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UNIVERSIDADE DE LISBOA
FACULDADE DE FARMÁCIA
Carbamato de Etilo em Vinhos Portugueses
Alberto Alexandre Ferreira de Castro Serra Mosqueira
Mestrado em Controlo da Qualidade e Toxicologia dos Alimentos
2007
UNIVERSIDADE DE LISBOA
FACULDADE DE FARMÁCIA
Carbamato de Etilo em Vinhos Portugueses
Alberto Alexandre Ferreira de Castro Serra Mosqueira
Dissertação orientada pela
Profa. Doutora Maria do Rosário Bronze e co-orientada pelo
Prof. Doutor Luís Vilas Boas
Mestrado em Controlo da Qualidade e Toxicologia dos Alimentos
2007
i
Resumo
Pretendeu-se com este trabalho efectuar o estudo da ocorrência do carbamato de etilo (CE) em
vinhos portugueses, utilizando diferentes métodos de pré-tratamento de amostras e de ensaio.
Desta forma foram utilizados 3 métodos de pré-tratamento de amostras, nomeadamente a
extracção em fase sólida (SPE) (técnica utilizada no Método Oficial para a análise do composto), a
microextracção em fase sólida (SPME) e o método QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective,
Rugged, Safe), associados à análise por cromatogafia gasosa / espectroscopia de massa (GC/MS)
(também utilizada no Método Oficial). Como método de análise alternativo foi utilizada a
cromatografia líquida de alta eficiência com detecção por fluorescência (HPLC-FLD). Neste caso o
composto em análise foi previamente sujeito a uma reacção de derivatização com o xantidrol. No
caso das determinações efectuadas por GC/MS com as 3 formas de pré-tratamento de amostras
utilizadas, verificou-se a presença de fenómenos de interferência em relação a uma das massas
necessárias para a identificação do composto. No caso da HPLC-FLD foram encontradas dificuldades
do ponto de vista instrumental na implementação da técnica. Utilizando a GC/MS e o pré-
tratamento por SPE e QuEChERS foi possível identificar presuntivamente a presença de CE em
algumas amostras de vinho. Verificou-se que nestas amostras os teores estimados do composto
foram inferiores aos limites legais ou voluntários presentemente em vigor em alguns países – Canadá
e Estados Unidos da América, respectivamente. Como conclusão do trabalho são apresentadas para
duas das amostras, com base nos respectivos dados de viticultura e vinificação, algumas das razões
que poderão explicar os teores de CE encontrados, sendo também sugeridos algumas propostas de
trabalhos futuros a efectuar para a análise deste composto.
Palavras-chave: carbamato de etilo, vinhos, portugueses, SPE, SPME, QuEChERS GC/MS, HPLC-FLD.
ii
Abstract
The purpose of this work was to study the occurrence of ethyl carbamate (CE) in Portuguese wines,
using different sample preparation and analysis methods. In this way 3 sample preparation methods
were used, namely solid phase extraction (SPE), (technique used in the Official Method for
determining the substance), solid phase micro extraction (SPME) and the QuEChERS method (Quick,
Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe), combined with gas chromatography / mass spectrometry
(also used in the Official Method). As an alternative method high efficiency liquid chromatography
with fluorescence detection (HPLC-FLD) was used. In this case the substance was previously
subjected to a derivatization reaction with xanthydrol. In the case of the determinations preformed
by GC/MS with the 3 sample preparation methods used, interference phenomena related to one of
the masses needed for the identification of the substance occurred. In the case of HPLC-FLD,
instrumental difficulties concerning the implementation of the method occurred. It was possible to
presumptively identify the substance in some wine samples using GC/MS and sample preparation by
SPE and QuEChERS. In these samples the estimated amounts of substance detected were inferior to
legal or voluntary limits presently in force in some countries, namely Canada and the United States
of America. As a conclusion of this work, some explanations for the amounts of CE found on two of
the samples are presented, based on the corresponding viticulture and vinification data, as well as
some future work proposals for the analysis of this substance.
Keywords: ethyl carbamate, wines, Portuguese, SPE, SPME, QuEChERS GC/MS, HPLC-FLD.
iii
Agradecimentos
Após a conclusão deste trabalho gostaria de transmitir os meus agradecimentos a todos aqueles que
contribuíram para a sua realização, particularmente
Aos meus orientadores Profa. Doutora Maria do Rosário Bronze e Prof. Doutor Luís Vilas Boas por
todo o trabalho de orientação, tempo dispendido e apoio prestado.
À Profa. Doutora Matilde Castro, coordenadora do mestrado por todo o empenho e apoio
demonstrado para a realização deste curso.
A todos os colegas dos laboratórios do Instituto de Tecnologia Química e Biológica/ Instituto de
Biologia Experimental e Tecnológica.
Ao Director do Instituto Português de Acreditação, Eng. Leopoldo Cortez por me ter permitido a
conciliação deste trabalho com as minhas restantes obrigações profissionais.
Finalmente quero deixar um agradecimento muito especial aos meus Pais por todo o apoio e
compreensão incondicionais que sempre me transmitiram ao longo da minha vida.
iv
Índice
Resumo i
Abstract ii
Índice iv
Índice de Figuras vi
Índice de Tabelas vii
Índice de Equações viii
Índice de Apêndices ix
Símbolos e Abreviaturas x
1. Introdução 1
1.1 Carbamato de Etilo – Aspectos toxicológicos, metabolização e regulamentação em vinhos 1
1.2 Mecanismos de formação do CE em vinhos e metodologias para o seu controlo 4
1.3 Objectivos do trabalho 10
1.4 Análise do carbamato de etilo 10
1.4.1 Cromatografia gasosa / espectroscopia de massa 12
1.4.2 Cromatografia líquida de alta eficiência / detecção por fluorescência 14
2. Materiais e métodos 16
2.1 Padrões, solventes, eluentes, reagentes, gases e água 16
2.2 Materiais utilizados no pré-tratamento das amostras 17
2.3 Equipamento 17
2.3 Modo de preparação das soluções 18
2.3.1 Solução padrão de carbamato de etilo para GC/MS – 0,013 mol/L 18
2.3.2 Solução padrão de carbamato de etilo para HPLC-FLD – 0,012 mol/L 18
2.3.3 Solução saturada com cloreto de sódio ou com sulfato de sódio para SPME 18
2.3.4 Solução de acetonitrilo a 1 % (v/v) de ácido acético para utilização no método QueChERS 18
2.3.5 Solulução aquosa de ácido clorídrico (HCl) 1,5 mol/L 18
2.3.7 Solução aquosa de acetato de sódio 20 mM – eluente HPLC-FLD 19
2.3.8 Soluções aquosas de etanol a 20 % e a 24 % para diluição das amostras em HPLC-FLD 19
2.4 Pré-tratamento das amostras 19
2.4.1 SPME 19
2.4.2 SPE 19
2.4.3 QuEChERS 20
2.4.4 HPLC-FLD 21
2.6 Condições instrumentais 21
2.6.1 Condições em GC/MS 21
2.6.2 Condições em HPLC-FLD 22
2.7 Amostras analisadas 23
3.1 Análise por cromatografia gasosa / espectroscopia de massa 24
3.1.1 Cromatograma e espectro de massa do carbamato de etilo 24
v
3.1.2 Escolha do tipo de coluna para a realização dos ensaios 26
3.1.2 Especificidade do método / presença de interferências 28
3.1.3 Método Oficial modificado 32
3.1.4 Resposta de padrões de CE a várias concentrações, estudo da linearidade e de limites de detecção e quantificação e escolha de padrão interno 33
3.1.5 Estudo do comportamento de padrões de CE com diferentes técnicas de pré-tratamento de amostras e estudo de alguns parâmetros para estas técnicas 37
3.2 Análise por cromatografia líquida de alta eficiência / detecção por fluorescência 40
3.3 Amostras em que foi detectado CE 42
4. Conclusões 47
5. Bibliografia 49
6. Apêndices 62
vi
Índice de Figuras
Figura 1 – Mecanismo proposto para a metabolização do CE 1
Figura 2 – Principais vias de formação do CE em vinhos 4
Figura 3 – Cromatograma de padrão de CE a 1000 ppb 24
Figura 4 – Espectro de massa do CE obtido pela análise de padrão a 1000 ppb 24
Figura 5 – Reacção “McLafferty +1” para o carbamato de etilo 25
Figura 6 – Cromatograma de padrão de CE a 1 ppm 26
Figura 7 - Cromatograma de amostra B com pré-tratamento por SPME 27
Figura 8 - Cromatograma de amostra A4 com pré-tratamento por SPE 27
Figura 9 - Cromatogama de amostra A3 fortificada a 1 ppm com CE com pré-tratamento por SPME 28
Figura 10 – Cromatograma de amostra C com pré-tratamento por SPME 29
Figura 11 – Cromatograma de amostra E com pré-tratamento por SPE 29
Figura 12 – Cromatograma de amostra D com pré-tratamento por QuEChERS 30
Figura 13 - Espectro de massa do composto não identificado 30
Figura 14 – Representação da zona de interferência causada por pico de massa 74 em amostra B com pré-tratamento por SPME 30
Figura 15 - Representação da zona de interferência causada por pico de massa 74 em amostra E com pré-tratamento por SPE 31
Figura 16 – Representação da zona de interferência causada por pico de massa 74em amostra B com pré-tratamento por SPE e fortificação a 60 ppb de CE 32
Figura 17 - Comparação de cromatogramas da amostra E obtidos com o Método Oficial e com o Método Oficial modificado 33
Figura 18 - Curva de calibração obtida com padrões de CE 33
Figura 19 – Cromatograma de solução de 10 % de isoctano em diclorometano 36
Figura 20 - Cromatograma de amostra D após pré-tratamento pelo método QuEChERS 36
Figura 21 - Cromatograma de amostra B após pré-tratamento da amostra por SPE com adição de 10 % isoctano (v/v) 37
Figura 22 - Influência da saturação com sais nas áreas obtidas em duplicados de padrões aquosos de CE a 60 ppb 38
Figura 23 - Influência da utilização de diferentes tempos de pré-tratamento nas áreas obtidas em padrões de CE a 60ppb saturados com NaCl 38
Figura 24 – Comparação das respostas obtidas com padrões de CE a 1000 ppb por injecção directa e pelo método QuEChERS 39
Figura 25 - Comparação de cromatograma de ensaio em branco e padrão de CE a 100 ppb obtidos por HPLC-FLD 40
Figura 26- Curva de calibração padrões CE em determinações por HPLC-FLD 40
Figura 27- Variação dos tempos de retenção do pico de CE nas determinações efectuadas por HPLC-FLD 42
Figura 28 - Cromatograma de amostra B com pré-tratamento por SPE 43
Figura 29 - Cromatograma de amostra C com pré-tratamento por SPE 43
Figura 30 – Cromatograma de amostra D com pré-tratamento por QuEChERS 44
Figura 31 – Cromatogramas das amostras B e C com sobrecarga com padrão de CE 44
vii
Índice de Tabelas
Tabela 1 - Limites legais em vigor no Canadá para o CE em diversas bebidas alcoólicas 2
Tabela 2 – Número de laboratórios acreditados para a análise do CE 3
Tabela 3 – Teores de CE encontrados em vinhos portugueses 9
Tabela 4 – Técnicas de pré-tratamento e métodos utilizados para a análise do CE 11
Tabela 5 - Comparação da GC/MS e HPLC-FLD na análise do CE em amostras de vinho 15
Tabela 6 - Programa de temperaturas do cromatógrafo gasoso 21
Tabela 7 – Programa de eluentes utilzado na HPLC-FLD 22
Tabela 8 – Identificação das amostras analisadas 23
Tabela 9 - Relações sinal-ruído (S/N) obtidas pelo método RMS na análise de padrões de CE com concentrações ente 1-50 ppb 34
Tabela 10 - Relações sinal-ruído (S/N) obtidas pelo método peak to peak na análise de padrões de CE com concentrações ente 1-50 ppb 34
Tabela 11 - Relações sinal-ruído (S/N) obtidas pelo método peak to peak segmentado na análise de padrões de CE com concentrações ente 1-50 ppb 34
Tabela 12– Estudo da linearidade das respostas de padrões de CE 35
Tabela 13– Estimativa dos limites de detecção e quantificação em GC/MS 35
Tabela 14 – Repetibilidade obtida no ensaio de padrões de CE a 10 e 50 ppb adicionados de isoctano a 10% (v/v) 37
Tabela 15 - Áreas e repetibilidade obtidas na análise de padrões de CE a 60 ppb saturados com NaCl 39
Tabela 16 - Estudo da linearidade das respostas de padrões de CE 41
Tabela 17 – Estimativa dos limites de detecção e quantificação em HPLC-FLD 41
viii
Índice de Equações
Equação 1 – Formação de CE através da reacção do dietildicarbonato/dietilpirocarbonato com a amónia 6
Equação 2 – Reaccção do xantidrol com o CE 14
Equação 3 – Limite de detecção 35
Equação 4 – Limite de quantificação 35
ix
Índice de Apêndices
Apêndice 1 - Equação para a formação do CE considerando o etanol, a ureia, a arginina e a citrulina 62
Apêndice 2 – Espectro de massa de padrão de CE a 1000 ppb e comparação com espectro da biblioteca de massas 62
Apêndice 3 - Comparação dos espectros de massa obtidos pela análise de diversas amostras com os espectros de massas das bibliotecas do GC/MS 63
Apêndice 4 – Cromatograma e comparação do espectro de massa de padrão de α-terpineol com espectro de massa das bibliotecas do GC/MS 65
Apêndice 5 – GC/MS 65
Apêndice 6 – Utilização do isoctano como padrão interno 69
Apêndice 7 - SPME 70
Apêndice 8 – HPLC-FLD 70
x
Símbolos e Abreviaturas
Alc. – Álcool
CE – Carbamato de Etilo
CW – Carbowax
DP – Desvio padrão
DPR % - Desvio padrão relativo percentual
DVB - Divinilbenzeno
FML – Fermentação malo-láctica
GC/MS - Cromatografia gasosa/espectroscopia de massa
HPLC-FLD – Cromatografia líquida de alta eficiência com detecção por fluorescência
M/Z – massa/carga
QuEChERS - Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe – Rápido, Fácil, Económico, Eficaz, Robusto
e Seguro
SCAN – Modo de varrimento contínuo
SIM – Monitorização selectiva de iões
SPE - Extracção em fase sólida
SPME – Microextracção em fase sólida
1
1. Introdução
1.1 Carbamato de Etilo – Aspectos toxicológicos, metabolização e regulamentação em vinhos
O carbamato de etilo (CE), também designado por uretano, é um éster do ácido carbâmico que
ocorre naturalmente em produtos fermentados. Deste modo é possível a sua presença em vários
produtos alimentares, entre os quais os vinhos.
O carbamato de etilo está classificado pela IARC - International Agency for Research on Cancer, na
classe 2B, ou seja, possivelmente carcinogénico para o homem [1,2]. Esta agência está a preparar
uma nova monografia intitulada - Vol. 96, Alcoholic Beverage Consumption, Acetaldehyde and
Urethane, cujo grupo de trabalho se reuniu em Fevereiro de 2007. Esta nova monografia visa
actualizar a última informação publicada por esta agência sobre o composto que data de 1974 [3].
O CE apresenta uma toxicidade aguda relativamente baixa, sendo a LD50 na ordem dos 2,5 g/Kg de
peso corporal [4]. O CE não é directamente carcinogénico nem mutagénico, mas sua a activação
pelo citocromo P-450, origina metabolitos que já exibem toxicidade [5,6].
O metabolismo do CE é mediado pelo menos através de 3 vias (Figura 1). Na primeira via o CE pode
ser hidrolizado a etanol, amónia e dióxido de carbono por uma esterase hepática. Na segunda via o
CE é convertido pelo citocromo P-450 em N-hidroxiuretano. Na terceira via, que também envolve o
citocromo P-450, o CE é convertido primeiramente em carbamato de vinilo e depois em carbamato
de vinilo epóxido. Os metabolitos do CE podem danificar o material genético através da formação
de aductos com o ADN, oxidação ou depurinação. Os mecanismos propostos indicam que o cobre
desempenhará um papel importante nestas reacções [7,19].
Figura 1 – Mecanismo proposto para a metabolização do CE [19]
2
Uma vez que a principal via de exposição da população em geral ao CE resulta do consumo de
bebidas alcoólicas [8], tem sido também estudada qual a influência do consumo de etanol na
metabolização do CE. Os resultados obtidos nestes estudos não têm sido consensuais, uma vez que
foi reportado quer o aumento da actividade do citocromo P450, o que levaria a um aumento da
oxidação do CE ao seu derivado epoxídico, quer uma diminuição da actividade do mesmo citocromo.
Quer o CE quer o etanol parecem competir como substratos para serem metabolizados por este
citocromo. A obtenção de resultados conclusivos é ainda dificultada, segundo os autores, pelo facto
do acetaldeído, resultante da oxidação do etanol, ser um potente inibidor da metabolização do CE e
também um substrato para o citocromo P450 [1,9, 10, 11].
A toxicidade do CE continua a ser presentemente estudada, quer através de ensaios in vitro quer in
vivo [1,5,12-32].
Em 1976 demonstrou-se a formação do CE durante as etapas de fermentação utilizadas para a
produção diversos alimentos e bebidas alcoólicas [33]. No entanto, os níveis de CE encontrados na
altura foram na ordem das poucas partes por bilião (ppb), não tendo sido a presença deste
composto considerada preocupante pelas autoridades oficiais. No entanto, em 1985, em análises
efectuadas pelas autoridades Canadianas em bebidas alcoólicas, foram determinados valores de CE
consideravelmente superiores, na ordem das partes por milhão (ppm), o que levou a um interesse
renovado pelo composto, tendo sido estabelecidos em alguns países limites de cumprimento
voluntário, no caso dos Estados Unidos da América, ou mesmo de cumprimento legal, no caso do
Canadá (Tabela 1):
Tabela 1 - Limites legais em vigor no Canadá para o CE em diversas bebidas alcoólicas [139] Tipo de bebida alcoólica Concentração de CE (ppb)
Cerveja (≤ 8,5 % alc.) 15
Cerveja (> 8,5 % alc.) 30
Cidra (% de alc. não indicada) 30
Vinho de mesa (< 14,0 % alc.) 30
Vinho licoroso (≥ 14,0 % alc.) 100
Bebidas espirituosas (≥ 21,0 % alc.) 150
Saké (% de alc. não indicada) 200
Licores de frutos (% de alc. não indicada) 400
No caso dos E.U.A. foi proposto à FDA – Food and Drug Administration, pelas associações de
produtores de vinhos americanas, um plano para redução dos teores de CE em vinhos de mesa e
vinhos licorosos. O acordo indicava que os vinhos de mesa não deveriam conter por lote, em média,
mais de 15 ppb de CE, sendo no entanto permitidos pontualmente valores superiores, enquanto que
para os vinhos licorosos, este valor não deveria ser superior a 60 ppb. Os objectivos deste plano
seriam, a partir da produção de 1995, que apenas 1 % do total de vinhos de mesa e licorosos
apresentassem teores de CE superiores a 25 e 90 ppb, respectivamente [35]. Em 2005 o Brasil fixou
3
um prazo de 5 anos para os produtores de cachaça cumprirem os mesmos limites legais existentes
no Canadá [36].
Em 2005, na sequência da 64ª Reunião do JECFA/WHO/FAO – Joint Expert Committe on Food
Additives / World Health Organization / Food and Agriculture Organization das Nações Unidas, foi
publicado um relatório da avaliação de risco do CE nos alimentos. Segundo este Comité a exposição
ao CE a partir da alimentação e bebidas alcoólicas é relevante, devendo ser continuada a
implementação de medidas para a redução do teor deste composto nos alimentos. Este relatório foi
apresentado para análise à Comissão do Codex Alimentarius [8]. Quer a nível nacional quer a nível
europeu, as diversas agências com competência na área alimentar continuam presentemente a
estudar a ocorrência deste composto nos vários alimentos. Em Janeiro de 2007 foi publicado um
estudo da Food Standards Agency do Reino Unido sobre a ocorrência do CE em vários alimentos
fermentados [113,114]. Está também em curso na European Food Safety Authority (EFSA) uma
reavaliação do risco do composto, de forma a considerar-se a necessidade do estabelecimento de
limites legais para a sua presença em alimentos, incluindo vinhos [37].
Em Portugal não existem presentemente laboratórios acreditados para a pesquisa de CE em vinhos.
Existe no entanto um laboratório acreditado para a análise do composto em aguardentes [126]. A
nível europeu e internacional o número de laboratórios como capacidade reconhecida para a
realização desta análise é também consideravelmente reduzido, como se pode verificar pela
seguinte tabela (Tabela 2) [107,126-130]:
Tabela 2 – Número de laboratórios acreditados para a análise do CE
Europa
(Alemanha, Bélgica, Dinamarca, Eslováquia, Espanha,
Finlândia, França, Grécia, Holanda, Itália, Irlanda, Reino
Unido, República Checa)
América
(Brasil, Canadá,
E.U.A.)
Laboratórios acreditados para a
análise do CE 9 5
Laboratórios acreditados para a
análise do CE em vinhos 8 3
Laboratórios que utilizam
Método Oficial (Regulamento
(CE) N.º 761/1999) [95]
1 -
4
1.2 Mecanismos de formação do CE em vinhos e metodologias para o seu
controlo
Em 1930 foi demonstrada a produção de ésteres carbâmicos após o aquecimento da ureia e etanol
entre 175 e 190ºC [38]. Foi também demonstrada por Ough, em 1976, a formação de CE em 72
horas, a partir da ureia e de soluções de etanol diluídas (11,5 %), sem a necessidade de
aquecimento [33], ou seja, em condições muito semelhantes às existentes nos vinhos.
Estudos subsequentes correlacionaram os teores de CE nos vinhos com a quantidade de ureia e
outros precursores biológicos neles existentes e ainda com o aumento da temperatura, quer de
fabrico, quer de armazenamento, dos mesmos. Desta forma, caso as condições do meio sejam
propícias, é possível a formação de CE através de várias reacções não enzimáticas com o etanol [39]
(Figura 2):
Figura 2 – Principais vias de formação do CE em vinhos
A Figura 2 representa as principais vias de formação de precursores de CE durante os processos de
fermentação que ocorrem durante a produção dos vinhos.
A ureia é geralmente produzida pelas leveduras durante as fases inicial e intermédia da
fermentação alcoólica, pela metabolização dos diversos aminoácidos existentes no sumo de uva, de
entre os quais a arginina é a mais abundante, numa concentração que varia nos mostos entre 100
mg/L e 2,5 g/L, dependendo da casta da uva, do solo e dos métodos de vinificação utilizados.
5
Durante os processos de fermentação, quando é acumulado um excesso de ureia no citoplasma das
células, esta é libertada para o meio exterior, neste caso o mosto. Estirpes de leveduras que
tenham uma elevada capacidade de degradação da arginina, mas uma reduzida capacidade de
utilização da ureia, tenderão a libertar para o meio maiores quantidades de ureia. A ureia
resultante da metabolização da arginina pela arginase, constitui o principal precursor para a
formação de CE, contribuindo com aproximadamente com 50 % do total de precursores que reagem
com o etanol para formarem o composto.
A metabolização da arginina é catalisada pela arginina dehidrogenase, dando origem a citrulina que
também pode reagir não enzimaticamente com o etanol, formando CE.
Por sua vez a citrulina é metabolizada numa reacção catalisada pela ornitina transcarbamilase,
dando origem a ornitina. Nesta reacção também é formado fosfato carbamílico, numa reacção
catabolizada pela carbamato cinase. O fosfato carbamílico, reagindo com o etanol, também poderá
formar CE.
A fermentação maloláctica (FML), também efectuada como parte do processo de fabricação dos
vinhos, pode contribuir para a formação de precursores do CE, uma vez que alguns microrganismos
utilizados nesta etapa (essencialmente bactérias malo-lácticas), possuem vias metabólicas idênticas
às descritas para as leveduras utilizadas na fermentação alcoólica. A arginina não é totalmente
metabolizada pelas leveduras durante a fermentação alcoólica, podendo ser utilizada como
substrato na FML o que irá originar mais precursores do CE. Este mecanismo foi descrito para
algumas estirpes de Oenococcus e de Lactobacillus [34,40-44,46-52,115].
Desta forma quer a realização da fermentação alcoólica, que a realização da fermentação
malo-láctica potenciam a formação de precursores que podem reagir com o etanol para dar origem
a CE.
Não obstante os mecanismos acima descritos constituírem as principais vias de formação do CE,
existem outras mecanismos possíveis para formação do composto ainda não completamente
estudados, uma vez que também foi reportada a presença de CE quer em sumos de uva não
fermentados. Também foi reportada a presença de CE em vinhos após engarrafamento, em alguns
casos com teores superiores a 100 ppb, nos quais não tinha sido detectada a presença de ureia,
arginina, e citrulina.
No caso dos vinhos após engarrafamento, uma das explicações apresentadas foi a de que a ureia se
encontra presente no meio, mas ligada a outros compostos azotados formados durante os processos
de fermentação. Estes compostos tendem a sofrer uma hidrólise com a passagem do tempo,
libertando ureia que pode reagir com o etanol formando CE. São mencionados como exemplo,
ensaios de envelhecimento forçado em vinhos, aos quais foi adicionado o composto 3a,6a-
dimetilglycouril, o qual causou um aumento nos teores de CE detectados [70].
Também têm sido desenvolvidos estudos que permitem correlacionar a presença de CE com outros
constituintes do vinho. Uthurry determinou diversos parâmetros analíticos em vinhos [69] para além
6
do CE, nomeadamente, lactato de etilo, ácido láctico, potássio, acidez volátil, ureia, amónia e
acidez total, os quais foram sujeitos a uma análise de componentes principais, a qual permitiu a
determinação de coeficientes de correlação entre o CE e o lactato de etilo e a acidez volátil.
Segundo os autores, esta correlação seria indicativa da existência de uma relação entre a presença
de CE e determinados processos microbiológicos que aumentassem a acidez volátil e a concentração
de ésteres, tais como a FML, e/ou determinados processos de degradação que produzissem ácido
láctico a partir de açúcares residuais.
Em 1976 também foi comprovada a formação de CE, através de uma reacção com a amónia, a partir
de um aditivo (DEDC - dietildicarbonato também designado por DEPC - dietilpirocarbonato),
utilizado como inibidor do crescimento das leveduras [63,64] (Equação 1):
O(CO2C2H5)2 + NH3 H2NCO2C2H5 + CO2 + C2H5OH DEDC/DEPC Amónia Carbamato de Etilo Dióxido de Carbono Etanol
Equação 1 – Formação de CE através da reacção do dietildicarbonato/dietilpirocarbonato com a amónia A utilização deste aditivo foi posteriormente proibida em alguns países, incluindo a Europa. Como
alternativas a este composto foi estudado o DMDC – dimetildicarbonato, e a possível formação de
compostos semelhantes ao CE, nomeadamente o carbamato de metilo [65,66]. Em finais de 2005 foi
autorizado pela União Europeia a utilização deste composto nos vinhos [67].
Nas bebidas alcoólicas destiladas preparadas a partir de matérias primas com teores naturalmente
elevados em glicósidos cianogénicos, por exemplo a amigdalina presente em alguns frutos - cerejas,
ameixas, pêssegos ou ginjas, ou a epiheterodendrina no caso do centeio, existem outros
mecanismos adicionais para a formação do CE. Nas bebidas preparadas a partir destes produtos, o
cianeto libertado por hidrólise térmica ou enzimática durante o processo produtivo reage com o
etanol presente no meio, dando também origem a CE num mecanismo semelhante ao verificado nos
vinhos. Este mecanismo de formação também foi descrito para a cachaça obtida a partir da cana do
açúcar, mas a fonte de cianeto neste produto ainda não foi identificada. Para além da catálise
enzimática, nos casos das bebidas destiladas, a hidrólise não enzimática dos precursores
cianogénicos passa por outros dois mecanismos, um deles através de reacções catalisadas pelo ião
Cu2+ presente na generalidade do material utilizado nos equipamentos de destilação - alambiques e
tubagens - e outro, cujas reacções específicas ainda estão a ser estudadas, pela formação de
radicais livres por exposição a luz ultravioleta. [59,71-73,83,118-120].
Existem ainda outros mecanismos propostos para a formação do CE em bebidas destiladas,
nomeadamente através da reacção de algumas proteínas com o etanol, com catálise pelo cobre
[71,74].
7
A formação do CE noutros alimentos também foi estudada, nomeadamente em pão e molho de soja,
[33,75-77, 131]. No caso do molho de soja considera-se que o principal precursor seja a citrulina em
vez da ureia e que uma deficiente fermentação láctica durante o processo de fabrico possa permitir
um aumento desta e, por conseguinte, dos teores de CE presentes no produto final.
Também foi sugerido que a azodicarbonamida utilizada como antioxidante em garrafas de cerveja e
também como agente de expansão da massa do pão, pudesse contribuir para a formação de CE
[72,78]. No entanto os baixos teores de CE ( <10 ppb) encontrados nestes alimentos indicam que a
contribuição deste composto para os teores totais do composto será muito provavelmente
desprezável. O mecanismo específico de formação do CE no pão não foi especificamente estudado.
No entanto considera-se que os mecanismos envolvidos serão muito semelhantes aos verificados nos
processos fermentativos de outros alimentos [59].
Uma vez que os teores de CE presentes nos vinhos podem ser influenciados por todas as etapas do
seu processo produtivo, desde as etapas de viticultura até ao envelhecimento em garrafa, importa
indicar algumas boas práticas e medidas que podem ser adoptadas de forma a diminuir o potencial
de formação do composto.
A utilização de leguminosas como cobertura nos terrenos das vinhas no Inverno, poderá adicionar
uma quantidade significativa de azoto ao solo, na ordem dos 40 kg/hectare, o que constitui cerca
do dobro do valor obtido através da utilização de fertilizantes sintéticos, os quais não devem ser
utilizados em quantidades superiores de azoto a 110 kg/hectare. Este excesso de azoto disponível
no solo traduzir-se-á numa maior quantidade de substratos, particularmente arginina, passíveis de
serem utilizados pelas leveduras e/ou bactérias e por conseguinte aumentar a quantidade de
precursores de CE.
As diferentes combinações de bacelo e porta-enxerto das vinhas, também influenciam os teores de
ureia que virão a ser encontrados nos vinhos. Geralmente a quantidade de azoto assimilada do solo
é dependente do porta-enxerto. No entanto utilizando o mesmo enxerto e diferentes bacelos,
poderá verificar-se uma variação de mais de 10 vezes nos teores de azoto detectados em análise
foliar, geralmente considerados como bons indicadores dos teores que irão ser encontrados nos
mostos [45,52,60,61].
Antes do início da fermentação será importante saber qual a quantidade de azoto assimilável
disponível no mosto. Esta não deverá exceder os 250-700 mg/L. A concentração de arginina deverá
ser inferior a 1 g/L e os teores de ureia não deverão ultrapassar os 3-5 mg/L, sendo os valores
normais encontrados nos vinhos entre 0,1-10 mg/L [52,62].
A selecção de microrganismos apropriados, ou seja leveduras e/ou bactérias que não sejam
exigentes relativamente à quantidade de azoto assimilável disponível no meio, e que não libertem
quantidades significativas de precursores, pode contribuir para minimizar a formação de carbamato
8
de etilo [44,45]. Isto pode ser conseguido através de leveduras que naturalmente possuam essa
característica (Lallemand 71B®, Red Star SC1120® ou Premier Cuvée PdM®, por exemplo [52]), ou
mesmo através da sua manipulação genética e metabólica [54,55,83,121]. A ocorrência de
fermentações espontâneas com microrganismos nativos existentes nos mostos é portanto
desaconselhada, uma vez que neste caso se desconhecem as suas características.
Caso os teores de ureia encontrados nos mostos sejam superiores aos recomendados, é possível a
utilização de ureases, enzimas específicas para cada substrato, de forma a catalisar a hidrólise da
ureia [51,56]. No entanto, a maioria das ureases utilizadas comercialmente é obtida a partir de
fontes não vinícolas, (p. ex. feijões) e são desadequadas para serem utilizadas em vinhos, cujo pH é
geralmente inferior ao pH de actividade máxima destas enzimas [51]. As ureases obtidas a partir de
bactérias que realizam a FML têm sido investigadas como alternativas para a remoção do excesso de
ureia nos vinhos. As ureases ácidas produzidas pelo Lactobacillus fermemtum e Lactobacillus
reuteri são bastante eficazes entre os pH 2,0 a 4,0 , o que abrange os valores mais frequentemente
encontrados nos vinhos. No entanto alguns dos compostos do vinho, por exemplo compostos
fenólicos (taninos das grainhas das uvas), dióxido de enxofre, etanol e ácidos orgânicos (p. ex.
málico, láctico, e pirúvico) inibem a actividade da urease obtida a partir do L. fermemtum [57]. No
entanto, pelo facto de serem necessárias quantidades significativas de enzimas para aplicação à
escala industrial, e pelo facto destas enzimas não terem um efeito sobre os outros precursores do
CE, a sua utilização não constitui uma solução total para o controlo dos teores do composto [42].
Algumas práticas enológicas também poderão influenciar os teores de CE encontrados nos vinhos. No
caso dos vinhos licorosos os processos de fermentação são parados pela adição de etanol numa fase
em que a produção de ureia pelas leveduras é elevada. Desta forma, a quantidade de ureia
disponível para formar CE será superior face a um processo de fermentação mais longo. Também é
indicado que o estágio, sur lie, ou seja a colocação de vinhos em barricas sem a remoção das
massas de fermentação, poderá influenciar nos teores de CE, apesar de não existir uma opinião
consensual sobre este prática enológica [52,53].
Uma vez que os processos de formação do CE não são enzimáticos, sendo favorecidos pelo aumento
da temperatura e pela concentração dos respectivos precursores e etanol, será também importante
controlar as temperaturas, quer ao longo da fermentação quer também as de armazenamento dos
produtos após o seu engarrafamento [51,62].
Outra metodologia possível para o controlo dos teores de CE presentes nos vinhos poderá passar
pela utilização de microrganismos com capacidade para produzirem enzimas que degradarem o
próprio composto nas bebidas alcoólicas. Tal aplicação foi já alvo de registo de patente nos E.U.A.
[58].
A presença inevitável de compostos com potencial para a formação de CE nos vinhos, e o facto dos
processos para a formação do CE serem não enzimáticos, levou a que fossem efectuados estudos
que, partindo de análises efectuadas aos vinhos imediatamente antes do seu engarrafamento,
9
permitissem a construção de um modelo que estimasse a quantidade máxima de CE passível de ser
formada após esta etapa. Os estudos efectuados permitiram a definição de equações (Apêndice 1),
para um modelo que contempla o etanol, a ureia, a arginina e a citrulina presentes nos vinhos [68].
Estas conclusões confirmaram as estimativas dos estudos anteriormente efectuados por Kodama
[51], nos quais foram avaliados os teores de CE presentes em vinhos armazenados a diferentes
temperaturas, durante 2 anos. É no entanto referida pelos autores a necessidade de serem
efectuados mais estudos desta natureza, para que sejam aperfeiçoados os valores calculados para as
constantes das referidas equações.
Tendo em conta o modo de formação do CE é portanto possível indicar tipos de vinhos nos quais,
devido ao tipo de práticas enológicas adoptadas, a probabilidade do composto se formar será maior,
nomeadamente [51,68]:
- Vinhos em que é efectuada a FML;
- Vinhos licorosos face a vinhos de mesa, uma vez que a fermentação é parada antes do seu
término, ou seja numa fase que em existe produção de ureia. Esta paragem é conseguida através da
adição de etanol, o que por sua vez também aumenta a probabilidade de formação de precursores
do CE. (p. ex. Vinhos do Porto, Vinhos Moscatel). A adição de etanol também pode favorecer a lise
das células, o que aumentará a quantidade de precursores libertados para o meio;
- Vinhos sujeitos a temperaturas elevadas, quer como forma de esterilização, quer como parte do
seu processo de fabrico (p. ex. Vinhos da Madeira);
- Quanto mais velho for um vinho maior será o teor de CE encontrado. Deste modo, vinhos com
longos períodos de estágio em barrica e/ou garrafa terão uma maior quantidade de CE;
É possível encontrar na literatura algumas referências aos teores de CE em vinhos Portugueses
(Tabela 3):
Tabela 3 – Teores de CE encontrados em vinhos portugueses Referência Vinho N.º de amostras Valor médio de CE (ppb) Origem
Antes de
estufagem Após estufagem
[79] Madeira 3
38,6 52,5
Portuguesa
Alentejo 8 3,2
Madeira 12 33,5
Porto 9 31,9 [80]
Brandies 13 91,2
Portuguesa
[81] tipo Porto 4 30,9 n.e.
tipo Madeira / tipo Porto 4 54,5 n.e. [85]
Xerez 2 4 Portuguesa
Porto 5 27,8 Portuguesa [113,114]
Madeira 2 39 Portuguesa
[116] tipo Porto 8 30 n.e.
[139] tipo Porto 7
2 amostras entre 20 e 50 ppb
2 amostras entre 50 e 100 ppb
1 amostra entre 100 e 500 ppb
n.e.
Legenda: n.e. – não especificada.
10
Em algumas das amostras o vinho é apenas indicado pelo seu tipo, não sendo especificamente
indicado o país de origem. Estas amostras poderão não ter sido produzidas em Portugal.
Da análise dos dados disponíveis é possível constatar que a maioria dos valores reportados se refere
essencialmente a vinhos da Madeira e do Porto. Relativamente aos vinhos de mesa, existe apenas
uma referência à análise de 8 amostras de vinho provenientes da Região do Alentejo. Estas amostras
foram analisadas pela técnica de HPLC-FLD (2.4.4) também utilizada neste trabalho.
Quando são comparados os valores indicados na tabela com os limites legais existentes (tomam-se
como referência os valores em vigor no Canadá indicados na Tabela 1), é possível verificar que a
maioria das amostras cumpre na generalidade estes limites.
1.3 Objectivos do trabalho
Os objectivos deste trabalho consistiram na análise de amostras de vinhos através do Método Oficial
para a análise do CE [95], efectuando o pré-tratamento de amostras por extracção em fase sólida
(SPE) e a análise por cromatografia gasosa/espectroscopia de massa (CG/MS), e também na
utilização de outras técnicas de pré-tratamento de amostras mais expeditas, nomeadamente a
microextracção em fase sólida (SPME), e o método QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective,
Rugged, Safe), também com análise por CG/MS e finalmente na utilização de uma outro método de
análise, por HPLC-FLD.
1.4 Análise do carbamato de etilo
Para proceder à análise do CE é necessário, na generalidade dos casos, a realização de diversas
etapas de pré-tratamento da amostra, dada a complexidade das matrizes em causa, antes de ser
possível efectuar a análise em si. Estas etapas contemplam fundamentalmente a extracção do
analito da matriz, mas também a sua limpeza ou fraccionamento, concentração e em certos casos
derivatização, tendo em conta todas as vantagens analíticas inerentes a cada processo em
particular, podendo estes procedimentos envolver até cerca de 80% do tempo analítico dispendido
[82]. Os critérios para análise
A literatura refere diversas técnicas para a análise do CE. São indicadas na Tabela 4 as técnicas de
pré-tratamento e métodos de análise mais frequentemente citados.
11
Tabela 4 – Técnicas de pré-tratamento e métodos utilizados para a análise do CE Autores Pré-tratamento da amostra Método de análise
Cairns et al. (1987) [84]
Ext. Líq./Líq. c/ acetona/diclorometano/éter de petróleo + Florisil + éter etílico/éter de petróleo + acetona
GC/HECD, GC/MS/MS
Conacher et al. (1987) [85]
Ext. Líq./Líq. c/ diclorometano + centrifugação + acetato e etilo GC/HECD, GC/ MS
Mildau et al. (1987) [86]
Ext. Extrelut + pentano + diclorometano CG/MS
Brumley et al. (1988) [81]
Ext. Líq./Líq. c/ diclorometano + centrifugação + acetato de etilo CG/MS/MS
Mossoba et al. (1988) [87] / Clegg e Frank (1988) [88]
Ext. Líq./Líq. c/ diclorometano + centrifugação + acetato de etilo CG/MI/FTIR
Giachetti et al. (1991) [89]
Ext. Líq./Líq. c/diclorometano/acetato de etilo + derivatização com xantidrol GC/MS
Ferreira e Fernandes (1992) [79]
Ext. Líq./Líq. c/ éter etílico + acetato de etilo GC/MS
Ma et al. (1995) [132]
Ext. Liq./Liq. c/diclorometano + acetato de etilo GC/TSD
Herbert et al. (2002) [80] Derivatização com xantidrol HPLC-FLD
Jagerdeo et al. (2002) [116] SPE c/ENV+ + centrifugação + acetato de etilo GC/GC/MS
Whiton et al. (2002) [90] SPME GC/MS
Lachenmeirer et al. (2004) [91,110] SPE c/Extrelut + pentano + diclorometano GC/MS/MS
Tat et al. (2004) [92] SPME GC/FID GC/MS
Mirzoian e Mabud (2006) [94] SPE c/ENV+ + acetato de etilo CG/MS
Legenda: ENV+ - copolímero hidroxilado de poliestireno-divinilbenzeno;
FID – detector por ionização com chama;
FTIR - espectrometria de infravermelhos com a transformada de Fourrier;
HECD - detector de condutividade electrolítica de Hall;
TSD – detecção termiónica específica.
12
Analisando os dados listados na Tabela 4 pode concluir-se que a técnica de pré-tratamento mais
frequentemente utilizada é a extracção líquido/líquido. Devido ao tempo necessário para a sua
realização e aos respectivos custos quer económicos, quer ecológicos, decorrentes da utilização de
elevadas quantidades de solventes, não se optou pela utilização desta técnica de pré-tratamento de
amostras. Em primeiro lugar pretendeu-se aplicar a técnica de análise indicada no Método Oficial
(SPE + GC/MS). O pré-tratamento por SPME e pelo método QuEChERS foram seleccionados pela sua
rapidez e simplicidade de execução, face ao pré-tratamento por SPE. A utilização da GC/MS/MS
também é citada por alguns autores. Uma vez que não se dispunha de um equipamento deste tipo,
este método não foi utilizado. O método de HPLC-FLD foi seleccionado pela rapidez do
pré-tratamento das amostras, e também pelo facto de utilizar uma reacção específica de
derivatização, o que permitira a diminuição da ocorrência de fenómenos de interferência.
1.4.1 Cromatografia gasosa / espectroscopia de massa
Pré-tratamento da amostra por extracção em fase sólida
Nos últimos anos a SPE tem vindo a substituir quase por completo a extracção líquido-líquido, uma
vez ter provado ser uma técnica muito poderosa no pré-tratamento de amostras para análise
cromatográfica, sendo comparativamente mais rápida e de fácil execução, precisa, consumindo
quantidades reduzidas de solventes orgânicos, não envolvendo material de custo oneroso e não
formando emulsões.
Apesar das vantagens inerentes à SPE, o pré-tratamento de amostras para análise cromatográfica
direcciona-se cada vez mais no sentido da diminuição do volume de amostra, redução do número de
passos analíticos e tempo envolvidos, isenção de solventes orgânicos tóxicos e miniaturização dos
sistemas extractivos, fundamentalmente com recurso às técnicas de extracção sorptiva. O Método
Oficial para análise do CE [95], determina o pré-tratamento das amostras de vinho por SPE,
utilizando-se uma coluna com enchimento de terras de diatomáceas com um volume de 50 ml. A
literatura reporta a utilização de diversos tipos de colunas (Tabela 4) para a análise do CE.
Pré-tratamento da amostra por microextracção em fase sólida
A microextracção em fase sólida consiste numa técnica para pré-tratamento de amostras que utiliza
uma fibra de sílica fundida que suporta uma fase estacionária, geralmente um polímero não volátil,
para a extracção de compostos orgânicos, directamente de amostras aquosas ou no headspace em
equilíbrio com a amostra. Ao expor-se a fibra à amostra verifica-se uma partição entre os
componentes voláteis da amostra e a sua fase líquida [96].
Os materiais da fase estacionária podem ser utilizados isoladamente (PDMS – polidimetilsiloxano ou
PA – poliacrilato) ou combinados com outros (p. ex. CW - carbowax, DVB - divinilbenzeno) de forma a
13
ser obtido uma material que combine as propriedades de adsorção de ambos. O composto a analisar é
então desorvido no injector do cromatógrafo. A fibra é montada num suporte semelhante a uma
seringa [97].
A aplicação desta técnica para a análise do CE em bebidas alcoólicas já foi estudada. Alguns autores
referem que as fibras mais adequadas serão as CW/DVB [90,110]. Outros autores referem a obtenção
de melhores resultados com fibras de CW/PDMS [98]. Optou-se neste trabalho por utilizar as fibras de
CW/DVB uma vez que é referido que estas permitiram uma menor adsorção de componentes da
matriz de bebidas alcoólicas [110].
Pré-tratamento da amostra por QuEChERS
Uma outra técnica para o pré-tratamento de amostras recentemente desenvolvida, designa-se por
QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe). Esta técnica foi apresentada em 2003 por
Anastassiades e seus colaboradores [99,100], sendo desenvolvida com o objectivo de se obter um
método que permitisse a análise simultânea de diversos resíduos de pesticidas presentes numa
amostra e que fosse simultaneamente fácil e rápida de efectuar, com baixos custos, uma vez que
outras técnicas de pré-tratamento de amostras, nomeadamente a SPME não substituíram com sucesso
a abordagem multi-resíduos tradicional.
Este método compreende 2 fases: uma extracção líquido-líquido, seguida de uma etapa de limpeza,
denominada extracção em fase sólida dispersiva, efectuada directamente na amostra à qual é
adicionado simultaneamente um material sorvente.
Desde a divulgação do método original, este tem sofrido algumas modificações e adaptações,
necessárias para a análise de compostos que sejam susceptíveis a degradação nas condições de
extracção descritas no método inicial (p.ex. pesticidas susceptíveis a ácidos e bases) e também como
forma a alargar a gama de matrizes alimentares abrangidas por este método [101].
O método de análise original foi sujeito a validação através de ensaios interlaboratoriais,
encontrando-se presentemente em discussão uma Norma Europeia (prEN 15662) [102], que descreve
esta técnica, com data de publicação prevista em 2009. Este método também se encontra em
discussão para adopção pela AOAC – American Organization of Analytical Chemists [103,104].
Uma vez que é referida a utilização deste método para a pesquisa de diversos pesticidas carbamatos,
considerou-se que poderia ser interessante a sua utilização para a pesquisa do CE. Na pesquisa
efectuada na literatura não foram encontradas referências específicas à sua aplicação para este
composto.
14
1.4.2 Cromatografia líquida de alta eficiência / detecção por fluorescência
Também é referida na literatura uma técnica de análise para o CE desenvolvida em Portugal,
especificamente por HPLC-FLD. Nesta técnica analítica é utilizada a reacção do xantidrol para a
identificação de amidas [106], através de uma reacção de substituição nucleofílica com o xantidrol
em meio ácido, em que o grupo amina do CE se comporta como um nucleófilo, dando origem a
xantiluretano, composto que apresenta fluorescência (Equação 2) [77,80].
Xantidrol Carbamato de etilo Xantiluretano
Equação 2 – Reaccção do xantidrol com o CE [77,80]
Esta reacção apresenta um alto rendimento (> 95 %) sendo relativamente fácil a obtenção do
derivado fluorescente. A literatura também refere a análise do xantiluretano por GC/MS, pela análise
de 7 fragmentos resultantes da ionização do composto por impacto electrónico, com fragmentos com
massas compreendidas entre 77 e 269 [89].
A especificidade desta reacção foi avaliada através de ensaios com diversos aminoácidos [80]. Desta
forma, segundo os autores, pretendeu-se desenvolver uma técnica que não apresentasse os
inconvenientes dos métodos de referência (tempos de análise elevados e incertezas associadas a
diversas etapas de limpeza da amostra) e que permitisse a análise de um número elevado de
amostras por dia, condição normalmente existente em laboratórios envolvidos em actividades de
controlo da qualidade.
Esta técnica permite efectuar a quantificação do CE directamente em amostras de vinho, sem
numerosas etapas de pré-tratamento da amostra, sendo apenas necessário efectuar uma diluição
inicial da amostra em solução aquosa de etanol e a reacção de derivatização propriamente dita.
Posteriormente ao seu desenvolvimento, o método foi avaliado em ensaios interlaboratoriais [108],
em que estiveram envolvidos 6 laboratórios que usaram os 2 métodos aqui apresentados (GC e HPLC)
tendo os resultados obtidos nos laboratórios participantes permitido, de acordo com os autores,
estabelecer uma boa correlação entre os métodos.
Apesar dos limites de detecção para esta técnica serem ligeiramente superiores aos indicados para o
método oficial (Tabela 5), esta técnica, segundo os autores, pode ser usada como forma de
despistagem do CE em vinhos, sendo as amostras positivas confirmadas por GC/MS. Alguma literatura
15
publicada em 2007 [77] indica, para produtos de soja fermentados, limites de detecção 5 vezes
superiores aos inicialmente reportados.
Tabela 5 - Comparação da GC/MS e HPLC-FLD na análise do CE em amostras de vinho [108] Parâmetro GC-MS (método oficial) HPLC-FLD
Validação
Interferências Existem compostos com massas comuns ao
CE com tempos de retenção próximos
O reagente de derivatização também pode
reagir com aminas e amidas
Pré-tratamento da amostra Laborioso para amostras de vinho Apenas diluição e derivatização da
amostra
Gama de linearidade 5 – 320 µg / L 5 – 500 µg / L
Limites de detecção Aprox. 3ppb 4,2 ppb
Limite de quantificação 10 ppb Aprox. 14 ppb
Precisão 4,7 % 6,3 %
Exactidão 91 % 96 %
Apreciação qualitativa
Quantidade de trabalho laboratorial Extensa tendo em conta a extracção Diluição da amostra e tempo da reacção
de derivatização
Duração da análise (incluindo pré-
tratamento da amostra e cromatografia) ≈ 3 horas ≈ 40 minutos
Custos da instrumentação Elevados (GC/MS ou MS/MS) Médios (HPLC-FLD)
Técnica do analista Elevada Média
Presença de interferentes Possível Possível
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2. Materiais e métodos
2.1 Padrões, solventes, eluentes, reagentes, gases e água
Padrões
- Carbamato de Etilo – Assay - Fluka
- Isoctano – Uvasol – Merck
- α-terpineol – 98 % - Sigma
Solventes
- Ácido acético – P.A. – Panreac
- Ácido clorídrico 37% (v/v)- P.A. – Panreac
- Diclorometano – Reagent Analytical Grade - LabScan, Sigma, Ridel-de-Haen, Aldrich
- Etanol – A.C.S. - Panreac
- Metanol – HPLC - Fischer Scientific
- Propan-1-ol – HPLC - LabScan
- Propan-2-ol – HPLC - LabScan
Eluentes
- Acetato de sódio – A.C.S. - Aldrich
- Acetonitrilo – HPLC Grade - LabScan, Ridel-de-Haen, LabScan
- Diclorometano – Analytical Regent Grade - LabScan, Sigma, Ridel-de-Haen, Aldrich
Regentes
- “PSA Bonded Silica” – Supelco
- Sulfato de magnésio – Reagent Plus – Aldrich
- Sulfato de sódio – P.A. - Panreac
- Xantidrol – 98% - Aldrich
- Cloreto de sódio – A.C.S. - Ridel-de-Haen
- Sulfato de sódio – A.C.S - Ridel-de-Haen
Gases
- Azoto para GC - Air Liquide
- Hélio para GC – Air Liquide
Água
Toda a água utilizada foi purificada num sistema Mili-Q – Milipore
17
2.2 Materiais utilizados no pré-tratamento das amostras
- Agitadores magnéticos – 10 mm – Supelco
- Balança MC1 Analytic AC 210P - Sartorius
- Banho de ultra sons - SonoRex
- Bomba de vácuo - 169 – Buchi
- Centrífuga 5804 R – Eppendorf
- Colunas Chemelut de 50 ml – Varian
- Colunas de 6ml (ENV+) – Supelco
- Colunas de plástico de 20 ml
- Fibras – Carbowax/Divinilbenzeno – 70 µm – Supelco
- Lã de vidro – QP - Panreac
- Medidor de pH – Microph 2002 - Crison
- Medidor e sonda de temperatura – P-500 e PI-100 – DOSTMANN
- Micropipetas de 100 µL, 500 µL e 1000 µL – Eppendorf
- Microseringa de 10µL – Hamilton Co.
- Placa de agitação 34532 – Snijders
- Rotavapor – RE 11-B - Buchi
- Septos 11mm (borracha/teflon) - BSB Analytic
- Seringa para SPME de uso manual – Supelco
- Sistema de obtenção de água Mili-Q – Milipore
- Sistema de vácuo VisiPump – Supelco
- Tampões de pH 4,00 e 7,02 – Crison
- Terra de diatomáceas – Grau industrial – Celatom Fw50 e Celatom Fw12
- Tubos de polietileno de 30 ml para centrífuga
- TurboVap LV Evaporator – Zymark
- Vials 1,5ml – VWR
- Vials de 15ml (21 mm × 70 mm) com septos de borracha/teflon – Supelco
2.3 Equipamento
Para a GC/MS foi utilizado um cromatógrafo gasoso / espectrómetro de massa QP 2010 da Shimadzu,
com o qual foram utilizadas alternadamente 2 colunas capilares: DB5-MS – (30m x 0,32mm x 0,25µm)
- J & W e Supelcowax – (30m x 0,32mm x 0,25µm) – Supelco. O software de análise utilizado foi o
GCMSolutions V. 2.10 – LabSolutions também da Shimadzu. O espectrómetro de massa dispunha das
seguintes bibliotecas de espectros de massas: NIST 12, NIST 27, NIST 62, NIST 147 e WILEY 229.
18
Para a HPLC-FLD foi utilizado um cromatógafo Surveyor Plus da ThermoFinnigan com amostrador
automático. Foi utilizada uma coluna RP-18 (5µm) LiChroCART 250 x 4 mm e uma pré-coluna RP-18
(5µm) LiChroCART 4 x 4 mm, ambas da Merck. O software de HPLC utilizado foi o ChromQuest v. 4.0
da ThermoFinnigan. Utilizou-se um detector de fluorescência FL3000 também da ThermoFinnigan com
o software 4880 da ATI Unicam.
2.3 Modo de preparação das soluções
2.3.1 Solução padrão de carbamato de etilo para GC/MS – 0,013 mol/L
Para as determinações em GC/MS todas as soluções padrão de CE foram preparadas dissolvendo
0,1159 g do sólido em água, acetona ou diclorometano, para um volume final de 100 ml,
efectuando-se diluições subsequentes para as restantes soluções de trabalho. A solução mãe e
restantes soluções foram armazenadas em frascos herméticos de vidro escuro em refrigeração
(5-8ºC).
2.3.2 Solução padrão de carbamato de etilo para HPLC-FLD – 0,012 mol/L
Para as determinações em HPLC-FLD foi preparada uma solução padrão de CE, dissolvendo
0,1158 g do sólido numa solução aquosa de etanol a 20 %, conforme indicado na literatura [81],
para um volume final de 100 ml, efectuando-se diluições subsequentes para as restantes
soluções de trabalho. A solução mãe e restantes soluções foram armazenadas em frascos
herméticos de vidro escuro em refrigeração (5-8ºC).
2.3.3 Solução saturada com cloreto de sódio ou com sulfato de sódio para SPME
Para a obtenção de soluções saturadas procedeu-se à adição de aproximadamente 2,5 g de
cloreto de sódio ou de 1,3 g de sulfato de sódio a cada vial, para um volume final de padrão de
CE ou de amostra de vinho de 7 ml.
2.3.4 Solução de acetonitrilo a 1 % (v/v) de ácido acético para utilização no método QueChERS
Num balão volumétrico de 100 ml foram adicionados 1 ml de ácido acético a 99 ml de
acetonitrilo.
2.3.5 Solulução aquosa de ácido clorídrico (HCl) 1,5 mol/L
Para a preparação da solução aquosa de HCl foram diluídos 6,26 ml de ácido a 37 % com água
para um volume final de 50 ml.
2.3.6 Solução de reagente de derivatização – xantidrol – 0,02 mol/L
Para a preparação da solução foram dissolvidos 0,1982 g de xantidrol em 1-propanol para um
volume final de 50 ml. Esta solução foi armazenada em refrigeração (5-8ºC), em frascos
19
herméticos de vidro escuro, cobertos por filme de alumínio de modo a evitar a exposição da
solução à luz.
2.3.7 Solução aquosa de acetato de sódio 20 mM – eluente HPLC-FLD
Para a preparação do eluente foram dissolvidos 1,641 g de acetato de sódio num volume de 2
litros de água.
2.3.8 Soluções aquosas de etanol a 20 % e a 24 % para diluição das amostras em HPLC-FLD
Para a preparação de soluções aquosas de etanol a 20 e 24 % foram diluídos 20 ou 24 ml de
etanol com água num volume final de 100 ml.
2.4 Pré-tratamento das amostras
2.4.1 SPME
a) Previamente à primeira utilização, cada fibra foi condicionada conforme instruções do
fabricante [108], pela exposição a 220ºC durante 30 minutos no injector do CG sem execução de
programa. Após o condicionamento de cada fibra foi verificada a ausência de picos interferentes
através da realização de um ensaio em branco no CG/MS com o mesmo programa utilizado para
as amostras.
b) Foram colocados 2,5 g de cloreto de sódio e um agitador magnético dentro de um vial de
15ml;
c) Foram transferidos 7ml de amostra para dentro do vial;
d) O vial foi de seguida fechado com a respectiva tampa de rosca;
e) Foi efectuada a imersão parcial do vial, a metade da altura deste, em banho de água
termostatizado por placa de aquecimento e temperatura medida por sonda de temperatura.
f) A fibra foi imediatamente inserida no vial, sem imersão através do septo da tampa;
g) A fibra foi exposta à amostra durante 20 minutos com agitação constante;
h) Terminado este tempo a fibra foi recolhida e foi efectuada a injecção imediata da amostra no
CG/MS.
2.4.2 SPE
2.4.2.1 Método Oficial [95]:
a.1) Para vinhos com mais de 14 % alc. Foi efectuada a diluição de 1:8 de amostra com água até
um volume final de 40 ml, conforme indicado no Método Oficial;
a.2) Para vinhos com menos de 14 % alc. Foi efectuada a diluição de 1:2 de amostra com água até
um volume final de 40 ml, conforme indicado no Método Oficial;
b) Após a diluição da amostra esta foi transferida para a coluna de extracção.
c) O recipiente que continha a amostra foi lavado com 10 ml de água e água de lavagem foi
também transferida para a coluna.
d) A amostra foi deixada em contacto com a coluna durante 4 minutos;
20
e) De seguida foi efectuada uma extracção da amostra, efectuando-se a eluição pela adição de 80
ml + 80 ml de diclorometano;
f) O eluído foi recolhido em balão e foi concentrado em rotavapor a 30ºC até um volume de
aproximadamente 3-4 ml;
g) O balão foi lavado com 1 ml de diclorometano e transferiu-se o extracto para um tubo de
ensaio;
h) A amostra foi colocada no evaporador e foi concentrada em corrente de azoto até um volume
final de 1 ml;
i) De seguida a amostra foi analisada por GC/MS.
2.4.2.2 Método Oficial modificado [44, 69, 123] com base no Procedimiento Normalizado de Trabajo
(PNT) utilizado no laboratório de controlo oficial em Espanha – idêntico a 2.4.2.1 excepto pelos
seguintes pontos:
a) São adicionados de 10 g de cloreto de sódio à amostra antes da transferência para a coluna.
Não é efectuada a lavagem do recipiente da amostra com 10 ml de água;
b) O tempo de contacto da amostra na coluna é de 5 minutos;
c) Não é efectuada a concentração final em corrente de azoto, efectuando-se a concentração até
um volume final de aproximadamente 1 ml no rotavapor.
No caso das colunas preparadas manualmente foi colocada lã de vidro no interior da base da coluna
de plástico de 20 ml de forma a ser obtida uma altura de aproximadamente 0,5 cm. As colunas foram
enchidas com terras de diatomáceas de ganulomeria intermédia (Fw12) ou fina (Fw50) até cerca de 1
cm do topo. Devido à pequena granulometria do material de enchimento utilizado, o caudal de
diclorometano foi aumentado pela utilização de um sistema de vácuo (Visipump).
No caso das colunas ENV+ estas foram activadas pela passagem de 5ml de metanol seguida da
passagem de 2 ml de água e novamente 5 ml de metanol. A coluna foi deixada a secar à temperatura
ambiente durante 20 min. De seguida foram colocados de 6 ml de amostra não diluída na coluna e
efectuada a eluição com 5 ml de metanol.
2.4.3 QuEChERS [109]:
a) Foram adicionados 15 ml de amostra a 15 ml da solução de acetonitrilo (2.3.4) num tubo para
centrífuga de 30 ml;
b) Foram adicionados 6 g de sulfato de magnésio e 1,5 g de acetato de sódio;
c) O tubo foi agitado manualmente durante 1 minuto;
d) A amostra foi centrifugada a 3500 r.p.m. (rotações por minuto) durante 1 minuto;
e) Foi recolhido 1 ml do sobrenadante e este foi transferido para um novo tubo de centrífuga de
10 ml;
f) Foram adicionados 50 mg de sílica ligada PSA e 150 mg de sulfato de magnésio;
g) O tubo foi agitado manualmente durante 20 segundos;
21
h) A amostra foi centrifugada a 3500 r.p.m durante 1 minuto;
i) O sobrenadante foi recolhido e foi efectuada a análise deste por GC/MS.
2.4.4 HPLC-FLD [80]:
a.1) Para vinhos com mais de 14 % alc. (v/v) foi efectuada uma diluição 1:8 de 5 ml de amostra
com solução aquosa de etanol a 20 %;
a.2) Para vinhos com menos de 14 % alc. (v/v) foi efectuada uma diluição 1:8 de 5 ml de amostra
com solução aquosa de etanol a 24 %;
b) Foram introduzidos 500 µL de amostra num vial de 1,5 ml;
c) Foram de seguida adicionados 100 µL da solução de xantidrol (2.3.5) e 50 µL da solução de HCl
(2.3.4);
d) O vial foi selado com o respectivo septo e agitado manualmente durante e 10 segundos;
e) A reacção foi desenvolvida na obscuridade durante 5 minutos após os quais a amostra foi
analisada.
A diluição dos vinhos, consoante o seu teor alcoólico, com soluções de etanol de diferente
concentração, é utilizada para normalizar o teor de etanol presente na amostra, para que as
condições da reacção de derivatização se mantenham semelhantes.
2.6 Condições instrumentais
2.6.1 Condições em GC/MS [95]:
a) Condições do GC
Colunas: Coluna capilar DB5 (30m x 0,32mm x 0,25µm);
Coluna capilar Carbowax (30m x 0,32mm x 0,25µm) – Coluna indicada no Método Oficial;
Volume de injecção: 0,5µL;
Gás transportador: Hélio;
Temperatura inicial do forno a coluna: 40ºC;
Temperatura de injecção: 180ºC;
Modo de injecção: Splitless;
Tempo de corte do solvente: 3 min.
Tabela 6 - Programa de temperaturas do cromatógrafo gasoso
Incremento
(ºC/min.)
Temperatura
final (ºC)
Tempo de
manutenção
da temp. (min.)
- 40,0 0,70
3,00 125,0 -
35,00 220,0 5,25
0
50
100
150
200
250
0 5 10 15 20 25 30 35
Tempo (min.)
Temperatura (ºC)
22
b) Condições do MS:
Temperatura da fonte iónica: 250ºC;
Temperatura da interface: 220ºC;
Início da aquisição: 3 min.;
Fim aquisição: 36 min.;
Fragmentação por impacto electrónico (70 eV);
Modo SCAN: Intervalo 0,5 seg.;
Velocidade de SCAN: 555;
Massas adquiridas: 30,00-300,00;
Modo SIM: Intervalo 0,2 seg.;
Massas adquiridas: 62,00; 74,00 e 89,00;
Limiar de detecção (Threshold) 1000.
2.6.2 Condições em HPLC-FLD [80]
a) Condições do HPLC:
Eluentes: A – Solução aquosa de acetato de sódio (2.3.6);
B - Acetonitrilo puro;
Injecção de loop total - 20 µl.
A coluna indicada no método [80] é uma AminoQuant II 200 x 2.1 mm com partículas de 5 mm -
Hewlett-Packard. Através da pesquisa no site do actual fabricante (Zorbax - Agilent) foi verificada a
semelhança com as colunas utilizadas nas determinações deste trabalho - LiChroCART – Merk). Os
fluxos de eluentes foram adaptados face ao indicado no método original (Tabela 7), tendo em conta
as maiores dimensões das colunas (2.2.6) utilizadas nas determinações.
Tabela 7 – Programa de eluentes utilzado na HPLC-FLD Tempo (min.) Eluente A (%) Eluente B (%) Fluxo (mL/min.)
0,01 55,00 45,0 0,900
36,00 50,00 50,00 0,900
38,00 0,00 100,00 1,200
40,00 0,00 100,00 1,600
52,00 0,00 100,00 1,600
56,00 55,00 45,00 0,900
58,00 55,00 45,00 0,900
0
20
40
60
80
100
120
0 10 20 30 40 50Tempo (min.)
Eluentes (%)
Eluente A (%)
Eluente B (%)
23
b) Condições do detector de fluorescência
Comprimento de onda de excitação: 234 nm
Comprimento de onda de emissão: 600 nm
2.7 Amostras analisadas
As diferentes amostras analisadas foram identificadas do seguinte modo (Tabela 8):
Tabela 8 – Identificação das amostras analisadas Codificação Tipo de amostra Região Ano
A1-A6 Mosto de vinho branco de em diversas
fases de fermentação Bucelas
2005
(Vindima)
B Vinho branco D.O.C. Bucelas 2004
C Vinho tinto D.O.C. Estremadura 2003
D Vinho de mesa tinto comercial n.º 1 n.a.
E Vinho de mesa branco comercial n.º 1 n.a.
F Vinho branco D.O.C. resultante dos
mostos A1-A6 Bucelas 2005
G Vinho licoroso comercial Douro n.a.
H Vinho tinto Regional Beira Interior 1999
I Vinho tinto D.O.C Setúbal 1998
J Vinho tinto Regional Estremadura 2002
K Vinho branco Regional Estremadura 2002
L Vinho licoroso D.O.C. Setúbal 2002
M Vinho de mesa branco comercial n.º 2 n.a.
N Vinho tinto D.O.C Beira Interior 2000
O Vinho tinto Regional Estremadura 1999
P Vinho de mesa tinto comercial nº2 Douro n.a.
n.a. – não aplicável – na rotulagem dos vinhos de mesa geralmente não é indicada a região de origem nem o ano de produção.
- As amostras A1 a A6 foram recolhidas durante a vindima de 2005 junto do produtor, sendo
congeladas a -18ºC imediatamente após a sua recolha até ao momento de análise.
- As amostras D, E e G foram adquiridas em grandes superfícies no Distrito de Lisboa.
- A amostra L foi cedida pelo Laboratório de Química do Instituto de Biologia Experimental e
Tecnológica / Instituto de Tecnologia Química e Biológica.
- As restantes amostras de vinho foram adquiridas em loja própria do produtor.
- Todas as amostras de vinhos analisadas foram obtidas a partir de produtos já engarrafados ou
embalados, nas mesmas condições de venda ao público em geral.
24
3. Resultados e discussão
3.1 Análise por cromatografia gasosa / espectroscopia de massa
3.1.1 Cromatograma e espectro de massa do carbamato de etilo
Quando analisado nas condições de GC/MS definidas em 2.5.1, utilizando uma coluna do tipo
carbowax, o carbamato de etilo apresentou um tempo de retenção de 23,34 minutos (Figura 3):
Figura 3 – Cromatograma de padrão de CE a 1000 ppb. Análise em modo SCAN
O composto, ao ser sujeito a ionização por impacto electrónico apresentou o seguinte espectro de
massa (Figura 4):
Figura 4 – Espectro de massa do CE obtido pela análise de padrão a 1000 ppb em modo SCAN
Da análise do espectro obtido (Figura 4) e das respectivas intensidades das massas (Apêndice 2) é
possível verificar que aquelas que apresentaram uma maior intensidade relativa foram, por ordem
decrescente, as massas 44, 62, 45, 31, 74, 43 e 46. A massa 89 corresponde ao ião molecular do
composto. Os fragmentos correspondentes a algumas das massas mais abundantes no espectro do são
respectivamente:
- m/z 44 – (NH2CO) +
- m/z 45 – (C2H5O)+
- m/z 74 – (M-CH3●)+
- m/z 62 – (M-C2H3●)+
A massa 62 resulta de uma reacção de rearranjo “McLafferty +1” (Figura 5). Os índices de semelhança
obtidos pela comparação destes espectros com os existentes nas bibliotecas do equipamento
(Apêndice 2) foram, para esta ordem de concentrações, iguais ou superiores a 95 %.
Carbamato de etilo
25
Figura 5 – Reacção “McLafferty +1” para o carbamato de etilo
A selecção dos iões para efeitos de identificação e quantificação do CE coloca alguns problemas. O
ião molecular do composto corresponde ao fragmento m/z 89. Este apresentou, para esta ordem de
concentrações uma intensidade relativa muito baixa de 10,67 %. Portanto, à medida que a
concentração de CE ensaiada fosse diminuída, e tendo em conta os valores das concentrações de CE
que seria expectável encontrar nos vinhos a analisar – poucos ppb’s – seria difícil a obtenção de uma
resposta satisfatória deste ião, para a gama mais baixa de concentrações ensaiada. A obtenção de
baixas respostas para a massa 89 foi confirmada quando foi efectuada a curva de calibração do
composto (dados apresentados na página 33). Este aspecto é referido no Método Oficial, que indica
que a para a obtenção de uma resposta satisfatória para esta massa, poderá ser necessário efectuar
reconcentrações dos extractos das amostras.
Os fragmentos 44 e 74 apresentam frequentemente interferências da matriz, mesmo quando são
utilizadas técnicas de cromatografia multidimensional. Também foi reportada a presença de
compostos interferentes em vinhos para as massas 27, 29, 31, e 45. A massa 74 é comum a todos os
ésteres alquil metílicos. Os fragmentos 44 e 45 são ainda susceptíveis a interferências causadas pela
presença do anidrido carbónico [79,81,85,89,91,93,112,116,117,132].
Desta forma, resta o fragmento 62 como o mais adequado para efeitos de quantificação do composto.
De facto em todas as referências para métodos de análise do composto é referida a utilização desta
massa para esse fim. [33,44,69,73,77,86,88,90,94,95,116-119,131]
No entanto, de acordo com os critérios definidos no Método Oficial [95], será necessário que sejam
efectuadas duas razões de intensidades, entre as massas 62 e 74, e entre as massas 62 e 89. Também
de acordo com Método Oficial estas razões não deverão divergir mais de 20 % entre padrões e
26
amostras, de forma a ser possível a identificação do CE. Como limite de quantificação são indicados
no Método Oficial 10 ppb.
As razões das áreas das massas calculadas nos padrões de CE ensaiados, com concentrações na ordem
dos 1000 ppb, foram respectivamente de 6,1 para a relação 62/74 e de 56,2 para a relação 62/89.
Aplicando a percentagem de variação admitida no Método Oficial (20%) obtiveram-se os valores de
6,1±1,2 para a relação 62/74 e de 56,2±11,2 para a relação 62/89.
Para se poder efectuar uma identificação do CE nas amostras de vinhos, de acordo com os critérios do
Método, as razões das massas calculadas a partir dos espectros de massa obtidos, necessitavam de
estar compreendidas nestes intervalos.
Como não existem valores de referência para estas relações, é necessário que estas sejam calculadas
previamente à análise de amostras em cada laboratório que pretenda efectuar uma identificação do
CE.
3.1.2 Escolha do tipo de coluna para a realização dos ensaios
Na fase inicial dos trabalhos foram efectuadas algumas determinações com uma coluna do tipo
DB-5. Utilizando esta coluna o CE apresentou, nas condições descritas em 2.6.1 um tempo de
retenção de 6,45 minutos (Figura 6).
Figura 6 – Cromatograma de padrão de CE a 1 ppm. Análise em modo SCAN
Após a análise de amostras em modo SCAN foi possível concluir que existiam compostos sobrepostos
ao CE que apresentam massas comuns a este (Figuras 7 e 8), nomeadamente as massas 62, 74 e 89
que, como anteriormente indicado, são as mais importantes para a identificação do composto. A
sobreposição de compostos com massas comuns ocorreu com a utilização dos métodos de
pré-tratamento por SPE e por MEFS. Não foram efectuadas determinações com esta coluna utilizando
o método de pré-tratamento por QuEChERS.
Carbamato de etilo
27
Figura 7 - Cromatograma de amostra B com pré-tratamento por SPME. Análise em modo SCAN
Os compostos sobrepostos foram identificados como sendo acetato de isoamilo (Apêndice 3 – Secção
1), e hexanol com um índice de semelhança de 96 e 97 %, no caso das amostras de vinho,
respectivamente (Figura 7) e hexenal, hexanol e octanol (Apêndice 3 – Secção 2,3 e 4,
respectivamente), com índices de semelhança de 97, 91 e 88 % no caso das amostras de mostos,
respectivamente (Figura 8).
Figura 8 - Cromatograma de amostra A4 com pré-tratamento por SPE. Análise em modo SCAN
Como forma adicional de confirmação da identidade dos compostos sobrepostos foram verificados os
índices de Kovats indicados na literatura para o tipo de coluna utilizado (DB-5) [137]. Os valores
reportados na literatura são de 838,5 para o hexenal (média de 4 valores), 876 para o acetato de
isoamilo (1 valor), 883,6 para o hexanol (média de 5 valores) e 1012 para o octanol (média de 3
valores). A ordem de saída verificada nos cromatogramas é concordante com os índices de retenção
consultados, excepto para o acetato de isoamilo, que foi eluído depois do hexanol no caso das
amostras de vinhos (Figura 7). No entanto os valores para ambos os compostos são bastantes próximos
entre si, e apenas foi considerado 1 valor para o acetato de isoamilo.
Foi ainda efectuada a análise em modo SCAN de amostras fortificadas com CE (Figura 9). Os
resultados obtidos confirmaram a sobreposição deste às substâncias anteriormente indicadas.
Acetato de isoamilo
Hexenal
Hexanol Octanol
Massa 62 Massa 74
Massa 89
Massa 62
Massa 74
Hexanol
28
Figura 9 - Cromatogama de amostra A3 fortificada a 1 ppm com CE com pré-tratamento por SPME. Análise em
modo SCAN
Desta forma concluiu-se que a coluna DB-5 não permitia a identificação do CE nas amostras
analisadas. O revestimento desta coluna é constituído por difenildimetilpolisiloxano que é menos
polar que a coluna do tipo carbowax, cujo revestimento é constituído por polietilenoglicol. Em todas
as determinações posteriormente efectuadas por GC/MS foi utilizada uma coluna de carbowax.
3.1.2 Especificidade do método / presença de interferências
São de seguida apresentados os resultados obtidos na análise de amostras com as 3 técnicas de
pré-tratamento anteriormente indicadas e posterior análise por GC/MS. Uma vez que o CE apresentou
um tempo de retenção de aproximadamente 23,34 minutos nos ensaios com padrões, os resultados de
seguida indicados (Figuras 10 a 12) reportam-se ao intervalo compreendido ente os 23 e os 24
minutos.
Em todas as amostras de vinhos analisadas foi detectada a presença de 2 compostos, o ácido
butanodioico e o 3-(Metiltio) propan-1-ol, ambos com índices de semelhança superiores a 93 %. Ambos
os compostos são característicos dos vinhos [136]. Analisando os espectros de massa obtidos para
cada um deles (Apêndice 3 – Secção 5 e 6, respectivamente) observa-se que o ácido butanodioico
apresenta a massa 74 comum com o CE e que o 3-(Metiltio) propan-1-ol apresenta a massa 62 comum
com o CE. No entanto, uma vez que os tempos de retenção obtidos para cada um deles foram em
média de 22,93 e 24,05 minutos, respectivamente considerou-se que a sua presença não constituiria
uma fonte de interferência para a análise do CE.
Foram também detectados outros picos com tempos de retenção mais próximos aos do CE, com 23,12
e 23,25 minutos, respectivamente. Estes compostos foram identificados como o
decenoato de etilo e o α-terpineol. Estes compostos são também característicos dos vinhos [135].
Devido ao facto dos picos detectados para estes compostos se encontrarem parcialmente
sobrepostos, os índices de semelhança obtidos foram inferiores, estando compreendidos entre os 73 e
os 85 %, respectivamente. Considerou-se que estes índices de semelhança não eram suficientes para
Pico de massa 62 resultante da fortificação com CE a 1000 ppb
29
se efectuar uma identificação dos compostos. Como forma adicional de confirmação da identidade
dos compostos foram verificados os respectivos índices de Kovats, para o tipo de coluna utilizado
(carbowax) [135]. Os valores consultados foram de 1702 para o ácido butanodioico, 1708 para o
decenoato de etilo, 1716 para o α-terpineol e de 2209 para o 3-(Metiltio) propan-1ol. Estes valores
são concordantes com a ordem de saída observada nos cromatogramas das amostras.
Analisado o espectro de massa do decenoato de etilo (Apêndice 3 – Secção 7) verificou-se que este
também apresenta a massa 74. Relativamente ao α-terpineol, uma vez que se dispunha do respectivo
padrão, este foi também analisado para se verificar qual o espectro de massa obtido no equipamento
utilizado (Apêndice 4). Esta análise permitiu confirmar a proximidade do tempo de retenção do
composto relativamente ao tempo do CE, mas também permitiu verificar no respectivo espectro a
ausência das 3 massas mais importantes para a identificação do CE (massas 62, 74 e 89).
Figura 10 – Cromatograma de amostra C com pré-tratamento por SPME. Análise em modo SCAN
Figura 11 – Cromatograma de amostra E com pré-tratamento por SPE. Análise em modo SCAN
No caso do método QuEChERS verificou-se que a sua utilização resultava na obtenção de
cromatogramas que só apresentavam um pico aos 23,15 minutos (Figura 12), detectado em todas as
amostras de vinho submetidas a este pré-tratamento, cujo espectro de massa (Figura 13) não teve
correspondência com nenhum composto listado nas bibliotecas de massas disponíveis no
equipamento.
a)
a)
b)
b)
c),d)
c),d)
30
Figura 12 – Cromatograma de amostra D com pré-tratamento por QuEChERS. Análise em modo SCAN
Legenda das Figuras 10 a 12: a) Ácido butanodioico;
b) 3-(Metiltio) propan-1-ol; c) Decenoato de etilo;
d) α-terpineol; e) Composto não identificado.
Figura 13 - Espectro de massa do composto não identificado em modo SCAN
Em resumo, nas amostras analisadas não se observaram compostos com o mesmo tempo de retenção
do CE, apesar de terem sido observados compostos com tempos próximos e com massas comuns ao
composto. Foi confirmado que estes compostos não eram CE.
Foram observados no entanto outros fenómenos de interferência a nível da análise do CE quando foi
utilizada a GC/MS. Em 75 % das 174 determinações efectuadas em amostras utilizando esta técnica,
foi detectada, independentemente do tipo de pré-tratamento da amostra utilizado e do tipo de
amostra analisado, a presença de um pico de massa 74 (Figuras 14 e 15) numa zona dos
cromatogramas que o sobrepunha ao tempo de retenção do CE.
Figura 14 – Representação da zona de interferência causada por pico de massa 74 em amostra B com
pré-tratamento por SPME. Análise em modo SCAN
a)
b)
Pico de interferência de massa 74
e)
31
Figura 15 - Representação da zona de interferência causada por pico de massa 74 em amostra E com
pré-tratamento por SPE. Análise em modo SCAN
A altura máxima do pico registado não teve uma correspondência directa com nenhum dos picos
registados nos cromatogramas em modo SCAN (Figuras 14 e 15). Desta forma não foi possível atribuir
a sua origem a um composto em particular presente nas amostras. Este pico foi detectado em tempos
diferentes nos vários cromatogramas. No exemplo dado na Figura 14, este pico foi detectado aos
22,90 minutos, enquanto que na Figura 15 este pico foi detectado aos 23,25 minutos.
Para verificar se esta variação nos tempos estaria relacionada com as intensidades registadas para o
pico, foi efectuada uma integração de todos os picos de interferência nos cromatogramas em que
foram detectados. Não foi possível estabelecer nenhuma correlação clara entre os dois conjuntos de
valores.
Foi também colocada a hipótese deste pico ter origem em compostos que pudessem ficar retidos na
coluna entre determinações, uma vez que a temperatura máxima de trabalho na coluna não
ultrapassou os 220ºC. Contudo, em nenhum dos nos ensaios em branco das colunas, repetidos em
duplicado e em triplicado efectuados quer no início, quer no fim das séries de determinações de
amostras e padrões, foi registado um pico de massa 74, que se sobrepusesse ao tempo de retenção do
CE (23,34 minutos).
Também nos ensaios em branco efectuados quer com as fibras, quer com os solventes utilizados, não
foi detectada a presença de um pico deste tipo. Como já anteriormente referido na página 25, a
literatura refere a ocorrência de alguns efeitos de matriz associados à massa 74, pelo que supõe que
este pico provavelmente tivesse origem em algum constituinte ou constituintes dos vinhos, mas à luz
dos elementos disponíveis não foi possível esclarecer de forma mais clara a sua origem.
A presença deste pico interferente impossibilitou a determinação das relações das intensidades das
áreas das massas (neste caso a relação entre as massas 62 e 74) que, conjuntamente com o tempo de
retenção observado, permitiram uma identificação inequívoca do CE nas amostras de vinho. Este
conclusão é exemplificada na Figura 16, em que é apresentado o cromatograma obtido em modo SIM
de uma amostra de vinho fortificada a 60 ppb com CE.
Pico de interferência de massa 74
32
Figura 16 – Representação da zona de interferência causada por pico de massa 74em amostra B com pré-
tratamento por SPE e fortificação a 60 ppb de CE. Análise em modo SIM
A razão 62/74 anteriormente calculada para as respectivas intensidades das massas foi de 6,1 em
determinações efectuadas com padrões, conforme indicado na página 26. Analisando a Figura 16,
observa-se que a massa 74 tem uma intensidade superior à massa 62. Desta forma não é possível
cumprir os critérios estabelecidos do Método Oficial para a identificação do CE. Também não é
possível cumprir os critérios estabelecidos para a outra relação de massas (62/89) mencionada no
Método Oficial, uma vez que não foi possível obter respostas satisfatórias para a massa 89 (3.1.4),
para a ordem grandeza de concentrações de interesse nos vinhos, ou seja, para uma concentração de
CE de 30 ppb, que representa o limite legal/voluntário em vigor em alguns países.
3.1.3 Método Oficial modificado
A presença do pico de interferência da massa 74 nos cromatogramas obtidos com as amostras, levou a
que fossem ensaiadas diversas modificações ao Método Oficial, na tentativa de eliminar ou reduzir ao
máximo a sua influência na determinação do CE. Estas alterações consistiram na modificação da
diluição das amostras antes da colocação na coluna de SPE, na alteração dos tempos de contacto da
amostra antes da eluição, na alteração dos volumes de diclorometano utilizados, e na utilização de
várias colunas em série.
Algumas das modificações ensaiadas, descritas em 2.4.2.2, tendo por base o Procedimiento
Normalizado de Trabajo (PNT) utilizado em Espanha no laboratório de controlo oficial de alimentos
[10, 15, 123], permitiram a obtenção de cromatogramas (Figura 17) com um menor número de picos
na zona de interesse para a pesquisa do CE.
Pico de massa 62 resultante da fortificação com CE
Pico de interferência da massa 74
33
Figura 17 - Comparação de cromatogramas da amostra E obtidos com o Método Oficial e com o Método Oficial
modificado. Análise em modo SCAN
Não obstante, continuou a verificar-se a presença da zona de interferência anteriormente descrita.
Considerou-se contudo que a utilização do método modificado poderia facilitar a identificação do CE
nas amostras, pelo que este foi preferencialmente utilizado face ao Método Oficial.
3.1.4 Resposta de padrões de CE a várias concentrações, estudo da linearidade e de limites de
detecção e quantificação e escolha de padrão interno
Foi estudada a linearidade das respostas obtidas para padrões de CE em solução aquosa com as
seguintes concentrações: 1, 5, 10, 25 e 50 ppb, uma vez que esta gama abrangia os limites legais
para a maioria das amostras a analisar, ou seja vinhos de mesa, cujo limite legal é 30 ppb. Com os
resultados obtidos na análise dos padrões em triplicado (Apêndice 5 – Secção 1), construiu-se uma
curva de calibração para as massas 62, 74 e 89 (Figura 18). Estas determinações foram efectuadas
sem a utilização de padrão interno, apesar de também ser ter estudado a possibilidade da utilização
do isoctano para esta função (resultados apresentados na página 36).
y = 86,693x + 20,386
R2 = 0,9903
y = 462x + 626,3
R2 = 0,9957
y = 7,6966x + 21,374
R2 = 0,5563
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
0 10 20 30 40 50
Concentração (ppb)
Áreas
Massa 62
Massa 74
Massa 89
Figura 18 - Curva de calibração obtida com padrões de CE. Determinações em triplicado em modo SIM
Para os padrões com uma concentração de 1 ppb não foram obtidos sinais para a massa 89. Para uma
concentração de 5 ppb também não foi possível a obtenção de sinais para todos os padrões ensaiados.
Método Oficial
Método Oficial modificado
34
Através do software disponível no equipamento, utilizando o método RMS (Root Mean Square) foram
calculadas as seguintes relações sinal-ruído (S/N):
Tabela 9 - Relações sinal-ruído (S/N) obtidas pelo método RMS na análise de padrões de CE com concentrações ente 1-50 ppb. Média de determinações em triplicado. Determinações em modo SIM Concentração de CE (ppb) S/N para massa 62 S/N para massa 74 S/N para massa 89
1 38,13 22,49 - 5 - - 3,70 10 - - 4,40 25 - - 5,89 50 - - 25,82
Uma vez que esta forma de cálculo da relação S/N, apesar de automatizada no equipamento
utilizado, tende a sobre estimar a relação obtida em aproximadamente 5 vezes [96] foi também
efectuado um cálculo manual da relação S/N obtida, através do método peak-to-peak exportando os
valores numéricos dos cromatogramas obtidos e efectuando os respectivos cálculos (Tabela 10 /
Apêndice 5 – Secção 2).
Tabela 10 - Relações sinal-ruído (S/N) obtidas pelo método peak to peak na análise de padrões de CE com concentrações ente 1-50 ppb. Média de determinações em triplicado. Determinações em modo SIM
Concentração de CE (ppb) S/N para massa 62 S/N para massa 74 S/N para massa 89 1 7,46 1,56 0,79 5 10,69 1,65 1,00 10 18,89 2,46 1,00 25 70,02 8,72 1,33 50 86,36 11,49 1,82
Também foi calculada a relação S/N através do método peak-to-peak, com segmentação do intervalo
considerado (Tabela 11 / Apêndice 5 – Secção 3).
Tabela 11 - Relações sinal-ruído (S/N) obtidas pelo método peak to peak segmentado na análise de padrões de CE com concentrações ente 1-50 ppb. Média de determinações em triplicado. Determinações em modo SIM.
Concentração de CE (ppb) S/N para massa 62 S/N para massa 74 S/N para massa 89 1 8,81 1,74 1,28 5 12,51 2,23 1,26 10 23,94 3,04 1,28 25 87,77 11,74 1,73 50 107,19 15,82 2,28
Consoante o método utilizado para a determinação da relação S/N é possível efectuar uma
apreciação distinta dos resultados obtidos. Considerando-se o método RMS foram calculados valores
superiores a 3 para as massas 62 e 74 com uma concentração de 1 ppb. No caso da massa 89 foi
calculado um valor superior a 3 para uma concentração de 5 ppb.
Utilizando os dois métodos peak to peak, foi calculado um valor superior a 3 para a massa 62, para
uma concentração de 1 ppb. No caso da massa 74 foi obtido um valor superior a 3 para 10 ou 25 ppb
consoante o método utilizado. No caso da massa 89 não foi calculado um valor superior a 3 para as
concentrações de padrões de CE ensaiadas para ambos os métodos utilizados.
35
A partir das respostas obtidas com os padrões de CE nesta gama de concentrações, foram também
calculadas as respectivas relações de intensidades das áreas para estas massas. Estes valores foram
comparados com as relações anteriormente calculadas para os padrões de CE a 1000 ppb (página 26).
No caso da relação 62/74 foram obtidos desvios inferiores a 20 % para toda a gama de concentrações
ensaiada. No caso da relação 62/89 apenas foi obtida uma variação inferior a 20 % no caso da
concentração mais elevada (Apêndice 5 – Secção 4).
Para cada uma das massas foi estudada a linearidade das respostas obtidas de acordo com as normas
NP EN ISO 8466-1 e NP EN ISO 8466-2 (Tabela 12) [133,134]. O teste utilizado foi o de
Fischer/Snedecor
Tabela 12 – Estudo da linearidade das respostas de padrões de CE.
Massas Intervalo de lineariedade
(ppb) N R2 CVm PG F(1;N-3) 95%
62 1-50 5 0,998 6,97 % 1,07 4,75
74 1-50 5 0,997 10,45 % 3,20 4,75
Legenda: N – número de pontos da curva de calibração PG – valor teste R2 – coeficiente de determinação F – valor tabelado de Fisher/Snedecor CVm – coeficiente de variação do método
Através da análise do Figura 18 e da Tabela 11 é possível verificar que a função de calibração para as
massas 62 e 74 foi linear no intervalo de concentrações estudado, ou seja, R2> 0,99 e PG<F
considerando-se um valor teste de 4,75 (Apêndice 5 – Secção 5). Ou seja, a função de calibração
polinomial não conduziu a um ajustamento significativamente melhor para as massas 62 e 74.
Relativamente à massa 89 não foi obtida uma resposta linear para a gama de concentrações estudada
(R=0,76). Isto poderá ser justificado pela dificuldade na obtenção de uma boa resposta para esta
massa na gama de concentrações estudada.
Os limites de detecção (LD) e de quantificação (LQ) foram estimados através da relação entre o
desvio padrão residual (Sx/y) e o declive (m) da curva de calibração através das seguintes equações
[97]:
Equação 3 – Limite de detecção Equação 4 – Limite de quantificação
m
kSLD yx/=
m
kSLQ yx /=
No caso do limite de detecção foram considerados valores para k de 2 e 3, correspondentes a níveis
de confiança de 92,1 e de 98,3 %, respectivamente e para o limite de quantificação foi considerado
um factor de 10 para a sua determinação [97] (Tabela 13):
Tabela 13 – Estimativa dos limites de detecção e quantificação em GC/MS LD (ppb) para diferentes
níveis de confiança Massa
92,1 % 98,2 %
LQ (ppb)
62 2,53 3,80 12,6
74 3,80 5,70 19,0
36
No caso da massa 62 verifica-se que o valor estimado para o LQ é bastante próximo ao indicado no
método oficial (10 ppb).
Na análise por GC/MS, será necessária a utilização de uma substância com a função padrão interno de
forma a ser possível efectuar a avaliação da taxa de recuperação de CE nas diferentes técnicas de
pré-tratamento de amostras utilizadas. O Método Oficial menciona a utilização de carbamato de
propilo como padrão interno. No entanto, alguma literatura refere a degradação deste composto em
armazenamento em refrigeração [90,119]. A literatura refere também a utilização outros compostos
como padrões internos, nomeadamente os n-butil e t-butil carbamatos, bem como o CEd5
[72,75,81,84-86].
Foi explorada a possibilidade da utilização do isoctano como padrão interno em substituição dos
carbamatos e do CE marcado. Este composto, quando analisado nas condições de GC/MS definidas em
2.6.1, utilizando uma coluna de carbowax, apresentou um tempo de retenção de 5,85 minutos (Figura
19):
Figura 19 – Cromatograma de solução de 10 % de isoctano em diclorometano. Análise efectuada em modo SCAN
O índice de semelhança obtido nas bibliotecas de massa disponíveis no equipamento foi de 90 %. A
partir da análise dos espectros de massa obtidos foi construída uma tabela de intensidades de massas
(Apêndice 6 - Secções 1 e 2). Da sua análise verifica-se que a massa mais abundante no espectro do
composto é a 59. Uma vez que esta massa não estava presente aos 5,85 minutos nos cromatogramas
obtidos nos extractos das amostras (Figura 20) considerou-se que o isoctano poderia ser utilizado
como padrão interno nas determinações efectuadas por GC/MS.
Figura 20 - Cromatograma de amostra D após pré-tratamento pelo método QuEChERS. Análise em modo SCAN
Isoctano
Ausência de pico de massa 59 no tempo
de retenção do isoctano
37
Após diversos ensaios considerou-se que a adição de 10 % de isoctano em volume aos extractos
obtidos na SPE e no método QuEChERS seria suficiente para a obtenção de uma boa resposta da massa
59 (Figura 21). Apesar de esta percentagem em volume poder ser considerada elevada, foi aquela que
permitiu a obtenção de uma boa resposta para a massa de interesse.
Figura 21 - Cromatograma de amostra B após pré-tratamento da amostra por SPE com adição de 10 % isoctano
(v/v). Análise em modo SCAN
Foi também estudada a repetibilidade das áreas obtidas em soluções de padrões de CE a 10 e 50 ppb
adicionadas com 10 % de isoctano (v/v) em dois dias, para as massas 62 no caso do CE e 59 no caso do
isoctano (Tabela 14 / Apêndice 6 – Secção 3).
Tabela 14 – Repetibilidade obtida no ensaio de padrões de CE a 10 e 50 ppb adicionados de isoctano a 10% (v/v). Média de 10 determinações em modo SIM para cada concentração
Dia 1 Dia 2
CE
10 ppb Isoctano 10 % CE
50 ppb Isoctano 10 %
Média 6792,2 261148,3 31596,4 475857
DP 1281,401 36976,94 5300,826 47645,15
DPR % 18,87 14,16 16,78 10,01
Para ambos os dias os valores obtidos para os DPR % das áreas foram inferiores a 20 % o que significa
que o isoctano poderia aparentemente ser utilizado como padrão interno na gama de concentrações
de interesse para a pesquisa do CE.
3.1.5 Estudo do comportamento de padrões de CE com diferentes técnicas de pré-tratamento de
amostras e estudo de alguns parâmetros para estas técnicas
SPME
Para a análise de CE em vinhos a literatura refere que na SPME deverão ser utilizadas temperaturas
entre os 20 e os 30ºC, uma vez que a utilização de valores superiores diminuirá a extracção do
composto da amostra [90]. As extracções por SPME foram efectuadas a temperaturas controladas
entre os 28-30ºC.
Pico de massa 59 do isoctano
38
A adição de sais a bebidas alcoólicas como forma de aumentar a extracção de CE também já foi
estudada. Foi reportado que a utilização de sulfato de sódio ou de cloreto de sódio duplica a
extracção de carbamato de etilo em bebidas alcoólicas [90,110].
Foi estudada portanto a adição de sais, nomeadamente cloreto de sódio e sulfato de sódio, no
pré-tratamento de padrões de CE a 60 ppb com fibras CW/DVB, com um tempo de 20 minutos, tendo-
se obtido áreas de respectivamente 22681 para o pré-tratamento sem adição de sais, 53314 para o
pré-tratamento com a adição de sulfato de sódio e 54636 para o pré-tratamento com a adição de
cloreto de sódio (Figura 22 / Apêndice 7 – Secção 1).
Áreas
0 10000 20000 30000 40000 50000 60000
Sem adição de sal
Sulfato de sódio
Cloreto de sódio
Figura 22 - Influência da saturação com sais nas áreas obtidas em duplicados de padrões aquosos de CE a 60 ppb.
Análise efectuada em modo SIM com integração da massa 62
Nos padrões a que foram adicionados sais, as áreas obtidas foram superiores ao dobro das áreas
obtidas nos padrões que não foi adicionado nenhum sal. Os resultados obtidos estão de acordo com os
reportados na literatura [110,111], que indicam um aumento na extracção de CE quando são
adicionados estes sais a padrões e amostras. O aumento de extracção verificado resulta do aumento
da força iónica da solução, o que diminui solubilidade de pequenos analitos polares tais como o CE,
que passarão em maior quantidade para o espaço de cabeça do vial contendo a amostra, aumentando
portanto o rendimento do pré-tratamento. Este efeito é também designado por “salting-out”
[90,110]. No caso da adição de cloreto de sódio verificou-se uma menor variação percentual das áreas
(14,30 %) do que quando foi adicionado sulfato de sódio (42,46 %).
Partindo dos resultados obtidos com a adição de sais foi estudado o efeito da influência de diferentes
tempos de extracção nas respostas obtidas em padrões aquosos de CE a 60 ppb saturados com cloreto
de sódio (Figura 23 / Apêndice 7 – Secção 2).
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Tempo (mon.)
Áreas
Figura 23 - Influência da utilização de diferentes tempos de pré-tratamento nas áreas obtidas em padrões de CE
a 60ppb saturados com NaCl. Análise efectuada em modo SIM com integração dos fragmentos 62, 74 e 89
39
Da análise da Figura 23 verifica-se que a extracção do CE tendeu a aumentar com o aumento dos
tempos de pré-tratamento ensaiados. Para se determinar o tempo de equilíbrio entre as fases, ou
seja aquele em que a concentração de CE seria máxima na fibra seria necessário efectuar o ensaio
com tempos de pré-tratamento mais longos. A menor variação percentual das áreas (0,27 %)
verificou-se para o tempo de pré-tratamento de 20 minutos. Alguns autores [110] mencionam que a
utilização de 180 minutos de pré-tratamento não será suficiente para este equilíbrio ser atingido. Por
questões de organização de trabalho experimental e de forma a não introduzir um factor adicional de
variabilidade nos resultados obtidos manteve-se o tempo de pré-tratamento de 20 minutos nas
determinações efectuadas por SPME. Foi também estudada a repetibilidade obtida na análise de 10
padrões de CE a 60 ppb saturados com NaCl com um tempo de pré-tratamento de 20 minutos (Tabela
15):
Tabela 15 - Áreas e repetibilidade obtidas na análise de padrões de CE a 60 ppb saturados com NaCl com pré-tratamento por SPME durante de 20 minutos. Média de 10 determinações
Intensidades da massa 62 Média
51413 53916 53797,3
53078 58922 DP
48756 60032 4,196x103
58831 48096 DPR %
52058 52871 7,80 %
Os valores de DPR % obtidos permitiram concluir que as fibras utilizadas apresentavam uma boa
repetibilidade.
QuEChERS
Foi ensaiada a recuperação obtida com esta técnica de pré-tratamento através da comparação das
respostas obtidas em duplicados de padrões de CE a 1000 ppb. Verificou-se que a percentagem de
recuperação de CE nestes ensaios com era em média de 61 %, o que representa um valor abaixo da
percentagem de recuperação requerida pelo Método Oficial, que se situa entre os 90 e os 110 % [95].
Figura 24 – Comparação das respostas obtidas com padrões de CE a 1000 ppb por injecção directa e pelo método
QuEChERS. Análise em modo SCAN
Padrão de CE a 1000 ppb
Padrão de CE a 1000 ppb p/ QuEChERS
40
Estes resultados permitiram concluir que esta técnica eliminava uma percentagem significativa do
composto, e que caso este estivesse presente em pequena quantidade nos vinhos impedir a sua
determinação.
3.2 Análise por cromatografia líquida de alta eficiência / detecção por fluorescência
No caso da HPLC-FLD os padrões de CE analisados nas condições descritas em 2.5.2 apresentaram
inicialmente na média de 100 determinações um tempo de retenção de 22,24 minutos (Figura 25):
Figura 25 - Comparação de cromatograma de ensaio em branco e padrão de CE a 100 ppb obtidos por HPLC-FLD
O DPR % obtido para o tempo de retenção dos padrões para a construção da curva de calibração foi
de 1,16 % (Apêndice 8 – Secção 1). Nos ensaios em branco efectuados, utilizando 500ul de uma
solução de etanol a 20 % e seguindo os passos descritos em 2.4.4, alíneas c), d) e e), observou-se a
existência de alguns compostos que também apresentam fluorescência aos comprimentos de onda
seleccionados no detector. No entanto inicialmente nenhum destes compostos se sobrepôs ao pico
correspondente ao CE.
As determinações efectuadas com padrões na gama entre 10 e 200 ppb permitiram a construção da
seguinte curva de calibração, com determinações em triplicado para cada ponto:
y = 1179,4x + 4202,4
R2 = 0,9898
0
50.000
100.000
150.000
200.000
250.000
300.000
0 50 100 150 200
Concentração CE (ppb)
Áreas
Figura 26 - Curva de calibração padrões CE em determinações por HPLC-FLD
Carbamato de etilo
Outros compostos fluorescentes
Branco Padrão
41
Foi também estudada a linearidade do método utilizando a mesma metodologia descrita para as
análises realizadas com GC/MS (Tabela 16 / Apêndice 8 – Secção 2).
Tabela 16 - Estudo da linearidade das respostas de padrões de CE
Intervalo de lineariedade (ppb) N R2 CVm PG F(1;N-3) 95%
1-200 24 0,989 9,39 % 0,019 4,32
Através da análise da Figura 26 e da Tabela 16 foi possível verificar que a função de calibração para o
método foi linear no intervalo de concentrações estudado, ou seja, R2> 0,99 e PG<F. Utilizando o
desvio padrão residual (Sx/y) e o declive (m) da curva de calibração foram estimados os limites de
detecção e de quantificação do método (Tabela 17), utilizando as fórmulas anteriormente indicadas.
Tabela 17 – Estimativa dos limites de detecção e quantificação em HPLC-FLD LD (ppb) para diferentes níveis de confiança
92,1 % 98,2 % LQ (ppb)
12,44 18,67 62,22
Os valores estimados para o LD e LQ são superiores aos indicados pelos autores do método original
(4,2 e 14 ppb, respectivamente - Tabela 5), mas aproximam-se dos valores determinados mais
recentemente por outros autores [77]. Ter-se-á que ter ainda em conta ao analisar estes valores o
facto da amostras de vinho sofrerem uma diluição de 1:8 antes de serem analisadas. Desta forma a
utilização deste método não permitira a avaliação do cumprimento dos limites legais presentemente
em vigor (30 ppb).
Observou-se ainda, à medida que se procederam a várias séries de ensaios em dias diferentes, um
aumento das pressões de funcionamento, que rapidamente levou a que fossem ultrapassados os
limites máximos de pressão previstos para a bomba do equipamento. Este facto verificou-se com 2
colunas cromatográficas, uma delas estreada para a realização deste trabalho e outra afecta a outro
projecto e também utilizada para estas determinações. Nas últimas séries determinações efectuadas
a paragem do funcionamento do equipamento verificava-se após terem decorrido cerca 10 minutos do
programa de 58 minutos o que não permitia a eluição do pico de CE.
Da análise dos tempos de retenção do CE obtidos com as várias séries de padrões e de amostras,
verificou-se também que estes apresentavam uma variação, com tendência a aumentar, à medida
que aumentava o número de determinações efectuado (Figura 27). Esta variação coincidia na maior
parte dos casos nos momentos em que eram preparadas novas soluções de eluentes.
42
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
30,00
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
Nº da determinação
tR
Figura 27- Variação dos tempos de retenção do pico de CE nas determinações efectuadas por HPLC-FLD
Outro factor que poderá também ter influenciado os resultados obtidos prende-se com o
comportamento das amostras após a reacção de derivatização. No momento da injecção observava-se
que as amostras injectadas se apresentavam límpidas. No entanto após cerca de 60 a 120 minutos
após a reacção de derivatização, observou-se que as amostras começavam a apresentar alguma
turvação. Observou-se também o aparecimento de alguns cristais nos vials contendo os padrões
ensaiados. Estas observações poderão indicar que uma hipótese possível para as dificuldades sentidas
possa ser uma reacção de precipitação ocorrida dentro da coluna cromatográfica, o que poderia
explicar, pelo menos parcialmente, os factos reportados.
3.3 Amostras em que foi detectado CE
Como anteriormente referido, na maioria das determinações efectuadas com amostras, observou-se
um pico de massa 74 sobreposto ao tempo de retenção do CE (Figura 16). Contudo, utilizando a SPE
foi possível detectar a possível presença de CE em duas amostras, nomeadamente as amostras B e C
(Figuras 28 e 29). Utilizando a técnica QuEChERS, foi também possível detectar uma possível
presença de CE na amostra D (Figura 30). Os cromatogramas apresentados neste capítulo
correspondem a análises efectuados em modo SIM nas quais foram seleccionadas as 3 massas mais
importantes para a identificação do CE. Cada uma destas massas é apresentada com uma cor
diferente nas figuras. Foi também aplicado um factor de ampliação de 100 nos cromatogramas para
melhor visualização dos respectivos picos. Nestas amostras, o pico de interferência de massa 74
observou-se depois do tempo de retenção do CE. Relativamente a estas amostras não foram
identificadas características que as distinguissem claramente dos restantes vinhos ensaiados que
pudessem ter contribuído para este facto. No caso das amostras submetidas a pré-tratamento por SPE
foi efectuada uma confirmação da presença de CE pela sobrecarga com padrão a 2 e 4 ppb no caso da
amostra B, com sobrecarga a 1 e 5 ppb no caso da amostra C (Figura 30). No caso da amostra
utilizando a técnica QuEChERS não efectuada esta confirmação.
Variações dos tempos de retenção coincidentes com a preparação de novos eluentes
43
Figura 28 - Cromatograma de amostra B com pré-tratamento por SPE. Análise em modo SIM. Legenda: a) massa 62 b) massa 74 c) massa 89
No caso da amostra B (Figura 28) apenas foi detectada a massa 62, não sendo possível o cálculo de
razões de massas. No entanto o tempo de retenção obtido foi coincidente com os tempos obtidos na
análise de padrões de CE. Efectuando a leitura da intensidade desta massa na curva de calibração
anteriormente calculada, a intensidade desta massa aponta para uma concentração de CE abaixo de 1
ppb.
Figura 29 - Cromatograma de amostra C com pré-tratamento por SPE. Análise em modo SIM.
Legenda: a) massa 62 b) massa 74 c) massa 89
No caso da amostra C (Figura 29), uma vez a intensidade do sinal detectado ter sido superior, já foi
possível efectuar o cálculo de relações entre as intensidades das massas 62 e 74. Neste caso, à
semelhança da amostra B, também não foi detectado qualquer sinal para a massa 89. A relação de
massas obtida no quociente da intensidades 62 e 74 foi de 5,70 o que representa um valor com uma
Possível pico de CE
Possível pico de CE
Pico de interferência de massa 74
Pico de interferência de massa 74
44
variação inferior a 20 % ao valor da relação obtido para os padrões de CE, o que permite o
cumprimento do critério de aceitação estabelecido no método oficial de análise do composto. O teor
de CE estimado para esta amostra foi de 8,90 ppb.
Figura 30 – Cromatograma de amostra D com pré-tratamento por QuEChERS. Análise em modo SIM. Legenda: a) massa 62 b) massa 74 c) massa 89
Relativamente à amostra D (Figura 30), à semelhança da amostra B apenas foi detectada uma
resposta para a massa 62. Tendo em conta a percentagem de recuperação estimada para o método
(61 %), calculou-se um teor de CE na ordem dos 3,72 ppb.
Sobrecarga de amostra B com padrão de CE
Legenda: 2 ppb 4 ppb
Sobrecarga de amostra C com padrão de CE Legenda: 1 ppb 5 ppb
Figura 31 – Cromatogramas das amostras B e C com sobrecarga com padrão de CE. Análise em modo SIM
No caso das amostras B e C foi possível efectuar uma análise de possíveis causas para a presença do
CE, uma vez que se dispunham dos dados relativos aos processos de viticultura aplicados, bem como
do processo de vinificação utilizado [124,125].
Possível pico de CE
Pico de interferência de massa 74
Pico de CE e das sobrecargas
Pico de CE e das sobrecargas
45
Relativamente à amostra B as vinhas nas quais foram produzidas as uvas utilizadas para os vinhos em
questão não foram alvo de fertilização azotada [124].
Também não foram utilizadas culturas para cobertura dos terrenos que pudessem contribuir
significativamente para o aumento do azoto disponível do solo. A incorporação de matéria orgânica
no solo foi mínima.
Os dados relativos aos mostos utilizados para a produção da amostra em questão evidenciam que os
teores de azoto disponível no arranque da fermentação contabilizando o azoto suplementar contido
nos nutrientes para leveduras adicionados ao sumo de uva, são em vários anos sucessivos incluindo o
ano do vinho em questão inferiores a 200-250 mg/L no arranque da fermentação, o que representa
um valor cerca de três vezes inferior quando comparado como os limites máximos recomendáveis de
azoto para que não ocorra a formação de CE, que se situam entre os 500-700 mg/L [52,62].
A levedura utilizada para a inoculação do sumo de uva também produz baixos teores de ureia, não
sendo particularmente exigente quanto à quantidade de azoto assimilável que necessita.
O processo de fermentação dos vinhos em causa decorreu sem incidentes de registo [124],
nomeadamente quanto a paragens de fermentação ou problemas relacionados com o sistema de
refrigeração. Esta etapa portanto terá tido uma contribuição mínima para a formação de CE.
No caso da amostra C também não foram efectuadas fertilizações com azoto nas vinhas de onde
provieram as uvas utilizadas para a produção do vinho em questão. Tratando-se de um vinho tinto, a
probabilidade, à priori, de se encontrar CE seria maior que para um vinho branco. Isto devido ao
facto das temperaturas normais de fermentação serem superiores, e pelo facto de existir uma maior
quantidade de substratos azotados no meio passíveis de serem hidrolisados a ureia, e reagirem com o
etanol presente no meio (a fermentação é feita sem esgotamento das massas).
No caso deste vinho os dados fornecidos não pareciam indicar que existisse um excesso de azoto
disponível no arranque da fermentação uma vez que apenas foram adicionados substratos com uma
concentração da ordem dos 14 mg/L [125], o que adicionado aos teores naturalmente presentes no
vinho provavelmente levaram a que não fossem excedidos os teores máximos recomendados já
anteriormente indicados (500-700 mg/L).
A levedura utilizada também não é particularmente exigente relativamente aos teores de azoto
assimilável necessário.
Também segundo os dados disponíveis [125], as temperaturas de fermentação registadas foram as
normalmente esperadas para este tipo de processo, não tendo sido registados picos de temperatura.
Um outro factor contributivo no caso deste vinho, poderá ter sido o facto da FML ter sido feita de
uma forma espontânea, sem selecção das estirpes de bactérias, o que não permitiu ao produtor
46
controlar a contribuição desta etapa para os teores finais de CE encontrados, através, por exemplo da
utilização de estirpes que não metabolizassem a arginina.
Também é também importante referir que o vinho em causa foi sujeito a estágio em barricas durante
12 meses [125]. Apesar de não existir uma posição consensual quanto à importância desta etapa na
formação de CE [53,122] não deixa de ser importante de referir a realização desta etapa, uma vez
que se verifica com o tempo uma lise celular, com a libertação de precursores de CE para o vinho.
Por último o facto do vinho em causa ser mais antigo poderá também explicar em parte os valores
mais elevados de CE encontrados nesta amostra, uma vez quer os teores de CE encontrados tendem a
ser mais elevados à medida que os vinhos envelhecem.
No entanto só poderia ser feita uma comparação definitiva entre ambas as amostras caso estas
tivessem sido mantidas nas mesmas condições de armazenamento.
47
4. Conclusões
Os vinhos e os mostos são matrizes complexas na sua constituição. Para ser possível efectuar a análise
do CE nestes produtos são necessários elaborados processos de pré-tratamento e/ou limpeza das
amostras. Mesmo após a aplicação destes processos é possível que sejam detectados compostos
interferentes. Muitos dos trabalhos mais recentes sobre a presença do CE em vinhos têm sido dirigidos
para o aperfeiçoamento de formas de pré-tratamento que permitam o pré-tratamento das amostras
de uma forma mais rápida (SPME) ou que eliminem os problemas causados pela presença de
interferentes (HPLC-FLD) uma vez que a implementação do método oficial é de difícil concretização
[93,107,116].
De forma a tentar ultrapassar os problemas causados pela presença de interferentes já acima
reportados, poder-se-iam tentar utilizar outras técnicas de pré-tratamento das amostras,
nomeadamente a extracção líquido-líquido frequentemente mencionada na literatura consultada
(Tabela 4). Esta técnica acarreta no entanto um impacto significativo, quer do ponto de vista
económico, quer do ponto de vista ambiental, pelas elevadas quantidades de solventes utilizadas.
Também pelo facto da sua utilização implicar elevados tempos para o pré-tratamento das amostras, a
sua implementação como técnica de rotina será de pouco interesse.
Não obstante ter sido possível efectuar uma estimativa dos valores de CE em algumas amostras, e ter
sido possível efectuar uma análise retrospectiva no caso de 2 amostras de alguns factores que
poderiam ter contribuído para os teores de CE, os resultados obtidos com este trabalho não foram
totalmente atingidos, principalmente pelas interferências detectadas nos cromatogramas obtidos
pela GC/MS e por outro lado pelas dificuldades sentidas na implementação do método de HPLC-FLD.
Em todas as amostras em que foi detectada a presença de CE, os valores estimados foram sempre
pelo menos aproximadamente 3 a 4 vezes inferiores aos limites legais presentemente existentes no
E.U.A. (limites voluntários) e no Canadá (limites obrigatórios). Os resultados obtidos são concordantes
com os valores encontrados na literatura para vinhos de mesa Portugueses, que são na ordem dos
3,2 ppb - Tabela 3 [80].
Alguns autores referem que a utilização da GC/MS/MS poderá resolver parte dos problemas causados
pela presença de interferentes [91,110]. No entanto a utilização desta técnica não poderá garantir a
resolução dos problemas encontrados.
Da pesquisa efectuada na literatura não foi encontrada nenhuma referência à aplicação do método
QuEChERS para a pesquisa de CE em vinhos. Este método comparativamente aos restantes métodos
ensaiados permitiu nas amostras ensaiadas, uma boa limpeza na zona de interesse para a pesquisa do
CE em vinhos, tendo sido possível detectar a presença de CE numa amostra, com uma concentração
estimada de 3,72 ppb. No entanto, as percentagens de recuperação obtidas encontraram-se abaixo
48
do exigido pelo Método Oficial. O método QuEChERS poderá ser estudado em maior profundidade de
forma a sejam obtidas taxas de recuperação do composto mais elevadas. Considera-se que poderá ser
interessante a realização de estudos adicionais utilizando este método.
Caso venha a ser estabelecido na Europa um limite legal para o CE, a aplicação de métodos de
despistagem que permitam um tempo de análise reduzido será importante quer nos laboratórios
envolvidos em actividades de controlo da qualidade, quer nos de controlo oficial.
49
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62
6. Apêndices
Apêndice 1 - Equação para a formação do CE considerando o etanol, a ureia, a arginina e a citrulina. [66]:
))(1(
(][][
)1(][][
][][32
322
332
01
10
kk
tkkektk
kk
kEtOHCtkek
kEtOHUCECE
cuot
+
+−−++
+−−= +
Caso se assuma uma única temperatura e um único intervalo de tempo a equação poder ser simplificada em:
)][082,0][264,0]([][][ 000 CUEtOHCECE t += +
Legenda:
[CE]t Concentração de CE a um tempo t k1 Constante de degradação da ureia medida
a partir da projecção do ln[U] vs t
[CE]0 Concentração de CE a um tempo 0 k2 Constante de degradação para a citrulina
[U]0 Concentração de ureia a um tempo 0 k3 Constante de resíntese para a citrulina
[C]0 Concentração de citrulina a um tempo 0 Kc Constante de formação observada de CE a
patrir da citrulina
[EtOH] Concentração de etanol
A utilização destas equações (para as quais é necessário determinar, para além dos teores de CE, os teores de
ureia e citrulina presentes nos vinhos) poderá constituir uma ferramenta que auxiliará os produtores a
classificarem os seus vinhos, relativamente ao risco destes ultrapassarem, em algum momento no futuro, os
limites legais estabelecidos para o CE.
Apêndice 2 – Tabela com espectro de massa de padrão de CE a 1000 ppb e comparação do espectro
obtido com biblioteca de massas. Média de determinações em triplicado.
Massa Intensidade relativa 30 69,67 31 474,67 32 21,67 39 21,00 41 7,33 42 46,33 43 178,67 44 1000,00 45 709,00 46 110,67 56 2,67 61 70,00 62 771,00 63 8,67 71 8,67 74 133,67 89 10,67
63
Apêndice 3 - Comparação dos espectros de massa obtidos pela análise de diversas amostras com os espectros de massas das bibliotecas do GC/MS.
As figuras assinaladas com a) representam os espectros obtidos com as amostras e as figuras assinaladas com b) representam os espectros de massas das bibliotecas de massas do GC/MS para os quais foi obtido o maior índice de semelhança
Secção 1 - Acetato de isoamilo detectado na amostra A4
Secção 2 - Espectro de massa do hexenal detectado na amostra F
Secção 3 - Espectro de massa do hexanol detectado na amostra A3
a)
b)
a)
a)
a)
b)
b)
b)
64
Secção 4 - Espectro de massa do octanol detectado na amostra A3
Secção 5 - Espectro de massa do ácido butanodioico detectado nas amostras de vinho
Secção 6 – Espectro de massa do 3-(Metiltio) propan-1-ol detectado nas amostras de vinho
Secção 7 - Espectro de massa do decenoato de etilo detectado nas amostras de vinho
a)
a)
b)
b)
a)
b)
a)
b)
65
Apêndice 4 – Cromatograma e comparação do espectro de massa de padrão de α-terpineol (a) com espectro da biblioteca de massas do GC/MS (b) em modo SCAN.
Apêndice 5 – GC/MS
Secção 1 - Áreas obtidas com a injecção directa de 0,5 µL de padrões de CE com concentrações entre os 1 e 50 ppb. Determinações em triplicado.
Legenda: n.d. – não detectado
Secção 2 - Forma de cálculo da relação S/N utilizando o método peak to peak
1 - Na opção de exportação de dados foi seleccionada a de saída de dados do cromatograma por massa;
2 - Os valores numéricos obtidos foram transferidos para uma folha de cálculo do programa Excel;
3 - Através das funções Máximo e Mínimo foram obtidos os valores numéricos das alturas para:
- O ruído de fundo, considerando o intervalo de tempo entre os 22,0 e os 23,0 minutos (600 valores);
- Os valores dos sinais obtidos para os picos de padrões de CE na zona compreendida entre os 23 e os 24
minutos;
Concentracção CE (ppb)
Área massa 62 Áreas massa 74 Áreas massa 89
1 1278 153 n.d. 1 1512 302 n.d. 1 1254 238 n.d. 5 1995 327 n.d. 5 2000 380 n.d. 5 3077 417 102 10 5475 967 32 10 4791 685 103 10 5657 1040 99 25 12780 2266 224 25 12659 1939 279 25 12395 2009 236 50 23674 4612 280 50 24276 4189 659 50 22698 4449 243
α-terpineol
a)
b)
66
4 - Efectuada a diferença numérica entre os máximos e mínimos obtidos para o sinal e para o ruído, foi calculada
a relação S/N. Para cada concentração considerou-se a média calculada em 3 determinações.
Secção 3 - Forma de cálculo da relação S/N utilizando o método peak to peak com segmentação de intervalo
1,2 – Idênticos à Secção 2
3 - Através das funções Máximo e Mínimo foram obtidos os valores numéricos das alturas para:
- O ruído de fundo, considerando o intervalo de tempo entre os 22,0 e os 23,0 minutos e 5 segmentos para
este intervalo (40 medições por segmento)
- Os valores dos sinais obtidos para os picos de padrões de CE na zona compreendida entre os 23 e os 24 minutos;
4 - Foi efectuada uma média dos 5 valores calculados para o ruído e foi calculada a relação S/N. Para cada
concentração considerou-se a média calculada em 3 determinações.
Secção 4 – Relações das intensidades das massas obtidas para padrões de CE com concentrações na gama de 1 a 50 ppb e diferença percentual face às relações obtidas para padrões a 1000 ppb. Média de triplicados para cada
concentração Concentração de padrão
CE (ppb) Relação 62/74
Diferença percentual face a padrão de CE a 1000 ppb
Relação 62/89 Diferença percentual face a padrão de CE a 1000 ppb
1 6,20 7,62 % n.c. n.c. 5 6,25 8,28 % 30,17 58,26 % 10 6,02 4,41 % 91,58 26,72 % 25 6,11 5,94 % 51,65 28,53 % 50 5,34 7,39 % 71,60 0,93 %
Legenda: n.c. – não calculado porque não foram obtidas respostas para a massa 89 para esta concentração de padrão
Secção 5 – Estudo da linearidade das respostas obtidas com padrões de CE na gama de 1 a 50 ppb
1 - Utilizando o programa Excel foi efectuado o tratamento estatístico dos resultados obtidos para cada uma das massas:
Massa 62 SUMÁRIO DOS RESULTADOS Estatística de regressão R múltiplo 0,997822796
Quadrado de R 0,995650332 Quadrado de R ajustado 0,995315742
Erro-padrão 585,8149692 Observações 15
ANOVA gl SQ MQ F F de significância
Regressão 1 1021209790 1021209790 2975,73354 9,71426E-17 Residual 13 4461329,316 343179,1782 Total 14 1025671119
Coeficientes Erro-padrão Stat t valor P 95% inferior 95% superior Ordenada na origem 626,2990971 215,9584524 2,900090689 0,01240576 159,7492262 1092,848968
Declive 462,0018811 8,469284542 54,55028448 9,7143E-17 443,7051043 480,2986579
Massa 74 SUMÁRIO DOS RESULTADOS Estatística de regressão R múltiplo 0,995126095
Quadrado de R 0,990275946 Quadrado de R ajustado 0,989527942
Erro-padrão 164,8056495 Observações 15
ANOVA gl SQ MQ F F de significância
Regressão 1 35958072,67 35958072,67 1323,891 1,81748E-14 Residual 13 353091,7273 27160,9021 Total 14 36311164,4
Coeficientes Erro-padrão Stat t valor P 95% inferior 95% superior Ordenada na origem 20,3858373 60,75497364 0,335541867 0,74257 -110,8673032 151,639
Declive 86,69308586 2,382639592 36,38531238 1,82E-14 81,54570598 91,84047
67
Massa 89 SUMÁRIO DOS RESULTADOS Estatística de regressão R múltiplo 0,760711888
Quadrado de R 0,578682576 Quadrado de R ajustado 0,526017899
Erro-padrão 120,9721262 Observações 10
ANOVA gl SQ MQ F F de significância
Regressão 1 160802,0575 160802,0575 10,98806 0,010622 Residual 8 117074,0425 14634,25531 Total 9 277876,1
Coeficientes Erro-padrão Stat t valor P 95% inferior 95% superior Ordenada na origem 33,41496599 69,4860326 0,480887521 0,643473 -126,82 193,65
Declive 7,395578231 2,231062048 3,314824094 0,010622 2,25074 12,54042
2 – Foram calculados o desvio padrão (Sm) e o coeficiente de determinação (CVm) para as massas 62 e 74. Uma
vez que não foi obtida uma resposta linear para a massa 89 (R=0,76) não foram efectuados os restantes cálculos
para esta massa.
b
SS xym
/= xm
m
SCV =
xyS / - desvio padrão residual da curva de calibração
b - declive da curva de calibração
x - média dos valores Para cada uma das massas os valores calculados foram respectivamente de:
Sm (62) = 1,27 CVm (62)= 6,97 %
Sm (74) = 1,90 CVm (74)= 10,45%
3 – Como complemento ao estudo da linearidade foi efectuada a análise de resíduos normalizados em Excel:
-2
-1,5
-1
-0,5
0
0,5
1
1,5
2
0 10 20 30 40 50
ppb
Resíduos
-2
-1,5
-1
-0,5
0
0,5
1
1,5
2
0 10 20 30 40 50 60
ppb
Resíduos
Figura A – Análise de resíduos para a massa 62 Figura B – Análise de resíduos para a massa 74 Para ambas as massas foram obtidos valores inferiores a 2 dp. Os valores dos resíduos apresentados nas figuras A
e B aparentam distribuir-se aleatoriamente em torno dos valores de x o que indica a linearidade das respostas
para as duas massas.
4 – De forma a complementar estes resultados foi realizado o teste de Fisher/Snedecor. Para cada uma das
massas foi definida a equação polinomial de 2º grau em Excel, efectuando-se de seguida o ajuste linear e
polinomial para os valores de y:
68
y = -0,685x2 + 497,47x + 426,11R2 = 0,996
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
0 10 20 30 40 50 60
ppb
Área
y = 0,3082x2 + 70,733x + 110,46R2 = 0,9923
0
1000
2000
3000
4000
5000
0 10 20 30 40 50 60
ppb
Área
Figura C - Curva e equação polinomial de 2º grau para a
massa 62
Figura D Curva e equação polinomial de 2º grau para a massa
74
Para o ajuste linear calculou-se em Excel o desvio padrão residual da curva de calibração linear ( xyS / ) e desvio
padrão residual da curva de calibração não linear ( 2yS ) da seguinte forma:
2
)(1
2
/ −
−=∑
=
N
yyS
N
iii
xy 3
)(1
22
2
−
−=∑
=
N
yyS
N
iii
y
N - número de padrões de calibração
iy - sinal obtido para um padrão de determinada concentração
iy - estimativa do sinal pela função de calibração linear para um padrão da mesma concentração
2iy - estimativa do sinal pela função de calibração polinomial do segundo grau para um padrão da mesma
concentração
Massa 62 Massa 74 Ajuste linear Ajuste polinomial
Ajuste linear Ajuste polinomial
ppb iy
2)( ii yy − 2iy
22 )( ii yy − ppb
iy 2)( ii yy − 2iy
22 )( ii yy −
1088,30 35986,09 922,90 126099,56 107,08 2108,74 181,50 812,32 1088,30 179521,69 922,90 347044,70 107,08 37994,20 181,50 14519,96 1 1088,30 27456,49 922,90 109630,52
1 107,08 17140,31 181,50 3192,11
2936,30 886045,69 2896,34 812404,78 453,85 16091,18 471,83 20975,73 2936,30 876657,69 2896,34 803416,43 453,85 5453,97 471,83 8432,75 5 2936,30 19796,49 2896,34 32639,84
5 453,85 1358,00 471,83 3006,33
5246,30 52303,69 5332,31 20360,44 887,32 6349,54 848,61 14016,19 5246,30 207298,09 5332,31 293016,52 887,32 40931,76 848,61 26768,23 10 5246,30 168674,49 5332,31 105423,60
10 887,32 23312,40 848,61 36630,13
12176,30 364453,69 12434,74 119207,92 2187,71 6129,17 2071,41 37865,27 12176,30 232999,29 12434,74 50294,79 2187,71 61857,16 2071,41 17532,41 25 12176,30 47829,69 12434,74 1578,87
25 2187,71 31937,62 2071,41 3895,01
23726,30 2735,29 23587,11 7549,87 4355,04 66030,50 4417,61 37787,47 23726,30 302170,09 23587,11 474569,43 4355,04 27567,95 4417,61 52262,53 50 23726,30 1057400,89 23587,11 790516,59
50 4355,04 8829,23 4417,61 985,33
Soma 4461329 Soma 4093754 Soma 353091,7273 Soma 278681,8 N-2 13 N-3 12 N-2 13 N-2 12 Sy/x 585,81 Sy2 584,08 Sy/x 164,806 Sy2 152,392
(Sy/x)2 343173,36 (Sy2)2 341145,94 (Sy/x)2 27161,02 (Sy2)2 23223,3
Com estes valores foi calculada a diferença de variâncias pela seguinte equação:
22
2/
2 *)3(*)2( yxy SNSNDS −−−=
Para a massa 62 o valor de DS calculado foi de 367502 e para a massa 74 o valor calculado foi de 74413,37. A
partir destes valores foi calculado o valor teste PG pela equação:
22
2
yS
DSPG =
69
Os valores obtidos, 1,08 para a massa 62 e 3,20 para a massa 74 foram comparados com o valor tabelado da
distribuição F de Fisher/Snedecor de acordo com o respectivo número de graus de liberdade, neste caso F(1;N-
3;0,95)=4,75. Como para ambas as massas PG<F a função de calibração polinomial não permite um melhor
ajustamento significativamente melhor. Conclui-se que a função de calibração é linear.
Apêndice 6 – Utilização do isoctano como padrão interno.
Secção 1 – Espectro de massa do isoctano. Média de determinações em triplicado em modo SCAN.
Fragmento Intensidade
relativa Fragmento
Intensidade
relativa Fragmento
Intensidade
relativa Fragmento
Intensidade
relativa
30,00 6 44,00 2 56,00 72 70,00 1
31,00 76 45,00 2 57,00 384 71,00 7
39,00 31 49,05 19 58,00 52 73,00 2
40,00 7 50,00 2 59,00 1000 79,00 1
41,00 139 51,00 1 60,00 37 83,00 2
42,00 6 53,00 7 61,00 1 97,00 10
43,00 71 55,00 36 69,00 5 115,00 40
116,00 1
Secção 2 - Comparação do espectro de massa do isoctano (a) com espectro da biblioteca de massas do GC/MS (b)
Secção 3 – Repetibilidade obtida em 2 dias pela análise de padrões de CE adicionados de isoctano a 10 %. Determinações em modo SIM.
Concentração de CE (ppb)
Áreas massa 62 (CE)
Área massa 59 (isoctano)
5188 234093 7545 279878 7066 276768 6040 289781 8111 318487 9171 260744 6293 272612 5054 181688 7127 241078
10
6327
Isoctano a 10%
256354 22791 470686 27268 401535 23559 442710 35747 474396 34108 517361 36037 533444 36057 462404 36700 455615 33009 559216
50
30688
Isoctano a 10%
441203
a)
b)
70
Apêndice 7 - SPME. Secção 1 - Influência da saturação com sais nas áreas obtidas na análise de padrões de CE a 60 ppb em modo SIM.
Condições
Áreas massa 62
Médias
Diferença percentual entre os valores
20756 Sem adição de sais
22606 21681 8,91 %
61138 Adição de NaCl
53490 57314 14,30 %
45066 Na2SO4 64202
54634 42,46 %
Secção 2 - Influência da utilização de diferentes tempos de pré-tratamento nas áreas obtidas em padrões de CE a
60 ppb saturados com NaCl em modo SIM.
Tempo da exposição da fibra Áreas das massas 62, 74 e 89 Diferença percentual entre
os valores 11972
5min 9036
32,50 %
46004 10min
53246 15,74 %
58831 20min
58992 0,27 %
105342 30min
116030 10,15 %
116646 40min
122716 9,49 %
Apêndice 8 – HPLC-FLD. Secção 1 - Áreas obtidas padrões de CE por HPLC-FLD com concentrações entre os 10 e 200 ppb. Determinações em triplicado.
Concentração de CE (ppb) Áreas
Concentração de CE (ppb) Áreas
10 17185 60 78144 10 13627 60 73456 10 11136 60 79900 15 21842 80 103028 15 18909 80 92469 15 22439 80 89882 25 39831 100 122324 25 30131 100 116011 25 36251 100 130844 40 57929 200 231018 40 49188 200 226599 40 51661 200 262311
Secção 2 - Estudo da linearidade da HPLC-FLD através respostas obtidas com padrões de CE na gama de 10 a 200 ppb
1 - Utilizando o programa Excel foi efectuado o tratamento estatístico dos resultados obtidos : Massa 62
SUMÁRIO DOS RESULTADOS Estatística de regressão
R múltiplo 0,994865 Quadrado de R 0,989756
Quadrado de R ajustado 0,989291 Erro-padrão 7339,2 Observações 24
ANOVA gl SQ MQ F F de significância
Regressão 1 1,14E+11 1,14E+11 2125,671 2,2E-23 Residual 22 1,19E+09 53863851 Total 23 1,16E+11
Coeficientes Erro-padrão Stat t valor P 95% inferior 95% superior Ordenada na origem 4202,381 2261,958 1,857851 0,076625 -488,632 8893,394
Declive 1179,407 25,5809 46,105 2,2E-23 1126,356 1232,459
71
2 – Foram calculados o desvio padrão (Sm) e o coeficiente de determinação (CVm)apresentando valores de
respectivamente 6,22 e 9,39 %.
3 – Como complemento ao estudo da linearidade foi efectuada a análise de resíduos normalizados em Excel:
-3,5
-2,5
-1,5
-0,5
0,5
1,5
2,5
3,5
0 50 100 150 200
ppb
Resíduos
Figura A – Análise de resíduos para HPLC-FLD
Excepto para um dos valores foram sempre obtidos valores inferiores a 2 dp. Os valores dos resíduos
apresentados aparentam distribuir-se aleatoriamente em torno dos valores de x o que indica a linearidade das
respostas obtidas
4 – De forma a complementar estes resultados foi realizado o teste de Fisher/Snedecor. sendo definida a
equação polinomial de 2º grau em Excel, efectuando-se de seguida o ajuste linear e polinomial para os valores de
y:
Massa 62 Ajuste linear Ajuste polinomial
ppb iy
2)( ii yy − 2iy
22 )( ii yy −
15996,40 1412769,96 15754,30 2046902,49 15996,40 5614056,36 15754,30 4525405,29 10 15996,40 23623488,16 15754,30 21328694,89 21893,40 2641,96 21707,55 18076,80 21893,40 8906643,36 21707,55 7831882,10 15 21893,40 297679,36 21707,55 535019,10 33687,40 37743820,96 33604,75 38766189,06 33687,40 12647980,96 33604,75 12066939,06 25 33687,40 6572044,96 33604,75 7002639,06 51378,40 42910360,36 51427,30 42272102,89 51378,40 4797852,16 51427,30 5014464,49 40 51378,40 79862,76 51427,30 54615,69 74966,40 10097141,76 75147,30 8980210,89 74966,40 2281308,16 75147,30 2860495,69 60 74966,40 24340408,96 75147,30 22588157,29 98554,40 20013096,96 98817,70 17726626,09 98554,40 37032093,16 98817,70 40305991,69
80
98554,40 75210521,76 98817,70 79846734,49 122142,40 32978,56 122438,50 13110,25 122142,40 37594065,96 122438,50 41312756,25
100
122142,40 75717842,56 122438,50 70652430,25 240082,40 82163347,36 239798,50 77097180,25 240082,40 181802075,56 239798,50 174226800,25
200
240082,40 494110657,96 239798,50 506812656,25
Soma 1185004740,04 Soma 1183886080,58 N-2 22 N-3 21
Sy/x 7339,20 Sy2 7508,36 (Sy/x)2 53863856,64 (Sy2)2 537469,89
72
y = -0,062x2 + 1192,2x + 3838,5R2 = 0,9898
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
0 50 100 150 200
ppb
Áreas
Figura B - Curva e equação polinomial de 2º grau
Com estes valores foi calculada diferença das variâncias, tendo-se obtido um valor DS2=1118620,12 e um valor
PG=0,0198. Comparando este valor com o tabelado da distribuição F de Fisher/Snedecor de acordo com o
respectivo número de graus de liberdade, neste caso F(1;N-3;0,95)=4,32.Como PG<F a função de calibração
polinomial não permite um melhor ajustamento significativamente melhor. Conclui-se que a função de
calibração é linear.
