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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA E QUÍMICA MEDICINAL – INSTITUTO DE CIÊNCIAS
BIOMÉDICAS
Carlos Eduardo da Silva Monteiro
Eficácia analgésica do novo agonista muscarínico
(LASSBio-981) em modelos de dor aguda, crônica
e tolerância antinociceptiva à morfina
Rio de Janeiro, 2015
ii
Carlos Eduardo da Silva Monteiro
Eficácia analgésica do novo agonista muscarínico
(LASSBio-981) em modelos de dor aguda, crônica
e tolerância antinociceptiva à morfina
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Farmacologia e Química Medicinal, Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade Federal do Rio de Janeiro, como requisito parcial à obtenção do título de Doutor em Ciências Biológicas (Farmacologia e Química Medicinal).
Orientadores: Prof. Dr. Eliezer Jesus de Lacerda Barreiro
Prof. Dr. Roberto Takashi Sudo
Rio de Janeiro, 2015
iii
FICHA CATALOGRÁFICA
Monteiro, Carlos Eduardo da Silva
Eficácia analgésica do novo agonista muscarínico (LASSBio-981) em
modelos de dor aguda, crônica e tolerância antinociceptiva à morfina /
Carlos Eduardo da Silva Monteiro. – Rio de Janeiro: UFRJ / ICB, 2015.
xvi , 103 f. : il. ; 31 cm.
Orientadores: Eliezer Jesus de Lacerda Barreiro, Roberto Takashi Sudo.
Tese (doutorado) -- UFRJ, Instituto de Ciências Biomédicas, Pós-Graduação em Farmacologia e Química Medicinal, 2015.
Referências bibliográficas: f. 80 – 103.
1. Dor Aguda - quimioterapia. 2. Analgésicos - farmacologia. 3. Modelos Animais de Doenças. 4. Dor Crônica - quimioterapia. 5. Receptor Muscarínico M2 - agonistas. 6. Morfina. 7. Ratos Wistar. 8. Animais. 9. Ciências Biológicas - Tese. I. Barreiro, Eliezer Jesus de Lacerda. II. Sudo, Roberto Takashi. III. Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Ciências Biomédicas, Pós-Graduação em Farmacologia e Química Medicinal. IV. Título.
iv
FOLHA DE APROVAÇÃO
Carlos Eduardo da Silva Monteiro
Eficácia analgésica do novo agonista muscarínico (LASSBio-981) em modelos de
dor aguda, crônica e tolerância antinociceptiva à morfina.
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Farmacologia e Química Medicinal, Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade Federal do Rio de Janeiro, como requisito parcial à obtenção do título de Doutor em Ciências Biológicas (Farmacologia e Química Medicinal).
Aprovada em 20 de Março de 2015.
Prof. Dr. Eliezer J. Barreiro, Faculdade de Farmácia, UFRJ.
(Orientador)
Prof. Dr. Nivaldo Ribeiro Villela, Faculdade de Ciências Médicas, UERJ.
Profa. Dra. Ana Maria Blanco Martinez, Faculdade de Medicina, UFRJ.
Profa. Dra. Patrícia Dias Fernandes, Instituto de Ciências Biomédicas, UFRJ.
Prof. Dr. Jorge Paes Barreto Marcondes de Souza, Faculdade de Medicina, UFRJ.
Profa. Dra. Lucienne da Silva Lara Morcillo, Instituto de Ciências Biomédicas, UFRJ. (Revisora)
v
DEDICATÓRIA
______________________________________________________________
A Deus por ter estado presente em minha vida.
Aos meus pais, Leda e Carlos pelo apoio, amizade, companheirismo, amor e
educação.
Aos meus irmãos pelo apoio e carinho.
Aos meus sobrinhos pelos momentos de brincadeiras e amor.
Aos meus avós pelo carinho, afeto e ensinamentos.
Aos meus amigos Fabiana, Vanessa, Cleide e Leandro pela amizade, apoio
incondicional e ensinamentos.
Aos meus tios pelo apoio e carinho.
vi
AGRADECIMENTOS
Aos meus orientadores Eliezer Barreiro e Roberto Takashi Sudo pela oportunidade,
ensinamentos e confiança no meu potencial.
As professoras Gisele Zapata-Sudo e Margarete Trachez pelos ensinamentos.
Aos Professores Doutores Carlos Alberto Manssour Fraga e Nailton Monteiro por
terem cedido de forma gentil as substâncias para este estudo.
À Doutoranda Roberta Tesch pela realização do estudo de ancoramento molecular.
À Professora Fernanda Antunes pela imensa ajuda e carinho.
Aos colegas do laboratório de Farmacologia: Sharlene, Kelvin, Jaqueline, Rachel,
Miguel Lemos, Josenildo Segundo, Guilherme, Allan, Nathália, Ananssa, Carla,
Daniela, Michele, Taís Frazão, Flávia e Thaiana.
Aos técnicos de laboratório Marly, Orlando e Tadeu pela ajuda e ensinamentos.
Aos colegas do LASSBio.
Ao Laboratório de Avaliação e Síntese de Substâncias Bioativas (LASSBio).
Ao CNPq, INCT-INOFAR e FAPERJ pelo apoio financeiro.
vii
Lista de ilustrações
Figura 1. Classificação da dor. 2
Figura 2. Classificação dos nociceptores. 3
Figura 3. Sensibilização periférica. 7
Figura 4. Desenvolvimento da hiperalgesia e alodinia. 8
Figura 5. Sensibilização central. 9
Figura 6. Corno dorsal da medula espinal. 11
Figura 7. Mecanismos centrais da dor. 12
Figura 8. Teoria do controle do portão. 13
Figura 9. Ativação e regulação dos receptores acoplados a proteína G. 17
Figura 10. Receptores muscarínicos e nicotínicos. 25
Figura 11. Estruturas químicas dos derivados (LASSBio-872, LASSBio-873, LASSBio-980 e LASSBio-981) e o protótipo zolpidem 30
Figura 12. Placa Quente. 33
Figura 13. Ligadura do 50 nervo lombar espinal. 35
Figura 14. Mini-bombas osmóticas. 36
Figura 15. Equipamento utilizado para avaliar a latência de retirada da pata. 38
Figura 16. Analgesímetro digital. 39
Figura 17. Equipamento utilizado para avaliar a atividade locomotora. 40
Figura 18. Atividade analgésica do LASSBio-981 no teste da placa-quente. 43
Figura 19. Atividade analgésica da morfina na placa-quente. 43
Figura 20. Efeito antinociceptivo da associação LASSBio-981 e morfina no teste da placa-quente. 44
Figure 21. Regressão linear do Log das doses do LASSBio-981, morfina e associação. 45
Figura 22. Isobolograma da interação entre LASSBio-981 e morfina no teste da placa-quente. 45
Figura 23. Curso temporal do efeito antinociceptivo do tramadol (10 mg/kg) + amitriptilina (10 mg/kg) em ratos LNE com hiperalgesia. 47
Figura 24. Curso temporal do efeito antinociceptivo do tramadol (10 mg/kg) + amitriptilina (10 mg/kg) em ratos LNE com alodinia. 48
Figura 25. Curso-temporal do efeito antinociceptivo do LASSBio-981 no teste de estimulação térmica e mecânica em ratos com LNE. 49
Figura 26. Efeito antinociceptivo do LASSBio-981 (10 mg/kg) + tramadol (10 mg/kg) em ratos LNE com hiperalgesia. 50
Figura 27. Atividade antinociceptiva do LASSBio-981 (10 mg/kg) + tramadol (10 mg/kg) em ratos LNE com alodinia. 51
viii
Figura 28. Efeito antinociceptivo do LASSBio-981 (10 mg/kg) + amitriptilina (2.5 mg/kg) em ratos LNE com hiperalgesia. 52
Figura 29. Efeito antinociceptivo do LASSBio-981 (10 mg/kg) + amitriptilina (2.5 mg/kg) em ratos com alodinia causada pela LNE. 53
Figura 30. Atividade antinociceptiva do LASSBio-981 (20 mg/kg) + amitriptilina (2.5 mg/kg) em ratos LNE com hiperalgesia. 54
Figura 31. Atividade antinociceptiva do LASSBio-981 (20 mg/kg) + amitriptilina (2.5 mg/kg) em ratos com alodinia causada pela LNE. 55
Figura 32. Curso temporal de desenvolvimento da tolerância à morfina. 57
Figura 33. LASSBio-981 previne a hiperalgesia em ratos LNE tolerantes à morfina. 58
Figura 34. LASSBio-981 previne a alodinia em ratos LNE tolerantes à morfina. 59
Figura 35. Reversão da hiperalgesia promovida pelo LASSBio-981 em ratos tolerantes à morfina. 60
Figura 36. Reversão da alodinia promovida pelo LASSBio-981 em ratos tolerantes à morfina. 60
Figura 37. Curso temporal da atividade analgésica do LASSBio-981 administrado por via intratecal. 61
Figura 38. Mecanismo de ação do LASSBio-981 no modelo de tolerância à morfina. 62
Figura 39. Efeito antinociceptivo do LASSBio-981 na hiperalgesia induzida pela diabetes. 64
Figura 40. Efeito antinociceptivo do LASSBio-981 na alodinia induzida pela diabetes. 65
Figura 41. Atividade locomotora de ratos tratados por 7 dias com LASSBio-981. 66
Figura 42. Superposição da conformação de QBN no receptor muscarínico M2 e sobreposição de β-FNA cocristalizado na estrutura do cristal do receptor µ-opióide. 67
Figura 43. Interações moleculares do LASSBio-981 no sítio ativo do receptor muscarínico M2 e receptor µ-opióide. 68
Figura 44. Subtipos dos receptores muscarínicos. 73
Lista de tabelas
Tabela 1. Avaliação do LASSBio-981 na glicemia e massa corporal em ratos diabéticos. 63
ix
ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
% AA - Percentual de atividade analgésica
AMPA - Ácido alfa-amino-3-hidróxi-5-metil-4- isoxazol propiônico
AMPc - Adenosina 3',5' monofosfato cíclico
ATP - Adenosina trifosfato
β-FNA- β-fulnatrexamina
Ca2+ - Cálcio iônico
CaM-KII - Proteína cinase dependente de cálcio/calmodulina
CGRP - Peptídeo relacionado ao gene da calcitonina
COX2 - Ciclo-oxigenase-2
DMSO - Dimetilsulfóxido
GRD - Gânglio da raíz dorsal
ERK - Proteína cinase regulada por sinais extracelulares
FMA - Forbol-12-miristato-13-acetato
GABA – Ácido gama amino-butírico
His- Histidina
IASP – Associação internacional para o estudo da dor
IIe- Isoleucina
IL-1A - Interleucina do tipo 1A
IL-1β - Interleucina do tipo 1 beta
i.p. - Via intraperitoneal
i.t. - Via intratecal
KATP - Canal de potássio sensível a ATP
K+ - Potássio iônico
Kv 4.2 - Canal de potássio do tipo 4.2 controlado por voltagem
LASSBio - Laboratório de Avaliação e Síntese de Substâncias Bioativas
LNE - Ligadura do nervo espinal
LPS – Lipopolissacarídeo
Lys- Lisina
L4 – 4o nervo lombar espinal
L5 – 5o nervo lombar espinal
L6 – 6o nervo lombar espinal
mGluR - Receptor metabotrópico de glutamato
x
Nav - Canal de sódio controlado por voltagem
NE - Norepinefrina
NK1 - Receptor da neurocinina 1
NMDA - receptor N-metil-D- aspartato
PAG - Substância cinzenta periaquedutal
PDB - Banco de dados de proteínas
PLCβ - Fosfolipase C beta
PKA - Proteína cinase A
PKC - Proteína cinase C
QBN- 3 quinuclidinil-benzilato
RMSD- Root Mean Square Deviation (desvio da raiz média quadrática)
RT-PCR - Reação em cadeia da polimerase via transcriptase reversa
s.c. - Via subcutânea
SRC - Proteína cinase citosólica
5-HT - Serotonina
STZ - Estreptozotocina
Thr- Treonina
TNF- - Fator alfa de necrose tumoral
Tyr - Tirosina
Trp – Triptofano
TRPV1 – Receptor de potencial transiente vanilóide do tipo 1
v.o. - Via oral
xi
Resumo
Carlos Eduardo da Silva Monteiro. Eficácia analgésica do novo agonista muscarínico (LASSBio-981) em modelos de dor aguda, crônica e tolerância antinociceptiva à morfina. Rio de Janeiro, 2015. Tese (Doutorado em Ciências
Biológicas, Farmacologia e Química Medicinal) - Programa de Pós-graduação em Farmacologia e Química Medicinal do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade Federal do Rio de Janeiro.
A dor neuropática é uma doença crônica incapacitante que atinge 7 a 8% da
população mundial, resultando em custo anual para a saúde de mais de 3 bilhões de
dólares. Tratamento eficaz da dor neuropática ainda é um desafio da medicina.
Apenas cerca de 50% dos pacientes tem alívio parcial dos sintomas. Diferentes
classes de fármacos como opióides, antidepressivos tricíclicos, anestésicos locais e
anticonvulsivantes que atuam em diferentes alvos vêm sendo usados isoladamente
ou na maioria das vezes de forma combinada. Utilizando-se de estratégias da
química medicinal, o Laboratório de Avaliação e Síntese de Substâncias Bioativas
(LASSBio) da Universidade Federal do Rio de Janeiro tem planejado e sintetizado
novas substâncias com perfil analgésico. Estudos anteriores caracterizaram a
atividade analgésica de 4 novos derivados heterocíclicos obtidos por modificações
bioisostéricas na molécula do zolpidem (LASSBio-872, LASSBio-873, LASSBio-980
e LASSBio-981) em modelos de dor aguda, inflamatória e crônica, em camundongos
e ratos. O presente projeto teve como objetivo avaliar a atividade antinociceptiva do
LASSBio-981, administrado pela via oral, em modelos animais de dor aguda,
neuropática e de tolerância antinociceptiva à morfina. Usando a placa quente como
modelo de dor aguda pode-se demonstrar atividade analgésica dose-dependente do
LASSBio-981 em camundongos e, por meio da construção de isobolograma, a sua
interação aditiva com a morfina. Em modelo de dor neuropática em ratos induzida
pela ligadura de nervo espinal em L5, LASSBio-981 reverteu sinais de hiperalgesia
térmica e alodinia mecânica e este efeito foi aumentado na presença do inibidor da
recaptação neuronal de noradrenalina e serotonina, amitriptilina, porém, não na do
agonista de receptor opióide e inibidor da recaptação de noradrenalina, tramadol.
LASSBio-981 também reverteu sinais de hiperalgesia térmica e mecânica em ratos
diabéticos induzidos pela estreptozotocina, sem alterar a aumentada concentração
plasmática de glicose. LASSBio-981 preveniu e reverteu sinais de tolerância
antinociceptiva a morfina induzida pela sua infusão crônica intraperitoneal por meio
xii
de bomba osmótica implantada na cavidade abdominal. Este efeito foi revertido pela
administração intratecal de metoctramina, sugerindo o receptor muscarínico M2
como alvo de ação do LASSBio-981, hipótese reforçada pelo estudo de ancoragem
molecular (docking) computacional. Efeito depressor da atividade motora que
pudesse interferir na mensuração da atividade antinociceptiva causada pela
administração prolongada de LASSBio-981, não foi reproduzido em modelo de
campo aberto. Em conclusão, este trabalho apresenta uma nova substância,
planejada a partir da molécula do zolpidem, denominada LASSBio-981, candidata ao
desenvolvimento de um fármaco agonista de receptor muscarínico M2, voltado ao
tratamento de dor crônica e da tolerância à morfina.
Palavras-chaves: Analgesia, hiperalgesia, alodinia, neuropatia, tolerância, morfina e receptor muscarínico M2.
xiii
Abstract
Carlos Eduardo da Silva Monteiro. Analgesic efficacy of new muscarinic agonist (LASSBio-981) in models of acute and chronic pain, and antinociceptive tolerance to morphine. Rio de Janeiro, 2015. Tese (Doutorado em Ciências Biológicas, Farmacologia e Química Medicinal) - Programa de Pós-graduação em Farmacologia e Química Medicinal do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade Federal do Rio de Janeiro. Neuropathic pain is a chronic disabling disease that affects about 7-8% of the
general population, resulting in an annual cost for health higher than 3 billion dollars.
Effective treatment of neuropathic pain is still a big challenge in medicine and only
approximately 50% of patients have some relief of symptoms. The treatment involves
the administration of one or more drugs from different pharmacological classes, such
as opioids, tricyclic antidepressants, anticonvulsants and local anesthetics. Using the
medicinal chemistry tools the Laboratório de Avaliação e Síntese de Substâncias
Bioativas (LASSBio) from Universidade Federal do Rio de Janeiro has synthetized
new compounds designed as analgesics. Previous studies characterized the
analgesic activity of four new heterocyclic derivatives by bioisosteric changes in the
molecule of zolpidem (LASSBio-872, LASSBio-873, LASSBio-980 and LASSBio-981)
in acute, inflammatory and chronic models of pain in mice and rats after
intraperitoneal administration. The aim of this study was to evaluate the
antinociceptive activity of LASSBio-981, orally administered, in animal models of
acute and neuropathic pain, and in model of tolerance to morphine. In acute pain
model of hot plate test in mice, oral administration of LASSBio-981 caused a dose-
dependent antinociceptive effect, and the isobolographyc analysis showed additive
interaction of this compound with morphine. LASSBio-981 reverted thermal
hyperalgesia and mechanical allodynia signs induced by L5 spinal nerve ligation
(SNL) model in rats and this effect was increased by simultaneous treatment with
amitriptyline, an inhibitor of norepinephrine and serotonine uptake, but not by
tramadol, an opioid receptor agonist and inhibitor of norepinephrine uptake.
Furthermore, LASSBio-981 reverted thermal hyperalgesia and mechanical allodynia
signs in streptozotocine-induced diabetic models in rats without reducing the
increased blood glucose level found in those animals. Prolonged morphine infusion
trough an osmotic mini-pump implanted in the abdominal cavity induced tolerance to
the antinociceptive effect in rats submitted to SNL. Oral intake of LASSBio-981
xiv
completely avoided and prevented the morphine-induced tolerance, which was
abolished by intrathecal injection of metoctramine supporting the hypothesis of
involvement of activation of muscarinic M2 receptor induced by LASSBio-981.
Prolonged treatment with LASSBio-981 did not reduce the motor activity of rats
measured in an open field device. Thus, there is no relationship of LASSBio-981-
induced antinociception with impairment of motor activity. As conclusion, this study
introduced a new compound, designed from the zolpidem molecule, nominated
LASSBio-981, candidate for development as an agonist of muscarinic M2 receptor
useful for the treatment of chronic pain and tolerance to morphine.
Key-words: Analgesia, hyperalgesia, allodynia, neuropathy, tolerance, morphine and M2 muscarinic receptor.
xv
SUMÁRIO
Abreviaturas, siglas e símbolos ix
Resumo xi
Abstract xiii
1 Introdução 1
1.1 Dor e nocicepção 1
1.2 Fisiopatologia da dor 2
1.2.1 Nociceptores 2
1.2.2 Neurotransmissores 5
1.2.3 Sensibilização periférica 6
1.2.4 Sensibilização central 8
1.2.5 Corno dorsal da medula espinal 10
1.2.6 Vias ascendentes nociceptivas 11
1.2.7 Neuromodulação da dor 12
1.3 Modelos de dor neuropática 14
1.3.1 Lesão do nervo espinal 15
1.3.2 Neuropatia diabética 15
1.4 Alvos farmacológicos para tratamento da dor neuropática 16
1.5 Tratamento da dor crônica 25
1.5.1 Tolerância antinociceptiva à morfina 27
1.6 Derivado Pirazolo [3,4-b]Pirrolo [3,4-d]Piridina 29
2 Objetivos 31
3 Materiais e métodos 32
3.1 Animais 32
3.2 Substâncias 32
3.3 Modelo de dor aguda 32
xvi
3.4 Modelos de dor neuropática 34
3.5 Atividade locomotora 40
3.6 Ancoramento molecular do LASSBio-981 na estrutura cristalográfica dos
receptores muscarínico M2 e µ opióide 40
3.7 Análise estatística 42
4.0 Resultados 42
4.1 Modelo de dor aguda 42
4.1.1 Placa-quente 42
4.1.1.1 Análise da interação do LASSBio-981 e morfina 44
4.2 Modelos de dor neuropática 46
4.2.1 Ligadura do nervo espinal 46
4.2.1.1 Combinação entre amitriptilina e tramadol 46
4.2.1.2 Combinação entre LASSBio-981 e tramadol 48
4.2.1.3 Combinação entre LASSBio-981 e amitriptilina 52
4.2.2 Tolerância antinociceptiva à morfina 56
4.2.3 Neuropatia diabética 62
4.3 Atividade locomotora 65
4.4 Ancoramento molecular do LASSBio-981 nos receptores muscarínico M2 e µ
opióide 66
5 Discussão 68
6 Conclusões 79
Referências 80
1
1 INTRODUÇÃO
1.1 Dor e Nocicepção
A dor é definida pela Associação Internacional para Estudo da Dor (IASP,
2012) como sendo uma experiência sensorial ou emocional desagradável associada
a um dano tecidual real ou iminente, sendo classificada em: aguda, inflamatória e
crônica. A dor aguda, também é denominada por alguns autores de nociceptiva, de
natureza localizada, de alta intensidade e que desaparece com a cessação do
estímulo, exerce função protetora alertando o indivíduo sobre a existência de um
estímulo agressivo.
A dor inflamatória, muitas vezes secundária ao insulto primário, resulta da
contribuição de um conjunto de mediadores químicos liberados no sítio da lesão
tecidual primária (Figura 1). O estímulo gerado na região inflamada é propagado
pela mesma via responsável pela dor aguda (SOMMER, 2004). Vários mediadores
da dor inflamatória têm sido bem caracterizados e as suas funções bem definidas.
Algumas citocinas pró-inflamatórias, tais como a IL-1A e TNF-, quimiocinas,
espécies reativas de oxigênio, aminas vasoativas, lipídeos, ATP, ácidos e outros
fatores são liberados pelos leucócitos recrutados, pelas células endoteliais e pelos
mastócitos teciduais (MA; GREENQUIST; LAMOTTE, 2006). A dor aguda e a dor
inflamatória são também conhecidas como dor fisiológica, tendo ambas o intuito de
preservar a integridade do indivíduo.
A dor crônica é caracterizada por longa duração e sua gênese é multifatorial
(figura 1). Ela se estabelece quando há perda do papel fisiológico de proteção e
reparo celular, tornando-a patológica (WOOLF, 2010). Diferente de outros sentidos
experimentados pelo homem, a dor é altamente individual e subjetiva (FOULKES e
WOOD, 2008; LACROIX-FRALISH e MOGIL, 2009). A nocicepção se refere às
informações sensoriais que chegam ao sistema nervoso central resultante da
ativação dos receptores sensoriais especializados, denominados nociceptores,
comunicando ao cérebro sobre os estímulos nocivos. A nocicepção envolve
processos neurais e a percepção do estímulo nociceptivo como dor pode ser
modulada por aspectos comportamentais como, por exemplo, o estresse (RODITI e
ROBINSON, 2011).
2
Figura 1. Classificação da dor em aguda, inflamatória e crônica (neuropática). A dor é iniciada por diferentes estímulos que são transduzidos em sinais elétricos, transmitidos ao corno dorsal, e em seguida ao córtex, para que ocorra a percepção do estímulo como doloroso. Modificado de Scholz e Woolf (2002).
1.2 Fisiopatologia da dor
1.2.1 Nociceptores
Nociceptores são receptores presentes nas terminações nervosas livres de
fibras C não mielinizadas, fibras Aδ levemente mielinizadas e fibras Aβ mielinizadas,
sendo ativados por diferentes estímulos (BASBAUM et al., 2009). Os nociceptores
estão distribuídos em diferentes órgãos e tecidos, sendo ativados por estímulos
químicos, térmicos e mecânicos, e modulados por uma variedade de peptídeos
endógenos como bradicinina, substância P e peptídeo relacionado ao gene da
calcitonina. Mecanoceptores são ativados especificamente por estímulos mecânicos
(tato e pressão), enquanto os termoceptores são ativados por temperaturas em torno
de 43-45 oC. Nociceptores polimodais estão presentes em fibras C (Figura 2a), e são
ativados com alto limiar para geração e propagação do estímulo nociceptivo (DUBIN
e PATAPOUTIAN, 2010). Os nociceptores que respondem a estímulos mecânicos e
3
frios são referidos como fibras mecano-frio (Figura 2b), e nociceptores que não
respondem ao estímulo mecânico (Figura 2c) são conhecidos como insensíveis ao
estímulo mecânico (GOLD e GEBHART, 2010).
Após a redução do limiar de ativação por diferentes substâncias, as fibras C
convertem um estímulo nocivo em despolarização de membrana gerando potencial
de ação. Os nociceptores podem ser ativados por substâncias exógenas e
endógenas, tais como: mediadores inflamatórios (bradicinina e prostaglandinas),
neurotransmissores (aminoácidos excitatórios, neurocininas, serotonina,
noradrenalina e histamina) e fatores de crescimento (fator de crescimento do nervo).
A condução do estímulo nociceptivo é iniciada após a ativação dos nociceptores, e a
informação transmitida ao cérebro para que haja a percepção e reconhecimento do
estímulo como doloroso (BASBAUM et al., 2009).
Figura 2. Classificação dos nociceptores quanto às características bioquímica, fisiológica e anatômica. As fibras aferentes que respondem aos estímulos térmico, químico e mecânico são classificadas como nociceptores polimodais (a), as fibras que respondem aos estímulos mecânico e frio são conhecidas como mecano-frio (b), e fibras que não respondem aos estímulos mecânicos como insensíveis ao estímulo mecânico (c). RTK, receptor tirosina cinase; SK, canal de potássio dependente de Ca2+ de pequena condutância; VGCC, canal de Ca2+ controlado por voltagem. Modificado de Gold e Gebhart (2010).
4
Os receptores de potencial transiente (TRP) são uma família de canais que
possuem cinco subfamílias (receptores de potencial transiente de ankirina, canônico,
melastatina, policistina e vanilóide) em mamíferos e roedores. Os TRPs têm função
efetora, mediando à excitação da célula em resposta a ativação dos receptores
acoplados a proteína G e outros canais. Os receptores são transdutores primários
de estímulo térmico, mecânico e químico (BENEMEI et al., 2013). As propriedades
sensoriais dos mecanorreceptores, termorreceptores e quimiorreceptores têm sido
avaliadas em modelos de dor e nocicepção (WANG e WOOLF, 2005).
O estímulo nociceptivo gerado na periferia é propagado para o sistema nervoso
central, por meio de potenciais de ação gerados nas fibras nervosas, pela abertura
de canais de Na+ voltagem dependentes (Nav). Os canais são classificados de
acordo com a suscetibilidade de inibição pela tetrodotoxina (neurotoxina que
bloqueia os potenciais de ação gerados pelos canais Nav): TTX-Sensível (TTX-S) e
TTX-Resistente (TTX-R) (KENNEDY, 2007). Existem nove isoformas (Nav 1.1 a Nav
1.9), onde os canais, Nav 1.2, Nav 1.6 e Nav 1.7 que se expressam regularmente nos
neurônios periféricos e o Nav 1.3 na condição de dano do nervo, são classificadas
como tetrodotoxina-sensível (WILSON et al., 2011). Os canais tetrodotoxina-
resistentes, Nav 1.8 e Nav 1.9 se expressam em neurônios de pequeno diâmetro. O
Nav 1.8 tem elevado limiar de excitação e de inativação, e se ativa e inativa
lentamente. Na lesão dos nervos, o curso temporal de ativação e reativação deste
canal está aumentado facilitando a geração de estímulos de alta frequência (LAI et
al., 2004).
Os canais de Ca2+ exercem função importante na transmissão do estímulo
nociceptivo. A despolarização da membrana abre os canais de Ca2+ controlado por
voltagem (Cav), permitindo o rápido influxo de Ca2+. O aumento da concentração
intracelular de Ca2+ regula numerosos processos fisiológicos, dentre eles liberação
de neurotransmissores e neuropeptídeos, plasticidade e excitabilidade neuronal. Os
canais Cav são complexos de multi-proteínas com subunidades α1 formando poro,
como parte central, cercada pelas subunidades α2δ, β e γ. A subunidade α1 contêm
quatro domínios transmembrana conservados que estão ligados por sequências
citoplasmáticas variáveis (KNIGHT et al., 2002; LUVISETTO et al., 2006). A
diversidade molecular dos canais Cav é o resultado de múltiplos genes que codifica
cada subunidade (CAO, 2006). Apesar dessa diversidade molecular, todos os canais
5
Cav estão divididos em duas categorias: ativados por alta voltagem, incluindo os
canais de Ca2+ do tipo L, N, P/Q e R que requerem ampla despolarização para
ativação, enquanto os canais de Ca2+ do tipo T são ativados por menores
despolarizações para ativação (LUVISETTO et al., 2006). A busca por novos
candidatos a fármacos para tratamento da dor tem explorado o bloqueio desses
canais com intuito de inibir a liberação de neurotransmissores excitatórios. O
ziconotídeo (peptídeo analgésico isolado de um molusco marinho) é exemplo de
bloqueador do canal Cav do tipo N (MILJANICH, 2004).
Estudos têm demonstrado a importância dos canais de K+ na dor (KAWANO
et al., 2009; ZOGA et al., 2010). Os canais de K+ do tipo M têm como função
controlar o potencial de membrana em repouso e a excitabilidade dos neurônios a
nível periférico e central (DELMAS et al., 2005). Tem-se mostrado que canais de K+
sensível a ATP (KATP) modulam respostas à dor (RODRIGUES e DUARTE, 2000).
Canais KATP podem mediar o efeito analgésico da morfina, sendo esse efeito
revertido pelo pré-tratamento com antagonista seletivo de KATP (RODRIGUES e
DUARTE, 2000).
1.2.2 Neurotransmissores
Os neurotransmissores são aminoácidos e neuropeptídeos liberados pelas
terminações aferentes primárias no corno dorsal da medula espinal, nos
interneurônios e nas vias supraespinais, onde modulam a transmissão nociceptiva.
Os aminoácidos excitatórios liberados pelas fibras aferentes primárias ativam os
neurônios de segunda ordem no corno dorsal, resultando em respostas reflexas
espinais e a ativação dos tratos ascendentes (TODD, 2010). Os tratos ascendentes
são responsáveis pela transmissão da informação nociceptiva da medula espinal
para os centros cerebrais superiores, tálamo e córtex somatossensorial (WU et al.,
2010).
As principais substâncias liberadas no corno dorsal são os aminoácidos
excitatórios glutamato e aspartato, o neuropeptídeo substância P e o peptídeo
relacionado ao gene da calcitonina (CGRP); e aminoácidos inibitórios gama-amino-
butírico (GABA) e glicina (TAYLOR, 2009a). L-glutamato e L-aspartato são os
neurotransmissores excitatórios importantes no sistema nervoso central. O L-
glutamato é liberado pelas fibras aferentes primárias, tendo efeito excitatório sobre
6
os neurônios pós-sinápticos, e estão envolvidos na fisiopatologia da dor crônica
(TODD, 2010). O L-glutamato atua em receptores ionotrópicos (NMDA, AMPA e
cainato) e metabotrópicos (mGluR), modifica a excitabilidade neuronal e glial através
das subunidades da proteína G, ativando canais iônicos e segundos mensageiros
como diacilglicerol e AMPc (D’ANTONI et al., 2008).
1.2.3 Sensibilização periférica
Mediadores inflamatórios ativam mecanismos de transdução de sinal
intracelular no nociceptor terminal, aumentando a produção, transporte e inserção de
canais transdutores de sinais, e canais iônicos controlados por voltagem na
membrana (FISCHER; MAK; MCNAUGHTON, 2010). O limiar para ativação é
reduzido e a excitabilidade da membrana aumentada para estímulo térmico e
mecânico. Nociceptores medeiam a resposta a estímulos periféricos através dos
terminais nervosos sensoriais (Figura 3). Entretanto, lesões do nervo periférico
refletem na sensibilização desses nociceptores e aumento da excitabilidade na
membrana (COSTIGAN; SCHOLZ; WOOLF, 2009).
O receptor potencial transiente vanilóide 1 (TRPV1) é um canal de cátion não
seletivo, ativado por capsaicina, calor nocivo e prótons (baixo pH). Mediadores
inflamatórios sensibilizam o canal TRPV1, promovendo a sensibilização das fibras
aferentes primárias. Além disso, os mediadores inflamatórios atuam sobre
receptores acoplados a proteínas G ou vias da tirosina cinase ativando assim a
fosfolipase C e/ou a fosfolipase A2, que, por sua vez, estimula o metabolismo do
ácido araquidônico (JULIUS e BASBAUM, 2001; HUANG; ZHANG; MCNAUGHTON,
2006).
A hipersensibilidade mecânica observada em camundongos submetidos à
injúria constritiva crônica (ICC) parece estar relacionada a ativação do TRPV1 uma
vez que este efeito foi revertido pela administração intratecal do antagonista TRPV1.
Alem disto, camundongos deficientes em TRPV1 (TRPV1-/-) tiveram a
hipersensibilidade atenuada após a injúria constritiva crônica (KIM et al., 2012).
Alterações plásticas ocorrem após a liberação de várias moléculas tais como,
peptídeos relacionados ao gene da calcitonina, bradicinina, prostaglandinas,
serotonina, histamina, H+ e ATP, no sítio de dano tecidual, causando alterações nos
neurônios sensoriais (MALIN et al., 2006; LI et al. 2008; JANKOWSKI et al., 2009).
7
Essas alterações estão relacionadas com o desenvolvimento da hiperalgesia e
alodinia (Figura 4), sendo esse mecanismo celular comum a diferentes modelos
animais de dor persistente incluindo a injúria constritiva crônica (WILSON-GERWING
et al., 2008; ZHANG et al., 2008), axotomia dos nervos periféricos (MICHALSKI;
BAIN; FAHNESTOCK, 2008; JANKOWSKI et al., 2009) e ligadura do nervo espinal
(SHIM et al., 2005; FUKUOKA et al., 2012). Existem vários mecanismos moleculares
envolvidos na sensibilização do nociceptor após a lesão, dentre eles, o fator
neurotrófico derivado da célula da glia. Os níveis do fator neurotrófico são alterados
no local da lesão e nos gânglios da raiz dorsal (MALIN et al., 2006; JANKOWSKI et
al., 2009). Diversos estudos demonstram aumento da expressão do fator de
crescimento neuronal no tecido nervoso periférico após inflamação e lesão do nervo
(MALIN et al., 2006; NICOL e VASKO 2007; PATERSON et al., 2009; JANKOWSKI
et al., 2009).
Figura 3. Sensibilização periférica. A nocicepção poder ser produzida por estímulos nocivos que ativam nociceptores de alto limiar, ou mediadores inflamatórios resultantes de um dano tecidual, tais como: bradicinina ou prostaglandinas. Esses mediadores podem se ligar a receptores acoplados a proteína G e induzir ativação das proteínas cinases A e C em nociceptores de fibras nervosas periféricas, na qual fosforilam os canais iônicos e receptores. O limiar de ativação dos receptores transdutores de sinal, como por exemplo, TRPV1 é reduzido e a excitabilidade da membrana da fibra nervosa é aumentada, produzindo um estado de sensibilização periférica. Adaptada de Scholz e Woolf (2002); e Hehn, Baron e Woolf (2012).
8
Figura 4. A hipersensibilidade da fibra aferente primária após a lesão do nervo resulta no aumento da transmissão sináptica e redução do mecanismo inibitório da dor. A amplificação dos estímulos nociceptivos promove o aumento da resposta à dor a estímulos nocivos (hiperalgesia), enquanto que os neurônios de segunda ordem que só transmitiam impulsos de alto limiar passam a responder a mecanoreceptores de baixo limiar, fazendo com que simples impulsos passem a ser entendidos como dor, dando origem ao quadro de alodinia. Adaptado de Woolf (2011).
1.2.4 Sensibilização central
A hiperatividade do nociceptor periférico (fibra aferente primária) oriunda da
lesão ou disfunção sensorial causa alterações secundárias no corno dorsal da
medula espinal (sensibilização central). A sensibilização central é responsável por
sintomas espontâneos (atividade ectópica) e pelo aumento da responsividade dos
neurônios no sistema nervoso central a estímulos nocivo ou inócuo (sintomas de
hiperalgesia e alodinia, respectivamente). As informações nociceptivas são
amplificadas quando chega ao sistema nervoso central que já se encontra
sensibilizado (LATREMOLIERE e WOOLF 2009).
A sensibilização central é iniciada e mantida pela sensibilização patológica
das fibras C, que sensibiliza os neurônios de segunda ordem no corno dorsal da
medula espinal, pela liberação de glutamato que age em receptores NMDA e AMPA,
e substância P em receptor NK1 (KUNER, 2010) (Figura 5). Os receptores NMDA e
AMPA são fosforilados pelas proteínas SRC, PKC, CaM-KII, PKA e ERK, reduzindo
o limiar de ativação desses receptores. A proteína ERK também reduz a corrente K+
através da fosforilação de canais de Kv4.2, aumentando a excitabilidade da
9
membrana (LATREMOLIERE e WOOLF, 2009; CHEN; ZHANG; MARVIZÓN,
2010a). Os canais de Cav do tipo neuronal também estão envolvidos na
sensibilização dos neurônios de projeção. A expressão destes canais localizados
nos terminais pré-sinápticos dos neurônios aferentes primários e que controlam a
exocitose ou liberação de glutamato e substância P (MCGIVERN, 2006) está
aumentada após a lesão do nervo periférico em ratos (DOOLEN et al., 2012). A
expressão dos canais Nav 1.3 e Nav 1.8 também estão aumentadas após a lesão do
nervo periférico, contribuindo para a sensibilização central (HE et al., 2010; MO et
al., 2011).
Várias evidências mostram a contribuição das células da glia no processo de
sensibilização central e fisiopatologia da dor neuropática (SUTER et al., 2007;
ECHEVERRY; SHI; ZHANG, 2008; GAO e JI, 2010). Em modelo de dor neuropática
induzida pela ligadura do nervo espinal, os astrócitos e microglia são ativados. A
ativação da célula da glia pelo glutamato e substância P estimula a liberação de
mediadores neuroinflamatórios e sensibilização dos neurônios (ZHANG et al., 2013;
CHEN et al., 2013a).
Figura 5. Sensibilização central. Sinapse entre neurônio aferente primário e neurônio de projeção. Os receptores metabotrópicos de glutamato estão presentes no terminal do neurônio pós-sináptico. Adaptada de Hehn et al. (2012).
10
1.2.5 Corno dorsal da medula espinal
O corno dorsal recebe informações sensoriais das fibras aferentes primárias
que inervam a pele e tecidos mais profundos do organismo e que respondem a tipos
específicos de estímulos nóxicos e não nóxicos. A Figura 6 mostra os aferentes
primários se projetando no corno dorsal e são distribuídos de acordo com a região
do corpo que inervam (TODD, 2010). A substância cinzenta da medula espinal está
subdividida em 10 lâminas e a maioria dos neurônios sensitivos está distribuída nas
lâminas I-III (ZEILHOFER; WILDNER; YEVENES, 2012). A lâmina I, também
conhecida como zona marginal é a mais externa do corno dorsal, e contém
interneurônios excitatório e inibitório, e neurônio de projeção responsável pela
transmissão da informação da medula espinal a níveis supraespinais incluindo a
área parabraqueal, substância cinzenta periaquedutal e tálamo. Alguns neurônios,
presentes na lâmina I são conhecidos como neurônios de amplo espectro (WDRs),
recebem impulsos de todas as fibras sensoriais, e respondem a estímulos de leve
toque a um “beliscão”, calor e químico (D’MELLO e DICKENSON, 2008).
Neurônios de projeção na lâmina I recebem impulsos monossinápticos das
fibras Aδ e C, bem como impulsos dos interneurônios excitatório e inibitório, e da
fibra serotoninérgica descendente (ZEILHOFER; WILDNER; YEVENES, 2012). Os
neurônios de projeção também recebem impulsos de interneurônios da lâmina II
(TODD, 2010). A lâmina II está localizada abaixo da lâmina I, e é conhecida como
substância gelatinosa. A lâmina II contém principalmente interneurônios excitatório
(glutamatérgico) e inibitório (gabaérgico) (JI et al., 2003; D’MELLO e DICKENSON,
2008).
Neurônios do corno dorsal sofrem alterações plásticas em condições
patológicas, causando a hiperatividade dos neurônios de projeção. No entanto, o
corno dorsal não é apenas um centro de transmissão nociceptiva, mas também
possui papel importante no desenvolvimento e manutenção da sensibilização central
(WOOLF e SALTER, 2000; JI et al., 2003).
O balanço entre a via inibitória e excitatória é um processo crítico para
manutenção da função sensorial normal. O bloqueio da transmissão inibitória a nível
espinal, por exemplo, pode resultar na alodinia, e alterações na função dessas vias
têm sido associadas com o desenvolvimento e manutenção da dor inflamatória e
neuropática (TODD, 2010).
11
Figura 6. Corno dorsal da medula espinal. Transmissão sináptica e controle da informação nociceptiva a nível espinal. Os principais neurônios de projeção residem nas lâminas superficiais e nas lâminas mais profundas no corno dorsal. Modificado de Berger et al. (2011).
1.2.6 Vias ascendentes nociceptivas
A transferência das informações nociceptivas da medula espinal para as
estruturas encefálicas é realizada por sistemas neuronais representados por fibras
longas, tais como: as vias espinotalâmica, espinorreticular e espinomesencefálica,
localizadas no quadrante ântero-lateral da medula espinal com distribuição
ascendente contralateral, transmitindo os impulsos nociceptivos para estruturas do
tronco cerebral e diencéfalo incluindo o tálamo, substância cinzenta periaquedutal,
região parabraquial, amígdala, formação reticular e hipotálamo (ALMEIDA;
ROIZENBLATT; TUFIK, 2004; TRACEY e MANTYH, 2007).
Os neurônios ascendentes projetam-se para a medula ventromedial rostral
(RVM), região que possui neurônios descendentes que se projetam para o corno
dorsal, podendo assim modular a via facilitatória da dor. Entretanto, um grande
número de neurônios de projeção é encontrado nas lâminas III-VI do corno dorsal e
estes se projetam predominantemente para o tálamo, transmitindo a informação
nociceptiva, e em seguida a regiões corticais para que ocorra a percepção do
12
estímulo como doloroso (BASBAUM et al., 2009). Os neurônios de projeção ativam o
córtex cingulado e insular via conexões no tronco cerebral (núcleo parabraqueal) e
amígdala, contribuindo para o componente afetivo da experiência de dor (Figura 7).
Diversas regiões do cérebro podem ser ativadas ou não durante a transmissão
nociceptiva, córtex cerebral e regiões corticais. Estas regiões formam o que é
comumente referido como um "centro da dor" e incluem regiões somatossensoriais
primária e secundária, insular, cingulado anterior e córtex pré-frontal (TRACEY e
MANTYH, 2007; KUNER, 2010).
Figura 7. Mecanismos centrais da dor. Vias ascendentes da dor. Modificado de Basbaum et al. (2009). PAG, Substância cinzenta periaquedutal; RVM, Medula ventromedial rostral; PB, Núcleo parabraqueal.
1.2.7 Neuromodulação da dor
Em 1965, Melzack e Wall propuseram a teoria do controle do portão como um
sistema modulatório da dor. A teoria sugere que os interneurônios inibitórios na
substância gelatinosa do corno dorsal espinal agem como unidades de “controle do
portão” para a entrada dos sinais nociceptivos no sistema nervoso central, oriundos
da periferia. Esse mecanismo modulatório é controlado pela atividade das fibras de
13
pequeno ou grande diâmetro. Atividade da fibra de grande diâmetro fecharia o
portão, enquanto a atividade das fibras de pequeno diâmetro abriria o portão (Figura
8). Fibras descendentes que têm origem em regiões supraespinais projetam-se no
corno dorsal e modulam o portão.
Figura 8. Teoria do controle do portão. Os sinais positivos e negativos indicam ativação e inibição das fibras nervosas, respectivamente. Adaptada de Melzack e Wall (1996).
A dor pode ser modulada por mecanismos celulares monoaminérgicos
descendentes que se projetam para o corno dorsal: sistema serotoninérgico
originado principalmente do núcleo magnus da rafe, e noradrenérgico do locus
coeruleus e outras regiões pontinas. Ambos, axônios serotoninérgicos e
noradrenérgicos possuem terminações difusas no corno dorsal, e formam sinapses
com neurônios da via ascendente nociceptiva (OSSIPOV; DUSSOR; PORRECA,
2010; OSSIPOV, 2012). Os interneurônios gabaérgico e glicinérgico inibem a
transmissão espinal nociceptiva e estão distribuídos na superfície do corno dorsal
(ZEILHOFER, 2005; BRÁZ et al., 2012). Diversos estudos indicam que a inibição
gabaérgica é reduzida após a lesão do nervo (DREW; SIDDALL; DUGGAN, 2004;
JANSSEN et al., 2011). Entretanto, Polgár et al. (2003) observaram que a perda dos
interneurônios não é a causa do desenvolvimento da hiperalgesia térmica após a
injúria constritiva crônica, demonstrando a complexidade da fisiopatologia da dor
neuropática.
14
Mecanismos descendentes oriundos de estruturas do tronco cerebral
influenciam na sinalização nociceptiva no corno dorsal da medula espinal. Essa
influência pode ser de natureza inibitória ou facilitatória. Mecanismo descendente
facilitatório da medula ventromedial rostral no tronco cerebral parece estar envolvido
na manutenção, mas não na iniciação da dor induzida pela lesão do nervo
(CARLSON et al., 2007). Administração de lidocaína (anestésico local), na medula
ventromedial rostral reverteu e não preveniu a hipersensibilidade tátil e térmica em
animais com ligadura do nervo espinal. O efeito da lidocaína foi maior em animais
com lesão do nervo, e observou-se que o mecanismo de facilitação descendente da
RVM influenciou nas respostas neuronais a estimulação tátil não nociva, sugerindo
um possível mecanismo celular de desenvolvimento da alodinia mecânica
(BURGESS et al., 2002).
1.3 Modelos de dor neuropática
A dor neuropática é definida como dor causada por uma lesão ou doença do
sistema somatosensorial (IASP, 2012). Anualmente, cerca de 7-8 % da população
mundial sofrem de dor crônica (TORRANCE et al., 2013). A dor neuropática é uma
modalidade de dor crônica que se instala após estímulo primário de alta intensidade
e duração. A perpetuação dos sintomas da dor neuropática não é acompanhada, na
maioria das vezes, pela presença do agente causador, dificultando o seu diagnóstico
(WANG e WANG, 2003a). A alodinia e hiperalgesia são sintomas frequentemente
observados na dor neuropática (SANDKUHLER, 2009), podendo se estender além
da área inervada pelo nervo lesado e pode se manifestar no membro contralateral
como imagem em espelho (MILLIGAN et al., 2003).
Pacientes acometidos de dor neuropática entre os níveis de moderado a
severo têm suas atividades cotidianas prejudicadas, tais como: praticar exercícios,
dormir, trabalhar e atender aos compromissos sociais. A dor neuropática pode estar
relacionada a trauma do nervo, infecção (vírus do herpes Zoster), alterações
metabólicas (diabetes), quimioterapia, irradiação, cirurgias, compressão do nervo,
tumores infiltrantes, neurotoxinas, inflamação e neurodegeneração (DWORKIN et
al., 2003).
15
Os modelos animais de experimentação são importantes para melhor
compreender a fisiopatologia da dor neuropática e desenvolver uma terapia eficaz
para o seu tratamento. Diferentes alvos moleculares têm sido identificados nestes
modelos.
1.3.1 Lesão do nervo espinal
Kim e Chung (1992) desenvolveram um modelo animal de mononeuropatia
periférica pela ligadura do nervo espinal. Nervos paraespinhais L5 e L6 são ligados
com intuito de promover uma lesão local, onde alterações celulares e moleculares
desencadeiam o processo de sensibilização central. Os animais desenvolvem
sintomas como alodinia mecânica, alodinia ao frio, hiperalgesia térmica e dor
espontânea. Alodinia mecânica na pata com dano é observada 24 horas após a
cirurgia, e o modelo experimental é válido por pelo menos 2 meses em ratos (KISO
et al., 2008). Diversos trabalhos (HUDMON et al., 2008; MO et al., 2011) têm
demonstrado o papel importante das isoformas dos canais de Na+ voltagem
dependente (Nav) no desenvolvimento e manutenção da dor neuropática. Os níveis
de expressão dos canais Nav 1.3 (MO et al., 2011) e Nav 1.8 (JOSHI et al., 2006;
JARVIS et al., 2007) estão aumentados, após a lesão induzida pela ligadura do
nervo espinal na dor neuropática.
1.3.2 Neuropatia diabética
A neuropatia diabética é uma das complicações da diabetes, presente em 60
a 70% dos casos. As neuropatias decorrentes da disfunção do nervo são
classificadas como periférica, autonômica, proximal e focal. A neuropatia periférica
incide em cerca de 47% dos pacientes diabéticos (ORMSETH; SCHOLZ;
BOOMERSHINE, 2011) e a sua fisiopatologia ainda é desconhecida.
Os pacientes acometidos pela neuropatia diabética desenvolvem sensações
anormais, como parestesias, alodinia, hiperalgesia e dor espontânea que coexistem
com a perda da função sensorial normal (CALLAGHAN et al., 2012). Modelos
animais de neuropatia induzida pela diabetes mellitus têm sido estabelecidos. O
modelo mais comumente utilizado de neuropatia diabética consiste na administração
de estreptozotocina (STZ) (ZAPATA-SUDO et al., 2012; ÁVILA et al., 2013).
16
Administração intravenosa de STZ induz diabetes, produzindo a destruição das
células β pancreáticas e aumento da glicemia (hiperglicemia) (ÁVILA et al., 2013;
AKBARZADEH et al., 2007). O estabelecimento da alodinia mecânica e hiperalgesia
térmica é observado em modelo animal de neuropatia diabética induzida pela STZ
(ZAPATA-SUDO et al., 2012).
Bierhaus et al. (2012) verificaram que concentrações aumentadas de
metilglioxal (produto da peroxidação lipídica associado ao estresse carbonílico na
diabetes) induz modificação na expressão de canais Nav 1.8 e despolarização dos
neurônios sensoriais. O evento aumenta a excitabilidade elétrica e disparo facilitado
de neurônios nociceptivos, resultando no quadro de hiperalgesia.
1.4 Alvos farmacológicos para o tratamento da dor neuropática
Os receptores acoplados a proteína G tem um papel chave em processos
fisiológicos ou associados a doenças, e por essa razão são alvos moleculares que
despertam interesse das indústrias farmacêuticas (ROSENBAUM;
RASMUSSEN; KOBILKA, 2009; LAPPANO e MAGGIOLINI, 2011).
Aproximadamente um terço dos fármacos atualmente disponíveis no mercado
interage com receptores acoplados a proteína G, demonstrando assim sua
relevância terapêutica (SCHLYER e HORUK, 2006; LAGERSTROM e SCHIOTH,
2008).
Os receptores acoplados a proteína G são uma das maiores famílias de
proteínas celulares, com aproximadamente 700 sequências identificadas no genoma
humano (HOPKINS e GROOM, 2002; OVERINGTON; AL-LAZIKANI; HOPKINS,
2006). Os receptores acoplados a proteína G tem 7 domínios transmembrana
conservados e um sítio de interação com o ligante localizado na superfície
extracelular (LEFKOWITZ, 2007; LAGERSTROM e SCHIOTH, 2008; ROSENBAUM;
RASMUSSEN; KOBILKA, 2009). Essas proteínas de membrana altamente
especializadas têm papel na transdução de sinal, convertendo informações
extracelulares em respostas intracelulares (Figura 9 A-G). Os ligantes que interagem
com os receptores acoplados a proteína G são numerosos, tais como os
neurotransmissores, aminas biogênicas, ácidos graxos, peptídeos, metais,
aminoácidos, proteínas e esteróides. As proteínas G associadas são constituídas de
17
três subunidades (Gα, Gβ, Gγ) e possuem uma atividade GTPase (Gα) que lhe
permite alternar entre um estado ativo (fosforilada) ou inativo (desfosforilada). Após
a interação com o ligante, o receptor ativa a proteína G associada (Figura 9A). A
forma ativa da proteína G (Gα fosforilada) é então dissociada do dímero Gβγ do
receptor. A subunidade Gα e o dímero Gβγ podem ativar adenilato ciclase e
fosfoinositídeo fosfolipase C que produzem os mensageiros secundários (Figura 9B)
(HENDRIKS-BALK et al., 2008; LEFKOWITZ, 2007). Adenilato ciclase converte ATP
em AMPc, e fosfoinositídeo fosfolipase C hidroliza fosfatidilinositol-4,5-bifosfato em
diacilglicerol e inositol-1,4,5-trifosfato. O inositol trifosfato se liga ao canal de Ca2+ do
retículo endoplasmático promovendo a liberação deste íon para o citosol (Figura 9C)
(MARTINS et al., 2012).
Figura 9. Ativação e regulação do receptor acoplado a proteína G. (a) Interação do ligante com receptor promove a fosforilação da subunidade da proteína G. (b) A subunidade fosforilada age como um mensageiro secundário, promovendo ativação das enzimas adenilato ciclase (ACA) (Gαs) ou fosfolipase C (PLC) (Gαq). (c) Os mensageiros secundários AMPc e inositol- 1,4,5-trifosfato (InsP3) são produtos diretos da conversão enzimática de ATP e fosfatidilinositol-4,5-bifosfato (PIP2) respectivamente. O Ca2+ citosólico é liberado após ativação dos canais de cálcio do retículo pelo InsP3. (d) Os mensageiros secundários podem desencadear reações em cascata que irão promover, por exemplo, a regulação da expressão gênica. (e) Elementos responsivos ao receptor acoplado a proteína G, bem como as proteínas cinases (PKs) ou proteínas cinases do receptor acoplado a proteína G (GRKs) fosforila o domínio intracelular do receptor e dissocia a proteína G. (f) As proteínas β-arrestinas podem reconhecer o domínio fosforilado do receptor e promover a internalização do mesmo. (g) Modificações na molécula da β-arrestina, bem como desfosforilação ou ubiquitinação define se o receptor internalizado será reciclado ou degradado respectivamente. Adaptado de Martins et al. (2012).
18
Os mensageiros secundários desencadeiam uma cascata de reações
envolvendo as proteínas cinases que promovem eventos biológicos como: regulação
da expressão gênica (Figura 9D). Ativação dos receptores é modulada por
mecanismos de regulação, como por exemplo, a internalização do receptor mediada
pela proteína β-arrestina (Figura 9G) (LEFKOWITZ, 2007; HANYALOGLU e VON
ZASTROW, 2008; HENDRIKS-BALK et al., 2008).
Os receptores acoplados a proteína G podem ser classificados em quarto
grupos: Gs, Gq, Gi/o e G12/13. Ao serem ativados, alguns receptores acoplam-se a
proteína G inibitória (Gi/o), inibindo a via da enzima adenilato ciclase, e ativando a
via da enzima fosfolipase C, enquanto outros acoplam-se a proteína G estimulatória
(Gs), ativando a enzima adenilato ciclase e estimulando a formação do segundo
mensageiro adenosina monofosfato cíclico; a proteína Gq ativa a fosfolipase C e a
proteína G12/13 interage com os transportadores de íons (LAGERSTROM e
SCHIOTH, 2008).
1.4.1 Via noradrenérgica
A inibição descendente da dor envolve em grande parte a liberação de
norepinefrina (NE) sintetizada nos núcleos do tronco cerebral, bem como locus
coeruleus (LC) e no corno dorsal da medula espinal. A noradrenalina liberada ativa o
receptor adrenérgico α2 resultando na inibição da liberação de neurotransmissores
excitatórios dos terminais aferentes primários e diminuição da ativação de neurônios
de projeção no corno dorsal (TANABE et al., 2005). Existem três isoformas de
receptores α2-adrenérgicos: α2A, α2B e α2C. A ativação desses receptores aumenta a
condutância do canal de K+ via proteína Gi, hiperpolariza a terminação nervosa e
reduz a condutância ao Ca2+, reduzindo assim a liberação de glutamato na
terminação aferente primária e redução da ativação dos impulsos nociceptivos nos
neurônios secundários do corno dorsal (PAN; LI; PAN, 2002; KAWASAKI et al.,
2003). A clonidina, agonista dos adrenoceptores α2 é utilizada na clínica para o alívio
da dor crônica (ACKERMAN; FOLLETT; ROSENQUIST, 2003). Outros fármacos de
uso clínico como amitriptilina, nortriptilina, duloxetina e venlafaxina, inibem a
recaptação neuronal de noradrenalina e serotonina e desta forma, causam analgesia
por mecanismo indireto (KISSIN et al., 2010; VIGUIER et al., 2013).
19
Diversos estudos demonstram que a indução de inflamação dos nervos
periféricos aumenta a inibição noradrenérgica descendente (MANSIKKA et al., 2004;
MOLINA e HERRERO, 2006) e a eficácia dos agonistas do receptor α2-adrenérgico
administrados pela via espinal (VIISANEN e PERTOVAARA, 2013; FAN et al., 2014).
1.4.2 Via serotoninérgica
O sistema descendente contendo fibras serotoninérgicas origina no núcleo
magno da rafe. A serotonina (5-HT) é um neurotransmissor e neuromodulador que
age sobre seus receptores, modulando a via ascendente e descendente da dor.
Assim como o sistema noradrenérgico, as fibras serotoninérgicas também
descendem para a medula espinal através do funículo dorsolateral. Os receptores
serotoninérgicos são classificados em 14 subtipos e os receptores 5-HT2A, 5-HT2B, 5-
HT2C, 5-HT3 e 5-HT6 e 5-HT7 presentes na fibra C estão relacionados com atividade
pro-nociceptiva periférica (MARKS et al., 2009; GODÍNEZ-CHAPARRO et al., 2011;
LIN et al., 2011). Diversos estudos têm sugerido um duplo papel para a
neurotransmissão serotoninérgica a nível espinal. Os subtipos dos receptores 5HT
estão associados à inibição ou facilitação descendente da dor (DOGRUL; OSSIPOV;
PORRECA, 2009). O aumento da transmissão serotoninérgica descendente e
inibição noradrenérgica descendente resultam no aumento da excitabilidade no
corno dorsal (sensibilização central), resultando na alodinia e hipersensibilidade
mecânica, bem como na dor espontânea, complicações comuns de pacientes com
dor neuropática (PETERS et al., 2010).
Com intuito de investigar a fisiopatologia da dor neuropática, Suzuki et al. (2004)
avaliaram a via descendente serotoninérgica após administração da ondansetrona
(antagonista seletivo do receptor 5-HT3). Ondansetrona inibiu a resposta espinal ao
estímulo mecânico que foi significativamente aumentada após ligadura do nervo
espinal, sugerindo um aumento na transmissão da via descendente serotoninérgica
facilitatória no cordão espinal. Entretanto, Hayashida et al. (2012) demonstraram o
efeito antinociceptivo do agonista 5HT-3 (clorofenil biguanida) causado pelo
aumento da liberação de GABA na medula espinal de ratos com ligadura do nervo
espinal. Os autores observaram que a ondansetrona reduziu o efeito antinociceptivo
da clonidina. Esse resultado corrobora com o estudo de Suzuki et al. (2004) que
demonstrou que a administração da 5-HT no corno dorsal inibe as respostas
20
nociceptivas. Assim, a 5-HT exerce duplo efeito na dor. Na periferia está envolvida
com o efeito pró-nociceptivo, enquanto que no cordão espinal com a analgesia
(KAYSER et al., 2011).
Diversos estudos demonstram a importância dos receptores 5-HT2 na
prevenção e tratamento da dor em modelos animais. Xie et al. (2008) mostraram que
a ketanserina (antagonista dos receptores 5-HT2A) reduziu significativamente efeito
analgésico do tramadol na dor inflamatória causada pela monoartrite em ratos,
evidenciando a importância desses receptores 5-HT2A na analgesia. Ativação do
receptor 5-HT2B previne e reduz a alodinia induzida pela injúria constritiva crônica.
Administração intratecal do agonista 5-HT2B (BW723C86) atenuou significativamente
a alodinia ao frio e mecânica. Esse efeito foi bloqueado pela coadministração do
antagonista seletivo do receptor 5-HT2B (RS127445) (URTIKOVA et al., 2012).
1.4.3 Via dopaminérgica
A dopamina é um neurotransmissor (catecolamina) presente no terminal
dopaminérgico na medula espinal e tem sido demonstrado modular a transmissão
nociceptiva (LAPIROTET al., 2011; TANIGUCHI et al., 2011). Os neurônios
dopaminérgicos se originam, em grande parte na substância nigra, área tegmental
ventral e hipotálamo, e se projetam para os sistemas nigroestriatal, mesocortical/
mesolímbico e túbero-infundibular, respectivamente. Os receptores dopaminérgicos
são receptores acoplados a proteína G e são classificados em 5 subtipos, D1-D5
(WOOD, 2008).
Diversos trabalhos demonstram que a percepção da dor pode ser modulada
pelos neurônios dopaminérgicos supraespinais (POTVIN; GRIGNON; MARCHAND,
2009; NAVRATILOVA et al., 2012; SOGABE et al., 2013). Em animais experimentais
de dor aguda, o aumento da atividade dopaminérgica pela levodopa inibe a
nocicepção (SHIMIZU et al., 2004). Cobacho et al. (2010) demonstraram que a
administração de levodopa alivia a alodinia tátil e ao frio em modelo de dor
neuropática em ratos e a ação analgésica envolve a ativação do receptor
dopaminérgico D2 na medula espinal. Posteriormente, Cobacho, De La Calle e Paíno
(2014) mostraram que um agonista seletivo do receptor D2 (quimpirole) inibiu a
alodinia em repostas a estímulos tátil e frio em modelo de dor neuropática causada
pela constrição crônica do nervo ciático em ratos.
21
Coffeen et al. (2010) observaram redução gradual dos níveis extracelular de
dopamina no córtex insular de ratos após inflamação. A redução dos níveis
correlaciona com a latência de retirada da pata. Houve aumento na expressão do
RNA mensageiro dos receptores D2 no córtex insular comparado ao grupo controle,
enquanto a expressão dos receptores D1 foi reduzida. Segundo os autores parece
haver um mecanismo de regulação dos receptores dopaminérgicos inibitórios e
excitatórios após processo de inflamação.
1.4.4 Via adenosinérgica
Adenosina é responsável pela construção de blocos de aminoácidos e uma
fonte de energia biológica na forma de adenosina trifosfato (ATP). Além disso,
adenosina é uma molécula de sinalização, atuando sobre seus receptores A1, A2A,
A2B e A3. Esses receptores estão acoplados a proteína G e têm sido associados a
várias funções biológicas (CHEN; ELTZSCHIG; FREDHOLM, 2013b). Ativação dos
receptores de adenosina causa analgesia em diferentes modelos de dor (GONG et
al., 2010; LI et al., 2010; GAO et al. 2014). A inosina é uma purina endógena
produzida pelo metabolismo da adenosina em reação catalizada pela adenosina
deaminase. Atividade analgésica do metabólito inosina tem sido demonstrada em
camundongos nos testes do ácido acético, formalina e glutamato. Inosina reduziu a
alodinia ao frio e alodinia mecânica induzida pela ligadura parcial do nervo ciático, e
alodinia mecânica induzida pelo adjuvante completo de Freund em camundongos.
Além disto, a inosina reduziu a hiperalgesia térmica e mecânica causada pela
bradicinina e forbol-12-miristato-13-acetato (FMA) em ratos. O mecanismo de ação
da inosina envolve a ativação dos receptores de adenosina A1 e A2A (NASCIMENTO
et al., 2010).
Gao et al. (2014) demonstraram que a ativação do receptor de adenosina do
subtipo A1 resulta em efeito antinociceptivo em camundongos nos testes da
formalina e contração abdominal induzida por ácido acético. Gong et al. (2010)
demonstraram que a administração intraperitoneal do agonista do receptor A1 (N6-
ciclopentiladenosina) aumentou a latência de retirada da pata a estimulação térmica
e mecânica em ratos normais, e reduziu a hiperalgesia térmica e alodinia mecânica
em ratos submetidos a ligadura do nervo espinal. Entretanto, ativação do receptor de
22
adenosina A2A periférico durante a inflamação induzida pela carragenina está
associada com a hiperalgesia mecânica em camundongos (LI et al., 2010). Ativação
do receptor de adenosina do subtipo A3 reverte a alodinia mecânica induzida pela
injúria constritiva crônica e por agentes quimioterápicos, e não tem efeito
antinociceptivo em modelo de dor aguda causada estimulação térmica (CHEN et al.
2012a).
1.4.5 Via canabinóide
Os efeitos biológicos dos compostos canabinóides são mediados através da
ligação e ativação dos seus receptores. O potencial terapêutico dos canabinóides
tem sido investigado em modelos animais de dor com intuito de explorar a atividade
analgésica e redução dos efeitos adversos, sendo que esses efeitos estão
relacionados com o subtipo de receptor (MANZANARES; JULIAN; CARRASCOA,
2006; KINGWELL, 2010). Existem dois subtipos de receptores canabinóides, CB1
(maior predominância no sistema nervoso central) e CB2 (maior predominância nos
tecidos periféricos), sendo diferenciados devido aos seus efeitos fisiológicos e
localizações no corpo. No entanto, agonistas do receptor CB2 não causa efeito
adverso no sistema nervoso central, tipicamente causado pelos agonistas CB1 (FINE
e ROSENFELD, 2013).
Ativação dos receptores CB1 e CB2 resulta na inibição da atividade da
adenilato ciclase via interação com a proteína G. Os receptores CB1 são mais
expressos no hipocampo, região cortical, cerebelo, e gânglio basal (MANZANARES;
JULIAN; CARRASCOA, 2006). Estudos demonstram que ativação dos receptores
CB1 a nível espinal e supraespinal resulta em efeito antinociceptivo significativo em
ratos submetidos ao dano da medula espinal (HAMA e SAGEN, 2011). No entanto,
Ikeda et al. (2013) observaram que a ativação espinal do receptor CB2 inibe a
resposta a dor em camundongos diabéticos induzidos pela estreptozotocina.
1.4.6 Via opióide
Os receptores opióides pertencem a uma superfamília de proteínas com 7
domínios transmembranares acoplados a proteína G. Os receptores são ativados
23
por peptídeos opióide endógenos (peptídeos encefalina, dinorfina e β-endorfina) e
fármacos opióides (PAN et al., 2008). A morfina é um fármaco, agonista dos
receptores opióides utilizado há décadas na medicina com intuito de aliviar a dor dos
pacientes. Os efeitos biológicos dos opióides estão relacionados a ativação dos
subtipos de receptores µ, κ e δ (WALDHOER; BARTLETT; WHISTLER, 2004).
Estudo de PCR em tempo real demonstrou que os receptores μ, δ, κ são
expressos no corno dorsal da medula espinal, gânglios da raiz dorsal e cérebro
(PENG; SARKAR; CHANG, 2012). Ativação do receptor µ no cérebro (córtex,
tálamo, PAG) e medula espinal (substância gelatinosa) induz analgesia
supraespinal, dependência física, depressão respiratória, miose, euforia e redução
da motilidade gastrointestinal. O receptor κ está distribuído no cérebro (hipotálamo e
PAG) e medula espinal (substância gelatinosa), e sua ativação promove analgesia
espinal, sedação, miose, inibição da liberação do hormônio antidiurético. O receptor
δ está presente no cérebro (núcleo pontino, amígdala, bulbos olfatórios e córtex) e
sua ativação promove analgesia, euforia, dependência física (KONERU;
SATYANARAYANA; RIZWAN, 2009).
O nível de expressão do receptor μ é reduzido em ratos com alodinia
mecânica após lesão do nervo (BACK et al., 2006). A morfina e os peptídeos
endógenos regulam a transmissão nociceptiva através da ativação dos receptores
opióides, promovendo: fechamento dos canais Cav, estimulação do efluxo de K+
(hiperpolarização do neurônio) e redução da produção de AMP cíclico via adenilil
ciclase. A regulação da transmissão nociceptiva é o resultado da redução da
excitabilidade neuronal por inibir a liberação de neurotransmissores excitatórios
(MACDONALD e LAMBERT, 2005).
1.4.7 Via colinérgica
Acetilcolina medeia seus efeitos fisiológicos através dos receptores
nicotínicos e muscarínicos. Os processos fisiológicos e atividade da acetilcolina são
controlados através da degradação enzimática pela acetilcolinesterase. O efeito
antinociceptivo ou analgésico dos agentes colinomiméticos é observado em animais
e humanos, sendo a medula espinal o maior sítio de ação dos colinomiméticos. No
entanto, os colinomiméticos administrados pela via intratecal mimetizam a liberação
de acetilcolina pelos interneurônios colinérgicos. Os interneurônios são ativados
24
pelos mecanismos descendentes monoaminérgicos, serotonina e noradrenalina
(JONES e DUNLOP, 2007).
Os receptores muscarínicos estão acoplados a proteína G e estudos de
clonagem molecular revelaram a existência de 5 receptores muscarínicos (M1-M5)
(WESS, 2004; LANGMEAD; WATSON; REAVILL, 2008). Os subtipos M1, M3 e M5
estão acoplados as proteínas Gq/11 para ativar a fosfolipase C, enquanto os
receptores M2 e M4 estão acoplados a Gi/o sensível a toxina pertussis (JONES e
DUNLOP, 2007) e estão localizados nos neurônios pré e pós-sinápticos (Figura 10).
Os receptores muscarínicos estão amplamente distribuídos no organismo e diversos
trabalhos (ZHANG et al., 2006, CHEN et al., 2010b) demonstram ampla presença na
medula espinal exercendo importante função na regulação da nocicepção. No corno
dorsal da medula espinal, o receptor muscarínico M2 é predominante, estando
também presentes os subtipos M3 e M4.
Cai et al. (2009) avaliaram a importância dos receptores M2, M3 e M4 no
controle colinérgico espinal da nocicepção. A utilização de RNA de interferência
(siRNA) para os subtipos M2 e M4 demonstrou que ambos receptores são
responsáveis pelo efeito analgésico dos agonistas muscarínicos em ratos normais.
Chen et al. (2010b) demonstraram que ativação dos receptores M2 e M4 inibem a
liberação sináptica de glutamato de neurônios no corno dorsal. A expressão do
receptor muscarínico M2 está aumentada na medula espinal de ratos com neuropatia
diabética induzida pela estreptozotocina (CHEN e PAN, 2003) e nos gânglios da raiz
dorsal de neurônios de animais submetidos a ligadura dos nervos espinhais L5 e L6
(HAYASHIDA et al., 2006). Administração intraperitoneal do agonista muscarínico
M2, arecaidina reduz a expressão do receptor vanilóide do tipo 1 (VR1), reduzindo
assim a hiperalgesia e alodinia causada pela administração intraplantar do fator de
crescimento do nervo em camundongos. Arecaidina inibe a atividade da PKCƐ,
impedindo sua translocação para a membrana plasmática e fosforilação do VR1 (DE
ANGELIS et al., 2014).
Os receptores nicotínicos são membros de uma família de canais iônicos
controlados por ligantes e estão amplamente distribuídos no sistema nervoso
periférico e central. Os receptores nicotínicos são compostos de várias combinações
de subunidades alfa (2-10) e beta (2-4), resultando em subtipos de receptores com
efeitos farmacológicos distintos. Estes efeitos podem ser positivos (analgesia e
25
melhora cognitiva) e negativos (dependência física, náusea e aumento da frequência
cardíaca) (HURST; ROLLEMA; BERTRAND, 2013). Os subtipos de receptores
nicotínicos α4β2 e α7 estão presentes no sistema nervoso central e modulam a dor,
enquanto os subtipos contendo subunidades α3 e β4 são expressas no sistema
nervoso autonômico, resultando em efeitos adversos (PICCIOTTO; HIGLEY;
MINEUR, 2012; HURST; ROLLEMA; BERTRAND, 2013). Nirogi et al. (2011)
relataram o efeito antinociceptivo de um agonista do receptor nicotínico do subtipo
α4β2 (A-366833) em modelos de dor aguda e dor neuropática. O agonista atenuou a
hiperalgesia mecânica induzida por quimioterápicos e diabetes.
Figura 10. Os receptores de acetilcolina (muscarínicos e nicotínicos) estão localizados a nível pré e pós-sináptico. Os receptores muscarínicos pré-sinápticos M2 e M4 possuem ação inibitória e atuam como autorreceptores inibitórios, enquanto os receptores M1 e M3 possuem ação excitatória nos terminais colinérgicos. Os receptores nicotínicos são compostos de várias combinações de subunidades alfa (2-10) e beta (2-4), resultando em subtipos de receptores com efeitos farmacológicos distintos. Modificado de Picciotto, Higley e Mineur (2012).
1.5 Tratamento da dor crônica
O tratamento atual da dor neuropática inclui a combinação de várias classes
de fármacos como os opióides, antidepressivos tricíclicos, agonistas alfa-2
adrenérgicos, anestésicos locais e anticonvulsivantes. Os analgésicos opióides são
relativamente eficazes para o alívio da dor imediata, mas os efeitos adversos e
26
potenciais riscos de abuso ou dependência impedem o seu uso por tempo
prolongado.
Antidepressivos e anticonvulsantes são considerados fármacos de primeira
linha para o tratamento da dor neuropática (BASIC-KES et al., 2009). Os
antidepressivos podem ser classificados de acordo com a estrutura química ou as
propriedades farmacológicas. Amitriptilina e maprotilina são antidepressivos
tricíclicos inibidores não seletivos da recaptação de monoaminas (serotonina e
noradrenalina). Fármacos anticonvulsivantes, tais como, a gabapentina e
pregabalina têm sido usados com algum sucesso na redução dos sintomas da dor
neuropática. A ação da gabapentina e pregabalina resulta da ligação ao canal de
Ca2+ da subunidade alfa2-delta (CaVα2δ) impedindo a liberação de
neurotransmissores excitatórios presentes nos terminais dos neurônios aferentes
primários. Isto dificulta a transmissão da dor no corno dorsal da medula resultando
em analgesia (TAYLOR, 2009b).
De 1960 a 2009, 59 fármacos foram identificados como analgésicos e
permanecem em uso. Sete desses fármacos foram considerados ter novos alvos
moleculares. No entanto, o sumatriptano foi considerado eficaz e outros novos
fármacos com alvo molecular similar foram introduzidos, da família dos triptanos
(KISSIN, 2010). Os fármacos triptanos, como o sumatriptano, são agonistas dos
autorreceptores pré-sinápticos 5HT1B/1D que estão associados a constrição dos
vasos sanguíneos intracranial e modulação da função do nervo trigeminal e
representa a terapia de escolha para o tratamento agudo da enxaqueca de
moderada a severa (HO et al., 2008; FERRARI et al., 2011). Entretanto, esses
fármacos não são usados para tratamento preventivo e o uso excessivo pode
resultar no aumento da responsividade aos estímulos evocados e estabelecimento
da enxaqueca, denominado sensibilização latente induzida pelos triptanos (DE
FELICE et al., 2010a; DE FELICE et al., 2010b).
A dor neuropática é considerada uma doença multifatorial, devido ao
envolvimento de vários alvos moleculares. Em vista disso faz-se necessário a
administração simultânea de um ou mais fármacos que atuem em diferentes alvos
moleculares e interajam de forma sinérgica para a reversão dos sintomas da dor
neuropática. Em função disto, a nova concepção de planejamento molecular e de
medicamentos para tratar a dor neuropática prevê estratégia multi-alvo com intuito
de aumentar o efeito analgésico dos fármacos e minimizar os efeitos colaterais.
27
Pettersen et al. (2009) investigaram a interação de antidepressivos com a
morfina após administração intratecal na dor aguda. Resultados mostraram que a
atividade antinociceptiva do inibidor específico da recaptação de serotonina,
citalopram, é inferior ao inibidor não específico da recaptação de serotonina e
noradrenalina, amitriptilina, e do inibidor específico da recaptação da serotonina,
maprotilina. A administração do citalopram não aumentou o efeito analgésico da
morfina. Fato surpreendente foi a intensa potencialização do efeito antinociceptivo
da morfina pela maprotilina. Pela análise isobolográfica ficou caracterizado um
sinergismo entre estas substâncias, sendo que a duração do efeito da morfina foi
aumentada em 4 vezes. Sudo et al. (2010) avaliaram a interação da morfina com
agonista α2-adrenérgico. Os autores observaram uma significativa potencialização
do efeito analgésico da morfina pelo agonista α2-adrenérgico derivado
imidazolidínico, PT-31.
1.5.1 Tolerância antinociceptiva à morfina
Administração crônica da morfina na prática clínica resulta, na maioria dos
casos, na perda da eficácia analgésica da mesma, descrita como tolerância ao efeito
analgésico. Tolerância antinociceptiva à morfina também pode ser demonstrada
experimentalmente em animais. Diversos trabalhos (CUI et al., 2006; VERA-
PORTOCARRERO et al., 2007; ROMERO; MIRANDA; PUIG, 2010) mostram que
administração crônica de morfina resulta em tolerância e hiperalgesia, estes de
causas ainda desconhecidas. Zanjani et al. (2013) observaram que os efeitos
analgésicos do agonista µ opióide são reduzidos em modelo animal de dor crônica
pela lesão do nervo ciático. A exposição crônica a morfina desencadeia uma cascata
de sinalização intracelular que resulta na desensibilização e endocitose dos
receptores opióides. Após a endocitose, os receptores podem ser reciclados e
transportados para a membrana, armazenados em compartimento intracelular, ou
degradado no citoplasma da célula (MARTIN e WHISTLER, 2007; QUILLINAN et al.,
2011).
A lesão do nervo ou exposição crônica a morfina pode ativar o sistema
neuroimune central, a célula da glia e estimular a produção de citocinas (ZHOU et
al., 2010; CHEN et al., 2012b). As células microgliais da medula espinal são ativadas
e recrutadas após lesão do nervo ciático e administração crônica à morfina (WEN et
28
al., 2011; LI, 2012). Após a lesão do nervo, há aumento da expressão dos
marcadores da microglia CD11b, Iba1 e IB4 (SUTER et al., 2007), e aumento da
fosforilação de MAP cinase p38 (SUTER et al., 2007; JI e SUTER, 2007). A inibição
de p38 na medula espinal tem atenuado a dor neuropática e tolerância
antinociceptiva induzida pela morfina (CUI et al., 2006; JI e SUTER, 2007). Ativação
de p38 na microglia espinal resulta no aumento da síntese e liberação do fator
neurotrófico derivado do cérebro e citocinas pró-inflamatórias IL-1β, IL-6 e TNF-α
(COULL; BEGGS; BOUDREAU, 2005; SUNG et al., 2005). Administração intratecal
de IL-1β, IL-6 e TNF-α induz hiperalgesia térmica e alodinia mecânica (KAWASAKI
et al., 2008a). Entretanto, o bloqueio espinal das citocinas atenua a dor inflamatória,
dor neuropática e tolerância à morfina (WATKINS et al., 2005; REN e DUBNER,
2010). Os mediadores liberados pela microglia podem modular a transmissão
sináptica na medula espinal, resultando no aumento da excitabilidade dos neurônios
do corno dorsal, promovendo a sensibilização central, em parte, inibindo a
transmissão sináptica inibitória (GRACE et al., 2014).
Kawasaki et al. (2008b) observaram que metaloproteinase de matriz-9 (MMP-
9) pode ativar a microglia via interação célula da glia-neurônio. A ligadura do nervo
espinal provoca rápido aumento da síntese de proteína MMP-9 e atividade dos
neurônios do GRD. Administração intratecal de MMP-9 induz alodinia mecânica
persistente por muitos dias, e ativação drástica da microglia, observado pelo
aumento da fosforilação da p38 e expressão de OX-42 na medula espinal.
Elhabazi et al. (2012) investigaram a participação dos receptores de
neuropeptídeos FF (NPFF) nas respostas neuroadaptativas dos tratamentos agudos
e crônicos à opióides. O bloqueio dos receptores NPFF pelo antagonista seletivo dos
receptores NPFF (RF9) reverteu de forma dose dependente a hiperalgesia causada
pela administração aguda de fentanil ou administração crônica de morfina. Além
disto, a administração de RF9 preveniu o desenvolvimento da tolerância à morfina.
Yang et al. (2012) mostraram que acetilcolina modula a dor, aumentando os níveis
de peptídeos opióides endógenos no cordão espinal de ratos. A retirada e
dependência à morfina podem produzir mudanças na sinalização colinérgica
(NEUGEBAUER et al., 2013).
29
1.6 Derivados Pirazolo[3,4-b]Pirrolo [3,4-d]Piridina
Menegatti et al. (2006) observaram os efeitos analgésicos dos derivados
heterotricíclicos obtidos por modificações bioisostéricas na molécula do zolpidem
(um agonista do receptor benzodiazepínico de estrutura química não
benzodiazepínica): LASSBio-872, LASSBio-873, LASSBio-980 e LASSBio-981
(Figura 11). As propriedades antinociceptivas destes derivados foram estudadas em
modelo de dor aguda por meio do teste na placa quente. Atividade analgésica
causada pelo LASSBio-872 (6 mg/kg) e LASSBio-873 (2 mg/kg) é equivalente à
morfina (10 mg/kg; Sudo et al., 2010). Apesar da similaridade com o zolpidem, a
atividade analgésica destes compostos não foi relacionada ao receptor
benzodiazepínico. Testes farmacológicos com uso de antagonistas específicos
indicaram que a ação analgésica do LASSBio-872, LASSBio-873, LASSBio-980 e
LASSBio-981 envolve em parte o receptor opióide (MENEGATTI et al., 2006).
Mendes et al. (2009) relataram os efeitos antihiperalgésico e sedativo do derivado
LASSBio-873 em camundongos nos testes da carragenina e campo aberto,
respectivamente. O LASSBio-873 preveniu e reverteu os sinais de hiperalgesia
térmica e alodinia mecânica, e não alterou a atividade locomotora dos ratos tratados
por 7 dias (MENDES et al., 2013). Os autores demonstraram que o efeito
antinociceptivo do LASSBio-873 foi revertido com a utilização do antagonista do
receptor muscarínico M2, demonstrando o envolvimento da via muscarínica no
mecanismo de ação do derivado.
30
Figura 11. Estruturas químicas dos derivados LASSBio-872, LASSBio-873, LASSBio-980 e LASSBio-981 e o protótipo zolpidem (N,N,6-trimetil-2-(4-metil fenil)- imidazo[1,2-a]piridina-3-acetamida).
Em vista dos significativos efeitos antinociceptivos observados com os
derivados do zolpidem, principalmente o LASSBio-981, que de acordo com estudos
prévios produziu atividade analgésica maior do que os demais derivados, despertou-
se o interesse em avaliar a atividade antinociceptiva do derivado no sistema nervoso
central pela administração intratecal, bem como o mecanismo de ação. A interação
analgésica do LASSBio-981 e morfina administrados por via oral foi investigada
empregando análise isobolográfica. O efeito antinociceptivo do derivado foi avaliado
em modelos de neuropatia diabética e ligadura do nervo espinal (LNE). O efeito
antinociceptivo da combinação de LASSBio-981 e tramadol (agonista opióide,
inibidor da recaptação de serotonina e noradrenalina) ou amitriptilina (antidepressivo
tricíclico) por via oral foi avaliado em animais com LNE. O efeito antinociceptivo do
derivado em prevenir e reverter a tolerância antinociceptiva à morfina foi investigado,
bem como seu mecanismo de ação. Avaliou-se um possível efeito depressor do
sistema nervoso central (sedação) de animais normais tratados cronicamente com o
derivado. O estudo de ancoramento molecular do LASSBio-981 nos receptores
muscarínico M2 e μ-opióide foi realizado para validar os resultados farmacológicos
anteriores.
31
2 OBJETIVOS
Geral:
- O projeto teve como objetivo investigar a atividade antinociceptiva do derivado do
zolpidem, LASSBio-981 administrado pela via intratecal e oral, em modelos de dor
aguda e crônica e o seu potencial efeito na prevenção e reversão da tolerância à
morfina em animais.
Específicos:
- Avaliar a atividade antinociceptiva do LASSBio-981 administrado pela via oral em
modelo de dor aguda em camundongos.
- Investigar a interação farmacológica do efeito antinociceptivo entre LASSBio-981 e
morfina administrados pela via oral em modelo de dor aguda, através da análise
isobolográfica.
- Avaliar o efeito antinociceptivo da associação de tramadol com amitriptilina no
modelo de ligadura do nervo espinal em ratos.
- Avaliar o efeito antinociceptivo da associação de LASSBio-981 com tramadol e
amitriptilina no modelo de ligadura do nervo espinal em ratos.
- Avaliar o efeito antinociceptivo de LASSBio-981 no modelo de tolerância à morfina
na dor causada pela ligadura do nervo espinal em ratos, e sua interação com o
receptor muscarínico M2 na medula espinal.
- Avaliar o efeito antinociceptivo de LASSBio-981 na dor causada pela neuropatia
diabética em ratos.
- Avaliar possível efeito sedativo de LASSBio-981 em ratos normais tratados durante
7 dias.
- Analisar a interação do LASSBio-981 nos receptores muscarínico M2 e μ opióide
através de estudos de ancoragem molecular.
32
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Animais
O projeto envolveu uso de ratos Wistar e camundongos suíços provenientes
do Biotério do Programa de Pós-Graduação em Farmacologia e Química Medicinal
do Instituto de Ciências Biomédicas da UFRJ e Instituto Vital Brazil, Niterói, RJ. Os
animais foram mantidos em ambiente com controle de temperatura (23-25 oC),
umidade (55-65%) e ciclo claro-escuro de 12:12 h, com início do ciclo claro às 6
horas da manhã. Ração e água foram oferecidos ad libidum, exceto quando o
protocolo requeria alguma forma de restrição. Foram utilizados nos experimentos 96
camundongos e 238 ratos divididos em diferentes grupos experimentais. Os
protocolos experimentais que envolveram animais foram aprovados pelo Comitê de
Ética e Uso de Animais da UFRJ com os códigos DFBCICB065 e DFBCICB066.
3.2 Substâncias
A substância LASSBio-981 foi sintetizada e cedida pelo Laboratório de
Avaliação e Síntese de Substâncias Bioativas (LASSBio) da UFRJ. O LASSBio-981
foi dissolvido e diluído em dimetilsulfóxido (DMSO). Amitriptilina, morfina e tramadol
foram cedidas pelo Laboratório Cristália Produtos Químicos e Farmacêuticos Ltda
(Itapira, SP) em forma de sais cloridrato, sulfato e cloridrato, respectivamente.
Metoctramina foi adquirido da Sigma (St Louis, MO, USA).
3.3 Modelo de dor aguda
3.3.1 Placa quente
Este modelo (TJØLSEN et al., 1991) é usado para investigar o efeito
antinociceptivo de substâncias que atuam no sistema nervoso central. O uso deste
método teve como objetivo determinar a atividade antinociceptiva do LASSBio-981
administrado pela via oral e sua interação com morfina. Para isto, camundongos
suíços (18-25 g) foram colocados sobre uma placa metálica aquecida a 52 oC
(Figura 12), e mensurada a latência de permanência do animal sobre a mesma sem
esboçar reação ao estímulo térmico (lambedura das patas dianteiras, salto). O cut-
33
off, definido como tempo máximo de permanência permitido sobre a placa aquecida,
para evitar lesão tecidual, foi 3 vezes a latência controle, normalmente em torno de
10 s. LASSBio-981 (10, 20, 40 e 80 mg/kg) e morfina (10, 20, 40 e 80 mg/kg) foram
administrados pela via oral por gavagem. O efeito antinociceptivo foi quantificado
sob forma de atividade analgésica (%AA) através da fórmula:
% AA = (latência observada) – (latência controle) X 100
(“cut off”) – (latência controle)
Figura 12. Placa quente (Hot Plate modelo 7406, Letica, Barcelona, Espanha) ajustada para 52º C.
3.3.1.1 Interação LASSBio-981 e morfina (análise isobolográfica)
Possível interação entre LASSBio-981 e morfina foi avaliada por meio da
construção de um isobolograma, conforme descrito anteriormente (TALLARIDA et
al., 1999, SUDO et al. 2010). O envolvimento de um número excessivo de animais
neste tipo de avaliação nos conduziu usar camundongos suíços (18-25 g) ao invés
de ratos. Experimentalmente, a análise isobolográfica envolveu as seguintes etapas:
1) construção de curva relacionando dose de LASSBio-981 ou morfina com atividade
analgésica (%AA) para determinação de suas respectivas doses eficazes médias
(DE50); 2) construção de curva dose-resposta usando misturas constituídas de
proporções fixas das DE50’s (1/16, 1/8, 1/4, 1/2, 1); 3) construção da linha aditiva
conectando os pontos da DE50 de LASSBio-981 com a DE50 da morfina e
determinação da DE50 aditiva (DE50ad); 4) comparação estatística entre o ponto
referente a DE50 experimental da mistura (DE50mix) com a DE50ad. Se o ponto da
34
DE50 experimental for estatisticamente diferente da DE50ad, o resultado poderá ser
interpretado como sinergismo, caso o ponto relativa a DE50mix esteja a esquerda da
linha aditiva, sub-aditiva ou antagonismo, caso o ponto esteja a direita da linha
aditiva e aditiva caso esteja próximo ou sobre a linha aditiva.
O Ponto Teórico Aditivo (DE50ad) foi estabelecido de acordo com o método
descrito por Tallarida (1992) e obtida a partir da seguinte fórmula:
DE50ad= DE50 LASSBio-981/(p1+Rp2)
onde R é a potência calculada de DE50LASSBio-981/DE50Morfina; p1 é a proporção
de LASSBio-981 na combinação e p2 a proporção de morfina na combinação. A
DE50 das combinações experimentais (DE50mix) é plotada no gráfico, mantendo a
mesma proporção do ponto teórico. Quando os valores experimentais estão
localizados sobre ou próximo da linha aditiva teórica, são consideradas interações
aditivas; se abaixo e à esquerda desta linha, as interações são sinérgicas e, quando
posicionadas acima e à direita, são ditas interações sub-aditivas ou antagonistas
(TALLARIDA, 2001).
3.4 Modelos de dor crônica (neuropática)
3.4.1 Ligadura do nervo espinal (LNE)
A ligadura do nervo espinal (LNE) descrita por Kim e Chung (1992) é modelo
clássico que melhor reproduz a dor neuropática em animais. Após anestesia com
cetamina (100 mg/kg i.p.) e xilazina (5 mg/kg i.p.), ratos Wistar (180-240 g) foram
posicionados em decúbito dorsal e seus músculos paraespinhais cuidadosamente
separados na região das vértebras L4 a S1. O processo transverso L6 foi retirado
para a visualização dos nervos espinhais L4 e L5, os quais foram cuidadosamente
separados para que fosse feita a ligadura do nervo L5 com fio de seda 6.0,
interrompendo assim o fluxo de ativação de todos os axônios no nervo (Figura 13).
Após o procedimento, os músculos paraespinhais e a pele foram suturados.
Antisséptico (povidine) foi aplicado topicamente, seguido da administração do
antibiótico oxitetraciclina (60 mg i.m.). O mesmo procedimento foi realizado nos
animais falso-operados (sham).
35
Figura 13. Ligadura do 5o nervo lombar espinal (L5). As setas indicam a localização do processo transverso L6 e os nervos espinhais L4 e L5.
3.4.1.1 Associação do LASSBio-981 com tramadol e amitriptilina
Os animais com LNE foram tratados durante 7 dias com os fármacos
isoladamente ou em combinações (tramadol + amitriptilina, LASSBio-981 + tramadol
e LASSBio-981 + amitriptilina), 7 dias após a cirurgia. O tramadol e amitriptilina são
fármacos utilizados no tratamento da dor neuropática.
3.4.1.2 Tolerância antinociceptiva à morfina
Modelo de tolerância à morfina foi desenvolvido com o objetivo de avaliar
possível efeito do LASSBio-981 na prevenção e reversão neste processo. Ratos
Wistar pesando entre 180 e 240 g foram submetidos a LNE para desenvolver os
sinais de hiperalgesia térmica e alodinia mecânica como descrito anteriormente.
Avaliações da latência e limiar de retirada da pata (controles) foram realizadas antes
(dia 0) e após a cirurgia (dia 7) para constatar o desenvolvimento dos sinais. Para
desenvolver a tolerância, mini-bombas osmóticas Alzet (Durect, Cupertino, CA)
(Figura 14) foram implantadas para infusão intraperitoneal de morfina (2,5 mg/kg/dia)
durante 16, 23 ou 30 dias sob taxa de 2,5 μl/h. A dose de morfina foi selecionada a
L5
L4
Processo
transverso L6
36
partir de trabalhos anteriores (GLOVER e DAVIS, 2008; KHALILZADEH et al., 2008).
A tolerância antinociceptiva à morfina em ratos com LNE foi observada três dias
após início da infusão de morfina (i.p.) e completamente estabelecida após 16 dias,
na qual a resposta nociceptiva retornou ao valor do controle (hiperalgesia térmica e
alodinia mecânica). Após o estabelecimento da tolerância, ainda sob infusão
contínua de morfina, os ratos foram tratados com LASSBio-981 (10 mg/kg v.o.),
amitriptilina (10 mg/kg, v.o., controle positivo) ou veículo (DMSO v.o.) diariamente
durante 14 dias (protocolo terapêutico). Para demonstrar efeito preventivo à
tolerância, LASSBio-981 (10 mg/kg v.o.), amitriptilina (10 mg/kg v.o.) ou veículo
(DMSO v.o.) foi administrado diariamente após o sétimo dia da LNE, durante 16
dias, no mesmo dia em que se iniciou a infusão de morfina. No final dos
experimentos, os animais foram eutanasiados sob anestesia profunda com
pentobarbital sódico (100 mg/kg, i.p.) e as mini-bombas foram retiradas, pesadas e
medidas o volume da solução de morfina remanescente para certificar o volume
injetado, assim como, a sua taxa de infusão.
Figura 14. Mini-bomba da Alzet (Durect, Cupertino, CA).
37
3.4.1.2.1 Investigação do mecanismo de ação do LASSBio-981
3.4.1.2.1.1 Administração intratecal
Trabalho anterior do laboratório havia demonstrado que o efeito
antinociceptivo do análogo do zolpidem LASSBio-873 em modelo de dor neuropática
resultava de sua interação com o receptor muscarínico M2 (MENDES et al. 2013).
Para investigar a participação deste receptor como alvo de ação do LASSBio-981,
metoctramina (10 µg em 40 µl) foi administrada no espaço intratecal entre os
espaços intervertebrais L4–L5 em ratos anestesiados com sevoflurano (3 vol%
gás/gás) (PETTERSEN et al., 2009). Metoctramina foi administrada durante o efeito
de LASSBio-981 (10 mg/kg, v.o) para avaliar o mecanismo de ação do LASSBio-981
na tolerância induzida pela morfina. O teste antinociceptivo foi realizado após
completa recuperação dos animais da anestesia (15 minutos). Latência de retirada
da pata foi avaliada antes e 15, 30, 60, 90, 120, e 150 minutos após administração
da metoctramina.
3.4.2 Neuropatia diabética
A diabetes foi induzida em ratos Wistar, pesando entre 180-240 g por meio de
injeção única de estreptozotocina (60 mg/kg i.v.) dissolvida em tampão fosfato
sódico (COURTEIX; ESCHALIER; LAVARENNE, 1993; ZAPATA-SUDO et al., 2012).
O nível de glicose no sangue foi avaliado por meio do equipamento Accu-Chek®
(Roche), a cada 7 dias após injeção de estreptozotocina, bem como a massa
corporal até o estabelecimento da hiperalgesia térmica e alodinia mecânica,
caracterizando assim a neuropatia. Ratos com glicemia igual ou maior a 240 mg/dl
foram considerados diabéticos e usados nos experimentos.
38
3.4.3. Avaliação comportamental dos animais com hiperalgesia e alodinia
3.4.3.1. Hiperalgesia térmica
Aumento da reatividade a estimulação térmica é um dos sinais que
caracterizam a dor neuropática. Os animais foram acondicionados em caixas de
acrílico transparentes por 40 minutos para aclimatação. A hiperalgesia térmica foi
avaliada através do teste de retirada da pata, no qual uma fonte de calor radiante
(Plantar meter modelo 37370, Ugo Basile SRL, Itália) era incidida na superfície
das patas traseiras dos animais para a determinação da latência de retirada da
pata (HARGREAVES et al., 1988; MENDES et al., 2013) (Figura 15). O tempo
medido entre o início do estímulo e a retirada da pata foi considerado como
latência de retirada da pata. Latência foi determinada utilizando a média de três
avaliações. As latências antes e após a administração das substâncias foram
mensuradas. Foi empregado um cut-off de 3 vezes a latência controle para
prevenir danos teciduais. Redução significativa da latência controle foi
caracterizada como hiperalgesia térmica.
Figura 15. Equipamento utilizado para avaliar a latência de retirada da pata.
39
3.4.3.2. Avaliação da alodinia mecânica
Alodinia, sensação de dor a estímulos que normalmente não causam dor, é
outro sinal bem característico da dor neuropática. Para avaliar o desenvolvimento da
alodinia mecânica foi utilizado o analgesímetro digital (Modelo EFF301, Insight, SP,
Brasil), versão digitalizada dos filamentos de Von Frey (Figura 16). O teste tem como
objetivo determinar o limiar de resposta do animal a estímulo álgico táctil. Este
aparelho possui um braço transdutor de força conectado a um pino sensor, acoplado
a uma ponteira com 1 mm de diâmetro, através do qual foi realizada uma força de
intensidade crescente contra a superfície da pata traseira do animal para determinar
o limiar de retirada da pata (VIVANCOS et al., 2004). O analgesímetro digital registra
automaticamente a força máxima (g) na qual o animal responde ao estímulo. A
média de cinco avaliações foi utilizada. Foi empregado um cut-off de 120 g para
evitar danos teciduais. Redução significativa do limiar mecânico causado pela
ligadura do nervo espinal foi considerada como alodinia mecânica. Os animais foram
colocados em caixas acrílicas individuais para aclimatização por 30 minutos antes
do início do teste. Após este período, foram determinados os limiares de retirada das
duas patas traseiras (controle) e após a administração das substâncias.
Figura 16. Analgesímetro digital, versão digitalizada dos filamentos de Von Frey.
40
3.5 Atividade locomotora
Medida da atividade motora (possível efeito sedativo) é etapa de grande
importância na avaliação toxicológica pré-clínica de novos candidatos a fármacos.
Ratos Wistar, sem serem submetidos a LNE ou administração de estreptozotocina,
foram tratados com LASSBio-981 (10 e 30 mg/kg v.o.) durante 7 dias. O teste da
atividade locomotora foi realizado em um campo aberto com dimensões de 45 × 45
cm (LE 8811, Letica) (Figura 17) 24 horas após a administração da última dose de
LASSBio-981. O protocolo foi realizado de acordo com Mendes et al. (2013). O
campo aberto é constituído de cruzamento de feixes infravermelhos invisíveis que
forma vários pequenos quadrados. A interrupção do feixe, em 3 dimensões, causada
pela movimentação do animal é contabilizada como um movimento. A atividade
locomotora total foi definida como o número total de interrupções registrado durante
40 minutos no computador. Posteriormente, os dados foram expressos como o
número de movimentos por minuto.
Figura 17. Equipamento utilizado para avaliação da atividade locomotora.
3.6 Ancoramento molecular de LASSBio-981 nas estruturas cristalográficas dos
receptores muscarínico M2 e µ opióide.
Os estudos de ancoramento molecular foram feitos com a estrutura
cristalográfica do receptor muscarínico M2 (PDB ID: 3UNO) (HAGA et al., 2012) e
41
receptor µ-opióide (PDB 4DKL) (MANGLIK et al., 2012) disponíveis no banco de
dados de proteínas PDB (http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do). O programa
GOLD 5.2 (CCDC) (JONES; WILLETT; GLEN, 1995) foi utilizado para o
ancoramento de LASSBio-981 no sítio de ligação ortostérico dos receptores, ou seja,
no sítio de reconhecimento molecular dos substratos endógenos. O conjunto de
resíduos de aminoácidos selecionados como o sítio de ligação foi definido por uma
distância de 10 Å do resíduo Tyr104 do receptor muscarínico M2. A mesma
metodologia foi empregada para o receptor µ-opióide selecionando o resíduo
correspondente, Tyr148. A fim de validar o programa GOLD 5.2 (CCDC) para esses
sistemas, um estudo de reancoramento foi realizado com os ligantes cocristalizados
de ambas as estruturas cristalográficas. O antagonista do receptor muscarínico M2, 3
quinuclidinil-benzilato (QBN) e o antagonista do receptor µ-opióide, β-fulnatrexamina
(β-FNA) foram reancorados dentro de seus respectivos sítios de ligação utilizando
todas as funções de pontuação disponíveis no programa GOLD 5.2 (CCDC). Dentre
essas funções: GoldScore, ChemScore, ChemPLP e ASP. A função Goldscore é
calculada a partir da soma de termos de energia de ligação de hidrogênio do
complexo proteína-ligante, energia de Van der Waals do complexo, energia de Van
der Waals interna do ligante e energia torcional do ligante levando em conta
parâmetros empíricos para a realização do cálculo (JONES et al., 1997). A função
Chemscore é derivada empiricamente de um conjunto de medições de afinidade de
82 complexos proteína-ligante e que estima a mudança de energia livre total que
ocorre na interação do ligante com a proteína (ELDRIDGE et al., 1997).
A função de pontuação ChemPLP contém um potencial específico (fPLP,
Piecewise Linear Potential) para o cálculo da complementaridade estérica entre
átomos pesados (ou seja, diferentes de hidrogênio) do ligante e da proteína e
termos, derivados da função ChemScore, para ligações de hidrogênio, dependentes
das distâncias e ângulos destas ligações, e para ligações envolvendo metais, além
de potenciais internos para os ligantes, que incluem um termo para colisões entre
átomos e um termo torcional derivado do campo de força Tripos (KORB; STUTZLE;
EXNER, 2009).
A estrutura de LASSBio-981 foi desenhada e minimizada energeticamente
utilizando o método ab initio Harthree-Fock e função de base 3-21G (BINKLEY;
POPLE; HEHRE, 1980), disponíveis no programa Spartan'08 (Wavefunction Inc.).
Após a validação do programa GOLD 5.2 (CCDC), três corridas de ancoramento
42
molecular foram realizadas com a estrutura otimizada do LASSBio-981, gerando 10
orientações por corrida. De 30 orientações geradas, aquela de maior pontuação foi
analisada. A escala de pontuação permite ranquear as orientações de acordo com o
somatório dos termos de energia da função escolhida previamente. Sendo assim
uma orientação com pontuação alta reflete um somatório dos termos de energia
mais favorável que uma orientação com pontuação menor.
3.7 Análise estatística
Os resultados estão apresentados como média ± erro padrão da média. As
análises estatísticas foram realizadas utilizando-se o programa Graph Pad Prism 5,0.
Para a comparação múltipla dos grupos experimentais foi utilizada a análise de
variância One-Way seguida pelo teste de Newman Keuls. Os valores de atividade
motora foram comparados pela Análise de Variância One-Way seguida pelo Teste
de Dunnett’s (comparação dos grupos com o controle). Diferenças estatísticas com
P < 0,05 foram consideradas significativas.
4 RESULTADOS
4.1 Modelos de dor aguda 4.1.1 Atividade antinociceptiva em modelo da placa quente
Foram investigados os efeitos antinociceptivos do LASSBio-981 e morfina
administrados pela via oral em camundongos. Atividade analgésica (%AA) máxima
observada para o LASSBio-981 nas doses de 10, 20, 40 e 80 mg/kg foi de 21,9 ± 5,4
(n= 8), 31,6 ± 6,4 (n= 8), 83,9 ± 8,2 (n= 8) e 97,6 ± 2,0% (n= 8), respectivamente,
observada entre os tempos de 15-50 minutos após administração. Atividade
antinociceptiva não foi observada com o veículo (DMSO) (Figura 18).
A Figura 19 mostra aumento da atividade antinociceptiva da morfina
administrada em função da dose. Assim, a atividade analgésica nas doses de 10,
20, 40 e 80 mg/kg foi de 35,6 ± 4,9 (n= 8), 52,4 ± 5,4 (n= 8), 69,4 ± 7,0 (n= 8), e 95,1
± 4,1% (n= 8), respectivamente.
43
0 20 40 60 80 1000
20
40
60
80
10010 mg/kg
40 mg/kg
80 mg/kg
20 mg/kg
LASSBio-981
DMSO
Tempo (min)
% A
A
Figura 18. Atividade antinociceptiva, medida em modelo da placa quente, causada pelo LASSBio-981 administrado pela via oral em doses crescentes em camundongos. Os dados estão representados como média ± EPM (n= 8 por dose).
0 20 40 60 80 1000
20
40
60
80
10020 mg/kg
40 mg/kg
80 mg/kg
10 mg/kg
MorfinaDMSO
Tempo (min)
% A
A
Figura 19. Atividade antinociceptiva da morfina administrada pela via oral em camundongos, medida em modelo da placa quente. Os pontos representam a média ± EPM (n= 8).
44
4.1.1.1 Análise da interação LASSBio-981 e morfina
No sentido de construir o isobolograma foram determinadas as DE50’s do
LASSBio-981, morfina e associação entre elas. A Figura 20 mostra aumento da AA
em função do aumento da proporção das misturas, sendo de 27,6 ± 6,8 (n= 8), 47,1
± 10,3 (n= 8), 66,0 ± 12,1 (n= 8), 74,3 ± 7,9 (n= 8), 90,6 ± 3,5% (n= 8),
respectivamente. A DE50 do LASSBio-981 foi de 20,1 ± 9,0 mg/kg, enquanto a DE50
da morfina foi de 16,2 ± 2,8 mg/kg. As proporções das DE50’s usadas para
determinação da DE50 da mistura foram 1/16, 1/8, 1/4, 1/2 e 1. A relação dose-
resposta causada pela mistura está mostrada na Figura 21. A DE50 da mistura
calculada pela regressão linear (y = α + βx, onde y é o %AA, α a interseção no eixo y
e x a log dose) foi de 11,6 ± 0,8 mg/kg (Figura 21).
O isobolograma mostrado na Figura 22 mostra que a diferença entre a
DE50aditiva (18,2 ± 6,0 mg/kg) e a DE50mistura (11,6 ± 0,8 mg/kg) não foi significativa
(P > 0,01).
0 20 40 60 80 1000
20
40
60
80
100
1/16
1/8
1/4
1/2
1
DMSO
LASSBio-981 + Morfina
Tempo (min)
% A
A
Figura 20. Atividade antinociceptiva causada pela associação LASSBio-981 e morfina, em modelo de placa quente em camundongos, coadministrada pelar via oral. Os dados estão apresentados como média ± EPM (n= 8 por dose).
45
Figura 21. Regressão linear correlacionando o log das doses do LASSBio-981, morfina e da mistura, após administração oral em camundongos. As inclinações das linhas (β) foram individualmente calculadas utilizando a equação y = α + βx, onde y é o %AA, α a interseção no eixo y e x a dose (log Dose).
Figura 22. Isobolograma construído por meio de experimentos realizados com camundongos em modelo de dor em placa quente. Os pontos na ordenada e na abscissa representam as DE50’s da morfina e LASSBio-981, respectivamente. Note que a DE50 mistura não foi significativamente diferente da DE50 aditiva (P > 0,01), sugerindo uma interação aditiva.
46
4.2 Efeitos em modelos de dor neuropática
4.2.1 Ligadura do nervo espinal
Baseado no fato de que o sucesso da terapêutica farmacológica da dor
neuropática depende da interação simultânea com mais de um alvo terapêutico,
propusemos uma série de experimentos para verificar se a eficiência em reverter
sinais de hiperalgesia térmica e alodinia mecânica em ratos submetidos a LNE
poderia ser aumentada com uso combinatório de agonistas. Foram escolhidas
substâncias classicamente prescritas como a amitriptilina, tramadol e morfina.
4.2.1.1 Combinação entre amitriptilina e tramadol
A Figura 23 mostra que a LNE em L5 reduziu significativamente a latência de
retirada da pata dos animais em resposta ao estímulo térmico 7 dias após a cirurgia,
caracterizando a instalação da hiperalgesia térmica. Não houve diferença na latência
controle e do limiar de retirada da pata no grupo sham.
A latência de retirada da pata dos ratos LNE foi reduzida de 12,9 ± 0,5 s
(controle dia 0) para 7,4 ± 0,3 s (dia 7). Tratamento com amitriptilina (10 mg/kg, n= 5)
aumentou a latência (P < 0,05) para 10,8 ± 0,2 s, efeito máximo observado 14 dias
após cirurgia. O grupo de ratos a ser tratado com tramadol (10 mg/kg) teve a
latência controle reduzida de 13,4 ± 0,7 s (controle dia 0) para 7,0 ± 0,3 s, 7 dias
após cirurgia. O tratamento aumentou a latência (P < 0,05) para 9,6 ± 0,4 s, 8 dias
após cirurgia. A latência controle dos ratos a serem tratados com associação de
tramadol e amitriptilina reduziu de 14,2 ± 0,5 s (controle dia 0) para 7,3 ± 0,4 s, 7
dias após cirurgia, e o tratamento aumentou (P < 0,05) para 10,1 ± 0,5 s, 10,1 ± 0,4
s, efeito máximo observado nos dias 8 e 10 após a cirurgia, respectivamente (Figura
23A). A área sobre a curva (ASC) da amitriptilina e tramadol foi de 200,3 ± 2,0, 192,7
± 5,9 (s.d-1), respectivamente, enquanto a ASC da associação foi de 196,8 ± 4,8 (s.d-
1), não havendo diferença entre os grupos experimentais (Figura 23B).
47
Figura 23. (A) Curso temporal do efeito antinociceptivo da amitriptilina (10 mg/kg, v.o, n= 5), tramadol (10 mg/kg, v.o, n= 5) e associação na latência de retirada da pata em ratos com hiperalgesia térmica devido a LNE. (B) Área sobre a curva determinada pelo método trapezoidal dos grupos experimentais. Os pontos representam a média ± EPM. *P < 0,05 vs dia 0; #P < 0,05 vs dia 7; &P < 0,05 vs LNE associação. aP < 0,05 vs Sham salina; bP < 0,05 vs LNE salina.
A Figura 24A mostra que o limiar controle dos ratos foi reduzido de 50,5 ± 1,5
g (controle dia 0) para 22,9 ± 0,8 g, 7 dias após cirurgia, confirmando o quadro de
alodinia mecânica. O tratamento com amitriptilina (10 mg/kg, n= 5) aumentou o limiar
de retirada para 34,2 ± 1,1 g e 34,0 ± 1,1 g, efeito máximo observado nos dias 10 e
14 após a cirurgia, respectivamente. Os ratos tratados com tramadol (10 mg/kg, n=
5) tiveram o limiar de retirada da pata reduzido de 51,7 ± 1,0 g (controle dia 0) para
22,0 ± 0,7 g, 7 dias após cirurgia, e o tratamento aumentou (P < 0,05) para 31,2 ±
1,4 g, 31,3 ± 0,7 g, 31,2 ± 1,5 g, nos dias 8, 10 e 14 após a cirurgia,
respectivamente.
48
Figura 24. (A) Curso temporal do efeito antinociceptivo da amitriptilina (10 mg/kg, v.o, n= 5), tramadol (10 mg/kg, v.o, n= 5) e associação no limiar de retirada da pata em ratos LNE com alodinia mecânica. (B) Área sobre a curva dos grupos experimentais. Os pontos representam a média ± EPM. *P < 0,05 vs dia 0; #P < 0,05 vs dia 7; &P < 0,05 vs LNE associação. aP < 0,05 vs Sham salina; bP < 0,05 vs LNE salina, cP < 0,05 vs LNE amitriptilina; dP < 0,05 vs LNE tramadol.
Os ratos LNE a serem tratados com associação de tramadol e amitriptilina
tiveram o limiar reduzido de 57,1 ± 1,5 g (controle dia 0) para 27,5 ± 2,1 g, 7 dias
após cirurgia, e o tratamento aumentou (P < 0,05) para 42,5 ± 1,3 g, 10 dias após a
cirurgia (Figura 24A). A área sobre a curva (ASC) da amitriptilina e tramadol foi de
678,5 ± 15,6 e 657,8 ± 14,5 (s.d-1), respectivamente, enquanto a ASC da associação
foi de 783,8 ± 13,1 (s.d-1), havendo diferença entre os grupos experimentais (Figura
24B). O efeito reversor da alodinia mecânica da associação foi significativamente
maior comparado com os fármacos administrados isoladamente.
49
4.2.1.2 Combinação entre LASSBio-981 e tramadol
A Figura 25 mostra que a LNE reduziu a latência e o limiar de retirada da pata
dos ratos em resposta ao estímulo térmico e mecânico, 7 dias após a cirurgia,
caracterizando a instalação da hiperalgesia térmica (A) e alodinia mecânica (B),
respectivamente. Esta alteração não foi vista nos ratos falso-operados (sham). A
latência e limiar de retirada da pata dos ratos com LNE tratados com LASSBio-981
por via oral (10, 20 e 30 mg/kg) foram significativamente aumentados. A dose de 30
mg/kg reverteu a hiperalgesia e alodinia após 7 dias de tratamento.
Figura 25. Curso temporal do efeito antinociceptivo do LASSBio-981 no teste de estimulação térmica (A) e mecânica (B). Os dados representam a média ± EPM (n= 6). *P < 0,05 vs dia 0; #P < 0,05 vs dia 7.
Os ratos submetidos a LNE foram tratados com LASSBio-981 (10 mg/kg),
tramadol (10 mg/kg) ou associação. A latência de retirada da pata foi
significativamente reduzida de 13,0 ± 1,1 s para 7,0 ± 0,1 s (n= 5), 7 dias após
cirurgia. Após tratamento com LASSBio-981 (10 mg/kg, v.o, n= 5) a latência
aumentou (P < 0,05) para 10,2 ± 0,2 s, 14 dias após cirurgia. Os ratos LNE tratados
50
com tramadol (10 mg/kg,v.o, n= 5) tiveram a latência de retirada da pata reduzida de
13,4 ± 0,7 s para 7,0 ± 0,3 s, 7 dias após cirurgia. O tratamento aumentou a latência
(P < 0,05) para 9,6 ± 0,4 s, efeito máximo observado 8 dias após cirurgia.
Figura 26. (A) Efeito antinociceptivo do LASSBio-981 (10 mg/kg, v.o, n= 5), tramadol (10 mg/kg, v.o, n= 5) e associação, em ratos LNE com hiperalgesia térmica. (B) Área sobre a curva medida pelo método trapezoidal dos grupos experimentais. Os pontos representam a média ± EPM. *P < 0,05 vs dia 0; #P < 0,05 vs dia 7. aP < 0,05 vs Sham DMSO; bP < 0,05 vs LNE DMSO.
O grupo de animais LNE tratado com associação teve a latência de retirada
da pata aumentada (P < 0,05) para 9,7 ± 0,5 s, 14 dias após cirurgia (Figura 26A). A
área sob a curva (ASC) do LASSBio-981 (192,8 ± 8,3 s.d-1), tramadol (192,7 ± 5,9
s.d-1) e associação (204,9 ± 3,5 s.d-1) demonstra que não houve diferença entre os
grupos experimentais (Figura 26B).
A Figura 27A mostra que a LNE reduziu significativamente o limiar ao teste
mecânico. O limiar de retirada da pata foi reduzido de 53,0 ± 1,2 g (controle dia 0)
para 21,7 ± 1,4 g (dia 7), confirmando o estabelecimento da alodinia mecânica.
51
Tratamento com LASSBio-981 (10 mg/kg, n= 5), elevou o limiar (P < 0,05) para 36,2
± 2,1 g, efeito máximo observado 14 dias após a cirurgia.
Figura 27. Atividade antinociceptiva do LASSBio-981 (10 mg/kg, v.o, n= 5), tramadol (10 mg/kg, v.o, n= 5) e associação em ratos LNE com alodinia mecânica. Os pontos representam a média ± EPM. *P < 0,05 vs dia 0; #P < 0,05 vs dia 7. aP < 0,05 vs Sham DMSO; bP < 0,05 vs LNE DMSO, cP < 0,05 vs LNE LASSBio-981; dP < 0,05 vs LNE tramadol.
No grupo de animais LNE tratado com tramadol (10 mg/kg, n= 5), o limiar
mecânico de retirada da pata foi reduzido de 51,7 ± 1,0 g para 22,0 ± 0,7 g, 7 dias
após cirurgia. Com o tratamento houve aumento (P < 0,05) do limiar para 31,3 ± 0,7
g, 10 dias após a cirurgia, enquanto, os animais LNE tratados com associação
tiveram o limiar aumentado para 33,2 ± 0,5 g, 14 dias após a cirurgia. A área sobre a
curva (ASC) do LASSBio-981 (678,6 ± 15,8 s.d-1), tramadol (657,8 ± 14,5 s.d-1) e
associação (734,3 ± 3,0 s.d-1) demonstra que houve diferença entre os grupos
experimentais, ou seja, a atividade antinociceptiva da associação foi maior do que as
substâncias administradas individualmente (Figura 27B).
52
4.2.1.3 Combinação entre LASSBio-981 e amitriptilina
A Figura 28A mostra o desenvolvimento da hiperalgesia térmica em ratos LNE
e o efeito antinociceptivo de LASSBio-981 (10 mg/kg, v.o., n= 5), amitriptilina (2,5
mg/kg, v.o., n= 5) e associação no teste de estimulação térmica.
Figura 28. Efeito antinociceptivo do LASSBio-981, amitriptilina e associação na latência de retirada da pata em ratos LNE com hiperalgesia térmica. Os pontos representam a média ± EPM (n= 5). *P < 0,05 vs dia 0; #P < 0,05 vs dia 7. aP < 0,05 vs Sham DMSO; bP < 0,05 vs LNE DMSO
Os resultados da latência e limiar de retirada da pata dos animais LNE
tratados com LASSBio-981 foram descritos anteriormente (Figura 26 e 27). A partir
dos resultados anteriores com amitriptilina (10 mg/kg) foi utilizada a dose de 2,5
mg/kg da mesma, com intuito de reduzir possíveis efeitos adversos e potencializar o
efeito antinociceptivo do LASSBio-981. No grupo de animais LNE, a latência de
retirada da pata foi reduzida de 13,1 ± 0,3 s para 7,3 ± 0,5 s, 7 dias após a cirurgia.
O tratamento com amitriptilina (2,5 mg/kg) aumentou a latência (P < 0,05) para 9,5 ±
0,2 s, efeito máximo observado em 10 dias após cirurgia. Entretanto, os animais
53
LNE tratados com a associação LASSBio-981 e amitriptilina tiveram um aumento da
latência (P < 0,05) para 10,2 ± 0,5 s, 10 dias após cirurgia. A área sobre a curva
(ASC) do LASSBio-981 (192,8 ± 8,3 s.d-1), amitriptilina (191,3 ± 3,0 s.d-1) e
associação (192,0 ± 4,0 s.d-1) demonstra que não houve diferença entre os grupos
experimentais (Figura 28B).
Figura 29. Efeito antinociceptivo do LASSBio-981, amitriptilina e associação no limiar de retirada da pata em animais LNE com alodinia mecânica. Os pontos representam a média ± EPM (n= 5). *P < 0,05 vs dia 0; #P < 0,05 vs dia 7; &P < 0,05 vs LNE associação. aP < 0,05 vs Sham DMSO; bP < 0,05 vs LNE DMSO, cP < 0,05 vs LNE LASSBio-981.
Os resultados que avaliam o limiar de retirada da pata dos ratos LNE ao
estimulo mecânico tratados com LASSBio-981 (10 mg/kg) foi descrito anteriormente.
O limiar de retirada da pata do grupo de animais submetidos a LNE reduziu de 52,3
± 0,8 g (controle dia 0) para 27,4 ± 1,1 g, 7 dias após cirurgia, confirmando a
instalação de alodinia mecânica e, quando tratados com amitriptilina (2,5 mg/kg), o
limiar foi significativamente aumentado para 32,4 ± 0,6 g e 32,4 ± 0,8 g nos dias 10 e
14 após cirurgia, respectivamente. No grupo tratado com a associação de LASSBio-
981 com amitriptilina, o limiar de retirada da pata reduziu de 57,5 ± 2,3 g (controle
54
dia 0) para 21,6 ± 1,2 g (dia 7) e o tratamento aumentou (P < 0,05) o limiar para 39,6
± 1,8 g, efeito máximo observado em 10 dias após cirurgia (Figura 29A). A área sob
a curva (ASC) do LASSBio-981 (678,6 ± 15,8 s.d-1), amitriptilina (706,2 ± 9,9 s.d-1) e
associação (741,6 ± 8,9 s.d-1), demonstra diferença significativa entre os grupos de
animais LNE tratados com o LASSBio-981 e associação das substâncias (Figura
29B).
Baseado nos resultados obtidos com a associação de LASSBio-981 (10
mg/kg) e amitriptilina (2,5 mg/kg), a dose do derivado LASSBio-981 foi aumentada
para 20 mg/kg com intuito de observar possível aumento do efeito antinociceptivo da
combinação.
Figura 30. Atividade antinociceptiva do LASSBio-981 (20 mg/kg, v.o.), amitriptilina (2.5 mg/kg, v.o.) e associação na latência de retirada da pata em ratos LNE com hiperalgesia térmica. Os pontos representam a média ± EPM (n= 5). *P < 0,05 vs dia 0; #P < 0,05 vs dia 7; &P < 0,05 vs LNE associação. aP < 0,05 vs Sham DMSO; bP < 0,05 vs LNE DMSO, cP < 0,05 vs LNE LASSBio-981, dP < 0,05 vs LNE amitriptilina.
No grupo controle, a latência de retirada da pata foi reduzida de 14,0 ± 0,8 s
(n= 5) (controle dia 0) para 7,3 ± 0,4 s (n= 5), 7 dias após a cirurgia. O tratamento
55
com LASSBio-981 (20 mg/kg, n= 5) aumentou a latência (P < 0,05) para 9,7 ± 0,2 s,
efeito máximo observado 10 dias após cirurgia. Neste grupo, a latência permaneceu
significativamente aumentada mesmo após 3 dias da suspensão do tratamento. No
grupo de animais LNE a ser tratado com amitriptilina (2,5 mg/kg), a latência de
retirada da pata foi reduzida de 13,2 ± 0,3 s (n= 5) para 7,3 ± 0,5 s (n= 5), 7 dias
após a cirurgia. O tratamento aumentou a latência (P < 0,05) para 9,5 ± 0,2 s, 10
dias após cirurgia. A latência do grupo de animais tratados com a associação
reduziu no controle de 12,2 ± 0,8 s (n= 5) para 7,4 ± 0,4 s (n= 5), 7 dias após
cirurgia. O tratamento aumentou a latência (P < 0,05) para 11,7 ± 0,7 s (n= 5), 11,6 ±
0,5 s (n= 5), observados nos dias 10 e 14 após cirurgia, respectivamente (Figura
30A). A área sob a curva do LASSBio-981 (199,4 ± 3,7 s.d-1), amitriptilina (190,3 ±
3,7 s.d-1) e associação (215,9 ± 4,7 s.d-1) mostra diferença (P < 0,05) entre os
grupos experimentais, e que o efeito antinociceptivo da associação foi maior do que
os fármacos administrados isoladamente (Figura 30B).
Figura 31. Atividade antinociceptiva do LASSBio-981 (20 mg/kg, v.o, n= 5), amitriptilina (2,5 mg/kg, v.o, n= 4) e associação no limiar de retirada da pata em ratos LNE com alodinia mecânica. Os pontos representam a média ± EPM (n= 5). *P < 0,05 vs dia 0; #P < 0,05 vs dia 7; &P < 0,05 vs LNE associação. cP < 0,05 vs LNE LASSBio-981.
56
A Figura 31A mostra que a ligadura do nervo espinal reduziu o limiar controle
dos animais tratados com LASSBio-981 (20 mg/kg, n= 5) de 39,8 ± 0,5 g (controle
dia 0) para 19,0 ± 0,9 g, 7 dias após cirurgia, confirmando o quadro de alodinia
mecânica. O tratamento aumentou o limiar de retirada para 28,7 ± 0,3 g, efeito
máximo observado 14 dias após a cirurgia.
O limiar de retirada da pata do grupo de animais LNE tratado com amitriptilina
reduziu o controle de 44,9 ± 1,8 g (controle dia 0) (n= 5) para 22,4 ± 1,8 g (n= 5), 7
dias após cirurgia, e quando tratados, aumentou para 29,8 ± 1,8 g, 10 dias após
cirurgia. O limiar controle dos animais tratados com associação foi reduzido de 39,6
± 0,3 g (n= 5) para 18,3 ± 1,3 g (n= 5), 7 dias após cirurgia, e o tratamento aumentou
(P < 0,05) para 34,4 ± 0,9 g, efeito máximo observado em 14 dias após a cirurgia. A
área sob a curva do LASSBio-981 (559,9 ± 8,5 s.d-1), amitriptilina (609,7 ± 16,4 s.d-1)
e associação (595,2 ± 9,1 s.d-1) mostrou que o efeito antinociceptivo da associação
foi maior do que LASSBio-981 (Figura 31B).
4.2.2 Efeito do LASSBio-981 na tolerância antinociceptiva à morfina
A Figura 32 mostra estabelecimento da tolerância progressiva ao efeito
antinociceptivo após infusão contínua de morfina através da mini-bomba osmótica
caracterizada pelo retorno dos sinais de hiperalgesia térmica e alodinia mecânica à
nível pré-infusão, em ratos submetidos a ligadura do nervo espinal. Este grupo
experimental serviu de padrão para avaliações posteriores.
Latência de retirada da pata de animais submetidos à LNE em resposta a
estimulação térmica foi reduzida de 11,4 ± 0,2 para 7,5 ± 0,3 s (n= 4) (P < 0,05) após
7 dias da cirurgia e aumentou para 12,0 ± 1,4 s (P < 0,05) 1 dia após infusão da
solução de morfina (2,5 mg/kg/dia, i.p.) (Figura 32A). Não foi observado efeito
antinociceptivo após infusão da salina. Tolerância à morfina foi tempo-dependente e
a latência de retirada da pata retornou ao nível do controle, ou seja, antes da infusão
de morfina (8,3 ± 1,5 s) (Figure 32A).
Limiar de retirada da pata a estimulação mecânica foi reduzido de 35,9 ± 0,3
para 16,2 ± 0,4 g, 7 dias após LNE e aumentou para 34,6 ± 0,6 g (P < 0,05) 1 dia
após infusão de morfina. O limiar de retirada para estimulação mecânica também foi
reduzida tempo-dependente durante 16 dias de infusão contínua, retornando ao
controle antes da infusão (Figura 32B).
57
0
4
8
12
16
7 10 13 16 19 23
Infusão
#
#
#
0
* ***
**
* * *
Infusão de morfina
Infusão de salina
LNE
*
A
Dias após cirurgia
La
tên
cia
(s)
0
10
20
30
40
50
0 7 10 13 16 19 23
Infusão
##
#
#
* * ** * *
LNE
B
Dias após cirurgiaL
imia
r (g
)
Figura 32. Curso temporal de desenvolvimento da tolerância à morfina. A morfina foi administrada utilizando (2,5 mg/kg/dia, i.p) mini bombas osmóticas da Alzet. A) Latência em resposta a estimulação térmica nas patas de ratos submetidos a LNE. B) Limiar de retirada da pata em resposta a estimulação mecânica. Os pontos representam a média ± SEM (n = 4). *P < 0,05 vs dia 0; #P < 0,05 vs dia 7.
4.2.2.1 Efeito do LASSBio-981 na prevenção da tolerância à morfina
Os animais foram submetidos à LNE e após o estabelecimento da
hiperalgesia térmica e alodinia mecânica, a morfina foi infundida durante 23 dias.
Latência de retirada da pata a estimulação térmica foi reduzida (P < 0,05, n= 4) para
todos os grupos (LASSBio-981, amitriptilina e DMSO) 7 dias após LNE (P < 0,05)
(Figura 33) e aumentou a nível de controle, 1 dia após infusão da morfina. A
coadministração da amitriptilina (10 mg/kg, v.o) não alterou o curso temporal do
desenvolvimento da tolerância induzida pela morfina, na qual foi totalmente
prevenida pelo LASSBio-981 (10 mg/kg, v.o) (Figure 33).
58
0
4
8
12
16
0 7 10 13 16 19 23 26 30
Morfina
Tratamento
# # # # #
*
*#
#
*
*
*
*
* *
# ##
##
#
LNE
LASSBio-981 10 mg/kg
Amitriptilina 10 mg/kg
DMSO
Dias após cirurgia
La
tên
cia
(s)
Figura 33. Efeito antinociceptivo do LASSBio-981 e amitriptilina avaliado no teste de retirada da pata em resposta a estimulação térmica em ratos submetidos a LNE. A morfina (2,5 mg/kg/dia i.p.) foi administrada por infusão contínua e LASSBio-981 (10 mg/kg, v.o), amitriptilina (10 mg/kg, v.o) e DMSO foram administrados diariamente durante 16 dias. *P < 0,05 vs dia 0; #P < 0,05 morfina vs dia 7. Os pontos representam a média ± EPM (n= 4).
Limiar de retirada da pata a estimulação mecânica foi significativamente
reduzida para todos os grupos experimentais (LASSBio-981, amitriptilina e DMSO) 7
dias após LNE (P < 0,05) (Figura 34) na qual retornou ao nível do controle, 1 dia
após infusão de morfina. A coadministração de amitriptilina (10 mg/kg, v.o) preveniu
parcialmente a tolerância após 12-16 dias de administração. Entretanto, a tolerância
à morfina foi totalmente prevenida pela administração do LASSBio-981 (10 mg/kg,
v.o) durante 16 dias (Figura 34). Esse efeito foi espontaneamente revertido após
suspensão da administração do LASSBio-981.
59
0
10
20
30
40
50
60
0 7 10 13 16 19 23 26 30
* #
#
# #
#
Morfina
Tratamento
*
#
###
#
#
##
*
*
*
* * *
LNE
#
#
LASSBio-981 10 mg/kg
Amitriptilina 10 mg/kg
DMSO
Dias após cirurgia
Lim
iar
(g)
Figura 34. Atividade antinociceptiva do LASSBio-981 e amitriptilina avaliada no teste de retirada da pata em resposta a estimulação mecânica em ratos submetidos a LNE. A morfina (2,5 mg/kg/dia) foi administrada por infusão contínua por i.p, e LASSBio-981 (10 mg/kg, v.o), amitriptilina (10 mg/kg, v.o) e DMSO foram administrados diariamente de forma intermitente 1 vez ao dia durante 16 dias. *P < 0,05 vs dia 0; #P < 0,05 morfina vs dia 7. Os pontos representam a média ± EPM (n= 4).
4.2.2.2 Efeito do LASSBio-981 na reversão da tolerância à morfina
As Figuras 35 e 36 mostram os resultados de três grupos experimentais, na
qual LASSBio-981, amitriptilina ou DMSO foi administrado por gavage após
estabelecimento da tolerância à morfina. A latência e o limiar de retirada da pata a
estimulação térmica ou mecânica, respectivamente foram reduzidas 7 dias após
LNE (P < 0,05) e aumentaram ao nível do controle, 1 dia após infusão de morfina
(Figura 35 e 36). Tolerância antinociceptiva à morfina foi gradualmente observada
durante 16 dias de infusão de morfina, retornando ao valor controle antes da infusão.
Ausência de efeito antinociceptivo foi notada com administração do veículo DMSO.
A latência para estimulação térmica aumentou de 8,0 ± 0,3 s para 10,2 ± 0,5 s
(P < 0,05) 14 dias após administração da amitriptilina (10 mg/kg) e de 7.7 ± 0.2 para
13,3 ± 1,2 s (P < 0,05) após tratamento com LASSBio-981(10 mg/kg) (Figura 35).
Amitriptilina e LASSBio-981 aumentou significativamente o limiar de retirada da pata
de 19,9 ± 1,0 para 29,0 ± 1,1 g e de 21,0 ± 0,6 para 37,0 ± 0,1 g (P < 0,05),
respectivamente (Figura 36).
60
0
4
8
12
16
7 13 19 26 33 37
Morfina
Tratamento
*
#
#
#
0
** *
*
#
# #
# ##
**
####
*
#
#
#
#
LNE
Amitriptilina 10 mg/kg
DMSO
LASSBio-981 10 mg/kg
Dias após cirurgia
La
tên
cia
(s)
Figura 35. Reversão da tolerância induzida pela morfina ao efeito antinociceptivo da hiperalgesia térmica em ratos, pelo LASSBio-981 e amitriptilina. LASSBio-981 (10 mg/kg, v.o), amitriptilina (10 mg/kg, v.o) ou DMSO foi administrado uma vez ao dia durante 14 dias após desenvolvimento da tolerância à morfina. Os pontos representam a média ± EPM (n= 4). *P < 0,05 versus dia 0; #P < 0,05 versus dia 7.
0
10
20
30
40
50
60
0 7 13 19 26 33 37
Morfina
Tratamento
# #
##
* ****
*
#
###
###
#
# # #
#
#
# #
LNE
DMSO
Amitriptilina 10 mg/kg
LASSBio-981 10 mg/kg
Dias após cirurgia
Lim
iar
(g)
Figura 36. Reversão da tolerância induzida pela morfina ao efeito antinociceptivo da alodinia mecânica em ratos, pelo LASSBio-981 e amitriptilina. LASSBio-981 (10 mg/kg, v.o), amitriptilina (10 mg/kg, v.o) ou DMSO foi administrado uma vez ao dia durante 14 dias após desenvolvimento da tolerância à morfina. Os pontos representam a média ± EPM (n= 4). *P < 0.05 versus dia 0; #P < 0.05 versus dia 7.
61
4.2.2.3 Mecanismo do LASSBio-981 na reversão da tolerância à morfina
Resultados anteriores do laboratório indicaram que o efeito antinociceptivo do
derivado do zolpidem LASSBio-873 resultava de sua interação com o receptor
muscarínico M2 na medula espinal (MENDES et al., 2013). Neste sentido,
experimentos preliminares foram realizados para certificar se esta hipótese se
confirmava com o LASSBio-981, também derivado do zolpidem. A Figura 37 mostra
que atividade analgésica causada pela administração intratecal do LASSBio-981 (10
µg) em rato foi de 18,5 ± 4,2% (n= 6) bem próxima do controle positivo morfina (10
µg) que foi de 26,5 ± 5,9% (n= 6). A coadministração de metoctramina (antagonista
do receptor muscarínico M2) inibiu por completo o efeito antinociceptivo do LASSBio-
981 (Figura 37).
0 15 30 45 60 750
10
20
30
40
Morfina 10 µg
LASSBio-981 10 µg
LASSBio-981 + Metoctramina 10 µg
*
*
Veículo
#
#
Tempo (min)
% A
A
Figura 37. Curso temporal da atividade analgésica (%AA) do LASSBio-981, morfina e LASSBio-981 + metoctramina administrados por via intratecal. *P < 0,05 vs. metoctramina. Os pontos representam a média ± EPM (n= 6).
O resultado anterior serviu de base para a realização do protocolo cujos
resultados estão apresentados a seguir. A Figura 38A mostra que administração
diária de LASSBio-981 (10 mg/kg, v.o) reverteu a tolerância induzida pela morfina de
62
forma completa e mantida. Após 7 dias de administração, o efeito do LASSBio-981
foi revertido pela injeção intratecal de metoctramina (10 µg), atingindo o seu máximo
em 30 minutos, seguido de reversão espontânea (Figura 38B).
0
4
8
12
16
0 7 10 13 16 19 23 26 30
LASSBio-981
Morfina
*
#
# ##
#
**
#
*
LNE
A
Dias após cirurgia
La
tên
cia
(s)
0
4
8
12
16
0 30 60 90 120 150
Morfina
†
† †
†
Metoctramina
B
Tempo (min)
La
tên
cia
(s)
Figura 38. Antagonismo do efeito do LASSBio-981 na reversão da tolerância induzida pela morfina em ratos com sinais de hiperalgesia térmica, pela metoctramina (antagonista do receptor muscarínico M2). A) LASSBio-981 (10 mg/kg) foi administrado por via oral durante 7 dias para reverter a tolerância induzida morfina. B) Ao final do tratamento com LASSBio-981, metoctramina (10 μg) foi administrada pela via intratecal. *P < 0,05 após cirurgia vs dia 0; # P < 0,05 morfina vs dia 7; †P < 0,05 vs tempo 0. Os pontos representam a média ± EPM (n= 4).
4.2.3 Neuropatia diabética
A Tabela 1 mostra que a injeção intravenosa de estreptozotocina (60 mg/kg)
aumentou significativamente (P < 0,05) a glicemia, entretanto, não alterou
significativamente a massa corporal mensuradas após 28 dias. O tratamento dos
ratos diabéticos com veículo (DMSO), amitriptilina (10 mg/kg) e LASSBio-981 (1, 10
e 30 mg/kg) durante 7 dias, não alterou a glicemia ou massa corporal.
63
Tabela 1. Efeito do LASSBio-981 no início e final do tratamento, na glicemia e massa corporal de ratos diabéticos induzidos pela estreptozotocina (60 mg/kg, i.v.). @P < 0,05 vs animal normal. Os dados estão representados como média ± EPM (n= 6).
Grupos experimentais Massa corporal (g)
Inicial final
Glicemia (mg/dl)
Inicial final
Animal normal 184,0 + 6,0 218,7 + 4,4 135,0 ± 3,5 111,5 ± 5,0
Diabético DMSO 232,0 + 12,2 225,0 + 8,7 469,0 ± 47,8 @ 522,3 ± 45,7 @
Diabético amitriptilina 221,8 + 15,5 208,5 + 17,5 552,2 ± 29,8 @ 600,0 ± 0,0 @
Diabético LASSBio-981 1 mg/kg 219,2 + 11,5 219,8 + 12,2 521,8 ± 48,3 @ 476,8 ± 37,0 @
Diabético LASSBio-981 10 mg/kg 189,3 + 13,5 204,0 + 13,0 541,3 ± 26,6 @ 554,0 ± 29,5 @
Diabético LASSBio-981 30 mg/kg 206,6 + 7,9 215,0 + 6,8 583,0 ± 7,6 @ 556,4 ± 20,2 @
4.2.3.1 Efeito antinociceptivo do LASSBio-981 na hiperalgesia térmica e alodinia
mecânica em ratos diabéticos
As Figuras 39 e 40 mostram que os animais diabéticos desenvolveram a
hiperalgesia térmica e alodinia mecânica ao longo de 4 semanas, respectivamente.
As doses do LASSBio-981 foram selecionadas de acordo com trabalho descrito por
Mendes (2010), sendo avaliadas no modelo de ligadura do nervo espinal.
A latência de retirada da pata ao estímulo térmico dos animais diabéticos
reduziu de 13,3 ± 1,1 s (controle dia 0) (n= 6) para 8,4 ± 0,5 s (após 28 dias) (n= 6, P
< 0,05). O tratamento com LASSBio-981 aumentou a latência de retirada da pata de
forma dose-dependente. A dose de 30 mg/kg (v.o, n= 6) aumentou (P < 0,05) a
latência para 11,3 ± 0,7 s, 12,0 ± 0,7 s, 12,4 ± 0,7 s e 10,7 ± 0,5 s nos dias 29, 31 e
35 após indução da diabetes.
No grupo da amitriptilina (10 mg/kg v.o, n=6) a latência de retirada da pata foi
reduzida (P < 0,05) de 12,0 ± 1,0 s (controle dia 0) para 7,4 ± 0,2 s (após 28 dias), e
quando tratado aumentou a latência (P < 0,05) para 8,7 ± 0,3 s, 10,5 ± 1,0 s, 10,2 ±
0,2 s nos dias 29, 31 e 35, respectivamente (Figura 39).
64
0
4
8
12
16
Diabético amitriptilina 10 mg/kg
0 28 31 35 38 42
Diabético LASSBio-981 1 mg/kg
Diabético LASSBio-981 10 mg/kg
Diabético LASSBio-981 30 mg/kg
Diabético DMSO
Normal DMSO
*
## #
**
#
STZ
Tratamento
#
* * ** * **
Dias após indução
La
tên
cia
(s)
Figura 39. Efeito antinociceptivo do LASSBio-981 (1, 10 e 30 mg/kg, v.o), amitriptilina (10 mg/kg, v.o) e DMSO (v.o.) na latência de retirada da pata em ratos com hiperalgesia térmica induzida pela administração da estreptozotocina. *P < 0,05 vs dia 0; #P < 0,05 vs dia 28. Os pontos representam a média ± EPM (n= 6).
A Figura 40 mostra redução do limiar de retirada da pata ao estímulo
mecânico nos animais diabetes de 38,9 ± 0,8 g (controle dia 0) para 24,2 ± 2,0 g
(após 28 dias) (P < 0,05). O tratamento diário com LASSBio-981 aumentou este
limiar de forma dose-dependente. Assim, na dose de 30 mg/kg (v.o, n= 6) aumentou
(P < 0,05) para 33,2 ± 0,7 g, 38,9 ± 0,7 g, 36,9 ± 1,2 g, 35,4 ± 0,7 g e 29,6 ± 0,7 g,
nos dias 29, 31, 35, 36 e 38 após indução da diabetes, respectivamente.
A resposta ao tratamento com o LASSBio-981 foi superior ao tratamento com
a amitriptilina. Neste grupo de ratos diabéticos, o limiar ao estímulo mecânico
reduziu de 40,2 ± 1,0 g (controle dia 0) para 21,1 ± 1,5 g (após 28 dias) (P < 0,05) e
o tratamento com amitriptilina (10 mg/kg, v.o, n= 6) aumentou parcialmente o limiar
(P < 0,05) para 29,3 ± 1,1 g (Figura 40).
65
0
10
20
30
40
50
Diabético amitriptilina 10 mg/kg
0 28 31 35 38 42
Diabético LASSBio-981 1 mg/kg
Diabético LASSBio-981 10 mg/kg
Diabético LASSBio-981 30 mg/kg
Diabético DMSO
Normal DMSO
*
# #
## #
*
#
STZ
Tratamento
** * * *
*
* *
Dias após indução
Lim
iar
(g)
Figura 40. Efeito antinociceptivo do LASSBio-981 (1, 10 e 30 mg/kg, v.o), amitriptilina (10 mg/kg, v.o) e DMSO (v.o) no limiar de retirada da pata em ratos com alodinia mecânica induzida pela administração de estreptozotocina. *P < 0,05 vs dia 0; #P < 0,05 vs dia 28. Os pontos representam a média ± EPM, n= 6.
4.3 Efeito do LASSBio-981 na atividade locomotora
Medida da atividade motora em modelo de campo aberto é um teste bastante
importante para verificação de efeito sedativo no desenvolvimento de fármacos. Os
ratos foram tratados com LASSBio-981 (10 e 30 mg/kg v.o.) e DMSO (v.o.) durante 7
dias. Atividade locomotora foi medida durante 40 minutos na manhã seguinte da
última dose administrada. A Figura 41 mostra que a atividade motora não foi
modificada pelo LASSBio-981 na dose de 10 mg/kg ou pelo DMSO. Entretanto, na
dose de 30 mg/kg a atividade motora foi reduzida de 97,7 ± 15,4 para 56,7 ± 10,2 (P
< 0,05).
66
0
50
100
150
DMSO 10 mg/kg 30 mg/kg
#
Controle
7 dias
Mo
vim
en
tos/m
inu
to
Figura 41. Atividade locomotora de ratos normais tratados durante 7 dias com LASSBio-981 ou com o veículo (DMSO) administrados pela via oral. A avaliação foi realizada 24 horas após a última administração. As barras representam a média ± EPM (n= 4). #P < 0,05 vs DMSO (7 dias).
4.4 Ancoramento molecular do LASSBio-981 na estrutura cristalográfica dos
receptores muscarínico M2 e µ opióide
O desvio padrão entre o resultado do reancoramento de QBN (Figura 42A) e
sua estrutura cocristalizada é representado pelo valor de RMSD (do inglês Root
Mean Square Deviation). Dentre as funções de pontuação utilizadas para o receptor
M2, a melhor função foi a goldscore. A função GoldScore obteve o menor valor de
RMSD (0,43 Å) para todos os átomos. Quanto menor o valor de RMSD mais próximo
do resultado experimental fica a orientação obtida no ancoramento molecular,
validando assim a função de pontuação escolhida. Após avaliação dos resultados de
ancoramento do LASSBio-981, um ancoramento semirrígido foi realizado conferindo
a flexibilidade para a cadeia lateral de Thr187, devido à sua proximidade com um
grupo aceptor de ligação de hidrogênio no LASSBio-981. Como esperado, a
metodologia semirrígida forneceu uma maior pontuação do que a metodologia rígida,
sendo a melhor orientação associada à escolhida para análises posteriores.
O reancoramento de β-FNA foi muito similar a sua estrutura cocristalizada,
com um RMSD de 2,6 Å para todos os átomos (Figura 42B). Foi utilizada a função
de pontuação ChemPLP por apresentar melhor resultado. No estudo de
67
ancoramento molecular do composto no receptor µ opióide foi utilizado o método
semirrígido, conferindo a flexibilidade para a cadeia lateral de Lys233, devido à sua
proximidade com um grupo aceptor de ligação de hidrogênio no LASSBio-981. A
metodologia semirrígida forneceu uma maior pontuação do que a metodologia rígida.
Figura 42. Validação do programa de ancoramento GOLD 5,2 e a função de ajuste padrão ChemPLP (A) Superposição da conformação de QBN na estrutura do cristal do receptor muscarinico M2 (azul claro) e obtida após o reancoramento (rosa), RMSD= 0,43 Å. (B) Sobreposição do composto β-FNA cocristalizado (rosa) e o resultado (verde) obtido a partir do seu ancoramento molecular no receptor µ-opióide (PDB 4DKL), RMSD= 2,6 Å.
O ancoramento molecular mostrou o LASSBio-981 interagindo principalmente
no sítio de ligação ortostérico do receptor muscarínico M2 por duas ligações de
hidrogênio entre a região pirazolo-piridina e grupos hidroxila dos resíduos Tyr426
(JAKUBÍK; RANDÁKOVÁ; DOLEŽAL, 2013) e Thr187 (JAKUBÍK; RANDÁKOVÁ;
DOLEŽAL, 2013). Também pode ser observado que os aminoácidos Trp155
(JAKUBÍK; RANDÁKOVÁ; DOLEŽAL, 2013), Trp400 (MIAO et al., 2013) e Tyr403
(VOGEL; SHEEHAN; SCHIMERLIK, 1997) se encontram próximos ao composto
podendo realizar interações hidrofóbicas (Figura 43A). Entretanto pode se observar
que o composto pode interagir com o receptor µ opióide por ligações hidrogênios
entre a região 1 fenil-pirrol-2,5-diona e os grupos RNH3 do resíduo Lys233 (ZHANG
et al., 2005) e hidroxila do resíduo Tyr148 (XU et al., 1999). O aminoácido lle144 se
encontra próximo ao composto LASSBio-981, sendo passível de ocorrer interações
hidrofóbicas (Figura 43B).
68
Figura 43. (A) Interações moleculares do LASSBio-981 no sítio ativo do receptor muscarínico M2, e a proximidade do resíduo Trp422, aminoácido importante para modulação alostérica; (B) interações entre o LASSBio-981 e o receptor µ-opióide. As linhas tracejadas representam as interações por ligação de hidrogênio.
5 DISCUSSÃO
No presente projeto foi investigado o efeito antinociceptivo do LASSBio-981
administrado pela via intratecal ou oral em modelo de dor aguda, neuropática e
tolerância à morfina. Demonstrou-se que a combinação do derivado com a morfina
produz interação farmacológica do tipo aditiva. O derivado possui efeito analgésico
em modelos de dor neuropática de diferentes origens. Esse efeito depende da
ativação espinal do receptor muscarínico M2. A dose que previne e reverte a
tolerância à morfina não altera a atividade locomotora dos animais. Os estudos de
ancoramento molecular demonstraram que o derivado interage no sítio de ligação
ortostérico dos receptores muscarínico M2 e µ-opióide e validam os resultados
prévios do laboratório.
Com interesse voltado ao desenvolvimento de novas substâncias aplicadas
ao tratamento da dor, Menegatti et al. (2006) planejaram, sintetizaram e
descreveram os efeitos antinociceptivos de derivados heterocíclicos obtidos por
modificações bioisostéricas na molécula do zolpidem, LASSBio-872, LASSBio-873,
LASSBio-980 e LASSBio-981, em modelo de dor aguda e inflamatória em
camundongos, após administração pela via intraperitoneal (MENEGATTI et al., 2006
69
e MENDES et al., 2009). Dados experimentais realizados em camundongos
revelaram os receptores opióides e muscarínicos como prováveis alvos de ação
destas substâncias.
Dentre os derivados do zolpidem sintetizados, o foco do nosso estudo foi o
LASSBio-981, desta vez administrada pela via oral. Numa primeira abordagem,
realizada em camundongos pode-se constatar atividade antinociceptiva do LASSBio-
981 em modelo de dor aguda (placa quente), compatível com absorção significativa
desta substância pelo trato gastrointestinal. A seguir, por meio da construção de um
isobolograma evidenciou-se interação aditiva entre o LASSBio-981 com a morfina.
Combinação de fármacos é uma abordagem que permite ativar
simultaneamente diferentes alvos farmacológicos e, possivelmente aumentar a
eficácia terapêutica, diminuir a dose, minimizar ou reduzir o desenvolvimento da
resistência a fármacos (CHOU, 2006). Alguns trabalhos exploram esta hipótese com
intuito de obter sinergismo ou adição para o tratamento da dor (PETTERSEN et al.,
2009; SUDO et al., 2010). Seguindo nesta linha, trabalhos prévios do laboratório
demonstraram sinergismo ao efeito antinociceptivo entre o inibidor seletivo da
recaptação de noradrenalina, maprotilina com a morfina (PETTERSEN et al. 2009) e
do agonista α2-adrenérgico derivado imidazolidínico, PT-31 com a morfina (SUDO et
al. 2010).
Envolvimento do receptor muscarínico tem sido relacionado com a ação do
derivado do zolpidem, LASSBio-873 (MENDES et al., 2013), no qual o efeito
antinociceptivo desta substância foi revertido pela administração intratecal do
antagonista do receptor M2 metoctramina, em ratos submetidos a LNE. A interação
dos neurônios colinérgicos com a morfina no sistema nervoso central tem sido
descrita. Os efeitos antinociceptivos induzidos pela morfina envolve em parte
ativação dos receptores muscarínicos M1 e M3 na medula ventrolateral rostral de
ratos (ABE et al., 2003). Em nosso estudo, a coadministração oral de LASSBio-981
e morfina em diferentes proporções da DE50 produziu uma interação aditiva em
camundongos submetidos ao teste da placa-quente.
Em estudo prévio demonstramos que o LASSBio-873 administrado pela via
oral foi efetivo em reduzir a hiperalgesia térmica e alodinia mecânica em ratos com
LNE (MENDES et al., 2013). Também caracterizou-se que a mesma intensidade de
efeito pode ser alcançada com dose 3 vezes menor de LASSBio-981 administrado
pela mesma via (MENDES, 2010; MENDES et al., 2013). Este resultado foi
70
determinante para a escolha do LASSBio-981 nas futuras investigações visando o
desenvolvimento de uma nova substância para o tratamento da dor neuropática,
com um perfil químico diferentes dos fármacos usuais.
Face a complexidade da fisiopatologia da dor neuropática e a atuação
terapêutica multi-alvo, protocolos experimentais combinando o LASSBio-981 a
fármacos de uso foram idealizados. De fato, a atividade antinociceptiva do LASSBio-
981 em reverter a hiperalgesia térmica e alodinia mecânica induzida pela LNE em
ratos foi aumentada na presença de amitriptilina, substância que inibe a recaptação
de serotonina e norepinefrina. Esse resultado não foi observado quando o LASSBio-
981 foi associado ao tramadol, agonista µ-opióide e inibidor da recaptação de
serotonina e norepinefrina em doses elevadas e, também com a associação do
tramadol a amitriptilina. Tentativas de ajustes de doses de cada substância
combinada foram realizadas, porém, não houve melhora na resposta da substância
aplicada individualmente. Codd et al. (2008) avaliaram as interações entre o
analgésico tramadol e quatro anticonvulsivantes no tratamento da alodinia induzida
pela ligadura do nervo espinal L5 em ratos. Os fármacos testados apresentaram
efeito antialodinico dose-dependente. Associação de tramadol e topiramato ou RWJ-
333369, tramadol e gabapentina ou lamotrigina apresentaram efeitos antialodinicos
e interações do tipo sinérgica. As combinações proporcionaram um alívio da dor
neuropática, porém, a ativação de diferentes alvos não resultou na reversão total
dos sinais de alodinia e hiperalgesia associados a dor neuropática.
Os analgésicos opióides são relativamente eficazes para o alívio da dor, mas
seu uso prolongado está limitado devido aos vários efeitos adversos, incluindo
tolerância e dependência física, constipação e tolerância cruzada a outros agonistas
μ-opióides (HUANG et al., 2012; DESAI et al., 2013). Tolerância a morfina tem sido
descrita no homem e em animais. A eficácia analgésica da morfina é reduzida após
a lesão do nervo periférico, devido a redução da expressão dos receptores µ opióide
no gânglio da raiz dorsal (HERVERA et al., 2011).
Em nosso estudo demonstramos que a tolerância antinociceptiva à morfina
pode ser induzida através da utilização de mini-bomba osmótica, sendo um
dispositivo seguro que permite a infusão contínua sem oscilações da concentração
no plasma, em comparação com a administração intermitente (IWAI et al, 2012;
OZDEMIR; BAGCIVAN; GURSOY, 2012). O LASSBio-981, administrado pela via
oral, preveniu e reverteu a tolerância antinociceptiva à morfina em ratos com LNE. O
71
mecanismo de ação pela qual a tolerância à morfina foi revertida dependeu da
ativação espinal dos receptores muscarínicos M2 causada pelo LASSBio-981.
Resultado semelhante havia sido mostrado com o análogo LASSBio-873 (MENDES
et al., 2013). A intensidade e a estabilidade de efeito foram fatos que chamaram a
atenção com esta substância.
O envolvimento do sistema colinérgico que possa justificar a ação do
LASSBio-981 na prevenção e reversão da tolerância à morfina é complexo. Honda
et al. (2004) observaram que os efeitos antinociceptivos induzidos pela morfina (s.c)
foi inibido pela injeção intratecal de atropina (antagonista do receptor muscarínico) e
pirenzepina (antagonista do receptor muscarínico M1/M4) de forma dose dependente.
Metoctramina (antagonista do receptor muscarínico M2) e 4-DAMP (antagonista M3)
não inibiram os efeitos antinociceptivos induzidos pela morfina. Administração
crônica de nicotina atenuou de forma dose-dependente a tolerância à morfina.
Entretanto, existe uma dependência cruzada entre os receptores nicotínicos e
opióides (HAGHPARAST et al., 2008).
Raghavendra, Rutkowski e Deleo (2002) observaram que a neuropatia
contribui para o desenvolvimento da tolerância à morfina. A indução da tolerância
consistiu de 2 injeções diárias de morfina (10 mg/kg, s.c.) por 5 dias, em ratos sham
e operados (transecção do nervo L5). O efeito analgésico máximo foi observado na
primeira dose e, no terceiro dia de administração o efeito foi reduzido, nos testes de
estimulação mecânica (filamentos do Von Frey) e térmica (tail-flick). No quinto dia de
administração, ambos os grupos desenvolveram tolerância antinociceptiva à morfina.
Os autores observaram que 16 h após a última administração de morfina nos grupos
sham e operado houve indução de hiperalgesia ou alodinia.
A tolerância à morfina tem sido atenuada por outros fármacos como
lamotrigina (anticonvulsivante que tem atividade em bloquear o canal Nav) (JUN et
al., 2013), vigabatrina (antiepilético que previne o catabolismo do ácido gama-
aminobutírico) (CHAVOOSHI et al., 2009) e gabapentina (anticonvulsivante com
ação sob canais de cálcio da subunidade Cavα2δ) prevenindo a liberação de
neurotransmissor excitatório presente nos terminais dos neurônios aferentes
primários (LIN et al., 2005). Diferentes mecanismos moleculares como
desensibilização e endocitose dos receptores μ opióides (QUILLINAN et al., 2011),
ativação das células da glia (ECHEVERRY; SHI; ZHANG, 2008; HORVATH;
ROMERO-SANDOVAL; DE LEO, 2010; CHEN et al., 2012b), aumento da
72
imunoreatividade no cordão espinal do peptídeo relacionado ao gene da calcitonina
mediado pela morfina (TUMATI et al., 2011), aumento da expressão do receptor
NK1 espinal (VERA-PORTOCARRERO et al. 2007) e receptor NMDA (OZDEMIR;
BAGCIVAN; GURSOY, 2012) têm sido sugerido para explicar a tolerância à morfina
após seu uso crônico.
A coadministração de metoctramina (antagonista do receptor muscarínico M2)
reduziu o efeito antinociceptivo do LASSBio-981. Mendes et al. (2013) obteve
resultados similares para o derivado LASSBio-873. A diferença estrutural entre o
LASSBio-981 e o LASSBio-873 é a presença do grupo nitro na posição para de um
dos anéis fenil conectado ao grupo pirazolo[3,4-b]pirrolo[3,4-d]piridina do LASSBio-
873. O efeito antinociceptivo do composto parece mimetizar a ação da acetilcolina,
neurotransmissor que possui diversas funções fisiológicas por interagir e ativar os
receptores muscarínicos e nicotínicos. Analgesia mediada pelo sistema muscarínico
tem sido descrita na medula espinal (JONES e DUNLOP, 2007), pela administração
de agonistas colinérgicos (EISENACH et al., 1996; GUIMARÃES; GUIMARÃES;
PRADO, 2000), sendo prevenida em camundongos deficientes para os receptores
muscarínicos M2 e M4 (DUTTAROY et al., 2002). Resultados similares foram obtidos
com a inibição supraespinal do receptor muscarínico M1 (GALEOTTI; BARTOLINI;
GHELARDINI, 2003, GALEOTTI; BARTOLINI; GHELARDINI, 2005). Os receptores
muscarínicos têm sua função relacionada a ativação da superfamília de receptores
acoplados a proteína G (WESS; EGLEN; GAUTAM, 2007) (Figura 44). Os
receptores muscarínicos constituem-se como alvos moleculares promissores para o
tratamento de diferentes condições clínicas (WESS; EGLEN; GAUTAM, 2007).
73
Figura 44. Subtipos dos receptores muscarínicos M1, M3 e M5 acoplados a proteína Gq/G11 e receptores muscarínicos M2 e M4 acoplados a proteína Gi/G0 (WESS; EGLEN; GAUTAM, 2007).
Margas, Mahmoud e Ruiz-Velasco (2010) observaram uma interação entre
os receptores µ opióide e muscarínico M2. Os resultados obtidos pelos autores
sugerem que a ativação dos receptores M2 nos neurônios do gânglio esfinopalatino
modula a transmissão opióide na vasculatura do cérebro para manter o fluxo
sanguíneo cerebral. A sinalização pré-sináptica dos receptores M2 atenua a inibição
gabaérgica (KOOS e TEPPER, 2002; APERGIS-SCHOUTE; PINTO; PARE, 2007).
Além disso, os receptores GABAB e muscarínico M2 estão localizados nos neurônios
aferentes pré-sinápticos na medula espinal, controlando a liberação de glutamato e
promovendo a analgesia espinal (IYADOMI et al., 2000; CHEN e PAN, 2004;
ZHANG et al., 2007). Ambos os receptores GABAB e muscarínico M2 interagem e
regulam a atividade do canal de K+ sensível à proteína G (DAVID et al., 2006;
FOWLER et al., 2007).
O dano dos nervos periféricos causada pela ligadura do nervo espinal L5 e L6
aumenta a expressão do receptor muscarínico M2 nos gânglios da raiz dorsal em
ratos (HAYASHIDA et al., 2006). A ligadura do nervo espinal L5 e L6 é responsável
pela ativação de células neuroinflamatórias, desenvolvimento e manutenção da dor
neuropática (ZNAOR et al., 2007). Trabalhos têm descrito o efeito anti-inflamatório
de agonistas muscarínicos pela ativação do receptor muscarínico M2 (BERNARDINI;
74
REEH; SAUER, 2001; YOON et al., 2007). Bernardini, Reeh e Sauer (2001)
investigaram os efeitos de agonistas colinérgicos na liberação de CGRP na pele de
ratos induzida por calor. A nicotina não reduziu a liberação de CGRP induzida pelo
calor, enquanto que os agonistas muscarínicos (muscarina e arecaidina) reduziram
significativamente a liberação de CGRP. Ativação do receptor muscarínico M2
induziu a desensibilização do nociceptor periférico.
Dussor et al (2004) demonstraram que administração de agonistas do
receptor muscarínico M2 inibiram o comportamento nociceptivo em modelo animal de
dor orofacial. Os autores observaram que ativação do receptor M2 modula a
liberação de CGRP no nervo trigeminal. Yoon et al. (2007) demonstraram o efeito
anti-inflamatório do agonista do receptor muscarínico M2 (arecaidina) administrado
por via intratecal em modelo de bolsa de ar em camundongos. O agonista reduziu de
forma dose dependente a migração de leucócitos induzido por zimosan. O efeito
anti-inflamatório foi bloqueado pelo pré-tratamento intratecal de metroctamina
(antagonista do receptor muscarínico M2). Os resultados fornecem evidência direta
que a ativação do receptor muscarínico M2 pode modular as respostas inflamatórias
periféricas.
A nicotina, agonista do receptor nicotínico tem sido descrita como modulador
da ativação da microglia e inflamação (WANG et al., 2003b; DE SIMONE et al.,
2005). De Simone et al. (2005) investigaram o papel do receptor nicotínico α7 em
modular a ativação da microglia e consequentemente inibir a liberação de
mediadores inflamatórios. As células microgliais expressam o receptor nicotínico α7,
e ativação do receptor pela nicotina reduz de forma dose-dependente a liberação de
TNF-α induzida por LPS, não reduzindo a liberação de interleucina-10 e interleucina-
1β. A nicotina modula a expressão de COX-2 e a síntese de prostaglandina E2.
Loreti et al. (2006) avaliaram a expressão de diferentes subtipos de
receptores muscarínicos em células imaturas de Schwann obtidas do nervo ciático
de ratos neonatais de dois dias de idade. As células de Schwann são células da
neuroglia do sistema nervoso periférico, sendo responsáveis pela produção da
bainha de mielina dos neurônios periféricos. Análise de RT-PCR demonstrou a
presença dos receptores M1, M2, M3 e M4 em cultura de células de Schwann, sendo
o receptor M2 com maior nível de expressão. A imunoprecipitação dos subtipos de
receptores demonstrou que os níveis de expressão do receptor M2>M3>M1. O
receptor M4 é pouco expresso e o receptor M5 não foi detectado. Segundo os
75
autores a presença e atividade dos receptores muscarínicos particulares nas células
imaturas de Schwann sugerem que acetilcolina pode ter um papel importante no
desenvolvimento das células.
As diferentes isoformas do receptor opióide µ, κ e δ têm cerca de 60% de
homologia. Os receptores são ativados pelos peptídeos opióide endógenos
(endomorfinas, encefalinas e dinorfinas) e agonista do receptor opióide administrado
exogenamente, como por exemplo, a morfina (PAN et al., 2008). O receptor µ
opióide é subdividido em µ1 que possui alta afinidade pela morfina e medeia a
analgesia supraespinal, enquanto o subtipo µ2 tem baixa afinidade para morfina e
promove analgesia espinal e depressão respiratória (HOLZER, 2014). O receptor κ
opióide promove disforia, em condições de estresse, na qual induz a liberação de
hormônios e neuropeptídeos, incluindo dinorfina (KNOLL e CARLEZON, 2010). A
estimulação prolongada do receptor κ em condição de estresse crônico pode
promover quadro depressivo (KNOLL e CARLEZON, 2010). O papel dos receptores
δ no cérebro parece diminuir os níveis de ansiedade e reduz o comportamento
depressivo (CHU SIN CHUNG e KIEFFER, 2013).
Alguns estudos sugerem que a interação simultânea do receptor μ-opióide
com outros receptores acoplados a proteína G pode resultar em efeitos analgésicos
de alta eficiência. Akgün et al. (2013) planejaram e obtiveram uma série de ligantes
bivalentes que contém farmacóforos de um antagonista do receptor metabotrópico
do glutamato do subtipo 5 e de um agonista do receptor μ-opióide ligados com
espaçadores. Os compostos foram testados em modelos de dor inflamatória e dor
do câncer ósseo. Quando administrado por via intratecal, o composto MMG22
(composto híbrido) foi mais potente do que a combinação dos compostos isolados.
O composto foi menos potente quando administrado por via intracerebroventricular
ou quando administrado por via intratecal em ratos normais. O composto MMG22
não causa tolerância aos efeitos analgésicos e não induz depressão respiratória,
dois efeitos adversos causados pela morfina.
O efeito antinociceptivo do LASSBio-981 foi também avaliado em modelo de
dor neuropática induzida pela estreptozotocina. A neuropatia diabética é uma das
complicações mais frequente da diabetes mellitus (LI et al, 2013), e pode ser
reproduzida em modelo animal de diabetes mellitus induzida pela estreptozotocina,
agente que destrói as células beta pancreáticas, inibindo a produção de insulina e
captação de glicose através do transportador de glicose do tipo 4 (GLUT-4)
76
(BEGUM; DRAZNIN, 1992; AKBARZADEH et al, 2007). A prevalência mundial da
diabetes atingirá 7,7% da população adulta, afetando aproximadamente 439 milhões
de adultos até 2030 (SHAW; SICREE; ZIMMERT, 2010).
Diversos alvos moleculares têm sido estudados com intuito de melhor
compreender a fisiopatologia da neuropatia diabética. Bishnoi et al. (2011)
demonstraram que a estreptozotocina promove ativação da microglia e liberação de
mediadores inflamatórios no corno dorsal da medula espinal. O aumento da
expressão do receptor TRPV1 e influxo de Ca2+ induz a sensibilização central,
promovendo o desenvolvimento da hiperalgesia térmica em ratos com neuropatia
diabética periférica. Ativação dos receptores GABAB produz antinocicepção por
normalizar a expressão do receptor NMDA em ratos com neuropatia diabética
induzida por estreptozotocina (BAI et al., 2014).
Anjaneyulu, Berent-Spillson e Russell (2008) investigaram o papel do receptor
metabotrópico de glutamato na neuropatia diabética. Os agonistas do receptor
metabotrópico de glutamato do subtipo 3 preveniu o desenvolvimento da neuropatia
diabética. Bierhaus et al. (2012) observaram que produto da peroxidação lipídica
associado ao estresse carbonílico na diabetes induz modificação na expressão de
canais Nav 1.8. Essa alteração aumenta a excitabilidade de neurônios nociceptivos,
resultando no quadro de hiperalgesia. Huang et al. (2014) investigaram a
contribuição do canal Nav 1,7 no comportamento de dor em ratos com neuropatia
diabética induzida pela estreptozotocina. O aumento dos níveis de TNF-α aumentou
a imunoreatividade do canal Nav 1,7 no gânglio da raiz dorsal. Menichella et al.
(2014) investigaram a participação do receptor de quimiocina CXCR4. Ativação do
receptor CXCR4 pelo fator 1 derivado da célula do estroma promove o aumento do
influxo de Ca2+ e excitabilidade neuronal. Administração do antagonista do receptor
CXCR4 (AMD3100) reverteu o comportamento de dor causada pela neuropatia
diabética.
Nossos estudos demonstram que o LASSBio-981 reverteu o quadro de
hiperalgesia térmica e alodinia mecânica de forma dose-dependente na neuropatia
diabética induzida pela estreptozotocina. Koga et al. (2004) avaliaram a contribuição
dos receptores muscarínicos espinal nos efeitos antialodinicos induzidos pela
clonidina em camundongos diabéticos. Alodinia mecânica foi inibida pela
administração intratecal de clonidina. O antagonista do receptor muscarínico
(atropina, i.t) e adrenoreceptor α2 (ioimbina, i.t ou s.c) quando administrados inibiram
77
o efeito antialodinico da clonidina. O efeito antialodinico da clonidina foi inibido pela
administração do antagonista do receptor muscarínico M1, pirenzepina, porém não
foi obtido com os antagonistas dos receptores muscarínico M2 (metoctramina) e M3
(4-DAMP). Os resultados sugerem que o receptor muscarínico M1 espinal participa
do efeito antialodinico da clonidina em camundongos diabéticos. Chen e Pan (2003)
relataram aumento da expressão do receptor muscarínico M2 na medula espinal de
ratos diabéticos, demonstrando assim a importância desse receptor para a
neuromodulação da dor. Cao et al. (2011) observaram que a neuropatia diabética
aumenta a atividade dos canais de Ca2+ ativado por voltagem do tipo T em
neurônios sensoriais primários. Os receptores muscarínicos do subtipo M4 tem sua
expressão aumentada nos gânglios da raiz dorsal dos neurônios, sendo responsável
pelo efeito analgésico do agonista muscarínico oxotremorina-M.
Uma hipótese frequentemente levantada de que a atividade antinociceptiva
após uso prolongado esteja sendo mascarada por uma possível depressão do
sistema nervoso central (sedação) não foi confirmada com a administração de
LASSBio-981 durante 7 dias consecutivos na dose de 10 mg/kg. Entretanto, redução
significativa foi observada na dose de 30 mg/kg sugerindo melhor investigação da
relação faixa de dose eficaz com o limiar de dose que provoca efeito sedativo
adverso. Mendes et al. (2013) não observaram efeito sedativo para o LASSBio-873
então, é possível que a ausência do grupo nitro no derivado LASSBio-981 possa
estar relacionado ao efeito sedativo. Resultados similares foram observados por Ma
et al (2001). Os autores demonstraram os efeitos farmacológicos do carbacol
(agonista colinérgico) e oxicodona a nível espinal e supraespinal. Os efeitos
antinociceptivo e sedativo do carbacol são mediados pela ativação do receptor
muscarínico M2. Oxicodona administrada na formação reticular pontina medial do
tronco encefálico não produziu efeitos antinociceptivo ou comportamental, mas
administração espinal produziu efeito antinociceptivo mediado pela ativação do
receptor muscarínico M2. Andersson et al. (2010) observaram que a administração
local de escopolamina (antagonista muscarínico) na substância nigra aumenta as
concentrações extracelulares de dopamina durante a atividade motora em animais
hemi-lesionados, mas não em animais normais. A ativação dos receptores
muscarínicos modula a liberação de dopamina na substância nigra.
O maior obstáculo no desenvolvimento de agonistas e antagonistas
muscarínicos tem sido o fato de que os aminoácidos do sitio de ligação ortostérico
78
para ligantes muscarínicos são altamente conservados, porém possui alta afinidade.
Entretanto, o sitio de ligação alostérico é mais seletivo e possui pouca afinidade
entre os subtipos do receptor (HULME; LU; BEE, 2003; KRUSE et al., 2014). O
domínio de ligação para os ligantes ortostéricos dos receptores muscarínicos está
localizado na região central do receptor transmembrana (WESS, 1996; HULME; LU;
BEE, 2003), enquanto os sítios de ligação para os ligantes alostéricos possuem
resíduos localizados nas alças extracelulares e segmentos periféricos das diferentes
hélices transmembranares (BIRDSALL e LAZARENO, 2005; MAY et al., 2007). Nos
últimos anos, os químicos medicinais têm planejado moléculas híbridas como
moduladores dos sítios alostérico e ortostérico com intuito de superar as diversas
limitações (MOHR et al., 2010; LANE; SEXTON; CHRISTOPOULOS, 2013).
A elucidação da estrutura cristalográfica do receptor muscarínico M2 humano,
juntamente com dados de mutagênese, tem contribuído para o reconhecimento
molecular dos agonistas e antagonistas. O LASSBio-981 interage com resíduos de
aminoácidos envolvidos primariamente com a afinidade dos agonistas, tais como,
Trp155 e Trp400 (GREGORY et al., 2010). Uma observação importante é que o
LASSBio-981 está próximo do resíduo de Thr187, sendo possível observar uma
ligação de hidrogênio com o composto. Esse resíduo de aminoácido está envolvido
na ligação dos agonistas, mas não com antagonistas (GREGORY et al., 2010), no
qual está de acordo com nossos resultados experimentais como potenciais
agonistas do receptor muscarínico M2.
De acordo com resultados obtidos por Menegatti et al. (2006), avaliamos se o
LASSBio-981 interagia com o receptor µ opióide através do estudo de ancoramento
molecular. O composto interage com o receptor por ligações hidrogênios entre a
região pirazolo-piridina e grupos hidroxila dos resíduos Lys233 e Tyr148. Pode ser
observado que os aminoácidos lle144 e His297 se encontram próximos ao composto
LASSBio-981, sendo passível de ocorrer interações de van der Waals. Mansour et
al. (1997) em seus estudos de mutagênese sugerem que His297 parece ser um
resíduo importante nas interações do ligante com receptor opióide. O resíduo His297
não é alterado nas isoformas µ, κ e δ dos receptores opióides e está em uma região
de alta homologia de aminoácidos.
79
6 CONCLUSÕES
- Atividade antinociceptiva do LASSBio-981 é reproduzida em modelo de dor aguda
após a sua administração pela via oral, sugerindo absorção significativa pelo trato
gastrointestinal.
- Administração simultânea do LASSBio-981 com a morfina resulta em atividade
antinociceptiva aditiva em modelo de dor aguda.
- O tramadol e amitriptilina aumentaram a atividade antinociceptiva do LASSBio-981
em reduzir a hiperalgesia térmica e alodinia mecânica em modelo de LNE em ratos.
- O LASSBio-981 preveniu e reverteu a tolerância antinociceptiva à morfina em ratos
com LNE.
- O LASSBio-981 foi eficaz em reverter a hiperalgesia térmica e alodinia mecânica
em ratos diabéticos.
- Administração de LASSBio-981 no período de 7 dias não alterou a atividade
motora de ratos em dose eficiente para reverter a hiperalgesia e alodinia mecânica,
porém, dose mais elevada pode ser seguida de efeito sedativo.
- Estudo de ancoramento molecular suporta a hipótese de ligação do LASSBio-981
com os receptores muscarínico M2 e µ- opióide.
80
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