Centrifugação Final

Ano letivo 2014/2015

Bioquímica Experimental I

Professor Francisco Pinto

Separação e Análise de Componentes Celulares por Centrifugação Diferencial

Grupo: 3 Turma: PL 13

Ana Rita Garcia, nº 44769

Carolina Sousa, nº 45662

Guilherme Gil Moreira, nº 45219

Joana Catarina Andrade, nº 44798

Data de Entrega: 21 de Outubro de 2014

2º Ano – 1º Semestre


ÍndiceResumo.................................................................................................................................3

Tratamento e Discussão de Resultados..................................................................................4

Doseamento de proteínas pelo método do biureto com desoxicolato.......................................4

Determinação da concentração proteica do homogenato de fígado e de cada uma das frações isoladas...................................................................................................................5

Fração mitocondrial – Determinação da atividade do sucinato: citocromo c oxidoreductase...7

Fração lisossomal – Determinação da atividade do fosfatase ácido...........................................9

Distribuição dos Marcadores Enzimáticos Estudados................................................................11

Análise da Fração Nuclear – isolamento do DNA.......................................................................13

Determinação da concentração de DNA na preparação final...........................................13

Determinação da percentagem de DNA obtido por grama de fígado..............................14

Bibliografia……………………………………………………………………………………………………………………………16

2


Resumo

Este trabalho teve como objetivo isolar várias frações subcelulares a partir de um

homogenato de fígado de porco por centrifugação diferencial e proceder à sua

caracterização bioquímica, efetuando a extração de DNA da fração nuclear e a análise da

distribuição do succinato citocromo c oxidorredutase e o fosfatase ácido nas diferentes

frações isoladas, de modo a que fosse possível determinar o grau de pureza do DNA

extraído.

Da análise da distribuição do succinato citocromo c oxidorredutase nas várias

frações, conclui-se que este enzima existe em maior concentração no pellet 2, uma vez que

este é específico da fração mitocondrial. Quanto ao fosfatase ácido, podemos afirmar que a

maior concentração do enzima se encontra no pellet 3, como era esperado visto que este é

específico da fração lisossomal. De acordo com os resultados obtidos, podemos concluir

que o fracionamento celular foi realizado com sucesso.

Após a extração de DNA, foi possível calcular a sua concentração na preparação

final, obtendo-se o valor de 33,65 μg/mL e ainda a percentagem de DNA por grama de

fígado, em que se obteve o valor de 0,2048%. Em relação ao grau de pureza, o valor obtido

foi de 1,66 que, em comparação com o valor tabelado – 1,8 – nos permite afirmar que o

DNA extraído ainda continha impurezas, nomeadamente as histonas.

3


Tratamento e Discussão de Resultados

Doseamento de proteínas pelo método do biureto com desoxicolato

Quadro 1 Dados necessários para traçar a curva de calibração

Volume (mL) Massa (mg) Absorvância (540 nm)

01º Ensaio

0 00,053

2º Ensaio 0,0533º Ensaio 0,053

11º Ensaio

0,05 0,250,073


21º Ensaio

0,10 0,500,095


31º Ensaio

0,20 1,000,129


41º Ensaio

0,30 1,500,179


51º Ensaio

0,40 2,000,189


61º Ensaio

0,50 2,500,258


71º Ensaio

0,60 3,000,302


81º Ensaio

0,80 4,000,390


91º Ensaio

1,00 5,000,456


Dado que a concentração de BSA é 5mg/mL, é necessário multiplicar o volume (em

mL) por 5, de modo a obter a massa (em mg). Esta massa é então utilizada para traçar a

curva de calibração.

4


Determinação da concentração proteica do homogenato de fígado e de cada uma das frações isoladas

Quadro 2 Dados necessários para determinar a concentração proteica no homogenato e em cada uma das frações

Amostras Abs540 MedianaMassa de Proteína por

mL de Solução Suspensa (mg)

Massa de Proteína num volume de 4 mL

de H2O (mg)

Volume Amostra (mL)

Concentração (mg/mL)

H0,201

0,177 1,5799 6,3196 0,5 12,63920,0780,177

P10,133

0,133 1,0472 4,1889 0,5 8,37780,1370,111

P20,176

0,197 1,8220 7,2881 0,75 9,71750,1970,214

P30,271

0,271 2,7179 10,8717 0,75 14,49600,2850,185

S30,274

0,264 2,6332 10,5327 0,75 14,04360,2640,101

Para esta determinação, registaram-se os valores da absorvência de cada uma das

amostras. Em seguida, utilizou-se a mediana destes valores para calcular a massa de

5

0 1 2 3 4 5 60

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

0.45

0.5

f(x) = 0.0825658856135047 x + 0.0465323759133283R² = 0.992528005681989

Curva de Calibração - Método do Biureto

Massa de proteína (mg)

Abs

orvâ

ncia

(540

nm

)

Figura 1 Relação entre a Absorvência e a Massa de Proteína – método do Biureto


proteína por mL de solução suspensa. Não se utilizou a média dos 3 valores, uma vez que o

valor obtido não seria um valor real, mas sim uma aproximação.

A partir da reta de calibração y = 0,0826x + 0,0465, onde y representa a

absorvência e x a massa da proteína em mg, calculou-se a massa de proteína por mL de

solução suspensa. Apresentemos então um exemplo do cálculo para o valor do

homogenato:

y=0,0826 x+0,0465⇔ 0,177=0,0826 x+0,0465 ⇔0,1305=0,0826 x ⇔

⇔ x=1,5799 mg

Visto que se adicionaram 4 mL de água de modo a suspender o pellet e que se

utilizou apenas 1 mL da suspensão resultante no método do biureto, é necessário

multiplicar o valor calculado anteriormente por 4, de modo a obter a massa de proteína

nesse volume.

1,5799 x 4=6,3196 mg

Sabendo ainda que o volume retirado de alíquota foi de 0,75 mL de cada fração

(exceto para o homogenato e P1, em que se retiraram 0,5 mL), é necessário dividir a massa

calculada acima pelo volume retirado de alíquota.

No caso do homogenato, tem-se então:

C=6,31960,5

=12,6392 mg /mL

Os valores das restantes frações foram calculados do mesmo modo.

6


Fração mitocondrial – Determinação da atividade do succinato: citocromo c oxidoreductase

Quadro 3 Determinação da atividade do succinato citocromo c oxidoreductase no homogenato inicial e em cada fração isolada

AmostraDeclive

(s⁻¹)

Mediana do

Declive (s⁻¹)

ΔAbs550/Δt (min-1)

Velocidade (M/min)

Velocidade (nM/min)

Unidade enzimática

(nmole/min)

Atividade (U/mL)

Volume total (mL)

Atividade total (U)

Homogenato

0,0013

0,0012 0,0723,4286x1

0⁻⁶3428,57 7,46571 149,314 89 132890,0010

0,0012

Pellet 1

0,0013

0,0013 0,0783,7143x1

0⁻⁶3714,29 8,08786 161,757 20 3235,140,0012

0,0013

Pellet 2

0,0020

0,0019 0,1145,4286x1

0⁻⁶5428,57 11,8207 236,414 9 2127,730,0019

0,0019

Pellet 3

0,0017

0,0017 0,1024,8571x1

0⁻⁶4857,14 10,5764 211,529 9 1903,760,0016

0,0017

Sobrenadante 3

0,0003

0,0003 0,0188,5714x1

0⁻⁷857,143 1,86643 37,3286 89 3322,240,0002

0,0003

Para esta determinação, registaram-se os valores da absorvência durante um minuto

com intervalos de 0,5 segundos, de modo a traçar as curvas de calibração para o

homogenato e cada uma das frações. Destas curvas, retiraram-se os declives das retas para

que fosse possível calcular a atividade (U/mL) do succinato citocromo c oxidorreductase.

O declive corresponde então a ΔAbs550/Δt, sendo que é necessário multiplicar o

valor do declive por 60, uma vez que queremos passar de segundos para minutos, ou seja,

(para o caso do homogenato):

0,0012 x60=0,072 min⁻ ¹

Em seguida, para calcular a velocidade (M/min), sabendo que ε = 2,1x10⁴ M⁻¹

cm⁻¹, temos:CΔt

=|¿|ε l

⇔CΔt

= 0,07221000

⇔CΔt

=3,42857 ×10−6 M /min¿

7


Sabendo que a atividade enzimática é definida como a quantidade de enzima que

catalisa a redução do citocromo c a uma velocidade de 1nmole/min, é necessário converter

o valor anterior para nM por minuto. Assim sendo, temos:

3,42857 ×10−6× 109=3428,57 nM /min

Em seguida, é necessário ainda voltar a converter este valor para nmoles/min, ou

seja,

U=3428,57 ×2,1775 ×0,001 ⇔ U=7,46571 nmoles /min

Observação: O valor de 2,1775 corresponde ao volume total, ou seja, 2 mL de tampão de

fosfatos, 0,08 mL de solução de citocromo c, 0,05 mL de cada fração, 0,0075 mL de KCN

e 0,04 mL de solução de succinato.

A atividade (U/mL) é calculada tendo em conta a unidade enzimática (calculada

acima) e o volume de cada fração. Como exemplo, tem-se para o homogenato:

UmL

=7,465710,05

=149,314 U /mL

Por fim, de modo a calcular a atividade total, é necessário fazer a multiplicação

entre o valor acima calculado, isto é, a atividade (U/mL), e o volume do meio de

isolamento:

U=149,314 ×89=13289 U

8


Fração lisossomal – Determinação da atividade do fosfatase ácido

Quadro 4 Determinação da atividade do fosfatase ácido no homogenato inicial e em cada fração isolada

AmostraAbs400

dos Tubos B

Mediana ΔAbs400Concentração

(M)Velocidade (µM/min)

Unidade enzimática

(µmole/min)

Atividade (U/mL)

Volume total (mL)

Atividade total (U)

Homogenato

0.48

0.435 0.291 1.38571x10-5 1.385714 0.005543 0.554286 89 49.33140.292

0.435

Pellet 1

0.244

0.204 0.060 2.85714x10-6 0.285714 0.001143 0.114286 20 2.28570.167

0.204

Pellet 2

0.246

0.246 0.102 4.85714x10-6 0.485714 0.001943 0.194286 9 1.74860.209

0.275

Pellet 3

0.391

0.338 0.194 9.23810x10-6 0.923810 0.003695 0.369524 9 3.32570.324

0.338

Sobrenadante 3

0.283

0.283 0.139 6.61905x10-6 0.661905 0.002648 0.264762 89 23.56380.235

0.303

Em primeiro lugar, é de salientar que foram utilizados os tubos B, uma vez que os

valores de absorvência obtidos para os tubos A eram demasiado elevados.

Para determinar a atividade do fosfatase ácido, registaram-se os valores de

absorvência a 400 nm. Foi ainda necessário calcular a mediana dos 3 valores de

absorvência medidos para cada fração. Sabendo que o valor de absorvência do branco

corresponde a 0,144 e que os valores da mediana correspondem aos valores da 3ª coluna,

para calcular ΔAbs400, é necessário subtrair a cada mediana de absorvência o valor do

branco. Assim sendo, para o caso do homogenato, temos:

ΔAbs 400=0,435−0,144=0,0291

Em seguida, pretendeu-se calcular a concentração (M). Para isso, é necessário

indicar que ε (pNP) = 2,1x10⁴ M⁻¹ cm⁻¹. Deste modo, podemos calcular a concentração da

seguinte forma:

9


Concentração= ΔAbsε

⇔ Concentração= 0,29121000

⇔ Concentração=1,38571 ×10−⁵ M

Após este cálculo, é necessário calcular a velocidade (em µM/min). Sabendo que a

leitura das absorvências foi feita durante 10 minutos e os valores de concentração para

cada fração (calculados da forma indicada acima), podemos calcular a velocidade da

seguinte forma:

Velocidade=ConcentraçãoΔt

⇔Velocidade=1,38571 ×10⁻ ⁵10

⇔Velocidade=1,38571 ×10−6 M /min

Uma vez que o valor da unidade enzimática é dado em μmole/min, é necessário

converter a velocidade para μM/min. Assim sendo:

Velocidade=1,38571 ×10−6 ×106=1,38571 μM /min

Deste modo, podemos prosseguir ao cálculo da unidade enzimática:

U=velocidade ×volume adicionado ⇔ U=1,38571 ×0,004 ⇔ U =0,005543 μmole /min

O volume de 0,004 L, ou seja, 4 mL, corresponde à soma dos 0,2 mL de

desoxicolato de sódio, 0,2 mL de tampão acetato de sódio, 0,5 mL de pNPP, 3 mL de

NaOH e 0,1 mL da fração diluída 10 vezes em H2O.

A atividade (U/mL) é calculada, tendo em conta a unidade enzimática (calculada

acima) e o volume de cada fração. Como exemplo, tem-se:

UmL

=0,0055430,01

=0,554286 U /mL

Por fim, de modo a calcular a atividade total, é necessário fazer a multiplicação

entre o valor acima calculado, isto é, a atividade (U/mL), e o volume do meio de

isolamento:

U=0,554286 ×89=49,3314 U

Distribuição dos Marcadores Enzimáticos Estudados

10


Quadro 5 Determinação da atividade específica do succinato citocromo c e do fosfatase ácido

AmostraV total

(mL)[Proteína] (mg/mL)

Succinato:citocromo c oxidoreductase

Atividade do fosfatase ácido

Atividade (U/mL)

Atividade específica

(U/mg)

Atividade (U/mL)

Atividade específica (U/mg)

Homogenato 89 12,6392 149,314 11,81356 0,554286 0,043854Pellet 1 20 8,37772 161,757 19,30801 0,114286 0,013642Pellet 2 9 9,71751 236,414 24,32868 0,194286 0,019993Pellet 3 9 14,4956 211,529 14,59264 0,369524 0,025492

Sobrenadante 3 89 14,0436 37,3286 2,658052 0,264762 0,018803

Para a determinação da atividade específica (U/mg de proteína) dos enzimas

estudados nas diferentes frações, é necessário, tanto para o succinato citocromo c

oxidorreductase como para o fosfatase ácido, ter em conta as suas atividades (U/mL) e a

concentração de proteína (mg/mL).

Sendo assim, demonstraremos como calcular a atividade específica do succinato

citocromo c oxidoreductase no homogenato, como exemplo. A atividade específica pode

então ser calculada através da divisão do valor da atividade (U/mL) pela concentração

proteica:

Atividadeespecífica= atividade[ proteína ]

=149,31412,6392

=11,81356 U /mg

No caso do fosfatase ácido, temos como exemplo, para o homogenato:

Atividadeespecífica=actividade[ proteína ]

=0,5542912,6392

=0,043854 U /mg

11


H P1 P2 P3 S30

50

100

150

200

250

Succinato:citocrómo c oxidoreductase

Actividade (U/mL) Actividade específica (U/mg)

Frações

Figura 2 Gráfico relativo à atividade do succinato citocromo c oxidoreductase

H P1 P2 P3 S30

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

Fosfatase Ácido

Actividade (U/mL) Actividade específica (U/mg)

Frações

Figura 3 Gráfico relativo à atividade do fosfatase ácido

Os gráficos apresentados acima, juntamente com o Quadro 5 pretendem ilustrar os

resultados obtidos relativamente à distribuição dos marcadores enzimáticos estudados, de

modo a que se possa avaliar o sucesso do fracionamento celular realizado. Dito isto, era de

esperar que a maior concentração proteica se encontrasse no sobrenadante 3, uma vez que

as proteínas têm uma elevada solubilidade no meio de isolamento. No entanto, não foi esse

o resultado observado, sendo que a maior concentração proteica se encontra sedimentada

no pellet 3, o que se pode dever ao facto das proteínas terem sido “arrastadas” por

organitos celulares mais pesados ou macroestruturas.

12


Para analisar a presença de atividades enzimáticas características da fração

mitocondrial, recorre-se à determinação da atividade do succinato citocromo c. Analisando

a Figura 2, podemos afirmar que a maior fração mitocondrial se encontra no pellet 2, tal

como se esperava, uma vez que o enzima é específico da fração mitocondrial, pelo que se

pode concluir que existe nesta fração a maior concentração de mitocôndrios.

Em relação ao fosfatase ácido, ou seja, o enzima específico da fração lisossomal e

analisando a Figura 3, podemos afirmar que a maior fração lisossomal se encontra no

pellet 3, tal como seria de esperar. No entanto, através da análise da mesma figura,

podemos ainda afirmar que a concentração de lisossomas no sobrenadante 3 também é

elevada. A explicação para este facto pode dever-se ao facto de estes organitos serem

bastante heterogéneos no seu tamanho.

Análise da Fração Nuclear – isolamento do DNA

Para começar, é necessário indicar que o valor de absorvência utilizado foi o

valor medido a 260 nm, uma vez que a medição de absorvências acima deste valor leva à

desnaturação do DNA.

A massa do fígado inicial corresponde a 8,8730 g.

Determinação da concentração de DNA na preparação final

O valor de absorvência a 260 nm da fração nuclear foi de 0,673. Sabe-se que 1 U.A260 corresponde a uma concentração de DNA de 50 μg/mL. Assim, podemos calcular a concentração de DNA na preparação final.

[ DNA ]= |×|50 μg /mL1 U . A 260 nm

⇔ [ DNA ]=0,673× 501

⇔ [ DNA ]=33,65 μg /mL

Determinação da percentagem de DNA obtido por grama de fígado

Em primeiro lugar, é necessário converter a concentração de DNA de μg para

grama. Assim sendo, tem-se:

13


33,65 μg/mL=33,65 ×10−6 g /mL

Sabendo que o fator de diluição foi de 27 vezes, é necessário multiplicar o valor acima por 27. Assim sendo, temos:

33,65 ×10−6× 27=9,0855× 10−4 g /mL

Visto que o volume de meio de isolamento utilizado corresponde a 20 mL, temos então de calcular a massa de DNA presente nesse volume, ou seja,

m ( DNA )= [ DNA ] × volume meiode isolamento1 mL

⇔ m ( DNA )=9,0855 ×10⁻ ⁴ × 201

⇔ m ( DNA )=1,8171 ×10⁻ ² g

Uma vez que queremos determinar qual a percentagem de DNA por grama de fígado, é necessário calcular o quociente entre a massa de DNA e a massa de fígado inicialmente pesada. Sabemos ainda que a massa de fígado inicial correspondia a 8,8730 g pelo que se obtém:

% (m /m)=1,8171 ×10⁻ ²8,8730

×100 ⇔ % (m /m )=0,2048 %

Desta forma, podemos concluir que em cada grama de fígado de porco, estão presentes 0,002 gramas de DNA (corresponde a %(m/m) = 0,2048%).

Análise do grau de pureza do DNA

Quadro 6 Apresentação dos valores necessários para determinar o grau de pureza do DNA

O grau de pureza do DNA extraído é calculado através da razão entre o valor de

absorvência a 260nm e valor de absorvência a 280nm.

A razão da absorvência a 260 nm e 280 nm é usada para determinar o grau de

pureza do DNA. A razão de 1,8 é aceitável para que se possa considerar o DNA puro. Caso

o valor desta razão seja inferior a 1,8, podemos afirmar que estamos na presença de

proteínas, fenol ou outros contaminantes que absorvem fortemente a 280 nm ou perto deste

comprimento de onda.

14

Fração Abs260 Abs280Pureza

de DNANuclear 0,673 0,405 1.66


Pureza de DNA=|260||280|

=0,6730,405

≈ 1,66

Uma vez que o grau de pureza de DNA corresponde a 1,66, o que pode ser

considerado como sendo inferior ao valor para o qual podemos admitir que o DNA é puro,

é-nos então possível afirmar que o DNA extraído se encontra contaminado por algum dos

fatores anteriormente referidos, sendo a contaminação por parte das histonas o fator mais

contribuinte.

Bibliografia

Boyer, R.F. (1986) Modern Experimental Biochemistry, Addison-Wesley: Reading,

MA

15


http://www.bio.davidson.edu/GCAt/protocols/NanoDrop_tip.pdf (consultado no dia

14 de Outubro de 2014, às 15h)

16

http://www.bio.davidson.edu/GCAt/protocols/NanoDrop_tip.pdf

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