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1
皮膚細胞が乳酸菌を取り込むと
多能性細胞になる
熊本大学大学院生命科学研究部
准教授 太田 訓正
2
幹細胞とは
人間では一つの受精卵から、200種類以上、約六〇兆個の細胞が作られ
る。 多種多様な細胞にも、もとをたどると親の細胞に行き当たり、それを幹細胞
(stem cell)と呼び、体性幹細胞、ES細胞、iPS細胞がある。
3
従来の幹細胞の特徴とその問題点
細胞 体性幹細胞 ES細胞 iPS細胞
作製法 体中に存在 胚を壊して作製 遺伝子を導入して作製
移植時の拒絶 自己細胞を利用すれ
ば拒絶が起きない
移植の際に免疫拒絶
の可能性がある
自己細胞を利用するの
で拒絶が起きない?
腫瘍化の恐れ 可能性は低い 可能性がある 可能性がある
4
新技術の特徴・従来技術との比較
• 従来からの問題点であった、腫瘍形成の危険がない多能
性細胞を作製することに成功した。
• 従来は生きた乳酸菌を用いたことで限られていたが、乳酸
菌由来リプログラム因子を用いれば、大量に多能性細胞を
作製することが可能となる。
• 本技術の適用により、乳酸菌は無限に増殖させることがで
きるため、コストを大幅に削減できることが期待される。
5 (Science ZERO)
真核細胞誕生のモデル 古細菌 真正細菌(乳酸菌など)
真正細菌の古細菌への感染
共生関係 Endosymbiotic theory (Margulis L., 1970)
遺伝子
真正細菌の遺伝子移動
核
ミトコンドリア
核の出現 DNA の増幅
真核細胞の誕生 20億年前
eubacteria (真正細菌)
archaebacteria (古細菌)
eucaryotes (真核細胞) 35億年前
6
私達のからだの細胞数: 60 兆個 (6 x 1013)
腸における腸内細菌数: 1,000 兆個 (1 x 1015)、1,000種類以上の腸内細菌が棲息.
1857年、パスツール博士が世界で最初に乳酸菌を発見
現在までに、約280 種類 の乳酸菌が同定されている
乳酸菌 [Lactic Acid Bacteria (LAB)]のバックグラウンド
Lactobacillus Lactococcus Streptococcus Enterococcus
Bifidobacterium
7
乳酸菌が細胞に直接作用し、どのような影響を持つかはほとんど
研究されていない 乳酸菌と細胞の研究は価値有り!
ロシアの生物学者イリヤ・メチニコフ(1845-1916年) 「ヨーグルト不老長寿説」 老化とは、腸内細菌の生成する腐敗物質による自家中毒
ヨーグルトに含まれる乳酸菌で腸内環境を改善すれば良い
インフルエンザ、ピロリ菌の撃退、癌、アレルギー、睡眠、ダイエット、etc…
(PNAS 2011)
腸内細菌は現代医療のトップランナー
8
バクテリアが宿主細胞の遺伝子発現を制御する
9
3 cmシャーレ (5 x 105 / 2ml)
0.1% Trypsin 1mM EDTA
乳酸菌 ヒト皮膚細胞 (Cell Applications社)
皮膚細胞用培養液 (Cell Applications社)
乳酸菌による細胞塊形成
(直径: 100 ~ 500 µm ~30 spheres / 5 x 105)
アルカリフォスファターゼ染色
300 µm
10
取り込まれた乳酸菌はヒト皮膚細胞の細胞質に局在する
核 小胞体
細胞間隙 vacuole 細胞膜 caveolar 乳酸菌
ミトコンドリア
16S ribosomal RNA
LAB-incorporated (LAB-in) cells 抗ー細胞壁抗体 DAPI
11
解離
LAB-in cellsは自己増殖を持たない
Dissociation Medium for ES cells Trypsin, 10 mg/ml Collagenase IV, KSR, 1M CaCl2 37℃, 5~20 min
ES細胞やiPS細胞は無限の増殖能を持つ 腫瘍化?
12
LAB-in cellsの多能性マーカー発現
RT-PCR
Quantative-PCR
ICC
LAB-in iPS LAB-in iPS LAB-in iPS
13
シャーレ内における細胞分化誘導– (1)
α-fetoprotein Tuj1
vimentin desmin
100µm
α-fetoprotein: (内胚葉)
Tuj1: (外胚葉)
vimentin: (外胚葉)
desmin: (中胚葉)
浮遊状態
DMEM/F12 containing 1% FCS 5 ng/ml basic FGF
2 週間 2 週間
14
α-SMA: (中胚葉)
Desmin: (中胚葉)
Tuj1: (外胚葉)
GFAP: (外胚葉)
接着状態 (laminin+PLL)
DMEM/F12 containing 1% FCS 5 ng/ml basic FGF
シャーレ内における細胞分化誘導– (2)
2 週間 2 週間
15
軟骨細胞 骨細胞 脂肪細胞
LAB-in cells clusters were cultured for 3 weeks in STEMPRO Adipogenesis,
Chondrogenesis, or Osteogenesis Differentiation Medium (GIBCO).
脂肪細胞: Oil Red O 染色
骨細胞: Alizarin Red 染色
軟骨細胞: Alcian Blue 染色
2 週間 3 週間 cho ost adi
シャーレ内における細胞分化誘導– (3)
16
control
LAB-in cells
(5 x 105 / 20 µl)
免疫不全マウス精巣 解析 3ヶ月後
control LAB-in cells
LAB-in cellsを移植しても腫瘍は形成されない
ES細胞やiPS細胞は腫瘍を形成
17
α-fetoprotein: (内胚葉)
NF: (外胚葉)
α-SMA: (中胚葉)
LAB-in cellsの生体内における細胞分化誘導
LAB-in cellsはin vivo & in vitroにおいて、 三胚葉由来の細胞に分化できる。
18
25,909 遺伝子 Whole Human Genome Microarray 4 x 44K (Agilent)
(A) (B)
多能性に関わる37遺伝子
NANOG x7.6
OCT3/4 x2.9
SOX2 x2.9
KLF4 x1.0
c-Myc x1.7
遺伝子発現プロファイルの比較
ヒト皮膚細胞 &
ヒト皮膚細胞+乳酸菌
125 遺伝子 > 30 倍 156 遺伝子 < 30 倍
ヒト皮膚細胞 &
ヒト皮膚細胞+乳酸菌
4,099 遺伝子 > 2 倍 3,481 遺伝子 < 2 倍
19
LAB-in cellsではHOX遺伝子の発現が劇的に減少する • 156 遺伝子 < 30 倍 • 発生に関わる遺伝子:43 遺伝子 • 21/43 遺伝子が HOX 遺伝子
HOX 遺伝子群 cho.6
cho.11
cho.15
cho.2
乳酸菌を取り込んだ細胞は、位置情報を失い、多能性を獲得する
no ProbeName UniGeneID GeneSymbol GeneName Description Fold change
[Bala-HGF]vs[C-HGF] Regulation
[Bala-HGF]vs[C-HGF]
1 A_24_P124558 HOXC8 Hs.664500 homeobox C8 Homo sapiens homeobox C8 (HOXC8), mRNA [NM_022658]
594.18225 down
2 A_23_P500998 HOXA9 Hs.659350 homeobox A9 Homo sapiens homeobox A9 (HOXA9), mRNA [NM_152739]
592.35516 down
3 A_23_P70968 HOXA7 Hs.660918 homeobox A7 Homo sapiens homeobox A7 (HOXA7), mRNA [NM_006896]
547.446 down
4 A_23_P363316 HOXB5 Hs.654456 homeobox B5 Homo sapiens homeobox B5 (HOXB5), mRNA [NM_002147]
489.89343 down
5 A_23_P66682 HOXB6 Hs.98428 homeobox B6 Homo sapiens homeobox B6 (HOXB6), mRNA [NM_018952]
385.91574 down
6 A_33_P3300965 HOXC6 Hs.549040 homeobox C6 Homo sapiens homeobox C6 (HOXC6), transcript variant 2, mRNA [NM_153693]
247.46118 down
7 A_24_P77904 HOXA10 Hs.110637 homeobox A10 Homo sapiens homeobox A10 (HOXA10), transcript variant 1, mRNA [NM_018951]
212.5776 down
8 A_23_P7313 SPP1 Hs.313 secreted phosphoprotein 1 Homo sapiens secreted phosphoprotein 1 (SPP1), transcript variant 1, mRNA [NM_001040058]
170.12749 down
9 A_23_P374695 TEK Hs.89640 TEK tyrosine kinase, endothelial Homo sapiens TEK tyrosine kinase, endothelial (TEK), mRNA [NM_000459]
168.16338 down
10 A_33_P3264528 HOXA11 Hs.249171 homeobox A11 Homo sapiens homeobox A11 (HOXA11), mRNA [NM_005523]
135.72766 down
11 A_33_P3300975 HOXC4 Hs.549040 homeobox C4 Homo sapiens homeobox C4 (HOXC4), transcript variant 1, mRNA [NM_014620]
131.16129 down
12 A_24_P264943 COMP Hs.1584 cartilage oligomeric matrix protein Homo sapiens cartilage oligomeric matrix protein (COMP), mRNA [NM_000095]
126.96592 down
13 A_23_P25150 HOXC9 Hs.658823 homeobox C9 Homo sapiens homeobox C9 (HOXC9), mRNA [NM_006897]
122.49983 down
14 A_24_P218805 HOXC10 Hs.44276 homeobox C10 Homo sapiens homeobox C10 (HOXC10), mRNA [NM_017409]
116.495 down
15 A_23_P55281 HOXB7 Hs.436181 homeobox B7 Homo sapiens homeobox B7 (HOXB7), mRNA [NM_004502]
98.938225 down
16 A_33_P3421243 AFP Hs.518808 alpha-fetoprotein Homo sapiens alpha-fetoprotein (AFP), mRNA [NM_001134]
91.343994 down
17 A_23_P370588 HOXB8 Hs.514292 homeobox B8 Homo sapiens homeobox B8 (HOXB8), mRNA [NM_024016]
76.56639 down
18 A_23_P65757 CCNB2 Hs.194698 cyclin B2 Homo sapiens cyclin B2 (CCNB2), mRNA [NM_004701]
71.749176 down
19 A_33_P3288159 ASPM Hs.121028 asp (abnormal spindle) homolog, microcephaly associated (Drosophila)
Homo sapiens asp (abnormal spindle) homolog, microcephaly associated (Drosophila) (ASPM), mRNA [NM_018136]
71.65447 down
20 A_23_P215634 IGFBP3 Hs.450230 insulin-like growth factor binding protein 3 Homo sapiens insulin-like growth factor binding protein 3 (IGFBP3), transcript variant 1, mRNA [NM_001013398]
67.36516 down
21 A_23_P316511 HOXB3 Hs.654560 homeobox B3 Homo sapiens homeobox B3 (HOXB3), mRNA [NM_002146]
65.995636 down
22 A_23_P52017 ASPM Hs.121028 asp (abnormal spindle) homolog, microcephaly associated (Drosophila)
Homo sapiens asp (abnormal spindle) homolog, microcephaly associated (Drosophila) (ASPM), mRNA [NM_018136]
65.810745 down
23 A_33_P3271273 HOXB2 Hs.514289 homeobox B2 Homo sapiens homeobox B2 (HOXB2), mRNA [NM_002145]
60.374454 down
24 A_33_P3377529 HOXA4 Hs.533357 homeobox A4 Homo sapiens homeobox A4 (HOXA4), mRNA [NM_002141]
57.784496 down
25 A_23_P212844 TACC3 Hs.104019 transforming, acidic coiled-coil containing protein 3
Homo sapiens transforming, acidic coiled-coil containing protein 3 (TACC3), mRNA [NM_006342]
53.95437 down
26 A_23_P210176 ITGA6 Hs.133397 integrin, alpha 6 Homo sapiens integrin, alpha 6 (ITGA6), transcript variant 2, mRNA [NM_000210]
53.341675 down
27 A_23_P423237 SGCG Hs.37167 sarcoglycan, gamma (35kDa dystrophin-associated glycoprotein)
Homo sapiens sarcoglycan, gamma (35kDa dystrophin-associated glycoprotein) (SGCG), mRNA [NM_000231]
50.23103 down
28 A_23_P24129 DKK1 Hs.40499 dickkopf homolog 1 (Xenopus laevis) Homo sapiens dickkopf homolog 1 (Xenopus laevis) (DKK1), mRNA [NM_012242]
49.39177 down
29 A_23_P163567 SMPD3 Hs.368421 sphingomyelin phosphodiesterase 3, neutral membrane (neutral sphingomyelinase II)
Homo sapiens sphingomyelin phosphodiesterase 3, neutral membrane (neutral sphingomyelinase II) (SMPD3), mRNA [NM_018667]
49.283035 down
30 A_24_P416370 HOXB4 Hs.664706 homeobox B4 Homo sapiens homeobox B4 (HOXB4), mRNA [NM_024015]
48.990253 down
31 A_33_P3330149 PAX6 Hs.270303 paired box 6 Homo sapiens paired box 6 (PAX6), transcript variant 1, mRNA [NM_000280]
46.525337 down
32 A_24_P30557 TBX5 Hs.381715 T-box 5 Homo sapiens T-box 5 (TBX5), transcript variant 1, mRNA [NM_000192]
45.041744 down
33 A_23_P146274 STMN2 Hs.521651 stathmin-like 2 Homo sapiens stathmin-like 2 (STMN2), mRNA [NM_007029]
43.262432 down
34 A_23_P122197 CCNB1 Hs.23960 cyclin B1 Homo sapiens cyclin B1 (CCNB1), mRNA [NM_031966]
42.742027 down
35 A_23_P100127 CASC5 Hs.181855 cancer susceptibility candidate 5 Homo sapiens cancer susceptibility candidate 5 (CASC5), transcript variant 1, mRNA [NM_170589]
42.700485 down
36 A_23_P373521 HAND2 Hs.388245 heart and neural crest derivatives expressed 2
Homo sapiens heart and neural crest derivatives expressed 2 (HAND2), mRNA [NM_021973]
41.600903 down
37 A_23_P167159 SCRG1 Hs.7122 stimulator of chondrogenesis 1 Homo sapiens stimulator of chondrogenesis 1 (SCRG1), mRNA [NM_007281]
39.337242 down
38 A_23_P215454 ELN Hs.647061 elastin Homo sapiens elastin (ELN), transcript variant 1, mRNA [NM_000501]
37.867306 down
39 A_23_P157136 SCIN Hs.655515 scinderin Homo sapiens scinderin (SCIN), transcript variant 2, mRNA [NM_033128]
35.781925 down
40 A_23_P58321 CCNA2 Hs.58974 cyclin A2 Homo sapiens cyclin A2 (CCNA2), mRNA [NM_001237]
33.80436 down
41 A_23_P501538 HOXA3 Hs.659337 homeobox A3 Homo sapiens homeobox A3 (HOXA3), transcript variant 2, mRNA [NM_153631]
33.353687 down
42 A_23_P107283 HOXB2 Hs.514289 homeobox B2 Homo sapiens homeobox B2 (HOXB2), mRNA [NM_002145]
31.19959 down
43 A_23_P96158 KRT17 Hs.2785 keratin 17 Homo sapiens keratin 17 (KRT17), mRNA [NM_000422]
30.959732 down
HOXC8 : 594 倍
HOXB2 : 31 倍
1
43
20
ほんまか? ほんまや!
(Cell, 152, 51-67, 2013)
Trypsin EDTA
乳酸菌 ヒト皮膚細胞
外胚葉
中胚葉
内胚葉
(Ohta et al., PLoS ONE 2012)
21
500 µm
乳酸菌由来リプログラム因子による細胞塊形成
(5 x 105 / 2ml)
0.1% Trypsin 1mM EDTA
ヒト皮膚細胞
皮膚細胞用培養液
乳酸菌由来 リプログラム因子 ?
22
脂肪細胞 骨細胞 軟骨細胞
(A)
(B) (C) (D)
乳酸菌由来因子によるヒト皮膚細胞のリプログラミング
23
A549細胞 A549細胞 +
乳酸菌成分 2週間
肺がん細胞 A549
Trypsin EDTA
乳酸菌由来 リプログラム因子
乳酸菌由来因子による肺がん細胞のリプログラミング−1
Oct
3/4
Oct
3/4
Sox
2
Sox
2
β-ac
tin
β-ac
tin
Nan
og
Nan
og
A549細胞 A549細胞 + 乳酸菌成分 G
DF-
3 R
ex1
EC
AT
FGF4
p1
5 p1
6 A
RF
GD
F-3
Rex
1 E
CAT
FG
F4
p15
p16
AR
F
24
A549細胞 A549細胞 +
乳酸菌成分 2週間 Trypsin
EDTA
肺がん細胞 A549
乳酸菌由来 リプログラム因子
乳酸菌由来因子による肺がん細胞のリプログラミング−2
骨細胞 脂肪細胞
25
DAPI merge α-fetoprotein
DAPI merge Neurofilament
乳酸菌由来因子による肺がん細胞のリプログラミング−3
Trypsin EDTA
肺がん細胞 A549
乳酸菌由来 リプログラム因子
接着状態 (laminin+PLL)
DMEM/F12 containing 1% FCS bFGF (5 ng/ml )
26
2週間 Trypsin EDTA
肝がん細胞 HepG2
乳酸菌由来 リプログラム因子
乳酸菌由来因子による肝がん細胞のリプログラミング
HepG2細胞 HepG2細胞 + 乳酸菌成分
脂肪細胞 骨細胞
27
2週間 Trypsin EDTA
乳がん細胞 MCF7
乳酸菌由来 リプログラム因子
乳酸菌由来因子による乳がん細胞のリプログラミング
MCF7細胞 MCF7細胞 + 乳酸菌成分
脂肪細胞 骨細胞
28
想定される用途
• 本技術の特徴を、癌化しない多能性細胞の作製に適用できる。
• 乳酸菌由来リプログラム因子を癌細胞に作用することにより、細胞増殖が抑えられることから、安全・安心な抗がん剤の開発に展開することも可能と思われる。
29
実用化に向けた課題 • 乳酸菌由来リプログラム因子の同定について、HPLCによるピークが同定できたが、個々の分子同定が未解決。
細胞塊形成活性
30
企業への期待 • 未解決の乳酸菌由来リプログラム因子の同定については、マススペクトロ解析の技術により克服できると考えている。
• 抗がん剤として、動物試験による評価(毒性試験・有効性)の技術を持つ、企業との共同研究を希望。
• また、癌制御因子の探索を考えている企業には、本乳酸菌由来リプログラム因子の導入が有効と思われる。
31
本技術に関する知的財産権
32
産学連携の経歴
2013年7月現在、民間3社と共同研究に向けて、
研究内容等を検討中。