生物技术药物制剂 Biotechnical Pharmaceutics Y eæY'[f …fdjpkc.fudan.edu.cn/_upload/article/files/23/28/b00c836b... · 2016. 8. 31. · 3. •生物技术药物(Biotech drugs)

生物技术药物制剂Biotechnical Pharmaceutics

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内容

• 概述

• 蛋白质多肽类药物注射剂的设计

• 蛋白质多肽类药物新型的注射给药系统

• 蛋白质多肽类的非注射剂型

• 基因递送系统

2复旦大学药剂学精品课程版权所有

概述

• 生物技术（biotechnology）

–应用生物体或其组成部分，在最适条件下，生产有价值的产物或进行有益过程的技术

–包括

• 基因工程

• 细胞工程

• 酶工程

• 发酵工程

• 生化工程

• 蛋白质工程

• 抗体工程


• 生物技术药物 (Biotech drugs)

–采用现代生物技术人为的创造一些条件，借助某些微生物、植物或动物来生产所需药品，一般来说指用DNA重组技术或其他生物技术研制的蛋白质和核酸类药物。

–包括

• 重组蛋白质药物

• 重组DNA药物

• 疫苗


• 生物技术药物的发展

– 1982，重组人胰岛素上市

– 1998, 65个生物药物上市

2600个进入临床前

700多个进行临床评价

200多种进入Ⅲ期临床

–学科的融合加速


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单克隆抗体的销售


• 生物技术药物的特点

–药理学：活性强，剂量小，毒副作用小

–生产和制备：稳定性差，空间构象易变

–检验特性：理化检验和生物活性检验


• 蛋白质药物的结构特点–蛋白质（朊）

• 一级结构– 氨基酸的组成和排列顺序

• 二级结构– α螺旋

– β折叠

• 三级结构– 螺旋和折叠肽链的空间排列

• 四级结构– 2个以上亚基通过非共价键结合的空间排列方式

–肽：10个以上氨基酸的为多肽


–蛋白质的理化性质

• 一般性质– 分子量大

– 在水中易形成亲水胶体，不易透过半透膜

– 旋光性（一般为右旋）

– 紫外吸收（230nm）

– 蛋白质的两性本质与电学性质：等电点

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Phe Tyr Try


–不稳定性

• 化学不稳定– 蛋白质水解

»酸、碱、蛋白酶

– 氧化

»甲硫氨酸、半胱氨酸

– 外消旋作用

»碱水解

»温度、pH、离子强度、金属离子

»使氨基酸成为非代谢形式

– 二硫鍵的断裂和交换

»二硫鍵稳定蛋白质构象

»硫醇类催化

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R-S-S-R R-S-S-R’+H-S-RH-S-R’


• 物理不稳定性– 变性：天然分子球状折叠的改变，如三级结构，通常是二级结构的破坏

»可逆变性

»不可逆变性

– 表面吸附

»蛋白质容易粘附在粗的表面

»表面吸附可导致构象变化

– 聚集

»在水溶液中自缔合

»二聚体、三聚体、六聚体

»变性剂可导致蛋白质聚集

– 沉淀

»宏观量的聚集

»与变性共轭发生


• 蛋白质药物的评价方法–液相色谱法

• RP-HPLC

• IEC

• SEC

–光谱法• UV

• 圆二色谱（CD）

• IR

–电泳

–生物活性测定与免疫测定


• 蛋白与多肽类药物生物学特点

–多为内源性物质

–药理活性强

–副作用较少、很少有过敏反应

–口服吸收差

–半衰期短、需长期给药


蛋白质类药物制剂的处方与工艺

一般剂型

溶液型注射剂

冻干粉注射剂


稳定化方法

1. 液体剂型中蛋白质类药物的稳定化–改造结构

–加入适宜辅料• 缓冲液

• 表面活性剂（非离子型）

• 糖和多元醇

• 盐类

• 聚乙二醇类– 低温保护剂和沉淀结晶剂

• 大分子化合物

• 组氨酸、甘氨酸、谷氨酸和赖氨酸的盐酸盐

• 金属离子


2. 固体状态蛋白质药物的稳定性与工艺

–冷冻干燥蛋白质药物制剂

• 适宜的辅料

• 冻干的工艺参数– 温度

– 时间

• 冷冻干燥过程中可能引起药物失活– 从液态到固态的相变过程中，包在蛋白质周围的水分子被除去而失活

– 高浓度的盐和缓冲组分的结晶或缓冲液pKa对温度敏感而导致pH变化、浓缩时蛋白质有限的溶解度等均能导致蛋白质药物失活


–喷雾干燥蛋白质药物制剂

• 加入稳定剂– 蔗糖能提高血红蛋白的稳定性

• 控制喷雾过程中的工艺参数


蛋白质药物在高分子材料中的不稳定

• 蛋白质药物稳定的一般性规律– 不稳定通常发生在制备、储存和释放过程中

• 体内释放– 生理温度下的湿环境

– 聚合物降解形成的微酸环境

• 药物包封过程中的不稳定

• 储存或干燥过程中，双糖（蔗糖）或多价离子（锌离子）的存在有利于蛋白质稳定

– 蛋白质不稳定的机理有

• 蛋白分子的伸展

• 水溶性或水不溶性聚集

• 水解

• 脱氨和氧化

– 加入稳定剂后可显著提高其稳定性


–聚合物中蛋白质释放过程中稳定性的影响因素

• 含水量

• 微环境pH值

• 聚合物表面吸附

• 由湿度引起的不稳定性

• 由酸诱导的蛋白不稳定


• 使稳定性研究简化的途径和方法

–模型蛋白的选用

• 适当的模型蛋白可以说明不稳定性机制

• 如核糖核酸酶

–聚合物中蛋白质结构的模拟和修饰

–选用不同的聚合物骨架


蛋白质多肽类药物新型注射给药系统

• 注射微球– 特点

• 缓释

• 延长体内作用时间（1-3月），减少给药次数

• 突释问题较严重

– 材料• PLGA、PLA

– 方法• 复乳-液中干燥法

• 相分离法

• 喷雾干燥法

• 熔融挤出法

• 低温喷雾冻干法


• 已开发的部分蛋白类药物缓释微球

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药物 t1/2（min）骨架材料缓释时间商品名开发厂家

曲普瑞林 30 PLGA 1M Decapeptyl Ipsen/Fering

亮丙瑞林 16 PLGA 1M Prostap SR Abbott/武田

亮丙瑞林 16 PLA 3M 武田

布舍瑞林 80 PLGA 1M Hoechst

高舍瑞林 PLGA 1M Zoladex ICI

那法瑞林 144 PLGA Syntex/South Res Inst

EPO PLGA 14d

研究中rhGH PLGA 30d

rhIFN-ɤ PLGA 7d

IL-α PLGA 7d


• 疫苗的微球注射剂

–疫苗需多次接种

–相隔时间长

–辍种率高

–类型

• 突释+缓释

• 脉冲释药


• 植入剂

–注射型植入剂

• PLGA的条状植入剂

• 原位凝胶（in-situ gel）

–非注射型植入剂

• 胶囊型植入剂

• 骨架材料制成的特殊形状植入剂


• 输注泵给药系统

–特点

• 长期、精确给药

• 电脑控制，程序式的释药

• 模拟正常胰腺分泌胰岛素模式

• 可实现基础输注剂量和餐前输注剂量

–类型

• Minimed公司 508型

• Disetronic公司 V100型

• Zyklomat轻便注射器

• Alzet渗透泵

• Lutrepulse机械泵25复

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• 环境敏感型给药系统

–物理敏感型

• 温敏

• 磁敏

–酶敏感型


• PEG化多肽、蛋白类注射给药

–改善药物在体内的药物动力学特征

–增加药物在体内的作用时间

–增加药物的溶解度和稳定性

–降低或消除免疫原性和毒副作用

–增加药物的治疗指数


• 其他注射给药系统

–脂质体

–纳米粒

–乳剂


蛋白多肽类药物非注射给药系统

• 黏膜给药系统–鼻腔给药系统

• 优势– 鼻腔内丰富的毛细血管和毛细淋巴管

– 鼻腔中大量的纤毛

– 相对较高的通透性

– 相对较低的酶活性

– 避开首过效应

– 易到达给药部位（与肺吸入相比）

• 缺点– 局部刺激性

– 对纤毛的妨碍和伤害

– 大分子药物吸收较少且不规则


• 提高鼻腔给药效果的方法– 吸收促进剂

• 胆酸盐类

• 非离子型表面活性剂

• 脂肪酸及其衍生物

• 磷脂类

• 环糊精及其衍生物

• 其他

– 酶抑制剂

– 延长药物在鼻腔内的滞留• 微球

• 亚微球

• 高分子材料或凝胶剂


• 已有的鼻腔喷雾剂

– 1995年FDA，降钙素鼻腔喷雾（Sandoz）

–胰岛素鼻腔喷雾Nazlin（加州生物工程公司）

–干扰素鼻腔喷雾剂

–疫苗的鼻腔免疫


• 肺部给药系统

–优势

• 具有巨大的可供吸收的表面积和丰富的毛细血管

• 酶活性低

• 避开了肝首过效应

• 对于肺部疾病具有更大的优势

–问题

• 肺部较脆弱，长期给药是问题

• 如何将药物全部输送到吸收部位

• 药物对肺部的局部作用

• 装置的问题


• 肺部给药的应用

–溶液或粉末吸入剂

–微球

–亚微粒与纳米粒

–脂质体


• 胰岛素肺部给药品种

– Pfizer， Exubera

– Novo Nordisk， AERx iDMs, Ⅲ期临床

–粉末吸入装置，Dura & Inhale


• 口服给药系统


• 限制多肽和蛋白类药物口服吸收的因素

–分子量大，亲水性强，难跨过生物膜

–胃肠内大量的酶降解

–肝脏的首过作用


• 胰岛素口服给药系统的研究

–生物粘附

–微粒给药系统

• 微球

• 纳米粒

• 微乳

• 脂质体

–肠溶制剂

–结肠定位

–促透剂和蛋白酶抑制剂的加入


• 口腔给药系统

• 直肠给药系统

• 其他给药系统


• 经皮给药系统

–离子导入

–超声波

–电穿孔

–传递体

–粉末经皮

• 无针注射

• 超音速导入


基因递送系统

• 基因（Gene）

–遗传信息的基本单位。一般指位于染色体上编码一个特定功能产物（如蛋白质或RNA分子等）的一段核苷酸序列。

• 基因治疗（Gene Therapy）

–依靠人源或外源的遗传物质，来纠正人类基因结构或功能上的错乱，阻止病变的发展，杀灭病变的细胞，或抑制外源病原体遗传物质的复制，从而实现对疾病的治疗。


基因治疗


• 基因治疗途径

– Ex vivo

• 将含外源基因的载体在体外导入人体自身或异体细胞，经体外细胞扩增后，再输入人体

– In vivo

• 将外源基因装配于适宜的载体传递系统，直接输入人体


• 基因治疗的关键

–目的基因

–靶细胞

–导入系统


• 基因递送屏障

–胞外屏障

• 载体进入机体到达靶细胞之前所遇到的屏障– 降解酶系统

– 吞噬系统

– 调理化作用

– 胞外粘膜层

–胞内屏障

• 靶细胞膜

• 内吞小泡

• 细胞核膜


• 基因导入方法

–物理导入法

• 电穿孔

• 直接注射

• 基因枪

• 微粒轰击

–化学导入法

• 给药系统

–生物学导入法

• 病毒载体


一般理化导入法

• 显微注射法

• 裸DNA注射法

• 电穿孔法

• 微粒轰击法

• 磷酸钙沉淀法


• 基因递送载体应具备的性质

–携带性能

–安全性

–缓释作用

–稳定性

–靶向性

–可促进目的基因从内吞小泡释放入胞浆

–可促进目的基因转运入核

–可调控基因输入后在体内的表达


基因递送的载体

• 病毒载体（Viral vector）

–野生型病毒经改造除去致病性后得到的基因输送系统

–转染效率高，安全性差

• 非病毒载体（Non-viral vector）

–安全性好

–转染效率低


病毒载体

• 逆转录病毒载体

• 腺病毒载体

• 其他病毒载体

–腺病毒相关病毒

–牛痘病毒基因载体

–单纯疱疹病毒载体


• 逆转录病毒（Retrovirus，RV）载体–优点

• 转染谱广，可以感染各种细胞类型

• 插入的外源基因可以完整的整合

• 对细胞感染率高

• 感染细胞后不产生病变，可建立细胞系长期持续表达外源基因

–不足• 只能整合至分裂相的细胞

• 可插入的外源基因较小，难以满足较大基因的插入

• 病毒滴度偏低

• 有产生野生型病毒或辅助病毒的可能


• 组成

–带有外源基因的重组逆转录病毒载体分子

–能已反式提供病毒结构蛋白的包装细胞

• 应用

–临床应用于抗肿瘤

–正研究导入脑瘤组织

– Ex vivo



• 腺病毒（Adenovirus）载体

–优点

• 安全

• 靶细胞范围广

• 滴度高

• 可以在肠道及呼吸道内繁殖，其重组病毒可由静脉注射、肠道吸收或气管内滴注多种方式给予

• 载体没有包膜，不易为补体所灭活

• 启动子功能强，能较高水平的表达外源基因


–不足

• 基因转移缺乏特异性

• 是一种非整合载体，对于非分裂相细胞，其介导的基因转移可持续表达几个月，但对于增殖旺盛的细胞，要达到长期的基因表达需要重复给予

• 重复给予时，可能产生机体的免疫应答

• 可能于其他血清型的腺病毒重组


• 构建

–人类血清5型腺病毒


非病毒载体

• 阳离子脂质体

• 阳离子纳米粒

• 阳离子聚合物

–聚赖氨酸

– PEI

–树枝状聚合物

–壳聚糖

• 受体介导的基因载体


• 阳离子脂质体

–中性磷脂

• 磷脂酰胆碱（PC）

• 磷脂酰乙醇胺（PE）

–阳性成分

• 硬脂胺（SA）

• DOTMA（(2,3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵）

• DOTAP（(2,3-二油氧基丙基)三甲基溴化铵）

• DC-Chol（3β[N-(N′,N′-二甲氨基乙基)氨甲酰基-胆固醇）

• DOSPA



• 影响阳离子脂质体转染的因素

–阳性成分的影响

–转染细胞的种类

–实验条件的影响


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