5´-T↓CTAGA-3´) en el extremo 3´, para permitir la

clonación del inserto en fase con el vector. Para la reacción de amplificación se utilizó 10ng de

templado, 25µM de cada oligonucleotido, 10mM dNTP, 1u Pfu y el ADN fue amplificado bajo las

siguientes condiciones: temperatura inicial de 94 °C por 4 min, seguido de 30 ciclos de

temperatura de desnaturalización de 94 °C por 45 s; 60 °C por 45 s; 72 °C por 1.30 min y un paso

final de 72 °C por 5 min Los productos de PCR se corrieron en geles de agarosa, se purificaron y

se clonaron en el vector pGAPZαC previamente digerido con Cla I y Xba I. A esta construcción se

le denominó pGAPZαC-At-FT.

3.4.2. PROPAGACIÓN DEL VECTOR

Se utilizaron células de E. coli para la propagación del vector pGAPZαC-At-FT. Las células se

transformaron por electroporación y se incubaron toda la noche en placas LB con bajo contenido

de sal (NaCl 0.5%) suplementadas con zeocina (50 µg/mL). Se usón análisis de PCR y análisis

de restricción para el escrutinio de eventos positivos. Confirmada la correcta ligación de la

secuencia en el marco de lectura del vector, se seleccionó un clon de E. coli para producir

suficiente cantidad de plásmido y transformar células competentes de P. pastoris.

Aproximadamente 5 µg de ADN se linearizó con la enzima de restricción Avr II (Xma JI, 5´-

C↓CTAGG-3´) que digiere en la región interna del vector. La digestión se inactivó por

calentamiento, el ADN se extrajo con fenol:cloroformo y se precipitó con 1/10 vol. de acetato de

107

sodio 3 M y 2.5 vol. de etanol al 100%. Se recuperó el ADN por centrifugación y la pastilla se lavó

con etanol al 80%, se secó y se resuspendió en agua destilada.

3.4.3. TRANSFORMACIÓN DE Pichia pastoris Y ANÁLISIS DE EXPRESIÓN

Se inocularon 5 mL de medio YPD con una colonia de la cepa silvestre X-33 de P. pastoris y se

incubadó toda la noche a 30 °C. Quinientos µL de este preinóculo fue inoculado a 500 mL de

medio YPD y se incubó toda la noche hasta una densidad óptica a λ600 nm de 1.3-1.5. Las

células se recuperaron por centrifugación a 1500 rpm por 5 min a 4 °C. La pastilla se resuspendió

en 500 mL de agua fría (0 °C) y las células se centrifugaron de nuevo y se resuspendieon en 250

mL de agua fría. Las células se centrifugaron y se resuspendieronen 20 mL de sorbitol 1M,

repitiendo este paso y manteniendo las células en hielo para ser usadas en fresco.

Las cepas de P. pastoris X-33 crecieron a 30 °C en un medio YPG [extracto de levadura al 1%

(w/v), peptona al 2% (w/v) y glicerol 2% (v/v)], medio YPDS [ extracto de levadura al 1% (w/v),

peptona al 2% (w/v), Glc 2% (w/v) y sorbitol 1 M] o en un medio de fermentación [glicerol 4% (v/v),

(NH4)2SO4 2.2% (w/v), K2HPO4 1.82% (w/v), MgSO4.7H2O 0.75% (w/v) y CaCl2.2H2O 0.05% (w/v),

suplementado con vitaminas y elementos trazas recomendados por Cregg et al., 1987]. Las cepas

de P. pastoris X-33 se transformaron por electroporación con 5 µg del vector pGAPZαC-AtFt

linearizado con Avr II. Las transformantes se seleccionaron en placas YPDS suplementadas con

Zeo (100 µg/mL) y se incubaron 4 días a 30 °C.

Se realizaron fermentaciones con P. pastoris expresando el gen atft o cepas transformadas con el

vector pGAPZαC vacío (control negativo) usando tanques de fermentación de 2.5 L (B.E.

Marubishi, Tokio, Japón) acoplado a una computadora para la adquisición de datos y supervisión

de las condiciones de fermentación, a través de un programa denominado FERMACS. Las

condiciones de operación durante la fermentación fue una temperatura de 30 °C y pH 6.0, una

velocidad constante de aereación a un flujo de 4 L/min y agitación de 500 rpm. El final de la fase

de fermentación después de la depleción del glicerol fue juzgado en base a un incremento en el

pH y pO2. Posteriormente, el cultivo fue adicionado con glicerol al 50% (v/v) y elementos traza, con

un incremento gradual del flujo entre 29.5 y 811.2 mL/min respecto al volumen inicial. Después de

una fermentación por 72 h, las celulas se colectaron por centrifugación y se ensayó la actividad

enzimática en la biomasa y en el sobrenadante del cultivo.

108

VIII. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

1. COMPARACIÓN Y CARACTERIZACIÓN ESTRUCTURAL DE CARBOHIDRATOS DE

ALMACÉN EN AGAVES Y DASYLIRION

1.1. PATRÓN DE CARBOHIDRATOS NO ESTRUCTURALES

La cantidad de carbohidratos que es almacenada en los tallos de agave es la característica más

importante considerada por los productores de estos cultivos; pues al ser la piña la parte industrial

utilizada en la elaboración de bebidas alcohólicas, una mayor acumulación de azúcares en este

órgano significa mayores ganacias económicas. En la Figura 31 se muestra el contenido de

carbohidratos no estructurales solubles en las especies de agave y dasylirion estudiadas. La

mayoría de estas especies presentó un intervalo de concentración de carbohidratos totales entre

360 y 640 mg/g. Dichos valores indican que estas especies acumulan mayor cantidad de

carbohidratos en su órgano de almacén comparada con otros cultivos como dalia (350 mg/g en

tubérculos) determinado en este mismo estudio, o con lo reportado para achicoria (240 mg/g, Van

Waes et al., 1998) o pastos como Lolium perenne (hasta 370 mg/g, Turner et al., 2006). De las

especies analizadas, destaca la alta concentración de carbohidratos en A. tequilana proveniente

de la región de Jalisco (At-J, 891.27 mg/g). Este resultado coincide con lo reportado por Nobel et

al. (1998), quienes establecen que esta especie acumula en su tallo hasta el 80% de los

carbohidratos no estructurales, una cantidad 2 a 3 veces mayor en comparación con otras

especies como A. deserti. Probablemente dicha característica influyó desde el siglo XIX, para la

dominancia de esta especie en la elaboración del vino de mezcal (tequila) sobre otras especies, e

incluso sobre otras variedades como criollo, pata de mula, moraleño, chato, mano larga y bermejo.

La Figura 31 muestra una gran diferencia en la distribución de carbohidratos solubles entre las

especies de Agave y Dasylirion. En dasylirion (Dsp-C), la Fru fue el carbohidrato más abundante

(38.43%), seguido de Glc (27.36%); mientras que los fructanos y la Suc representan el 17.98 y

16.21%, respectivamente. En contraste, los fructanos constituyen el principal carbohidrato no

estructural en agaves, con valores superiores al 60%. El mayor porcentaje de fructanos fue

observado en A. angustifolia proveniente de Oaxaca (Aa-O) con un 85.81% (516.94 mg/g),

correspondiéndole a A. fourcroydes de Yucatán (Af-Y) el porcentaje más bajo de 64.22% (482.47

mg/g). Esta característica en Af-Y refleja el uso dado para esta especie, la cual es cultivada

109

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000m

g/g

DM

Carbohidratos totales Fructanos Sacarosa Fructosa Glucosa

At-J At-G Aa-S Aa-O Ac-O Ap-O Af-Y Dsp-C Dv

Especies de Agave y Dasylirion Figura 31. Contenido de carbohidratos no estructurales solubles. El valor presentado es el promedio de tres determinaciones independientes. La concentración esta dada en base seca (DM). Abreviaturas según se indica en la Tabla 12.

principalmente para la obtención de fibras y solo más recientemente, en la elaboración de bebidas

alcohólicas (henequén), que es el principal uso del resto de las especies analizadas. De igual

manera, una baja concentración de fructanos concomitante con una mayor cantidad de fibra fue

observada en dasylirion, una planta que es utilizada tanto para la obtención de fibra como para la

elaboración de la bebida alcohólica (sotol). Aun así, estos valores representan altas

concentraciones de fructanos comparados por ejemplo, con trigo con una concentración promedio

de 60 mg/g (Kerepesi y Galiba, 2000).

1.2. FACTORES ONTOGÉNICOS

La menor cantidad de fructanos encontrados en dasylirion (96.02 mg/g) puede ser explicada como

una diferencia de géneros; sin embargo, también se debe considerar la presencia del órgano floral

en esta planta, ya que la concentración de estos carbohidratos es afectada por aspectos

ontogénicos (Marx et al., 1997; Itaya et al., 2002). La depolimerización y movilización de fructanos,

110

así como la exportación de Suc, han sido reportadas durante actividades fisiológicas que

demandan energía a la planta, para los procesos de regeneración foliar en pastos (Amiard et al.,

2003), durante el llenado de granos en cereales (Yang et al., 2004), procesos de brote en

Asteraceae (Machado de Carvalho y Dietrich, 1993) y durante el desarrollo floral del lirio de la

mañana (Alliaceae, Hemerocallis, Bieleski, 1993), Phippsia algida (Gramineae) (Solhaug y Aares,

1994) y Campanula rapunculoides (Campanulaceae, Vergauwen et al., 2000). La emergencia de la

inflorescencia en dasylirion pudo haber causado un decremento en la concentración de fructanos

debido a la depolimerización de la molécula, para suministrar la energía requerida en la floración.

La alta concentración de Suc y monosacáridos presentes en esta especie, puede contribuir a

mantener el potencial osmótico y la presión de turgencia al nivel requerido para los eventos de

crecimiento y expansión celular.

1.3. INFLUENCIA DEL AMBIENTE EN EL PATRÓN DE CARBOHIDRATOS NO

ESTRUCTURALES

Una alta acumulación de fructanos y la presencia de carbohidratos relacionados con su

metabolismo (Suc, Fru, Glc) en los tallos de agave, confirma que es en este órgano donde se

presenta el metabolismo activo para este tipo de carbohidratos. Sin embargo, la principal

diferencia entre los agaves fue la distribución de los carbohidratos restantes.

Las plantas provenientes de la región de Oaxaca presentaron el mismo comportamiento: una baja

concentración de Suc y una aún menor, de Glc; curiosamente, estas especies también

presentaron una alta concentración de Fru. Una relación de alta Fru y una casi imperceptible

cantidad de Glc, refleja un estado fisiológico de hidrólisis activa de fructanos en el tallo por parte

de la FEH. La probable actividad de FEH se correlaciona con una baja concentración de Suc, que

de otra manera estuviese inhibiendo su actividad enzimática. Para una probable actividad de FEH

debe esperarse un bajo DP de los fructanos y un decremento en el potencial osmótico,

condiciones probablemente requeridas para el buen desarrollo de los agaves bajo las

características climáticas que prevalecen en esta región.

Af-Y y At-J, por su parte, también presentaron una concentración considerable de Fru (Af-Y,

presentó la más alta concentración de Fru, 130.45 mg/g); sin embargo, a diferencia de las

especies de Oaxaca, también se observó una cantidad significativa de Glc, casi en una relación de

3 a 1. Esto indica una respuesta fisiológica diferente por parte de estas especies; sugiriendo la

111

presencia de una FEH activa en acción concertada con una Inv, que además de generar

cantidades equimolares de Glc y Fru a partir de la hidrólisis de Suc, puede inducir una mayor

actividad de la FEH al evitar la inhibición de esta enzima por la Suc. Alternativamente, una mayor

cantidad de Glc, también puede ser indicativa de un proceso de inhibición de la reincorporación de

este carbohidrato al metabolismo primario de la célula. Por otra parte, el indicio de una actividad

FEH no necesariamente sugiere un proceso de degradación, ya que en algunas

monocotiledóneas, como el trigo, se ha observado la co-ocurrencia de actividades 1-SST y FEH,

sugiriendo que esta última enzima puede participar en la determinación estructural de los fructanos

(Van den Ende et al., 2003b).

Respecto a A. angustifolia, aunque taxonómicamente clasificadas como tal, las plantas

provenientes de Oaxaca y Sonora presentaron un patrón de carbohidratos muy distinto (Figura

31), influenciado seguramente por las condiciones ambientales, pues incluso, estas plantas

presentaron características morfológicas disímiles. Equiza et al. (2001), en un estudio realizado en

variedades de trigo con diferente tolerancia al frío, mostraron diferencias morfológicas atribuidas

principalmente a un proceso de economía de agua, más que a la intensidad de luz o al mismo

estrés térmico.

Por otra parte, de acuerdo a lo establecido por la Secretaría de Patrimonio y Fomento Industrial

(1997), por sus características geográficas adecuadas para el cultivo de A. tequilana var. azul,

Jalisco y Guanajuato se encuentran dentro de la zona de denominación de origen para la

elaboración de tequila. Sin embargo, aunque A. tequilana proveniente de Jalisco y Guanajuato

pertenecen a esta variedad y por su forma de propagación (rizomas), son considerados

genotípicamente iguales (Gil-Vega et al., 2001), el contenido de carbohidratos difirió

significativamente (900 vs 550 mg/g), sugiriendo que las condiciones geoclimáticas propias de

cada lugar, pueden influir en el patrón de carbohidratos, así como se ha reportado una variación

en el contenido de azúcares en otras especies que acumulan fructanos en función de las

condiciones abióticas (Sims, 2003; Gebbing, 2003).

En este sentido, para A. tequilana crecida en distintas zonas de Jalisco, se han establecido

regiones óptimas y marginales para su cultivo (Ruíz-Corral et al., 2002). Dependiendo de las

condiciones de la región, esta planta presenta un comportamiento diferencial en su desarrollo y

contenido de carbohidratos: su ciclo en la región centro (Tequila-Amatitán) es de hasta 6 años, en

tanto que en los Altos, el ciclo toma de 8 a 10 años pero con mejores parámetros de calidad como

112

alto contenido de azúcares, bajo porcentaje de fibra y mayor dimensión de la planta con un peso

promedio de 60 kg para las piñas vs 40 kg en aquellas de la región centro (Valenzuela, 1997). Un

estudio en la determinación del EPI (sección 1.5, pag. 24) mostró que las frescas temperaturas

nocturnas (7 a 18 °C) que se presenta en los Altos, es la condición más determinante para una

mayor fijación de CO2 en esta especie (Ruíz-Corral et al., 2002). Desde el punto de vista

bioquímico, se ha mostrado que temperaturas nocturnas frescas favorecen la actividad de la

PEPC en plantas CAM, y aunado a una disminución de la transpiración, hay una mayor

asimilación de carbono (Pimienta-Barrios et al., 2001). En la Tabla 12 se muestra que la zona de

Los Altos, Jal. presenta un tipo de clima subtropical templado (temperatura media anual entre 5 y

18 °C), en tanto que Pénjamo, Gto. es considerado como semicálido subhúmedo (temperatura

media anual entre 18 y 22 °C). Siendo la temperatura entre estas dos zonas la característica más

contrastante, puede ser este factor el más influyente en el diferente contenido de carbohidratos

observado entre ambas plantas.

Finalmente, debe considerarse que esta discrepancia tan notoria puede deberse también, a las

distintas épocas en que estas plantas fueron colectadas: At-J en marzo y At-G en diciembre del

2002. En A. tequilana se ha observado una tasa máxima de fijación de CO2 durante la primavera

(∼23 µmol m-2 s-1), cuando existe un mayor flujo fotosintético de fotones (∼1337 µmol m-2 s-1) y

una menor humedad en el suelo (∼12%); mientras que a finales de otoño y principios de invierno,

cuando la humedad del suelo aumenta (∼24%) y el flujo fotosintético de fotones disminuye (∼583

µmol m-2 s-1), la fijación de CO2 reportada decrece a la mitad (∼12 µmol m-2 s-1). Considerando

que la cantidad de luz interceptada es un factor condicionante en la eficiencia de conversión de

energía luminosa a materia seca y su distribución a los órganos y sus constituyentes, en achicoria

y alcachofa Jerusalem se ha mostrado que este parámetro es determinante en el rendimiento de

inulina (Meijer et al., 1993). La temperatura ambiental también presenta un efecto dominante en la

acumulación de estos carbohidratos, pues las bajas temperaturas en Asteraceae favorecen las

actividades enzimáticas de FEH y 1-FFT (Monti et al., 2005). Por lo tanto, la época en que se

cosechan los cultivos que acumulan fructanos, definitivamente debe ser factor determinante en el

DP y contenido de carbohidratos.

113

1.4. FUNCIÓN DE LOS FRUCTANOS EN LA SEQUÍA

A pesar de que no hay un mecanismo completamente entendido, las evidencias indican un papel

protector de los fructanos a plantas sometidas a estrés hídrico (Pilon-Smit et al., 1995; De Roover

et al., 2000; Vereyken et al., 2003a); y aunque se han reportado diferentes respuestas, todas ellas

implican un ajuste en la concentración o DP de los fructanos (Amiard et al., 2003b). En el caso de

las especies analizadas en este trabajo, Aa-S y Dsp-C, que fueron las plantas colectadas en

regiones donde la limitación del agua es una característica ambiental, presentaron un patrón de

carbohidratos cuyo comportamiento puede explicarse como un mecanismo de adaptación a

condiciones de sequía.

Aa-S y Dsp-C presentaron cantidades significativas de Suc (87.48 y 86.60 mg/g, respectivamente;

Figura 31). Aunque sólo fue menor que en Af-Y (95.07 mg/g), en Aa-S, después de los fructanos,

la Suc representa el carbohidrato más abundante. La acumulación de Suc en variedades de trigo

se ha correlacionado con una mayor tolerancia a la sequía (Kerepesi y Galiba, 2000). De acuerdo

a la Tabla 12, Aa-S y Dsp-C son las especies que crecen en mayores condiciones de sequía, con

un promedio de precipitación pluvial inferior a 400 mm. Aunque no elucidado claramente el efecto

fisiológico, es evidente que la sequía, es una condición ambiental que induce cambios en la

partición del carbono fotosintético, y favorece la acumulación de Suc, probablemente a través de la

activación de la sacarosa-fosfato-sintasa (E.C. 2.4.1.14, Amiard et al., 2003b).

Dentro de los distintos efectos que provoca la sequía, puede mencionarse la respuesta observada

en achicoria y otras dicotiledóneas, donde hay una activación de FT y acumulación de fructanos

(De Roover et al., 2000). Mientras, la acumulación de cantidades significativas de Glc y Fru

observada en dasylirion, indica que esta especie más bien sigue el comportamiento reportado en

otras monocotiledóneas como Festuca arundinacea, Lolium perenne y Triticum aestivum, donde

se evidencia una acumulación de hexosas provenientes de la hidrólisis de fructanos (Spollen y

Nelson, 1994; Karsten y MacAdam, 2001). Esta acumulación, como respuesta a sequía, provoca

un decremento en el potencial osmótico de la planta y sostiene el estatus hídrico a un valor que

permite mantener el metabolismo en un nivel basal (Karsten y MacAdam, 2001).

Adicionalmente, en Aa-S y Dsp-C se presentó una relación cercana a 1 de Fru:Glc. Esto sugiere la

presencia de una invertasa. Sin embargo, debe ser improbable su naturaleza vacuolar, pues como

se ha señalado, una disminución en la concentración vacuolar de Suc conlleva a una regulación

positiva de la FEH, cuya actividad en estas especies no es evidente a partir de los resultados

114

mostrados en la Figura 31. Por lo tanto, se sugiere la intervención de una invertasa probablemente

apoplástica, cuya participación en la hidrólisis de fructo-oligosacáridos (FOS) y Suc como medio

de protección celular localizada (disminución del punto de congelación local o interacción con la

membrana plasmática), ha sido propuesta en avena (Livingston y Henson, 1998) y en Agave

deserti (Wang y Nobel, 1998). En el primer caso, la posible participación de la invertasa

apoplástica fue evidente cuando la planta de avena fue sometida a temperaturas congelantes,

condiciones que implican una disposición limitada de agua; mientras que A. deserti es una planta

ampliamente dispersa en el desierto sonorense, con una precipitación pluvial promedio de 200

mm. Con lo anterior podemos concluir, que una alta concentración de Suc y cantidades

equimolares de Fru y Glc en Aa-S y Dsp-C, son condiciones de adaptación de estas especies a la

sequía extrema presente en las regiones donde fueron colectadas.

1.5. PRESENCIA DE ALMIDÓN

Los fructanos son una alternativa diferente al almidón donde no se involucra la formación de

ésteres de fosfato durante su síntesis; sin embargo, esta alternativa no es absoluta, pues las

plantas que almacenan fructanos también sintetizan almidón (Orthen, 2001). La Figura 32 muestra

que los tallos de agave y dasylirion almacenan almidón en un intervalo de 0.75% para Ap-O hasta

el 2.71% para Af-Y. La carencia de este carbohidrato en agaves ha sido reportado en A. vera cruz

(Srinivasan y Bathia, 1953) y A. deserti (Wang y Nobel, 1998), situación similar para otros

miembros Asparagales como Asparagus officinalis, donde se reportó la ausencia de almidón

(Pollock, 1986) o su presencia en concentraciones inferiores al 2% como en Allium vineale

(0.021%), A.ursinum (0.032%) (Hendry, 1987) y Phormium spp. (2%) (Sims et al., 2001). Este

intervalo es inferior al 11% encontrado en tubérculos de dalia en este trabajo y a lo reportado en

otras monocotiledóneas, con un rango de 4.0% en Hordeum vulgare y hasta un 25.3% en Poa ×

jemtlandica (Cairns et al., 2002a).

La presencia de almidón en especies que sintetizan fructanos, indica que la capacidad genética de

acumular este carbohidrato no es expresada en alto grado como en otras especies. Y aunque no

hay análisis de los mecanismos que limitan su acumulación principalmente en tejidos vegetales,

Cairns et al. (2002b) descartan alguna causa por fotoasimilación, inhibición por acumulación de

Suc o fosfato o la implicación de un ritmo circadiano.

115

Figura 32. Presencia de almidón en especies de Agave y Dasylirion. Para fines de comparación también se determinó almidón en tubérculos de Dahlia variabilis (Dv).

En el presente trabajo no se determinó la presencia de almidón en las pencas; sin embargo, la co-

ocurrencia de almidón y fructanos en órganos foliares ha sido reportada en especies sintetizadoras

de fructanos (Orthen, 2001; Cairns et al., 2002). Contrario a esto, en A. deserti, prácticamente no

se detectó almidón en los tejidos vasculares de sus hojas maduras, sino que, además de Suc,

fueron detectados 1-Kes, 6G-Kes, Nys y un DP5 (Wang y Nobel, 1998). La presencia de estos

FOS en el floema, sugiere que solo una pequeña fracción de Suc generada en la fotosíntesis es

acumulada transitoriamente en forma de almidón, mientras que otra parte importante debe ser

transportada en los tejidos vasculares, donde es sustrato para la síntesis de FOS, a partir de

actividades FT detectadas en el floema de A. deserti (Wang y Nobel, 1998).

Al momento, no hay estudios fisiológicos enfocados a la interacción metabólica de almidón y

fructanos en órganos de almacén. En papas transgénicas que sintetizan levanos a partir de la

introducción del gen sacB que codifica para la levansucrasa de Bacillus subtilis, se observó la

acumulación de fructanos en el amiloplasto. Sin embargo la presencia de este enzima heteróloga

provocó cambios en la partición de carbono, los gránulos de almidón mostraron alteraciones

116

morfológicas y físicas y el rendimiento de los tubérculos fue inferior a las silvestres (Gerrits, 2000).

Por otra parte, análisis histológicos en alcachofa Jerusalem y cebolla, han mostrado la presencia

de almidón durante la fase de desarrollo del tubérculo y del bulbo, respectivamente, pero este

carbohidrato desaparece durante la dormancia; por lo que Orthen (2001 y 2004) sugiere que cada

uno de estos carbohidratos cumple funciones fisiológicas distints de acuerdo al estado fenológico

de la planta.

La acumulación de fructanos sugiere una ventaja evolutiva sobre el almidón, considerando: i) su

naturaleza química (Fru-f vs Glc-p), con una conformación piranosa de mayor flexibilidad; ii) su

localización vacuolar (vs plastídica), donde la gran capacidad de almacén de este organelo evita la

inhibición de la fotosíntesis por acumulación de Suc citoplásmica; iii) su solubilidad (soluble vs

cristalino precipitado), que afecta significativamente las relaciones hídricas y propiedades

coloidales de las células y iv) sus enzimas metabólicas, que son menos sensibles a bajas

temperaturas e inducibles a estrés abiótico (Vijn y Smeekens, 1999; Van Laere y Van den Ende,

2002). En agaves, la mayor concentración de fructanos sobre almidón puede presentar ventajas

fisiológicas en ambientes áridos o donde se requieran cambios rápidos en la distribución de

carbono, como cuando hay una repentina disposición de agua en las regiones desérticas.

1.6. PERFIL CROMATOGRÁFICO DE FRUCTANOS

1.6.1. CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA (TLC)

La técnica de TLC fue de las primeras usadas en la caracterización de fructanos y está aún en

uso, pues aunque con menor resolución, da información cualitativa semejante a sistemas

cromatográficos de alta resolución, además de ofrecer la ventaja de ser un método sencillo, barato

y rápido. En una primera aproximación, los fructanos de agave y dasylirion fueron separados en

fructanos de alto y bajo DP por precipitación con etanol absoluto. Los FOS (DP < 8) fueron

visualizados en un sistema de TLC de base de sílice (Figura 33). En general, la fracción de bajo

DP está pobremente representada en las especies analizadas; por lo que, la principal fracción de

fructanos debe corresponder a moléculas con un mayor DP. La identidad de los compuestos

además, fue corroborada con estándares, a excepción de una señal que se observó entre la Suc

y 1-Kes. De acuerdo a sistemas de TLC similares, se tiene bien establecido que la serie de los

neofructanos (con Glc interna) presentan valores de Rf mayor a la serie de inulina con el mismo

117

Figura 33. Cromatografía en capa fina de fructanos de Agave y Dasylirion. La cromatografía fue desarrollada tres veces en un sistema de solventes de butanol:propanol:agua (3:12:4, v/v/v). St, estándares: M, fracción de monosacáridos (fructosa y glucosa); O, punto de origen.

DP (Cairns et al., 1999), por lo que esta señal en nuestro sistema, debe corresponder a la 6G-Kes,

molécula que caracteriza a los miembros de las Asparagales. Y al igual que lo reportado para

algunos miembros de este orden, como espárrago y cebolla, no fue evidente la presencia de 6-

Kes, molécula que en este sistema migra con un Rf inferior a la 1-Kes.

Las señales correspondientes a DP4 y DP5 fueron también visualizadas, aunque con una menor

intensidad y, mediante la fase móvil aquí utilizada, fue difícil establecer si éstos pertenecen a la

serie inulina, a la neoserie o representan una mezcla de ambos. At-J presentó el patrón más

disímil; esta especie contiene casi exclusivamente monosacáridos (Glc y Fru) y solo se observó

una señal muy tenue correspondiente a la 6G-Kes. Los FOS estuvieron prácticamente ausentes,

indicando que la mayor parte de sus fructanos corresponden a moléculas de mayor DP. En las

especies de agave de la región de Oaxaca (Aa-O, Ac-O y Ap-O), además de Af-Y, se observó una

baja cantidad 1-Kes. Esta molécula fue más evidente en Aa-S y más abundante en At-G y Dsp-C.

A partir de la Figura 33 es posible concluir que los agaves y dasylirion acumulan en sus tallos al

menos dos tipos de fructanos: la serie inulina, característica de algunas Asteraceae, como

118

achicoria, alcachofa Jerusalem y dalia, y una segunda serie de neofructanos reportada en

Asparagales como cebolla, ajo y espárrago.

1.6.2. CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (INTERCAMBIO ANIÓNICO

ACOPLADO A DETECTOR DE PULSO AMPEROMÉTRICO (HPAEC-PAD)

La cromatografía de alta resolución HPAEC es actualmente el método preferido para la

visualización de la distribución de fructanos presentes en una planta, ya que esta herramienta no

solo permite la separación de las diferentes series de fructanos (inulinas, levanos y neofructanos),

sino que además, es posible distinguir FOS isómeros, como las kestotriosas (1-Kes, 6-Kes y 6G-

Kes) (Shiomi et al., 1991; Bancal et al., 1993; Pavis et al., 2001a). En la Figura 34 se muestra el

perfil cromatográfico de los fructanos extraídos de A. tequilana, A. potatorum y A. angustifolia y se

compara con los fructanos bien determinados en achicoria y cebolla. La Tabla 15 enlista los

compuestos identificados en estas especies.

La achicoria, de la familia Compositae, acumula en sus raíces fructanos de la serie inulina (Ix,

donde x indica el DP), y aunque hay evidencias de la presencia de residuos ramificados en esta

especie (Carpita et al., 1991; Wack y Blaschek, 2006), su contribución no es significativa y en la

Figura 34 solo se observa una serie de fructanos lineales con unidades fructo-furanosil β(2-1) con

un incremento progresivo en su DP. Por otra parte, el perfil cromatográfico de los fructanos

presentes en cebolla ha sido ampliamente identificado (Ernst et al., 1998; Ritsema et al., 2003).

Éste es caracterizado por la presencia de la serie inulina, además de la presencia dominante de

neofructanos, identificados por la presencia de una unidad interna de Glc (i-α-D-Glcp). La 6G-Kes

es el fructano más abundante de esta serie (DP3); mientras que para los neofructanos superiores

(DP≥4) hay diferentes isómeros, dependiendo de la Fru terminal que acepta una unidad fructo-

furanosil para la elongación de la cadena. En la diferenciación de estos isómeros, Ernst et al.

(1998) propusieron nombrar como Nx cuando la molécula es elongada por ambos extremos o

como Nx cuando la elongación sucede solo del lado de la Glc.

De acuerdo al tiempo de retención mostrado en los picos eluidos de las distintas especies de

agave (Figura 34), se evidencia en estas plantas la presencia de la serie inulina tal como en

achicoria; además como sucede en cebolla, también se encuentra presente neofructanos

elongados en ambos extremos de la cadena (tipo Nx y Nx). Adicionalmente, en los agaves se

identificaron la elución de picos con una menor abundancia a los demás y que no concuerdan con

119

Figura 34. Perfil cromatográfico (HPAEC-PAD) de fructanos de agave comparados con fructanos de achicoria (tipo inulina) y cebolla (neofructanos). La identificación de los compuestos eluídos se hizo según se indica en la Tabla 15.

120

algún tiempo de retención de los fructanos correspondientes a las especies utilizadas como

referencia. En agaves, las señales pertenecientes a fructanos con mayor DP se vuelven anchas y

poco resueltas, sugiriendo la presencia de una mezcla de isómeros. Probablemente, estos picos

son debidos a moléculas con enlaces β(2-6) o a unidades ramificadas, tal como se ha reportado

en algunos miembros Asparagales que sintetizan este tipo de carbohidratos (Brasch et al., 1988;

Spies et al., 1992; Sims et al., 2001; Sims, 2003). El perfil de fructanos en las especies de agave

analizadas en la Figura 34, son muy similares entre sí; sin embargo, se observan algunas

diferencias en la abundancia de los picos.

Tabla 15. Identificación de fructanos eluídos en un sistema cromatográfico intercambio aniónico de alta resolución (HPAEC-PAD).

Pico Tipo de fructano Nombre Achicoria

Cebolla Agave spp.

S - sacarosa × × × I3 inulina 1-kestotriosa

(1-Kes) × × ×

N3 neofructano 6G-kestotriosa (6G-Kes/ Neo)

× ×

I4 inulina 1,1-kestotetraosa (nistosa, Nys)

× × ×

N4 neofructano 1y6G-kestotetraosa × × N4 neofructano 1,6G-kestotetraosa × × I5 inulina 1,1,1-kestopentaosa × × × N5 neofructano 1,1y6G-kestopentaosa/

1y1,6G-kestopentaosa × ×

N5 neofructano 1,1,6G-kestopentaosa × × I6 inulina 1,1,1,1-kestohexaosa × × × N6 neofructanos mezcla de neofructanos × × 7 fructanos isómeros de DP 7 × × 8 fructanos isómeros de DP 8 × × 9 fructanos isómeros de DP 9 × × 10 fructanos isómeros de DP 10 × × * fructanos no identificados ×

Los compuestos fueron identificados su comportamiento de elución comparado con estándares o especies ampliamente caracterizadas como achicocria y cebolla. La nomenclatura de los compuestos identificados es de acuerdo a Waterhouse y Chatterton, 1993. La asignación de los picos sigue la propuesta de Ernst et al., 1998, donde Ix, refiere a la serie inulina con x grado de polimerización; Nx y Nx indican respectivamente, si el fructano es elongado sobre ambos extremos de la molécula o sólo del lado de la glucosa, respectivamente. Los asteriscos indican fructanos no identificados en agaves, en base a los tiempos de elución de los compuestos usados como referencia. El símbolo ×, indica la presencia del compuesto en las especies analizadas.

121

1.7. ANÁLISIS DE ENLACES POR DERIVATIZACIÓN DE FRUCTANOS A ALDITOL

ACETATOS PARCIALMENTE METILADOS (PMAA)

Para ensayar la hipótesis de que los fructanos son especie-específicos, la fracción de alto peso

molecular (DP>8) de cada una de las especies, fue derivatizada a compuestos PMAA. Al igual que

lo observado en el perfil cromatográfico de los agaves, de la Figura 35 se puede concluir que las

diferencias de estos productos son más cuantitativas que cualitativas.

El cromatograma de Aa-S se tomó como representativo de estas especies y se comparó con los

PMAA resultantes de la derivatización de fructanos de dalia y cebolla (Figura 36). La identidad de

cada derivado fue determinado de acuerdo a los criterios discutidos en la literatura (Carpita y

Shea, 1990; Bancal et al., 1993), por comparación con estándares y por análisis del patrón de

fragmentación generado por el bombardeo de electrones a estos compuestos. En el Apéndice B

se muestra con detalle un análisis de la fragmentación de cada uno de los compuestos

derivatizados que fueron identificados; mientras que en la Tabla 16 se resume esta información.

i) Dahlia variabilis

Al igual que en otras Asteraceae, la inulina almacenada en raíces de achicoria, se caracteriza por

tener una unidad de Glc en un extremo no reductor, y específicamente en el caso de dalia, esta

molécula además contiene un bajo porcentaje de ramificaciones (Carpita et al., 1991; Wack y

Blaschek, 2006). La Fru en su forma reducida, al igual que otras cetosas, genera los epímeros

glucitol y manitol. Los epímeros derivados de la Fru terminal (β-D-Fruf-t) presente en fructanos,

fueron resueltos en la columna HP5 utilizada, y corresponde a los compuestos 1 y 2 mostrados en

la Figura 36. Estas moléculas fueron muy simétricas y caracterizadas por la presencia de los

dobletes m/z 161 y 162 como fragmentos primarios, y m/z 205 y 206, 145 y 146 y 101 y 102, como

fragmentos minoritarios. Estos patrones de fragmentación idénticos son en ocasiones reconocidos

solo por sutiles diferencias en su intensidad. El compuesto 3 fue asignado a la unidad terminal de

α-D-Glucopiranosa (α-D-Glcp-t); el fragmento base de esta molécula es m/z 102, diferente al

fragmento base m/z 129 característico de los residuos de Fru. Los fragmentos primarios m/z 161 y

162 de intensidades similares, generaron los iones m/z 129 y 102 a partir de la eliminación de

metanol y ácido acético, respectivamente. Una ruptura menos favorecida sucedida entre los

carbonos contiguos metoxilados C2 y C3, generó un fragmento prominente de m/z 118 y un

fragmento diagnóstico para esta molécula de m/z 205.

122

Figura 35. Perfil de elusión, utilizando cromatografía de gases, de fructanos de Agave y Dasylirion derivatizados a alditol acetatos parcialmente metilados. Las abreviaturas son como se indican en la Tabla 12.

123

Figura 36. Comparación de fructanos derivatizados en tres especies vegetales. Agave angustifolia de Oaxaca fue elegida como representativa de las especies aquí estudiadas y sus productos de derivatización fueron comparados con Allium cepa (cebolla) y Dahlia variabilis (dalia). El número de pico corresponde al compuesto identificado según se indica en la Tabla 16.

124

La principal contribución de fructanos en dalia y otras Asteraceae corresponde a las unidades de

Fru unidas mediante enlaces β(2-1) (β2-1-D-Fruf), representada en los compuestos 4 y 5 de la

Figura 36. Éstos corresponden a los epímeros glucitol y manitol, y sus espectros son

caracterizados por m/z 190 y 161 como fragmentos primarios, resultado de la ruptura entre los

carbonos metoxilados contiguos C3 y C4. Una cantidad de 1,6-di-β-D-fructofuranosa (1,6-di-β-D-

Fruf) fue evidenciada con este método e identificada en el compuesto 8. Este derivado es debido a

la presencia de Fru ramificadas, reportado en bajo porcentaje en dalia (Carpita et al., 1991; Wack

y Blaschek, 2006). La presencia de los epímeros glucitol y manitol derivados de este tipo de Fru,

no fueron aquí cromatográficamente resueltos, por lo que el patrón de fragmentación de esta

molécula (Tabla 16) corresponde a una mezcla de ambas configuraciones. Estas unidades fueron

identificadas por la presencia de un doblete característico de m/z 189 y 190.

ii) Allium cepa

El perfil cromatográfico de los PMAA derivados de cebolla (Figura 36) muestra una diferencia

cuantitativa con dalia. La principal contribución de β-D-Fruf-t (compuestos 1 y 2) indica en esta

especie la presencia de fructanos con un DP menor (DP3-10 reportado en cebolla vs DP hasta 48

en dalia, Praznik y Beck, 1985; Fujishima et al., 2005). El patrón de fragmentación de un

compuesto adicional observado (compuesto 7), indica la presencia de α-D-glucopiranosa interna

(α-D-Glcp-i). El fragmento base de esta molécula es m/z 102 con un fragmento prominente de m/z

118. A diferencia de la α-D-Glcp-t, este derivado presenta un fragmento de m/z 233 debido a un

grupo acetil adicional en el C6. Además, las unidades α-D-Glcp-i y -t pueden ser diferenciadas

una de otra, debido a que la ruptura entre los C3 y C4 producen los fragmentos m/z 162 y 189 y

m/z 161 y 162, respectivamente.

iii) Agave y Dasylirion

Del cromatograma de Aa-S (Figura 36) y de todas las demás especies de Agave y Dasylirion

(Figura 35), es evidente que los fructanos en estas plantas presentan una diversidad estructural. El

compuesto 7 en estos cromatogramas confirma la presencia de neofructanos, además de

unidades de α-D-Glcp-t (compuesto 3), ramificaciones (compuesto 8) y la presencia de β-2-1-D-

Fruf indica una cantidad importante de enlaces β(2-1) (compuestos 5 y 6).

125

Tabla 16. Alditol acetatos parcialmente metilados identificados en fructanos de Agave y Dasylirion spp., Dahlia variabilis y Allium cepa.

Pico Tr a Compuesto derivatizado Tipo de enlace b Patrón de fragmentación c 1

50.21 2,5-Di-O-acetil-(2-deuterio)-1,3,4,6-

tetra-O-metil-D-manitol β-D-Fruf-t 129 (100), 162 (46.6), 161 (30.0), 87 (25.0), 101 (15.8), 102 (15.0), 75 (11.7), 145

(8.3), 72 (8.3), 146 (6.8), 113 (3.3), 120 (2.1) 2


tetra-O-metil-D-glucitol β-D-Fruf-t 129 (100), 162 (38.9), 161 (34.7), 87 (24.5), 101 (15.2), 102 (14.4), 75 (10.1), 72

(10.1), 146 (5.8), 145 (5.08), 113 (3.3), 120 (2.8) 3


tetra-O-metil-glucitol α-D-Glcp-t 102 (100), 129 (62.0), 118 (55.7), 101 (52.4), 145 (40.0), 71, 72 (36.6), 87 (36.0),

76 (31.1), 162 (27.8), 161 (26.2), 59 (26.2), 60 (18), 113 (14.0), 205 (11.4) 4

63.71 2,5,6-Tri-O-acetil-(2-deuterio)-1,3,4-tri-

O-metil-manitol (2→6)-β-D-Fruf 129 (100), 162 (45.2), 87 (35.8), 99 (16.9), 189 (15.0), 71, 72, 102 (13.2), 75

(12.2), 60 (10.3) 5

64.36 1,2,5-Tri-O-acetil-(2-deuterio)-3,4,6-tri-

O-metil-manitol (2→1)-β-D-Fruf 129 (100), 87 (33.8), 161 (25.4), 190 (23.7), 101 (14.4), 100 (13.5), 71, 72 (10.1),

75 (8.47), 145 (6.7), 59. 60, 99, 102, 113 (3.3) 6d

64.74

2,5,6-Tri-O-acetil-(2-deuterio)-1,3,4-tri-O-metil-glucitol + 1,2,5-Tri-O-acetil-(2-

deuterio)-3,4,6-tri-O-metil-glucitol

(2→1)/ (2→6)-β-D-Fruf

129 (100), 87 (30.3), 161 (29.4), 190 (14.1), 162 (11.6), 101 (10.7), 100 (8.9), 71, 72, 75, 118 (7.1), 189 (6.2), 99 (5.3)

7 68.67

1,5,6-Tri-O-acetil-(1-deuterio)-2,3,4-tri-O-metil-glucitol

α-D-Glcp-i 102 (100), 118 (75.8), 99 (56.8), 129 (55.1), 87 (51.7), 101 (27.5), 59 (25.8), 72, 162 (22.4), 71 (22), 60 (14.6), 100, 189 (13.7), 72 (12.0), 145 (6.8), 233 (4.3)

8 82.14

1,2,5,6-Tetra-O-acetil-(2-deuterio)-3,4-di-O-metil-hexitol

1,6-di-β-D-Fruf 129 (100), 87 (42.5), 190 (20.3), 189 (17.5), 100 (16.2), 99 (14.8), 60 (11.1), 71, 72 (7.4)

El número de pico corresponde al orden de elución mostrado en la Figura 34; a Tiempo de retención (min) en la columna HP5; b t, i, unidades terminal e interna, respectivamente; c valores en paréntesis indican la intensidad relativa de los fragmentos; d, en el caso de D. variabilis y A. cepa, este pico corresponde únicamente al 1,2,5-Tri-O-acetil-(2-deuterio)-3,4,6-tri-O-metil-glucitol.

126

Adicionalmente, en el compuesto 4 se identificó un derivado correspondiente a la configuración

manitol del derivado β(2-6)-D-fructofuranosa (β,2-6-D-Fruf), caracterizada por un fragmento m/z

189, indicativo de que el oxígeno 6 debe estar sustituido por un grupo acetilo. Esto evidencia la

presencia de enlaces β(2-6) en las especies de Agave y Dasylirion. La reducción de los

compuestos metilados con borohidruro deuterado, introdujo asimetría en los derivados de β(2-1)- y

β(2-6)-D-Fruf que de otra manera hubiesen producido fragmentos idénticos. De esta forma, los

enlaces β(2-1)-Fruf fueron diferenciados por la presencia de m/z 190 y 161 como fragmentos

mayoritarios, mientras que los enlaces β(2-6)-Fruf generaron fragmentos m/z 189 y 162.

Los epímeros manitol de estos derivados fueron cromatográficamente bien resueltos en los picos 4

y 5 (Figura 36), mientras que esto no fue posible para los epímeros glucitol. Por lo tanto, el pico 6

presente en los cromatogramas de agaves y dasylirion contiene las configuraciones glucitol para

ambos tipos de enlace (Figuras 34 y 35; Tabla 16): 2,5,6-tri-O-acetil-2-deuterio-1,3,4-tri-O-metil-

glucitol para los residuos β(2-1)-D-Fruf y 1,2,5-tri-O-acetil-2-deuterio-3,4,6-tri-O-metil-glucitol para

las unidades β(2-6)-D-Fruf. El patrón de fragmentación para este pico es el resultado de todos los

iones presentes en ambos derivados. Para aspectos de cuantificación, el porcentaje de

contribución de cada derivado en el pico 6, fue calculado como la proporción de m/z 189/190

(resultante de la reducción con NaBD4), tomando en consideración la abundancia natural de 13C

(1.11%) (Carpita y Shea, 1990).

1.7.1. CUANTIFICACIÓN DE LOS GLICOSIL-DERIVADOS

Aunque los fructanos de agave y dasylirion parecen estructuralmente similares, la Figura 37

muestra diferencias significativas en la contribución de cada derivado. Un análisis cuantitativo de

estas discrepancias puede ser útil en la elucidación de posibles estructuras para cada especie. La

contribución de los PMAA se cuantificó como porcentaje de mol (% mol) del total de compuestos

en cada una de las especies, se compararon entre ellos y con las proporciones encontradas para

dalia y cebolla.

Teóricamente, los fructanos contienen, si es el caso, una unidad de Glc por cada molécula; por lo

que de los datos colectados, se confirma lo observado por TLC: las especies de Agave y

Dasylirion almacenan en sus tallos al menos dos tipos de fructanos: aquellos con una unidad α-D-

Glcp-t y una serie que corresponde a los neofructanos.

127

0

20

40

60

80

100m

ol

%

Fru-terminal Glc-terminal Fru (2-6) Fru (2-1) Glc-interna Ramificación

At-J At-G Aa-S Aa-O Ac-O Ap-O Af-Y Dsp-C

Figura 37. Cuantificación de los glicosil-derivados en fructanos de las especies analizadas. Ac, Allium cepa. Las barras representan la desviación estándar de tres repeticiones determinadas independientemente.

Retomando la idea de una unidad de Glc por molécula de fructano, los % mol correspondientes a

α-D-Glcp-i y -t se sumaron y fueron considerados como la unidad. Los valores de % mol de los

demás compuestos fueron comparados con esta unidad (Tabla 17). A partir de estos datos fue

posible deducir comportamientos interesantes (Tablas 17 y 18), que permitieron asociar las

especies en tres grupos: el Grupo I, integrado por At-J, Aa-S, Aa-O y Ap-O; en el Grupo II, se

incluyó a Ac-O, Af-Y y Dsp-C; mientras que un comportamiento totalmente diferente fue observado

en At-G, que conformó el Grupo III.

La serie de neofructanos fue más abundante en los agaves del Grupo I, presentando cuatro

estructuras de neofructanos por cada molécula con α-D- Glcp-t; en el Grupo II esta relación fue de

2:1, mientras que At-G presentó cantidades equimolares de estos fructanos. Una mayor

contribución de enlaces β(2-1) en relación a los β(2-6) fue una constante observada en todas las

especies; siendo la relación de 2, 4 y 3 para los Grupos I, II y III, respectivamente. De manera

interesante, en el Grupo I se presentó una relación cercana a 1 entre los derivados de β(2-6)-Fruf

y las unidades ramificadas; este valor no fue significativamente diferente al 0.8 encontrado para el

resto de las especies, sugiriendo esto la presencia de un enlace β(2-6) en cada punto de

128

Tabla 17. Contribución relativa de compuestos derivatizados en los fructanos. Grupo DP

Estimado t-αααα-D-Glcp

i-αααα-D-Glcp

t-ββββ-D-Fruf

(2-6)-ββββ-D-Fruf

(2-1)-ββββ-D-Fruf

1,6-di-ββββ-D-Fruf

I

At-J 18.12 0.2 0.79 4.7 3.46 5.53 3.42

Aa-S 13.07 0.18 0.82 4.51 1.9 3.92 1.74

Aa-O 31.75 0.21 0.79 10.51 6.01 9.64 4.59

Ap-O 15.34 0.17 0.83 5.19 2.12 4.84 2.19

II

Ac-O 11.17 0.33 0.67 4.27 0.95 3.71 1.24

Af-Y 6.66 0.31 0.69 2.81 0.49 1.82 0.55

Dsp-C 9.09 0.38 0.62 3.21 0.84 3.08 0.96

III

At-G 7.13 0.52 0.48 2.99 0.65 1.75 0.74

Standard

Dv 37.43 1 n.d. 2.44 nd 33.17 0.82

Ac 4.79 0.66 0.34 2.38 nd 1.32 0.09

La sumatoria del % mol correspondiente a α-D-Glcp-i y -t fue considerada como la unidad y como referencia para los demás compuestos derivatizados. nd, no detectado.

Tabla 18. Correlación entre diferentes compuestos derivatizados. Grupo DGlc-i/DGlc-t ββββ(2-1)/ ββββ (2-6) ββββ (2-6)/1,6-di-Fru Fru-t/1,6-di-Fru

I

At-J 3.95 1.60 1.01 1.37

Aa-S 4.56 2.06 1.09 2.59

Aa-O 3.76 1.60 1.31 2.29

Ap-O 4.88 2.28 0.97 2.37

II

Ac-O 2.03 3.91 0.77 3.44

Af-Y 2.23 3.71 0.89 5.11

Dsp-C 1.63 3.67 0.88 3.34

III

At-G 0.92 2.69 0.88 4.04

Los valores fueron calculados relativos a la abundancia de α-D-Glcp-i y -t, que fue considerada como la unidad. nd, no detectado.

129

ramificación. Otro dato importante, fue la relación encontrada entre la Fruf-t y las ramificaciones.

Este valor puede correlacionarse con la longitud de la molécula, así como con la frecuencia de

ramificación; ya que en moléculas con un alto DP o altamente ramificadas, esta proporción toma

un valor cercano a 1. En este contexto, el Grupo I presentó el valor más bajo, con un relación

cercana a 2 para todas las especies incluidas, a excepción de At-J que tuvo un valor de 1,

indicando la presencia de fructanos altamente ramificados. Ac-O y Dsp-C presentaron un relación

de 3, mientras que una estructura menos ramificada puede deducirse para At-G y Af-Y con valores

de 4 y 5, respectivamente. La estimación del DP promedio se realizó a través de la sumatoria de

cada uno de los compuestos derivatizados (Tabla 17).

Los valores obtenidos para dalia y cebolla validaron este método, ya que el DP calculado de esta

manera cayó en el intervalo reportado para estas especies (Praznik y Beck, 1985; Fujishima et al.,

2005). De esta forma, los agaves del Grupo I contienen fructanos de alto DP (de 13 a 32),

mientras que las especies restantes almacenan fructanos con un DP inferior que va desde DP7-

11. En la literatura científica no hay muchos reportes sobre el intervalo de DP en especies de

agaves. En A. deserti se determinó un rango de DP entre 3 y 32 (Satyanarayana, 1976c), y más

recientemente, nuestro grupo de trabajo reportó valores de DP entre 3 y 29 para A. tequilana

(López et al., 2003, ver más adelante). El DP estimado para todas las especies de agave y

dasylirion aquí consideradas, cayeron dentro de estos valores; sin embargo, este intervalo es muy

amplio, y sugiere la presencia de una mezcla heterogénea de fructanos con un comportamiento

polidisperso.

1.7.2. SIGNIFICANCIA DE LA DIVERSIDAD ESTRUCTURAL DE FRUCTANOS

En un análisis realizado por Chatterton y Harrison (2003), se sugiere que la diversidad estructural

encontrada en Agropyron cristatum es importante para la tolerancia de este pasto a las

condiciones de sequía. La diversidad de fructanos encontrada en agaves puede ser determinante

en el desarrollo de estas plantas en ambientes hostiles. Sin embargo, cabe resaltar que a partir de

los datos obtenidos, no se encontró una relación aparente de la estructura de los fructanos con el

medio ambiente donde se desarrollaron las plantas. Por ejemplo, las plantas de A. angustifolia

colectadas en dos zonas diferentes, Sonora y Oaxaca, estuvieron asociadas al mismo grupo

(Grupo I); en tanto que, diferentes especies, A. potatorum y A. cantala, colectadas en la misma

región (Sola de Vega, Oaxaca) fueron clasificadas en distintos Grupos (I y II, respectivamente).

130

Esto puede sugerir, que la concentración y DP de los fructanos puede estar relacionado con

factores ambientales (ver secciones 1.3 y 1.4.), y que la estructura de estas moléculas puede estar

más relacionada a la especie. Sin embargo, esta última aseveración debe hacerse con cuidado, ya

que Dasylirion spp., que pertenece a la familia Nolinaceae que es la taxonómicamente más

alejada, se agrupa junto a A. fourcroydes (Yucatán) y A. cantala (Oaxaca). En tanto, A. tequilana

proveniente de la región de Guanajuato, formó un grupo totalmente separado, a pesar de

pertenecer a la misma especie de A. tequilana proveniente de la zona de los Altos, Jal.

1.8. CARACTERIZACIÓN DE FRUCTANOS EN A. tequilana Weber var. azul (JALISCO)

Para una caracterización estructural más detallada, los fructanos de A. tequilana Weber var. azul

colectada en la región de los Altos, Jal. fueron analizados con métodos espectroscópicos de alta

resolución como la ionización/desorción por láser asistida por una matriz-tiempo de vuelo (MALDI-

TOF-MS) y resonancia magnética nuclear (RMN).

1.8.1. ESPECTROMETRÍA DE MASAS POR IONIZACIÓN/DESORCIÓN POR LÁSER ASISTIDA

POR UNA MATRIZ-TIEMPO DE VUELO (MALDI-TOF-MS)

En la Figura 38 se muestra el espectro de masas para At-J obtenido mediante la técnica de

MALDI-TOF-MS. Este espectro permite confirmar con una mayor resolución y precisión, la

presencia de una mezcla polidispersa de fructanos en agaves. El rango de masas observado es

de m/z 527 a 4739 Da; valores que indican para esta especie, fructanos con un DP de 3 a 29

formando aductos con el Na (G-Fn+ + Na+).

1.8.2. RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR DE 13C

La Figura 39 muestra el espectro de 13C-RMN de los fructanos de At-J. El desplazamiento químico

de la señal de sus carbonos, fue determinado por comparación con espectros de estándares como

Suc, 1-Kes, Nys, 1-fructosil-nistosa (DP5) (Megazyme), dalia (Sigma) y con aquellos valores

reportados en la literatura para fructanos en otros cultivos (Brasch et al., 1998; Liu et al., 1991;

Bonnet et al., 1997; y otros).

La Tabla 19 muestra los desplazamientos de las señales correspondientes, cuando las muestras

fueron sometidas a un campo magnético. En el Apéndice C, además se muestra los valores

reportados en la literatura y que fueron de gran utilidad para la interpretación de los espectros.

131

Figura 38. Espectro de masas MALDI-TOF-MS de fructanos de A. tequilana. El espectro fue registrado en la forma de ión positivo (H+); el ácido 2,5-dihidroxibenzoico fue la matriz utilizada. La especie analizada provino de la región de los Altos, Jal.

Figura 39. Espectro de 13C-RMN de fructanos de A. tequilana. Los desplazamientos químicos en el espectro de At-J fueron asignados por comparación con compuestos estándares Los números sobre la señal indican el número de carbono correspondiente a la fructosa y aquellos con una G como subíndice, indica los correspondientes a la glucosa.

132

La región ∼ 104.0 a 106.0 ppm corresponde a la señal del carbono anomérico de los residuos β-D-

Fruf. Esta región muestra una, dos y tres señales para Suc, 1-Kes y Nys con una, dos y tres

unidades de Fru, respectivamente. El DP5 (fructosil-nistosa) también muestra tres señales en esta

región, pero con un ligero ensanchamiento en una de ellas, indicando que el residuo adicional de

Fru tiene un desplazamiento equivalente a otra unidad fructo-furanosil. El espectro de dalia, con

una sola señal en esta región, indica un solo tipo de Fru predominante (β-D-Fruf 2-1), que vuelve

simétrica la señal. En el espectro de At-J, las cuatro señales observadas en la región anomérica (δ

104.87, 104.68, 104.54 y 104.06 ppm), indican la presencia de al menos cuatro diferentes

unidades β-D-Fruf. La señal δ 104.54 ppm fue asignada a la β-D-Fruf-t, pues este valor es

semejante al 104.53 ppm presente en la Suc y cae en el rango de 104.3 a 104.9 ppm reportado

para este tipo de unidad. El valor δ 104.06 ppm fue asignado a la D-Fruf-i β(2-1), ya que se sabe

que el enlace del C1 de hexafuranosas desplaza la señal “campo abajo” de su carbono adyacente

(Tabla 19 y Apéndice C); pues a diferencia de la conformación de silla de la forma piranosa, el

anillo furanosa es más susceptible a cambios conformacionales. Esta señal es la más intensa en

la región anomérica de At-J e indica la predominancia del enlace β(2-1) en fructanos de esta

especie. Una resonancia a una mayor frecuencia (“campo abajo”) es reportada en el C2 de D-Fruf-

i β(2-6) y de 1,6-di-β-D-Fruf (Brasch et al., 1988; Spies et al., 1992; Sims et al., 2001), por lo que

los valores de δ 104.87 y 104.68 ppm en At-J, pueden deberse a la presencia de enlaces β(2-6) y

fructosas ramificadas, respectivamente. En el espectro de At-J no se observa resonancia en la

región de δ 103.20-104.4 ppm característico de α-D-Glcp-i (Liu et al., 1991; Shiomi, 1993); sin

embargo, para esta unidad también se ha reportado una resonancia de 104.5 ppm (De Bruyn y

Van Loo, 1991), por lo que es posible que la señal δ 104.54 ppm sea debida a ambas unidades de

β-D-Fruf-t y α-D-Glcp-i. Una resonancia a ∼ δ 98.9 ppm es característica de una β-D-Fruf

reductora (De Bruyn y Van Loo, 1991), por lo que la ausencia de señal en esta zona confirma la

naturaleza no reductora de los fructanos. Una señal ∼ δ 93.1 ppm presente en los estándares, es

debido al C1 anomérico de la Glc y cae dentro del rango reportado (δ 91.5 -94.0 ppm). En la Suc

esta señal tiene una intensidad semejante a la del C2 de la Fru, y ésta va disminuyendo conforme

aumentan las unidades de Fru (Suc > 1-Kes > Nys > DP5), hasta no ser detectado en el espectro

de dalia. En At-J, esta señal no fue evidente; sin embargo, las señales debidas a los C2 y C5 de la

Glc si fueron detectadas (δ 71.96 y 73.25 ppm, respectivamente).

133

Tabla 19. Desplazamientos químicos de 13C-RMN. Carbono A. tequilana Sacarosa 1-Kestotriosa Nistosa DP5 inulina D.variabilis

F1 61.67-i, (2-1) 62.16 60.99-t 61.46-t 60.27 61.71

61.24-glc - 61.48-i 61.64-i 59.97 n.d.

60.77-i, (2-6) o-r - - 61.46-i 59.67 n.d.

62.27-i, (2-6) - - - 59.67 n.d.

F2 104.87-i, 2-6 104.53 104.36 104.30-t 103.00 104.10

104.68-r - 103.86 103.84-i 102.51 n.d.

104.54-t o -glc - - 103.66-i 102.34 n.d.

104.06-i, 2-1 - - - 102.34 n.d.

F3 77.54-t,-i, 2-1 77.19 77.24 78.10 76.8 77.80

77.32-i, 2-6 - 77.24 77.38 76.00 n.d.

77.32 - 77.38 76.62 n.d.

F4 75.98i, 2-6 74.82 75.05 75.05 73.72 75.11

75.46 - 74.43 74.92 73.57 n.d.

75.17 - - 74.47 73.12 n.d.

74.60-glc - - - 73.12 n.d.

F5 81.95-glc 82.23 81.82 81.84 80.54 81.92

81.12-glc - 81.74 81.70 80.38 n.d.

n.d. - - 81.70 80.38 n.d.

F6 64.11 63.23 62.95 62.86 61.56 62.98

63.37 - 62.8 62.86 61.56 n.d.

63.10 - - 62.86 61.56 n.d.

G1 n.d. 93.03 93.11 93.13 91.80 n.d.

G2 71.96 71.92 71.76 71.80 70.48 n.d.

G3 n.d. 73.42 73.19 73.20 71.87 n.d.

G4 n.d 70.05 69.81 69.82 68.50 n.d.

G5 73.25 73.25 73.04 73.06 71.74 n.d.

G6 n.d. 60.94 60.69 60.71 59.38 n.d.

El valor de los desplazamientos es en ppm; Fx indica el número de carbono en la fructosa; Gx el correspondiente a la glucosa; donde hay mayor certidumbre se indica los posibles asignamientos químicos de la señal basados en los estándares o en referencias: -t, residuo terminal; -i, (2-1), residuo interno con enlace β(2-1); -i, (2-6), residuo interno con enlace β(2-1); -r, residuo ramificado; -glc, glucosa interna. n.d., no detectado.

134

Todas las señales correspondientes a la Glc se observan en el espectro de la asparagosina

(DP∼14), fructano caracterizado en Asparagus officinalis (Shiomi, 1993), y en los FOS de

Cordyline australis (DP∼ 16) (Brasch et al., 1988) y Pucinella peisonis (DP∼ 10) (Spies et al.,

1992). La débil visualización de solo algunas señales de la Glc en At-J, indica un DP superior al de

las especies mencionadas, pero inferior al de dalia.

Las zonas restantes del espectro de At-J se muestran complejas, indicando que los cinco tipos de

señales pueden estar presentes. El desplazamiento químico en regiones cercanas, vuelve ancha

las señales considerablemente, haciendo difícil una exacta interpretación; sin embargo, es posible

destacar algunas características del espectro. Una señal identificada a δ 60.77 ppm puede ser

atribuida a β-D-Fruf (2-6) (δ60.8 ppm en levanos, Shiomi, 1993) o a 1,6-di-β-D-Fruf (δ 60.8 ppm

para U. maritima, P. peisonis y Agropyron repens, Spies et al. 1992); mientras los enlaces β(2-1)

se evidencian con la señal C1 a δ 61.6 ppm, confirmada en los estándares de 1-Kes y dalia. Un

desplazamiento a una menor frecuencia, δ 61.24 ppm, sugiere la presencia de α-D-Glcp-i (De

Bruyn y Van Loo, 1991; Shiomi, 1993). Los ajustes a δ 74.6 ppm debido al C4 y δ 81.95 y 81.12

ppm debidas a los carbonos 5 (C5) confirman lo anterior, ya que sus valores semejan a lo

reportado para neofructanos (De Bruyn y Van Loo, 1991; Shiomi, 1993). La presencia de 1,6-di-β-

D-Fruf también puede sugerirse por la semejanza de los valores reportados para estructuras

ramificadas como los fructanos presentes en C. australis, U. maritima y Phormium spp. (Brasch et

al., 1988; Spies et al., 1992; Sims et al., 2001); sin embargo, estos valores caen en las regiones

pobremente resueltas. Finalmente, cabe destacar que el espectro de At-J presentó mayor

semejanza con aquellos publicados para Cordyline australis, Phormium spp. y especialmente para

Urginea maritima (Figura 40). Esto confirma lo reportado por Sims et al. (2001 y 2003), que

aseveran que la estructura de los fructanos puede ser un criterio adicional para la clasificación de

las especies; pues al estar éstas taxonómicamente más relacionadas, presentan fructanos con

características estructurales semejantes.

135

Figura 40. Espectros de 13C-RMN de fructanos en Asparagales. Comparación de frucanos de Agave tequilana (Jalisco) con lo reportado en la literatura para Phormium spp. (Sims et al., 2001); Urginea maritima (Spies et al., 1992) y Cordyline australis (Brasch et al., 1988).

1.8.3. RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR DE PROTÓN

A diferencia de 13C-RMN, los reportes de 1H-RMN de fructanos son mucho más escasos (De

Bruyn y Van Loo, 1991; Liu et al., 1991). En la Figura 41 se muestra los espectros de 1H-RMN

obtenidos para Suc y fructanos de dalia y At-J; mientras que la Tabla 20 muestra las asignaciones

dadas a las señales emitidas por estos compuestos, de acuerdo a los valores reportados en la

literatura y a sus características espectrales (presencia de singletes, dobletes, etc). A partir de la

estructura de la Suc, se deducen once señales para los distintos protones presentes en la

molécula (seis para Glc y 5 para Fru). La señal emitida por el H1 de la Glc es fácilmente

identificada, pues al ser el único protón unido a un átomo de carbono con dos oxígenos vecinos,

resuena como un doblete a altas frecuencias (δ 5.1-5.4 ppm).

136

Figura 41. Espectro de 1H-RMN de sacarosa y fructanos de Dahlia variabilis y Agave tequilana.

Los H3 y H4 de la Fru fueron identificados como un doblete y un triplete con desplazamientos de δ

4.00 y 3.83 ppm, respectivamente. Los dobletes a δ 3.36 y 3.32 ppm fueron asignados al H6 unido

al carbono primario de la Glc y Fru, respectivamente; mientras que el singlete observado a δ 3.45

ppm es debido al H1 de la Fru, cuyo carbono tiene como vecino al C2 que carece de protones. El

H3 de la Glc se identificó como un triplete a δ 3.52 ppm. Finalmente en la región δ 3.58-3.72 ppm

se observa una señal sin resolución debida a los cercanos desplazamientos químicos de H2 y H5

de la Glc y al H5 de la Fru, por lo que no fue posible una asignación específica de sus

desplazamientos químicos. En el espectro de inulina de dalia, solo fue posible identificar las

resonancias correspondientes al H3 (δ 4.04 ppm) y H4 (δ 3.88 ppm) de la Fru.

137

Tabla 20. Desplazamientos químicos de 1H-RMN. 1H Suc 1-Kes 6G-Kes 6-Kes 6G-Kes Suc Dalia

De Bruyn y Van

Loo, 1991 De Bruyn y Van

Loo, 1991 De Bruyn y Van

Loo, 1991 Liu et al.,

1991 Liu et al.,

1991 Este

trabajo Este

trabajo G1 5.42 5.44 5.4 5.15 5.22 5.20 (d) n.d.

G2 3.57 3.57 3.57 3.33 3.37 n.r. n.d.

G3 3.48 3.47 3.53 3.53 3.56 3.52 (t) n.d.

G4 n.r. n.r. n.r. 3.25 3.34 3.22 (t) n.d.

G5 n.r. n.r. n.r. 3.6 3.77 n.r. n.d.

G6 n.r. n.r. n.r. 3.61 3.5 3.32 (d) n.d.

3.66

F1 n.r. n.r. n.r. 3.46-i 3.46-O1 3.45 (s) n.r.

3.46-t 3.52-O6

3.64-O6

F3 4.25 (d) 4.28 (d) 4.19 (d) 3.97-i 4.04-O1 4.00 (d) 4.04 (d)

4.22 (d) 4.19 (d) 3.94-t 4.00-O6

F4 4.06 (t) 4.08 (t) 4.15 (t) 3.82-i 3.89-O1 3.83 (t) 3.88 (t)

4.05 (t) 4.08 (t) 3.87-t 3.97-O6

F5 n.r. n.r. n.r. 3.72-i 3.69-O1 n.r. n.r.

n.r. n.r. 3.65-t 3.71-O6

F6 n.r. n.r. n.r. 3.55-i 3.53-O1 3.36 (d) n.r.

3.73-i 3.63-O1

3.40-t 3.54-O6

Valores de desplazamientos químicos (en ppm) de 1H reportado para sacarosa, 6-kestotriosa y 6G-kestrotriosa (neokestosa); Gx indica el número de protón en la glucosa; Fx el correspondiente a la fructosa; -t, residuo terminal; -i, residuo interno; -O1 y O6, residuos unidos al O1 y O6 de la glucosa interna, respectivamente. En este trabajo las resonancias de 1H para sacarosa y fructanos de dalia fueron asignadas de acuerdo a los valores de la literatura y por las características del espectro; la letra entre paréntesis indica la señal de resonancia: s, singlete; d, doblete y t, triplete. n.r., no reportado o no resuelto; n.d., no detectado.

Respecto a los fructanos de At-J, la resonancia del H1 de la Glc (δ 5.23 ppm) fue bien resuelta,

mientras que las demás señales se presentaron sin resolución en un intervalo de δ 3.40 a 4.18

ppm. La complejidad de los fructanos en esta especie evidenciada en 13C-RMN y el estrecha

región donde los protones resuenan, hizo imposible la resolución de sus señales y con ello un

detallado análisis estructural. Sin embargo, a través de la integración del área bajo los picos

138

(Figura 41) fue posible estimar el DP de los fructanos presentes en At-J. Considerando que la

señal de δ 5.23 ppm corresponde al único H1 de la Glc, su área fue considerada como la unidad

(0.76) y relacionada con la región del resto de las señales (94.25), estimándose un aproximado de

124 H presentes en esta área y que corresponde a un DP promedio de 21 unidades.

1.9. ESTRUCTURAS PROPUESTAS PARA FRUCTANOS EN Agave Y Dasylirion

Las características estructurales determinadas en los fructanos de agaves y dasylirion, coinciden

con otros miembros de las Asparagales. En general, éstos se caracterizan por una baja

representación de inulinas comparados con los miembros Asterales. Además, la presencia del

isómero 6-Kes no es vidente, consecuentemente, si existen levanos en estas especies, deben

estar solo en pequeñas cantidades. Por otra parte, en el orden Asparagales es posible distinguir

claramente al género Allium, con su predominante neoserie y fructanos lineales tipo inulina, de

otros géneros taxonómicamente menos relacionados como Phormium, Cordyline, Urginea y Agave

caracterizados por la presencia de graminanos y unidades ramificadas. Considerando que los

fructanos en agaves y dasylirion constituyen una mezcla polidispersa y con estructuras

heterogéneas, es difícil elucidar una estructura molecular para estas especies. Sin embargo, los

datos colectados ofrecen una valiosa información acerca de las características predominantes de

estos carbohidratos. A partir de dichos datos en la Figura 42 se muestra dos tipos generales de

estructuras propuestas para los fructanos en estas especies, con valores de n1 a n4 ≥ 0 y variables

acorde a cada especie y condiciones medioambientales.

Una posible estructura clasifica a estos fructanos como “graminanos ramificados” (Figura 42A), ya

que en estas plantas se evidenció los dos tipos de enlace β-fructo-furanosil, además de la

presencia de 1,6-di-β-D-Fruf (Fru ramificada). La estructura más pequeña de un fructano

ramificado, corresponde a la bifurcosa (1 y 6-kestotetraosa, DP4), por lo que probablemente a

partir de esta estructura las FT presentes en agaves y dasylirion catalizan la elongación de la

molécula. Esta estructura semeja a aquella reportada para A. vera cruz. Para esta especie,

Aspinall y Das Gupta (1959) proponen un graminano de DP∼31 altamente ramificado.

Una segunda estructura propuesta para los fructanos de agaves y dasylirion es caracterizada por

una unidad de i-α-D-Glcp con puntos de ramificación, “neofructano ramificado” (Figura 42B). A

este tipo estructural lo hemos denominado “agavinas” (Mancilla-Margalli y López, 2006) y aunque

139

Figura 42. Estructuras propuestas para fructanos presentes en Agave y Dasylirion. A) graminano ramificado con glucosa terminal y B) con una unidad de α-D-glucopiranosa interna y puntos de ramificación (agavinas). La diferencia entre las especies debe estar dado por los valores de n1 a n4 ≥ 0, que a su vez deben depender no solo de la especie sino de las condiciones ambientales.

no hay reportes de una caracterización molecular de un fructano con tales características, éste es

muy semejante a la estructura propuesta para Urginea maritima (Spies et al., 1992). La propuesta

para los fructanos en estas especies coincide en un esqueleto →1)-D-Fruf-β-(2→ con una unidad

α-D-Glcp interna, con una cierta frecuencia de ramificación (cada tres residuos para At-J y U.

maritima) y una unidad D-Fruf β(2-6) en cada punto de ramificación seguida de un β-D-Fruf

terminal. La diferente contribución de cada tipo de estructura y la longitud de la cadena

encontradas en miembros de este género, pueden reflejar diferencias no solo atribuibles a

lasespecies, sino además debe reflejar el estado fisiológico de la planta y su capacidad de

adaptación a diferentes condiciones geoclimáticas.

1.10. POSIBLES IMPLICACIONES DE LA PRESENCIA DE FRUCTANOS EN AGAVES Y

DASYLIRION

Las implicaciones evolutivas de la diversidad estructural de los fructanos no son claras; sin

embargo, de acuerdo a Hendry (1987 y 1993), los fructanos son el principal carbohidrato de

almacén en más de la mitad de las especies del orden Liliales (actualmente orden Asparagales de

acuerdo a la clasificación de Dahlgren, Clifford y Jeo, 1985), y propone que la presencia de este

carbohidrato es clave para la distribución cosmopolita de estas especies, incluyendo regiones

tropicales y áridas. Este orden no es considerado altamente evolucionado como el resto de los que

almacenan fructanos. Además, las evidencias más antiguas de plantas que almacenan estos

140

carbohidratos, corresponden a especies primitivas representadas actualmente por miembros de la

familia Agavaceae. En las regiones áridas donde estas especies crecen exitosamente, la

disponibilidad limitada de agua es la característica predominante. Estas condiciones fueron, de

acuerdo a Hendry, factores climáticos que contribuyeron al origen de las plantas sintetizadoras de

fructanos. Por lo tanto, de una manera especulativa, podemos concluir que la diversidad

estructural de los fructanos, pudo haber sido determinante en la supervivencia y adaptación de la

flora ancestral de las Asparagales, y que actualmente su presencia sigue siendo factor relevante

para el desarrollo de estas especies en condiciones áridas.

141

2. IDENTIFICACIÓN DE ACTIVIDADES ENZIMÁTICAS INVOLUCRADAS EN EL

METABOLISMO DE FRUCTANOS DE AGAVE Y DASYLIRION

La diversidad de estructuras encontrada en tallos de agave y dasylirion a partir del análisis de sus

carbohidratos, sugiere la participación de diferentes FT en su síntesis. En la literatura científica,

concerniente a la purificación de FT de origen vegetal, sobresalen dos estrategias

cromatográficas utilizadas. La primera, la cual es empleada por la mayoría de los autores (Van den

Ende et al., 1996; Marx et al., 1997; St. John et al., 1997a), utiliza primeramente una cromatografía

de afinidad, seguida de intercambio iónico; mientras que en una segunda estrategia, estos pasos

cromatográficos son invertidos (Duchateau et al., 1995; Koops y Jonker, 1996; Henson y

Livingston, 1996). En la identificación de actividades de las FT en agaves y dasylirion en este

trabajo, se intentaron ambas estrategias y los resultados de éstas se muestran a continuación.

2.1. ESTRATEGIA CROMATOGRÁFICA I


Las proteínas precipitadas con una saturación al 80% de sulfato de amonio, fueron recuperadas

por centrifugación y cargadas en una columna de afinidad de concanavalina A. La fracción

proteínica que no interaccionó con la resina tuvo una absorbancia λ280nm de 2 a 3, pero no

presentó actividad de FT utilizando Suc o 1-Kes como sustrato, por lo que esta fracción fue

eliminada. Por otra parte, las proteínas con afinidad a la resina, fueron eluidas con 1.5 vol. de α-

metil-manopiranósido. En la Figura 43A se observa que las proteínas eluyeron en un solo pico, por

lo que las fracciones correspondientes se juntaron en lo que se denominó fracción ConA. La

interacción de estas proteínas con la resina y su desplazamiento por la adición de α-metil-

manopiranósido, confirma la naturaleza glicosilada de esta familia de enzimas, reportada

anteriormente por algunos autores (Van de Ende et al., 1996b, Koops y Jonker, 1996).

La determinación de Bradford indicó una concentración de 1 mg/mL. Una concentración proteínica

de 0.6 µg/µL fue utilizada en el bioensayo enzimático, que evidenció la presencia de FT, FEH y

seguramente de Inv (Figura 43B). Utilizando 200 mM de Suc como sustrato, se detectó la

formación de FOS hasta DP5, desde el primer tiempo de muestreo (18 h), no habiendo formación

de fructanos superiores aún después de 65 h (Figura 43B). Generalmente, los reportes sobre la

142

Figura 43. Cromatografía de afinidad a concanavalina A. A) Se muestra el patrón de elución de proteínas de Agave tequilana (Jalisco) y Agave angustifolia (Oaxaca) de la resina concanavalina A después de la aplicación de α-metil-manopiranósido 150 mM. B) Productos del ensayo enzimático de A. tequilana a distintos tiempos de reacción (0, 18, 40 y 65 h), con distintos sustratos (sacarosa 200 mM o fructanos al 1%) y dos temperaturas de incubación (30 °C y 0 °C); St, compuestos estándar; M, monosacáridos (fructosa + glucosa); Suc, sacarosa; 1-Kes, 1-kestotriosa; Nis, nistosa; DP5, fructosil-nistosa; O, origen de la cromatografía.

síntesis de fructanos in vitro indican diferentes resultados comparado a lo encontrado in planta,

regularmente el DP es notablemente inferior. Estas diferencias son atribuidas a las diferentes

características de los medios de reacción (Van den Ende et al., 2003). Además, se ha establecido

143

en Asteracea, que el patrón de fructanos sintetizados in vitro depende de la relación (1-SST + 1-

FFT)/Suc (Van den Ende et al., 1996; Hellwege et al., 2000) y que la formación de fructanos

superiores, sucede después de que la 1-Kes es acumulada en una concentración capaz de

competir con la Suc como fructosil-aceptor (Van den Ende et al., 1996b). La síntesis única de FOS

en la fracción ConA puede ser explicada por una reducción de Suc, sin suficiente acumulación de

1-Kes para inducir la síntesis de fructanos superiores.

De acuerdo a Van den Ende y Van Laere (1996b), las FT de achicoria presentan mayor actividad a

0 °C, mientras que la actividad Inv genuina o intrínseca en las FT se ve decrecida a esta

temperatura. Con la finalidad de reducir el tiempo de síntesis in vitro y de contrarrestar la posible

interferencia de Inv en la síntesis de fructanos, la fracción ConA se incubó a 0 °C; sin embargo,

contrariamente a lo esperado, hubo una severa reducción en la actividad (Figura 43B) y sólo se

observó la formación de 1-Kes. Las FT parecen tener diferentes propiedades cinéticas de acuerdo

a la especie (Vergauwen et al., 2003) y no solo eso, sino que también pudiesen ser reguladas por

distintos factores. Por ejemplo, durante condiciones de sequía, la 1-SST de achicoria es inducida

(De Roover et al., 2000), mientras que en algunas monocotiledóneas esta enzima es inhibida

(Kawakami y Yoshida, 2002). Como parte de su ciclo fenológico, las plantas de achicoria son

sometidas a temperaturas frías que inducen la acumulación de fructanos en sus raíces (Bais y

Ravishankar, 2001); mientras que las necesidades fisiológicas de los agaves son distintas, y las

bajas temperaturas incluso, pueden causar detrimentos en estas plantas (Irish, 2000). Por lo tanto,

es posible que la regulación de las FT en agaves sea distinta a la achicoria y que podría estar

sujeta a otros factores de inducción, más relacionados con el estatus hídrico que con la

temperatura.

Por otra parte, la fracción ConA fue ensayada en presencia de fructanos al 1% extraídos de At-J.

La formación de monosacáridos (Glc y Fru) es indicativa de la presencia de Inv y/o FEH en esta

fracción (Figura 43B).


Después de dializada y concentrada la fracción ConA, ésta fue aplicada a una columna de

intercambio aniónico (Mono Q Sepharose, Amersham Pharmacia). Al igual que lo reportado por

Van den Ende et al., (1996b), al valor de pH utilizado (7.0), las actividades β-fructofuranosidasas

(Inv y FEH), no interactuaron con la resina, por lo que esta fracción fue colectada (Q0) y ensayada

144

para estas actividades. La fracción proteínica que se pegó a la resina Mono Q, fue eluida con un

gradiente lineal de NaCl (0 a 600 mM). La Figura 44A muestra que las proteínas provenientes de

At-J y Aa-O presentaron un comportamiento similar; sus proteínas eluyeron en cuatro picos

principales (Q1, Q2, Q3 y Q4) a concentraciones similares de NaCl (75, 155, 310 y 525 mM,

respectivamente).

Figura 44. Cromatografía de intercambio aniónico. A) La fracciones ConA de A. tequilana (Jalisco) y A. angustifolia (Oaxaca) fueron cargadas en una resina MonoQ y eluidas con un gradiente continuo de NaCl (0-600 mM, pH 7.0); B) Productos del ensayo enzimático de A. tequilana a distintos tiempos de reacción (0, 18, 40 y 65 h); St, compuestos estándar; M, monosacáridos (fructosa + glucosa); Suc, sacarosa; 1-Kes, 1-kestotriosa; Nis, nistosa; DP5, fructosil-nistosa; O, origen.

145

Cada una de estas fracciones fue ensayada para actividad de FT (Figura 44B). Las fracciones Q1

y Q2 no mostraron actividad FT cuando fueron incubadas con Suc 200 mM; mientras que las

fracciones Q3 y Q4 presentaron actividad FT diferencial, indicando que la cromatografía de

intercambio aniónico enriqueció las distintas actividades en diferentes fracciones. En presencia de

Suc, las proteínas en Q3 sintetizaron FOS hasta DP5, mientras que en Q4 solo se observó la

generación de 1-Kes. Para alcachofa Jerusalem, Koops y Jonker (1996), reportaron la elución de

1-SST de una resina MonoQ (pH 6.5) a una concentración de 250 mM de NaCl, que podría

equivaler a los 310 mM de la fracción Q3, donde esta enzima podría estar enriquecida. Por otra

parte, la débil presencia de 1-Kes en Q4 puede ser explicada como una actividad residual de 1-

SST en esta fracción; donde probablemente pueda encontrarse enriquecida la 1-FFT. Esta última

enzima utiliza Suc como fructosil-aceptor en la generación de 1-Kes, pero es incapaz de utilizarla

como donador. La generación de FOS (DP>3) a partir de 1-Kes puede evidenciar si esta fracción

está enriquecida con la 1-FFT; desafortunadamente, este bioensayo no se llevó a cabo.

2.1.3. CROMATOGRAFÍA DE HIDROXIAPATITA

Las FT presentan pesos moleculares y propiedades bioquímicas semejantes (Tabla 11) que

complica su purificación y caracterización. Una estrategia cromatográfica para separar estas

actividades es el uso de la resina de hidroxiapatita (HA) (Koops y Jonker, 1996; Lüscher et al.,

2000). Esta resina es un mineral que presenta grupos de calcio, hidroxilos y fosfatos; por lo que su

superficie constituye un mosaico complejo de cargas y la interacción de las proteínas con la resina

es multifactorial, dependiendo entre otras cosas, de la naturaleza de la proteína (ácida o básica),

la interacción específica de los grupos carboxilo y de las características del eluyente (Gorbunoff y

Timasheff, 1984). Las proteínas contenidas en la fracción Q3 y Q4 disueltas en buffer Bis-Tris-HCl

(pH 6.0) fueron cargadas a la resina HA. La fracción lavada con este mismo buffer fue colectada

en la fracción denominada HA-L (Q3 o Q4). Posteriormente, la columna fue lavada con buffer

NaH2PO4 300 mM (pH 5.6). Los grupos fosfato del buffer neutralizan los sitios de caIcio de la

resina y le confirieren carga negativa (Gorbunoff y Timasheff, 1984). La fracción proteínica eluída

de esta forma se denominó HA-E (Q3 o Q4). En la Figura 45 se muestra los productos obtenidos

en el ensayo enzimático de estas fracciones. El uso de la resina HA discriminó notoriamente las

diferentes actividades FT, reteniendo aparentemente la actividad 1-SST pero no la 1-FFT, en

acuerdo a lo reportado por Koops y Jonker (1996).

146

Figura 45. Cromatografía de hidroxiapatita. Las fracciones Q3 y Q4 fueron cargadas en una columna de hidroxiapatita. La columna se lavó con Bis-Tris-HCl 20 mM (pH 6.0) recuperando las fracciones sin interacción: HA-L; mientras que la fracción proteínica que interaccionó con la columna se eluyó con NaH2PO4 300 mM (pH 5.6): HA-E. El ensayo enzimático se realizó con Suc 200 mM o 1-Kes 45 mM, según se indica, tomando alícuotas a tiempos 0, 18, 45 y 60 h. St, compuestos estándar; M, monosacáridos; Suc, sacarosa; 1-Kes, 1-kestotriosa; Nis, nistosa; DP5, fructosil-nistosa; O, origen.

i) HA-LQ3

En la fracción Q3, las proteínas sin interacción no presentaron actividad en presencia de Suc 200

mM, pero usando 1-Kes 45 mM se logró la síntesis de productos superiores a DP5, sin generación

de monosacáridos, por lo que se sugiere que esta fracción está enriquecida con 1-FFT.

ii) HA-EQ3

La fracción proteínica que fue eluída de la resina, sintetizó FOS en presencia de Suc. Sin

embargo, de manera interesante, se observó un patrón característico de β-fructofuranosidasa en

147

presencia de 1-Kes, con la generación predominante de monosacáridos (Glc y Fru). Esto sugiere

la presencia de 1-SST en esta fracción, enzima que es capaz de utilizar Suc como sustrato para

formar 1-Kes principalmente, y FOS superiores (actividad 1-FFT) solo cuando cierta relación de

Suc/1-Kes es alcanzada (Van den Ende et al., 1996a); mientras que su actividad β-

fructofuranosidasa, puede ser semejante a lo reportado en trigo, donde la 1-SST en presencia de

1-Kes 50 mM, presentó actividad predominante de 1-FEH con la generación de Fru y Suc (Nagaraj

et al., 2004).

iii) HA-LQ4

La fracción HA-LQ4 en presencia de Suc, sintetizó un producto cuyo Rf es inferior al de la 1-Kes

(Figura 45) con dominante producción de monosacáridos. Cuando esta misma fracción fue

ensayada con 1-Kes, hubo formación de FOS superiores a DP5. Este hecho sugiere la posible

presencia de una actividad 6-SFT, enzima que usa Suc como fructosil-aceptor y donador (∼20%

de la actividad) en la formación de 6-Kes, producto con un Rf inferior a la 1-Kes. Esta enzima tiene

predominante actividad de Inv (∼78%) en presencia de Suc, que justifica la producción importante

de monosacáridos observada. Por otra parte, esta enzima, presenta actividad polimerizante

cuando usa 1-Kes como sustrato (Sprenger et al., 1997) y que puede explicar la presencia de FOS

en el bioensayo usando 1-Kes como sustrato.

iv) HA-EQ4

La fracción proteínica que eluyó de la resina en esta fracción, al igual que HA-EQ3, presentó

características de 1-SST, pero con notables diferencias. En presencia de Suc, el producto

predominante fue la 1-Kes, y a diferencia de HA-EQ3, se observó una ligera acción polimerizante

sólo en el último tiempo de muestreo (60 h). En presencia de 1-Kes no hay actividad β-

fructofuranosidasa, sino una actividad de polimerización, y al igual que la fracción HA-LQ3 no hay

presencia de monosacáridos, sugiriendo una actividad de polimerización de una enzima que

además es capaz de utilizar Suc. A diferencia de lo reportado en cebolla y espárrago,

recientemente se mostró que la 6G-FFT de Lolium perenne puede utilizar Suc como donador en la

síntesis poco favorecida de 1-Kes (Lasseur et al., 2006); por lo que en la fracción HA-EQ4 no

podemos eliminar la posible presencia de la 6G-FFT en los agaves.

Aunque la resina HA claramente discriminó diferentes actividades FT, no podemos descartar la

presencia de una mezcla de más de una de ellas en las distintas fracciones. La actividad 1-SST en

las fracciones HA-EQ3 y -EQ4 con comportamientos distintos, abre la posibilidad de la existencia

148

de isoformas para esta enzima, igual que lo reportado en otras especies (Duchateau et al., 1995;

Lüscher et al., 1996 y 2000a). Por ejemplo, Lüscher et al. (2000a) reporta en cebada dos

isoenzimas 1-SST. Ambas formas generan 1-Kes y Glc a partir de Suc, pero una de ellas en

presencia de 1-Kes presenta actividad FEH, generando Fru y Suc. Se sugiere que la Suc

generada de esta forma, es utilizada posteriormente para la síntesis de 1-Kes y producción de Glc.

2.1.4. CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN (FILTRACIÓN EN GEL)

La resina de exclusión Sephacryl S-200 fue calibrada con proteínas estándares (Figura 46A). La

fracción Q0, que no interaccionó con la resina de intercambio aniónico y que presentó actividad de

β-fructofuranosidasa, se cargó en la columna y fue eluída con buffer de exclusión.

Figura 46. Cromatografía de exclusión en gel. A) Determinación del volumen vacío con azul dextran (2000 kDa) y calibración de la columna Sephacryl S-200 (Amersham Pharmacia) con catalasa (232 kDa), γ-globulina (158 kDa), seroalbúmina (66 kDa) y lisozima (14.3 kDa); B) La fracción Q0 proveniente de intercambio aniónico fue cargada en la columna y eluída con buffer de citrato-fosfato 50 mM (pH 5.5), colectando tres fracciones: Q0-A, Q0-B y Q0-C; C) Productos del ensayo enzimático de las tres fracciones ensayadas con fructanos al 1% extraídos de Agave tequilana (Jalisco), a distintos tiempos de reacción (0, 18, 45 y 60 h). St, compuestos estándar; M, monosacáridos (fructosa y glucosa); Suc, sacarosa; 1-Kes, 1-kestotriosa; DP4, nistosa; DP5, fructosil-nistosa; O, origen.

149

El patrón de elución muestra tres fracciones claramente definidas, denominadas Q0-A, Q0-B y Q0-

C (Figura 46B). De acuerdo a la ecuación de regresión y=0.5882× + 2.8613, (r2 0.9461), obtenida

graficando el log PM de las proteínas estándares vs su coeficiente de distribución (Ecuación IV),

para las fracciones eluidas se deteminó un intervalo de peso molecular de 126 a 180 kDa para

Q0-A, 70 a 121 kDa para Q0-B y de 23 a 38 kDa para Q0-C (Tabla 21).

Cada una de las fracciones fue ensayada con fructanos al 1% extraídos de A. tequilana (Jal.). La

Figura 46C muestra claramente que la actividad FEH está contenida en la fracción Q0-B. Los

productos generados de esta reacción fueron exclusivamente monosacáridos, aunque la señal

para estos carbohidratos fue de menor intensidad a la esperada. A diferencia de las FT, las FEH

son enzimas monoméricas con PM de 65 a 75 kDa (Tabla 11) (Marx et al., 1997; De Roover et al.,

1999; Van den Ende et al., 2003), por lo que el rango de peso molecular de la fracción Q0-B

coincide con los valores reportados para estas enzimas.

2.1.5. IDENTIFICACIÓN PUTATIVA DE ENZIMAS INVOLUCRADAS EN EL METABOLISMO DE

FRUCTANOS EN Agave tequilana (JALISCO)

La Figura 47 muestra un gel SDS-PAGE de las fracciones proteínicas obtenidas a lo largo de los

distintos pasos cromatográficos. Como se puede observar, a pesar de pasar el extracto crudo por

varias resinas, aún se observa la presencia de una mezcla de proteínas. Aunque lejos de la

posibilidad de atribuir con alta certeza una actividad específica a alguna proteína observada,

podemos sin embargo, marcar algunas bandas como fuertes candidatos con actividad FT, con

base en su enriquecimiento cromatográfico correlacionado con las actividades observadas en este

trabajo y los pesos moleculares reportados en la literatura.

Tabla 21. Calibración de la columna de exclusión y estimación de pesos moleculares de las proteínas en la fracción QO.

Proteína PM (kDa) log PM Ve Ve/Vo Kav Conc. (mg/mL)

Azul dextran 2000 3.3010 130 1 - 1 Catalasa 232 2.3654 132 1.0153 8.65×-3 2 γγγγ-Globulina 158 2.1986 156 1.2000 0.1125 2 Seroalbúmina 66 1.8195 190 1.4615 0.2597 2 Lisozima 14.3 1.1553 386 2.9692 1.1080 2 Q0-A 126-180 2.10-2.25 134-168 1.0307-1.2930 0.0173-0.1298 - Q0-B 70-121 1.84-2.08 172-224 1.3230-1.7230 0.1817-0.4068 - Q0-C 23-38 1.36-1.57 284-332 2.1846-2.5538 0.6665-0.8743 -

Ve, volumen de elución; Vo, volumen muerto (determinado con azul dextran), Kav, Ve-Vo/Vc-Vo; V, volumen de columna (361.0318 mL).

150

Figura 47. Electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante (SDS-PAGE). Fracciones proteínicas obtenidas de Agave tequilana (Jalisco) a través de distintos pasos de purificación. PM, marcadores de peso molecular; ConA, fracciones eluídas de concanavalina A; fracciones Q obtenidas de intercambio aniónico, Q0, sin interacción; Q3 y Q4, eluídas con 310 y 525 mM de NaCl, respectivamente; fracciones HA obtenidas de hidroxiapatita por lavados (HA-L, sin interacción) con Bis-Tris HCl 20 mM o eluídas (HA-E) con NaH2PO4 300 mM. En asteriscos se marcan las probables enzimas participantes en el metabolismo de fructanos.

En el carril Q0, hay bandas de proteínas que no se observan en los siguientes carriles. En esta

fracción se observó una actividad FEH, que de acuerdo a los resultados de la cromatografía de

exclusión, esta proteína debe presentar un peso molecular de 70 a 121 kDa. Una banda marcada

con un asterisco arriba de los 68 kDa podría corresponder a esta enzima. En las fracciones

provenientes de HA, donde hubo mayor discriminación de actividad, se observa un par de bandas

enriquecidas de ∼ 40 y 22 kDa; en estas fracciones se observó actividad polimerizante, sin

generación de monosacáridos (Figura 44), por lo que estas bandas pueden corresponder al

heterodímero de la 1-FFT; sin embargo, estos valores difieren con lo reportado para estas enzimas

(∼ 50 y 20 kDa).

151

2.2. ESTRATEGIA CROMATOGRÁFICA II

En la segunda estrategia ensayada, el extracto crudo fue separado en una resina de intercambio

aniónico (Mono Q Sepharose; Amersham Pharmacia), seguida de una cromatografía de afinidad

(concanavalina A). Para esta estrategia, se ensayaron los extractos proteínicos de At-J, Aa-S, Ap-

O y Dsp-C. Estas especies mostraron un comportamiento casi similar con diferencias

principalmente cuantitativas o en la presencia o ausencia de un compuesto minoritario (Tabla 22);

siendo Dsp-C, la especie con un comportamiento más disímil. En las siguientes secciones se

muestran únicamente los resultados obtenidos para A. potatorum. Los productos de los

bioensayos fueron detectados en esta ocasión por HPAEC-PAD. Esta técnica presenta el

inconveniente de que el detector tiene diferentes factores de respuesta para cada compuesto, por

lo que para fines cuantitativos, el equipo debe calibrarse para cada compuesto detectado (Pavis et

al., 2001a); sin embargo, su límite de detección y capacidad de resolución la hacen una de las

técnicas de mayor utilidad en el análisis de fructanos.

2.2.1. EXTRACTO CRUDO

Para identificar las principales actividades enzimáticas, 40 µL de extracto crudo de A. potatorum

(15.82 mg/mL) fueron ensayados a un volumen final de 50 µL, usando Suc o 1-Kes a una

concentración de 200 mM o con fructanos al 1% (Figura 48). Después de 24 h de reacción, los

productos formados con Suc y 1-Kes fueron comparables al patrón de fructanos encontrados in

planta (Figura 34). Sutiles diferencias observadas in vivo e in vitro son atribuibles a un entorno

distinto (Van den Ende et al., 2003), además de un probable requerimiento de la inducción de los

genes que codifican para estas FT en la síntesis de estos carbohidratos (Vijn et al., 1997;

Kawakami and Yoshida, 2002; Nagaraj et al., 2004). La formación de FOS de diversas estructuras

hasta un DP12, habla de la presencia de diferentes enzimas involucradas en su síntesis. La

capacidad de usar Suc como único sustrato inicial en la formación de estos productos, indica que

la 1-SST es una enzima activa en la síntesis y acumulación de 1-Kes, metabolito central usado por

las demás FT que polimerizan este trisacárido en diferentes maneras. Los DP3 más abundantes

fueron la 1-Kes y 6G-Kes. Una considerable acumulación de la serie inulina, representada

mayoritariamente por Nys (I4), sugiere la participación de 1-FFT en la elongación de estos IOS. Al

igual que lo observado in planta, los fructanos sintetizados in vitro corresponden mayoritariamente

a los neofructanos, representados por 6G-Kes (N3), 1 y 6G-kestotetraosa (N4, FGFF) y 1,6G-

152

kestotetraosa (N4, FFGF). Estos compuestos DP4, son isómeros producidos por una fructosil-

transferencia a cualquiera de las dos Fru terminales presentes en la 6G-Kes. Esto puede suceder

Figura 48. Perfil cromatográfico (HPAEC-PAD) de fructanos sintetizados por enzimas presentes en el extracto crudo de A. potatorum. Los picos son identificados según se indica en la Tabla 15. Tabla 22. Productos formados en los bioensayos con fracciones Q y usando sacarosa o 1-kestotriosa como sustrato. Se utiliza la nomenclatura propuesta por Ernst et al. (1998), en donde Ix, refiere a la serie inulina con x grado de polimerización; Nx y Nx indican respectivamente, si el fructano es elongado sobre ambos extremos de la molécula o sólo del lado de la glucosa, respectivamente. Se indica la enzima identificada y el número de asteriscos indica la actividad relativa de acuerdo a la abundancia de los productos formados (s.p., sin producto).

153

Fracción + Sustrato A.angustifolia A. tequilana A. potatorum Dasylirion spp. Q1 + Suc 200 Mm I3 1-SST

N3, N4, N4 6G-FFT 6-K 6-SFT I4….DP7 1-FFT*

I3 1-SST** N3, N4, N4 6G-FFT** 6-K, BF 6-SFT I4…. DP9 1-FFT**

I3 1-SST*** N3, N4, N4 6G-FFT*** 6-K, BF 6-SFT I4…. DP6 1-FFT**

s.p.

Q1 + 1-Kes 50 mM N3, N4 6G-FFT* I4 1-FFT*

N3, N4, N4 6G-FFT** 6-K, BF 6-SFT I4…. DP9 1-FFT**

N3, N4, N4 6G-FFT*** BF 6-SFT I4…. DP8 1-FFT**

I4 1-FFT

Q2 + Suc 200 mM GFF 1-SST*

I3 1-SST** N3, N4, N4 6G-FFT** 6-K, BF 6-SFT I4…..DP10 1- FFT**

I3 1-SST*** N3, N4, N4 6G-FFT** 6-K, BF 6-SFT I4…..DP5 1- FFT*

I3 1-SST*** N3, N4, N4 6G-FFT*** 6-K, BF 6-SFT* I4…..DP6 1- FFT**

Q2 + 1-Kes 50 mM N3, N4, N4 6G-FFT*** I4….DP8 1-FFT**

N3, N4, N4 6G-FFT** 6K, BF 6-SFT I4……DP10 1-FFT***

N3, N4, N4 6G-FFT** BF 6-SFT I4……DP7 1-FFT**

-

Q3 + Suc 200 mM I3 1-SST** N3 6G-FFT*

I3 1-SST** N3, N4, N4 6G-FFT** 6-K, BF 6-SFT I4…..DP13 1- FFT**

I3 1-SST*** I4 1-SST o FFT*

I3 1-SST** I4 1-SST o FFT*

Q3 + 1-Kes 50 mM N3, N4, N4 6G-FFT** I4……..DP8 1-FFT***

- N3, N4, N4 6G-FFT** I4……DP6 1-FFT***

N3, N4, N4 6G-FFT*** I4 1-SST o FFT*

Q4 + Suc 200 mM I3 1-SST* I3 1-SST** N3, N4, N4 6G-FFT** 6-K, BF 6-SFT I4…. DP13 1-FFT***

I3 1-SST**


Q4 + 1-Kes 50 mM N3, N4, N4 6G-FFT*** I5…..DP5 1-FFT*

N3, N4, N4 6G-FFT* 6K, BF 6-SFT I4……DP8 1-FFT**

N3, N4, N4 6G-FFT** I4……DP7 1-FFT***


Q5 + Suc 200 mM s.p. I3 1-SST*** N3, N4, N4 6G-FFT** 6-K, BF 6-SFT I4…. DP7 1-FFT*

N3, N4, N4 6G-FFT**


Q5 + 1-Kes 50 mM N3, N4, N4 6G-FFT** I4 1-FFT*

N3, N4, N4 6G-FFT* BF 6-SFT I4…. DP7 1-FFT**

N3, N4, N4 6G-FFT** I4……DP6 1-FFT***


154

a través de la actividad de la 1-FFT o la 6G-FFT (Ritsema et al., 2005); sin embargo, la relativa

abundancia de la 6G-Kes in vitro y la acumulación de neofructanos in vivo, sugiere fuertemente

que la 6G-FFT es una actividad importante en plantas de agave y dasylirion.

La síntesis de FOS del extracto crudo de A. potatorum con 1-Kes 200 mM, no difiere mucho del

patrón de fructanos formados con Suc (Figura 48). De nuevo, se observan productos de DP12,

pero con una mayor acumulación de FOS superiores a 5. Una diferencia notable, fue la presencia

de fructosil-nistosa (I5) y picos adicionales con DP7 y 8, los cuales son claramente ausentes en los

productos formados a partir de Suc. Aunque estos últimos productos no pueden ser identificados

con certeza, pudiesen tratarse también de IOS; hecho que sugiere una competencia de la 6G-FFT

y la 1-FFT por la 1-Kes como sustrato.

Cuando el extracto crudo fue ensayado con fructanos de agave al 1%, se identificó la presencia de

actividad FEH (Figura 48), evidente por la gran acumulación de Fru y una disminución

principalmente de Suc y 1-Kes. La cantidad significativa de Glc puede ser indicio también de una

importante actividad de Inv.

Varios de los pequeños picos observados en el perfil cromatográfico de los fructanos in planta

(Figura 34), fueron también sintetizados a partir del extracto enzimático con Suc o 1-Kes, aunque

con una abundancia menor. De acuerdo al análisis de metilación, estos compuestos deben

pertenecer a graminanos o pequeños fructanos ramificados; por lo que en agaves y dasylirion

deben estar presentes además, aquellas enzimas encargadas de la síntesis de enlaces β(2-6) y/o

puntos de ramificación. La síntesis de estos compuestos implica una fructosil-transferencia al C6

de una fructosa en la generación de un enlace β(2-6), reacción catalizada por la 6-SFT. Los

productos característicos de esta enzima en gramíneas, 6-Kes y bifurcosa (1 y 6-kestotetraosa),

no son característicos de las Asparagales. De acuerdo a su comportamiento cromatográfico, el

pequeño pico que eluye entre 1-Kes y 6G-Kes (marcado con un asterisco en la Figura 48), podría

atribuirse a la 6-Kes y la bifurcosa podría estar coeluyendo con la 1 y 6G-kestotetraosa (N4)

(Shiomi, 1992; Bancal et al., 1993; Pavis et al., 2001a); sin embargo, estos compuestos son solo

tentativamente identificados como tal en agaves y dasylirion. Por otra parte, la baja actividad de 6-

SFT contrasta con el porcentaje de enlaces β(2-6) encontrada en agaves y dasylirion mediante

análisis de PMAA (Tablas 16 y 17); el cual aunque siempre inferior al porcentaje de enlaces β(2-

1), se encuentra en cantidades importantes. Sin embargo, dada la relativa abundancia de puntos

de ramificación en estas plantas, puede sugerirse que la 6-SFT es más activa en la síntesis de

155

graminanos y fructanos ramificados que en la formación de 6-Kes y sus productos de

polimerización. En especies de Lolium, para explicar la síntesis preferente de levanoneoseries

sobre la escasa generación de fructanos ramificados, se propone que la 6-SFT tiene menor

afinidad al uso de 1-Kes (para la síntesis de bifurcosa) que la afinidad de 6G-FFT a este mismo

sustrato (en la síntesis de 6G-Kes) (Pavis et al., 2001b). En plantas de agave y dasylirion, la

afinidad de la 6-SFT pudiese también ser diferencial, presentando mayor afinidad por los IOS

como sustratos en la formación de fructanos ramificados que por el uso de Suc y 6-Kes en la

síntesis respectiva de 6-Kes y levanos superiores.


Las proteínas del extracto crudo se aplicaron a una columna de intercambio aniónico (Mono Q).

Las proteínas sin interacción con la resina, fueron recuperadas en la fracción Q0 (Figura 49). Las

proteínas con interacción fueron eluidas con un gradiente de NaCl de 0 a 1 M. A pesar de que este

gradiente fue más amplio que el usado en la estrategia I (0 a 600 mM), las fracciones no pudieron

resolverse en picos bien definidos, tal vez el volumen del gradiente no fue suficiente. Siete

fracciones (Q1 a Q7) fueron colectadas como se muestra en la Figura 49 y utilizadas en

bioensayos enzimáticos con Suc o 1-Kes. La Tabla 21 indica los productos formados en las

distintas fracciones y los compara con las cuatro especies estudiadas (At-J, Aa-S, Ap-O y Dsp-C).

i) Fracción Q0

La Figura 50 muestra las actividades hidrolíticas encontradas en la fracción Q0. Cuando estas

proteínas fueron ensayadas con Suc 200 mM, se observó la producción de Glc y Fru y una

pequeña cantidad de 1-Kes. La FEH no hidroliza Suc (De Connick et al., 2005), por lo que estos

resultados indican la presencia de Inv, que además de hidrolizar Suc (G-F → G + F), en un

exceso de este sustrato es capaz de transferir unidades de Fru de una Suc donadora a otra

aceptora, formando las kestotriosas (G-F + G-F → GFF + G). La presencia de FEH en la fracción

Q0 fue evidente al utilizar 1-Kes como sustrato, donde hubo producción importante de Suc y Fru

principalmente (GFF → GF + F). Cuando esta misma fracción fue ensayada con fructanos de

agave al 1%, se observó una generación importante de Fru, probablemente a partir de la hidrólisis

de los fructanos superiores, cuya abundancia se vio disminuida. Cantidades casi equimolares de

Fru y Glc, indican que la Inv también fue importante en la actividad hidrolítica presente en esta

fracción.

156

ii) PROBABLES ISOFORMAS DE 1-SST

La Figura 51 muestra el patrón cromatográfico de los ensayos enzimáticos de cada fracción Q.

Cabe destacar la alta producción de Glc y poca generación de Fru en todas las fracciones, cuando

se utiliza Suc como sustrato. Esto indica la presencia de la 1-SST con una activa utilización de

esta molécula como fructosil-donador (G-F + G-F → GFF + G). La constante presencia de esta

actividad en las tres fracciones aquí descritas, sugiere la existencia de isoenzimas para la 1-SST,

como se discutió anteriormente en la sección 2.1.3. Aunque se desconoce la significancia

fisiológica de isoformas de las enzimas 1-SST, se han evidenciado dos formas en cebada y cinco

isoenzimas en alcachofa Jerusalem (Lüscher et al., 1996 y 2000a), con diferentes propiedades

electroforéticas y patrones de glicosilación.

iii) Fracción Q1

En la fracción Q1 es posible detectar varias actividades enzimáticas: enzimas capaces de utilizar

Suc y enzimas con actividades polimerizantes. La formación importante de 1-Kes a partir de Suc,

indica la presencia de la 1-SST; sin embargo también se identificó tentativamente a la 6-Kes y

Figura 49. Cromatografía de intercambio aniónico. El extracto crudo (12 mL) fue cargado a la resina Mono Q (45 mL), lavado con 2.5 vol. columna con Bis-Tris HCl 15 mM (pH 7.0) y eluido 100 mL de un gradiente lineal de NaCl (0-1M).

157

Figura 50. Actividades hidrolíticas de la fracción Q0. La nomenclatura de los picos es de acuerdo a Ernst et al. (1998). En el cromatograma inferior se hace una comparación de los fructanos control (línea negra) sin extracto y fructanos en presencia de la fracción Q0 (línea azul). La nomenclatura de los picos es como se indica en la Figura 48. bifurcosa (BF), aunque en cantidades muy inferiores; por lo que la 6-SFT, enzima que también

utiliza Suc como donador, debe estar presente y quizá es responsable de alguna reacción de

polimerización. En esta fracción se encontró enriquecida la actividad 6G-FFT, pues la formación

de neofructanos (6G-Kes, 1&6G- y 1,6G-kestotetraosa) fue superior incluso a la serie inulina.

Usando 1-Kes 50 mM como sustrato, se observó la síntesis de fructosil-nistosa (I5) y

probablemente otros IOS superiores; sin embargo, el producto principal en esta reacción fue la

6G-Kes. Esto de nuevo, sugiere la presencia de la 1-FFT y 6G-FFT en la misma fracción y la

competencia de ambas enzimas por el sustrato, donde al parecer la 6G-FFT tiene mayor afinidad.

En la caracterización de la 6G-FFT de cebolla y Lolium perenne, se sugiere que esta enzima

sintetiza neofructanos e inulina, a partir de la 1-Kes (Ritsema et al., 2003; Lasseur et al., 2006).

158

Figura 51. Perfil cromatográfico (HPAEC-PAD) de productos del ensayo enzimático de las fracciones de intercambio aniónico de A. potatorum. La nomenclatura de los picos es como se indica en la Figura 48; BF, bifurcosa. Tiempo de reacción, 24 h.

Hecho contrario se ha demostrado en espárrago, donde las evidencias indican que estas

actividades se encuentran en enzimas independientes y altamente específicas (Ueno et al., 2005).

Al igual que el género Allium y Asparagus, el género Agave pertenece al orden Asparagales, por lo

que ambas posibilidades son factibles en la familia Agavaceae. Esto es, los productos de

polimerización observados en la fracción Q1 (Figura 50) pueden ser debidos a la existencia de una

6G-FFT con ambas actividades, o a la presencia de dos actividades independientes y específicas.

iv) Fracción Q2

El producto principal de la fracción Q2 fue la 1-Kes cuando se usó Suc como sustrato, habiéndose

formado también una cantidad significativa de 6G-Kes como único producto identificable de la 6G-

159

FFT (Figura 51). La detección de 6-Kes y bifurcosa, sugiere además la presencia de la 6-SFT.

Igualmente, se detectó un pequeño pico correspondiente a la Nys; seguramente dada por la

presencia de la 1-SST, que utiliza Suc para formar 1-Kes y posteriormente Nys. A pesar de haber

detectado actividad de Inv en la fracción Q0 (Figura 51), no se puede descartar su presencia en

esta fracción; pues en concentraciones considerables de Suc, esta enzima sintetiza los tres DP3

observados, esto es, 1-Kes, 6-Kes y 6G-Kes (Km de actividad transferasa de 220 a 300 mM). Sin

embargo, en Inv de Saccharomyces cerevisiae y de achicoria, bajo tales condiciones, el producto

favorecido de la Inv es la 6-Kes (Cairns y Ashton, 1991; Van den Ende y Van Laere, 1993),

compuesto que es sintetizado solo en menor cantidad en la fracción Q2 (Figura 51).

Cuando esta fracción fue ensayada con 1-Kes, hubo síntesis de los neofructanos, aunque en esta

ocasión la Nys fue el FOS predominante. Estos resultados dan una idea de que las actividades

6G-FFT y 1-FFT pudiesen estar en enzimas distintas. Esto es, en las fracciones Q1 y Q2 se

evidencia la presencia de ambas actividades; sin embargo, éstas presentan comportamientos

distintos bajo las mismas condiciones de reacción. Seguramente, estas fracciones contienen más

de una actividad, pero las actividades específicas están enriquecidas en cada una de dichas

fracciones proteínicas. La eficiencia en la competencia por el sustrato también debe ser

influenciado por la concentración enzimática, de acuerdo a Van den Ende et al. (1996) que

establecen que el patrón de productos formados depende de la concentración de las enzimas

presentes. Aunque es difícil saber las proporciones de ambas actividades en cada una de las

fracciones, si en la Q2 hay un enriquecimiento de la 1-FFT, aún es evidente la mayor afinidad de la

6G-FFT por la 1-Kes, que aunque en concentraciones inferiores, sintetiza cantidades

considerables de neofructanos.

v) Fracción Q3

Las fracciones Q3 a Q7 presentaron el mismo comportamiento, por lo que únicamente se muestra

el patrón de fructanos obtenidos con Q3 (Figura 51). En presencia de Suc se observó poca

actividad, hubo síntesis de 1-Kes aunque en menor cantidad comparada a las fracciones

anteriores. La Nys también se generó en poca abundancia. El uso de Suc como sustrato indica

actividad de 1-SST; sin embargo, la enzima debe estar en una concentración mucho menor. Cabe

resaltar que en estas fracciones no se detectó 6-Kes y bifurcosa, por lo que la 6-SFT no debe

estar aquí presente. El bioensayo con 1-Kes evidenció una importante actividad de 1-FFT, pues el

producto principal fue Nys, además de la formación de otros IOS. Solo pequeñas cantidades de

160

neofructanos fueron sintetizados en esta reacción, indicando remanentes de actividad 6G-FFT.

Esto además, refuerza la idea de actividades independientes de 6G-FFT y 1-FFT.


Cada una de las fracciones Q, fueron cargadas a una columna de concanavalina A. Las fracciones

eluidas con α-metil-manopiranósido provenientes de Q1 y Q2 fueron denominadas ConA-1 y

ConA-2, respectivamente. Las fracciones Q3 a Q7, que presentaron actividades enzimáticas

similares, se juntaron en una sola fracción, se cargaron en la resina de concanavalina A y la

fracción eluida se denominó ConA-3. La Figura 52 muestra los productos enzimáticos obtenidos

cuando dichas fracciones fueron ensayadas con Suc o 1-Kes.

Figura 52. Productos de la acción enzimática de las fracciones afines a concanavalina A. Las fracciones obtenidas de intercambio aniónico fueron cargadas en una columna de afinidad y fueron eluidas con α-metil-manopiranósido. La nomenclatura de los picos es como se indica en la Figura 48.

161

En la fracción ConA-1, fue fácil la identificación de la actividad 1-SST, pues en presencia de Suc,

hubo síntesis únicamente de 1-Kes y con 1-Kes como sustrato, el producto formado fue Nys. En la

fracción ConA-2, es evidente la participación de la 1-SST en la síntesis de 1-Kes; sin embargo, en

esta ocasión hubo una síntesis significativa de Nys, probablemente por la presencia de 1-FFT.

Cuando esta fracción fue ensayada con 1-Kes, hubo actividad polimerizante y síntesis de FOS

hasta DP6. Hubo formación de una cantidad significativa de Nys, siendo predominantes los

neofructanos, indicando la participación de la 6G-FFT. Finalmente, en la fracción ConA-3 se

descarta la presencia de la 1-SST o 6-SFT, pues las actividades enzimáticas contenidas en dicha

fracción no utilizaron Suc como fructosil-donador y no hubo síntesis de productos. Por otra parte,

esta fracción en presencia de 1-Kes hubo una marcada actividad polimerizante con la síntesis de

fructanos hasta DP10; el patrón de fructanos obtenidos semeja a los encontrados in planta (Figura

34). Aunque los neofructanos fueron sintetizados en este extracto, la abundancia de IOS

(identificados nistosa Nys y fructosil-nistosa I5) fue notablemente mayor que en las fracciones

anteriores, evidenciando la participación de una actividad 1-FFT. Al igual que lo observado en la

cromatografía de intercambio aniónico, un análisis de los productos de ConA-2 y -3, abre la

posibilidad de que las actividades 6G-FFT y 1-FFT co-eluyan o la presencia de ambas actividades

en una sola enzima. Como se explica en la sección anterior, la primera opción puede ser la mas

viable; sin embargo, tampoco se descarta la presencia de algún cofactor o condición presente en

la fracción ConA-3 que modifique el comportamiento de la enzima hacia una mayor afinidad por la

1-Kes y preferente síntesis de IOS.

2.2.4. ACTIVIDADES FRUCTOSILTRANSFERASAS IDENTIFICADAS EN AGAVES Y

DASYLIRION

A partir del análisis estructural de los fructanos almacenados en los tallos de agave y dasylirion, y

de las actividades identificadas en estas mismas especies, es posible deducir las FT involucradas

en el metabolismo de fructanos en estas plantas. En la Figura 53 se muestra un modelo de una vía

metabólica probablemente disponible en estas especies.

Al igual que lo reportado en otras plantas, la acumulación de Suc en la vacuola debe ser el factor

que induce la síntesis de las kestotriosas 1-Kes y 6-Kes por parte de la 1-SST y 6-SFT,

respectivamente. Sin embargo, las propiedades cinéticas de estas enzimas deben ser diferentes,

pues la preferente síntesis de 1-Kes sobre la 6-Kes indica que la 1-SST es más activa usando Suc

162

como sustrato. La 6-SFT probablemente presenta mayor actividad en la generación de moléculas

ramificadas, usando inulinas o neofructanos como sustratos.

La 1-Kes debe ser el metabolito a partir del cual se sintetizan los neofructanos por acción de la

6G-FFT, moléculas de inulina a través de la 1-FFT o fructanos ramificados cuando actúa la 6-SFT.

El que se siga preferentemente una vía metabólica en la síntesis de un tipo estructural específico,

puede depender de factores como concentración umbral de sustratos, concentración y

propiedades cinéticas de cada una de las enzimas involucradas y, muy probablemente, de

condiciones climáticas y ontogénicas, como determinantes en la inducción de los genes de estas

enzimas.

Figura 53. Modelo propuesto para la biosíntesis de fructanos en Agave y Dasylirion.

163

3. AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIAS CODIFICANTES DE ENZIMAS DEL

METABOLISMO DE FRUCTANOS DE AGAVE Y SU EXPRESIÓN EN Pichia pastoris

3.1. EXTRACCIÓN DE ÁCIDO RIBONUCLEICO (ARN)

La calidad del material genómico extraído, influye determinantemente en el éxito del aislamiento

de secuencias codificadoras; por lo tanto, se ensayaron distintos métodos de extracción de ARN

óptimo para agaves, con un tallo especialmente fibroso y alto contenido de carbohidratos. En la

Figura 54 se compara el ARN de At-G extraído con distintas metodologías. En la determinación de

la integridad y cuantificación del ARN, los electroferogramas son más sensibles y precisos que los

geles de agarosa. Los dos picos que se muestran en los electroferogramas corresponden a los

ARN ribosomales 28S y 18S, en una relación 1:1 para el caso del método de precipitación con LiCl

y de 1:2 para el método de trizol. El ARN extraído con este último método, muestra un poco de

degradación, visible como un pequeño pico al inicio del espectro. Esto mismo también fue evidente

en el gel de agarosa. La conversión de los picos en el electroferograma a bandas de un gel de

agarosa, se muestra en el panel C de la Figura 54. En la Figura 54D se muestra un gel de agarosa

correspondiente al ARN extraído con los métodos de precipitación de LiCl y Trizol

El método de elección fue el de Trizol, pues la degradación del ARN es mínima y es, además, una

metodología rápida, sencilla y principalmente de mejores rendimientos (1.15 µg/µL de Trizol vs

0.15 µg/µL de precipitación con LiCl).

3.2. AMPLIFICACIÓN DE FRAGMENTOS DE ÁCIDO DESOXIRIBONUCLEICO

COMPLEMENTARIO (ADNc) A TRAVÉS DE LA REACCIÓN EN CADENA DE LA

POLIMERASA (PCR)

Una concentración de ARN de 0.25 µg/µL de At-G fue utilizada para la síntesis de la primera

cadena de ADN complementario (ADNc), y ésta última se utilizó en la amplificación de fragmentos,

a través de una reacción de PCR usando tres diferentes combinaciones de oligonucleótidos

iniciadores. En la Figura 55A se muestran las bandas de los fragmentos amplificados con los

oligonucleótidos AtFT1 y AtFT2 (Tabla 14, Materiales y Métodos). Se observó una banda

prominente de ∼450 pb, de acuerdo al tamaño aproximado de 430 pb esperado según el

alineamiento mostrado en la Figura 27 (3.1.5. Materiales y Métodos). Se observa sin embargo, una

banda importante de ∼1300 pb, indicando una baja especificidad de esta combinación de

164

oligonucleótidos. La combinación de oligonucleótidos AtFT3 y AtFT4 produjo bandas de

aproximadamente 480 pb (Figura 55B); mientras que la combinación de oligonucleótidos AtFT1 y

AtFT4 generó los fragmentos de 610 pb (Figura 55C). Cepas de E. coli DH5α fueron

transformadas con el vector pGEM-T Easy conteniendo cada uno de los fragmentos amplificados.

Los plásmidos fueron purificados y después de la confirmación de la presencia del inserto en el

vector por análisis de restricción (Figura 56), varias bandas fueron secuenciadas.

Figura 54. Extracción de ARN. A) y B) electroferogramas de ARN extraído con el método de precipitación con LiCl y de Trizol, respectivamente; C) conversión de los electroferogramas a un gel virtual; D) visualización de bandas de ARN en un gel de agarosa. M, marcadores de peso molecular; A1 a A4, diferentes muestras de ARN extraídas con el método de precipitación con LiCl; B1 a B5, muestras extraídas con trizol; C1 y C2, ARN extraídos con el kit “RNAeasy Plant Mini” en presencia de hidrocloruro de guanidina e isotiocianato de guanidina como agentes caotrópicos, respectivamente.

165

Figura 55. Amplificación de fragmentos con oligonucleótidos degenerados. Se utilizaron tres combinaciones de oligonucleótidos según se indica. Para la secuencia de los oligos, ver Tabla 14 (Materiales y Métodos).

Las colonias blancas obtenidas con la combinación de AtFT1 y AtFT2 no presentaron crecimiento

cuando se incubaron en medio líquido LB con antibiótico, o si crecieron, el análisis de restricción

mostró la presencia de vectores vacíos.

3.3. IDENTIDAD DE LOS FRAGMENTOS AMPLIFICADOS

La secuencia de los fragmentos amplificados fue analizada y comparada en el banco de datos

disponibles en la red (www.ncbi.nhl.gov). Tres de estas secuencias presentaron alta identidad con

enzimas involucradas en el metabolismo de fructanos. La secuencia de sus ADNc y los

aminoácidos resultantes de su traducción se muestran en el Apéndice D. En la Tabla 23 se

enlistan las secuencias reportadas de enzimas involucradas en el metabolismo de fructanos y que

fueron utilizadas a lo largo de este trabajo para la comparación y caracterización de nuestras

secuencias. Los fragmentos aislados fueron alineados con las secuencias proteínicas de la Tabla

166

Figura 56. Análisis de restricción de productos amplificados con oligonucleótidos degenerados. Los plásmidos pGEM-T Easy que contienen los fragmentos amplificados fueron incubados 1.5 h a 37 °C con la enzima Eco RI. Los números en los carriles indican la colonia a partir de la cual los plásmidos fueron purificados. Las colonias 1, 2, 7, 8 son transformantes con el inserto amplificado a partir de la combinación de oligonucleótidos AtFT1 y AtFT4; las colonias 5 y 6 fueron transformadas con el producto de amplificación de AtFT3 y AtFT4. M, marcador en pb; el carril C es el control negativo (plásmido 6 sin enzima). El vector pGEM-T Easy tiene un tamaño de 3015 pb.

23. El dendograma resultante se muestra en la Figura 57, donde se observa que las FT de

monocotiledóneas se agrupan aparte de las dicotiledóneas, teniendo más homología las enzimas

con la misma función; es decir, las 6-SFT agrupan entre ellas, mientras que las 1-FFT caen en el

mismo grupo. Esto no es el caso para las FT e Inv-V del orden Asparagales, donde las Inv-V, 1-

SST y 6G-FFT se agrupan entre ellas. Una de las secuencias amplificadas de A. tequilana se

agrupó con la Inv-V de maíz (42.4%), de espárrago (73.6%) y de cebolla (99.1%), con la que

presentó la mayor homología, por lo que a esta secuencia se le denominó At-InvV. Otra secuencia,

agrupó con las 6G-FFT de espárrago (64.3%) y cebolla (62.4%) y fue denominada At-FT.

Finalmente, la tercera secuencia presentó una homología de ~70% con CWI de cultivos como

arroz, maíz, papa, zanahoria y jitomate; su homología con las FEH presentan un rango de 58 al

65% y una homología todavía inferior se observó con algunas FT como 6-SFT de Poa secunda

(43%) y 6G-FFT de cebolla (42%). Esta secuencia fue denominada At-FEH.

Van den Ende et al., (2002) discuten el origen polifilético de las Inv-V y FT a partir de una Inv

ancestral. De acuerdo a estos autores, una repetida duplicación de esta Inv debió dar origen, de

manera independiente, a tres tipos de enzimas vacuolares: i) Inv-V de dicotiledóneas, ii) FT de

dicotiledóneas e iii) Inv-V y FT de monocotiledóneas. Una Inv poco evolucionada pudo haber dado

origen a las FT antes de la divergencia de mono- y di-cotiledóneas, que posteriormente evolucionó

a las FT de dicotiledóneas; esto justifica el agrupamiento de FT de dicotiledóneas con Inv-V de

167

Tabla 23. Secuencias de enzimas relacionadas con el metabolismo de fructanos. Enzima Especie * pI No. aminoácidos No. Accesión

banco de datos Abreviatura

1-SST Cichorium intybus D 5.12 640 U81520 Ci-1SST 1-SST Taraxacum officinale D 4.97 632 AJ250634 To-1SST 1-SST Helianthus tuberosus D 5.03 630 AJ009757 Ht-1SST 1-SST Cynara scolymus D 5.36 637 Y09662 Cs-1SST 1-SST Allium cepa M 5.03 623 CAA06838 Ac-1SST 1-SST Allium sativum M 5.43 623 AY098442 As-1-SST 1-SST Festuca arundinacea M 4.74 654 AJ297369 Fa-1SST 1-SST Lolium perenne M 5.20 653 AY245431 Lp-1SST 1-SST Triticum aestivum M 4.91 662 AB159786 Ta-1SST 6-SFT Agropyron cristatum M 5.64 623 AF211253 Acr-6SFT 6-SFT Poa secunda M 5.45 618 AF192394 Ps-6SFT 6-SFT Lolium temulentum M 4.95 625 AJ532550 Lt-6SFT 6-SFT Lolium perenne M 5.11 623 AF494041 Lp-6SFT 6-SFT Hordeum vulgare M 5.18 625 X83233 Hv-6SFT 6-SFT Triticum aestivum M 5.24 616 AB029887 Ta-6SFT 1-FFT Cichorium intybus D 4.97 617 U84398 Ci-1FFT 1-FFT Helianthus tuberosus D 4.95 615 AJ009756 Ht-1FFT 1-FFT Cynara scolymus D 4.95 615 AJ009756 Cs-1FFT 1-FFT Echinops ritro D 4.92 608 AJ811624 Er-1FFT 1-FFT Viguiera discolor D 4.77 609 AJ811625 Vd-1FFT 1-FFT Lolium perenne M 5.57 670 AY082350 Lp-1FFT2 1-FFT Lolium perenne M 4.85 648 AF481763 Lp-1FFT1 1-FFT Triticum aestivum M 4.91 648 AB088409 Ta-1FFa 1-FFT Triticum aestivum M 4.99 644 AB088410 Ta-1FFTb

6G-FFT Allium cepa M 5.46 612 Y07838 Ac-6GFFT 6G-FFT Asparagus officinalis M 5.56 610 AB084283 Ao-6GFFT 6G-FFT Lolium perenne M 4.84 645 AF492836 Lp-6GFFT

Inv Daucus carota D 5.06 661 X75352 Dc-Inv Inv Allium cepa M 4.94 690 AJ006067 Ac-Inv Inv Asparagus officinalis M 4.88 662 AF002656 Ao-Inv Inv Tulipa gesneriana M 5.05 628 X95651 Tg-Inv Inv Zea mays M 4.96 670 U16123 Zm-Inv

1-FEH I Cichorium intybus D 7.06 568 AJ242538 Ci-1FEH I 1-FEH IIa Cichorium intybus D 5.32 581 AJ295033 Ci-1FEH IIa 1-FEH IIb Cichorium intybus D 5.32 581 AJ295034 Ci-1FEH IIb

1-FEH Campanula rapunculoides D 5.13 578 AJ509808 Cr-1FEH 1-FEH Triticum aestivum D 4.9 597 AJ516025 Ta-1FEHa 1-FEH Triticum aestivum D 4.9 596 AJ508387 Ta-1FEHb 6-FEH Triticum aestivum D 7.06 598 AM075205 Ta-6FEH 1-FEH Hordeum vulgare M 5.06 599 AJ605333 Hv-1FEH 6-KEH Triticum aestivum M 4.92 587 AB089270 Ta-6KEH 6-FEH Beta vulgaris D 4.98 606 AJ508534 Bv-6FEH CWI Arabidopsis thaliana D 9.10 589 NM_112232 Ath-CWI CWI Nicotiana tabacum D 9.12 580 X81834 Nt-CWI CWI Triticum aestivum M 9.00 584 AF03042 Ta-CWI

*D, dicotiledónea; M, monocotiledónea

168

Figura 57. Dendograma de secuencias alineadas de fructosiltransferasas. En negrillas y subrayadas se resalta las secuencias amplificadas con los oligonucleótidos degenerados usando ADNc de A. tequilana como templado. Las abreviaciones son como se indica en la Tabla 23. El número refiere a la distancia de similitud.

monocotiledóneas que no sintetizan fructanos, como el arroz (Oriza sativa). Por otra parte, las Inv-

V y FT de monocotiledóneas pudieron haberse originado una vez que la Inv ancestral divergió en

mono- y dicotiledóneas; esto explica por qué, por ejemplo, la 1-SST de cebolla tiene mayor

homología con la Inv que le dio origen (Inv de cebolla) que a otras 1-SST de dicotiledóneas. La

explicación de esta evolución puede ser clave para entender la diversidad enzimática en

monocotiledóneas comparada con un metabolismo más simple en las especies dicotiledóneas.

La secuencia At-FEH se agrupó con las FEH y otras Inv-CW. Su identidad como FEH puede

verificarse por la presencia de dominios característicos para este tipo de enzimas. Casi al inicio de

la secuencia amplificada se identificó el triplete WIN (Figura 58), característico de las Inv ácidas de

origen vegetal (Inv-V y Inv-CW) (Gallagher et al., 2004).

169

At-FEH ----YHFQPPRNWINDPNGPMYYNGIYHLFYQYNPYGAVWG----NIVWAHSVSTDMINWKALEPAIYPSKPFDVNGCWSGSATILPGN-KPAILYTGIDPQNR—QVQNIAFPKNLSDPYLREW 117

At-Inv ------------------------------------------------WGHAVSRDLVHWTHLPLAMVPDQWYDINGVWTGSATILPDG-QIVMLYTGAT—NESVQVQNLAVPADQSDTLLLRW 77

At-FT ----YHFQPPRYFMSDPSGPVYYKGWYHFFYQHNAKAAFWG----NIAWGHAASRDLLNWVHLPLAVEPDHWYDIEGDWTGSVAVLPDG-RVIMLFTGGTGANELAQVVNLAVAADPSGPLLMEW 117

Ci-1SST QRSAYHFQPDKNFISDPDGPMYHMGWYHLFYQYNPESAIWG----NITWGHSVSRDMINWFHLPFAMVPDHWYDIEGVMTGSATVLPNG-QIIMLYTGNA—YDLSQLQCLAYAVNSSDPLLLEW 225

Ht-1SST QRSTYHFQPDKNFISDPDGPMYHMGWYHLFYQYNPQSAIWG----NITWGHSVSKDMINWFHLPFAMVPDHWYDIEGVMTGSATVLPNG-QIIMLYSGNA—YDLSQVQCLAYAVNSSDPLLIEW 213

Ac-1SST QRTGYHFQPPNHFMADPNAAMYYKGWYHFFYQYNPNGSAWDY---SISWGHAVSKDMIHWLHLPVAMVPDHWYDSKGVWSGYATTLPDG-RIIVLYTGGT—DQLVQVQNLAEPADPSDPLLIEW 203

Ta-1SST QWQRTGYHFQPDKYYQNDPNGPVYYGGWYHFFYQYNPSGSVWEP-QIVWGHAVSKDLIHWRHLPPALVPDQWYDIKGVLTGSITVLPDG-KVILLYTGNT—ETFAQVTCLAEPADPSDPLLREW 242

Acr-6SFT QRSSYHFQPAKNYMSDPDGLLYYGGWYHMFYQYNPVGTDWAD---GMAWGHAVSRNLVQWRTLPIAMKPDQWYDILGVLSGSVTVLPNG-TVIMLYTGATN-DWYVEATCLALPADPNDPLLRRW 207

Hv-6SFT QRSGYHFQTAKNYMSDPNGLMYYRGWYHMFYQYNPVGTDWDD---GMEWGHAVSRNLVQWRTLPIAMVADQWYDILGVLSGSMTVLPNG-TVIMIYTGATN-ASAVEVQCIATPADPNDPLLRRW 206

Cs-1FFT ERTAFHFQPAKNFIYDPNGPLFHMGWYHLFYQYNPYAPFWG----NMTWGHAVSKDMINWFELPIALAPTEWYDIEGVLSGSTTILPDG-RIFALYTGNT—NDLEQLQCKAVPVNASDPLLVEW 208

Ci-1FFT ERTAYHFQPAKNFIYDPNGPLFHMGWYHLFYQYNPYAPIWG----NMSWGHAVSKDMINWFELPVALTPTEWYDIEGVLSGSTTALPNG-QIFALYTGNA—NDFSQLQCKAVPLNTSDPLLLEW 209

Lp-1FFT QRTGFHFQPEKNWMNDPNGPVYYKGWYHLFYQYNPEGAIWGN---KIAWGHAVSRDMLRWRHLPIAMFPDQWYDINGAWSGSATVLPDG-RIVMLYTGST—NASVQVQCLAFPSDPSDPLLTNW 245

Ac-6GFT QRCGFHFRTVRNYMNDPSGPMYYKGWYHLFYQHNKDFAYWG----NITWGHAVSRDLINWQHLPVAVGPDHWYDISGVWTGSIIVVSED-RVVMLFTGGT—KSFDQSINLAEAADPSDPLLLKW 190

Ao-6GFFT QRAGFHFRTVKNYMNDPSGPMYYKGWYHLFYQHNPNYAYWG----DISWGHAVSRDLLNWFHLPVAVKPDRWYDIYGVWTGSITVMPDDGRVVMLYTGGT—KEKYQIMSVAMAADPSDPLLVEW 187

Ac-Inv QRTGFHFQPVKNWMNDPNGPLYYKGWYHFFYQYNPEGAVWG----NIAWGHAVSRDLVHWTHLPLAMVPDQWYDINGVWTGSATILPDG-QIVMLYTGAT—NESVQVQNLAVPADQSDTLLLRW 269

Ao-Inv QRTGFHFQPEKNWMNDPNGPLYYKGWYHFFYQYNPNAAVWG----DIAWGHAVSKDLLSWRHLPLAMVPDRWYDINGVWTGSATILPDG-RIIMLYTGAT—NESVQVQNLAVPADLSDPLLLEW 237

Dc-Inv QRTSFHFQPQENWMNDPNGPLFHMGWYHLFYQYNPDSAIWG----NITWGHAISRDLINWLHLPFAMQPDQWYDINGVWTGSATILPDG-KIVMLYTGDT—DDLVQVQNLAYPANLSDPLLLDW 250

Zm-Inv LRTGYHFQPPKNWINDPNAPMYYKGWYHFFYQYNPKGAVWG----NIVWAHSVSRDLINWVALEPALRPSIPGDRYGCWSGSATVLPDGGGPVIMYTGVDHPDINYQVQNVAYPKNVSDPLLREW 173

Ci-1FEH YRTGFHFQPPKNWINDPNGPMYFNGVYHLFYQYNPYGPLWG----NISWGHSISYDLVNWFLLEPALSPKEPYDINGCLSGSATILPGP-RPIILYTGQDVNNS—QVQNLAFPKNLSDPLLKEW 161

Cr-1FEH YRTGYHFQPPQNWMNDPNGPMYYKGVYHFFYQYNPNGPLFGD---IMIWGHSVSYDLVNWIHIDPAIYPTDPADINSCFSGSATFLPGY-KPVMLYTGLDTEKR—QVQNLAVPKNLSDPFLREW 166

Lp-FEH YRTAYHFQPPKNWINDPNGPMYYNGIYHEFYQYNPNGSLWG----NIIWGHSVSTDLINWIPVEPAIERDIPSDISGCWTGSATIISGD-QPIIIYTG-ADKENR-QLQNIVLPKNKSDPYLREW 163

Hv-1&6FEH YKTAFHFQPAKNWMNDPSGPMYFNGIYHEFYQYNLNGPIFG----DIVWGHSVSTDLVNWIGLEPALVRDTPSDIDGCWTGSVTILPGG-KPVIIYTG-GNIDQH-QTQNIAFPKNRSDPYLREW 183

Ta-6KEH YRTAYHLQPPKNWINDPCGPMYYNGIYHEFYQYNPDGSFNPNTSYNIVWGHSVSTDLVNWITLEPAIEPDTPNDIKGCWSGSATIVSGD-QPVIIYTGVIDIEKH-QVQNIALPKNRSDPYLREW 177

Bv-6FEH YRTAYHFQSPKNWMNDPNGPMIYKGIYHLFYQYYPYDPVWHT---EIVWGHSTSTDLINWTQQPIALSPSEPYDINGCWSGSITILPQN-KPVILYTGINNKNY—QVQNLALPKNLSDPYLKEW 176

Ta-CWI LRTGYHFQPPKHWINDPNGPMYYKGLYHLFYQYNPKGAVWG----NIIWAHSVSTDLVDWVALEPGIYPSKPFDINGCWSGSATILPNG-VPVIMYTGIEPKET—PSAERRVPGQPLRPFLRKW 162

Zm-CWI LRTGYHFQPPMNWINDPNAPLYYKGWYHLFYQYNPKGAVWG----NIVWAHSVSRDLINWVALEPAIYPSIPSDKYGCWSGSATILEDG-TPAILYTGIDRADINYQVQVLALPKDASDPLLREW 173

.. . . . . *.*: * ::: * .: * . :* : :::* . : . * *

170

At-FEH VKP-DYNPIIA---PV-NGINASAFRDPTTAWHGPD-GHWRLVIGSKRK----HRGMAIMYRSRDFINWIRAKHPLHSANG-TGMWECI---------- 192

At-Inv KKSE-ANPILV----PPPGIGDKDFRDPTTAWYEPSDDTWRIVIGSKDS---SHSGIAIVYSTKDFINYKLIPGILH-AVERVGMWECV---------- 154

At-FT IKYDA-NPVLH----PPRGIGLKDFRDPNPVWYNSLESTWYVVAGSKNDSL-SHTGIALVYTTKDFLSYTLLPGVLH-AVDIVGMWECV---------- 198

Ci-1SST KKYEG-NPILF----PPPGVGYKDFRDPSTLWMGP-DGEWRMVMGSKHNETI---GCALVYRTTNFTHFELNEEVLH-AVPHTGMWECVDLYPVSTTHT 326

Ht-1SST KKYEG-NPVLL----PPPGVGYKDFRDPSTLWSGP-DGEYRMVMGSKHNETI---GCALIYHTTNFTHFELKEEVLH-AVPHTGMWECVDLYPVSTVHT 314

Ac-1SST KKSNG-NPILM----PPPGVGPHDFRDPFPVWYNESDSTWHMLIGSKDD---NHYGTVLIYTTKDFETYTLLPDILHKTKDSVGMLECVDLYPVATTGN 310

Ta-1SST VKHPA-NPVVF----PPPGIGMKDFRDPTTAWFDESDGTWRTIIGSKNDSD--HSGIVFSYKTKDFLSYELMPGYMYRGPKGTGEYECIDLYAVGGGRK 346

Acr-6SFT TKHPA-NPIIW----SPPGIGTKDFRDPMTPWYDDSDHTWRTLFGSKDDHHGHHDGIAIMYKTKDFLNYELIPGILHRVEN-TGEWECIDFYPVGGGG- 307

Hv-6SFT TKHPA-NPVIW----SPPGVGTKDFRDPMTAWYDESDETWRTLLGSKDDHDGHHDGIAMMYKTKDFLNYELIPGILHRVVR-TGEWECIDFYPVGRRS-- 302

Cs-1FFT VRYDA-NPILY----APSGIGLTDYRDPSTVWTGP-DGKHRMIIGTKRNTT----GLVLVYHTTDFTNYVMLDEPLH-SVPNTDMWECVDLYPVSTTNDS 308

Ci-1FFT VKYEN-NPILF----TPPGIGLKDYRDPSTVWTGP-DGKHRMIMGTKINRT----GLVLVYHTTDFTNYVMLEEPLH-SVPDTDMWECVDLYPVSTINDS- 309

Lp-1FFT TKYEG-NPVLY----PPPHVGEKDFRDPTTAWYDGSDGMWRIVIGSKDNRR---AGMALTYKTKNFHDFELVPGVLHRVPA-TGMWECIDLYPVGGARGID 353

Ac-6GFT IKYDN-NPILW----PPPGIVRDDFRDPNPIWYNASESTYHIVVGSKNDSL-QHTGIALVYLTKDFKKFDLLPTVLH-SVDKVGMWECVEVYPVATTGPL- 302

Ao-6GFFT VKYDEVNPVLR----PPPGIGLTDFRDPNPIWYNTTDSTWQLVIGSKNDSL-QHTGIAMVYTTKDFINLTLLPGVLH-SVDHVGMWECVDLFPVASSGPL- 297

Ac-Inv KKSE-ANPILV----PPPGIGDKDFRDPTTAWYEPSDDTWRIVIGSKDS---SHSGIAIVYSTKDFINYKLIPGILH-AVERVGMWECVDFYPVATADSSH 376

Ao-Inv TKVDDANPILV----PPPGVGATDFRDPTTAWFEPSDSTWRIAIGTKDA---DHSGVALVYSTKDFLNYTLLPGTLH-TVKHVGMWECIDFYPIATSGAG- 344

Dc-Inv IKYPD-NPVMF----PPPGIGSTDFRDPTTAWIGP-DGKWRITIGSKVNKT----GISLMYKTTDFITYELLDNLLH-AVPGTGMWECVDFYPVSVTVSN- 350

Zm-Inv VKP-SHNPVIV---PE-GGINATQFRDPTTAWRGPGPEQWRLLVGSAAGSS-PPRGVAYVYRSRDFRRWRRVRRPLHSAP--TGMWECPDFYPVSKGGAPR 282

Ci-1FEH IKW-SGNPLLT--PVDD--IKAGQFRDPSTAWMGPD-GKWRIVIGSEID----GHGTALLYRSTNGTKWIRSKKPLHFSSK-TGMWECPDFYPVTNGDKKG 261

Cr-1FEH VKH-KANPIMT-TPEG---VKADDFRDPSTAWLGYD-GKWRVLVGSKKN----DLGVAYLYQSKDFVKWERFDYPLMSMME-TSTWECPDFFPVSVSSTNG 267

Lp-FEH TKA-GNNPVIQ---PVGPGLNASQFRDPTTGWIGPD-GLWRIAVGAELN----GYGAALLYKSQDFLNWTRVDHPLYSSNA-SSMWECPDFFAVLPGNSGG 265

Hv-1_6FEH IKA-ANNPVLR---PDEPGMNVIEFRDPTTGWIGPD-GHWRMAVGGELN----GYSAALLYKSEDFLNWTKVDHPPYSHNG-SNMWECPDFFAALPGNNGG 285

Ta-6KEH TKA-GNNPVIQ---SGVPGLNSGQFRDPTTGWIGPD-GLWRIAVGAQLN----GYGAALLYKSEDFLNWTRVDHPLYSSNA-SIMLECLDFFAVLPGSNNG 280

Bv-6FEH IKL-PQNPLMAGTPTNNNNINASSFRDPSTAWQLSD-GKWRVIVGTQQG----KRGLAVLFTSDDFVKWNNTGNPLHSTEG-NGIWECPDFFPVYVGKSLG 280

Ta-CWI VKP-DYNPIIN---PD-HGINASAFRDPTTAWYGPD-GHWRLVVGSKEN----MRGIAVLYRSRDFRRWIKAHHSLHAG-L-TGMWECPDFYPVAVAGGRR 271

Zm-CWI EKPEEYNPVAT---PAAGGINATQFRDPTTAWRHAG--HWRMLVGSVRG----ARGMALVYRSRDFRKWTKAKHPLHSAAL-TGMWECPDFFPVS-GPGLQ 275

: **: : :*** . * * . : : : **

Figura 58. Alineamiento de los fragmentos amplificados de A. tequilana con enzimas relacionadas al metabolismo de fructanos. Se

muestra únicamente el alineamiento en la región donde el ADNc fue amplificado. *, indica que los residuos son idénticos; :, indica que hay

una sustitución conservada y ., indica la existencia de un sustitución semi-conservada. Las abreviaturas son como se indica en la Tabla 23.

171

En este triplete, muchas veces la isoleucina es intercambiada por metionina (WMN) y aunque no

hay evidencias de su importancia en la funcionalidad de este tipo de enzimas, también se

encuentra conservada en las FEH reportadas hasta ahora (Figura 58). Este dominio no se

encuentra en las FT vegetales, a excepción de la 1-FFT de L. perenne (WMN). Se mantiene

conservada la presencia de un residuo aromático (el triptófano puede ser sustituido por tirosina o

fenilalanina), cuya importancia en la estabilidad de la estructura enzimática ha sido sugerida. La

presencia de este dominio es por lo tanto, importante para diferenciar las FT de actividades β-

fructofuranosidasas. At-FT presentó en esta región un triplete FMS, descartando su acción β-

fructofuranosidasa; desafortunadamente, el fragmento At-Inv no fue amplificado en esta región.

Un par de aminoácidos río arriba de este tripéptido, se encuentra el denominado motivo β-

fructosidasa, indicado en la Figura 58 en itálica y subrayado. Este dominio también es altamente

conservado en Inv como una secuencia NDPNG, pudiendo ser diferente o no en las FT y FEH. El

fragmento At-FEH presenta una secuencia NDPNG en esta región, en tanto que el pentapéptido

SDPSG, identificado en At-FT, nos permite afirmar que esta secuencia no corresponde a una Inv o

FEH, sino más bien a una FT. Esta región no fue amplificada en At-Inv, la cual presentó una mayor

homología con las Inv.

Otro dominio que se considera importante, es el pentapéptido WEC[P/V]D. Esta secuencia es útil

para diferenciar InvV de CWI, pues en el primer caso, este motivo conserva la valina, que es

intercambiada por prolina en el caso de las CWI. Las secuencias At-FT y At-Inv conservan el

motivo WECV, presente además en las FT, reforzando la idea de que este tipo de enzimas ha

evolucionado a partir de Inv-V ancestrales y no de CWI. Curiosamente, At-FEH presentó en este

sitio una secuencia WECI. Este cambio de isoleucina por valina también se observa en la 1-SST

de trigo, la 6-SFT de cebada y Agropyron crystatum e Inv-V de espárrago. El motivo WECI en At-

FEH difiere al conservado WECPD de CWI y las demás FEH, comprometiendo quizá su identidad

como FEH. Sin embargo, la 6-KEH también presenta un motivo bastante disímil al resto de las β-

fructofuranosidasas (LECLD). Goetz y Roitsch (1999), mostraron por mutagénesis sitio dirigida,

que un cambio de prolina por valina en la secuencia de CWI de Chenopodium rubrum

(Amaranthaceae), es suficiente para ajustar el pH óptimo de la actividad Inv a valores más básicos

(de 3.75 a 4.4), semejantes al pH óptimo de las Inv-V, así como la especificidad de su sustrato

(reducción importante de hidrólisis de la rafinosa). Estos autores discuten que este efecto puede

ser explicado, por la influencia que estos residuos (prolina o valina) pueden tener en la orientación

172

del grupo tiol en el residuo de cisteína conservado en el dominio EC contiguo (marcado con una

flecha ↓ en la Figura 58), así como su valor de pKa, esencial para su función de catalizador ácido-

base en el ataque nucleofílico a la Suc. Esto abre la posibilidad de determinar el pH óptimo de

catálisis de la 6-KEH y comprobar si este dominio está involucrado en la alta especificidad de su

actividad.

3.4. AMPLIFICACIÓN DEL ADNc COMPLETO DE LA FRUCTOSILTRANSFERASA (atft)

3.4.1. AMPLIFICACIÓN DE LOS EXTREMOS TERMINAL 5´ Y 3´

En la Figura 59 se muestra la estrategia que se siguió para obtener el ADNc completo de atft. A

partir de la secuencia obtenida con los oligonucleótidos degenerados, se diseñaron

oligonucleótidos altamente específicos para amplificar cada uno de los extremos (5´- y 3´-AtRACE,

Tabla 14). Estas secuencias se marcan en negrillas en la Figura 59. Los ADNc reportados para

otras FT y FEH, tienen una longitud promedio ligeramente mayor a 2 kb, por lo que en atft se

espera un fragmento aproximado de 1300 a 1500 pb para el extremo 3’ y de 600 a 800 pb para el

extremo 5’.Para evitar la interferencia de ARNm truncados, el ARN total se digirió con fosfatasa

intestinal de carnero (CIP) para hidrolizar estos ARN incompletos. Después de una purificación, la

mezcla fue tratada con fosfatasa ácida de tabaco (TAP), la cual hidroliza la estructura CAP en el

extremo 5´ de los ARNm, dejando expuestos sus grupos fosfatos que se aprovecharon para el

acoplamiento de una secuencia adaptadora a través de una ARN ligasa (Figura 59A, Tabla 14).

Por su parte, para el éxito del aislamiento del extremo 3', se enriqueció la fracción de los ARNm

con una resina de poli-A.

Figura 59. Amplificación rápida de los extremos del ADNc de atft mediado por la RNA ligasa (RACE). A) Estrategia seguida para la obtención del ADNc completo: i) La secuencia peptídica obtenida con los oligonucleótidos degenerados; a partir de ésta se diseñaron los oligonucleótidos gene específico para amplificar los extremos 5' y 3' (OGE 5' y 3'); ii) Representación del ADNc completo; la caja rayada indica la posición de la secuencia conocida y las cajas negras representan las secuencias por amplificar; iii) Integración de adaptadores a los extremos 5' y 3' del ADNc. A partir de sus secuencias se usaron oligonucleótidos para amplificar, junto con los OGE 5' y 3', el ADNc completo. Las flechas continuas indican las secuencias de los oligonucleótidos externos y las discontinuas la de los oligonucleótidos internos (PCR anidado). La región común entre los extremos 5´ y 3´ contiene un sitio Bsh TI (5´-A↓CCGGT-3´) indicado con una punta de flecha en i). B) Productos de amplificación de los extremos 5' y 3' del ADNc atft. C) Análisis de restricción de las construcciones p-GEM-T At3´- y At5´RACE que contienen los extremos amplificados; los plásmidos fueron digeridos con Not I (5´-GC↓GGCCGC-3´). Los números indican el número de clon; C, digestión control (sin enzima); M, marcador.

173

174

En la transcripción reversa de estos ARNm, se utilizó un templado de oligo-dT acoplado a una

secuencia adaptadora, de tal manera que el extremo 3´ de los ADNc recién sintetizados,

contuviera una secuencia conocida. Los oligonucleótidos 5'- y 3'-RACE, suministrados por la casa

comercial Ambion y diseñados a partir de las secuencias de los adaptadores (Tabla 14), fueron

utilizados junto con los oligonucleótidos gen-específicos 5´- y 3´-AtRACE, respectivamente, para

amplificar los extremos correspondientes. En la Figura 59B se muestran los productos de

amplificación obtenidos por PCR. Para el extremo 3’ se obtuvo una sola banda de

aproximadamente 1800 pb; mientras que para el extremo 5’ se observó una banda prominente de

750 pb y dos bandas adicionales de menor tamaño e intensidad, posiblemente debidas a una

amplificación inespecífica.

Las bandas de tamaño esperado fueron purificadas y ligadas, de manera independiente, en el

vector pGEM-T Easy. Las construcciones pGEM-T At3´RACE y pGEM-T At5´RACE así obtenidas,

se utilizaron para la transformación de células competentes de E. coli DH5α. Se hizo un escrutinio

de colonias blancas, purificación de plásmidos y análisis de restricción para verificar la presencia

del inserto en el vector (Figura 59C). Los plásmidos que liberaron el inserto del tamaño esperado

al ser digeridos con Not I (5´-GC↓GGCCGC-3´) fueron secuenciados. Estas nuevas secuencias

alinearon perfectamente con las provenientes de los oligonucleótidos degenerados. En el extremo

3’ se identificó la región poli-T (Apéndice D). En la región común a ambas secuencias se encontró

un sitio de restricción Bsh TI (5´-A↓CCGGT-3´), único en la secuencia completa y no presente en

el vector. Este sitio fue aprovechado posteriormente para la ligación de ambos fragmentos.

3.4.2. DETERMINACIÓN DE LA ORIENTACIÓN DE LOS INSERTOS EN EL VECTOR

La zona donde se empalman las secuencias At5´- y At3´-RACE comprende una región de 168 pb,

donde se identificó el sitio Bsh TI 15 pb río arriba de esta zona de traslapamiento. Esta enzima

junto con Sal I (5´-G↓TCGAC-3´), que presenta un sitio de corte único dentro de la zona de

clonación múltiple del vector pGEM-T Easy, se utilizó para determinar la orientación de los insertos

en el vector. En la Figura 60A y 60B se muestran las dos probables orientaciones para los insertos

At5´- y At3´-RACE, respectivamente. Si el inserto At5´-RACE tuviera una orientación 5´→ 3´, una

doble digestión con Sal I y Bsh TI produciría un fragmento pequeño de ∼170 pb y uno mayor de

∼3595 pb; mientras que si la orientación fuese inversa 5´← 3´, la doble digestión daría un

175

Figura 60. Orientación de los insertos At5´- y At3´-RACE en el vector pGEM-T Easy. A) y B) Las dos posibles orientaciones de los insertos At5´- y At3´-RACE, respectivamente, se indican los tamaños teóricos (pb) de las bandas esperadas después de una doble digestión con Sal I y Bsh TI; C) Análisis de restricción de las clonas 20 y 12 con las construcciones pGEM-T At5´-RACE y At3´-RACE, respectivamente. DD, doble digestión (Sal I/Bsh TI); SP6 y T7, son regiones promotoras en el vector pGEM-T Easy.

176

fragmento de ∼600 pb y otro de ∼3165 pb. Respecto al fragmento At3’-RACE, una orientación 5’

→ 3’ se evidenciaría por la presencia de una banda de ∼1800 pb y otra de ∼3015 pb. En el caso

de que el inserto tuviese una orientación inversa, 5’ ← 3’, la digestión debería producir una banda

de ∼4785 pb y otra, no visible, de apenas ∼30 pb.

Distintas clonas fueron analizadas por restricción. En la Figura 60C se muestran los productos de

digestión de las construcciones pGEM-T At5´-RACE y -At3´-RACE cuando éstos fueron incubados

de manera independiente con la enzima Sal I, Bsh TI o ambas en una doble digestión. Cuando se

utilizó una sola de las enzimas, se observa al vector linealizado. La doble digestión en el vector

pGEM-T At5´-RACE produjo una banda cercana a las ∼700 pb y otra superior a las 3000. En la

doble digestión de pGEM-T At3´-RACE, se observó la presencia de una banda de ∼ 1700 pb y otra

superior a las 3000 pb. Con la anterior se concluye que el inserto At5´-RACE tiene una orientación

5´← 3´, mientras que la orientación del inserto At3´-RACE es 5´ → 3´.

3.4.3. LIGACIÓN DEL ADNc COMPLETO DE atft

La estrategia que se siguió para la ligación de los extremos At5´- y At3´-RACE se muestra en la

Figura 61. El plásmido pGEM-T At5´-RACE fue digerido con las enzimas Not I y Bsh TI. Not I corta

en ambos extremos del vector y Bsh TI dentro del inserto; por lo que se obtuvieron tres bandas:

una banda 1) de 3015 pb correspondiente al vector, una banda 2) de 600 pb y una banda 3) más

pequeña de 150 pb. Estas dos últimas, corresponden al inserto digerido y contienen en sus

extremos, terminaciones cohesivas con sitios Not I y Bsh TI en sentido 5´→ 3´ para la banda 2) y

en dirección opuesta para la secuencia 3).

Por otra parte, el plásmido pGEM-T At3´-RACE fue digerido con las enzimas Bsh TI y Sal I. Esta

última enzima, corta solo en un extremo del vector, por lo que los productos obtenidos de esta

digestión fueron un fragmento 4) de ∼3030 pb, que corresponde al vector (3015 pb) más un

pedazo del inserto y un fragmento 5) de ∼1800 pb. Ambos fragmentos tienen en sus extremos,

terminaciones cohesivas Bsh TI y Sal I (Figura 61).

Las bandas 2, 4 y 5 se eluyeron y purificaron del gel (Figura 62A). Posteriormente, la banda 4 se

digirió con la enzima Not I, para eliminar de esta manera, los 15 pb correspondientes al extremo

5´de la zona de sobrelapamiento (banda 4*). Además con esta digestión, el vector (banda 4*)

contiene ahora en sus extremos 5´ y 3´, las terminaciones Not I y Sal I, respectivamente. Este

vector se cortó, eluyó y purificó. Finalmente, usando la enzima T4 ADN ligasa, el vector (banda

177

4*), con extremos Not I y Sal I, se ligó con el fragmento 2 (terminación Not I y Bsh TI) y con la

banda 5 (terminación Sal I y Bsh TI). Esto hace posible una sola dirección en la ligación y asegura

la correcta orientación de los fragmentos At5´- y At3´-RACE junto con el vector pGEM-T Easy. El

plásmido pGEM- T atft, obtenido de esta manera, fue utilizado para la transformación de células de

E. coli DH5α.

Figura 61. Estrategia de clonación para la obtención del plásmido pGEM-T atft. Las bandas 2, 4 y 5, productos de digestión de los plásmidos pGEM-T At5´-RACE y At3´-RACE, fueron ligadas para la obtención de pGEM-T atft, que contiene el ADNc completo de la fructosiltransferasa aislada de A. tequilana.

178

Figura 62. Digestión y análisis de restricción. A) Distintas clonas del plásmido pGEM-

T At5´RACE digeridas con Not I y Bsh TI; clonas del plásmido pGEM-T At3´RACE

digeridas con Sal I y Bsh TI; el vector pGEM-T que contiene 15 pb de la región

empalmada (proveniente de la digestión de At3´-RACE) digerido con Not I; B) Análisis

de restricción de distintas clonas del plásmido pGEM-T atft digeridas con Not I.

La Figura 62B muestra un análisis de restricción donde se evidencia la presencia de un inserto

mayor a 2 kb cuando el plásmido es digerido con la enzima Not I. Tres clonas fueron utilizadas

para la purificación de plásmidos y confirmar su identidad por secuenciación.

3.5. ANÁLISIS DE LA SECUENCIA atft

El ADNc atft presenta una longitud de 2226 pb, incluyendo las 96 y 222 bases en las regiones 5´- y

3´-UTR (untranslated region), respectivamente. En el Apéndice D se muestra la secuencia y su

traducción teórica. Se observa la región poli-A en el extremo 3´ y los codones subrayados y en

negrilla, indican el inicio (ATG) y terminación (TGA) de la traducción. En la región 5´-UTR, en

negrillas, se indica un pequeño marco de lectura (ORF) que precede al ORF de atft. Esta

secuencia codifica un péptido de 22 aminoácidos, cuya función es difícil de precisar.

La secuencia atft consta de un marco de lectura abierta de 1905 pb, que codifica para una

proteína de 635 aminoácidos, con una masa molecular teórica de 69.9 kDa y un pI de 5.38. Los

aminoácidos de naturaleza hidrofóbica (alanina, isoleucina, leucina, fenilalanina, triptófano y

valina) predominan en un 37.63%, seguido de aminoácidos polares (asparagina, cisteína,

glutamina, tirosina, serina y treonina) con un 24.72%, aminoácidos ácidos (ácidos aspártico y

glutámico) con el 11.33% y finalmente, aminoácidos básicos (lisina y arginina) con el 7.87%.

La relación filogenética de AtFT con otras enzimas del metabolismo de fructanos se observa en el

árbol filogenético sin raíz de la Figura 63; su análisis evidencia tres principales ramificaciones. En

179

el grupo I y II se agrupan las FT de mono- y di-cotiledóneas, respectivamente; mientras que en un

tercer grupo más distante se observan las enzimas FEH. AtFT comparte aún una mayor

homología con las 6G-FFT de espárrago (69%) y cebolla (68%), quienes junto con las 1-SST de

cebolla y ajo (identidad del 65 y 68%, respectivamente) forman el subgrupo Ia, correspondiente a

las FT de miembros Asparagales. Varias Inv-V de monocotiledóneas también presentan alta

identidad con AtFT: cebolla y espárrago (65%), tulipán (60%), además de Inv-V de especies que

no sintetizan fructanos, tales como arroz y caña de azúcar (60%).

Figura 63. Árbol filogenético sin raíz de enzimas del metabolismo de fructanos. Las

secuencias analizadas corresponden a proteínas inmaduras traducidas a partir de su

ADNc. Las secuencias fueron alineadas con el programa clustal W

(http//www.ebi.ac.uk/clustalW) y el programa TREEVIEW fue utlizado para crear el

árbol filogenético.

180

AtFT es menos similar a la 6G-FFT de L. perenne (54%), quien junto con otras FT de Poaceae

conforman el subgrupo IIb. Las actividades 6-SFT se agruparon como Ic; la identidad de AtFt con

estas enzimas varía de 52 al 56%. Por otra parte, una menor homología de AtFT fue observada

con 1-SST y 1-FFT de Asterales (49 to 54%) agrupados en las ramificaciones IIa y IIb,

respectivamente. Una relación mucho más distante es observada con las enzimas FEH; sus

homologías varían de 35 a 38% en monocotiledóneas y de 38 a 40% para especies

dicotiledóneas.

3.5.1. USO DE CODONES DEL ADNc DE atft

El contenido total de residuos de citosina (C) y guanina (G) en la región codificadora de atft es de

52.23%. Aunque no está disponible aún el genoma completo de Agave tequilana, y no hay muchas

secuencias aisladas de ésta u otras especies de agave para fines de comparación, en la Tabla 24

se muestra el uso de codones encontradas para el atft. Hay una tendencia al uso preferencial de

C, principalmente, y de G en la tercera posición de los codones sobre adenina (A) o timina (T). La

excepción es isoleucina con frecuencias equivalentes de T y C, además de treonina, alanina, ácido

aspártico y glicina que usan preferentemente T en la tercera posición del triplete.

3.5.2. IDENTIFICACIÓN DE LA PROTEÍNA MADURA

De acuerdo a algunos criterios propuestos (Von Heijne, 1986; Von Heijne y Abrahmsén, 1989; Jain

et al., 1994), el péptido señal de la mayoría de las proteínas recién sintetizadas, se caracteriza por

una región-n de 5 a 8 aminoácidos rica en residuos básicos (lisina, arginina, histidina), seguido de

la región-h de 8 a 12 aminoácidos hidrofóbicos (alanina, cisteína, fenilalanina, isoleucina, leucina,

metionina, valina) y aminoácidos propensos a la formación de α-hélices (ácido aspártico, glicina,

asparagina, serina) y finalmente, la región-c de una carácter más polar, típicamente de 6

aminoácidos e involucrada en el sitio de reconocimiento y ruptura por parte de la peptidasa del

péptido señal (Jain et al., 1994). En la Figura 64 se señalan estas tres regiones identificadas en la

secuencia deducida para atft. La frontera de la región-n se localizó en el residuo arginina-29, el

residuo positivo más situado hacia el C-terminal (Von Heijne y Abrahmsén, 1989); mientras que la

región-h cumple con las características para organismos eucariotes: presencia de aminoácidos

hidrofóbicos (alanina, fenilalanina, leucina y valina) y aminoácidos formadores de α-hélices

(serina), además de presentar un carácter más hidrofóbico que en el caso de las bacterias por

181

Tabla 24. Uso de codones en el ADNc de atft. El número al lado del aminoácido, indica el número de veces que dicho aminoácido es codificado por el codón correspondiente; en paréntesis, se indica su frecuencia en por ciento y en negrillas, se indica el total de veces que aparece este residuo en la proteína. 1era posición (extremo 5´)

2a Posición 3era posición (extremo 3´)

T C A G T Phe 10 (50.0) Ser 4 (9.1) Tyr 12 (44.4) Cys 2 (50.0) T Phe 10 (50.0)

Phe 20 Ser 10 (22.7) Tyr 15 (55.6)

Tyr 27 Cys 2 (50.0) Cys 4

C

Leu 8 (12.5) Ser 9 (20.5) Alto 0 (0) Alto 1 (100) A Leu 10 (15.6) Ser 7 (15.9) Alto 0 (0) Trp 18 (100) G

C Leu 11 (17.2) Pro 7 (20.0) His 8 (40.0) Arg 2 (7.4) T Leu 19 (29.7) Pro 10 (28.6) His 12 (60.0)

His 20 Arg 2 (7.4) C

Leu 3 ( 4.7) Pro 8 (22.8) Gln 6 (37.5) Arg 4 (14.8) A Leu 13 (20.3)

Leu 64 Pro 10 (28.6) Pro 35

Gln 10 (62.5) Glc 16

Arg 4 (14.8) G

A Ile 11 (40.7) Thr 16 (39.0) Asn 11 (44.0) Ser 4 (9.1) T Ile 11 (40.7) Thr 14 (34.1) Asn 14 (56.0)

Asn 25 Ser 10 (22.7) Ser 44

C

Ile 5 (18.5) Ile 27

Thr 5 (12.2) Lys 12 (52.2) Arg 4 (14.8) A

Met 9 (100) Thr 6 (14.6) Thr 41

Lys 11 (47.8) Lys 23

Arg 11 (40.7) Arg 27

G

G Val 14 (25.0) Ala 15 (27.8) Asp 23 (60.5) Gly 24 (45.2) T Val 18 (32.1) Ala 12 (22.2) Asp 15 (39.5)

Asp 38 Gly 14 (26.4) C

Val 5 (8.9) Ala 15 (27.8) Glu 15 Gly 7 (13.2) A Val 19 (33.9)

Val 56 Ala 12 (22.2) Ala 54

Glu 19 Glu 34

Gly 8 (15.1) Gly 53

G

ejemplo, con una proporción de leucina de ∼40% (38.46%) y ∼10% de alanina (15.38%) (Von

Heijne y Abrahmsén, 1989).

Utilizando el programa SignalP (versión 3.0) disponible en la dirección

www.cbs.dtu.dk/services/SignalP (Bendtsen et al., 2004), para AtFT se predijo un péptido señal de

43 aminoácidos; es decir, la peptidasa podría actuar entre los codones 43 y 44, en la secuencia

LLA-AAL (Figuras 64 y 65). La hidrofobicidad, longitud y presencia de aminoácidos con carga

negativa (ácidos glutámico y aspártico), sugieren que este péptido-señal dirige a la preproproteína

al retículo endoplásmico, donde debe ser eliminado por la peptidasa y la proproteína así generada,

debe sufrir modificaciones postraduccionales antes de dirigirse a la vacuola, siendo seguramente

la glicosilación, una de las más importantes.

Adicionalmente, se identificó la secuencia W-XXX-[M/I/V]-LXWQ, reportada en In-V y FT de

monocotiledóneas alrededor del inicio de la proteína madura (secuencia subrayada en la Figura

182

Figura 64.- Predicción del péptido señal en AtFT. Se utilizó el programa SignalP 3.0 (www.cbs.dtu.dk/services/SignalP) con dos métodos algorítmicos de predicción: A) Redes neurales, con el “score” S que indica la probabilidad de que el aminoácido pertenezca a un péptido señal o a una proteína madura; “score” C, indica la probabilidad de que el aminoácido sea el sitio de corte por parte de la peptidasa; score Y, es un derivado de S y C, para dar mayor confiabilidad a la predicción. B) Modelo de Markov, calcula la probabilidad de la presencia o ausencia del péptido señal en la secuencia, así como el sitio de corte, en base a las regiones n, h y c.

183

65; Van den Ende et al., 2002), aunque en esta región, la AtFT muestra una sustitución

conservada de triptófano por fenilalanina (aminoácido 82) con una secuencia FTTKMLQWQ. La

larga secuencia después del péptido señal y antes del inicio de la proteína madura, es

característica de Inv-V y FT (de 59 a 115 aminoácidos) y sugiere la presencia de un péptido líder

que debe dirigir la proteína hacia la vacuola (Van den Ende et al., 2002). Esto contrasta con el

péptido señal más corto (20 a 30 aminoácidos), reportado en CWI e incluso FEH cuya localización

vacuolar ha sido confirmada (Chalmers et al., 2005). En el alineamiento de AtFT con otras Inv-V y

FT, se observa una zona poco conservada después de la región correspondiente al péptido señal.

El péptido líder de las Inv-V y FT también es eliminado de la proproteína para dar lugar a la

proteína madura con la funcionalidad requerida. De acuerdo al alineamiento con otras proteínas

cuyo sitio de ruptura en la formación de la proteína madura ha sido reportado (Sprenger et al.,

1995; Van den Ende et al., 1996, 2000; Vijn et al., 1997; Kawakami y Yoshida, 2002; Lidgett et al.,

2002; Ueno et al., 2005), se estableció el inicio de la proteína madura de AtFT a partir del

aminoácido glicina-76 (Figura 65, Apéndice D), es decir, la proproteína debe ser procesada en la

secuencia AGL-GEE para dar finalmente, una proteína madura con una masa teórica de 62 kDa y

un pI de 5.17; valores que coinciden con el peso molecular deducido a partir de las secuencias de

otras FT (60 a 69 kDa) (Wei y Chatterton, 2001; Gallagher et al., 2004; Nagaraj et al., 2004), y

diferente de los valores reportadas para los heterodímeros de las FT purificadadas con

subunidades alrededor de 50 y 20 kDa (Tabla 11). Estas diferencias sugieren que dichas enzimas

son traducidas a partir de un único ARNm que debe ser posteriormente, procesado en dos

subunidades y glicosilado (Sprenger et al., 1995; Lüscher et al., 1996).

Figura 65. Alineamiento de AtFT con Inv-V y FT. Las cajas negras indican las secuencias consenso en la familia GH32; resaltado y subrayado, se muestran los sitios potenciales de glicosilación de AtFT; marcado con gris se indica el inicio de la subunidad larga de la proteína madura, y en el caso de Hv-6SFT, también el inicio de la subunidad pequeña; los residuos resaltados y en itálicas, señalan los posibles residuos importantes en la especificidad de las distintas enzima, de acuerdo a Wei y Chatterton (2001). La flecha indica el sitio de procesamiento del péptido señal de AtFT. Línea de consenso, * aminoácidos idénticos; :, sustituciones conservadas; ., sustituciones semi-conservadas. Abreviaturas, como se indica en la Tabla 23.

184

↓

AtFT -MGSQ---DVESARSLHAPIVG----------SPPPRRTLTLRSLSLALSVVAFLLAAALLLSKSGSVPNPNQGL 61

Ac-6GFFT -MDAQ---DIESR----HPLIG----------ARPRRR--ALRSLSILLAAALLLGLVLFYANGTGSGTAVD--- 52

Ao-6GFFT ----M---ATSLQ----APILG----------SRPPRR--TLRFLSFALFSALVLVVASFSSRKSESGSGLR--- 49

Hv-6SFT -MGSH---GKPPLPYAYKPLPS---DAADGK----RTGCMRWSACATVLTASAMAVVVVGATLLAGLRMEQAVD- 64

Acr-6SFT -MGSHTMPGKPPLPYAYKPLLSGTTDEANGQ----RTGCTRRRVCAAMLTASAMVVVVVAAAFLARARVDKVVN- 69

Ci-1SST -MASS------TTATTPLILRDETQICPQLAGSPVGRRLSMANVLSGILVFVLVICVLVAVIHDQSQQIMATN-- 66

To-1SST -MASS------TTAATPLILHND---------STPRRRLSLAKLLSGIPVAVLVIFALVTVILNQSQHTSATGNI 59

Lp-1FFT -MESR----SIPGAYAYEPLPHSS-DDAHGHDDRRSAGGVRWRACAAVLAASALVVFVVAST-LAGSRVDRVAVD 68

Ac-Inv -MSSD---DLESPPSSYLPIPPSD---EFHDQPPPLRS--WLRLLSIPLALMFLLFLATFLSNLESPPSDSGLVS 66

Ao-Inv MASSR---DVESPPTSYAPLPSDD---EQRPGSAPPRS--RLRLIAIAMPPILLLALAAALF-LSGSGAVTDLVA 66

: : : .

AtFT --------------------------------------------------DAILAPLPQSGAGLGEE----DYPF 82

Ac-6GFFT -------------------------------------------------------------PVRVDN----EFPW 62

Ao-6GFFT -------------------------------------------------------------SGSVEP----EYAW 59

Hv-6SFT -----------------------------------------------------------------EEAAAGGFPW 73

Acr-6SFT -----------------------------------------------------------------EEAAGG-FPW 78

Ci-1SST --------------------------------------------NHQGGDKPTSAATFTAPLLQVDLKRVPGKLE 97

To-1SST --------------------------------------------DFHGGDKPSSDTTFTE-MVPEELKQVLIKLE 90

Lp-1FFT VAAMPALSETARSRGK----------------------------DAGVSEKTSGAADEMGFLGAGSGADADGFPW 115

Ac-Inv DPVTFDVNPAVVRRGKDAGVSDKTSGVDSGFVLDPVAVDANSVVVHRGKDAGVSDKTSGVDSGLLKDSPLGPYPW 141

Ao-Inv GPSP-DTMPEIVR-------------------------------TDRGVEEGVSSKSSGAGPGLLTSVSHGQYPW 109

I II III

AtFT TTKMLQWQHTGFHFQPPRYFMSDPSGPVYYKGWHHFFYQHNAKAAFWGN-IAWGHAASRDLLNWVHLPLAVEPDH 156

Ac-6GFFT TNDMLAWQRCGFHFRTVRNYMNDPSGPMYYKGWYHLFYQHNKDFAYWGN-ITWGHAVSRDLINWQHLPVAVGPDH 136

Ao-6GFFT TNQMLTWQRAGFHFRTVKNYMNDPSGPMYYKGWYHLFYQHNPNYAYWGD-ISWGHAVSRDLLNWFHLPVAVKPDR 136

Hv-6SFT SNEMLQWQRSGYHFQTAKNYMSDPNGLMYYRGWYHMFYQYNPVGTDWDDGMEWGHAVSRNLVQWRTLPIAMVADQ 148

Acr-6SFT SNEMLQWQRSSYHFQPAKNYMSDPDGLLYYGGWYHMFYQYNPVGTDWADGMAWGHAVSRNLVQWRTLPIAMKPDQ 153

Ci-1SST SNADVEWQRSAYHFQPDKNFISDPDGPMYHMGWYHLFYQYNPESAIWGN-ITWGHSVSRDMINWFHLPFAMVPDH 171

To-1SST SNAGVEWERSAYHFQPDKNFISDPDGPMYHMGWYHLFYQYNPESAIWGN-ITWGHSISRDMINWFHLPFAMVPDH 163

Lp-1FFT SNAMLQWQRTGFHFQPEMNWMNDPNGPVYYRGWYHLFYQYNPEGAVWGN-IAWGHAVSRDLVHWRHLPLAMVPDQ 189

Ac-Inv TNQMLSWQRTGFHFQPVKNWMNDPNGPLYYKGWYHFFYQYNPEGAVWGN-IAWGHAVSRDLVHWTHLPLAMVPDQ 215

Ao-Inv TNKMLSWQRTGFHFQPEKNWMNDPNGPLYYKGWYHFFYQYNPNAAVWGD-IAWGHAVSKDLLSWRHLPLAMVPDR 183

:. : *:: .:**:. ::.**.* :*: ****:***:* : * : : ***: *:::: * **.*: .*:

AtFT WYDIEGDWTGSVAVLPDG-RVIMLFTGGTGANELAQVVNLAVAADPSDPLLMEWIKYDA-NPVLHPPRGIGLKDF 229

Ac-6GFFT WYDISGVWTGSIIVVSED-RVVMLFTGGT--KSFDQSINLAEAADPSDPLLLKWIKYDN-NPILWPPPGIVRDDF 207

Ao-6GFFT WYDIYGVWTGSITVMPDDGRVVMLYTGGT--KEKYQIMSVAMAADPSDPLLVEWVKYDEVNPVLRPPPGIGLTDF 206

Hv-6SFT WYDILGVLSGSMTVLPNG-TVIMIYTGAT-NASAVEVQCIATPADPNDPLLRRWTKHPA-NPVIWSPPGVGTKDF 220

Acr-6SFT WYDILGVLSGSVTVLPNG-TVIMLYTGAT-NDWYVEATCLALPADPNDPLLRRWTKHPA-NPIIWSPPGIGTKDF 225

Ci-1SST WYDIEGVMTGSATVLPNG-QIIMLYTGNA--YDLSQLQCLAYAVNSSDPLLLEWKKYEG-NPILFPPPGVGYKDF 242

To-1SST WYDIEGVMTGSATMLPNG-QIIMLYTGNA--YDLSQLQCLAYAVNSSDPLLLEWKKYEG-NPILFPPPGVGYKDF 234

Lp-1FFT WYDINGVWTGSATVFPDG-QIIMLYTGNA--YDLAQLQCLAYAVNSSDPLLLEWKKYEG-NPILFPPPGVGYKDF 260

Ac-Inv WYDINGVWTGSATILPDG-QIVMLYTGAT--NESVQVQNLAVPADQSDTLLLRWKKSE-ANPILVPPPGIGDKDF 286

Ao-Inv WYDINGVWTGSATILPDG-RIIMLYTGAT--NESVQVQNLAVPADLSDPLLLEWTKVDDANPILVPPPGVGATDF 255

**** * :** :..:. : *::** :. : :* . : .*.** .* * **:: .* *: **

IV v

AtFT RDPNPVWYNSSESTWYVVVGSKNDSL-SHTGIALVYTTKDFLSYTLLPGVLHAVDIVGMWECVDLYPVATAG-PL 302

Ac-6GFFT RDPNPIWYNASESTYHIVVGSKNDSL-QHTGIALVYLTKDFKKFDLLPTVLHSVDKVGMWECVEVYPVATTG-PL 280

Ao-6GFFT RDPNPIWYNTTDSTWQLVIGSKNDSL-QHTGIAMVYTTKDFINLTLLPGVLHSVDHVGMWECVDLFPVASSG-PL 279

Hv-6SFT RDPMTAWYDESDETWRTLLGSKDDHDGHHDGIAMMYKTKDFLNYELIPGILHRVVRTGEWECIDFYPVGRRS--- 292

Acr-6SFT RDPMTPWYDDSDHTWRTLFGSKDDHHGHHDGIAIMYKTKDFLNYELIPGILHRVENTGEWECIDFYPVGGGG--- 297

Ci-1SST RDPSTLWMGP-DGEWRMVMGSKHN---ETIGCALVYRTTNFTHFELNEEVLHAVPHTGMWECVDLYPVSTTHTNG 313

To-1SST RDPSTLWRGP-DGDWIMIMGSKHN---QTIGCALVYRTSNFTHFELSEEPLHAVPHTGMWECVDLYPVSTTHTNG 305

Lp-1FFT1 RDPTTAWFDESDQTWRTVIGSKDNNG--HAGIAMVYKTKDFLNYELIPGYLHRVDGTGMWECIDFYPVGGK---- 329

Lp-FFT2 RDPTTAWFDESDQTWRTVIGSKDNNG--HAGIAMVYKTKDFLNYELIPGYLHRVDGTGMWECIDFYPVGGK---- 329

Ac-Inv RDPTTAWYEPSDDTWRIVIGSKDS---SHSGIAIVYSTKDFINYKLIPGILHAVERVGMWECVDFYPVATADSSH 358

Ao-Inv RDPTTAWFEPSDSTWRIAIGTKDA---DHSGVALVYSTKDFLNYTLLPGTLHTVKHVGMWECIDFYPIATSG-AG 326

*** . * :: : .*:*. * *::* *.:* * ** * .* ***::.:*:.

185

VII VIII AtFT VGRALEN----SVPAGENVKHVLKAGLNDEWHDYYAIGTYDREANKWTPDDEIIDVGIGLRYDWGKFYASRTFYD 373

Ac-6GFFT LHKAIDNFDVDRVLDRSTVKHVLKASMNDEWHDYYAIGTFDPIGNKWTPDDETVDVGIGLRYDWGKFYASRTFFD 355

Ao-6GFFT IGRGLD----RSMMLADNVKHVLKASMNDEWHDYYAIGSYDVATHRWVPDDESVDVGIGMRIDWGKFYASRTFYD 350

Hv-6SFT ------------SDNSSEMLHVLKASMDDERHDYYSLGTYDSAANTWTPIDPELDLGIGLRYDWGKFYASTSFYD 355

Acr-6SFT ------------SENSSEVLHVLKASMDDERHDYYSLGTYDSAANIWTPIDPELDLGIGLRYDWGKFYASTSFYD 360

Ci-1SST LDMK---------DNGPNVKYILKQSGDEDRHDWYAVGTFDPEKDKWYPDDPENDVGIGLRYDYGKFYASKTFYD 379

To-1SST LDMM---------DNGPNVKYILKQSGDEDRHDWYAIGSFDPINDKWYPDDPENDVGIGLRYDYGKFYASKTFYD 371

Lp-1FFT --------------NGSEELYVIKESSDDDRHDWYTLGKYDAAANTFTAADPENDLGIGLRYDWGKFYATKTFYD 390

Ac-Inv ANHGLDP----SARPSPAVKHVLKASMDDDRHDYYAIGTYDPAQNTWVPDDASVDVGIGLRYDWGKFYASKTFYD 429

Ao-Inv ANRGLDP----SVRPSKLVKHVLKESSDDDRQDWYAIGTYDPDTNKWTPDDESLDVGIGLRYDLGKFYASKTFYD 397

. :::* . ::: :*:*::*.:* . : . * *:***:* * *****: :*:*

AtFT PVKQRRVLWGYVGETDSREVDIRKGWASVEGLARTVLFDEKTGTNLLTWPVEEVESLRMT-SKNFSNVIISPGTT 447

Ac-6GFFT PLKQRRIIWGYIGEVDSQKADIAKGWASLQGIPRSVLYDVKTGTNVLTWPIEEMEGLRMA-RKDFSGIKIKKGST 429

Ao-6GFFT PVKERRVMWGYVGETDSGDADVAKGWASFQGIPRTVLFDVKTGTNVLTWPIEEVESLRMT-RKDFSDIVVNKGST 424

Hv-6SFT PAKNRRVLMGYVGEVDSKRADVVKGWASIQSVPRTVALDEKTRTNLLLWPVEEIETLRLN-ATELTDVTINTGSV 429

Acr-6SFT PAKKRRVLMGYVGEVDSKRADVVKGWASIQSVPRTIALDEKTRTNLLLWPVEEIETLRLN-ATELSDVTLNTGSL 434

Ci-1SST QHQKRRVLWGYVGETDPPKSDLLKGWANILNIPRSVVLDTQTGTNLIQWPIEEVEKLRSTKYDEFKDVELRPGSL 454

To-1SST QHKSRRVLWGYVGETDPPKDDLLKGWANMLNIPRTIVLDTVTGTNLIQWPIDEVENLRSKKYDEFKDVELRPGSI 401

Lp-1FFT PAKNRRVLWGWIGETDSERADVAKGWASLMSIPRTVELDEKTRTNLIQWPVEELETLRIK-STDLGGVTIDHGSV 464

Ac-Inv HAKKRRILWSWIGETDSETADIAKGWASLQGVPRTVLLDVKTGSNLITWPVVEIESLRTR-PRDFSGITVDAGST 503

Ao-Inv QEKKRRVLWGWIGESDSESADILKGWASLQGIPRTVLYDLRTGSNLITWPIEEVESLRSN-LHDFSGITIDKGST 471

:.**:: .::** *. *: ****.. .:.*:: * * :*:: **: *:* ** :: .: : *:

AtFT VQL-DIGDANQLDIVAEFEIKKEELEAVIEA--DVTYNCSTSGGAATRGLLGPFGLLVLANED-LTEQTATYFYV 518

Ac-6GFFT VELSDFGDAFQIDIEAEFTISKEALEATIEA--DVGYNCSSSGGAAIRGTLGPFGLLVLANQD-LTENTATYFYV 501

Ao-6GFFT VEL-HVGDANQLDIEAEFEMDKDALETAIEA--DIGYNCSSSGGAVSRGVLGPFGLFVLANQD-LTELTATYFYV 495

Hv-6SFT IHI-PLRQGTQLDIEASFHLDASAVAALNEA--DVGYNCSSSGGAVNRGALGPFGLLVLAAGDRRGEQTAVYFYV 501

Acr-6SFT VHV-PLRQGTQPDIEATFHLDAAAVAALNEA--DVGYNCSSSGGAVNRGALGPFGLLVLAAGDRRGEKTAVYFYV 506

Ci-1SST VPL-EIGTATQLDISATFEIDQKKLQSTLEA--DVLFNCTTSEGSVGRGVLGPFGIVVLADAN-RSEQLPVYFYI 525

To-1SST IPL-EIGSATQLDIMATFEIDEKMLESTLEA--DVLFNCTTSEGSVGRGVLGPFGIVVLADAK-RSEQLPVYFYI 517

Lp-1FFT YPL-PLHRATQLDIEASFRIDTATVAALNEA--DVGYNCSTSGGSANRGALGPFGLLVLADG--KAEQTAVYFYV 534

Ac-Inv FKL-DVGGAAQLDIEAEFKISSEELEAVKEA--DVSYNCSSSGGAAERGVLGPFGLLVLANQD-LTEQTATYFYV 574

Ao-Inv FHL-DVHGAAQLDIEAEFKINEESLSAEAENGTGVMYNCSGGGGAAERGLLGPFGLLVLANSD-LTEQTAAYFYV 485

: . . * ** * * :. : : * .: :**: . *:. ** *****:.*** . * ..***:

AtFT GRGTDGSLQTHLCQDELRSSKAYNIVKRVVGHTVPVLAGEMLSLRILVDHSIVESYAQGGRASTTSRVYPTEAIY 593

Ac-6GFFT SKGIDGSLITHFCQDETRSSKANDIVKRVVGGTVPVLDGETFAVRILVDHSVIESFAMGGRTSATSRAYPTEAIN 576

Ao-6GFFT SRATDGSLHTHLCHDEMRSSKANDIVKRVVGGTFTVLDGELLSLRILVDHSIVESFAQGGRTSATSRVYPTEAIY 570

Hv-6SFT SRGLDGGLHTSFCQDELRSSRAKDVTKRVIGSTVPVLDGEALSMRVLVDHSIVQGFDMGGRTTMTSRVYPMES-Y 575

Acr-6SFT SRGLDGGLQTSFCQDELRSSRAKDVTKRVIGSTVPVLGGEAFSMRVLVDHSIVQGFAMGGRITMTSRVYPMEA-Y 580

Ci-1SST AKDTDGTSKTYFCADESRSSTDKDVGKWVYGSSVPVLGGENYNMRLLVDHSIVEGFAQGGRTVVTSRVYPTKAIY 600

To-1SST AKNTDGSSKTYFCADESRSSMDKSVGKWVYGDSVPVLEGEKHNMRLLVDHSIVEGFAQGGRTVVTSRVYPTKAIY 592

Lp-1FFT AKGLDGTLQTHFCHDESRSTLARDVVKRVVGYTVPVLDGEAFSVRVLVDHSIVESFAMGGRSTATSRVYPTEAIY 609

Ac-Inv SRGMDGGLNTHFCQDEKRSSKASDIVKRIVGHSVPVLDGESFALRILVDHSIVESFAQGGRASATSRVYPTEAIY 649

Ao-Inv SRGVDGELQTHFCQDEMRSSKANDIVKSVVGGTVPVLKGETLSLRILVDHSIVESFAQGGRASATSRVYPTEAIY 604

.: ** * :* ** **: .: * : * :..** ** :*:*****:::.: *** ***.** ::

AtFT EGARVFLFNNATAATVIGKSVKIWHMNSTHDTICHYPSLKAQ-------- 635

Ac-6GFFT SAARVFLFNNATGVDVIAESVKIWQMNSTYNDFYHF-------------- 612

Ao-6GFFT ERARVFLFNNATGATITAKAVKVWQMNSTSNQYYPFTSSN---------- 610

Hv-6SFT QEARVYLFNNATGASVTAERLVVHEMDSAHNQLSNEDDGMYLHQVLESRH 625

Acr-6SFT QEAGVYLFNNATGASVTAERLVVHEMDSAHNQLSNEDAYMYVR------- 623

Ci-1SST GAAKIFLFNNATGISVKVS-LKIWKMAEAQLDPFPLSGWSS--------- 640

To-1SST GAAKLFLFNNATGISVKAS-LKIWKMAEAQLDPFPLSGWSS--------- 632

Lp-1FFT GAAGAYLFNNATGGSVTVEKLVVHEMDSSYNQIFMADDL----------- 648

Ac-Inv NNARVFVFNNATGAKVTAQSLKVWHMSTAINEIYDPATSVM--------- 690

Ao-Inv SSAKVFLFNNATGASITAQSLKIWHMNSTLSRPFDFNDGAQAQ------- 662

* ::*****. : . : : .* :

186

En la secuencia teórica de AtFT, se identificaron seis sitios potenciales de glicosilación (N-X-S/T,

donde X no es prolina) (Figura 65), valor que cae dentro del intervalo reportado de sitios de

glicosilación presente en FT (de 5 a 9; Chalmers et al., 2005). La presencia de sitios de

glicosilación coincide con la capacidad de estas proteínas de ser retenidas en resinas de ConA.

Esta propiedad sugiere que estas enzimas deben ser procesadas en el retículo endoplásmico y es

una característica de las enzimas vacuolares, por lo que adicionalmente al valor teórico de su pI

(5.17), se sugiere que AtFT tiene una localización vacuolar, al igual que las demás FT y concuerda

con el pH para la actividad óptima de este tipo de enzimas.

3.5.3. GLICOSILHIDROLASA 32

La comparación con la base de datos, también indicó que AtFT pertenece a la familia 32 de las

glicosilhidrolasas (GH32), donde también se incluye algunas β-fructofuranosidasas como

invertasas, levanasas, inulinasas y FT de vegetales y hongos (http://afmb.cnrs-

mrs.fr/CAZY/families.html). Esto fue confirmado en el análisis de alineamiento mostrado en la

Figura 65, donde se identificaron algunas secuencias consenso reportadas para la familia GH32

(Batista et al., 1999; Menéndez et al., 2002; Ritsema et al., 2004).

La región I corresponde a la secuencia conocida como caja de unión a Suc. Ritsema et al. (2004),

recientemente demostraron que esta región influye en la determinación del producto y no en la

especificidad de sustrato. Esta región presenta el consenso HXX-[P/T/V]-XXXX-[A/I/L/M/V]-

[A/C/G/N/S/Y]-[D/E]-P-[C/D/N/S]-[A/G] (Chalmers et al., 2005) con el motivo β-fructosidasa

NDPNG, altamente conservado en Inv-V y 1-SST de Festuca arundinacea y más variable en el

resto de las FT (Wei y Chatterton, 2001). En una FT dada, este pentapéptido es más homólogo a

una enzima de otra especie que codifica para la misma actividad enzimática que a otra FT de la

misma especie pero con diferente actividad, manteniéndose siempre invariable el presunto

nucleófilo ácido aspártico en posición adjunta a la prolina (Ritsema et al., 2005). La secuencia

SDPSG en AtFT, indica que el ADNc aislado codifica para una FT más que para una Inv-V, y que

esta región es más homóloga a los pentapéptidos SDPDG de 1-SST de las Asterales, SDPNG

reportado en 6-SFT de las Poales o a la secuencia NDPSG observada en las 6G-FFT de las

Asparagales cebolla y espárrago (Figura 65). La naturaleza FT de AtFT, además, se confirma con

la presencia de fenilalanina-102 en la región I. En esta posición, hay un residuo aromático muy

conservado; en las Inv-V, éste siempre corresponde a triptófano, en tanto que en las FT es

187

fenilalanina o tirosina pero nunca triptófano (Ritsema et al., 2005). En esta misma región es

posible localizar una serina que diferencia a las FT vegetales con las de otras fuentes (por

ejemplo, está ausente en las FT de bacterias y hongos; Rehm et al., 1990).

A través del análisis de la secuencia, además es posible identificar el origen de las FT. Por

ejemplo, en la región I se identifica una serina que diferencia a las FT vegetales con las de otras

fuentes (por ejemplo, está ausente en las FT de bacterias y hongos). Además, el consenso

DXG_KFYA (región VIII) es una región altamente conservada, donde el guión indica un

aminoácido faltante en FT vegetales y presente en algunas de otro origen (Rehm, 1998).

De manera interesante, en la posición 116 (región II) AtFT muestra un cambio conservado de

tirosina presente en la mayoría de las FT por una histidina. Se identificaron, además, los residuos

RDP y EC en las regiones IV y V, respectivamente. Estos residuos han sido sugeridos como clave

en la funcionalidad de las enzimas involucradas en el metabolismo de fructanos. El tripéptido RDP

está estrictamente conservado en todas las β-fructofuranosidasas, incluyendo las FT bacterianas

pertenecientes a la familia GH68. El ácido aspártico en este dominio, parece involucrado en el

enlace o ruptura de la Suc por parte de las levansucrasas bacterianas de Glucanacetobacter

diazotrophicus y Streptococcus salivarius (Menéndez et al., 2002). En la misma región referida, las

Inv-V vegetales muestran el consenso altamente conservado DFRDPTTAW y, de nuevo, este

consenso puede ser diferente en las FT (Batista et al., 1999). En AtFT esta caja consiste en la

secuencia DFRDPNP, consenso estrictamente conservado para las otras dos secuencias 6G-FFT

de Asparagales (Vijn et al., 1997; Ueno et al., 2005), pero diferente a la secuencia 6G-FFT de

Lolium perenne (Lasseur et al., 2006).

Wei y Chatterton (2001) mostraron un alineamiento múltiple de FT, Inv-V y CWI, indicando

aminoácidos que pudiesen ser específicos para cada tipo de actividad enzimática. Para cebolla, la

única secuencia 6G-FFT reportada en ese momento, estos autores sugirieron los aminoácidos

arginina-77, valina-79, lisina-104 y arginina-351 como específicos para dicha actividad (Figura 65).

La secuencia de espárrago posteriormente reportada (Ueno et al., 2005) mostró coincidencia con

la mayoría de estos aminoácidos (arginina-74, valina-76 y arginina-346), habiendo un cambio de

lisina por prolina-101. Con lo que respecta a la AtFT, estos aminoácidos difieren casi por completo

(glutamina-97, prolina-99, alanina-124), coincidiendo únicamente en la arginina-369; mientras que

ninguna coincidencia con estos residuos es observada con la secuencia 6G-FFT de L. perenne

(Lasseur et al., 2006).

188

3.6. EXPRESIÓN HETERÓLOGA DE atft

La comparación de las secuencias deducidas de ADNc involucrados en el metabolismo de

fructanos, junto con análisis filogenéticos, han permitido asignar con cierta confiabilidad una

función putativa a una secuencia. Sin embargo, dada la gran similitud que comparte esta familia de

proteínas, puede resultar arriesgado inferir una función putativa solo en base a la homología de la

secuencia de aminoácidos, por lo que se vuelve necesario el análisis de expresión del ADNc

aislado. Un sistema de expresión heterólogo, además, ofrece la posibilidad de estudiar las

propiedades enzimáticas de la proteína, en un medio aislado de probables interferencias

endógenas, hecho invaluable en el caso de las FT donde esta demostrado el interferencia de sus

actividades.

Uno de los problemas en la expresión de los ADNc de las FT, es la presencia de Inv endógenas

en sistemas heterólogos como tabaco, papa y betabel, que compiten por la Suc como sustrato. La

mutante Inv- de Saccharomyces cerevisiae también ha sido utilizada; sin embargo, la actividad de

las FT expresadas en esta levadura resulta baja probablemente por una hiperglicosilación,

característica de este sistema (Ritsema y Smeekens, 2003). Afortunadamente, otra levadura,

Pichia pastoris, se caracteriza por la ausencia de enzimas sucrolíticas, por lo que la convierten en

el sistema ideal en el estudio de enzimas relacionadas con el metabolismo de Suc, además de

presentar un patrón de glicosilación y modificaciones postraduccionales semejantes a un sistema

vegetal (Trujillo et al., 2002; Ritsema y Smeekens, 2003). Por estas ventajas, P. pastoris ha sido el

sistema más recurrido en los últimos tiempos en la expresión de FT, Inv y FEH (Sprenger et al.,

1995; Hochstrasser et al., 1998; Lüscher et al., 2000; Trujillo et al., 2002; De Coninck et al., 2005),

utilizando generalmente el vector pPICZ, cuya expresión se encuentra regulada bajo el promotor

del gen alcohol oxidasa (aox I), inducible en presencia de metanol.

3.6.1. CONSTRUCCIÓN DEL VECTOR pGAPZααααC-atft

Los oligonucleótidos PpAt-FT1 y PpAt-FT2 (Tabla 14) se usaron para amplificar el ADNc atft

completo contenido en el vector pGEM-T Easy, eliminando además el péptido señal y el codón de

terminación (TGA) de esta secuencia, e introduciendo en el nuevo fragmento los sitios de

restricción Cla I y Xba I, para facilitar su ligación en pGAPZαC. Este vector contiene el promotor

de la enzima gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAP), cuya expresión es constitutiva; y de

189

probarse su inocuidad en las células hospederas, puede resultar una alternativa económica y

segura para el análisis o producción de este sistema con alguna perspectiva biotecnológica.

El vector pGAPZαC-AtFT así generado, fue amplificado en células de E. coli crecidas con el

antibiótico zeocina como agente de selección. La presencia de la construcción en las

transformantes fue confirmado, y el vector fue analizado por secuenciación, para verificar que la

secuencia estuviese en el marco de lectura correcto. El vector linearizado con Avr II fue utilizado

para transformar, por electroporación, la cepa silvestre de P. pastoris X33. La secuencia AtFT fue

incorporada al genoma de la levadura por un proceso de recombinación homóloga.

3.6.2. ANÁLISIS DE EXPRESIÓN

En el extremo 5´ de su secuencia, AtFT es fusionado al factor α (factor de secreción derivada de

S. cerevisiae), por lo que se esperaría que al producirse la proteína, ésta fuese secretada al medio

extracelular; sin embargo, en ocasiones esto no sucede y la proteína permanece en el interior.

Una vez crecidas, las levaduras fueron centrifugadas, recuperándose el sobrenadante y la fracción

celular. La velocidad de crecimiento y la producción de biomasa fueron comparables entre la cepa

silvestre X33 y las células transformadas, indicando que la expresión constitutiva de AtFT no fue

tóxica para la célula hospedera. Durante el crecimiento de las células, el pH del medio disminuyó

de 6 hasta 4.5 o aún a valores inferiores y la actividad FT se detectó principalmente en las células.

La disminución del pH pudo haber interferido en el correcto proceso de excreción de la proteína o

haber causado su inactivación por un valor de pH inferior al de su actividad óptima. Para resolver

lo anterior, cepas transformadas de P. pastoris fueron inoculadas en un tanque de fermentación de

2.5 L, en condiciones de alta aireación y un control de pH a un valor de 6. Aun así, la comparación

de las Figuras 66 y 67 muestra que la actividad enzimática en el sobrenadante fue menor que la

detectada en las células. Esta menor actividad indica que el péptido señal del factor α dirigió a la

proteína AtFT recién sintetizada, hacia el espacio periplásmico, donde la mayor parte de la

actividad debió ser retenida, al igual que se ha reportado en otras fructosidasas. La detección de

actividad también sugiere que durante su tránsito al periplasma, AtFT debió ser glicosilada,

condición que parece esencial para su función catalítica (Ritsema y Smeekens, 2003). Los

sustratos y productos del ensayo enzimático fueron capaces de fluir hacia o desde el espacio

periplásmico vía un proceso de difusión.

190

Figura 66. Perfil cromatográfico de los productos generados de AtFT excretada al medio extracelular. A) Fructanos de cebolla; Productos del ensayo enzimático del extracto proteínico secretado al medio extracelular utilizando B) sacarosa, C) 1-Kestotriosa o D) nistosa como sustrato.

191

Figura 67. Perfil cromatográfico de los productos generados de AtFT contenida en la fracción celular. A) Fructanos de cebolla; Productos del ensayo enzimático del extracto proteínico contenido en la fracción celular utilizando B) sacarosa, C) 1-Kestotriosa o D) nistosa como sustrato.

192

En presencia de Suc como único sustrato, no hubo detección de actividad FT en la fracción del

sobrenadante (Figura 66B). Sin embargo, en la fracción celular se observó una producción

considerable de 1-Kes a partir de este sustrato. Las FT con capacidad de utilizar Suc como

donador es la 1-SST y la 6-SFT, y solo recientemente se reportó en la 6G-FFT de L. perenne, la

síntesis de pequeñas cantidades de 1-Kes a partir de Suc (Lasseur et al., 2006). Minimizando este

hecho, los autores sugieren que en presencia única de Suc, esta enzima sintetiza primero 1-Kes

que utiliza posteriormente para la formación de 6G-Kes, que se forma después de 4 h de reacción.

Sin embargo, la cantidad de 1-Kes sintetizada por AtFT es considerable y no se observa la síntesis

de otro producto adicional. Se puede descartar la interferencia de una Inv que sintetice este

producto a partir de las condiciones del ensayo (alta concentración de Suc), pues P. pastoris

carece de cualquier actividad sucrolítica.

Cuando AtFT de la fracción celular o el sobrenadante fue ensayado en presencia de 1-Kes o Nys

como sustratos, hay una clara actividad 1-FFT (Figuras 65 y 66). Hay generación de IOS hasta

DP6 e incluso hasta DP7 en el caso de la fracción celular; y es en esta última fracción donde los

productos se sintetizaron en mayor abundancia. Una combinación de sustratos (Suc + 1-Kes, Suc

+ Nys o 1-Kes + Nys) no modificó el patrón de fructanos sintetizados. En el caso del

sobrenadante, la incubación con Nys disminuye notablemente la formación de Suc y Fru,

sugiriendo que la reacción de polimerización es limitada en presencia de 1-Kes, ya que ésta debe

competir con la Suc y agua como fructosil-aceptor. Además de la serie Ix como productos

generados predominantemente por AtFT, también se observó la generación de pequeños picos,

que de acuerdo a la comparación con el perfil cromatográfico de fructanos de cebolla,

corresponden a los neofructanos. Estos resultados indican que atft codifica una 1-FFT con

actividad colateral de 6G-FFT. La actividad relativa 1-FFT/6G-FFT de esta enzima debe tener una

proporción mucho mayor al reportado para cebolla (0.45, Fujishima et al., 2005) y L. perenne

(0.48, Lasseur et al., 2006), y más parecido al sistema de espárrago donde se reporta para la 6G-

FFT una relación de actividad 1-FFT/6G-FFT de 16 (Ueno et al., 2005) y donde además se

demuestra la existencia de enzimas independientes para la síntesis de inulinas y neofructanos.

3.6.3. IDENTIDAD DE LA AtFT

La inesperada incapacidad de AtFT de sintetizar 6G-Kes, a pesar de la mayor homología con las

enzimas de actividad 6G-FFT, confirma la importancia de ensayar la expresión de secuencias

193

genómicas en un sistema heterólogo antes de asignarles una función putativa. Esto coincide con

otros autores (Van den Ende et al., 2003; Gallagher et al., 2004; De Coninck et al., 2005) cuyas

evidencias demuestran que enzimas con funcionalidad (Inv vs FT) y localización (vacuolar vs

apoplástica) diferentes pueden asociarse en un mismo grupo filogenético. atft es la primera

secuencia clonada para una actividad 1-FFT de Asparagales. Su mayor homología con la 6G-FFT

de cebolla y espárrago y no con otras 1-FFT de monocotiledóneas, refuerza la hipótesis de que las

FT evolucionaron independientemente en familias no relacionadas, a través de pequeños cambios

mutacionales que causaron diferencias en la especificidad de sustrato y por lo tanto, en el perfil de

sus fructanos.

La comparación de AtFT con las secuencias de 6G-FFT de cebolla y espárrago, muestra que

mientras estas dos últimas presentan el consenso NDPSG en el motivo β-fructosidasa, AtFT

difiere en la serina-104 (SDSPG) (Figura 65). Ritsema et al. (2005) discuten que este motivo es

bien conservado en las enzimas que comparten la misma actividad cinética. En un trabajo

reciente, estos autores demostraron que mutaciones en el residuo ácido aspártico-84 de la 6G-

FFT de cebolla (posición equivalente a la serina-104 de AtFT) afecta la especificidad del producto.

La mutación N84S que genera el consenso SDPSG, semejante al presente en AtFT, cambió la

actividad de esta enzima. Esta proteína al igual que la silvestre, es incapaz de utilizar Suc como

sustrato donador; sin embargo, con esta única mutación dicha enzima no tuvo mas actividad de

6G-FFT, sino que sintetizó fructanos tipo inulina en presencia de 1-Kes. El comportamiento de

esta enzima es similar a lo que fue observado en el análisis de expresión de AtFT. Esto ayuda a

explicar, en parte, la actividad 1-FFT encontrada en esta enzima, porque la secuencia β-

fructosidasa de AtFt es menos similar al consenso conservado YDPNG de las 1-FFT de

dicotiledóneas o NDPNG de las monocotiledóneas.

atft también es el primer ADNc aislado para una FT de la importante familia Agavaceae y

contribuye a enriquecer el limitado conocimiento del metabolismo de fructanos en estas plantas.

Aunque AtFT sintetiza neofructanos, esto no explica la predominancia de estos carbohidratos en la

planta y en los ensayos de actividad enzimática. Su pequeña actividad 6G-FFT fuertemente

sugiere la presencia de enzimas independientes: AtFT activa en la síntesis de inulinas y una 6G-

FFT, aún no purificada ni clonada, encargada de la formación de neofructanos. Por otra parte,

tampoco se puede descartar que AtFT tenga una función dual de 1-FFT/6G-FFT. Los neofructanos

observados en agaves podrían ser sintetizados por reacciones de polimerización a partir de la 6G-

194

Kes generada. Esto es, inicialmente AtFT podría sintetizar 6G-Kes y después de haber alcanzado

cierto umbral, AtFT podría actuar sobre este mismo metabolito elongando la cadena a través de

cualquiera de los dos residuos de Fru terminal.

Una desventaja de P. pastoris como sistema de expresión puede ser las diferencias en el

comportamiento enzimático de las enzimas heterólogas comparadas con las nativas. Esto ha sido

explicado como diferencias durante el plegamiento o el proceso de glicosilación (Hochstrasser et

al., 1998; Ueno et al., 2005). La presencia de actividad AtFT en el sobrenadante y en la fracción

celular, indican que la proteína fue procesada diferencialmente, hecho que se ve reflejado por

distintos comportamientos enzimáticos en ambas fracciones: la fracción celular es más activa y

utiliza Suc en la síntesis de 1-Kes. Si un cambio de un solo aminoácido puede modificar la

especificidad del producto formado por una FT, un distinto plegamiento o grado de glicosilación,

podría estar modificando la actividad enzimática de AtFT de manera importante; por lo que la

expresión de atft en otro sistema heterólogo o la purificación a homogeneidad de la enzima

podrían ser datos valiosos en el análisis del metabolismo de fructanos en agaves.

195

IX. CONCLUSIONES

• Los tallos de agave almacenan fructanos como principal carbohidrato de reserva (hasta

el 80% de su peso seco). La presencia de enlaces β-D-Fruf-(2-1), -(2-6) y disustituída,

así como unidades α-D-Glcp-interna y –terminal, indican una complejidad similar a lo

reportado en otros miembros Asparagales, reforzando la posibilidad de utilizar la

determinación estructural de fructanos como un criterio adicional en la clasificación

taxonómica.

• Las diferencias estructurales en los fructanos de agave y dasylirion son más cuantitativas

que cualitativas. La concentración de este carbohidrato y aquellos relacionados con su

metabolismo (Sac, Fru, Glc) presentaron una correlación con las condiciones climáticas

donde crecieron las plantas. Este hecho sugiere que la presencia, diversidad y/o

metabolismo de los fructanos en estas especies, puede contribuir a una mejor tolerancia a

estrés abiótico, especialmente a condiciones de sequía, donde por lo general se

desarrollan.

• En el extracto crudo de agaves y dasylirion se logró la identificación de diferentes

actividades enzimáticas, con capacidad de sintetizar un espectro de fructanos semejante a

lo encontrado in vitro a partir de sacarosa como único sustrato.

• Los distintos pasos cromatográficos utilizados, permitieron la identificación de actividades

diferenciales de las FT encontradas en agaves.

• El ADNc aislado de A. tequilana (atft), codifica una glicosilhidrolasa de la familia 32

(GH32). Su consenso DPSG distinto al DPNG altamente conservado en Inv, la identifica

como una FT. Ls expresión heteróloga de atft en Pichia pastoris, mostró que ésta es una

1-FFT a pesar de que su secuencia es más homóloga a la 6G-FFT de las Asparagales

Asparagus officinalis (espárrago) y Allium cepa (cebolla).

• Este es el primer ADNc aislado de una 1-FFT de Asparagales y el primer FT de la familia

Agavaceae.

196

X. PERSPECTIVAS

i).- La identificación de la diversidad estructural de fructanos en plantas de agave y dasylirion, las

propiedades de las diferentes actividades enzimáticas que participan en su síntesis y el

entendimiento de la regulación de la expresión de sus respectivos genes, pueden conducir al

entendimiento de las bases fisiológicas que le permite a estas plantas regular sus niveles de

carbohidratos como un mecanismo de tolerancia al estrés hídrico.

ii).- El conocimiento de la secuencia del ADNc que codifica para la AtFT, facilita la obtención de su

secuencia genómica. El análisis de su sistema de intrones y exones puede ayudar a entender los

mecanismos, factores ambientales y genéticos que regulan su expresión. Dado los antecedentes

de una variabilidad en el motivo β-fructosidasa en las FT y de la implicación de un mecanismo de

“splicing” alternativo en papa bajo estrés por frío, se hace interesante el estudio de la disposición

genómica de dicho gen buscando algún comportamiento similar.

iii).- El análisis de expresión de AtFT indica que ésta es 1-FFT, a pesar de su mayor homología

con la 6G-FFT de espárrago y cebolla. Este hecho abre la perspectiva de futuros análisis

mutacionales, encaminados al entendimiento de la relación estructura-función con la especificidad

de la actividad enzimática. Por ejemplo, un análisis en la mutación S104D en el motivo β-

fructosidasa de AtFT (SDPSGP), diferente al motivo presente en espárrago y cebolla (NDPSGP), o

una mutación en el dominio DFRFPNP presente únicamente en estas tres secuencias, pueden dar

una idea de los dominios y residuos clave en la especificidad enzimática de estas FT.

iv).- La identificación de la diversidad estructural en agaves, obliga a estudiar las propiedades de

estas nuevas moléculas, para una potencial aplicación biotecnológica (agrícola, industrial,

farmacéutica, alimentaria) similar o diferente a las aplicaciones dadas a los fructanos tipo inulina.

Un especial énfasis podría ser puesto en el área de prebióticos, desde que recientemente se ha

demostrado que la 6G-Kes, presenta un mejor efecto bifidogénico que los IOS, ya industrialmente

utilizados con fines nutracéuticos.

197

v).- La inocuidad de la expresión constitutiva de A-FT, ofrece la perspectiva de escalar su

expresión heteróloga a un nivel industrial o semi-industrial para aplicaciones biotecnológicas.

vi).- Finalmente, un entendimiento básico de la fisiología de los fructanos con el metabolismo de

carbohidratos en agaves, a lo largo de todo su ciclo de desarrollo, podría permitir la sobre-

expresión endógena de AtFT, para volver realidad el sueño de todo industrial tequilero: mayor

acumulación de fructanos a una menor edad de la planta.

198

XI. APÉNDICES

APÉNDICE A. PREPARACIÓN DE SOLUCIONES

Reactivo revelador de carbohidratos: Solución A, 100 mL de difenilamina al 4% en acetona; solución B,

100 mL de anilina al 4% en acetona; Solución C, 20 mL de ácido fosfórico al 85%. Mezclar las soluciones

antes de usarse.

Solución Bradford (stock): 100 mL de etanol al 95%, 200 mL de ácido fosfórico 88%, Serva azul G 350

mg. Estable indefinidamente a temperatura ambiente.

Reactivo de Bradford (reactivo de trabajo): 425 mL de agua destilada, 15 mL de etanol al 95%; 30 mL de

ácido fosfórico al 88%. Mezclar y filtrar a través de un papel Whatman No.1. Almacenar a temperatura

ambiente en una botella ámbar. Estable por varias semanas, pero necesita ser filtrada de nuevo.

Buffer McIlvaine: Citrato-fosfato 50 mM, pH 5.5, EDTA 5 mM, NaN3 0.02%, PMSF 0.1 µM

Buffer de afinidad: Citrato-fosfato 50 mM, pH 5.5, EDTA 5 mM, NaN3 0.02%, PMSF 0.1 µM, con CaCl2 1

mM, MnSO4 1 mM y NaCl 0.5 M

Buffer de intercambio aniónico: Bis-Tris-HCl 15 mM, pH 7.0, EDTA 5 mM, NaN3 0.02%, PMSF 0.1 µM

Buffer de exclusión: citrato-fosfato 50 mM, pH 5.5, NaCl 200 mM, NaN3 0.02%.

Gel separador: El gel separador al 10% se preparó con 3.3 mL de solución stock de acrilamida (acrilamida

3%, bis-acrilamida 0.08%), mezclado con 2.5 mL de buffer de separación (Tris-HCl 1.5 M, pH 8.8) y 4.1 mL

de agua. Para geles desnaturalizantes se añadió SDS a una concentración final de 0.4%. Se añadió 50 L

de persulfato de amonio al 10% y 5 L de N,N,N´,N´-tetrametilene-etilendiamina (TEMED) para permitir la

polimerización de la solución.

Gel concentrador: El gel concentrador al 5% se preparó mezclando 670 L de solución stock de acrilamida

con 1 mL de buffer concentrador (Tris-HCl 0.5 M, pH 6.8 para geles nativos y Tris-HCl 0.5 M pH 6.8 y SDS

0.4% para geles desnaturalizantes) y 2.3 mL de agua. Se añadió 30 L de persulfato de amonio y 5 L de

TEMED. Esta solución se pipeteó sobre el gel de separación polimerizado, insertando un peine

electroforético y se permitió su polimerización.

Buffer de muestra: Tris-HCl 312.5 mM pH 6.8, glicerol 50% y azul de bromofenol 0.05% para geles nativos

y Tris 1 M, glicerol 50%, azul de bromofenol 0.05% y SDS 10% para geles desnaturalizantes.

Solución de tinción: Azul Coomassie R-250 0.2%, metanol 90%, ácido acético glacial 10%.

Solución de desteñido: Metanol 10%, ácido acético glacial 10%.

Buffer de extracción de ADN: Tris-HCl 100 mM, EDTA 25 mM, NaCl 250 mM, SDS 0.5%, pH 8.0.

Buffer TE: Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8.0.

Buffer TAE: Tris-HCl 40 mM, ácido acético 20 mM, EDTA 1mM.

Buffer de extracción de ARN: Tris-HCl 100 mM, EDTA 15 mM, NaCl 200 mM, sarcosyl 0.5%.

199

Bromuro de etidio: 4 µL de bromuro de etidio de una solución stock de 10 mg/mL por cada 100 mL de

TAE.

Buffer de carga: Tis-HCl 10 mM pH 7.6, azul de bromofenol 0.03%, cianol xileno 0.03%, glicerol 60%,

EDTA 60 mM.

Buffer de transcripción: Tris-HCl 250 mM, pH 8.3, KCl 375 mM, MgCl2 15 mM.

Buffer de PCR: Tris-HCl 200 mM, pH 8.4, KCl 500 mM.

Medio Luria Bertani: Bactotriptona 1%, extracto de levadura 0.5%, NaCl 1%, pH 7.0.

Buffer de ligación 10××××: Tris-HCl 300 mM pH 7.8, MgCl2 20 mM, DTT 20 mM, ATP 2 mM, polietilenglicol

10%.

Buffer O+: Tris-HCl 50 mM pH 7.5, MgCl2 10 mM, NaCl 100 mM, BSA 0.1 mg/mL.

Medio YPD: Extracto de levadura 1%, peptona 2%, dextrosa 2%, pH 7.0.

200

APÉNDICE B. ANÁLISIS DE FRAGMENTACIÓN DE PMAA

1.- 2,5-Di-O-acetil-2-deuterio-1,3,4,6-tetra-O-metil-hexitol (-glucitol y -manitol) (β-D-Fruf-t)

201

2.- 1,5-Di-O-acetil-(1-deuterio)-2,3,4,6-tetra-O-metil-glucitol (α-D-Glcp-t)

202

3.- 2,5,6-Tri-O-acetil-(2-deuterio)-1,3,4-tri-O-metil-manitol (D-Fruf-β2-6)

203

4.- 1,2,5-Tri-O-acetil-(2-deuterio)-3,4,6-tri-O-metil-manitol (D-Fruf-β2-1)

204

5.- 2,5,6-Tri-O-acetil-(2-deuterio)-1,3,4-tri-O-metil-glucitol + 1,2,5-Tri-O-acetil-(2-deuterio)-3,4,6-tri-O-metil-glucitol [D-Fruf- β- (2→1)/ (2→6)]

205

6.- 1,5,6-Tri-O-acetil-(1-deuterio)-2,3,4-tri-O-metil-glucitol (α-D-Glcp-i)

206

7.- 1,2,5,6-Tetra-O-acetil-(2-deuterio)-3,4-di-O-metil-hexitol (-glucitol y -manitol) (1,6-di-β-D-Fruf)

207

APÉNDICE C. DESPLAZAMIENTOS QUÍMICOS DE 13C-FRUCTANOS El valor de los desplazamientos es en ppm; Fx indica el número de carbono en la fructosa; Gx el correspondiente a la glucosa; donde se muestra se

indica los asignamientos reportados en la literatura: -t, residuo terminal; -i, (2-1), residuo interno con enlace β(2-1); -i, (2-6), residuo interno con

enlace β(2-6); -r, residuo ramificado; -glc, glucosa interna. n.d., no detectado; n.r., no reportado.

Carbono Suc Suc 1-Kes 1-Kes 6-Kes 6-Kes 6G-Kes 6G-Kes 6G-Kes

De Bruyn y Van Loo,

1991

Carpita et al., 1991

De Bruyn y Van Loo,

1991

Shiomi, 1993

Liu et al., 1991

Praznik et al 1992

Shiomi, 1993 Liu et al., 1991

De Bruyn y Van Loo,

1991 F1 62.5 64.07 61.7 61.04-t 59.48-t 61.4-t 62.19-t 61.13-O1 61 61.2 61.50-i 60.88-i 62.4-i 60.94-t 59.89-O6 61.1 F2 104.5 106.38 104.1 104.34-t 103.35-t 104.9-t 104.45-t 103.29-O1 104.5 104.5 103.86-i 103.35-i 104.9-i 104.43-t 103.24-O6 104.5 F3 77.8 79.11 77.5 77.25 76.20-t 77.8-t 77.52 75.94-O1 77.1 77.5 75.81-i 77.4-i 76.97 76.47-O6 77.6 F4 75.4 76.71 75.2 75.09 74.35-t 75.9-t 75.08 73.57-O1 75.2 74.7 74.47 74.01-i 75.5-i 74.67 74.01-O6 74.7 F5 82.2 84.07 81.9 81.82 80.77-t 82.3-t 82.08 80.70-O1 81.9 82 81.73 79.86-i 81.4-i 81.88 80.90-O6 82.1 F6 63.2 65.11 62.9 62.98 62.20-t 63.7-t 63.16 61.96-O1 63.2 63.1 62.81 62.58-i 64.1-i 63.09 61.93-O6 63.2

G1 92.9 n.r. 93.3 93.1 91.72 93.2 92.85 91.56 92.8 G2 71.9 n.r. 71.9 71.75 70.65 72.1 71.8 70.58 71.8 G3 73.4 n.r. 73.4 73.21 72.19 73.7 71.13 72.03 73.2 G4 70 n.r. 70 69.83 68.88 70.4 69.79 68.81 70 G5 73.2 n.r. 73.2 73.03 71.99 73.5 72.23 71.11 72.4 G6 61 n.r. 60.9 60.74 59.94 61 61.13 59.95 60.9

208

Carbono Nis

FFGF FGFF

Inulina

Inulina

Inulina

C. intybus β(2-1)

C. intybus

β(2-1) H.tuberosus

β(2-1) Shiomi, 1993 Shiomi, 1993 Shiomi, 1993 Shiomi, 1993 Spies et al.,

1992 Goto et al.,

1995 Sims et al.,

2001 Carpita et al.,

1991 Sims et al.,

2001 F1 61.08-t 62.19-t 61.11-t 61.50-t 61.7 61.8 63.55 n.r. 61.74-i 61.38-i 60.93-t 61.58-i 63.17 61.55-i 61.73-i F2 104.38-t 104.44-t 104.46-t 104.4-t 104.1 103.93 105.3-t 105.88 105.3-t 103.93-i 104.37-t 104.38-t 103.95-i 104.9-i 106.34 104.7- 103.74-i 103.73-i 103.99-i 103.89-i 104.9-i 103.85-i 103.79-i F3 78.2 78.37 77.52 77.73 77.8 78.04 79.67 77.49 77.48 77.3 77.67 79.99 77.43 76.96 77.15 77.45 79.46 F4 75.15 75.08 75.17 75.06 75.1 75.35 76.97 75.03 75.04 75.06 75.03 76.65 74.57 74.67 74.49 74.96 F5 81.93 82.08 81.93 81.78 81.9 81.91 83.75 81.78 81.88 81.84 F6 62.97 63.16 63.04 62.98 63 62.99 64.82 62.94 63.09 62.92 62.94 62.9 62.82

G1 93.2 92.74 92.99 93.18 n.r. 93.2 94.1 n.r. 94.1-t G2 71.88 71.76 71.77 71.9 n.r. 72.03 n.r. G3 73.3 73.15 73.16 73.3 n.r. 73.59 n.r. G4 69.92 69.89 69.88 69.92 n.r. 70.23 n.r. G5 73.14 72.19 72.28 73.13 n.r. 73.24 n.r. G6 60.81 61.09 61 60.8 n.r. 61.17 n.r.

209

Carbono P. sochifolia

β(2-1) Levano β(2-6)

Levano β(2-6)

F. arundinacea

β(2-6) P. peisonis

β(2-6) P. pratense

β(2-6) A. cepa

Neo T. aestivum Graminano

Goto et al., 1995

Goto et al., 1995

Shiomi, 1993

Carpita et al., 1991 Spies et al., 1992

Sims et al., 2001

Sims et al., 2001

Carpita et al., 1991

F1 61.61-t 61.27 60.8 62.61 60.8-t n.r. n.r. 63.23 61.84-i 63.11 60.8-i, (2-6) 62.82 62.08-glc 63.75 F2 104.53-t 104.95 105.04 106.91 104.8-t 105.3-t 105.3-t 106.36 104-i 106.5 105.1-i 105.6, 2-6-i 104.7-104.9-i 106.19 104.14-glc 106.33 106.91 105.95 F3 77.82-t 77.56 77.2 78.99 77.5-t 79.54 78.20-i 79.4 77.2-i 79.32 77.89-glc 79.71 F4 75.46-t 76.26 76.07 77.91 75.4-t 79.13 75.38-i 77.3 77.11 74.93-glc F5 81.99-t 81.06 81.13 82.99 76.1-i 78.04 82.00-i 83.84 77.47 82.18-glc F6 63.02-t 64.21 64.2 66.1 82.0-t 83.03 63.10-i 65.17 81.2-t 83.79 63.15-glc 64.89

G1 93.35 n.r. n.r. 63.3-t 66.12 G2 72.08 n.r. n.r. 64.3-i 65.06 G3 73.57 n.r. n.r. 64.94, 65.35 G4 70.24 n.r. n.r. 93 94.1-t 94.1-t n.r. G5 73.34 n.r. n.r. 71.9 93.6-i n.r. G6 61.17 n.r. n.r. 73.5 n.r.

210

Carbono A. repens Mezcla compleja

A. officinalis Asparagosina

Phormium tenax/cookianum

C. australis Mezcla compleja

U. maritima Mezcla compleja

Spies et al., 1992 Shiomi, 1993 Sims et al, 2001 Brasch et al., 1988 Spies et al., 1992 F1 60.80-t 61.27-t n.r. 61.40 60.80-t 60.80-i, (2-6) 61.13-t 61.50 61.20-i, (2-1) 61.20-r 61.08-t 61.80 60.70-i, (2-6) 61.77-i 62.10 60.80-r

61.55-i 61.49-i

61.46-i 61.40-i 61.35-i F2 104.50-t 104.26t 105.30-t 104.40 104.50-t 105.00-i,( 2-6) 103.90-i 104.70-i, (2-1) 104.50 104.00-i, (2-1) 104.30-r 103.87-i 104.90-i, (2-1) 104.90-t 104.90-i, (2-6) 183.81-i 105.60-i, (2-6) 105.00-r 104.60-r 103.76-i 105.50-r 105.30-i 103.69-i 103.64-i F3 77.50-t 78.08 n.r. 77.90 77.50-t 77.10-i, (2-6) 78.04 78.10 77.50-i, (2-1) 77.50-r 77.94 78.40 77.30-i, (2-6) 77.93 78.60 77.50-r 77.86 77.84 77.78 77.75 77.71 77.70 77.66 77.63 77.42

211

F4 75.10-t 75.09 n.r. 75.70 75.40-t 75.70-i, (2-6) 75.03 76.00 75.20-i, (2-1) 75.70-r 75.00 76.50 76.00-i, (2-6) 74.96 76.70 75.90-r 74.93 74.85 74.82 74.43 F5 81.90-t 81.74 n.r. 81.10 81.90-t 81.10-i, (2-6) 81.30 81.90-i, (2-1) 81.10-r 81.50 81.00-i, (2-6) y -r 82.40 82.50 F6 63.10-t 63.00 n.r. 63.50 63.40-t 64.20-i, (2-6) 62.95 63.50 63.10-i, (2-1) 64.00-r 62.91 64.00 64.00-i, (2-6) y -t 62.87 64.40 62.83 62.71

G1 n.r. 92.85 94.10-t 93.40, 93.70 n.d. G2 n.r. 71.80 93.60-i 72.40 n.d. G3 n.r. 73.13 n.r. 73.90 n.d. G4 n.r. 69.79 n.r. 70.50, 71.00 n.d. G5 n.r. 72.23 n.r. 73.70 n.d. G6 n.r. 61.13 n.r. 68.90 n.d.

212

APÉNDICE D. SECUENCIAS AISLADAS

TAC CAT TTC CAG CCA CCG CGA AAT TGG ATC AAC GAT CCA Y H F Q P P R N W I N D P

AAT GGA CCA ATG TAT TAT AAT GGC ATC TAC CAC CTC TTC N G P M Y Y N G I Y H L F

TAT CAG TAC AAC CCC TAC GGT GCA GTG TGG GGC AAC ATT Y Q Y N P Y G A V W G N I

GTG TGG GCC CAC TCA GTT TCA ACG GAC ATG ATC AAT TGG V W A H S V S T D M I N W

AAG GCA CTC GAA CCC GCG ATC TAC CCG TCC AAA CCC TTT K A L E P A I Y P S K P F

GAC GTT AAC GGG TGC TGG TCC GGG TCG GCT ACC ATC CTC D V N G C W S G S A T I L

CCG GGT AAC AAA CCC GCC ATC CTC TAC ACG GGT ATC GAC P G N K P A I L Y T G I D

CCG CAA AAC AGG CAG GTC CAA AAC ATT GCG TTC CCA AAA P Q N R Q V Q N I A F P K

AAC CTG TCC GAC CCG TAT CTT CGC GAA TGG GTC AAA CCC N L S D P Y L R E W V K P

GAT TAC AAC CCG ATA ATT GCC CCC GTC AAC GGG ATC AAC D Y N P I I A P V N G I N

GCT AGT GCG TTC CGC GAC CCG ACA ACG GCC TGG CAC GGT A S A F R D P T T A W H G

CCG GAC GGG CAC TGG AGG CTG GTG ATT GGG AGC AAG AGG P D G H W R L V I G S K R

AAG CAC AGG GGG ATG GCC ATC ATG TAC CGG AGC CGG GAC K H R G M A I M Y R S R D

TTT ATT AAC TGG ATC CGG GCG AAG CAC CCG TTA CAC TCT F I N W I R A K H P L H S

GCT AAC GGT ACG GGT ATG TGG GAA TGC ATT A N G T G M W E C I Secuencia At-FEH. En la parte superior se muestra la secuencia del ADNc y en la parte inferior y en negrilla, el producto de su traducción.

213

TGG GGC CAT GCT GTA TCC AGA GAC CTA GTC CAC TGG ACT W G H A V S R D L V H W T

CAC CTA CCC CTA GCC ATG GTC CCA GAC CAA TGG TAC GAC H L P L A M V P D Q W Y D

ATC AAC GGC GTC TGG ACC GGG TCG GCC ACC ATC CTA CCG I N G V W T G S A T I L P

GAC GGC CAA ATC GTC ATG TTG TAC ACC GGG GCC ACC AAC D G Q I V M L Y T G A T N

GAA TCG GTC CAA GTC CAG AAC TTA GCG GTC CCA GCA GAT E S V Q V Q N L A V P A D

CAG TCC GAC ACG TTA CTC CTG AGA TGG AAG AAG TCC GAG Q S D T L L L R W K K S E

GCC AAC CCC ATC CTG GTC CCT CCC CCA GGC ATA GGG GAC A N P I L V P P P G I G D

AAG GAC TTC AGG GAC CCC ACC ACA GCA TGG TAC GAA CCT K D F R D P T T A W Y E P

TCC GAC GAC ACA TGG CGC ATC GTG ATC GGC TCC AAG GAC S D D T W R I V I G S K D

TCC TCC CAT AGC GGC ATC GCC ATC GTC TAC AGC ACC AAG S S H S G I A I V Y S T K

GAC TTC ATC AAC TAC AAA CTC ATC CCT GGG ATC CTC CAT D F I N Y K L I P G I L H

GCG GTG GAG CGG GTT GGT ATG TGG GAA TGC GTT A V E R V G M W E C V Secuencia At-Inv. En la parte superior se muestra la secuencia del ADNc y en la parte inferior y en negrilla, el producto de su traducción.

214

TAC CAT TTC CAG CCC CCA AGA TAT TTT ATG AGC GAT CCC Y H F Q P P R Y F M S D P

AGC GGT CCC GTG TAC TAC AAG GGT TGG TAC CAT TTC TTC S G P V Y Y K G W Y H F F

TAC CAA CAC AAT GCA AAA GCT GCA TTC TGG GGC AAC ATT Y Q H N A K A A F W G N I

GCA TGG GGT CAT GCT GCG TCT CGT GAC CTC CTC AAC TGG A W G H A A S R D L L N W

GTC CAC CTA CCC TTG GCT GTG GAA CCG GAC CAT TGG TAT V H L P L A V E P D H W Y

GAT ATT GAA GGT GAC TGG ACG GGC TCA GTT GCG GTA TTA D I E G D W T G S V A V L

CCT GAT GGT CGG GTC ATA ATG CTA TTC ACT GGT GGT ACC P D G R V I M L F T G G T

GGT GCG AAT GAG CTG GCA CAG GTC GTC AAT CTT GCG GTG G A N E L A Q V V N L A V

GCT GCC GAT CCC TCG GGT CCA CTC CTG ATG GAA TGG ATC A A D P S G P L L M E W I

AAG TAT GAT GCA AAC CCA GTG CTG CAT CCT CCG CGT GGC K Y D A N P V L H P P R G

ATC GGC CTC AAG GAC TTC AGG GAC CCC AAT CCA GTC TGG I G L K D F R D P N P V W

TAT AAC TCA TTA GAA TCC ACA TGG TAC GTA GTG GCT GGC Y N S L E S T W Y V V A G

TCC AAG AAT GAT TCA TTA TCC CAC ACT GGT ATT GCT CTT S K N D S L S H T G I A L

GTT TAC ACC ACC AAA GAC TTT CTC TCC TAC ACT CTC CTC V Y T T K D F L S Y T L L

CCC GGT GTC CTC CAC GCT GTT GAT ATT GTC GGC ATG TGG P G V L H A V D I V G M W

GAG TGC GTT GA E C V Secuencia At-FT. En la parte superior se muestra la secuencia del ADNc y en la parte inferior y en negrilla, el producto de su traducción.

215

TGCGTTTGCTGGCTTTGATGAAAGTGTCTCAACCCTTCACCCATTTTCTTCACTTGGTCG

M K V S Q P F T H F L H L V

GGTGTTATTACGCTCACCGGCGGTGACCTCACCACC ATG GGC TCG CAG GAC G C Y Y A H R R Alto M G S Q D

GTC GAG TCT GCT CGC TCG CTG CAC GCC CCC ATC GTC GGT TCC CCT V E S A R S L H A P I V G S P

CCT CCG CGG AGG ACG TTA ACG TTA AGA TCA CTC TCC CTC GCC CTG P P R R T L T L R S L S L A L

TCC GTC GTC GCC TTC CTC CTT GCT GCG GCC CTT TTA CTC AGT AAG

S V V A F L L A ⇓⇓⇓⇓ A A L L L S K

TCG GGT TCG GTT CCG AAC CCG AAT CAA GGA CTG GAT GCA ATA TTG S G S V P N P N Q G L D A I L

GCT CCA TTA CCG CAA TCG GGT GCG GGT TTG GGT GAG GAG GAC TAC

A P L P Q S G A G L G E ↓↓↓↓ E D Y CCG TTT ACC ACT AAG ATG CTG CAG TGG CAG CAC ACC GGG TTC CAT P F T T K M L Q W Q H T G F H

TTC CAA CCC CCA AGA TAT TTT ATG AGC GAT CCC AGC GGT CCC GTG F Q P P R Y F M S D P S G P V

TAC TAC AAG GGT TGG CAC CAT TTC TTC TAC CAA CAC AAT GCA AAA Y Y K G W H H F F Y Q H N A K

GCT GCA TTC TGG GGC AAC ATT GCA TGG GGT CAT GCT GCG TCT CGT A A F W G N I A W G H A A S R

GAC CTC CTC AAC TGG GTC CAC CTA CCC TTG GCT GTG GAA CCG GAC D L L N W V H L P L A V E P D

CAT TGG TAT GAT ATT GAA GGT GAC TGG ACG GGC TCA GTT GCG GTA H W Y D I E G D W T G S V A V

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Secuencia AtFT. Secuencia completa del ADNc amplificado; en cuadros negros se muestra el codón de inicio (ATG) y de terminación (TGA); así como los sitios probables de ruptura del péptido señal (⇓) y el péptido líder (↓) para generar la proteína madura. Se muestra las regiones 5´- y 3´-UTR (región poli-A). En la zona 5´-UTR se marca con negrillas un marco de lectura previo al inicio de la proteína madura.

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CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y ESTUDIOS … · 2012-10-30 · centro de investigaciÓn y estudios avanzados del instituto politÉcnico nacional unidad de biotecnologÍa e ingenierÍa