Gene  expression  and  cell  decisions  Alfonso  Martinez  Arias  Department  of  Genetics  University  of  Cambridge  Email:  ama11@hermes.cam.ac.uk      Lecture1  The  lac  Operon:  essential  features  of  a  genetic  regulatory  circuit  for  an  inductive  system.    Lecture  2  Lambda:  a  genetic  switch,  the  circuitry  of  a  decision  and  the  programme  it  regulates    Lecture  3  Gene  expression  in  eukaryotes:  s.  cerevisiae  Gal4  as  a  guide  for  universal  principles  of    transcriptional  regulation    References  The  topics  that  we  shall  cover  in  these  lectures  are  classic  topics  of  molecular  biology  and  basically  any  text  book  on  Genetics  will  tell  you  a  version  of  each  of  them.  In  addition,  today  you  can  find  much  in  the  web  -­‐often  the  issue  is  more  a  matter  of  knowing  how  to  search  what  you  want  to  know  rather  than  having  a  fixed  source  for  it-­‐  so  you  should  roam  and  look.  Notwithstanding  this,  there  are  two  books  which  you  will  find  helpful  and  which  will  give  you  a  broad  perspective  on  the  subjects:    Ptashne,  M.  (2004)  A  genetic  switch.  3rd  edition.  Blackwell.  (in  particular  chapters  1-­‐4).  Ptashne,  M.  and  Gann,  A.    (2002)  Genes  and  signals  Cold  Spring  Harbor  Press  (particularly  chapters  1  and  2).    Your  libraries  will  have  them.    Also  here  you  have  a  small  number  of  additional  references  which  will  help  you  broaden  the  material  of  the  lectures.  A  few  other  helpful,  but  by  no  means  compulsory  reading:      

• Dodd,  B.,  Shearwin,  K.  and  Egan,  JB.  (2005)  Revisited  gene  regulation  in  bacteriophage  lambda.  Curr  Op  in  Genetics  and  Development15,  145-­‐152  (a  bit  dense  but  once  you  have  the  hang  of  λ it  will  be  interesting)  

• Driever,  W.,  Ma,  J.,  Nusslein  Volhard,  C.  and  Ptashne,  M.  (1989)  Rescue  of  bicoid  mutant  Drosophila  embryos  by  Bicoid  fusion  proteins  containing  heterologous  activating  sequences.  Nature  342,  149-­‐152  (this  is  an  important  set  of  experiments,  though  the  paper  has  more  information  than  you  need.  Still,  it  is  the  reference),  

• Hahn,  S.  and  Young,  E.  (2011)  Transcriptional  regulation  in  S.  cerevisiae:  transcription  factor  regulation  and  function,  mechanisms  of  initiation  and  roles  of  activators  and  coactivators.  In  Yeastbook.  Genetics  189,  705-­‐736  (some  of  its  sections  useful  but  more  a  resource  than  a  central  reference;  it  is  clear  though)  

• Murray,  N.  and  Gann,  A.  What  has  phage  lambda  ever  done  for  us?  Curr  Biol.  17,  R305-­‐R312.  

1

• Oehler,  S.  and  Muller-­‐Hill,  B.  (2010)  High  local  concentration,  a  fundamental  strategy  of  life.  J.  Mol  Biol  395,  242-­‐253  (an  interesting  read  about  some  fundamental  principles  of  chemistry  applied  to  the  Lac  operon  which  will  give  you  some  references  for  the  lectures.  The  good  thing  is  that  his  is  about  principles)  

• Ptashne,  M.  (2011)  Principles  of  a  switch.  Nature  Chem.  Biol.  7,  484-­‐487  (like  all  Ptashne’s,  variation  on  his  favourite  themes  but  also,  as  all  Ptashne’s,  VERY  CLEAR)  

• Ptashne,  M.  (2005)  Regulation  of  transcription.  From  Lambda  to  eukaryotes.  Trends  in  Biochem.  Sci.  30,  275-­‐278.  (as  above)  

• Small,  S.,  Blair,  A.  and  Levine,  M.  (1992)  Regulation  of  even-­‐skipped  stripe  2  in  the  Drosophila  embryo.  EMBO  J  11,  4047-­‐4057  (this  is  a  classic  and  worth  a  read).  

• Traven,  A.,  Jelicic,  B.  and  Sopta,  M.  (2006)Yeast  Gal4  a  transcriptional  paradigm  revisited.  EMBO  Reports.  7,  496-­‐499    (a  useful  account  of  Gal4  activity;  a  bit  more  than  you  need  to  but  the  first  half  certainly  useful)  

   Lecture1  The  lac  Operon:  essential  features  of  a  genetic  regulatory  circuit  for  an  inductive  system    One  of  the  interesting  issues  in  Biology  is  the  diversity  of  organisms  and,  within  each  organism,  the  diversity  of  cells  that  make  them  up.  As  we  know,  the  differences  between  cells  are  due  to  their  constituents  (a  skin  cell  is  different  from  a  muscle  cell  because  of  the  way  they  are  built  which,  in  some  sense,  is  fit  for  purpose),  but  the  question  becomes  how  are  these  differences  achieved?  The  issue  can  be  addressed  through  a  small  number  of  related  questions:    

1. What  is  the  molecular  basis  for  these  differences?  2. How  can  we  found  about  it?  3. How  many  ways  are  there  to  be  different?  

 If  you  did  not  know  anything  about  the  mechanisms  that  underlie  the  working  of  living  systems,  but  knew  about  their  constituent  elements,  and  had  to  take  a  guess  about  where  the  molecular  basis  for  those  differences  lie  (we  are  reductionistic),  we  would  point  the  finger  to  the  DNA.  After  all,  if  in  these  days  of  massive  DNA  sequencing  you  looked  at  the  sequence  of  different  organisms,  you  would  find  that  they  are  different  and,  on  the  other  hand,  organisms  that  look  similar  have  similar  DNA,  and  in  the  case  of  twins,  identical.  However,  this  is  not  the  explanation  because  within  an  organism  there  are  many  different  kinds  of  cells  and  the  DNA  in  these  cells  is  the  same.  DNA  is  the  template  for  RNA  and  if  we  use  another  very  useful  technique  that  is  popular  these  days  and  which  allows  us  to  look  at  gene  expression  (sequencing  to  mRNA  populations  through  microarray  analysis  or  related  techniques)  we  would  find  that  different  cells,  express  different  bits  of  DNA  or,  what  is  the  same,  cell  types  are  associated  with  different  parts  of  the  genome.  Thus,  we  could  infer  that  the  differences  between  cells  arise  because  different  cells  express  different  genes  and  that  this  has  something  to  do  with  the  differences  we  observe  between  organisms.  This  conclusion  is  underpinned  by  some  interesting  experiments  which,  in  an  important  manner,  preceded,  these  technologies.    In  the  1960s  the  question  of  how  cells  become  different  during  development  hovered  over  Biology.  When  the  structure  of  DNA  was  found,  a  sensible  explanation  would  have  been  that,  as  we  have  mentioned,  different  cells  would  have  different  DNA,  that  somehow  DNA  

2

would  be  lost  in  cell  specific  manner.  Not  as  far  fetched  as  it  sounds  but  it  needed  testing  (Biology  is  not  just  a  collection  of  facts  but  of  questions  that  an  be  answered  experimentally)  and  John  Gurdon  did  the  experiment.  Maybe  differentiated  cells  had  lost  DNA  they  did  not  need.  If  this  were  the  case,  the  nucleus  from  a  differentiated  cell  could  not  support  the  development  of  a  whole  organism.    The  test:  take  the  nucleus  of  a  differentiated  cell,  place  it  in  an  enucleated  oocyte  and  see  what  happens  when  you  activate  development.  These  experiments  was  done  in  frogs  and  they  succeeded  with  different  types  of  cells,  thus  making  the  point  that  the  DNA  of  an  organism  is  maintained  intact  during  development  and  that  therefore,  the  differences  between  cells  must  be  due  to  differential  expression  of  the  DNA.      Conclusion:  understanding  how  different  bits  of  DNA  come  to  be  expressed  in  different  cells  is  central  to  understanding  how  cells  become  different  and  therefore  how  organisms  are  put  together.      How  do  we  find  out:  Genetics  and  Biochemistry  Whatever  way  cells  use  to  choose  which  bit  of  DNA  to  transcribe,  it  is  likely  to  involve  a  mechanism  that  is  reliable  and  reproducible.  This  mechanism  and  its  variations  is  the  core  of  these  lectures.  But  before  we  get  into  the  real  subject  matter,  one  issue  of  method.  You  probably  have  seen  all  this  before,  but  there  is  no  harm  in  bringing  it  up  again,  perhaps  from  a  different  perspective:  understanding  biological  processes  always  requires  a  combination  of  Genetics  and  Biochemistry  and  if  one  can  work  with  both  at  the  same  time,  much  the  better.      Genetics  is  much  more  than  a  narrative  about  genes.  Genetics  is  a  language  that  allows  us  to  formulate  questions  in  precise  manners,  it  has  a  set  of  rules  that  allows  us  to  explore  those  questions  and  get  an  answer.  In  many  ways  genetics  is  to  Biology  what  Maths  is  to  Physics.  Unfortunately  Genetics  alone  is  not  enough,  and  Biochemistry,  the  chemical  analysis  of  the  processes  revealed  by  Genetics,  is  what  brings  the  mechanistic  element  into  the  picture.  Genetics  gives  you  function,  Biochemistry  gives  you  mechanism.  The  combination  is  powerful.    Let  us  see  this  with  an  abstract  example.  Suppose  we  need  to  figure  out  a  situation  in  which  a  cell  divides  and  one  of  the  daughters  changes  its  state  from  A  to  B  i.e.  we  go  from  A  to  A  and  B.  A  way  to  analyze  this  process  is  to  look  for  mutants  in  which  this  process  goes  awry.  For  example  in  which  A  does  not  divide  (this  does  not  teach  us  very  much),  or  in  which  A  gives  rise  to  two  A  cells  or  to  two  B  cells,  this  is  more  informative.  Once  we  have  these  mutations,  we  can  organize  them  into  complementation  groups  –which  will  tell  us  if  they  map  to  one  gene  or  more  than  one  gene-­‐  and  analyze  if  they  are  dominant  or  recessive.  Then,  if  we  have  them  into  more  than  one  group,  we  can  use  epistasis  analysis  to  explore  the  way  these  are  organized  (remember  your  basic  genetics  courses)    And  in  the  terms  of  the  processes  that  you  have  been  seeing,  imagine  that  you  have  a  protein  that  binds  DNA  and,  somehow,  it  does  something  to  transcription/gene  expression.  Genetics  allows  you  to  unravel  “the  function  of  the  gene”.  If  you  mutate  the  protein  or  the  DNA,  the  outcome  is  telling:      No  expression  in  the  mutant  means  that  Protein  +  DNA  promotes  gene  expression.  

3

Expression  in  the  mutant  means  that  Protein  +  DNA  promotes  repression  of  gene  expression.    Now,  in  order  to  understand  Genetics  let  us  get  a  glossary  of  terms  beginning  with  mutant  (✸)  classes  in  a  diploid  organism,  and  how  to  interpret  them:    If:      ✸/✸    <      +/+ (meaning  that  the  functiom  of  ✸  is  less  than  the  wild  type  (+))    is  a  loss  of  function  mutant. If:      ✸/✸ > +/+ this  is  a  gain  of  function  mutant. If:      ✸/+ ≠ +/+ this  is  a  dominant  mutation If:      ✸/✸ < ✸/+ = +/+ this  is  a  recessive  mutation    Now,  if  a  mutation  acts  only  on  the  chromosome  on  which  it  resides,  it  is  said  to  act  ‘in  cis’,  whereas  if  it  can  act  on  a  different  chromosome,  it  is  said  to  act  ‘in  trans’.  There  are  also  mutations  which  only  exhibit  a  phenotype  at  a  particular  temperature,  these  are  said  to  be  temperature  sensitive  mutations  and  are  an  example  of  a  conditional  mutation  (we  shall  see  examples  of  how  these  are  used  in  the  lecture  on  lambda).  Genetics  is  the  best  way  to  begin  to  tease  apart  biological  systems  but  then  one  needs  the  Biochemistry  to  interpret  the  mechanisms  suggested  by  the  Genetics.      Now  let  us  get  into  the  main  topic:  the  molecular  mechanisms  that  allow  cells  to  decide  which  genes  to  express  and  when.  It  should  not  be  a  surprise  to  you  that  these  decisions  are  not  restricted  to  eukaryotes  and  that  bacteria  and  viruses  also  have  to  wrestle  with  them.  It  is  very  interesting  and  exciting  to  think  about  how  a  cell  decides  to  be  leg  or  arm,  or  nose  or  ear,  but  perhaps  learning  about  simpler  decisions,  which  in  the  abstract,  are  similar,  we  can  learn  something.  Also,  it  is  important  to  be  reductionistic  and  the  notion  of  a  decision  can  be  generalized.  Furthermore,  analyzing  these  processes  in  prokaryotes  provides  insights  which,  as  we  shall  see,  guide  our  understanding  of  the  processes  in  eukaryotes.      The  lac  Operon  In  the  1940s,  as  he  was  fighting  in  the  French  Resistance,  J  Monod  was  investigating  the  biology  of  E  coli  growth,  trying  to  figure  out  the  simple  observation  that  when  presented  

with  two  sources  of  carbon,  Glucose  and  Lactose,  E  coli  would  metabolize  Glucose  first  and  then,  after  a  lag,  move  on  to  use  Lactose.  Genetics  is  abstract  and  has  symbols  and  here  I  just  want  us  to  focus  on  the  essentials  and  want  you  to  realize,  because  this  will  serve  you  in  the  rest  of  your  lives  as  biologists,  that  understanding  how  to  use  genetic  reasoning,  will  save  you  a  lot  of  time  and  give  you  a  lot  of  insights  when  trying  to  understand  a  process.    J.  Monod  and  his  colleague  F.  Jacob,  began  to  isolate  

mutations  that  would  affect  the  growth  characteristics  of  E.  coli  in  these  carbon  sources.  From  the  analysis  of  these  mutations  they  develop  a  model  which  Biochemistry  proved  to  be  right  and  which  serves  as  a  basis  for  the  way  we  think  about  gene  regulation.  You  will  see  as  we  develop  it,  echoes  from  Steve  Jackson’s  lectures,  but  you  will  also  see  that  we  begin  to  build  the  foundations  for  the  operation  of  a  regulatory  system.    E.  coli  can  use  glucose  or  lactose  as  a  source  of  carbon  and  energy.  As  lactose  is  a  disaccharide  and  needs  to  be  hydrolyzed,  E.  coli  prefers  to  use  glucose.  The  enzyme  that  

4

deals  with  Lactose  is  ß-­‐galactosidase.  So,  how  does  E.  coli  make  the  choice?  What  regulates  the  use  of  lactose?  How  is  it  kept  off  while  there  is  glucose  around?  How  is  it  turned  on?    Jacob  and  Monod  focused  on  mutations  that  would  allow  or  forbid  the  cells  to  grow  on  lactose,  the  second  carbon  source.  Lactose  requires  an  enzyme:  ß-­‐galactosidase  which  is  encoded  in  the  lac  Operon  (a  set  of  genes  in  a  chain  that  is  required  to  deal  with  lactose)  and  using  simple  assays  for  ß-­‐galactosidase  one  can  look  for  mutants  that  either  cannot  make  ß-­‐galactosidase  when  they  should  or  that  make  ß-­‐galactosidase  when  they  should  not.  These  mutants  provide  insights  into  the  molecular  mechanisms  that  allow  E.  coli.    Lac  genetics                      Genetic  analysis  of  these  mutants  (complementation,  dominance,  cis/trans)  led  Monod  and  Jacob  to  an  interesting  set  of  hypotheses:  

   

(i) that  the  ability  to  grow  (or  not)  on  lactose  was  associated  with  changes  in  gene  expression  (this  is  important  because  people,  at  the  time,  could  only  think  in  terms  of  proteins  and  considered  that  when  changing  from  glucose  to  lactose,  the  cell  simply  changed  the  proteins  it  used  rather  than  the  proteins  it  made)  

(ii) most  mutations  identified  genes  encoding  enzymes  for  lactose  metabolism  (ß-­‐galactosidase  (Z),  

its  permease  (Y)  and  a  transacetylase  (A))    (iii) some  mutations  identified  genes  encoding  proteins  that  regulate  whether  and  

when  cells  made  ß-­‐galacosidase  (I).  (iv) Some  mutations  could  only  be  interpreted  as  regulating  or  controlling  the  ability  

of  a  cell  to  make  ß-­‐galactosidase  (O,  P).    Let  us  look  at  these  mutations  in  turn:    Mutations  in  Z,  Y  and  A  showed  some  characteristics  which  led  to  the  notion  that  the  genes  for  Z,  Y  and  A  were  organized  in  a  line,  an  Operon.  They  are  transcribed  as  part  of  the  same  and  unique  mRNA  and  translated  in  series.  Operons  are  very  common  in  prokaryotes  and  less  so  un  eukaryotes.  All  mutations    (Z,  Y,  A)  are  recessive  and  cis  i.e.    in  diploid  (which  in  E.  coli  are  made  ingeniously  with  special  factor,  F  factors  -­‐see  D.  Summers  lectures-­‐,  or  

 

5

nowadays  plasmids;  Z+/Z-­‐  makes  ß-­‐galactosidase.  Although  some  mutations  in  Z  also  affect  Y  and  A  (and  mutations  in  Y,  affect  A),  in  general  mutations  in  any  of  the  three  genes  (complementation  groups)  only  affect  that  gene;  they  identify  standard  genes.    Mutations  in  I  are  a  bit  more  interesting  because,  although  they  do  not  map  near  ZYA  they  affect  their  expression:  ZYA  are  intact  and  yet  a  mutation  in  I  leads  to  either  expression  of  the  three  or  expression  of  none.  The  i  mutations  that  lead  to  expression  of  ß-­‐galactosidase  are  recessive  and  trans  acting  i.e.  i+/i-­‐  is  wildtype  and  has  a  normal  regulation.  The  i  mutations  that  repress  expression  of  ZYA  are  dominant  and  trans  acting.      

   A  third  class  of  mutations  is  the  most  interesting  one  and  it  is  a  tribute  to  Jacob  and  Monod  that  they  figured  out  how  they  work  and  what  they  tell  us  about  genes  before  they  knew  about  their  molecular  basis.  Whereas  I,  Z,  Y  and  A  code  for  proteins  a  set  of  mutations  called  O,  affect  the  activity  of  I  and  the  expression  of  ZYA  but  there  is  no  protein  associated  with  them.  Furthermore,  these  mutations  seem  to  act  in  cis.  As  it  turns  out  O  identifies  a  region  in  the  DNA  to  which  I  binds  and  determines  whether  ZYA  are  expressed.  There  are  two  main  kinds  of  O  mutants:  

• Oc  (c  for  constitutive):  these  mutants  lead  to  the  expression  of  ZYA,  even  in  the  absence  of  lactose.  The  mutations  are  dominant  and  cis  acting  i.e.  oc  z+/  o+  z-­‐  leads  to  constitutive  expression  of  ß-­‐galactosidase  whereas  oc  z-­‐/  o+  z+  leads  to  regulated  expression.    

• Os  (s  for  superrepressor):  in  these  mutants,  there  is  no  expression  of  ZYA.  Using  the  same  tests,  they  are  cis  acting  and  dominant.  

 

   

6

P  turns  out  to  be  the  site  of  binding  and  initual  activity  of  RNA  polymerase.  Notice  the  relative  location  of  P  and  O  i.e.  O  can  block  the  activity  of  RNA  pol.    The  Molecular  Biology  (biochemistry)  Biochemistry  allows  an  interpretation  of  the  genetic  experiments.  ZYA  encode  the  structural  genes,  enzymes.  I  encodes  a  protein  that  acts  as  a  repressor  for  the  expression  of  ZYA.  It  binds  to  O,  which  is  a  site  in  the  DNA  that  overlaps  the  promoter  (P)  which  is  the  RNA  polymerase  binding  site;  when  I  is  bound,  it  does  not  allow  the  polymerase  to  initiate  the  expression  of  ZYA.    The  function  of  I  is  to  block  the  progress  of  RNA  polymerase  and  thus  inhibit  gene  expression.  An  Oc  mutant  results  in  constitutive  ZYA  expression,  because  it  cannot  bind  the  repressor.  In  Os  the  repressor  binds  so  tightly  that  it  never  induces.  In  Is the  repressor  binds  and  can  never  be  released.      The  interactions  between  the  proteins  and  the  DNA  rely,  as  you  know,  on  precise  structural  details  and  the  binding  of  the  repressor  I  to  O  depends  on  whether  or  not  allolactose,  a  derivative  of  lactose,  is  present  or  not.  In  the  absence  of  allolactose,  I  binds  and  represses  expression  but  when  there  is  lactose  around,  allolactose  is  formed,  binds  I  and  induces  a  structural  change  that  precludes  its  binding  to  DNA  and  thus  allows  polymerase  to  transcribe  the  ZYA  (lac)  operon.    The  choice:  glucose  or  lactose?  OK,  we  understand  how  the  system  functions  when  there  is  lactose,  and  we  can  explain  how  the  cell  is  not  going  to  waste  energy  transcribing  ß-­‐galactosidase  when  there  is  no  lactose  around  but,  how  does  it  make  the  choice  when  it  is  presented  with  a  mixture  of  glucose  and  lactose?  how  does  it  ‘know’  how  to  use  glucose  first?  Here,  again,  Genetics  comes  to  the  rescue  because,  in  addition  to  the  mutants  in  I,  O,  Z,  Y  and  A,  there  is  another  class  of  mutations:      if  we  look  at  the  mutations  that  alter  the  expression  of  ß-­‐galactosidase,  we  find  another  set  of  mutants  which  affect  the  expression  even  in  the  presence  of  Lactose  and  which  do  not  

map  to  any  of  the  genes  we  know  about.  They  map  to  a  gene  encoding  CAP  (Catabolite  Activating  Protein).  If  this  protein  is  mutated,  expression  of  ZYA  is  low  in  the  presence  of  lactose,  even  if  I  is  mutated.  CAP  binds  cAMP,  the  amounts  of  which  are  regulated  by  glucose  metabolism,  and  understanding  its  function  provides  an  explanation  for  the  switch  between  glucose  and  lactose  when  both  are  present.  CAP  binds  near  P  and  helps  RNApolymerase  to  transcribe  ZYA,  but  it  does  so  only  in  the  presence  of  cAMP.  As  cAMP  is  suppressed  by  glucose,  the  activity  of  CAP  goes  down  and  this  explains  why  expression  of  lacZYA  is  inefficient  or  absent  in  the  presence  of  glucose.  When  glucose  is  low,  cAMP  rises,  binds  to  CAP  enhancing  its  ability  to  form  dimers,  bind  DNA,  and  increase  the  rate  of  transcription  of  the  ZYA.    

 

 

7

Now  we  can  understand  what  happens  at  the  molecular  level  in  the  different  conditions  that  set  the  problem  in  the  first  place  (try  for  yourself  to  write  down  the  molecular  state  of  the  system  when  there  is  glucose  only,  lactose  only  or  both).  Write  a  table  with  the  different  genes,  the  activities  in  the  different  carbon  sources;  you  can  also  play  with  mutants.    Some  (important)  molecular  details  The  study  of  the  Lac  Operon  provides  some  insights  into  fundamental  aspects  of  the  molecular  basis  of  transcriptional  regulation  and  the  way  it  is  used  by  cells  to  make  decisions  about  their  physiology  or  their  fate.      Specificity  of  transcriptional  regulation:  recognition  helix  of  the  repressor  (there  is  just  one  α−helix  in  the  protein)  can  interact  with  about  5bp  of  DNA,  but  this  is  not  enough  recognition  to  make  the  sequence  unique  –and  therefore  allow  a  unique  code  for  regulation-­‐  nor  to  make  the  binding  strong  in  molecular  terms  –do  not  forget  that  we  are  looking  at  a  chemical  system  in  which  the  interaction  between  a  protein  and  DNA  is  dynamic-­‐  .    The  E  coli  genome  is  about  5  x  106  bps.  If  one  wants  to  have  a  unique  sequence  (so  that  unequivocal  specificity  is  achieved)    one  needs,  at  least,  11bp  (411  which  is  the  probability  that  would  make  the  sequence  unique,  is  4.2x106,  the  genome),  so  rather  than  changing  the  structure  of  the  protein  in  an  implausible  manner  –given  the  structure  of  the  DNA  an  interaction  surface  with  more  than  5bp  might  be  complicated-­‐,  what  evolution  seems  to  have  achieved  is  to  create  a  duplication  of  the  site  i.e.  the  the  repressor  binds  as  a  dimer.  As  we  shall  see  this  might  be  a  general  principle:  palindromic  sequence  or  direct  repeats.      Cooperativity:  when  trying  to  establish  a  state,  one  wants  to  create  conditionality  i.e.  for  the  Lac  Operon  to  operate  optimally  you  do  not  want  it  to  use  too  many  repressor  molecules,  because  then  it  might  not  be  possible  to  counteract  their  effect,  nor  too  few,  because  then  they  could  never  repress.  The  Lac  Operon  is  a  biochemical  system,  which  means  that  the  repressor  is  binding  and  unbinding  all  the  time  and  that  it  still  works  i.e.  it  represses.  Thus,  given  the  Kd  of  the  interaction  between  the  repressor  and  the  DNA,  the  repression  will  be  determined,  in  principle,  by  the  number  of  molecules  of  I.  It  so  happens  that  on  the  average  there  are  five  (5!)  molecules  of  the  repressor  per  cell,  which  is  about  2  dimers.  It  is  here  where  the  effect  of  the  dimer  becomes  important:  when  one  molecule  binds,  it  can  unbind  easily  but  when  another  molecule  binds  in  the  nearby  site,  the  two  hold  each  other  longer  in  place,  this  is  called  cooperativity  and  highlights  the  significance  of  the  dimer  and  the  palindromic  site:  it  serves  to  increase  the  stability  of  the  interaction  between  the  repressor  and  the  DNA.  The  advantages  of  cooperative  binding  and  ‘regulated  recruitment”  are  obvious  because  it  helps  using  less  

molecules  for  a  regulatory  event  and  therefore  contributes  to  the  specificity  of  the  event  and  the  sensitivity  of  the  system.  Interestingly,  in  addition  to  the  original  Operator,  there  are  two  additional  Operators,  with  lower  affinity  for  the  repressor,  located  on  either  side  of  O  (O1),  O2  and  O3.  The  repressor  binds  to  these  sites  too  and,  as  they  are  far  from  the  original  O,  they  are  held  in  place  through  DNA  looping  and  tetramers  of  I.  These  sequences  play  a  role  in  the  repression  because  they  increase  cooperativity  

8

and,  with  the  looping,  fix  the  DNA  and  the  repression.  The  repressor  tends  to  form  tetramers  in  vitro.  Thus,  if    there  are  5  molecules  of  the  repressor  per  cell,  if  the  tetramer  is  the  working  unit  of  the  lac  operon,  this  means  that  there  is  about  one  functional  molecule  of  repressor  per  cell.  There  are  consequences  of  this.    Regulated  recruitment:  Another  feature  of  interactions  between  proteins  that  regulate  transcription  and  DNA  is  a  by  product  of  cooperativity  is  what  we  can  call  “regulated  recruitment”  and  is  exemplified  by  the  effects  of  CAP.  The  interaction  of  CAP  with  RNA  polymerase  enhances  the  affinity  of  polymerase  for  the  DNA  and  increases  its  function  i.e.  it  is  cooperative  but  between  two  proteins  and,  in  some  manner,  CAP  promotes  the  recruitment  of  RNA  polymerase  to  the  site  of  transcription  initiation.  The  interaction  is  mediated  by  a  specific  sequence  in  CAP.    Two  small  matters  at  the  end:  the  molecular  basis  of  physiological  memory  And  how  does  it  all  start?  Lactose  needs  the  Permease  to  get  into  the  cell  and  the  permease  is  encoded  by  the  Y  gene  which,  in  the  absence  of  Lactose  is,  like  the  rest  of  the  Operon,  repressed  by  I.  How  does  the  Lac  Operon  then  get  derepressed  in  the  first  place?  The  idea  is  to  remember  chemistry  and  that  there  is  about  one  molecule  of  functional  repressor  per  cell  i.e.  as  the  repressor  binds  and  unbinds,  with  just  one  molecule  per  cell,  when  it  is  off  nothing  can  take  its  place  and  this  will  lead  to  a  small  leakage  of  gene  expression  and  that  will  allow  a  few  molecules  of  the  permease  to  be  made  and  thereby  bring  in  some  Lactose  which  will  become  important  when  the  glucose  is  off  and  the  CAP  dimer  boosts  the  expression  of  ZYA.  The  system  is  poised  or  primed  for  activity.  This  is  important  because  in  the  presence  of  both  glucose  and  lactose,  there  is  lactose  (!)  and  therefore  there  is  every  chance  for  the  Lac  Operon  to  leak  and  it  probably  does.      Memory,  feedbacks  and  circuits  One  interesting  observation  about  the  Lac  operon  arises  when  intermediate  levels  of  inducer  are  applied  to  the  system.  Say  we  grow  cells  at  an  intermediate  concentration  of  lactose  that  results  in  some  cells  being  fully  induced  and  some  not  being  induced  at  all  –all  depending  on  the  state  of  the  repressor  at  the  time  of  the  exposure-­‐.  Interestingly  when  the  induced  cells  are  selected  and  placed  at  this  intermediate  concentration  of  lactose  again,  all  remain  induced.  In  contrast  the  uninduced  ones  exert  their  right  of  activating  or  not.  The  reason  for  this  lies  in  the  Permease,  encoded  by  the  Y  gene  of  the  Operon,  which  once  expressed  at  a  certain  level  creates  a  positive  feedback  loop  that  maintains  the  system  active:  the  permease  will  bring  in  lactose,  which  will  inhibit  the  repressor  and  this  will  bring  in  more  lactose……..  Positive  feedback  loops  are  very  important  in  the  maintenance  of  the  activity  of  genetic  circuits  and  we  shall  see  more  of  this  in  the  next  lecture.    They  create  small  memories  of  the  input  and  not  only  allows  for    the  economic  maintenance  of  the  system  but  they  also  provide  useful  insights  into  regulatory  logic  that  you  will  use  later.  

         

9

                           

 Summary  Thus  we  can  see  how  to  establish  a  small  genetic  circuit  that  will  utilize  effectively  and  on  demand  carbon  resources.  The  system  is  very  simple  from  the  regulatory  point  of  view:  it  is  all  about  establishing  that  positive  feedback  loop  involving  the  permease.      We  have  also  learnt  two  molecular  principles  that  we  shall  see  in  action  soon:  cooperativity,  regulated  recruitment  and  memory.  The  three  are  likely  to  be  the  consequence  of  natural  selection  and  they  are  all  geared  to  the  maintenance  of  the  organism,  sometimes  against  the  organism’s  will.    The  system  works  on  demand  and  the  feedback  loop  support  the  economy  and  effectiveness  of  the  regulatory  system.  

10

 Lecture  2  Lambda:  a  genetic  switch,  the  circuitry  of  a  decision  and  the  programme  it  regulates    Cells  make  choices  about  what  they  want  to  do,  what  they  want  to  be  and  they  use  molecular  mechanisms  that  underpin  those  choices.  In  the  last  lecture  we  saw  how  E.  coli  makes  a  choice,  a  useful  choice,  to  metabolize  Glucose  before  Lactose  as  a  carbon  source  when  presented  with  both.  From  an  engineering  point  of  view,  it  is  a  question  of  IF  this,  then  NOT  that;  what  an  electrical  engineer  would  call  a  “NOT  gate”.  Today  we  are  going  to  see  a  different  decision  and  thereby  a  different  mechanism:  the  decision  of  a  bacteriophage,  lambda  (λ),  whether  to  kill  or  not  to  kill  an  E.  coli  cell.  The  underlying  molecular  process  driving  this  decision  is  similar  to  the  one  E.  colu  uses  to  utilize  Lactose  and,  together  the  two  systems  provide  a  basis  to  think  about  more  complex  molecular  devices  that  mediate  decisions,  more  complicated  decisions,  in  eukaryotes  .      Bacteriophages  are  bacterial  parasites  and  λ  is  one  of  them  that  has  been  studied  in  detail.  When  it  infects  a  bacterium, λ  has  a  choice,  either  to  kill  the  cell,  and  in  the  process  make  many  copies  of  itself,  or  to  become  a  passenger,  by  integrating  its  DNA  in  the  bacterial  chromosome…….and  kill  the  cell  later.  We  know  this  because  one  can  look  for  variants  of  the  phage.  Infecting  a  lawn  of  E.  coli  at  a  low  density  (such  that  individual  phages  are  separated  in  the  plate)  one  observes  well  defined  individual  plaques;  and  there  are  two  different  kinds  of  plaques:  nice,  round  clear  plaques  (O)  or  turbid  plaques  (ø).  The  clear  

plaques  reflect  a  chain  reaction  in  which  the  bacteriophage  sequentially  kills  bacteria  as  it  grows  i.e.  one  phage  generates  many  triggering  a  chain  reaction  and  thus,  because  of  the  lysis  that  is  observed,  all  bacteria  al  killed  and  the  plaques  are  called  ‘lytic’.  The  turbid  plaques  reflect  the  observation  that  sometimes  λ  kills  and  sometimes  it  does  not,  and  that  when  it  does  not,  it  grows  with,  within  actually,  the  bacterium  giving  rise  to  ‘lysogens”.    Lysogens  have  an  interesting  property:  bacteria  with  a  lysogenic  phenotype  are  immune  to  further  infection  i.e.  if  one  tries  to  infect  a  lysogen  with  the  product  of  a  lytic  plaque,  one  cannot  do  this  and  the  resulting  plaque  remains  opaque.  Conversely,  lytic  plaques  never  give  rise  to  lysogens  when  infecting  other  bacteria.  However,  if  one  takes  a  lysogen  and  treats  it  with  UV  light,  one  induces  lysis.  As  in  the  case  of  Lac,  a  combination  of  genetics  and  biochemistry  provides  an  

explanation  for  this  observations  and  a  model  of  how  the  system  functions.  Thus,  we  have  a  series  of  observations  to  explain  and  explore    

• What  is  the  molecular  basis  of  lysis  and  lysogeny?  • How  does  a  phage  decide  what  to  do?  • What  is  immunity?  • How  does  UV  act  to  induce  lysis?  

 Looking  for  mutants  (remember  that  this  is  what  Genetics  is  about)  that  affect  the  ability  of  λ  to  grow  lytically  or  lysogenically,  and  applying  the  rules  that  we  laid  down  in  last  lecture  1,  we  can  find  something  about  the  mechanism  that  mediates  the  decision  of  the  phage.  Looking  for  mutants  that  produce  plaques,  we  find  four  complementation  groups  associated  

!

11

with  these  plaques:  cI,  cro,  cII  and  cIII,  but  these  mutants  exhibit  different  behaviours  when  we  subject  them  to  genetic  tests.      In  all  cases  one  can  isolate  clear  (lytic)  plaques,  but  sometimes  it  is  possible  to  isolate  lysogens  from  cII  and  cIII  mutants,  which  are  stable,  immune  and  inducible  by  UV  light,  but  this  is  never  the  case  for  cI,  which  only  produces  clear  plaques.  On  the  other  hand  none  of  the  three  mutants  cI,  cII  and  cIII  can  grow  on  a  lysogenic  culture  i.e.  they  cannot  lyse  a  lysogen,  which,  therefore,  is  immune  to  these  mutations.  However,  occasionally  one  can  isolate  a  mutant  which  does  this,  these  are  called  λvir  and  represents  an  interesting  and  useful  exception.    

   Given  what  we  learnt  about  the  Operon,  an  interpretation  of  the  mutants  and  their  relationships  suggest  the  following  picture  for  the  activities  of  λ  phage :    

• cI  is  a  repressor  of  lysis  and  therefore,  if  it  is  mutated,  λ will  always  lyse.    It  is  called  the  Repressor  (because  its  function,  normally,  is  to  repress;  notice  that  many  genes  are  named  on  the  basis  of  their  loss  of  function  phenotypes  and  not  on  the  basis  of  what  the  proteins  they  code  for  do).  

• cII  and  cIII  seem  to  work  to  establish  lysogeny  but  they  are  not  required  for  its  maintenance  and  therefore  when  mutated  can,  occasionally,  produce  turbid  plaques.  A  good  example  of  this  is  provided  by  the  different  behaviour  of  temperature  sensitive  (ts)  mutations  in  cI,  cII  and  cIII.  It  is  possible  to  isolate  lysogens  for  the  three  mutants  at  the  permissive  temperature,  30oC.  However,  when  they  are  raised  to  the  non  permissive  temperature,  40oC,  cIts  lyses  but  cIIts  and  cIIIts  continue  to  grow  as  lysogens.  As  normal  mutants  in  cII  and  cIII  lyse,  this  observation  suggests  that  their  products  are  required  for  the  initiation  or  establishment,  but  not  the    maintenance,  of  lysogeny.  On  the  other  hand  cI  is  required  for  both.  We  shall  see  below  what  is  the  role  of  cII  and  cIII.  

• Cro  represses  lysogeny,  so  when  mutated  yields  lysogens  Corollary:  there  must  be  a  regulatory    relationship  between  cro  and  cI.  

• λvir  mutants  are  not  easy  to  interpret,  but  the  fact  that  they  are  rare,  suggests  that  they  might  map  to  some  sort  of  control  region  involved  in  repression  and  which  is  unable  to  bind  the  repressor.  These  mutations  are  cis.  

• Immunity  must  be  due  to  the  existence  of  high  levels  of  the  repressor  protein  in  the  host  which  will  suppress  the  lytic  programme  in  other  phages.  Upon  infection  the  DNA  of  the  new  phage  must  be  taken  over  by  the  Repressor  of  the  resident  phage  and  this  block  lysis.    

• UV  must  target  the  Repressor,  break  it  down.  

cI

cII

cIII

cro

!vir

clear turbid

clear

clear

turbid

clear

turbid

turbid

turbid

turbid

clear no

yes

yes

yes

no

lof 30oC 40oC

ts allele growthon

lysogen

12

Now  we  have  a  picture  and  therefore  we  need  a  mechanism;  once  we  have  the  genetics,  we  need  biochemistry  (or  cell  biology,  as  it  may  be  the  case)  to  interpret  the  phenotypes  and  this  is  the  same  here.  If  you  are  interested  in  details  look  up  Ptashne’s  book  (in  particular  chapters  1-­‐4,  with  chapter  4  deserving  special  attention;  the  rest  of  the  book,  dense,  but  there  are  useful  things  if  you  are  curious).        There  are  two  fundamental  molecular  components  to  the  system:    

1. A  very  high  level  control  region  that  determines  the  sequence  of  events  2. A  programme,  a  genetic  programme,  that  follows  from  the  activity  of  (1).    

 We  are  again  in  one  of  those  situations  of  “NOT  gates”.  The  control  region  works  in  such  a  manner  that:  if  A,  then  lysis;  if  B  (or  NOT  A),  then  lysogeny.  Lysogeny  is  a  status  quo  that  is  established  and  maintained  by  a  molecular  event.  Lysis  requires,  and  is  associated  with,  a  genetic  programme  that  leads  to  phage  building.    IMPORTANT  NOTE:  This  is  the  first  time  that  we  have  encountered  the  notion  of  a  programme  and  therefore  it  is  important  to  pause  and,  at  least,  mark  this  event.  A  genetic  programm  is  a  sequence  of  transcriptional  and  translational  events  that  change  the  state  of  a  cell  and  can  generate  something  new  a  state  and  lead  to  new  programmes.  They  are  very  important  in  development.  In  the  case  of  a  λ  lytic  the  programme  results  in  the  building  of  new  phage  and  the  lysis  of  a  bacterium.      Let  us  see  how  this  works  and  how  can  we  make  sense  of  the  genetics.    The  molecular  elements:  control  As  we  already  have  stated,  the  system  has  a  control  region,  in  the  DNA,  and  also  a  programme,  which  is  clearly  mediated  by  proteins.  The  decision  making  (to  lyse  or  not  to  lyse)  is  dependent  on  the  interactions  between  the  DNA  and  the  proteins.  The  operative  system  is  a  control  region,  an  Operator  -­‐the  OR  region  that  is  mutated  in  λvir-­‐,  and  four  proteins  cro,  cI,  cII,  cIII,  which  emerge  as  complementation  groups  in  the  genetic  screens.    Genetic  analysis  indicates  that  the  cro  and  cI  (Repressor)  proteins  play  different,  but  related,  roles  in  the  state  of  the  cells,  but  it  is  the  biochemistry  -­‐and  then  the  combination  of  genetics  and  biochemistry-­‐  that  tells  us  how  it  works,  because  this  is  associated  with  their  different  structures  which  matter  for  the  mechanism  and  the  decision.      The  cro  protein  is  made  up  of  a  simple  globular  domain  that  binds  DNA.  On  the  other  hand,  cI  is  made  up  of  two  globules,  linked  by  a  hinge  –this  will  suffice  for  all  practical  purposes-­‐;  one  of  the  globules  binds  DNA  and  another  can  bind  to  another  copy  of  itself.  This,  and  the  existence  of  duplicated  binding  sites  on  the  DNA  (see  the  end  of  last  lecture),  leads  to  dimers  as  the  devices  that  mediate  function  (both  cro  and  cI  function  as  dimers).    

13

Molecular  analysis  reveals  that  cro  and  cI  bind  to  a  region  of  DNA,  the  operator  OR  –a  very  similar  situation  to  the  one  we  discussed  in  the  last  lecture  about  Lac-­‐  which  is  subdivided  into  three  linked  sections,  OR  1,  OR  2  and  OR  3,  which  seem  to  overlap  with  two  promoters:  

PRM  and  PR  (see  Fig).    If  PRM  is  active,  more  cI  is  made  (notice  the  “more”,  we  shall  come  back  to  this  later  i.e.  how  is  the  expression  of  cI  started?)  and  the  phage  integrates  in  the  bacterial  chromosome.  If  PR  is  active,  the  phage  will  lysogenize;  one  of  the  elements  for  this  is  the  synthesis  of  cro.    The  game  is  that  cI  and  cro  battle  for  binding  to  OR  as  this  will  determine  which  promoter  will  be  active  and  which  programme  will  be  executed  (insertion  and  lysogeny  or  lysis).  The  battle  is  a  molecular  competition  based  on  affinities  and  driven  by  concentrations  (see  end  of  last  lecture).  As  the  DNA  is  constant,  it  is  all  down  to  the  relative  concentrations  of  cro  and  cI  and  to  the  fact  that  OR  1,  OR  2  and  OR  3  have  different  affinities  for  

both,  cro  and  cI.      

1. cI  binds,  preferentially  and  first,  at  OR2  and  this  has  two  consequences:  it  prevents  binding  of  the  RNA  polymerase  to  PR  and  thereby  inhibits  the  synthesis  of  cro.  At  the  same  time,  it  helps  RNA  polymerase  bind  to  PRM  and  promote  the  expression  of  cI  (in  reality,  more  cI-­‐  we  shall  see  shortly  how  the  battle  starts).  So,  cI  at  OR2  → cI (more) expression.    

2. cI  can  also  bind  OR3  but,  when  it  does,  here  it  has  different  effects:  it  cannot  activate  PRM  and  it  cannot  inhibit  PR,  which  then  triggers  gene  expression.  So,  cI  at  OR3  → cro expression.  

 3. cI  may  bind  at  OR1  but  here  it  cannot  activate  PRM  and  blocks  PR.  So,  cI  at  OR1  → no

expression of cro nor of cI.    

4. Cro  binding  blocks  the  binding  of  cI  and  thereby  determines  its  occupancy  of  OR.    It  turns  out  that  the  affinities  of cI  and  cro are mirror image of each other. In the case of cI: OR1  >  OR2  >  OR3, whereas in the case of cro:  OR3  >  OR2  >  OR1. Under normal conditions, as indicated by Ptashne, if one  takes  a  snapshot  of  OR  in  a  lysogen  one  will  find,  on  average,  that  90%  of  the  cells  have  cI  at  OR1  and  OR2  and  only  in  about  10%  of  the  cells  the  three  operators  are  occupied. These  indicates  that  the  determinants  of  the  outcome  are,  as  in  any  chemical  system,  the  affinities  of  the  proteins  with  a  variant  (the  interactions  between  the  repressor  dimers).  The  relative  affinities  and  concentrations  of  cro  and  cI  provide  the  key  for  the  state  of  a  cell  (see  Fig).    

From M. Ptashne 2011Nat Chem Biol

14

Altogether,  these  observations  provide  a  basis  to  understand  the  cI  and  cro  mutants.  It  also  provides  a  basis  to  understand  λvir  which  must  be  a  cis  mutation  (in  the  operator)  and  we  can  now  explain  the  odd  observation  that  λvir  mutants  cannot  enter  lysogeny,  probably  because  being  mutants  in  the  operator,  would  not  allow  for  the  repressor  to  seat  in  or  would  favour  the  binding  of  cro.  They  are  cis  but  because  of  the  nature  of  the  phage  growth,  they  can  be  understood  as  cis  dominant  (but  have  a  weird  twist).  Activation  of  PR  leads  to  the  expression  of  several  lytic  genes  which  will  help  the  phage  reproduce  and  then  kill  the  cell.  Factors  affecting  the  decisions:  the  establishment  Now  we  know  how  the  key  control  region  works,  but  how  does  λ ever get  to  the  point  of  making  a  decision?  How  does  λ set  up  the  decision?  How  does  the  system  set  itself  up  for  the  decision  which  we  know  is  ‘random’  or,  if  you  wish  to  be  more  precise  ‘stochastic’,  at  least  at  first  sight?      A  combination  of  classical  genetics  (mutant  analysis  and  epistasis)  and  molecular  biology  (looking  at  DNA,  RNA  and  proteins),  suggests  the  existence  of  three  phases  in  the  process:  Very  early,  Early  and  Late.  We  can  infer  that  there  are  different  phases  from  the  mutants  (remember,  for  example,  the  different  behaviour  of  the  ts  mutants  in  cI,  cII  and  cIII).  The  decision,  the  game  at  the  Operator,  is  made  some  time  between  the  Early  and  the  Late  phases,  and  understanding  this  process  will  give  us  an  insight  into  WHAT,  if  anything,  mediates  the  decision,  and  perhaps  provides  a  basis  for  the  molecular  basis  of  decision  making.  Let  us  have  a  coarse  grained  look  at  the  different  phases.      Very  early:  When  the  phage  injects  its  DNA,  polymerase  binds  to  two  promoters  :  PR  and  PL  and    leads  to  the  transcription  of  cro  (from  PR)  and  of  an  interesting  protein  called  N  (made  from  PL  )  whose  job  is  to  enable  the  functioning  of  RNA  polymerase  at  DNA  sequences  that  are  energetically  difficult-­‐  remember  that  this  is  a  product  of  chemistry  and  evolution.  This  extends  transcription  from  both  PR  and  PL    Early:  During  this  phase,  N  allows  the  extension  of  the  transcription  from  sites  close  to  PR  and  PL  to  a  number  of  genes  that  set  up  the  stage  for  the  decision  making  process.  From  PL  it  leads  to  the  expression  of  genes  that  will  set  lysis  in  motion.  From  PR  it  leads  to  the  expression  of  genes  involved  in  integration  (int)  and  two  old  friends  of  ours:  cII  and  cIII,  which  remember  were  identified  as  lysogenic  mutants.  cII  is  an  activator  of  transcription  which  is  degraded  by  proteases  and  cIII  protects  cII  from  degradation.  cII  leads  to  the  expression  of  cI  from  a  promoter  called  PRE  (for  promoter  repressor  establishment).  And  then  a  competition  ensues  between  cro  and  cI  in  which  the  goal  is  to  see  whether  lysogeny  (a  process  that  is  cI  dependent)  can  be  established.    Late:  this  is  the  decider  and  it  is  here  where  the  pathways  bifurcate.  The  outcome  of  this  phase  depends  on  whether  the  process  is  lytic  or  lysogenic.  If  cII  manages  to  make  enough  cI  so  that  it  establishes  its  position  at  OR1    and  OR2  ,  it  will  establish  expression  from  PRM  and  it  will  be  a  lysogen.  Otherwise,  cro  will  always  outcompete  cI  and  lysis  will  set  in.    

15

 In  summary:  If  Cro  and  Q  are  ON:  lysis  will  ensue.  If  cII,  cIII  and  then  cI  are    ON,  then  lysogeny  will  ensue.      

   The  decision:  what  decides?  A  bistable  state.  Bistability.  Now,  we  know  all  the  elements  of  the  system  and  what  does  it  take  for  the  coin  (and  it  is  the  toss  of  a  coin)  to  go  one  way  or  another.  How  is  then  the  decision  made?  How  many  levels  are  there  are  to  the  decision?  How  are  they  regulated  and  enacted?      As  we  have  seen,  the  key  element  is  the  relative  ratio  of  cI  and  cro.  As  initially  cro  is  made,  the  decision  hinges  on  the  ability  of  the  phage  to  pump  enough  of  cI  to  set  up  stable  transcroption  of  the  repressor  and  this  depends  on  whether  cII  can  get  to  make  enough  of  cI  

Infection

cII

pRE cI

Lysis Lysogeny

Proteases

16

from  PRE.  The  stability  of  cII  is  dependent  on  proteases  from  the  cell  and  this  can  reflect  the  state  of  a  cell:  growth  in  rich  medium  will  activate  proteases  and  lead  to  lysis  –because  the  levels  of  cII  will  be  low  and  it  will  never  be  able  to  establish  the  levels  of  cI  needed  for  lysogeny.  On  the  other  hand,  starvation  will  lead  to  low  levels  of  proteases  which  will  result  in  higher  levels  of  cII  which  will  lead  to  enough  cI  to  get  the  positive  feedback  loop  going,  and  it  is  a  positive  feedback  loop,  and  lysogeny  established.  

 This  system  with  two  alternative  states  which  repress  each  other  but  self  reinforce    is  called  a  bistable  system.  Such  systems  always  result  in  one  or  the  other  state,  there  is  no  possibility  of  long  term  coexistence  of  both.        

 Summary:  a  comparison  with  the  lac  operon  Although  the  Lac  operon  and  the  Lysis-­‐Lysogeny  switch,  each  has  its  own  special  issues,  they  also  have  much  in  common  and  it  may  be  worth  reflecting  on  these  similarities,  particularly  in  the  context  of  the  general  principles  discussed  at  the  end  of  lecture  1.      

• In  both  instances  there  is  an  Operator,  a  cis  acting  control  region  which  acts  as  a  landing  pad  for  DNA  binding  proteins  that  control  the  activity  of  RNA  polymerase.    

• In  both  cases  there  is  cooperativity  –in  the  case  of  the  repressor  (I)  and  CAP  in  lac,  and  in  the  case  of  the  repressor  (cI)  and  cro  in  λ.  In  both  instances  there  are  dimers  which  help  tether  the  proteins  to  the  DNA  and  give  them  a  higher  chance  to  do  their  job.  

• In  both  instances    there  is  regulated  recruitment  of  the  RNA  polymerase  to  the  sites  of  action:  cI  and  CAP.  

• In  both  cases,  the  chief  regulatory  proteins  (cI  and  I)  can  form  tetramers  which  lead  to  looping  of  the  DNA  and  the  stabilization  of  the  structures,  through  these  larger,  energetically  favourable  structures.  

• In  both  instances  positive  feedback  loops  ensure  the  stability  of  the  states  (the  transacetylase  in  the  case  of  lac  and  the  synthesis  of  cI  in  the  case  of  λ.  

• Both  systems  have  evolved  a  way  to  sense  the  environment.  The  main  difference  is  that  in  one  case  (λ),  a  programme  is  activated  and  in  the  other  (Lac)  it  is  the  synthesis  of  an  enzyme.  

• From  a  regulatory  perspective,  λ is  two  autoregulatory  systems  inhibiting  each  other.  This  type  of  regulation  is  very  common  in  biological  systems.  It  is  robust  and  probably  mediates  choices  between  one  state  or  another.  

                   

cI cro

LysisLysogeny

17

Lecture  3  Gene  expression  in  eukaryotes:  S.  cerevisiae  Gal4  as  a  guide  for    universal  principles  of    transcriptional  regulation    The  principles  that  we  can  extract  from  the  analysis  of  the  regulation  of  fate  decisions  in  Lac  and  λ can  be  extrapolated  to  eukaryotes.  However  in  these  systems,  there  are  additional  layers  of  regulation  that  introduce  novel  elements  into  the  mechanism.  For  example  there  is  a  nucleus  which  creates  a  distinct  compartment  in  which  transcription  is  separated  from  translation  and  thus  creates  an  opportunity  to  regulate  transcription  in  terms  of  the  entry  or  exit  of  proteins  from  the  nucleus.  Most  significantly  the  DNA  is  organized  into  nucleosomes  around  histones,  giving  rise  to  chromatin-­‐  which  hampers  the  access  and  progress  of  RNA  polymerase  creating  a  ‘need’  for  regulation  of  the  structure  of  the  chromatin  in  association  with  gene  expression  (see  S.  Jackson’s  lectures.  People  call  this  level  of  regulation  ‘epigenetics”.  In  addition,  the  basal  transcriptional  machinery  is  much  more  complicated  and  there  is  a  large  number  of  proteins  associated  with  RNA  polymerase  (see  again  S  Jackson’s  lectures);  this  introduces  many  layers  of  potential  regulation  in  the  assembly  of  the  machinery  for  and  initiation  of  the  process  of  transcription.  And  every  one  of  these  levels  (nuclear  access  of  specific  factors,  chromatin  structure  an  assembly  of  basal  transcriptional  machinery)  are  used  to  regulate  gene  expression.    Yeast  provides  a  good  system  where  to  begin  to  see  how  molecular  interactions  mediate  responses  and  create  circuitry  and,  within  yeast,  the  biochemical  system  utilizing  Galactose  has  provide  many  insights  into  how  the  basic  principles  of  prokaryotes  are  put  to  work  in  eukaryotes.    Regulatory  logic  of  the  Gal  system  of  S.  cerevisiae  As  it  is  customary  by  now,  we  start  with  a  survey  of  the  genes  required  for  the  growth  of  yeast  on  galactose  i.e.  we  look  for  mutations  (loss  of  function,  gain  of  function  or  temperature  sensitive)  that  affect  the  ability  of  cells  to  do  this.  Then  using  epistasis  and,  by  now,  a  little  bit  of  molecular  biology,  one  can  work  out  a  genetic  circuit  that  functions  in  this  process.  This  type  of  analysis  reveals  that  the  system  can  be  divided  into  two  core  components,  a  collection  of  ‘structural  genes’  which  encode  enzymes  and  molecules  dedicated  to  galactose  metabolism  (centrally  GAL1,  GAL10,  GAL7,  GAL2)  and  regulatory  

genes  whose  function  is  to  regulate  the  expression  of  the  structural  gene  (GAL4,  GAL80,  GAL3  and  GAL11).  Although  this  is  the  core,  modern  methods  have  identified  a  large  number  of  genes  that  are  co-­‐ordinately  regulated  by  the  regulatory  box,  all  of  them  associated  in  one  way  or  another  with  the  metabolism  of  Galactose.  As  we  have  discussed  eukaryotes  offer  an  ample  number  of  possibilities  for  gene  regulation,  and  this  system  exploits  them  all.  The  usual  genetic  analysis  reveals  a  complex  relationship  between  the  regulatory  genes  highlighted  in  the  figure,  whose  biochemical  meaning  unravels  in  the  molecular  analysis.    

 A  common  theme  of  all  the  genes  under  the  control  of  the  regulatory  tool  box  is  a  regulatory  region  present  in  all  genes  involved  in  galactose  growth,  this  sequence  is  cis  acting  and  is  called  UASGAL  (Upstream  Activating  Sequence  related  to  Galactose);  it  is  similar  to  the  CAP  

Gal1Gal2Gal7Gal10

Gal4 Gal80Gal3 Gal11

18

binding  site  in  E.  coli  Lac  or  the  cI/cro  Operator  in  λ and  there  are  about  300  of  these  sequences  in  the  genome.  This  means  that  there  are  many  genes  under  coordinated  regulation.    So,  you  can  already  see  the  scale  of  the  complexity  of  eukaryotic  gene  regulation.  The  main  transcriptional  regulator  here  is  Gal4  (encoded  by  the  GAL4  gene),  which  binds  UASGAL  and  is,  if  you  wish,  the  equivalent  of  CAP  or  cI  in  E.  coli  and  λ.    Following  Ptashne,  let  us  focus  on  the  GAL1  gene  which,  for  all  practical  purposes  illustrates  how  the  regulation  of  its  expression  works  i.e.  what  is  true  for  GAL1  will  be  true  for  other  genes  that  have  a  UASGAL  and  which  are  under  common  regulation.        A  technical  interlude:  Reporter  assays.  A  technical  and  important  issue  when  dealing  with  eukaryotic  transcription  is  the  notion  of  reporter.  In  order  to  facilitate  the  readout  of  a  potentially  significant  transcriptional  interaction,  one  can  use  a  bacterial  gene  e.g  lacZ  for  which  there  are  easy  assays,  or  more  recently  Green  or  Red  Fluorescent  Protein,  that  glow.  If  one  places  genes  encoding  these  proteins  downstream  of  putative  regulatory  regions,  one  can  use  the  proteins  as  ‘reporters’  for  the  transcriptional  event.  Bypassing  any  function  that  the  gene  under  regulation  would  have  and  making  the  experiments  easy.  We  shall  see  much  of  this  in  this  lecture.    A  look  at  the  regulatory  region  of  GAL1  (defined  through  DNA  bashing  and  reporter  analysis),  identifies  an  element  located  at  about  275  bps  from  the  transcription  start  site  that  is  necessary  and  sufficient  and  which  contains  four  binding  sites  for  Gal4  (UASGAL).  Downstream  from  it  there  is  a  repressor  binding  site  for  Mig1  which,  much  as  in  the  case  of  Lac,  ensures  that  the  Galactose  regulatory  network  is  only  used  when  there  is  Galactose  around  and  not  when  there  are  other  sugars  e.g  glucose.    We  can  already  see  here  some  of  the  features  that  distinguish  eukaryotes  from  prokaryotes:    

• There  are  multiple  UASGAL  regulatory  sites  • There  are  larger  distances  from  the  regulatory  sequences  to  the  promoter:  the  

UASGAL  is  located  over  200bp  from  the  initiation  of  transcription  and  contains  multiple  sites  of  17bp  each  –which  allow  them  to  be  unique-­‐,  whereas  in  E.  coli  the  regulatory  sites  tend  to  be  around  40bp  from  the  transcription  start  site.  

• The  repressor,  Mig1,  does  not  work  like  the  bacterial  repressors  by  occluding  the  binding  of  RNA  polymerase  but  by  recruiting  other  proteins  that  affect  the  chromatin  structure  and  the  interactions  of  other  regulatory  proteins  involved  in  the  transcriptional  activators.  We  shall  not  say  too  much  about  Mig1  however  it  is  important  to  bear  in  mind  that  1)  It  plays  a  role  in  the  regulation  of  GAL1  activity  and  2)  it  does  not  act  like  bacterial  repressors.  Mig1  is  a  way  of  ensuring  that  the  Galactose  genes  are  not  expressed  in  the  absence  of  galactose;  a  bit  like  the  lac  repressor  but,  as  we  have  already  said,  it  works  not  by  occluding  the  DNA  but  by  recruiting  a  complex  of  proteins  that  mediate  repression.  Mig1  also  exploits  the  compartmentalization  of  the  cell:  in  the  absence  of  glucose  it  is  in  the  cytoplasm  and  phosphorylated.  This  changes  if  there  is  glucose  as  then  it  enters  the  nucleus,  binds  its  site  and  recruits  the  repressive  complexes.  

 These  features  are  typical  and  general  of  eukaryotic  regulatory  regions.  One  feature  in  common  with  Lac  is  that  the  system  is  under  negative  regulation  i.e.  the  expression  of  GAL1  is  repressed  until  there  is  Galactose  in  the  medium  and  the  reason  for  this  is  that  although  

275bp UAS GAL4

GAL1Mig1

19

Gal4  is  bound  to  the  DNA  (as  a  dimer),  it  cannot  promote  transcription,  not  only  because  Mig1  is  working  (see  above)  but,  most  significantly,  because  the  product  of  the  GAL80  gene  is  bound  to  a  specific  domain  on  Gal4  and  does  not  allow  the  relevant  interactions  that  promote  transcriptional  activation.  When  there  is  Galactose  around,  Gal80  is  taken  off  Gal4  by  Gal3,  which  is  a  cytoplasmic  protein  that  senses  Galactose,  Mig1  is  also  shuttled  out  of  the  nucleus,  and  Gal4  is  allowed  to  interact  with  the  transcriptional  machinery.  Thus  the  system  exploits  the  nuclear  compartmentalization  of  eukaryotic  cells  for  the  purposes  of  regulation.  Once  Gal4  is  free  from  Gal80  it  can  recruit  and  interact  with  members  of  the  Mediator  complex,  which  will  bring  in  RNA  polymerase  to  the  site.    The  product  of  the  Gal11  gene  is  an  element  of  the  Mediator  complex  that  interacts  with  Gal4  and  provides  a  bridge  for  the  recruitment  and  activation  of  RNA  polymerase.    Thus  one  can  see  how  the  genetic  relationships  are,  again,  enlightened  by  the  molecular  biology  and  the  biochemistry.    

       Now,  what  is  interesting  is  to  look  into  the  way  Gal4  promotes  transcription  as  this  has  served  as  a  reference  for  the  way  we  think  about  the  regulation  of  transcription  in  other  eukaryotic  systems  (always  bear  in  mind  S.  Jackson’s  lectures).      Gal4  Analysis  of  the  Gal4  protein  reveals  the  existence  of  three  structural  domains,  each  with  a  specific  function,  that  act  in  a  modular  manner:  a  DNA  binding  domain,  a  domain  involved  in  the  dimerization  and  an  “activation  domain”  which  contains  a  Gal80  binding  site.  Modularity  means  that  each  of  these  domains  will  work  on  its  own  and,  more  significantly,  together  with  other  proteins  that  complement  the  domain  function.  Experiments  testing  this  through  measuring  the  activity  of  the  different  fragments  of  the  protein  reveal  that  the  DNA  binding  domain  and  the  activation  domain  are  independent  and  work  in  heterologous  systems.  In  a  series  of  experiments,  it  was  shown  that  GAL1  can  be  activated  by  Gal4  activation  domain  from  a  different  DNA  binding  domain  -­‐provided  there  is  a  regulatory  region  in  the  DNA;  thus,  one  could  take  the  DNA  binding  domain  from  cI  or  from  I,  attach  it  

GAL1

GAL1

Gal80

RNA polII

GAL1Mig1

Gal11MEDIATORGal4

20

to  the  dimerization  and  activation  domain  of  Gal4  and  this  will  lead  to  transcriptional  activation  in  yeast.  This  is  a  most  important  result  because  it  will  explain  much  of  the  logic  of  transcriptional  activation  in  eukaryotes  and,  particularly,  in  development.  This  experiment  states  that  one  can  have  large  numbers  of  combinations  between  DNA  binding  domains  and  activation  domains.      The  activating  domain  is  an  interesting  beast.  Intrigued  by  this  function,  Ptashne  and  his  colleagues  decided  to  do  an  experiment  whereby  they  took  a  Gal4  DNA  binding  and  dimerization  domain  and  attached  to  it  a  large  number  of  possible  polypeptides.  Then  they  tested  their  activity  in  a  reporter  assay.  They  did  find  that  the  activation  domain  of  Gal4  could  be  substituted  by  a  number  of  peptides  most  of  which  had  an  acidic  nature.  As  long  as  they  could  reach  the  transcriptional  machinery,  their  structure  did  not  matter  and  they  worked.  This  observation  allows  one  further  experiment,  the  reverse  of  the  heterologous  DNA  binding  domain  which  shows  that  the  DNA  binding  domain  provides  the  anchor  for  the  activating  domain  and  the  number  of  links  don’t  matter.  One  can  tie  an  activation  domain  to  Gal80  and,  under  these  circumstances,  one  can  get  Gal4  dependent  transcriptional  activation  even  in  presence  of  glucose  because  the  heterologous  activation  domain  works.  This  experiment  makes  the  point  that  the  role  of  Gal80  is  to  impede  the  interaction  of  Gal4  with  the  basal  transcriptional  machinery.    The  jigsaw:  DNA  binding  domains,  interaction  domains,  activation  domains.  The  machinery  is  general:  Gal4  works  in  flies!  What  the  work  with  Gal4  illustrates  is  a  general  principle  of  eukaryotic  transcription  factors  and  this  is  that  they  are  modular,  that  they  have  three  elements  (DNA  binding  domain,  

interaction  domain  and  activation  or,  in  the  case  of  repressors,  repression  domains)  that  work  independently  of  each  other  but  that  when  they  come  together  provide  a  unique  code  for  a  particular  gene.  There  is  a  small  and  finite  number  of  these  elements  and  have  names  associated  with  their  structures  (e.g  Zinc  fingers  (ZF),  basic  HelixLoopHelix  (bHLH),  Homeodomains  (HD),  Leucine  Zippers  

(LZ))  and  transcription  factors  emerge  from  combinations  of  these  different  domains  which  creates  a  very  large  repertoire.      The  activation  or  repression  domains  are  interesting  and  important  because  they  interact  with  the  basal  transcriptional  machinery  (S.  Jackson’s  lectures)  and  this  is  what  determines  the  output  of  the  interactions  between  the  different  transcription  factors.  As  we  have  seen  there  is  a  certain  generic  nature  to  the  activation  or  repression  domains  (though  there  are  some  rules)  and  they  can  work  for  any  DNA  binding  domain.  What  is  perhaps  most  interesting  is  that  some  of  these  activators  and  repressors  work  in  different  species.  It  is  in  this  manner,  through  combinatorials,  that  the  400  or  so  transcription  factors  in  eukaryotic  cell  can  drive    the  expression  of  over  30,000  genes  in  a  space  and  time  controlled  manner.    We  can  mentioned  that  we  can  tether  the  Gal4  activation  domain  to  a  different  DNA  binding  domain  and  get  it  to  drive  transcription.  Probably  not  surprising,  DNA  is  DNA.  But  what  

From Ptashne and Gann, Genes and signals

DNA binding

Trans Activation

21

about  the  transcriptional  machinery?  Is  it  organism  dependent?  To  test  this,  we  take  the  Gal4  protein  from  S.  cerevisiae  and  express  it  in  Drosophila.  If  we  provide  a  reporter  for  Gal4  by  introducing  in  the  chromosome  a  UASGAL  upstream  of,  for  example,  ß-­‐galactosidase  (lacZ)  ,  we  can  get  the  yeast  Gal4  to  activate  expression  of  lacZ  in  Drosophila  using  the  transcriptional  machinery  of  Drosophila.  If  Gal4  is  expressed  from  some  promoter  which  drives  tissue  or  cell  specific  expression,  Gal4  will  elicit  the  expression  of  lacZ  in  the  pattern  of  Gal4.  This  shows  that  the  yeast  Gal4  protein  can  interact  with  (talk  to!)  the  basal  transcriptional  machinery  of  the  fruit  fly  and  therefore  suggests  that  there  is  a  universal  molecular  language  for  the  process  of  transcription.  Similar  experiments  can  be  done  with  mammalian  cells  and,  in  general,  they  work.    Yeast  meets  Drosophila:  Bicoid  and  Gal4,  affinities  We  did  say  at  the  beginning  that  the  discussions  on  prokaryotes  and  eukaryotes  were  to  try  to  learn  something  about  the  way  cells  use  transcription  to  make  decisions  during  development.  You  will  be  hearing  a  lot  about  this  later  in  the  course  but  here  I  would  like  to  introduce  you  to  an  interesting  system  which  has  taught  us  a  lot  about  the  relationship  between  gene  regulation  and  development:  the  segmentation  of  the  Drosophila  embryo.  An  important  molecule  and  trigger  of  this  process  is  called  Bicoid,  a  transcription  factor  with  a  DNA  binding  domain  of  the  homeodomain  (HD)  kind  (it  has  a  HD  in  its  N  terminus  and  an  Activation  Domain  in  its  C  terminus  (347-­‐414)  –we  know  this  through  the  kind  of  experiments  that  allowed  us  to  dissect  Gal4).  This  protein  is  expressed  at  the  anterior  pole  of  the  Drosophila  embryo  and  diffuses  posteriorly  to  generate  an  exponential  gradient  which  determines  where  the  different  parts  and  the  different  segments  lie  in  a  concentration  dependent  manner.  If  Bicoid  is  missing  the  larva  that  hatches  from  the  embryo  lacks  the  anterior  segments  and  has  the  tail  part  disorganized  and  sometimes  an  extra  posterior  end  at  the  missing  anterior.      We  do  know  that  Bicoid  is  a  transcriptional  activator  because  there  is  a  target  gene  called  hunchback  which  is  activated  at  a  certain  Bicoid  concentration  and  requires  Bicoid.  In  fact  there  are  Bicoid  binding  sites  upstream  of  the  transcription  start  of  hunchback  (hb)  which  can  be  shown  to  be  necessary  for  expression;  some  are  high  affinity  binding  sites  and  some  are  low  and  it  is  the  combination  of  the  two  that  determined  where  a  gene  is  expressed  in  the  AP  axis  of  the  embryo.  Extraction  and  multimerization  of  these  sites  in  front  of  a  reporter  confirms  that  they  behave  as  high  and  low  affinity  sites  and,  for  the  same  gradient  of  Bicoid,  they  generate  nested  patterns  of  expression.      We  can  also  take  the  Bicoid  binding  sites  and  place  several  of  them  upstream  of  a  GAL1:lacZ  gene  reporter  in  yeast,  provide  Bicoid  in  trans  –in  yeast-­‐  and  observe  how  it  activates  the  reporter.  What  we  learn  is  that  Bicoid  can  interact  with  the  basal  transcriptional  machinery  of  yeast  and  work  with  it  to  promote  transcription.  This  is  remarkable  but  perhaps  not  surprising  if,  as  we  have  seen,  the  Gal4  protein  from  yeast  can  work  in  Drosophila  and  interact  with  its  transcriptional  machinery.      

22

   Functional  deletion  analysis  of  the  Bicoid  protein,  reveals  that  there  is  an  activation  domain  in  the  C  terminus  of  the  protein  and  that  without  it,  Bicoid  cannot  function:  it  does  not  activate  transcription  in  yeast  and  the  fly  does  not  make  a  head.  Interestingly  we  can  substitute  this  activation  domain  for  a  similar  one  from  other  proteins  e.g  Gal4,  and  it  will  work.  These  experiments  indicate  that  Bicoid  works  by  activating  transcription  of  downstream  genes.  A  hybrid  protein  containing  Bcd  (DNA  binding  domain):Gal4  (activation  domain)  not  only  activates  transcription  efficiently  in  yeast,  but  it  is  also  capable  of  rescuing  a  bcd  mutant  embryo.    These  experiments  reveal  the  universality  of  the  eukaryotic  basal  transcriptional  machinery  and  the  modularity  of  the  system.  This  also  emphasizes  that  this  modularity  can  play  important  roles  in  the  diversification.    Organizing  different  cells  in  space  through  recruitment  and  affinities.  An  example  from  Drosophila,  the  eve  2  enhancers    One  of  the  significant  problems  in  developmental  biology  is  how  a  relatively  small  repertoire  of  transcription  factors  can  generate  a  much  larger  number  of  cell  types.  We  have  seen  that  part  of  the  solution  lies  in  the  combinations  that  arise  from  the  modularity  of  transcription  factors.  However,  two  concepts  that  we  seen  earlier,  ‘cooperativity’  and  

‘regulated  recruitment’,  play  an  important  role  in  the  regulatory  process:  combinatorials,  cooperativity  and  regulated  recruitment  work  together  to  specify  when  and  where  a  gene  is  expressed  in  an  organism.  One  can  see  how  effective  these  are  by  looking  at  another  example  of  the  early  Drosophila  embryo:  the  activation  of  stripes  of  expression  of  the  gene  even  skipped  –the  name  comes  because  the  mutant  lacks  half  of  the  segments  in  Drosophila  and  these  happen  to  be  the  even  numbered  segments-­‐.    

In  the  Drosophila  blastoderm,  the  even  skipped  (eve)  gene  is  expressed  in  seven  non  overlapping  stripes  and  molecular  genetic  analysis  showed  that  each  stripe  has  its  own  control  panel,  a  collection  of  cis  acting  regulatory  elements.  The  expression  of  the  second  stripe,  eve2,  has  become  a  reference  for  our  

understanding  of  the  spatial  control  of  gene  expression  in  eukaryotes.  In  the  early  Drosophila  embryo  the  gradient  of  Bicoid  (see  above)  not  only  leads  to  the  expression  of  hb  but  it  trickles  down  to  other  genes  like  hb  (Kruppel  (Kr),  Giant  (Gt),  knirps  (kni))  that  codee  

Bicoid (bcd)

bcdhb bs GAL1 lacZ

HD AD

Gal4 AD

o

o

23

for  transcription  factors,  generating  a  set  of  overlapping  domains  that  span  the  length  of  the  embryo.  Interactions  between  Bicoid  and  these  factors  converge  on  a  third  tier  of  regulatory  elements  the  regulatory  regions  of  the  even  skipped  gene.  One  of  the  stripes,  number  2,  has  been  studied  in  great  detail  and  its  regulation  provides  general  features.  The  stripe  emerges  because  eve  is  subject  to    a  combination  of  positive  and  negative  proteins  each  with  their  own  control  element  (see  Fig  and  slides).    

The  eve2  control  region  is  about  480bp  long  and  contains  high  affinity  binding  sites  for  Bcd,  Hb,  Kr  and  Gt,  multiple  sites,  which  says  that  there  must  be  cooperativity.  Activation  depends  on  cooperative  interactions  between  Bcd  and  Hb  -­‐loss  of  function  of  Bcd  and  Hb    or  their  binding  sites  in  reporter  assays  abolishes  expression  of  eve  2-­‐  the  restriction  of  the  domain  relies  on  repressive  interactions  mediated  by  Kr  and  Gt  –loss  of  function  of  Kr  and  Gt  or  their  binding  sites  results  in  expanded  stripe  2.    The  complexity  of  the  regulatory  region,  does  highlight  the  amount  of  information  that  the  cell  needs  to  create  this  simple  pattern  but  also  shows,  at  work,  many  of  the  features  we  have  discussed  in  these  (and  S  jackson’s)  lectures.  

The  interactions  between  the  different  regulatory  elements  and  the  eve2  regulatory  region  can  be  construed  as  a  regulatory  network  in  which  Bicoid  activates  the  expression  of  the  activator  (Hb)  and  collaborates  with  it.  The  core  of  such  network  is  known  as  a  feedforward  loop  and  has  interesting  properties  dynamical  and  regulatory.  

Summary:  General  principles  for  differential  transcription?  

From  the  perspective  of  the  regulation  of  gene  expression,  the  main  difference  between  E.  coli,  λ,  yeast  and  Drosophila  is  the  amount  of  information  that  the  DNA  has  to  process  in  each  case.  As  complexity  increases,  so  does  the  complexity  of  the  regulatory  regions  and  the  proteins  that  read  them.  However,  there  are  some  basic  strategies  and  principles  used  in  all  cases.  The  first  and  most  important  one  is  that  weak  interactions  (protein:DNA  interactions  are  generally  weak)  become  strong  through  cooperative  binding.  Cooperativity  can  be  used  for  regulated  recruitment  which  thus  provides  a  foundation  for  combinations  of  transcription  factors  at  a  regulatory  site.  This  is  largely  allowed  by  the  modular  nature  of  their  functional  domains.  Finally,  repressors  and  activators  work  together  to  ensure  that  genes  are  expressed  when  and  where  they  are  needed.  I  is  interesting  how  from  a  simple  set  of  mechanis,  about  400-­‐500  transcription  factors  can  interact  to  regulate  between  20-­‐50,000  genes  and  generate  over  1020  different  cell  types  during  development.  

One  final  and  important  comment  is  that  the  interactions  between  transcription  factors  and  DNA  serve  to  generate  circuits  that,  as  the  networks  they  represent,  provide  useful  information  for  gene  regulation.  It  is  the  interactions  between  these  networks  that  informs  the  life  of  E.  coli,  yeast  and  the  development  and  life  of  higher  eukaryotes.  

Bcd

Hb Gt Kr

eve 2

24