CARRERA DE ESPECIALIZACION EN BIOTECNOLOGIA …biotecnologiaindustrial.fcen.uba.ar/wp-content/uploads... · 2019. 8. 26. · CARRERA DE ESPECIALIZACION EN BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL

CARRERA DE ESPECIALIZACION EN

BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL

FCEyN-INTI

Docente a cargo: SANTAGAPITA, Patricio

CEBI_E1: Cromatografía

Materia de Especialización CEBI_E1

Técnicas de análisis en biotecnología

Módulo I: Moléculas pequeñas.

Módulo II: Macromoléculas.

Patricio Santagapita_CEBI_E1

Técnicas de Análisis

Temario clase de hoy

1. Conceptos básicos y tipos de columnas

2. Tipos de cromatografías

3. Instrumentación

Cromatografía

3

Muestreo y análisis

de las materias

primas

Análisis de

productos

intermedios

Monitorización de

la calidad de los

productos

Monitorización de

la calidad de los

efluentes



Cromatografía

4

• Técnica que permite separar los diferentes

componentes de una mezcla compleja.

• La separación se logra por diferencias en

la movilidad relativa de los solutos

(interacciones físicas y químicas entre los

componentes).



Cromatografía

5

Componentes involucrados:

– Fase estacionaria (FE)

– Fase móvil (FM)

– Soluto o muestra



Cromatografía



Generalidades/ terminología

FE. Columna de fase sólida ("matriz", "resina", por lo general algún

tipo de polímero, a menudo un polisacárido) colocado en un tubo de

vidrio

- adsorbente: material sólido o de la matriz, una "fase estacionaria"

a la que algunas moléculas se unen

- elución: el proceso de lavado de aquello que quedó absorbido

(con un buffer de elución)

Cromatografía

7

• Se pueden clasificar:

• De acuerdo al soporte

• Al tipo de equilibrio que se establece en la

separación

• Al estado de agregación de la fase móvil



Cromatografía



Cromatografía

Cromatografía

FM

LÍQUIDO

GAS

Cromatografía Líquida

(LC)

Cromatografía gaseosa

(CG o GC)



Tipos de cromatografías: se definen según los mecanismos de

interacción FM-FE.

a.Size exclusion chromatography (también llamada Molecular

Sieve o Gel filtration).

b. Afinidad: Affinity chromatography

b1. Hydrophobic interaction chromatography (HIC)

c. Intercambio iónico: Ion exchange chromatography (catiónica y

aniónica)

d. Adsorción (y fase reversa)

Cromatografía

– Adsorción superficial

– Partición

– Intercambio iónico

– Exclusión molecular



Tipos

Cromatografía – Tipos



Generalidades

Cromatografía

Por alguna razón (diferencias de radio hidrodinámico -tamaño + forma),

diferentes afinidades de unión de la columna de la matriz o por

interacciones electrostáticas), algunas moléculas se mantienen más

tiempo en la columna (y en ese caso eluyen posteriormente) y otras se

retienen menos (en ese caso eluyen antes).

Se pasa por la columna

una mezcla de proteínas



Cromatografía

• Constante de distribución(Kc)= relaciona la

concentración de un soluto entre la fase

móvil y la estacionaria.

Kc = Cs

CmConcentración del analito en

fase estacionaria

Concentración del

analito en fase móvil



Cromatografía

k= Tr – Tm

Tm

IMPORTANTE: k <<<<< a 1: soluto muy poco retenido

k entre 1 y 5: valor ideal

k 20 o mayor: cromatografías muy largas

Factor de retención (k) = permite comparar la velocidad

de migración de los diferentes solutos. Se puede

determinar experimentalmente.



Cromatografía

Dispersión Caminos múltiples

•Empaquetamiento

•Rango de tamaño de

partícula

•Diámetro de partícula



Cromatografía

Ensanchamiento a flujos bajos

Dispersión



Cromatografía

Transferencia de masa



Cromatografía

Dispersión

Ecuación de van Deemter:

Multiplicidad

de caminosDifusión longitudinal

Transferencia de masa



Cromatografía

(vel FM)

(altura

del

“plato”)



Cromatografía

A ∞ Ce dpCe = forma de la partícula

dp = diámetro de la partícula

B DMP

∞

DMP = difusividad de la FM

•Inversamente proporcional al flujo

•Importante en GC (DMP del gas elevada)

dt = diámetro de la columnaC

dt2

DMP

∞



Cromatografía

Cromatografía de exclusión molecular

Animación de la técnica (GE Healthcare)

https://www.youtube.com/watch?v=oV5VB5kO3tQ

BIORAD ©

Otra opción:

http://www.wiley.com/college/fob/quiz/quiz0

5/5-6.html

https://www.youtube.com/watch?v=oV5VB5kO3tQ

Principlos de

SEC• Las cápsulas o filtros moleculares se

basan en el tamaño y forma

• La separación de las moléculas se llama

fraccionamiento y se basa en el radio

hidrodinámico de la molécula

• El tamaño de poro de las cápsulas

determina el límite de exclusión y por lo

tanto lo que pasa POR las cápsulas o

ALREDEDOR de estas

BIORAD ©


Cromatografía



SEC

Hay varios tipos de beads (cápsulas) disponibles (hidratadas, de

polisacáridos porosos (dextrano, agarosa) o de poliacrilamida)

que cubren rangos muy amplios

El volumen de buffer requerido será función del radio

hidrodinámico de las moléculas. Si son de forma similar, la

separación será basicamente por tamaño

Cromatografía



SEC

Cromatografía

SIGMA ALDRICH ©

SEC• Las cápsulas de las columna poseen

poros pequeños. Hay tamaños de

poros variables

• Las moléculas más grandes que el

poro viajarán rápidamente por la

columna, ya que no entran entre los

poros

• Las moléculas más pequeñas que el

poro pasarán por estos y tardarán

mucho más tiempo en eluir de la

columna


Cromatografía

GRAN DIFERENCIA CON

ELECTROFORESISNelson & Cox, Lehninger Principles of

Biochemistry, 3rd ed.

SEC

Procedimiento

Existen kits

comerciales

fáciles de utilizar

BIORAD ©


Cromatografía

Principios de

SEC

BIORAD ©


Cromatografía

Asociar quién eluye

primero o después con

la “distancia” que

recorrió cada molécula

de una mezcla.

SEC

Ejemplo: mezcla

de: hemoglobina

y vitamina B12

• La hemoglobina posee color rojo-marrón

y su PM es de 65 KDa

• La vitamina B12 is rosa y su PM es de

1,35 KDa

• Si el límite de exclusión de las cápsulas

es de 60 KDa, quién eluye primero?


Cromatografía

BIORAD ©

La hemoglobina eluye primero, mientras

que luego la vitamina B12



SEC

Detección (caso del ejemplo)

Calibración de la columna

- construcción de curva de calibración a partir de la determinación

del volumen de elución en proteínas de PM conocido

- uso de estándar interno

Cromatografía



SEC

Det. PM polímero modificado (basado en alginato de sodio).

Cal. Patrones de pululanos en el rango de 5.800 a 1.600.000

Viny: 200 uL

Fase móvil:

Buffer pH7

Cromatografía



Cromatografía

Cromatografía de afinidad

Animación:

https://www.youtube.com/watch?time_

continue=7&v=FUAQKjKT99Y

Uso de ligandos específicos unidos

covalentemente a la columna

Fundamento de la separación: adsorción

reversible de los ligandos a la matriz

https://www.youtube.com/watch?time_continue=7&v=FUAQKjKT99Y



Cromatografía


Etapas (descripto en video)



Cromatografía

Ejemplos de columnas afinidad comerciales

SIGMA

ALDRICH ©



Cromatografía


Algunas propiedades físicas de las resinas utilizadas

Thermo Scientific ©



Cromatografía

Cromatografía de

Afinidad

BIORAD ©



Cromatografía

Cromatografía de

Afinidad • Usa tags de afinidad

- permiten que las moléculas se

unan a la columna

- pueden ser específicos hacia la

proteína de interés

• Aquellas proteínas que no se unen

pasan rápidamente por la columna

• Se usa un buffer para luego eluir

las proteínas que si se unieron

BIORAD ©

Ej.: inmunoafinidad



Cromatografía


Buffer de elución: dependiendo de la columna, se usan o una

diferencia en pH (se baja el mismo) o se utiliza un buffer con el

ligando libre específico de la columna (depende de disponibilidad/

costo) que compite por la unión en la columna con la molécula de

interés



Cromatografía


Thermo Scientific ©

Algunos ejemplos

de buffer de elución



Cromatografía


Si luego se debe separar las macromoléculas de ligandos

pequeños o realizar un cambio de buffer (si requiero pasar de una

columna a otra, por ej.): DIALISIS

(uso de membranas semi-permeables a diferenes PM)



Cromatografía


Nelson & Cox, Lehninger Principles of




Cromatografía


muy usadas:

- cromatografía de inmunoafinidad: se usan anticuerpos

inmobilizados en la columna

- polyHis tags= la columna posee iones Ni2+ (o Cu2+, Co2+ o Zn2+)

que unen al grupo imidazol de las histidinas puestas ad hoc en la

producción in vivo de proteínas recombinantes en el C-terminal.

Se utiliza luego un buffer con imidazol para eluir.

- cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC).

https://www.youtube.com/watch?v=v6SPK6ZovgA

https://www.youtube.com/watch?v=v6SPK6ZovgA



Cromatografía


Elusión usando buffer con imidazol – His tag proteins



Cromatografía


Elección de pH óptimo para elusión – IgG

(usando un gradiente)



Cromatografía

Cromatografía de

interacción

hidrofóbica

HIC

• Las cápsulas de la columna son

hidrofóbicas

• La columna se trata con un buffer de

elavada concentración salina

• Aquellas proteínas que son hidrofóbicas

se unen a las cápsulas

• Un buffer de bajo contenido de sal eluye

las proteínas menos hidrofóbicas

• Un buffer sin sales eluye las proteínas de

interés

BIORAD ©

Paso 1: HICLa muestra se adiciona

a la matriz junto con un

buffer de alto contenido

de sal

- Las proteínas hidrofóbicas

interactúan con la columna

- Los iones de la sal

interactúan con proteínas

menos hidrofóbicas y con

agua

Hydrophobic bead


Cromatografía

BIORAD ©

ej. proteína recombinante con GFP

1-2 M sulfato de amonio; 3 M cloruro de sodio

Paso 2: HIC

Lavar las proteínas

menos hidrofóbicas de

la columna con buffer

con bajo contenido de

sal

- Así se eluirán las proteínas

menos hidrofóbicas

- mi proteína de interés

quedará unida a la columna

O

S

O

O O- -

Hydrophobic

bead


Cromatografía

BIORAD ©

Paso 3: HIC

La proteína de

interés se eluye de la

columna con un

buffer sin sales

Hydrophobic

bead


Cromatografía

BIORAD ©

HIC


Cromatografía



Cromatografía


- polyHis tags

Purificación de una proteína con tag de histidinas a partir de un

extracto sin purificar.

Otro muy usado es GST tag (glutathione S-transferase), y muchas

veces se utilizan en combinación.

La enzima unirá a su substrato.

GST: 211 aa (26 kDa).



Cromatografía

Cromatografía de intercambio iónico

Animación de la técnica (GE Healthcare)

https://www.youtube.com/watch?v=q3fMqgT1do8

Ej. de resina aniónica (+)

http://www.wiley.com/college/fob/quiz/quiz05/5-5.html

Ej. general – independiente de la resina-

Fundamento de la unión: interacciones electrostáticas

https://www.youtube.com/watch?v=q3fMqgT1do8

http://www.wiley.com/college/fob/quiz/quiz05/5-5.html



Cromatografía

Cromatografía de

intercambio

iónico

• Las cápsulas de la columna

están cargadas:

-positivamente (+) - aniónica (ej.

grupos DEAE -dietilaminoetil-)

- negativamente (-) - catiónica (ej.

grupos carboximetilos (CM))

• Las moléculas a ser purificadas

deben poseer una carga opuesta

a las de las cápsulas de la

columna

• Aquellas moléculas que no se

unen a las cápsulas, pasan por la

columna rapidamenteBIORAD ©



Cromatografía

Cromatografía de intercambio

iónico

Columna catiónica (carga -)

Todo lo cargado en forma (-)

eluirá primero

Luego eluirá desde lo de menor

carga neta (+) hasta lo de

mayor carga neta (+)



Cromatografía


Las columnas presentan grupos cargados. Si los grupos

ionizables son ácidos o bases débiles → dependerán del pH del

buffer!

La fuerza de unión dependerá:

-carga neta de la proteína (pI)

-concentración de sales en el buffer (competencia con las

proteínas por los sitios de unión de la columna)



Cromatografía


Entonces,

Mientras mayor sea la diferencia (pH buffer y pI) →

> carga neta de la proteína al pH del buffer

→ más fuertemente se unirá a una carga opuesta en la matriz y

→ mayor es la concentración de sal en el buffer para eluirla

Eligiendo adecuadamente el buffer de elución (generalmente se

realiza un gradiente que incrementa la concentración o pH), se

pueden separar proteínas específicas de la columna en forma

diferencial



Cromatografía

Producción de proteínas (completo)



Cromatografía

Protocolo de purificación de proteínas



Cromatografía

Cromatografía de IEX+HIC+SEC

Ver animación

https://www.youtube.com/watch?v=KAkZG

pdmWio&feature=youtu.be

http://www.gelifesciences.com/gehcls_images/GELS/Related Content/Files/1314774443672/litdoc3Dkit.swf_20120420125305.swf

https://www.youtube.com/watch?v=KAkZGpdmWio&feature=youtu.be



Cromatografía

Ejemplo purificación para una enzima

Nelson & Cox, Lehninger Principles of


Adsorción:

fenómeno superficial, partículas de soluto

adsorbidas en la fase estacionaria


Cromatografía

d) Cromatografía de Adsorción

• FE: Sólidos muy porosos con capacidad

adsorbente

– Sílica

– Alúmina

• FM:

– Solventes orgánicos

Capacidad de carga

Presentaciones


Cromatografía

• Solvente y soluto compiten por los sitios de

adsorción en la fase estacionaria


Cromatografía


Cromatografía

Cromatografía de Adsorción

M. Sánchez-CEBI_1a 63

Cromatografía de Adsorción• La fuerza eluyente 0 es la energía de adsorción del disolvente por

unidad de superficie (sílica).

Solvente Fuerza de Elución

Fluorcalcanos -0.20

N-pentano 0.00

N-hexano 0.01

1-clorubutano 0.20

Benceno 0.20

Xileno 0.24

Cloroformo 0.26

Tolueno 0.28

Cloruro de metileno 0.32

Acetato de etilo 0.38

Tetrahidrofurano 0.44

Acetonitrilo 0.50

Metanol 0.70


Cromatografía

• Tipos de rellenos:Esférico Irregular


Cromatografía

Aplicaciones industriales:

– Separación de isómeros

– Análisis de compuestos poco solubles en agua

– LC preparativa


Cromatografía

Ejemplos


Cromatografía

Separación de cis y trans pirazolina. Columna 100 x 0.3 cm,

sílice pelicular. Fase móvil: 50% cloruro de metileno / isooctano.

Caudal 0.25 mL/min. Detector UV 254 nm.


Cromatografía

Ejemplos

Cromatografía en fase reversa



Cromatografía

THF

i-PROPANOL

ACETONAETANOL

ACETONITRILO

METANOLAGUA

LONGITUD DE

ONDA MINIMA UV212 nm

205 nm

330 nm210 nm

190 nm

205 nm190 nm

INDICE DE

REFRACCION1.405

1.384

1.3561.359

1.341

1.4571.333

FUERZA DE

SOLVENTE4.4

4.2

3.43.6

3.1

3.00.0



Cromatografía

Cromatografía en fase reversa

Fase Ligada

Fase

reversa

Fase

normal

C-18 Mas utilizada

en RP-HPLC

C-8 menor retención

que C18

C-3, C-4 Proteínas y

péptidos

CN compuestos de

polaridad

intermedia

NH2 hidratos de

Carbono



Cromatografía

Ejemplo

Efecto de la longitud de la cadena en la eficiencia

de las columnas de siloxano en fase inversa

empaquetadas con partículas de 5 m. Fase

móvil: 50/50 metanol/agua. Caudal 1 mL/min



Cromatografía

Algunas aplicaciones



Cromatografía

Caso: analitos ionizables (débiles)

pKa=4.6

Muy polar = menos retenidaMenos polar = más retenida

Variar pH de FM

Supresión de iones

Par iónico (IPC)



Cromatografía

Estrategias

Supresión de iones



Cromatografía

Cromatografía de Par Iónico• Utiliza una columna HPLC de fase reversa.

• Se añade a la FM un reactivo (alquilsulfonato) que se aloja en la FE convirtiéndola en un intercambiador iónico.

• Los iones del analito se pueden unir a la fase estacionaria por atracción electrostática con los iones del surfactante.

• Mecanismo de retención: mezcla de interacciones con fase reversa y de intercambio iónico.

SO3

SO3 N

R

R

R

H+

Na+

Fase unida Reactivo de par iónico

Muestra

N+

N+

O C R

O

H2PO4



Cromatografía

Longitud de cadena del reactivo de par iónico



Cromatografía



Cromatografía

Instrumentación (general)

Suministro de solventes:

Funciones básicas:

• Proveer flujo constante y preciso

• Proveer composiciones precisas de fase móvil

• Proveer la fuerza necesaria para empujar la FM a través del empaquetamiento compacto de la fase de la columna



Cromatografía

• Agua, soluciones buffer acuosas y solventes

orgánicos tales como metanol, acetonitrilo o

diferentes mezclas. Grado HPLC.

• FM sin elementos particulados. Evitar obstrucciones

en el sistema (conexiones muy estrechas, pistones

de zafiro y columna muy empaquetada)

Suministro de solventes:



Cromatografía



Cromatografía

Columnas• Columnas analíticas: diám. interno: 4.6 mm, < 0.1 mg muestra

• Columnas semipreparativas: diám. interno: 1 a 3 cm, de 1 a 200 mg

muestra

• Columnas preparativas diám. int.: varios cm. Solo para uso industrial.

Requieren equipo especial.

Cuidados físicos con la columna:

• No golpear la columna

• No dejar secar la columna


Cromatografía

Retomando…


Cromatografía


Cromatografía


Cromatografía


Cromatografía

Detectores• Basados en una PROPIEDAD física o físico-química DEL

SOLUTO (no la presenta la FM). Bastante selectivos y muy sensibles.

– UV

– Fluorescencia

– Electroquímicos

• Basados en una PROPIEDAD DE LA DISOLUCIÓN comparan el cambio global de alguna propiedad física de la FM con y sin soluto eluido. Responden a un conjunto amplio de solutos. Poco sensibles.

– Índice de refracción

– Conductividad



Cromatografía

Propiedades del detector

• Sensibilidad adecuada

• Respuesta lineal amplia

• Respuesta rápida y reproducible

• Manejo sencillo

• Límite de detección: relación señal/ruido. No solo depende del detector!

• Límite de cuantificación: límite de concentración más bajo para mediciones cuantitativamente precisas



Cromatografía

Rango lineal ó dinámico = LOL /LOQ



Cromatografía

UV-Visible

Ley de Beer: A = ɛ l c

Coeficiente de extinción

concentraciónlong. de la celda

ɛ sustancia

longitud de onda

Se analiza una longitud de onda por cada medición

Solvente!!Patricio Santagapita_CEBI_E1


Cromatografía

Detector UV por arreglo de diodos

Va realizando barridos completos del

espectro UV-Vis

Permite reprocesar el mismo cromatograma

detectando a diferentes l

Se puede obtener el espectro UV-Vis de

cada pico del cromatograma y compararlo

con una base de datos

Rtl

Abs



Cromatografía

Detector de fluorescenciaMuy sensibles y selectivos.

Dos l de trabajo:

-excitación

-emisión

Para analitos fluorescentes

(derivados)



Cromatografía

Detectores de índice de refracción

• ƒ Miden variaciones en el IR del

analito con respecto al de la

FM

• ƒ Sólo se pueden usar si la

elución es isocrática

• ƒ Son universales, pero tienen

baja sensibilidad



Cromatografía

Detectores de conductividad

•Aplicaciones: Iones,

ácidos, bases y sales

•ƒ Baja sensibilidad

•ƒ Sensibles a impurezas

de la fase móvil



Cromatografía

Detectores electroquímicos• Se basan en la reacción redox entre el analito y un

electrodo

• El nivel de reacción es proporcional a la

concentración del analito.

• Se mide y se compara con un electrodo de

referencia.



Cromatografía

Detectores por espectrometría de masas

• Introducción de la FM en cámara de vacío

• Vaporización previa de solvente

• Termovaporizador-ionizador

• Aplicable a compuestos termoestables y no volátiles

• Espectros de impacto electrónico


Cromatografía

Análisis cualitativo

Permite identificar los compuestos individuales

en la muestra

– El parámetro más común es su tiempo de retención

– Dependiendo del detector utilizado la identificación

se puede basar en la estructura química, molecular,

peso o algún otro parámetro molecular.



Cromatografía

Análisis cuantitativo• Detectores dan una respuesta proporcional a la cantidad de

sustancia (m):

• Respuesta = a x m

a: característico para cada sustancia

Como el componente atraviesa el

detector en un período de tiempo Área

f: factor de respuesta. Cantidad de

sustancia por unidad de área



Cromatografía

Análisis cuantitativo


Cromatografía

Tomado de AFO (QO-FCEN-UBA), 2013

Método del estándar externo

• Se preparan soluciones del estándar de concentración

conocida.

• Se grafica área vs. concentración

Debe verificarse el rango de linealidad de respuesta!!



Cromatografía




Cromatografía




Cromatografía


Método del estándar interno


Cromatografía


Método del estándar interno


Cromatografía




Cromatografía

Problemas



Cromatografía



Cromatografía



Cromatografía



Cromatografía

Análisis de paper

Ref: Balázs Bobály et, al. Recovery of proteins Affected by Mobile

Phase Trifluoroacetic Acid Concentration in Reversed-Phase

Chormatography. Journal of Chromatographic Science 2014;1–6.

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