CENTRO DE INVESTIGACIÓN Y DE ESTUDIOS

AVANZADOS DEL INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL.

UNIDAD IRAPUATO.

Desarrollo de un nuevo método de transformación genética en el reino

fungi.

Tesis que presenta

IBQ. Denis Israel Magaña Ortíz.

Para Obtener el Grado de

Maestro en Ciencias.

En la Especialidad de

Biotecnología de plantas.

Director de la Tesis: Dr. Miguel Ángel Gómez Lim.

Irapuato, Guanajuato. Agosto, 2010.

ii

iii

AGRADECIMIENTOS. Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT), por el soporte institucional y monetario con la beca número 22655 para la realización de los estudios de Maestría presentados en este trabajo. A los integrantes del Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional, Unidad Irapuato, por permitirme cursar mis estudios de posgrado en una institución de alta calidad y que proporciona una excelente formación humana. A la Universidad Nacional Autónoma de México por los recursos económicos para la realización de los experimentos desarrollados en esta tesis. Al Dr. Miguel Ángel Gómez Lim, por la oportunidad de unirme a su grupo de trabajo, por su deseo de escuchar y comprender las ideas de sus alumnos, por su disposición a resolver cualquier duda con paciencia y serenidad, por su confianza en el desarrollo del proyecto, en fin, por todo el apoyo brindado a lo largo de mis estudios cursados. Al Dr. Achim Loske Mehling cuya asesoría, confianza, conocimientos y excelente disposición permitieron el desarrollo de los experimentos cruciales que se detallan en este trabajo. A los integrantes del Laboratorio de Ondas de Choque del Centro de Física Aplicada y Tecnología Avanzada de la Universidad Nacional Autónoma de México, en especial a la QFI. Concepción Arredondo, al M. en C. Francisco Fernández y a Erick Ramos Espinoza sin cuyo apoyo y deseo sincero de colaborar esta tesis no hubiera sido posible. A mi cotutora Dra. Elizabeth de la Luz Ortíz Vazquéz, por su completa disposición a compartir sus conocimientos, sugerencias, críticas de una manera amable y diáfana durante toda mi formación profesional. Le estoy infinitamente agradecido por su amistad y confianza demostrada sobre todo en los momentos más difíciles de mi vida. A la Dra. Dora Linda Guzmán por dedicarme tiempo para el análisis de mis resultados, para corregir mis errores, y cuyas propuestas permitieron mejorar sustancialmente este trabajo de tesis. Todo lo anterior con amabilidad, confianza y apoyo sincero. A mis compañeros de laboratorio de Laboratorio de Plantas Tropicales y Salud Humana del Departamento de Ingeniería Genética, que siempre estuvieron dispuestos a colaborar, a opinar, resolver dudas, y fomentar un buen ambiente de trabajo. Agradezco en especial a Margarita y a Lina su amistad y apoyo. Al Biól. Luis Jorge Saucedo por la confianza y disposición plena en el desarrollo de mis experimentos. Al Dr. Francisco Luna cuya oportuna asesoría me permitió resolver numerosas dudas en la fase experimental de mi trabajo.

iv

DEDICATORIA.

Quiero dedicar esta tesis en primer lugar a mi familia, por todo lo que ha hecho por mí. A Nancy, quien ha llenado mi vida de felicidad sin condiciones. A mi mejor amigo Héctor, quien me ha ayudado a superarme en múltiples aspectos de mi vida a lo largo de estos años. A la familia Cordourier Maruri por su apoyo en los días más complicados. Al Mtro. José Luis Domínguez quien siempre estuvo dispuesto a compartir su sabiduría y tiempo conmigo. A Carmen Silverio, Marianne Luna, Andrea Rojas, William Pereira, Claudia Torres, Mario Mex, David Chan y Christian Ávila que a pesar del tiempo y la distancia me demuestran lo valioso de la amistad. A Hypatia Arano por su valioso apoyo y tierna amistad otorgados a lo largo de mi estancia en la maestría. A mis compañeros y amigos de la maestría, en especial a Hernán López, Juliana Medina, Alondra Ortega, Diana Ascencio, Omar Córdova e Ithaí Ángeles.

v

ÍNDICE GENERAL.

Página

ÍNDICE DE FIGURAS. ix

ÍNDICE DE TABLAS xi

ABSTRACT. xii

RESUMEN xiii

ANTECEDENTES. 1

1.1. Impacto biotecnológico de los hongos. 1

2.1. La transformación genética de hongos. 3

2.1.1. Transformación por electroporación. 3

2.1.2. Transformación por biobalística. 6

2.1.3. Transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens. 9

2.1.4. Transformación por medio de protoplastos. 13

2.2. Transformación de células por medio de ondas de choque. 15

2.2.1. Conceptos básicos de la física de ondas de choque. 15

2.2.2. Conceptos básicos del equipo de litotripsia extracorporal

utilizado en este trabajo.

17

2.2.3. Evidencias de la transformación de células por cavitación

acústica.

19

2.3. Especies de hongos utilizados en este trabajo. 20

2.3.1. El hongo ascomiceto Aspergillus niger. 20

2.3.1.1. Importancia biotecnológica de la actividad

proteolítica de Aspergillus niger.

22

2.3.2. El hongo Colletotrichum gloeosporioides. 24

2.3.3. El hongo Fusarium solani. 25

2.3.4. La levadura Saccharomyces cerevisiae. 26

JUSTIFICACIÓN. 29

vi

HIPÓTESIS. 30

OBJETIVO GENERAL. 31

OBJETIVOS ESPECÍFICOS. 31

METODOLOGÍA. 32

1. Cepas utilizadas en este trabajo. 32

2. Plásmidos utilizados en este trabajo y extracción de ADN

plasmídico.

32

3. Establecimiento de las concentraciones inhibitorias de

higromicina.

33

4. Estandarización de la cantidad y calidad del inóculo. 34

5. Descripción del equipo experimental. 35

6. Preparación y procesamiento de las muestras. 37

6.1. Protocolo de transformación genética de las especies

Fusarium solani y Colletotrichum gloeosporioides.

37

6.2. Protocolo de transformación genética del hongo

Aspergillus niger.

38

6.3. Protocolo de transformación de la levadura

Saccharomyces cerevisiae.

39

7. Extracción de ADN de hongos filamentosos. 39

8. Extracción de ADN de la levadura Saccharomyces

cerevisiae.

40

9. Escrutinio de probables cepas transformadas. 41

RESULTADOS. 44

1. Transformación genética del hongo Fusarium solani. 44

2. Transformación genética del hongo Colletotrichum

gloeosporioides.

47

3. Transformación genética de la levadura Saccharomyces 49

vii

cerevisiae.

4. Transformación genética del hongo Aspergillus niger. 54

4. 1. Protocolos de selección con higromicina. 54

4. 2. Protocolos de transformación con la construcción

pepA- y gen de selección a fleomicina.

58

DISCUSIÓN. 63

1. Transformación genética del hongo Fusarium solani. 63

2. Transformación genética del hongo Colletotrichum

gloeosporioides.

64

3. Transformación genética de la levadura Saccharomyces

cerevisiae.

65

4. Transformación genética del hongo Aspergillus niger. 67

CONCLUSIONES. 69

BIBLIOGRAFÍA. 70

APÉNDICE. Medios de cultivo. 78

viii

ÍNDICE DE FIGURAS.

Pág.

Figura 1. Mecanismo postulado de captación de ADN en los equipos de

electroporación por incremento de tensión en la superficie celular. 4

Figura 2. Mecanismo postulado de la captación de ADN en un campo eléctrico

mediante la desestabilización de la membrana y posterior formación de vesículas. 5

Figura 3. Resultados obtenidos en la transformación de Trichoderma harzanium por

electroporación 6

Figura 4. Efecto de la presión de helio en el número de transformantes de

Aspergillus nidulans durante los protocolos de biobalística 9

Figura 5. Espectro típico de cambios de presión generados por ondas de choque. 17

Figura 6. Esquema básico del equipo piezoeléctrico utilizado en este trabajo. 19

Figura 7. Clasificación funcional de los marcos de lectura (ORFs) de Aspergillus

niger de acuerdo a las categorías Funcat. 22

Figura 8. Unidad de ultrasonido y control principal del equipo Piezolith 2300 36

Figura 9. Sistema piezoeléctrico y unidad de disparo del equipo Piezolith 2300. 36

Figura 10. Morfología microscópica de micelio de las cepas silvestre y resistente a

higromicina de Fusarium solani. 45

Figura 11. Gel de electroforesis de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

correspondiente a los protocolos de transformación de Fusarium solani. 46

Figura 12. Gel de electroforesis de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

correspondiente a los protocolos de transformación de Colletotrichum

gloeosporioides.

48

Figura 13. Cepas protótrofas a triptófano de Saccharomyces cerevisiae obtenidas

por medio de ondas de choque. 51

Figura 14. Propagación en medio líquido de cepas protótrofas a triptófano de

Saccharomyces cerevisiae obtenidas por medio de ondas de choque. 52

Figura 15. Gel de electroforesis de muestras de extracción de ADN y PCR

correspondientes a los protocolos de transformación de Saccharomyces cerevisiae. 53

Figura 16. Curva de calibración de número de colonias viables versus absorbancia

a 420 nm de la cepa ATCC 1015 de Aspergillus niger. 54

Figura 17. Curva de calibración de número de conidios versus absorbancia a 420

nm de la cepa ATCC 1015 de Aspergillus niger. 55

ix

Figura 18. Cepas de Aspergillus niger propagadas en medio selectivo con

higromicina (100 µg/ml). 57

Figura 19. Gel de electroforesis de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

correspondiente a los protocolos de transformación de Aspergillus niger. 57

Figura 20. Expresión de la proteína verde fluorescente (GFP) en una de las cepas

resistentes a higromicina. 58

Figura 21. Esquema de la construcción pepA- ensamblada en este trabajo para el

aislamiento de cepas de Aspergillus niger deficientes en proteasas. 60

Figura 22. Gel de electroforesis que muestra el análisis de restricción de la

construcción pepA- clonada en el vector SK+. 60

Figura 23. Cepas generadas durante los protocolos de transformación de

Aspergillus niger por medio de ondas de choque con el gen de resistencia a

fleomicina

61

Figura 24. Cepas deficientes en proteasas generadas durante los protocolos de

transformación de Aspergillus niger por medio de ondas de choque. 62

x

ÍNDICE DE TABLAS.

Pág.

Tabla 1. Ejemplos seleccionados de compuestos comercialmente importantes

producidos por hongos. 2

Tabla 2. Especies (Fungi y oomicetos) transformadas en núcleo celular por

biobalística. 8

Tabla 3. Condiciones óptimas para la transformación de Aspergillus nidulans y

Trichoderma harzanium por medio de biobalística. 8

Tabla 4. Ejemplos de organismos no vegetales que han sido transformados por

Agrobacterium tumefaciens en condiciones de laboratorio. 12

Tabla 5. Características genómicas del hongo Aspergillus niger cepa CBS 513.88. 21

Tabla 6. Características generales del genoma de Nectria heamatoccoca. 25

Tabla 7. Concentraciones de selección establecidas con higromicina de las

especies utilizadas en este trabajo. 34

Tabla 8. Número de probables transformantes obtenidos con tres repeticiones del

protocolo de transformación de Fusarium solani por medio de ondas de choque. 44

Tabla 9. Parámetros relevantes del protocolo de transformación de Fusarium solani

por medio de ondas de choque. 45

Tabla 10. Número de probables transformantes obtenidos con tres repeticiones del

protocolo de transformación de Colletotrichum gloeosporioides por medio de ondas

de choque.

47

Tabla 11. Parámetros estandarizados para el protocolo de transformación de

Colletotrichum gloeosporioides por medio de ondas de choque. 49

Tabla 12. Número de probables transformantes obtenidos tres repeticiones del

protocolo de transformación de Saccharomyces cerevisiae por medio de ondas de

choque con 150 pulsos.

50

Tabla 13. Parámetros estandarizados para el protocolo de transformación de

Saccharomyces cerevisiae por medio de ondas de choque. 51

Tabla 14. Valores obtenidos para las curvas de calibración de absorbancia a 420

nm de los conidios de la cepa de Aspergillus niger ATCC 1015. 54

Tabla 15. Número de probables transformantes obtenidos tres repeticiones del

protocolo de transformación de Aspergillus niger por medio de ondas de choque

con 100 pulsos.

56

Tabla 16. Parámetros estandarizados para el protocolo de transformación de

Aspergillus niger por medio de ondas de choque. 56

xi

Tabla 17. Número de probables transformantes obtenidos con la construcción

pepA- con conidios de la cepa ATCC 1015 de Aspergillus niger. 60

Tabla 18. Parámetros estandarizados para el protocolo de transformación de

Aspergillus niger por medio de ondas de choque con el gen pepA-. 61

xii

ABSTRACT.

The kingdom Fungi includes a diverse group of organisms, all of them are characterized by

morphological and metabolic diversity. Fungi are eukaryotic organisms, heterotrophic, non-

photosynthetic, thereby their nutrition is by absorption from their surroundings. All of these features

made fungi valuable tool as model systems. The development of molecular biology and massive

genomes sequencing allow a better comprehension and description of metabolism and evolution of

Fungi. However, to exploit all the potential of genetic manipulation of these organisms is difficult

and there are several problems to insert genes of importance in science and industry. Most of the

current methodologies to achieve genetic manipulation (protoplast transformation, electroporation,

biolistic, Agrobacterium-mediated transformation) have deficiencies of success and reproducibility.

In this work a new methodology for genetic transformation with high efficiency in Fungi was

developed and the stability of transformants was demonstrated. The application of shockwaves

produced by a piezoelectric generator, as used in urinary stone fragmentationi (extracorporeal

shockwave lithotripsy), allowed the insertion of reporter genes in diverse groups of Fungi as

Colletotrichum gloeosporioides, Fusarium solani, Saccharomyces cerevisiae and Aspergillus niger.

The genetic transformation was validated by polymerase chain reaction (PCR). In Aspergillus niger

the genetic transformation was evaluated by the expression of green fluorescent protein (GFP). The

results show that the efficiency with this new method was higher than efficiency of the usage of

protoplast. In Colletotrichum gloeosporioides the efficiency was 7.3% (compared with 0.0018%), in

Fusarium solani, the efficiency was 0.6% (compared with 0.0001%) and finally, in Aspergillus niger

the calculated efficiency was 0.53% (compared with 0.005%). In the case of the yeast

Saccharomyces cerevisiae the efficiency was higher than the chemical procedures (0.0086%

compared with 0.00084%). In another group of experiments, a genetic construction of argillopepsin

A disrupted by the gene of resistance to fleomicin was assembly. The transformation of Aspergillus

niger ATCC 1015 with this construction permits the isolation of protease deficient strains. The

efficiency in this last protocol was 0.74%.

xiii

RESUMEN.

El reino fungi está integrado por grupos de microorganismos que se caracterizan por su gran

diversidad metabólica y morfológica, así como variabilidad intrínseca. Son organismos eucarióticos,

heterótrofos, carecen de sistema fotosintético, son unicelulares o pluricelulares y adquieren los

nutrientes por absorción. Todas estas características han hecho a los hongos valiosas

herramientas como modelos de estudio. Con el advenimiento de la biología molecular y la

secuenciación de genomas existe la posibilidad de una mejor comprensión del metabolismo y

evolución de los hongos. Sin embargo, ante la posibilidad de manipular genéticamente estos

microorganismos se presentan numerosas problemáticas para la inserción de los genes de interés.

La mayoría de los métodos actuales de transformación (protoplastos, electroporación, biobalística,

transformación mediada por Agrobacterium) presentan desventajas de reproducibilidad y eficiencia.

En este trabajo se desarrolló de un nuevo método de transformación genética para el reino fungi y

se demostró la eficacia del mismo. La aplicación de ondas de choque producidas por un generador

piezoeléctrico del tipo utilizado en la desintegración no invasiva de cálculos renales (litotricia

extracorpórea) permitió la inserción de genes reporteros en diversos grupos de hongos como

Colletotrichum gloeosporioides, Fusarium solani, Aspergillus niger y Saccharomyces cerevisiae. La

presencia de los genes reporteros fue validada por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

En Aspergillus niger la transformación también fue evaluada por la expresión de la proteína verde

fluorescente. Los resultados demuestran que la eficiencia fue mayor a la reportada con el uso de

protoplastos. En Colletotrichum gloeosporioides la eficiencia de transformación fue de 7.3 %

(contra 0.0018%), en Fusarium solani fue de 0.6% (contra 0.0001%) y con Aspergillus niger se

estableció una eficiencia de 0.53% (contra 0.005%). En el caso de la levadura Saccharomyces

cerevisiae la eficiencia también fue mayor a la reportada con métodos químicos: 0.0086% (contra

0.00084%). En otra serie de experimentos, se logró ensamblar una construcción del gen que

codifica para la la argilopepsina A interrumpida por la secuencia del antibiótico de resistencia a

fleomicina. La transformación con esta secuencia ensamblada permitió el aislamiento de cepas

deficientes en proteasas de Aspergillus niger. La eficiencia de este protocolo fue de 0.74%.

1

ANTECEDENTES.

1.1. Impacto biotecnológico de los hongos.

Desde hace varias décadas, los hongos (de ahora en adelante al utilizar la palabra hongos, nos

referimos a los miembros del reino Fungi) han sido objeto de estudios genéticos y biotecnológicos

para la comprensión de la regulación genética, actividad metabólica, y para la producción de

enzimas y otros compuestos recombinantes.

Debido a que los hongos poseen una extraordinaria capacidad de secreción, existe un

creciente interés en la optimización de métodos convencionales y en el desarrollo de nuevos

métodos para introducir genes de interés cuyos productos puedan ser secretados al medio

externo y fácilmente recuperados.

Los métodos actuales de transformación genética desarrollados son poco eficientes, poco

reproducibles y complejos; pero a pesar de estas limitaciones ha sido posible la producción de

diversas proteínas recombinantes por la manipulación genética de hongos.

Son muchas las especies utilizadas a nivel comercial para la producción de enzimas

endógenas o heterólogas, aunque las más utilizadas en el ámbito de la producción de enzimas

recombinantes son Aspergillus niger, Aspergillus oryzae y Trichoderma reesei.

Para dar una idea de la importancia de la industria enzimática, basta decir que el mercado

mundial de enzimas alcanzó los 4 mil millones de dólares en 2004 y su tasa de crecimiento anual

se ha estimado en 6%. Por tanto, se calcula que para el 2011, alcance la cifra de los 6 mil

millones de dólares a nivel mundial (Popper, 2009).

Asimismo, una gran cantidad de antibióticos se han obtenido de hongos a partir del trabajo

pionero de Alexander Fleming con la penicilina. Este metabolito secundario producido

comercialmente por el hongo Penicillium chrysogenum ha permitido salvar millones de vidas y ha

generado un campo fructífero en el desarrollo de compuestos activos para la medicina.

2

Hay muchos compuestos comerciales producidos por hongos (Tabla 1), sin embargo, el

compuesto producido por estos organismos con mayor demanda a nivel mundial es el ácido

cítrico. Se producen anualmente 1.75 millones de toneladas de ácido cítrico con un valor de 1,600

millones de dólares. El hongo utilizado para este proceso es Aspergillus niger debido a su

capacidad de secretar grandes cantidades de este metabolito (Soccol et al. 2006).

Tabla 1. Algunos compuestos comercialmente importantes producidos por hongos (Meyer, 2008).

Compuesto comercial Organismo Área de aplicación principal

Ácido cítrico Aspergillus niger Alimentos y bebidas

Ácido itacónico Aspergillus terreus Industria de polímeros

Alfa-amilasa Aspergillus niger, Aspergillus

oryzae

Procesamiento de almidón e

industria de los alimentos

Quimosina Aspergillus niger Industria alimentaria

Celulasa Trichoderma viride,

Trichoderma reesei.

Industrias textil y papelera

Glucoamilasa Aspergillus phoenices,

Rhizopus delemar

Procesamiento de almidón

Glucosa oxidasa Aspergillus niger, Aspergillus

oryzae

Industria textil

Lacasa Trametes vesicolor Industrias textil y papelera

Cefalosporina Acremonium chrysogenum Industria farmacéutica

Ciclosporina Tolycladium nivenum Industria farmacéutica

Griseofulvina Penicillium griseofulvum Industria farmacéutica

Lovastatina Monascus rubber,

Aspergillus terreus

Industria farmacéutica

Vacunas (Hepatitis B y

papiloma humano)

Saccharomyces cerevisiae Industria biotecnológica y de

salud humana

Taxol Taxomyces andrenae Industria farmacéutica

Una desventaja en la producción de los compuestos referidos en la tabla 1 es la

variabilidad que presentan los hongos en su capacidad metabólica, de tal manera que la

3

transformación genética representa una alternativa para el mejoramiento de los rendimientos en la

producción de metabolitos de interés.

2.1. La transformación genética de hongos.

Se han utilizado numerosas técnicas para la introducción de material genético en muchas

especies de hongos. A continuación se describirán las herramientas más utilizadas.

2.1.1. Transformación por electroporación.

Esta técnica se basa en la permeabilización relativa de las biomembranas inducida por

campos eléctricos de alta intensidad y corta duración. Los primeros ensayos de

electroporación se realizaron en células de ratón deficientes en timidina cinasa (Neumann

et al. 1982). Posteriormente se realizaron ensayos en la cepa de E. coli K12 con la

inserción del plásmido pUC18. La optimización de este protocolo permitió la obtención de

5x109 transformantes por µg de ADN. Esta elevada eficiencia ha convertido la

electroporación en el método de rutina para la transformación de cepas de E. coli en la

gran mayoría de laboratorios del mundo. (Calvin y Hanawalt. 1988).

En forma general el funcionamiento de un equipo de electroporación se basa en la

descarga de un capacitor que produce el campo eléctrico requerido. Este campo eléctrico

de duración de apenas unos 10 µs genera poros instantáneos en la célula y permite el

paso del ADN. Un capacitor es, en breves palabras, un dispositivo de dos placas paralelas

que permite el almacenamiento de corriente eléctrica. El capacitor utilizado en las

diferentes marcas comerciales tiene una capacidad de almacenamiento entre 2 y 1000 µF

y utiliza voltajes entre 200 y 2000 voltios. La carga eléctrica almacenada es liberada de

manera casi inmediata a través de un interruptor electrónico.

El mecanismo de transferencia no está plenamente comprendido. Una de las

hipótesis en torno al proceso de captación en células de mamífero se muestra en la figura

1. La acción del campo eléctrico sobre la superficie celular genera una conductividad y una

tensión eléctrica que terminan por romper de manera reversible la membrana (Imai e Isaka.

4

2002). Al mismo tiempo las cargas electrostáticas ocasionan que las hebras de ADN se

adhieran a la superficie, de tal modo que al ocurrir los rompimientos de dicha superficie, el

ADN puede pasar al interior de la célula.

Por otra parte, la figura 2 muestra un mecanismo donde la corriente eléctrica

inducida por el equipo de electroporación permite la adhesión de partículas de ADN,

desestabiliza la estructura de las membranas y forma vesículas que encierran el ADN y lo

conducen al interior. Se ha postulado también que existe algún mecanismo que transfiere

el ADN al interior de la célula por medio de poros.

A pesar del éxito de la electroporación en bacterias y el uso relativamente común

en células de mamíferos, este método no es práctico en plantas, levaduras y hongos

filamentosos. En el caso de las levaduras el método de electroporación no puede competir

con los altos rendimientos logrados por métodos químicos, además de que requiere la

estandarización de las variables de voltaje y capacitancia para los diferentes tipos de

cepas.

Figura 1. Mecanismo postulado de captación de ADN por incremento de tensión en la

superficie celular (Adaptado de Imai e Isaka. 2002).

Incremento de la tensión generada por el campo eléctrico.

Captación del ADN por rompimientos reversibles de la membrana.

5

Figura 2. Mecanismo postulado de la captación de ADN en un campo eléctrico mediante la

desestabilización de la membrana y posterior formación de vesículas (endocitosis). (Imai e

Isaka. 2002).

Este método es poco eficiente en hongos. En los hongos filamentosos la pared

celular está formada por quitinas, glucanos y glicoproteínas enlazadas de manera

compleja, las interacciones con el campo eléctrico no son lo suficientemente intensas como

para permitir el paso del ADN al interior de las células (Bowman y Free. 2006). Estudios

pioneros en el campo de electroporación en hongos filamentosos mostraron que es

necesario un tratamiento previo de la pared celular para lograr la transformación con genes

reporteros (Goldman et al. 1990). Además se requiere la adición de enzimas hidrolíticas

que degraden compuestos de la pared celular. Asimismo, es necesario añadir

polietilenglicol a la muestra, con el consecuente riesgo de formar complejos multicelulares.

En la figura 3 se muestran los resultados de un ensayo de electroporación con la

especie Trichoderma harzanium utilizando células sensibles a la ósmosis (OSC, por sus

siglas en inglés), este trabajo fue realizado por Goldman y colaboradores en 1990. En la

6

figura puede observarse que el proceso tiene un punto óptimo en el parámetro de 2.8

kV/cm para el campo eléctrico generando 52 transformantes por microgramo de ADN. La

mayor eficiencia en este protocolo utilizando 1.8x109 células sensibles a la ósmosis fue de

apenas 7.5x10-6 %.

Figura 3. Resultados obtenidos en la transformación de Trichoderma harzanium por

electroporación (Datos de Goldman et al. 1990).

2.1.2. Transformación por biobalística.

Este método fue diseñado para realizar la transformación de especies vegetales en las

cuales no existía la posibilidad de transformación por Agrobacterium. La inserción de

partículas por bombardeo ofrece un método rápido de insertar ADN tanto para expresión

transitoria como para lograr una transformación estable. El principal beneficio de este

método es que puede utilizarse tejido intacto, sin someterlo a procesos de degradación de

la pared celular y sus consecuencias.

La mayoría de los protocolos de biobalística utilizan el mismo principio para la

aceleración de partículas y su inserción en el tejido blanco, es decir una fuerza generada

Campo eléctrico (kV/cm).

7

por explosión o expansión de un gas impulsa un transportador, que contiene las partículas

a liberar a través de un canal. De tal manera que el transportador al finalizar su

deslizamiento queda sujeto al equipo que lo impulsa mientras las partículas son dirigidas

hacia el tejido. Esta fuerza puede ser generada por una pistola calibre 22 adaptada, una

descarga de alto voltaje, expansión acelerada de aire comprimido o helio. La muestra suele

colocarse entre 6 a 10 cm del punto de liberación de las partículas.

En la actualidad los equipos de biobalística comerciales utilizan helio para generar

la fuerza necesaria para impulsar las partículas (Sunagawa et al. 2007. Herzog et al. 1996.

Lorito et al. 1993. Finer et al. 1992). Entre los parámetros a estandarizar en estos modelos

se encuentran la cantidad de inóculo, la presión de helio, la distancia entre la liberación de

la partículas y el objetivo, el tipo de transportadores a utilizar y el diámetro de los

microproyectiles.

No es fácil establecer un mecanismo de transformación eficaz para todos los

hongos, por ello el método de biobalística constituye una opción para especies

recalcitrantes o para patógenos obligados. En el caso de los hongos filamentosos los

conidios o micelio pueden ser colocados en medio de agar semisólido. Debido a su baja

eficiencia este método se utiliza en casos donde los protocolos con protoplastos o

Agrobacterium tumefaciens no ofrecen resultados.

Existen varias especies con protocolos establecidos, entre ascomicetos,

basidiomicetos y oomicetos, como se muestra en la tabla 2. En la tabla 3 se detallan las

variables utilizadas en dos de los protocolos reportados. Finalmente, en la figura 4 se

muestra una gráfica del número de transformantes obtenidos (por µg ADN y 1x108

conidios) usando diferentes presiones de helio en psi (libras por pulgada cuadrada). Para

presiones mayores a 1200 psi la eficiencia del método comienza a disminuir de manera

drástica, seguramente por el daño causado al tejido.

La mayor eficiencia calculada en este protocolo, es por tanto, 5x10-6 % con

respecto al número de conidios utilizados.

8

Tabla 2. Especies (Fungi y oomicetos) transformadas en núcleo celular por biobalística.

(Adaptada de Herzog, RW. 1996).

Especie Tejido utilizado Modo de selección Referencia

Aspergillus nidulans Conidios Prototrofía Herzog et al. 1996.

Trichoderma

harzanium

Conidios Resistencia a

higromicina

Lorito et al. 1993.

Gliocladium virens Conidios Resistencia a

higromicina

Lorito et al. 1993.

Phytophtora spp. Micelio Higromicina y

actividad con GUS

Bailey et al. 1993.

Uromyces

appendiculatus

Esporas GUS Li et al. 1993.

Uncinula necátor Hifas Resistencia a

benomil

Smith et al. 1992.

Neurospora crassa Conidios Prototrofía Armaleo et al.

1990.

Suillus grivelei Micelio Higromicina Sunagawa et al.

2007

Tabla 3. Condiciones óptimas para la transformación de Aspergillus nidulans y Trichoderma

harzanium por medio de biobalística. (Basada en Herzog, RW. 1996).

Variables Aspergillus nidulans Trichoderma harzanium

Concentración de conidios 1x108 1x107

Presión de helio 1200 psi 1200 psi

Distancia al objetivo 6 cm 6 cm

Diámetro medio de los

microproyectiles

0.4-1.1 µm 1.1 µm

Material de los

microproyectiles

Tungsteno Tungsteno

Referencia Herzog et al. 1996. Lorito et al. 1993.

9

Figura 4. Efecto de la presión de helio en el número de transformantes de Aspergillus

nidulans durante los protocolos de biobalística (Adaptada de Herzog, RW. 1996).

2.1.3. Transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens.

Agrobacterium tumefaciens es una bacteria fitopatógena, gram-negativa, que puede

transferir e integrar parte de su ADN plasmídico en el genoma del organismo susceptible a

infección. Las secuencias de inserción (T-ADN) se encuentran localizadas en un plásmido

“inductor de tumores” (Ti, por su abreviatura en inglés). De manera natural, la región T-

ADN que es transferida a las células de la planta contiene genes que codifican hormonas

vegetales que son las causantes de la formación de tumores.

También contiene secuencias para la producción de moléculas llamadas octopinas

o nopalinas, que sólo pueden ser utilizadas por las bacterias. El plásmido Ti contiene otro

segmento llamado región de virulencia, el cual está conformado por un gran número de

genes denominados vir (Zhu et al. 2000). Las proteínas codificadas por la región de

virulencia están involucradas en la formación, transporte y la integración del T-ADN. La

10

región T-ADN del plásmido está delimitada por bordes repetidos de 24 pb, lo cuales son la

señal de activación para el sistema de transferencia a las células de la planta (Lacroix et al.

2008). La capacidad que tiene esta bacteria para insertar genes en los genomas vegetales

abrió la posibilidad de obtener las primeras plantas transgénicas. La región T-ADN fue

modificada para que en lugar de inducir la síntesis de compuestos benéficos para la

bacteria se transfirieran secuencias con genes reporteros.

Estudios posteriores mostraron que bajo condiciones de laboratorio, la capacidad

de dicha bacteria para transferir parte de su ADN no está limitada al reino vegetal. Los

organismos susceptibles a infección por Agrobacterium tumefaciens incluyen levaduras,

hongos filamentosos y células humanas.

El primer reporte de la transformación mediada por Agrobacterium en organismos

no vegetales se refirió a la levadura Saccharomyces cerevisiae donde células ura- fueron

complementadas con el gen ura3 por la transferencia e integración de secuencias T-DNA.

Este estudio pionero ofreció aspectos relevantes de la transformación mediada por

Agrobacterium en eucariontes. En primera instancia, resultó necesaria la adición de

compuestos inductores (derivados fenólicos, en específico acetosiringona) de los genes de

virulencia para que se llevara a cabo el proceso de infección.

Además, se observó un proceso de protección por parte de la maquinaria de

Agrobacterium tumefaciens sobre el T-ADN a transferir, cosa que no ocurre durante los

procesos físicos de transformación. Mutaciones específicas en los genes de virulencia

mostraron las diversas funciones que estas secuencias desempeñan en el proceso de

quimiotaxis, transferencia e integración del ADN exógeno (Bundock et al. 1995).

Posteriormente estudios en Aspergillus awamori, Aspergillus niger, Neurospora crassa,

Fusarium venetatum, entre otros, ofrecieron una notable alternativa a los métodos

disponibles de transformación de hongos filamentosos.

Como en el caso anterior, la inducción de los genes de virulencia se logró mediante

la adición de acetosiringona y se demostró la posibilidad de utilizar tanto conidios como

11

micelio para el proceso de transformación (de Groot et al. 1998). También se observó que

de acuerdo al grado de homología de las secuencias y los mecanismos de integración

propios de cada organismo infectado la inserción puede llevarse a cabo por procesos de

recombinación ilegítima o recombinación homóloga (Michielse et al. 2005).

En este sentido el impacto de la transformación mediada por Agrobacterium quizá

ha sido mayor en hongos filamentosos. Especies cuya transformación no había sido

lograda o que presentaban tasas muy bajas de inserción de genes, ahora podían ser

modificadas con protocolos reproducibles. La tabla 4 proporciona una visión general de los

organismos no vegetales que han sido transformados por Agrobacterium tumefaciens,

puede observarse el impacto de esta técnica en organismos del reino fungi y hongos

filamentosos en específico.

De igual modo, estandarizando numerosas variables podían lograrse una elevada

tasa de eficiencia en el proceso de transformación de hongos filamentosos. Puesto que en

algunas especies la inserción de genes era de una sola copia por genoma y se observaban

procesos de recombinación homóloga, la transformación con este método abría la

posibilidad de interrumpir la función génica de manera específica.

Sin embargo, existen desventajas en este método. Se ha encontrado una notable

variabilidad de virulencia en las cepas, especies de gran importancia (como Aspergillus

niger) no son susceptibles de altas tasas de transformación con este método, otras

especies se han mostrado recalcitrantes (por ejemplo Sclerotinia sclerotiorum) y se

requiere un control óptimo de numerosas variables para lograr un protocolo exitoso.

(Michielse et al. 2005).

Aunado a esto estudios realizados en plantas han demostrado que Agrobacterium

tumefaciens no sólo transfiere regiones del T-ADN del plásmido de virulencia, sino que es

capaz de integrar secuencias de hasta 18 kb de su ADN cromosómico en el genoma de las

plantas infectadas, lo cual no es deseable (Ülker et al. 2008).

12

Tabla 4. Ejemplos de organismos no vegetales que han sido transformados por

Agrobacterium tumefaciens en condiciones de laboratorio (Adaptado de Lacroix et al.

2006).

Reino Phylum Familia Especie

Fungi

Ascomycota

Pleosporales

Leptosphaeria maculans

Venturia inaequalis

Helminthosporium turcicum

Incerta sedis Mycosphaerella graminicola

Eurotiales

Aspergillus awamori

Aspergillus fumigatus

Aspergillus niger

Monascus purpureus

Onygenales

Blastomyces dermatitidis

Coccidioides immitis

Histoplasma capsulatum

Helotiales Botrytis cinerea

Pezizales Tuber borchii

Hypocreales

Fusarium oxysporum

Fusarium venetatum

Trichoderma atroviridae

Trichoderma reesei

Verticilium fungicola

Sordariales Neurospora crassa

Phycorales Colletotrichum gloeosporioide.

Verticillium dahliae

Incerta sedis Magnaporthe grisea

Saccharomycetales Kluyveromyces lactis

Saccharomyces cerevisiae

Basydiomicota Agaricales Agaricus bisporus

Zygomycota Mucorales Rhyzopus oryzae

Animalia Chordata Hominidae Homo sapiens

13

2.1.4. Transformación genética utilizando protoplastos.

Los protoplastos son células sin pared celular y fueron inicialmente utilizados para estudios

bioquímicos en levaduras. Sin embargo, en la actualidad tienen importancia en los estudios

sobre la estructura y síntesis de la pared celular así como en la secreción de proteínas en

numerosos organismos incluyendo plantas, levaduras y hongos filamentosos.

Además, la ingeniería genética de hongos tuvo un considerable avance con la

estandarización de numerosos protocolos de transformación utilizando protoplastos. El

inicio del análisis para la obtención de protoplastos en levaduras y hongos filamentosos

comenzó durante la década de 1970. Durante este período se determinó que el aislamiento

óptimo de protoplastos depende de numerosos factores como el uso de estabilizadores

osmóticos, el pH de la suspensión y la edad del micelio. Otra conclusión de estos estudios

es que el problema crítico consistía en encontrar la mezcla de enzimas correcta para

degradar la compleja estructura de polímeros de quitina y glucanos de la pared celular.

En un inicio, el uso de enzimas proteolíticas provenientes del caracol Helix pomatia

fue bastante útil para la formación de protoplastos. Sin embargo, la técnica de extracción

de estas enzimas resultaba tediosa y deficiente. Se realizaron numerosos ensayos para la

obtención de enzimas proteolíticas con Cytophaga sp., Streptomyces venezulae y

Trichoderma harzianum (Peberdy 1979) y se comprobó que Trichoderma harzianum

resultaba una excelente fuente de enzimas líticas para la obtención de protoplastos sobre

todo si el hongo se incubaba en presencia de quitina.

Finalmente se obtuvo una preparación de enzimas de Trichoderma harzanium,

llamada comercialmente Novozyme 234, que constituyó un gran avance en la obtención de

protoplastos de numerosas especies. Esta mezcla fue capaz de producir millones de

protoplastos de Aspergillus nidulans en menos de una hora de incubación y demostró sus

capacidad de degradación de la pared celular en un amplio rango de especies.

14

La transformación de protoplastos de levadura y protoplastos de Neurospora

crassa se publicó en 1978 (Ruiz-Díez, B. 2002). La utilización de marcadores de selección

en hongos filamentosos empezó con protoplastos de Aspergillus nidulans obtenidos con

Novozyme 234. La utilización del gen de resistencia a higromicina obtenido de E. coli

permitió la transformación de un amplio número de cepas silvestres de hongos. A pesar de

los inconvenientes que se detallan a continuación, hasta hoy, el uso de protoplastos

constituye una rutina en la manipulación genética de hongos filamentosos y es el método

más utilizado para su transformación.

Desde el inicio de la manipulación de protoplastos varios grupos de investigación

observaron la formación de agregados celulares multinucleados. Esto implica la creación

de organismos modificados con una ploidía indeseada. Posteriormente, la adición de

polietilenglicol durante los protocolos de transformación indujo la fusión de los protoplastos

(Bradshaw, RE. 2006). Durante mucho tiempo se señaló este fenómeno como un artefacto

de los protocolos de manipulación.

Otros experimentos de coloración micelial y marcadores nutricionales fueron

utilizados para demostrar sin lugar a dudas que había una fusión de protoplastos y un

intercambio de información genética entre especies vegetativamente incompatibles durante

los protocolos de transformación. Ejemplos de estos experimentos son los que se llevaron

a cabo mezclando protoplastos de Aspergillus nidulans y Aspergillus rugulosos, en los

cuales las cepas obtenidas mostraban fenotipos intermedios entre ambas especies.

También se realizaron experimentos con Penicillium chrysogenum y Penicillium cyaneo-

fulvum (Bradshaw, RE. 2006).

Finalmente, se han llevado a cabo experimentos de fusión de protoplastos con

especies relativamente distantes como Trichoderma reesei y Saccharomyces cerevisiae

para observar el intercambio de material genético durante la manipulación de protoplastos

(Kumari and Panda, 1994).

15

2.2. Transformación de células por medio de ondas de choque.

En este apartado se darán a conocer algunas generalidades sobre la física de las ondas de

choque describiendo los conceptos de onda mecánica, presión, cavitación, frecuencia, etc.

También se describirán las ideas básicas de la aplicación de ondas de choque en el equipo

utilizado (litotriptor extracorporal) durante la fase experimental de este trabajo.

Finalmente, se discutirán algunas ideas actuales sobre el proceso hipotético por el

cual el ADN del medio circundante es captado por células sometidas a ondas de choque.

2.2.1. Conceptos básicos de la física de las ondas de choque.

Las ondas físicas se encuentran en cualquier lugar a nuestro alrededor. Una onda física se

puede describir como la propagación de una perturbación a través de un espacio definido.

Durante el proceso hay una liberación de energía. Las ondas físicas provienen de una

fuente y se desplazan de un punto a otro propagando la perturbación referida. De modo

general, las ondas físicas se dividen en mecánicas y electromagnéticas. Las ondas de

choque son ondas mecánicas, esto es, requieren un medio para propagarse. Otros

ejemplos de ondas mecánicas son el sonido ambiental, las ondas que se propagan a

través de sismos, las ondas en las cuerdas de los instrumentos musicales y el ultrasonido.

Las ondas electromagnéticas en cambio no requieren de un medio para propagarse; la luz,

los rayos X, las microondas pueden propagarse plenamente en el vacío.

Durante su desplazamiento las ondas mecánicas ocasionan un movimiento de

oscilación en el medio donde se propagan. Si las vibraciones que ocurren en la fuente de la

onda mecánica provocan cierta periodicidad en las oscilaciones del medio, la onda

mecánica puede ser caracterizada por su frecuencia. La frecuencia, es entonces, el

número de ciclos de estas oscilaciones que ocurren en un segundo. La unidad de

frecuencia en el sistema internacional de unidades es el Hertz. El concepto básico anterior

permite clasificar las ondas mecánicas en infrasonido, sonido audible, ultrasonido e

16

hipersonido de acuerdo a la capacidad del oído humano. El sonido audible va de los 20 Hz

hasta los 20 kHz. El ultrasonido se encuentra arriba de los 20kHz. Las ondas de choque

utilizadas en este trabajo poseen un espectro de frecuencias que va desde menos de los

20 kHz hasta varios megahertz.

Otro aspecto importante de la transmisión de ondas mecánicas es la impedancia

acústica del medio en el cual se propagan. Esta es una medida de la dificultad con que la

onda se desplaza en un medio específico. La dificultad está referida por definición a la

velocidad del sonido y la densidad del material. Por ejemplo, el sonido se propaga más

rápidamente en el agua que en el aire y el agua es más densa que el aire. Por tanto, la

impedancia acústica es mayor en el agua que en el aire.

Para generar una onda de choque se requiere una liberación súbita de energía en

un espacio limitado. Esta energía puede ser de tipo mecánico, eléctrico, químico o nuclear.

La liberación inmediata de energía ocasiona una discontinuidad muy marcada y cambios

drásticos en la presión, densidad, temperatura, entropía y velocidad de las partículas

situadas en la vecindad de la onda de choque (Loske, 2007).

Entre las características de las ondas de choque estudiadas en este trabajo se

encuentra la amplitud del pico de presión positivo (p+) y la amplitud del pulso de presión

“negativo” o de rarefacción (p-). En la figura 5 puede observarse el perfil de presión típico

de una onda de choque en agua.

17

Figura 5. Variación de presión típica generada en el equipo utilizado en este trabajo (Loske

et al. 2002).

2.2.2. Conceptos básicos del equipo de litotricia extracórporea utilizado en este trabajo.

El estudio de las ondas de choque para la desintegración de cálculos renales se originó a

mediados del siglo XX. Entre las ventajas del uso de ondas de choque para la

desintegración de cálculos renales (litotricia extracórporea) destacan la baja morbilidad y

su carácter no invasivo. Esta técnica logra erradicar los cálculos renales, sin que haya

recurrencia, en el 80% de los pacientes tratados. Se han desarrollado tres tipos de

generadores de ondas de choque (litotriptores) de uso médico. En estos tres sistemas la

energía eléctrica es almacenada en una serie de capacitores. La liberación de esta energía

y la consecuente formación de ondas de choque se logra a través transductores de tipo

electrohidraúlico, electromagnético y piezoeléctrico.

18

En la mayoría de los litotriptores de uso médico las ondas de choque son

generadas en agua y transmitidas al paciente a través de una membrana flexible. Esto se

debe a que la impedancia acústica del agua y de los tejidos son semejantes, evitando

reflexiones y la liberación nociva e innecesaria de energía en esta zona. El establecimiento

de la dirección de las ondas de choque y la ubicación de los cálculos se logra por medio de

equipos de ultrasonido ó rayos X. Un esquema de un litotriptor como el utilizado en este

trabajo puede observarse en la figura 6. El generador de ondas de choque piezoeléctrico

se encuentra en la parte inferior del litotriptor y está formado por 3000 pequeños cristales

piezoeléctricos montados sobre el sector de un cascarón esférico de aluminio. Cada

elemento piezoeléctrico es capaz de convertir la energía eléctrica en mecánica y viceversa.

Ejemplos de materiales piezoeléctricos son la cerámica y ciertos compuestos como el

titanato de bario.

La energía eléctrica de los capacitores de este equipo (con un voltaje de 5 a 10 kV)

se descarga a través de los cristales piezoeléctricos provocando una expansión en cada

uno de ellos. La perturbación originada por cada cristal se transmite al agua y se

superpone con la de los demás cristales, formando una onda de choque en la vecindad del

centro del arreglo (ver figura 6). La geometría del sistema de cristales es semiesférica de

tal manera que la energía converge en el centro.

Los equipos de litotricia pueden generar picos como los de la figura 5 con valores

máximos de presión positiva de 30 a 150 MPa y duración de 0.5 a 3 µs seguido de un

descenso brusco hasta valores negativos de 20 MPa de duración de 2 a 20 µs. Para darse

una idea de estos valores las zonas más profundas del océano (10 km debajo del nivel del

mar) alcanzan una presión de unos 100 MPa. El cambio brusco de presión genera

interesantes fenómenos en las superficies de los cálculos renales. Entre los mecanismos

de desintegración de los cálculos renales se encuentran el desprendimiento ocasionado

por fracturas, la compresión y la cavitación acústica (Loske et al. 2002. Loske, AM. 2007).

19

Figura 6. Esquema básico de un generador de ondas de choque piezoeléctrico como el

utilizado en este trabajo. (Adaptado de Loske et al. 2002).

2.2.3. Evidencias de la transformación de células por cavitación acústica.

Los líquidos generalmente contienen gases disueltos y burbujas con diámetros

menores a 0.1 mm. Durante una primera etapa del paso de la onda de choque, estas

burbujas se ven sometidas a compresión por el pico de presión positivo de la onda de

choque. La caída súbita de presión (figura 5) en la etapa subsiguiente ocasiona que el gas

de las burbujas expanda su volumen cientos de veces. Este crecimiento dura alrededor de

unos 50 µs y las burbujas permanecen estables durante 200 a 450 µs, para finalmente

sufrir un colapso violento. Producto de este colapso, es la formación de ondas de choque

secundarias y pequeños chorros de líquido (microjets) con velocidades de hasta 400 m/s

(Ohl, CD. 2002. Klaseboer et al. 2007).

20

El fenómeno anterior se conoce como cavitación acústica. Se ha demostrado que

estas la cavitación acústica puede ocasionar la captura de una variedad de moléculas en

diversos tipos celulares. En la actualidad, este fenómeno ha estimulado el interés en la

posibilidad de introducir de manera no lesiva ADN, medicamentos y proteínas de interés en

experimentos clínicos (Newman, CMH. Bettinger, T. 2007).

Se cree que la cavitación acústica ocasiona una serie de lesiones en las células

debido a la liberación de estos chorros de velocidades considerables. La distancia de

acción del colapso de las burbujas ha sido estimada de 10 a 100 µm. Hasta ahora los

modelos de captura se han elaborado a partir de experimentos utilizando ultrasonido para

producir los fenómenos de cavitación acústica (Zarnitsyn et al. 2008).

El objetivo de esta tesis fue demostrar la amplia aplicabilidad de este método de

transformación para diferentes hongos filamentosos y levaduras. Por esa razón se describe

a continuación una breve semblanza de cada hongo utilizado en este trabajo y su

importancia.

2.3. Especies de hongos utilizados en este trabajo.

2.3.1. El hongo ascomiceto Aspergillus niger.

Aspergillus niger es el hongo filamentoso más utilizado en la industria debido a sus

notables capacidades metabólicas. Sus usos a nivel comercial van desde la producción de

grandes cantidades de ácido cítrico, ácido glucónico y enzimas como las amilasas, hasta la

producción de proteínas heterólogas como la quimosina y el interferón humano (Andersen

et al. 2008). Además el género Aspergillus tiene una larga participación en la elaboración

de alimentos y en la actualidad se le considera un microorganismo “generalmente

reconocido como seguro” (GRAS por sus siglas en inglés). Esto último constituye una gran

ventaja para la aceptación de los compuestos producidos para alimentación tanto de

animales como de seres humanos.

21

Existe evidencia que las proteínas heterólogas son correctamente glicosiladas en

el género Aspergillus, a diferencia de otros organismos del reino fungi que presentan

diferentes tasas de hiperglicosilación (Maras et al.1999; Deshpande et al. 2008).Con esta

versatilidad en la producción de compuestos de interés y en sus altos rendimientos,

Aspergillus niger tiene el potencial de convertirse en el biorreactor de multitud de

compuestos benéficos en el futuro.

La secuenciación del genoma de Aspergillus niger cepa CBS 513.8 ha

proporcionado valiosa información sobre las redes metabólicas de este microorganismo.

Sin duda alguna, los próximos avances en la ingeniería metabólica incrementarán los

rendimientos en la elaboración de metabolitos de interés en este hongo (Pel et al. 2007).

El genoma de Aspergillus niger se ha estimado en 33.9 megabases que contienen

un total de 14,165 marcos de lectura (ORF, Open Reading Frames, por sus siglas en

inglés). Los datos generales del genoma de Aspergillus niger se resumen en la tabla 5 y en

la figura 7 se muestra la clasificación funcional de los marcos de lectura de acuerdo a la

jerarquía FunCat (Ruepp et al. 2004).

Tabla 5. Características genómicas del hongo Aspergillus niger cepa CBS 513.88. (Datos

tomados de Pel et al. 2007).

Tamaño del genoma ensamblado (Mb) 33.9

Genes que codifican proteínas 14,165

Contenido de GC en el genoma ensamblado (%) 50.4

Tamaño promedio de los genes (pb) 1,572

Densidad génica (genes/kb) 0.42

Promedio de intrones por gen 2.57

Tamaño promedio de los intrones (pb) 97

Tamaño promedio de los exones (pb) 370

22

Figura 7. Clasificación funcional de los marcos de lectura (ORFs) de Aspergillus niger de

acuerdo a las categorías Funcat. (Imagen tomada de Pel et al. 2007).

2.3.1.1. Importancia biotecnológica de la actividad proteolítica de Aspergillus niger.

Desde el comienzo de la aplicación de la biotecnología en hongos se reconoció la

importancia de la actividad proteolítica como un posible obstáculo para la producción de

compuestos de interés. A pesar de que se han logrado avances en el control de la

actividad proteolítica y se han aislado mutantes con deficiencia en la secreción de estas

enzimas, este aspecto de la biotecnología de los hongos todavía sigue siendo un

problema.

Un uso racional de la ingeniería genética en el género Aspergillus para el control

de la actividad proteolítica requiere el bloqueo específico de proteasas que interfieren con

la producción de la proteína de interés. El bloqueo indiscriminado de las proteasas en las

23

cepas de Aspergillus podría disminuir su tasa de crecimiento normal e inclusive podría

resultar letal.

Por otra parte, la actividad de proteasas específicas, como KEX2 (Broekhuijsen et

al., 1993), resultan importantes para la liberación del compuesto de interés sin que se

requiera un tratamiento enzimático posterior. Los primeros estudios determinaron que la

argilopepsina A es la proteasa con mayor actividad en las cepas de Aspergillus niger. Por

los tanto, el uso biotecnológico de esta especie se ha basado en cepas mutantes que no

producen dicha proteasa (Nevalainen et al. 2005; Mattern et al. 1992).

No obstante, el conocimiento emanado de la secuenciación del genoma de

Aspergillus niger podría ofrecer una perspectiva más acorde de la regulación de la

actividad proteolítica. Por ejemplo, se ha determinado que existen alrededor de 100 a 200

secuencias que codifican posibles proteasas en el genoma de Aspergillus niger (Pel et al.

2007) y el trabajo reciente de Punt et al. (2008) ha logrado caracterizar un factor de

transcripción (codificado por el gen prtT) que regula la mayor parte de la actividad

proteolítica en este hongo filamentoso.

Sin embargo, existen numerosas variables a considerar durante el uso

biotecnológico de Aspergillus niger y los problemas relacionados con la actividad

proteolítica. La secreción de proteasas es más baja, por ejemplo, en medios con valores

neutros de pH que en medios ácidos (Lubertozzi and Keasling, 2009). Asimismo se ha

demostrado que altas cantidades de glucosa reprimen la expresión de proteasas. Otros

parámetros como la fuente de nitrógeno y la morfología del pellet en el biorreactor pueden

disminuir también la actividad de estas enzimas (Lubertozzi and Keasling, 2009).

La comprensión y uso racional de la información contenida en el genoma de

Aspergillus niger, el establecimiento de métodos de transformación eficientes, la ingeniería

metabólica y la exploración de variables de la tecnología de fermentaciones permitirán, de

manera combinada, convertir a este hongo filamentoso en una excelente plataforma de

producción de metabolitos de interés.

24

2.3.2. El hongo Colletotrichum gloeosporioides.

Las especies agrupadas bajo el nombre de Colletotrichum (Glomerella en su

estado sexual) infectan una gran variedad de plantas de importancia comercial provocando

una enfermedad conocida como antracnosis. Entre las especies afectadas se encuentran

el mango, papaya, manzana, tomate, pepino, melón y maíz. Para el establecimiento de la

interacción compatible y posterior infección, el hongo desarrolla una célula especializada

conocida como apresorio, que se caracteriza por la presencia de melaninas. Esta célula

genera una gran cantidad de presión sobre la cutícula de la planta que es colonizada.

Después del proceso de penetración, una vesícula infecciosa y la hifa primaria

comienzan a desarrollarse. Este primer estadío de infección se identifica como biotrófico,

esto es, el hongo coloniza la planta sin causar muerte celular. Posteriormente se inicia una

etapa necrotrófica, donde las hifas secundarias se diseminan en el tejido y causan la

muerte celular. El ciclo vital de las especies identificadas como Colletotrichum se conoce

como hemibiotrófica, puesto que las etapas biotrófica y necrotrófica de desarrollo son

establecidas como una secuencia temporal e involucran procesos de diferenciación muy

específicos (Wei et al. 2003, Münch et al. 2008)

El genoma de algunas especies de Colletotrichum está siendo secuenciada en dos

proyectos paralelos, uno involucra la cepa Glomerella graminicola M1.001 y el otro la cepa

Colletotrichum higginsianum IMI 349063. El primer proyecto de secuenciación está a cargo

del Broad Institute de Harvard y el Instituto Tecnológico de Massachusetts, el segundo se

lleva a cabo en Instituto Max Planck. Los dos genomas no han sido ensamblados por

completo y los marcos de lectura (ORFs) no han sido anotados en alguna categoría. El

tamaño estimado del genoma es de 51.6 Mb en el caso de Glommerella graminicola y 50

Mb en la primera estimación elaborada por el Instituto Max Planck.

25

2.3.3. El hongo Fusarium solani.

El hongo ascomiceto Nectria haematococca, comúnmente identificado como

Fusarium solani en su estado asexual, es un miembro de un clado que agrupa alrededor de

50 especies bajo el nombre genérico de “complejo de especies Fusarium solani”. Los

miembros de este grupo monofilético son capaces de colonizar una gran variedad de

ambientes que van desde zonas cultivables hasta desiertos. Como patógenos, los

miembros de este complejo son responsables de enfermedades en alrededor de 100

géneros de plantas. También representan el grupo más importante de patógenos

relacionado con infecciones oportunistas y queratitis en humanos.

La habilidad de estos hongos filamentosos para adaptarse a gran variedad de

ecosistemas e infectar especies de plantas y animales nos ofrece una idea de su

plasticidad genética y su amplia capacidad metabólica. Los miembros de este complejo de

especies pueden degradar, por ejemplo, hidrocarburos, compuestos organofluorados,

ligninas, cianuros de metales y pesticidas (Coleman et al, 2009).En la tabla 6 se detallan

las características del genoma secuenciado de Nectria heamatoccoca.

Tabla 6. Características generales del genoma de Nectria heamatoccoca (Basada en

Coleman et al. 2009).

Tamaño del genoma (Mb) 54.5

Número de genes 15,707

Densidad génica (genes/Mb) 307

Tamaño promedio de genes (bases) 1,674

Tamaño promedio del transcrito (bases) 1,503

Tamaño promedio de proteínas (aminoácidos) 480

Número de exones por gen 3.1

Tamaño promedio de los exones (bases) 488

Tamaño promedio de los intrones (bases) 84

26

2.3.4. La levadura Saccharomyces cerevisiae.

El genoma de la levadura de panadería (Saccharomyces cerevisiae) fue el primer

genoma eucariótico secuenciado y por tanto, el inicio del estudio sistemático de la

organización, regulación y mantenimiento de la estructura génica en organismos con

cromosomas compactados en núcleos definidos. En la actualidad existen numerosas

herramientas que permiten el conocimiento de los genes, los marcos de lectura (ORFs) y

los productos que estos genes codifican. Entre las bases de datos disponibles se

encuentran Saccharomyces Genome Database (http://www.yeastgenome.org), y

Comprehensive Yeast Genome Database (http://mips.gsf.de/genre/proj/yeast). Asimismo,

otras bases de datos proporcionan la información generada a partir de microarreglos

(http://transcriptome.ens.fr /ymgv/index.php) y la información de redes de interacción de

proteínas (General Repository of Interaction Datasets [http://www.thebiogrid.org/]).

Otros centros conservan las cepas utilizadas en laboratorios de todo el mundo y los

plásmidos creados para la modificación genética de Saccharomyces cerevisiae en multitud

de proyectos (European Saccharomyces cerevisiae Archive for Functional Analysis

[http://web.uni-frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/] y Japanese Yeast Genetic Resource

Center [http://yeast.lab.nig.ac.jp/nig/index_en.html]).

Un estudio más detallado de la genómica funcional de esta levadura ha generado

una colección de mutantes con 6000 genes interrumpidos (knockouts) que cubren un 96%

del genoma esta especie del reino fungi (Saccharomyces Genome Deletion Project).

Incluso esta colección de cepas está disponible para su venta a los grupos de

investigación. Debido a todo lo anterior esta especie se ha convertido en uno de los

modelos eucarióticos mejor establecidos.

La manipulación genética de Saccharomyces cerevisiae ha permitido el estudio de

procesos biológicos fundamentales como el envejecimiento, el transporte de ARN

mensajero, el ciclo celular y el procesamiento de proteínas. Asimismo esta levadura

funciona como modelo de estudio de enfermedades humanas como el cáncer, el diseño de

27

medicamentos, la identificación del plegamiento de priones, el estudio de virus y la

ecotoxicología.

Saccharomyces cerevisiae también desempeña un papel relevante en la

investigación aplicada debido a su capacidad sobresaliente para producir etanol y dióxido

de carbono a partir de azúcares con alta productividad y rendimientos. La industria

biotecnológica aprovecha estas cualidades metabólicas en los procesos de panadería,

elaboración de vino y cerveza, y producción de bioetanol, además de ser el sistema

utilizado para la producción de algunas vacunas humanas como las de la hepatitis B y el

virus del papiloma. Como Saccharomyces cerevisiae es relativamente tolerante a niveles

bajos de pH, y a las altas concentraciones de azúcar y etanol, los riesgos de contaminación

durante los procesos son menores. Además, esta levadura es altamente resistente a los

compuestos generados durante la hidrólisis de la biomasa y es capaz de crecer

anaeróbicamente (Nevoigt, 2008).

La remoción de la pared celular en Saccharomyces cerevisiae y posterior

formación de protoplastos fue reportada desde el año de 1957. La adición de enzimas

provenientes del caracol Helix pomatia disolvió por entero la pared celular de este

microorganismo. La primera transformación con este tipo de células se logró hasta el año

de 1978 con la inserción de un plásmido que confería prototrofía a triptófano (Gietz, RD.

Woods, RA. 2001).

El método de transformación de la levadura por medio de protoplastos se convirtió

en uso común en laboratorios de todo el mundo. Sin embargo, se sugirió que la

transformación genética o la captura del ADN por las células era ocasionada por la fusión

de los protoplastos y en consecuencia, ocurría una poliploidía indeseada en los procesos

de transformación. El primer protocolo de transformación exitoso y reproducible se logró a

partir del estudio sistemático de Ito y colaboradores en 1981. Este grupo mostró que

cationes monovalentes como Na+, K+, Rb+, Cs+ y Li+ pueden ser usados en combinación

con polietilenglicol (PEG) para estimular la captura de ADN plasmídico en levaduras con

28

pared celular intactas. Los mejores resultados involucraron el uso de acetato de litio y la

incubación de las células durante 5 minutos a 420C. Los rendimientos de transformación

con este nuevo método fueron inferiores al uso de protoplastos; pero el uso de cationes y

PEG resultó mucho más rápido, simple y fácil de estandarizar (Ito et al. 1983).

Posteriores modificaciones han logrado mejorar los rendimientos de transformación

hasta lograr valores de 1x106 cepas recombinantes por microgramo de ADN y 1x108

células. Estas modificaciones involucran la desnaturalización del ADN para convertirlo en

una estructura de una sola hebra, la adición de transportadores de ADN de una sola hebra

(single stranded DNA carrier) y la incubación de las células durante el proceso de captura a

420C durante 40 minutos (Gietz et al. 1992). Hasta ahora estos elevados rendimientos

convierten el protocolo por cationes y choque térmico en el más utilizado en todo el mundo

para la transformación de la levadura Saccharomyces cerevisiae.

29

JUSTIFICACIÓN.

Los métodos actuales de transformación genética en hongos presentan numerosos

problemas respecto a su eficiencia, reproducibilidad y fenómenos indeseados de

modificación de la carga genética. Es por lo anterior que en este trabajo se propone un

nuevo método de transformación que solucione los problemas anteriores, permita generar

mutantes con fenotipos de interés científico e incursione en la exploración de parámetros

físicos involucrados en la transformación genética por medio de ondas de choque.

30

HIPÓTESIS.

Es posible introducir genes de interés en hongos mediante un proceso de cavitación

acústica generado por ondas de choque y además, estos genes pueden establecerse de

manera funcional en el genoma del hospedero.

31

OBJETIVO GENERAL.

Determinar los parámetros generales que permitan la transformación genética de hongos mediante

ondas de choque.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS.

• Establecer las variables (número de ondas de choque, concentración de material biológico,

concentración de ADN, concentración de antibiótico de selección) que permitan la

obtención de transformantes en las especies: Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus niger,

Fusarium solani y Colletotrichum gloeosporioides por medio de ondas de choque.

• Propagar las cepas que presenten el fenotipo de interés y analizar la expresión de los

genes reporteros insertados.

• Realizar pruebas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para validar la presencia

de los genes insertados.

• Determinar la eficiencia del proceso en relación a sistemas tradicionales.

32

METODOLOGÍA.

1. Cepas utilizadas.

• Las cepas de Fusarium solani y Colletotrichum gloeosporioides fueron donadas por

el Dr. José Tun del Instituto Tecnológico de Conkal, Yucatán.

• La cepa de Saccharomyces cerevisiae w303a fue donada por el Dr. Plinio Guzmán

Villate del CINVESTAV, Unidad Irapuato.

• Las cepas de Aspergillus niger ATCC 1015 y Aspergillus niger ATCC 16888 fueron

donadas por la Dra. Dora Linda Guzmán del CINVESTAV, Unidad Irapuato.

• Las cepas de E. coli para la multiplicación de vectores fueron DH10B y GM48. Esta

última está modificada genéticamente en la maquinaria de metilación de

secuencias de ADN.

2. Plásmidos utilizados en este trabajo y extracción de ADN plasmídico.

• Se utilizó el plásmido pCambia 1302 (CAMBIA, Canberra, Australia) para la

transformación de los hongos Fusarium solani y Colletotrichum gloeosporioides.

Este plásmido confiere resistencia a higromicina a partir del gen hptII (higromicina

fosfotransferasa II) acoplado al promotor CaMV35S (Virus del mosaico de la coliflor

35S).

• Para los protocolos de transformación de las cepas de Aspergillus niger 16888 y

Aspergillus niger ATCC 1015 se utilizó el plásmido pBINGFPHPH (O´Connell et al.

2004) proporcionado por la Dra. June Kilpatrick Simpson Williamson del

CINVESTAV, Unidad Irapuato. Este plásmido también confiere a higromicina con

el gen hph (higromicina B fosfotransferasa). El gen de la proteína verde

fluorescente (gfp) y el gen de resistencia están bajo control del promotor gpdA de

Aspergillus nidulans y el terminador trpC (antranilato sintasa) de la misma especie.

33

• El plásmido PGBKT7 (Clontech, California, EU) fue proporcionado por el Dr. Plinio

Guzmán Villate. Este plásmido permite la selección de transformantes en

Saccharomyces cerevisiae por prototrofía a triptófano. Contiene la secuencia

completa del gen TRP1 que codifica para la enzima N-(5'-fosforibosil)-antranilato

isomerasa.

• La extracción de ADN plasmídico de las cepas de E. coli DH10B y E. coli GM48 se

llevó a cabo de acuerdo al protocolo Maxiprep modificado de Sambrook et al.

2001.

3. Establecimiento de las concentraciones inhibitorias de higromicina.

De manera natural las diferentes cepas de la misma especie de hongos filamentosos

presentan variabilidad en la tolerancia a la actividad de antibióticos de selección. Para

evitar la presencia de falsos transformantes se realizaron pruebas, previas a los protocolos

de transformación, para establecer los límites de resistencia al antibiótico higromicina.

La higromicina es un compuesto ampliamente utilizado como agente de selección

en hongos filamentosos, su acción impide el proceso de traducción del ARN mensajero al

unirse al sitio activo de los ribosomas. Se realizaron pruebas con 100 µg/ml, 200 µg/ml,

300 µg/ml y 400 µg/ml de higromicina para cada una de las especies utilizadas en este

trabajo. Los resultados se resumen en la tabla 7. Además de la higromicina se añadieron

los antibióticos carbenicilina y estreptomicina en los protocolos para prevenir la

contaminación por bacterias.

34

Tabla 7. Concentraciones de selección establecidas con higromicina de las especies

utilizadas en este trabajo.

Especie Concentración establecida de selección

con higromicina

Colletotrichum gloeosporioides 200 µg/ml

Fusarium solani 400 µg/ml

Aspergillus niger 400 µg/ml

4. Estandarización de la cantidad y calidad del inóculo.

En numerosos protocolos el uso de micelio representa una alternativa para la

transformación genética de hongos filamentosos. Sobre todo en especies con baja

capacidad de esporulación. El inconveniente principal del uso de micelio radica en la

presencia de múltiples núcleos (heterocariosis) en las hifas de diferentes especies.

En este trabajo debido a la baja esporulación o a la poca viabilidad de las esporas

se decidió utilizar micelio de dos especies de hongos: Fusarium solani y Colletotrichum

gloeosporioides. Para evitar el uso de dos tejidos diferentes (micelio y esporas) el micelio

de estas dos especies fue filtrado con una membrana Millipore de 0.45 µm. En el caso de

Aspergillus niger debido a su alta tasa de esporulación se utilizaron conidios para los

protocolos de transformación.

• Fusarium solani y Colletotrichum gloeosporioides. Las cepas se crecieron en medio

mínimo para Aspergillus agar (ver apéndice para la composición y preparación de

medio) durante tres días. Con un asa de siembra se tomó una muestra de micelio del

hongo, este tejido se filtró a través de una membrana Millipore de 0.45 µm para evitar la

presencia de esporas. El micelio se resuspendió mediante un vórtex en 9 ml de medio

mínimo para Aspergillus en forma líquida. Se efectuó el conteo al microscopio de hifas

de la suspensión y se plaquearon dos muestras de 100 µl de la solución micelial en

medio mínimo para Aspergillus agar para el conteo de colonias viables.

35

• Aspergillus niger. Para estandarizar la cantidad de inóculo se realizó una curva de

calibración a 420 nm de conidios de Aspergillus niger. Las cepas ATCC 16888 y ATCC

1015 se crecieron en medio mínimo para Aspergillus durante seis días a 280C. Las

esporas se lavaron con medio líquido para Aspergillus para obtener cuatro lecturas de

absorbancia a 420 nm. Las muestras se colocaron en un hematocitómetro para contar

el número de conidios por mililitro. Las muestras también se plaquearon en medio

mínimo para Aspergillus agar con tres repeticiones.

• Saccharomyces cerevisiae. Se creció un preinóculo de la levadura en 5 ml de medio

mínimo para levadura (YMM, ver apéndice para la composición de este medio) durante

12 horas a 300C en agitación. Los 5 ml se trasladaron a un matraz conteniendo 100 ml

de medio YMM, se incubó el cultivo de levadura a 300C hasta alcanzar una densidad

óptica de 0.5 a 600 nm (aproximadamente 3 horas). La medición de la absorbancia

referida equivale a 1x106/ml células registradas con el hematocitómetro.

5. Descripción del equipo experimental.

Para los protocolos de transformación desarrollados en este trabajo se empleó un litotriptor

modelo Piezolith 2300 modificado (marca Richard Wolf GMbH, Knittlingen, Alemania). Este

equipo tiene acoplado un sistema de ultrasonido que se usó para centrar la muestra (figura

8). El sistema posee un capacitor que puede cargarse con voltajes entre 5 y 10 kV.

La energía eléctrica se encuentra almacenada en una fuente de alto voltaje. La

descarga del capacitor está controlada por un interruptor de chispa situado en la base del

generador (figura 9). El circuito de descarga está conectado a un sistema electrónico que

permite ajustar la frecuencia de emisión de ondas de choque y el voltaje de descarga.

Finalmente, el sistema piezoeléctrico generador de las ondas de choque está constituido

por 3000 cristales que al recibir la descarga de los capacitores se expanden súbitamente

para generar las ondas mecánicas en el agua circundante.

36

Figura 8. Monitor de ultrasonido y consola de mando del equipo Piezolith 2300.

Figura 9. Generador piezoeléctrico y circuito de descarga del equipo Piezolith 2300. El

interior de la base se encuentra relleno con agua y dentro se coloca la muestra para ser

sometida a los diferentes pulsos de ondas mecánicas.

37

6. Preparación y procesamiento de las muestras.

6.1. Protocolo de transformación genética de las especies Fusarium solani y Colletotrichum

gloeosporioides.

Se prepararon con un sellador comercial bolsitas de propileno de 1 cm por 1.5 cm para

colocar la solución micelial y el ADN plasmídico con el gen de interés. Se utilizaron 6 µl de

ADN plasmídico (pCambia 1302) a una concentración de 1 µg/µl en el caso de Fusarium

solani. En el caso de Colletotrichum gloeosporioides se utilizaron 10 µl del mismo plásmido

a una concentración de 1 µg/µl. Estos 10 µl se disolvieron en 190 µl de suspensión de

micelio del hongo por lo que la concentración total de ADN en la muestra fue de 30 µg/ml

en el caso de Fusarium solani y 50 µg/ml en el caso de Colletotrichum gloeosporioides.

En total se prepararon cinco muestras para cada especie dentro de las bolsitas de

propileno, cuatro conteniendo la concentración referida de ADN y una muestra de 200 µl

de solución micelial sin ADN como control. La muestra 1 se sometió a 100 ondas de

choque, la muestra 2 se sometió a 200 ondas de choque, la muestra tres a 300 ondas de

choque, la cuatro a 400 ondas de choque. La muestra control se sometió a 250 ondas de

choque.

El voltaje utilizado fue de 7.6±0.15 kV con una frecuencia de generación de ondas

de choque de 0.5 Hertz. Después de la aplicación de las ondas de choque las muestras se

depositaron en filtros de celulosa sobre cajas petri con medio mínimo para Aspergillus agar

sin antibiótico de selección. Después de 24 horas de recuperación del tejido micelial, los

filtros se transfirieron a medio mínimo para Aspergillus con una concentración de 200 µg/ml

de higromicina como antibiótico de selección en el caso de Colletotrichum gloeosporioides

y 400 µg/ml en el caso de Fusarium solani. Las cepas resistentes a higromicina se

observaron a las 48 horas de realizar la transferencia al medio selectivo. Se realizaron tres

repeticiones del protocolo de cada especie.

38

6.2. Protocolo de transformación genética del hongo Aspergillus niger.

Para el proceso de transformación las cepas se crecieron en medio mínimo para

Aspergillus agar durante seis días a 280C hasta que se observó una buena producción de

conidios. Los conidios se lavaron con medio mínimo para Aspergillus líquido y se diluyeron

hasta lograr una concentración de 1x104 UFC tomando como punto de partida las lecturas

iniciales analizadas en una curva de calibración. Por otra parte se prepararon con un

sellador comercial bolsitas de propileno de 1 cm por 1.5 cm para colocar la solución de

conidios y el ADN plasmídico a transfectar.

Se utilizaron 10 µl de ADN plasmídico (pBINGFPHPH) a una concentración de 1

µg/µl. Estos 10 µl se disolvieron en 190 µl de suspensión de conidios del hongo por lo que

la concentración total de ADN en la muestra fue de 50 µg/ml. En total se prepararon cinco

muestras dentro de las bolsitas de propileno: cuatro conteniendo la concentración referida

de ADN y una muestra de 200 µl de solución de conidios sin ADN como control. La

muestra 1 se sometió a 100 ondas de choque, la muestra 2 se sometió a 200 ondas de

choque, la muestra tres a 300 ondas de choque, la cuatro a 400 ondas de choque. La

muestra control se sometió a 250 ondas de choque.

Después de la aplicación de las ondas de choque las muestras se depositaron en

filtros de celulosa sobre cajas petri con medio mínimo para Aspergillus agar sin antibiótico

de selección. Después de 24 horas de recuperación del tejido del hongo, los filtros se

transfirieron a medio mínimo para Aspergillus con una concentración de 400 µg/ml de

higromicina como antibiótico de selección. Las cepas resistentes a higromicina se

observaron a las 48 horas de realizar la transferencia al medio selectivo. Se realizaron tres

repeticiones de este protocolo.

39

6.3. Protocolo de transformación de la levadura Saccharomyces cerevisiae.

Para realizar este protocolo se prepararon pequeñas bolsas de propileno de 1 cm x

1.5 cm con un sellador de plástico comercial. En cada bolsa se colocaron 194 µl del cultivo

de levadura y 6 µl de ADN del plásmido pGBKT7 a una concentración de 1 µg/ml. En total

se prepararon cinco muestras dentro de las bolsitas de propileno: cuatro conteniendo la

concentración referida de ADN y una muestra de 200 µl de solución de células sin ADN

como control. La muestra 1 se sometió a 100 ondas de choque, la muestra 2 se sometió a

200 ondas de choque, la muestra tres a 300 ondas de choque, la cuatro a 400 ondas de

choque. La muestra control se sometió a 250 ondas de choque.

Las muestras se trasladaron a tubos eppendorf con 900 µl de medio YMM, se

incubaron durante media hora a 300C en agitación para permitir la recuperación celular. En

forma posterior, las muestras se plaquearon en medio mínimo para levadura agar sin

triptófano para permitir la selección de transformantes. Estas cajas de cultivo se incubaron

de manera inmediata a 300C. Las colonias con el gen de interés se observaron a las 24

horas de la siembra en medio selectivo. Se llevaron a cabo tres repeticiones de este

protocolo.

7. Extracción de ADN de hongos filamentosos.

La metodología básica está reportada por Punekar et al. (2003), este protocolo fue

modificado para mejorar la calidad de ADN y su concentración. El micelio del hongo se

creció en 200 ml de medio mínimo para Aspergillus líquido durante una semana a quince

días, dependiendo de la especie. El micelio del hongo se filtró para retirar el exceso de

líquido. Se tomaron de 4 a 5 gramos de micelio húmedo del hongo y se trituraron con un

mortero y nitrógeno líquido hasta obtener un polvo fino. En forma simultánea se

precalentaron 10 ml de buffer de lisis (10 mM Tris-HCl pH 7.5, 0.5 M de NaCl y 1% de

SDS) a 650C en un tubo corex de 40 ml. Se tomaron 2.5 gramos del micelio perfectamente

triturado (la relación de buffer y tejido macerado es 1:4 peso/volumen) y se depositaron en

el buffer de lisis precalentado. Esta mezcla se calentó durante 20 minutos a 650C.

40

Al término de este tiempo la muestra se dejó enfriar y se le añaden 6 ml de

solución de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1 v/v). La muestra se centrifugó a

4500 g durante 20 minutos. Al término de tiempo la epifase se transfirió a un tubo corex

limpio y se le añadieron 6 ml más de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1 v/v). La

muestra se centrifugó nuevamente a 4500 g durante 20 minutos. El sobrenadante se lavó

de igual manera con fenol:cloroformo (4:5 v/v). Al sobrenadante se le añadieron 0.54 del

volumen recuperado de isopropanol y se dejó incubando a -200 C durante una hora.

Transcurrido el período de tiempo anterior la muestra se centrifugó a 4500 g para precipitar

el ADN. La pastilla obtenida se lavó en dos ocasiones con etanol absoluto (4500 g durante

10 minutos). La muestra se dejó secar y prepararon alícuotas de 200 ml de agua

desionizada estéril. Para mejorar la calidad del ADN extraído, las muestras se trataron con

el kit DNA Clean and Concentrator (Zymo Research, EU).

8. Extracción de ADN de la levadura Saccharomyces cerevisiae.

Se utilizaron dos protocolos de extracción de ADN, uno basado en el choque térmico de la

pared celular de levadura (Harju et al. 2004) y otro basado en el uso de perlas de vidrio

(Sobanski y Dickinson. 1995). En ambos casos se evita el uso de enzimas hidrolíticas. El

protocolo basado en Sobansky y Dickinson (1995) consta de las siguientes etapas:

Se inoculó una colonia de levadura en 5 ml del medio YPD y se dejó crecer hasta

la saturación del medio (1 ó 2 días). Para recuperar las células el cultivo se transfirieron a

un tubo falcon limpio y estéril. La muestra se centrifugó a 2500 g durante 5 minutos. Se

retiró el sobrenadante y las células se resuspendieron en 500 µl de agua estéril. Las

células se transfirieron a tubos eppendorf estériles y se precipitaron centrifugando la

muestra a máxima velocidad durante 10 segundos. Se retiró el exceso de agua, las

muestras se resuspendieron en el agua restante y se añadieron 200 µl de la solución de

Winston (2% Tritón X-100, 1% SDS, 100 mM de NaCl, 10 mM de Tris-HCl pH 8.0 y 1 mM

de EDTA).

41

La muestra se disolvió completamente en el buffer, se le añadieron 2 perlas de

vidrio estériles de 2 mm de diámetro y 200 µl de fenol:cloroformo (4:5 v/v). La muestra se

colocó en un vórtex a máxima velocidad durante 5 minutos, se le añadieron 200 µl más

de agua estéril y se centrifugó a 10,000 g durante 5 minutos. El sobrenadante se transfirió

a un tubo limpio, se le añadieron 2 µg de RNAsa A y se incubó durante 5 minutos a 370C.

Posteriormente se le añadieron 200 µl de fenol:cloroformo (4:5 v/v), se colocó esta

mezcla en un vórtex a máxima velocidad durante 1 minuto. Se tomó nuevamente el

sobrenadante y los lavados de fenol:cloroformo se repitieron dos veces más. Al

sobrenadante obtenido de la última centrifugación se le añadió 500 µl de etanol absoluto,

se incubó a -200C durante 15 minutos y se centrifugó a 10,000 g durante 5 minutos. La

pastilla se lavó una vez más con etanol absoluto y se dejó secar completamente. La

muestra de ADN obtenida se disolvió en 50 µl de agua estéril.

9. Escrutinio de probables cepas transformadas.

Para detectar la inserción de los genes de interés se realizaron pruebas con la reacción en

cadena de la polimerasa (PCR). Para el gen hpt contenido en el plásmido pCambia 1302

utilizado en las especies de Fusarium solani y Colletotrichum gloeosporioides se emplearon

los siguientes oligonúcleotidos:

Iniciador directo: 5`-CGTCTGTCGAGAAGTTTC-´3

Iniciador reverso: 5´-TACTTCTACACAGCCATC-´3

Las condiciones de la reacción fueron: 950C de desnaturalización por 30 segundos,

420C de alineamiento durante 30 segundos y 720C de extensión durante 90 segundos. Se

corrieron 25 ciclos de amplificación. El tamaño esperado del fragmento amplificado con

estos oligonucleótidos es de 1000 pb. Los productos de amplificación se analizaron en un

gel de agarosa al 8%.

Para el gen hph contenido en el plásmido pBINGFPHPH utilizado para la

transformación de Aspergillus niger se emplearon dos pares de oligonúcleotidos:

42

• Par proporcionado por el laboratorio Laboratorio de Marcadores Moleculares y

Genética Molecular (CINVESTAV, Unidad Irapuato):

Iniciador directo: 5`-GCACGAGGTGCCGGA-´3

Iniciador reverso: 5´-GCTCTCGGAGGGCGA-´3

• Par diseñado con el software Geneious 4.6.4 (2009):

Iniciador directo: 5`-AGCTGCGCCGATGGTTTCTACAA-´3

Iniciador reverso: 5´-ATCGCCTCGCTCCAGTCAATG-´3

Con el fin de optimizar el alineamiento de los oligonucleótidos se llevó a cabo un

protocolo de PCR tipo touch-down. Se utilizó una temperatura superior de alineamiento a la

recomendada para evitar la amplificación de zonas inespecíficas. Esta temperatura

disminuyó hasta alcanzar el valor óptimo de alineamiento, es en esta última temperatura

donde ocurrieron la mayor parte de las amplificaciones requeridas.

Las condiciones iniciales de reacción fueron: 940C de desnaturalización por 30

segundos, 560C de alineamiento durante 30 segundos (disminuyendo 10C en cada ciclo

hasta alcanzar los 510C) y 720C de extensión durante 50 segundos. Las condiciones finales

de reacción fueron: 940C de desnaturalización por 30 segundos, 510C de alineamiento

durante 30 segundos y 720C de extensión durante 50 segundos. Se corrieron 24 de estos

ciclos. El tamaño esperado con estos oligonucleótidos es de 500 pb. Se utilizaron de 200

ng de ADN en cada reacción. Los productos de amplificación se analizaron en un gel de

agarosa al 0.8%.

Finalmente, para la detección del gen trp1 contenido en el plásmido pGBKT7 para

la transformación de Saccharomyces cerevisiae se diseñó el siguiente par de oligos con el

software Geneious 4.6.4 (2009):

Iniciador directo: 5`- TGGTCCATTGGTGAAAGTTTGCGG-´3

43

Iniciador reverso: 5´- TTTGTCTCCACACCTCCGCTTACA-´3

Las condiciones de la reacción fueron: 950C de desnaturalización por 30 segundos,

460C de alineamiento durante 30 segundos y 720C de extensión durante 90 segundos. Las

reacciones se analizaron en un gel de agarosa al 8%.

44

RESULTADOS.

1. Transformación genética del hongo Fusarium solani.

Se obtuvieron cepas resistentes a higromicina con el plásmido pCambia 1302 en un

ensayo inicial con 200 y 300 ondas de choque. Utilizando 100 y 400 ondas de choque no

se obtuvieron colonias resistentes; con 200 ondas de choque se detectaron siete probables

transformantes y con 300 una probable cepa transgénica. Se realizaron tres repeticiones

del protocolo con 200 ondas de choque de ondas de choque. Los resultados se muestran

en la tabla 8. La eficiencia calculada en este protocolo fue de 0.6% con 200 ondas de

choque.

Tabla 8. Número de probables transformantes obtenidos en tres repeticiones del protocolo

de transformación de Fusarium solani por medio de ondas de choque.

Repetición Colonias viables Colonias resistentes

1 1220 7

2 1330 5

3 1090 6

Se determinó una concentración de higromicina para la propagación de las cepas

en medio líquido de 70 µg/ml. Tres de las cepas se propagaron en medio mínimo para

Aspergillus con la concentración de higromicina referida. En una de las cepas se realizó

una caracterización morfológica (figura 10); así como la extracción y purificación de ADN

genómico.

45

Figura 10. Morfología microscópica del micelio de las cepas silvestre (número 1) y

resistente a higromicina (número 2) de Fusarium solani. Puede observarse el

engrosamiento de las hifas y el cambio de tamaño de los núcleos.

Para el análisis por PCR se utilizaron 500 µg de ADN en cada reacción. Se obtuvo

un fragmento del tamaño esperado (1 Kb) con el plásmido pCambia 1302 como control

positivo y en la cepa resistente a higromicina. Por el contrario, en la cepa silvestre de

Fusarium solani no se observó ningún fragmento producto de la reacción (ver figura 11). La

tabla 9 resume las variables importantes en el protocolo de transformación de este hongo

por medio de ondas de choque.

Tabla 9. Parámetros relevantes del protocolo de transformación de Fusarium solani por

medio de ondas de choque.

Nombre de la variable Valores estandarizados

Voltaje 7.6 ± 0.15 kV

Frecuencia de emisión de ondas de choque

0.5 Hertz

Número de ondas de choque 200

Tipo de inóculo Micelio

Colonias viables (UFC) 1x103

Cantidad de ADN 50 µg/ml

Volumen de muestra 200 µl

Concentración de selección con higromicina

400 µg/ml

1 2

46

Figura 11. Gel de electroforesis de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

correspondiente a los protocolos de transformación de Fusarium solani. Carril 1. Marcador

de peso molecular. Carril 2. Control positivo, plásmido pCambia 1302. Carril 3. ADN

genómico de cepa resistente de Fusarium solani. Carril 4. ADN genómico de la cepa

silvestre de Fusarium solani. Las flechas en la figura muestran el peso molecular

(kilobases) de la banda señalada en el marcador de referencia.

1 kb.

0.5 kb.

1 2 3 4

47

2. Transformación genética del hongo Colletotrichum gloeosporioides.

Ensayos iniciales generaron cepas resistentes a higromicina con 100 y 200 ondas de

choque con el plásmido pCambia 1302. Utilizando 300 y 400 ondas de choque no se

obtuvieron colonias resistentes; con 100 ondas de choque se detectaron cinco probables

transformantes y con 200 ondas de choque 89 probables cepas transgénicas. Se realizaron

tres repeticiones del protocolo con 200 ondas de choque de ondas de choque.

Los resultados se muestran en la tabla 10. La eficiencia calculada en este

protocolo fue de 7.3% con 200 ondas de choque.

Tabla 10. Número de probables transformantes obtenidos con tres repeticiones del

protocolo de transformación de Colletotrichum gloeosporioides por medio de ondas de

choque. (NC*. No cuantificable. Las cepas crecieron una muy cerca de otra y fue imposible

contarlas).

Repetición Colonias viables Colonias resistentes

1 1530 89

2 1220 92

3 1430 NC*

Se determinó una concentración de higromicina para la propagación de las cepas

de 35 µg/ml en medio líquido para Aspergillus. Se llevó a cabo la extracción y purificación

de ADN genómico. A partir del ADN extraído se realizó un protocolo de reacción en cadena

de la polimerasa con los oligonucleótidos correspondientes al gen hpt. Se utilizaron 200 ng

de ADN en cada reacción de amplificación. El ADN genómico de la cepa resistente y el

control positivo mostraron la amplificación del fragmento esperado. La cepa silvestre no

48

mostró ningún fragmento producto de la reacción (figura 12). Los parámetros relevantes del

protocolo de transformación se resumen en la tabla 11.

Figura 12. Gel de electroforesis de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

correspondiente a los protocolos de transformación de Colletotrichum gloeosporioides.

Carril 1. Marcador de peso molecular. Carril 2. Control positivo, plásmido pCambia 1302.

Carril 3. ADN genómico de correspondiente a la cepa silvestre. Carril 4. ADN genómico de

la cepa resistente de Colletotrichum gloeosporioides. Las flechas en la figura muestran el

peso molecular (kilobases) de la banda señalada en el marcador de referencia.

1 2 3 4

0.947 kb.

1.375 kb.

49

Tabla 11. Parámetros estandarizados para el protocolo de transformación de

Colletotrichum gloeosporioides por medio de ondas de choque.

Nombre de la variable Valores estandarizados.

Voltaje 7.6±0.15 kV

Frecuencia de emisión de ondas de choque

0.5 Hertz.

Número de ondas de choque 200

Tipo de inóculo Micelio

Colonias viables (UFC) 1x103

Cantidad de ADN 30 µg/ml

Volumen de muestra 200 µl

Concentración de selección con higromicina

200 µg/ml

3. Transformación genética de la levadura Saccharomyces cerevisiae.

Se realizó un ensayo inicial con el plásmido pBINGFPHPH que confiere resistencia

a higromicina en fase con el promotor gpdA (gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa) de

Aspergillus nidulans. A pesar de la poca homología con el promotor respectivo gpd1 de

Saccharomyces cerevisiae, se decidieron realizar estos ensayos preliminares.

La levadura se creció en medio YPD (ver apéndice para la composición de los

medios) hasta alcanzar una absorbancia de 0.5 a 600 nm. Se contaron las levaduras a esta

absorbancia en un hematocitómetro siendo de 1x106 levaduras por mililitro. Asimismo se

determinó una concentración inhibitoria de higromicina de 200 µg/ml. Para la realización de

estas pruebas se colocaron 190 µl del medio de cultivo y 10 µl de ADN a una

concentración de 1µg/µl del plásmido pBINGFPHPH. Es importante mencionar que durante

el proceso de aplicación de las ondas de choque se formaron numerosas burbujas en el

50

medio de cultivo. Después de este proceso, las células se incubaron durante 30 minutos a

300C para permitir su recuperación. Finalmente se plaquearon en medio selectivo con la

concentración antes referida de higromicina. Se realizaron tres repeticiones con este

protocolo; sin embargo no se produjeron transformantes.

Por otra parte, el uso del vector comercial pGBKT7 requirió el uso de medio

mínimo para levadura (YMM). Este medio sintético permite la adición y sustracción de

aminoácidos para la selección de levaduras por prototrofía. Para analizar la viabilidad de

este protocolo se realizaron ensayos para comprobar que la cepa utilizada (w303a) era

auxótrofa a triptófano (figuras 14 y 15). La utilización de un medio sintético disminuyó la

presencia de burbujas. Se obtuvieron cinco y doce cepas protótrofas a triptófano con 100 y

200 ondas de choque respectivamente. Un segundo ensayo para acotar estas variables

permitió observar que a 150 ondas de choque se obtenía un mayor número de

transformantes. Los resultados de la repetición del protocolo con 150 ondas de choque se

resumen en la tabla 12.

Tabla 12. Número de probables transformantes obtenidos con tres repeticiones del

protocolo de transformación de Saccharomyces cerevisiae por medio de ondas de choque

con 150 ondas de choque.

Repetición. Colonias viables. Colonias protótrofas.

1 2x105 18

2 2x105 12

3 2x105 22

La eficiencia calculada de este protocolo fue de 0.0086% con respecto a las células

totales de la levadura sometidas a las ondas de choque. Los parámetros relevantes del

51

protocolo se resumen en la tabla 13. En las figuras 13 y 14 pueden observarse las pruebas

de selección por prototrofía de las cepas obtenidas.

Tabla 13. Parámetros estandarizados para el protocolo de transformación de

Saccharomyces cerevisiae por medio de ondas de choque.

Nombre de la variable. Valores estandarizados.

Voltaje. 7.6±0.15 kV

Frecuencia de emisión de ondas de choque.

0.5 Hertz.

Número de ondas de choque. 150.

Tipo de inóculo. Células.

Colonias viables. (UFC) 2x105

Cantidad de ADN. 30 µg/ml.

Volumen de muestra. 200 µl.

Selección. Prototrofía a triptófano.

Figura 13. Cepas protótrofas a triptófano de Saccharomyces cerevisiae obtenidas por

medio de ondas de choque. Las cepas fueron crecidas en medio sintético YMM sin

triptófano durante cinco días. Cepas marcadas con la letra C (control): cepas silvestres.

52

Cepas marcadas con los números 1,2,3,4,5 y 6: Cepas aisladas de los protocolos de

transformación.

Figura 14. Propagación en medio líquido de cepas protótrofas a triptófano de

Saccharomyces cerevisiae obtenidas por medio de ondas de choque. Tubo de ensayo con

el número 1. Cepa silvestre crecida en medio YPD (contiene todos los aminoácidos).

Número 2. Cepa silvestre en medio YMM sin triptófano. Números 3 y 4. Cepas obtenidas

por medio de ondas de choque en medio YMM sin triptófano. Número 5. Cepa silvestre en

medio YMM con triptófano añadido.

Para evitar el uso de enzimas hibrolíticas se utilizaron dos protocolos alternativos

de extracción de ADN, uno basado en el choque térmico de la pared celular de levadura

(Harju et al. 2004) y otro basado en el uso de perlas de vidrio (Sobanski y Dickinson. 1995).

El protocolo de choque térmico no ofreció buenos resultados. El ADN presentaba

impurezas a pesar de la adición de lavados con fenol y cloroformo. La cantidad de ADN

extraída era además, muy poca, en promedio 50 ng/µl.

El uso de perlas de vidrio por otra parte permitió la extracción de ADN en buena

cantidad y libre de impurezas. Los rendimientos por extracción de 5 mililitros de levadura

fueron en promedio de 3 µg/µl en un volumen de 50 µl (ver figura 15). El tamaño esperado

con estos oligonucleótidos es de 650 pb. Se utilizaron de 200 ng de ADN en cada reacción.

Los productos de amplificación se analizaron en un gel de agarosa. Se obtuvo una

amplificación del tamaño esperado en cuatro cepas protótrofas analizadas y en el plásmido

53

pGBKT7 utilizado como control positivo. El ADN extraído de la cepa silvestre no mostró

ninguna amplificación en la reacción de PCR (figura 15).

Figura 15. Gel de electroforesis de muestras de extracción de ADN y PCR

correspondientes a los protocolos de transformación de Saccharomyces cerevisiae. Carril

1. Marcador de peso molecular. Carriles 2, 3 y 4. Extracciones de ADN genómico. Carril 5.

Reacción de amplificación cepa silvestre. Carriles 6, 7, 8 y 9. Reacción de amplificación de

cepas protótrofas generadas por el protocolo. Carril 10. Reacción de amplificación del

plásmido pGBKT7 utilizado como control positivo. Las flechas en la figura muestran el peso

molecular (kilobases) de la banda señalada.

1 2 3 4 5 6 8 9 10 7

0.831 kb.

0.564 kb.

54

4. Transformación genética del hongo Aspergillus niger.

4. 1. Protocolos de selección con higromicina.

Para estandarizar la cantidad de inóculo en los protocolos de transformación se realizó una

curva de calibración de las esporas (conidios) y de colonias viables versus absorbancia de

la cepa ATCC 1015 de Aspergillus niger a 420 nm. Los valores obtenidos se registran en la

tabla 14. El coeficiente de regresión lineal fue mayor en el caso de las colonias viables

(UFC) R=0.992 con respecto al número de conidios R=0.942 (figuras 16 y 17). Este

resultado indica una mayor confiabilidad en los datos de la calibración con respecto al

número de colonias viables.

Tabla 14. Valores obtenidos para las curvas de calibración de absorbancia a 420 nm de los

conidios de la cepa de Aspergillus niger ATCC 1015.

Absorbancia. No. conidios. log(No. conidios) UFC (colonias/ml) log (UFC)

0,373 3,00E+06 6,477121255 450000 5,65321251 0,21 8,00E+05 5,903089987 200000 5,30103

0,312 2,00E+06 6,301029996 380000 5,5797836 0,289 1,50E+06 6,176091259 310000 5,49136169

Figura 16. Curva de calibración de número de colonias viables versus absorbancia a 420

nm de la cepa ATCC 1015 de Aspergillus niger.

log10(UFC).

Absorbancia (420 nm).

55

Figura 17. Curva de calibración de número de conidios versus absorbancia a 420 nm de la

cepa ATCC 1015 de Aspergillus niger.

Un ensayo inicial del protocolo de transformación generó cepas resistentes a

higromicina con el plásmido pBINGFPHPH con 100 ondas de choque. La aplicación de

200, 300 y 400 ondas de choque no generó cepas resistentes. Se realizaron tres

repeticiones con 100 ondas de choque. Los resultados se resumen en la tabla 15. Después

de su aislamiento, las cepas fueron propagadas en medio mínimo para Aspergillus líquido

con una concentración de selección de 100 µg/ml (figura 18). Los parámetros relevantes de

este protocolo se resumen en la tabla 16. La eficiencia calculada con respecto al número

total de colonias viables fue de 0.53%. Posteriormente, se efectúo la extracción de ADN y

el análisis por PCR. El tamaño del fragmento esperado con los oligonucleótidos utilizados

es de 500 pb.

log10(Conidios).

56

Tabla 15. Número de probables transformantes obtenidos con tres repeticiones del

protocolo de transformación de Aspergillus niger por medio de ondas de choque con 100

ondas de choque.

Repetición. Colonias viables. Colonias resistentes.

1 1x104 16

2 1x104 50

3 1x104 27

Tabla 16. Parámetros estandarizados para el protocolo de transformación de Aspergillus

niger por medio de ondas de choque.

Nombre de la variable Valores estandarizados

Voltaje 7.6 ± 0.15 kV

Frecuencia de emisión de ondas de choque

0.5 Hertz

Número de ondas de choque 100

Tipo de inóculo Conidios

Colonias viables (UFC) 1x104

Cantidad de ADN 50 µg/ml

Volumen de muestra 200 µl

Concentración de selección con higromicina

400 µg/ml

En dos de cinco cepas analizadas por PCR se obtuvo una amplificación positiva.

Por el contrario, el ADN extraído de la cepa silvestre no mostró ninguna amplificación en la

reacción de PCR (figura 19). Además en estas dos cepas pudo observarse la expresión de

la proteína verde fluorescente (figura 20). Se realizaron microcultivos y se documentó la

actividad del gen reportero al tercer día de crecimiento con un microscopio de fluorescencia

57

MDR Leica a 480-520 nm. Por el contrario, la cepa silvestre de Aspergillus niger ATCC

1015 no mostró fluorescencia en este mismo espectro de longitud de onda y en la misma

tiempo de crecimiento.

Figura 18. Cepas de Aspergillus niger propagadas en medio selectivo con higromicina (100

µg/ml). Cultivo marcado con el número 1: Cepa silvestre (control). Cultivos marcados con

los números 2, 3, 4, 5 y 6: Cepas aisladas de los protocolos de transformación con 100

ondas de choque.

Figura 19. Gel de electroforesis de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

correspondiente a los protocolos de transformación de Aspergillus niger. Carril 1. Marcador

de peso molecular. Carril 2. Control positivo, plásmido pBINGFPHPH. Carriles 3 y 4.

1 2 3 4 5 6

0.564 kb.

1. 2. 3. 4. 5.

58

Extracciones ADN genómico de correspondiente a dos de las cepas resistentes. Carril 5.

ADN genómico de la cepa silvestre de Aspergillus niger. Las flechas en la figura muestran

el peso molecular (kilobases) de la banda señalada en el marcador de referencia.

Figura 20. Expresión de la proteína verde fluorescente (GFP) en una de las cepas

resistentes a higromicina. Panel A. Cepa crecida durante tres días en medio mínimo para

Aspergillus vista en campo claro con el objetivo 20X. Panel B. Misma cepa observada con

lámpara de fluorescencia a 480-520 nm.

4.2. Transformación de Aspergillus niger con la construcción pepA- y el gen de selección a

fleomicina.

Para la obtención de cepas deficientes de proteasas se decidió ensayar protocolos

de transformación con el gen de la peptidasa A de Aspergillus niger interrumpida por la

secuencia del gen ble que confiere resistencia a fleomicina (Drocourt et al. 1990). Se

prefirió el uso del gen de resistencia a fleomicina porque tiene este antibiótico tiene una

mejor capacidad de inhibición del crecimiento de la cepa silvestre de Aspergillus niger que

la actividad de la higromicina.

A. B.

59

Esta construcción se sintetizó comercialmente en tres fragmentos de 1955, 1881 y

1634 pares de bases (figura 21), los cuales fueron ensamblados y clonados en el vector

SK+ (figura 22). Para el uso de la secuencia en los protocolos de transformación, el

plásmido fue digerido con la enzima HindIII, la banda liberada se cortó en el gel de agarosa

y se purificó con el kit Illustra Gen Band Purification (GE Healthcare).

Para la elaboración de las muestras se utilizaron conidios y micelio de las cepas de

Aspergillus niger ATCC 16888 y ATCC 1015.La cantidad de ADN utilizado por muestra fue

de 10 µg. El volumen total de la muestra fue de 200 µl en bolsas de polipropileno. Por

tanto, la concentración final de ADN fue de 50 µg/ml. La utilización de micelio de la cepa

ATCC 16888 resultó ineficaz, el micelio de Aspergillus niger es cenocítico y es inviable al

disgregarse en la solución experimental.

Con respecto al inóculo de la cepa de Aspergillus niger ATCC 1015 se colocaron

en la muestra un total 1x104 esporas, lo cual resultó equivalente a 1x103 UFC. La

utilización de una solución de esporas de esta cepa generó los resultados que se resumen

en la tabla 17 y se muestran en la figura 23. Los parámetros relevantes de este protocolo

se resumen en la tabla 18. Por tanto, la eficiencia de este protocolo con respecto al número

de colonias viables fue de 0.74%.

Paralelamente al ensamblaje de los fragmentos de la construcción pepA- y la

estandarización de los protocolos se realizaron ensayos para discriminar y aislar cepas

deficientes en actividad proteolítica. En un inicio se efectuaron ensayos con un medio

basado en leche descremada que ofreció pobres resultados (Mattern et al.1992). Sin

embargo, nuevas pruebas apoyadas en el trabajo de van den Homberg et al. (1995)

permitieron elaborar un medio que contiene gelatina y caseína para ensayos de proteólisis

(ver apéndice para la composición de medios).

Este medio permitió observar de manera clara y evidente la formación de un halo

turbio en las cepas silvestres producto de la proteólisis de la caseína, el cual no se observó

en las cepas transformadas con la construcción (figura 24).

60

Figura 21. Esquema de la construcción pepA- ensamblada en este trabajo para el

aislamiento de cepas de Aspergillus niger deficientes en proteasas.

Figura 22. Gel de electroforesis que muestra el análisis de restricción de la construcción

pepA- clonada en el vector SK+. Carril 1. Digestión con la enzima EcoRI, que libera la

construcción pepA- (5.4 kb) y el vector SK+ (2.7kb). Carril 2. Marcador de peso molecular.

Carril 3. Digestión con la enzima HindIII, que libera la construcción pepA- (5.4 kb) y el

vector SK+ (2.7kb). Las flechas en la figura muestran el peso molecular (kilobases) de la

banda señalada.

Tabla 17. Número de probables transformantes obtenidos con la construcción pepA- con

conidios de la cepa ATCC 1015 de Aspergillus niger.

Muestra Número de ondas de

choque Resistentes obtenidos

Control 200 Cero M1 100 57 M2 200 102 M3 300 65

5.148 kb.

2.027 kb.

5.4 kb.

2.7 kb.

61

Figura 23. Cepas generadas durante los protocolos de transformación de Aspergillus niger

por medio de ondas de choque con el gen de resistencia a fleomicina interrumpiendo el

gen de la peptidasa A. Caja marcada con la letra A. Muestra control: colonias

bombardeadas sin ADN y sembradas en medio selectivo (fleomicina 5 µg/ml). Caja

marcada con la letra B. Colonias obtenidas con 200 ondas de choque y sembradas en

medio selectivo con la concentración antes mencionada.

Tabla 18. Parámetros estandarizados para el protocolo de transformación de Aspergillus

niger por medio de ondas de choque con el gen pepA-.

Nombre de la variable Valores estandarizados

Voltaje 7.6 ± 0.15 kV

Frecuencia de emisión de ondas de choque

0.5 Hertz

Número de ondas de choque 200

Tipo de inóculo Conidios

Colonias viables (UFC) 1x103

Cantidad de ADN 50 µg/ml

Volumen de muestra 200 µl

Concentración de selección con fleomicina

5 µg/ml

A. B.

62

Figura 24. Cepas deficientes en proteasas generadas durante los protocolos de

transformación de Aspergillus niger por medio de ondas de choque. Caja marcada con la

letra A. Muestra control con cepas silvestres de Aspergillus niger crecidas en medio

caseína-gelatina incubadas a 300C. Cajas marcadas con las letras B y C. Colonias

obtenidas con 200 ondas de choque y sembradas en el medio antes mencionado con las

mismas condiciones y en presencia de fleomicina (5 µg/ml). Nótese la ausencia de halo en

B y C.

A. C. B.

63

DISCUSIÓN.

1. Transformación genética del hongo Fusarium solani.

El hongo Fusarium solani (Nectria haematococca en su estado sexual) resulta de gran

interés científico, médico y fitopatológico (Coleman et al. 2009). Sin embargo; poco se ha

avanzado en métodos de transformación genética que permitan explotar parte de la

diversidad metabólica de este organismo. Hasta ahora el protocolo de transformación por

protoplastos ha permitido el estudio de la regulación de los genes de cutinasa y pectato

liasas, importantes en el proceso de fitopatogenicidad (Soliday et al. 1989; Yang et al.

2005).

Los rendimientos en estos protocolos de transformación han sido de diez mutantes

estables por microgramo de ADN y por 1x107 protoplastos. La eficiencia de este método

fue de 0.0001% con respecto al número de protoplastos. Además de considerar estos

bajos rendimientos, el uso de protoplastos representa un riesgo de formación de células

con poliploidía indeseada (Bradshaw, RE. 2006). Un segundo protocolo con modificaciones

como la adición de sorbitol para mantener la estado osmótico y el uso de una mayor

cantidad de polietilenglicol, permitió elevar los rendimientos hasta obtener 1x104 posibles

mutantes por microgramo de ADN y 1x107 protoplastos (Crowhurst et al. 1992). La

eficiencia de este protocolo fue de 0.1%.

En la metodología descrita anteriormente se observó que los resultados variaban

de lote a lote de protoplastos y se encontró también que existía una falta de correlación

entre la cantidad de ADN y la eficiencia de transformación. Como señalan los autores esta

variación puede deberse a factores biológicos no definidos que afectan de manera directa

la posibilidad de obtener altas frecuencias de transformación. Los autores no indagaron en

qué consistirían estos factores.

La metodología basada en la transformación mediada por Agrobacterium por otra

parte, ha permitido explorar la enzima quitosanasa como factor de patogenicidad en

64

cultivos de interés comercial como el chícharo. La transformación por medio de este

protocolo generó 12 transformantes por cada 1x105 conidios. La eficiencia para esta

metodología fue de 0.012%. (Liu, H. Bao, X. 2009). Como se muestra en el trabajo

mencionado de Crowhurst et al. 1992 no se observa una correlación directa en la cantidad

de ADN utilizado en el proceso de transformación y número de probables mutantes. Por

tanto, la cantidad de ADN no es un parámetro confiable para cuantificar la eficiencia de

estos protocolos.

Es por todo lo anterior, que se decidió comparar en este trabajo la cantidad de

cepas resistentes obtenidas con el número de posibles colonias del organismo contenidas

en el inóculo como medida de la eficiencia. De tal manera, que si bien no es una medida

exacta del éxito del método, si mejora la apreciación de los alcances de determinado tipo

de metodología con respecto a las diferentes opciones de transformación existentes. En

vista de lo anterior, el proceso de transformación propuesto en este trabajo incrementa en

grado sustancial la eficiencia lograda en la inserción de genes de interés. La eficiencia por

medio de ondas de choque, como se detalla en el apartado de resultados, es de 0.6% para

la especie Fusarium solani. Los resultados de este trabajo indican la posibilidad de un

nuevo método de transformación que incrementa la eficiencia y evitaría la aparición de

células poliploides.

2. Transformación genética del hongo Colletotrichum gloeosporioides.

Los protocolos de transformación de este hongo filamentoso con el uso de protoplastos

tienen una eficiencia reportada de 0.0018% (Wei et al. 2004). Esta metodología ha

permitido estudiar la importancia de la transferencia de glicerol como nutriente del

organismo infectado al fitopatógeno. Los estudios de transformación mediada por

Agrobacterium tumefaciens tuvieron una eficiencia de entre 0.005% y 0.013% (de Groot et

al. 1998). Sin embargo, estudios posteriores mostraron una variación en la eficiencia con

valores de 0.00039% para el uso de protoplastos y 0.00046% en la metodología con

65

Agrobacterium (Shamoun et al 2006). Estos valores resultan muy inferiores a los obtenidos

con los primeros protocolos citados.

El protocolo establecido en este trabajo incrementa en varios órdenes de magnitud

la eficiencia de la transformación (7.3% con respecto a las colonias viables), disminuye el

riesgo de la formación de organismos poliploides y nulifica la posibilidad de insertar ADN

bacteriano no deseado como puede ocurrir con Agrobacterium. El uso del promotor

CaMV35S resultó funcional tanto en Fusarium solani como en Colletotrichum

gloeosporioides. La posibilidad de utilizar este promotor derivado del virus del mosaico de

la coliflor ya había sido demostrada por Mullins et al. 2001. No obstante, como se discute

en el trabajo referido, el fenotipo de las cepas mutantes puede variar con el promotor

utilizado. En este trabajo se observó un crecimiento excesivamente lento de las cepas

aisladas, aunque la resistencia a higromicina se mantuvo durante la propagación de las

colonias aisladas.

3. Transformación genética de la levadura Saccharomyces cerevisiae.

A pesar de que el protocolo establecido en este trabajo presenta una eficiencia ligeramente

superior a los métodos químicos establecidos para la transformación de levadura (0.0086%

contra 0.0019%) y es muy superior al uso de protoplastos (0.00084%) no puede competir

con la eficiencia de protocolos modificados con la adición de ADN de una sola hebra y

choque térmico (eficiencias cercanas al 1%). (Ito et al. 1983; Gietz et al. 1992). Además, en

el protocolo actual de transformación de la levadura Saccharomyces cerevisiae por

métodos químicos y de temperatura se ha demostrado que no ocurre la formación de

células poliploides (Gietz, RD. Woods, RA. 2001).

Esta combinación de alta eficiencia, tiempos relativamente breves de

transformación, así como ausencia de problemas de carga génica se deben sin duda a las

propiedades de la pared celular de la levadura, cuya contenido de quitina es muy inferior al

contenido presente en la pared de los hongos filamentosos. La adición de cationes y

66

polietilenglicol son suficientes para inducir la permeabilidad en la pared celular y la captura

de ADN del medio externo.

No obstante que el método propuesto en este trabajo no compite con el método

estándar de transformación en la levadura Saccharomyces cerevisiae en los valores de

eficiencia, proporciona valiosa información respecto a los alcances del uso de ondas de

choque para la inserción de genes de interés. Es decir, la transformación por medio de

ondas de choque no está limitada en a hongos filamentosos, también es posible introducir

ADN de interés en células de levaduras como se demuestra.

El protocolo establecido señala que es posible transformar células con genes que

confieren prototrofía a un metabolito específico. Además el protocolo utilizado no está

optimizado porque muchos parámetros físicos no fueron modificados para observar si

existe variación en la eficiencia del método. Por ejemplo, pueden utilizarse diferentes

voltajes. También existe la posibilidad de utilizar ondas de choque en tándem. En esta

modalidad dos ondas de choque son generadas con un ligero retraso de una respecto a la

otra con el fin de incrementar los efectos de daño mecánico en los cálculos renales (Loske

et al. 2002. Loske, AM. 2007).

Es probable que la adición de una segunda onda de choque incremente el efecto

de la cavitación acústica en las vecindades de la célula y por tanto, permita la formación de

mayor número de microjets en el líquido de la suspensión celular. La exploración de las

modalidades antes mencionadas quizá permita un incremento de la eficiencia de la

transformación en Saccharomyces cerevisiae y sin duda, permitirá una mayor comprensión

de los mecanismos que permiten la captura de ADN en levaduras por medio de ondas de

choque.

67

4. Transformación genética del hongo Aspergillus niger.

Como se describió anteriormente, el hongo filamentoso Aspergillus niger presenta

actividades metabólicas y de secreción que lo convierten en un fuerte candidato para

convertirse en uno de los organismos más prometedores para ser utilizados como

biofábricas en un futuro cercano (Nevalainen et al. 2005; Karnaukhova et al. 2007;

Lubertozzi, D. Keasling, JD. 2009). No obstante, hasta ahora continúan utilizándose

mutaciones aleatorias inducidas por luz ultravioleta o agentes químicos para la obtención

de cepas con determinadas características (Lotfy et al. 2007).

La utilización de estos agentes mutagénicos puede interferir con rutas metabólicas

importantes en este microorganismo y disminuir su tasa de crecimiento o de secreción.

Además, la maquinaria de reparación celular puede revertir las mutaciones en las

secuencias de ADN modificadas, con la consecuente pérdida del fenotipo de interés

(Goldman et al. 2002).

Los métodos actuales de transformación incluyen la utilización de protoplastos y el

uso de Agrobacterium tumefaciens como vector de transformación (Meyer et al. 2007; de

Groot et al. 1998). El uso de protoplastos ha sido desde finales del siglo pasado el método

más utilizado en la transformación de Aspergillus niger. La obtención de cepas auxótrofas o

con sensibilidad toxigénica a cierto tipo de compuestos han permitido el aislamiento de

mutantes con fenotipos de interés. Los rendimientos de los protocolos de protoplastos son

cercanos al 0.005% y en casos extraordinarios al 0.01% (Meyer et al. 2007; Lubertozzi, D.

Keasling, JD. 2009). A pesar de ello la gran cantidad de protoplastos utilizados permite la

obtención de mutantes con la inserción genética deseada. La formación de poliploides y el

intercambio genético en cepas vegetativamente incompatibles fueron comprobados en

Aspergillus nidulans y hasta ahora es un problema no resuelto en el uso de protoplastos de

cualquier especie de hongos filamentosos.

Muchas especies del género Aspergillus son susceptibles de transformación

mediante Agrobacterium con rendimientos relativamente buenos (Michielse et al. 2004;

68

Michielse et al. 2005). En la especie Aspergillus awamori, por ejemplo, se obtuvo un

rendimiento del 0.04% en el protocolo desarrollado por de Groot et al. 1998. La eficiencia

reportada por de Groot et al. para Aspergillus niger fue de apenas 0.00005% y hasta ahora

no existe un protocolo reportado que mejore estos resultados.

Usando el protocolo de ondas de choque se plantea un mejor escenario para la

genómica funcional de este organismo. En los dos protocolos desarrollados en este trabajo

se observó una eficiencia bastante superior a los métodos convencionales (0.53% y

0.74%). Esta eficiencia fue validada por ensayos de reacción en cadena de la polimerasa y

la visualización de la proteína verde fluorescente. También este protocolo permitió el

aislamiento de cepas deficientes en proteasas sin realizar un mutagénesis aleatoria con

agentes químicos o luz ultravioleta. Este procedimiento, al utilizar una secuencia que

promovía la recombinación homóloga, redujo notablemente la cantidad de tiempo de

análisis en el aislamiento de cepas de interés.

En este trabajo se desarrollaron por vez primera protocolos reproducibles de

transformación genética de hongos mediante ondas de choque. Los protocolos se

caracterizaron por una mayor eficiencia, mayor facilidad y menor cantidad de trabajo para

obtener transformantes. A pesar de que no se conocen los mecanismos precisos de

transformación, los resultados de este trabajo sugieren la posibilidad de transformar

multitud de organismos de manera reproducible, eficiente y funcional. Como se mencionó

anteriormente, la transformación genética sigue siendo un obstáculo para el estudio y

utilización de varios hongos (por ejemplo, los basiodiomicetos). Con este protocolo, que se

presenta por primera vez, se abre la posibilidad de modificar especies que antes no se

podían manipular genéticamente.

69

CONCLUSIONES.

1. Es posible transferir secuencias de ADN en hongos mediante ondas de choque.

2. Las secuencias de ADN insertadas pueden expresarse de manera funcional en los organismos

modificados.

3. La eficiencia de los protocolos establecidos son mayores a los de los métodos

convencionalmente utilizados y no implican el uso de protoplastos.

4. La metodología de transformación genética por medio de ondas de choque permite el

aislamiento de cepas de interés con un gen específico, como se demostró con las cepas

deficientes en proteasas.

70

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78

APÉNDICE.

Medios de cultivo utilizados en este trabajo.

1. Medio mínimo para Aspergillus.

Glucosa 10 g

20X Nitratos 50 ml

1000X Trazas 1 ml.

1% Tiamina 1 ml

Aforar a un litro, ajustar el pH de 6.0 a 6.5 con NaOH 0.1 N.

20X Nitratos

NaNO3 120 g.

KCl 50 ml.

MgSO4 10.4 g.

KH2PO4 30.4 g.

1000X Trazas

Agua destilada 60 ml

ZnSO4 7H2O 2.2 g

H3BO3 1.1 g

MnCl2.4 H2O 0.5 g

FeSO4.7 H2O 0.5 g

79

CoCl2 6 H2O 0.17 g

CuSO4.5 H2O 0.16 g

Na2MoO4.2 H2O 0.15 g

Na4EDTA 5 g

2. Medio YPD.

Extracto de levadura. 10 g

Peptona. 20 g

Glucosa. 20 g

Aforar a un litro y autoclavar.

3. Medio YMM.

Base nitrogenada. 6.68 g

Glucosa. 20 g

Dropo out. 10 ml

Agar 20 g

Aminoácidos (Stocks al 1%).

Adenina. 1 ml.

Tirosina. 3 ml.

Uracilo. 4 ml.

Histidina. 1 ml.

Leucina. 6 ml.

Triptófano. 4 ml.

Aforar a un litro y autoclavar.

80

Drop out. 100x. (Componentes para un litro).

Arginina. 2 g

Isoleucina. 6 g

Lisina. 4 g

Metionina. 1 g

Fenilalanina. 6 g

Treonina. 5 g

4. Medio caseína y gelatina.

Glucosa 9 g

20X Nitratos 50 ml

1000X Trazas 1 ml

1% Tiamina 1 ml

Gelatina 10 g

Caseína 10 g

Casaminoácidos 5 g

Tritón 100 µl

Aforar a un litro, ajustar el pH de 6.0 a 6.5 con NaOH 0.1 N.