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Caria Sofia Rodrigues Leal
CARACTERIZACcedilAtildeO GENEacuteTICA DA RACcedilA BOVINA BARROSAtilde
Estudos de geneacutetica bioquiacutemica familiar e populacional
Dissertaccedilatildeo de Mestrado em Ecologia
Aplicada apresentada agrave Faculdade de Ciecircncias
da Universidade do Porto
Porto
1998
Agradecimentos
Quero aqui apresentar o meu agradecimento agrave ajuda prestada por certas pessoas sem a qual
natildeo era possiacutevel a realizaccedilatildeo do presente trabalho
Ao Prof Doutor Nuno Ferrand de Almeida agradeccedilo a oportunidade e o apoio constante que
demonstrou durante a realizaccedilatildeo deste trabalho as indicaccedilotildees que forneceu na estruturaccedilatildeo e
elaboraccedilatildeo do mesmo pela cedecircncia de bibliografia bem como as criacuteticas e sucessivas revisotildees do
manuscrito
Ao Prof Doutor Paulo Alexandrino quero agradecer o apoio na realizaccedilatildeo deste mesmo
trabalho assim como todas as indicaccedilotildees que forneceu para a sua realizaccedilatildeo praacutetica
Ao Prof Doutor Jorge Eiras pelas facilidades concedidas na utilizaccedilatildeo do laboratoacuterio de
Bioquiacutemica do Departamento de Zoologia e Antropologia e ao ICETA pelas facilidades concedidas na
utilizaccedilatildeo dos laboratoacuterios de Geneacutetica Animal
Agrave comissatildeo do Mestrado na figura da Prof Dra Leonor Fidalgo e ao respectivo corpo docente
os importantes conhecimentos transmitidos durante o ano curricular deste mestrado
Agrave AMIBA (Associaccedilatildeo do Minho dos Criadores de Bovinos de Raccedila Barrosatilde) principalmente
ao Sr Miguel Machado e Dr Joseacute Leite pelo apoio dado pela ajuda na recolha de amostras de sangue
e pelo simpaacutetico acolhimento que demonstraram na sua associaccedilatildeo estando sempre prontos a dispensar
os seus serviccedilos
Agrave DRAEDM (Direcccedilatildeo Regional de Agricultura de Entre Douro e Minho) em especial ao
Sr Engdeg Corte Real Santos (Estaccedilatildeo de Produccedilatildeo Animal da Zona Agraacuteria do Vale do Ave) agradeccedilo
todo o apoio e encorajamento que demonstrou
Quero tambeacutem agradecer a colaboraccedilatildeo e o tempo despendido nas vaacuterias saiacutedas de campo aos
funcionaacuterios do Livro Genealoacutegico (ao Sr Guilherme em especial) e aos funcionaacuterios das brigadas de
Sanidade Animal de Vieira do Minho e Poacutevoa de Lanhoso
A todos os colegas de mestrado e de laboratoacuterio pela amizade pelo apoio e pelo ambiente de
camaradagem existente entre todos em especial agrave Madalena Branco ao Joatildeo Alexandrino ao
Agostinho Antunes agrave Graccedila Lopes ao Filipe Castro e agrave Rita Campos
Agrave Junta Nacional de Investigaccedilatildeo Cientiacutefica e Tecnoloacutegica (JNICT) agradeccedilo a Bolsa de
Mestrado (PRAXIS XXIBM879996) que me foi concedida o que possibilitou a minha
disponibilidade para a realizaccedilatildeo da parte praacutetica de investigaccedilatildeo deste trabalho
Aos meus amigos em especial agrave Dra Graccedila Loureiro ao Dr Armando Loureiro e agrave Dra Filipa
Carvalho pela paciecircncia pelo apoio constante que revelaram ao longo deste trabalho e pelas suas
criacuteticas ao manuscrito
Agrave minha matildee e ao meu marido que tornaram possiacutevel este percurso que me conduziu ateacute aqui
A eles dedico todo este trabalho
INDICE
1 - INTRODUCcedilAtildeO 1 11 - A DOMESTICACcedilAtildeO 3
111- Evidecircncia histoacuterica da domesticaccedilatildeo do gado bovino 3
112- Paleontologia arqueozoologia 4
113- Anaacutelise geneacutetica 7
12 - A DIVERSIDADE DAS RACcedilAS BOVINAS 10
121-Asraccedilas ibeacutericas 10
122 - A raccedila Barrosatilde 11
Aspectos histoacutericos da dispersatildeo e evoluccedilatildeo do efectivo populacional 11
Aspectos morfoloacutegicos 15
Origem 15
2 - MATERIAL E MEacuteTODOS 17
21- AMOSTRAGEM E CONSERVACcedilAtildeO DAS AMOSTRAS 17
211-Amostragem 17
212 - Obtenccedilatildeo e conservaccedilatildeo das amostras de sangue 17
22- BATERIA DE MARCADORES GENEacuteTICOS SELECCIONADOS 18
23 - TRATAMENTO DAS AMOSTRAS 24
24 - MEacuteTODOS DE SEPARACcedilAtildeO 26
25 - MEacuteTODOS DE DETECCcedilAtildeO 34
26 - MEacuteTODOS DE CAacuteLCULO 38
3 - RESULTADOS E DISCUSSAtildeO 39
31- ANAacuteLISE DOS MEacuteTODOS DE SEPARACcedilAtildeO 39
32 - ANAacuteLISE FAMILIAR 51
33 - ANAacuteLISE POPULACIONAL LOCUS A LOCUS 54
34 - ANAacuteLISE POPULACIONAL CONJUNTA 72
341 - Diversidade geneacutetica na raccedila Barrosatilde 72
342 - Comparaccedilatildeo com outra raccedilas Ibeacutericas 74
343 - Diferenciaccedilatildeo geneacutetica 77
4 - CONDIDERACcedilOtildeES FINAIS 86
5 - CONCLUSOtildeES 88
6 - REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 90
ANEXO
Introduccedilatildeo
1 - INTRODUCcedilAtildeO
O crescente interesse demonstrado pelas raccedilas bovinas autoacutectones permitiu o
aparecimento nos uacuteltimos anos de uma conjuntura poliacutetica e econoacutemica claramente favoraacutevel
agrave sua conservaccedilatildeo Este interesse reflecte-se por exemplo na criaccedilatildeo de incentivos agrave produccedilatildeo
(ajudas comunitaacuterias e medidas agroambientais) ou no apelo ao consumo de produtos de
qualidade certificada Estas circunstacircncias implicam contudo a necessidade de uma maior
capacidade de produccedilatildeo que em sistemas agriacutecolas tecnicamente pouco desenvolvidos poderaacute
estar associada a programas de melhoramento geneacutetico e consequentemente a eventuais
perdas de diversidade geneacutetica (FAO 1994 LoFTUS et ai1994 FERNANDES 1996)
Em Portugal existe um nuacutemero consideraacutevel de raccedilas bovinas autoacutectones que se
encontram ainda pouco estudadas Na verdade a maior parte dos trabalhos sobre elas
realizados envolve anaacutelises fenotiacutepicas estando ainda por investigar a estrutura geneacutetica das
suas populaccedilotildees o seu grau de proximidade a sua origem e evoluccedilatildeo recente
No seio das raccedilas nacionais a raccedila Barrosatilde apresenta um conjunto de caracteriacutesticas
morfoloacutegicas muito peculiares que incluem um perfil cocircncavo da cabeccedila uma saliecircncia das
arcadas orbitarias e cornos em forma de lira alta Este conjunto de particularidades tem
suscitado opiniotildees controversas sobre a sua origem (GONCcedilALVES GARCIA 1964 GARCIA et ai 1981 LEAL 1995) Por outro lado eacute claramente uma raccedila emblemaacutetica da regiatildeo noroeste
de Portugal associada a uma agricultura de subsistecircncia e a um patrimoacutenio cultural que se
torna necessaacuterio conservar (GONCcedilALVES GARCIA 1964 GARCIA et ai 1981 LEAL 1995)
A sua aacuterea de distribuiccedilatildeo abrange apenas 17 concelhos pertencentes a 4 distritos Vila
Real Viana do Castelo Braga e Porto Actualmente a existecircncia de problemas de produccedilatildeo eacute
responsaacutevel pela progressiva diminuiccedilatildeo de alguns nuacutecleos populacionais apesar dos esforccedilos
de certas entidades para o evitar (MARTINS 1982 LEAL 1995)
i
Introduccedilatildeo
Em face do exposto torna-se necessaacuterio alargar a investigaccedilatildeo sobre esta raccedila bovina
nomeadamente atraveacutes da sua caracterizaccedilatildeo geneacutetica Espera-se assim poder contribuir para
o estabelecimento de um plano de conservaccedilatildeo da Barrosatilde e simultaneamente aprofundar o
estado actual do conhecimento sobre a geneacutetica das suas populaccedilotildees
2
Introduccedilatildeo
11 - A DOMESTICACcedilAtildeO
111 - Evidecircncia histoacuterica da domesticaccedilatildeo do gado bovino
Haacute cerca de 15000 anos verificavam-se profundas mudanccedilas climaacuteticas na Terra Os
glaciares recuaram para Norte a temperatura tornou-se mais amena uma maior aacuterea
geograacutefica tornou-se habitaacutevel O Homem teve entatildeo de vencer dificuldades impostas pela
Natureza inventando a agricultura e a criaccedilatildeo de gado passando de caccedilador noacutemada a
agricultor e a pastor (SARAIVA 1993)
O iniacutecio da agricultura e a primeira domesticaccedilatildeo de animais por parte do Homem estaacute
datada de 10000 anos aC (final do Paleoliacutetico) numa regiatildeo conhecida por Crescente Feacutertil
no Proacuteximo Oriente O primeiro animal domesticado teraacute sido o catildeo seguindo-se a ovelha a
cabra e o gado bovino jaacute no Neoliacutetico (8000 anos aC) (HEMMER 1990 CLUTTON-BROCK
1992)
A domesticaccedilatildeo do gado bovino foi provavelmente um processo gradual Eacute natural
que no princiacutepio apenas alguns animais (essencialmente fecircmeas) fossem retirados das manadas
de auroques selvagens e criados isoladamente natildeo levando de imediato ao aparecimento de
diferenccedilas morfoloacutegicas claras Esta hipoacutetese eacute apoiada por registos arqueozooloacutegicos onde a
forma proto-domesticada natildeo se distingue da forma selvagem (LOFTUS et ai 1994)
A expansatildeo neoliacutetica em direcccedilatildeo agrave Europa teraacute levado milhares de anos seguindo uma
via mariacutetima (mar Mediterracircneo) e uma via continental (atraveacutes dos Balcatildes e pelo curso do
Danuacutebio) Da Siciacutelia a revoluccedilatildeo neoliacutetica espalhou-se por toda a bacia mediterracircnea
ocidental atingindo a Peniacutensula Ibeacuterica e a costa atlacircntica e trazendo consigo a arte a
agricultura e a criaccedilatildeo de gado Desta forma soacute no 5 deg mileacutenio aC chegaram agrave Peniacutensula
Ibeacuterica as praacuteticas agriacutecolas e a pastoriacutecia (SARAIVA 1993)
Desde o Neoliacutetico que o gado bovino domesticado (Bos taurus) tem um papel muito
importante para o Homem As grandes civilizaccedilotildees da Antiguidade datildeo-nos testemunhos
escritos e trabalhos artiacutesticos indicando a sua importacircncia na alimentaccedilatildeo (carne leite) nos
trabalhos agriacutecolas na guerra na arquitectura e mesmo na religiatildeo
3
Introduccedilatildeo
Durante o periacuteodo compreendido entre o iniacutecio do Neoliacutetico ateacute agraves idades do Cobre e
do Bronze a domesticaccedilatildeo dos bovinos levou a uma contiacutenua diminuiccedilatildeo do tamanho corporal
dos animais na Europa Posteriormente este processo teraacute sido interrompido com a introduccedilatildeo
de gado bovino trazido de Roma e muitas raccedilas extinguiram-se apoacutes a queda do Impeacuterio
Romano (EPSTEIN amp MASON 1984)
Esta tendecircncia continuou a observar-se durante a Idade Meacutedia e soacute com a Revoluccedilatildeo
Industrial e a necessidade de abastecer as grandes cidades se produziu um incremento na
criaccedilatildeo de gado (EPSTEIN amp MASON 1984)
Neste domiacutenio a modernizaccedilatildeo da agricultura e a produccedilatildeo intensiva de alimentos teraacute
originado uma contiacutenua diminuiccedilatildeo dos efectivos populacionais de muitas raccedilas autoacutectones
evidente sobretudo durante a uacuteltima metade deste seacuteculo Estas circunstacircncias determinaram
assim a sensibilizaccedilatildeo da sociedade para as consequecircncias do empobrecimento de diversidade
geneacutetica do gado bovino permitindo o estabelecimento de linhas de investigaccedilatildeo destinadas agrave
sua gestatildeo e conservaccedilatildeo (BROWN et ai 1993 FAO 1996)
112 - Paleontologia arqueozoologia
De acordo com os actuais dados paleontoloacutegicos o mais antigo ruminante do Velho
Mundo teraacute aparecido no Mioceno (Gelocus) caracterizando-se pela ausecircncia de incisivos na
mandiacutebula superior e possuindo jaacute uma conformaccedilatildeo do esqueleto idecircntica agrave dos bovinos
actuais (IGLESIAS 1989 e GARCIA et ai 1992) Esta forma viria a originar posteriormente os
quatro geacuteneros actuais de ruminantes Ovis Capra Antilope e Bos (IGLESIAS 1989)
A evidecircncia paleontoloacutegica indica tambeacutem que teratildeo existido na Europa diferentes
espeacutecies de boviacutedeos actualmente extintas Destas apenas o auroque sobreviveu ateacute agrave Idade
Meacutedia havendo documentos escritos que se referem ao local e data da morte do uacuteltimo
exemplar (Poloacutenia 1627) (LOFTUS et ai 1994)
As primeiras representaccedilotildees de bovinos feitas pelo Homem devem precisamente
referir-se a auroques sendo um dos exemplos mais conhecidos constituiacutedo pelas pinturas
rupestres das grutas de Lascaux (Franccedila) (figura 111)
4
Introduccedilatildeo
Figura 111 Pintura rupestre nas paredes de grutas em Lascaux Franccedila Datando de haacute cerca de 15000 anos Reproduzido de FORBES (1986)
Soacute mais tarde surge a evidecircncia de que o processo de domesticaccedilatildeo se poderaacute ter
iniciado De facto alguns achados neoliacuteticos (8000 a 5500 anos aC) provenientes da
Anatoacutelia parecem indicar a presenccedila de animais jaacute domesticados Esta regiatildeo do Sudoeste
Asiaacutetico poderaacute assim constituir o centro de domesticaccedilatildeo do gado bovino a partir de
populaccedilotildees selvagens da subespeacutecie asiaacutetica do auroque (Bos primigenius namadicus)
(EPSTEIN amp MASON 1984)
Outra evidecircncia adicional eacute fornecida pela descoberta de ossos e dentes de um animal
sensivelmente mais pequeno do que o auroque (Iraque 5000 anos aC) bem como por um
primeiro testemunho escrito onde se descreve em placas de argila uma cabeccedila de vaca
(Mesopotacircmia 5000 anos aC) (ROGERSON 1991)
Muitos outros achados arqueoloacutegicos e paleontoloacutegicos foram encontrados na
Mesopotacircmia (4000 anos aC) e no vale do rio Nilo (4000 anos aC) mostrando um bovino
totalmente domesticado e de longos cornos (EPSTEIN amp MASON 1984)
A consolidaccedilatildeo do processo de domesticaccedilatildeo eacute a partir desta altura inquestionaacutevel
tornando-se abundantes os registos de bovinos domesticados na Mesopotacircmia e vale do Nilo
A este respeito devem referir-se especialmente as numerosas esculturas relevos pinturas e
textos em papiro que relatam pormenores da vida quotidiana do povo egiacutepcio e onde aparecem
diversas cenas que mostram a importacircncia do gado bovino na agricultura e na alimentaccedilatildeo
(figura 112)
5
Introduccedilatildeo
Figura 112 Desenho ilustrativo de uma ordenha 5a dinastia Reproduzido de BAINES
amp MEacuteLEK (1980)
A partir desta altura as descobertas arqueozooloacutegicas satildeo testemunho de uma
expansatildeo do gado bovino Assim existem registos datados de haacute cerca de 2000 e 3000 anos
aC que sugerem a ocorrecircncia no Norte de Aacutefrica de animais de enormes cornos em forma de
lira (EPSTEIN amp MASON 1984)
Tal expansatildeo daacute-se tambeacutem pela Turquia indo ateacute ao Caacuteucaso e agrave Ruacutessia e chega
tambeacutem agrave Europa onde nas regiotildees do Norte foram encontrados objectos de arte da idade do
Cobre e do Bronze que representam bovinos e datam do iniacutecio do Cristianismo (EPSTEIN amp
MASON 1984)
A migraccedilatildeo para oriente estaacute tambeacutem bem documentada atraveacutes de numerosos restos
arqueozooloacutegicos descobertos em toda a Aacutesia Eacute contudo nesta regiatildeo geograacutefica que se
pode observar a transiccedilatildeo de gado bovino sem bossa (Bos taurus) para outro com bossa (Bos
indicus) Segundo alguns autores as raccedilas de Bos indiens ou gado zebu derivariam das raccedilas
de Bos taurus ou gado taurino atraveacutes de um processo de selecccedilatildeo (EPSTEIN amp MASON
1984) Alternativamente estes dados podem tambeacutem ser interpretados como a ocorrecircncia de
dois processos de domesticaccedilatildeo independentes seguidos do contacto entre as duas populaccedilotildees
domeacutesticas de gado bovino
Adicionalmente deve salientar-se que a evidecircncia descrita eacute ainda muito incompleta
pelo que a interpretaccedilatildeo dos dados deve ser feita com bastante precauccedilatildeo A tiacutetulo de
exemplo refiram-se os achados arqueozooloacutegicos efectuados na Peniacutensula dos Balcatildes e na
6
Introduccedilatildeo
Macedoacutenia Grega (6200 anos aC) Segundo EPSTEIN amp MASON (1984) estes achados
sugerem que o Sul da Europa poderia constituir o primeiro centro de domesticaccedilatildeo do gado
bovino a partir de onde se teria iniciado a sua expansatildeo em direcccedilatildeo ao resto do continente
europeu Ruacutessia e Sudoeste Asiaacutetico
113 - Anaacutelise geneacutetica
A investigaccedilatildeo sobre a geneacutetica das diferentes raccedilas de gado bovino tem contribuiacutedo de
forma muito significativa para a compreensatildeo da sua histoacuteria dos padrotildees de diversidade que
actualmente as caracterizam e do seu grau de parentesco Os resultados actualmente
disponiacuteveis reportam-se a trecircs domiacutenios principais grupos sanguiacuteneos variaccedilatildeo geneacutetica de
proteiacutenas e polimorfismos do DNA (DNA mitocondrial e microssateacutelites)
Grupos sanguiacuteneos
A primeira tentativa para avaliar o grau de diferenciaccedilatildeo geneacutetica entre raccedilas bovinas e
caracterizar a sua diversidade data do iniacutecio de deacutecada de 70 e envolveu precisamente o
estudo dos diferentes grupos sanguiacuteneos que iam sendo descritos (RUSSELL 1996 USHA
1996) Contudo a maior parte dos resultados natildeo permitiu a obtenccedilatildeo de conclusotildees
definitivas pelo facto de se trabalhar com um nuacutemero relativamente reduzido de loci que
adicionalmente era pouco polimoacuterfico Deve poreacutem referir-se que se dispotildee actualmente de
uma consideraacutevel quantidade de informaccedilatildeo no que se refere agrave distribuiccedilatildeo da variabilidade dos
grupos sanguiacuteneos nas diferentes raccedilas bovinas conferindo a este conjunto de dados uma
importacircncia natildeo despreziacutevel no estudo de eventuais alteraccedilotildees da estrutura geneacutetica de
populaccedilotildees de gado bovino nos uacuteltimos vinte anos (RUSSELL 1996 USHA 1996)
Proteiacutenas
A introduccedilatildeo de teacutecnicas electroforeacuteticas de separaccedilatildeo de proteiacutenas permitiu aumentar
de forma muito consideraacutevel o nuacutemero de sistemas geneacuteticos polimoacuterficos conhecidos nas
raccedilas bovinas em especial no que se refere a proteiacutenas do sangue e do leite (USHA 1996)
A anaacutelise da sua distribuiccedilatildeo populacional veio demonstrar a ocorrecircncia de dois grupos
principais de bovinos ou duas subespeacutecies (Bos primigenius taurus e Bos primigenius
7
Introduccedilatildeo
indiens) cada um deles caracterizado pela presenccedila de diversos alelos privativos em vaacuterios loci
(BRAEND 1971)
Estes resultados estatildeo de uma maneira geral de acordo com dados morfoloacutegicos
histoacutericos e ainda com a distribuiccedilatildeo geograacutefica conhecida dos principais grupos (EPSTEIN amp
MASON 1984) No entanto o acreacutescimo de informaccedilatildeo fornecido por este tipo de marcadores
foi ainda insuficiente para resolver muitas das interpretaccedilotildees contraditoacuterias publicadas sobre o
tema
Polimorfismo do DNA
A introduccedilatildeo das teacutecnicas de anaacutelise genoacutemica directa e em especial a descoberta do
polimorfismo do DNA-mitocondrial (mtDNA) e dos microssateacutelites forneceram os
instrumentos necessaacuterios a uma detalhada caracterizaccedilatildeo geneacutetica das raccedilas bovinas
A anaacutelise da variaccedilatildeo da moleacutecula de mtDNA permitiu verificar que Bos primigenius
taurus e Bos primigenius indicus teratildeo divergido haacute cerca de 210000 anos uma data muito
anterior agrave indicada pelos dados arqueoloacutegicos para o iniacutecio do processo de domesticaccedilatildeo Eacute
assim muito provaacutevel que tenham ocorrido duas domesticaccedilotildees independentes a partir de duas
subespeacutecies diferentes do auroque Bos primigenius namadicus teraacute dado origem ao gado
zebu na Aacutesia (Vale do Indu) e Bos primigenius primigenius ao gado europeu vindo do
Proacuteximo Oriente (LOFTUS et ai 1994a 1994b)
Muito recentemente BRADLEY et ai (1996) e MACHUGH et ai (1997) sugerem ainda
uma terceira domesticaccedilatildeo independente ocorrida em Aacutefrica Esta evidecircncia resulta tambeacutem
de anaacutelise do polimorfismo do mtDNA indicando uma separaccedilatildeo entre os ancestrais do gado
europeu e africano anterior agrave domesticaccedilatildeo (22000 - 26000 anos) Este terceiro processo de
domesticaccedilatildeo ter-se-ia assim efectuado a partir da subespeacutecie africana do auroque (Bos
primigenius opisthonomus)
A descoberta dos microssateacutelites e do seu elevado grau de polimorfismo data do fim da
deacutecada de 80 (Lm amp LUTY 1989 WEBER amp MAY 1989) e constitui provavelmente a
metodologia mais adequada para estudar a histoacuteria recente da diversificaccedilatildeo das raccedilas bovinas
(MACHUGH et ai 1994 ARRANZ et ai 1996) Os primeiros resultados que envolvem uma
caracterizaccedilatildeo em larga escala de diferentes populaccedilotildees permitiram distinguir mais claramente
a estrutura geneacutetica dos dois grandes grupos de gado bovino (Bos taurus e Bos indicus) e
constituem a base para futuros estudos mais especiacuteficos
8
Introduccedilatildeo
Por outro lado os microssateacutelites permitiram tambeacutem o iniacutecio do projecto de
cartografia do genoma bovino que no fim de 1994 contabilizava 202 marcadores geneacuteticos
(dos quais 144 eram microssateacutelites) regularmente espaccedilados em 90 do seu comprimento
Cerca de um ano depois existiam jaacute mais de 400 microssateacutelites (USHA et ai 1995) levando
EGGEN et ai (1995) a apresentar um trabalho de revisatildeo e consolidaccedilatildeo de informaccedilatildeo jaacute
existente para evitar a ocorrecircncia de possiacuteveis redundacircncias
A aplicaccedilatildeo deste tipo de marcadores natildeo se restringe apenas agrave anaacutelise da diversidade
geneacutetica populacional e agrave construccedilatildeo de mapas geneacuteticos De facto satildeo actualmente escolhidos
para a realizaccedilatildeo de testes de paternidade (GLOWATZKI-MULLIS et ai 1995 USHA et ai 1995
ARRANZ et ai 1996) detecccedilatildeo de loci que determinam a expressatildeo de caracteriacutesticas
quantitativas (QTL) (RON et ai 1994) determinaccedilatildeo do sexo em embriotildees selecccedilatildeo animal
assistida entre outros
No seu conjunto estes resultados tecircm permitido um avanccedilo notaacutevel na compreensatildeo da
evoluccedilatildeo das actuais raccedilas bovinas A prossecuccedilatildeo desta via de investigaccedilatildeo poderaacute levar ao
esclarecimento definitivo do nuacutemero de domesticaccedilotildees independentes que teraacute ocorrido
(EPSTEIN amp MASON 1984 LOFTUS et al 1994a 1994b BRADLEY et al 1996 MACHUGH et
al 1997) a partir das populaccedilotildees selvagens de auroque Seguidamente eacute legiacutetimo esperar que
venha a ser possiacutevel analisar a uma escala mais fina o grau de parentesco geneacutetico entre raccedilas
que ocupem aacutereas geograacuteficas mais reduzidas Neste particular seraacute extremamente interessante
incluir as populaccedilotildees ibeacutericas e em especial a raccedila Barrosatilde
9
Introduccedilatildeo
12 - A DIVERSIDADE DAS RACcedilAS BOVINAS
A domesticaccedilatildeo resultou na criaccedilatildeo de milhares de raccedilas de animais domeacutesticos
geneticamente diferentes e adaptadas agraves necessidades humanas e a uma grande variedade de
condiccedilotildees ambientais (FAO 1993)
121 - As raccedilas ibeacutericas
A grande diversidade de raccedilas bovinas da Peniacutensula Ibeacuterica poderaacute dever-se em parte
agrave introduccedilatildeo de outras raccedilas domeacutesticas que se cruzaram entre si e com bovinos jaacute existentes
na Peniacutensula A introduccedilatildeo de outras raccedilas teraacute sido feita de duas formas distintas
1 - atraveacutes dos movimentos migratoacuterios acompanhando as vaacuterias invasotildees de povos
vindos do oriente como eacute o caso dos Feniacutecios ( seacutec X aC) Gregos (seacutec VII aC) e
Romanos (seacutec III aC) Estes uacuteltimos dominaram completamente a Peniacutensula durante
7 seacuteculos e teratildeo contribuiacutedo para a diversificaccedilatildeo do gado bovino pelo facto de
introduzirem animais de caracteriacutesticas diferentes Supotildee-se que do seu cruzamento
com os bovinos ibeacutericos se teratildeo originado os troncos aquitacircnico e ibeacuterico (MIRANDA
do VALE 1949)
2 - atraveacutes da introduccedilatildeo de animais do Norte de Aacutefrica na sequecircncia da invasatildeo de
povos como os Cartagineses (seacutec V aC) e jaacute na era cristatilde os Mouros (711 dC)
Estes teratildeo introduzido descendentes de Bos primigenius opisthonomus que poderaacute
ter influenciado a formaccedilatildeo de vaacuterias raccedilas ibeacutericas nomeadamente as raccedilas Barrosatilde e
Cachena (APARIacuteCIO 1960 in IGLESIAS 1989 EPSTEIN amp MASON 1984) Estas
poderatildeo assim constituir uma linha que descende do tronco mauritaacutenico (MIRANDA
do VALE 1949)
10
Introduccedilatildeo
Adicionalmente eacute provaacutevel que povos oriundos do Norte da Europa nomeadamente
os Visigodos possam ter introduzido gado bovino dessa regiatildeo Contudo a sua eventual
contribuiccedilatildeo para a diversidade de raccedilas bovinas da Peniacutensula Ibeacuterica estaacute por esclarecer
122 - A raccedila Barrosatilde
Aspectos histoacutericos da dispersatildeo e evoluccedilatildeo do efectivo populacional
O centro de criaccedilatildeo da raccedila Barrosatilde situa-se actualmente na zona do planalto da Serra
do Barroso abrangendo os actuais concelhos de Montalegre Boticas Vieira do Minho
(freguesias de Campos e Ruivatildees) e Cabeceiras de Basto (freguesia de Gondiatildees) Esta regiatildeo
natildeo possui condiccedilotildees agro-climateacutericas que permitam grandes exploraccedilotildees agriacutecolas pelo que
uma parte importante da populaccedilatildeo se dedica agrave criaccedilatildeo de gado (GARCIA et ai 1981
FERNANDES 1996)
Vivendo sobretudo em zonas montanhosas a Barrosatilde eacute utilizada essencialmente como
forccedila de trabalho e na produccedilatildeo de carne de excelente qualidade motivo pelo qual a Uniatildeo
Europeia a reconhece com denominaccedilatildeo de Origem Protegida (FERNANDES 1996)
No seacuteculo passado e iniacutecio do seacuteculo XX existia um grande incentivo para a criaccedilatildeo
desta raccedila devido agrave procura da sua carne muito apreciada em Inglaterra Este incentivo
contribuiu indirectamente para que a estatura dos animais se elevasse (GARCIA et ai 1981) e
para que a zona de criaccedilatildeo se dispersasse pelas aacutereas submontanhosas e pelas planiacutecies do
Entre Douro e Minho ateacute agrave orla mariacutetima chegando mesmo ao concelho de Vila Nova de Gaia
(figura 121) Nestas zonas fazia-se a criaccedilatildeo de novilhos para exploraccedilatildeo como bois de
trabalho e para produccedilatildeo de carne Tal exploraccedilatildeo estaacute bem patente nos paineacuteis de azulejos da
estaccedilatildeo de caminhos de ferro de S Bento no Porto e mesmo nos desenhos das calccediladas nas
principais avenidas desta cidade
li
Introduccedilatildeo
B
bull bull bull _ bull bull bull - bull bull
Figura 121 A) Junta de bois de trabalho de raccedila Barrosatilde B) Fecircmea adulta Barrosatilde C) Macho adulto Barrosatilde Fotografias datadas de 1949 gentilmente cedidas pela Direcccedilatildeo Regional de Agricultura de Entre Douro e Minho - Centro de Produccedilatildeo Animal (DRAEDM)
12
Introduccedilatildeo
Poreacutem a necessidade de maiores produccedilotildees de carne foi conduzindo durante a
segunda metade deste seacuteculo a um progressivo decliacutenio no efectivo populacional da raccedila
Barrosatilde tornando-se mesmo raro poder observar uma junta de bois Recentemente as
alteraccedilotildees verificadas na poliacutetica agraacuteria e ambiental da Uniatildeo Europeia teratildeo permitido
alguma recuperaccedilatildeo Nesse contexto a criaccedilatildeo em 1981 do Livro Genealoacutegico da raccedila
Barrosatilde constitui um passo importante para a certificaccedilatildeo dos animais e o aumento do seu
valor Actualmente o seu efectivo populacional tem crescido continuamente e essa tendecircncia
parece estaacutevel
Segundo dados fornecidos pelo Registo Zooteacutecnico e pela Associaccedilatildeo do Minho dos
Criadores de Bovinos de Raccedila Barrosatilde (AMTOA) existiam em 1996 38002 fecircmeas
reprodutoras inscritas e 375 touros de cobriccedilatildeo (tabela 1221) distribuiacutedos por vaacuterios
concelhos dos distritos de Viana do Castelo Braga Vila Real e Porto (figura 122)
Tabela 1221 Movimento do Registo Zooteacutecnico relativo agrave raccedila Barrosatilde
Vacas Inscritas Postos de Cobriccedilatildeo Vitelos Anos Abatidas Registadas Inscritas Encerrados Recenseados Existecircncias Inscritos 1981 0 4884 4882 1 25 24 0 1982 19 6169 11032 6 42 60 532 1983 31 4436 15437 14 35 81 1593 1984 72 866 16231 13 14 82 2151 1985 47 604 16788 15 15 82 1767 1986 106 1027 17709 18 13 77 2414 1987 72 1186 18823 2 14 89 2632 1988 122 1192 19877 5 7 91 2574 1989 138 718 20506 14 26 103 2532 1990 89 1017 21440 8 7 102 2404 1991 159 1309 22590 14 26 114 2531 1992 52 1902 24440 6 17 125 3203 1993 0 4205 28645 37 87 175 4077 1994 0 6248 34893 58 111 228 4679 1995 340 2447 37000 0 112 340 5759 1996 120 1122 38002 26 61 375 5901
Fonte Registo Zooteacutecnico (cedido pela AM1BA)
Apesar desta situaccedilatildeo favoraacutevel natildeo se pode considerar que a raccedila Barrosatilde natildeo corra
ainda perigo de extinccedilatildeo Na verdade satildeo vaacuterios os factores que tecircm contribuiacutedo para a
diminuiccedilatildeo da sua aacuterea de criaccedilatildeo ou mesmo para a alteraccedilatildeo das caracteriacutesticas destes
animais De entre esses factores deve salientar-se i) a substituiccedilatildeo de Barrosatilde por outras raccedilas
autoacutectones (Minhota Mirandesa Maronesa) ou importadas (Friacutesia Gelbvieh e Parda Suiacuteccedila)
13
Introduccedilatildeo
que fornecem ao agricultor um rendimento superior ii) a progressiva mecanizaccedilatildeo da
agricultura e a diminuiccedilatildeo das aacutereas de pastagem iii) o pequeno nuacutemero de machos
reprodutores associado a um efectivo idoso iv) uma baixa fertilidade meacutedia grandes
intervalos entre partos e elevado nuacutemero de abortos e v) desmotivaccedilatildeo dos produtores mesmo
em face das actuais condiccedilotildees de comercializaccedilatildeo
LEGENDA
| j - -Concelhos de Entre Douro e Minho S Concelhos de Traacutes-os-Montes
ESCALA 11380000
Figura 122 Mapa de distribuiccedilatildeo do actual efectivo Barrosatilde
14
Introduccedilatildeo
Aspectos morfoloacutegicos
O bovino Barrosatilde apresenta uma estatura mediana com 121-130 cm de altura agrave
cernelha e pelagem de cor castanha (variando entre a cor de palha ateacute a cor acerejada) (LEAL
1995) A cabeccedila eacute curta e larga encimada por uma cornamenta em forma de lira alta os
cornos satildeo muito compridos e espessos de cor branca suja com pontas escuras o conjunto
ocular eacute saliente dando-lhe o aspecto de olhos de sapo as orelhas satildeo de tamanho meacutedio os
membros satildeo curtos e pouco ossudos e o pescoccedilo eacute curto bem ligado agrave cabeccedila e com garrote
largo (MARTINS 1982)
Eacute uma raccedila com caracteres sexuais secundaacuterios bem diferenciados Os touros satildeo
normalmente mais escuros particularmente no terccedilo anterior com maior corpulecircncia do que as
fecircmeas mais robustos com barbela mais desenvolvida cabeccedila mais curta e mais larga cornos
mais grossos e ligeiramente mais curtos (GARCIA et ai 1981 MARTINS 1982)
Esta raccedila apresenta duas particularidades morfoloacutegicas que a distinguem de todas as
outras raccedilas grande desenvolvimento coacuterneo e perfil cocircncavo da cabeccedila com acentuado
prognatismo mandibular O elevado crescimento coacuterneo poderaacute estar relacionado com a
selecccedilatildeo dos animais De facto nas populares chegas de touros o animal que sai vencedor seraacute
o touro cobridor das vacas da aldeia Este processo teraacute permitido a primazia de touros de
maior ossatura capital mais potente musculatura ceacutefalo-cervical maior forccedila no acircngulo taacutersico
e consequentemente grande desenvolvimento dos cornos (MIRANDA do VALE in GONCcedilALVES GARCIA 1964 ARAUacuteJO 1986) No que se refere ao acentuado prognatismo
mandibular eacute possiacutevel que em parte esteja relacionado com o grande desenvolvimento
coacuterneo Este teraacute exigido um desenvolvimento correlativo de certos ossos cranianos e o
atrofiamento dos ossos da face (GONCcedilALVES GARCIA 1964)
Origem
A origem da raccedila Barrosatilde e o seu enquadramento com as outras raccedilas da Peniacutensula
Ibeacuterica estaacute ainda por explicar constatando-se uma grande heterogeneidade na opiniatildeo de
diversos autores a este respeito (MARTINS 1982)
Alguns autores referem a existecircncia no Norte de Aacutefrica (vale do Nilo) de um gado
com caracteriacutesticas morfoloacutegicas semelhantes agrave actual raccedila Barrosatilde em especial no que se
refere agrave forma tamanho e espessura dos cornos Este gado eacute normalmente associado agrave
15
Introduccedilatildeo
designaccedilatildeo subespeciacutefica Bos primigenius opisthonomus (embora tambeacutem se refira como Bos
primigenius mauritaniens e como Bos taurus desertorum) e teraacute chegado agrave Peniacutensula Ibeacuterica
atraveacutes de vaacuterias rotas migratoacuterias dos povos norte-africanos A raccedila Barrosatilde poderia assim
ser incluiacuteda no tronco mauritaacutenico tendo como ancestral Bos primigenius mauritanicus
(GARCIA et ai 1981)
Neste contexto poderaacute admitir-se que o gado que corresponde a este grupo se tenha
instalado na Peniacutensula Ibeacuterica provavelmente durante a longa ocupaccedilatildeo Moura (GONCcedilALVES
GARCIA 1964) Posteriormente a raccedila Barrosatilde teraacute sido desalojada pelos troncos ibeacuterico e
aquitacircnico restando apenas um nuacutecleo populacional confinado agraves zonas planaacutelticas do
Barroso onde permaneceu ateacute hoje (GONCcedilALVES GARCIA 1964)
Esta hipoacutetese natildeo eacute contudo partilhada por outros autores que lhe criticam a escassa
evidecircncia (forma e tamanho dos cornos) e portanto uma clara ausecircncia de base cientiacutefica
(IGLESIAS 1989)
Perante o exposto pode verificar-se que a raccedila Barrosatilde apresenta aspectos
morfoloacutegicos e histoacuterico-evolutivos muito peculiares sendo ainda hoje difiacutecil proceder ao seu
enquadramento no seio das restantes raccedilas bovinas ibeacutericas O aprofundamento da investigaccedilatildeo
sobre a estrutura geneacutetica das suas populaccedilotildees poderaacute ser assim uma via para o
esclarecimento das muitas questotildees que permanecem por responder Nestas condiccedilotildees este
trabalho pretende ser uma contribuiccedilatildeo para o conhecimento da geneacutetica das populaccedilotildees da
raccedila bovina Barrosatilde atraveacutes da consecuccedilatildeo dos seguintes objectivos
1 estudo da variabilidade geneacutetica da raccedila Barrosatilde ao niacutevel das proteiacutenas eritrocitaacuterias
e plasmaacuteticas
2 desenvolvimento e afinaccedilatildeo de teacutecnicas de separaccedilatildeo de proteiacutenas por electroforese
e focagem isoeleacutectrica e sua detecccedilatildeo especiacutefica (histoquiacutemica e imunoloacutegica)
3 anaacutelise familiar dos polimorfismos encontrados
4 avaliaccedilatildeo do grau de diferenciaccedilatildeo geneacutetica existente entre a raccedila Barrosatilde e outras
raccedilas bovinas
16
Material e Meacutetodos
2 - MATERIAL E MEacuteTODOS
21 - AMOSTRAGEM E CONSERVACcedilAtildeO DAS AMOSTRAS
211 - Amostragem
Foram recolhidas 356 amostras de sangue correspondente a 294 indiviacuteduos de raccedila
Barrosatilde (dos quais 141 estavam inscritos no Livro Genealoacutegico) e 62 indiviacuteduos de raccedila
Minhota As colheitas efectuaram-se em zonas de intensa criaccedilatildeo da Barrosatilde designadamente
nos concelhos de Arcos de Valdevez Cabeceiras de Basto Fafe Poacutevoa de Lanhoso e
Monccedilatildeo em finais de 1993 durante o ano de 1994 e ainda no periacuteodo de 1996 1997 em
Vieira do Minho
A recolha de sangue em indiviacuteduos de raccedila Minhota foi efectuada com a finalidade de
servir como termo de comparaccedilatildeo geneacutetica uma vez que se realizam cruzamentos entre esta
raccedila e a Barrosatilde
212 - Obtenccedilatildeo e conservaccedilatildeo das amostras de sangue
O sangue foi colhido da veia jugular em tubos contendo 01 ml de EDTA (aacutecido
etilnodiaminotetraceacutetico) dissoacutedico a 10 ou em tubos heparinados
As amostras de sangue foram centrifugadas (10 minutos a 13000 rpm) separando-se
em seguida o plasma dos eritroacutecitos Aos eritroacutecitos foi adicionado meio de glicerol (seis
partes de uma soluccedilatildeo 5 de citrato trissoacutedico 2H20 adicionados a quatro partes de glicerol)
numa proporccedilatildeo aproximada de 21 as amostras foram conservadas a -20degC
17
Material e Meacutetodos
22 - BATERIA DE MARCADORES GENEacuteTICOS SELECCIONADOS
No presente trabalho foi escolhida uma bateria de 12 marcadores geneacuteticos dispersos
no genoma do bovino (figura 5) HB (Hemoglobina) CAII (Anidrase carboacutenica) PEPB
(Peptidase B) DIA (Diaforase) NP (Fosforilase nucleosiacutedica) MDH (Desidrogenase do
malato) PGD (Desidrogenase do aacutecido fosfoglucoacutenico) GPI (Isomerase da fosfoglucose)
MPI (Isomerase da manose-6-fosfato) ALB (Albumina) TF (Transferrina) e GC
(Componente especiacutefico de grupo)
CP SODl TF
PEPC IDH1
AMY1 AMY1A PGM1
4
LDHB PEPB
ADH2 PGM2 ALB GC SOD3
6
IADA
ALDH1
CAII
ME1 PGM3 SOD2
NP
10
CAT HBBq22-q27
PGD IALDH2 DIA4
HP GPIq22-q24
MPI iBF GLOl
LDHA MDH2
Figura 221 Localizaccedilatildeo de vaacuterios loci proteicos no genoma de Bos taurus Com um tom mais carregado indicam-se os marcadores estudados neste trabalho Adaptado de FRIES et ai (1993)
18
Material e Meacutetodos
bull HB
A hemoglobina eacute responsaacutevel pelo transporte do oxigeacutenio dos pulmotildees para os tecidos
A sua estrutura eacute tetrameacuterica tendo cada uma das quatro subunidades um grupo prosteacutetico -
- heme - com um aacutetomo de ferro no centro A fracccedilatildeo principal da hemoglobina de mamiacuteferos
adultos eacute composta por duas cadeias a e duas cadeias P (BRAEND 1971 CECCHINI amp Nus
1986)
O locus da HB foi um dos primeiros a ser estudado apresentando polimorfismo em
vaacuterios mamiacuteferos (CECCHJM amp Nus 1986 BRAEND et ai 1988 CLARKE et ai 1989 WANG
et ai 1990 SELVARAJ et ai 1991) Em 1955 CABANNE amp SERAIN (in BRAEND 1988)
descrevem pela primeira vez o polimorfismo da HB em bovinos do Norte da Aacutefrica
Posteriormente muitos estudos foram efectuados descrevendo-se 13 variantes (raros na sua
maioria) com diferenccedilas apenas nas cadeias beta (CECCHINI amp Nus 1986 BRAEND 1988)
bull CAII-EC4211
A CAII eacute uma metaloenzima com grande distribuiccedilatildeo nos animais e nas plantas
(TASHIAN 1989) Catalisa de forma reversiacutevel a hidrataccedilatildeo do C02 em H2C03 (CECCHINI amp
Nus 1986 TASHIAN 1989) O seu papel fisioloacutegico ainda natildeo eacute bem conhecido mas eacute
possiacutevel que tenha participaccedilatildeo na manutenccedilatildeo do balanccedilo osmoacutetico (TASHIAN 1989)
A ocorrecircncia de variaccedilatildeo geneacutetica na CAII estaacute descrita em muitas espeacutecies de
mamiacuteferos tendo sido descritos dois loci polimoacuterficos (CAI e CAII) (TASHIAN amp CARTER
1976 CLARICE et ai 1989 SELVARAJ et ai 1991)
SARTORE et ai (1969) foram os primeiros a detectar polimorfismo electroforeacutetico da
anidrase carboacutenica em bovinos domeacutesticos e buacutefalos americanos Nos eritroacutecitos de bovinos
apenas se exprime a anidrase carboacutenica II que apresenta geralmente 2 alelos codominantes
autossoacutemicos (CAIPF e CAIPS) (SARTORE et ai 1969 TASHIAN amp CARTER 1976) Mais
tarde foram encontrados 3 novos alelos (C Z e X) (CECCHINI amp Nus 1986)
19
Material e Meacutetodos
bull PEPB-EC3412
As peptidases formam um conjunto de enzimas capazes de hidrolisar di- e tripeacuteptidos
caracterizando-se pela sua especificidade em relaccedilatildeo a diversos substratos bem como atraveacutes
da sua distribuiccedilatildeo tecidular
A PEPB apresenta uma estrutura monomeacuterica tendo sido descrita como polimoacuterfica
em algumas raccedilas brasileiras de bovinos de origem europeia e indiana (DEL LAMA et ai
1992)
bull DIA-EC1643
A enzima monomeacuterica DIA (NADH - Methemoglobina redutase) tambeacutem conhecida
por citocromo bs redutase faz parte de um grupo de enzimas que catalisam a reduccedilatildeo da
methemoglobina (IGLESIAS 1989 VIEIRA 1993 kRAHhetal 1986)
O seu polimorfismo geneacutetico foi detectado em vaacuterias espeacutecies de Ungulados incluindo
os bovinos (CLARKE et ai 1989 IGLESIAS 1989 SELVARAJ et ai 1991 TATE amp McEWAN
1992)
bull NP-EC2421
A enzima NP encontra-se distribuiacuteda por vaacuterios tecidos e oacutergatildeos e catalisa
reversivelmente a fosforoacutelise dos nucleosiacutedeos puriacutenicos levando agrave formaccedilatildeo das respectivas
bases e ribose-1-fosfato (IGLESIAS 1989)
O polimorfismo geneacutetico desta enzima foi detectado em vaacuterias espeacutecies de mamiacuteferos
incluindo os bovinos (ANSAY 1973 HARRIS amp HOPKINSON 1978 TUKER amp YOUNG 1988
CLARKE eacutetal 1989 IGLESIAS 1989 FERRAND 1995)
20
Material e Meacutetodos
bull MDH-ECl 1137
A MDH eacute uma oxirredutase dimeacuterica na maioria dos mamiacuteferos responsaacutevel pela
oxidaccedilatildeo do L-malato em oxoglutarato com NAD como aceitador A reacccedilatildeo eacute reversiacutevel em
presenccedila de NADH e oxaloacetato A enzima diz-se NAD especiacutefica pelo facto da reacccedilatildeo soacute
ocorrer na presenccedila deste cofactor (MORAIS 1992 PEREIRA 1997)
A ocorrecircncia de variaccedilatildeo geneacutetica neste locus foi descrita para vaacuterios mamiacuteferos
(HARRIS amp HOPKINSON 1978 TUNOacuteN et ai 1989 SELVARAJ et ai 1991) Contudo
relativamente aos bovinos natildeo foi possiacutevel encontrar referecircncias quanto ao seu polimorfismo
bull PGD-EC11144
A PGD eacute uma enzima dimeacuterica envolvida na via das pentoses-fosfato catalisando a
conversatildeo de 6-fosfogluconato em ribose-5-fosfato
O polimorfismo geneacutetico do locus PGD estaacute descrito em diversas espeacutecies de
Ungulados (HERZOG 1988 PENEDO et ai 1988 BEKENEV amp ORLO VA 1991 KUROSAWA amp
TANAKA 1991 JANZEN amp COTHRAN 1991 FERNDALE et al 1992) Contudo relativamente
aos bovinos natildeo foi possiacutevel encontrar referecircncias quanto ao seu polimorfismo
bull GPI-EC5319
A isomerase da fosfoglucose cataliza a reacccedilatildeo reversiacutevel de conversatildeo de glucose-
-6-fosfato em frutose-6-fosfato (HARRIS amp HOPKINSON 1978 PRETSCHei ai 1990)
Eacute uma enzima dimeacuterica com polimorfismo geneacutetico em vaacuterias espeacutecies de mamiacuteferos
nomeadamente no catildeo (ARNOLD amp Bouw 1989) no porco (VAN DE WEGHE et ai 1988
BEKENEV amp ORLO VA 1991) na ovelha (RASERO et ai 1993) em lamas e alpacas (PENEDO et
ai 1988) e no Homem (HARRIS amp HOPKINSON 1978)
21
Material e Meacutetodos
bull MPI-EC5318
A MPI eacute uma enzima monomeacuterica de acccedilatildeo cataliacutetica que permite a isomerizaccedilatildeo de D-
-manose-6-fosfato em D-frutose-6-fosfato
Em diversas espeacutecies de mamiacuteferos nomeadamente no Homem (RlTTER et ai 1974)
em babuiacutenos (RITTER amp SCHMITT 1973) e ratos (NICHOLS et ai 1973 VANDEBERG amp
AIVALIOTIS 1990) esta enzima natildeo apresenta actividade em eritroacutecitos sendo poreacutem
detectada em diversos tecidos como rim fiacutegado e o muacutesculo Mais tarde demonstrou-se a
possibilidade de proceder a esta detecccedilatildeo em hemolisados de cavalos coelhos e lebres (HALL
et ai 1991 VIEIRA amp FERRAND 1995 SANTOS 1995)
O polimorfismo geneacutetico de MPI em bovinos foi descrito por ANSAY (1973)
apresentando trecircs alelos autossoacutemicos codominantes (MPPA MPIB e MPIC)
bull ALB
A albumina eacute a proteiacutena mais abundante no plasma dos mamiacuteferos e apresenta uma
estrutura monomeacuterica A sua funccedilatildeo estaacute relacionada com processos de transporte e de
regulaccedilatildeo do balanccedilo osmoacutetico (CECCHTNI amp Nus 1986 CARTER et al 1989)
O polimorfismo geneacutetico da albumina estaacute descrito em vaacuterias espeacutecies de Ungulados
(STORMONT et ai 1963 BOWLING amp CLARK 1988 PENEDO et ai 1988 ERHARDT 1991
SELVARAJeacutetfa 1991CRISTOFALOpounda 1992 ERHARDT amp SlMIANER 1993)
EFREMOV e ASHTON em 1965 (in CECCHTNI amp Nus 1986) descrevem pela primeira vez
polimorfismo geneacutetico em raccedilas bovinas inglesas Inicialmente encontraram-se dois alelos
(ALBA ou ALBF e ALBB ou ALBS) por electroforese aacutecida Mais tarde descreveram-
-se outros alelos em raccedilas britacircnicas (ALBH e ALBG) e em raccedilas africanas (ALBD
ALBE e ALBF) (CECCHINI amp Nus 1986) ABE et ai em 1971 descrevem o alelo ALBX
(in CECCHTNI amp Nus 1986)
22
Material e Meacutetodos
bull TF
A transferrina eacute uma 3-globulina seacuterica responsaacutevel pelo transporte do ferro Possui
uma estrutura monomeacuterica glicosilada (CECCHINI amp Nus 1986 WELCHS 1990 PENHALLOW
et ai 1991 CUNHA 1994)
O polimorfismo geneacutetico desta proteiacutena foi detectado em vaacuterias espeacutecies de Ungulados
(KRISTJANSSON 1963 STORMONT et ai 1963 ASHTON 1965 GAHNE et ai 1977 CECCHJNI
amp Nus 1986 ERHARD 1986 KUROSAWA amp TANAKA 1988 PENEDO et ai 1988 CLARKE et
ai 1989 HERZOG 1989 JUNEJA et ai 1989 TSUJI et ai 1989 SCHNEIDER et ai 1990
STRATIL et ai 1990 WANG et ai 1990 SELVARAJ et ai 1991 DRATCH et ai 1992
VANKAN amp BELL 1992a CIacuteZovket ai 1993 ERHARD et ai 1993)
ASHTON em 1965 descreveu pela primeira vez o polimorfismo geneacutetico de TF em
bovinos estando actualmente descritos sete alelos TFA TFB TFD1 TFD2 TFE
TFF e TFG (CECCHTNI amp Nus 1986) A subdivisatildeo do alelo TFD em TFD1 e TFD2 foi
descrita por KRISTJANSSON amp HICKMAN (1965)
Nos bovinos os loci TF e CP encontram-se ligados como tem sido descrito para vaacuterias
espeacutecies de mamiacuteferos (JUNEJA et ai 1989)
bull GC
A GC apresenta uma estrutura monomeacuterica e o seu polimorfismo geneacutetico estaacute descrito
em vaacuterias espeacutecies de Ungulados (GAHNE 1963 KRISTJANSSON 1963 JUNEJA et ai 1987
PENEDO et ai 1988 PENEDO amp JUNEJA 1989 KALAacuteB et ai 1990 ERHARDT 1991 VANKAN
amp BELL 1992b STERN et ai 1992 ERHARDT amp SIMIANER 1993 STRATIL et ai 1995)
Nos bovinos o polimorfismo geneacutetico da GC foi inicialmente descrito por GAHNE
(1963) e ASHTON (1963) in GAHNE et ai 1977) mas soacute mais tarde foi possiacutevel obter
frequecircncias geacutenicas para este locus (alelos GCA e GCB) em diferentes raccedilas europeias
(GAHNE et ai 1977) A utilizaccedilatildeo de novas teacutecnicas de separaccedilatildeo permitiu distinguir um
terceiro alelo GCC (VAN DE WEGHE 1982)
23
Material e Meacutetodos
A existecircncia de ligaccedilatildeo factorial entre os loci ALB e GC foi demostrada no Homem
em primeiro lugar e depois nos cavalos nos bovinos e na ovelha (VAN DE WEGHE 1982
ERHARDT amp SlMIANER 1993)
23 - TRATAMENTO DAS AMOSTRAS
bull HB
A separaccedilatildeo da moleacutecula HB por focagem isoeleacutectrica foi feita mediante a utilizaccedilatildeo de
hemolisados diluiacutedos 18 em aacutegua bidestilada
bull CAII
A separaccedilatildeo electroforeacutetica de CAII foi realizada em gel de amido e em focagem
isoeleacutectrica No primeiro caso as amostras foram simplesmente tratadas com tolueno
enquanto no segundo se procedeu ainda agrave sua reduccedilatildeo com uma soluccedilatildeo de ditiotreitol
(DTT) 120 mM (100 uacute de amostra natildeo diluiacuteda e 20 pi de DTT 120 mM) durante 1 h a 37degC
Quando se utilizou focagem isoeleacutectrica aleacutem do tratamento jaacute referido foi necessaacuterio
realizar uma diluiccedilatildeo final de 110 com aacutegua bidestilada
bull PEPB DIA NP MDH PGP GPI e MPI
As separaccedilotildees electroforeacuteticas de PEPB DIA NP MDH PGD GPI e MPI em gel de
amido foram efectuadas com hemolisados natildeo diluiacutedos submetidos ao mesmo tratamento
descrito para CAII quando separada por electroforese convencional
24
Material e Meacutetodos
bull ALB
Na separaccedilatildeo de ALB por focagem isoeleacutectrica utilizaram-se amostras de plasma
diluiacutedas com aacutegua bidestilada na proporccedilatildeo de 170
bull TF
Na separaccedilatildeo de TF efectuada por focagem isoeleacutectrica utilizaram-se amostras de
plasma submetidas a vaacuterios tipos de tratamento para comparaccedilatildeo dos padrotildees de bandas
obtidos
1 Remoccedilatildeo dos resiacuteduos de aacutecido siaacutelico da moleacutecula de TF
diluiccedilatildeo 13 com neuraminidase durante 1 h a 37 degC
2 Remoccedilatildeo do Fe da moleacutecula de TF
diluiccedilatildeo 13 com EDTA-dissoacutedico (20) 2 h antes da aplicaccedilatildeo para remoccedilatildeo dos
aacutetomos de Fe da moleacutecula de TF
3 Saturaccedilatildeo em Fe da moleacutecula de TF
31 - diluiccedilatildeo 13 com soluccedilatildeo de sulfato de amoacutenio feacuterrico 015 (pv) em aacutecido
ciacutetrico 60 mM seguida de incubaccedilatildeo agrave temperatura ambiente 18 h A utilizaccedilatildeo
de uma razatildeo ligante Fe de 201 permite uma raacutepida saturaccedilatildeo da moleacutecula de
TF (FERRAND 1995)
32 - diluiccedilatildeo 13 com soluccedilatildeo de sulfato de amoacutenio ferroso 015 (pv) em aacutecido
ciacutetrico 60 mM seguida de incubaccedilatildeo agrave temperatura ambiente 18 h
33 - diluiccedilatildeo 13 com soluccedilatildeo de citrato de amoacutenio feacuterrico 015 (pv) em aacutecido
ciacutetrico 60 mM seguida de incubaccedilatildeo agrave temperatura ambiente 18 h
34 - diluiccedilatildeo 13 com soluccedilatildeo de citrato feacuterrico 015 (pv) em aacutecido ciacutetrico
60 mM seguida de incubaccedilatildeo agrave temperatura ambiente 18 h
35 - diluiccedilatildeo 13 com soluccedilatildeo de cloreto de ferro 015 (pv) em aacutecido ciacutetrico
60 mM seguida de incubaccedilatildeo agrave temperatura ambiente 18 h
25
Material e Meacutetodos
Antes da inserccedilatildeo as amostras foram parcialmente purificadas atraveacutes da adiccedilatildeo de 5
volumes de uma soluccedilatildeo de rivanol 06 (pv) em tampatildeo Tris HC1 005 M (ajusta-se o pH
para valores de 91 com Tris 1 M) seguida de centrifugaccedilatildeo
bull GCcedil
A fim de proceder agrave remoccedilatildeo dos resiacuteduos de aacutecido siaacutelico existente nas cadeias de
hidratos de carbono ligadas agrave moleacutecula GC as amostras de plasma foram submetidas a uma
incubaccedilatildeo com uma soluccedilatildeo de neuraminidase Clostridium perfringens SIGMA type V 18
Uml) na proporccedilatildeo de 13 durante 18 h a 37degC acrescentando-se posteriormente aacutegua
bidestilada ateacute agrave obtenccedilatildeo de uma diluiccedilatildeo final de 14 Paralelamente procedeu-se a uma
diluiccedilatildeo das amostras com aacutegua bidestilada (19) para comparaccedilatildeo dos padrotildees de bandas
obtidos
24 - MEacuteTODOS DE SEPARACcedilAtildeO
Electroforese convencional
Nas teacutecnicas de electroforese convencional foram utilizados vaacuterios sistemas de tampatildeo
para os geacuteis e para as pontes conforme a proteiacutena em estudo
Focagem isoeleacutectrica
Os sistemas de focagem isoeleacutectrica utilizados na separaccedilatildeo de proteiacutenas foram
realizados em matrizes de poliacrilamida (T = 5 C = 3) com dimensotildees 230xl00x03mm
Os geacuteis foram aplicados sobre uma peliacutecula de suporte GELFIX (SERVA) permitindo o seu
manuseamento adequado
A adiccedilatildeo de soluccedilotildees de TEMED 10 (pv) e persulfato de amoacutenio (PSA) 10 (pv)
permitiu a polimerizaccedilatildeo do gel agrave temperatura ambiente (24 horas) ou a 37 degC durante 1 h
As separaccedilotildees por focagem isoeleacutectrica decorreram sobre placa de arrefecimento a
aproximadamente 10degC (8 - 12degC)
26
Material e Meacutetodos
HB
A separaccedilatildeo da moleacutecula de HB foi realizada por focagem isoeleacutectrica em gradiente de
pH livre segundo a teacutecnica descrita por FERRAND (1995) com algumas modificaccedilotildees
A composiccedilatildeo da soluccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo e os paracircmetros eleacutectricos utilizados estatildeo
indicados nas tabelas 241 e 242 respectivamente
Tabela 241 Soluccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo utilizada para a separaccedilatildeo da moleacutecula nativa de HB por focagem isoeleacutectrica
Componentes da soluccedilatildeo Quantidades
Acrilamida 28 (pv)
Bisacrilamida 2 (pv)
Sacarose
Anfoacutelitos 5-8 (SIGMA)
7-9 (PHARMACIA)
Aacutegua bidestilada TEMED 10 (vv)
PSA 10 (pv)
18 ml
08 ml
2 g
300 p1
300 ul
ateacute 10 ml volume final
10 ul
70 ul
Tabela 242 Paracircmetros eleacutectricos utilizados na focagem isoeleacutectrica de HB
Voltagem (V) Corrente (mA) Potecircncia (W) Tempo (T)
Preacute focagem 1500 25 1
2
3
30 min
15 min
15 min
Focagem 1500 25 15 2h 30 min
As soluccedilotildees para os eleacutectrodos foram aacutecido aspaacutertico 004 M (acircnodo) e NaOH 01 M
(caacutetodo) As amostras foram aplicadas a 15 cm do caacutetodo tendo sido inseridas com o auxiacutelio
de um aplicador de borracha silicone (SERVA)
27
Material e Meacutetodos
bull CAII
A separaccedilatildeo de CAII fez-se em gel de amido (15 pv SIGMA) conforme o descrito
por AMORIM (1983) com algumas modificaccedilotildees e ainda por focagem isoeleacutectrica em
gradiente de pH livre
Utilizam-se os seguintes sistemas tampatildeo para a separaccedilatildeo por electroforese em gel de
amido
Tampatildeo das Pontes Tris 0250 M pH = 76 Aacutecido ciacutetrico 0067 M
Tampatildeo do Gel Diluiccedilatildeo 110 do tampatildeo das pH = 76 pontes
As amostras foram inseridas em meio Sephadex G-200 (PHARMACIA) na proporccedilatildeo
de 11 As electroforeses foram realizadas em placa de arrefecimento (8degC) e com um
gradiente de potencial de 5 Vcm durante 16 h
A teacutecnica utilizada para a separaccedilatildeo de CAII por focagem isoeleacutectrica foi a descrita por
BOWLING et ai (1990) com algumas modificaccedilotildees A composiccedilatildeo da soluccedilatildeo de
polimerizaccedilatildeo e os paracircmetros eleacutectricos utilizados estatildeo indicados nas tabelas 243 e 244
respectivamente
As soluccedilotildees para os eleacutectrodos foram aacutecido aspaacutertico 004 M (acircnodo) e NaOH 01 M
(caacutetodo) As amostras foram inseridas com o auxiacutelio de um aplicador de borracha silicone
(SERVA) colocado a 15 cm do caacutetodo
28
Material e Meacutetodos
Tabela 243 Soluccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo utilizada na separaccedilatildeo de CAII por focagem isoeleacutectrica
Componentes da soluccedilatildeo
Acrilamida 28 (pv)
Bisacrilamida 2 (pv)
Sacarose
Anfoacutelitos 4-65 (PHARMACIA)
Anfoacutelitos 35-10 (PHARMACIA)
Aacutegua bidestilada TEMED 10 (vv)
PSA 10 (pv)
Quantidades 18 ml
08 ml
2 g
500 |ol
100 ul
ateacute 10 ml volume final
10 ul
70 ul
Tabela 244 Paracircmetros eleacutectricos utilizados na separaccedilatildeo de CAII por focagem isoeleacutectrica
Voltagem (V) Corrente (mA) Potecircncia (W) Tempo (T)
Preacute focagem 1500 25 1
3
5
30 min
15 min
15 min
Focagem 2500 25 8
10
12
30 min
30 min
30 min
bull PEPB
A separaccedilatildeo da PEPB foi realizada em gel de amido (15 pv SIGMA) de acordo
com a teacutecnica descrita por POVEY et ai (1972) com algumas modificaccedilotildees
29
Material e Meacutetodos
Utilizou-se o seguinte sistema tampatildeo
Tampatildeo das Pontes Tris 01 M
pH = 74 NaH2P04 01 M
Tampatildeo do Gel Diluiccedilatildeo 110 do tampatildeo das
pH = 74 pontes
As amostras satildeo inseridas em meio Sephadex G-200 (PHARMACIA) na proporccedilatildeo de
11 As electroforeses foram realizadas em placas de arrefecimento (8degC) e com um gradiente
de potencial de 5 Vcm durante 16 h
bull DIA
No caso da separaccedilatildeo de DIA a teacutecnica eacute idecircntica agrave utilizada para CAII electroforese
em gel de amido (15 pv SIGMA) conforme o descrito por AMORIM (1983) com algumas
modificaccedilotildees
bull NP MDH PGD GPJ e MPI
As separaccedilotildees das enzimas NP MDH PGD GPI e MPI fizeram-se em simultacircneo por
electroforese em gel de amido (15 pv SIGMA) conforme o descrito por AMORIM et ai
(1982) com algumas modificaccedilotildees
Utilizou-se o seguinte sistema tampatildeo
1130 M
0400 M
0020 M 0010 M
Tampatildeo das Pontes NaOH
pH = 60 Aacutecido ciacutetrico
Tampatildeo do Gel HisHCl
pH = 60 NaOH
30
Material e Meacutetodos
As amostras foram inseridas em meio Sephadex G-200 (PHARMACIA) na proporccedilatildeo
de 11 As electroforeses foram realizadas em placas de arrefecimento (8degC) e com um
gradiente de potencial de 8 Vcm durante 15 h
ALB
Nas tabelas 245 e 246 indicam-se respectivamente a composiccedilatildeo da soluccedilatildeo de
polimerizaccedilatildeo para a separaccedilatildeo de ALB por focagem isoeleacutectrica segundo a teacutecnica descrita
por ROCHA et ai (1991) com algumas modificaccedilotildees e os paracircmetros eleacutectricos
Tabela 245 Soluccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo utilizada para a separaccedilatildeo de ALB por focagem isoeleacutectrica
Componentes da soluccedilatildeo Quantidades
Acrilamida 28 (pv)
Bisacrilamida 2 (pv)
Ureia
Anfoacutelitos 5-6 (PHARMACIA)
Anfoacutelitos 5-8 (PHARMACIA)
Anfoacutelitos 6-8 (PHARMACIA)
Aacutegua bidestilada TEMED 10 (vv)
PSA 10 (pv)
18 ml
08 ml
48 g
250 ni
250 ni
125 ul
ateacute 10 ml volume final
30 ul
70 ul
Tabela 246 Paracircmetros eleacutectricos utilizados na separaccedilatildeo de ALB por focagem isoeleacutectrica
Voltagem (V) Corrente (mA) Potecircncia (W) Tempo (T)
Preacute focagem 1500 25
Focagem 1500 25
1 30 min
2 15 min
3 15 min
4 3 h
5 30 min
31
Material e Meacutetodos
As soluccedilotildees para os eleacutectrodos foram aacutecido aspaacutertico 004 M (acircnodo) e NaOH 1 M
(caacutetodo) As amostras foram aplicadas a 15 cm do caacutetodo com o auxiacutelio de um aplicador de
borracha silicone (SERVA)
TF
A separaccedilatildeo da moleacutecula de TF foi efectuada por focagem isoeleacutectrica A composiccedilatildeo
da soluccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo e os paracircmetros eleacutectricos utilizados estatildeo indicados nas tabelas
247 e 248 respectivamente
Tabela 247 Soluccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo utilizada para a separaccedilatildeo da TF por focagem isoeleacutectrica
Componentes da soluccedilatildeo Quantidades
Acrilamida 28 (pv)
Bisacrilamida 2 (pv)
Sacarose
Anfoacutelitos 35-5(LKB)
Anfoacutelitos 4-65 (PHARMACIA)
Aacutegua bidestilada
TEMED 10 (vv) PSA 10 (pv)
18 ml
08 ml
2 g
100 ul
500 ul
ateacute 10 ml volume final
30 ul
70 ul
Tabela 248 Paracircmetros eleacutectricos utilizados na separaccedilatildeo de TF por focagem isoeleacutectrica
Voltagem (V) Corrente (mA) Potecircncia (W) Tempo (T)
Preacute focagem 1500 25
Focagem 2500 25
l 20 min
2 10 min
3 10 min
8 30 min
10 30 min
12 30 min
32
Material e Meacutetodos
As soluccedilotildees para os eleacutectrodos foram de aacutecido aspaacutertico 004 M (acircnodo) e de NaOH
1 M (caacutetodo) As amostras foram aplicadas a 15 cm do caacutetodo com o auxiacutelio de um aplicador
de borracha silicone (SERVA)
GC
Nas tabelas 249 e 2410 apresenta-se respectivamente a composiccedilatildeo da soluccedilatildeo de
polimerizaccedilatildeo e os paracircmetros eleacutectricos utilizados na focagem isoeleacutectrica de GC
Tabela 249 Soluccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo utilizada para a separaccedilatildeo da GC por focagem isoeleacutectrica
Componentes da soluccedilatildeo Quantidades
Acrilamida 28 (pv)
Bisacrilamida 2 (pv)
Sacarose
Anfoacutelitos 45-54 (PHARMACIA)
Anfoacutelitos 4-6 (LKB)
Aacutegua bidestilada TEMED 10 (vv)
PSA 10 (pv)
18 ml
08 ml
2 g
437 ul
188 (il
eacute 10 ml volume final
10 ul
70 ul
Tabela 2410 Paracircmetros eleacutectricos utilizados na separaccedilatildeo de GC por focagem isoeleacutectrica
Voltagem (V) Corrente (mA) Potecircncia (W) Tempo (T)
Preacute focagem 1500 25
Focagem 1500 25
1 30 min
2 15 min
3 15 min
4 3 h
5 30 min
33
Material e Meacutetodos
Para os eleacutectrodos foram utilizadas soluccedilotildees de aacutecido aspaacutertico 004 M (acircnodo) e de
NaOH 02 M (caacutetodo) As amostras foram inseridas com o auxiacutelio de um aplicador de
borracha silicone (SERVA) colocado a 15 cm do caacutetodo
25 - MEacuteTODOS DE DETECCcedilAtildeO
Apoacutes a separaccedilatildeo das proteiacutenas os padrotildees electroforeacuteticos foram geralmente obtidos
por detecccedilatildeo especiacutefica aproveitando a actividade cataliacutetica das enzimas Noutros casos a
revelaccedilatildeo foi feita por coloraccedilatildeo geral de proteiacutenas
bull HB
A visualizaccedilatildeo da HB foi obtida mediante coloraccedilatildeo geral de proteiacutenas segundo o
seguinte procedimento
Fixaccedilatildeo
Imersatildeo do gel numa soluccedilatildeo de aacutecido tricloroaceacutetico 125 (pv) durante 10 minutos
Coloraccedilatildeo geral de proteiacutenas
Coloraccedilatildeo com uma soluccedilatildeo de Coomassie R-250 0115 (pv) numa mistura de aacutecido
aceacuteticoetanolaacutegua destilada (42571) apoacutes aquecimento seguida de filtraccedilatildeo durante
5-10 minutos A descoloraccedilatildeo eacute feita com aacutecido aceacutetico etanol e aacutegua destilada
aquecida a cerca de 60degC ateacute se obter o contraste desejado
bull CAII
Apoacutes separaccedilatildeo por electroforese em gel de amido visualizou-se a CAII pela sua
actividade esteraacutesica adicionando-se diacetato de fluoresceiacutena (em quantidades vestigiais que
34
Material e Meacutetodos
foram previamente dissolvidas em 200 uacute de acetona) a uma soluccedilatildeo de incubaccedilatildeo tamponada
(pH = 66) Esta soluccedilatildeo de incubaccedilatildeo eacute composta por aacutecido ciacutetrico 27 mM e Na2HP04
116 mM e foi aplicada sobre o gel de amido com o auxiacutelio de papeacuteis de filtro Whatman ndegl
Em seguida incubou-se durante 30 minutos a 37degC A observaccedilatildeo das bandas de CAII (devido
agrave sua capacidade esteraacutesica) eacute feita sob luz ultravioleta
Apoacutes separaccedilatildeo por focagem isoeleacutectrica utilizou-se uma coloraccedilatildeo geral de proteiacutenas
para visualizaccedilatildeo da CAII segundo o meacutetodo descrito para a HB sem fixaccedilatildeo
bull PEPB
A detecccedilatildeo da PEPB apoacutes a separaccedilatildeo electroforeacutetica foi feita atraveacutes da aplicaccedilatildeo
sobre o gel de amido de papeacuteis de filtro Whatman ndegl embebidos numa soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo
seguindo-se uma incubaccedilatildeo de 30 minutos a 37degC
A soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo conteacutem o substrato da PEPB L-leucilglicil-glicina 0004 M
veneno de cobra da espeacutecie Agkistrodon piscivorus piscivorus 04 (pv) MTT 24 mM e
metosulfato de fenazina (PMS) 03 mM num tampatildeo de pH = 80 (Tris HC1005 M)
bull DIA
Apoacutes a separaccedilatildeo por electroforese em gel de amido a identificaccedilatildeo da DIA foi obtida
pela adiccedilatildeo de uma soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo a uma fatia do gel A incubaccedilatildeo decorreu durante 2
horas a 37degC
A soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo foi realizada em duas fases
Io - colocou-se 26-diclorofenol-indofenol (DCIP) 01 mM com um tampatildeo de
pH = 85 (Tris HC1 005M) adicionando-se agrave mistura aacutegua bidestilada ateacute perfazer
50 ml Em seguida filtrou-se a soluccedilatildeo
2o - agrave soluccedilatildeo filtrada adicionou-se MTT 03 mM e NADH 02 mM e agitou-se antes
de verter sobre a fatia de gel de amido
35
Material e Meacutetodos
bull NP
A detecccedilatildeo da enzima NP apoacutes a separaccedilatildeo por electroforese foi feita atraveacutes da
aplicaccedilatildeo sobre o gel de amido de papeacuteis de filtro Whatman ndegl embebidos com a soluccedilatildeo de
coloraccedilatildeo Em seguida incubou-se durante 15 minutos a 37degC
A soluccedilatildeo de incubaccedilatildeo conteacutem inosina 37 mM MTT 24 mM XOD 0004 Uml uma
gota de azul de Meldola (SIGMA) (10 vv em aacutegua bidestilada) e uma soluccedilatildeo de tampatildeo
de incubaccedilatildeo pH = 75 constituiacuteda por KH2P04 005 M e NaOH 004 M
bull MDH
Na detecccedilatildeo da actividade enzimaacutetica de MDH foi utilizado o meacutetodo de sandwich
apoacutes a sua separaccedilatildeo electroforeacutetica em gel de amido Em seguida incubou-se durante 15
minutos a 37degC O meacutetodo de sandwich consiste na aplicaccedilatildeo de uma fatia de gel de amido
entre duas folhas de papel de filtro Whatman ndegl embebido com a soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo
A soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo utilizada na detecccedilatildeo da MDH conteacutem NAD 1 mM MTT
2 mM e piruvato de soacutedio (quantidades vestigiais) Esta soluccedilatildeo foi feita com um tampatildeo de
incubaccedilatildeo pH = 74 constituiacutedo por aacutecido maacutelico 0222 M Tris 050 M e MgCl2 002 M
bull PGP
A detecccedilatildeo da actividade enzimaacutetica de PGD foi feita pelo meacutetodo de sandwich apoacutes a
sua separaccedilatildeo electroforeacutetica em gel de amido
A soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo conteacutem quantidades vestigiais de aacutecido 6-fosfoglucoacutenico
NADP MTT e uma gota de azul de Meldola (05 pv em aacutegua bidestilada) dissolvidos num
tampatildeo de pH = 74 constituiacutedo por Tris 01 M HisHCl 01 M Imidazol 0015 M e MgCl2
0005 M
36
Material e Meacutetodos
bull GPI
A detecccedilatildeo da actividade enzimaacutetica de GPI foi feita pelo meacutetodo de sandwich apoacutes a
sua separaccedilatildeo electroforeacutetica em gel de amido
A soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo conteacutem frutose-6-fosfato 55 mM NADP 22 mM MTT
4 mM desidrogenase da glucose-6-fosfato (G6PD) 14 Uml e uma gota de azul de Meldola
(05 pv em aacutegua bidestilada) dissolvidos num tampatildeo de pH = 74 constituiacutedo por Tris 01
M HisHCl 01 M Imidazol 0015 M e MgCl2 0005 M
bull MPI
Detectou-se a actividade enzimaacutetica de MPI pelo meacutetodo de sandwich apoacutes a sua
separaccedilatildeo electroforeacutetica em gel de amido
A soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo conteacutem manose-6-fosfato 42 mM NADP 13 mM MTT
24 mM e uma gota de azul de Meldola (05 pv em aacutegua bidestilada) dissolvidos num
tampatildeo de pH = 74 constituiacutedo por Tris 01 M HisHCl 01 M Imidazol 0015 M e MgCl2
0005 M Por fim adicionaram-se as enzimas isomerase da glucose-6-fosfato (GPI) 3 Uml e
desidrogenase da glucose-6-fosfato (G6PD) 5 Uml
bull ALBeTF
A detecccedilatildeo de ALB e de TF foi efectuada atraveacutes do meacutetodo de coloraccedilatildeo geral de
proteiacutenas descrito para a HB utilizando-se Coomasie R-250 sem fixaccedilatildeo
bull GCcedil
A visualizaccedilatildeo de GC efectuou-se por detecccedilatildeo imunoenzimaacutetica apoacutes transferecircncia da
proteiacutena para uma membrana de nitrocelulose (045 pm SCHLEICHER amp SCHULL)
segundo a teacutecnica descrita por FERRAND (1995)
37
Material e Meacutetodos
Apoacutes esse processo de transferecircncia as membranas de nitrocelulose foram lavadas 3
vezes (15 minutos) numa soluccedilatildeo de Tween 20 (MERCK) 0025 (vv) em soro fisioloacutegico
tamponado com fosfato (PBS Na2HP04 50 mM KH2P04 18mM NaCl 147 mM pH = 71) e
bloqueadas numa soluccedilatildeo de leite em poacute magro (5 pv em PBS) durante 18 h com agitaccedilatildeo
permanente e agrave temperatura ambiente
Depois da primeira lavagem aplicou-se o antisoro (anti-GC humana ATAB 81936)
diluiacutedo 1170 em PBS com 1 (pv) de albumina seacuterica bovina (SIGMA) durante 1 h agrave
temperatura ambiente
Repetiu-se novamente a lavagem segundo o processo jaacute referido seguindo-se a
aplicaccedilatildeo do segundo antisoro (anticorpos contra imunoglobulinas caprinas desenvolvidos em
coelho e conjugados com uma peroxidase ATAB 83806) diluiacutedo 1600 em PBS com 1
(pv) de albumina seacuterica bovina (SIGMA) durante 1 h agrave temperatura ambiente
Depois de duas lavagens (5 minutos) com Tween 20PBS procedeu-se agrave detecccedilatildeo da
GC com uma soluccedilatildeo de 9-amino-2-etilcarbazol 004 (pv) e de metanol 20 (vv) em PBS
As bandas correspondentes agrave actividade peroxidaacutesica aparecem rapidamente bloqueando-se a
reacccedilatildeo com aacutegua bidestilada
26 - MEacuteTODOS DE CAacuteLCULO
As frequecircncias geacutenicas foram calculadas por contagem directa de genes a partir da
distribuiccedilatildeo fenotiacutepica obtida
O caacutelculo dos valores de heterozigotia meacutedia (H) da proporccedilatildeo de loci polimoacuterficos
(P) do nuacutemero meacutedio de alelos por locus (ria) estatiacutesticas F e frequecircncias fenotiacutepicas
esperadas segundo o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg foi efectuado com a utilizaccedilatildeo do
programa BIOSYS versatildeo 17 (SWOFFORD amp SELANDER 1989)
O caacutelculo de distacircncias geneacuteticas e obtenccedilatildeo de dendrogramas foi efectuado com o
programa PHYLIP versatildeo 35 (FELSENTEIN 1993)
38
Resultados e Discussatildeo
3 - RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
31 - ANAacuteLISE DOS MEacuteTODOS DE SEPARACcedilAtildeO
De entre os 12 loci estudados neste trabalho detectaram-se 5 monomoacuterficos
(PEPB DIA GPI MDH e PGD) e 7 polimoacuterficos (HB CAII NP MPI ALB TF e GC)
Loci monomoacuterficos
bull PEPB
A utilizaccedilatildeo de teacutecnicas de electroforese em gel de amido permitiu a detecccedilatildeo de
um soacute fenoacutetipo (figura 311) correspondente a indiviacuteduos homozigoacuteticos para o alelo
PEPB2 descrito por DEL LAMA et ai (1992) No entanto na raccedila Minhota detectou-se
um indiviacuteduo heterozigoacutetico
O fenoacutetipo PEPB 2 apresenta um padratildeo com duas bandas uma de grande
intensidade e outra secundaacuteria mais anoacutedica de menor intensidade No indiviacuteduo
heterozigoacutetico 2-1 (natildeo representado) observou-se um padratildeo de trecircs bandas sendo a
terceira mais anoacutedica e menos intensa
A quase inexistecircncia de PEPB1 nas raccedilas estudadas estaacute de acordo com o referido
em DEL LAMA et ai (1992) que sugere a fixaccedilatildeo de PEPB2 na maior parte das
populaccedilotildees de bovinos de origem europeia (com excepccedilatildeo das raccedilas italianas Marchigiana
e Chianina)
39
Resultados e Discussatildeo
+
Figura 311 Fenoacutetipos de PEPB observados por electroforese convencional em gel de amido
bull DIA
Os resultados obtidos para a enzima DIA revelaram ausecircncia de polimorfismo
electroforeacutetico (figura 312) Resultados semelhantes foram tambeacutem obtidos em vaacuterias
raccedilas autoacutectones espanholas (GONZALEZ et ai 1987 IGLESIAS 1989 ARRANZ et ai
1992)
MAKAVEEV (1979 in IGLESIAS 1989) detectou polimorfismo desta enzima em
eritroacutecitos de buacutefalos da Bulgaacuteria e nas raccedilas bovinas Frisia e Simmental descrevendo dois
alelos codominantes DIAA e DIAB
Figura 312 Padratildeo de DIA observado por electroforese convencional em gel de amido
40
Resultados e Discussatildeo
Natildeo se detectou variaccedilatildeo electroforeacutetica para o locus GPI Estes resultados natildeo se
podem comparar com os obtidos noutras raccedilas por natildeo ter sido possiacutevel consultar outros
trabalhos onde se descrevesse variaccedilatildeo do locus GPI em gado bovino
A figura 313 apresenta o padratildeo obtido para esta enzima observando-se trecircs
bandas duas com grande intensidade e uma banda mais anoacutedica de menor intensidade
Figura 313 Padratildeo de GPI obtido em hemolisados por electroforese convencional em gel de amido
bull MDH
A enzima MDH revelou-se monomoacuterfiacuteca Este resultado eacute concordante com outros
estudos (ARRANZ et ai 1992)
Na figura 314 observa-se o padratildeo de bandas detectado por electroforese
convencional em gel de amido
Figura 314 Padratildeo de MDH observado por electroforese convencional em gel de amido
41
Resultados e Discussatildeo
bull PGD
A enzima PGD revelou-se monomoacuterfica para as raccedilas Barrosatilde e Minhota tambeacutem
neste caso natildeo se encontrou qualquer referecircncia bibliograacutefica relativa a um possiacutevel
polimorfismo deste locus em gado bovino
Na figura 315 observa-se o padratildeo obtido para esta enzima Em amostras
armazenadas por um longo periacuteodo de tempo detectaram-se duas bandas sendo a mais
anoacutedica a que revela menor intensidade as amostras mais recentes apresentam um padratildeo
electroforeacutetico com uma soacute banda
Figura 315 Padratildeo de PGD observado por electroforese convencional em gel de amido
Loci polimoacuterficos
bull HB
A electroforese convencional natildeo permite discriminar os electromorfos de HB No
entanto a utilizaccedilatildeo de sistemas de focagem isoeleacutectrica conduz agrave detecccedilatildeo de
polimorfismo nesta proteiacutena observando-se dois fenoacutetipos HB A e HB AB
Na figura 316 observa-se o padratildeo electroforeacutetico desta moleacutecula resultante da
expressatildeo de dois alelos codominantes HBA e HBB Resultados idecircnticos estatildeo
descritos em raccedilas bovinas da Peniacutensulas Ibeacuterica (VICENTE 1978 KiDD et ai 1980
IGLESIAS 1989)
42
Resultados e Discussatildeo
+ -HBB
HBA
AB AB A A
Figura 316 Separaccedilatildeo de hemoglobina nativa por focagem isoeleacutectrica
bull poundAH
A utilizaccedilatildeo de electroforese em gel de amido e focagem isoeleacutectrica permitiu
identificar trecircs fenoacutetipos CAII F CAII FS e CAII S atribuiacutedos agrave expressatildeo de dois alelos
codominantes CAF e CAS (figuras 317 e 318) Poreacutem a separaccedilatildeo por electroforese em
gel de amido implica alguma morosidade (tempos de corrida muito longos) e em amostras
coaguladas o erro de leitura pode ser superior a 20 Estas dificuldades satildeo minimizadas
quando se recorre a focagem isoeleacutectrica
Assim a separaccedilatildeo da enzima CAII por focagem isoeleacutectrica oferece vaacuterias vantagens
nomeadamente
bull rapidez e simplicidade de execuccedilatildeo
bull utilizaccedilatildeo de pequenas quantidades de material bioloacutegico
bull maior nuacutemero de amostras fenotipadas por corrida
bull possibilidade de utilizaccedilatildeo de amostras coaguladas
43
Resultados e Discussatildeo
F F F S FS FS F S FS
Figura 317 Fenoacutetipos de CAII observados sob luz ultravioleta apoacutes separaccedilatildeo por electroforese convencional em gel de amido e coloraccedilatildeo com diacetato de fluoresceina
CAIIF
| CAIIS
Figura 318 Fenoacutetipos de CAII observados por focagem isoeleacutectrica apoacutes coloraccedilatildeo geral de proteiacutenas
bull NP
A expressatildeo fenotiacutepica de NP resulta das combinaccedilotildees possiacuteveis entre um alelo
dominante NPH e um recessivo NPL (ANSAY 1973) Este facto implica que apenas em
presenccedila do feno tipo NP L eacute possiacutevel fazer corresponder um genoacutetipo (jaacute que o fenoacutetipo NP H
pode corresponder aos genoacutetipos HH e HL e o fenoacutetipo NP L corresponde ao genoacutetipo LL)
Na figura 319 apresenta-se o padratildeo obtido para a proteiacutena apoacutes separaccedilatildeo
electroforeacutetica em gel de amido
44
+
w
FS FS ]
Resultados e Discussatildeo
H L L H L L
Figura 319 Fenoacutetipos de NP detectados por electroforese convencional em gel de amido
bull MPI
Na raccedila Minhota detectaram-se quatro fenoacutetipos MPI AB MPI B MPI BC e MPI C
anteriormente descritos por ANSAY (1973) em bovinos na raccedila Barrosatilde apenas se observam
os trecircs uacuteltimos fenoacutetipos De acordo com o mesmo autor os fenoacutetipos encontrados nesta raccedila
resultam da combinaccedilatildeo de dois alelos codominantes MPIB e MPPC enquanto que MPIA
aparece na raccedila Minhota com uma frequecircncia reduzida
Como se pode observar pela anaacutelise da figura 3110 MPIA aparece como o alelo
mais anoacutedico MPIC como o mais catoacutedico e o alelo mais frequente MPIB situa-se numa
posiccedilatildeo intermeacutedia em relaccedilatildeo aos anteriores Contudo a intensidade das bandas eacute muito
fraca tornando-se quase imperceptiacutevel em alguns casos Esta grande dificuldade em obter um
contraste de bandas adequado mesmo apoacutes longos periacuteodos de incubaccedilatildeo a 37degC poderaacute
eventualmente levar a uma incorrecta interpretaccedilatildeo dos fenoacutetipos Assim a utilizaccedilatildeo de
sistemas de focagem isoeleacutectrica na determinaccedilatildeo destes fenoacutetipos seria aconselhaacutevel a fim
de verificar os resultados obtidos por electroforese convencional
45
Resultados e Discussatildeo
Figura 3110 Fenoacutetipos de MPI observados por electroforese convencional em gel de amido
bull ALB
A separaccedilatildeo por focagem isoeleacutectrica permitiu detectar polimorfismo em ALB Cada
indiviacuteduo homozigoacutetico aparece com trecircs bandas duas de maior intensidade e uma mais
aciacutedica com menor intensidade os indiviacuteduos heterozigoacuteticos podem apresentar ateacute seis
bandas
Esta heterogeneidade nos padrotildees de ALB tem sido interpretada como o resultado da
capacidade desta proteiacutena se ligar a vaacuterias substacircncias diferentes (FERRAND 1995) Com a
inclusatildeo de ureia (8M) na matriz de separaccedilatildeo reagente que provoca a desnaturaccedilatildeo da
proteiacutena levando a uma alteraccedilatildeo do seu pi para uma zona mais baacutesica do gradiente
conseguem-se obter padrotildees de bandas mais simples e mais definidos (KAWAGUCHI 1973
FERRAND 1995)
Na figura 3111 apresentam-se os padrotildees observados que foram interpretados como
sendo determinados por trecircs alelos codominantes ALBA ALBB e ALBV
GAHNE et ai (1977) e IGLESIAS (1989) detectaram por electroforese em gel de
poliacrilamida e de amido respectivamente dois variantes em gado bovino ALBA e
ALBB A utilizaccedilatildeo de focagem isoeleacutectrica veio confirmar a existecircncia destes dois alelos e
acrescentar um terceiro designado por ALBV com uma mobilidade mais aciacutedico do que
ALBA
46
Resultados e Discussatildeo
A B A B A B B B A B A G
Figura 3111 Fenoacutetipos de ALB determinados em amostras de plasma por focagem isoeleacutectrica na presenccedila de ureia 8M
ARRANZ et ai (1992) revelaram a existecircncia de um outro variante (ALBD) com
mobilidade electroforeacutetica intermeacutedia entre ALBA e ALBB ainda natildeo descrito em
nenhuma raccedila autoacutectone espanhola Este alelo poderaacute corresponder ao alelo ALBV
encontrado neste trabalho apesar de apresentar um pi mais aacutecidico do que ALBA (ARRANZ
comunicaccedilatildeo pessoal)
Desta forma a teacutecnica de separaccedilatildeo por focagem isoeleacutectrica provou ser eficaz na
separaccedilatildeo dos variantes de ALB tal como jaacute foi demonstrado no gato (BELL et ai 1994) na
ovelha (ERHARDT amp SIMIANER 1993) e no coelho (FERRAND amp ROCHA 1992)
bull TF
A transferrina eacute um dos marcadores mais importantes no estudo e caracterizaccedilatildeo
geneacutetica de raccedilas bovinas devido ao seu elevado polimorfismo No entanto a sua fenotipagem
natildeo eacute simples existindo frequentemente problemas de resoluccedilatildeo e de separaccedilatildeo das bandas
(IGLESIAS 1989)
A fim de averiguar qual a melhor forma de separar os diferentes produtos geacutenicos
descritos no locus TF testaram-se vaacuterios sistemas electroforeacuteticos em geacuteis de agarose numa
vasta gama de sistemas tampatildeo Esta teacutecnica natildeo ofereceu resultados satisfatoacuterios pelo que se
passou agrave separaccedilatildeo da TF por focagem isoeleacutectrica recorrendo a matrizes de poliacrilamida
47
Resultados e Discussatildeo
com diferentes concentraccedilotildees de ureia (6M e 8M) tambeacutem neste caso natildeo se conseguiram
resultados positivos
Este tipo de dificuldades encontradas na fenotipagem da TF por focagem isoeleacutectrica
tinham jaacute sido descritos noutras espeacutecies nomeadamente na cabra (ERHARDT 1986) e no
coelho (FERRAND 1995) No entanto TSUJI et ai (1989) demostraram ser possiacutevel fenotipar
esta proteiacutena em bovinos por focagem isoeleacutectrica sem grandes problemas e sem qualquer
aditivo na matriz de poliacrilamida
Desta forma a utilizaccedilatildeo de uma teacutecnica de focagem isoeleacutectrica com um gradiente de
pH 35-65 reforccedilado em 40-65 permitiu separar os produtos geacutenicos do locus TF Contudo
os padrotildees obtidos nem sempre eram definidos tornando-se dificilmente interpretaacuteveis
Na tentativa de melhorar os padrotildees de resoluccedilatildeo e de verificar se a variaccedilatildeo detectada
natildeo resultava de diferenccedilas no estado feacuterrico da moleacutecula de TF ou ainda da existecircncia de
aacutecidos siaacutelicos ligados agrave moleacutecula procedeu-se agrave sua separaccedilatildeo apoacutes vaacuterios tratamentos das
amostras
A remoccedilatildeo dos aacutecidos siaacutelicos atraveacutes do tratamento das amostras com neuraminidase
natildeo permitiu a obtenccedilatildeo de bandas definidas este tratamento natildeo altera significativamente o
padratildeo das bandas de TF de bovinos como jaacute tinha sido descrito por PENHALLOU et ai
(1991)
A obtenccedilatildeo de TF no estado apofeacuterrico foi conseguida submetendo as amostras a um
tratamento com EDTA-dissoacutedico Neste caso observa-se que apoTF apresenta uma
mobilidade menor e um padratildeo de bandas mais simples mas ainda sem uma definiccedilatildeo
adequada
A forma Fe2TF foi obtida mediante vaacuterios tratamentos com dadores de Fe (ver capiacutetulo
Material e Meacutetodos) Os resultados soacute se mostraram satisfatoacuterios atraveacutes da saturaccedilatildeo da
moleacutecula de TF com uma soluccedilatildeo de sulfato de amoacutenio feacuterrico provavelmente por causar uma
maior estabilidade da moleacutecula ao longo da sua separaccedilatildeo por focagem isoeleacutectrica com
elevadas voltagens pois segundo WELCHS (1990) a forma difeacuterrica da transferrina eacute mais
resistente agrave desnaturaccedilatildeo e ao calor do que a forma apoTF
48
Resultados e Discussatildeo
Estatildeo descritos pelo menos oito alelos no locus TF TFAl TFA2 TFB TFD1
TFD2 TFE TFF e TFG os mais comuns no gado europeu (Bos taurus) satildeo TFA
TFD1 TFD2 e TFE (JAMIESON 1965) No gado asiaacutetico e africano (Bos indicus) ocorrem
aleacutem das formas anteriores os alelos TFB e TFF
Na figura 3112 apresenta-se o proteinograma obtido com a utilizaccedilatildeo de amostras
saturadas com Fe Esta teacutecnica permitiu a separaccedilatildeo de TFD em TFD1 e TFD2 e a
detecccedilatildeo de todos os outros fenoacutetipos descritos em bovinos europeus Assim observaram-se
quatro alelos codominantes TFA TFD1 TFD2 e TFE
A expressatildeo fenotiacutepica dos alelos em homozigotia caracteriza-se pela presenccedila de dois
dupletos de bandas aparecendo a banda mais aciacutedica de cada dupleto com intensidade mais
fraca Os indiviacuteduos herozigoacuteticos podem apresentar ateacute oito bandas
Figura 3112 Fenoacutetipos de TF determinados por focagem isoeleacutectrica apartir de amostras saturadas com uma soluccedilatildeo de sulfato de amoacutenio feacuterrico
IGLESIAS (1989) detectou TFA e TFD nas cinco raccedilas de bovinos da Galiza o
variante TFE na raccedila Cachena espanhola e um outro variante raro TFR com mobilidade
mais lenta na raccedila Rubia Galega
bull QQ
A GC eacute uma proteiacutena plasmaacutetica que demonstra um elevado grau de heterogeneidade
geneacutetica em mamiacuteferos (FERRAND 1995)
A separaccedilatildeo de GC em focagem isoeleacutectrica seguida da utilizaccedilatildeo de immunoblotting
melhorou de forma consideraacutevel a capacidade de investigar a variaccedilatildeo desta proteiacutena em
49
Resultados e Discussatildeo
diferentes espeacutecies (JUNEJA et ai 1987 PENEDO amp JUNEJA 1989 STRATIL et ai 1990
KALAacuteB et ai 1990 STERN et ai 1992 VANKAN amp BELL 1992 FERRAND 1995)
Nas figuras 3113 e 3114 apresentam-se alguns dos fenoacutetipos obtidos na separaccedilatildeo
da GC por focagem isoeleacutectrica Verifica-se que em amostras tratadas com neuraminidase o
padratildeo de bandas se apresenta mais simplificado surgindo no entanto duas bandas (uma
mais baacutesica e uma mais aciacutedica) de natureza desconhecida Os padrotildees observados foram
interpretados como sendo determinados por dois alelos GCF e GCS
mdashGCF
S F S FS S FS F F S FS 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Figura 3113 Fenoacutetipos de GC determinados por focagem isoeleacutectrica amostras 1 8 9 e 10 tratadas com neuraminidase amostras 2 a 7 diluiacutedas em aacutegua bidestilada
S1 $ l S- -
FS S S S F S FS S FS F S
Figura 3114 Fenoacutetipos de GC determinados em amostras de plasma tratados com neuraminidase apoacutes focagem isoeleacutectrica
Nota-se a existecircncia de dois alelos codominantes GCF e GCS sendo o segundo
mais aciacutedico do que o primeiro
50
Resultados e Discussatildeo
32 - ANAacuteLISE FAMILIAR
A realizaccedilatildeo da anaacutelise familiar relativo ao conjunto de loci polimoacuterficos estudados
observa-se no estudo de 27 pares matildeefilho Esta situaccedilatildeo resulta da grande dificuldade
existente na obtenccedilatildeo de informaccedilatildeo sobre os machos
Os resultados apresentam-se nas tabelas 321 a 326 natildeo foi possiacutevel testar o
equiliacutebrio de Hardy-Weinberg devido ao reduzido tamanho da amostra bem como ao facto de
vaacuterios alelos ocorrerem em baixa frequecircncia
Refira-se que natildeo foi detectado qualquer caso de exclusatildeo matildeefilho
Tabela 321 Sistema CAII Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica em 27 pares matildeefilho Os valores esperados segundo o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg estatildeo indicados entre parecircntesis
Total
4 (32) 17
(122) 6
(116) 27
Tabela 322 Sistema NP Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica em 27 pares matildeefilho Os valores esperados segundo o equiliacutebrio de Hardy--Weinberg estatildeo indicados entre parecircntesis
Total
14
(114)
13
(156)
27
^ ^ ^ Filho
Matildee - ^ F
Fenoacutetipos
F f~ (11)
FS 2
(21)
S
Total 3
Fenoacutetipos
FS S
3
(21)
10 5
(61) (40)
1 5
(40) (76)
14 10
- v ^ ^ Filho Fenoacutetipos
Matildee - ^ H L
Fenoacutetipos
H 10 4
(77) (37)
L 5 8
(37) (119)
Total 15 12
51
Resultados e Discussatildeo
Tabela 323 Sistema MPI Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica em 26 pares matildeefilho Os valores esperados segundo o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg estatildeo indicados entre parecircntesis
^ Filho Fenoacutetipos Total
Matildee ^ ~ ^ A AB AC B BC c Fenoacutetipos
A 0 0 0 - - - 0
(00) (00) (00) (00)
AB 0 0 0 0 0 - 0
(00) (00) (00) (00) (00) (00)
AC 0 0 0 - 0 0 0
(00) (00) (00) (00) (00) (00)
B - 0 - 24 1 - 25
(00) (242) (06) (248)
BC - 0 0 1 0 0 1
(00) (00) (06) (06) (00) (12)
C - - 0 - 0 0 0
(00) (00) (00) (00)
Total 0 0 0 25 1 0 26
Tabela 324 Sistema ALB Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica em 27 pares matildeefilho Os valores esperados segundo o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg estatildeo indicados entre parecircntesis
^ ^ Filho Fenoacutetipos Total
M atilde e ^ ^ - s ^ ^ A AB AV B BV V
Fenoacutetipos
A 24 2 0 - - - 26
(251) (04) (02) (257)
AB 0 0 0 0 0 -
0
(04) (04) (00) (00) (00) (08)
AG 1 0 0 - 0 0 1
(02) (00) (02) (00) (00) (04)
B - 0 - 0 0 - 0
(00) (00) (00) (00)
BG - 0 0 0 0 0 0
(00) (00) (00) (00) (00) (00)
G - - 0 - 0 0 0
(00) (00) (00) (00)
Total 25 2 0 0 0 0 27
52
Resultados e Discussatildeo
Tabela 325 Sistema TF Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica em 27 pares matildeefilho Os valores esperados segundo o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg estatildeo indicados entre parecircntesis
Filho Fenoacutetipos Total
Matildee ^ A ADI AD2 AE Dl D1D2 DIE D2 D2E E
Fenoacutetipos
A 6
(51)
1
(14)
4
(21)
1
(03)
12
(89)
ADI 1 2 0 0 0 0 0 - - - 3
(14) (24) (06) (01) (04) (06) (01) (56)
AD2 2 0 5 0 - 0 - 2 0 - 9
(21) (06) (36) (01) (06) (08) (01) (79)
AE 0 0 0 0 - - 0 - 0 0 0
(03) (01) (01) (06) (01) (01) (00) (13) Dl 0
(04) 1
(01)
1
(02)
0
(00)
- 2
(07)
D1D2 - 0 1 - 0 0 0 0 0 - 1
(06) (06) (02) (10) (00) (02) (00) (26) DIE - 0 - 0 0 0 0 - 0 0 0
(01) (01) (00) (00) (02) (00) (00) (04)
D2 0
(08) 0
(02)
0
(03)
0
(01)
- 0
(14) D2E - - 0 0 - 0 0 0 0 0 0
(01) (01) (00) (00) (01) (02) (00) (05) E 0
(00) 0
(00)
0
(00)
0
(00)
0
(00)
Total 9 3 10 1 1 1 0 2 0 0 27
Tabela 326 Sistema GC Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica em 27 pares matildeefilho Os valores esperados segundo o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg estatildeo indicados entre parecircntesis
- - ^ F i l h o Fenoacutetipos Total
Matildee ^ ^ 1 2-1 2
Fenoacutetipos
1 17 2 19
(156) (31) (187)
2-1 5 2 0 7
(31) (38) (06) (75)
2 _ 1 0 1
(06) (01) (07)
Total 22 5 0 27
53
Resultados e Discussatildeo
33 - ANAacuteLISE POPULACIONAL LOCUS A LOCUS
Neste capiacutetulo faz-se a anaacutelise populacional dos loci polimoacuterficos e ainda dos loci
PEPB e DIA para os quais natildeo se detectou variaccedilatildeo na raccedila Barrosatilde A sua inclusatildeo justifica-
-se pelo facto de serem polimoacuterficos noutras raccedilas bovinas ou em espeacutecies aparentadas
bull PEPB
O locus PEPB revelou-se monomoacuterfico nas trecircs populaccedilotildees de bovinos de raccedila
Barrosatilde e Minhota tendo sido detectado um uacutenico produto geacutenico PEPB2 (observado um
indiviacuteduo heterozigoacutetico da raccedila Minhota) No entanto este locus eacute referido como polimoacuterfico
em raccedilas bovinas criadas no Brasil onde se detectaram dois alelos codominantes PEPB1 e
PEPB2 (DEL LAMA et ai 1992)
O alelo PEPB2 estaacute fixado nas raccedilas de origem europeia incluindo as estudadas neste
trabalho excepto nas raccedilas italianas Marchigiana e Chianina nas quais PEPB1 apresenta
frequecircncias geacutenicas entre 011 e 014 (tabela 331)
Tabela 331 Frequecircncias geacutenicas de PEPB em vaacuterias raccedilas bovinas
N
Frequecircncias geacutenicas N PEPB1 PEPB2 Referecircncia
Barrosatilde inscrita 141 - 100 Este trabalho
Barrosatilde natildeo inscrita 153 - 100 t i
Minhota 62 001 plusmn0003 099 plusmn 0003 ec
Blonde dAquitaine 13 - 100 DEL LAMAetal 1992)
Charolesa 118 - 100 laquo
Chianina 83 014 plusmn003 086 plusmn 003 t t
Hereford 79 - 100 et
Frisia 125 - 100 t t
Jersey 139 - 100
Limousine 24 - 100
Marchigiana 85 011 plusmn002 089 plusmn 002 te
Simmental 75 - 100 t t
54
Resultados e Discussatildeo
bull DIA
Pela anaacutelise da tabela 332 verifica-se natildeo existir variaccedilatildeo geneacutetica neste locus nas
raccedilas bovinas apresentadas estando fixado o alelo DIAS os resultados obtidos estatildeo de
acordo com os jaacute publicados por outros autores (GONZALEZ et ai 1987 IGLESIAS 1989) Por
outro lado nas populaccedilotildees de buacutefalos ocorre um segundo alelo DIAF com frequecircncias
entre 019 e 021
Tabela 332 Frequecircncias geacutenicas de DIA em vaacuterias populaccedilotildees de raccedilas bovinas e buacutefalos
Frequecircncias geacutenicas
N DIAF DIAS Referecircncia
Portugal
Barrosatilde inscrita 141
Barrosatilde natildeo inscrita 153
Minhota 62
Espanha
Cachena 71
Caldelana 60
Frieiresa 33
Limiana 39
Rubia Gallega 168
Vianesa 40
Sayaguesa (Zamora) 147
Morucha (Salamanca) 101
Alistana Sanabresa 157
Blanca Cacerena 62
Caacuterdena Andaluza 25
Asturiana de los Vallegraves 127
Asturiana de la Montana 106
Bulgaacuteria
Buacutefalo 122
Murrah (Buacutefalo) 51
raquo IGLESIAS (1989)
- 100 Este trabalho
- 100
- 100 a
- 100 IGLESIAS (1989)
- 100
- 100
- 100
- 100
- 100
- 100 GONZALEZ et al (19
- 100
- 100 st
- 100 st
- 100
- 100
- 100
019 + 00 081 plusmn00 MAKAVEEV(1984
021 plusmn00 079 plusmn 00 laquo
55
Resultados e Discussatildeo
bull HB
Os resultados obtidos no estudo de HB permitiram distinguir dois fenoacutetipos definidos
por dois alelos HBA e HBB (tabela 333)
Tabela 333 Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica de HB em populaccedilotildees das raccedilas Barrosatilde e Minhota Os valores esperados de acordo com o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg estatildeo indicados entre parecircntesis
Fenoacutetipos N HBA HBAB HBB
Barrosatilde inscrita 141 141
Barrosatilde natildeo inscrita 153 153
Minhota 62 56 6 0
(561) (58) (01)
As frequecircncias geacutenicas das raccedilas estudadas bem como outras jaacute publicadas referentes a
vaacuterias raccedilas bovinas europeias e a duas espeacutecies de buacutefalos encontram-se discriminadas na
tabela 334
A elevada frequecircncia do alelo HBA nas raccedilas estudadas (fixado na raccedila Barrosatilde)
situam-nas juntamente com outras raccedilas bovinas do centro e sul da Europa onde este alelo
ocorre com frequecircncias entre 080-098 (VICENTE 1978) Nas restantes raccedilas europeias
HBA ocorre com uma ampla margem de variaccedilatildeo (038 - 100) apresentando-se quase
sempre como o alelo mais frequente
No caso dos buacutefalos observa-se uma inversatildeo nos valores das frequecircncias geacutenicas
sendo o alelo HBB o mais frequente
A presenccedila de HBB nos bovinos europeus apesar de em baixa frequecircncia pode ser
indicativo de uma origem a partir de raccedilas asiaacuteticas ou africanas jaacute que eacute nestes continentes
que este alelo ocorre com frequecircncia mais elevadas as frequecircncias geacutenicas mais elevadas estatildeo
descritas no gado zebu da Aacutefrica (BRAEND 1971 VICENTE 1978)
56
Resultados e Discussatildeo
Tabela 334 Frequecircncias geacutenicas de HB em vaacuterias populaccedilotildees de raccedilas bovinas e buacutefalos
N
Frequecircncias geacutenicas
N HBA HBB Referecircncia
Portugal
Barrosatilde inscrita 141 100 - Este trabalho
Barrosatilde natildeo inscrita 153 100 -
Minhota 62 095 plusmn 002 005 plusmn 002
Mertolenga 147 093 plusmn 002 007 plusmn 002 KTOD et ai (1980)
Alentejana 155 096 plusmn 001 004 plusmn001 IacuteIacute
Mirandesa 107 099+001 001 plusmn001 NOBRE (S data)
Espanha
Cachena 71 091 + 002 009 plusmn 002 IGLESIAS (1989)
Caldelana 60 097 plusmn 002 003 plusmn 002
Frieiresa 33 095 plusmn 003 005 plusmn 003
Limiana 39 090 plusmn 003 010 plusmn003
Rubia Gallega 168 093 plusmn 001 007 plusmn001 ce
Vianesa 40 098 plusmn 002 002 plusmn002
Sayaguesa (Zamora) 147 083 plusmn002 017 plusmn002 GONZALEZ et al ( 1987)
Morucha (Salamanca) 101 084 plusmn 003 016 plusmn003 ce
Alistana Sanabresa 157 099 plusmn 001 001 plusmn001
Blanca Cacerefia 62 071 plusmn 004 029 plusmn 004 laquo
Caacuterdena Andaluza 25 096 plusmn 003 004 plusmn 003 IacuteIacute
Asturiana de los Vallegraves 127 091 plusmn002 009 plusmn002
Pirenaica 383 084 plusmn 001 016 plusmn001 VICENTE (1978)
Tudanca 42 065 plusmn 005 035 plusmn 005 laquo
Morena del N O 25 100 -
Frisona 97 100 - laquo
Asturiana de la Montaria 106 079+003 021 plusmn003
De Lidia 124 079 plusmn 003 021 plusmn003 KlDDeacutetal (1980)
Retinta 164 081 plusmn002 019 plusmn002
Itaacutelia
Chianina 264 096 plusmn 001 004 plusmn 001 CARENZiera (1970)
Marchigiana 112 099 plusmn001 001 plusmn001
Bulgaacuteria
Sofia Brown 173 089 plusmn 002 011 plusmn002 MAKAVEEV (1970)
Buacutefalo 77 009 plusmn 002 091 plusmn002 MAKAVEEV(1984)
Murrah (Buacutefalo) 51 015 plusmn004 085 plusmn 004 ce
G Bretanha
Jersey 467 038 plusmn 002 062 plusmn 002 LARSENefa (1974)
in IGLESIAS (1989)
57
Resultados e Discussatildeo
A frequecircncia obtida para HBB na raccedila Minhota (005) aproxima-a das raccedilas do sul da
Europa onde este alelo ocorre com uma frequecircncia de aproximadamente 01 Por outro lado a
completa ausecircncia de HBB na raccedila Barrosatilde eacute um resultado interessante mas para o qual natildeo
eacute possiacutevel fornecer actualmente uma explicaccedilatildeo satisfatoacuteria
CAII
A distribuiccedilatildeo dos fenoacutetipos observados para o locus CAII apresenta-se na tabela
335
Tabela 335 Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica de CAU em populaccedilotildees das raccedilas Barrosatilde e Minhota Entre parecircntesis indicam-se os valores esperados de acordo com o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg
Fenoacutetipos N CA F CAFS CAS
Barrosatilde inscrita 141 17 58 66
(149) (622) (639)
Barrosatilde natildeo inscrita 153 20 71 62
(200) (710) (620)
Minhota 62 3 13 46
(14) (162) (444)
x2
0651 1 0420
0000 1 0995
Os valores do teste de 2 nas populaccedilotildees de raccedila Barrosatilde demonstram natildeo haver
desvios significativos ao equiliacutebrio de Hardy-Weinberg apesar de se observar um ligeiro
excesso de homozigoacuteticos F na populaccedilatildeo de raccedila Barrosatilde (inscrita) Para a raccedila Minhota natildeo
foi possiacutevel testar o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg
Na tabela 336 apresentam-se as frequecircncias geacutenicas de CAII nas populaccedilotildees
estudadas bem como as publicadas por outros autores
O locus CAII apresenta-se polimoacuterfico na maior parte das populaccedilotildees bovinas
europeias sendo o alelo CAIIS o que ocorre com frequecircncia mais elevada
58
Resultados e Discussatildeo
Tabela 336 Frequecircncias geacutemeas de CAU em vaacuterias populaccedilotildees de raccedilas bovinas e de buacutefalos
N
Frequecircncias geacutenicas N CAS CAF Referecircncia
Portugal
Barrosatilde inscrita 141 068 plusmn 003 032 plusmn 003 Este trabalho
Barrosatilde natildeo inscrita 153 064+003 036 plusmn 003
Minhota 62 085 plusmn 003 015+003 Iacute Iacute
Mertolenga 147 085 plusmn 002 015+002 Kn)Deiacutea(1980)
Alentejana 155 091 plusmn 002 009 plusmn 002
Mirandesa 107 099 + 001 001+001 NOBRE (S data)
Espanha
Cachena 71 077 + 004 023 plusmn 004 IGLESIAS (1989)
Caldelana 60 096 plusmn 002 004 plusmn 002 ce
Frieiresa 33 094 + 003 006 plusmn 003
Limiana 39 083 + 004 017 plusmn 004
Rubia Gallega 168 089 plusmn 002 011+002
Vianesa 40 086 + 004 014 plusmn 004
Sayaguesa 147 072 plusmn 003 028+003 GONZALEZ eacutetal (1987)
Morucha 101 072 plusmn 003 028 plusmn 003 a
Alistana Sanabresa 157 092 plusmn 002 008+002 iacute iacute
Blanca Cacerena 62 067 plusmn 004 033 plusmn 004 IacuteIacute
Caacuterdena Andaluza 25 100
Asturiana de los Vallegraves 127 087 plusmn 002 013+002 laquo
Asturiana de la Montaria 106 077 plusmn003 023 plusmn 003 IacuteIacute
Tudanca 42 076 plusmn 005 024 plusmn 005 VICENTE (1978)
Morena del NO 25 092 plusmn 004 008 plusmn 004
De Lidia 124 061+003 039 plusmn 003 KjDDetal (1980)
Retinta 164 065 + 003 035+003 iacuteiacute
Bulgaacuteria
Buacutefalo 263 007 + 001 093+001 MAKAVEEV(1984)
Murran (Buacutefalo) 51 020 plusmn 004 080 plusmn 004 laquo
Alemanha
Frisia 550 083 plusmn 001 017 + 001 THTNNES eacutetal (1976)
Suiacuteccedila
Simmental 1039 079 + 001 021+001 KAgraveSTLIeacutetal (1980)
Castanha Suiacuteccedila 546 087 plusmn 001 013+001
Friburg 223 084 + 002 016+002
in IGLESIAS (1989)
59
Resultados e Discussatildeo
As frequecircncias aleacutelicas de CAIPS e CAIPF nas raccedilas Cachena espanhola e Barrosatilde
portuguesa satildeo idecircnticas o que poderaacute eventualmente indicar estar-se em presenccedila de uma soacute
raccedila com designaccedilotildees diferentes nos dois paiacuteses Esta hipoacutetese eacute reforccedilada pelo facto de natildeo
haver diferenccedilas significativas entre dados morfomeacutetricos obtidos nas duas raccedilas (LEAL 1995)
Nos buacutefalos observa-se mais uma vez uma inversatildeo nas frequecircncias dos dois alelos do
locus CAII em relaccedilatildeo aos bovinos sendo CAF o mais frequente com valores situados entre
080 e 093
bull NP
Pela anaacutelise das tabelas 337 e 338 verifiacuteca-se a presenccedila dos dois alelos descritos
neste locus nas vaacuterias raccedilas bovinas sendo NPL o mais frequente nas raccedilas europeias (052 e
099) Observa-se uma grande similaridade entre os valores das frequecircncias geacutenicas o que natildeo
permite diferenciar as raccedilas estudadas neste trabalho das restantes
Tabela 337 Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica de NP em populaccedilotildees das raccedilas Barrosatilde e Minhota
N
Fenoacutetipos
N NP H NPL
Barrosatilde inscrita 141 69 72
Barrosatilde natildeo inscrita 153 55 98
Minhota 62 19 43
60
Resultados e Discussatildeo
Tabela 338 Frequecircncias geacutenicas para NP em vaacuterias populaccedilotildees e raccedilas bovinas
N
Frequecircncias geacutenicas
N NPH NPL Referecircncia
Portugal
Barrosatilde inscrita 141 029 plusmn 003 071 plusmn 003 Este trabalho
Barrosatilde natildeo inscrita 153 020 plusmn 002 080 plusmn 002 cc
Minhota 62 017 + 004 083 + 004
Espanha
Cachena 71 020 plusmn 003 080 plusmn 003 IGLESIAS (1989)
Caldelana 60 013+003 087 plusmn 003 t t
Frieiresa 33 011+004 089 plusmn 004
Limiana 39 008 plusmn 003 092 plusmn 003
Rubia Gallega 168 015+002 085 plusmn 002
Vianesa 40 013 + 004 087 plusmn 004 t i
Sayaguesa 147 014 + 002 086 plusmn 002 GONZALEZ et ai ( 1987)
Morucha 101 020 plusmn 003 080 plusmn 003
Alistana Sanabresa 157 001+001 099 + 001
Blanca Cacerena 62 048 plusmn 005 052 plusmn 005 laquo
Caacuterdena Andaluza 25 004 plusmn 003 096 plusmn 003 IacuteIacute
Asturiana de los Vallegraves 127 028 plusmn 003 072 plusmn 003
Asturiana de la Montana 106 026 plusmn 003 074 plusmn 003
Beacutelgica
Charolesa 130 026 plusmn 003 074 + 003 ANSAY amp HANSET (1972)
Frisia 91 006 plusmn 002 094 plusmn 002 t t
in IGLESIAS (1989)
MPI
A distribuiccedilatildeo dos fenoacutetipos observados para o locus MPI apresenta-se na tabela 339
Das trecircs populaccedilotildees estudadas apenas a raccedila Minhota apresenta valores observados
proacuteximos dos valores esperados segundo o formalismo de Hardy-Weinberg Por outro lado
apesar de natildeo ter sido possiacutevel testar o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg nas restantes populaccedilotildees
a aparente diferenccedila entre valores observados e esperados poderaacute dever-se a um excesso de
indiviacuteduos homozigoacuteticos para MPIC Este resultado poderaacute estar relacionado com o
processo de amostragem ou com outras causas como o acasalamento entre indiviacuteduos
61
Resultados e Discussatildeo
aparentados a existecircncia de sub-populaccedilotildees de tamanho pequeno ou ainda a um reduzido
nuacutemero de machos reprodutores
Tabela 339 Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica de MPI em populaccedilotildees das raccedilas Barrosatilde e Minhota Entre parecircntesis indicam-se os valores esperados de acordo com o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg
Fenoacutetipos N MPIA MPIAB MPIAC MPIB MPIBC MPIC
Barrosatilde inscrita 138 - - - 131 6 1
(1301) (78) (01)
Barrosatilde natildeo inscrita 1 5 2 - - - 147 4 1
(1460) (59) (01)
Minhota 61 0 3 0 56 2 0
(00) (29) (01) (561) (19) (00)
A anaacutelise da tabela 3310 permite verificar que MPIB e MPIC ocorrem nas duas
raccedilas de bovinos estudadas sendo MPIB o alelo mais comum nas trecircs populaccedilotildees A
ocorrecircncia de MPI A na raccedila Minhota contraria o descrito por ANSAY (1973) quando afirma
a exclusividade do fenoacutetipo AB na raccedila Charolesa
Tabela 3310 Frequecircncias geacutenicas de MPI nas populaccedilotildees estudadas
N
Frequecircncias geacutenicas
N MPPA MPPB MPIC
Barrosatilde inscrita 138 - 097 + 001 003+001
Barrosatilde natildeo inscrita 152 - 098 + 001 002+001
Minhota 61 002 plusmn 001 096 plusmn002 002 plusmn 001
A informaccedilatildeo disponiacutevel sobre este marcador em anteriores trabalhos de anaacutelise
geneacutetica em bovinos eacute quase inexistente Tal poderaacute dever-se agraves dificuldades de visualizaccedilatildeo
encontradas na sua fenotipagem por electroforese convencional A detecccedilatildeo de MPI estaacute
descrita em tecidos musculares e em leucoacutecitos neste trabalho utilizaram-se eritroacutecitos para o
estudo de variaccedilatildeo geneacutetica desta proteiacutena mas eacute provaacutevel que a sua expressatildeo ocorra apenas
na fracccedilatildeo leucocitaacuteria (natildeo separada) o que explicaria precisamente a sua fraca actividade
62
Resultados e Discussatildeo
ALB
A distribuiccedilatildeo dos fenoacutetipos observados para o locus ALB apresenta-se na tabela
3311
Apesar de natildeo ter sido possiacutevel testar o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg todas as
amostras estudadas mostram desvios muito reduzidos entre valores observados e esperados
Tabela 3311 Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica de ALB em populaccedilotildees das raccedilas Barrosatilde e Minhota Entre parecircntesis indicam-se os valores esperados de acordo com o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg
N
Fenoacutetipos N ALBA ALBAB ALBB ALBBV ALBAV ALB V
Barrosatilde inscrita 142 137 3 - - 2 -(1370) (30) (00) (00) (20) (00)
Barrosatilde natildeo inscrita 153 145 5 1 - 2 -(1440) (68) (01) (01) (20) (00)
Minhota 62 59
(590)
3 (30) (00)
Na tabela 3312 estatildeo discriminadas as frequecircncias geacutenicas estimadas para as
populaccedilotildees estudadas bem como as de outras populaccedilotildees de bovinos da Europa e de buacutefalos
da Bulgaacuteria
Verifica-se que ALBA eacute o alelo mais comum encontrando-se aparentemente fixado
em vaacuterias raccedilas bovinas de origem europeia
Como jaacute referido para HB a presenccedila de ALBB nas raccedilas europeias parece
relacionar-se com a sua localizaccedilatildeo geograacutefica verificando-se que de uma maneira geral a sua
frequecircncia aumenta agrave medida que nos aproximamos do sul da Europa e de Aacutefrica eacute no gado
zebu africano que este alelo ocorre com frequecircncias mais elevadas variando entre 030 e 060
(VICENTE 1978) Assim a presenccedila de ALBB no gado europeu poderaacute indicar a passagem
pela Europa de bovinos oriundos de Aacutefrica (CECCHINI amp Nus 1986) Eacute de notar que apenas a
raccedila Minhota e algumas das restantes raccedilas da Peniacutensula Ibeacuterica natildeo apresentam ALBB
63
Resultados e Discussatildeo
Tabela 3312 Frequecircncias geacutenicas de ALB em vaacuterias populaccedilotildees de raccedilas bovinas e em buacutefalos
Frequecircncias geacutenicas
N ALBA (F) ALBB (S) ALBV Referecircncia
Portugal
Barrosatilde inscrita 142 098 + 001 001 plusmn 001 001 plusmn001 Este trabalho
Barrosatilde natildeo inscrita 153 097 + 001 002+001 001 plusmn001
Minhota 62 098 plusmn 001 - 002 plusmn 001
Mertolenga 147 084 plusmn 002 016 + 002 - KlDDetal (1980)
Alentejana 155 094+001 006 plusmn 001 -
Mirandesa 106 094 + 002 006 plusmn 002 - NOBRE (S data)
Espanha -
Cachena 71 098 + 001 002+001 - IGLESIAS (1989)
Caldelana 60 098 plusmn 001 002 + 001 -
Frieiresa 33 100 - - raquo
Limiana 39 097 + 002 003 plusmn 002 -
Rubia Gallega 201 099 plusmn 000 001 plusmn000 -
Vianesa 40 093 + 003 007 + 003 -
Sayaguesa 147 096 plusmn001 004 plusmn 001 - GONZALEZ et al (1987)
Moracha 101 089 plusmn 002 011+002 -
Alistaria Sanabresa 157 090 plusmn 002 010 plusmn002 -
Blanca Cacerena 62 056 plusmn 005 044 plusmn 005 -
Caacuterdena Andaluza 25 100 - -
Asturiana de los Vallegraves 127 099 + 001 001 plusmn001 -
Asturiana de la Montana 106 099 plusmn001 001 plusmn001 -
Pirenaica 265 092 + 001 008 plusmn001 - VICENTE (1978)
Tudanca 42 100 - -
Morena del N O 25 092 + 004 008 plusmn 004 -
Frisona 97 100 - -
De Lidia 124 100 - - KIDDeacutetal (1980)
Retinta 164 097 + 001 003 plusmn001 -
Itaacutelia
Chinina 264 089 + 001 011 plusmn001 - CARENZIeacutetal (1970)
Marchigiana 124 074 + 003 026 plusmn 003 -
Beacutelgica
Pied vermelha Este-Flandern 503 100 - - BOUQUET amp VAN de WEGHE (1972)
Vermelha Oeste-Flandern 155 100 - -
Pied preta 174 100 - -
Pied vermelha-Campine 265 100 - -
w IGLESIAS (1989)
(Continua)
64
Resultados e Discussatildeo
Tabela 3312 Frequecircncias geacutenicas de ALB em vaacuterias populaccedilotildees de raccedilas bovinas e de buacutefalos (continuaccedilatildeo)
Frequecircncias geacutenicas N ALBA (F) ALBB (S) ALBV Referecircncia
Bulgaacuteria
Sofia Brow 170 096+001 004 + 001 - M A K A V E E V ( 1 9 7 0 )
Buacutefalo 225 047 plusmn 002 053 plusmn 002 - M A K A V E E V ( 1 9 8 4 )
Murrah (Buacutefalo) 76 012+003 088 plusmn 003 -
G Bretanha
Charolesa 99 084 plusmn 003 016 + 003 - SPOONER amp OLIVER (1969)
Frisia 1422 100 - -
Hereford 215 099 plusmn 001 001+001 -
Jersey 217 100 - -
laquo IGLESIAS (1989)
Neste trabalho descreve-se tambeacutem o alelo ALBV com uma frequecircncia de 001 e
002 nas raccedilas Barrosatilde e Minhota respectivamente Este alelo natildeo se encontra descrito em
qualquer raccedila europeia podendo a sua detecccedilatildeo estar relacionada com a capacidade resolvente
da teacutecnica de focagem isoeleacutectrica utilizada na separaccedilatildeo de ALB
TF
A transferrina eacute provavelmente o mais informativo dos sistemas polimoacuterficos estudados
em virtude do nuacutemero de alelos que apresenta
A distribuiccedilatildeo dos fenoacutetipos observados para o locus TF apresenta-se na tabela 3313
E possiacutevel verificar a existecircncia de equiliacutebrio de Hardy-Weinberg em todas as populaccedilotildees
estudadas
Da anaacutelise das frequecircncias geacutenicas expressas na tabela 3314 verifica-se que este locus
apresenta quatro produtos geacutenicos na maioria das raccedilas europeias sendo os alelos TFA e
TFD (incluindo os subtipos TFD1 e TFD2) os que apresentam frequecircncias mais elevadas
(027 a 092 para o alelo TFA e 026 a 073 para o alelo TFD)
Observa-se tambeacutem que a frequecircncia de TFD2 nas raccedilas estudadas eacute mais elevada do
que a de TFD1 como ocorre na maioria das raccedilas ibeacutericas
65
Resultados e Discussatildeo
No que se refere a TFE verifica-se que a sua frequecircncia eacute relativamente baixa nas
raccedilas europeias (001 e 022) e estaacute mesmo ausente em quase todas as raccedilas da regiatildeo da
Galiza (com excepccedilatildeo da raccedila Cachena espanhola e Rubia Gallega) e na raccedila Minhota Note-se
a grande semelhanccedila entre os valores de frequecircncias geacutenicas deste alelo na raccedila Cachena
espanhola (005) e nas populaccedilotildees de raccedila Barrosatilde (004 e 003) o que mais uma vez sugere
uma grande proximidade entre as duas Apesar de ocorrer em baixa frequecircncia nos bovinos
europeus a presenccedila de TFE nestas raccedilas pode indicar uma proveniecircncia asiaacutetica ou africana
pois eacute nestes continentes que aquele alelo eacute mais comum (BRAEND 1971)
66
Resultados e Discussatildeo
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Resultados e Discussatildeo
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68
Resultados e Discussatildeo
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69
Resultados e Discussatildeo
bull GC
A distribuiccedilatildeo dos fenoacutetipos observados para o locus GC apresenta-se na tabela 3315
A sua anaacutelise permite verificar a existecircncia de diferenccedilas entre os valores observados e
esperados para raccedila Barrosatilde (populaccedilatildeo inscrita no Livro Genealoacutegico) Este desvio ao
equiliacutebrio de Hardy-Weinberg deve-se agrave existecircncia de um excesso de homozigoacuteticos
sugerindo assim a ocorrecircncia de uma possiacutevel subestruturaccedilatildeo na populaccedilatildeo
Nas restantes amostras estudadas natildeo foi possiacutevel aplicar o teste de Contudo a
diferenccedila entre valores observados e esperados de acordo com o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg
eacute praticamente inexistente na populaccedilatildeo Barrosatilde natildeo inscrita e pouco acentuada na raccedila
Minhota
Tabela 3315 Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica de GC em populaccedilotildees das raccedilas Barrosatilde e Minhota Entre parecircntesis indicam-se os valores esperados de acordo com o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg
Fenoacutetipos N GCS GCFS GCF
Barrosatilde inscrita 142 98 35 8
(945) (419) (45)
Barrosatilde natildeo inscrita 153 109 40 4
(1087) (406) (37)
Minhota 62 54 5 3
(514) (101) (04)
x2
3913 1 0048
A distribuiccedilatildeo das frequecircncias geacutenicas apresentada na tabela 3316 mostra que GCS eacute
o alelo mais comum nas raccedilas europeias (com excepccedilatildeo da raccedila Frisia da Sueacutecia) As raccedilas
estudadas neste trabalho tecircm frequecircncias aleacutelicas para este locus que as aproximam das raccedilas
espanholas
70
Resultados e Discussatildeo
Tabela 3316 Frequecircncias geacutenicas de GC em vaacuterias populaccedilotildees de raccedilas bovinas
Frequecircncias geacutenicas
N GCF(ouA) GCS(ouB) GCC Referecircncia
Portugal
Barrosatilde inscrita
Barrosatilde natildeo inscrita
Minhota
Alentejana
Mirandesa
Espanha
De Lidia
Frisona
Beacutelgica
Branca e azul
Flemish vermelha
Campine vermelha e branca
Preta e branca
Flemish branca e vermelha
Sueacutecia
Vermelha e Branca
Frisia
141 018 plusmn0023
153 016 plusmn002
62 009 plusmn 003
028 plusmn 004
97 020 plusmn 003
1306 008 plusmn001
124 015 plusmn002
2323 031 plusmn001
431 016 plusmn001
299 012 plusmn001
299 019 plusmn002
140 006 plusmn 001
1030 039 plusmn001
273 079 plusmn 002
082 plusmn 002
084 plusmn 002
091 plusmn003
072 plusmn 004
080 plusmn 003
092 plusmn 001
085 plusmn 002
069 plusmn 001
084 plusmn 001
088 plusmn 001
081 plusmn002
065 plusmn 003
061 plusmn001
021 plusmn002
029 plusmn 003
Este trabalho
CUNHA (1994)
NOBRE (S data)
PIEDRAFUA et ai (1984)
VAN de WEGHE et ai (1982)
GAHNE(1963)
in PIEDRAFUA et ai (1984)
71
Resultados e Discussatildeo
34 - ANAacuteLISE POPULACIONAL CONJUNTA
341 - Diversidade geneacutetica na raccedila Barrosatilde
As estimativas da variabilidade geneacutetica das populaccedilotildees de bovinos das raccedilas Barrosatilde e
Minhota efectuaram-se considerando apenas 6 loci polimoacuterficos HB CAII MPI ALB TF e
GC
Tabela 341 Estimativa da variabilidade geneacutetica (6 loci) atraveacutes dos valores de heterozigotia observada (Ho) e esperada (He) nas populaccedilotildees estudadas
Barrosatilde inscrita Barrosatilde natildeo inscrita Minhota Locus
Ho He Ho He Ho He
HB 0000 0000 0000 0000 0097 0093
CAH 0411 0441 0464 0464 0210 0262
MPI 0043 0056 0026 0039 0082 0080
ALB 0035 0035 0046 0058 0048 0048
TF 0603 0590 0556 0595 0694 0638
GC 0248 0297 0261 0265 0081 0163
Os resultados expressos na tabela 341 mostram em geral a ausecircncia de diferenccedilas
significativas entre os valores de heterozigotia observada (Ho) e heterozigotia esperada (He)
para os loci estudados Deve contudo notar-se que na raccedila Minhota e quanto ao locus GC o
valor de He eacute aproximadamente o dobro da Ho Nos restantes loci o ligeiro desvio observado
entre Ho e He sugere em geral um deacutefice de heterozigoacuteticos
Nas duas populaccedilotildees de raccedila Barrosatilde os sistemas TF e CAII satildeo os que apresentam
valores de heterozigotia mais elevados Pelo contraacuterio os loci MPI e ALB mostram valores de
heterozigotia baixos possivelmente devido ao excesso de homozigoacuteticos (MPI B e ALB A)
detectados nas trecircs populaccedilotildees
Na tabela 342 apresentam-se os valores do nuacutemero meacutedio de alelos por locus (ria)
percentagem de loci polimoacuterficos (P) heterozigotia meacutedia observada (Ho) e heterozigotia
esperada (He) nas populaccedilotildees de bovinos estudados Estes valores devem ser interpretados
72
Resultados e Discussatildeo
tendo em conta o facto de os 6 loci investigados serem polimoacuterficos em pelo menos uma
populaccedilatildeo
Tabela 342 Variabilidade geneacutetica detectada em trecircs populaccedilotildees de bovinos atraveacutes da anaacutelise de 6 loci polimoacuterficos N - efectivo meacutedio estudado por locus na - nuacutemero meacutedio de alelos por locus P - proporccedilatildeo de loci polimoacuterficos Ho - heterozigotia observada He - heterozigotia meacutedia esperada Entre parecircntesis indicam-se os valores do desvio padratildeo
Raccedila Populaccedilatildeo N na P Ho He
Barrosatilde inscrita 1407 233 833 0223 0237
(06) (042) (0100) (0100)
Barrosatilde natildeo inscrita 1528 233 833 0226 0237
(02) (042) (0098) (0101)
Minhota 618 233 1000 0202 0214
(02) (021) (0101) (0090)
A sua anaacutelise permite verificar em primeiro lugar a ocorrecircncia de uma grande
semelhanccedila entre os valores de H nas duas raccedilas estudadas Barrosatilde e Minhota revelando a
existecircncia de uma variabilidade geneacutetica idecircntica nas trecircs populaccedilotildees de bovinos Observa-se
tambeacutem que os valores de heterozigotia meacutedia observada (Ho) natildeo diferem significativamente
dos valores de heterozigotia esperados (He) nas trecircs populaccedilotildees sendo o valor mais elevado o
encontrado na populaccedilatildeo de raccedila Barrosatilde (237)
Os elevados valores de P (833 na raccedila Barrosatilde e 100 na raccedila Minhota) resultam
do facto de apenas se terem utilizado loci polimoacuterficos nesta anaacutelise e o nuacutemero meacutedio de
alelos por locus (na) eacute igual nas trecircs populaccedilotildees estudadas (233)
A tabela 343 apresenta estimativas de FB Frr e FST para as trecircs populaccedilotildees de
bovinos Os valores de Fis indicam a existecircncia de uma acentuada deficiecircncia de
heterozigoacuteticos nos loci MPI e GC Nos restantes loci verifica-se por um lado a tendecircncia
para um excesso de heterozigoacuteticos nos loci HB e TF (com valores de -0051 e -0021
respectivamente) e por outro lado para uma ligeira deficiecircncia de heterozigoacuteticos nos loci
CAII e ALB (com valores de 0066 e 0072 respectivamente) A meacutedia ponderada de FiS
mostra uma deficiecircncia de heterozigoacuteticos de 48
73
Resultados e Discussatildeo
Tabela 343 Distribuiccedilatildeo relativa da diversidade geneacutetica nas trecircs populaccedilotildees de bovinos Hs-heterozigotia intrapopulacional HT-heterozigotia total Valores das estatiacutesticas F para 6 loci analisados
Locus H s Hx Fis FIT FST
HB 0030 0031 -0051 -0016 0033
CAII 0387 0404 0066 0104 0041
MPI 0058 0059 0130 0133 0004
ALB 0046 0047 0072 0075 0004
TF 0605 0627 -0021 0015 0036
GC 0241 0244 0183 0193 0012
Meacutedia 0228 0235 0048 0078 0031
As estimativas de FST indicam a existecircncia de um baixo grau de diferenciaccedilatildeo
populacional nos bovinos estudados Os valores de FST para os 6 loci analisados podem
considerar-se baixos (entre 0004 e 0041) apresentando uma meacutedia ponderada de 0031
Assim soacute uma pequena parte da diversidade geneacutetica (31) se deve a diferenccedilas entre as
populaccedilotildees sendo muito maior a diversidade dentro de cada populaccedilatildeo do que entre as
populaccedilotildees
Os baixos valores de FST encontrados para os loci MPI e ALB resultam de frequecircncias
elevadas de MPIB e ALBA respectivamente e traduzem uma grande homogeneidade entre
as raccedilas bovinas estudadas natildeo se detectando subestruturaccedilatildeo populacional
342 - Comparaccedilatildeo com outras raccedilas ibeacutericas
Tendo em conta o pequeno nuacutemero de loci comuns a este e a outros estudos
estimaram-se diferentes valores de heterozigotia meacutedia consoante o nuacutemero de loci de que se
dispunha Na tabela 344 e 345 apresentam-se valores de heterozigotia meacutedia para as
diferentes raccedilas obtidos a partir de quatro (FF) e cinco loci (FF+) respectivamente bem como
os valores de na P e os respectivos desvios padratildeo em vaacuterias raccedilas de bovinos ibeacutericos
A diversidade geneacutetica do bovino Barrosatilde avaliada pela taxa meacutedia de heterozigotia
(0281-0272 e 0249-0260 para 5 e 4 loci respectivamente) parece ocupar uma posiccedilatildeo
74
Resultados e Discussatildeo
intermeacutedia no seio das raccedilas ibeacutericas Tambeacutem o grau de variabilidade geneacutetica nos bovinos
avaliado por paracircmetros como o nuacutemero meacutedio de alelos por locus e a proporccedilatildeo de loci
polimoacuterficos (P) demonstra que as raccedilas estudadas neste trabalho ocupam uma posiccedilatildeo
intermeacutedia quando comparadas com outras raccedilas ibeacutericas
A anaacutelise das tabelas 344 e 345 mostra que todas as medidas de diversidade geneacutetica
(H P e de na) apresentam valores idecircnticos Esta semelhanccedila permite supor que o processo de
domesticaccedilatildeo iniciado haacute menos de 10000 anos natildeo levou a uma grande diferenciaccedilatildeo
geneacutetica entre as raccedilas pelo menos relativamente aos marcadores geneacuteticos estudados neste
trabalho Desta forma verifica-se que as principais diferenccedilas entre as raccedilas resultam de
pequenas alteraccedilotildees das suas frequecircncias geacutenicas provavelmente causadas pelo baixo nuacutemero
de animais destinados agrave reproduccedilatildeo (mais marcado nos machos) e pelos cruzamentos dirigidos
em cada raccedila
Por outro lado este baixo niacutevel de diferenciaccedilatildeo geneacutetica deveraacute estar tambeacutem
associado ao facto de na origem das raccedilas bovinas ibeacutericas se encontrar um uacutenico processo de
domesticaccedilatildeo seguido provavelmente de um processo de expansatildeo populacional bastante
recente do Proacuteximo Oriente ateacute agrave Europa Adicionalmente estima-se que a diferenciaccedilatildeo dos
bovinos em raccedilas autoacutectones soacute teraacute ocorrido nos uacuteltimos 300 anos (LOFTUS et ai 1994)
Neste contexto os eventuais estrangulamentos do efectivo populacional (bottleneck)
e efeitos de fundador ocorridos durante o periacuteodo inicial da domesticaccedilatildeo do gado bovino e
capazes de afectar de forma muito diferente vaacuterios nuacutecleos populacionais natildeo satildeo detectados
na Peniacutensula Ibeacuterica
75
Resultados e Discussatildeo
Tabela 344 Variabilidade geneacutetica em vaacuterias raccedilas de bovinos atraveacutes da anaacutelise de 4 loci polimoacuterficos N - efectivo meacutedio estudado por locus ria - nuacutemero meacutedio de alelos por locus P-- proporccedilatildeo de loci polimoacuterficos yent - heterozigotia meacutedia esperada Entre parecircntesis indicam-se os valores do desvio padratildeo
Raccedila Populaccedilatildeo N nbdquo P H +
Portugal
Barrosatilde inscrita 1410(00) 23 (05) 750 0249 (0135)
Barrosatilde natildeo inscrita 1530 (00) 23 (05) 755 0260(0135)
Minhota 620 (00) 20 (00) 1000 0216 (0094)
Mertolenga 1470 (00) 23 (03) 1000 0315 (0097)
Alentejana 1550(00) 23 (03) 1000 0239 (0123)
Mirandesa 1065 (03) 20 (00) 1000 0159(0110)
Espanha
Cachena 710 (00) 23 (03) 1000 0279(0111)
Caldelana 600 (00) 20 (00) 1000 0166 (0107)
Frieiresa 330 (00) 18(03) 750 0177(0112)
Limiana 390 (00) 20 (00) 1000 0246 (0087)
Rubia Gallega 1845(95) 25 (05) 1000 0215(0110)
Vianesa 400 (00) 20 (00) 1000 0221 (0087)
Sayaguesa 1470 (00) 23 (03) 1000 0320 (0094)
Morucha 1010(00) 23 (03) 1000 0361 (0084)
Alistaria Sanabresa 1570 (00) 23 (03) 1000 0213 (0104)
Blanca Cacerefia 618 (03) 20 (00) 1000 0377 (0078)
Caacuterdena Andaluza 250 (00) 15(03) 500 0131 (0106)
Asturiana de los Vallegraves 1265 (05) 23 (03) 1000 0237(0107)
Asturiana de la Montana 1060 (00) 23 (03) 1000 0280 (0088)
Tudanca 420 (00) 20 (04) 750 0321 (0109)
Morena del N O 250 (00) 18 (03) 750 0203 (0108)
Frisona 6540 (00) 18 (05) 500 0203 (0130)
De Lidia 1240 (00) 23 (03) 1000 0367(0135)
Retinta 1640 (00) 23 (03) 1000 0338 (0107)
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Resultados e Discussatildeo
Tabela 345 Variabilidade geneacutetica em vaacuterias raccedilas de bovinos atraveacutes da anaacutelise de 5 loci polimoacuterficos N - efectivo meacutedio estudado por locus na - nuacutemero meacutedio de alelos por locus P--proporccedilatildeo de loci polimoacuterficos H^ - heterozigotia meacutedia esperada Entre parecircntesis indicam-se os valores do desvio padratildeo
Raccedila Populaccedilatildeo N na P i r Portugal
Barrosatilde inscrita 1410 (00) 22 (04) 800 0281 (0109)
Barrosatilde natildeo inscrita 1530(00) 22 (04) 800 0272 (0105)
Minhota 620 (00) 20 (00) 1000 0229 (0074)
Espanha Cachena 710 (00) 22 (02) 1000 0289 (0087)
Caldelana 600 (00) 20 (00) 1000 0180 (0084)
Frieiresa 330 (00) 18 (02) 800 0180 (0087)
Limiana 390 (00) 20 (00) 1000 0226(0071)
Rubia Gallega 1812(81) 24 (04) 1000 0223 (0086)
Vianesa 400 (00) 20 (00) 1000 0374 (0168)
Sayaguesa 1470 (00) 22 (02) 1000 0305 (0074)
Morucha 1010 (00) 22 (02) 1000 0353 (0066)
Alistaria Sanabresa 1570 (00) 22 (02) 1000 0174 (0089)
Blanca Cacerefla 616 (02) 20(00) 1000 0402 (0065)
Caacuterdena Andaluza 250 (00) 16(02) 600 0120 (0083)
Asturiana de los Vallegraves 1266 (04) 22 (02) 1000 0270 (0089)
Asturiana de la Montaria 1060(00) 22 (02) 1000 0301 (0072)
343 - Diferenciaccedilatildeo geneacutetica
Nas tabelas 346 e 347 apresentam-se as distacircncias geneacuteticas de Nei (NEI 1978)
calculadas para 23 (4 loci HB CAII ALB e TF) e 15 (5 loci HB CAII ALB TF e NP)
raccedilas bovinas ibeacutericas respectivamente Da sua anaacutelise ressalta o facto de aqueles valores
serem na sua maioria bastante baixos
De entre as raccedilas bovinas ibeacutericas estudadas a Frisona e a Cachena demonstram estar
mais proacuteximas da raccedila Barrosatilde com valores de DNei de 0092 (4 loci) e de 0104 (5 loci)
respectivamente Por outro lado as raccedilas Asturiana de la Montana e Vianesa aparecem como
as mais diferenciadas DNei= 0334 (4 loci ) e Dgtjei= 0330 (5 loci) respectivamente
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Resultados e Discussatildeo
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Resultados e Discussatildeo
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80
Resultados e Discussatildeo
No que se refere agrave raccedila Minhota verifica-se que a Frieiresa eacute a que estaacute mais proacutexima
(valores de 0077 e 0074 para 4 e 5 loci respectivamente) e que mais um vez eacute a Asturiana de
la Montana a mais diferenciada das raccedilas (valores de 0389 e 0349 para 4 e 5 loci respectivamente)
A diferenciaccedilatildeo geneacutetica entre as raccedilas bovinas ibeacutericas encontra-se representada nos
dendrogramas construiacutedos pelos meacutetodos de agrupamento NJ (Neighbor-joining SATTOU amp
NEI 1987) e UPGMA (Unweightedpair-group arithmetic average SNEATH amp SOKAL 1973)
(figuras 341 342 343 e 344) Foram realizados testes de reamostragem do tipo
bootstrap (100 reacuteplicas) para a anaacutelise da consistecircncia dos padrotildees de ramificaccedilatildeo
apresentando-se os seus valores entre parecircntesis
A anaacutelise conjunta dos quatro dendrogramas permite verificar uma falta de consistecircncia
nos vaacuterios padrotildees de ramificaccedilatildeo para as raccedilas bovinas ibeacutericas associada a valores de
bootstrap em geral muito reduzidos De facto observa-se que o padratildeo de ramificaccedilatildeo dos
dendrogramas se altera consoante o meacutetodo de agrupamento usado e o nuacutemero de loci considerados Estas alteraccedilotildees nos agrupamentos das diferentes raccedilas devem-se
provavelmente agrave instabilidade causada pelo reduzido nuacutemero de loci polimoacuterficos utilizados
neste estudo bem como ao facto de as frequecircncias geacutenicas serem muito semelhantes em todas
as populaccedilotildees estudadas
Deve contudo referir-se que a raccedila Barrosatilde aparece normalmente associada a vaacuterias
raccedilas do norte da Peniacutensula Ibeacuterica nomeadamente a Cachena (Galiza) a Asturiana de la
Montana (Astuacuterias) a Sayaquesa e a Morucha (Salamanca)
No que se refere agrave raccedila Minhota esta aparece vaacuterias vezes associada agraves raccedilas Rubia
Gallega Frisona Asturiana de los Vallegraves e Frieiresa
81
Resultados e Discussatildeo
(18)
(14)
(11)
(5)
(3)
Sayaquesa
(39)
[32)
(21)1-
- -HsT
(49)
(1)
(3)
(18)
(8)
(13)1
(12)
19)
(16T
De Lidia
(99) Asturiana de la Montana
Tudanca bullMorucha
Cachena Barrosatilde mdashFrisona
Minhota -Asturiana de los Vallegraves Rubia Gallega
Frieiresa Alentejana
(65)
Mertolenga -Vianesa
Blanra Cacerefla
Retinta Linuacuteana
i (39)r
Mirandesa Caacuterdena Andaluza Morena NO
Caldelana Alistano Sanabresa
Figura 341 Dendrograma construiacutedo com base nas distacircncias geneacuteticas de NEI (1978) entre 23 raccedilas de bovinos (4 loci HBCAII ALB e TF) atraveacutes do meacutetodo de agrupamento NJ Os valores de probabilidade de ocorrecircncia de cada agrupamento obtidos atraveacutes de um teste de bootstrap indicam-se entre parecircntesis
82
Resultados e Discussatildeo
Morucha
Cachena Sayaquesa
Rubia Gallega Asturiana de los Vallegraves Freiresa
Frisona Minhota Alentejana Mertolenga
(43) ( 2 8 gt - ^ C a W e l a l
( iacute 7gtrl - Mirandesa L__ Alistano Sanabresa
Caacuterdena Andaluza Vianesa
Barrosatilde Retinta
De Lidia Tudanca
Asturiana de la Montana Morena NO Blanca Cacerena
Figura 342 Dendrograma construiacutedo com base nas distacircncias geneacuteticas de NEI (1978) entre 23 raccedilas de bovinos (4 loci HB CAII ALB e TF) atraveacutes do meacutetodo de agrupamento UPGMA Os valores de probabilidade de ocorrecircncia de cada agrupamento obtidos atraveacutes de um teste de bootstrap indicam-se entre parecircntesis
83
Resultados e Discussatildeo
(42)f
(30)1 I
(7)
2D
(23)1
I mdash l( 2 8 )
r
(49) r (23) r L
i4) I
(18) (23) bull
(28)
(55gt
-Caldelana Caacuterdena Andaluza
Alistano Sanabresa _ _ Rabia Galkga
Minhota Frieiresa
gt Asturiana de los Vallegraves
Asturiana de Ia Montana Barrosatilde
Sayaquesa mdashMorucha
Cachena Limiana
Blanca Cacerena Vianesa
Figura 343 Dendrograma construiacutedo com base nas distacircncias geneacuteticas de NEI (1978) entre 15 raccedilas de bovinos (5 loci HB CAII ALB TF e NP) atraveacutes do meacutetodo de agrupamento NJ Os valores de probabilidade de ocorrecircncia de cada agrupamento obtidos atraveacutes de um teste de bootstrap indicam-se entre parecircntesis
(21)
(18)
(100)
(55)
(15)T r i shyT
C a
(40) |_Caacute
Alistano Sanabresa
(37)
(61)
(46
(29)
^ o i j r mdash
Caldelana Caacuterdena Andaluza
Limiana Vianesa
Rubia Gallega Asturiana de los Vallegraves
(32j~
j2frTL
Frieiresa
Minhota Cachena Morucha
Sayaquesa
Barrosatilde bull Blanca Cacerena
Asturiana de la Montana
Figura 344 Dendrograma construiacutedo com base nas distacircncias geneacuteticas de NEI (1978) entre 15 raccedilas de bovinos (5 loci HB CAII ALB TF e NP) atraveacutes do meacutetodo de agrupamento UPGMA Os valores de probabilidade de ocorrecircncia de cada agrupamento obtidos atraveacutes de um teste de bootstrap indicam-se entre parecircntesis
84
Resultados e Discussatildeo
No seu conjunto estes resultados natildeo satildeo suficientes para o estabelecimento de uma
histoacuteria evolutiva das actuais raccedilas bovinas ibeacutericas nem para a separaccedilatildeo da raccedila Barrosatilde das
restantes Consequentemente natildeo eacute possiacutevel neste momento fazer corresponder a anaacutelise da
diversidade e estrutura geneacutetica das populaccedilotildees ibeacutericas de gado bovino com alguma das
hipoacuteteses evolutivas propostas por diversos autores com base em evidecircncia morfoloacutegica
(VALLEJO 1978 IGLESIAS 1989 CORDEIRO 1986 JORGE 1996)
De acordo com essa evidecircncia a raccedila Barrosatilde (e tambeacutem a Cachena) derivaria do
denominado tronco mauritaacutenico (Bos primigenius opisthonomus) ou seja de populaccedilotildees
originaacuterias do Norte de Aacutefrica que teriam passado para o sul da Peniacutensula Ibeacuterica alcanccedilando
mais tarde o Norte de Portugal e de Espanha Por outro lado a filiaccedilatildeo da raccedila Minhota
segundo JORGE (1996) deriva do tronco aquitacircnico (Bos primigenius primigenius) tal como a
maior parte das raccedilas da Galiza das Astuacuterias e dos Pirineacuteus
Embora os resultados apresentados neste trabalho pareccedilam de facto indicar que as
raccedilas Barrosatilde e Minhota derivam de troncos diferentes eacute necessaacuterio aprofundar de forma
muito consideraacutevel a investigaccedilatildeo sobre a estrutura geneacutetica das raccedilas bovinas ibeacutericas antes de
se poder formular conclusotildees mais sustentadas
85
Con8ideraccedil8es Finais
4 - CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
O trabalho desenvolvido nesta dissertaccedilatildeo permitiu o estudo de alguns sistemas
geneacuteticos polimoacuterficos jaacute descritos em bovinos (HB CAII NP MPI ALB TF e GC) nas
raccedilas Barrosatilde e Minhota Permitiu ainda a aplicaccedilatildeo de teacutecnicas de separaccedilatildeo electroforeacuteticas
mais eficazes em alguns desses sistemas
Vaacuterias limitaccedilotildees durante a execuccedilatildeo praacutetica deste trabalho obrigaram de alguma
forma a alteraccedilotildees no programa inicial Entre elas devem referir-se
1 a recolha de amostras de sangue mostrou-se difiacutecil e demorada sendo necessaacuteria a
coordenaccedilatildeo de esforccedilos de vaacuterias entidades (Direcccedilatildeo Regional de Agricultura de
Entre Douro e Minho e brigadas de Sanidade Animal locais) de veterinaacuterios e de
criadores de bovinos retirando tempo agrave execuccedilatildeo praacutetica do trabalho
2 a afinaccedilatildeo de vaacuterias teacutecnicas electroforeacuteticas para certos marcadores geneacuteticos
envolveu um consideraacutevel esforccedilo de investigaccedilatildeo
3 a impossibilidade de apurar atempadamente as teacutecnicas de separaccedilatildeo ou de
visualizaccedilatildeo para a amilase a ceruloplasmina e a poacutes-transferrina
4 a escassa bibliografia sobre o bovino Barrosatilde e sobre as teacutecnicas utilizadas neste
trabalho em gado bovino
Apesar das limitaccedilotildees considera-se que este trabalho se reveste de alguma importacircncia
pelo facto de constituir um contributo para a caracterizaccedilatildeo geneacutetica de uma raccedila bovina muito
peculiar A este respeito entendeu-se que numa primeira fase se procederia ao estudo de um
conjunto de proteiacutenas polimoacuterficas de forma a poder iniciar uma comparaccedilatildeo com outras raccedilas
bovinas nomeadamente ibeacutericas para as quais jaacute existem resultados publicados Por outro
86
Consideraccedilotildees Finais
lado o estabelecimento de um conjunto de teacutecnicas de fenotipagem dos loci considerados
permite desde logo a sua aplicaccedilatildeo em questotildees de identificaccedilatildeo individual e de anaacutelise da
paternidade
Eacute contudo evidente que o aprofundamento deste trabalho deveraacute necessariamente
evoluir na direcccedilatildeo da anaacutelise molecular da variaccedilatildeo geneacutetica Adicionalmente seraacute do maior
interesse alargar o domiacutenio de investigaccedilatildeo agraves restantes raccedilas bovinas autoacutectones
Em face do exposto entende-se ser possiacutevel definir trecircs linhas de investigaccedilatildeo para os
proacuteximos anos
1 - ampliaccedilatildeo da bateria de sistemas geneacuteticos polimoacuterficos detectados em proteiacutenas do
sangue e do leite
2 - anaacutelise da variabilidade geneacutetica de um conjunto de microssateacutelites se possiacutevel
associados a algumas das proteiacutenas polimoacuterficas jaacute descritas
3 - estudo do polimorfismo da moleacutecula de DNA-mitocondrial
De uma forma geral pode assim considerar-se que os principais objectivos definidos
no iniacutecio deste trabalho foram alcanccedilados pelo que se apresentam em seguida as conclusotildees
87
Conclusotildees
5 - CONCLUSOtildeES
A utilizaccedilatildeo de um sistema de focagem isoeleacutectrica permitiu detectar a existecircncia de
polimorfismo geneacutetico na hemoglobina distinguindo-se dois produtos geacutenicos na raccedila bovina
Minhota HBA e HBB Na raccedila Barrosatilde HBA foi o uacutenico produto geacutenico encontrado
A utilizaccedilatildeo de um sistema de focagem isoeleacutectrica permitiu a detecccedilatildeo de dois
produtos geacutenicos no locus CAII (CAIPF e CAIPS) e revelou-se mais eficaz de que as
teacutecnicas de separaccedilatildeo convencional em gel de amido
A investigaccedilatildeo realizada permitiu detectar a ocorrecircncia de polimorfismo geneacutetico de
MPI atraveacutes de um sistema electroforeacutetico em gel de amido tendo-se detectado trecircs produtos
geacutenicos (MPIA MPIB e MPIC) A fraca actividade de MPI e a grande dificuldade na
obtenccedilatildeo de um contraste de bandas adequado poderaacute dever-se ao facto de a sua expressatildeo soacute
ocorrer na fracccedilatildeo leucocitaacuteria do sangue
A aplicaccedilatildeo de um sistema de focagem isoeleacutectrica na presenccedila de ureia (8M) revelou-
-se muito eficaz na separaccedilatildeo de ALB e permitiu detectar pela primeira vez um novo variante
ALBV ligeiramente mais aciacutedico do que ALBA
A combinaccedilatildeo de uma teacutecnica de focagem isoeleacutectrica com um preacutevio tratamento das
amostras a fim de saturar a moleacutecula de TF com Fe permitiu a detecccedilatildeo de quatro produtos
geacutenicos (TF A TFD1 TFD2 e TFE) nas raccedilas estudadas
88
Conclusotildees
A combinaccedilatildeo de uma teacutecnica de focagem isoeleacutectrica com a detecccedilatildeo por
immunoblotting permitiu detectar dois produtos geacutenicos no locus GC (GCA e GCB) O
tratamento de amostras com neuraminidase permitiu a obtenccedilatildeo de padrotildees mais simples do
que os conseguidos com amostras nativas Esta simplificaccedilatildeo resulta da provaacutevel remoccedilatildeo de
aacutecidos siaacutelicos ligados agrave moleacutecula de GC
Natildeo se detectou nenhum caso de exclusatildeo na anaacutelise de segregaccedilatildeo de 27 pares
matildeefilho feita separadamente para cada locus
Verifiacutecou-se a presenccedila de dois alelos raros HBB e PEPB1 na raccedila Minhota Estes
alelos poderatildeo ser utilizados na distinccedilatildeo das duas raccedilas estudadas
Foi encontrado um valor de heterozigotia meacutedia de 0237 em populaccedilotildees de raccedila
Barrosatilde indicativo de uma variabilidade geneacutetica intermeacutedia em relaccedilatildeo agrave generalidade das
raccedilas ibeacutericas As diferenccedilas observadas entre as vaacuterias raccedilas ibeacutericas poderatildeo reflectir
fenoacutemenos histoacuterico-evolutivos muito recentes dada a sua proximidade e grande semelhanccedila
Foi observado um reduzido niacutevel de diferenciaccedilatildeo entre as raccedilas Barrosatilde e Minhota
(FST= 0031) demonstrando-se que a maior parte da diversidade geneacutetica se atribui a diferenccedilas
intrapopulacionais Este valor de FST pode considerar-se baixo quando comparado com o
obtido no estudo de outras espeacutecies animais sugerindo um elevado fluxo geacutenico
interpopulacional Por outro lado reflecte ainda uma histoacuteria demograacutefica muito recente
A utilizaccedilatildeo de meacutetodos de agrupamento NJ e UPGMA obtidos a partir de matrizes de
distacircncias geneacuteticas de Nei natildeo permitiu separar a raccedila Barrosatilde das restantes raccedilas ibeacutericas
89
Referecircncias Bibliograacuteficas
6 - REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
AMORIM A (1983) Contribuiccedilatildeo para o conhecimento da Geneacutetica Humana Estudo de Geneacutetica Bioquiacutemica
Formal e Populacional e de Ligaccedilatildeo Factorial Tese de Doutoramento Faculdade de Ciecircncias do
Porto
AMORIM A KOMPF J SCHUNTER F amp RITTER H (1982) Aminolevulinate dehydratase (EC42124)
Linkage analysis Hum Genet 61 48-49
ANSAY M (1973) Techniques microelectrophoretiques dans lanalyse de la multipliciteacute enzymatique chez les
bovins Deacutetection Eacutelectrophoreacutetique des Polymorphismes Biochimiques Chez les Mammifegraveres
Application a LEacutetude Geacuteneacutetique des Populations Centre National de la Recherche Scientifique
Paris 43-58
ARANA A pound amp ZARAGOZA P (1986) Nueva electroforetica dei enzima NADH-Diafrosa (DIA-2) detectada
en la espeacutecie Oryctolagus cuniculus (L) Zootecnia XXXV ndeg 7-12 125-130
ARAUacuteJO J (1986) Contribuiccedilatildeo para o estudo dos bovinos de raccedila Barrosatilde Relatoacuterio de estaacutegio da
licenciatura em Engenharia Zooteacutecnica Universidade dos Accedilores
ARNOLD I C J amp Bouw J (1989) A new allele of glucose phosphate isomerase in dogs Animal Genetics
20 217-220
ARRANZ J J BAYON Y amp SAN PRIMITIVO F (1992) Biochemical polymorphisms in Spanish Avilena-
-Negra Ibeacuterica cattle Animal Genetics 23 (suppl 1) 19
ARRANZ J J BAYON Y amp SAN PRIMITIVO F (1996) Comparison of protein markers and microsatellites in
differentiation of cattle populations Animal Genetics 27 415-419
ASHTON G C (1965) Cattle serum transferrins A balanced polymorphism Genetics 52 983-997
90
Referecircncias Bibliograacuteficas
BAINES J amp MEacuteLEK J (1980) Egipto - Deuses Templos e Faraoacutes Grandes Culturas e Civilizaccedilotildees Ciacuterculo
de Leitores
BELL K ARTHUR H amp ANDERSON I L (1994) Esterase and albumin polymorphism in the domestic cat
(Felis catus) XXIV International Conference on Animal Genetics Praga Julho 1994
BEKENEV V A amp ORLOVA G V (1991) Polymorphism of erytrocytic enzymes in Large White pig breeds in
Siberia Animal Genetics 22 (suppl 1) 23-24
BOWLING A T amp CLARK R S (1988) Excess of heacuteteacuterozygotes at albumin locus in American Standardbred
horses Animal Genetics 19 331-341
BOWLING A T GORDON L PENEDO M C T WICTUM E amp BEEBOUT J (1990) A single gel for
determining genetic of equine erythrocyte carbonic anhydrase (CA) and catalase (Cat) Animal
Genetics 21 191-197
BRADLEY D G MACHUGH D E CUNNINGHAM P amp LOFTUS R T (1996) Mitochondrial diversity and
the origins of African and European cattle Proceeding of the National Academy of Sciences of USA
93 5131-5135
BRAEND M (1971) Studies on the relationships between cattle breeds in Africa Asia and Europe Evidence
obtained by studies of blood groups and protein polymorphisms World Review of Animal Production
VIO (1) 10-14
BRAEND M (1988) Haemoglobin polymorphism in Norwegian Red Cattle Animal Genetics 19 59-62
BRAEND M NESSE 1 L amp EFREMOV G D (1988) Expression and genetics of caprine haemoglobins
Animal Genetics 18 223-231
BROWN L B KANE H amp AYRES H (1993) Vital signs WW Norton e Co pp 323 New York
CARTER D C HE X M MUNSON S EL TWIGG P D GERNERT K M BROOM M B amp MILLER T
Y (1989) Three dimensional structure of human serum albumin Science 244 1195-1198
CECCHINI G amp Nus M D (1986) Literature review on cattle blood polymorphisms and preliminary results
of analysis in East African Zebu in Ethiopia Agric Subtrop and Ttropicale 3 (80) 433-463
91
Referocircicias Bibliograacuteficas
CiacuteZovAacute D STRATIL A MULLER E amp CEPICA S (1993) A new partially deficient transferrin variant in
the pig Animal Genetics 24 305-306
CLARKE S W TUCKER E M amp OSTERHOFF D R (1989) Blood groups and biochemical polymorphism
in the Namaqua sheep breed Animal Genetics 20 279-286
CLUTTON-BROCK J (1992) Domestication of animals In Jomes S Martin R Pilbeam D (eds) The
Cambridge Encyclopedia of Human Evolution pp 380-385 Cambridge University Press
CORDEIRO J P (1986) As raccedilas bovinas em Portugal - Sua Origem O meacutedico veterinaacuterio I (1) 29-39
CRISTOFALO G Cozzi M C amp VALIATI P (1992) Identification of a new variant in the equine serum
alB-glycoprotein (A1B) system Animal Genetics 23 (suppl 1) 24
CUNHA L M (1994) Caracterizaccedilatildeo Morfo-Funcional e Geneacutetica da Raccedila Bovina Alentejana Trabalho de
fim de curso apresentado agrave Escola Superior Agraacuteria de Beja
DEL LAMA S N DEL LAMA M A MESTRINER M A amp MORTARI N (1992) Peptidase B polymorphism
in cattle erythrocytes Biochem Genet 30 247-255
DRATCH P TATE M KRAAY G J amp GERWING V (1992) Plasma proteins differentiating European red
deer and North American elk Animal Genetics 23 (suppl 1) 32
EGGEN A amp FRIES R (1995) An integrated cytogenetic and meiotic map of the bovine genome Animal
Genetics 26 215-236
ERHARDT G (1986) Transferrin variants in sheep separation and characterization by polyacrylamide gel
electrophoresis and isoelectric focusing Animal Genetics 17 343-352
ERHARDT G (1991) Genetic polymorphism of vitamin D binding protein and serum albumin in sheep
Animal Genetics 22 (suppl 1) 28-29
ERHARDT G amp SIMIANER H (1993) Linkage between the loci for serum albumin and vitamin D binding
protein (GC) in sheep Animal Genetics 24 301-303
EPSTEIN H amp MASON I L (1984) Cattle In Mason I L (ed) Evolution of domesticated animals pp 7-
-27 Longman
92
Referecircncias Bibliograacuteficas
FAO (1993) A diversidade da Natureza Um patrimoacutenio valioso Documento produzido pela FAO Divisatildeo de
informaccedilatildeo - Out de 1993 Veterinaacuteria Teacutecnica 10 10-12
FAO (1996) World Watch List for Domestic Animal Diversity 2a ediccedilatildeo FAOUNEP pp 334 Roma
FARNDALE B M HUBBARD D E amp ANDERSON L L (1992) A new PGD variant in New Zeland
Thoroughbred horses Animal Genetics 23 (suppl 1) 24
FELSENSTEIN J (1993) PHYLIP (Phylogeny Inference Package) Version 35 Distributed by the autor Seattle
University of Washington
FERNANDES M T S (1996) Raccedilas de bovinos autoacutectones Um importante recurso geneacutetico animal portuguecircs
a preservar e a defender Veterinaacuteria Teacutecnica 12 10-15
FERRAND N (1995) Variaccedilatildeo geneacutetica de proteiacutenas em populaccedilotildees de coelho (Oryctolagus cuniculus) -
- Anaacutelise da diferenciaccedilatildeo subespecifica subestruturaccedilatildeo expansatildeo geograacutefica e domesticaccedilatildeo
Dissertaccedilatildeo de Doutoramento em Biologia apresentada agrave Faculdade de Ciecircncias da Universidade do
Porto
FERRAND N amp ROCHA J (1991) Genetic polymorphism of serum albumin in wild rabbits populations
Animal Genetics 22 (suppl 1) 36
FORBES P MACKEITH B amp PEBERDY R (1986) Mamiacuteferos Ungulados e Lagomorfos Ciacuterculo de Leitores
FRIES R EGGEN A amp WOMACK J E (1993) The bovine genome map Mammalian Genome 4 405-428
GAHNE B(1963) Inherited variation in the post-albumin of cattle serum Hereditas 50126-135
GAHNE B JUNEJA R K amp GROLMUS J (1977) Horizontal polyacrylamine gel electrophoresis for the
simultaneous phenotyping of transferrin post-transferrin albumin and post-albumin in the blood
plasma of cattle Arum Bid Grps Biochem Genet 8127-137
GARCIA L S VICENTE M V BECERRA A L YEBRA F A RODRIcircGUES M F amp LOacutePEZ J M S
(1992) Razas Bovinas Autoacutectonas de Galicia - I Razas Morenas Galegas (Recursos Xeneacuteticos a
Conservar) Xunta de Galicia
GARCIA M ROSAacuteRIO J amp ANTUNES M (1981) Bovinos em Portugal Direcccedilatildeo dos Serviccedilos Veterinaacuterios -
- DGSV pp 44-78 Lisboa
93
Referecircncias Bibliograacuteficas
GLOWATZKI-MULLIS M L GAILLARD C WIGGER G amp FRIES R (1995) Microsatellite-based
parentage control in cattle Animal Genetics 26 7-12
GONCcedilALVES GARCIA M L (1964) A Raccedila Bovina Barrosatilde Boletim Pecuaacuterio n deg 1 Ano XXXII DGSP
pp 103-172 Lisboa
GONZALEZ P TUNON MJ amp VALLEJO M (1987) Genetic relationships between Spanish native breeds of
cattle Animal Genetics 18 249-256
HALL S B L COTHRAN E G amp KING J A (1991) Variability of manosephosphate isomerase (MPI)
from haemolysate in 14 horse breeds Animal Genetics 22 (suppl 1) 22
HARRIS H amp HOPKINSON D A (1976) Handbook of enzyme electrophoresis in human genetics North-
-Holland Publishers
HEMMER H (1990) Domestication The decline of environmental appreciation Cambridge University Press
HERZOG S (1988) Polymorphism and genetic control of erythrocyte 6-phosphogluconate dehydrogenase in
the genus Cervus Animal Genetics 19 291-294
HERZOG S (1989) Genetic polymorphism of transferrin in fallow deer Cervus dama L Animal Genetics 20
421-426
IGLESIAS A B (1989) Estrutura y relaciones geneacuteticas de razas bovinas mediante marcadores geneacuteticos
(Polimorfismos Bioquiacutemicos) Dissertaccedilatildeo de Doutoramento em Biologia apresentada agrave Faculdade de
Biologia da Universidade de Santiago
JAMIESON A (1965) The genetics of transferrins in cattle Heredity 20 419-441
JANZEN M K amp COTHRAN E G (1991) A new PGD variant from North American horses of feral origin
Animal Genetics 22 (suppl 1) 21-22
JORGE E S (1996) Bovinos da raccedila Minhota Contribuiccedilatildeo para a sua histoacuteria Veterinaacuteria Teacutecnica 10 10-
-18
94
Referecircncias Bibliograacuteficas
JUNEJA R K GAHNE B amp STRATIL A (1987) Polymorphic plasma postalbumins of some domestic
animals (pig Po2 horse XK and dog Pa proteins) identified as homologous Animal Genetics 18 119-
-124
JUNEJA R K KURYL J GAHNE B amp ZURKOWSKI M (1989) Linkage between the loci for transferrin
and ceruloplasmin in pigs Animal Genetics 20 307-311
KALAB P STRATIL A amp GLASNAacuteK V (1990) Genetic polymorphism of serum vitamin D-binding protein
(GC) in sheep and mouflon Animal Genetic 21 317-321
KAWAGUCHI T (1973) Polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of serum albumin into three
bands Clinica ChimicaActa 45 85-92
KIDD K K STONE W H CRIMELLA C CARENZI C CASATI M amp ROGNONI G (1980)
Immunogenetic and population genetic analyses of Iberian cattle Anim Blood Grps Biochem Genet
11 21-38
KRISTJANSSON F K (1963) Genetic control of two pre-albumins in pigs Genetics 48 1059-1063
KRISTJANSSON F K amp HICKMAN C G (1965) Subdivision of the allele TF D for transferrins in Holstein
and Ayrshire cattle Genetics 52 627-630
KUROSAWA Y amp TANAKA K (1988) Electrophoretic variants of serum transferrin in wild pig populations of
Japan Animal Genetics 19 31-35
LEAL C (1995) Apreciaccedilatildeo fenotiacutepica de um nuacutecleo de bovinos de raccedila Barrosatilde e amostragem para sua
caracterizaccedilatildeo geneacutetica Relatoacuterio de estaacutegio de licenciatura em Biologia - Ramo Cientiacutefico
Tecnoloacutegico em Ecologia e Recursos Zooloacutegicos Faculdade de Ciecircncias da Universidade do Porto
LITT M amp LUTTY J A (1989) A hipervariable microsatellite revealed by in vitro amplification of a
dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene American Jornal of Human Genetics 44
397-401
LOFTUS R T MACHUGH D E NGERE L O BALAIN D S BADI A M BRADLEY D G amp
CUNNINGHAM E P (1994a) Mitochondrial genetic variation in European African and Indian cattle
populations Animal Genetics 25 265-271
95
Referecircncias Bibliograacuteficas
LOFTUS R T MACHUGH B E BRADLEY B G SHARP P M amp CUNNINGHAM P (1994b) Evidence
for two independent domestications of cattle Proceeding of the National Academy of Sciences of USA
91 2757-2761
MACHUGH D E LOFTUS R T BRADLEY B G SHARP P M amp CUNNINGHAM P (1994)
Microsatellite DNA variation and among European cattle breeds Proceedings of the Royal Society of
London B 256 25-31
MACHUGH B E SHRIVER M B LOFTUS R T CUNNINGHAM P amp BRADLEY B G (1997)
Microsatellite DNA Variation and the Evolution Domestication and Phylogeography of taurine and
zebu cattle (Bos taunts and Bos indicus) Genetics 146 1071-1086
MARTINS R (1982) Conservaccedilatildeo e melhoramento dos bovinos de raccedila Barrosatilde Relatoacuterio de estaacutegio de
licenciatura em Produccedilatildeo Animal Instituto Universitaacuterio de Traacutes-os-Montes e Alto Douro
MIRANDA DO VALE J (1949) Gado Bissulco Livraria Saacute da Costa Lisboa
MORAIS M L (1992) Estudo Desenvolvimento e Optimizaccedilatildeo de Teacutecnicas de Separaccedilatildeo e Detecccedilatildeo
Especiacutefica de Proteiacutenas Dissertaccedilatildeo de Mestrado em Biologia Celular apresentada agrave Faculdade de
Ciecircncias da Universidade de Coimbra
NEI M (1978) Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small number of individuals
Genetics 89 583-590
NICHOLS E A CHAPMAN V M amp RUDDLE F H (1973) Polymorphism and linkage for
Mannosephosphate isomerase in Mus musculus Biochem Genet 8 47-53
NOBRE J M (s data) Caracterizaccedilatildeo geneacutetica da raccedila bovina Mirandesa Trabalho de fim de curso
efectuado na Estaccedilatildeo Nacional de Selecccedilatildeo e Reproduccedilatildeo Animal Curso de Engenharia Zooteacutecnica da
Universidade de Eacutevora
PENEDO M C T FOWLER M E BOWLING A T ANDERSON B L amp GORDON L (1988) Genetic
variation in the Wood of llamas Llama glama and alpaca Llama pacos Animal Genetics 19 267-
-276
PENEDO M C T amp JUNEJA R K (1989) Polymorphic plasma postalbumin (PO) of llamas and alpacas
identified as GC Protein Animal Genetics 20 221-223
96
Referecircncias Bibliograacuteficas
PENHALLOW R C MASON A B amp WOODWORTH R C (1991) Electrophoretic characterization of
human equine and bovine transferrins Comp Biochem Physiol 98B 41-45
PEREIRA A A (1997) Caracterizaccedilatildeo Geneacutetica de Algumas Subpopulaccedilotildees de Truta de Rio Salmo trutta L
da Bacia Hidrograacutefica do Rio Lima Dissertaccedilatildeo de Mestrado em Ecologia Aplicada apresentada agrave
Faculdade de Ciecircncias da Universidade do Porto
PIEDRAFITA J TEJEDOR M T amp ZARAGAZA L (1984) Post-Albuminas y Post-Transferrinas en
poblaciones bovinas Espafiolas Frisona y De Lidia Comunicacioacuten Presentada A La 34deg Reunion
Anual De La Federacioacuten Europea de Zootecnia 114-121
POVEY S CORNEY G LEWIS W H P ROBSON E B PARRINGTON J M amp HARRIS H (1972) The
genetics of peptidase C in man Ann Hum Genet 35 455-465
PRETSCH W amp MERKLE S (1990) Glucose Phosphate Isomerase Enzyme - Activity Mutants in Mus
musculus Genetical and Biochemical Characterization Biochemical Genetics 28 97-110
RASERO R D I STASIO L amp BERRA G P (1993) Polymorphism of erythocyte glucosephosphae isomerase
in sheep Animal Genetics 24 63-64
RITTER EL FRIEDRICHSON U amp SCHMITT J (1974) Genetic variation of Manose phosphate isomerase in
Man Humangenetik 22 261
RITTER H amp SCHMITT J (1973) Genetic polymorphism of Manose phosphate isomerase in Primates
Humangenetik 19 325-326
ROCHA J KOtildeMPF J FERRAND N AMORIM A amp RITTER H (1991) Separation of human alloalbumin
variants by isoelectric focusing Electrophoresis 12 313-314
ROGERSON J (1991) Biacuteblia- Os Caminhos de Deus Grandes Culturas e Civilizaccedilotildees Ciacuterculo de Leitores
RON M BAND M YANAI A amp WELLER J L (1994) Mapping quantitative trait loci with DNA
microsatellites in a commercial dairy cattle population Animal Genetics 25 259-264
RUSSEL G (1996) The analysis of genetic diversity in cattle to preserve future breeding options (Online)
Available http wwwribbsrcacukcdiv_wwwinformhtm (1996 November 29)
97
Referecircncias Bibliograacuteficas
SAITOU N amp NEI M (1987) The neighbor-joining method a new method for reconstructing phylogenetic
trees Mol Biol Evol 4 406-425
SANTOS O C M (1995) Caracterizaccedilatildeo Geneacutetica de Populaccedilotildees de Lebre Ibeacuterica (Lepus granatensis) e
Lebre Europeia (Lepus europaeus) - Aspectos Bioquiacutemicos e Populacionais Dissertaccedilatildeo de Mestrado
em Ecologia Aplicada apresentada agrave Faculdade de Ciecircncias da Universidade do Porto
SARAIVA J A (1993) Histoacuteria de Portugal Publicaccedilotildees Europa-Ameacuterica
SARTORE G STORMONT C MORRIS B G amp GRUNDER A A (1969) Multiple electrophoretic forms of
Carbonic Anhydrase in red cells of domestic cattle (Bos taurus) and American buffalo (Bison bison)
Genetics 61823-831
SCHNEIDER H SCHNEIDER M P C SILVA B T F amp SALZANO F M (1990) Transferrin and albumin
polymorphisms in buffaloes from Brazil Animal Genetics 21 335-337
SEATH P H A amp SOKAL R R (1973) Numeric Taxonomy W H Freeman amp Co
SELVARAJ O S MUKHERJEE T K DHALIWAL S S TAN S G amp BARKER J S F (1991) Biochemical
polymorphisms in the local goats of South-East Asia Animal Genetics 22 (suppl 1) 32
STERN C M MILLER S A amp SCHANFIELD M S (1992) Differentiation of wapiti and Eurasian red deer
by isoelectric focusing electrophoresis of GC on agarose gels Animal Genetics 23 (suppl 1) 23
STORMONT C amp SUZUKI Y (1963) Genetic control of albumin phenotypes in horses Proceeding of the
Society for Experimental Biology and Medicine 144 673-675
STRATIL A GLASNAacuteK V BOBAacuteK P CiacutezovAacute D GAacuteBRISOVAacute E amp KALAB P (1990) Variation of some
serum proteins in red deer Cervus elaphus L Animal Genetics 21 285-293
SWOFFORD D L amp SELANDER R B (1989) BIOSYS-1 A computer program for the analysis of allelic
variation in population genetics and biochemical systematics Release 17 Illinois Natural History
Survey
TASHIAN R E (1989) The carbonic anhydrases widening perspectives on their evolution expression and
function BioEssays 10 186-192
98
Referecircncias Bibliograacuteficas
TASHIAN R E amp CARTER N D (1976) Biochemical Genetics of Carbonic Anhydrase In Harris H (ed)
Advances in Human Genetics 7 1-56 Plenum
TATE M L amp MCEWAN K M (1992) Genetic polymorphism of erytrocyte diaphorase in red deer Cervus
elaphusL Animal Genetics 23 449-452
TSUJI S SAOAMITSU Y amp GOTO N (1989) Ultrathin-leyer isoelectric focusing for bovine serum
transferrin phenotyping Biochem Genet 27 425-429
TUCKER E M amp YOUNG J D (1988) Genetic control of red-cell nucleoside transport and its association
with the B blood-group locus and nucleoside phosphorylase activity in sheep Biochem Genet 26 489-
-501
TUNON M J GONZALEZ P amp VALLEJO M (1989) Genetic relationships between 14 native Spanish
breeds of goat Animal Genetics 20 205-212
USHA A P (1996) Cattle diversity by blood typing (Online) Available http
wwwribbsrcacukcdiv_wwwinfobhtm ( 1996)
USHA A P SIMPSON S P amp WILLIAMS J L (1995) Probability of random sire exclusion using
microsatellite markers for parentage verification Animal Genetics 26 155-161
VANDEBERG J amp AIVALIOTIS M (1990) Mannose-6-phosphate isomerase polymorphism in baboon
erythrocytes Biochemical Genetics 28 495-501
VAN DE WEGHE A VAN ZEVEREN A amp BOUQUET Y (1982) The vitamin D binding protein in domestic
animals Comp Biochem Physiol 73B 977-982
VAN DE WEGHE A YABLANSKI T S VAN ZEVEREN A amp BOUQUET Y (1988) A third variant of glucose
phosphate isomerase in pigs Animal Genetics 19 55-58
VANKAN D M amp BELL K (1992 a) A new allele in Australian goats Animal Genetics 23 453-456
VANKAN D M amp BELL K (1992 b) Genetic polymorphism of vitamin D-binding protein (GC) in Australian
goats Animal Genetics 23 457-462
VICENTE M V (1978) Razas vacunas autoacutectonas en vias de extincioacuten (Aportaciones al estuacutedio geneacutetico)
Fundacioacuten Juan March Serie Universitaacuteria LXK 10-51
99
Referecircncias Bibliograacuteficas
VIEIRA J (1993) Utilizaccedilatildeo de marcadores geneacuteticos na caracterizaccedilatildeo e certificaccedilatildeo de populaccedilotildees
domeacutesticas e selvagens de coelho (Oryctolagus cunicuius) Dissertaccedilatildeo de Mestrado apresentada agrave
Faculdade de Ciecircncias da Universidade do Porto
VIEIRA J amp FERRAND N (1995) Four new alleles at the mannose-6-phosphate isomerase locus in rabbit
Animal Genetics 26 37-38
WANG S FOOTE W C amp BUNCH T D (1990) Transferrin and haemoglobin polymorphism in
domesticated goats in the USA Animal Genetics 21 91-94
WEBER J L amp MAY P E (1989) Abundant class of human DNA polymorphisms which can be typed using
the polymerase chain reaction American Jornal of Human Genetics 44 388-396
WELCHS S (1990) A comparison of the structure and properties of serum transferrin from 17 animal species
Comp Biochem Physiol 97 B (3) 417-427
100
ANEXO
Anexos
RESUMO E CONCLUSOtildeES
Neste trabalho apresenta-se uma contribuiccedilatildeo para o estudo geneacutetico da raccedila bovina Barrosatilde e de uma outra raccedila (Minhota) atraveacutes da anaacutelise da variaccedilatildeo geneacutetica de proteiacutenas detectada pela utilizaccedilatildeo de sistemas electroforeacuteticos convencionais e por focagem isoeleacutectrica
Definiram-se os seguintes objectivos fundamentais
1 estudo da variabilidade geneacutetica da raccedila Barrosatilde ao niacutevel das proteiacutenas eritrocitaacuterias e plasmaacuteticas 2 desenvolvimento e afinaccedilatildeo de teacutecnicas de separaccedilatildeo de proteiacutenas por electroforese e focagem
isoeleacutectrica e sua detecccedilatildeo especiacutefica (histoquiacutemica e imunoloacutegica) 3 anaacutelise familiar dos polimorfismos encontrados 4 avaliaccedilatildeo do grau de diferenciaccedilatildeo geneacutetica existente entre a raccedila Barrosatilde e outras raccedilas bovinas
Escolheu-se um conjunto de 12 sistemas geneacuteticos (sete dos quais se revelaram polimoacuterficos) que pudesse satisfazer os objectivos fundamentais do trabalho
Assim apoacutes desenvolvimento de teacutecnicas de separaccedilatildeo para os sistemas geneacuteticos considerados procedeu-se a uma anaacutelise familiar baseada nos polimorfismos encontrados nas populaccedilotildees de raccedila Barrosatilde ao estudo de distribuiccedilatildeo populacional dos fenoacutetipos das duas raccedilas estudadas e de outras raccedilas bovinas da Europa (principalmente da Peniacutensula Ibeacuterica)
Com base neste trabalho obtiveram-se as seguintes conclusotildees
bull a utilizaccedilatildeo de um sistema de focagem isoeleacutectrica permitiu detectar a existecircncia de polimorfismo geneacutetico na hemoglobina distinguindo-se dois produtos geacutenicos na raccedila bovina Minhota HBA e HBB Na raccedila Barrosatilde HBA foi o uacutenico produto geacutenico encontrado
bull a utilizaccedilatildeo de um sistema de focagem isoeleacutectrica permitiu a detecccedilatildeo de dois produtos geacutenicos no locus CAII (CAIIF e CAIPS) e revelou-se mais eficaz de que as teacutecnicas de separaccedilatildeo convencional em gel de amido
bull a investigaccedilatildeo realizada permitiu detectar a ocorrecircncia de polimorfismo geneacutetico de MPI atraveacutes de um sistema electroforeacutetico em gel de amido tendo-se detectado trecircs produtos geacutenicos (MPIA MPIB e MPIC) A fraca actividade de MPI e a grande dificuldade na obtenccedilatildeo de um contraste de bandas adequado poderaacute dever-se ao facto de a sua expressatildeo soacute ocorrer na fracccedilatildeo leucocitaacuteria do sangue
bull a aplicaccedilatildeo de um sistema de focagem isoeleacutectrica na presenccedila de ureia (8M) revelou-se muito eficaz na separaccedilatildeo de ALB e permitiu detectar pela primeira vez um novo variante ALBV ligeiramente mais aciacutedico do que ALB A
bull a combinaccedilatildeo de uma teacutecnica de focagem isoeleacutectrica com um preacutevio tratamento das amostras a fim de saturar a moleacutecula de TF com Fe permitiu a detecccedilatildeo de quatro produtos geacutenicos (TFA TFD1 TFD2 e TFE) nas raccedilas estudadas
bull a combinaccedilatildeo de uma teacutecnica de focagem isoeleacutectrica com a detecccedilatildeo por immunoblotting permitiu detectar dois produtos geacutenicos no locus GC (GCA e GCB) O tratamento de amostras com neuraminidase permitiu a obtenccedilatildeo de padrotildees mais simples do que os conseguidos com amostras nativas Esta simplificaccedilatildeo resulta da provaacutevel remoccedilatildeo de aacutecidos siaacutelicos ligados agrave moleacutecula de GC
bull natildeo se detectou nenhum caso de exclusatildeo na anaacutelise de segregaccedilatildeo de 27 pares matildeefilho feita separadamente para cada locus
bull verificou-se a presenccedila de dois alelos raros HBB e PEPB1 na raccedila Minhota Estes alelos poderatildeo ser utilizados na distinccedilatildeo das duas raccedilas estudadas
I
Anexos
bull foi encontrado um valor de heterozigotia meacutedia de 0237 em populaccedilotildees de raccedila Barrosatilde indicativo de uma variabilidade geneacutetica intermeacutedia em relaccedilatildeo agrave generalidade das raccedilas ibeacutericas As diferenccedilas observadas entre as vaacuterias raccedilas ibeacutericas poderatildeo reflectir fenoacutemenos histoacuterico-evolutivos muito recentes dada a sua proximidade e grande semelhanccedila
bull foi observado um reduzido niacutevel de diferenciaccedilatildeo entre as raccedilas Barrosatilde e Minhota (FST = 0031) demonstrando-se que a maior parte da diversidade geneacutetica se atribui a diferenccedilas intrapopulacionais Este valor de FST pode considerar-se baixo quando comparado com o obtido no estudo de outras espeacutecies animais sugerindo um elevado fluxo geacutemeo interpopulacional Por outro lado reflecte ainda uma histoacuteria demograacutefica muito recente
bull a utilizaccedilatildeo de meacutetodos de agrupamento NJ e UPGMA obtidos a partir de matrizes de distacircncias geneacuteticas de Nei natildeo permitiu separar a raccedila Barrosatilde das restantes raccedilas ibeacutericas
II
Anexos
Tabela A Frequecircncias geacutenicas para os vaacuterios sistemas polimoacuterficos encontrados na raccedila Barrosatilde (indiviacuteduos inscritos e natildeo inscritos) utilizadas na anaacutelise familiar
LOCUS ALELOS FREQUEcircNCIA GEacuteNICA
CAII 294 035
065
NP 294 H
L
024
076
MPI 290 A
B
C
000
098
002
ALB 294 A
B
V
097
002
001
TF 294 A
Dl
D2
E
057
016
023
004
GC 294 083 017
TTI
Agradecimentos
Quero aqui apresentar o meu agradecimento agrave ajuda prestada por certas pessoas sem a qual
natildeo era possiacutevel a realizaccedilatildeo do presente trabalho
Ao Prof Doutor Nuno Ferrand de Almeida agradeccedilo a oportunidade e o apoio constante que
demonstrou durante a realizaccedilatildeo deste trabalho as indicaccedilotildees que forneceu na estruturaccedilatildeo e
elaboraccedilatildeo do mesmo pela cedecircncia de bibliografia bem como as criacuteticas e sucessivas revisotildees do
manuscrito
Ao Prof Doutor Paulo Alexandrino quero agradecer o apoio na realizaccedilatildeo deste mesmo
trabalho assim como todas as indicaccedilotildees que forneceu para a sua realizaccedilatildeo praacutetica
Ao Prof Doutor Jorge Eiras pelas facilidades concedidas na utilizaccedilatildeo do laboratoacuterio de
Bioquiacutemica do Departamento de Zoologia e Antropologia e ao ICETA pelas facilidades concedidas na
utilizaccedilatildeo dos laboratoacuterios de Geneacutetica Animal
Agrave comissatildeo do Mestrado na figura da Prof Dra Leonor Fidalgo e ao respectivo corpo docente
os importantes conhecimentos transmitidos durante o ano curricular deste mestrado
Agrave AMIBA (Associaccedilatildeo do Minho dos Criadores de Bovinos de Raccedila Barrosatilde) principalmente
ao Sr Miguel Machado e Dr Joseacute Leite pelo apoio dado pela ajuda na recolha de amostras de sangue
e pelo simpaacutetico acolhimento que demonstraram na sua associaccedilatildeo estando sempre prontos a dispensar
os seus serviccedilos
Agrave DRAEDM (Direcccedilatildeo Regional de Agricultura de Entre Douro e Minho) em especial ao
Sr Engdeg Corte Real Santos (Estaccedilatildeo de Produccedilatildeo Animal da Zona Agraacuteria do Vale do Ave) agradeccedilo
todo o apoio e encorajamento que demonstrou
Quero tambeacutem agradecer a colaboraccedilatildeo e o tempo despendido nas vaacuterias saiacutedas de campo aos
funcionaacuterios do Livro Genealoacutegico (ao Sr Guilherme em especial) e aos funcionaacuterios das brigadas de
Sanidade Animal de Vieira do Minho e Poacutevoa de Lanhoso
A todos os colegas de mestrado e de laboratoacuterio pela amizade pelo apoio e pelo ambiente de
camaradagem existente entre todos em especial agrave Madalena Branco ao Joatildeo Alexandrino ao
Agostinho Antunes agrave Graccedila Lopes ao Filipe Castro e agrave Rita Campos
Agrave Junta Nacional de Investigaccedilatildeo Cientiacutefica e Tecnoloacutegica (JNICT) agradeccedilo a Bolsa de
Mestrado (PRAXIS XXIBM879996) que me foi concedida o que possibilitou a minha
disponibilidade para a realizaccedilatildeo da parte praacutetica de investigaccedilatildeo deste trabalho
Aos meus amigos em especial agrave Dra Graccedila Loureiro ao Dr Armando Loureiro e agrave Dra Filipa
Carvalho pela paciecircncia pelo apoio constante que revelaram ao longo deste trabalho e pelas suas
criacuteticas ao manuscrito
Agrave minha matildee e ao meu marido que tornaram possiacutevel este percurso que me conduziu ateacute aqui
A eles dedico todo este trabalho
INDICE
1 - INTRODUCcedilAtildeO 1 11 - A DOMESTICACcedilAtildeO 3
111- Evidecircncia histoacuterica da domesticaccedilatildeo do gado bovino 3
112- Paleontologia arqueozoologia 4
113- Anaacutelise geneacutetica 7
12 - A DIVERSIDADE DAS RACcedilAS BOVINAS 10
121-Asraccedilas ibeacutericas 10
122 - A raccedila Barrosatilde 11
Aspectos histoacutericos da dispersatildeo e evoluccedilatildeo do efectivo populacional 11
Aspectos morfoloacutegicos 15
Origem 15
2 - MATERIAL E MEacuteTODOS 17
21- AMOSTRAGEM E CONSERVACcedilAtildeO DAS AMOSTRAS 17
211-Amostragem 17
212 - Obtenccedilatildeo e conservaccedilatildeo das amostras de sangue 17
22- BATERIA DE MARCADORES GENEacuteTICOS SELECCIONADOS 18
23 - TRATAMENTO DAS AMOSTRAS 24
24 - MEacuteTODOS DE SEPARACcedilAtildeO 26
25 - MEacuteTODOS DE DETECCcedilAtildeO 34
26 - MEacuteTODOS DE CAacuteLCULO 38
3 - RESULTADOS E DISCUSSAtildeO 39
31- ANAacuteLISE DOS MEacuteTODOS DE SEPARACcedilAtildeO 39
32 - ANAacuteLISE FAMILIAR 51
33 - ANAacuteLISE POPULACIONAL LOCUS A LOCUS 54
34 - ANAacuteLISE POPULACIONAL CONJUNTA 72
341 - Diversidade geneacutetica na raccedila Barrosatilde 72
342 - Comparaccedilatildeo com outra raccedilas Ibeacutericas 74
343 - Diferenciaccedilatildeo geneacutetica 77
4 - CONDIDERACcedilOtildeES FINAIS 86
5 - CONCLUSOtildeES 88
6 - REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 90
ANEXO
Introduccedilatildeo
1 - INTRODUCcedilAtildeO
O crescente interesse demonstrado pelas raccedilas bovinas autoacutectones permitiu o
aparecimento nos uacuteltimos anos de uma conjuntura poliacutetica e econoacutemica claramente favoraacutevel
agrave sua conservaccedilatildeo Este interesse reflecte-se por exemplo na criaccedilatildeo de incentivos agrave produccedilatildeo
(ajudas comunitaacuterias e medidas agroambientais) ou no apelo ao consumo de produtos de
qualidade certificada Estas circunstacircncias implicam contudo a necessidade de uma maior
capacidade de produccedilatildeo que em sistemas agriacutecolas tecnicamente pouco desenvolvidos poderaacute
estar associada a programas de melhoramento geneacutetico e consequentemente a eventuais
perdas de diversidade geneacutetica (FAO 1994 LoFTUS et ai1994 FERNANDES 1996)
Em Portugal existe um nuacutemero consideraacutevel de raccedilas bovinas autoacutectones que se
encontram ainda pouco estudadas Na verdade a maior parte dos trabalhos sobre elas
realizados envolve anaacutelises fenotiacutepicas estando ainda por investigar a estrutura geneacutetica das
suas populaccedilotildees o seu grau de proximidade a sua origem e evoluccedilatildeo recente
No seio das raccedilas nacionais a raccedila Barrosatilde apresenta um conjunto de caracteriacutesticas
morfoloacutegicas muito peculiares que incluem um perfil cocircncavo da cabeccedila uma saliecircncia das
arcadas orbitarias e cornos em forma de lira alta Este conjunto de particularidades tem
suscitado opiniotildees controversas sobre a sua origem (GONCcedilALVES GARCIA 1964 GARCIA et ai 1981 LEAL 1995) Por outro lado eacute claramente uma raccedila emblemaacutetica da regiatildeo noroeste
de Portugal associada a uma agricultura de subsistecircncia e a um patrimoacutenio cultural que se
torna necessaacuterio conservar (GONCcedilALVES GARCIA 1964 GARCIA et ai 1981 LEAL 1995)
A sua aacuterea de distribuiccedilatildeo abrange apenas 17 concelhos pertencentes a 4 distritos Vila
Real Viana do Castelo Braga e Porto Actualmente a existecircncia de problemas de produccedilatildeo eacute
responsaacutevel pela progressiva diminuiccedilatildeo de alguns nuacutecleos populacionais apesar dos esforccedilos
de certas entidades para o evitar (MARTINS 1982 LEAL 1995)
i
Introduccedilatildeo
Em face do exposto torna-se necessaacuterio alargar a investigaccedilatildeo sobre esta raccedila bovina
nomeadamente atraveacutes da sua caracterizaccedilatildeo geneacutetica Espera-se assim poder contribuir para
o estabelecimento de um plano de conservaccedilatildeo da Barrosatilde e simultaneamente aprofundar o
estado actual do conhecimento sobre a geneacutetica das suas populaccedilotildees
2
Introduccedilatildeo
11 - A DOMESTICACcedilAtildeO
111 - Evidecircncia histoacuterica da domesticaccedilatildeo do gado bovino
Haacute cerca de 15000 anos verificavam-se profundas mudanccedilas climaacuteticas na Terra Os
glaciares recuaram para Norte a temperatura tornou-se mais amena uma maior aacuterea
geograacutefica tornou-se habitaacutevel O Homem teve entatildeo de vencer dificuldades impostas pela
Natureza inventando a agricultura e a criaccedilatildeo de gado passando de caccedilador noacutemada a
agricultor e a pastor (SARAIVA 1993)
O iniacutecio da agricultura e a primeira domesticaccedilatildeo de animais por parte do Homem estaacute
datada de 10000 anos aC (final do Paleoliacutetico) numa regiatildeo conhecida por Crescente Feacutertil
no Proacuteximo Oriente O primeiro animal domesticado teraacute sido o catildeo seguindo-se a ovelha a
cabra e o gado bovino jaacute no Neoliacutetico (8000 anos aC) (HEMMER 1990 CLUTTON-BROCK
1992)
A domesticaccedilatildeo do gado bovino foi provavelmente um processo gradual Eacute natural
que no princiacutepio apenas alguns animais (essencialmente fecircmeas) fossem retirados das manadas
de auroques selvagens e criados isoladamente natildeo levando de imediato ao aparecimento de
diferenccedilas morfoloacutegicas claras Esta hipoacutetese eacute apoiada por registos arqueozooloacutegicos onde a
forma proto-domesticada natildeo se distingue da forma selvagem (LOFTUS et ai 1994)
A expansatildeo neoliacutetica em direcccedilatildeo agrave Europa teraacute levado milhares de anos seguindo uma
via mariacutetima (mar Mediterracircneo) e uma via continental (atraveacutes dos Balcatildes e pelo curso do
Danuacutebio) Da Siciacutelia a revoluccedilatildeo neoliacutetica espalhou-se por toda a bacia mediterracircnea
ocidental atingindo a Peniacutensula Ibeacuterica e a costa atlacircntica e trazendo consigo a arte a
agricultura e a criaccedilatildeo de gado Desta forma soacute no 5 deg mileacutenio aC chegaram agrave Peniacutensula
Ibeacuterica as praacuteticas agriacutecolas e a pastoriacutecia (SARAIVA 1993)
Desde o Neoliacutetico que o gado bovino domesticado (Bos taurus) tem um papel muito
importante para o Homem As grandes civilizaccedilotildees da Antiguidade datildeo-nos testemunhos
escritos e trabalhos artiacutesticos indicando a sua importacircncia na alimentaccedilatildeo (carne leite) nos
trabalhos agriacutecolas na guerra na arquitectura e mesmo na religiatildeo
3
Introduccedilatildeo
Durante o periacuteodo compreendido entre o iniacutecio do Neoliacutetico ateacute agraves idades do Cobre e
do Bronze a domesticaccedilatildeo dos bovinos levou a uma contiacutenua diminuiccedilatildeo do tamanho corporal
dos animais na Europa Posteriormente este processo teraacute sido interrompido com a introduccedilatildeo
de gado bovino trazido de Roma e muitas raccedilas extinguiram-se apoacutes a queda do Impeacuterio
Romano (EPSTEIN amp MASON 1984)
Esta tendecircncia continuou a observar-se durante a Idade Meacutedia e soacute com a Revoluccedilatildeo
Industrial e a necessidade de abastecer as grandes cidades se produziu um incremento na
criaccedilatildeo de gado (EPSTEIN amp MASON 1984)
Neste domiacutenio a modernizaccedilatildeo da agricultura e a produccedilatildeo intensiva de alimentos teraacute
originado uma contiacutenua diminuiccedilatildeo dos efectivos populacionais de muitas raccedilas autoacutectones
evidente sobretudo durante a uacuteltima metade deste seacuteculo Estas circunstacircncias determinaram
assim a sensibilizaccedilatildeo da sociedade para as consequecircncias do empobrecimento de diversidade
geneacutetica do gado bovino permitindo o estabelecimento de linhas de investigaccedilatildeo destinadas agrave
sua gestatildeo e conservaccedilatildeo (BROWN et ai 1993 FAO 1996)
112 - Paleontologia arqueozoologia
De acordo com os actuais dados paleontoloacutegicos o mais antigo ruminante do Velho
Mundo teraacute aparecido no Mioceno (Gelocus) caracterizando-se pela ausecircncia de incisivos na
mandiacutebula superior e possuindo jaacute uma conformaccedilatildeo do esqueleto idecircntica agrave dos bovinos
actuais (IGLESIAS 1989 e GARCIA et ai 1992) Esta forma viria a originar posteriormente os
quatro geacuteneros actuais de ruminantes Ovis Capra Antilope e Bos (IGLESIAS 1989)
A evidecircncia paleontoloacutegica indica tambeacutem que teratildeo existido na Europa diferentes
espeacutecies de boviacutedeos actualmente extintas Destas apenas o auroque sobreviveu ateacute agrave Idade
Meacutedia havendo documentos escritos que se referem ao local e data da morte do uacuteltimo
exemplar (Poloacutenia 1627) (LOFTUS et ai 1994)
As primeiras representaccedilotildees de bovinos feitas pelo Homem devem precisamente
referir-se a auroques sendo um dos exemplos mais conhecidos constituiacutedo pelas pinturas
rupestres das grutas de Lascaux (Franccedila) (figura 111)
4
Introduccedilatildeo
Figura 111 Pintura rupestre nas paredes de grutas em Lascaux Franccedila Datando de haacute cerca de 15000 anos Reproduzido de FORBES (1986)
Soacute mais tarde surge a evidecircncia de que o processo de domesticaccedilatildeo se poderaacute ter
iniciado De facto alguns achados neoliacuteticos (8000 a 5500 anos aC) provenientes da
Anatoacutelia parecem indicar a presenccedila de animais jaacute domesticados Esta regiatildeo do Sudoeste
Asiaacutetico poderaacute assim constituir o centro de domesticaccedilatildeo do gado bovino a partir de
populaccedilotildees selvagens da subespeacutecie asiaacutetica do auroque (Bos primigenius namadicus)
(EPSTEIN amp MASON 1984)
Outra evidecircncia adicional eacute fornecida pela descoberta de ossos e dentes de um animal
sensivelmente mais pequeno do que o auroque (Iraque 5000 anos aC) bem como por um
primeiro testemunho escrito onde se descreve em placas de argila uma cabeccedila de vaca
(Mesopotacircmia 5000 anos aC) (ROGERSON 1991)
Muitos outros achados arqueoloacutegicos e paleontoloacutegicos foram encontrados na
Mesopotacircmia (4000 anos aC) e no vale do rio Nilo (4000 anos aC) mostrando um bovino
totalmente domesticado e de longos cornos (EPSTEIN amp MASON 1984)
A consolidaccedilatildeo do processo de domesticaccedilatildeo eacute a partir desta altura inquestionaacutevel
tornando-se abundantes os registos de bovinos domesticados na Mesopotacircmia e vale do Nilo
A este respeito devem referir-se especialmente as numerosas esculturas relevos pinturas e
textos em papiro que relatam pormenores da vida quotidiana do povo egiacutepcio e onde aparecem
diversas cenas que mostram a importacircncia do gado bovino na agricultura e na alimentaccedilatildeo
(figura 112)
5
Introduccedilatildeo
Figura 112 Desenho ilustrativo de uma ordenha 5a dinastia Reproduzido de BAINES
amp MEacuteLEK (1980)
A partir desta altura as descobertas arqueozooloacutegicas satildeo testemunho de uma
expansatildeo do gado bovino Assim existem registos datados de haacute cerca de 2000 e 3000 anos
aC que sugerem a ocorrecircncia no Norte de Aacutefrica de animais de enormes cornos em forma de
lira (EPSTEIN amp MASON 1984)
Tal expansatildeo daacute-se tambeacutem pela Turquia indo ateacute ao Caacuteucaso e agrave Ruacutessia e chega
tambeacutem agrave Europa onde nas regiotildees do Norte foram encontrados objectos de arte da idade do
Cobre e do Bronze que representam bovinos e datam do iniacutecio do Cristianismo (EPSTEIN amp
MASON 1984)
A migraccedilatildeo para oriente estaacute tambeacutem bem documentada atraveacutes de numerosos restos
arqueozooloacutegicos descobertos em toda a Aacutesia Eacute contudo nesta regiatildeo geograacutefica que se
pode observar a transiccedilatildeo de gado bovino sem bossa (Bos taurus) para outro com bossa (Bos
indicus) Segundo alguns autores as raccedilas de Bos indiens ou gado zebu derivariam das raccedilas
de Bos taurus ou gado taurino atraveacutes de um processo de selecccedilatildeo (EPSTEIN amp MASON
1984) Alternativamente estes dados podem tambeacutem ser interpretados como a ocorrecircncia de
dois processos de domesticaccedilatildeo independentes seguidos do contacto entre as duas populaccedilotildees
domeacutesticas de gado bovino
Adicionalmente deve salientar-se que a evidecircncia descrita eacute ainda muito incompleta
pelo que a interpretaccedilatildeo dos dados deve ser feita com bastante precauccedilatildeo A tiacutetulo de
exemplo refiram-se os achados arqueozooloacutegicos efectuados na Peniacutensula dos Balcatildes e na
6
Introduccedilatildeo
Macedoacutenia Grega (6200 anos aC) Segundo EPSTEIN amp MASON (1984) estes achados
sugerem que o Sul da Europa poderia constituir o primeiro centro de domesticaccedilatildeo do gado
bovino a partir de onde se teria iniciado a sua expansatildeo em direcccedilatildeo ao resto do continente
europeu Ruacutessia e Sudoeste Asiaacutetico
113 - Anaacutelise geneacutetica
A investigaccedilatildeo sobre a geneacutetica das diferentes raccedilas de gado bovino tem contribuiacutedo de
forma muito significativa para a compreensatildeo da sua histoacuteria dos padrotildees de diversidade que
actualmente as caracterizam e do seu grau de parentesco Os resultados actualmente
disponiacuteveis reportam-se a trecircs domiacutenios principais grupos sanguiacuteneos variaccedilatildeo geneacutetica de
proteiacutenas e polimorfismos do DNA (DNA mitocondrial e microssateacutelites)
Grupos sanguiacuteneos
A primeira tentativa para avaliar o grau de diferenciaccedilatildeo geneacutetica entre raccedilas bovinas e
caracterizar a sua diversidade data do iniacutecio de deacutecada de 70 e envolveu precisamente o
estudo dos diferentes grupos sanguiacuteneos que iam sendo descritos (RUSSELL 1996 USHA
1996) Contudo a maior parte dos resultados natildeo permitiu a obtenccedilatildeo de conclusotildees
definitivas pelo facto de se trabalhar com um nuacutemero relativamente reduzido de loci que
adicionalmente era pouco polimoacuterfico Deve poreacutem referir-se que se dispotildee actualmente de
uma consideraacutevel quantidade de informaccedilatildeo no que se refere agrave distribuiccedilatildeo da variabilidade dos
grupos sanguiacuteneos nas diferentes raccedilas bovinas conferindo a este conjunto de dados uma
importacircncia natildeo despreziacutevel no estudo de eventuais alteraccedilotildees da estrutura geneacutetica de
populaccedilotildees de gado bovino nos uacuteltimos vinte anos (RUSSELL 1996 USHA 1996)
Proteiacutenas
A introduccedilatildeo de teacutecnicas electroforeacuteticas de separaccedilatildeo de proteiacutenas permitiu aumentar
de forma muito consideraacutevel o nuacutemero de sistemas geneacuteticos polimoacuterficos conhecidos nas
raccedilas bovinas em especial no que se refere a proteiacutenas do sangue e do leite (USHA 1996)
A anaacutelise da sua distribuiccedilatildeo populacional veio demonstrar a ocorrecircncia de dois grupos
principais de bovinos ou duas subespeacutecies (Bos primigenius taurus e Bos primigenius
7
Introduccedilatildeo
indiens) cada um deles caracterizado pela presenccedila de diversos alelos privativos em vaacuterios loci
(BRAEND 1971)
Estes resultados estatildeo de uma maneira geral de acordo com dados morfoloacutegicos
histoacutericos e ainda com a distribuiccedilatildeo geograacutefica conhecida dos principais grupos (EPSTEIN amp
MASON 1984) No entanto o acreacutescimo de informaccedilatildeo fornecido por este tipo de marcadores
foi ainda insuficiente para resolver muitas das interpretaccedilotildees contraditoacuterias publicadas sobre o
tema
Polimorfismo do DNA
A introduccedilatildeo das teacutecnicas de anaacutelise genoacutemica directa e em especial a descoberta do
polimorfismo do DNA-mitocondrial (mtDNA) e dos microssateacutelites forneceram os
instrumentos necessaacuterios a uma detalhada caracterizaccedilatildeo geneacutetica das raccedilas bovinas
A anaacutelise da variaccedilatildeo da moleacutecula de mtDNA permitiu verificar que Bos primigenius
taurus e Bos primigenius indicus teratildeo divergido haacute cerca de 210000 anos uma data muito
anterior agrave indicada pelos dados arqueoloacutegicos para o iniacutecio do processo de domesticaccedilatildeo Eacute
assim muito provaacutevel que tenham ocorrido duas domesticaccedilotildees independentes a partir de duas
subespeacutecies diferentes do auroque Bos primigenius namadicus teraacute dado origem ao gado
zebu na Aacutesia (Vale do Indu) e Bos primigenius primigenius ao gado europeu vindo do
Proacuteximo Oriente (LOFTUS et ai 1994a 1994b)
Muito recentemente BRADLEY et ai (1996) e MACHUGH et ai (1997) sugerem ainda
uma terceira domesticaccedilatildeo independente ocorrida em Aacutefrica Esta evidecircncia resulta tambeacutem
de anaacutelise do polimorfismo do mtDNA indicando uma separaccedilatildeo entre os ancestrais do gado
europeu e africano anterior agrave domesticaccedilatildeo (22000 - 26000 anos) Este terceiro processo de
domesticaccedilatildeo ter-se-ia assim efectuado a partir da subespeacutecie africana do auroque (Bos
primigenius opisthonomus)
A descoberta dos microssateacutelites e do seu elevado grau de polimorfismo data do fim da
deacutecada de 80 (Lm amp LUTY 1989 WEBER amp MAY 1989) e constitui provavelmente a
metodologia mais adequada para estudar a histoacuteria recente da diversificaccedilatildeo das raccedilas bovinas
(MACHUGH et ai 1994 ARRANZ et ai 1996) Os primeiros resultados que envolvem uma
caracterizaccedilatildeo em larga escala de diferentes populaccedilotildees permitiram distinguir mais claramente
a estrutura geneacutetica dos dois grandes grupos de gado bovino (Bos taurus e Bos indicus) e
constituem a base para futuros estudos mais especiacuteficos
8
Introduccedilatildeo
Por outro lado os microssateacutelites permitiram tambeacutem o iniacutecio do projecto de
cartografia do genoma bovino que no fim de 1994 contabilizava 202 marcadores geneacuteticos
(dos quais 144 eram microssateacutelites) regularmente espaccedilados em 90 do seu comprimento
Cerca de um ano depois existiam jaacute mais de 400 microssateacutelites (USHA et ai 1995) levando
EGGEN et ai (1995) a apresentar um trabalho de revisatildeo e consolidaccedilatildeo de informaccedilatildeo jaacute
existente para evitar a ocorrecircncia de possiacuteveis redundacircncias
A aplicaccedilatildeo deste tipo de marcadores natildeo se restringe apenas agrave anaacutelise da diversidade
geneacutetica populacional e agrave construccedilatildeo de mapas geneacuteticos De facto satildeo actualmente escolhidos
para a realizaccedilatildeo de testes de paternidade (GLOWATZKI-MULLIS et ai 1995 USHA et ai 1995
ARRANZ et ai 1996) detecccedilatildeo de loci que determinam a expressatildeo de caracteriacutesticas
quantitativas (QTL) (RON et ai 1994) determinaccedilatildeo do sexo em embriotildees selecccedilatildeo animal
assistida entre outros
No seu conjunto estes resultados tecircm permitido um avanccedilo notaacutevel na compreensatildeo da
evoluccedilatildeo das actuais raccedilas bovinas A prossecuccedilatildeo desta via de investigaccedilatildeo poderaacute levar ao
esclarecimento definitivo do nuacutemero de domesticaccedilotildees independentes que teraacute ocorrido
(EPSTEIN amp MASON 1984 LOFTUS et al 1994a 1994b BRADLEY et al 1996 MACHUGH et
al 1997) a partir das populaccedilotildees selvagens de auroque Seguidamente eacute legiacutetimo esperar que
venha a ser possiacutevel analisar a uma escala mais fina o grau de parentesco geneacutetico entre raccedilas
que ocupem aacutereas geograacuteficas mais reduzidas Neste particular seraacute extremamente interessante
incluir as populaccedilotildees ibeacutericas e em especial a raccedila Barrosatilde
9
Introduccedilatildeo
12 - A DIVERSIDADE DAS RACcedilAS BOVINAS
A domesticaccedilatildeo resultou na criaccedilatildeo de milhares de raccedilas de animais domeacutesticos
geneticamente diferentes e adaptadas agraves necessidades humanas e a uma grande variedade de
condiccedilotildees ambientais (FAO 1993)
121 - As raccedilas ibeacutericas
A grande diversidade de raccedilas bovinas da Peniacutensula Ibeacuterica poderaacute dever-se em parte
agrave introduccedilatildeo de outras raccedilas domeacutesticas que se cruzaram entre si e com bovinos jaacute existentes
na Peniacutensula A introduccedilatildeo de outras raccedilas teraacute sido feita de duas formas distintas
1 - atraveacutes dos movimentos migratoacuterios acompanhando as vaacuterias invasotildees de povos
vindos do oriente como eacute o caso dos Feniacutecios ( seacutec X aC) Gregos (seacutec VII aC) e
Romanos (seacutec III aC) Estes uacuteltimos dominaram completamente a Peniacutensula durante
7 seacuteculos e teratildeo contribuiacutedo para a diversificaccedilatildeo do gado bovino pelo facto de
introduzirem animais de caracteriacutesticas diferentes Supotildee-se que do seu cruzamento
com os bovinos ibeacutericos se teratildeo originado os troncos aquitacircnico e ibeacuterico (MIRANDA
do VALE 1949)
2 - atraveacutes da introduccedilatildeo de animais do Norte de Aacutefrica na sequecircncia da invasatildeo de
povos como os Cartagineses (seacutec V aC) e jaacute na era cristatilde os Mouros (711 dC)
Estes teratildeo introduzido descendentes de Bos primigenius opisthonomus que poderaacute
ter influenciado a formaccedilatildeo de vaacuterias raccedilas ibeacutericas nomeadamente as raccedilas Barrosatilde e
Cachena (APARIacuteCIO 1960 in IGLESIAS 1989 EPSTEIN amp MASON 1984) Estas
poderatildeo assim constituir uma linha que descende do tronco mauritaacutenico (MIRANDA
do VALE 1949)
10
Introduccedilatildeo
Adicionalmente eacute provaacutevel que povos oriundos do Norte da Europa nomeadamente
os Visigodos possam ter introduzido gado bovino dessa regiatildeo Contudo a sua eventual
contribuiccedilatildeo para a diversidade de raccedilas bovinas da Peniacutensula Ibeacuterica estaacute por esclarecer
122 - A raccedila Barrosatilde
Aspectos histoacutericos da dispersatildeo e evoluccedilatildeo do efectivo populacional
O centro de criaccedilatildeo da raccedila Barrosatilde situa-se actualmente na zona do planalto da Serra
do Barroso abrangendo os actuais concelhos de Montalegre Boticas Vieira do Minho
(freguesias de Campos e Ruivatildees) e Cabeceiras de Basto (freguesia de Gondiatildees) Esta regiatildeo
natildeo possui condiccedilotildees agro-climateacutericas que permitam grandes exploraccedilotildees agriacutecolas pelo que
uma parte importante da populaccedilatildeo se dedica agrave criaccedilatildeo de gado (GARCIA et ai 1981
FERNANDES 1996)
Vivendo sobretudo em zonas montanhosas a Barrosatilde eacute utilizada essencialmente como
forccedila de trabalho e na produccedilatildeo de carne de excelente qualidade motivo pelo qual a Uniatildeo
Europeia a reconhece com denominaccedilatildeo de Origem Protegida (FERNANDES 1996)
No seacuteculo passado e iniacutecio do seacuteculo XX existia um grande incentivo para a criaccedilatildeo
desta raccedila devido agrave procura da sua carne muito apreciada em Inglaterra Este incentivo
contribuiu indirectamente para que a estatura dos animais se elevasse (GARCIA et ai 1981) e
para que a zona de criaccedilatildeo se dispersasse pelas aacutereas submontanhosas e pelas planiacutecies do
Entre Douro e Minho ateacute agrave orla mariacutetima chegando mesmo ao concelho de Vila Nova de Gaia
(figura 121) Nestas zonas fazia-se a criaccedilatildeo de novilhos para exploraccedilatildeo como bois de
trabalho e para produccedilatildeo de carne Tal exploraccedilatildeo estaacute bem patente nos paineacuteis de azulejos da
estaccedilatildeo de caminhos de ferro de S Bento no Porto e mesmo nos desenhos das calccediladas nas
principais avenidas desta cidade
li
Introduccedilatildeo
B
bull bull bull _ bull bull bull - bull bull
Figura 121 A) Junta de bois de trabalho de raccedila Barrosatilde B) Fecircmea adulta Barrosatilde C) Macho adulto Barrosatilde Fotografias datadas de 1949 gentilmente cedidas pela Direcccedilatildeo Regional de Agricultura de Entre Douro e Minho - Centro de Produccedilatildeo Animal (DRAEDM)
12
Introduccedilatildeo
Poreacutem a necessidade de maiores produccedilotildees de carne foi conduzindo durante a
segunda metade deste seacuteculo a um progressivo decliacutenio no efectivo populacional da raccedila
Barrosatilde tornando-se mesmo raro poder observar uma junta de bois Recentemente as
alteraccedilotildees verificadas na poliacutetica agraacuteria e ambiental da Uniatildeo Europeia teratildeo permitido
alguma recuperaccedilatildeo Nesse contexto a criaccedilatildeo em 1981 do Livro Genealoacutegico da raccedila
Barrosatilde constitui um passo importante para a certificaccedilatildeo dos animais e o aumento do seu
valor Actualmente o seu efectivo populacional tem crescido continuamente e essa tendecircncia
parece estaacutevel
Segundo dados fornecidos pelo Registo Zooteacutecnico e pela Associaccedilatildeo do Minho dos
Criadores de Bovinos de Raccedila Barrosatilde (AMTOA) existiam em 1996 38002 fecircmeas
reprodutoras inscritas e 375 touros de cobriccedilatildeo (tabela 1221) distribuiacutedos por vaacuterios
concelhos dos distritos de Viana do Castelo Braga Vila Real e Porto (figura 122)
Tabela 1221 Movimento do Registo Zooteacutecnico relativo agrave raccedila Barrosatilde
Vacas Inscritas Postos de Cobriccedilatildeo Vitelos Anos Abatidas Registadas Inscritas Encerrados Recenseados Existecircncias Inscritos 1981 0 4884 4882 1 25 24 0 1982 19 6169 11032 6 42 60 532 1983 31 4436 15437 14 35 81 1593 1984 72 866 16231 13 14 82 2151 1985 47 604 16788 15 15 82 1767 1986 106 1027 17709 18 13 77 2414 1987 72 1186 18823 2 14 89 2632 1988 122 1192 19877 5 7 91 2574 1989 138 718 20506 14 26 103 2532 1990 89 1017 21440 8 7 102 2404 1991 159 1309 22590 14 26 114 2531 1992 52 1902 24440 6 17 125 3203 1993 0 4205 28645 37 87 175 4077 1994 0 6248 34893 58 111 228 4679 1995 340 2447 37000 0 112 340 5759 1996 120 1122 38002 26 61 375 5901
Fonte Registo Zooteacutecnico (cedido pela AM1BA)
Apesar desta situaccedilatildeo favoraacutevel natildeo se pode considerar que a raccedila Barrosatilde natildeo corra
ainda perigo de extinccedilatildeo Na verdade satildeo vaacuterios os factores que tecircm contribuiacutedo para a
diminuiccedilatildeo da sua aacuterea de criaccedilatildeo ou mesmo para a alteraccedilatildeo das caracteriacutesticas destes
animais De entre esses factores deve salientar-se i) a substituiccedilatildeo de Barrosatilde por outras raccedilas
autoacutectones (Minhota Mirandesa Maronesa) ou importadas (Friacutesia Gelbvieh e Parda Suiacuteccedila)
13
Introduccedilatildeo
que fornecem ao agricultor um rendimento superior ii) a progressiva mecanizaccedilatildeo da
agricultura e a diminuiccedilatildeo das aacutereas de pastagem iii) o pequeno nuacutemero de machos
reprodutores associado a um efectivo idoso iv) uma baixa fertilidade meacutedia grandes
intervalos entre partos e elevado nuacutemero de abortos e v) desmotivaccedilatildeo dos produtores mesmo
em face das actuais condiccedilotildees de comercializaccedilatildeo
LEGENDA
| j - -Concelhos de Entre Douro e Minho S Concelhos de Traacutes-os-Montes
ESCALA 11380000
Figura 122 Mapa de distribuiccedilatildeo do actual efectivo Barrosatilde
14
Introduccedilatildeo
Aspectos morfoloacutegicos
O bovino Barrosatilde apresenta uma estatura mediana com 121-130 cm de altura agrave
cernelha e pelagem de cor castanha (variando entre a cor de palha ateacute a cor acerejada) (LEAL
1995) A cabeccedila eacute curta e larga encimada por uma cornamenta em forma de lira alta os
cornos satildeo muito compridos e espessos de cor branca suja com pontas escuras o conjunto
ocular eacute saliente dando-lhe o aspecto de olhos de sapo as orelhas satildeo de tamanho meacutedio os
membros satildeo curtos e pouco ossudos e o pescoccedilo eacute curto bem ligado agrave cabeccedila e com garrote
largo (MARTINS 1982)
Eacute uma raccedila com caracteres sexuais secundaacuterios bem diferenciados Os touros satildeo
normalmente mais escuros particularmente no terccedilo anterior com maior corpulecircncia do que as
fecircmeas mais robustos com barbela mais desenvolvida cabeccedila mais curta e mais larga cornos
mais grossos e ligeiramente mais curtos (GARCIA et ai 1981 MARTINS 1982)
Esta raccedila apresenta duas particularidades morfoloacutegicas que a distinguem de todas as
outras raccedilas grande desenvolvimento coacuterneo e perfil cocircncavo da cabeccedila com acentuado
prognatismo mandibular O elevado crescimento coacuterneo poderaacute estar relacionado com a
selecccedilatildeo dos animais De facto nas populares chegas de touros o animal que sai vencedor seraacute
o touro cobridor das vacas da aldeia Este processo teraacute permitido a primazia de touros de
maior ossatura capital mais potente musculatura ceacutefalo-cervical maior forccedila no acircngulo taacutersico
e consequentemente grande desenvolvimento dos cornos (MIRANDA do VALE in GONCcedilALVES GARCIA 1964 ARAUacuteJO 1986) No que se refere ao acentuado prognatismo
mandibular eacute possiacutevel que em parte esteja relacionado com o grande desenvolvimento
coacuterneo Este teraacute exigido um desenvolvimento correlativo de certos ossos cranianos e o
atrofiamento dos ossos da face (GONCcedilALVES GARCIA 1964)
Origem
A origem da raccedila Barrosatilde e o seu enquadramento com as outras raccedilas da Peniacutensula
Ibeacuterica estaacute ainda por explicar constatando-se uma grande heterogeneidade na opiniatildeo de
diversos autores a este respeito (MARTINS 1982)
Alguns autores referem a existecircncia no Norte de Aacutefrica (vale do Nilo) de um gado
com caracteriacutesticas morfoloacutegicas semelhantes agrave actual raccedila Barrosatilde em especial no que se
refere agrave forma tamanho e espessura dos cornos Este gado eacute normalmente associado agrave
15
Introduccedilatildeo
designaccedilatildeo subespeciacutefica Bos primigenius opisthonomus (embora tambeacutem se refira como Bos
primigenius mauritaniens e como Bos taurus desertorum) e teraacute chegado agrave Peniacutensula Ibeacuterica
atraveacutes de vaacuterias rotas migratoacuterias dos povos norte-africanos A raccedila Barrosatilde poderia assim
ser incluiacuteda no tronco mauritaacutenico tendo como ancestral Bos primigenius mauritanicus
(GARCIA et ai 1981)
Neste contexto poderaacute admitir-se que o gado que corresponde a este grupo se tenha
instalado na Peniacutensula Ibeacuterica provavelmente durante a longa ocupaccedilatildeo Moura (GONCcedilALVES
GARCIA 1964) Posteriormente a raccedila Barrosatilde teraacute sido desalojada pelos troncos ibeacuterico e
aquitacircnico restando apenas um nuacutecleo populacional confinado agraves zonas planaacutelticas do
Barroso onde permaneceu ateacute hoje (GONCcedilALVES GARCIA 1964)
Esta hipoacutetese natildeo eacute contudo partilhada por outros autores que lhe criticam a escassa
evidecircncia (forma e tamanho dos cornos) e portanto uma clara ausecircncia de base cientiacutefica
(IGLESIAS 1989)
Perante o exposto pode verificar-se que a raccedila Barrosatilde apresenta aspectos
morfoloacutegicos e histoacuterico-evolutivos muito peculiares sendo ainda hoje difiacutecil proceder ao seu
enquadramento no seio das restantes raccedilas bovinas ibeacutericas O aprofundamento da investigaccedilatildeo
sobre a estrutura geneacutetica das suas populaccedilotildees poderaacute ser assim uma via para o
esclarecimento das muitas questotildees que permanecem por responder Nestas condiccedilotildees este
trabalho pretende ser uma contribuiccedilatildeo para o conhecimento da geneacutetica das populaccedilotildees da
raccedila bovina Barrosatilde atraveacutes da consecuccedilatildeo dos seguintes objectivos
1 estudo da variabilidade geneacutetica da raccedila Barrosatilde ao niacutevel das proteiacutenas eritrocitaacuterias
e plasmaacuteticas
2 desenvolvimento e afinaccedilatildeo de teacutecnicas de separaccedilatildeo de proteiacutenas por electroforese
e focagem isoeleacutectrica e sua detecccedilatildeo especiacutefica (histoquiacutemica e imunoloacutegica)
3 anaacutelise familiar dos polimorfismos encontrados
4 avaliaccedilatildeo do grau de diferenciaccedilatildeo geneacutetica existente entre a raccedila Barrosatilde e outras
raccedilas bovinas
16
Material e Meacutetodos
2 - MATERIAL E MEacuteTODOS
21 - AMOSTRAGEM E CONSERVACcedilAtildeO DAS AMOSTRAS
211 - Amostragem
Foram recolhidas 356 amostras de sangue correspondente a 294 indiviacuteduos de raccedila
Barrosatilde (dos quais 141 estavam inscritos no Livro Genealoacutegico) e 62 indiviacuteduos de raccedila
Minhota As colheitas efectuaram-se em zonas de intensa criaccedilatildeo da Barrosatilde designadamente
nos concelhos de Arcos de Valdevez Cabeceiras de Basto Fafe Poacutevoa de Lanhoso e
Monccedilatildeo em finais de 1993 durante o ano de 1994 e ainda no periacuteodo de 1996 1997 em
Vieira do Minho
A recolha de sangue em indiviacuteduos de raccedila Minhota foi efectuada com a finalidade de
servir como termo de comparaccedilatildeo geneacutetica uma vez que se realizam cruzamentos entre esta
raccedila e a Barrosatilde
212 - Obtenccedilatildeo e conservaccedilatildeo das amostras de sangue
O sangue foi colhido da veia jugular em tubos contendo 01 ml de EDTA (aacutecido
etilnodiaminotetraceacutetico) dissoacutedico a 10 ou em tubos heparinados
As amostras de sangue foram centrifugadas (10 minutos a 13000 rpm) separando-se
em seguida o plasma dos eritroacutecitos Aos eritroacutecitos foi adicionado meio de glicerol (seis
partes de uma soluccedilatildeo 5 de citrato trissoacutedico 2H20 adicionados a quatro partes de glicerol)
numa proporccedilatildeo aproximada de 21 as amostras foram conservadas a -20degC
17
Material e Meacutetodos
22 - BATERIA DE MARCADORES GENEacuteTICOS SELECCIONADOS
No presente trabalho foi escolhida uma bateria de 12 marcadores geneacuteticos dispersos
no genoma do bovino (figura 5) HB (Hemoglobina) CAII (Anidrase carboacutenica) PEPB
(Peptidase B) DIA (Diaforase) NP (Fosforilase nucleosiacutedica) MDH (Desidrogenase do
malato) PGD (Desidrogenase do aacutecido fosfoglucoacutenico) GPI (Isomerase da fosfoglucose)
MPI (Isomerase da manose-6-fosfato) ALB (Albumina) TF (Transferrina) e GC
(Componente especiacutefico de grupo)
CP SODl TF
PEPC IDH1
AMY1 AMY1A PGM1
4
LDHB PEPB
ADH2 PGM2 ALB GC SOD3
6
IADA
ALDH1
CAII
ME1 PGM3 SOD2
NP
10
CAT HBBq22-q27
PGD IALDH2 DIA4
HP GPIq22-q24
MPI iBF GLOl
LDHA MDH2
Figura 221 Localizaccedilatildeo de vaacuterios loci proteicos no genoma de Bos taurus Com um tom mais carregado indicam-se os marcadores estudados neste trabalho Adaptado de FRIES et ai (1993)
18
Material e Meacutetodos
bull HB
A hemoglobina eacute responsaacutevel pelo transporte do oxigeacutenio dos pulmotildees para os tecidos
A sua estrutura eacute tetrameacuterica tendo cada uma das quatro subunidades um grupo prosteacutetico -
- heme - com um aacutetomo de ferro no centro A fracccedilatildeo principal da hemoglobina de mamiacuteferos
adultos eacute composta por duas cadeias a e duas cadeias P (BRAEND 1971 CECCHINI amp Nus
1986)
O locus da HB foi um dos primeiros a ser estudado apresentando polimorfismo em
vaacuterios mamiacuteferos (CECCHJM amp Nus 1986 BRAEND et ai 1988 CLARKE et ai 1989 WANG
et ai 1990 SELVARAJ et ai 1991) Em 1955 CABANNE amp SERAIN (in BRAEND 1988)
descrevem pela primeira vez o polimorfismo da HB em bovinos do Norte da Aacutefrica
Posteriormente muitos estudos foram efectuados descrevendo-se 13 variantes (raros na sua
maioria) com diferenccedilas apenas nas cadeias beta (CECCHINI amp Nus 1986 BRAEND 1988)
bull CAII-EC4211
A CAII eacute uma metaloenzima com grande distribuiccedilatildeo nos animais e nas plantas
(TASHIAN 1989) Catalisa de forma reversiacutevel a hidrataccedilatildeo do C02 em H2C03 (CECCHINI amp
Nus 1986 TASHIAN 1989) O seu papel fisioloacutegico ainda natildeo eacute bem conhecido mas eacute
possiacutevel que tenha participaccedilatildeo na manutenccedilatildeo do balanccedilo osmoacutetico (TASHIAN 1989)
A ocorrecircncia de variaccedilatildeo geneacutetica na CAII estaacute descrita em muitas espeacutecies de
mamiacuteferos tendo sido descritos dois loci polimoacuterficos (CAI e CAII) (TASHIAN amp CARTER
1976 CLARICE et ai 1989 SELVARAJ et ai 1991)
SARTORE et ai (1969) foram os primeiros a detectar polimorfismo electroforeacutetico da
anidrase carboacutenica em bovinos domeacutesticos e buacutefalos americanos Nos eritroacutecitos de bovinos
apenas se exprime a anidrase carboacutenica II que apresenta geralmente 2 alelos codominantes
autossoacutemicos (CAIPF e CAIPS) (SARTORE et ai 1969 TASHIAN amp CARTER 1976) Mais
tarde foram encontrados 3 novos alelos (C Z e X) (CECCHINI amp Nus 1986)
19
Material e Meacutetodos
bull PEPB-EC3412
As peptidases formam um conjunto de enzimas capazes de hidrolisar di- e tripeacuteptidos
caracterizando-se pela sua especificidade em relaccedilatildeo a diversos substratos bem como atraveacutes
da sua distribuiccedilatildeo tecidular
A PEPB apresenta uma estrutura monomeacuterica tendo sido descrita como polimoacuterfica
em algumas raccedilas brasileiras de bovinos de origem europeia e indiana (DEL LAMA et ai
1992)
bull DIA-EC1643
A enzima monomeacuterica DIA (NADH - Methemoglobina redutase) tambeacutem conhecida
por citocromo bs redutase faz parte de um grupo de enzimas que catalisam a reduccedilatildeo da
methemoglobina (IGLESIAS 1989 VIEIRA 1993 kRAHhetal 1986)
O seu polimorfismo geneacutetico foi detectado em vaacuterias espeacutecies de Ungulados incluindo
os bovinos (CLARKE et ai 1989 IGLESIAS 1989 SELVARAJ et ai 1991 TATE amp McEWAN
1992)
bull NP-EC2421
A enzima NP encontra-se distribuiacuteda por vaacuterios tecidos e oacutergatildeos e catalisa
reversivelmente a fosforoacutelise dos nucleosiacutedeos puriacutenicos levando agrave formaccedilatildeo das respectivas
bases e ribose-1-fosfato (IGLESIAS 1989)
O polimorfismo geneacutetico desta enzima foi detectado em vaacuterias espeacutecies de mamiacuteferos
incluindo os bovinos (ANSAY 1973 HARRIS amp HOPKINSON 1978 TUKER amp YOUNG 1988
CLARKE eacutetal 1989 IGLESIAS 1989 FERRAND 1995)
20
Material e Meacutetodos
bull MDH-ECl 1137
A MDH eacute uma oxirredutase dimeacuterica na maioria dos mamiacuteferos responsaacutevel pela
oxidaccedilatildeo do L-malato em oxoglutarato com NAD como aceitador A reacccedilatildeo eacute reversiacutevel em
presenccedila de NADH e oxaloacetato A enzima diz-se NAD especiacutefica pelo facto da reacccedilatildeo soacute
ocorrer na presenccedila deste cofactor (MORAIS 1992 PEREIRA 1997)
A ocorrecircncia de variaccedilatildeo geneacutetica neste locus foi descrita para vaacuterios mamiacuteferos
(HARRIS amp HOPKINSON 1978 TUNOacuteN et ai 1989 SELVARAJ et ai 1991) Contudo
relativamente aos bovinos natildeo foi possiacutevel encontrar referecircncias quanto ao seu polimorfismo
bull PGD-EC11144
A PGD eacute uma enzima dimeacuterica envolvida na via das pentoses-fosfato catalisando a
conversatildeo de 6-fosfogluconato em ribose-5-fosfato
O polimorfismo geneacutetico do locus PGD estaacute descrito em diversas espeacutecies de
Ungulados (HERZOG 1988 PENEDO et ai 1988 BEKENEV amp ORLO VA 1991 KUROSAWA amp
TANAKA 1991 JANZEN amp COTHRAN 1991 FERNDALE et al 1992) Contudo relativamente
aos bovinos natildeo foi possiacutevel encontrar referecircncias quanto ao seu polimorfismo
bull GPI-EC5319
A isomerase da fosfoglucose cataliza a reacccedilatildeo reversiacutevel de conversatildeo de glucose-
-6-fosfato em frutose-6-fosfato (HARRIS amp HOPKINSON 1978 PRETSCHei ai 1990)
Eacute uma enzima dimeacuterica com polimorfismo geneacutetico em vaacuterias espeacutecies de mamiacuteferos
nomeadamente no catildeo (ARNOLD amp Bouw 1989) no porco (VAN DE WEGHE et ai 1988
BEKENEV amp ORLO VA 1991) na ovelha (RASERO et ai 1993) em lamas e alpacas (PENEDO et
ai 1988) e no Homem (HARRIS amp HOPKINSON 1978)
21
Material e Meacutetodos
bull MPI-EC5318
A MPI eacute uma enzima monomeacuterica de acccedilatildeo cataliacutetica que permite a isomerizaccedilatildeo de D-
-manose-6-fosfato em D-frutose-6-fosfato
Em diversas espeacutecies de mamiacuteferos nomeadamente no Homem (RlTTER et ai 1974)
em babuiacutenos (RITTER amp SCHMITT 1973) e ratos (NICHOLS et ai 1973 VANDEBERG amp
AIVALIOTIS 1990) esta enzima natildeo apresenta actividade em eritroacutecitos sendo poreacutem
detectada em diversos tecidos como rim fiacutegado e o muacutesculo Mais tarde demonstrou-se a
possibilidade de proceder a esta detecccedilatildeo em hemolisados de cavalos coelhos e lebres (HALL
et ai 1991 VIEIRA amp FERRAND 1995 SANTOS 1995)
O polimorfismo geneacutetico de MPI em bovinos foi descrito por ANSAY (1973)
apresentando trecircs alelos autossoacutemicos codominantes (MPPA MPIB e MPIC)
bull ALB
A albumina eacute a proteiacutena mais abundante no plasma dos mamiacuteferos e apresenta uma
estrutura monomeacuterica A sua funccedilatildeo estaacute relacionada com processos de transporte e de
regulaccedilatildeo do balanccedilo osmoacutetico (CECCHTNI amp Nus 1986 CARTER et al 1989)
O polimorfismo geneacutetico da albumina estaacute descrito em vaacuterias espeacutecies de Ungulados
(STORMONT et ai 1963 BOWLING amp CLARK 1988 PENEDO et ai 1988 ERHARDT 1991
SELVARAJeacutetfa 1991CRISTOFALOpounda 1992 ERHARDT amp SlMIANER 1993)
EFREMOV e ASHTON em 1965 (in CECCHTNI amp Nus 1986) descrevem pela primeira vez
polimorfismo geneacutetico em raccedilas bovinas inglesas Inicialmente encontraram-se dois alelos
(ALBA ou ALBF e ALBB ou ALBS) por electroforese aacutecida Mais tarde descreveram-
-se outros alelos em raccedilas britacircnicas (ALBH e ALBG) e em raccedilas africanas (ALBD
ALBE e ALBF) (CECCHINI amp Nus 1986) ABE et ai em 1971 descrevem o alelo ALBX
(in CECCHTNI amp Nus 1986)
22
Material e Meacutetodos
bull TF
A transferrina eacute uma 3-globulina seacuterica responsaacutevel pelo transporte do ferro Possui
uma estrutura monomeacuterica glicosilada (CECCHINI amp Nus 1986 WELCHS 1990 PENHALLOW
et ai 1991 CUNHA 1994)
O polimorfismo geneacutetico desta proteiacutena foi detectado em vaacuterias espeacutecies de Ungulados
(KRISTJANSSON 1963 STORMONT et ai 1963 ASHTON 1965 GAHNE et ai 1977 CECCHJNI
amp Nus 1986 ERHARD 1986 KUROSAWA amp TANAKA 1988 PENEDO et ai 1988 CLARKE et
ai 1989 HERZOG 1989 JUNEJA et ai 1989 TSUJI et ai 1989 SCHNEIDER et ai 1990
STRATIL et ai 1990 WANG et ai 1990 SELVARAJ et ai 1991 DRATCH et ai 1992
VANKAN amp BELL 1992a CIacuteZovket ai 1993 ERHARD et ai 1993)
ASHTON em 1965 descreveu pela primeira vez o polimorfismo geneacutetico de TF em
bovinos estando actualmente descritos sete alelos TFA TFB TFD1 TFD2 TFE
TFF e TFG (CECCHTNI amp Nus 1986) A subdivisatildeo do alelo TFD em TFD1 e TFD2 foi
descrita por KRISTJANSSON amp HICKMAN (1965)
Nos bovinos os loci TF e CP encontram-se ligados como tem sido descrito para vaacuterias
espeacutecies de mamiacuteferos (JUNEJA et ai 1989)
bull GC
A GC apresenta uma estrutura monomeacuterica e o seu polimorfismo geneacutetico estaacute descrito
em vaacuterias espeacutecies de Ungulados (GAHNE 1963 KRISTJANSSON 1963 JUNEJA et ai 1987
PENEDO et ai 1988 PENEDO amp JUNEJA 1989 KALAacuteB et ai 1990 ERHARDT 1991 VANKAN
amp BELL 1992b STERN et ai 1992 ERHARDT amp SIMIANER 1993 STRATIL et ai 1995)
Nos bovinos o polimorfismo geneacutetico da GC foi inicialmente descrito por GAHNE
(1963) e ASHTON (1963) in GAHNE et ai 1977) mas soacute mais tarde foi possiacutevel obter
frequecircncias geacutenicas para este locus (alelos GCA e GCB) em diferentes raccedilas europeias
(GAHNE et ai 1977) A utilizaccedilatildeo de novas teacutecnicas de separaccedilatildeo permitiu distinguir um
terceiro alelo GCC (VAN DE WEGHE 1982)
23
Material e Meacutetodos
A existecircncia de ligaccedilatildeo factorial entre os loci ALB e GC foi demostrada no Homem
em primeiro lugar e depois nos cavalos nos bovinos e na ovelha (VAN DE WEGHE 1982
ERHARDT amp SlMIANER 1993)
23 - TRATAMENTO DAS AMOSTRAS
bull HB
A separaccedilatildeo da moleacutecula HB por focagem isoeleacutectrica foi feita mediante a utilizaccedilatildeo de
hemolisados diluiacutedos 18 em aacutegua bidestilada
bull CAII
A separaccedilatildeo electroforeacutetica de CAII foi realizada em gel de amido e em focagem
isoeleacutectrica No primeiro caso as amostras foram simplesmente tratadas com tolueno
enquanto no segundo se procedeu ainda agrave sua reduccedilatildeo com uma soluccedilatildeo de ditiotreitol
(DTT) 120 mM (100 uacute de amostra natildeo diluiacuteda e 20 pi de DTT 120 mM) durante 1 h a 37degC
Quando se utilizou focagem isoeleacutectrica aleacutem do tratamento jaacute referido foi necessaacuterio
realizar uma diluiccedilatildeo final de 110 com aacutegua bidestilada
bull PEPB DIA NP MDH PGP GPI e MPI
As separaccedilotildees electroforeacuteticas de PEPB DIA NP MDH PGD GPI e MPI em gel de
amido foram efectuadas com hemolisados natildeo diluiacutedos submetidos ao mesmo tratamento
descrito para CAII quando separada por electroforese convencional
24
Material e Meacutetodos
bull ALB
Na separaccedilatildeo de ALB por focagem isoeleacutectrica utilizaram-se amostras de plasma
diluiacutedas com aacutegua bidestilada na proporccedilatildeo de 170
bull TF
Na separaccedilatildeo de TF efectuada por focagem isoeleacutectrica utilizaram-se amostras de
plasma submetidas a vaacuterios tipos de tratamento para comparaccedilatildeo dos padrotildees de bandas
obtidos
1 Remoccedilatildeo dos resiacuteduos de aacutecido siaacutelico da moleacutecula de TF
diluiccedilatildeo 13 com neuraminidase durante 1 h a 37 degC
2 Remoccedilatildeo do Fe da moleacutecula de TF
diluiccedilatildeo 13 com EDTA-dissoacutedico (20) 2 h antes da aplicaccedilatildeo para remoccedilatildeo dos
aacutetomos de Fe da moleacutecula de TF
3 Saturaccedilatildeo em Fe da moleacutecula de TF
31 - diluiccedilatildeo 13 com soluccedilatildeo de sulfato de amoacutenio feacuterrico 015 (pv) em aacutecido
ciacutetrico 60 mM seguida de incubaccedilatildeo agrave temperatura ambiente 18 h A utilizaccedilatildeo
de uma razatildeo ligante Fe de 201 permite uma raacutepida saturaccedilatildeo da moleacutecula de
TF (FERRAND 1995)
32 - diluiccedilatildeo 13 com soluccedilatildeo de sulfato de amoacutenio ferroso 015 (pv) em aacutecido
ciacutetrico 60 mM seguida de incubaccedilatildeo agrave temperatura ambiente 18 h
33 - diluiccedilatildeo 13 com soluccedilatildeo de citrato de amoacutenio feacuterrico 015 (pv) em aacutecido
ciacutetrico 60 mM seguida de incubaccedilatildeo agrave temperatura ambiente 18 h
34 - diluiccedilatildeo 13 com soluccedilatildeo de citrato feacuterrico 015 (pv) em aacutecido ciacutetrico
60 mM seguida de incubaccedilatildeo agrave temperatura ambiente 18 h
35 - diluiccedilatildeo 13 com soluccedilatildeo de cloreto de ferro 015 (pv) em aacutecido ciacutetrico
60 mM seguida de incubaccedilatildeo agrave temperatura ambiente 18 h
25
Material e Meacutetodos
Antes da inserccedilatildeo as amostras foram parcialmente purificadas atraveacutes da adiccedilatildeo de 5
volumes de uma soluccedilatildeo de rivanol 06 (pv) em tampatildeo Tris HC1 005 M (ajusta-se o pH
para valores de 91 com Tris 1 M) seguida de centrifugaccedilatildeo
bull GCcedil
A fim de proceder agrave remoccedilatildeo dos resiacuteduos de aacutecido siaacutelico existente nas cadeias de
hidratos de carbono ligadas agrave moleacutecula GC as amostras de plasma foram submetidas a uma
incubaccedilatildeo com uma soluccedilatildeo de neuraminidase Clostridium perfringens SIGMA type V 18
Uml) na proporccedilatildeo de 13 durante 18 h a 37degC acrescentando-se posteriormente aacutegua
bidestilada ateacute agrave obtenccedilatildeo de uma diluiccedilatildeo final de 14 Paralelamente procedeu-se a uma
diluiccedilatildeo das amostras com aacutegua bidestilada (19) para comparaccedilatildeo dos padrotildees de bandas
obtidos
24 - MEacuteTODOS DE SEPARACcedilAtildeO
Electroforese convencional
Nas teacutecnicas de electroforese convencional foram utilizados vaacuterios sistemas de tampatildeo
para os geacuteis e para as pontes conforme a proteiacutena em estudo
Focagem isoeleacutectrica
Os sistemas de focagem isoeleacutectrica utilizados na separaccedilatildeo de proteiacutenas foram
realizados em matrizes de poliacrilamida (T = 5 C = 3) com dimensotildees 230xl00x03mm
Os geacuteis foram aplicados sobre uma peliacutecula de suporte GELFIX (SERVA) permitindo o seu
manuseamento adequado
A adiccedilatildeo de soluccedilotildees de TEMED 10 (pv) e persulfato de amoacutenio (PSA) 10 (pv)
permitiu a polimerizaccedilatildeo do gel agrave temperatura ambiente (24 horas) ou a 37 degC durante 1 h
As separaccedilotildees por focagem isoeleacutectrica decorreram sobre placa de arrefecimento a
aproximadamente 10degC (8 - 12degC)
26
Material e Meacutetodos
HB
A separaccedilatildeo da moleacutecula de HB foi realizada por focagem isoeleacutectrica em gradiente de
pH livre segundo a teacutecnica descrita por FERRAND (1995) com algumas modificaccedilotildees
A composiccedilatildeo da soluccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo e os paracircmetros eleacutectricos utilizados estatildeo
indicados nas tabelas 241 e 242 respectivamente
Tabela 241 Soluccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo utilizada para a separaccedilatildeo da moleacutecula nativa de HB por focagem isoeleacutectrica
Componentes da soluccedilatildeo Quantidades
Acrilamida 28 (pv)
Bisacrilamida 2 (pv)
Sacarose
Anfoacutelitos 5-8 (SIGMA)
7-9 (PHARMACIA)
Aacutegua bidestilada TEMED 10 (vv)
PSA 10 (pv)
18 ml
08 ml
2 g
300 p1
300 ul
ateacute 10 ml volume final
10 ul
70 ul
Tabela 242 Paracircmetros eleacutectricos utilizados na focagem isoeleacutectrica de HB
Voltagem (V) Corrente (mA) Potecircncia (W) Tempo (T)
Preacute focagem 1500 25 1
2
3
30 min
15 min
15 min
Focagem 1500 25 15 2h 30 min
As soluccedilotildees para os eleacutectrodos foram aacutecido aspaacutertico 004 M (acircnodo) e NaOH 01 M
(caacutetodo) As amostras foram aplicadas a 15 cm do caacutetodo tendo sido inseridas com o auxiacutelio
de um aplicador de borracha silicone (SERVA)
27
Material e Meacutetodos
bull CAII
A separaccedilatildeo de CAII fez-se em gel de amido (15 pv SIGMA) conforme o descrito
por AMORIM (1983) com algumas modificaccedilotildees e ainda por focagem isoeleacutectrica em
gradiente de pH livre
Utilizam-se os seguintes sistemas tampatildeo para a separaccedilatildeo por electroforese em gel de
amido
Tampatildeo das Pontes Tris 0250 M pH = 76 Aacutecido ciacutetrico 0067 M
Tampatildeo do Gel Diluiccedilatildeo 110 do tampatildeo das pH = 76 pontes
As amostras foram inseridas em meio Sephadex G-200 (PHARMACIA) na proporccedilatildeo
de 11 As electroforeses foram realizadas em placa de arrefecimento (8degC) e com um
gradiente de potencial de 5 Vcm durante 16 h
A teacutecnica utilizada para a separaccedilatildeo de CAII por focagem isoeleacutectrica foi a descrita por
BOWLING et ai (1990) com algumas modificaccedilotildees A composiccedilatildeo da soluccedilatildeo de
polimerizaccedilatildeo e os paracircmetros eleacutectricos utilizados estatildeo indicados nas tabelas 243 e 244
respectivamente
As soluccedilotildees para os eleacutectrodos foram aacutecido aspaacutertico 004 M (acircnodo) e NaOH 01 M
(caacutetodo) As amostras foram inseridas com o auxiacutelio de um aplicador de borracha silicone
(SERVA) colocado a 15 cm do caacutetodo
28
Material e Meacutetodos
Tabela 243 Soluccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo utilizada na separaccedilatildeo de CAII por focagem isoeleacutectrica
Componentes da soluccedilatildeo
Acrilamida 28 (pv)
Bisacrilamida 2 (pv)
Sacarose
Anfoacutelitos 4-65 (PHARMACIA)
Anfoacutelitos 35-10 (PHARMACIA)
Aacutegua bidestilada TEMED 10 (vv)
PSA 10 (pv)
Quantidades 18 ml
08 ml
2 g
500 |ol
100 ul
ateacute 10 ml volume final
10 ul
70 ul
Tabela 244 Paracircmetros eleacutectricos utilizados na separaccedilatildeo de CAII por focagem isoeleacutectrica
Voltagem (V) Corrente (mA) Potecircncia (W) Tempo (T)
Preacute focagem 1500 25 1
3
5
30 min
15 min
15 min
Focagem 2500 25 8
10
12
30 min
30 min
30 min
bull PEPB
A separaccedilatildeo da PEPB foi realizada em gel de amido (15 pv SIGMA) de acordo
com a teacutecnica descrita por POVEY et ai (1972) com algumas modificaccedilotildees
29
Material e Meacutetodos
Utilizou-se o seguinte sistema tampatildeo
Tampatildeo das Pontes Tris 01 M
pH = 74 NaH2P04 01 M
Tampatildeo do Gel Diluiccedilatildeo 110 do tampatildeo das
pH = 74 pontes
As amostras satildeo inseridas em meio Sephadex G-200 (PHARMACIA) na proporccedilatildeo de
11 As electroforeses foram realizadas em placas de arrefecimento (8degC) e com um gradiente
de potencial de 5 Vcm durante 16 h
bull DIA
No caso da separaccedilatildeo de DIA a teacutecnica eacute idecircntica agrave utilizada para CAII electroforese
em gel de amido (15 pv SIGMA) conforme o descrito por AMORIM (1983) com algumas
modificaccedilotildees
bull NP MDH PGD GPJ e MPI
As separaccedilotildees das enzimas NP MDH PGD GPI e MPI fizeram-se em simultacircneo por
electroforese em gel de amido (15 pv SIGMA) conforme o descrito por AMORIM et ai
(1982) com algumas modificaccedilotildees
Utilizou-se o seguinte sistema tampatildeo
1130 M
0400 M
0020 M 0010 M
Tampatildeo das Pontes NaOH
pH = 60 Aacutecido ciacutetrico
Tampatildeo do Gel HisHCl
pH = 60 NaOH
30
Material e Meacutetodos
As amostras foram inseridas em meio Sephadex G-200 (PHARMACIA) na proporccedilatildeo
de 11 As electroforeses foram realizadas em placas de arrefecimento (8degC) e com um
gradiente de potencial de 8 Vcm durante 15 h
ALB
Nas tabelas 245 e 246 indicam-se respectivamente a composiccedilatildeo da soluccedilatildeo de
polimerizaccedilatildeo para a separaccedilatildeo de ALB por focagem isoeleacutectrica segundo a teacutecnica descrita
por ROCHA et ai (1991) com algumas modificaccedilotildees e os paracircmetros eleacutectricos
Tabela 245 Soluccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo utilizada para a separaccedilatildeo de ALB por focagem isoeleacutectrica
Componentes da soluccedilatildeo Quantidades
Acrilamida 28 (pv)
Bisacrilamida 2 (pv)
Ureia
Anfoacutelitos 5-6 (PHARMACIA)
Anfoacutelitos 5-8 (PHARMACIA)
Anfoacutelitos 6-8 (PHARMACIA)
Aacutegua bidestilada TEMED 10 (vv)
PSA 10 (pv)
18 ml
08 ml
48 g
250 ni
250 ni
125 ul
ateacute 10 ml volume final
30 ul
70 ul
Tabela 246 Paracircmetros eleacutectricos utilizados na separaccedilatildeo de ALB por focagem isoeleacutectrica
Voltagem (V) Corrente (mA) Potecircncia (W) Tempo (T)
Preacute focagem 1500 25
Focagem 1500 25
1 30 min
2 15 min
3 15 min
4 3 h
5 30 min
31
Material e Meacutetodos
As soluccedilotildees para os eleacutectrodos foram aacutecido aspaacutertico 004 M (acircnodo) e NaOH 1 M
(caacutetodo) As amostras foram aplicadas a 15 cm do caacutetodo com o auxiacutelio de um aplicador de
borracha silicone (SERVA)
TF
A separaccedilatildeo da moleacutecula de TF foi efectuada por focagem isoeleacutectrica A composiccedilatildeo
da soluccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo e os paracircmetros eleacutectricos utilizados estatildeo indicados nas tabelas
247 e 248 respectivamente
Tabela 247 Soluccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo utilizada para a separaccedilatildeo da TF por focagem isoeleacutectrica
Componentes da soluccedilatildeo Quantidades
Acrilamida 28 (pv)
Bisacrilamida 2 (pv)
Sacarose
Anfoacutelitos 35-5(LKB)
Anfoacutelitos 4-65 (PHARMACIA)
Aacutegua bidestilada
TEMED 10 (vv) PSA 10 (pv)
18 ml
08 ml
2 g
100 ul
500 ul
ateacute 10 ml volume final
30 ul
70 ul
Tabela 248 Paracircmetros eleacutectricos utilizados na separaccedilatildeo de TF por focagem isoeleacutectrica
Voltagem (V) Corrente (mA) Potecircncia (W) Tempo (T)
Preacute focagem 1500 25
Focagem 2500 25
l 20 min
2 10 min
3 10 min
8 30 min
10 30 min
12 30 min
32
Material e Meacutetodos
As soluccedilotildees para os eleacutectrodos foram de aacutecido aspaacutertico 004 M (acircnodo) e de NaOH
1 M (caacutetodo) As amostras foram aplicadas a 15 cm do caacutetodo com o auxiacutelio de um aplicador
de borracha silicone (SERVA)
GC
Nas tabelas 249 e 2410 apresenta-se respectivamente a composiccedilatildeo da soluccedilatildeo de
polimerizaccedilatildeo e os paracircmetros eleacutectricos utilizados na focagem isoeleacutectrica de GC
Tabela 249 Soluccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo utilizada para a separaccedilatildeo da GC por focagem isoeleacutectrica
Componentes da soluccedilatildeo Quantidades
Acrilamida 28 (pv)
Bisacrilamida 2 (pv)
Sacarose
Anfoacutelitos 45-54 (PHARMACIA)
Anfoacutelitos 4-6 (LKB)
Aacutegua bidestilada TEMED 10 (vv)
PSA 10 (pv)
18 ml
08 ml
2 g
437 ul
188 (il
eacute 10 ml volume final
10 ul
70 ul
Tabela 2410 Paracircmetros eleacutectricos utilizados na separaccedilatildeo de GC por focagem isoeleacutectrica
Voltagem (V) Corrente (mA) Potecircncia (W) Tempo (T)
Preacute focagem 1500 25
Focagem 1500 25
1 30 min
2 15 min
3 15 min
4 3 h
5 30 min
33
Material e Meacutetodos
Para os eleacutectrodos foram utilizadas soluccedilotildees de aacutecido aspaacutertico 004 M (acircnodo) e de
NaOH 02 M (caacutetodo) As amostras foram inseridas com o auxiacutelio de um aplicador de
borracha silicone (SERVA) colocado a 15 cm do caacutetodo
25 - MEacuteTODOS DE DETECCcedilAtildeO
Apoacutes a separaccedilatildeo das proteiacutenas os padrotildees electroforeacuteticos foram geralmente obtidos
por detecccedilatildeo especiacutefica aproveitando a actividade cataliacutetica das enzimas Noutros casos a
revelaccedilatildeo foi feita por coloraccedilatildeo geral de proteiacutenas
bull HB
A visualizaccedilatildeo da HB foi obtida mediante coloraccedilatildeo geral de proteiacutenas segundo o
seguinte procedimento
Fixaccedilatildeo
Imersatildeo do gel numa soluccedilatildeo de aacutecido tricloroaceacutetico 125 (pv) durante 10 minutos
Coloraccedilatildeo geral de proteiacutenas
Coloraccedilatildeo com uma soluccedilatildeo de Coomassie R-250 0115 (pv) numa mistura de aacutecido
aceacuteticoetanolaacutegua destilada (42571) apoacutes aquecimento seguida de filtraccedilatildeo durante
5-10 minutos A descoloraccedilatildeo eacute feita com aacutecido aceacutetico etanol e aacutegua destilada
aquecida a cerca de 60degC ateacute se obter o contraste desejado
bull CAII
Apoacutes separaccedilatildeo por electroforese em gel de amido visualizou-se a CAII pela sua
actividade esteraacutesica adicionando-se diacetato de fluoresceiacutena (em quantidades vestigiais que
34
Material e Meacutetodos
foram previamente dissolvidas em 200 uacute de acetona) a uma soluccedilatildeo de incubaccedilatildeo tamponada
(pH = 66) Esta soluccedilatildeo de incubaccedilatildeo eacute composta por aacutecido ciacutetrico 27 mM e Na2HP04
116 mM e foi aplicada sobre o gel de amido com o auxiacutelio de papeacuteis de filtro Whatman ndegl
Em seguida incubou-se durante 30 minutos a 37degC A observaccedilatildeo das bandas de CAII (devido
agrave sua capacidade esteraacutesica) eacute feita sob luz ultravioleta
Apoacutes separaccedilatildeo por focagem isoeleacutectrica utilizou-se uma coloraccedilatildeo geral de proteiacutenas
para visualizaccedilatildeo da CAII segundo o meacutetodo descrito para a HB sem fixaccedilatildeo
bull PEPB
A detecccedilatildeo da PEPB apoacutes a separaccedilatildeo electroforeacutetica foi feita atraveacutes da aplicaccedilatildeo
sobre o gel de amido de papeacuteis de filtro Whatman ndegl embebidos numa soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo
seguindo-se uma incubaccedilatildeo de 30 minutos a 37degC
A soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo conteacutem o substrato da PEPB L-leucilglicil-glicina 0004 M
veneno de cobra da espeacutecie Agkistrodon piscivorus piscivorus 04 (pv) MTT 24 mM e
metosulfato de fenazina (PMS) 03 mM num tampatildeo de pH = 80 (Tris HC1005 M)
bull DIA
Apoacutes a separaccedilatildeo por electroforese em gel de amido a identificaccedilatildeo da DIA foi obtida
pela adiccedilatildeo de uma soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo a uma fatia do gel A incubaccedilatildeo decorreu durante 2
horas a 37degC
A soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo foi realizada em duas fases
Io - colocou-se 26-diclorofenol-indofenol (DCIP) 01 mM com um tampatildeo de
pH = 85 (Tris HC1 005M) adicionando-se agrave mistura aacutegua bidestilada ateacute perfazer
50 ml Em seguida filtrou-se a soluccedilatildeo
2o - agrave soluccedilatildeo filtrada adicionou-se MTT 03 mM e NADH 02 mM e agitou-se antes
de verter sobre a fatia de gel de amido
35
Material e Meacutetodos
bull NP
A detecccedilatildeo da enzima NP apoacutes a separaccedilatildeo por electroforese foi feita atraveacutes da
aplicaccedilatildeo sobre o gel de amido de papeacuteis de filtro Whatman ndegl embebidos com a soluccedilatildeo de
coloraccedilatildeo Em seguida incubou-se durante 15 minutos a 37degC
A soluccedilatildeo de incubaccedilatildeo conteacutem inosina 37 mM MTT 24 mM XOD 0004 Uml uma
gota de azul de Meldola (SIGMA) (10 vv em aacutegua bidestilada) e uma soluccedilatildeo de tampatildeo
de incubaccedilatildeo pH = 75 constituiacuteda por KH2P04 005 M e NaOH 004 M
bull MDH
Na detecccedilatildeo da actividade enzimaacutetica de MDH foi utilizado o meacutetodo de sandwich
apoacutes a sua separaccedilatildeo electroforeacutetica em gel de amido Em seguida incubou-se durante 15
minutos a 37degC O meacutetodo de sandwich consiste na aplicaccedilatildeo de uma fatia de gel de amido
entre duas folhas de papel de filtro Whatman ndegl embebido com a soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo
A soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo utilizada na detecccedilatildeo da MDH conteacutem NAD 1 mM MTT
2 mM e piruvato de soacutedio (quantidades vestigiais) Esta soluccedilatildeo foi feita com um tampatildeo de
incubaccedilatildeo pH = 74 constituiacutedo por aacutecido maacutelico 0222 M Tris 050 M e MgCl2 002 M
bull PGP
A detecccedilatildeo da actividade enzimaacutetica de PGD foi feita pelo meacutetodo de sandwich apoacutes a
sua separaccedilatildeo electroforeacutetica em gel de amido
A soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo conteacutem quantidades vestigiais de aacutecido 6-fosfoglucoacutenico
NADP MTT e uma gota de azul de Meldola (05 pv em aacutegua bidestilada) dissolvidos num
tampatildeo de pH = 74 constituiacutedo por Tris 01 M HisHCl 01 M Imidazol 0015 M e MgCl2
0005 M
36
Material e Meacutetodos
bull GPI
A detecccedilatildeo da actividade enzimaacutetica de GPI foi feita pelo meacutetodo de sandwich apoacutes a
sua separaccedilatildeo electroforeacutetica em gel de amido
A soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo conteacutem frutose-6-fosfato 55 mM NADP 22 mM MTT
4 mM desidrogenase da glucose-6-fosfato (G6PD) 14 Uml e uma gota de azul de Meldola
(05 pv em aacutegua bidestilada) dissolvidos num tampatildeo de pH = 74 constituiacutedo por Tris 01
M HisHCl 01 M Imidazol 0015 M e MgCl2 0005 M
bull MPI
Detectou-se a actividade enzimaacutetica de MPI pelo meacutetodo de sandwich apoacutes a sua
separaccedilatildeo electroforeacutetica em gel de amido
A soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo conteacutem manose-6-fosfato 42 mM NADP 13 mM MTT
24 mM e uma gota de azul de Meldola (05 pv em aacutegua bidestilada) dissolvidos num
tampatildeo de pH = 74 constituiacutedo por Tris 01 M HisHCl 01 M Imidazol 0015 M e MgCl2
0005 M Por fim adicionaram-se as enzimas isomerase da glucose-6-fosfato (GPI) 3 Uml e
desidrogenase da glucose-6-fosfato (G6PD) 5 Uml
bull ALBeTF
A detecccedilatildeo de ALB e de TF foi efectuada atraveacutes do meacutetodo de coloraccedilatildeo geral de
proteiacutenas descrito para a HB utilizando-se Coomasie R-250 sem fixaccedilatildeo
bull GCcedil
A visualizaccedilatildeo de GC efectuou-se por detecccedilatildeo imunoenzimaacutetica apoacutes transferecircncia da
proteiacutena para uma membrana de nitrocelulose (045 pm SCHLEICHER amp SCHULL)
segundo a teacutecnica descrita por FERRAND (1995)
37
Material e Meacutetodos
Apoacutes esse processo de transferecircncia as membranas de nitrocelulose foram lavadas 3
vezes (15 minutos) numa soluccedilatildeo de Tween 20 (MERCK) 0025 (vv) em soro fisioloacutegico
tamponado com fosfato (PBS Na2HP04 50 mM KH2P04 18mM NaCl 147 mM pH = 71) e
bloqueadas numa soluccedilatildeo de leite em poacute magro (5 pv em PBS) durante 18 h com agitaccedilatildeo
permanente e agrave temperatura ambiente
Depois da primeira lavagem aplicou-se o antisoro (anti-GC humana ATAB 81936)
diluiacutedo 1170 em PBS com 1 (pv) de albumina seacuterica bovina (SIGMA) durante 1 h agrave
temperatura ambiente
Repetiu-se novamente a lavagem segundo o processo jaacute referido seguindo-se a
aplicaccedilatildeo do segundo antisoro (anticorpos contra imunoglobulinas caprinas desenvolvidos em
coelho e conjugados com uma peroxidase ATAB 83806) diluiacutedo 1600 em PBS com 1
(pv) de albumina seacuterica bovina (SIGMA) durante 1 h agrave temperatura ambiente
Depois de duas lavagens (5 minutos) com Tween 20PBS procedeu-se agrave detecccedilatildeo da
GC com uma soluccedilatildeo de 9-amino-2-etilcarbazol 004 (pv) e de metanol 20 (vv) em PBS
As bandas correspondentes agrave actividade peroxidaacutesica aparecem rapidamente bloqueando-se a
reacccedilatildeo com aacutegua bidestilada
26 - MEacuteTODOS DE CAacuteLCULO
As frequecircncias geacutenicas foram calculadas por contagem directa de genes a partir da
distribuiccedilatildeo fenotiacutepica obtida
O caacutelculo dos valores de heterozigotia meacutedia (H) da proporccedilatildeo de loci polimoacuterficos
(P) do nuacutemero meacutedio de alelos por locus (ria) estatiacutesticas F e frequecircncias fenotiacutepicas
esperadas segundo o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg foi efectuado com a utilizaccedilatildeo do
programa BIOSYS versatildeo 17 (SWOFFORD amp SELANDER 1989)
O caacutelculo de distacircncias geneacuteticas e obtenccedilatildeo de dendrogramas foi efectuado com o
programa PHYLIP versatildeo 35 (FELSENTEIN 1993)
38
Resultados e Discussatildeo
3 - RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
31 - ANAacuteLISE DOS MEacuteTODOS DE SEPARACcedilAtildeO
De entre os 12 loci estudados neste trabalho detectaram-se 5 monomoacuterficos
(PEPB DIA GPI MDH e PGD) e 7 polimoacuterficos (HB CAII NP MPI ALB TF e GC)
Loci monomoacuterficos
bull PEPB
A utilizaccedilatildeo de teacutecnicas de electroforese em gel de amido permitiu a detecccedilatildeo de
um soacute fenoacutetipo (figura 311) correspondente a indiviacuteduos homozigoacuteticos para o alelo
PEPB2 descrito por DEL LAMA et ai (1992) No entanto na raccedila Minhota detectou-se
um indiviacuteduo heterozigoacutetico
O fenoacutetipo PEPB 2 apresenta um padratildeo com duas bandas uma de grande
intensidade e outra secundaacuteria mais anoacutedica de menor intensidade No indiviacuteduo
heterozigoacutetico 2-1 (natildeo representado) observou-se um padratildeo de trecircs bandas sendo a
terceira mais anoacutedica e menos intensa
A quase inexistecircncia de PEPB1 nas raccedilas estudadas estaacute de acordo com o referido
em DEL LAMA et ai (1992) que sugere a fixaccedilatildeo de PEPB2 na maior parte das
populaccedilotildees de bovinos de origem europeia (com excepccedilatildeo das raccedilas italianas Marchigiana
e Chianina)
39
Resultados e Discussatildeo
+
Figura 311 Fenoacutetipos de PEPB observados por electroforese convencional em gel de amido
bull DIA
Os resultados obtidos para a enzima DIA revelaram ausecircncia de polimorfismo
electroforeacutetico (figura 312) Resultados semelhantes foram tambeacutem obtidos em vaacuterias
raccedilas autoacutectones espanholas (GONZALEZ et ai 1987 IGLESIAS 1989 ARRANZ et ai
1992)
MAKAVEEV (1979 in IGLESIAS 1989) detectou polimorfismo desta enzima em
eritroacutecitos de buacutefalos da Bulgaacuteria e nas raccedilas bovinas Frisia e Simmental descrevendo dois
alelos codominantes DIAA e DIAB
Figura 312 Padratildeo de DIA observado por electroforese convencional em gel de amido
40
Resultados e Discussatildeo
Natildeo se detectou variaccedilatildeo electroforeacutetica para o locus GPI Estes resultados natildeo se
podem comparar com os obtidos noutras raccedilas por natildeo ter sido possiacutevel consultar outros
trabalhos onde se descrevesse variaccedilatildeo do locus GPI em gado bovino
A figura 313 apresenta o padratildeo obtido para esta enzima observando-se trecircs
bandas duas com grande intensidade e uma banda mais anoacutedica de menor intensidade
Figura 313 Padratildeo de GPI obtido em hemolisados por electroforese convencional em gel de amido
bull MDH
A enzima MDH revelou-se monomoacuterfiacuteca Este resultado eacute concordante com outros
estudos (ARRANZ et ai 1992)
Na figura 314 observa-se o padratildeo de bandas detectado por electroforese
convencional em gel de amido
Figura 314 Padratildeo de MDH observado por electroforese convencional em gel de amido
41
Resultados e Discussatildeo
bull PGD
A enzima PGD revelou-se monomoacuterfica para as raccedilas Barrosatilde e Minhota tambeacutem
neste caso natildeo se encontrou qualquer referecircncia bibliograacutefica relativa a um possiacutevel
polimorfismo deste locus em gado bovino
Na figura 315 observa-se o padratildeo obtido para esta enzima Em amostras
armazenadas por um longo periacuteodo de tempo detectaram-se duas bandas sendo a mais
anoacutedica a que revela menor intensidade as amostras mais recentes apresentam um padratildeo
electroforeacutetico com uma soacute banda
Figura 315 Padratildeo de PGD observado por electroforese convencional em gel de amido
Loci polimoacuterficos
bull HB
A electroforese convencional natildeo permite discriminar os electromorfos de HB No
entanto a utilizaccedilatildeo de sistemas de focagem isoeleacutectrica conduz agrave detecccedilatildeo de
polimorfismo nesta proteiacutena observando-se dois fenoacutetipos HB A e HB AB
Na figura 316 observa-se o padratildeo electroforeacutetico desta moleacutecula resultante da
expressatildeo de dois alelos codominantes HBA e HBB Resultados idecircnticos estatildeo
descritos em raccedilas bovinas da Peniacutensulas Ibeacuterica (VICENTE 1978 KiDD et ai 1980
IGLESIAS 1989)
42
Resultados e Discussatildeo
+ -HBB
HBA
AB AB A A
Figura 316 Separaccedilatildeo de hemoglobina nativa por focagem isoeleacutectrica
bull poundAH
A utilizaccedilatildeo de electroforese em gel de amido e focagem isoeleacutectrica permitiu
identificar trecircs fenoacutetipos CAII F CAII FS e CAII S atribuiacutedos agrave expressatildeo de dois alelos
codominantes CAF e CAS (figuras 317 e 318) Poreacutem a separaccedilatildeo por electroforese em
gel de amido implica alguma morosidade (tempos de corrida muito longos) e em amostras
coaguladas o erro de leitura pode ser superior a 20 Estas dificuldades satildeo minimizadas
quando se recorre a focagem isoeleacutectrica
Assim a separaccedilatildeo da enzima CAII por focagem isoeleacutectrica oferece vaacuterias vantagens
nomeadamente
bull rapidez e simplicidade de execuccedilatildeo
bull utilizaccedilatildeo de pequenas quantidades de material bioloacutegico
bull maior nuacutemero de amostras fenotipadas por corrida
bull possibilidade de utilizaccedilatildeo de amostras coaguladas
43
Resultados e Discussatildeo
F F F S FS FS F S FS
Figura 317 Fenoacutetipos de CAII observados sob luz ultravioleta apoacutes separaccedilatildeo por electroforese convencional em gel de amido e coloraccedilatildeo com diacetato de fluoresceina
CAIIF
| CAIIS
Figura 318 Fenoacutetipos de CAII observados por focagem isoeleacutectrica apoacutes coloraccedilatildeo geral de proteiacutenas
bull NP
A expressatildeo fenotiacutepica de NP resulta das combinaccedilotildees possiacuteveis entre um alelo
dominante NPH e um recessivo NPL (ANSAY 1973) Este facto implica que apenas em
presenccedila do feno tipo NP L eacute possiacutevel fazer corresponder um genoacutetipo (jaacute que o fenoacutetipo NP H
pode corresponder aos genoacutetipos HH e HL e o fenoacutetipo NP L corresponde ao genoacutetipo LL)
Na figura 319 apresenta-se o padratildeo obtido para a proteiacutena apoacutes separaccedilatildeo
electroforeacutetica em gel de amido
44
+
w
FS FS ]
Resultados e Discussatildeo
H L L H L L
Figura 319 Fenoacutetipos de NP detectados por electroforese convencional em gel de amido
bull MPI
Na raccedila Minhota detectaram-se quatro fenoacutetipos MPI AB MPI B MPI BC e MPI C
anteriormente descritos por ANSAY (1973) em bovinos na raccedila Barrosatilde apenas se observam
os trecircs uacuteltimos fenoacutetipos De acordo com o mesmo autor os fenoacutetipos encontrados nesta raccedila
resultam da combinaccedilatildeo de dois alelos codominantes MPIB e MPPC enquanto que MPIA
aparece na raccedila Minhota com uma frequecircncia reduzida
Como se pode observar pela anaacutelise da figura 3110 MPIA aparece como o alelo
mais anoacutedico MPIC como o mais catoacutedico e o alelo mais frequente MPIB situa-se numa
posiccedilatildeo intermeacutedia em relaccedilatildeo aos anteriores Contudo a intensidade das bandas eacute muito
fraca tornando-se quase imperceptiacutevel em alguns casos Esta grande dificuldade em obter um
contraste de bandas adequado mesmo apoacutes longos periacuteodos de incubaccedilatildeo a 37degC poderaacute
eventualmente levar a uma incorrecta interpretaccedilatildeo dos fenoacutetipos Assim a utilizaccedilatildeo de
sistemas de focagem isoeleacutectrica na determinaccedilatildeo destes fenoacutetipos seria aconselhaacutevel a fim
de verificar os resultados obtidos por electroforese convencional
45
Resultados e Discussatildeo
Figura 3110 Fenoacutetipos de MPI observados por electroforese convencional em gel de amido
bull ALB
A separaccedilatildeo por focagem isoeleacutectrica permitiu detectar polimorfismo em ALB Cada
indiviacuteduo homozigoacutetico aparece com trecircs bandas duas de maior intensidade e uma mais
aciacutedica com menor intensidade os indiviacuteduos heterozigoacuteticos podem apresentar ateacute seis
bandas
Esta heterogeneidade nos padrotildees de ALB tem sido interpretada como o resultado da
capacidade desta proteiacutena se ligar a vaacuterias substacircncias diferentes (FERRAND 1995) Com a
inclusatildeo de ureia (8M) na matriz de separaccedilatildeo reagente que provoca a desnaturaccedilatildeo da
proteiacutena levando a uma alteraccedilatildeo do seu pi para uma zona mais baacutesica do gradiente
conseguem-se obter padrotildees de bandas mais simples e mais definidos (KAWAGUCHI 1973
FERRAND 1995)
Na figura 3111 apresentam-se os padrotildees observados que foram interpretados como
sendo determinados por trecircs alelos codominantes ALBA ALBB e ALBV
GAHNE et ai (1977) e IGLESIAS (1989) detectaram por electroforese em gel de
poliacrilamida e de amido respectivamente dois variantes em gado bovino ALBA e
ALBB A utilizaccedilatildeo de focagem isoeleacutectrica veio confirmar a existecircncia destes dois alelos e
acrescentar um terceiro designado por ALBV com uma mobilidade mais aciacutedico do que
ALBA
46
Resultados e Discussatildeo
A B A B A B B B A B A G
Figura 3111 Fenoacutetipos de ALB determinados em amostras de plasma por focagem isoeleacutectrica na presenccedila de ureia 8M
ARRANZ et ai (1992) revelaram a existecircncia de um outro variante (ALBD) com
mobilidade electroforeacutetica intermeacutedia entre ALBA e ALBB ainda natildeo descrito em
nenhuma raccedila autoacutectone espanhola Este alelo poderaacute corresponder ao alelo ALBV
encontrado neste trabalho apesar de apresentar um pi mais aacutecidico do que ALBA (ARRANZ
comunicaccedilatildeo pessoal)
Desta forma a teacutecnica de separaccedilatildeo por focagem isoeleacutectrica provou ser eficaz na
separaccedilatildeo dos variantes de ALB tal como jaacute foi demonstrado no gato (BELL et ai 1994) na
ovelha (ERHARDT amp SIMIANER 1993) e no coelho (FERRAND amp ROCHA 1992)
bull TF
A transferrina eacute um dos marcadores mais importantes no estudo e caracterizaccedilatildeo
geneacutetica de raccedilas bovinas devido ao seu elevado polimorfismo No entanto a sua fenotipagem
natildeo eacute simples existindo frequentemente problemas de resoluccedilatildeo e de separaccedilatildeo das bandas
(IGLESIAS 1989)
A fim de averiguar qual a melhor forma de separar os diferentes produtos geacutenicos
descritos no locus TF testaram-se vaacuterios sistemas electroforeacuteticos em geacuteis de agarose numa
vasta gama de sistemas tampatildeo Esta teacutecnica natildeo ofereceu resultados satisfatoacuterios pelo que se
passou agrave separaccedilatildeo da TF por focagem isoeleacutectrica recorrendo a matrizes de poliacrilamida
47
Resultados e Discussatildeo
com diferentes concentraccedilotildees de ureia (6M e 8M) tambeacutem neste caso natildeo se conseguiram
resultados positivos
Este tipo de dificuldades encontradas na fenotipagem da TF por focagem isoeleacutectrica
tinham jaacute sido descritos noutras espeacutecies nomeadamente na cabra (ERHARDT 1986) e no
coelho (FERRAND 1995) No entanto TSUJI et ai (1989) demostraram ser possiacutevel fenotipar
esta proteiacutena em bovinos por focagem isoeleacutectrica sem grandes problemas e sem qualquer
aditivo na matriz de poliacrilamida
Desta forma a utilizaccedilatildeo de uma teacutecnica de focagem isoeleacutectrica com um gradiente de
pH 35-65 reforccedilado em 40-65 permitiu separar os produtos geacutenicos do locus TF Contudo
os padrotildees obtidos nem sempre eram definidos tornando-se dificilmente interpretaacuteveis
Na tentativa de melhorar os padrotildees de resoluccedilatildeo e de verificar se a variaccedilatildeo detectada
natildeo resultava de diferenccedilas no estado feacuterrico da moleacutecula de TF ou ainda da existecircncia de
aacutecidos siaacutelicos ligados agrave moleacutecula procedeu-se agrave sua separaccedilatildeo apoacutes vaacuterios tratamentos das
amostras
A remoccedilatildeo dos aacutecidos siaacutelicos atraveacutes do tratamento das amostras com neuraminidase
natildeo permitiu a obtenccedilatildeo de bandas definidas este tratamento natildeo altera significativamente o
padratildeo das bandas de TF de bovinos como jaacute tinha sido descrito por PENHALLOU et ai
(1991)
A obtenccedilatildeo de TF no estado apofeacuterrico foi conseguida submetendo as amostras a um
tratamento com EDTA-dissoacutedico Neste caso observa-se que apoTF apresenta uma
mobilidade menor e um padratildeo de bandas mais simples mas ainda sem uma definiccedilatildeo
adequada
A forma Fe2TF foi obtida mediante vaacuterios tratamentos com dadores de Fe (ver capiacutetulo
Material e Meacutetodos) Os resultados soacute se mostraram satisfatoacuterios atraveacutes da saturaccedilatildeo da
moleacutecula de TF com uma soluccedilatildeo de sulfato de amoacutenio feacuterrico provavelmente por causar uma
maior estabilidade da moleacutecula ao longo da sua separaccedilatildeo por focagem isoeleacutectrica com
elevadas voltagens pois segundo WELCHS (1990) a forma difeacuterrica da transferrina eacute mais
resistente agrave desnaturaccedilatildeo e ao calor do que a forma apoTF
48
Resultados e Discussatildeo
Estatildeo descritos pelo menos oito alelos no locus TF TFAl TFA2 TFB TFD1
TFD2 TFE TFF e TFG os mais comuns no gado europeu (Bos taurus) satildeo TFA
TFD1 TFD2 e TFE (JAMIESON 1965) No gado asiaacutetico e africano (Bos indicus) ocorrem
aleacutem das formas anteriores os alelos TFB e TFF
Na figura 3112 apresenta-se o proteinograma obtido com a utilizaccedilatildeo de amostras
saturadas com Fe Esta teacutecnica permitiu a separaccedilatildeo de TFD em TFD1 e TFD2 e a
detecccedilatildeo de todos os outros fenoacutetipos descritos em bovinos europeus Assim observaram-se
quatro alelos codominantes TFA TFD1 TFD2 e TFE
A expressatildeo fenotiacutepica dos alelos em homozigotia caracteriza-se pela presenccedila de dois
dupletos de bandas aparecendo a banda mais aciacutedica de cada dupleto com intensidade mais
fraca Os indiviacuteduos herozigoacuteticos podem apresentar ateacute oito bandas
Figura 3112 Fenoacutetipos de TF determinados por focagem isoeleacutectrica apartir de amostras saturadas com uma soluccedilatildeo de sulfato de amoacutenio feacuterrico
IGLESIAS (1989) detectou TFA e TFD nas cinco raccedilas de bovinos da Galiza o
variante TFE na raccedila Cachena espanhola e um outro variante raro TFR com mobilidade
mais lenta na raccedila Rubia Galega
bull QQ
A GC eacute uma proteiacutena plasmaacutetica que demonstra um elevado grau de heterogeneidade
geneacutetica em mamiacuteferos (FERRAND 1995)
A separaccedilatildeo de GC em focagem isoeleacutectrica seguida da utilizaccedilatildeo de immunoblotting
melhorou de forma consideraacutevel a capacidade de investigar a variaccedilatildeo desta proteiacutena em
49
Resultados e Discussatildeo
diferentes espeacutecies (JUNEJA et ai 1987 PENEDO amp JUNEJA 1989 STRATIL et ai 1990
KALAacuteB et ai 1990 STERN et ai 1992 VANKAN amp BELL 1992 FERRAND 1995)
Nas figuras 3113 e 3114 apresentam-se alguns dos fenoacutetipos obtidos na separaccedilatildeo
da GC por focagem isoeleacutectrica Verifica-se que em amostras tratadas com neuraminidase o
padratildeo de bandas se apresenta mais simplificado surgindo no entanto duas bandas (uma
mais baacutesica e uma mais aciacutedica) de natureza desconhecida Os padrotildees observados foram
interpretados como sendo determinados por dois alelos GCF e GCS
mdashGCF
S F S FS S FS F F S FS 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Figura 3113 Fenoacutetipos de GC determinados por focagem isoeleacutectrica amostras 1 8 9 e 10 tratadas com neuraminidase amostras 2 a 7 diluiacutedas em aacutegua bidestilada
S1 $ l S- -
FS S S S F S FS S FS F S
Figura 3114 Fenoacutetipos de GC determinados em amostras de plasma tratados com neuraminidase apoacutes focagem isoeleacutectrica
Nota-se a existecircncia de dois alelos codominantes GCF e GCS sendo o segundo
mais aciacutedico do que o primeiro
50
Resultados e Discussatildeo
32 - ANAacuteLISE FAMILIAR
A realizaccedilatildeo da anaacutelise familiar relativo ao conjunto de loci polimoacuterficos estudados
observa-se no estudo de 27 pares matildeefilho Esta situaccedilatildeo resulta da grande dificuldade
existente na obtenccedilatildeo de informaccedilatildeo sobre os machos
Os resultados apresentam-se nas tabelas 321 a 326 natildeo foi possiacutevel testar o
equiliacutebrio de Hardy-Weinberg devido ao reduzido tamanho da amostra bem como ao facto de
vaacuterios alelos ocorrerem em baixa frequecircncia
Refira-se que natildeo foi detectado qualquer caso de exclusatildeo matildeefilho
Tabela 321 Sistema CAII Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica em 27 pares matildeefilho Os valores esperados segundo o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg estatildeo indicados entre parecircntesis
Total
4 (32) 17
(122) 6
(116) 27
Tabela 322 Sistema NP Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica em 27 pares matildeefilho Os valores esperados segundo o equiliacutebrio de Hardy--Weinberg estatildeo indicados entre parecircntesis
Total
14
(114)
13
(156)
27
^ ^ ^ Filho
Matildee - ^ F
Fenoacutetipos
F f~ (11)
FS 2
(21)
S
Total 3
Fenoacutetipos
FS S
3
(21)
10 5
(61) (40)
1 5
(40) (76)
14 10
- v ^ ^ Filho Fenoacutetipos
Matildee - ^ H L
Fenoacutetipos
H 10 4
(77) (37)
L 5 8
(37) (119)
Total 15 12
51
Resultados e Discussatildeo
Tabela 323 Sistema MPI Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica em 26 pares matildeefilho Os valores esperados segundo o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg estatildeo indicados entre parecircntesis
^ Filho Fenoacutetipos Total
Matildee ^ ~ ^ A AB AC B BC c Fenoacutetipos
A 0 0 0 - - - 0
(00) (00) (00) (00)
AB 0 0 0 0 0 - 0
(00) (00) (00) (00) (00) (00)
AC 0 0 0 - 0 0 0
(00) (00) (00) (00) (00) (00)
B - 0 - 24 1 - 25
(00) (242) (06) (248)
BC - 0 0 1 0 0 1
(00) (00) (06) (06) (00) (12)
C - - 0 - 0 0 0
(00) (00) (00) (00)
Total 0 0 0 25 1 0 26
Tabela 324 Sistema ALB Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica em 27 pares matildeefilho Os valores esperados segundo o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg estatildeo indicados entre parecircntesis
^ ^ Filho Fenoacutetipos Total
M atilde e ^ ^ - s ^ ^ A AB AV B BV V
Fenoacutetipos
A 24 2 0 - - - 26
(251) (04) (02) (257)
AB 0 0 0 0 0 -
0
(04) (04) (00) (00) (00) (08)
AG 1 0 0 - 0 0 1
(02) (00) (02) (00) (00) (04)
B - 0 - 0 0 - 0
(00) (00) (00) (00)
BG - 0 0 0 0 0 0
(00) (00) (00) (00) (00) (00)
G - - 0 - 0 0 0
(00) (00) (00) (00)
Total 25 2 0 0 0 0 27
52
Resultados e Discussatildeo
Tabela 325 Sistema TF Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica em 27 pares matildeefilho Os valores esperados segundo o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg estatildeo indicados entre parecircntesis
Filho Fenoacutetipos Total
Matildee ^ A ADI AD2 AE Dl D1D2 DIE D2 D2E E
Fenoacutetipos
A 6
(51)
1
(14)
4
(21)
1
(03)
12
(89)
ADI 1 2 0 0 0 0 0 - - - 3
(14) (24) (06) (01) (04) (06) (01) (56)
AD2 2 0 5 0 - 0 - 2 0 - 9
(21) (06) (36) (01) (06) (08) (01) (79)
AE 0 0 0 0 - - 0 - 0 0 0
(03) (01) (01) (06) (01) (01) (00) (13) Dl 0
(04) 1
(01)
1
(02)
0
(00)
- 2
(07)
D1D2 - 0 1 - 0 0 0 0 0 - 1
(06) (06) (02) (10) (00) (02) (00) (26) DIE - 0 - 0 0 0 0 - 0 0 0
(01) (01) (00) (00) (02) (00) (00) (04)
D2 0
(08) 0
(02)
0
(03)
0
(01)
- 0
(14) D2E - - 0 0 - 0 0 0 0 0 0
(01) (01) (00) (00) (01) (02) (00) (05) E 0
(00) 0
(00)
0
(00)
0
(00)
0
(00)
Total 9 3 10 1 1 1 0 2 0 0 27
Tabela 326 Sistema GC Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica em 27 pares matildeefilho Os valores esperados segundo o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg estatildeo indicados entre parecircntesis
- - ^ F i l h o Fenoacutetipos Total
Matildee ^ ^ 1 2-1 2
Fenoacutetipos
1 17 2 19
(156) (31) (187)
2-1 5 2 0 7
(31) (38) (06) (75)
2 _ 1 0 1
(06) (01) (07)
Total 22 5 0 27
53
Resultados e Discussatildeo
33 - ANAacuteLISE POPULACIONAL LOCUS A LOCUS
Neste capiacutetulo faz-se a anaacutelise populacional dos loci polimoacuterficos e ainda dos loci
PEPB e DIA para os quais natildeo se detectou variaccedilatildeo na raccedila Barrosatilde A sua inclusatildeo justifica-
-se pelo facto de serem polimoacuterficos noutras raccedilas bovinas ou em espeacutecies aparentadas
bull PEPB
O locus PEPB revelou-se monomoacuterfico nas trecircs populaccedilotildees de bovinos de raccedila
Barrosatilde e Minhota tendo sido detectado um uacutenico produto geacutenico PEPB2 (observado um
indiviacuteduo heterozigoacutetico da raccedila Minhota) No entanto este locus eacute referido como polimoacuterfico
em raccedilas bovinas criadas no Brasil onde se detectaram dois alelos codominantes PEPB1 e
PEPB2 (DEL LAMA et ai 1992)
O alelo PEPB2 estaacute fixado nas raccedilas de origem europeia incluindo as estudadas neste
trabalho excepto nas raccedilas italianas Marchigiana e Chianina nas quais PEPB1 apresenta
frequecircncias geacutenicas entre 011 e 014 (tabela 331)
Tabela 331 Frequecircncias geacutenicas de PEPB em vaacuterias raccedilas bovinas
N
Frequecircncias geacutenicas N PEPB1 PEPB2 Referecircncia
Barrosatilde inscrita 141 - 100 Este trabalho
Barrosatilde natildeo inscrita 153 - 100 t i
Minhota 62 001 plusmn0003 099 plusmn 0003 ec
Blonde dAquitaine 13 - 100 DEL LAMAetal 1992)
Charolesa 118 - 100 laquo
Chianina 83 014 plusmn003 086 plusmn 003 t t
Hereford 79 - 100 et
Frisia 125 - 100 t t
Jersey 139 - 100
Limousine 24 - 100
Marchigiana 85 011 plusmn002 089 plusmn 002 te
Simmental 75 - 100 t t
54
Resultados e Discussatildeo
bull DIA
Pela anaacutelise da tabela 332 verifica-se natildeo existir variaccedilatildeo geneacutetica neste locus nas
raccedilas bovinas apresentadas estando fixado o alelo DIAS os resultados obtidos estatildeo de
acordo com os jaacute publicados por outros autores (GONZALEZ et ai 1987 IGLESIAS 1989) Por
outro lado nas populaccedilotildees de buacutefalos ocorre um segundo alelo DIAF com frequecircncias
entre 019 e 021
Tabela 332 Frequecircncias geacutenicas de DIA em vaacuterias populaccedilotildees de raccedilas bovinas e buacutefalos
Frequecircncias geacutenicas
N DIAF DIAS Referecircncia
Portugal
Barrosatilde inscrita 141
Barrosatilde natildeo inscrita 153
Minhota 62
Espanha
Cachena 71
Caldelana 60
Frieiresa 33
Limiana 39
Rubia Gallega 168
Vianesa 40
Sayaguesa (Zamora) 147
Morucha (Salamanca) 101
Alistana Sanabresa 157
Blanca Cacerena 62
Caacuterdena Andaluza 25
Asturiana de los Vallegraves 127
Asturiana de la Montana 106
Bulgaacuteria
Buacutefalo 122
Murrah (Buacutefalo) 51
raquo IGLESIAS (1989)
- 100 Este trabalho
- 100
- 100 a
- 100 IGLESIAS (1989)
- 100
- 100
- 100
- 100
- 100
- 100 GONZALEZ et al (19
- 100
- 100 st
- 100 st
- 100
- 100
- 100
019 + 00 081 plusmn00 MAKAVEEV(1984
021 plusmn00 079 plusmn 00 laquo
55
Resultados e Discussatildeo
bull HB
Os resultados obtidos no estudo de HB permitiram distinguir dois fenoacutetipos definidos
por dois alelos HBA e HBB (tabela 333)
Tabela 333 Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica de HB em populaccedilotildees das raccedilas Barrosatilde e Minhota Os valores esperados de acordo com o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg estatildeo indicados entre parecircntesis
Fenoacutetipos N HBA HBAB HBB
Barrosatilde inscrita 141 141
Barrosatilde natildeo inscrita 153 153
Minhota 62 56 6 0
(561) (58) (01)
As frequecircncias geacutenicas das raccedilas estudadas bem como outras jaacute publicadas referentes a
vaacuterias raccedilas bovinas europeias e a duas espeacutecies de buacutefalos encontram-se discriminadas na
tabela 334
A elevada frequecircncia do alelo HBA nas raccedilas estudadas (fixado na raccedila Barrosatilde)
situam-nas juntamente com outras raccedilas bovinas do centro e sul da Europa onde este alelo
ocorre com frequecircncias entre 080-098 (VICENTE 1978) Nas restantes raccedilas europeias
HBA ocorre com uma ampla margem de variaccedilatildeo (038 - 100) apresentando-se quase
sempre como o alelo mais frequente
No caso dos buacutefalos observa-se uma inversatildeo nos valores das frequecircncias geacutenicas
sendo o alelo HBB o mais frequente
A presenccedila de HBB nos bovinos europeus apesar de em baixa frequecircncia pode ser
indicativo de uma origem a partir de raccedilas asiaacuteticas ou africanas jaacute que eacute nestes continentes
que este alelo ocorre com frequecircncia mais elevadas as frequecircncias geacutenicas mais elevadas estatildeo
descritas no gado zebu da Aacutefrica (BRAEND 1971 VICENTE 1978)
56
Resultados e Discussatildeo
Tabela 334 Frequecircncias geacutenicas de HB em vaacuterias populaccedilotildees de raccedilas bovinas e buacutefalos
N
Frequecircncias geacutenicas
N HBA HBB Referecircncia
Portugal
Barrosatilde inscrita 141 100 - Este trabalho
Barrosatilde natildeo inscrita 153 100 -
Minhota 62 095 plusmn 002 005 plusmn 002
Mertolenga 147 093 plusmn 002 007 plusmn 002 KTOD et ai (1980)
Alentejana 155 096 plusmn 001 004 plusmn001 IacuteIacute
Mirandesa 107 099+001 001 plusmn001 NOBRE (S data)
Espanha
Cachena 71 091 + 002 009 plusmn 002 IGLESIAS (1989)
Caldelana 60 097 plusmn 002 003 plusmn 002
Frieiresa 33 095 plusmn 003 005 plusmn 003
Limiana 39 090 plusmn 003 010 plusmn003
Rubia Gallega 168 093 plusmn 001 007 plusmn001 ce
Vianesa 40 098 plusmn 002 002 plusmn002
Sayaguesa (Zamora) 147 083 plusmn002 017 plusmn002 GONZALEZ et al ( 1987)
Morucha (Salamanca) 101 084 plusmn 003 016 plusmn003 ce
Alistana Sanabresa 157 099 plusmn 001 001 plusmn001
Blanca Cacerefia 62 071 plusmn 004 029 plusmn 004 laquo
Caacuterdena Andaluza 25 096 plusmn 003 004 plusmn 003 IacuteIacute
Asturiana de los Vallegraves 127 091 plusmn002 009 plusmn002
Pirenaica 383 084 plusmn 001 016 plusmn001 VICENTE (1978)
Tudanca 42 065 plusmn 005 035 plusmn 005 laquo
Morena del N O 25 100 -
Frisona 97 100 - laquo
Asturiana de la Montaria 106 079+003 021 plusmn003
De Lidia 124 079 plusmn 003 021 plusmn003 KlDDeacutetal (1980)
Retinta 164 081 plusmn002 019 plusmn002
Itaacutelia
Chianina 264 096 plusmn 001 004 plusmn 001 CARENZiera (1970)
Marchigiana 112 099 plusmn001 001 plusmn001
Bulgaacuteria
Sofia Brown 173 089 plusmn 002 011 plusmn002 MAKAVEEV (1970)
Buacutefalo 77 009 plusmn 002 091 plusmn002 MAKAVEEV(1984)
Murrah (Buacutefalo) 51 015 plusmn004 085 plusmn 004 ce
G Bretanha
Jersey 467 038 plusmn 002 062 plusmn 002 LARSENefa (1974)
in IGLESIAS (1989)
57
Resultados e Discussatildeo
A frequecircncia obtida para HBB na raccedila Minhota (005) aproxima-a das raccedilas do sul da
Europa onde este alelo ocorre com uma frequecircncia de aproximadamente 01 Por outro lado a
completa ausecircncia de HBB na raccedila Barrosatilde eacute um resultado interessante mas para o qual natildeo
eacute possiacutevel fornecer actualmente uma explicaccedilatildeo satisfatoacuteria
CAII
A distribuiccedilatildeo dos fenoacutetipos observados para o locus CAII apresenta-se na tabela
335
Tabela 335 Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica de CAU em populaccedilotildees das raccedilas Barrosatilde e Minhota Entre parecircntesis indicam-se os valores esperados de acordo com o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg
Fenoacutetipos N CA F CAFS CAS
Barrosatilde inscrita 141 17 58 66
(149) (622) (639)
Barrosatilde natildeo inscrita 153 20 71 62
(200) (710) (620)
Minhota 62 3 13 46
(14) (162) (444)
x2
0651 1 0420
0000 1 0995
Os valores do teste de 2 nas populaccedilotildees de raccedila Barrosatilde demonstram natildeo haver
desvios significativos ao equiliacutebrio de Hardy-Weinberg apesar de se observar um ligeiro
excesso de homozigoacuteticos F na populaccedilatildeo de raccedila Barrosatilde (inscrita) Para a raccedila Minhota natildeo
foi possiacutevel testar o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg
Na tabela 336 apresentam-se as frequecircncias geacutenicas de CAII nas populaccedilotildees
estudadas bem como as publicadas por outros autores
O locus CAII apresenta-se polimoacuterfico na maior parte das populaccedilotildees bovinas
europeias sendo o alelo CAIIS o que ocorre com frequecircncia mais elevada
58
Resultados e Discussatildeo
Tabela 336 Frequecircncias geacutemeas de CAU em vaacuterias populaccedilotildees de raccedilas bovinas e de buacutefalos
N
Frequecircncias geacutenicas N CAS CAF Referecircncia
Portugal
Barrosatilde inscrita 141 068 plusmn 003 032 plusmn 003 Este trabalho
Barrosatilde natildeo inscrita 153 064+003 036 plusmn 003
Minhota 62 085 plusmn 003 015+003 Iacute Iacute
Mertolenga 147 085 plusmn 002 015+002 Kn)Deiacutea(1980)
Alentejana 155 091 plusmn 002 009 plusmn 002
Mirandesa 107 099 + 001 001+001 NOBRE (S data)
Espanha
Cachena 71 077 + 004 023 plusmn 004 IGLESIAS (1989)
Caldelana 60 096 plusmn 002 004 plusmn 002 ce
Frieiresa 33 094 + 003 006 plusmn 003
Limiana 39 083 + 004 017 plusmn 004
Rubia Gallega 168 089 plusmn 002 011+002
Vianesa 40 086 + 004 014 plusmn 004
Sayaguesa 147 072 plusmn 003 028+003 GONZALEZ eacutetal (1987)
Morucha 101 072 plusmn 003 028 plusmn 003 a
Alistana Sanabresa 157 092 plusmn 002 008+002 iacute iacute
Blanca Cacerena 62 067 plusmn 004 033 plusmn 004 IacuteIacute
Caacuterdena Andaluza 25 100
Asturiana de los Vallegraves 127 087 plusmn 002 013+002 laquo
Asturiana de la Montaria 106 077 plusmn003 023 plusmn 003 IacuteIacute
Tudanca 42 076 plusmn 005 024 plusmn 005 VICENTE (1978)
Morena del NO 25 092 plusmn 004 008 plusmn 004
De Lidia 124 061+003 039 plusmn 003 KjDDetal (1980)
Retinta 164 065 + 003 035+003 iacuteiacute
Bulgaacuteria
Buacutefalo 263 007 + 001 093+001 MAKAVEEV(1984)
Murran (Buacutefalo) 51 020 plusmn 004 080 plusmn 004 laquo
Alemanha
Frisia 550 083 plusmn 001 017 + 001 THTNNES eacutetal (1976)
Suiacuteccedila
Simmental 1039 079 + 001 021+001 KAgraveSTLIeacutetal (1980)
Castanha Suiacuteccedila 546 087 plusmn 001 013+001
Friburg 223 084 + 002 016+002
in IGLESIAS (1989)
59
Resultados e Discussatildeo
As frequecircncias aleacutelicas de CAIPS e CAIPF nas raccedilas Cachena espanhola e Barrosatilde
portuguesa satildeo idecircnticas o que poderaacute eventualmente indicar estar-se em presenccedila de uma soacute
raccedila com designaccedilotildees diferentes nos dois paiacuteses Esta hipoacutetese eacute reforccedilada pelo facto de natildeo
haver diferenccedilas significativas entre dados morfomeacutetricos obtidos nas duas raccedilas (LEAL 1995)
Nos buacutefalos observa-se mais uma vez uma inversatildeo nas frequecircncias dos dois alelos do
locus CAII em relaccedilatildeo aos bovinos sendo CAF o mais frequente com valores situados entre
080 e 093
bull NP
Pela anaacutelise das tabelas 337 e 338 verifiacuteca-se a presenccedila dos dois alelos descritos
neste locus nas vaacuterias raccedilas bovinas sendo NPL o mais frequente nas raccedilas europeias (052 e
099) Observa-se uma grande similaridade entre os valores das frequecircncias geacutenicas o que natildeo
permite diferenciar as raccedilas estudadas neste trabalho das restantes
Tabela 337 Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica de NP em populaccedilotildees das raccedilas Barrosatilde e Minhota
N
Fenoacutetipos
N NP H NPL
Barrosatilde inscrita 141 69 72
Barrosatilde natildeo inscrita 153 55 98
Minhota 62 19 43
60
Resultados e Discussatildeo
Tabela 338 Frequecircncias geacutenicas para NP em vaacuterias populaccedilotildees e raccedilas bovinas
N
Frequecircncias geacutenicas
N NPH NPL Referecircncia
Portugal
Barrosatilde inscrita 141 029 plusmn 003 071 plusmn 003 Este trabalho
Barrosatilde natildeo inscrita 153 020 plusmn 002 080 plusmn 002 cc
Minhota 62 017 + 004 083 + 004
Espanha
Cachena 71 020 plusmn 003 080 plusmn 003 IGLESIAS (1989)
Caldelana 60 013+003 087 plusmn 003 t t
Frieiresa 33 011+004 089 plusmn 004
Limiana 39 008 plusmn 003 092 plusmn 003
Rubia Gallega 168 015+002 085 plusmn 002
Vianesa 40 013 + 004 087 plusmn 004 t i
Sayaguesa 147 014 + 002 086 plusmn 002 GONZALEZ et ai ( 1987)
Morucha 101 020 plusmn 003 080 plusmn 003
Alistana Sanabresa 157 001+001 099 + 001
Blanca Cacerena 62 048 plusmn 005 052 plusmn 005 laquo
Caacuterdena Andaluza 25 004 plusmn 003 096 plusmn 003 IacuteIacute
Asturiana de los Vallegraves 127 028 plusmn 003 072 plusmn 003
Asturiana de la Montana 106 026 plusmn 003 074 plusmn 003
Beacutelgica
Charolesa 130 026 plusmn 003 074 + 003 ANSAY amp HANSET (1972)
Frisia 91 006 plusmn 002 094 plusmn 002 t t
in IGLESIAS (1989)
MPI
A distribuiccedilatildeo dos fenoacutetipos observados para o locus MPI apresenta-se na tabela 339
Das trecircs populaccedilotildees estudadas apenas a raccedila Minhota apresenta valores observados
proacuteximos dos valores esperados segundo o formalismo de Hardy-Weinberg Por outro lado
apesar de natildeo ter sido possiacutevel testar o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg nas restantes populaccedilotildees
a aparente diferenccedila entre valores observados e esperados poderaacute dever-se a um excesso de
indiviacuteduos homozigoacuteticos para MPIC Este resultado poderaacute estar relacionado com o
processo de amostragem ou com outras causas como o acasalamento entre indiviacuteduos
61
Resultados e Discussatildeo
aparentados a existecircncia de sub-populaccedilotildees de tamanho pequeno ou ainda a um reduzido
nuacutemero de machos reprodutores
Tabela 339 Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica de MPI em populaccedilotildees das raccedilas Barrosatilde e Minhota Entre parecircntesis indicam-se os valores esperados de acordo com o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg
Fenoacutetipos N MPIA MPIAB MPIAC MPIB MPIBC MPIC
Barrosatilde inscrita 138 - - - 131 6 1
(1301) (78) (01)
Barrosatilde natildeo inscrita 1 5 2 - - - 147 4 1
(1460) (59) (01)
Minhota 61 0 3 0 56 2 0
(00) (29) (01) (561) (19) (00)
A anaacutelise da tabela 3310 permite verificar que MPIB e MPIC ocorrem nas duas
raccedilas de bovinos estudadas sendo MPIB o alelo mais comum nas trecircs populaccedilotildees A
ocorrecircncia de MPI A na raccedila Minhota contraria o descrito por ANSAY (1973) quando afirma
a exclusividade do fenoacutetipo AB na raccedila Charolesa
Tabela 3310 Frequecircncias geacutenicas de MPI nas populaccedilotildees estudadas
N
Frequecircncias geacutenicas
N MPPA MPPB MPIC
Barrosatilde inscrita 138 - 097 + 001 003+001
Barrosatilde natildeo inscrita 152 - 098 + 001 002+001
Minhota 61 002 plusmn 001 096 plusmn002 002 plusmn 001
A informaccedilatildeo disponiacutevel sobre este marcador em anteriores trabalhos de anaacutelise
geneacutetica em bovinos eacute quase inexistente Tal poderaacute dever-se agraves dificuldades de visualizaccedilatildeo
encontradas na sua fenotipagem por electroforese convencional A detecccedilatildeo de MPI estaacute
descrita em tecidos musculares e em leucoacutecitos neste trabalho utilizaram-se eritroacutecitos para o
estudo de variaccedilatildeo geneacutetica desta proteiacutena mas eacute provaacutevel que a sua expressatildeo ocorra apenas
na fracccedilatildeo leucocitaacuteria (natildeo separada) o que explicaria precisamente a sua fraca actividade
62
Resultados e Discussatildeo
ALB
A distribuiccedilatildeo dos fenoacutetipos observados para o locus ALB apresenta-se na tabela
3311
Apesar de natildeo ter sido possiacutevel testar o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg todas as
amostras estudadas mostram desvios muito reduzidos entre valores observados e esperados
Tabela 3311 Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica de ALB em populaccedilotildees das raccedilas Barrosatilde e Minhota Entre parecircntesis indicam-se os valores esperados de acordo com o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg
N
Fenoacutetipos N ALBA ALBAB ALBB ALBBV ALBAV ALB V
Barrosatilde inscrita 142 137 3 - - 2 -(1370) (30) (00) (00) (20) (00)
Barrosatilde natildeo inscrita 153 145 5 1 - 2 -(1440) (68) (01) (01) (20) (00)
Minhota 62 59
(590)
3 (30) (00)
Na tabela 3312 estatildeo discriminadas as frequecircncias geacutenicas estimadas para as
populaccedilotildees estudadas bem como as de outras populaccedilotildees de bovinos da Europa e de buacutefalos
da Bulgaacuteria
Verifica-se que ALBA eacute o alelo mais comum encontrando-se aparentemente fixado
em vaacuterias raccedilas bovinas de origem europeia
Como jaacute referido para HB a presenccedila de ALBB nas raccedilas europeias parece
relacionar-se com a sua localizaccedilatildeo geograacutefica verificando-se que de uma maneira geral a sua
frequecircncia aumenta agrave medida que nos aproximamos do sul da Europa e de Aacutefrica eacute no gado
zebu africano que este alelo ocorre com frequecircncias mais elevadas variando entre 030 e 060
(VICENTE 1978) Assim a presenccedila de ALBB no gado europeu poderaacute indicar a passagem
pela Europa de bovinos oriundos de Aacutefrica (CECCHINI amp Nus 1986) Eacute de notar que apenas a
raccedila Minhota e algumas das restantes raccedilas da Peniacutensula Ibeacuterica natildeo apresentam ALBB
63
Resultados e Discussatildeo
Tabela 3312 Frequecircncias geacutenicas de ALB em vaacuterias populaccedilotildees de raccedilas bovinas e em buacutefalos
Frequecircncias geacutenicas
N ALBA (F) ALBB (S) ALBV Referecircncia
Portugal
Barrosatilde inscrita 142 098 + 001 001 plusmn 001 001 plusmn001 Este trabalho
Barrosatilde natildeo inscrita 153 097 + 001 002+001 001 plusmn001
Minhota 62 098 plusmn 001 - 002 plusmn 001
Mertolenga 147 084 plusmn 002 016 + 002 - KlDDetal (1980)
Alentejana 155 094+001 006 plusmn 001 -
Mirandesa 106 094 + 002 006 plusmn 002 - NOBRE (S data)
Espanha -
Cachena 71 098 + 001 002+001 - IGLESIAS (1989)
Caldelana 60 098 plusmn 001 002 + 001 -
Frieiresa 33 100 - - raquo
Limiana 39 097 + 002 003 plusmn 002 -
Rubia Gallega 201 099 plusmn 000 001 plusmn000 -
Vianesa 40 093 + 003 007 + 003 -
Sayaguesa 147 096 plusmn001 004 plusmn 001 - GONZALEZ et al (1987)
Moracha 101 089 plusmn 002 011+002 -
Alistaria Sanabresa 157 090 plusmn 002 010 plusmn002 -
Blanca Cacerena 62 056 plusmn 005 044 plusmn 005 -
Caacuterdena Andaluza 25 100 - -
Asturiana de los Vallegraves 127 099 + 001 001 plusmn001 -
Asturiana de la Montana 106 099 plusmn001 001 plusmn001 -
Pirenaica 265 092 + 001 008 plusmn001 - VICENTE (1978)
Tudanca 42 100 - -
Morena del N O 25 092 + 004 008 plusmn 004 -
Frisona 97 100 - -
De Lidia 124 100 - - KIDDeacutetal (1980)
Retinta 164 097 + 001 003 plusmn001 -
Itaacutelia
Chinina 264 089 + 001 011 plusmn001 - CARENZIeacutetal (1970)
Marchigiana 124 074 + 003 026 plusmn 003 -
Beacutelgica
Pied vermelha Este-Flandern 503 100 - - BOUQUET amp VAN de WEGHE (1972)
Vermelha Oeste-Flandern 155 100 - -
Pied preta 174 100 - -
Pied vermelha-Campine 265 100 - -
w IGLESIAS (1989)
(Continua)
64
Resultados e Discussatildeo
Tabela 3312 Frequecircncias geacutenicas de ALB em vaacuterias populaccedilotildees de raccedilas bovinas e de buacutefalos (continuaccedilatildeo)
Frequecircncias geacutenicas N ALBA (F) ALBB (S) ALBV Referecircncia
Bulgaacuteria
Sofia Brow 170 096+001 004 + 001 - M A K A V E E V ( 1 9 7 0 )
Buacutefalo 225 047 plusmn 002 053 plusmn 002 - M A K A V E E V ( 1 9 8 4 )
Murrah (Buacutefalo) 76 012+003 088 plusmn 003 -
G Bretanha
Charolesa 99 084 plusmn 003 016 + 003 - SPOONER amp OLIVER (1969)
Frisia 1422 100 - -
Hereford 215 099 plusmn 001 001+001 -
Jersey 217 100 - -
laquo IGLESIAS (1989)
Neste trabalho descreve-se tambeacutem o alelo ALBV com uma frequecircncia de 001 e
002 nas raccedilas Barrosatilde e Minhota respectivamente Este alelo natildeo se encontra descrito em
qualquer raccedila europeia podendo a sua detecccedilatildeo estar relacionada com a capacidade resolvente
da teacutecnica de focagem isoeleacutectrica utilizada na separaccedilatildeo de ALB
TF
A transferrina eacute provavelmente o mais informativo dos sistemas polimoacuterficos estudados
em virtude do nuacutemero de alelos que apresenta
A distribuiccedilatildeo dos fenoacutetipos observados para o locus TF apresenta-se na tabela 3313
E possiacutevel verificar a existecircncia de equiliacutebrio de Hardy-Weinberg em todas as populaccedilotildees
estudadas
Da anaacutelise das frequecircncias geacutenicas expressas na tabela 3314 verifica-se que este locus
apresenta quatro produtos geacutenicos na maioria das raccedilas europeias sendo os alelos TFA e
TFD (incluindo os subtipos TFD1 e TFD2) os que apresentam frequecircncias mais elevadas
(027 a 092 para o alelo TFA e 026 a 073 para o alelo TFD)
Observa-se tambeacutem que a frequecircncia de TFD2 nas raccedilas estudadas eacute mais elevada do
que a de TFD1 como ocorre na maioria das raccedilas ibeacutericas
65
Resultados e Discussatildeo
No que se refere a TFE verifica-se que a sua frequecircncia eacute relativamente baixa nas
raccedilas europeias (001 e 022) e estaacute mesmo ausente em quase todas as raccedilas da regiatildeo da
Galiza (com excepccedilatildeo da raccedila Cachena espanhola e Rubia Gallega) e na raccedila Minhota Note-se
a grande semelhanccedila entre os valores de frequecircncias geacutenicas deste alelo na raccedila Cachena
espanhola (005) e nas populaccedilotildees de raccedila Barrosatilde (004 e 003) o que mais uma vez sugere
uma grande proximidade entre as duas Apesar de ocorrer em baixa frequecircncia nos bovinos
europeus a presenccedila de TFE nestas raccedilas pode indicar uma proveniecircncia asiaacutetica ou africana
pois eacute nestes continentes que aquele alelo eacute mais comum (BRAEND 1971)
66
Resultados e Discussatildeo
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Resultados e Discussatildeo
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Resultados e Discussatildeo
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69
Resultados e Discussatildeo
bull GC
A distribuiccedilatildeo dos fenoacutetipos observados para o locus GC apresenta-se na tabela 3315
A sua anaacutelise permite verificar a existecircncia de diferenccedilas entre os valores observados e
esperados para raccedila Barrosatilde (populaccedilatildeo inscrita no Livro Genealoacutegico) Este desvio ao
equiliacutebrio de Hardy-Weinberg deve-se agrave existecircncia de um excesso de homozigoacuteticos
sugerindo assim a ocorrecircncia de uma possiacutevel subestruturaccedilatildeo na populaccedilatildeo
Nas restantes amostras estudadas natildeo foi possiacutevel aplicar o teste de Contudo a
diferenccedila entre valores observados e esperados de acordo com o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg
eacute praticamente inexistente na populaccedilatildeo Barrosatilde natildeo inscrita e pouco acentuada na raccedila
Minhota
Tabela 3315 Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica de GC em populaccedilotildees das raccedilas Barrosatilde e Minhota Entre parecircntesis indicam-se os valores esperados de acordo com o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg
Fenoacutetipos N GCS GCFS GCF
Barrosatilde inscrita 142 98 35 8
(945) (419) (45)
Barrosatilde natildeo inscrita 153 109 40 4
(1087) (406) (37)
Minhota 62 54 5 3
(514) (101) (04)
x2
3913 1 0048
A distribuiccedilatildeo das frequecircncias geacutenicas apresentada na tabela 3316 mostra que GCS eacute
o alelo mais comum nas raccedilas europeias (com excepccedilatildeo da raccedila Frisia da Sueacutecia) As raccedilas
estudadas neste trabalho tecircm frequecircncias aleacutelicas para este locus que as aproximam das raccedilas
espanholas
70
Resultados e Discussatildeo
Tabela 3316 Frequecircncias geacutenicas de GC em vaacuterias populaccedilotildees de raccedilas bovinas
Frequecircncias geacutenicas
N GCF(ouA) GCS(ouB) GCC Referecircncia
Portugal
Barrosatilde inscrita
Barrosatilde natildeo inscrita
Minhota
Alentejana
Mirandesa
Espanha
De Lidia
Frisona
Beacutelgica
Branca e azul
Flemish vermelha
Campine vermelha e branca
Preta e branca
Flemish branca e vermelha
Sueacutecia
Vermelha e Branca
Frisia
141 018 plusmn0023
153 016 plusmn002
62 009 plusmn 003
028 plusmn 004
97 020 plusmn 003
1306 008 plusmn001
124 015 plusmn002
2323 031 plusmn001
431 016 plusmn001
299 012 plusmn001
299 019 plusmn002
140 006 plusmn 001
1030 039 plusmn001
273 079 plusmn 002
082 plusmn 002
084 plusmn 002
091 plusmn003
072 plusmn 004
080 plusmn 003
092 plusmn 001
085 plusmn 002
069 plusmn 001
084 plusmn 001
088 plusmn 001
081 plusmn002
065 plusmn 003
061 plusmn001
021 plusmn002
029 plusmn 003
Este trabalho
CUNHA (1994)
NOBRE (S data)
PIEDRAFUA et ai (1984)
VAN de WEGHE et ai (1982)
GAHNE(1963)
in PIEDRAFUA et ai (1984)
71
Resultados e Discussatildeo
34 - ANAacuteLISE POPULACIONAL CONJUNTA
341 - Diversidade geneacutetica na raccedila Barrosatilde
As estimativas da variabilidade geneacutetica das populaccedilotildees de bovinos das raccedilas Barrosatilde e
Minhota efectuaram-se considerando apenas 6 loci polimoacuterficos HB CAII MPI ALB TF e
GC
Tabela 341 Estimativa da variabilidade geneacutetica (6 loci) atraveacutes dos valores de heterozigotia observada (Ho) e esperada (He) nas populaccedilotildees estudadas
Barrosatilde inscrita Barrosatilde natildeo inscrita Minhota Locus
Ho He Ho He Ho He
HB 0000 0000 0000 0000 0097 0093
CAH 0411 0441 0464 0464 0210 0262
MPI 0043 0056 0026 0039 0082 0080
ALB 0035 0035 0046 0058 0048 0048
TF 0603 0590 0556 0595 0694 0638
GC 0248 0297 0261 0265 0081 0163
Os resultados expressos na tabela 341 mostram em geral a ausecircncia de diferenccedilas
significativas entre os valores de heterozigotia observada (Ho) e heterozigotia esperada (He)
para os loci estudados Deve contudo notar-se que na raccedila Minhota e quanto ao locus GC o
valor de He eacute aproximadamente o dobro da Ho Nos restantes loci o ligeiro desvio observado
entre Ho e He sugere em geral um deacutefice de heterozigoacuteticos
Nas duas populaccedilotildees de raccedila Barrosatilde os sistemas TF e CAII satildeo os que apresentam
valores de heterozigotia mais elevados Pelo contraacuterio os loci MPI e ALB mostram valores de
heterozigotia baixos possivelmente devido ao excesso de homozigoacuteticos (MPI B e ALB A)
detectados nas trecircs populaccedilotildees
Na tabela 342 apresentam-se os valores do nuacutemero meacutedio de alelos por locus (ria)
percentagem de loci polimoacuterficos (P) heterozigotia meacutedia observada (Ho) e heterozigotia
esperada (He) nas populaccedilotildees de bovinos estudados Estes valores devem ser interpretados
72
Resultados e Discussatildeo
tendo em conta o facto de os 6 loci investigados serem polimoacuterficos em pelo menos uma
populaccedilatildeo
Tabela 342 Variabilidade geneacutetica detectada em trecircs populaccedilotildees de bovinos atraveacutes da anaacutelise de 6 loci polimoacuterficos N - efectivo meacutedio estudado por locus na - nuacutemero meacutedio de alelos por locus P - proporccedilatildeo de loci polimoacuterficos Ho - heterozigotia observada He - heterozigotia meacutedia esperada Entre parecircntesis indicam-se os valores do desvio padratildeo
Raccedila Populaccedilatildeo N na P Ho He
Barrosatilde inscrita 1407 233 833 0223 0237
(06) (042) (0100) (0100)
Barrosatilde natildeo inscrita 1528 233 833 0226 0237
(02) (042) (0098) (0101)
Minhota 618 233 1000 0202 0214
(02) (021) (0101) (0090)
A sua anaacutelise permite verificar em primeiro lugar a ocorrecircncia de uma grande
semelhanccedila entre os valores de H nas duas raccedilas estudadas Barrosatilde e Minhota revelando a
existecircncia de uma variabilidade geneacutetica idecircntica nas trecircs populaccedilotildees de bovinos Observa-se
tambeacutem que os valores de heterozigotia meacutedia observada (Ho) natildeo diferem significativamente
dos valores de heterozigotia esperados (He) nas trecircs populaccedilotildees sendo o valor mais elevado o
encontrado na populaccedilatildeo de raccedila Barrosatilde (237)
Os elevados valores de P (833 na raccedila Barrosatilde e 100 na raccedila Minhota) resultam
do facto de apenas se terem utilizado loci polimoacuterficos nesta anaacutelise e o nuacutemero meacutedio de
alelos por locus (na) eacute igual nas trecircs populaccedilotildees estudadas (233)
A tabela 343 apresenta estimativas de FB Frr e FST para as trecircs populaccedilotildees de
bovinos Os valores de Fis indicam a existecircncia de uma acentuada deficiecircncia de
heterozigoacuteticos nos loci MPI e GC Nos restantes loci verifica-se por um lado a tendecircncia
para um excesso de heterozigoacuteticos nos loci HB e TF (com valores de -0051 e -0021
respectivamente) e por outro lado para uma ligeira deficiecircncia de heterozigoacuteticos nos loci
CAII e ALB (com valores de 0066 e 0072 respectivamente) A meacutedia ponderada de FiS
mostra uma deficiecircncia de heterozigoacuteticos de 48
73
Resultados e Discussatildeo
Tabela 343 Distribuiccedilatildeo relativa da diversidade geneacutetica nas trecircs populaccedilotildees de bovinos Hs-heterozigotia intrapopulacional HT-heterozigotia total Valores das estatiacutesticas F para 6 loci analisados
Locus H s Hx Fis FIT FST
HB 0030 0031 -0051 -0016 0033
CAII 0387 0404 0066 0104 0041
MPI 0058 0059 0130 0133 0004
ALB 0046 0047 0072 0075 0004
TF 0605 0627 -0021 0015 0036
GC 0241 0244 0183 0193 0012
Meacutedia 0228 0235 0048 0078 0031
As estimativas de FST indicam a existecircncia de um baixo grau de diferenciaccedilatildeo
populacional nos bovinos estudados Os valores de FST para os 6 loci analisados podem
considerar-se baixos (entre 0004 e 0041) apresentando uma meacutedia ponderada de 0031
Assim soacute uma pequena parte da diversidade geneacutetica (31) se deve a diferenccedilas entre as
populaccedilotildees sendo muito maior a diversidade dentro de cada populaccedilatildeo do que entre as
populaccedilotildees
Os baixos valores de FST encontrados para os loci MPI e ALB resultam de frequecircncias
elevadas de MPIB e ALBA respectivamente e traduzem uma grande homogeneidade entre
as raccedilas bovinas estudadas natildeo se detectando subestruturaccedilatildeo populacional
342 - Comparaccedilatildeo com outras raccedilas ibeacutericas
Tendo em conta o pequeno nuacutemero de loci comuns a este e a outros estudos
estimaram-se diferentes valores de heterozigotia meacutedia consoante o nuacutemero de loci de que se
dispunha Na tabela 344 e 345 apresentam-se valores de heterozigotia meacutedia para as
diferentes raccedilas obtidos a partir de quatro (FF) e cinco loci (FF+) respectivamente bem como
os valores de na P e os respectivos desvios padratildeo em vaacuterias raccedilas de bovinos ibeacutericos
A diversidade geneacutetica do bovino Barrosatilde avaliada pela taxa meacutedia de heterozigotia
(0281-0272 e 0249-0260 para 5 e 4 loci respectivamente) parece ocupar uma posiccedilatildeo
74
Resultados e Discussatildeo
intermeacutedia no seio das raccedilas ibeacutericas Tambeacutem o grau de variabilidade geneacutetica nos bovinos
avaliado por paracircmetros como o nuacutemero meacutedio de alelos por locus e a proporccedilatildeo de loci
polimoacuterficos (P) demonstra que as raccedilas estudadas neste trabalho ocupam uma posiccedilatildeo
intermeacutedia quando comparadas com outras raccedilas ibeacutericas
A anaacutelise das tabelas 344 e 345 mostra que todas as medidas de diversidade geneacutetica
(H P e de na) apresentam valores idecircnticos Esta semelhanccedila permite supor que o processo de
domesticaccedilatildeo iniciado haacute menos de 10000 anos natildeo levou a uma grande diferenciaccedilatildeo
geneacutetica entre as raccedilas pelo menos relativamente aos marcadores geneacuteticos estudados neste
trabalho Desta forma verifica-se que as principais diferenccedilas entre as raccedilas resultam de
pequenas alteraccedilotildees das suas frequecircncias geacutenicas provavelmente causadas pelo baixo nuacutemero
de animais destinados agrave reproduccedilatildeo (mais marcado nos machos) e pelos cruzamentos dirigidos
em cada raccedila
Por outro lado este baixo niacutevel de diferenciaccedilatildeo geneacutetica deveraacute estar tambeacutem
associado ao facto de na origem das raccedilas bovinas ibeacutericas se encontrar um uacutenico processo de
domesticaccedilatildeo seguido provavelmente de um processo de expansatildeo populacional bastante
recente do Proacuteximo Oriente ateacute agrave Europa Adicionalmente estima-se que a diferenciaccedilatildeo dos
bovinos em raccedilas autoacutectones soacute teraacute ocorrido nos uacuteltimos 300 anos (LOFTUS et ai 1994)
Neste contexto os eventuais estrangulamentos do efectivo populacional (bottleneck)
e efeitos de fundador ocorridos durante o periacuteodo inicial da domesticaccedilatildeo do gado bovino e
capazes de afectar de forma muito diferente vaacuterios nuacutecleos populacionais natildeo satildeo detectados
na Peniacutensula Ibeacuterica
75
Resultados e Discussatildeo
Tabela 344 Variabilidade geneacutetica em vaacuterias raccedilas de bovinos atraveacutes da anaacutelise de 4 loci polimoacuterficos N - efectivo meacutedio estudado por locus ria - nuacutemero meacutedio de alelos por locus P-- proporccedilatildeo de loci polimoacuterficos yent - heterozigotia meacutedia esperada Entre parecircntesis indicam-se os valores do desvio padratildeo
Raccedila Populaccedilatildeo N nbdquo P H +
Portugal
Barrosatilde inscrita 1410(00) 23 (05) 750 0249 (0135)
Barrosatilde natildeo inscrita 1530 (00) 23 (05) 755 0260(0135)
Minhota 620 (00) 20 (00) 1000 0216 (0094)
Mertolenga 1470 (00) 23 (03) 1000 0315 (0097)
Alentejana 1550(00) 23 (03) 1000 0239 (0123)
Mirandesa 1065 (03) 20 (00) 1000 0159(0110)
Espanha
Cachena 710 (00) 23 (03) 1000 0279(0111)
Caldelana 600 (00) 20 (00) 1000 0166 (0107)
Frieiresa 330 (00) 18(03) 750 0177(0112)
Limiana 390 (00) 20 (00) 1000 0246 (0087)
Rubia Gallega 1845(95) 25 (05) 1000 0215(0110)
Vianesa 400 (00) 20 (00) 1000 0221 (0087)
Sayaguesa 1470 (00) 23 (03) 1000 0320 (0094)
Morucha 1010(00) 23 (03) 1000 0361 (0084)
Alistaria Sanabresa 1570 (00) 23 (03) 1000 0213 (0104)
Blanca Cacerefia 618 (03) 20 (00) 1000 0377 (0078)
Caacuterdena Andaluza 250 (00) 15(03) 500 0131 (0106)
Asturiana de los Vallegraves 1265 (05) 23 (03) 1000 0237(0107)
Asturiana de la Montana 1060 (00) 23 (03) 1000 0280 (0088)
Tudanca 420 (00) 20 (04) 750 0321 (0109)
Morena del N O 250 (00) 18 (03) 750 0203 (0108)
Frisona 6540 (00) 18 (05) 500 0203 (0130)
De Lidia 1240 (00) 23 (03) 1000 0367(0135)
Retinta 1640 (00) 23 (03) 1000 0338 (0107)
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Resultados e Discussatildeo
Tabela 345 Variabilidade geneacutetica em vaacuterias raccedilas de bovinos atraveacutes da anaacutelise de 5 loci polimoacuterficos N - efectivo meacutedio estudado por locus na - nuacutemero meacutedio de alelos por locus P--proporccedilatildeo de loci polimoacuterficos H^ - heterozigotia meacutedia esperada Entre parecircntesis indicam-se os valores do desvio padratildeo
Raccedila Populaccedilatildeo N na P i r Portugal
Barrosatilde inscrita 1410 (00) 22 (04) 800 0281 (0109)
Barrosatilde natildeo inscrita 1530(00) 22 (04) 800 0272 (0105)
Minhota 620 (00) 20 (00) 1000 0229 (0074)
Espanha Cachena 710 (00) 22 (02) 1000 0289 (0087)
Caldelana 600 (00) 20 (00) 1000 0180 (0084)
Frieiresa 330 (00) 18 (02) 800 0180 (0087)
Limiana 390 (00) 20 (00) 1000 0226(0071)
Rubia Gallega 1812(81) 24 (04) 1000 0223 (0086)
Vianesa 400 (00) 20 (00) 1000 0374 (0168)
Sayaguesa 1470 (00) 22 (02) 1000 0305 (0074)
Morucha 1010 (00) 22 (02) 1000 0353 (0066)
Alistaria Sanabresa 1570 (00) 22 (02) 1000 0174 (0089)
Blanca Cacerefla 616 (02) 20(00) 1000 0402 (0065)
Caacuterdena Andaluza 250 (00) 16(02) 600 0120 (0083)
Asturiana de los Vallegraves 1266 (04) 22 (02) 1000 0270 (0089)
Asturiana de la Montaria 1060(00) 22 (02) 1000 0301 (0072)
343 - Diferenciaccedilatildeo geneacutetica
Nas tabelas 346 e 347 apresentam-se as distacircncias geneacuteticas de Nei (NEI 1978)
calculadas para 23 (4 loci HB CAII ALB e TF) e 15 (5 loci HB CAII ALB TF e NP)
raccedilas bovinas ibeacutericas respectivamente Da sua anaacutelise ressalta o facto de aqueles valores
serem na sua maioria bastante baixos
De entre as raccedilas bovinas ibeacutericas estudadas a Frisona e a Cachena demonstram estar
mais proacuteximas da raccedila Barrosatilde com valores de DNei de 0092 (4 loci) e de 0104 (5 loci)
respectivamente Por outro lado as raccedilas Asturiana de la Montana e Vianesa aparecem como
as mais diferenciadas DNei= 0334 (4 loci ) e Dgtjei= 0330 (5 loci) respectivamente
77
Resultados e Discussatildeo
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Resultados e Discussatildeo
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Resultados e Discussatildeo
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80
Resultados e Discussatildeo
No que se refere agrave raccedila Minhota verifica-se que a Frieiresa eacute a que estaacute mais proacutexima
(valores de 0077 e 0074 para 4 e 5 loci respectivamente) e que mais um vez eacute a Asturiana de
la Montana a mais diferenciada das raccedilas (valores de 0389 e 0349 para 4 e 5 loci respectivamente)
A diferenciaccedilatildeo geneacutetica entre as raccedilas bovinas ibeacutericas encontra-se representada nos
dendrogramas construiacutedos pelos meacutetodos de agrupamento NJ (Neighbor-joining SATTOU amp
NEI 1987) e UPGMA (Unweightedpair-group arithmetic average SNEATH amp SOKAL 1973)
(figuras 341 342 343 e 344) Foram realizados testes de reamostragem do tipo
bootstrap (100 reacuteplicas) para a anaacutelise da consistecircncia dos padrotildees de ramificaccedilatildeo
apresentando-se os seus valores entre parecircntesis
A anaacutelise conjunta dos quatro dendrogramas permite verificar uma falta de consistecircncia
nos vaacuterios padrotildees de ramificaccedilatildeo para as raccedilas bovinas ibeacutericas associada a valores de
bootstrap em geral muito reduzidos De facto observa-se que o padratildeo de ramificaccedilatildeo dos
dendrogramas se altera consoante o meacutetodo de agrupamento usado e o nuacutemero de loci considerados Estas alteraccedilotildees nos agrupamentos das diferentes raccedilas devem-se
provavelmente agrave instabilidade causada pelo reduzido nuacutemero de loci polimoacuterficos utilizados
neste estudo bem como ao facto de as frequecircncias geacutenicas serem muito semelhantes em todas
as populaccedilotildees estudadas
Deve contudo referir-se que a raccedila Barrosatilde aparece normalmente associada a vaacuterias
raccedilas do norte da Peniacutensula Ibeacuterica nomeadamente a Cachena (Galiza) a Asturiana de la
Montana (Astuacuterias) a Sayaquesa e a Morucha (Salamanca)
No que se refere agrave raccedila Minhota esta aparece vaacuterias vezes associada agraves raccedilas Rubia
Gallega Frisona Asturiana de los Vallegraves e Frieiresa
81
Resultados e Discussatildeo
(18)
(14)
(11)
(5)
(3)
Sayaquesa
(39)
[32)
(21)1-
- -HsT
(49)
(1)
(3)
(18)
(8)
(13)1
(12)
19)
(16T
De Lidia
(99) Asturiana de la Montana
Tudanca bullMorucha
Cachena Barrosatilde mdashFrisona
Minhota -Asturiana de los Vallegraves Rubia Gallega
Frieiresa Alentejana
(65)
Mertolenga -Vianesa
Blanra Cacerefla
Retinta Linuacuteana
i (39)r
Mirandesa Caacuterdena Andaluza Morena NO
Caldelana Alistano Sanabresa
Figura 341 Dendrograma construiacutedo com base nas distacircncias geneacuteticas de NEI (1978) entre 23 raccedilas de bovinos (4 loci HBCAII ALB e TF) atraveacutes do meacutetodo de agrupamento NJ Os valores de probabilidade de ocorrecircncia de cada agrupamento obtidos atraveacutes de um teste de bootstrap indicam-se entre parecircntesis
82
Resultados e Discussatildeo
Morucha
Cachena Sayaquesa
Rubia Gallega Asturiana de los Vallegraves Freiresa
Frisona Minhota Alentejana Mertolenga
(43) ( 2 8 gt - ^ C a W e l a l
( iacute 7gtrl - Mirandesa L__ Alistano Sanabresa
Caacuterdena Andaluza Vianesa
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De Lidia Tudanca
Asturiana de la Montana Morena NO Blanca Cacerena
Figura 342 Dendrograma construiacutedo com base nas distacircncias geneacuteticas de NEI (1978) entre 23 raccedilas de bovinos (4 loci HB CAII ALB e TF) atraveacutes do meacutetodo de agrupamento UPGMA Os valores de probabilidade de ocorrecircncia de cada agrupamento obtidos atraveacutes de um teste de bootstrap indicam-se entre parecircntesis
83
Resultados e Discussatildeo
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Alistano Sanabresa _ _ Rabia Galkga
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Figura 343 Dendrograma construiacutedo com base nas distacircncias geneacuteticas de NEI (1978) entre 15 raccedilas de bovinos (5 loci HB CAII ALB TF e NP) atraveacutes do meacutetodo de agrupamento NJ Os valores de probabilidade de ocorrecircncia de cada agrupamento obtidos atraveacutes de um teste de bootstrap indicam-se entre parecircntesis
(21)
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Alistano Sanabresa
(37)
(61)
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Asturiana de la Montana
Figura 344 Dendrograma construiacutedo com base nas distacircncias geneacuteticas de NEI (1978) entre 15 raccedilas de bovinos (5 loci HB CAII ALB TF e NP) atraveacutes do meacutetodo de agrupamento UPGMA Os valores de probabilidade de ocorrecircncia de cada agrupamento obtidos atraveacutes de um teste de bootstrap indicam-se entre parecircntesis
84
Resultados e Discussatildeo
No seu conjunto estes resultados natildeo satildeo suficientes para o estabelecimento de uma
histoacuteria evolutiva das actuais raccedilas bovinas ibeacutericas nem para a separaccedilatildeo da raccedila Barrosatilde das
restantes Consequentemente natildeo eacute possiacutevel neste momento fazer corresponder a anaacutelise da
diversidade e estrutura geneacutetica das populaccedilotildees ibeacutericas de gado bovino com alguma das
hipoacuteteses evolutivas propostas por diversos autores com base em evidecircncia morfoloacutegica
(VALLEJO 1978 IGLESIAS 1989 CORDEIRO 1986 JORGE 1996)
De acordo com essa evidecircncia a raccedila Barrosatilde (e tambeacutem a Cachena) derivaria do
denominado tronco mauritaacutenico (Bos primigenius opisthonomus) ou seja de populaccedilotildees
originaacuterias do Norte de Aacutefrica que teriam passado para o sul da Peniacutensula Ibeacuterica alcanccedilando
mais tarde o Norte de Portugal e de Espanha Por outro lado a filiaccedilatildeo da raccedila Minhota
segundo JORGE (1996) deriva do tronco aquitacircnico (Bos primigenius primigenius) tal como a
maior parte das raccedilas da Galiza das Astuacuterias e dos Pirineacuteus
Embora os resultados apresentados neste trabalho pareccedilam de facto indicar que as
raccedilas Barrosatilde e Minhota derivam de troncos diferentes eacute necessaacuterio aprofundar de forma
muito consideraacutevel a investigaccedilatildeo sobre a estrutura geneacutetica das raccedilas bovinas ibeacutericas antes de
se poder formular conclusotildees mais sustentadas
85
Con8ideraccedil8es Finais
4 - CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
O trabalho desenvolvido nesta dissertaccedilatildeo permitiu o estudo de alguns sistemas
geneacuteticos polimoacuterficos jaacute descritos em bovinos (HB CAII NP MPI ALB TF e GC) nas
raccedilas Barrosatilde e Minhota Permitiu ainda a aplicaccedilatildeo de teacutecnicas de separaccedilatildeo electroforeacuteticas
mais eficazes em alguns desses sistemas
Vaacuterias limitaccedilotildees durante a execuccedilatildeo praacutetica deste trabalho obrigaram de alguma
forma a alteraccedilotildees no programa inicial Entre elas devem referir-se
1 a recolha de amostras de sangue mostrou-se difiacutecil e demorada sendo necessaacuteria a
coordenaccedilatildeo de esforccedilos de vaacuterias entidades (Direcccedilatildeo Regional de Agricultura de
Entre Douro e Minho e brigadas de Sanidade Animal locais) de veterinaacuterios e de
criadores de bovinos retirando tempo agrave execuccedilatildeo praacutetica do trabalho
2 a afinaccedilatildeo de vaacuterias teacutecnicas electroforeacuteticas para certos marcadores geneacuteticos
envolveu um consideraacutevel esforccedilo de investigaccedilatildeo
3 a impossibilidade de apurar atempadamente as teacutecnicas de separaccedilatildeo ou de
visualizaccedilatildeo para a amilase a ceruloplasmina e a poacutes-transferrina
4 a escassa bibliografia sobre o bovino Barrosatilde e sobre as teacutecnicas utilizadas neste
trabalho em gado bovino
Apesar das limitaccedilotildees considera-se que este trabalho se reveste de alguma importacircncia
pelo facto de constituir um contributo para a caracterizaccedilatildeo geneacutetica de uma raccedila bovina muito
peculiar A este respeito entendeu-se que numa primeira fase se procederia ao estudo de um
conjunto de proteiacutenas polimoacuterficas de forma a poder iniciar uma comparaccedilatildeo com outras raccedilas
bovinas nomeadamente ibeacutericas para as quais jaacute existem resultados publicados Por outro
86
Consideraccedilotildees Finais
lado o estabelecimento de um conjunto de teacutecnicas de fenotipagem dos loci considerados
permite desde logo a sua aplicaccedilatildeo em questotildees de identificaccedilatildeo individual e de anaacutelise da
paternidade
Eacute contudo evidente que o aprofundamento deste trabalho deveraacute necessariamente
evoluir na direcccedilatildeo da anaacutelise molecular da variaccedilatildeo geneacutetica Adicionalmente seraacute do maior
interesse alargar o domiacutenio de investigaccedilatildeo agraves restantes raccedilas bovinas autoacutectones
Em face do exposto entende-se ser possiacutevel definir trecircs linhas de investigaccedilatildeo para os
proacuteximos anos
1 - ampliaccedilatildeo da bateria de sistemas geneacuteticos polimoacuterficos detectados em proteiacutenas do
sangue e do leite
2 - anaacutelise da variabilidade geneacutetica de um conjunto de microssateacutelites se possiacutevel
associados a algumas das proteiacutenas polimoacuterficas jaacute descritas
3 - estudo do polimorfismo da moleacutecula de DNA-mitocondrial
De uma forma geral pode assim considerar-se que os principais objectivos definidos
no iniacutecio deste trabalho foram alcanccedilados pelo que se apresentam em seguida as conclusotildees
87
Conclusotildees
5 - CONCLUSOtildeES
A utilizaccedilatildeo de um sistema de focagem isoeleacutectrica permitiu detectar a existecircncia de
polimorfismo geneacutetico na hemoglobina distinguindo-se dois produtos geacutenicos na raccedila bovina
Minhota HBA e HBB Na raccedila Barrosatilde HBA foi o uacutenico produto geacutenico encontrado
A utilizaccedilatildeo de um sistema de focagem isoeleacutectrica permitiu a detecccedilatildeo de dois
produtos geacutenicos no locus CAII (CAIPF e CAIPS) e revelou-se mais eficaz de que as
teacutecnicas de separaccedilatildeo convencional em gel de amido
A investigaccedilatildeo realizada permitiu detectar a ocorrecircncia de polimorfismo geneacutetico de
MPI atraveacutes de um sistema electroforeacutetico em gel de amido tendo-se detectado trecircs produtos
geacutenicos (MPIA MPIB e MPIC) A fraca actividade de MPI e a grande dificuldade na
obtenccedilatildeo de um contraste de bandas adequado poderaacute dever-se ao facto de a sua expressatildeo soacute
ocorrer na fracccedilatildeo leucocitaacuteria do sangue
A aplicaccedilatildeo de um sistema de focagem isoeleacutectrica na presenccedila de ureia (8M) revelou-
-se muito eficaz na separaccedilatildeo de ALB e permitiu detectar pela primeira vez um novo variante
ALBV ligeiramente mais aciacutedico do que ALBA
A combinaccedilatildeo de uma teacutecnica de focagem isoeleacutectrica com um preacutevio tratamento das
amostras a fim de saturar a moleacutecula de TF com Fe permitiu a detecccedilatildeo de quatro produtos
geacutenicos (TF A TFD1 TFD2 e TFE) nas raccedilas estudadas
88
Conclusotildees
A combinaccedilatildeo de uma teacutecnica de focagem isoeleacutectrica com a detecccedilatildeo por
immunoblotting permitiu detectar dois produtos geacutenicos no locus GC (GCA e GCB) O
tratamento de amostras com neuraminidase permitiu a obtenccedilatildeo de padrotildees mais simples do
que os conseguidos com amostras nativas Esta simplificaccedilatildeo resulta da provaacutevel remoccedilatildeo de
aacutecidos siaacutelicos ligados agrave moleacutecula de GC
Natildeo se detectou nenhum caso de exclusatildeo na anaacutelise de segregaccedilatildeo de 27 pares
matildeefilho feita separadamente para cada locus
Verifiacutecou-se a presenccedila de dois alelos raros HBB e PEPB1 na raccedila Minhota Estes
alelos poderatildeo ser utilizados na distinccedilatildeo das duas raccedilas estudadas
Foi encontrado um valor de heterozigotia meacutedia de 0237 em populaccedilotildees de raccedila
Barrosatilde indicativo de uma variabilidade geneacutetica intermeacutedia em relaccedilatildeo agrave generalidade das
raccedilas ibeacutericas As diferenccedilas observadas entre as vaacuterias raccedilas ibeacutericas poderatildeo reflectir
fenoacutemenos histoacuterico-evolutivos muito recentes dada a sua proximidade e grande semelhanccedila
Foi observado um reduzido niacutevel de diferenciaccedilatildeo entre as raccedilas Barrosatilde e Minhota
(FST= 0031) demonstrando-se que a maior parte da diversidade geneacutetica se atribui a diferenccedilas
intrapopulacionais Este valor de FST pode considerar-se baixo quando comparado com o
obtido no estudo de outras espeacutecies animais sugerindo um elevado fluxo geacutenico
interpopulacional Por outro lado reflecte ainda uma histoacuteria demograacutefica muito recente
A utilizaccedilatildeo de meacutetodos de agrupamento NJ e UPGMA obtidos a partir de matrizes de
distacircncias geneacuteticas de Nei natildeo permitiu separar a raccedila Barrosatilde das restantes raccedilas ibeacutericas
89
Referecircncias Bibliograacuteficas
6 - REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
AMORIM A (1983) Contribuiccedilatildeo para o conhecimento da Geneacutetica Humana Estudo de Geneacutetica Bioquiacutemica
Formal e Populacional e de Ligaccedilatildeo Factorial Tese de Doutoramento Faculdade de Ciecircncias do
Porto
AMORIM A KOMPF J SCHUNTER F amp RITTER H (1982) Aminolevulinate dehydratase (EC42124)
Linkage analysis Hum Genet 61 48-49
ANSAY M (1973) Techniques microelectrophoretiques dans lanalyse de la multipliciteacute enzymatique chez les
bovins Deacutetection Eacutelectrophoreacutetique des Polymorphismes Biochimiques Chez les Mammifegraveres
Application a LEacutetude Geacuteneacutetique des Populations Centre National de la Recherche Scientifique
Paris 43-58
ARANA A pound amp ZARAGOZA P (1986) Nueva electroforetica dei enzima NADH-Diafrosa (DIA-2) detectada
en la espeacutecie Oryctolagus cuniculus (L) Zootecnia XXXV ndeg 7-12 125-130
ARAUacuteJO J (1986) Contribuiccedilatildeo para o estudo dos bovinos de raccedila Barrosatilde Relatoacuterio de estaacutegio da
licenciatura em Engenharia Zooteacutecnica Universidade dos Accedilores
ARNOLD I C J amp Bouw J (1989) A new allele of glucose phosphate isomerase in dogs Animal Genetics
20 217-220
ARRANZ J J BAYON Y amp SAN PRIMITIVO F (1992) Biochemical polymorphisms in Spanish Avilena-
-Negra Ibeacuterica cattle Animal Genetics 23 (suppl 1) 19
ARRANZ J J BAYON Y amp SAN PRIMITIVO F (1996) Comparison of protein markers and microsatellites in
differentiation of cattle populations Animal Genetics 27 415-419
ASHTON G C (1965) Cattle serum transferrins A balanced polymorphism Genetics 52 983-997
90
Referecircncias Bibliograacuteficas
BAINES J amp MEacuteLEK J (1980) Egipto - Deuses Templos e Faraoacutes Grandes Culturas e Civilizaccedilotildees Ciacuterculo
de Leitores
BELL K ARTHUR H amp ANDERSON I L (1994) Esterase and albumin polymorphism in the domestic cat
(Felis catus) XXIV International Conference on Animal Genetics Praga Julho 1994
BEKENEV V A amp ORLOVA G V (1991) Polymorphism of erytrocytic enzymes in Large White pig breeds in
Siberia Animal Genetics 22 (suppl 1) 23-24
BOWLING A T amp CLARK R S (1988) Excess of heacuteteacuterozygotes at albumin locus in American Standardbred
horses Animal Genetics 19 331-341
BOWLING A T GORDON L PENEDO M C T WICTUM E amp BEEBOUT J (1990) A single gel for
determining genetic of equine erythrocyte carbonic anhydrase (CA) and catalase (Cat) Animal
Genetics 21 191-197
BRADLEY D G MACHUGH D E CUNNINGHAM P amp LOFTUS R T (1996) Mitochondrial diversity and
the origins of African and European cattle Proceeding of the National Academy of Sciences of USA
93 5131-5135
BRAEND M (1971) Studies on the relationships between cattle breeds in Africa Asia and Europe Evidence
obtained by studies of blood groups and protein polymorphisms World Review of Animal Production
VIO (1) 10-14
BRAEND M (1988) Haemoglobin polymorphism in Norwegian Red Cattle Animal Genetics 19 59-62
BRAEND M NESSE 1 L amp EFREMOV G D (1988) Expression and genetics of caprine haemoglobins
Animal Genetics 18 223-231
BROWN L B KANE H amp AYRES H (1993) Vital signs WW Norton e Co pp 323 New York
CARTER D C HE X M MUNSON S EL TWIGG P D GERNERT K M BROOM M B amp MILLER T
Y (1989) Three dimensional structure of human serum albumin Science 244 1195-1198
CECCHINI G amp Nus M D (1986) Literature review on cattle blood polymorphisms and preliminary results
of analysis in East African Zebu in Ethiopia Agric Subtrop and Ttropicale 3 (80) 433-463
91
Referocircicias Bibliograacuteficas
CiacuteZovAacute D STRATIL A MULLER E amp CEPICA S (1993) A new partially deficient transferrin variant in
the pig Animal Genetics 24 305-306
CLARKE S W TUCKER E M amp OSTERHOFF D R (1989) Blood groups and biochemical polymorphism
in the Namaqua sheep breed Animal Genetics 20 279-286
CLUTTON-BROCK J (1992) Domestication of animals In Jomes S Martin R Pilbeam D (eds) The
Cambridge Encyclopedia of Human Evolution pp 380-385 Cambridge University Press
CORDEIRO J P (1986) As raccedilas bovinas em Portugal - Sua Origem O meacutedico veterinaacuterio I (1) 29-39
CRISTOFALO G Cozzi M C amp VALIATI P (1992) Identification of a new variant in the equine serum
alB-glycoprotein (A1B) system Animal Genetics 23 (suppl 1) 24
CUNHA L M (1994) Caracterizaccedilatildeo Morfo-Funcional e Geneacutetica da Raccedila Bovina Alentejana Trabalho de
fim de curso apresentado agrave Escola Superior Agraacuteria de Beja
DEL LAMA S N DEL LAMA M A MESTRINER M A amp MORTARI N (1992) Peptidase B polymorphism
in cattle erythrocytes Biochem Genet 30 247-255
DRATCH P TATE M KRAAY G J amp GERWING V (1992) Plasma proteins differentiating European red
deer and North American elk Animal Genetics 23 (suppl 1) 32
EGGEN A amp FRIES R (1995) An integrated cytogenetic and meiotic map of the bovine genome Animal
Genetics 26 215-236
ERHARDT G (1986) Transferrin variants in sheep separation and characterization by polyacrylamide gel
electrophoresis and isoelectric focusing Animal Genetics 17 343-352
ERHARDT G (1991) Genetic polymorphism of vitamin D binding protein and serum albumin in sheep
Animal Genetics 22 (suppl 1) 28-29
ERHARDT G amp SIMIANER H (1993) Linkage between the loci for serum albumin and vitamin D binding
protein (GC) in sheep Animal Genetics 24 301-303
EPSTEIN H amp MASON I L (1984) Cattle In Mason I L (ed) Evolution of domesticated animals pp 7-
-27 Longman
92
Referecircncias Bibliograacuteficas
FAO (1993) A diversidade da Natureza Um patrimoacutenio valioso Documento produzido pela FAO Divisatildeo de
informaccedilatildeo - Out de 1993 Veterinaacuteria Teacutecnica 10 10-12
FAO (1996) World Watch List for Domestic Animal Diversity 2a ediccedilatildeo FAOUNEP pp 334 Roma
FARNDALE B M HUBBARD D E amp ANDERSON L L (1992) A new PGD variant in New Zeland
Thoroughbred horses Animal Genetics 23 (suppl 1) 24
FELSENSTEIN J (1993) PHYLIP (Phylogeny Inference Package) Version 35 Distributed by the autor Seattle
University of Washington
FERNANDES M T S (1996) Raccedilas de bovinos autoacutectones Um importante recurso geneacutetico animal portuguecircs
a preservar e a defender Veterinaacuteria Teacutecnica 12 10-15
FERRAND N (1995) Variaccedilatildeo geneacutetica de proteiacutenas em populaccedilotildees de coelho (Oryctolagus cuniculus) -
- Anaacutelise da diferenciaccedilatildeo subespecifica subestruturaccedilatildeo expansatildeo geograacutefica e domesticaccedilatildeo
Dissertaccedilatildeo de Doutoramento em Biologia apresentada agrave Faculdade de Ciecircncias da Universidade do
Porto
FERRAND N amp ROCHA J (1991) Genetic polymorphism of serum albumin in wild rabbits populations
Animal Genetics 22 (suppl 1) 36
FORBES P MACKEITH B amp PEBERDY R (1986) Mamiacuteferos Ungulados e Lagomorfos Ciacuterculo de Leitores
FRIES R EGGEN A amp WOMACK J E (1993) The bovine genome map Mammalian Genome 4 405-428
GAHNE B(1963) Inherited variation in the post-albumin of cattle serum Hereditas 50126-135
GAHNE B JUNEJA R K amp GROLMUS J (1977) Horizontal polyacrylamine gel electrophoresis for the
simultaneous phenotyping of transferrin post-transferrin albumin and post-albumin in the blood
plasma of cattle Arum Bid Grps Biochem Genet 8127-137
GARCIA L S VICENTE M V BECERRA A L YEBRA F A RODRIcircGUES M F amp LOacutePEZ J M S
(1992) Razas Bovinas Autoacutectonas de Galicia - I Razas Morenas Galegas (Recursos Xeneacuteticos a
Conservar) Xunta de Galicia
GARCIA M ROSAacuteRIO J amp ANTUNES M (1981) Bovinos em Portugal Direcccedilatildeo dos Serviccedilos Veterinaacuterios -
- DGSV pp 44-78 Lisboa
93
Referecircncias Bibliograacuteficas
GLOWATZKI-MULLIS M L GAILLARD C WIGGER G amp FRIES R (1995) Microsatellite-based
parentage control in cattle Animal Genetics 26 7-12
GONCcedilALVES GARCIA M L (1964) A Raccedila Bovina Barrosatilde Boletim Pecuaacuterio n deg 1 Ano XXXII DGSP
pp 103-172 Lisboa
GONZALEZ P TUNON MJ amp VALLEJO M (1987) Genetic relationships between Spanish native breeds of
cattle Animal Genetics 18 249-256
HALL S B L COTHRAN E G amp KING J A (1991) Variability of manosephosphate isomerase (MPI)
from haemolysate in 14 horse breeds Animal Genetics 22 (suppl 1) 22
HARRIS H amp HOPKINSON D A (1976) Handbook of enzyme electrophoresis in human genetics North-
-Holland Publishers
HEMMER H (1990) Domestication The decline of environmental appreciation Cambridge University Press
HERZOG S (1988) Polymorphism and genetic control of erythrocyte 6-phosphogluconate dehydrogenase in
the genus Cervus Animal Genetics 19 291-294
HERZOG S (1989) Genetic polymorphism of transferrin in fallow deer Cervus dama L Animal Genetics 20
421-426
IGLESIAS A B (1989) Estrutura y relaciones geneacuteticas de razas bovinas mediante marcadores geneacuteticos
(Polimorfismos Bioquiacutemicos) Dissertaccedilatildeo de Doutoramento em Biologia apresentada agrave Faculdade de
Biologia da Universidade de Santiago
JAMIESON A (1965) The genetics of transferrins in cattle Heredity 20 419-441
JANZEN M K amp COTHRAN E G (1991) A new PGD variant from North American horses of feral origin
Animal Genetics 22 (suppl 1) 21-22
JORGE E S (1996) Bovinos da raccedila Minhota Contribuiccedilatildeo para a sua histoacuteria Veterinaacuteria Teacutecnica 10 10-
-18
94
Referecircncias Bibliograacuteficas
JUNEJA R K GAHNE B amp STRATIL A (1987) Polymorphic plasma postalbumins of some domestic
animals (pig Po2 horse XK and dog Pa proteins) identified as homologous Animal Genetics 18 119-
-124
JUNEJA R K KURYL J GAHNE B amp ZURKOWSKI M (1989) Linkage between the loci for transferrin
and ceruloplasmin in pigs Animal Genetics 20 307-311
KALAB P STRATIL A amp GLASNAacuteK V (1990) Genetic polymorphism of serum vitamin D-binding protein
(GC) in sheep and mouflon Animal Genetic 21 317-321
KAWAGUCHI T (1973) Polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of serum albumin into three
bands Clinica ChimicaActa 45 85-92
KIDD K K STONE W H CRIMELLA C CARENZI C CASATI M amp ROGNONI G (1980)
Immunogenetic and population genetic analyses of Iberian cattle Anim Blood Grps Biochem Genet
11 21-38
KRISTJANSSON F K (1963) Genetic control of two pre-albumins in pigs Genetics 48 1059-1063
KRISTJANSSON F K amp HICKMAN C G (1965) Subdivision of the allele TF D for transferrins in Holstein
and Ayrshire cattle Genetics 52 627-630
KUROSAWA Y amp TANAKA K (1988) Electrophoretic variants of serum transferrin in wild pig populations of
Japan Animal Genetics 19 31-35
LEAL C (1995) Apreciaccedilatildeo fenotiacutepica de um nuacutecleo de bovinos de raccedila Barrosatilde e amostragem para sua
caracterizaccedilatildeo geneacutetica Relatoacuterio de estaacutegio de licenciatura em Biologia - Ramo Cientiacutefico
Tecnoloacutegico em Ecologia e Recursos Zooloacutegicos Faculdade de Ciecircncias da Universidade do Porto
LITT M amp LUTTY J A (1989) A hipervariable microsatellite revealed by in vitro amplification of a
dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene American Jornal of Human Genetics 44
397-401
LOFTUS R T MACHUGH D E NGERE L O BALAIN D S BADI A M BRADLEY D G amp
CUNNINGHAM E P (1994a) Mitochondrial genetic variation in European African and Indian cattle
populations Animal Genetics 25 265-271
95
Referecircncias Bibliograacuteficas
LOFTUS R T MACHUGH B E BRADLEY B G SHARP P M amp CUNNINGHAM P (1994b) Evidence
for two independent domestications of cattle Proceeding of the National Academy of Sciences of USA
91 2757-2761
MACHUGH D E LOFTUS R T BRADLEY B G SHARP P M amp CUNNINGHAM P (1994)
Microsatellite DNA variation and among European cattle breeds Proceedings of the Royal Society of
London B 256 25-31
MACHUGH B E SHRIVER M B LOFTUS R T CUNNINGHAM P amp BRADLEY B G (1997)
Microsatellite DNA Variation and the Evolution Domestication and Phylogeography of taurine and
zebu cattle (Bos taunts and Bos indicus) Genetics 146 1071-1086
MARTINS R (1982) Conservaccedilatildeo e melhoramento dos bovinos de raccedila Barrosatilde Relatoacuterio de estaacutegio de
licenciatura em Produccedilatildeo Animal Instituto Universitaacuterio de Traacutes-os-Montes e Alto Douro
MIRANDA DO VALE J (1949) Gado Bissulco Livraria Saacute da Costa Lisboa
MORAIS M L (1992) Estudo Desenvolvimento e Optimizaccedilatildeo de Teacutecnicas de Separaccedilatildeo e Detecccedilatildeo
Especiacutefica de Proteiacutenas Dissertaccedilatildeo de Mestrado em Biologia Celular apresentada agrave Faculdade de
Ciecircncias da Universidade de Coimbra
NEI M (1978) Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small number of individuals
Genetics 89 583-590
NICHOLS E A CHAPMAN V M amp RUDDLE F H (1973) Polymorphism and linkage for
Mannosephosphate isomerase in Mus musculus Biochem Genet 8 47-53
NOBRE J M (s data) Caracterizaccedilatildeo geneacutetica da raccedila bovina Mirandesa Trabalho de fim de curso
efectuado na Estaccedilatildeo Nacional de Selecccedilatildeo e Reproduccedilatildeo Animal Curso de Engenharia Zooteacutecnica da
Universidade de Eacutevora
PENEDO M C T FOWLER M E BOWLING A T ANDERSON B L amp GORDON L (1988) Genetic
variation in the Wood of llamas Llama glama and alpaca Llama pacos Animal Genetics 19 267-
-276
PENEDO M C T amp JUNEJA R K (1989) Polymorphic plasma postalbumin (PO) of llamas and alpacas
identified as GC Protein Animal Genetics 20 221-223
96
Referecircncias Bibliograacuteficas
PENHALLOW R C MASON A B amp WOODWORTH R C (1991) Electrophoretic characterization of
human equine and bovine transferrins Comp Biochem Physiol 98B 41-45
PEREIRA A A (1997) Caracterizaccedilatildeo Geneacutetica de Algumas Subpopulaccedilotildees de Truta de Rio Salmo trutta L
da Bacia Hidrograacutefica do Rio Lima Dissertaccedilatildeo de Mestrado em Ecologia Aplicada apresentada agrave
Faculdade de Ciecircncias da Universidade do Porto
PIEDRAFITA J TEJEDOR M T amp ZARAGAZA L (1984) Post-Albuminas y Post-Transferrinas en
poblaciones bovinas Espafiolas Frisona y De Lidia Comunicacioacuten Presentada A La 34deg Reunion
Anual De La Federacioacuten Europea de Zootecnia 114-121
POVEY S CORNEY G LEWIS W H P ROBSON E B PARRINGTON J M amp HARRIS H (1972) The
genetics of peptidase C in man Ann Hum Genet 35 455-465
PRETSCH W amp MERKLE S (1990) Glucose Phosphate Isomerase Enzyme - Activity Mutants in Mus
musculus Genetical and Biochemical Characterization Biochemical Genetics 28 97-110
RASERO R D I STASIO L amp BERRA G P (1993) Polymorphism of erythocyte glucosephosphae isomerase
in sheep Animal Genetics 24 63-64
RITTER EL FRIEDRICHSON U amp SCHMITT J (1974) Genetic variation of Manose phosphate isomerase in
Man Humangenetik 22 261
RITTER H amp SCHMITT J (1973) Genetic polymorphism of Manose phosphate isomerase in Primates
Humangenetik 19 325-326
ROCHA J KOtildeMPF J FERRAND N AMORIM A amp RITTER H (1991) Separation of human alloalbumin
variants by isoelectric focusing Electrophoresis 12 313-314
ROGERSON J (1991) Biacuteblia- Os Caminhos de Deus Grandes Culturas e Civilizaccedilotildees Ciacuterculo de Leitores
RON M BAND M YANAI A amp WELLER J L (1994) Mapping quantitative trait loci with DNA
microsatellites in a commercial dairy cattle population Animal Genetics 25 259-264
RUSSEL G (1996) The analysis of genetic diversity in cattle to preserve future breeding options (Online)
Available http wwwribbsrcacukcdiv_wwwinformhtm (1996 November 29)
97
Referecircncias Bibliograacuteficas
SAITOU N amp NEI M (1987) The neighbor-joining method a new method for reconstructing phylogenetic
trees Mol Biol Evol 4 406-425
SANTOS O C M (1995) Caracterizaccedilatildeo Geneacutetica de Populaccedilotildees de Lebre Ibeacuterica (Lepus granatensis) e
Lebre Europeia (Lepus europaeus) - Aspectos Bioquiacutemicos e Populacionais Dissertaccedilatildeo de Mestrado
em Ecologia Aplicada apresentada agrave Faculdade de Ciecircncias da Universidade do Porto
SARAIVA J A (1993) Histoacuteria de Portugal Publicaccedilotildees Europa-Ameacuterica
SARTORE G STORMONT C MORRIS B G amp GRUNDER A A (1969) Multiple electrophoretic forms of
Carbonic Anhydrase in red cells of domestic cattle (Bos taurus) and American buffalo (Bison bison)
Genetics 61823-831
SCHNEIDER H SCHNEIDER M P C SILVA B T F amp SALZANO F M (1990) Transferrin and albumin
polymorphisms in buffaloes from Brazil Animal Genetics 21 335-337
SEATH P H A amp SOKAL R R (1973) Numeric Taxonomy W H Freeman amp Co
SELVARAJ O S MUKHERJEE T K DHALIWAL S S TAN S G amp BARKER J S F (1991) Biochemical
polymorphisms in the local goats of South-East Asia Animal Genetics 22 (suppl 1) 32
STERN C M MILLER S A amp SCHANFIELD M S (1992) Differentiation of wapiti and Eurasian red deer
by isoelectric focusing electrophoresis of GC on agarose gels Animal Genetics 23 (suppl 1) 23
STORMONT C amp SUZUKI Y (1963) Genetic control of albumin phenotypes in horses Proceeding of the
Society for Experimental Biology and Medicine 144 673-675
STRATIL A GLASNAacuteK V BOBAacuteK P CiacutezovAacute D GAacuteBRISOVAacute E amp KALAB P (1990) Variation of some
serum proteins in red deer Cervus elaphus L Animal Genetics 21 285-293
SWOFFORD D L amp SELANDER R B (1989) BIOSYS-1 A computer program for the analysis of allelic
variation in population genetics and biochemical systematics Release 17 Illinois Natural History
Survey
TASHIAN R E (1989) The carbonic anhydrases widening perspectives on their evolution expression and
function BioEssays 10 186-192
98
Referecircncias Bibliograacuteficas
TASHIAN R E amp CARTER N D (1976) Biochemical Genetics of Carbonic Anhydrase In Harris H (ed)
Advances in Human Genetics 7 1-56 Plenum
TATE M L amp MCEWAN K M (1992) Genetic polymorphism of erytrocyte diaphorase in red deer Cervus
elaphusL Animal Genetics 23 449-452
TSUJI S SAOAMITSU Y amp GOTO N (1989) Ultrathin-leyer isoelectric focusing for bovine serum
transferrin phenotyping Biochem Genet 27 425-429
TUCKER E M amp YOUNG J D (1988) Genetic control of red-cell nucleoside transport and its association
with the B blood-group locus and nucleoside phosphorylase activity in sheep Biochem Genet 26 489-
-501
TUNON M J GONZALEZ P amp VALLEJO M (1989) Genetic relationships between 14 native Spanish
breeds of goat Animal Genetics 20 205-212
USHA A P (1996) Cattle diversity by blood typing (Online) Available http
wwwribbsrcacukcdiv_wwwinfobhtm ( 1996)
USHA A P SIMPSON S P amp WILLIAMS J L (1995) Probability of random sire exclusion using
microsatellite markers for parentage verification Animal Genetics 26 155-161
VANDEBERG J amp AIVALIOTIS M (1990) Mannose-6-phosphate isomerase polymorphism in baboon
erythrocytes Biochemical Genetics 28 495-501
VAN DE WEGHE A VAN ZEVEREN A amp BOUQUET Y (1982) The vitamin D binding protein in domestic
animals Comp Biochem Physiol 73B 977-982
VAN DE WEGHE A YABLANSKI T S VAN ZEVEREN A amp BOUQUET Y (1988) A third variant of glucose
phosphate isomerase in pigs Animal Genetics 19 55-58
VANKAN D M amp BELL K (1992 a) A new allele in Australian goats Animal Genetics 23 453-456
VANKAN D M amp BELL K (1992 b) Genetic polymorphism of vitamin D-binding protein (GC) in Australian
goats Animal Genetics 23 457-462
VICENTE M V (1978) Razas vacunas autoacutectonas en vias de extincioacuten (Aportaciones al estuacutedio geneacutetico)
Fundacioacuten Juan March Serie Universitaacuteria LXK 10-51
99
Referecircncias Bibliograacuteficas
VIEIRA J (1993) Utilizaccedilatildeo de marcadores geneacuteticos na caracterizaccedilatildeo e certificaccedilatildeo de populaccedilotildees
domeacutesticas e selvagens de coelho (Oryctolagus cunicuius) Dissertaccedilatildeo de Mestrado apresentada agrave
Faculdade de Ciecircncias da Universidade do Porto
VIEIRA J amp FERRAND N (1995) Four new alleles at the mannose-6-phosphate isomerase locus in rabbit
Animal Genetics 26 37-38
WANG S FOOTE W C amp BUNCH T D (1990) Transferrin and haemoglobin polymorphism in
domesticated goats in the USA Animal Genetics 21 91-94
WEBER J L amp MAY P E (1989) Abundant class of human DNA polymorphisms which can be typed using
the polymerase chain reaction American Jornal of Human Genetics 44 388-396
WELCHS S (1990) A comparison of the structure and properties of serum transferrin from 17 animal species
Comp Biochem Physiol 97 B (3) 417-427
100
ANEXO
Anexos
RESUMO E CONCLUSOtildeES
Neste trabalho apresenta-se uma contribuiccedilatildeo para o estudo geneacutetico da raccedila bovina Barrosatilde e de uma outra raccedila (Minhota) atraveacutes da anaacutelise da variaccedilatildeo geneacutetica de proteiacutenas detectada pela utilizaccedilatildeo de sistemas electroforeacuteticos convencionais e por focagem isoeleacutectrica
Definiram-se os seguintes objectivos fundamentais
1 estudo da variabilidade geneacutetica da raccedila Barrosatilde ao niacutevel das proteiacutenas eritrocitaacuterias e plasmaacuteticas 2 desenvolvimento e afinaccedilatildeo de teacutecnicas de separaccedilatildeo de proteiacutenas por electroforese e focagem
isoeleacutectrica e sua detecccedilatildeo especiacutefica (histoquiacutemica e imunoloacutegica) 3 anaacutelise familiar dos polimorfismos encontrados 4 avaliaccedilatildeo do grau de diferenciaccedilatildeo geneacutetica existente entre a raccedila Barrosatilde e outras raccedilas bovinas
Escolheu-se um conjunto de 12 sistemas geneacuteticos (sete dos quais se revelaram polimoacuterficos) que pudesse satisfazer os objectivos fundamentais do trabalho
Assim apoacutes desenvolvimento de teacutecnicas de separaccedilatildeo para os sistemas geneacuteticos considerados procedeu-se a uma anaacutelise familiar baseada nos polimorfismos encontrados nas populaccedilotildees de raccedila Barrosatilde ao estudo de distribuiccedilatildeo populacional dos fenoacutetipos das duas raccedilas estudadas e de outras raccedilas bovinas da Europa (principalmente da Peniacutensula Ibeacuterica)
Com base neste trabalho obtiveram-se as seguintes conclusotildees
bull a utilizaccedilatildeo de um sistema de focagem isoeleacutectrica permitiu detectar a existecircncia de polimorfismo geneacutetico na hemoglobina distinguindo-se dois produtos geacutenicos na raccedila bovina Minhota HBA e HBB Na raccedila Barrosatilde HBA foi o uacutenico produto geacutenico encontrado
bull a utilizaccedilatildeo de um sistema de focagem isoeleacutectrica permitiu a detecccedilatildeo de dois produtos geacutenicos no locus CAII (CAIIF e CAIPS) e revelou-se mais eficaz de que as teacutecnicas de separaccedilatildeo convencional em gel de amido
bull a investigaccedilatildeo realizada permitiu detectar a ocorrecircncia de polimorfismo geneacutetico de MPI atraveacutes de um sistema electroforeacutetico em gel de amido tendo-se detectado trecircs produtos geacutenicos (MPIA MPIB e MPIC) A fraca actividade de MPI e a grande dificuldade na obtenccedilatildeo de um contraste de bandas adequado poderaacute dever-se ao facto de a sua expressatildeo soacute ocorrer na fracccedilatildeo leucocitaacuteria do sangue
bull a aplicaccedilatildeo de um sistema de focagem isoeleacutectrica na presenccedila de ureia (8M) revelou-se muito eficaz na separaccedilatildeo de ALB e permitiu detectar pela primeira vez um novo variante ALBV ligeiramente mais aciacutedico do que ALB A
bull a combinaccedilatildeo de uma teacutecnica de focagem isoeleacutectrica com um preacutevio tratamento das amostras a fim de saturar a moleacutecula de TF com Fe permitiu a detecccedilatildeo de quatro produtos geacutenicos (TFA TFD1 TFD2 e TFE) nas raccedilas estudadas
bull a combinaccedilatildeo de uma teacutecnica de focagem isoeleacutectrica com a detecccedilatildeo por immunoblotting permitiu detectar dois produtos geacutenicos no locus GC (GCA e GCB) O tratamento de amostras com neuraminidase permitiu a obtenccedilatildeo de padrotildees mais simples do que os conseguidos com amostras nativas Esta simplificaccedilatildeo resulta da provaacutevel remoccedilatildeo de aacutecidos siaacutelicos ligados agrave moleacutecula de GC
bull natildeo se detectou nenhum caso de exclusatildeo na anaacutelise de segregaccedilatildeo de 27 pares matildeefilho feita separadamente para cada locus
bull verificou-se a presenccedila de dois alelos raros HBB e PEPB1 na raccedila Minhota Estes alelos poderatildeo ser utilizados na distinccedilatildeo das duas raccedilas estudadas
I
Anexos
bull foi encontrado um valor de heterozigotia meacutedia de 0237 em populaccedilotildees de raccedila Barrosatilde indicativo de uma variabilidade geneacutetica intermeacutedia em relaccedilatildeo agrave generalidade das raccedilas ibeacutericas As diferenccedilas observadas entre as vaacuterias raccedilas ibeacutericas poderatildeo reflectir fenoacutemenos histoacuterico-evolutivos muito recentes dada a sua proximidade e grande semelhanccedila
bull foi observado um reduzido niacutevel de diferenciaccedilatildeo entre as raccedilas Barrosatilde e Minhota (FST = 0031) demonstrando-se que a maior parte da diversidade geneacutetica se atribui a diferenccedilas intrapopulacionais Este valor de FST pode considerar-se baixo quando comparado com o obtido no estudo de outras espeacutecies animais sugerindo um elevado fluxo geacutemeo interpopulacional Por outro lado reflecte ainda uma histoacuteria demograacutefica muito recente
bull a utilizaccedilatildeo de meacutetodos de agrupamento NJ e UPGMA obtidos a partir de matrizes de distacircncias geneacuteticas de Nei natildeo permitiu separar a raccedila Barrosatilde das restantes raccedilas ibeacutericas
II
Anexos
Tabela A Frequecircncias geacutenicas para os vaacuterios sistemas polimoacuterficos encontrados na raccedila Barrosatilde (indiviacuteduos inscritos e natildeo inscritos) utilizadas na anaacutelise familiar
LOCUS ALELOS FREQUEcircNCIA GEacuteNICA
CAII 294 035
065
NP 294 H
L
024
076
MPI 290 A
B
C
000
098
002
ALB 294 A
B
V
097
002
001
TF 294 A
Dl
D2
E
057
016
023
004
GC 294 083 017
TTI
A todos os colegas de mestrado e de laboratoacuterio pela amizade pelo apoio e pelo ambiente de
camaradagem existente entre todos em especial agrave Madalena Branco ao Joatildeo Alexandrino ao
Agostinho Antunes agrave Graccedila Lopes ao Filipe Castro e agrave Rita Campos
Agrave Junta Nacional de Investigaccedilatildeo Cientiacutefica e Tecnoloacutegica (JNICT) agradeccedilo a Bolsa de
Mestrado (PRAXIS XXIBM879996) que me foi concedida o que possibilitou a minha
disponibilidade para a realizaccedilatildeo da parte praacutetica de investigaccedilatildeo deste trabalho
Aos meus amigos em especial agrave Dra Graccedila Loureiro ao Dr Armando Loureiro e agrave Dra Filipa
Carvalho pela paciecircncia pelo apoio constante que revelaram ao longo deste trabalho e pelas suas
criacuteticas ao manuscrito
Agrave minha matildee e ao meu marido que tornaram possiacutevel este percurso que me conduziu ateacute aqui
A eles dedico todo este trabalho
INDICE
1 - INTRODUCcedilAtildeO 1 11 - A DOMESTICACcedilAtildeO 3
111- Evidecircncia histoacuterica da domesticaccedilatildeo do gado bovino 3
112- Paleontologia arqueozoologia 4
113- Anaacutelise geneacutetica 7
12 - A DIVERSIDADE DAS RACcedilAS BOVINAS 10
121-Asraccedilas ibeacutericas 10
122 - A raccedila Barrosatilde 11
Aspectos histoacutericos da dispersatildeo e evoluccedilatildeo do efectivo populacional 11
Aspectos morfoloacutegicos 15
Origem 15
2 - MATERIAL E MEacuteTODOS 17
21- AMOSTRAGEM E CONSERVACcedilAtildeO DAS AMOSTRAS 17
211-Amostragem 17
212 - Obtenccedilatildeo e conservaccedilatildeo das amostras de sangue 17
22- BATERIA DE MARCADORES GENEacuteTICOS SELECCIONADOS 18
23 - TRATAMENTO DAS AMOSTRAS 24
24 - MEacuteTODOS DE SEPARACcedilAtildeO 26
25 - MEacuteTODOS DE DETECCcedilAtildeO 34
26 - MEacuteTODOS DE CAacuteLCULO 38
3 - RESULTADOS E DISCUSSAtildeO 39
31- ANAacuteLISE DOS MEacuteTODOS DE SEPARACcedilAtildeO 39
32 - ANAacuteLISE FAMILIAR 51
33 - ANAacuteLISE POPULACIONAL LOCUS A LOCUS 54
34 - ANAacuteLISE POPULACIONAL CONJUNTA 72
341 - Diversidade geneacutetica na raccedila Barrosatilde 72
342 - Comparaccedilatildeo com outra raccedilas Ibeacutericas 74
343 - Diferenciaccedilatildeo geneacutetica 77
4 - CONDIDERACcedilOtildeES FINAIS 86
5 - CONCLUSOtildeES 88
6 - REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 90
ANEXO
Introduccedilatildeo
1 - INTRODUCcedilAtildeO
O crescente interesse demonstrado pelas raccedilas bovinas autoacutectones permitiu o
aparecimento nos uacuteltimos anos de uma conjuntura poliacutetica e econoacutemica claramente favoraacutevel
agrave sua conservaccedilatildeo Este interesse reflecte-se por exemplo na criaccedilatildeo de incentivos agrave produccedilatildeo
(ajudas comunitaacuterias e medidas agroambientais) ou no apelo ao consumo de produtos de
qualidade certificada Estas circunstacircncias implicam contudo a necessidade de uma maior
capacidade de produccedilatildeo que em sistemas agriacutecolas tecnicamente pouco desenvolvidos poderaacute
estar associada a programas de melhoramento geneacutetico e consequentemente a eventuais
perdas de diversidade geneacutetica (FAO 1994 LoFTUS et ai1994 FERNANDES 1996)
Em Portugal existe um nuacutemero consideraacutevel de raccedilas bovinas autoacutectones que se
encontram ainda pouco estudadas Na verdade a maior parte dos trabalhos sobre elas
realizados envolve anaacutelises fenotiacutepicas estando ainda por investigar a estrutura geneacutetica das
suas populaccedilotildees o seu grau de proximidade a sua origem e evoluccedilatildeo recente
No seio das raccedilas nacionais a raccedila Barrosatilde apresenta um conjunto de caracteriacutesticas
morfoloacutegicas muito peculiares que incluem um perfil cocircncavo da cabeccedila uma saliecircncia das
arcadas orbitarias e cornos em forma de lira alta Este conjunto de particularidades tem
suscitado opiniotildees controversas sobre a sua origem (GONCcedilALVES GARCIA 1964 GARCIA et ai 1981 LEAL 1995) Por outro lado eacute claramente uma raccedila emblemaacutetica da regiatildeo noroeste
de Portugal associada a uma agricultura de subsistecircncia e a um patrimoacutenio cultural que se
torna necessaacuterio conservar (GONCcedilALVES GARCIA 1964 GARCIA et ai 1981 LEAL 1995)
A sua aacuterea de distribuiccedilatildeo abrange apenas 17 concelhos pertencentes a 4 distritos Vila
Real Viana do Castelo Braga e Porto Actualmente a existecircncia de problemas de produccedilatildeo eacute
responsaacutevel pela progressiva diminuiccedilatildeo de alguns nuacutecleos populacionais apesar dos esforccedilos
de certas entidades para o evitar (MARTINS 1982 LEAL 1995)
i
Introduccedilatildeo
Em face do exposto torna-se necessaacuterio alargar a investigaccedilatildeo sobre esta raccedila bovina
nomeadamente atraveacutes da sua caracterizaccedilatildeo geneacutetica Espera-se assim poder contribuir para
o estabelecimento de um plano de conservaccedilatildeo da Barrosatilde e simultaneamente aprofundar o
estado actual do conhecimento sobre a geneacutetica das suas populaccedilotildees
2
Introduccedilatildeo
11 - A DOMESTICACcedilAtildeO
111 - Evidecircncia histoacuterica da domesticaccedilatildeo do gado bovino
Haacute cerca de 15000 anos verificavam-se profundas mudanccedilas climaacuteticas na Terra Os
glaciares recuaram para Norte a temperatura tornou-se mais amena uma maior aacuterea
geograacutefica tornou-se habitaacutevel O Homem teve entatildeo de vencer dificuldades impostas pela
Natureza inventando a agricultura e a criaccedilatildeo de gado passando de caccedilador noacutemada a
agricultor e a pastor (SARAIVA 1993)
O iniacutecio da agricultura e a primeira domesticaccedilatildeo de animais por parte do Homem estaacute
datada de 10000 anos aC (final do Paleoliacutetico) numa regiatildeo conhecida por Crescente Feacutertil
no Proacuteximo Oriente O primeiro animal domesticado teraacute sido o catildeo seguindo-se a ovelha a
cabra e o gado bovino jaacute no Neoliacutetico (8000 anos aC) (HEMMER 1990 CLUTTON-BROCK
1992)
A domesticaccedilatildeo do gado bovino foi provavelmente um processo gradual Eacute natural
que no princiacutepio apenas alguns animais (essencialmente fecircmeas) fossem retirados das manadas
de auroques selvagens e criados isoladamente natildeo levando de imediato ao aparecimento de
diferenccedilas morfoloacutegicas claras Esta hipoacutetese eacute apoiada por registos arqueozooloacutegicos onde a
forma proto-domesticada natildeo se distingue da forma selvagem (LOFTUS et ai 1994)
A expansatildeo neoliacutetica em direcccedilatildeo agrave Europa teraacute levado milhares de anos seguindo uma
via mariacutetima (mar Mediterracircneo) e uma via continental (atraveacutes dos Balcatildes e pelo curso do
Danuacutebio) Da Siciacutelia a revoluccedilatildeo neoliacutetica espalhou-se por toda a bacia mediterracircnea
ocidental atingindo a Peniacutensula Ibeacuterica e a costa atlacircntica e trazendo consigo a arte a
agricultura e a criaccedilatildeo de gado Desta forma soacute no 5 deg mileacutenio aC chegaram agrave Peniacutensula
Ibeacuterica as praacuteticas agriacutecolas e a pastoriacutecia (SARAIVA 1993)
Desde o Neoliacutetico que o gado bovino domesticado (Bos taurus) tem um papel muito
importante para o Homem As grandes civilizaccedilotildees da Antiguidade datildeo-nos testemunhos
escritos e trabalhos artiacutesticos indicando a sua importacircncia na alimentaccedilatildeo (carne leite) nos
trabalhos agriacutecolas na guerra na arquitectura e mesmo na religiatildeo
3
Introduccedilatildeo
Durante o periacuteodo compreendido entre o iniacutecio do Neoliacutetico ateacute agraves idades do Cobre e
do Bronze a domesticaccedilatildeo dos bovinos levou a uma contiacutenua diminuiccedilatildeo do tamanho corporal
dos animais na Europa Posteriormente este processo teraacute sido interrompido com a introduccedilatildeo
de gado bovino trazido de Roma e muitas raccedilas extinguiram-se apoacutes a queda do Impeacuterio
Romano (EPSTEIN amp MASON 1984)
Esta tendecircncia continuou a observar-se durante a Idade Meacutedia e soacute com a Revoluccedilatildeo
Industrial e a necessidade de abastecer as grandes cidades se produziu um incremento na
criaccedilatildeo de gado (EPSTEIN amp MASON 1984)
Neste domiacutenio a modernizaccedilatildeo da agricultura e a produccedilatildeo intensiva de alimentos teraacute
originado uma contiacutenua diminuiccedilatildeo dos efectivos populacionais de muitas raccedilas autoacutectones
evidente sobretudo durante a uacuteltima metade deste seacuteculo Estas circunstacircncias determinaram
assim a sensibilizaccedilatildeo da sociedade para as consequecircncias do empobrecimento de diversidade
geneacutetica do gado bovino permitindo o estabelecimento de linhas de investigaccedilatildeo destinadas agrave
sua gestatildeo e conservaccedilatildeo (BROWN et ai 1993 FAO 1996)
112 - Paleontologia arqueozoologia
De acordo com os actuais dados paleontoloacutegicos o mais antigo ruminante do Velho
Mundo teraacute aparecido no Mioceno (Gelocus) caracterizando-se pela ausecircncia de incisivos na
mandiacutebula superior e possuindo jaacute uma conformaccedilatildeo do esqueleto idecircntica agrave dos bovinos
actuais (IGLESIAS 1989 e GARCIA et ai 1992) Esta forma viria a originar posteriormente os
quatro geacuteneros actuais de ruminantes Ovis Capra Antilope e Bos (IGLESIAS 1989)
A evidecircncia paleontoloacutegica indica tambeacutem que teratildeo existido na Europa diferentes
espeacutecies de boviacutedeos actualmente extintas Destas apenas o auroque sobreviveu ateacute agrave Idade
Meacutedia havendo documentos escritos que se referem ao local e data da morte do uacuteltimo
exemplar (Poloacutenia 1627) (LOFTUS et ai 1994)
As primeiras representaccedilotildees de bovinos feitas pelo Homem devem precisamente
referir-se a auroques sendo um dos exemplos mais conhecidos constituiacutedo pelas pinturas
rupestres das grutas de Lascaux (Franccedila) (figura 111)
4
Introduccedilatildeo
Figura 111 Pintura rupestre nas paredes de grutas em Lascaux Franccedila Datando de haacute cerca de 15000 anos Reproduzido de FORBES (1986)
Soacute mais tarde surge a evidecircncia de que o processo de domesticaccedilatildeo se poderaacute ter
iniciado De facto alguns achados neoliacuteticos (8000 a 5500 anos aC) provenientes da
Anatoacutelia parecem indicar a presenccedila de animais jaacute domesticados Esta regiatildeo do Sudoeste
Asiaacutetico poderaacute assim constituir o centro de domesticaccedilatildeo do gado bovino a partir de
populaccedilotildees selvagens da subespeacutecie asiaacutetica do auroque (Bos primigenius namadicus)
(EPSTEIN amp MASON 1984)
Outra evidecircncia adicional eacute fornecida pela descoberta de ossos e dentes de um animal
sensivelmente mais pequeno do que o auroque (Iraque 5000 anos aC) bem como por um
primeiro testemunho escrito onde se descreve em placas de argila uma cabeccedila de vaca
(Mesopotacircmia 5000 anos aC) (ROGERSON 1991)
Muitos outros achados arqueoloacutegicos e paleontoloacutegicos foram encontrados na
Mesopotacircmia (4000 anos aC) e no vale do rio Nilo (4000 anos aC) mostrando um bovino
totalmente domesticado e de longos cornos (EPSTEIN amp MASON 1984)
A consolidaccedilatildeo do processo de domesticaccedilatildeo eacute a partir desta altura inquestionaacutevel
tornando-se abundantes os registos de bovinos domesticados na Mesopotacircmia e vale do Nilo
A este respeito devem referir-se especialmente as numerosas esculturas relevos pinturas e
textos em papiro que relatam pormenores da vida quotidiana do povo egiacutepcio e onde aparecem
diversas cenas que mostram a importacircncia do gado bovino na agricultura e na alimentaccedilatildeo
(figura 112)
5
Introduccedilatildeo
Figura 112 Desenho ilustrativo de uma ordenha 5a dinastia Reproduzido de BAINES
amp MEacuteLEK (1980)
A partir desta altura as descobertas arqueozooloacutegicas satildeo testemunho de uma
expansatildeo do gado bovino Assim existem registos datados de haacute cerca de 2000 e 3000 anos
aC que sugerem a ocorrecircncia no Norte de Aacutefrica de animais de enormes cornos em forma de
lira (EPSTEIN amp MASON 1984)
Tal expansatildeo daacute-se tambeacutem pela Turquia indo ateacute ao Caacuteucaso e agrave Ruacutessia e chega
tambeacutem agrave Europa onde nas regiotildees do Norte foram encontrados objectos de arte da idade do
Cobre e do Bronze que representam bovinos e datam do iniacutecio do Cristianismo (EPSTEIN amp
MASON 1984)
A migraccedilatildeo para oriente estaacute tambeacutem bem documentada atraveacutes de numerosos restos
arqueozooloacutegicos descobertos em toda a Aacutesia Eacute contudo nesta regiatildeo geograacutefica que se
pode observar a transiccedilatildeo de gado bovino sem bossa (Bos taurus) para outro com bossa (Bos
indicus) Segundo alguns autores as raccedilas de Bos indiens ou gado zebu derivariam das raccedilas
de Bos taurus ou gado taurino atraveacutes de um processo de selecccedilatildeo (EPSTEIN amp MASON
1984) Alternativamente estes dados podem tambeacutem ser interpretados como a ocorrecircncia de
dois processos de domesticaccedilatildeo independentes seguidos do contacto entre as duas populaccedilotildees
domeacutesticas de gado bovino
Adicionalmente deve salientar-se que a evidecircncia descrita eacute ainda muito incompleta
pelo que a interpretaccedilatildeo dos dados deve ser feita com bastante precauccedilatildeo A tiacutetulo de
exemplo refiram-se os achados arqueozooloacutegicos efectuados na Peniacutensula dos Balcatildes e na
6
Introduccedilatildeo
Macedoacutenia Grega (6200 anos aC) Segundo EPSTEIN amp MASON (1984) estes achados
sugerem que o Sul da Europa poderia constituir o primeiro centro de domesticaccedilatildeo do gado
bovino a partir de onde se teria iniciado a sua expansatildeo em direcccedilatildeo ao resto do continente
europeu Ruacutessia e Sudoeste Asiaacutetico
113 - Anaacutelise geneacutetica
A investigaccedilatildeo sobre a geneacutetica das diferentes raccedilas de gado bovino tem contribuiacutedo de
forma muito significativa para a compreensatildeo da sua histoacuteria dos padrotildees de diversidade que
actualmente as caracterizam e do seu grau de parentesco Os resultados actualmente
disponiacuteveis reportam-se a trecircs domiacutenios principais grupos sanguiacuteneos variaccedilatildeo geneacutetica de
proteiacutenas e polimorfismos do DNA (DNA mitocondrial e microssateacutelites)
Grupos sanguiacuteneos
A primeira tentativa para avaliar o grau de diferenciaccedilatildeo geneacutetica entre raccedilas bovinas e
caracterizar a sua diversidade data do iniacutecio de deacutecada de 70 e envolveu precisamente o
estudo dos diferentes grupos sanguiacuteneos que iam sendo descritos (RUSSELL 1996 USHA
1996) Contudo a maior parte dos resultados natildeo permitiu a obtenccedilatildeo de conclusotildees
definitivas pelo facto de se trabalhar com um nuacutemero relativamente reduzido de loci que
adicionalmente era pouco polimoacuterfico Deve poreacutem referir-se que se dispotildee actualmente de
uma consideraacutevel quantidade de informaccedilatildeo no que se refere agrave distribuiccedilatildeo da variabilidade dos
grupos sanguiacuteneos nas diferentes raccedilas bovinas conferindo a este conjunto de dados uma
importacircncia natildeo despreziacutevel no estudo de eventuais alteraccedilotildees da estrutura geneacutetica de
populaccedilotildees de gado bovino nos uacuteltimos vinte anos (RUSSELL 1996 USHA 1996)
Proteiacutenas
A introduccedilatildeo de teacutecnicas electroforeacuteticas de separaccedilatildeo de proteiacutenas permitiu aumentar
de forma muito consideraacutevel o nuacutemero de sistemas geneacuteticos polimoacuterficos conhecidos nas
raccedilas bovinas em especial no que se refere a proteiacutenas do sangue e do leite (USHA 1996)
A anaacutelise da sua distribuiccedilatildeo populacional veio demonstrar a ocorrecircncia de dois grupos
principais de bovinos ou duas subespeacutecies (Bos primigenius taurus e Bos primigenius
7
Introduccedilatildeo
indiens) cada um deles caracterizado pela presenccedila de diversos alelos privativos em vaacuterios loci
(BRAEND 1971)
Estes resultados estatildeo de uma maneira geral de acordo com dados morfoloacutegicos
histoacutericos e ainda com a distribuiccedilatildeo geograacutefica conhecida dos principais grupos (EPSTEIN amp
MASON 1984) No entanto o acreacutescimo de informaccedilatildeo fornecido por este tipo de marcadores
foi ainda insuficiente para resolver muitas das interpretaccedilotildees contraditoacuterias publicadas sobre o
tema
Polimorfismo do DNA
A introduccedilatildeo das teacutecnicas de anaacutelise genoacutemica directa e em especial a descoberta do
polimorfismo do DNA-mitocondrial (mtDNA) e dos microssateacutelites forneceram os
instrumentos necessaacuterios a uma detalhada caracterizaccedilatildeo geneacutetica das raccedilas bovinas
A anaacutelise da variaccedilatildeo da moleacutecula de mtDNA permitiu verificar que Bos primigenius
taurus e Bos primigenius indicus teratildeo divergido haacute cerca de 210000 anos uma data muito
anterior agrave indicada pelos dados arqueoloacutegicos para o iniacutecio do processo de domesticaccedilatildeo Eacute
assim muito provaacutevel que tenham ocorrido duas domesticaccedilotildees independentes a partir de duas
subespeacutecies diferentes do auroque Bos primigenius namadicus teraacute dado origem ao gado
zebu na Aacutesia (Vale do Indu) e Bos primigenius primigenius ao gado europeu vindo do
Proacuteximo Oriente (LOFTUS et ai 1994a 1994b)
Muito recentemente BRADLEY et ai (1996) e MACHUGH et ai (1997) sugerem ainda
uma terceira domesticaccedilatildeo independente ocorrida em Aacutefrica Esta evidecircncia resulta tambeacutem
de anaacutelise do polimorfismo do mtDNA indicando uma separaccedilatildeo entre os ancestrais do gado
europeu e africano anterior agrave domesticaccedilatildeo (22000 - 26000 anos) Este terceiro processo de
domesticaccedilatildeo ter-se-ia assim efectuado a partir da subespeacutecie africana do auroque (Bos
primigenius opisthonomus)
A descoberta dos microssateacutelites e do seu elevado grau de polimorfismo data do fim da
deacutecada de 80 (Lm amp LUTY 1989 WEBER amp MAY 1989) e constitui provavelmente a
metodologia mais adequada para estudar a histoacuteria recente da diversificaccedilatildeo das raccedilas bovinas
(MACHUGH et ai 1994 ARRANZ et ai 1996) Os primeiros resultados que envolvem uma
caracterizaccedilatildeo em larga escala de diferentes populaccedilotildees permitiram distinguir mais claramente
a estrutura geneacutetica dos dois grandes grupos de gado bovino (Bos taurus e Bos indicus) e
constituem a base para futuros estudos mais especiacuteficos
8
Introduccedilatildeo
Por outro lado os microssateacutelites permitiram tambeacutem o iniacutecio do projecto de
cartografia do genoma bovino que no fim de 1994 contabilizava 202 marcadores geneacuteticos
(dos quais 144 eram microssateacutelites) regularmente espaccedilados em 90 do seu comprimento
Cerca de um ano depois existiam jaacute mais de 400 microssateacutelites (USHA et ai 1995) levando
EGGEN et ai (1995) a apresentar um trabalho de revisatildeo e consolidaccedilatildeo de informaccedilatildeo jaacute
existente para evitar a ocorrecircncia de possiacuteveis redundacircncias
A aplicaccedilatildeo deste tipo de marcadores natildeo se restringe apenas agrave anaacutelise da diversidade
geneacutetica populacional e agrave construccedilatildeo de mapas geneacuteticos De facto satildeo actualmente escolhidos
para a realizaccedilatildeo de testes de paternidade (GLOWATZKI-MULLIS et ai 1995 USHA et ai 1995
ARRANZ et ai 1996) detecccedilatildeo de loci que determinam a expressatildeo de caracteriacutesticas
quantitativas (QTL) (RON et ai 1994) determinaccedilatildeo do sexo em embriotildees selecccedilatildeo animal
assistida entre outros
No seu conjunto estes resultados tecircm permitido um avanccedilo notaacutevel na compreensatildeo da
evoluccedilatildeo das actuais raccedilas bovinas A prossecuccedilatildeo desta via de investigaccedilatildeo poderaacute levar ao
esclarecimento definitivo do nuacutemero de domesticaccedilotildees independentes que teraacute ocorrido
(EPSTEIN amp MASON 1984 LOFTUS et al 1994a 1994b BRADLEY et al 1996 MACHUGH et
al 1997) a partir das populaccedilotildees selvagens de auroque Seguidamente eacute legiacutetimo esperar que
venha a ser possiacutevel analisar a uma escala mais fina o grau de parentesco geneacutetico entre raccedilas
que ocupem aacutereas geograacuteficas mais reduzidas Neste particular seraacute extremamente interessante
incluir as populaccedilotildees ibeacutericas e em especial a raccedila Barrosatilde
9
Introduccedilatildeo
12 - A DIVERSIDADE DAS RACcedilAS BOVINAS
A domesticaccedilatildeo resultou na criaccedilatildeo de milhares de raccedilas de animais domeacutesticos
geneticamente diferentes e adaptadas agraves necessidades humanas e a uma grande variedade de
condiccedilotildees ambientais (FAO 1993)
121 - As raccedilas ibeacutericas
A grande diversidade de raccedilas bovinas da Peniacutensula Ibeacuterica poderaacute dever-se em parte
agrave introduccedilatildeo de outras raccedilas domeacutesticas que se cruzaram entre si e com bovinos jaacute existentes
na Peniacutensula A introduccedilatildeo de outras raccedilas teraacute sido feita de duas formas distintas
1 - atraveacutes dos movimentos migratoacuterios acompanhando as vaacuterias invasotildees de povos
vindos do oriente como eacute o caso dos Feniacutecios ( seacutec X aC) Gregos (seacutec VII aC) e
Romanos (seacutec III aC) Estes uacuteltimos dominaram completamente a Peniacutensula durante
7 seacuteculos e teratildeo contribuiacutedo para a diversificaccedilatildeo do gado bovino pelo facto de
introduzirem animais de caracteriacutesticas diferentes Supotildee-se que do seu cruzamento
com os bovinos ibeacutericos se teratildeo originado os troncos aquitacircnico e ibeacuterico (MIRANDA
do VALE 1949)
2 - atraveacutes da introduccedilatildeo de animais do Norte de Aacutefrica na sequecircncia da invasatildeo de
povos como os Cartagineses (seacutec V aC) e jaacute na era cristatilde os Mouros (711 dC)
Estes teratildeo introduzido descendentes de Bos primigenius opisthonomus que poderaacute
ter influenciado a formaccedilatildeo de vaacuterias raccedilas ibeacutericas nomeadamente as raccedilas Barrosatilde e
Cachena (APARIacuteCIO 1960 in IGLESIAS 1989 EPSTEIN amp MASON 1984) Estas
poderatildeo assim constituir uma linha que descende do tronco mauritaacutenico (MIRANDA
do VALE 1949)
10
Introduccedilatildeo
Adicionalmente eacute provaacutevel que povos oriundos do Norte da Europa nomeadamente
os Visigodos possam ter introduzido gado bovino dessa regiatildeo Contudo a sua eventual
contribuiccedilatildeo para a diversidade de raccedilas bovinas da Peniacutensula Ibeacuterica estaacute por esclarecer
122 - A raccedila Barrosatilde
Aspectos histoacutericos da dispersatildeo e evoluccedilatildeo do efectivo populacional
O centro de criaccedilatildeo da raccedila Barrosatilde situa-se actualmente na zona do planalto da Serra
do Barroso abrangendo os actuais concelhos de Montalegre Boticas Vieira do Minho
(freguesias de Campos e Ruivatildees) e Cabeceiras de Basto (freguesia de Gondiatildees) Esta regiatildeo
natildeo possui condiccedilotildees agro-climateacutericas que permitam grandes exploraccedilotildees agriacutecolas pelo que
uma parte importante da populaccedilatildeo se dedica agrave criaccedilatildeo de gado (GARCIA et ai 1981
FERNANDES 1996)
Vivendo sobretudo em zonas montanhosas a Barrosatilde eacute utilizada essencialmente como
forccedila de trabalho e na produccedilatildeo de carne de excelente qualidade motivo pelo qual a Uniatildeo
Europeia a reconhece com denominaccedilatildeo de Origem Protegida (FERNANDES 1996)
No seacuteculo passado e iniacutecio do seacuteculo XX existia um grande incentivo para a criaccedilatildeo
desta raccedila devido agrave procura da sua carne muito apreciada em Inglaterra Este incentivo
contribuiu indirectamente para que a estatura dos animais se elevasse (GARCIA et ai 1981) e
para que a zona de criaccedilatildeo se dispersasse pelas aacutereas submontanhosas e pelas planiacutecies do
Entre Douro e Minho ateacute agrave orla mariacutetima chegando mesmo ao concelho de Vila Nova de Gaia
(figura 121) Nestas zonas fazia-se a criaccedilatildeo de novilhos para exploraccedilatildeo como bois de
trabalho e para produccedilatildeo de carne Tal exploraccedilatildeo estaacute bem patente nos paineacuteis de azulejos da
estaccedilatildeo de caminhos de ferro de S Bento no Porto e mesmo nos desenhos das calccediladas nas
principais avenidas desta cidade
li
Introduccedilatildeo
B
bull bull bull _ bull bull bull - bull bull
Figura 121 A) Junta de bois de trabalho de raccedila Barrosatilde B) Fecircmea adulta Barrosatilde C) Macho adulto Barrosatilde Fotografias datadas de 1949 gentilmente cedidas pela Direcccedilatildeo Regional de Agricultura de Entre Douro e Minho - Centro de Produccedilatildeo Animal (DRAEDM)
12
Introduccedilatildeo
Poreacutem a necessidade de maiores produccedilotildees de carne foi conduzindo durante a
segunda metade deste seacuteculo a um progressivo decliacutenio no efectivo populacional da raccedila
Barrosatilde tornando-se mesmo raro poder observar uma junta de bois Recentemente as
alteraccedilotildees verificadas na poliacutetica agraacuteria e ambiental da Uniatildeo Europeia teratildeo permitido
alguma recuperaccedilatildeo Nesse contexto a criaccedilatildeo em 1981 do Livro Genealoacutegico da raccedila
Barrosatilde constitui um passo importante para a certificaccedilatildeo dos animais e o aumento do seu
valor Actualmente o seu efectivo populacional tem crescido continuamente e essa tendecircncia
parece estaacutevel
Segundo dados fornecidos pelo Registo Zooteacutecnico e pela Associaccedilatildeo do Minho dos
Criadores de Bovinos de Raccedila Barrosatilde (AMTOA) existiam em 1996 38002 fecircmeas
reprodutoras inscritas e 375 touros de cobriccedilatildeo (tabela 1221) distribuiacutedos por vaacuterios
concelhos dos distritos de Viana do Castelo Braga Vila Real e Porto (figura 122)
Tabela 1221 Movimento do Registo Zooteacutecnico relativo agrave raccedila Barrosatilde
Vacas Inscritas Postos de Cobriccedilatildeo Vitelos Anos Abatidas Registadas Inscritas Encerrados Recenseados Existecircncias Inscritos 1981 0 4884 4882 1 25 24 0 1982 19 6169 11032 6 42 60 532 1983 31 4436 15437 14 35 81 1593 1984 72 866 16231 13 14 82 2151 1985 47 604 16788 15 15 82 1767 1986 106 1027 17709 18 13 77 2414 1987 72 1186 18823 2 14 89 2632 1988 122 1192 19877 5 7 91 2574 1989 138 718 20506 14 26 103 2532 1990 89 1017 21440 8 7 102 2404 1991 159 1309 22590 14 26 114 2531 1992 52 1902 24440 6 17 125 3203 1993 0 4205 28645 37 87 175 4077 1994 0 6248 34893 58 111 228 4679 1995 340 2447 37000 0 112 340 5759 1996 120 1122 38002 26 61 375 5901
Fonte Registo Zooteacutecnico (cedido pela AM1BA)
Apesar desta situaccedilatildeo favoraacutevel natildeo se pode considerar que a raccedila Barrosatilde natildeo corra
ainda perigo de extinccedilatildeo Na verdade satildeo vaacuterios os factores que tecircm contribuiacutedo para a
diminuiccedilatildeo da sua aacuterea de criaccedilatildeo ou mesmo para a alteraccedilatildeo das caracteriacutesticas destes
animais De entre esses factores deve salientar-se i) a substituiccedilatildeo de Barrosatilde por outras raccedilas
autoacutectones (Minhota Mirandesa Maronesa) ou importadas (Friacutesia Gelbvieh e Parda Suiacuteccedila)
13
Introduccedilatildeo
que fornecem ao agricultor um rendimento superior ii) a progressiva mecanizaccedilatildeo da
agricultura e a diminuiccedilatildeo das aacutereas de pastagem iii) o pequeno nuacutemero de machos
reprodutores associado a um efectivo idoso iv) uma baixa fertilidade meacutedia grandes
intervalos entre partos e elevado nuacutemero de abortos e v) desmotivaccedilatildeo dos produtores mesmo
em face das actuais condiccedilotildees de comercializaccedilatildeo
LEGENDA
| j - -Concelhos de Entre Douro e Minho S Concelhos de Traacutes-os-Montes
ESCALA 11380000
Figura 122 Mapa de distribuiccedilatildeo do actual efectivo Barrosatilde
14
Introduccedilatildeo
Aspectos morfoloacutegicos
O bovino Barrosatilde apresenta uma estatura mediana com 121-130 cm de altura agrave
cernelha e pelagem de cor castanha (variando entre a cor de palha ateacute a cor acerejada) (LEAL
1995) A cabeccedila eacute curta e larga encimada por uma cornamenta em forma de lira alta os
cornos satildeo muito compridos e espessos de cor branca suja com pontas escuras o conjunto
ocular eacute saliente dando-lhe o aspecto de olhos de sapo as orelhas satildeo de tamanho meacutedio os
membros satildeo curtos e pouco ossudos e o pescoccedilo eacute curto bem ligado agrave cabeccedila e com garrote
largo (MARTINS 1982)
Eacute uma raccedila com caracteres sexuais secundaacuterios bem diferenciados Os touros satildeo
normalmente mais escuros particularmente no terccedilo anterior com maior corpulecircncia do que as
fecircmeas mais robustos com barbela mais desenvolvida cabeccedila mais curta e mais larga cornos
mais grossos e ligeiramente mais curtos (GARCIA et ai 1981 MARTINS 1982)
Esta raccedila apresenta duas particularidades morfoloacutegicas que a distinguem de todas as
outras raccedilas grande desenvolvimento coacuterneo e perfil cocircncavo da cabeccedila com acentuado
prognatismo mandibular O elevado crescimento coacuterneo poderaacute estar relacionado com a
selecccedilatildeo dos animais De facto nas populares chegas de touros o animal que sai vencedor seraacute
o touro cobridor das vacas da aldeia Este processo teraacute permitido a primazia de touros de
maior ossatura capital mais potente musculatura ceacutefalo-cervical maior forccedila no acircngulo taacutersico
e consequentemente grande desenvolvimento dos cornos (MIRANDA do VALE in GONCcedilALVES GARCIA 1964 ARAUacuteJO 1986) No que se refere ao acentuado prognatismo
mandibular eacute possiacutevel que em parte esteja relacionado com o grande desenvolvimento
coacuterneo Este teraacute exigido um desenvolvimento correlativo de certos ossos cranianos e o
atrofiamento dos ossos da face (GONCcedilALVES GARCIA 1964)
Origem
A origem da raccedila Barrosatilde e o seu enquadramento com as outras raccedilas da Peniacutensula
Ibeacuterica estaacute ainda por explicar constatando-se uma grande heterogeneidade na opiniatildeo de
diversos autores a este respeito (MARTINS 1982)
Alguns autores referem a existecircncia no Norte de Aacutefrica (vale do Nilo) de um gado
com caracteriacutesticas morfoloacutegicas semelhantes agrave actual raccedila Barrosatilde em especial no que se
refere agrave forma tamanho e espessura dos cornos Este gado eacute normalmente associado agrave
15
Introduccedilatildeo
designaccedilatildeo subespeciacutefica Bos primigenius opisthonomus (embora tambeacutem se refira como Bos
primigenius mauritaniens e como Bos taurus desertorum) e teraacute chegado agrave Peniacutensula Ibeacuterica
atraveacutes de vaacuterias rotas migratoacuterias dos povos norte-africanos A raccedila Barrosatilde poderia assim
ser incluiacuteda no tronco mauritaacutenico tendo como ancestral Bos primigenius mauritanicus
(GARCIA et ai 1981)
Neste contexto poderaacute admitir-se que o gado que corresponde a este grupo se tenha
instalado na Peniacutensula Ibeacuterica provavelmente durante a longa ocupaccedilatildeo Moura (GONCcedilALVES
GARCIA 1964) Posteriormente a raccedila Barrosatilde teraacute sido desalojada pelos troncos ibeacuterico e
aquitacircnico restando apenas um nuacutecleo populacional confinado agraves zonas planaacutelticas do
Barroso onde permaneceu ateacute hoje (GONCcedilALVES GARCIA 1964)
Esta hipoacutetese natildeo eacute contudo partilhada por outros autores que lhe criticam a escassa
evidecircncia (forma e tamanho dos cornos) e portanto uma clara ausecircncia de base cientiacutefica
(IGLESIAS 1989)
Perante o exposto pode verificar-se que a raccedila Barrosatilde apresenta aspectos
morfoloacutegicos e histoacuterico-evolutivos muito peculiares sendo ainda hoje difiacutecil proceder ao seu
enquadramento no seio das restantes raccedilas bovinas ibeacutericas O aprofundamento da investigaccedilatildeo
sobre a estrutura geneacutetica das suas populaccedilotildees poderaacute ser assim uma via para o
esclarecimento das muitas questotildees que permanecem por responder Nestas condiccedilotildees este
trabalho pretende ser uma contribuiccedilatildeo para o conhecimento da geneacutetica das populaccedilotildees da
raccedila bovina Barrosatilde atraveacutes da consecuccedilatildeo dos seguintes objectivos
1 estudo da variabilidade geneacutetica da raccedila Barrosatilde ao niacutevel das proteiacutenas eritrocitaacuterias
e plasmaacuteticas
2 desenvolvimento e afinaccedilatildeo de teacutecnicas de separaccedilatildeo de proteiacutenas por electroforese
e focagem isoeleacutectrica e sua detecccedilatildeo especiacutefica (histoquiacutemica e imunoloacutegica)
3 anaacutelise familiar dos polimorfismos encontrados
4 avaliaccedilatildeo do grau de diferenciaccedilatildeo geneacutetica existente entre a raccedila Barrosatilde e outras
raccedilas bovinas
16
Material e Meacutetodos
2 - MATERIAL E MEacuteTODOS
21 - AMOSTRAGEM E CONSERVACcedilAtildeO DAS AMOSTRAS
211 - Amostragem
Foram recolhidas 356 amostras de sangue correspondente a 294 indiviacuteduos de raccedila
Barrosatilde (dos quais 141 estavam inscritos no Livro Genealoacutegico) e 62 indiviacuteduos de raccedila
Minhota As colheitas efectuaram-se em zonas de intensa criaccedilatildeo da Barrosatilde designadamente
nos concelhos de Arcos de Valdevez Cabeceiras de Basto Fafe Poacutevoa de Lanhoso e
Monccedilatildeo em finais de 1993 durante o ano de 1994 e ainda no periacuteodo de 1996 1997 em
Vieira do Minho
A recolha de sangue em indiviacuteduos de raccedila Minhota foi efectuada com a finalidade de
servir como termo de comparaccedilatildeo geneacutetica uma vez que se realizam cruzamentos entre esta
raccedila e a Barrosatilde
212 - Obtenccedilatildeo e conservaccedilatildeo das amostras de sangue
O sangue foi colhido da veia jugular em tubos contendo 01 ml de EDTA (aacutecido
etilnodiaminotetraceacutetico) dissoacutedico a 10 ou em tubos heparinados
As amostras de sangue foram centrifugadas (10 minutos a 13000 rpm) separando-se
em seguida o plasma dos eritroacutecitos Aos eritroacutecitos foi adicionado meio de glicerol (seis
partes de uma soluccedilatildeo 5 de citrato trissoacutedico 2H20 adicionados a quatro partes de glicerol)
numa proporccedilatildeo aproximada de 21 as amostras foram conservadas a -20degC
17
Material e Meacutetodos
22 - BATERIA DE MARCADORES GENEacuteTICOS SELECCIONADOS
No presente trabalho foi escolhida uma bateria de 12 marcadores geneacuteticos dispersos
no genoma do bovino (figura 5) HB (Hemoglobina) CAII (Anidrase carboacutenica) PEPB
(Peptidase B) DIA (Diaforase) NP (Fosforilase nucleosiacutedica) MDH (Desidrogenase do
malato) PGD (Desidrogenase do aacutecido fosfoglucoacutenico) GPI (Isomerase da fosfoglucose)
MPI (Isomerase da manose-6-fosfato) ALB (Albumina) TF (Transferrina) e GC
(Componente especiacutefico de grupo)
CP SODl TF
PEPC IDH1
AMY1 AMY1A PGM1
4
LDHB PEPB
ADH2 PGM2 ALB GC SOD3
6
IADA
ALDH1
CAII
ME1 PGM3 SOD2
NP
10
CAT HBBq22-q27
PGD IALDH2 DIA4
HP GPIq22-q24
MPI iBF GLOl
LDHA MDH2
Figura 221 Localizaccedilatildeo de vaacuterios loci proteicos no genoma de Bos taurus Com um tom mais carregado indicam-se os marcadores estudados neste trabalho Adaptado de FRIES et ai (1993)
18
Material e Meacutetodos
bull HB
A hemoglobina eacute responsaacutevel pelo transporte do oxigeacutenio dos pulmotildees para os tecidos
A sua estrutura eacute tetrameacuterica tendo cada uma das quatro subunidades um grupo prosteacutetico -
- heme - com um aacutetomo de ferro no centro A fracccedilatildeo principal da hemoglobina de mamiacuteferos
adultos eacute composta por duas cadeias a e duas cadeias P (BRAEND 1971 CECCHINI amp Nus
1986)
O locus da HB foi um dos primeiros a ser estudado apresentando polimorfismo em
vaacuterios mamiacuteferos (CECCHJM amp Nus 1986 BRAEND et ai 1988 CLARKE et ai 1989 WANG
et ai 1990 SELVARAJ et ai 1991) Em 1955 CABANNE amp SERAIN (in BRAEND 1988)
descrevem pela primeira vez o polimorfismo da HB em bovinos do Norte da Aacutefrica
Posteriormente muitos estudos foram efectuados descrevendo-se 13 variantes (raros na sua
maioria) com diferenccedilas apenas nas cadeias beta (CECCHINI amp Nus 1986 BRAEND 1988)
bull CAII-EC4211
A CAII eacute uma metaloenzima com grande distribuiccedilatildeo nos animais e nas plantas
(TASHIAN 1989) Catalisa de forma reversiacutevel a hidrataccedilatildeo do C02 em H2C03 (CECCHINI amp
Nus 1986 TASHIAN 1989) O seu papel fisioloacutegico ainda natildeo eacute bem conhecido mas eacute
possiacutevel que tenha participaccedilatildeo na manutenccedilatildeo do balanccedilo osmoacutetico (TASHIAN 1989)
A ocorrecircncia de variaccedilatildeo geneacutetica na CAII estaacute descrita em muitas espeacutecies de
mamiacuteferos tendo sido descritos dois loci polimoacuterficos (CAI e CAII) (TASHIAN amp CARTER
1976 CLARICE et ai 1989 SELVARAJ et ai 1991)
SARTORE et ai (1969) foram os primeiros a detectar polimorfismo electroforeacutetico da
anidrase carboacutenica em bovinos domeacutesticos e buacutefalos americanos Nos eritroacutecitos de bovinos
apenas se exprime a anidrase carboacutenica II que apresenta geralmente 2 alelos codominantes
autossoacutemicos (CAIPF e CAIPS) (SARTORE et ai 1969 TASHIAN amp CARTER 1976) Mais
tarde foram encontrados 3 novos alelos (C Z e X) (CECCHINI amp Nus 1986)
19
Material e Meacutetodos
bull PEPB-EC3412
As peptidases formam um conjunto de enzimas capazes de hidrolisar di- e tripeacuteptidos
caracterizando-se pela sua especificidade em relaccedilatildeo a diversos substratos bem como atraveacutes
da sua distribuiccedilatildeo tecidular
A PEPB apresenta uma estrutura monomeacuterica tendo sido descrita como polimoacuterfica
em algumas raccedilas brasileiras de bovinos de origem europeia e indiana (DEL LAMA et ai
1992)
bull DIA-EC1643
A enzima monomeacuterica DIA (NADH - Methemoglobina redutase) tambeacutem conhecida
por citocromo bs redutase faz parte de um grupo de enzimas que catalisam a reduccedilatildeo da
methemoglobina (IGLESIAS 1989 VIEIRA 1993 kRAHhetal 1986)
O seu polimorfismo geneacutetico foi detectado em vaacuterias espeacutecies de Ungulados incluindo
os bovinos (CLARKE et ai 1989 IGLESIAS 1989 SELVARAJ et ai 1991 TATE amp McEWAN
1992)
bull NP-EC2421
A enzima NP encontra-se distribuiacuteda por vaacuterios tecidos e oacutergatildeos e catalisa
reversivelmente a fosforoacutelise dos nucleosiacutedeos puriacutenicos levando agrave formaccedilatildeo das respectivas
bases e ribose-1-fosfato (IGLESIAS 1989)
O polimorfismo geneacutetico desta enzima foi detectado em vaacuterias espeacutecies de mamiacuteferos
incluindo os bovinos (ANSAY 1973 HARRIS amp HOPKINSON 1978 TUKER amp YOUNG 1988
CLARKE eacutetal 1989 IGLESIAS 1989 FERRAND 1995)
20
Material e Meacutetodos
bull MDH-ECl 1137
A MDH eacute uma oxirredutase dimeacuterica na maioria dos mamiacuteferos responsaacutevel pela
oxidaccedilatildeo do L-malato em oxoglutarato com NAD como aceitador A reacccedilatildeo eacute reversiacutevel em
presenccedila de NADH e oxaloacetato A enzima diz-se NAD especiacutefica pelo facto da reacccedilatildeo soacute
ocorrer na presenccedila deste cofactor (MORAIS 1992 PEREIRA 1997)
A ocorrecircncia de variaccedilatildeo geneacutetica neste locus foi descrita para vaacuterios mamiacuteferos
(HARRIS amp HOPKINSON 1978 TUNOacuteN et ai 1989 SELVARAJ et ai 1991) Contudo
relativamente aos bovinos natildeo foi possiacutevel encontrar referecircncias quanto ao seu polimorfismo
bull PGD-EC11144
A PGD eacute uma enzima dimeacuterica envolvida na via das pentoses-fosfato catalisando a
conversatildeo de 6-fosfogluconato em ribose-5-fosfato
O polimorfismo geneacutetico do locus PGD estaacute descrito em diversas espeacutecies de
Ungulados (HERZOG 1988 PENEDO et ai 1988 BEKENEV amp ORLO VA 1991 KUROSAWA amp
TANAKA 1991 JANZEN amp COTHRAN 1991 FERNDALE et al 1992) Contudo relativamente
aos bovinos natildeo foi possiacutevel encontrar referecircncias quanto ao seu polimorfismo
bull GPI-EC5319
A isomerase da fosfoglucose cataliza a reacccedilatildeo reversiacutevel de conversatildeo de glucose-
-6-fosfato em frutose-6-fosfato (HARRIS amp HOPKINSON 1978 PRETSCHei ai 1990)
Eacute uma enzima dimeacuterica com polimorfismo geneacutetico em vaacuterias espeacutecies de mamiacuteferos
nomeadamente no catildeo (ARNOLD amp Bouw 1989) no porco (VAN DE WEGHE et ai 1988
BEKENEV amp ORLO VA 1991) na ovelha (RASERO et ai 1993) em lamas e alpacas (PENEDO et
ai 1988) e no Homem (HARRIS amp HOPKINSON 1978)
21
Material e Meacutetodos
bull MPI-EC5318
A MPI eacute uma enzima monomeacuterica de acccedilatildeo cataliacutetica que permite a isomerizaccedilatildeo de D-
-manose-6-fosfato em D-frutose-6-fosfato
Em diversas espeacutecies de mamiacuteferos nomeadamente no Homem (RlTTER et ai 1974)
em babuiacutenos (RITTER amp SCHMITT 1973) e ratos (NICHOLS et ai 1973 VANDEBERG amp
AIVALIOTIS 1990) esta enzima natildeo apresenta actividade em eritroacutecitos sendo poreacutem
detectada em diversos tecidos como rim fiacutegado e o muacutesculo Mais tarde demonstrou-se a
possibilidade de proceder a esta detecccedilatildeo em hemolisados de cavalos coelhos e lebres (HALL
et ai 1991 VIEIRA amp FERRAND 1995 SANTOS 1995)
O polimorfismo geneacutetico de MPI em bovinos foi descrito por ANSAY (1973)
apresentando trecircs alelos autossoacutemicos codominantes (MPPA MPIB e MPIC)
bull ALB
A albumina eacute a proteiacutena mais abundante no plasma dos mamiacuteferos e apresenta uma
estrutura monomeacuterica A sua funccedilatildeo estaacute relacionada com processos de transporte e de
regulaccedilatildeo do balanccedilo osmoacutetico (CECCHTNI amp Nus 1986 CARTER et al 1989)
O polimorfismo geneacutetico da albumina estaacute descrito em vaacuterias espeacutecies de Ungulados
(STORMONT et ai 1963 BOWLING amp CLARK 1988 PENEDO et ai 1988 ERHARDT 1991
SELVARAJeacutetfa 1991CRISTOFALOpounda 1992 ERHARDT amp SlMIANER 1993)
EFREMOV e ASHTON em 1965 (in CECCHTNI amp Nus 1986) descrevem pela primeira vez
polimorfismo geneacutetico em raccedilas bovinas inglesas Inicialmente encontraram-se dois alelos
(ALBA ou ALBF e ALBB ou ALBS) por electroforese aacutecida Mais tarde descreveram-
-se outros alelos em raccedilas britacircnicas (ALBH e ALBG) e em raccedilas africanas (ALBD
ALBE e ALBF) (CECCHINI amp Nus 1986) ABE et ai em 1971 descrevem o alelo ALBX
(in CECCHTNI amp Nus 1986)
22
Material e Meacutetodos
bull TF
A transferrina eacute uma 3-globulina seacuterica responsaacutevel pelo transporte do ferro Possui
uma estrutura monomeacuterica glicosilada (CECCHINI amp Nus 1986 WELCHS 1990 PENHALLOW
et ai 1991 CUNHA 1994)
O polimorfismo geneacutetico desta proteiacutena foi detectado em vaacuterias espeacutecies de Ungulados
(KRISTJANSSON 1963 STORMONT et ai 1963 ASHTON 1965 GAHNE et ai 1977 CECCHJNI
amp Nus 1986 ERHARD 1986 KUROSAWA amp TANAKA 1988 PENEDO et ai 1988 CLARKE et
ai 1989 HERZOG 1989 JUNEJA et ai 1989 TSUJI et ai 1989 SCHNEIDER et ai 1990
STRATIL et ai 1990 WANG et ai 1990 SELVARAJ et ai 1991 DRATCH et ai 1992
VANKAN amp BELL 1992a CIacuteZovket ai 1993 ERHARD et ai 1993)
ASHTON em 1965 descreveu pela primeira vez o polimorfismo geneacutetico de TF em
bovinos estando actualmente descritos sete alelos TFA TFB TFD1 TFD2 TFE
TFF e TFG (CECCHTNI amp Nus 1986) A subdivisatildeo do alelo TFD em TFD1 e TFD2 foi
descrita por KRISTJANSSON amp HICKMAN (1965)
Nos bovinos os loci TF e CP encontram-se ligados como tem sido descrito para vaacuterias
espeacutecies de mamiacuteferos (JUNEJA et ai 1989)
bull GC
A GC apresenta uma estrutura monomeacuterica e o seu polimorfismo geneacutetico estaacute descrito
em vaacuterias espeacutecies de Ungulados (GAHNE 1963 KRISTJANSSON 1963 JUNEJA et ai 1987
PENEDO et ai 1988 PENEDO amp JUNEJA 1989 KALAacuteB et ai 1990 ERHARDT 1991 VANKAN
amp BELL 1992b STERN et ai 1992 ERHARDT amp SIMIANER 1993 STRATIL et ai 1995)
Nos bovinos o polimorfismo geneacutetico da GC foi inicialmente descrito por GAHNE
(1963) e ASHTON (1963) in GAHNE et ai 1977) mas soacute mais tarde foi possiacutevel obter
frequecircncias geacutenicas para este locus (alelos GCA e GCB) em diferentes raccedilas europeias
(GAHNE et ai 1977) A utilizaccedilatildeo de novas teacutecnicas de separaccedilatildeo permitiu distinguir um
terceiro alelo GCC (VAN DE WEGHE 1982)
23
Material e Meacutetodos
A existecircncia de ligaccedilatildeo factorial entre os loci ALB e GC foi demostrada no Homem
em primeiro lugar e depois nos cavalos nos bovinos e na ovelha (VAN DE WEGHE 1982
ERHARDT amp SlMIANER 1993)
23 - TRATAMENTO DAS AMOSTRAS
bull HB
A separaccedilatildeo da moleacutecula HB por focagem isoeleacutectrica foi feita mediante a utilizaccedilatildeo de
hemolisados diluiacutedos 18 em aacutegua bidestilada
bull CAII
A separaccedilatildeo electroforeacutetica de CAII foi realizada em gel de amido e em focagem
isoeleacutectrica No primeiro caso as amostras foram simplesmente tratadas com tolueno
enquanto no segundo se procedeu ainda agrave sua reduccedilatildeo com uma soluccedilatildeo de ditiotreitol
(DTT) 120 mM (100 uacute de amostra natildeo diluiacuteda e 20 pi de DTT 120 mM) durante 1 h a 37degC
Quando se utilizou focagem isoeleacutectrica aleacutem do tratamento jaacute referido foi necessaacuterio
realizar uma diluiccedilatildeo final de 110 com aacutegua bidestilada
bull PEPB DIA NP MDH PGP GPI e MPI
As separaccedilotildees electroforeacuteticas de PEPB DIA NP MDH PGD GPI e MPI em gel de
amido foram efectuadas com hemolisados natildeo diluiacutedos submetidos ao mesmo tratamento
descrito para CAII quando separada por electroforese convencional
24
Material e Meacutetodos
bull ALB
Na separaccedilatildeo de ALB por focagem isoeleacutectrica utilizaram-se amostras de plasma
diluiacutedas com aacutegua bidestilada na proporccedilatildeo de 170
bull TF
Na separaccedilatildeo de TF efectuada por focagem isoeleacutectrica utilizaram-se amostras de
plasma submetidas a vaacuterios tipos de tratamento para comparaccedilatildeo dos padrotildees de bandas
obtidos
1 Remoccedilatildeo dos resiacuteduos de aacutecido siaacutelico da moleacutecula de TF
diluiccedilatildeo 13 com neuraminidase durante 1 h a 37 degC
2 Remoccedilatildeo do Fe da moleacutecula de TF
diluiccedilatildeo 13 com EDTA-dissoacutedico (20) 2 h antes da aplicaccedilatildeo para remoccedilatildeo dos
aacutetomos de Fe da moleacutecula de TF
3 Saturaccedilatildeo em Fe da moleacutecula de TF
31 - diluiccedilatildeo 13 com soluccedilatildeo de sulfato de amoacutenio feacuterrico 015 (pv) em aacutecido
ciacutetrico 60 mM seguida de incubaccedilatildeo agrave temperatura ambiente 18 h A utilizaccedilatildeo
de uma razatildeo ligante Fe de 201 permite uma raacutepida saturaccedilatildeo da moleacutecula de
TF (FERRAND 1995)
32 - diluiccedilatildeo 13 com soluccedilatildeo de sulfato de amoacutenio ferroso 015 (pv) em aacutecido
ciacutetrico 60 mM seguida de incubaccedilatildeo agrave temperatura ambiente 18 h
33 - diluiccedilatildeo 13 com soluccedilatildeo de citrato de amoacutenio feacuterrico 015 (pv) em aacutecido
ciacutetrico 60 mM seguida de incubaccedilatildeo agrave temperatura ambiente 18 h
34 - diluiccedilatildeo 13 com soluccedilatildeo de citrato feacuterrico 015 (pv) em aacutecido ciacutetrico
60 mM seguida de incubaccedilatildeo agrave temperatura ambiente 18 h
35 - diluiccedilatildeo 13 com soluccedilatildeo de cloreto de ferro 015 (pv) em aacutecido ciacutetrico
60 mM seguida de incubaccedilatildeo agrave temperatura ambiente 18 h
25
Material e Meacutetodos
Antes da inserccedilatildeo as amostras foram parcialmente purificadas atraveacutes da adiccedilatildeo de 5
volumes de uma soluccedilatildeo de rivanol 06 (pv) em tampatildeo Tris HC1 005 M (ajusta-se o pH
para valores de 91 com Tris 1 M) seguida de centrifugaccedilatildeo
bull GCcedil
A fim de proceder agrave remoccedilatildeo dos resiacuteduos de aacutecido siaacutelico existente nas cadeias de
hidratos de carbono ligadas agrave moleacutecula GC as amostras de plasma foram submetidas a uma
incubaccedilatildeo com uma soluccedilatildeo de neuraminidase Clostridium perfringens SIGMA type V 18
Uml) na proporccedilatildeo de 13 durante 18 h a 37degC acrescentando-se posteriormente aacutegua
bidestilada ateacute agrave obtenccedilatildeo de uma diluiccedilatildeo final de 14 Paralelamente procedeu-se a uma
diluiccedilatildeo das amostras com aacutegua bidestilada (19) para comparaccedilatildeo dos padrotildees de bandas
obtidos
24 - MEacuteTODOS DE SEPARACcedilAtildeO
Electroforese convencional
Nas teacutecnicas de electroforese convencional foram utilizados vaacuterios sistemas de tampatildeo
para os geacuteis e para as pontes conforme a proteiacutena em estudo
Focagem isoeleacutectrica
Os sistemas de focagem isoeleacutectrica utilizados na separaccedilatildeo de proteiacutenas foram
realizados em matrizes de poliacrilamida (T = 5 C = 3) com dimensotildees 230xl00x03mm
Os geacuteis foram aplicados sobre uma peliacutecula de suporte GELFIX (SERVA) permitindo o seu
manuseamento adequado
A adiccedilatildeo de soluccedilotildees de TEMED 10 (pv) e persulfato de amoacutenio (PSA) 10 (pv)
permitiu a polimerizaccedilatildeo do gel agrave temperatura ambiente (24 horas) ou a 37 degC durante 1 h
As separaccedilotildees por focagem isoeleacutectrica decorreram sobre placa de arrefecimento a
aproximadamente 10degC (8 - 12degC)
26
Material e Meacutetodos
HB
A separaccedilatildeo da moleacutecula de HB foi realizada por focagem isoeleacutectrica em gradiente de
pH livre segundo a teacutecnica descrita por FERRAND (1995) com algumas modificaccedilotildees
A composiccedilatildeo da soluccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo e os paracircmetros eleacutectricos utilizados estatildeo
indicados nas tabelas 241 e 242 respectivamente
Tabela 241 Soluccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo utilizada para a separaccedilatildeo da moleacutecula nativa de HB por focagem isoeleacutectrica
Componentes da soluccedilatildeo Quantidades
Acrilamida 28 (pv)
Bisacrilamida 2 (pv)
Sacarose
Anfoacutelitos 5-8 (SIGMA)
7-9 (PHARMACIA)
Aacutegua bidestilada TEMED 10 (vv)
PSA 10 (pv)
18 ml
08 ml
2 g
300 p1
300 ul
ateacute 10 ml volume final
10 ul
70 ul
Tabela 242 Paracircmetros eleacutectricos utilizados na focagem isoeleacutectrica de HB
Voltagem (V) Corrente (mA) Potecircncia (W) Tempo (T)
Preacute focagem 1500 25 1
2
3
30 min
15 min
15 min
Focagem 1500 25 15 2h 30 min
As soluccedilotildees para os eleacutectrodos foram aacutecido aspaacutertico 004 M (acircnodo) e NaOH 01 M
(caacutetodo) As amostras foram aplicadas a 15 cm do caacutetodo tendo sido inseridas com o auxiacutelio
de um aplicador de borracha silicone (SERVA)
27
Material e Meacutetodos
bull CAII
A separaccedilatildeo de CAII fez-se em gel de amido (15 pv SIGMA) conforme o descrito
por AMORIM (1983) com algumas modificaccedilotildees e ainda por focagem isoeleacutectrica em
gradiente de pH livre
Utilizam-se os seguintes sistemas tampatildeo para a separaccedilatildeo por electroforese em gel de
amido
Tampatildeo das Pontes Tris 0250 M pH = 76 Aacutecido ciacutetrico 0067 M
Tampatildeo do Gel Diluiccedilatildeo 110 do tampatildeo das pH = 76 pontes
As amostras foram inseridas em meio Sephadex G-200 (PHARMACIA) na proporccedilatildeo
de 11 As electroforeses foram realizadas em placa de arrefecimento (8degC) e com um
gradiente de potencial de 5 Vcm durante 16 h
A teacutecnica utilizada para a separaccedilatildeo de CAII por focagem isoeleacutectrica foi a descrita por
BOWLING et ai (1990) com algumas modificaccedilotildees A composiccedilatildeo da soluccedilatildeo de
polimerizaccedilatildeo e os paracircmetros eleacutectricos utilizados estatildeo indicados nas tabelas 243 e 244
respectivamente
As soluccedilotildees para os eleacutectrodos foram aacutecido aspaacutertico 004 M (acircnodo) e NaOH 01 M
(caacutetodo) As amostras foram inseridas com o auxiacutelio de um aplicador de borracha silicone
(SERVA) colocado a 15 cm do caacutetodo
28
Material e Meacutetodos
Tabela 243 Soluccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo utilizada na separaccedilatildeo de CAII por focagem isoeleacutectrica
Componentes da soluccedilatildeo
Acrilamida 28 (pv)
Bisacrilamida 2 (pv)
Sacarose
Anfoacutelitos 4-65 (PHARMACIA)
Anfoacutelitos 35-10 (PHARMACIA)
Aacutegua bidestilada TEMED 10 (vv)
PSA 10 (pv)
Quantidades 18 ml
08 ml
2 g
500 |ol
100 ul
ateacute 10 ml volume final
10 ul
70 ul
Tabela 244 Paracircmetros eleacutectricos utilizados na separaccedilatildeo de CAII por focagem isoeleacutectrica
Voltagem (V) Corrente (mA) Potecircncia (W) Tempo (T)
Preacute focagem 1500 25 1
3
5
30 min
15 min
15 min
Focagem 2500 25 8
10
12
30 min
30 min
30 min
bull PEPB
A separaccedilatildeo da PEPB foi realizada em gel de amido (15 pv SIGMA) de acordo
com a teacutecnica descrita por POVEY et ai (1972) com algumas modificaccedilotildees
29
Material e Meacutetodos
Utilizou-se o seguinte sistema tampatildeo
Tampatildeo das Pontes Tris 01 M
pH = 74 NaH2P04 01 M
Tampatildeo do Gel Diluiccedilatildeo 110 do tampatildeo das
pH = 74 pontes
As amostras satildeo inseridas em meio Sephadex G-200 (PHARMACIA) na proporccedilatildeo de
11 As electroforeses foram realizadas em placas de arrefecimento (8degC) e com um gradiente
de potencial de 5 Vcm durante 16 h
bull DIA
No caso da separaccedilatildeo de DIA a teacutecnica eacute idecircntica agrave utilizada para CAII electroforese
em gel de amido (15 pv SIGMA) conforme o descrito por AMORIM (1983) com algumas
modificaccedilotildees
bull NP MDH PGD GPJ e MPI
As separaccedilotildees das enzimas NP MDH PGD GPI e MPI fizeram-se em simultacircneo por
electroforese em gel de amido (15 pv SIGMA) conforme o descrito por AMORIM et ai
(1982) com algumas modificaccedilotildees
Utilizou-se o seguinte sistema tampatildeo
1130 M
0400 M
0020 M 0010 M
Tampatildeo das Pontes NaOH
pH = 60 Aacutecido ciacutetrico
Tampatildeo do Gel HisHCl
pH = 60 NaOH
30
Material e Meacutetodos
As amostras foram inseridas em meio Sephadex G-200 (PHARMACIA) na proporccedilatildeo
de 11 As electroforeses foram realizadas em placas de arrefecimento (8degC) e com um
gradiente de potencial de 8 Vcm durante 15 h
ALB
Nas tabelas 245 e 246 indicam-se respectivamente a composiccedilatildeo da soluccedilatildeo de
polimerizaccedilatildeo para a separaccedilatildeo de ALB por focagem isoeleacutectrica segundo a teacutecnica descrita
por ROCHA et ai (1991) com algumas modificaccedilotildees e os paracircmetros eleacutectricos
Tabela 245 Soluccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo utilizada para a separaccedilatildeo de ALB por focagem isoeleacutectrica
Componentes da soluccedilatildeo Quantidades
Acrilamida 28 (pv)
Bisacrilamida 2 (pv)
Ureia
Anfoacutelitos 5-6 (PHARMACIA)
Anfoacutelitos 5-8 (PHARMACIA)
Anfoacutelitos 6-8 (PHARMACIA)
Aacutegua bidestilada TEMED 10 (vv)
PSA 10 (pv)
18 ml
08 ml
48 g
250 ni
250 ni
125 ul
ateacute 10 ml volume final
30 ul
70 ul
Tabela 246 Paracircmetros eleacutectricos utilizados na separaccedilatildeo de ALB por focagem isoeleacutectrica
Voltagem (V) Corrente (mA) Potecircncia (W) Tempo (T)
Preacute focagem 1500 25
Focagem 1500 25
1 30 min
2 15 min
3 15 min
4 3 h
5 30 min
31
Material e Meacutetodos
As soluccedilotildees para os eleacutectrodos foram aacutecido aspaacutertico 004 M (acircnodo) e NaOH 1 M
(caacutetodo) As amostras foram aplicadas a 15 cm do caacutetodo com o auxiacutelio de um aplicador de
borracha silicone (SERVA)
TF
A separaccedilatildeo da moleacutecula de TF foi efectuada por focagem isoeleacutectrica A composiccedilatildeo
da soluccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo e os paracircmetros eleacutectricos utilizados estatildeo indicados nas tabelas
247 e 248 respectivamente
Tabela 247 Soluccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo utilizada para a separaccedilatildeo da TF por focagem isoeleacutectrica
Componentes da soluccedilatildeo Quantidades
Acrilamida 28 (pv)
Bisacrilamida 2 (pv)
Sacarose
Anfoacutelitos 35-5(LKB)
Anfoacutelitos 4-65 (PHARMACIA)
Aacutegua bidestilada
TEMED 10 (vv) PSA 10 (pv)
18 ml
08 ml
2 g
100 ul
500 ul
ateacute 10 ml volume final
30 ul
70 ul
Tabela 248 Paracircmetros eleacutectricos utilizados na separaccedilatildeo de TF por focagem isoeleacutectrica
Voltagem (V) Corrente (mA) Potecircncia (W) Tempo (T)
Preacute focagem 1500 25
Focagem 2500 25
l 20 min
2 10 min
3 10 min
8 30 min
10 30 min
12 30 min
32
Material e Meacutetodos
As soluccedilotildees para os eleacutectrodos foram de aacutecido aspaacutertico 004 M (acircnodo) e de NaOH
1 M (caacutetodo) As amostras foram aplicadas a 15 cm do caacutetodo com o auxiacutelio de um aplicador
de borracha silicone (SERVA)
GC
Nas tabelas 249 e 2410 apresenta-se respectivamente a composiccedilatildeo da soluccedilatildeo de
polimerizaccedilatildeo e os paracircmetros eleacutectricos utilizados na focagem isoeleacutectrica de GC
Tabela 249 Soluccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo utilizada para a separaccedilatildeo da GC por focagem isoeleacutectrica
Componentes da soluccedilatildeo Quantidades
Acrilamida 28 (pv)
Bisacrilamida 2 (pv)
Sacarose
Anfoacutelitos 45-54 (PHARMACIA)
Anfoacutelitos 4-6 (LKB)
Aacutegua bidestilada TEMED 10 (vv)
PSA 10 (pv)
18 ml
08 ml
2 g
437 ul
188 (il
eacute 10 ml volume final
10 ul
70 ul
Tabela 2410 Paracircmetros eleacutectricos utilizados na separaccedilatildeo de GC por focagem isoeleacutectrica
Voltagem (V) Corrente (mA) Potecircncia (W) Tempo (T)
Preacute focagem 1500 25
Focagem 1500 25
1 30 min
2 15 min
3 15 min
4 3 h
5 30 min
33
Material e Meacutetodos
Para os eleacutectrodos foram utilizadas soluccedilotildees de aacutecido aspaacutertico 004 M (acircnodo) e de
NaOH 02 M (caacutetodo) As amostras foram inseridas com o auxiacutelio de um aplicador de
borracha silicone (SERVA) colocado a 15 cm do caacutetodo
25 - MEacuteTODOS DE DETECCcedilAtildeO
Apoacutes a separaccedilatildeo das proteiacutenas os padrotildees electroforeacuteticos foram geralmente obtidos
por detecccedilatildeo especiacutefica aproveitando a actividade cataliacutetica das enzimas Noutros casos a
revelaccedilatildeo foi feita por coloraccedilatildeo geral de proteiacutenas
bull HB
A visualizaccedilatildeo da HB foi obtida mediante coloraccedilatildeo geral de proteiacutenas segundo o
seguinte procedimento
Fixaccedilatildeo
Imersatildeo do gel numa soluccedilatildeo de aacutecido tricloroaceacutetico 125 (pv) durante 10 minutos
Coloraccedilatildeo geral de proteiacutenas
Coloraccedilatildeo com uma soluccedilatildeo de Coomassie R-250 0115 (pv) numa mistura de aacutecido
aceacuteticoetanolaacutegua destilada (42571) apoacutes aquecimento seguida de filtraccedilatildeo durante
5-10 minutos A descoloraccedilatildeo eacute feita com aacutecido aceacutetico etanol e aacutegua destilada
aquecida a cerca de 60degC ateacute se obter o contraste desejado
bull CAII
Apoacutes separaccedilatildeo por electroforese em gel de amido visualizou-se a CAII pela sua
actividade esteraacutesica adicionando-se diacetato de fluoresceiacutena (em quantidades vestigiais que
34
Material e Meacutetodos
foram previamente dissolvidas em 200 uacute de acetona) a uma soluccedilatildeo de incubaccedilatildeo tamponada
(pH = 66) Esta soluccedilatildeo de incubaccedilatildeo eacute composta por aacutecido ciacutetrico 27 mM e Na2HP04
116 mM e foi aplicada sobre o gel de amido com o auxiacutelio de papeacuteis de filtro Whatman ndegl
Em seguida incubou-se durante 30 minutos a 37degC A observaccedilatildeo das bandas de CAII (devido
agrave sua capacidade esteraacutesica) eacute feita sob luz ultravioleta
Apoacutes separaccedilatildeo por focagem isoeleacutectrica utilizou-se uma coloraccedilatildeo geral de proteiacutenas
para visualizaccedilatildeo da CAII segundo o meacutetodo descrito para a HB sem fixaccedilatildeo
bull PEPB
A detecccedilatildeo da PEPB apoacutes a separaccedilatildeo electroforeacutetica foi feita atraveacutes da aplicaccedilatildeo
sobre o gel de amido de papeacuteis de filtro Whatman ndegl embebidos numa soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo
seguindo-se uma incubaccedilatildeo de 30 minutos a 37degC
A soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo conteacutem o substrato da PEPB L-leucilglicil-glicina 0004 M
veneno de cobra da espeacutecie Agkistrodon piscivorus piscivorus 04 (pv) MTT 24 mM e
metosulfato de fenazina (PMS) 03 mM num tampatildeo de pH = 80 (Tris HC1005 M)
bull DIA
Apoacutes a separaccedilatildeo por electroforese em gel de amido a identificaccedilatildeo da DIA foi obtida
pela adiccedilatildeo de uma soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo a uma fatia do gel A incubaccedilatildeo decorreu durante 2
horas a 37degC
A soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo foi realizada em duas fases
Io - colocou-se 26-diclorofenol-indofenol (DCIP) 01 mM com um tampatildeo de
pH = 85 (Tris HC1 005M) adicionando-se agrave mistura aacutegua bidestilada ateacute perfazer
50 ml Em seguida filtrou-se a soluccedilatildeo
2o - agrave soluccedilatildeo filtrada adicionou-se MTT 03 mM e NADH 02 mM e agitou-se antes
de verter sobre a fatia de gel de amido
35
Material e Meacutetodos
bull NP
A detecccedilatildeo da enzima NP apoacutes a separaccedilatildeo por electroforese foi feita atraveacutes da
aplicaccedilatildeo sobre o gel de amido de papeacuteis de filtro Whatman ndegl embebidos com a soluccedilatildeo de
coloraccedilatildeo Em seguida incubou-se durante 15 minutos a 37degC
A soluccedilatildeo de incubaccedilatildeo conteacutem inosina 37 mM MTT 24 mM XOD 0004 Uml uma
gota de azul de Meldola (SIGMA) (10 vv em aacutegua bidestilada) e uma soluccedilatildeo de tampatildeo
de incubaccedilatildeo pH = 75 constituiacuteda por KH2P04 005 M e NaOH 004 M
bull MDH
Na detecccedilatildeo da actividade enzimaacutetica de MDH foi utilizado o meacutetodo de sandwich
apoacutes a sua separaccedilatildeo electroforeacutetica em gel de amido Em seguida incubou-se durante 15
minutos a 37degC O meacutetodo de sandwich consiste na aplicaccedilatildeo de uma fatia de gel de amido
entre duas folhas de papel de filtro Whatman ndegl embebido com a soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo
A soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo utilizada na detecccedilatildeo da MDH conteacutem NAD 1 mM MTT
2 mM e piruvato de soacutedio (quantidades vestigiais) Esta soluccedilatildeo foi feita com um tampatildeo de
incubaccedilatildeo pH = 74 constituiacutedo por aacutecido maacutelico 0222 M Tris 050 M e MgCl2 002 M
bull PGP
A detecccedilatildeo da actividade enzimaacutetica de PGD foi feita pelo meacutetodo de sandwich apoacutes a
sua separaccedilatildeo electroforeacutetica em gel de amido
A soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo conteacutem quantidades vestigiais de aacutecido 6-fosfoglucoacutenico
NADP MTT e uma gota de azul de Meldola (05 pv em aacutegua bidestilada) dissolvidos num
tampatildeo de pH = 74 constituiacutedo por Tris 01 M HisHCl 01 M Imidazol 0015 M e MgCl2
0005 M
36
Material e Meacutetodos
bull GPI
A detecccedilatildeo da actividade enzimaacutetica de GPI foi feita pelo meacutetodo de sandwich apoacutes a
sua separaccedilatildeo electroforeacutetica em gel de amido
A soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo conteacutem frutose-6-fosfato 55 mM NADP 22 mM MTT
4 mM desidrogenase da glucose-6-fosfato (G6PD) 14 Uml e uma gota de azul de Meldola
(05 pv em aacutegua bidestilada) dissolvidos num tampatildeo de pH = 74 constituiacutedo por Tris 01
M HisHCl 01 M Imidazol 0015 M e MgCl2 0005 M
bull MPI
Detectou-se a actividade enzimaacutetica de MPI pelo meacutetodo de sandwich apoacutes a sua
separaccedilatildeo electroforeacutetica em gel de amido
A soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo conteacutem manose-6-fosfato 42 mM NADP 13 mM MTT
24 mM e uma gota de azul de Meldola (05 pv em aacutegua bidestilada) dissolvidos num
tampatildeo de pH = 74 constituiacutedo por Tris 01 M HisHCl 01 M Imidazol 0015 M e MgCl2
0005 M Por fim adicionaram-se as enzimas isomerase da glucose-6-fosfato (GPI) 3 Uml e
desidrogenase da glucose-6-fosfato (G6PD) 5 Uml
bull ALBeTF
A detecccedilatildeo de ALB e de TF foi efectuada atraveacutes do meacutetodo de coloraccedilatildeo geral de
proteiacutenas descrito para a HB utilizando-se Coomasie R-250 sem fixaccedilatildeo
bull GCcedil
A visualizaccedilatildeo de GC efectuou-se por detecccedilatildeo imunoenzimaacutetica apoacutes transferecircncia da
proteiacutena para uma membrana de nitrocelulose (045 pm SCHLEICHER amp SCHULL)
segundo a teacutecnica descrita por FERRAND (1995)
37
Material e Meacutetodos
Apoacutes esse processo de transferecircncia as membranas de nitrocelulose foram lavadas 3
vezes (15 minutos) numa soluccedilatildeo de Tween 20 (MERCK) 0025 (vv) em soro fisioloacutegico
tamponado com fosfato (PBS Na2HP04 50 mM KH2P04 18mM NaCl 147 mM pH = 71) e
bloqueadas numa soluccedilatildeo de leite em poacute magro (5 pv em PBS) durante 18 h com agitaccedilatildeo
permanente e agrave temperatura ambiente
Depois da primeira lavagem aplicou-se o antisoro (anti-GC humana ATAB 81936)
diluiacutedo 1170 em PBS com 1 (pv) de albumina seacuterica bovina (SIGMA) durante 1 h agrave
temperatura ambiente
Repetiu-se novamente a lavagem segundo o processo jaacute referido seguindo-se a
aplicaccedilatildeo do segundo antisoro (anticorpos contra imunoglobulinas caprinas desenvolvidos em
coelho e conjugados com uma peroxidase ATAB 83806) diluiacutedo 1600 em PBS com 1
(pv) de albumina seacuterica bovina (SIGMA) durante 1 h agrave temperatura ambiente
Depois de duas lavagens (5 minutos) com Tween 20PBS procedeu-se agrave detecccedilatildeo da
GC com uma soluccedilatildeo de 9-amino-2-etilcarbazol 004 (pv) e de metanol 20 (vv) em PBS
As bandas correspondentes agrave actividade peroxidaacutesica aparecem rapidamente bloqueando-se a
reacccedilatildeo com aacutegua bidestilada
26 - MEacuteTODOS DE CAacuteLCULO
As frequecircncias geacutenicas foram calculadas por contagem directa de genes a partir da
distribuiccedilatildeo fenotiacutepica obtida
O caacutelculo dos valores de heterozigotia meacutedia (H) da proporccedilatildeo de loci polimoacuterficos
(P) do nuacutemero meacutedio de alelos por locus (ria) estatiacutesticas F e frequecircncias fenotiacutepicas
esperadas segundo o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg foi efectuado com a utilizaccedilatildeo do
programa BIOSYS versatildeo 17 (SWOFFORD amp SELANDER 1989)
O caacutelculo de distacircncias geneacuteticas e obtenccedilatildeo de dendrogramas foi efectuado com o
programa PHYLIP versatildeo 35 (FELSENTEIN 1993)
38
Resultados e Discussatildeo
3 - RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
31 - ANAacuteLISE DOS MEacuteTODOS DE SEPARACcedilAtildeO
De entre os 12 loci estudados neste trabalho detectaram-se 5 monomoacuterficos
(PEPB DIA GPI MDH e PGD) e 7 polimoacuterficos (HB CAII NP MPI ALB TF e GC)
Loci monomoacuterficos
bull PEPB
A utilizaccedilatildeo de teacutecnicas de electroforese em gel de amido permitiu a detecccedilatildeo de
um soacute fenoacutetipo (figura 311) correspondente a indiviacuteduos homozigoacuteticos para o alelo
PEPB2 descrito por DEL LAMA et ai (1992) No entanto na raccedila Minhota detectou-se
um indiviacuteduo heterozigoacutetico
O fenoacutetipo PEPB 2 apresenta um padratildeo com duas bandas uma de grande
intensidade e outra secundaacuteria mais anoacutedica de menor intensidade No indiviacuteduo
heterozigoacutetico 2-1 (natildeo representado) observou-se um padratildeo de trecircs bandas sendo a
terceira mais anoacutedica e menos intensa
A quase inexistecircncia de PEPB1 nas raccedilas estudadas estaacute de acordo com o referido
em DEL LAMA et ai (1992) que sugere a fixaccedilatildeo de PEPB2 na maior parte das
populaccedilotildees de bovinos de origem europeia (com excepccedilatildeo das raccedilas italianas Marchigiana
e Chianina)
39
Resultados e Discussatildeo
+
Figura 311 Fenoacutetipos de PEPB observados por electroforese convencional em gel de amido
bull DIA
Os resultados obtidos para a enzima DIA revelaram ausecircncia de polimorfismo
electroforeacutetico (figura 312) Resultados semelhantes foram tambeacutem obtidos em vaacuterias
raccedilas autoacutectones espanholas (GONZALEZ et ai 1987 IGLESIAS 1989 ARRANZ et ai
1992)
MAKAVEEV (1979 in IGLESIAS 1989) detectou polimorfismo desta enzima em
eritroacutecitos de buacutefalos da Bulgaacuteria e nas raccedilas bovinas Frisia e Simmental descrevendo dois
alelos codominantes DIAA e DIAB
Figura 312 Padratildeo de DIA observado por electroforese convencional em gel de amido
40
Resultados e Discussatildeo
Natildeo se detectou variaccedilatildeo electroforeacutetica para o locus GPI Estes resultados natildeo se
podem comparar com os obtidos noutras raccedilas por natildeo ter sido possiacutevel consultar outros
trabalhos onde se descrevesse variaccedilatildeo do locus GPI em gado bovino
A figura 313 apresenta o padratildeo obtido para esta enzima observando-se trecircs
bandas duas com grande intensidade e uma banda mais anoacutedica de menor intensidade
Figura 313 Padratildeo de GPI obtido em hemolisados por electroforese convencional em gel de amido
bull MDH
A enzima MDH revelou-se monomoacuterfiacuteca Este resultado eacute concordante com outros
estudos (ARRANZ et ai 1992)
Na figura 314 observa-se o padratildeo de bandas detectado por electroforese
convencional em gel de amido
Figura 314 Padratildeo de MDH observado por electroforese convencional em gel de amido
41
Resultados e Discussatildeo
bull PGD
A enzima PGD revelou-se monomoacuterfica para as raccedilas Barrosatilde e Minhota tambeacutem
neste caso natildeo se encontrou qualquer referecircncia bibliograacutefica relativa a um possiacutevel
polimorfismo deste locus em gado bovino
Na figura 315 observa-se o padratildeo obtido para esta enzima Em amostras
armazenadas por um longo periacuteodo de tempo detectaram-se duas bandas sendo a mais
anoacutedica a que revela menor intensidade as amostras mais recentes apresentam um padratildeo
electroforeacutetico com uma soacute banda
Figura 315 Padratildeo de PGD observado por electroforese convencional em gel de amido
Loci polimoacuterficos
bull HB
A electroforese convencional natildeo permite discriminar os electromorfos de HB No
entanto a utilizaccedilatildeo de sistemas de focagem isoeleacutectrica conduz agrave detecccedilatildeo de
polimorfismo nesta proteiacutena observando-se dois fenoacutetipos HB A e HB AB
Na figura 316 observa-se o padratildeo electroforeacutetico desta moleacutecula resultante da
expressatildeo de dois alelos codominantes HBA e HBB Resultados idecircnticos estatildeo
descritos em raccedilas bovinas da Peniacutensulas Ibeacuterica (VICENTE 1978 KiDD et ai 1980
IGLESIAS 1989)
42
Resultados e Discussatildeo
+ -HBB
HBA
AB AB A A
Figura 316 Separaccedilatildeo de hemoglobina nativa por focagem isoeleacutectrica
bull poundAH
A utilizaccedilatildeo de electroforese em gel de amido e focagem isoeleacutectrica permitiu
identificar trecircs fenoacutetipos CAII F CAII FS e CAII S atribuiacutedos agrave expressatildeo de dois alelos
codominantes CAF e CAS (figuras 317 e 318) Poreacutem a separaccedilatildeo por electroforese em
gel de amido implica alguma morosidade (tempos de corrida muito longos) e em amostras
coaguladas o erro de leitura pode ser superior a 20 Estas dificuldades satildeo minimizadas
quando se recorre a focagem isoeleacutectrica
Assim a separaccedilatildeo da enzima CAII por focagem isoeleacutectrica oferece vaacuterias vantagens
nomeadamente
bull rapidez e simplicidade de execuccedilatildeo
bull utilizaccedilatildeo de pequenas quantidades de material bioloacutegico
bull maior nuacutemero de amostras fenotipadas por corrida
bull possibilidade de utilizaccedilatildeo de amostras coaguladas
43
Resultados e Discussatildeo
F F F S FS FS F S FS
Figura 317 Fenoacutetipos de CAII observados sob luz ultravioleta apoacutes separaccedilatildeo por electroforese convencional em gel de amido e coloraccedilatildeo com diacetato de fluoresceina
CAIIF
| CAIIS
Figura 318 Fenoacutetipos de CAII observados por focagem isoeleacutectrica apoacutes coloraccedilatildeo geral de proteiacutenas
bull NP
A expressatildeo fenotiacutepica de NP resulta das combinaccedilotildees possiacuteveis entre um alelo
dominante NPH e um recessivo NPL (ANSAY 1973) Este facto implica que apenas em
presenccedila do feno tipo NP L eacute possiacutevel fazer corresponder um genoacutetipo (jaacute que o fenoacutetipo NP H
pode corresponder aos genoacutetipos HH e HL e o fenoacutetipo NP L corresponde ao genoacutetipo LL)
Na figura 319 apresenta-se o padratildeo obtido para a proteiacutena apoacutes separaccedilatildeo
electroforeacutetica em gel de amido
44
+
w
FS FS ]
Resultados e Discussatildeo
H L L H L L
Figura 319 Fenoacutetipos de NP detectados por electroforese convencional em gel de amido
bull MPI
Na raccedila Minhota detectaram-se quatro fenoacutetipos MPI AB MPI B MPI BC e MPI C
anteriormente descritos por ANSAY (1973) em bovinos na raccedila Barrosatilde apenas se observam
os trecircs uacuteltimos fenoacutetipos De acordo com o mesmo autor os fenoacutetipos encontrados nesta raccedila
resultam da combinaccedilatildeo de dois alelos codominantes MPIB e MPPC enquanto que MPIA
aparece na raccedila Minhota com uma frequecircncia reduzida
Como se pode observar pela anaacutelise da figura 3110 MPIA aparece como o alelo
mais anoacutedico MPIC como o mais catoacutedico e o alelo mais frequente MPIB situa-se numa
posiccedilatildeo intermeacutedia em relaccedilatildeo aos anteriores Contudo a intensidade das bandas eacute muito
fraca tornando-se quase imperceptiacutevel em alguns casos Esta grande dificuldade em obter um
contraste de bandas adequado mesmo apoacutes longos periacuteodos de incubaccedilatildeo a 37degC poderaacute
eventualmente levar a uma incorrecta interpretaccedilatildeo dos fenoacutetipos Assim a utilizaccedilatildeo de
sistemas de focagem isoeleacutectrica na determinaccedilatildeo destes fenoacutetipos seria aconselhaacutevel a fim
de verificar os resultados obtidos por electroforese convencional
45
Resultados e Discussatildeo
Figura 3110 Fenoacutetipos de MPI observados por electroforese convencional em gel de amido
bull ALB
A separaccedilatildeo por focagem isoeleacutectrica permitiu detectar polimorfismo em ALB Cada
indiviacuteduo homozigoacutetico aparece com trecircs bandas duas de maior intensidade e uma mais
aciacutedica com menor intensidade os indiviacuteduos heterozigoacuteticos podem apresentar ateacute seis
bandas
Esta heterogeneidade nos padrotildees de ALB tem sido interpretada como o resultado da
capacidade desta proteiacutena se ligar a vaacuterias substacircncias diferentes (FERRAND 1995) Com a
inclusatildeo de ureia (8M) na matriz de separaccedilatildeo reagente que provoca a desnaturaccedilatildeo da
proteiacutena levando a uma alteraccedilatildeo do seu pi para uma zona mais baacutesica do gradiente
conseguem-se obter padrotildees de bandas mais simples e mais definidos (KAWAGUCHI 1973
FERRAND 1995)
Na figura 3111 apresentam-se os padrotildees observados que foram interpretados como
sendo determinados por trecircs alelos codominantes ALBA ALBB e ALBV
GAHNE et ai (1977) e IGLESIAS (1989) detectaram por electroforese em gel de
poliacrilamida e de amido respectivamente dois variantes em gado bovino ALBA e
ALBB A utilizaccedilatildeo de focagem isoeleacutectrica veio confirmar a existecircncia destes dois alelos e
acrescentar um terceiro designado por ALBV com uma mobilidade mais aciacutedico do que
ALBA
46
Resultados e Discussatildeo
A B A B A B B B A B A G
Figura 3111 Fenoacutetipos de ALB determinados em amostras de plasma por focagem isoeleacutectrica na presenccedila de ureia 8M
ARRANZ et ai (1992) revelaram a existecircncia de um outro variante (ALBD) com
mobilidade electroforeacutetica intermeacutedia entre ALBA e ALBB ainda natildeo descrito em
nenhuma raccedila autoacutectone espanhola Este alelo poderaacute corresponder ao alelo ALBV
encontrado neste trabalho apesar de apresentar um pi mais aacutecidico do que ALBA (ARRANZ
comunicaccedilatildeo pessoal)
Desta forma a teacutecnica de separaccedilatildeo por focagem isoeleacutectrica provou ser eficaz na
separaccedilatildeo dos variantes de ALB tal como jaacute foi demonstrado no gato (BELL et ai 1994) na
ovelha (ERHARDT amp SIMIANER 1993) e no coelho (FERRAND amp ROCHA 1992)
bull TF
A transferrina eacute um dos marcadores mais importantes no estudo e caracterizaccedilatildeo
geneacutetica de raccedilas bovinas devido ao seu elevado polimorfismo No entanto a sua fenotipagem
natildeo eacute simples existindo frequentemente problemas de resoluccedilatildeo e de separaccedilatildeo das bandas
(IGLESIAS 1989)
A fim de averiguar qual a melhor forma de separar os diferentes produtos geacutenicos
descritos no locus TF testaram-se vaacuterios sistemas electroforeacuteticos em geacuteis de agarose numa
vasta gama de sistemas tampatildeo Esta teacutecnica natildeo ofereceu resultados satisfatoacuterios pelo que se
passou agrave separaccedilatildeo da TF por focagem isoeleacutectrica recorrendo a matrizes de poliacrilamida
47
Resultados e Discussatildeo
com diferentes concentraccedilotildees de ureia (6M e 8M) tambeacutem neste caso natildeo se conseguiram
resultados positivos
Este tipo de dificuldades encontradas na fenotipagem da TF por focagem isoeleacutectrica
tinham jaacute sido descritos noutras espeacutecies nomeadamente na cabra (ERHARDT 1986) e no
coelho (FERRAND 1995) No entanto TSUJI et ai (1989) demostraram ser possiacutevel fenotipar
esta proteiacutena em bovinos por focagem isoeleacutectrica sem grandes problemas e sem qualquer
aditivo na matriz de poliacrilamida
Desta forma a utilizaccedilatildeo de uma teacutecnica de focagem isoeleacutectrica com um gradiente de
pH 35-65 reforccedilado em 40-65 permitiu separar os produtos geacutenicos do locus TF Contudo
os padrotildees obtidos nem sempre eram definidos tornando-se dificilmente interpretaacuteveis
Na tentativa de melhorar os padrotildees de resoluccedilatildeo e de verificar se a variaccedilatildeo detectada
natildeo resultava de diferenccedilas no estado feacuterrico da moleacutecula de TF ou ainda da existecircncia de
aacutecidos siaacutelicos ligados agrave moleacutecula procedeu-se agrave sua separaccedilatildeo apoacutes vaacuterios tratamentos das
amostras
A remoccedilatildeo dos aacutecidos siaacutelicos atraveacutes do tratamento das amostras com neuraminidase
natildeo permitiu a obtenccedilatildeo de bandas definidas este tratamento natildeo altera significativamente o
padratildeo das bandas de TF de bovinos como jaacute tinha sido descrito por PENHALLOU et ai
(1991)
A obtenccedilatildeo de TF no estado apofeacuterrico foi conseguida submetendo as amostras a um
tratamento com EDTA-dissoacutedico Neste caso observa-se que apoTF apresenta uma
mobilidade menor e um padratildeo de bandas mais simples mas ainda sem uma definiccedilatildeo
adequada
A forma Fe2TF foi obtida mediante vaacuterios tratamentos com dadores de Fe (ver capiacutetulo
Material e Meacutetodos) Os resultados soacute se mostraram satisfatoacuterios atraveacutes da saturaccedilatildeo da
moleacutecula de TF com uma soluccedilatildeo de sulfato de amoacutenio feacuterrico provavelmente por causar uma
maior estabilidade da moleacutecula ao longo da sua separaccedilatildeo por focagem isoeleacutectrica com
elevadas voltagens pois segundo WELCHS (1990) a forma difeacuterrica da transferrina eacute mais
resistente agrave desnaturaccedilatildeo e ao calor do que a forma apoTF
48
Resultados e Discussatildeo
Estatildeo descritos pelo menos oito alelos no locus TF TFAl TFA2 TFB TFD1
TFD2 TFE TFF e TFG os mais comuns no gado europeu (Bos taurus) satildeo TFA
TFD1 TFD2 e TFE (JAMIESON 1965) No gado asiaacutetico e africano (Bos indicus) ocorrem
aleacutem das formas anteriores os alelos TFB e TFF
Na figura 3112 apresenta-se o proteinograma obtido com a utilizaccedilatildeo de amostras
saturadas com Fe Esta teacutecnica permitiu a separaccedilatildeo de TFD em TFD1 e TFD2 e a
detecccedilatildeo de todos os outros fenoacutetipos descritos em bovinos europeus Assim observaram-se
quatro alelos codominantes TFA TFD1 TFD2 e TFE
A expressatildeo fenotiacutepica dos alelos em homozigotia caracteriza-se pela presenccedila de dois
dupletos de bandas aparecendo a banda mais aciacutedica de cada dupleto com intensidade mais
fraca Os indiviacuteduos herozigoacuteticos podem apresentar ateacute oito bandas
Figura 3112 Fenoacutetipos de TF determinados por focagem isoeleacutectrica apartir de amostras saturadas com uma soluccedilatildeo de sulfato de amoacutenio feacuterrico
IGLESIAS (1989) detectou TFA e TFD nas cinco raccedilas de bovinos da Galiza o
variante TFE na raccedila Cachena espanhola e um outro variante raro TFR com mobilidade
mais lenta na raccedila Rubia Galega
bull QQ
A GC eacute uma proteiacutena plasmaacutetica que demonstra um elevado grau de heterogeneidade
geneacutetica em mamiacuteferos (FERRAND 1995)
A separaccedilatildeo de GC em focagem isoeleacutectrica seguida da utilizaccedilatildeo de immunoblotting
melhorou de forma consideraacutevel a capacidade de investigar a variaccedilatildeo desta proteiacutena em
49
Resultados e Discussatildeo
diferentes espeacutecies (JUNEJA et ai 1987 PENEDO amp JUNEJA 1989 STRATIL et ai 1990
KALAacuteB et ai 1990 STERN et ai 1992 VANKAN amp BELL 1992 FERRAND 1995)
Nas figuras 3113 e 3114 apresentam-se alguns dos fenoacutetipos obtidos na separaccedilatildeo
da GC por focagem isoeleacutectrica Verifica-se que em amostras tratadas com neuraminidase o
padratildeo de bandas se apresenta mais simplificado surgindo no entanto duas bandas (uma
mais baacutesica e uma mais aciacutedica) de natureza desconhecida Os padrotildees observados foram
interpretados como sendo determinados por dois alelos GCF e GCS
mdashGCF
S F S FS S FS F F S FS 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Figura 3113 Fenoacutetipos de GC determinados por focagem isoeleacutectrica amostras 1 8 9 e 10 tratadas com neuraminidase amostras 2 a 7 diluiacutedas em aacutegua bidestilada
S1 $ l S- -
FS S S S F S FS S FS F S
Figura 3114 Fenoacutetipos de GC determinados em amostras de plasma tratados com neuraminidase apoacutes focagem isoeleacutectrica
Nota-se a existecircncia de dois alelos codominantes GCF e GCS sendo o segundo
mais aciacutedico do que o primeiro
50
Resultados e Discussatildeo
32 - ANAacuteLISE FAMILIAR
A realizaccedilatildeo da anaacutelise familiar relativo ao conjunto de loci polimoacuterficos estudados
observa-se no estudo de 27 pares matildeefilho Esta situaccedilatildeo resulta da grande dificuldade
existente na obtenccedilatildeo de informaccedilatildeo sobre os machos
Os resultados apresentam-se nas tabelas 321 a 326 natildeo foi possiacutevel testar o
equiliacutebrio de Hardy-Weinberg devido ao reduzido tamanho da amostra bem como ao facto de
vaacuterios alelos ocorrerem em baixa frequecircncia
Refira-se que natildeo foi detectado qualquer caso de exclusatildeo matildeefilho
Tabela 321 Sistema CAII Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica em 27 pares matildeefilho Os valores esperados segundo o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg estatildeo indicados entre parecircntesis
Total
4 (32) 17
(122) 6
(116) 27
Tabela 322 Sistema NP Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica em 27 pares matildeefilho Os valores esperados segundo o equiliacutebrio de Hardy--Weinberg estatildeo indicados entre parecircntesis
Total
14
(114)
13
(156)
27
^ ^ ^ Filho
Matildee - ^ F
Fenoacutetipos
F f~ (11)
FS 2
(21)
S
Total 3
Fenoacutetipos
FS S
3
(21)
10 5
(61) (40)
1 5
(40) (76)
14 10
- v ^ ^ Filho Fenoacutetipos
Matildee - ^ H L
Fenoacutetipos
H 10 4
(77) (37)
L 5 8
(37) (119)
Total 15 12
51
Resultados e Discussatildeo
Tabela 323 Sistema MPI Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica em 26 pares matildeefilho Os valores esperados segundo o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg estatildeo indicados entre parecircntesis
^ Filho Fenoacutetipos Total
Matildee ^ ~ ^ A AB AC B BC c Fenoacutetipos
A 0 0 0 - - - 0
(00) (00) (00) (00)
AB 0 0 0 0 0 - 0
(00) (00) (00) (00) (00) (00)
AC 0 0 0 - 0 0 0
(00) (00) (00) (00) (00) (00)
B - 0 - 24 1 - 25
(00) (242) (06) (248)
BC - 0 0 1 0 0 1
(00) (00) (06) (06) (00) (12)
C - - 0 - 0 0 0
(00) (00) (00) (00)
Total 0 0 0 25 1 0 26
Tabela 324 Sistema ALB Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica em 27 pares matildeefilho Os valores esperados segundo o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg estatildeo indicados entre parecircntesis
^ ^ Filho Fenoacutetipos Total
M atilde e ^ ^ - s ^ ^ A AB AV B BV V
Fenoacutetipos
A 24 2 0 - - - 26
(251) (04) (02) (257)
AB 0 0 0 0 0 -
0
(04) (04) (00) (00) (00) (08)
AG 1 0 0 - 0 0 1
(02) (00) (02) (00) (00) (04)
B - 0 - 0 0 - 0
(00) (00) (00) (00)
BG - 0 0 0 0 0 0
(00) (00) (00) (00) (00) (00)
G - - 0 - 0 0 0
(00) (00) (00) (00)
Total 25 2 0 0 0 0 27
52
Resultados e Discussatildeo
Tabela 325 Sistema TF Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica em 27 pares matildeefilho Os valores esperados segundo o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg estatildeo indicados entre parecircntesis
Filho Fenoacutetipos Total
Matildee ^ A ADI AD2 AE Dl D1D2 DIE D2 D2E E
Fenoacutetipos
A 6
(51)
1
(14)
4
(21)
1
(03)
12
(89)
ADI 1 2 0 0 0 0 0 - - - 3
(14) (24) (06) (01) (04) (06) (01) (56)
AD2 2 0 5 0 - 0 - 2 0 - 9
(21) (06) (36) (01) (06) (08) (01) (79)
AE 0 0 0 0 - - 0 - 0 0 0
(03) (01) (01) (06) (01) (01) (00) (13) Dl 0
(04) 1
(01)
1
(02)
0
(00)
- 2
(07)
D1D2 - 0 1 - 0 0 0 0 0 - 1
(06) (06) (02) (10) (00) (02) (00) (26) DIE - 0 - 0 0 0 0 - 0 0 0
(01) (01) (00) (00) (02) (00) (00) (04)
D2 0
(08) 0
(02)
0
(03)
0
(01)
- 0
(14) D2E - - 0 0 - 0 0 0 0 0 0
(01) (01) (00) (00) (01) (02) (00) (05) E 0
(00) 0
(00)
0
(00)
0
(00)
0
(00)
Total 9 3 10 1 1 1 0 2 0 0 27
Tabela 326 Sistema GC Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica em 27 pares matildeefilho Os valores esperados segundo o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg estatildeo indicados entre parecircntesis
- - ^ F i l h o Fenoacutetipos Total
Matildee ^ ^ 1 2-1 2
Fenoacutetipos
1 17 2 19
(156) (31) (187)
2-1 5 2 0 7
(31) (38) (06) (75)
2 _ 1 0 1
(06) (01) (07)
Total 22 5 0 27
53
Resultados e Discussatildeo
33 - ANAacuteLISE POPULACIONAL LOCUS A LOCUS
Neste capiacutetulo faz-se a anaacutelise populacional dos loci polimoacuterficos e ainda dos loci
PEPB e DIA para os quais natildeo se detectou variaccedilatildeo na raccedila Barrosatilde A sua inclusatildeo justifica-
-se pelo facto de serem polimoacuterficos noutras raccedilas bovinas ou em espeacutecies aparentadas
bull PEPB
O locus PEPB revelou-se monomoacuterfico nas trecircs populaccedilotildees de bovinos de raccedila
Barrosatilde e Minhota tendo sido detectado um uacutenico produto geacutenico PEPB2 (observado um
indiviacuteduo heterozigoacutetico da raccedila Minhota) No entanto este locus eacute referido como polimoacuterfico
em raccedilas bovinas criadas no Brasil onde se detectaram dois alelos codominantes PEPB1 e
PEPB2 (DEL LAMA et ai 1992)
O alelo PEPB2 estaacute fixado nas raccedilas de origem europeia incluindo as estudadas neste
trabalho excepto nas raccedilas italianas Marchigiana e Chianina nas quais PEPB1 apresenta
frequecircncias geacutenicas entre 011 e 014 (tabela 331)
Tabela 331 Frequecircncias geacutenicas de PEPB em vaacuterias raccedilas bovinas
N
Frequecircncias geacutenicas N PEPB1 PEPB2 Referecircncia
Barrosatilde inscrita 141 - 100 Este trabalho
Barrosatilde natildeo inscrita 153 - 100 t i
Minhota 62 001 plusmn0003 099 plusmn 0003 ec
Blonde dAquitaine 13 - 100 DEL LAMAetal 1992)
Charolesa 118 - 100 laquo
Chianina 83 014 plusmn003 086 plusmn 003 t t
Hereford 79 - 100 et
Frisia 125 - 100 t t
Jersey 139 - 100
Limousine 24 - 100
Marchigiana 85 011 plusmn002 089 plusmn 002 te
Simmental 75 - 100 t t
54
Resultados e Discussatildeo
bull DIA
Pela anaacutelise da tabela 332 verifica-se natildeo existir variaccedilatildeo geneacutetica neste locus nas
raccedilas bovinas apresentadas estando fixado o alelo DIAS os resultados obtidos estatildeo de
acordo com os jaacute publicados por outros autores (GONZALEZ et ai 1987 IGLESIAS 1989) Por
outro lado nas populaccedilotildees de buacutefalos ocorre um segundo alelo DIAF com frequecircncias
entre 019 e 021
Tabela 332 Frequecircncias geacutenicas de DIA em vaacuterias populaccedilotildees de raccedilas bovinas e buacutefalos
Frequecircncias geacutenicas
N DIAF DIAS Referecircncia
Portugal
Barrosatilde inscrita 141
Barrosatilde natildeo inscrita 153
Minhota 62
Espanha
Cachena 71
Caldelana 60
Frieiresa 33
Limiana 39
Rubia Gallega 168
Vianesa 40
Sayaguesa (Zamora) 147
Morucha (Salamanca) 101
Alistana Sanabresa 157
Blanca Cacerena 62
Caacuterdena Andaluza 25
Asturiana de los Vallegraves 127
Asturiana de la Montana 106
Bulgaacuteria
Buacutefalo 122
Murrah (Buacutefalo) 51
raquo IGLESIAS (1989)
- 100 Este trabalho
- 100
- 100 a
- 100 IGLESIAS (1989)
- 100
- 100
- 100
- 100
- 100
- 100 GONZALEZ et al (19
- 100
- 100 st
- 100 st
- 100
- 100
- 100
019 + 00 081 plusmn00 MAKAVEEV(1984
021 plusmn00 079 plusmn 00 laquo
55
Resultados e Discussatildeo
bull HB
Os resultados obtidos no estudo de HB permitiram distinguir dois fenoacutetipos definidos
por dois alelos HBA e HBB (tabela 333)
Tabela 333 Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica de HB em populaccedilotildees das raccedilas Barrosatilde e Minhota Os valores esperados de acordo com o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg estatildeo indicados entre parecircntesis
Fenoacutetipos N HBA HBAB HBB
Barrosatilde inscrita 141 141
Barrosatilde natildeo inscrita 153 153
Minhota 62 56 6 0
(561) (58) (01)
As frequecircncias geacutenicas das raccedilas estudadas bem como outras jaacute publicadas referentes a
vaacuterias raccedilas bovinas europeias e a duas espeacutecies de buacutefalos encontram-se discriminadas na
tabela 334
A elevada frequecircncia do alelo HBA nas raccedilas estudadas (fixado na raccedila Barrosatilde)
situam-nas juntamente com outras raccedilas bovinas do centro e sul da Europa onde este alelo
ocorre com frequecircncias entre 080-098 (VICENTE 1978) Nas restantes raccedilas europeias
HBA ocorre com uma ampla margem de variaccedilatildeo (038 - 100) apresentando-se quase
sempre como o alelo mais frequente
No caso dos buacutefalos observa-se uma inversatildeo nos valores das frequecircncias geacutenicas
sendo o alelo HBB o mais frequente
A presenccedila de HBB nos bovinos europeus apesar de em baixa frequecircncia pode ser
indicativo de uma origem a partir de raccedilas asiaacuteticas ou africanas jaacute que eacute nestes continentes
que este alelo ocorre com frequecircncia mais elevadas as frequecircncias geacutenicas mais elevadas estatildeo
descritas no gado zebu da Aacutefrica (BRAEND 1971 VICENTE 1978)
56
Resultados e Discussatildeo
Tabela 334 Frequecircncias geacutenicas de HB em vaacuterias populaccedilotildees de raccedilas bovinas e buacutefalos
N
Frequecircncias geacutenicas
N HBA HBB Referecircncia
Portugal
Barrosatilde inscrita 141 100 - Este trabalho
Barrosatilde natildeo inscrita 153 100 -
Minhota 62 095 plusmn 002 005 plusmn 002
Mertolenga 147 093 plusmn 002 007 plusmn 002 KTOD et ai (1980)
Alentejana 155 096 plusmn 001 004 plusmn001 IacuteIacute
Mirandesa 107 099+001 001 plusmn001 NOBRE (S data)
Espanha
Cachena 71 091 + 002 009 plusmn 002 IGLESIAS (1989)
Caldelana 60 097 plusmn 002 003 plusmn 002
Frieiresa 33 095 plusmn 003 005 plusmn 003
Limiana 39 090 plusmn 003 010 plusmn003
Rubia Gallega 168 093 plusmn 001 007 plusmn001 ce
Vianesa 40 098 plusmn 002 002 plusmn002
Sayaguesa (Zamora) 147 083 plusmn002 017 plusmn002 GONZALEZ et al ( 1987)
Morucha (Salamanca) 101 084 plusmn 003 016 plusmn003 ce
Alistana Sanabresa 157 099 plusmn 001 001 plusmn001
Blanca Cacerefia 62 071 plusmn 004 029 plusmn 004 laquo
Caacuterdena Andaluza 25 096 plusmn 003 004 plusmn 003 IacuteIacute
Asturiana de los Vallegraves 127 091 plusmn002 009 plusmn002
Pirenaica 383 084 plusmn 001 016 plusmn001 VICENTE (1978)
Tudanca 42 065 plusmn 005 035 plusmn 005 laquo
Morena del N O 25 100 -
Frisona 97 100 - laquo
Asturiana de la Montaria 106 079+003 021 plusmn003
De Lidia 124 079 plusmn 003 021 plusmn003 KlDDeacutetal (1980)
Retinta 164 081 plusmn002 019 plusmn002
Itaacutelia
Chianina 264 096 plusmn 001 004 plusmn 001 CARENZiera (1970)
Marchigiana 112 099 plusmn001 001 plusmn001
Bulgaacuteria
Sofia Brown 173 089 plusmn 002 011 plusmn002 MAKAVEEV (1970)
Buacutefalo 77 009 plusmn 002 091 plusmn002 MAKAVEEV(1984)
Murrah (Buacutefalo) 51 015 plusmn004 085 plusmn 004 ce
G Bretanha
Jersey 467 038 plusmn 002 062 plusmn 002 LARSENefa (1974)
in IGLESIAS (1989)
57
Resultados e Discussatildeo
A frequecircncia obtida para HBB na raccedila Minhota (005) aproxima-a das raccedilas do sul da
Europa onde este alelo ocorre com uma frequecircncia de aproximadamente 01 Por outro lado a
completa ausecircncia de HBB na raccedila Barrosatilde eacute um resultado interessante mas para o qual natildeo
eacute possiacutevel fornecer actualmente uma explicaccedilatildeo satisfatoacuteria
CAII
A distribuiccedilatildeo dos fenoacutetipos observados para o locus CAII apresenta-se na tabela
335
Tabela 335 Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica de CAU em populaccedilotildees das raccedilas Barrosatilde e Minhota Entre parecircntesis indicam-se os valores esperados de acordo com o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg
Fenoacutetipos N CA F CAFS CAS
Barrosatilde inscrita 141 17 58 66
(149) (622) (639)
Barrosatilde natildeo inscrita 153 20 71 62
(200) (710) (620)
Minhota 62 3 13 46
(14) (162) (444)
x2
0651 1 0420
0000 1 0995
Os valores do teste de 2 nas populaccedilotildees de raccedila Barrosatilde demonstram natildeo haver
desvios significativos ao equiliacutebrio de Hardy-Weinberg apesar de se observar um ligeiro
excesso de homozigoacuteticos F na populaccedilatildeo de raccedila Barrosatilde (inscrita) Para a raccedila Minhota natildeo
foi possiacutevel testar o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg
Na tabela 336 apresentam-se as frequecircncias geacutenicas de CAII nas populaccedilotildees
estudadas bem como as publicadas por outros autores
O locus CAII apresenta-se polimoacuterfico na maior parte das populaccedilotildees bovinas
europeias sendo o alelo CAIIS o que ocorre com frequecircncia mais elevada
58
Resultados e Discussatildeo
Tabela 336 Frequecircncias geacutemeas de CAU em vaacuterias populaccedilotildees de raccedilas bovinas e de buacutefalos
N
Frequecircncias geacutenicas N CAS CAF Referecircncia
Portugal
Barrosatilde inscrita 141 068 plusmn 003 032 plusmn 003 Este trabalho
Barrosatilde natildeo inscrita 153 064+003 036 plusmn 003
Minhota 62 085 plusmn 003 015+003 Iacute Iacute
Mertolenga 147 085 plusmn 002 015+002 Kn)Deiacutea(1980)
Alentejana 155 091 plusmn 002 009 plusmn 002
Mirandesa 107 099 + 001 001+001 NOBRE (S data)
Espanha
Cachena 71 077 + 004 023 plusmn 004 IGLESIAS (1989)
Caldelana 60 096 plusmn 002 004 plusmn 002 ce
Frieiresa 33 094 + 003 006 plusmn 003
Limiana 39 083 + 004 017 plusmn 004
Rubia Gallega 168 089 plusmn 002 011+002
Vianesa 40 086 + 004 014 plusmn 004
Sayaguesa 147 072 plusmn 003 028+003 GONZALEZ eacutetal (1987)
Morucha 101 072 plusmn 003 028 plusmn 003 a
Alistana Sanabresa 157 092 plusmn 002 008+002 iacute iacute
Blanca Cacerena 62 067 plusmn 004 033 plusmn 004 IacuteIacute
Caacuterdena Andaluza 25 100
Asturiana de los Vallegraves 127 087 plusmn 002 013+002 laquo
Asturiana de la Montaria 106 077 plusmn003 023 plusmn 003 IacuteIacute
Tudanca 42 076 plusmn 005 024 plusmn 005 VICENTE (1978)
Morena del NO 25 092 plusmn 004 008 plusmn 004
De Lidia 124 061+003 039 plusmn 003 KjDDetal (1980)
Retinta 164 065 + 003 035+003 iacuteiacute
Bulgaacuteria
Buacutefalo 263 007 + 001 093+001 MAKAVEEV(1984)
Murran (Buacutefalo) 51 020 plusmn 004 080 plusmn 004 laquo
Alemanha
Frisia 550 083 plusmn 001 017 + 001 THTNNES eacutetal (1976)
Suiacuteccedila
Simmental 1039 079 + 001 021+001 KAgraveSTLIeacutetal (1980)
Castanha Suiacuteccedila 546 087 plusmn 001 013+001
Friburg 223 084 + 002 016+002
in IGLESIAS (1989)
59
Resultados e Discussatildeo
As frequecircncias aleacutelicas de CAIPS e CAIPF nas raccedilas Cachena espanhola e Barrosatilde
portuguesa satildeo idecircnticas o que poderaacute eventualmente indicar estar-se em presenccedila de uma soacute
raccedila com designaccedilotildees diferentes nos dois paiacuteses Esta hipoacutetese eacute reforccedilada pelo facto de natildeo
haver diferenccedilas significativas entre dados morfomeacutetricos obtidos nas duas raccedilas (LEAL 1995)
Nos buacutefalos observa-se mais uma vez uma inversatildeo nas frequecircncias dos dois alelos do
locus CAII em relaccedilatildeo aos bovinos sendo CAF o mais frequente com valores situados entre
080 e 093
bull NP
Pela anaacutelise das tabelas 337 e 338 verifiacuteca-se a presenccedila dos dois alelos descritos
neste locus nas vaacuterias raccedilas bovinas sendo NPL o mais frequente nas raccedilas europeias (052 e
099) Observa-se uma grande similaridade entre os valores das frequecircncias geacutenicas o que natildeo
permite diferenciar as raccedilas estudadas neste trabalho das restantes
Tabela 337 Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica de NP em populaccedilotildees das raccedilas Barrosatilde e Minhota
N
Fenoacutetipos
N NP H NPL
Barrosatilde inscrita 141 69 72
Barrosatilde natildeo inscrita 153 55 98
Minhota 62 19 43
60
Resultados e Discussatildeo
Tabela 338 Frequecircncias geacutenicas para NP em vaacuterias populaccedilotildees e raccedilas bovinas
N
Frequecircncias geacutenicas
N NPH NPL Referecircncia
Portugal
Barrosatilde inscrita 141 029 plusmn 003 071 plusmn 003 Este trabalho
Barrosatilde natildeo inscrita 153 020 plusmn 002 080 plusmn 002 cc
Minhota 62 017 + 004 083 + 004
Espanha
Cachena 71 020 plusmn 003 080 plusmn 003 IGLESIAS (1989)
Caldelana 60 013+003 087 plusmn 003 t t
Frieiresa 33 011+004 089 plusmn 004
Limiana 39 008 plusmn 003 092 plusmn 003
Rubia Gallega 168 015+002 085 plusmn 002
Vianesa 40 013 + 004 087 plusmn 004 t i
Sayaguesa 147 014 + 002 086 plusmn 002 GONZALEZ et ai ( 1987)
Morucha 101 020 plusmn 003 080 plusmn 003
Alistana Sanabresa 157 001+001 099 + 001
Blanca Cacerena 62 048 plusmn 005 052 plusmn 005 laquo
Caacuterdena Andaluza 25 004 plusmn 003 096 plusmn 003 IacuteIacute
Asturiana de los Vallegraves 127 028 plusmn 003 072 plusmn 003
Asturiana de la Montana 106 026 plusmn 003 074 plusmn 003
Beacutelgica
Charolesa 130 026 plusmn 003 074 + 003 ANSAY amp HANSET (1972)
Frisia 91 006 plusmn 002 094 plusmn 002 t t
in IGLESIAS (1989)
MPI
A distribuiccedilatildeo dos fenoacutetipos observados para o locus MPI apresenta-se na tabela 339
Das trecircs populaccedilotildees estudadas apenas a raccedila Minhota apresenta valores observados
proacuteximos dos valores esperados segundo o formalismo de Hardy-Weinberg Por outro lado
apesar de natildeo ter sido possiacutevel testar o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg nas restantes populaccedilotildees
a aparente diferenccedila entre valores observados e esperados poderaacute dever-se a um excesso de
indiviacuteduos homozigoacuteticos para MPIC Este resultado poderaacute estar relacionado com o
processo de amostragem ou com outras causas como o acasalamento entre indiviacuteduos
61
Resultados e Discussatildeo
aparentados a existecircncia de sub-populaccedilotildees de tamanho pequeno ou ainda a um reduzido
nuacutemero de machos reprodutores
Tabela 339 Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica de MPI em populaccedilotildees das raccedilas Barrosatilde e Minhota Entre parecircntesis indicam-se os valores esperados de acordo com o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg
Fenoacutetipos N MPIA MPIAB MPIAC MPIB MPIBC MPIC
Barrosatilde inscrita 138 - - - 131 6 1
(1301) (78) (01)
Barrosatilde natildeo inscrita 1 5 2 - - - 147 4 1
(1460) (59) (01)
Minhota 61 0 3 0 56 2 0
(00) (29) (01) (561) (19) (00)
A anaacutelise da tabela 3310 permite verificar que MPIB e MPIC ocorrem nas duas
raccedilas de bovinos estudadas sendo MPIB o alelo mais comum nas trecircs populaccedilotildees A
ocorrecircncia de MPI A na raccedila Minhota contraria o descrito por ANSAY (1973) quando afirma
a exclusividade do fenoacutetipo AB na raccedila Charolesa
Tabela 3310 Frequecircncias geacutenicas de MPI nas populaccedilotildees estudadas
N
Frequecircncias geacutenicas
N MPPA MPPB MPIC
Barrosatilde inscrita 138 - 097 + 001 003+001
Barrosatilde natildeo inscrita 152 - 098 + 001 002+001
Minhota 61 002 plusmn 001 096 plusmn002 002 plusmn 001
A informaccedilatildeo disponiacutevel sobre este marcador em anteriores trabalhos de anaacutelise
geneacutetica em bovinos eacute quase inexistente Tal poderaacute dever-se agraves dificuldades de visualizaccedilatildeo
encontradas na sua fenotipagem por electroforese convencional A detecccedilatildeo de MPI estaacute
descrita em tecidos musculares e em leucoacutecitos neste trabalho utilizaram-se eritroacutecitos para o
estudo de variaccedilatildeo geneacutetica desta proteiacutena mas eacute provaacutevel que a sua expressatildeo ocorra apenas
na fracccedilatildeo leucocitaacuteria (natildeo separada) o que explicaria precisamente a sua fraca actividade
62
Resultados e Discussatildeo
ALB
A distribuiccedilatildeo dos fenoacutetipos observados para o locus ALB apresenta-se na tabela
3311
Apesar de natildeo ter sido possiacutevel testar o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg todas as
amostras estudadas mostram desvios muito reduzidos entre valores observados e esperados
Tabela 3311 Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica de ALB em populaccedilotildees das raccedilas Barrosatilde e Minhota Entre parecircntesis indicam-se os valores esperados de acordo com o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg
N
Fenoacutetipos N ALBA ALBAB ALBB ALBBV ALBAV ALB V
Barrosatilde inscrita 142 137 3 - - 2 -(1370) (30) (00) (00) (20) (00)
Barrosatilde natildeo inscrita 153 145 5 1 - 2 -(1440) (68) (01) (01) (20) (00)
Minhota 62 59
(590)
3 (30) (00)
Na tabela 3312 estatildeo discriminadas as frequecircncias geacutenicas estimadas para as
populaccedilotildees estudadas bem como as de outras populaccedilotildees de bovinos da Europa e de buacutefalos
da Bulgaacuteria
Verifica-se que ALBA eacute o alelo mais comum encontrando-se aparentemente fixado
em vaacuterias raccedilas bovinas de origem europeia
Como jaacute referido para HB a presenccedila de ALBB nas raccedilas europeias parece
relacionar-se com a sua localizaccedilatildeo geograacutefica verificando-se que de uma maneira geral a sua
frequecircncia aumenta agrave medida que nos aproximamos do sul da Europa e de Aacutefrica eacute no gado
zebu africano que este alelo ocorre com frequecircncias mais elevadas variando entre 030 e 060
(VICENTE 1978) Assim a presenccedila de ALBB no gado europeu poderaacute indicar a passagem
pela Europa de bovinos oriundos de Aacutefrica (CECCHINI amp Nus 1986) Eacute de notar que apenas a
raccedila Minhota e algumas das restantes raccedilas da Peniacutensula Ibeacuterica natildeo apresentam ALBB
63
Resultados e Discussatildeo
Tabela 3312 Frequecircncias geacutenicas de ALB em vaacuterias populaccedilotildees de raccedilas bovinas e em buacutefalos
Frequecircncias geacutenicas
N ALBA (F) ALBB (S) ALBV Referecircncia
Portugal
Barrosatilde inscrita 142 098 + 001 001 plusmn 001 001 plusmn001 Este trabalho
Barrosatilde natildeo inscrita 153 097 + 001 002+001 001 plusmn001
Minhota 62 098 plusmn 001 - 002 plusmn 001
Mertolenga 147 084 plusmn 002 016 + 002 - KlDDetal (1980)
Alentejana 155 094+001 006 plusmn 001 -
Mirandesa 106 094 + 002 006 plusmn 002 - NOBRE (S data)
Espanha -
Cachena 71 098 + 001 002+001 - IGLESIAS (1989)
Caldelana 60 098 plusmn 001 002 + 001 -
Frieiresa 33 100 - - raquo
Limiana 39 097 + 002 003 plusmn 002 -
Rubia Gallega 201 099 plusmn 000 001 plusmn000 -
Vianesa 40 093 + 003 007 + 003 -
Sayaguesa 147 096 plusmn001 004 plusmn 001 - GONZALEZ et al (1987)
Moracha 101 089 plusmn 002 011+002 -
Alistaria Sanabresa 157 090 plusmn 002 010 plusmn002 -
Blanca Cacerena 62 056 plusmn 005 044 plusmn 005 -
Caacuterdena Andaluza 25 100 - -
Asturiana de los Vallegraves 127 099 + 001 001 plusmn001 -
Asturiana de la Montana 106 099 plusmn001 001 plusmn001 -
Pirenaica 265 092 + 001 008 plusmn001 - VICENTE (1978)
Tudanca 42 100 - -
Morena del N O 25 092 + 004 008 plusmn 004 -
Frisona 97 100 - -
De Lidia 124 100 - - KIDDeacutetal (1980)
Retinta 164 097 + 001 003 plusmn001 -
Itaacutelia
Chinina 264 089 + 001 011 plusmn001 - CARENZIeacutetal (1970)
Marchigiana 124 074 + 003 026 plusmn 003 -
Beacutelgica
Pied vermelha Este-Flandern 503 100 - - BOUQUET amp VAN de WEGHE (1972)
Vermelha Oeste-Flandern 155 100 - -
Pied preta 174 100 - -
Pied vermelha-Campine 265 100 - -
w IGLESIAS (1989)
(Continua)
64
Resultados e Discussatildeo
Tabela 3312 Frequecircncias geacutenicas de ALB em vaacuterias populaccedilotildees de raccedilas bovinas e de buacutefalos (continuaccedilatildeo)
Frequecircncias geacutenicas N ALBA (F) ALBB (S) ALBV Referecircncia
Bulgaacuteria
Sofia Brow 170 096+001 004 + 001 - M A K A V E E V ( 1 9 7 0 )
Buacutefalo 225 047 plusmn 002 053 plusmn 002 - M A K A V E E V ( 1 9 8 4 )
Murrah (Buacutefalo) 76 012+003 088 plusmn 003 -
G Bretanha
Charolesa 99 084 plusmn 003 016 + 003 - SPOONER amp OLIVER (1969)
Frisia 1422 100 - -
Hereford 215 099 plusmn 001 001+001 -
Jersey 217 100 - -
laquo IGLESIAS (1989)
Neste trabalho descreve-se tambeacutem o alelo ALBV com uma frequecircncia de 001 e
002 nas raccedilas Barrosatilde e Minhota respectivamente Este alelo natildeo se encontra descrito em
qualquer raccedila europeia podendo a sua detecccedilatildeo estar relacionada com a capacidade resolvente
da teacutecnica de focagem isoeleacutectrica utilizada na separaccedilatildeo de ALB
TF
A transferrina eacute provavelmente o mais informativo dos sistemas polimoacuterficos estudados
em virtude do nuacutemero de alelos que apresenta
A distribuiccedilatildeo dos fenoacutetipos observados para o locus TF apresenta-se na tabela 3313
E possiacutevel verificar a existecircncia de equiliacutebrio de Hardy-Weinberg em todas as populaccedilotildees
estudadas
Da anaacutelise das frequecircncias geacutenicas expressas na tabela 3314 verifica-se que este locus
apresenta quatro produtos geacutenicos na maioria das raccedilas europeias sendo os alelos TFA e
TFD (incluindo os subtipos TFD1 e TFD2) os que apresentam frequecircncias mais elevadas
(027 a 092 para o alelo TFA e 026 a 073 para o alelo TFD)
Observa-se tambeacutem que a frequecircncia de TFD2 nas raccedilas estudadas eacute mais elevada do
que a de TFD1 como ocorre na maioria das raccedilas ibeacutericas
65
Resultados e Discussatildeo
No que se refere a TFE verifica-se que a sua frequecircncia eacute relativamente baixa nas
raccedilas europeias (001 e 022) e estaacute mesmo ausente em quase todas as raccedilas da regiatildeo da
Galiza (com excepccedilatildeo da raccedila Cachena espanhola e Rubia Gallega) e na raccedila Minhota Note-se
a grande semelhanccedila entre os valores de frequecircncias geacutenicas deste alelo na raccedila Cachena
espanhola (005) e nas populaccedilotildees de raccedila Barrosatilde (004 e 003) o que mais uma vez sugere
uma grande proximidade entre as duas Apesar de ocorrer em baixa frequecircncia nos bovinos
europeus a presenccedila de TFE nestas raccedilas pode indicar uma proveniecircncia asiaacutetica ou africana
pois eacute nestes continentes que aquele alelo eacute mais comum (BRAEND 1971)
66
Resultados e Discussatildeo
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Resultados e Discussatildeo
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69
Resultados e Discussatildeo
bull GC
A distribuiccedilatildeo dos fenoacutetipos observados para o locus GC apresenta-se na tabela 3315
A sua anaacutelise permite verificar a existecircncia de diferenccedilas entre os valores observados e
esperados para raccedila Barrosatilde (populaccedilatildeo inscrita no Livro Genealoacutegico) Este desvio ao
equiliacutebrio de Hardy-Weinberg deve-se agrave existecircncia de um excesso de homozigoacuteticos
sugerindo assim a ocorrecircncia de uma possiacutevel subestruturaccedilatildeo na populaccedilatildeo
Nas restantes amostras estudadas natildeo foi possiacutevel aplicar o teste de Contudo a
diferenccedila entre valores observados e esperados de acordo com o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg
eacute praticamente inexistente na populaccedilatildeo Barrosatilde natildeo inscrita e pouco acentuada na raccedila
Minhota
Tabela 3315 Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica de GC em populaccedilotildees das raccedilas Barrosatilde e Minhota Entre parecircntesis indicam-se os valores esperados de acordo com o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg
Fenoacutetipos N GCS GCFS GCF
Barrosatilde inscrita 142 98 35 8
(945) (419) (45)
Barrosatilde natildeo inscrita 153 109 40 4
(1087) (406) (37)
Minhota 62 54 5 3
(514) (101) (04)
x2
3913 1 0048
A distribuiccedilatildeo das frequecircncias geacutenicas apresentada na tabela 3316 mostra que GCS eacute
o alelo mais comum nas raccedilas europeias (com excepccedilatildeo da raccedila Frisia da Sueacutecia) As raccedilas
estudadas neste trabalho tecircm frequecircncias aleacutelicas para este locus que as aproximam das raccedilas
espanholas
70
Resultados e Discussatildeo
Tabela 3316 Frequecircncias geacutenicas de GC em vaacuterias populaccedilotildees de raccedilas bovinas
Frequecircncias geacutenicas
N GCF(ouA) GCS(ouB) GCC Referecircncia
Portugal
Barrosatilde inscrita
Barrosatilde natildeo inscrita
Minhota
Alentejana
Mirandesa
Espanha
De Lidia
Frisona
Beacutelgica
Branca e azul
Flemish vermelha
Campine vermelha e branca
Preta e branca
Flemish branca e vermelha
Sueacutecia
Vermelha e Branca
Frisia
141 018 plusmn0023
153 016 plusmn002
62 009 plusmn 003
028 plusmn 004
97 020 plusmn 003
1306 008 plusmn001
124 015 plusmn002
2323 031 plusmn001
431 016 plusmn001
299 012 plusmn001
299 019 plusmn002
140 006 plusmn 001
1030 039 plusmn001
273 079 plusmn 002
082 plusmn 002
084 plusmn 002
091 plusmn003
072 plusmn 004
080 plusmn 003
092 plusmn 001
085 plusmn 002
069 plusmn 001
084 plusmn 001
088 plusmn 001
081 plusmn002
065 plusmn 003
061 plusmn001
021 plusmn002
029 plusmn 003
Este trabalho
CUNHA (1994)
NOBRE (S data)
PIEDRAFUA et ai (1984)
VAN de WEGHE et ai (1982)
GAHNE(1963)
in PIEDRAFUA et ai (1984)
71
Resultados e Discussatildeo
34 - ANAacuteLISE POPULACIONAL CONJUNTA
341 - Diversidade geneacutetica na raccedila Barrosatilde
As estimativas da variabilidade geneacutetica das populaccedilotildees de bovinos das raccedilas Barrosatilde e
Minhota efectuaram-se considerando apenas 6 loci polimoacuterficos HB CAII MPI ALB TF e
GC
Tabela 341 Estimativa da variabilidade geneacutetica (6 loci) atraveacutes dos valores de heterozigotia observada (Ho) e esperada (He) nas populaccedilotildees estudadas
Barrosatilde inscrita Barrosatilde natildeo inscrita Minhota Locus
Ho He Ho He Ho He
HB 0000 0000 0000 0000 0097 0093
CAH 0411 0441 0464 0464 0210 0262
MPI 0043 0056 0026 0039 0082 0080
ALB 0035 0035 0046 0058 0048 0048
TF 0603 0590 0556 0595 0694 0638
GC 0248 0297 0261 0265 0081 0163
Os resultados expressos na tabela 341 mostram em geral a ausecircncia de diferenccedilas
significativas entre os valores de heterozigotia observada (Ho) e heterozigotia esperada (He)
para os loci estudados Deve contudo notar-se que na raccedila Minhota e quanto ao locus GC o
valor de He eacute aproximadamente o dobro da Ho Nos restantes loci o ligeiro desvio observado
entre Ho e He sugere em geral um deacutefice de heterozigoacuteticos
Nas duas populaccedilotildees de raccedila Barrosatilde os sistemas TF e CAII satildeo os que apresentam
valores de heterozigotia mais elevados Pelo contraacuterio os loci MPI e ALB mostram valores de
heterozigotia baixos possivelmente devido ao excesso de homozigoacuteticos (MPI B e ALB A)
detectados nas trecircs populaccedilotildees
Na tabela 342 apresentam-se os valores do nuacutemero meacutedio de alelos por locus (ria)
percentagem de loci polimoacuterficos (P) heterozigotia meacutedia observada (Ho) e heterozigotia
esperada (He) nas populaccedilotildees de bovinos estudados Estes valores devem ser interpretados
72
Resultados e Discussatildeo
tendo em conta o facto de os 6 loci investigados serem polimoacuterficos em pelo menos uma
populaccedilatildeo
Tabela 342 Variabilidade geneacutetica detectada em trecircs populaccedilotildees de bovinos atraveacutes da anaacutelise de 6 loci polimoacuterficos N - efectivo meacutedio estudado por locus na - nuacutemero meacutedio de alelos por locus P - proporccedilatildeo de loci polimoacuterficos Ho - heterozigotia observada He - heterozigotia meacutedia esperada Entre parecircntesis indicam-se os valores do desvio padratildeo
Raccedila Populaccedilatildeo N na P Ho He
Barrosatilde inscrita 1407 233 833 0223 0237
(06) (042) (0100) (0100)
Barrosatilde natildeo inscrita 1528 233 833 0226 0237
(02) (042) (0098) (0101)
Minhota 618 233 1000 0202 0214
(02) (021) (0101) (0090)
A sua anaacutelise permite verificar em primeiro lugar a ocorrecircncia de uma grande
semelhanccedila entre os valores de H nas duas raccedilas estudadas Barrosatilde e Minhota revelando a
existecircncia de uma variabilidade geneacutetica idecircntica nas trecircs populaccedilotildees de bovinos Observa-se
tambeacutem que os valores de heterozigotia meacutedia observada (Ho) natildeo diferem significativamente
dos valores de heterozigotia esperados (He) nas trecircs populaccedilotildees sendo o valor mais elevado o
encontrado na populaccedilatildeo de raccedila Barrosatilde (237)
Os elevados valores de P (833 na raccedila Barrosatilde e 100 na raccedila Minhota) resultam
do facto de apenas se terem utilizado loci polimoacuterficos nesta anaacutelise e o nuacutemero meacutedio de
alelos por locus (na) eacute igual nas trecircs populaccedilotildees estudadas (233)
A tabela 343 apresenta estimativas de FB Frr e FST para as trecircs populaccedilotildees de
bovinos Os valores de Fis indicam a existecircncia de uma acentuada deficiecircncia de
heterozigoacuteticos nos loci MPI e GC Nos restantes loci verifica-se por um lado a tendecircncia
para um excesso de heterozigoacuteticos nos loci HB e TF (com valores de -0051 e -0021
respectivamente) e por outro lado para uma ligeira deficiecircncia de heterozigoacuteticos nos loci
CAII e ALB (com valores de 0066 e 0072 respectivamente) A meacutedia ponderada de FiS
mostra uma deficiecircncia de heterozigoacuteticos de 48
73
Resultados e Discussatildeo
Tabela 343 Distribuiccedilatildeo relativa da diversidade geneacutetica nas trecircs populaccedilotildees de bovinos Hs-heterozigotia intrapopulacional HT-heterozigotia total Valores das estatiacutesticas F para 6 loci analisados
Locus H s Hx Fis FIT FST
HB 0030 0031 -0051 -0016 0033
CAII 0387 0404 0066 0104 0041
MPI 0058 0059 0130 0133 0004
ALB 0046 0047 0072 0075 0004
TF 0605 0627 -0021 0015 0036
GC 0241 0244 0183 0193 0012
Meacutedia 0228 0235 0048 0078 0031
As estimativas de FST indicam a existecircncia de um baixo grau de diferenciaccedilatildeo
populacional nos bovinos estudados Os valores de FST para os 6 loci analisados podem
considerar-se baixos (entre 0004 e 0041) apresentando uma meacutedia ponderada de 0031
Assim soacute uma pequena parte da diversidade geneacutetica (31) se deve a diferenccedilas entre as
populaccedilotildees sendo muito maior a diversidade dentro de cada populaccedilatildeo do que entre as
populaccedilotildees
Os baixos valores de FST encontrados para os loci MPI e ALB resultam de frequecircncias
elevadas de MPIB e ALBA respectivamente e traduzem uma grande homogeneidade entre
as raccedilas bovinas estudadas natildeo se detectando subestruturaccedilatildeo populacional
342 - Comparaccedilatildeo com outras raccedilas ibeacutericas
Tendo em conta o pequeno nuacutemero de loci comuns a este e a outros estudos
estimaram-se diferentes valores de heterozigotia meacutedia consoante o nuacutemero de loci de que se
dispunha Na tabela 344 e 345 apresentam-se valores de heterozigotia meacutedia para as
diferentes raccedilas obtidos a partir de quatro (FF) e cinco loci (FF+) respectivamente bem como
os valores de na P e os respectivos desvios padratildeo em vaacuterias raccedilas de bovinos ibeacutericos
A diversidade geneacutetica do bovino Barrosatilde avaliada pela taxa meacutedia de heterozigotia
(0281-0272 e 0249-0260 para 5 e 4 loci respectivamente) parece ocupar uma posiccedilatildeo
74
Resultados e Discussatildeo
intermeacutedia no seio das raccedilas ibeacutericas Tambeacutem o grau de variabilidade geneacutetica nos bovinos
avaliado por paracircmetros como o nuacutemero meacutedio de alelos por locus e a proporccedilatildeo de loci
polimoacuterficos (P) demonstra que as raccedilas estudadas neste trabalho ocupam uma posiccedilatildeo
intermeacutedia quando comparadas com outras raccedilas ibeacutericas
A anaacutelise das tabelas 344 e 345 mostra que todas as medidas de diversidade geneacutetica
(H P e de na) apresentam valores idecircnticos Esta semelhanccedila permite supor que o processo de
domesticaccedilatildeo iniciado haacute menos de 10000 anos natildeo levou a uma grande diferenciaccedilatildeo
geneacutetica entre as raccedilas pelo menos relativamente aos marcadores geneacuteticos estudados neste
trabalho Desta forma verifica-se que as principais diferenccedilas entre as raccedilas resultam de
pequenas alteraccedilotildees das suas frequecircncias geacutenicas provavelmente causadas pelo baixo nuacutemero
de animais destinados agrave reproduccedilatildeo (mais marcado nos machos) e pelos cruzamentos dirigidos
em cada raccedila
Por outro lado este baixo niacutevel de diferenciaccedilatildeo geneacutetica deveraacute estar tambeacutem
associado ao facto de na origem das raccedilas bovinas ibeacutericas se encontrar um uacutenico processo de
domesticaccedilatildeo seguido provavelmente de um processo de expansatildeo populacional bastante
recente do Proacuteximo Oriente ateacute agrave Europa Adicionalmente estima-se que a diferenciaccedilatildeo dos
bovinos em raccedilas autoacutectones soacute teraacute ocorrido nos uacuteltimos 300 anos (LOFTUS et ai 1994)
Neste contexto os eventuais estrangulamentos do efectivo populacional (bottleneck)
e efeitos de fundador ocorridos durante o periacuteodo inicial da domesticaccedilatildeo do gado bovino e
capazes de afectar de forma muito diferente vaacuterios nuacutecleos populacionais natildeo satildeo detectados
na Peniacutensula Ibeacuterica
75
Resultados e Discussatildeo
Tabela 344 Variabilidade geneacutetica em vaacuterias raccedilas de bovinos atraveacutes da anaacutelise de 4 loci polimoacuterficos N - efectivo meacutedio estudado por locus ria - nuacutemero meacutedio de alelos por locus P-- proporccedilatildeo de loci polimoacuterficos yent - heterozigotia meacutedia esperada Entre parecircntesis indicam-se os valores do desvio padratildeo
Raccedila Populaccedilatildeo N nbdquo P H +
Portugal
Barrosatilde inscrita 1410(00) 23 (05) 750 0249 (0135)
Barrosatilde natildeo inscrita 1530 (00) 23 (05) 755 0260(0135)
Minhota 620 (00) 20 (00) 1000 0216 (0094)
Mertolenga 1470 (00) 23 (03) 1000 0315 (0097)
Alentejana 1550(00) 23 (03) 1000 0239 (0123)
Mirandesa 1065 (03) 20 (00) 1000 0159(0110)
Espanha
Cachena 710 (00) 23 (03) 1000 0279(0111)
Caldelana 600 (00) 20 (00) 1000 0166 (0107)
Frieiresa 330 (00) 18(03) 750 0177(0112)
Limiana 390 (00) 20 (00) 1000 0246 (0087)
Rubia Gallega 1845(95) 25 (05) 1000 0215(0110)
Vianesa 400 (00) 20 (00) 1000 0221 (0087)
Sayaguesa 1470 (00) 23 (03) 1000 0320 (0094)
Morucha 1010(00) 23 (03) 1000 0361 (0084)
Alistaria Sanabresa 1570 (00) 23 (03) 1000 0213 (0104)
Blanca Cacerefia 618 (03) 20 (00) 1000 0377 (0078)
Caacuterdena Andaluza 250 (00) 15(03) 500 0131 (0106)
Asturiana de los Vallegraves 1265 (05) 23 (03) 1000 0237(0107)
Asturiana de la Montana 1060 (00) 23 (03) 1000 0280 (0088)
Tudanca 420 (00) 20 (04) 750 0321 (0109)
Morena del N O 250 (00) 18 (03) 750 0203 (0108)
Frisona 6540 (00) 18 (05) 500 0203 (0130)
De Lidia 1240 (00) 23 (03) 1000 0367(0135)
Retinta 1640 (00) 23 (03) 1000 0338 (0107)
76
Resultados e Discussatildeo
Tabela 345 Variabilidade geneacutetica em vaacuterias raccedilas de bovinos atraveacutes da anaacutelise de 5 loci polimoacuterficos N - efectivo meacutedio estudado por locus na - nuacutemero meacutedio de alelos por locus P--proporccedilatildeo de loci polimoacuterficos H^ - heterozigotia meacutedia esperada Entre parecircntesis indicam-se os valores do desvio padratildeo
Raccedila Populaccedilatildeo N na P i r Portugal
Barrosatilde inscrita 1410 (00) 22 (04) 800 0281 (0109)
Barrosatilde natildeo inscrita 1530(00) 22 (04) 800 0272 (0105)
Minhota 620 (00) 20 (00) 1000 0229 (0074)
Espanha Cachena 710 (00) 22 (02) 1000 0289 (0087)
Caldelana 600 (00) 20 (00) 1000 0180 (0084)
Frieiresa 330 (00) 18 (02) 800 0180 (0087)
Limiana 390 (00) 20 (00) 1000 0226(0071)
Rubia Gallega 1812(81) 24 (04) 1000 0223 (0086)
Vianesa 400 (00) 20 (00) 1000 0374 (0168)
Sayaguesa 1470 (00) 22 (02) 1000 0305 (0074)
Morucha 1010 (00) 22 (02) 1000 0353 (0066)
Alistaria Sanabresa 1570 (00) 22 (02) 1000 0174 (0089)
Blanca Cacerefla 616 (02) 20(00) 1000 0402 (0065)
Caacuterdena Andaluza 250 (00) 16(02) 600 0120 (0083)
Asturiana de los Vallegraves 1266 (04) 22 (02) 1000 0270 (0089)
Asturiana de la Montaria 1060(00) 22 (02) 1000 0301 (0072)
343 - Diferenciaccedilatildeo geneacutetica
Nas tabelas 346 e 347 apresentam-se as distacircncias geneacuteticas de Nei (NEI 1978)
calculadas para 23 (4 loci HB CAII ALB e TF) e 15 (5 loci HB CAII ALB TF e NP)
raccedilas bovinas ibeacutericas respectivamente Da sua anaacutelise ressalta o facto de aqueles valores
serem na sua maioria bastante baixos
De entre as raccedilas bovinas ibeacutericas estudadas a Frisona e a Cachena demonstram estar
mais proacuteximas da raccedila Barrosatilde com valores de DNei de 0092 (4 loci) e de 0104 (5 loci)
respectivamente Por outro lado as raccedilas Asturiana de la Montana e Vianesa aparecem como
as mais diferenciadas DNei= 0334 (4 loci ) e Dgtjei= 0330 (5 loci) respectivamente
77
Resultados e Discussatildeo
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Resultados e Discussatildeo
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Resultados e Discussatildeo
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80
Resultados e Discussatildeo
No que se refere agrave raccedila Minhota verifica-se que a Frieiresa eacute a que estaacute mais proacutexima
(valores de 0077 e 0074 para 4 e 5 loci respectivamente) e que mais um vez eacute a Asturiana de
la Montana a mais diferenciada das raccedilas (valores de 0389 e 0349 para 4 e 5 loci respectivamente)
A diferenciaccedilatildeo geneacutetica entre as raccedilas bovinas ibeacutericas encontra-se representada nos
dendrogramas construiacutedos pelos meacutetodos de agrupamento NJ (Neighbor-joining SATTOU amp
NEI 1987) e UPGMA (Unweightedpair-group arithmetic average SNEATH amp SOKAL 1973)
(figuras 341 342 343 e 344) Foram realizados testes de reamostragem do tipo
bootstrap (100 reacuteplicas) para a anaacutelise da consistecircncia dos padrotildees de ramificaccedilatildeo
apresentando-se os seus valores entre parecircntesis
A anaacutelise conjunta dos quatro dendrogramas permite verificar uma falta de consistecircncia
nos vaacuterios padrotildees de ramificaccedilatildeo para as raccedilas bovinas ibeacutericas associada a valores de
bootstrap em geral muito reduzidos De facto observa-se que o padratildeo de ramificaccedilatildeo dos
dendrogramas se altera consoante o meacutetodo de agrupamento usado e o nuacutemero de loci considerados Estas alteraccedilotildees nos agrupamentos das diferentes raccedilas devem-se
provavelmente agrave instabilidade causada pelo reduzido nuacutemero de loci polimoacuterficos utilizados
neste estudo bem como ao facto de as frequecircncias geacutenicas serem muito semelhantes em todas
as populaccedilotildees estudadas
Deve contudo referir-se que a raccedila Barrosatilde aparece normalmente associada a vaacuterias
raccedilas do norte da Peniacutensula Ibeacuterica nomeadamente a Cachena (Galiza) a Asturiana de la
Montana (Astuacuterias) a Sayaquesa e a Morucha (Salamanca)
No que se refere agrave raccedila Minhota esta aparece vaacuterias vezes associada agraves raccedilas Rubia
Gallega Frisona Asturiana de los Vallegraves e Frieiresa
81
Resultados e Discussatildeo
(18)
(14)
(11)
(5)
(3)
Sayaquesa
(39)
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Caldelana Alistano Sanabresa
Figura 341 Dendrograma construiacutedo com base nas distacircncias geneacuteticas de NEI (1978) entre 23 raccedilas de bovinos (4 loci HBCAII ALB e TF) atraveacutes do meacutetodo de agrupamento NJ Os valores de probabilidade de ocorrecircncia de cada agrupamento obtidos atraveacutes de um teste de bootstrap indicam-se entre parecircntesis
82
Resultados e Discussatildeo
Morucha
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Rubia Gallega Asturiana de los Vallegraves Freiresa
Frisona Minhota Alentejana Mertolenga
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Caacuterdena Andaluza Vianesa
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De Lidia Tudanca
Asturiana de la Montana Morena NO Blanca Cacerena
Figura 342 Dendrograma construiacutedo com base nas distacircncias geneacuteticas de NEI (1978) entre 23 raccedilas de bovinos (4 loci HB CAII ALB e TF) atraveacutes do meacutetodo de agrupamento UPGMA Os valores de probabilidade de ocorrecircncia de cada agrupamento obtidos atraveacutes de um teste de bootstrap indicam-se entre parecircntesis
83
Resultados e Discussatildeo
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Figura 343 Dendrograma construiacutedo com base nas distacircncias geneacuteticas de NEI (1978) entre 15 raccedilas de bovinos (5 loci HB CAII ALB TF e NP) atraveacutes do meacutetodo de agrupamento NJ Os valores de probabilidade de ocorrecircncia de cada agrupamento obtidos atraveacutes de um teste de bootstrap indicam-se entre parecircntesis
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Alistano Sanabresa
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Frieiresa
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Asturiana de la Montana
Figura 344 Dendrograma construiacutedo com base nas distacircncias geneacuteticas de NEI (1978) entre 15 raccedilas de bovinos (5 loci HB CAII ALB TF e NP) atraveacutes do meacutetodo de agrupamento UPGMA Os valores de probabilidade de ocorrecircncia de cada agrupamento obtidos atraveacutes de um teste de bootstrap indicam-se entre parecircntesis
84
Resultados e Discussatildeo
No seu conjunto estes resultados natildeo satildeo suficientes para o estabelecimento de uma
histoacuteria evolutiva das actuais raccedilas bovinas ibeacutericas nem para a separaccedilatildeo da raccedila Barrosatilde das
restantes Consequentemente natildeo eacute possiacutevel neste momento fazer corresponder a anaacutelise da
diversidade e estrutura geneacutetica das populaccedilotildees ibeacutericas de gado bovino com alguma das
hipoacuteteses evolutivas propostas por diversos autores com base em evidecircncia morfoloacutegica
(VALLEJO 1978 IGLESIAS 1989 CORDEIRO 1986 JORGE 1996)
De acordo com essa evidecircncia a raccedila Barrosatilde (e tambeacutem a Cachena) derivaria do
denominado tronco mauritaacutenico (Bos primigenius opisthonomus) ou seja de populaccedilotildees
originaacuterias do Norte de Aacutefrica que teriam passado para o sul da Peniacutensula Ibeacuterica alcanccedilando
mais tarde o Norte de Portugal e de Espanha Por outro lado a filiaccedilatildeo da raccedila Minhota
segundo JORGE (1996) deriva do tronco aquitacircnico (Bos primigenius primigenius) tal como a
maior parte das raccedilas da Galiza das Astuacuterias e dos Pirineacuteus
Embora os resultados apresentados neste trabalho pareccedilam de facto indicar que as
raccedilas Barrosatilde e Minhota derivam de troncos diferentes eacute necessaacuterio aprofundar de forma
muito consideraacutevel a investigaccedilatildeo sobre a estrutura geneacutetica das raccedilas bovinas ibeacutericas antes de
se poder formular conclusotildees mais sustentadas
85
Con8ideraccedil8es Finais
4 - CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
O trabalho desenvolvido nesta dissertaccedilatildeo permitiu o estudo de alguns sistemas
geneacuteticos polimoacuterficos jaacute descritos em bovinos (HB CAII NP MPI ALB TF e GC) nas
raccedilas Barrosatilde e Minhota Permitiu ainda a aplicaccedilatildeo de teacutecnicas de separaccedilatildeo electroforeacuteticas
mais eficazes em alguns desses sistemas
Vaacuterias limitaccedilotildees durante a execuccedilatildeo praacutetica deste trabalho obrigaram de alguma
forma a alteraccedilotildees no programa inicial Entre elas devem referir-se
1 a recolha de amostras de sangue mostrou-se difiacutecil e demorada sendo necessaacuteria a
coordenaccedilatildeo de esforccedilos de vaacuterias entidades (Direcccedilatildeo Regional de Agricultura de
Entre Douro e Minho e brigadas de Sanidade Animal locais) de veterinaacuterios e de
criadores de bovinos retirando tempo agrave execuccedilatildeo praacutetica do trabalho
2 a afinaccedilatildeo de vaacuterias teacutecnicas electroforeacuteticas para certos marcadores geneacuteticos
envolveu um consideraacutevel esforccedilo de investigaccedilatildeo
3 a impossibilidade de apurar atempadamente as teacutecnicas de separaccedilatildeo ou de
visualizaccedilatildeo para a amilase a ceruloplasmina e a poacutes-transferrina
4 a escassa bibliografia sobre o bovino Barrosatilde e sobre as teacutecnicas utilizadas neste
trabalho em gado bovino
Apesar das limitaccedilotildees considera-se que este trabalho se reveste de alguma importacircncia
pelo facto de constituir um contributo para a caracterizaccedilatildeo geneacutetica de uma raccedila bovina muito
peculiar A este respeito entendeu-se que numa primeira fase se procederia ao estudo de um
conjunto de proteiacutenas polimoacuterficas de forma a poder iniciar uma comparaccedilatildeo com outras raccedilas
bovinas nomeadamente ibeacutericas para as quais jaacute existem resultados publicados Por outro
86
Consideraccedilotildees Finais
lado o estabelecimento de um conjunto de teacutecnicas de fenotipagem dos loci considerados
permite desde logo a sua aplicaccedilatildeo em questotildees de identificaccedilatildeo individual e de anaacutelise da
paternidade
Eacute contudo evidente que o aprofundamento deste trabalho deveraacute necessariamente
evoluir na direcccedilatildeo da anaacutelise molecular da variaccedilatildeo geneacutetica Adicionalmente seraacute do maior
interesse alargar o domiacutenio de investigaccedilatildeo agraves restantes raccedilas bovinas autoacutectones
Em face do exposto entende-se ser possiacutevel definir trecircs linhas de investigaccedilatildeo para os
proacuteximos anos
1 - ampliaccedilatildeo da bateria de sistemas geneacuteticos polimoacuterficos detectados em proteiacutenas do
sangue e do leite
2 - anaacutelise da variabilidade geneacutetica de um conjunto de microssateacutelites se possiacutevel
associados a algumas das proteiacutenas polimoacuterficas jaacute descritas
3 - estudo do polimorfismo da moleacutecula de DNA-mitocondrial
De uma forma geral pode assim considerar-se que os principais objectivos definidos
no iniacutecio deste trabalho foram alcanccedilados pelo que se apresentam em seguida as conclusotildees
87
Conclusotildees
5 - CONCLUSOtildeES
A utilizaccedilatildeo de um sistema de focagem isoeleacutectrica permitiu detectar a existecircncia de
polimorfismo geneacutetico na hemoglobina distinguindo-se dois produtos geacutenicos na raccedila bovina
Minhota HBA e HBB Na raccedila Barrosatilde HBA foi o uacutenico produto geacutenico encontrado
A utilizaccedilatildeo de um sistema de focagem isoeleacutectrica permitiu a detecccedilatildeo de dois
produtos geacutenicos no locus CAII (CAIPF e CAIPS) e revelou-se mais eficaz de que as
teacutecnicas de separaccedilatildeo convencional em gel de amido
A investigaccedilatildeo realizada permitiu detectar a ocorrecircncia de polimorfismo geneacutetico de
MPI atraveacutes de um sistema electroforeacutetico em gel de amido tendo-se detectado trecircs produtos
geacutenicos (MPIA MPIB e MPIC) A fraca actividade de MPI e a grande dificuldade na
obtenccedilatildeo de um contraste de bandas adequado poderaacute dever-se ao facto de a sua expressatildeo soacute
ocorrer na fracccedilatildeo leucocitaacuteria do sangue
A aplicaccedilatildeo de um sistema de focagem isoeleacutectrica na presenccedila de ureia (8M) revelou-
-se muito eficaz na separaccedilatildeo de ALB e permitiu detectar pela primeira vez um novo variante
ALBV ligeiramente mais aciacutedico do que ALBA
A combinaccedilatildeo de uma teacutecnica de focagem isoeleacutectrica com um preacutevio tratamento das
amostras a fim de saturar a moleacutecula de TF com Fe permitiu a detecccedilatildeo de quatro produtos
geacutenicos (TF A TFD1 TFD2 e TFE) nas raccedilas estudadas
88
Conclusotildees
A combinaccedilatildeo de uma teacutecnica de focagem isoeleacutectrica com a detecccedilatildeo por
immunoblotting permitiu detectar dois produtos geacutenicos no locus GC (GCA e GCB) O
tratamento de amostras com neuraminidase permitiu a obtenccedilatildeo de padrotildees mais simples do
que os conseguidos com amostras nativas Esta simplificaccedilatildeo resulta da provaacutevel remoccedilatildeo de
aacutecidos siaacutelicos ligados agrave moleacutecula de GC
Natildeo se detectou nenhum caso de exclusatildeo na anaacutelise de segregaccedilatildeo de 27 pares
matildeefilho feita separadamente para cada locus
Verifiacutecou-se a presenccedila de dois alelos raros HBB e PEPB1 na raccedila Minhota Estes
alelos poderatildeo ser utilizados na distinccedilatildeo das duas raccedilas estudadas
Foi encontrado um valor de heterozigotia meacutedia de 0237 em populaccedilotildees de raccedila
Barrosatilde indicativo de uma variabilidade geneacutetica intermeacutedia em relaccedilatildeo agrave generalidade das
raccedilas ibeacutericas As diferenccedilas observadas entre as vaacuterias raccedilas ibeacutericas poderatildeo reflectir
fenoacutemenos histoacuterico-evolutivos muito recentes dada a sua proximidade e grande semelhanccedila
Foi observado um reduzido niacutevel de diferenciaccedilatildeo entre as raccedilas Barrosatilde e Minhota
(FST= 0031) demonstrando-se que a maior parte da diversidade geneacutetica se atribui a diferenccedilas
intrapopulacionais Este valor de FST pode considerar-se baixo quando comparado com o
obtido no estudo de outras espeacutecies animais sugerindo um elevado fluxo geacutenico
interpopulacional Por outro lado reflecte ainda uma histoacuteria demograacutefica muito recente
A utilizaccedilatildeo de meacutetodos de agrupamento NJ e UPGMA obtidos a partir de matrizes de
distacircncias geneacuteticas de Nei natildeo permitiu separar a raccedila Barrosatilde das restantes raccedilas ibeacutericas
89
Referecircncias Bibliograacuteficas
6 - REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
AMORIM A (1983) Contribuiccedilatildeo para o conhecimento da Geneacutetica Humana Estudo de Geneacutetica Bioquiacutemica
Formal e Populacional e de Ligaccedilatildeo Factorial Tese de Doutoramento Faculdade de Ciecircncias do
Porto
AMORIM A KOMPF J SCHUNTER F amp RITTER H (1982) Aminolevulinate dehydratase (EC42124)
Linkage analysis Hum Genet 61 48-49
ANSAY M (1973) Techniques microelectrophoretiques dans lanalyse de la multipliciteacute enzymatique chez les
bovins Deacutetection Eacutelectrophoreacutetique des Polymorphismes Biochimiques Chez les Mammifegraveres
Application a LEacutetude Geacuteneacutetique des Populations Centre National de la Recherche Scientifique
Paris 43-58
ARANA A pound amp ZARAGOZA P (1986) Nueva electroforetica dei enzima NADH-Diafrosa (DIA-2) detectada
en la espeacutecie Oryctolagus cuniculus (L) Zootecnia XXXV ndeg 7-12 125-130
ARAUacuteJO J (1986) Contribuiccedilatildeo para o estudo dos bovinos de raccedila Barrosatilde Relatoacuterio de estaacutegio da
licenciatura em Engenharia Zooteacutecnica Universidade dos Accedilores
ARNOLD I C J amp Bouw J (1989) A new allele of glucose phosphate isomerase in dogs Animal Genetics
20 217-220
ARRANZ J J BAYON Y amp SAN PRIMITIVO F (1992) Biochemical polymorphisms in Spanish Avilena-
-Negra Ibeacuterica cattle Animal Genetics 23 (suppl 1) 19
ARRANZ J J BAYON Y amp SAN PRIMITIVO F (1996) Comparison of protein markers and microsatellites in
differentiation of cattle populations Animal Genetics 27 415-419
ASHTON G C (1965) Cattle serum transferrins A balanced polymorphism Genetics 52 983-997
90
Referecircncias Bibliograacuteficas
BAINES J amp MEacuteLEK J (1980) Egipto - Deuses Templos e Faraoacutes Grandes Culturas e Civilizaccedilotildees Ciacuterculo
de Leitores
BELL K ARTHUR H amp ANDERSON I L (1994) Esterase and albumin polymorphism in the domestic cat
(Felis catus) XXIV International Conference on Animal Genetics Praga Julho 1994
BEKENEV V A amp ORLOVA G V (1991) Polymorphism of erytrocytic enzymes in Large White pig breeds in
Siberia Animal Genetics 22 (suppl 1) 23-24
BOWLING A T amp CLARK R S (1988) Excess of heacuteteacuterozygotes at albumin locus in American Standardbred
horses Animal Genetics 19 331-341
BOWLING A T GORDON L PENEDO M C T WICTUM E amp BEEBOUT J (1990) A single gel for
determining genetic of equine erythrocyte carbonic anhydrase (CA) and catalase (Cat) Animal
Genetics 21 191-197
BRADLEY D G MACHUGH D E CUNNINGHAM P amp LOFTUS R T (1996) Mitochondrial diversity and
the origins of African and European cattle Proceeding of the National Academy of Sciences of USA
93 5131-5135
BRAEND M (1971) Studies on the relationships between cattle breeds in Africa Asia and Europe Evidence
obtained by studies of blood groups and protein polymorphisms World Review of Animal Production
VIO (1) 10-14
BRAEND M (1988) Haemoglobin polymorphism in Norwegian Red Cattle Animal Genetics 19 59-62
BRAEND M NESSE 1 L amp EFREMOV G D (1988) Expression and genetics of caprine haemoglobins
Animal Genetics 18 223-231
BROWN L B KANE H amp AYRES H (1993) Vital signs WW Norton e Co pp 323 New York
CARTER D C HE X M MUNSON S EL TWIGG P D GERNERT K M BROOM M B amp MILLER T
Y (1989) Three dimensional structure of human serum albumin Science 244 1195-1198
CECCHINI G amp Nus M D (1986) Literature review on cattle blood polymorphisms and preliminary results
of analysis in East African Zebu in Ethiopia Agric Subtrop and Ttropicale 3 (80) 433-463
91
Referocircicias Bibliograacuteficas
CiacuteZovAacute D STRATIL A MULLER E amp CEPICA S (1993) A new partially deficient transferrin variant in
the pig Animal Genetics 24 305-306
CLARKE S W TUCKER E M amp OSTERHOFF D R (1989) Blood groups and biochemical polymorphism
in the Namaqua sheep breed Animal Genetics 20 279-286
CLUTTON-BROCK J (1992) Domestication of animals In Jomes S Martin R Pilbeam D (eds) The
Cambridge Encyclopedia of Human Evolution pp 380-385 Cambridge University Press
CORDEIRO J P (1986) As raccedilas bovinas em Portugal - Sua Origem O meacutedico veterinaacuterio I (1) 29-39
CRISTOFALO G Cozzi M C amp VALIATI P (1992) Identification of a new variant in the equine serum
alB-glycoprotein (A1B) system Animal Genetics 23 (suppl 1) 24
CUNHA L M (1994) Caracterizaccedilatildeo Morfo-Funcional e Geneacutetica da Raccedila Bovina Alentejana Trabalho de
fim de curso apresentado agrave Escola Superior Agraacuteria de Beja
DEL LAMA S N DEL LAMA M A MESTRINER M A amp MORTARI N (1992) Peptidase B polymorphism
in cattle erythrocytes Biochem Genet 30 247-255
DRATCH P TATE M KRAAY G J amp GERWING V (1992) Plasma proteins differentiating European red
deer and North American elk Animal Genetics 23 (suppl 1) 32
EGGEN A amp FRIES R (1995) An integrated cytogenetic and meiotic map of the bovine genome Animal
Genetics 26 215-236
ERHARDT G (1986) Transferrin variants in sheep separation and characterization by polyacrylamide gel
electrophoresis and isoelectric focusing Animal Genetics 17 343-352
ERHARDT G (1991) Genetic polymorphism of vitamin D binding protein and serum albumin in sheep
Animal Genetics 22 (suppl 1) 28-29
ERHARDT G amp SIMIANER H (1993) Linkage between the loci for serum albumin and vitamin D binding
protein (GC) in sheep Animal Genetics 24 301-303
EPSTEIN H amp MASON I L (1984) Cattle In Mason I L (ed) Evolution of domesticated animals pp 7-
-27 Longman
92
Referecircncias Bibliograacuteficas
FAO (1993) A diversidade da Natureza Um patrimoacutenio valioso Documento produzido pela FAO Divisatildeo de
informaccedilatildeo - Out de 1993 Veterinaacuteria Teacutecnica 10 10-12
FAO (1996) World Watch List for Domestic Animal Diversity 2a ediccedilatildeo FAOUNEP pp 334 Roma
FARNDALE B M HUBBARD D E amp ANDERSON L L (1992) A new PGD variant in New Zeland
Thoroughbred horses Animal Genetics 23 (suppl 1) 24
FELSENSTEIN J (1993) PHYLIP (Phylogeny Inference Package) Version 35 Distributed by the autor Seattle
University of Washington
FERNANDES M T S (1996) Raccedilas de bovinos autoacutectones Um importante recurso geneacutetico animal portuguecircs
a preservar e a defender Veterinaacuteria Teacutecnica 12 10-15
FERRAND N (1995) Variaccedilatildeo geneacutetica de proteiacutenas em populaccedilotildees de coelho (Oryctolagus cuniculus) -
- Anaacutelise da diferenciaccedilatildeo subespecifica subestruturaccedilatildeo expansatildeo geograacutefica e domesticaccedilatildeo
Dissertaccedilatildeo de Doutoramento em Biologia apresentada agrave Faculdade de Ciecircncias da Universidade do
Porto
FERRAND N amp ROCHA J (1991) Genetic polymorphism of serum albumin in wild rabbits populations
Animal Genetics 22 (suppl 1) 36
FORBES P MACKEITH B amp PEBERDY R (1986) Mamiacuteferos Ungulados e Lagomorfos Ciacuterculo de Leitores
FRIES R EGGEN A amp WOMACK J E (1993) The bovine genome map Mammalian Genome 4 405-428
GAHNE B(1963) Inherited variation in the post-albumin of cattle serum Hereditas 50126-135
GAHNE B JUNEJA R K amp GROLMUS J (1977) Horizontal polyacrylamine gel electrophoresis for the
simultaneous phenotyping of transferrin post-transferrin albumin and post-albumin in the blood
plasma of cattle Arum Bid Grps Biochem Genet 8127-137
GARCIA L S VICENTE M V BECERRA A L YEBRA F A RODRIcircGUES M F amp LOacutePEZ J M S
(1992) Razas Bovinas Autoacutectonas de Galicia - I Razas Morenas Galegas (Recursos Xeneacuteticos a
Conservar) Xunta de Galicia
GARCIA M ROSAacuteRIO J amp ANTUNES M (1981) Bovinos em Portugal Direcccedilatildeo dos Serviccedilos Veterinaacuterios -
- DGSV pp 44-78 Lisboa
93
Referecircncias Bibliograacuteficas
GLOWATZKI-MULLIS M L GAILLARD C WIGGER G amp FRIES R (1995) Microsatellite-based
parentage control in cattle Animal Genetics 26 7-12
GONCcedilALVES GARCIA M L (1964) A Raccedila Bovina Barrosatilde Boletim Pecuaacuterio n deg 1 Ano XXXII DGSP
pp 103-172 Lisboa
GONZALEZ P TUNON MJ amp VALLEJO M (1987) Genetic relationships between Spanish native breeds of
cattle Animal Genetics 18 249-256
HALL S B L COTHRAN E G amp KING J A (1991) Variability of manosephosphate isomerase (MPI)
from haemolysate in 14 horse breeds Animal Genetics 22 (suppl 1) 22
HARRIS H amp HOPKINSON D A (1976) Handbook of enzyme electrophoresis in human genetics North-
-Holland Publishers
HEMMER H (1990) Domestication The decline of environmental appreciation Cambridge University Press
HERZOG S (1988) Polymorphism and genetic control of erythrocyte 6-phosphogluconate dehydrogenase in
the genus Cervus Animal Genetics 19 291-294
HERZOG S (1989) Genetic polymorphism of transferrin in fallow deer Cervus dama L Animal Genetics 20
421-426
IGLESIAS A B (1989) Estrutura y relaciones geneacuteticas de razas bovinas mediante marcadores geneacuteticos
(Polimorfismos Bioquiacutemicos) Dissertaccedilatildeo de Doutoramento em Biologia apresentada agrave Faculdade de
Biologia da Universidade de Santiago
JAMIESON A (1965) The genetics of transferrins in cattle Heredity 20 419-441
JANZEN M K amp COTHRAN E G (1991) A new PGD variant from North American horses of feral origin
Animal Genetics 22 (suppl 1) 21-22
JORGE E S (1996) Bovinos da raccedila Minhota Contribuiccedilatildeo para a sua histoacuteria Veterinaacuteria Teacutecnica 10 10-
-18
94
Referecircncias Bibliograacuteficas
JUNEJA R K GAHNE B amp STRATIL A (1987) Polymorphic plasma postalbumins of some domestic
animals (pig Po2 horse XK and dog Pa proteins) identified as homologous Animal Genetics 18 119-
-124
JUNEJA R K KURYL J GAHNE B amp ZURKOWSKI M (1989) Linkage between the loci for transferrin
and ceruloplasmin in pigs Animal Genetics 20 307-311
KALAB P STRATIL A amp GLASNAacuteK V (1990) Genetic polymorphism of serum vitamin D-binding protein
(GC) in sheep and mouflon Animal Genetic 21 317-321
KAWAGUCHI T (1973) Polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of serum albumin into three
bands Clinica ChimicaActa 45 85-92
KIDD K K STONE W H CRIMELLA C CARENZI C CASATI M amp ROGNONI G (1980)
Immunogenetic and population genetic analyses of Iberian cattle Anim Blood Grps Biochem Genet
11 21-38
KRISTJANSSON F K (1963) Genetic control of two pre-albumins in pigs Genetics 48 1059-1063
KRISTJANSSON F K amp HICKMAN C G (1965) Subdivision of the allele TF D for transferrins in Holstein
and Ayrshire cattle Genetics 52 627-630
KUROSAWA Y amp TANAKA K (1988) Electrophoretic variants of serum transferrin in wild pig populations of
Japan Animal Genetics 19 31-35
LEAL C (1995) Apreciaccedilatildeo fenotiacutepica de um nuacutecleo de bovinos de raccedila Barrosatilde e amostragem para sua
caracterizaccedilatildeo geneacutetica Relatoacuterio de estaacutegio de licenciatura em Biologia - Ramo Cientiacutefico
Tecnoloacutegico em Ecologia e Recursos Zooloacutegicos Faculdade de Ciecircncias da Universidade do Porto
LITT M amp LUTTY J A (1989) A hipervariable microsatellite revealed by in vitro amplification of a
dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene American Jornal of Human Genetics 44
397-401
LOFTUS R T MACHUGH D E NGERE L O BALAIN D S BADI A M BRADLEY D G amp
CUNNINGHAM E P (1994a) Mitochondrial genetic variation in European African and Indian cattle
populations Animal Genetics 25 265-271
95
Referecircncias Bibliograacuteficas
LOFTUS R T MACHUGH B E BRADLEY B G SHARP P M amp CUNNINGHAM P (1994b) Evidence
for two independent domestications of cattle Proceeding of the National Academy of Sciences of USA
91 2757-2761
MACHUGH D E LOFTUS R T BRADLEY B G SHARP P M amp CUNNINGHAM P (1994)
Microsatellite DNA variation and among European cattle breeds Proceedings of the Royal Society of
London B 256 25-31
MACHUGH B E SHRIVER M B LOFTUS R T CUNNINGHAM P amp BRADLEY B G (1997)
Microsatellite DNA Variation and the Evolution Domestication and Phylogeography of taurine and
zebu cattle (Bos taunts and Bos indicus) Genetics 146 1071-1086
MARTINS R (1982) Conservaccedilatildeo e melhoramento dos bovinos de raccedila Barrosatilde Relatoacuterio de estaacutegio de
licenciatura em Produccedilatildeo Animal Instituto Universitaacuterio de Traacutes-os-Montes e Alto Douro
MIRANDA DO VALE J (1949) Gado Bissulco Livraria Saacute da Costa Lisboa
MORAIS M L (1992) Estudo Desenvolvimento e Optimizaccedilatildeo de Teacutecnicas de Separaccedilatildeo e Detecccedilatildeo
Especiacutefica de Proteiacutenas Dissertaccedilatildeo de Mestrado em Biologia Celular apresentada agrave Faculdade de
Ciecircncias da Universidade de Coimbra
NEI M (1978) Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small number of individuals
Genetics 89 583-590
NICHOLS E A CHAPMAN V M amp RUDDLE F H (1973) Polymorphism and linkage for
Mannosephosphate isomerase in Mus musculus Biochem Genet 8 47-53
NOBRE J M (s data) Caracterizaccedilatildeo geneacutetica da raccedila bovina Mirandesa Trabalho de fim de curso
efectuado na Estaccedilatildeo Nacional de Selecccedilatildeo e Reproduccedilatildeo Animal Curso de Engenharia Zooteacutecnica da
Universidade de Eacutevora
PENEDO M C T FOWLER M E BOWLING A T ANDERSON B L amp GORDON L (1988) Genetic
variation in the Wood of llamas Llama glama and alpaca Llama pacos Animal Genetics 19 267-
-276
PENEDO M C T amp JUNEJA R K (1989) Polymorphic plasma postalbumin (PO) of llamas and alpacas
identified as GC Protein Animal Genetics 20 221-223
96
Referecircncias Bibliograacuteficas
PENHALLOW R C MASON A B amp WOODWORTH R C (1991) Electrophoretic characterization of
human equine and bovine transferrins Comp Biochem Physiol 98B 41-45
PEREIRA A A (1997) Caracterizaccedilatildeo Geneacutetica de Algumas Subpopulaccedilotildees de Truta de Rio Salmo trutta L
da Bacia Hidrograacutefica do Rio Lima Dissertaccedilatildeo de Mestrado em Ecologia Aplicada apresentada agrave
Faculdade de Ciecircncias da Universidade do Porto
PIEDRAFITA J TEJEDOR M T amp ZARAGAZA L (1984) Post-Albuminas y Post-Transferrinas en
poblaciones bovinas Espafiolas Frisona y De Lidia Comunicacioacuten Presentada A La 34deg Reunion
Anual De La Federacioacuten Europea de Zootecnia 114-121
POVEY S CORNEY G LEWIS W H P ROBSON E B PARRINGTON J M amp HARRIS H (1972) The
genetics of peptidase C in man Ann Hum Genet 35 455-465
PRETSCH W amp MERKLE S (1990) Glucose Phosphate Isomerase Enzyme - Activity Mutants in Mus
musculus Genetical and Biochemical Characterization Biochemical Genetics 28 97-110
RASERO R D I STASIO L amp BERRA G P (1993) Polymorphism of erythocyte glucosephosphae isomerase
in sheep Animal Genetics 24 63-64
RITTER EL FRIEDRICHSON U amp SCHMITT J (1974) Genetic variation of Manose phosphate isomerase in
Man Humangenetik 22 261
RITTER H amp SCHMITT J (1973) Genetic polymorphism of Manose phosphate isomerase in Primates
Humangenetik 19 325-326
ROCHA J KOtildeMPF J FERRAND N AMORIM A amp RITTER H (1991) Separation of human alloalbumin
variants by isoelectric focusing Electrophoresis 12 313-314
ROGERSON J (1991) Biacuteblia- Os Caminhos de Deus Grandes Culturas e Civilizaccedilotildees Ciacuterculo de Leitores
RON M BAND M YANAI A amp WELLER J L (1994) Mapping quantitative trait loci with DNA
microsatellites in a commercial dairy cattle population Animal Genetics 25 259-264
RUSSEL G (1996) The analysis of genetic diversity in cattle to preserve future breeding options (Online)
Available http wwwribbsrcacukcdiv_wwwinformhtm (1996 November 29)
97
Referecircncias Bibliograacuteficas
SAITOU N amp NEI M (1987) The neighbor-joining method a new method for reconstructing phylogenetic
trees Mol Biol Evol 4 406-425
SANTOS O C M (1995) Caracterizaccedilatildeo Geneacutetica de Populaccedilotildees de Lebre Ibeacuterica (Lepus granatensis) e
Lebre Europeia (Lepus europaeus) - Aspectos Bioquiacutemicos e Populacionais Dissertaccedilatildeo de Mestrado
em Ecologia Aplicada apresentada agrave Faculdade de Ciecircncias da Universidade do Porto
SARAIVA J A (1993) Histoacuteria de Portugal Publicaccedilotildees Europa-Ameacuterica
SARTORE G STORMONT C MORRIS B G amp GRUNDER A A (1969) Multiple electrophoretic forms of
Carbonic Anhydrase in red cells of domestic cattle (Bos taurus) and American buffalo (Bison bison)
Genetics 61823-831
SCHNEIDER H SCHNEIDER M P C SILVA B T F amp SALZANO F M (1990) Transferrin and albumin
polymorphisms in buffaloes from Brazil Animal Genetics 21 335-337
SEATH P H A amp SOKAL R R (1973) Numeric Taxonomy W H Freeman amp Co
SELVARAJ O S MUKHERJEE T K DHALIWAL S S TAN S G amp BARKER J S F (1991) Biochemical
polymorphisms in the local goats of South-East Asia Animal Genetics 22 (suppl 1) 32
STERN C M MILLER S A amp SCHANFIELD M S (1992) Differentiation of wapiti and Eurasian red deer
by isoelectric focusing electrophoresis of GC on agarose gels Animal Genetics 23 (suppl 1) 23
STORMONT C amp SUZUKI Y (1963) Genetic control of albumin phenotypes in horses Proceeding of the
Society for Experimental Biology and Medicine 144 673-675
STRATIL A GLASNAacuteK V BOBAacuteK P CiacutezovAacute D GAacuteBRISOVAacute E amp KALAB P (1990) Variation of some
serum proteins in red deer Cervus elaphus L Animal Genetics 21 285-293
SWOFFORD D L amp SELANDER R B (1989) BIOSYS-1 A computer program for the analysis of allelic
variation in population genetics and biochemical systematics Release 17 Illinois Natural History
Survey
TASHIAN R E (1989) The carbonic anhydrases widening perspectives on their evolution expression and
function BioEssays 10 186-192
98
Referecircncias Bibliograacuteficas
TASHIAN R E amp CARTER N D (1976) Biochemical Genetics of Carbonic Anhydrase In Harris H (ed)
Advances in Human Genetics 7 1-56 Plenum
TATE M L amp MCEWAN K M (1992) Genetic polymorphism of erytrocyte diaphorase in red deer Cervus
elaphusL Animal Genetics 23 449-452
TSUJI S SAOAMITSU Y amp GOTO N (1989) Ultrathin-leyer isoelectric focusing for bovine serum
transferrin phenotyping Biochem Genet 27 425-429
TUCKER E M amp YOUNG J D (1988) Genetic control of red-cell nucleoside transport and its association
with the B blood-group locus and nucleoside phosphorylase activity in sheep Biochem Genet 26 489-
-501
TUNON M J GONZALEZ P amp VALLEJO M (1989) Genetic relationships between 14 native Spanish
breeds of goat Animal Genetics 20 205-212
USHA A P (1996) Cattle diversity by blood typing (Online) Available http
wwwribbsrcacukcdiv_wwwinfobhtm ( 1996)
USHA A P SIMPSON S P amp WILLIAMS J L (1995) Probability of random sire exclusion using
microsatellite markers for parentage verification Animal Genetics 26 155-161
VANDEBERG J amp AIVALIOTIS M (1990) Mannose-6-phosphate isomerase polymorphism in baboon
erythrocytes Biochemical Genetics 28 495-501
VAN DE WEGHE A VAN ZEVEREN A amp BOUQUET Y (1982) The vitamin D binding protein in domestic
animals Comp Biochem Physiol 73B 977-982
VAN DE WEGHE A YABLANSKI T S VAN ZEVEREN A amp BOUQUET Y (1988) A third variant of glucose
phosphate isomerase in pigs Animal Genetics 19 55-58
VANKAN D M amp BELL K (1992 a) A new allele in Australian goats Animal Genetics 23 453-456
VANKAN D M amp BELL K (1992 b) Genetic polymorphism of vitamin D-binding protein (GC) in Australian
goats Animal Genetics 23 457-462
VICENTE M V (1978) Razas vacunas autoacutectonas en vias de extincioacuten (Aportaciones al estuacutedio geneacutetico)
Fundacioacuten Juan March Serie Universitaacuteria LXK 10-51
99
Referecircncias Bibliograacuteficas
VIEIRA J (1993) Utilizaccedilatildeo de marcadores geneacuteticos na caracterizaccedilatildeo e certificaccedilatildeo de populaccedilotildees
domeacutesticas e selvagens de coelho (Oryctolagus cunicuius) Dissertaccedilatildeo de Mestrado apresentada agrave
Faculdade de Ciecircncias da Universidade do Porto
VIEIRA J amp FERRAND N (1995) Four new alleles at the mannose-6-phosphate isomerase locus in rabbit
Animal Genetics 26 37-38
WANG S FOOTE W C amp BUNCH T D (1990) Transferrin and haemoglobin polymorphism in
domesticated goats in the USA Animal Genetics 21 91-94
WEBER J L amp MAY P E (1989) Abundant class of human DNA polymorphisms which can be typed using
the polymerase chain reaction American Jornal of Human Genetics 44 388-396
WELCHS S (1990) A comparison of the structure and properties of serum transferrin from 17 animal species
Comp Biochem Physiol 97 B (3) 417-427
100
ANEXO
Anexos
RESUMO E CONCLUSOtildeES
Neste trabalho apresenta-se uma contribuiccedilatildeo para o estudo geneacutetico da raccedila bovina Barrosatilde e de uma outra raccedila (Minhota) atraveacutes da anaacutelise da variaccedilatildeo geneacutetica de proteiacutenas detectada pela utilizaccedilatildeo de sistemas electroforeacuteticos convencionais e por focagem isoeleacutectrica
Definiram-se os seguintes objectivos fundamentais
1 estudo da variabilidade geneacutetica da raccedila Barrosatilde ao niacutevel das proteiacutenas eritrocitaacuterias e plasmaacuteticas 2 desenvolvimento e afinaccedilatildeo de teacutecnicas de separaccedilatildeo de proteiacutenas por electroforese e focagem
isoeleacutectrica e sua detecccedilatildeo especiacutefica (histoquiacutemica e imunoloacutegica) 3 anaacutelise familiar dos polimorfismos encontrados 4 avaliaccedilatildeo do grau de diferenciaccedilatildeo geneacutetica existente entre a raccedila Barrosatilde e outras raccedilas bovinas
Escolheu-se um conjunto de 12 sistemas geneacuteticos (sete dos quais se revelaram polimoacuterficos) que pudesse satisfazer os objectivos fundamentais do trabalho
Assim apoacutes desenvolvimento de teacutecnicas de separaccedilatildeo para os sistemas geneacuteticos considerados procedeu-se a uma anaacutelise familiar baseada nos polimorfismos encontrados nas populaccedilotildees de raccedila Barrosatilde ao estudo de distribuiccedilatildeo populacional dos fenoacutetipos das duas raccedilas estudadas e de outras raccedilas bovinas da Europa (principalmente da Peniacutensula Ibeacuterica)
Com base neste trabalho obtiveram-se as seguintes conclusotildees
bull a utilizaccedilatildeo de um sistema de focagem isoeleacutectrica permitiu detectar a existecircncia de polimorfismo geneacutetico na hemoglobina distinguindo-se dois produtos geacutenicos na raccedila bovina Minhota HBA e HBB Na raccedila Barrosatilde HBA foi o uacutenico produto geacutenico encontrado
bull a utilizaccedilatildeo de um sistema de focagem isoeleacutectrica permitiu a detecccedilatildeo de dois produtos geacutenicos no locus CAII (CAIIF e CAIPS) e revelou-se mais eficaz de que as teacutecnicas de separaccedilatildeo convencional em gel de amido
bull a investigaccedilatildeo realizada permitiu detectar a ocorrecircncia de polimorfismo geneacutetico de MPI atraveacutes de um sistema electroforeacutetico em gel de amido tendo-se detectado trecircs produtos geacutenicos (MPIA MPIB e MPIC) A fraca actividade de MPI e a grande dificuldade na obtenccedilatildeo de um contraste de bandas adequado poderaacute dever-se ao facto de a sua expressatildeo soacute ocorrer na fracccedilatildeo leucocitaacuteria do sangue
bull a aplicaccedilatildeo de um sistema de focagem isoeleacutectrica na presenccedila de ureia (8M) revelou-se muito eficaz na separaccedilatildeo de ALB e permitiu detectar pela primeira vez um novo variante ALBV ligeiramente mais aciacutedico do que ALB A
bull a combinaccedilatildeo de uma teacutecnica de focagem isoeleacutectrica com um preacutevio tratamento das amostras a fim de saturar a moleacutecula de TF com Fe permitiu a detecccedilatildeo de quatro produtos geacutenicos (TFA TFD1 TFD2 e TFE) nas raccedilas estudadas
bull a combinaccedilatildeo de uma teacutecnica de focagem isoeleacutectrica com a detecccedilatildeo por immunoblotting permitiu detectar dois produtos geacutenicos no locus GC (GCA e GCB) O tratamento de amostras com neuraminidase permitiu a obtenccedilatildeo de padrotildees mais simples do que os conseguidos com amostras nativas Esta simplificaccedilatildeo resulta da provaacutevel remoccedilatildeo de aacutecidos siaacutelicos ligados agrave moleacutecula de GC
bull natildeo se detectou nenhum caso de exclusatildeo na anaacutelise de segregaccedilatildeo de 27 pares matildeefilho feita separadamente para cada locus
bull verificou-se a presenccedila de dois alelos raros HBB e PEPB1 na raccedila Minhota Estes alelos poderatildeo ser utilizados na distinccedilatildeo das duas raccedilas estudadas
I
Anexos
bull foi encontrado um valor de heterozigotia meacutedia de 0237 em populaccedilotildees de raccedila Barrosatilde indicativo de uma variabilidade geneacutetica intermeacutedia em relaccedilatildeo agrave generalidade das raccedilas ibeacutericas As diferenccedilas observadas entre as vaacuterias raccedilas ibeacutericas poderatildeo reflectir fenoacutemenos histoacuterico-evolutivos muito recentes dada a sua proximidade e grande semelhanccedila
bull foi observado um reduzido niacutevel de diferenciaccedilatildeo entre as raccedilas Barrosatilde e Minhota (FST = 0031) demonstrando-se que a maior parte da diversidade geneacutetica se atribui a diferenccedilas intrapopulacionais Este valor de FST pode considerar-se baixo quando comparado com o obtido no estudo de outras espeacutecies animais sugerindo um elevado fluxo geacutemeo interpopulacional Por outro lado reflecte ainda uma histoacuteria demograacutefica muito recente
bull a utilizaccedilatildeo de meacutetodos de agrupamento NJ e UPGMA obtidos a partir de matrizes de distacircncias geneacuteticas de Nei natildeo permitiu separar a raccedila Barrosatilde das restantes raccedilas ibeacutericas
II
Anexos
Tabela A Frequecircncias geacutenicas para os vaacuterios sistemas polimoacuterficos encontrados na raccedila Barrosatilde (indiviacuteduos inscritos e natildeo inscritos) utilizadas na anaacutelise familiar
LOCUS ALELOS FREQUEcircNCIA GEacuteNICA
CAII 294 035
065
NP 294 H
L
024
076
MPI 290 A
B
C
000
098
002
ALB 294 A
B
V
097
002
001
TF 294 A
Dl
D2
E
057
016
023
004
GC 294 083 017
TTI
INDICE
1 - INTRODUCcedilAtildeO 1 11 - A DOMESTICACcedilAtildeO 3
111- Evidecircncia histoacuterica da domesticaccedilatildeo do gado bovino 3
112- Paleontologia arqueozoologia 4
113- Anaacutelise geneacutetica 7
12 - A DIVERSIDADE DAS RACcedilAS BOVINAS 10
121-Asraccedilas ibeacutericas 10
122 - A raccedila Barrosatilde 11
Aspectos histoacutericos da dispersatildeo e evoluccedilatildeo do efectivo populacional 11
Aspectos morfoloacutegicos 15
Origem 15
2 - MATERIAL E MEacuteTODOS 17
21- AMOSTRAGEM E CONSERVACcedilAtildeO DAS AMOSTRAS 17
211-Amostragem 17
212 - Obtenccedilatildeo e conservaccedilatildeo das amostras de sangue 17
22- BATERIA DE MARCADORES GENEacuteTICOS SELECCIONADOS 18
23 - TRATAMENTO DAS AMOSTRAS 24
24 - MEacuteTODOS DE SEPARACcedilAtildeO 26
25 - MEacuteTODOS DE DETECCcedilAtildeO 34
26 - MEacuteTODOS DE CAacuteLCULO 38
3 - RESULTADOS E DISCUSSAtildeO 39
31- ANAacuteLISE DOS MEacuteTODOS DE SEPARACcedilAtildeO 39
32 - ANAacuteLISE FAMILIAR 51
33 - ANAacuteLISE POPULACIONAL LOCUS A LOCUS 54
34 - ANAacuteLISE POPULACIONAL CONJUNTA 72
341 - Diversidade geneacutetica na raccedila Barrosatilde 72
342 - Comparaccedilatildeo com outra raccedilas Ibeacutericas 74
343 - Diferenciaccedilatildeo geneacutetica 77
4 - CONDIDERACcedilOtildeES FINAIS 86
5 - CONCLUSOtildeES 88
6 - REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS 90
ANEXO
Introduccedilatildeo
1 - INTRODUCcedilAtildeO
O crescente interesse demonstrado pelas raccedilas bovinas autoacutectones permitiu o
aparecimento nos uacuteltimos anos de uma conjuntura poliacutetica e econoacutemica claramente favoraacutevel
agrave sua conservaccedilatildeo Este interesse reflecte-se por exemplo na criaccedilatildeo de incentivos agrave produccedilatildeo
(ajudas comunitaacuterias e medidas agroambientais) ou no apelo ao consumo de produtos de
qualidade certificada Estas circunstacircncias implicam contudo a necessidade de uma maior
capacidade de produccedilatildeo que em sistemas agriacutecolas tecnicamente pouco desenvolvidos poderaacute
estar associada a programas de melhoramento geneacutetico e consequentemente a eventuais
perdas de diversidade geneacutetica (FAO 1994 LoFTUS et ai1994 FERNANDES 1996)
Em Portugal existe um nuacutemero consideraacutevel de raccedilas bovinas autoacutectones que se
encontram ainda pouco estudadas Na verdade a maior parte dos trabalhos sobre elas
realizados envolve anaacutelises fenotiacutepicas estando ainda por investigar a estrutura geneacutetica das
suas populaccedilotildees o seu grau de proximidade a sua origem e evoluccedilatildeo recente
No seio das raccedilas nacionais a raccedila Barrosatilde apresenta um conjunto de caracteriacutesticas
morfoloacutegicas muito peculiares que incluem um perfil cocircncavo da cabeccedila uma saliecircncia das
arcadas orbitarias e cornos em forma de lira alta Este conjunto de particularidades tem
suscitado opiniotildees controversas sobre a sua origem (GONCcedilALVES GARCIA 1964 GARCIA et ai 1981 LEAL 1995) Por outro lado eacute claramente uma raccedila emblemaacutetica da regiatildeo noroeste
de Portugal associada a uma agricultura de subsistecircncia e a um patrimoacutenio cultural que se
torna necessaacuterio conservar (GONCcedilALVES GARCIA 1964 GARCIA et ai 1981 LEAL 1995)
A sua aacuterea de distribuiccedilatildeo abrange apenas 17 concelhos pertencentes a 4 distritos Vila
Real Viana do Castelo Braga e Porto Actualmente a existecircncia de problemas de produccedilatildeo eacute
responsaacutevel pela progressiva diminuiccedilatildeo de alguns nuacutecleos populacionais apesar dos esforccedilos
de certas entidades para o evitar (MARTINS 1982 LEAL 1995)
i
Introduccedilatildeo
Em face do exposto torna-se necessaacuterio alargar a investigaccedilatildeo sobre esta raccedila bovina
nomeadamente atraveacutes da sua caracterizaccedilatildeo geneacutetica Espera-se assim poder contribuir para
o estabelecimento de um plano de conservaccedilatildeo da Barrosatilde e simultaneamente aprofundar o
estado actual do conhecimento sobre a geneacutetica das suas populaccedilotildees
2
Introduccedilatildeo
11 - A DOMESTICACcedilAtildeO
111 - Evidecircncia histoacuterica da domesticaccedilatildeo do gado bovino
Haacute cerca de 15000 anos verificavam-se profundas mudanccedilas climaacuteticas na Terra Os
glaciares recuaram para Norte a temperatura tornou-se mais amena uma maior aacuterea
geograacutefica tornou-se habitaacutevel O Homem teve entatildeo de vencer dificuldades impostas pela
Natureza inventando a agricultura e a criaccedilatildeo de gado passando de caccedilador noacutemada a
agricultor e a pastor (SARAIVA 1993)
O iniacutecio da agricultura e a primeira domesticaccedilatildeo de animais por parte do Homem estaacute
datada de 10000 anos aC (final do Paleoliacutetico) numa regiatildeo conhecida por Crescente Feacutertil
no Proacuteximo Oriente O primeiro animal domesticado teraacute sido o catildeo seguindo-se a ovelha a
cabra e o gado bovino jaacute no Neoliacutetico (8000 anos aC) (HEMMER 1990 CLUTTON-BROCK
1992)
A domesticaccedilatildeo do gado bovino foi provavelmente um processo gradual Eacute natural
que no princiacutepio apenas alguns animais (essencialmente fecircmeas) fossem retirados das manadas
de auroques selvagens e criados isoladamente natildeo levando de imediato ao aparecimento de
diferenccedilas morfoloacutegicas claras Esta hipoacutetese eacute apoiada por registos arqueozooloacutegicos onde a
forma proto-domesticada natildeo se distingue da forma selvagem (LOFTUS et ai 1994)
A expansatildeo neoliacutetica em direcccedilatildeo agrave Europa teraacute levado milhares de anos seguindo uma
via mariacutetima (mar Mediterracircneo) e uma via continental (atraveacutes dos Balcatildes e pelo curso do
Danuacutebio) Da Siciacutelia a revoluccedilatildeo neoliacutetica espalhou-se por toda a bacia mediterracircnea
ocidental atingindo a Peniacutensula Ibeacuterica e a costa atlacircntica e trazendo consigo a arte a
agricultura e a criaccedilatildeo de gado Desta forma soacute no 5 deg mileacutenio aC chegaram agrave Peniacutensula
Ibeacuterica as praacuteticas agriacutecolas e a pastoriacutecia (SARAIVA 1993)
Desde o Neoliacutetico que o gado bovino domesticado (Bos taurus) tem um papel muito
importante para o Homem As grandes civilizaccedilotildees da Antiguidade datildeo-nos testemunhos
escritos e trabalhos artiacutesticos indicando a sua importacircncia na alimentaccedilatildeo (carne leite) nos
trabalhos agriacutecolas na guerra na arquitectura e mesmo na religiatildeo
3
Introduccedilatildeo
Durante o periacuteodo compreendido entre o iniacutecio do Neoliacutetico ateacute agraves idades do Cobre e
do Bronze a domesticaccedilatildeo dos bovinos levou a uma contiacutenua diminuiccedilatildeo do tamanho corporal
dos animais na Europa Posteriormente este processo teraacute sido interrompido com a introduccedilatildeo
de gado bovino trazido de Roma e muitas raccedilas extinguiram-se apoacutes a queda do Impeacuterio
Romano (EPSTEIN amp MASON 1984)
Esta tendecircncia continuou a observar-se durante a Idade Meacutedia e soacute com a Revoluccedilatildeo
Industrial e a necessidade de abastecer as grandes cidades se produziu um incremento na
criaccedilatildeo de gado (EPSTEIN amp MASON 1984)
Neste domiacutenio a modernizaccedilatildeo da agricultura e a produccedilatildeo intensiva de alimentos teraacute
originado uma contiacutenua diminuiccedilatildeo dos efectivos populacionais de muitas raccedilas autoacutectones
evidente sobretudo durante a uacuteltima metade deste seacuteculo Estas circunstacircncias determinaram
assim a sensibilizaccedilatildeo da sociedade para as consequecircncias do empobrecimento de diversidade
geneacutetica do gado bovino permitindo o estabelecimento de linhas de investigaccedilatildeo destinadas agrave
sua gestatildeo e conservaccedilatildeo (BROWN et ai 1993 FAO 1996)
112 - Paleontologia arqueozoologia
De acordo com os actuais dados paleontoloacutegicos o mais antigo ruminante do Velho
Mundo teraacute aparecido no Mioceno (Gelocus) caracterizando-se pela ausecircncia de incisivos na
mandiacutebula superior e possuindo jaacute uma conformaccedilatildeo do esqueleto idecircntica agrave dos bovinos
actuais (IGLESIAS 1989 e GARCIA et ai 1992) Esta forma viria a originar posteriormente os
quatro geacuteneros actuais de ruminantes Ovis Capra Antilope e Bos (IGLESIAS 1989)
A evidecircncia paleontoloacutegica indica tambeacutem que teratildeo existido na Europa diferentes
espeacutecies de boviacutedeos actualmente extintas Destas apenas o auroque sobreviveu ateacute agrave Idade
Meacutedia havendo documentos escritos que se referem ao local e data da morte do uacuteltimo
exemplar (Poloacutenia 1627) (LOFTUS et ai 1994)
As primeiras representaccedilotildees de bovinos feitas pelo Homem devem precisamente
referir-se a auroques sendo um dos exemplos mais conhecidos constituiacutedo pelas pinturas
rupestres das grutas de Lascaux (Franccedila) (figura 111)
4
Introduccedilatildeo
Figura 111 Pintura rupestre nas paredes de grutas em Lascaux Franccedila Datando de haacute cerca de 15000 anos Reproduzido de FORBES (1986)
Soacute mais tarde surge a evidecircncia de que o processo de domesticaccedilatildeo se poderaacute ter
iniciado De facto alguns achados neoliacuteticos (8000 a 5500 anos aC) provenientes da
Anatoacutelia parecem indicar a presenccedila de animais jaacute domesticados Esta regiatildeo do Sudoeste
Asiaacutetico poderaacute assim constituir o centro de domesticaccedilatildeo do gado bovino a partir de
populaccedilotildees selvagens da subespeacutecie asiaacutetica do auroque (Bos primigenius namadicus)
(EPSTEIN amp MASON 1984)
Outra evidecircncia adicional eacute fornecida pela descoberta de ossos e dentes de um animal
sensivelmente mais pequeno do que o auroque (Iraque 5000 anos aC) bem como por um
primeiro testemunho escrito onde se descreve em placas de argila uma cabeccedila de vaca
(Mesopotacircmia 5000 anos aC) (ROGERSON 1991)
Muitos outros achados arqueoloacutegicos e paleontoloacutegicos foram encontrados na
Mesopotacircmia (4000 anos aC) e no vale do rio Nilo (4000 anos aC) mostrando um bovino
totalmente domesticado e de longos cornos (EPSTEIN amp MASON 1984)
A consolidaccedilatildeo do processo de domesticaccedilatildeo eacute a partir desta altura inquestionaacutevel
tornando-se abundantes os registos de bovinos domesticados na Mesopotacircmia e vale do Nilo
A este respeito devem referir-se especialmente as numerosas esculturas relevos pinturas e
textos em papiro que relatam pormenores da vida quotidiana do povo egiacutepcio e onde aparecem
diversas cenas que mostram a importacircncia do gado bovino na agricultura e na alimentaccedilatildeo
(figura 112)
5
Introduccedilatildeo
Figura 112 Desenho ilustrativo de uma ordenha 5a dinastia Reproduzido de BAINES
amp MEacuteLEK (1980)
A partir desta altura as descobertas arqueozooloacutegicas satildeo testemunho de uma
expansatildeo do gado bovino Assim existem registos datados de haacute cerca de 2000 e 3000 anos
aC que sugerem a ocorrecircncia no Norte de Aacutefrica de animais de enormes cornos em forma de
lira (EPSTEIN amp MASON 1984)
Tal expansatildeo daacute-se tambeacutem pela Turquia indo ateacute ao Caacuteucaso e agrave Ruacutessia e chega
tambeacutem agrave Europa onde nas regiotildees do Norte foram encontrados objectos de arte da idade do
Cobre e do Bronze que representam bovinos e datam do iniacutecio do Cristianismo (EPSTEIN amp
MASON 1984)
A migraccedilatildeo para oriente estaacute tambeacutem bem documentada atraveacutes de numerosos restos
arqueozooloacutegicos descobertos em toda a Aacutesia Eacute contudo nesta regiatildeo geograacutefica que se
pode observar a transiccedilatildeo de gado bovino sem bossa (Bos taurus) para outro com bossa (Bos
indicus) Segundo alguns autores as raccedilas de Bos indiens ou gado zebu derivariam das raccedilas
de Bos taurus ou gado taurino atraveacutes de um processo de selecccedilatildeo (EPSTEIN amp MASON
1984) Alternativamente estes dados podem tambeacutem ser interpretados como a ocorrecircncia de
dois processos de domesticaccedilatildeo independentes seguidos do contacto entre as duas populaccedilotildees
domeacutesticas de gado bovino
Adicionalmente deve salientar-se que a evidecircncia descrita eacute ainda muito incompleta
pelo que a interpretaccedilatildeo dos dados deve ser feita com bastante precauccedilatildeo A tiacutetulo de
exemplo refiram-se os achados arqueozooloacutegicos efectuados na Peniacutensula dos Balcatildes e na
6
Introduccedilatildeo
Macedoacutenia Grega (6200 anos aC) Segundo EPSTEIN amp MASON (1984) estes achados
sugerem que o Sul da Europa poderia constituir o primeiro centro de domesticaccedilatildeo do gado
bovino a partir de onde se teria iniciado a sua expansatildeo em direcccedilatildeo ao resto do continente
europeu Ruacutessia e Sudoeste Asiaacutetico
113 - Anaacutelise geneacutetica
A investigaccedilatildeo sobre a geneacutetica das diferentes raccedilas de gado bovino tem contribuiacutedo de
forma muito significativa para a compreensatildeo da sua histoacuteria dos padrotildees de diversidade que
actualmente as caracterizam e do seu grau de parentesco Os resultados actualmente
disponiacuteveis reportam-se a trecircs domiacutenios principais grupos sanguiacuteneos variaccedilatildeo geneacutetica de
proteiacutenas e polimorfismos do DNA (DNA mitocondrial e microssateacutelites)
Grupos sanguiacuteneos
A primeira tentativa para avaliar o grau de diferenciaccedilatildeo geneacutetica entre raccedilas bovinas e
caracterizar a sua diversidade data do iniacutecio de deacutecada de 70 e envolveu precisamente o
estudo dos diferentes grupos sanguiacuteneos que iam sendo descritos (RUSSELL 1996 USHA
1996) Contudo a maior parte dos resultados natildeo permitiu a obtenccedilatildeo de conclusotildees
definitivas pelo facto de se trabalhar com um nuacutemero relativamente reduzido de loci que
adicionalmente era pouco polimoacuterfico Deve poreacutem referir-se que se dispotildee actualmente de
uma consideraacutevel quantidade de informaccedilatildeo no que se refere agrave distribuiccedilatildeo da variabilidade dos
grupos sanguiacuteneos nas diferentes raccedilas bovinas conferindo a este conjunto de dados uma
importacircncia natildeo despreziacutevel no estudo de eventuais alteraccedilotildees da estrutura geneacutetica de
populaccedilotildees de gado bovino nos uacuteltimos vinte anos (RUSSELL 1996 USHA 1996)
Proteiacutenas
A introduccedilatildeo de teacutecnicas electroforeacuteticas de separaccedilatildeo de proteiacutenas permitiu aumentar
de forma muito consideraacutevel o nuacutemero de sistemas geneacuteticos polimoacuterficos conhecidos nas
raccedilas bovinas em especial no que se refere a proteiacutenas do sangue e do leite (USHA 1996)
A anaacutelise da sua distribuiccedilatildeo populacional veio demonstrar a ocorrecircncia de dois grupos
principais de bovinos ou duas subespeacutecies (Bos primigenius taurus e Bos primigenius
7
Introduccedilatildeo
indiens) cada um deles caracterizado pela presenccedila de diversos alelos privativos em vaacuterios loci
(BRAEND 1971)
Estes resultados estatildeo de uma maneira geral de acordo com dados morfoloacutegicos
histoacutericos e ainda com a distribuiccedilatildeo geograacutefica conhecida dos principais grupos (EPSTEIN amp
MASON 1984) No entanto o acreacutescimo de informaccedilatildeo fornecido por este tipo de marcadores
foi ainda insuficiente para resolver muitas das interpretaccedilotildees contraditoacuterias publicadas sobre o
tema
Polimorfismo do DNA
A introduccedilatildeo das teacutecnicas de anaacutelise genoacutemica directa e em especial a descoberta do
polimorfismo do DNA-mitocondrial (mtDNA) e dos microssateacutelites forneceram os
instrumentos necessaacuterios a uma detalhada caracterizaccedilatildeo geneacutetica das raccedilas bovinas
A anaacutelise da variaccedilatildeo da moleacutecula de mtDNA permitiu verificar que Bos primigenius
taurus e Bos primigenius indicus teratildeo divergido haacute cerca de 210000 anos uma data muito
anterior agrave indicada pelos dados arqueoloacutegicos para o iniacutecio do processo de domesticaccedilatildeo Eacute
assim muito provaacutevel que tenham ocorrido duas domesticaccedilotildees independentes a partir de duas
subespeacutecies diferentes do auroque Bos primigenius namadicus teraacute dado origem ao gado
zebu na Aacutesia (Vale do Indu) e Bos primigenius primigenius ao gado europeu vindo do
Proacuteximo Oriente (LOFTUS et ai 1994a 1994b)
Muito recentemente BRADLEY et ai (1996) e MACHUGH et ai (1997) sugerem ainda
uma terceira domesticaccedilatildeo independente ocorrida em Aacutefrica Esta evidecircncia resulta tambeacutem
de anaacutelise do polimorfismo do mtDNA indicando uma separaccedilatildeo entre os ancestrais do gado
europeu e africano anterior agrave domesticaccedilatildeo (22000 - 26000 anos) Este terceiro processo de
domesticaccedilatildeo ter-se-ia assim efectuado a partir da subespeacutecie africana do auroque (Bos
primigenius opisthonomus)
A descoberta dos microssateacutelites e do seu elevado grau de polimorfismo data do fim da
deacutecada de 80 (Lm amp LUTY 1989 WEBER amp MAY 1989) e constitui provavelmente a
metodologia mais adequada para estudar a histoacuteria recente da diversificaccedilatildeo das raccedilas bovinas
(MACHUGH et ai 1994 ARRANZ et ai 1996) Os primeiros resultados que envolvem uma
caracterizaccedilatildeo em larga escala de diferentes populaccedilotildees permitiram distinguir mais claramente
a estrutura geneacutetica dos dois grandes grupos de gado bovino (Bos taurus e Bos indicus) e
constituem a base para futuros estudos mais especiacuteficos
8
Introduccedilatildeo
Por outro lado os microssateacutelites permitiram tambeacutem o iniacutecio do projecto de
cartografia do genoma bovino que no fim de 1994 contabilizava 202 marcadores geneacuteticos
(dos quais 144 eram microssateacutelites) regularmente espaccedilados em 90 do seu comprimento
Cerca de um ano depois existiam jaacute mais de 400 microssateacutelites (USHA et ai 1995) levando
EGGEN et ai (1995) a apresentar um trabalho de revisatildeo e consolidaccedilatildeo de informaccedilatildeo jaacute
existente para evitar a ocorrecircncia de possiacuteveis redundacircncias
A aplicaccedilatildeo deste tipo de marcadores natildeo se restringe apenas agrave anaacutelise da diversidade
geneacutetica populacional e agrave construccedilatildeo de mapas geneacuteticos De facto satildeo actualmente escolhidos
para a realizaccedilatildeo de testes de paternidade (GLOWATZKI-MULLIS et ai 1995 USHA et ai 1995
ARRANZ et ai 1996) detecccedilatildeo de loci que determinam a expressatildeo de caracteriacutesticas
quantitativas (QTL) (RON et ai 1994) determinaccedilatildeo do sexo em embriotildees selecccedilatildeo animal
assistida entre outros
No seu conjunto estes resultados tecircm permitido um avanccedilo notaacutevel na compreensatildeo da
evoluccedilatildeo das actuais raccedilas bovinas A prossecuccedilatildeo desta via de investigaccedilatildeo poderaacute levar ao
esclarecimento definitivo do nuacutemero de domesticaccedilotildees independentes que teraacute ocorrido
(EPSTEIN amp MASON 1984 LOFTUS et al 1994a 1994b BRADLEY et al 1996 MACHUGH et
al 1997) a partir das populaccedilotildees selvagens de auroque Seguidamente eacute legiacutetimo esperar que
venha a ser possiacutevel analisar a uma escala mais fina o grau de parentesco geneacutetico entre raccedilas
que ocupem aacutereas geograacuteficas mais reduzidas Neste particular seraacute extremamente interessante
incluir as populaccedilotildees ibeacutericas e em especial a raccedila Barrosatilde
9
Introduccedilatildeo
12 - A DIVERSIDADE DAS RACcedilAS BOVINAS
A domesticaccedilatildeo resultou na criaccedilatildeo de milhares de raccedilas de animais domeacutesticos
geneticamente diferentes e adaptadas agraves necessidades humanas e a uma grande variedade de
condiccedilotildees ambientais (FAO 1993)
121 - As raccedilas ibeacutericas
A grande diversidade de raccedilas bovinas da Peniacutensula Ibeacuterica poderaacute dever-se em parte
agrave introduccedilatildeo de outras raccedilas domeacutesticas que se cruzaram entre si e com bovinos jaacute existentes
na Peniacutensula A introduccedilatildeo de outras raccedilas teraacute sido feita de duas formas distintas
1 - atraveacutes dos movimentos migratoacuterios acompanhando as vaacuterias invasotildees de povos
vindos do oriente como eacute o caso dos Feniacutecios ( seacutec X aC) Gregos (seacutec VII aC) e
Romanos (seacutec III aC) Estes uacuteltimos dominaram completamente a Peniacutensula durante
7 seacuteculos e teratildeo contribuiacutedo para a diversificaccedilatildeo do gado bovino pelo facto de
introduzirem animais de caracteriacutesticas diferentes Supotildee-se que do seu cruzamento
com os bovinos ibeacutericos se teratildeo originado os troncos aquitacircnico e ibeacuterico (MIRANDA
do VALE 1949)
2 - atraveacutes da introduccedilatildeo de animais do Norte de Aacutefrica na sequecircncia da invasatildeo de
povos como os Cartagineses (seacutec V aC) e jaacute na era cristatilde os Mouros (711 dC)
Estes teratildeo introduzido descendentes de Bos primigenius opisthonomus que poderaacute
ter influenciado a formaccedilatildeo de vaacuterias raccedilas ibeacutericas nomeadamente as raccedilas Barrosatilde e
Cachena (APARIacuteCIO 1960 in IGLESIAS 1989 EPSTEIN amp MASON 1984) Estas
poderatildeo assim constituir uma linha que descende do tronco mauritaacutenico (MIRANDA
do VALE 1949)
10
Introduccedilatildeo
Adicionalmente eacute provaacutevel que povos oriundos do Norte da Europa nomeadamente
os Visigodos possam ter introduzido gado bovino dessa regiatildeo Contudo a sua eventual
contribuiccedilatildeo para a diversidade de raccedilas bovinas da Peniacutensula Ibeacuterica estaacute por esclarecer
122 - A raccedila Barrosatilde
Aspectos histoacutericos da dispersatildeo e evoluccedilatildeo do efectivo populacional
O centro de criaccedilatildeo da raccedila Barrosatilde situa-se actualmente na zona do planalto da Serra
do Barroso abrangendo os actuais concelhos de Montalegre Boticas Vieira do Minho
(freguesias de Campos e Ruivatildees) e Cabeceiras de Basto (freguesia de Gondiatildees) Esta regiatildeo
natildeo possui condiccedilotildees agro-climateacutericas que permitam grandes exploraccedilotildees agriacutecolas pelo que
uma parte importante da populaccedilatildeo se dedica agrave criaccedilatildeo de gado (GARCIA et ai 1981
FERNANDES 1996)
Vivendo sobretudo em zonas montanhosas a Barrosatilde eacute utilizada essencialmente como
forccedila de trabalho e na produccedilatildeo de carne de excelente qualidade motivo pelo qual a Uniatildeo
Europeia a reconhece com denominaccedilatildeo de Origem Protegida (FERNANDES 1996)
No seacuteculo passado e iniacutecio do seacuteculo XX existia um grande incentivo para a criaccedilatildeo
desta raccedila devido agrave procura da sua carne muito apreciada em Inglaterra Este incentivo
contribuiu indirectamente para que a estatura dos animais se elevasse (GARCIA et ai 1981) e
para que a zona de criaccedilatildeo se dispersasse pelas aacutereas submontanhosas e pelas planiacutecies do
Entre Douro e Minho ateacute agrave orla mariacutetima chegando mesmo ao concelho de Vila Nova de Gaia
(figura 121) Nestas zonas fazia-se a criaccedilatildeo de novilhos para exploraccedilatildeo como bois de
trabalho e para produccedilatildeo de carne Tal exploraccedilatildeo estaacute bem patente nos paineacuteis de azulejos da
estaccedilatildeo de caminhos de ferro de S Bento no Porto e mesmo nos desenhos das calccediladas nas
principais avenidas desta cidade
li
Introduccedilatildeo
B
bull bull bull _ bull bull bull - bull bull
Figura 121 A) Junta de bois de trabalho de raccedila Barrosatilde B) Fecircmea adulta Barrosatilde C) Macho adulto Barrosatilde Fotografias datadas de 1949 gentilmente cedidas pela Direcccedilatildeo Regional de Agricultura de Entre Douro e Minho - Centro de Produccedilatildeo Animal (DRAEDM)
12
Introduccedilatildeo
Poreacutem a necessidade de maiores produccedilotildees de carne foi conduzindo durante a
segunda metade deste seacuteculo a um progressivo decliacutenio no efectivo populacional da raccedila
Barrosatilde tornando-se mesmo raro poder observar uma junta de bois Recentemente as
alteraccedilotildees verificadas na poliacutetica agraacuteria e ambiental da Uniatildeo Europeia teratildeo permitido
alguma recuperaccedilatildeo Nesse contexto a criaccedilatildeo em 1981 do Livro Genealoacutegico da raccedila
Barrosatilde constitui um passo importante para a certificaccedilatildeo dos animais e o aumento do seu
valor Actualmente o seu efectivo populacional tem crescido continuamente e essa tendecircncia
parece estaacutevel
Segundo dados fornecidos pelo Registo Zooteacutecnico e pela Associaccedilatildeo do Minho dos
Criadores de Bovinos de Raccedila Barrosatilde (AMTOA) existiam em 1996 38002 fecircmeas
reprodutoras inscritas e 375 touros de cobriccedilatildeo (tabela 1221) distribuiacutedos por vaacuterios
concelhos dos distritos de Viana do Castelo Braga Vila Real e Porto (figura 122)
Tabela 1221 Movimento do Registo Zooteacutecnico relativo agrave raccedila Barrosatilde
Vacas Inscritas Postos de Cobriccedilatildeo Vitelos Anos Abatidas Registadas Inscritas Encerrados Recenseados Existecircncias Inscritos 1981 0 4884 4882 1 25 24 0 1982 19 6169 11032 6 42 60 532 1983 31 4436 15437 14 35 81 1593 1984 72 866 16231 13 14 82 2151 1985 47 604 16788 15 15 82 1767 1986 106 1027 17709 18 13 77 2414 1987 72 1186 18823 2 14 89 2632 1988 122 1192 19877 5 7 91 2574 1989 138 718 20506 14 26 103 2532 1990 89 1017 21440 8 7 102 2404 1991 159 1309 22590 14 26 114 2531 1992 52 1902 24440 6 17 125 3203 1993 0 4205 28645 37 87 175 4077 1994 0 6248 34893 58 111 228 4679 1995 340 2447 37000 0 112 340 5759 1996 120 1122 38002 26 61 375 5901
Fonte Registo Zooteacutecnico (cedido pela AM1BA)
Apesar desta situaccedilatildeo favoraacutevel natildeo se pode considerar que a raccedila Barrosatilde natildeo corra
ainda perigo de extinccedilatildeo Na verdade satildeo vaacuterios os factores que tecircm contribuiacutedo para a
diminuiccedilatildeo da sua aacuterea de criaccedilatildeo ou mesmo para a alteraccedilatildeo das caracteriacutesticas destes
animais De entre esses factores deve salientar-se i) a substituiccedilatildeo de Barrosatilde por outras raccedilas
autoacutectones (Minhota Mirandesa Maronesa) ou importadas (Friacutesia Gelbvieh e Parda Suiacuteccedila)
13
Introduccedilatildeo
que fornecem ao agricultor um rendimento superior ii) a progressiva mecanizaccedilatildeo da
agricultura e a diminuiccedilatildeo das aacutereas de pastagem iii) o pequeno nuacutemero de machos
reprodutores associado a um efectivo idoso iv) uma baixa fertilidade meacutedia grandes
intervalos entre partos e elevado nuacutemero de abortos e v) desmotivaccedilatildeo dos produtores mesmo
em face das actuais condiccedilotildees de comercializaccedilatildeo
LEGENDA
| j - -Concelhos de Entre Douro e Minho S Concelhos de Traacutes-os-Montes
ESCALA 11380000
Figura 122 Mapa de distribuiccedilatildeo do actual efectivo Barrosatilde
14
Introduccedilatildeo
Aspectos morfoloacutegicos
O bovino Barrosatilde apresenta uma estatura mediana com 121-130 cm de altura agrave
cernelha e pelagem de cor castanha (variando entre a cor de palha ateacute a cor acerejada) (LEAL
1995) A cabeccedila eacute curta e larga encimada por uma cornamenta em forma de lira alta os
cornos satildeo muito compridos e espessos de cor branca suja com pontas escuras o conjunto
ocular eacute saliente dando-lhe o aspecto de olhos de sapo as orelhas satildeo de tamanho meacutedio os
membros satildeo curtos e pouco ossudos e o pescoccedilo eacute curto bem ligado agrave cabeccedila e com garrote
largo (MARTINS 1982)
Eacute uma raccedila com caracteres sexuais secundaacuterios bem diferenciados Os touros satildeo
normalmente mais escuros particularmente no terccedilo anterior com maior corpulecircncia do que as
fecircmeas mais robustos com barbela mais desenvolvida cabeccedila mais curta e mais larga cornos
mais grossos e ligeiramente mais curtos (GARCIA et ai 1981 MARTINS 1982)
Esta raccedila apresenta duas particularidades morfoloacutegicas que a distinguem de todas as
outras raccedilas grande desenvolvimento coacuterneo e perfil cocircncavo da cabeccedila com acentuado
prognatismo mandibular O elevado crescimento coacuterneo poderaacute estar relacionado com a
selecccedilatildeo dos animais De facto nas populares chegas de touros o animal que sai vencedor seraacute
o touro cobridor das vacas da aldeia Este processo teraacute permitido a primazia de touros de
maior ossatura capital mais potente musculatura ceacutefalo-cervical maior forccedila no acircngulo taacutersico
e consequentemente grande desenvolvimento dos cornos (MIRANDA do VALE in GONCcedilALVES GARCIA 1964 ARAUacuteJO 1986) No que se refere ao acentuado prognatismo
mandibular eacute possiacutevel que em parte esteja relacionado com o grande desenvolvimento
coacuterneo Este teraacute exigido um desenvolvimento correlativo de certos ossos cranianos e o
atrofiamento dos ossos da face (GONCcedilALVES GARCIA 1964)
Origem
A origem da raccedila Barrosatilde e o seu enquadramento com as outras raccedilas da Peniacutensula
Ibeacuterica estaacute ainda por explicar constatando-se uma grande heterogeneidade na opiniatildeo de
diversos autores a este respeito (MARTINS 1982)
Alguns autores referem a existecircncia no Norte de Aacutefrica (vale do Nilo) de um gado
com caracteriacutesticas morfoloacutegicas semelhantes agrave actual raccedila Barrosatilde em especial no que se
refere agrave forma tamanho e espessura dos cornos Este gado eacute normalmente associado agrave
15
Introduccedilatildeo
designaccedilatildeo subespeciacutefica Bos primigenius opisthonomus (embora tambeacutem se refira como Bos
primigenius mauritaniens e como Bos taurus desertorum) e teraacute chegado agrave Peniacutensula Ibeacuterica
atraveacutes de vaacuterias rotas migratoacuterias dos povos norte-africanos A raccedila Barrosatilde poderia assim
ser incluiacuteda no tronco mauritaacutenico tendo como ancestral Bos primigenius mauritanicus
(GARCIA et ai 1981)
Neste contexto poderaacute admitir-se que o gado que corresponde a este grupo se tenha
instalado na Peniacutensula Ibeacuterica provavelmente durante a longa ocupaccedilatildeo Moura (GONCcedilALVES
GARCIA 1964) Posteriormente a raccedila Barrosatilde teraacute sido desalojada pelos troncos ibeacuterico e
aquitacircnico restando apenas um nuacutecleo populacional confinado agraves zonas planaacutelticas do
Barroso onde permaneceu ateacute hoje (GONCcedilALVES GARCIA 1964)
Esta hipoacutetese natildeo eacute contudo partilhada por outros autores que lhe criticam a escassa
evidecircncia (forma e tamanho dos cornos) e portanto uma clara ausecircncia de base cientiacutefica
(IGLESIAS 1989)
Perante o exposto pode verificar-se que a raccedila Barrosatilde apresenta aspectos
morfoloacutegicos e histoacuterico-evolutivos muito peculiares sendo ainda hoje difiacutecil proceder ao seu
enquadramento no seio das restantes raccedilas bovinas ibeacutericas O aprofundamento da investigaccedilatildeo
sobre a estrutura geneacutetica das suas populaccedilotildees poderaacute ser assim uma via para o
esclarecimento das muitas questotildees que permanecem por responder Nestas condiccedilotildees este
trabalho pretende ser uma contribuiccedilatildeo para o conhecimento da geneacutetica das populaccedilotildees da
raccedila bovina Barrosatilde atraveacutes da consecuccedilatildeo dos seguintes objectivos
1 estudo da variabilidade geneacutetica da raccedila Barrosatilde ao niacutevel das proteiacutenas eritrocitaacuterias
e plasmaacuteticas
2 desenvolvimento e afinaccedilatildeo de teacutecnicas de separaccedilatildeo de proteiacutenas por electroforese
e focagem isoeleacutectrica e sua detecccedilatildeo especiacutefica (histoquiacutemica e imunoloacutegica)
3 anaacutelise familiar dos polimorfismos encontrados
4 avaliaccedilatildeo do grau de diferenciaccedilatildeo geneacutetica existente entre a raccedila Barrosatilde e outras
raccedilas bovinas
16
Material e Meacutetodos
2 - MATERIAL E MEacuteTODOS
21 - AMOSTRAGEM E CONSERVACcedilAtildeO DAS AMOSTRAS
211 - Amostragem
Foram recolhidas 356 amostras de sangue correspondente a 294 indiviacuteduos de raccedila
Barrosatilde (dos quais 141 estavam inscritos no Livro Genealoacutegico) e 62 indiviacuteduos de raccedila
Minhota As colheitas efectuaram-se em zonas de intensa criaccedilatildeo da Barrosatilde designadamente
nos concelhos de Arcos de Valdevez Cabeceiras de Basto Fafe Poacutevoa de Lanhoso e
Monccedilatildeo em finais de 1993 durante o ano de 1994 e ainda no periacuteodo de 1996 1997 em
Vieira do Minho
A recolha de sangue em indiviacuteduos de raccedila Minhota foi efectuada com a finalidade de
servir como termo de comparaccedilatildeo geneacutetica uma vez que se realizam cruzamentos entre esta
raccedila e a Barrosatilde
212 - Obtenccedilatildeo e conservaccedilatildeo das amostras de sangue
O sangue foi colhido da veia jugular em tubos contendo 01 ml de EDTA (aacutecido
etilnodiaminotetraceacutetico) dissoacutedico a 10 ou em tubos heparinados
As amostras de sangue foram centrifugadas (10 minutos a 13000 rpm) separando-se
em seguida o plasma dos eritroacutecitos Aos eritroacutecitos foi adicionado meio de glicerol (seis
partes de uma soluccedilatildeo 5 de citrato trissoacutedico 2H20 adicionados a quatro partes de glicerol)
numa proporccedilatildeo aproximada de 21 as amostras foram conservadas a -20degC
17
Material e Meacutetodos
22 - BATERIA DE MARCADORES GENEacuteTICOS SELECCIONADOS
No presente trabalho foi escolhida uma bateria de 12 marcadores geneacuteticos dispersos
no genoma do bovino (figura 5) HB (Hemoglobina) CAII (Anidrase carboacutenica) PEPB
(Peptidase B) DIA (Diaforase) NP (Fosforilase nucleosiacutedica) MDH (Desidrogenase do
malato) PGD (Desidrogenase do aacutecido fosfoglucoacutenico) GPI (Isomerase da fosfoglucose)
MPI (Isomerase da manose-6-fosfato) ALB (Albumina) TF (Transferrina) e GC
(Componente especiacutefico de grupo)
CP SODl TF
PEPC IDH1
AMY1 AMY1A PGM1
4
LDHB PEPB
ADH2 PGM2 ALB GC SOD3
6
IADA
ALDH1
CAII
ME1 PGM3 SOD2
NP
10
CAT HBBq22-q27
PGD IALDH2 DIA4
HP GPIq22-q24
MPI iBF GLOl
LDHA MDH2
Figura 221 Localizaccedilatildeo de vaacuterios loci proteicos no genoma de Bos taurus Com um tom mais carregado indicam-se os marcadores estudados neste trabalho Adaptado de FRIES et ai (1993)
18
Material e Meacutetodos
bull HB
A hemoglobina eacute responsaacutevel pelo transporte do oxigeacutenio dos pulmotildees para os tecidos
A sua estrutura eacute tetrameacuterica tendo cada uma das quatro subunidades um grupo prosteacutetico -
- heme - com um aacutetomo de ferro no centro A fracccedilatildeo principal da hemoglobina de mamiacuteferos
adultos eacute composta por duas cadeias a e duas cadeias P (BRAEND 1971 CECCHINI amp Nus
1986)
O locus da HB foi um dos primeiros a ser estudado apresentando polimorfismo em
vaacuterios mamiacuteferos (CECCHJM amp Nus 1986 BRAEND et ai 1988 CLARKE et ai 1989 WANG
et ai 1990 SELVARAJ et ai 1991) Em 1955 CABANNE amp SERAIN (in BRAEND 1988)
descrevem pela primeira vez o polimorfismo da HB em bovinos do Norte da Aacutefrica
Posteriormente muitos estudos foram efectuados descrevendo-se 13 variantes (raros na sua
maioria) com diferenccedilas apenas nas cadeias beta (CECCHINI amp Nus 1986 BRAEND 1988)
bull CAII-EC4211
A CAII eacute uma metaloenzima com grande distribuiccedilatildeo nos animais e nas plantas
(TASHIAN 1989) Catalisa de forma reversiacutevel a hidrataccedilatildeo do C02 em H2C03 (CECCHINI amp
Nus 1986 TASHIAN 1989) O seu papel fisioloacutegico ainda natildeo eacute bem conhecido mas eacute
possiacutevel que tenha participaccedilatildeo na manutenccedilatildeo do balanccedilo osmoacutetico (TASHIAN 1989)
A ocorrecircncia de variaccedilatildeo geneacutetica na CAII estaacute descrita em muitas espeacutecies de
mamiacuteferos tendo sido descritos dois loci polimoacuterficos (CAI e CAII) (TASHIAN amp CARTER
1976 CLARICE et ai 1989 SELVARAJ et ai 1991)
SARTORE et ai (1969) foram os primeiros a detectar polimorfismo electroforeacutetico da
anidrase carboacutenica em bovinos domeacutesticos e buacutefalos americanos Nos eritroacutecitos de bovinos
apenas se exprime a anidrase carboacutenica II que apresenta geralmente 2 alelos codominantes
autossoacutemicos (CAIPF e CAIPS) (SARTORE et ai 1969 TASHIAN amp CARTER 1976) Mais
tarde foram encontrados 3 novos alelos (C Z e X) (CECCHINI amp Nus 1986)
19
Material e Meacutetodos
bull PEPB-EC3412
As peptidases formam um conjunto de enzimas capazes de hidrolisar di- e tripeacuteptidos
caracterizando-se pela sua especificidade em relaccedilatildeo a diversos substratos bem como atraveacutes
da sua distribuiccedilatildeo tecidular
A PEPB apresenta uma estrutura monomeacuterica tendo sido descrita como polimoacuterfica
em algumas raccedilas brasileiras de bovinos de origem europeia e indiana (DEL LAMA et ai
1992)
bull DIA-EC1643
A enzima monomeacuterica DIA (NADH - Methemoglobina redutase) tambeacutem conhecida
por citocromo bs redutase faz parte de um grupo de enzimas que catalisam a reduccedilatildeo da
methemoglobina (IGLESIAS 1989 VIEIRA 1993 kRAHhetal 1986)
O seu polimorfismo geneacutetico foi detectado em vaacuterias espeacutecies de Ungulados incluindo
os bovinos (CLARKE et ai 1989 IGLESIAS 1989 SELVARAJ et ai 1991 TATE amp McEWAN
1992)
bull NP-EC2421
A enzima NP encontra-se distribuiacuteda por vaacuterios tecidos e oacutergatildeos e catalisa
reversivelmente a fosforoacutelise dos nucleosiacutedeos puriacutenicos levando agrave formaccedilatildeo das respectivas
bases e ribose-1-fosfato (IGLESIAS 1989)
O polimorfismo geneacutetico desta enzima foi detectado em vaacuterias espeacutecies de mamiacuteferos
incluindo os bovinos (ANSAY 1973 HARRIS amp HOPKINSON 1978 TUKER amp YOUNG 1988
CLARKE eacutetal 1989 IGLESIAS 1989 FERRAND 1995)
20
Material e Meacutetodos
bull MDH-ECl 1137
A MDH eacute uma oxirredutase dimeacuterica na maioria dos mamiacuteferos responsaacutevel pela
oxidaccedilatildeo do L-malato em oxoglutarato com NAD como aceitador A reacccedilatildeo eacute reversiacutevel em
presenccedila de NADH e oxaloacetato A enzima diz-se NAD especiacutefica pelo facto da reacccedilatildeo soacute
ocorrer na presenccedila deste cofactor (MORAIS 1992 PEREIRA 1997)
A ocorrecircncia de variaccedilatildeo geneacutetica neste locus foi descrita para vaacuterios mamiacuteferos
(HARRIS amp HOPKINSON 1978 TUNOacuteN et ai 1989 SELVARAJ et ai 1991) Contudo
relativamente aos bovinos natildeo foi possiacutevel encontrar referecircncias quanto ao seu polimorfismo
bull PGD-EC11144
A PGD eacute uma enzima dimeacuterica envolvida na via das pentoses-fosfato catalisando a
conversatildeo de 6-fosfogluconato em ribose-5-fosfato
O polimorfismo geneacutetico do locus PGD estaacute descrito em diversas espeacutecies de
Ungulados (HERZOG 1988 PENEDO et ai 1988 BEKENEV amp ORLO VA 1991 KUROSAWA amp
TANAKA 1991 JANZEN amp COTHRAN 1991 FERNDALE et al 1992) Contudo relativamente
aos bovinos natildeo foi possiacutevel encontrar referecircncias quanto ao seu polimorfismo
bull GPI-EC5319
A isomerase da fosfoglucose cataliza a reacccedilatildeo reversiacutevel de conversatildeo de glucose-
-6-fosfato em frutose-6-fosfato (HARRIS amp HOPKINSON 1978 PRETSCHei ai 1990)
Eacute uma enzima dimeacuterica com polimorfismo geneacutetico em vaacuterias espeacutecies de mamiacuteferos
nomeadamente no catildeo (ARNOLD amp Bouw 1989) no porco (VAN DE WEGHE et ai 1988
BEKENEV amp ORLO VA 1991) na ovelha (RASERO et ai 1993) em lamas e alpacas (PENEDO et
ai 1988) e no Homem (HARRIS amp HOPKINSON 1978)
21
Material e Meacutetodos
bull MPI-EC5318
A MPI eacute uma enzima monomeacuterica de acccedilatildeo cataliacutetica que permite a isomerizaccedilatildeo de D-
-manose-6-fosfato em D-frutose-6-fosfato
Em diversas espeacutecies de mamiacuteferos nomeadamente no Homem (RlTTER et ai 1974)
em babuiacutenos (RITTER amp SCHMITT 1973) e ratos (NICHOLS et ai 1973 VANDEBERG amp
AIVALIOTIS 1990) esta enzima natildeo apresenta actividade em eritroacutecitos sendo poreacutem
detectada em diversos tecidos como rim fiacutegado e o muacutesculo Mais tarde demonstrou-se a
possibilidade de proceder a esta detecccedilatildeo em hemolisados de cavalos coelhos e lebres (HALL
et ai 1991 VIEIRA amp FERRAND 1995 SANTOS 1995)
O polimorfismo geneacutetico de MPI em bovinos foi descrito por ANSAY (1973)
apresentando trecircs alelos autossoacutemicos codominantes (MPPA MPIB e MPIC)
bull ALB
A albumina eacute a proteiacutena mais abundante no plasma dos mamiacuteferos e apresenta uma
estrutura monomeacuterica A sua funccedilatildeo estaacute relacionada com processos de transporte e de
regulaccedilatildeo do balanccedilo osmoacutetico (CECCHTNI amp Nus 1986 CARTER et al 1989)
O polimorfismo geneacutetico da albumina estaacute descrito em vaacuterias espeacutecies de Ungulados
(STORMONT et ai 1963 BOWLING amp CLARK 1988 PENEDO et ai 1988 ERHARDT 1991
SELVARAJeacutetfa 1991CRISTOFALOpounda 1992 ERHARDT amp SlMIANER 1993)
EFREMOV e ASHTON em 1965 (in CECCHTNI amp Nus 1986) descrevem pela primeira vez
polimorfismo geneacutetico em raccedilas bovinas inglesas Inicialmente encontraram-se dois alelos
(ALBA ou ALBF e ALBB ou ALBS) por electroforese aacutecida Mais tarde descreveram-
-se outros alelos em raccedilas britacircnicas (ALBH e ALBG) e em raccedilas africanas (ALBD
ALBE e ALBF) (CECCHINI amp Nus 1986) ABE et ai em 1971 descrevem o alelo ALBX
(in CECCHTNI amp Nus 1986)
22
Material e Meacutetodos
bull TF
A transferrina eacute uma 3-globulina seacuterica responsaacutevel pelo transporte do ferro Possui
uma estrutura monomeacuterica glicosilada (CECCHINI amp Nus 1986 WELCHS 1990 PENHALLOW
et ai 1991 CUNHA 1994)
O polimorfismo geneacutetico desta proteiacutena foi detectado em vaacuterias espeacutecies de Ungulados
(KRISTJANSSON 1963 STORMONT et ai 1963 ASHTON 1965 GAHNE et ai 1977 CECCHJNI
amp Nus 1986 ERHARD 1986 KUROSAWA amp TANAKA 1988 PENEDO et ai 1988 CLARKE et
ai 1989 HERZOG 1989 JUNEJA et ai 1989 TSUJI et ai 1989 SCHNEIDER et ai 1990
STRATIL et ai 1990 WANG et ai 1990 SELVARAJ et ai 1991 DRATCH et ai 1992
VANKAN amp BELL 1992a CIacuteZovket ai 1993 ERHARD et ai 1993)
ASHTON em 1965 descreveu pela primeira vez o polimorfismo geneacutetico de TF em
bovinos estando actualmente descritos sete alelos TFA TFB TFD1 TFD2 TFE
TFF e TFG (CECCHTNI amp Nus 1986) A subdivisatildeo do alelo TFD em TFD1 e TFD2 foi
descrita por KRISTJANSSON amp HICKMAN (1965)
Nos bovinos os loci TF e CP encontram-se ligados como tem sido descrito para vaacuterias
espeacutecies de mamiacuteferos (JUNEJA et ai 1989)
bull GC
A GC apresenta uma estrutura monomeacuterica e o seu polimorfismo geneacutetico estaacute descrito
em vaacuterias espeacutecies de Ungulados (GAHNE 1963 KRISTJANSSON 1963 JUNEJA et ai 1987
PENEDO et ai 1988 PENEDO amp JUNEJA 1989 KALAacuteB et ai 1990 ERHARDT 1991 VANKAN
amp BELL 1992b STERN et ai 1992 ERHARDT amp SIMIANER 1993 STRATIL et ai 1995)
Nos bovinos o polimorfismo geneacutetico da GC foi inicialmente descrito por GAHNE
(1963) e ASHTON (1963) in GAHNE et ai 1977) mas soacute mais tarde foi possiacutevel obter
frequecircncias geacutenicas para este locus (alelos GCA e GCB) em diferentes raccedilas europeias
(GAHNE et ai 1977) A utilizaccedilatildeo de novas teacutecnicas de separaccedilatildeo permitiu distinguir um
terceiro alelo GCC (VAN DE WEGHE 1982)
23
Material e Meacutetodos
A existecircncia de ligaccedilatildeo factorial entre os loci ALB e GC foi demostrada no Homem
em primeiro lugar e depois nos cavalos nos bovinos e na ovelha (VAN DE WEGHE 1982
ERHARDT amp SlMIANER 1993)
23 - TRATAMENTO DAS AMOSTRAS
bull HB
A separaccedilatildeo da moleacutecula HB por focagem isoeleacutectrica foi feita mediante a utilizaccedilatildeo de
hemolisados diluiacutedos 18 em aacutegua bidestilada
bull CAII
A separaccedilatildeo electroforeacutetica de CAII foi realizada em gel de amido e em focagem
isoeleacutectrica No primeiro caso as amostras foram simplesmente tratadas com tolueno
enquanto no segundo se procedeu ainda agrave sua reduccedilatildeo com uma soluccedilatildeo de ditiotreitol
(DTT) 120 mM (100 uacute de amostra natildeo diluiacuteda e 20 pi de DTT 120 mM) durante 1 h a 37degC
Quando se utilizou focagem isoeleacutectrica aleacutem do tratamento jaacute referido foi necessaacuterio
realizar uma diluiccedilatildeo final de 110 com aacutegua bidestilada
bull PEPB DIA NP MDH PGP GPI e MPI
As separaccedilotildees electroforeacuteticas de PEPB DIA NP MDH PGD GPI e MPI em gel de
amido foram efectuadas com hemolisados natildeo diluiacutedos submetidos ao mesmo tratamento
descrito para CAII quando separada por electroforese convencional
24
Material e Meacutetodos
bull ALB
Na separaccedilatildeo de ALB por focagem isoeleacutectrica utilizaram-se amostras de plasma
diluiacutedas com aacutegua bidestilada na proporccedilatildeo de 170
bull TF
Na separaccedilatildeo de TF efectuada por focagem isoeleacutectrica utilizaram-se amostras de
plasma submetidas a vaacuterios tipos de tratamento para comparaccedilatildeo dos padrotildees de bandas
obtidos
1 Remoccedilatildeo dos resiacuteduos de aacutecido siaacutelico da moleacutecula de TF
diluiccedilatildeo 13 com neuraminidase durante 1 h a 37 degC
2 Remoccedilatildeo do Fe da moleacutecula de TF
diluiccedilatildeo 13 com EDTA-dissoacutedico (20) 2 h antes da aplicaccedilatildeo para remoccedilatildeo dos
aacutetomos de Fe da moleacutecula de TF
3 Saturaccedilatildeo em Fe da moleacutecula de TF
31 - diluiccedilatildeo 13 com soluccedilatildeo de sulfato de amoacutenio feacuterrico 015 (pv) em aacutecido
ciacutetrico 60 mM seguida de incubaccedilatildeo agrave temperatura ambiente 18 h A utilizaccedilatildeo
de uma razatildeo ligante Fe de 201 permite uma raacutepida saturaccedilatildeo da moleacutecula de
TF (FERRAND 1995)
32 - diluiccedilatildeo 13 com soluccedilatildeo de sulfato de amoacutenio ferroso 015 (pv) em aacutecido
ciacutetrico 60 mM seguida de incubaccedilatildeo agrave temperatura ambiente 18 h
33 - diluiccedilatildeo 13 com soluccedilatildeo de citrato de amoacutenio feacuterrico 015 (pv) em aacutecido
ciacutetrico 60 mM seguida de incubaccedilatildeo agrave temperatura ambiente 18 h
34 - diluiccedilatildeo 13 com soluccedilatildeo de citrato feacuterrico 015 (pv) em aacutecido ciacutetrico
60 mM seguida de incubaccedilatildeo agrave temperatura ambiente 18 h
35 - diluiccedilatildeo 13 com soluccedilatildeo de cloreto de ferro 015 (pv) em aacutecido ciacutetrico
60 mM seguida de incubaccedilatildeo agrave temperatura ambiente 18 h
25
Material e Meacutetodos
Antes da inserccedilatildeo as amostras foram parcialmente purificadas atraveacutes da adiccedilatildeo de 5
volumes de uma soluccedilatildeo de rivanol 06 (pv) em tampatildeo Tris HC1 005 M (ajusta-se o pH
para valores de 91 com Tris 1 M) seguida de centrifugaccedilatildeo
bull GCcedil
A fim de proceder agrave remoccedilatildeo dos resiacuteduos de aacutecido siaacutelico existente nas cadeias de
hidratos de carbono ligadas agrave moleacutecula GC as amostras de plasma foram submetidas a uma
incubaccedilatildeo com uma soluccedilatildeo de neuraminidase Clostridium perfringens SIGMA type V 18
Uml) na proporccedilatildeo de 13 durante 18 h a 37degC acrescentando-se posteriormente aacutegua
bidestilada ateacute agrave obtenccedilatildeo de uma diluiccedilatildeo final de 14 Paralelamente procedeu-se a uma
diluiccedilatildeo das amostras com aacutegua bidestilada (19) para comparaccedilatildeo dos padrotildees de bandas
obtidos
24 - MEacuteTODOS DE SEPARACcedilAtildeO
Electroforese convencional
Nas teacutecnicas de electroforese convencional foram utilizados vaacuterios sistemas de tampatildeo
para os geacuteis e para as pontes conforme a proteiacutena em estudo
Focagem isoeleacutectrica
Os sistemas de focagem isoeleacutectrica utilizados na separaccedilatildeo de proteiacutenas foram
realizados em matrizes de poliacrilamida (T = 5 C = 3) com dimensotildees 230xl00x03mm
Os geacuteis foram aplicados sobre uma peliacutecula de suporte GELFIX (SERVA) permitindo o seu
manuseamento adequado
A adiccedilatildeo de soluccedilotildees de TEMED 10 (pv) e persulfato de amoacutenio (PSA) 10 (pv)
permitiu a polimerizaccedilatildeo do gel agrave temperatura ambiente (24 horas) ou a 37 degC durante 1 h
As separaccedilotildees por focagem isoeleacutectrica decorreram sobre placa de arrefecimento a
aproximadamente 10degC (8 - 12degC)
26
Material e Meacutetodos
HB
A separaccedilatildeo da moleacutecula de HB foi realizada por focagem isoeleacutectrica em gradiente de
pH livre segundo a teacutecnica descrita por FERRAND (1995) com algumas modificaccedilotildees
A composiccedilatildeo da soluccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo e os paracircmetros eleacutectricos utilizados estatildeo
indicados nas tabelas 241 e 242 respectivamente
Tabela 241 Soluccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo utilizada para a separaccedilatildeo da moleacutecula nativa de HB por focagem isoeleacutectrica
Componentes da soluccedilatildeo Quantidades
Acrilamida 28 (pv)
Bisacrilamida 2 (pv)
Sacarose
Anfoacutelitos 5-8 (SIGMA)
7-9 (PHARMACIA)
Aacutegua bidestilada TEMED 10 (vv)
PSA 10 (pv)
18 ml
08 ml
2 g
300 p1
300 ul
ateacute 10 ml volume final
10 ul
70 ul
Tabela 242 Paracircmetros eleacutectricos utilizados na focagem isoeleacutectrica de HB
Voltagem (V) Corrente (mA) Potecircncia (W) Tempo (T)
Preacute focagem 1500 25 1
2
3
30 min
15 min
15 min
Focagem 1500 25 15 2h 30 min
As soluccedilotildees para os eleacutectrodos foram aacutecido aspaacutertico 004 M (acircnodo) e NaOH 01 M
(caacutetodo) As amostras foram aplicadas a 15 cm do caacutetodo tendo sido inseridas com o auxiacutelio
de um aplicador de borracha silicone (SERVA)
27
Material e Meacutetodos
bull CAII
A separaccedilatildeo de CAII fez-se em gel de amido (15 pv SIGMA) conforme o descrito
por AMORIM (1983) com algumas modificaccedilotildees e ainda por focagem isoeleacutectrica em
gradiente de pH livre
Utilizam-se os seguintes sistemas tampatildeo para a separaccedilatildeo por electroforese em gel de
amido
Tampatildeo das Pontes Tris 0250 M pH = 76 Aacutecido ciacutetrico 0067 M
Tampatildeo do Gel Diluiccedilatildeo 110 do tampatildeo das pH = 76 pontes
As amostras foram inseridas em meio Sephadex G-200 (PHARMACIA) na proporccedilatildeo
de 11 As electroforeses foram realizadas em placa de arrefecimento (8degC) e com um
gradiente de potencial de 5 Vcm durante 16 h
A teacutecnica utilizada para a separaccedilatildeo de CAII por focagem isoeleacutectrica foi a descrita por
BOWLING et ai (1990) com algumas modificaccedilotildees A composiccedilatildeo da soluccedilatildeo de
polimerizaccedilatildeo e os paracircmetros eleacutectricos utilizados estatildeo indicados nas tabelas 243 e 244
respectivamente
As soluccedilotildees para os eleacutectrodos foram aacutecido aspaacutertico 004 M (acircnodo) e NaOH 01 M
(caacutetodo) As amostras foram inseridas com o auxiacutelio de um aplicador de borracha silicone
(SERVA) colocado a 15 cm do caacutetodo
28
Material e Meacutetodos
Tabela 243 Soluccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo utilizada na separaccedilatildeo de CAII por focagem isoeleacutectrica
Componentes da soluccedilatildeo
Acrilamida 28 (pv)
Bisacrilamida 2 (pv)
Sacarose
Anfoacutelitos 4-65 (PHARMACIA)
Anfoacutelitos 35-10 (PHARMACIA)
Aacutegua bidestilada TEMED 10 (vv)
PSA 10 (pv)
Quantidades 18 ml
08 ml
2 g
500 |ol
100 ul
ateacute 10 ml volume final
10 ul
70 ul
Tabela 244 Paracircmetros eleacutectricos utilizados na separaccedilatildeo de CAII por focagem isoeleacutectrica
Voltagem (V) Corrente (mA) Potecircncia (W) Tempo (T)
Preacute focagem 1500 25 1
3
5
30 min
15 min
15 min
Focagem 2500 25 8
10
12
30 min
30 min
30 min
bull PEPB
A separaccedilatildeo da PEPB foi realizada em gel de amido (15 pv SIGMA) de acordo
com a teacutecnica descrita por POVEY et ai (1972) com algumas modificaccedilotildees
29
Material e Meacutetodos
Utilizou-se o seguinte sistema tampatildeo
Tampatildeo das Pontes Tris 01 M
pH = 74 NaH2P04 01 M
Tampatildeo do Gel Diluiccedilatildeo 110 do tampatildeo das
pH = 74 pontes
As amostras satildeo inseridas em meio Sephadex G-200 (PHARMACIA) na proporccedilatildeo de
11 As electroforeses foram realizadas em placas de arrefecimento (8degC) e com um gradiente
de potencial de 5 Vcm durante 16 h
bull DIA
No caso da separaccedilatildeo de DIA a teacutecnica eacute idecircntica agrave utilizada para CAII electroforese
em gel de amido (15 pv SIGMA) conforme o descrito por AMORIM (1983) com algumas
modificaccedilotildees
bull NP MDH PGD GPJ e MPI
As separaccedilotildees das enzimas NP MDH PGD GPI e MPI fizeram-se em simultacircneo por
electroforese em gel de amido (15 pv SIGMA) conforme o descrito por AMORIM et ai
(1982) com algumas modificaccedilotildees
Utilizou-se o seguinte sistema tampatildeo
1130 M
0400 M
0020 M 0010 M
Tampatildeo das Pontes NaOH
pH = 60 Aacutecido ciacutetrico
Tampatildeo do Gel HisHCl
pH = 60 NaOH
30
Material e Meacutetodos
As amostras foram inseridas em meio Sephadex G-200 (PHARMACIA) na proporccedilatildeo
de 11 As electroforeses foram realizadas em placas de arrefecimento (8degC) e com um
gradiente de potencial de 8 Vcm durante 15 h
ALB
Nas tabelas 245 e 246 indicam-se respectivamente a composiccedilatildeo da soluccedilatildeo de
polimerizaccedilatildeo para a separaccedilatildeo de ALB por focagem isoeleacutectrica segundo a teacutecnica descrita
por ROCHA et ai (1991) com algumas modificaccedilotildees e os paracircmetros eleacutectricos
Tabela 245 Soluccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo utilizada para a separaccedilatildeo de ALB por focagem isoeleacutectrica
Componentes da soluccedilatildeo Quantidades
Acrilamida 28 (pv)
Bisacrilamida 2 (pv)
Ureia
Anfoacutelitos 5-6 (PHARMACIA)
Anfoacutelitos 5-8 (PHARMACIA)
Anfoacutelitos 6-8 (PHARMACIA)
Aacutegua bidestilada TEMED 10 (vv)
PSA 10 (pv)
18 ml
08 ml
48 g
250 ni
250 ni
125 ul
ateacute 10 ml volume final
30 ul
70 ul
Tabela 246 Paracircmetros eleacutectricos utilizados na separaccedilatildeo de ALB por focagem isoeleacutectrica
Voltagem (V) Corrente (mA) Potecircncia (W) Tempo (T)
Preacute focagem 1500 25
Focagem 1500 25
1 30 min
2 15 min
3 15 min
4 3 h
5 30 min
31
Material e Meacutetodos
As soluccedilotildees para os eleacutectrodos foram aacutecido aspaacutertico 004 M (acircnodo) e NaOH 1 M
(caacutetodo) As amostras foram aplicadas a 15 cm do caacutetodo com o auxiacutelio de um aplicador de
borracha silicone (SERVA)
TF
A separaccedilatildeo da moleacutecula de TF foi efectuada por focagem isoeleacutectrica A composiccedilatildeo
da soluccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo e os paracircmetros eleacutectricos utilizados estatildeo indicados nas tabelas
247 e 248 respectivamente
Tabela 247 Soluccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo utilizada para a separaccedilatildeo da TF por focagem isoeleacutectrica
Componentes da soluccedilatildeo Quantidades
Acrilamida 28 (pv)
Bisacrilamida 2 (pv)
Sacarose
Anfoacutelitos 35-5(LKB)
Anfoacutelitos 4-65 (PHARMACIA)
Aacutegua bidestilada
TEMED 10 (vv) PSA 10 (pv)
18 ml
08 ml
2 g
100 ul
500 ul
ateacute 10 ml volume final
30 ul
70 ul
Tabela 248 Paracircmetros eleacutectricos utilizados na separaccedilatildeo de TF por focagem isoeleacutectrica
Voltagem (V) Corrente (mA) Potecircncia (W) Tempo (T)
Preacute focagem 1500 25
Focagem 2500 25
l 20 min
2 10 min
3 10 min
8 30 min
10 30 min
12 30 min
32
Material e Meacutetodos
As soluccedilotildees para os eleacutectrodos foram de aacutecido aspaacutertico 004 M (acircnodo) e de NaOH
1 M (caacutetodo) As amostras foram aplicadas a 15 cm do caacutetodo com o auxiacutelio de um aplicador
de borracha silicone (SERVA)
GC
Nas tabelas 249 e 2410 apresenta-se respectivamente a composiccedilatildeo da soluccedilatildeo de
polimerizaccedilatildeo e os paracircmetros eleacutectricos utilizados na focagem isoeleacutectrica de GC
Tabela 249 Soluccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo utilizada para a separaccedilatildeo da GC por focagem isoeleacutectrica
Componentes da soluccedilatildeo Quantidades
Acrilamida 28 (pv)
Bisacrilamida 2 (pv)
Sacarose
Anfoacutelitos 45-54 (PHARMACIA)
Anfoacutelitos 4-6 (LKB)
Aacutegua bidestilada TEMED 10 (vv)
PSA 10 (pv)
18 ml
08 ml
2 g
437 ul
188 (il
eacute 10 ml volume final
10 ul
70 ul
Tabela 2410 Paracircmetros eleacutectricos utilizados na separaccedilatildeo de GC por focagem isoeleacutectrica
Voltagem (V) Corrente (mA) Potecircncia (W) Tempo (T)
Preacute focagem 1500 25
Focagem 1500 25
1 30 min
2 15 min
3 15 min
4 3 h
5 30 min
33
Material e Meacutetodos
Para os eleacutectrodos foram utilizadas soluccedilotildees de aacutecido aspaacutertico 004 M (acircnodo) e de
NaOH 02 M (caacutetodo) As amostras foram inseridas com o auxiacutelio de um aplicador de
borracha silicone (SERVA) colocado a 15 cm do caacutetodo
25 - MEacuteTODOS DE DETECCcedilAtildeO
Apoacutes a separaccedilatildeo das proteiacutenas os padrotildees electroforeacuteticos foram geralmente obtidos
por detecccedilatildeo especiacutefica aproveitando a actividade cataliacutetica das enzimas Noutros casos a
revelaccedilatildeo foi feita por coloraccedilatildeo geral de proteiacutenas
bull HB
A visualizaccedilatildeo da HB foi obtida mediante coloraccedilatildeo geral de proteiacutenas segundo o
seguinte procedimento
Fixaccedilatildeo
Imersatildeo do gel numa soluccedilatildeo de aacutecido tricloroaceacutetico 125 (pv) durante 10 minutos
Coloraccedilatildeo geral de proteiacutenas
Coloraccedilatildeo com uma soluccedilatildeo de Coomassie R-250 0115 (pv) numa mistura de aacutecido
aceacuteticoetanolaacutegua destilada (42571) apoacutes aquecimento seguida de filtraccedilatildeo durante
5-10 minutos A descoloraccedilatildeo eacute feita com aacutecido aceacutetico etanol e aacutegua destilada
aquecida a cerca de 60degC ateacute se obter o contraste desejado
bull CAII
Apoacutes separaccedilatildeo por electroforese em gel de amido visualizou-se a CAII pela sua
actividade esteraacutesica adicionando-se diacetato de fluoresceiacutena (em quantidades vestigiais que
34
Material e Meacutetodos
foram previamente dissolvidas em 200 uacute de acetona) a uma soluccedilatildeo de incubaccedilatildeo tamponada
(pH = 66) Esta soluccedilatildeo de incubaccedilatildeo eacute composta por aacutecido ciacutetrico 27 mM e Na2HP04
116 mM e foi aplicada sobre o gel de amido com o auxiacutelio de papeacuteis de filtro Whatman ndegl
Em seguida incubou-se durante 30 minutos a 37degC A observaccedilatildeo das bandas de CAII (devido
agrave sua capacidade esteraacutesica) eacute feita sob luz ultravioleta
Apoacutes separaccedilatildeo por focagem isoeleacutectrica utilizou-se uma coloraccedilatildeo geral de proteiacutenas
para visualizaccedilatildeo da CAII segundo o meacutetodo descrito para a HB sem fixaccedilatildeo
bull PEPB
A detecccedilatildeo da PEPB apoacutes a separaccedilatildeo electroforeacutetica foi feita atraveacutes da aplicaccedilatildeo
sobre o gel de amido de papeacuteis de filtro Whatman ndegl embebidos numa soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo
seguindo-se uma incubaccedilatildeo de 30 minutos a 37degC
A soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo conteacutem o substrato da PEPB L-leucilglicil-glicina 0004 M
veneno de cobra da espeacutecie Agkistrodon piscivorus piscivorus 04 (pv) MTT 24 mM e
metosulfato de fenazina (PMS) 03 mM num tampatildeo de pH = 80 (Tris HC1005 M)
bull DIA
Apoacutes a separaccedilatildeo por electroforese em gel de amido a identificaccedilatildeo da DIA foi obtida
pela adiccedilatildeo de uma soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo a uma fatia do gel A incubaccedilatildeo decorreu durante 2
horas a 37degC
A soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo foi realizada em duas fases
Io - colocou-se 26-diclorofenol-indofenol (DCIP) 01 mM com um tampatildeo de
pH = 85 (Tris HC1 005M) adicionando-se agrave mistura aacutegua bidestilada ateacute perfazer
50 ml Em seguida filtrou-se a soluccedilatildeo
2o - agrave soluccedilatildeo filtrada adicionou-se MTT 03 mM e NADH 02 mM e agitou-se antes
de verter sobre a fatia de gel de amido
35
Material e Meacutetodos
bull NP
A detecccedilatildeo da enzima NP apoacutes a separaccedilatildeo por electroforese foi feita atraveacutes da
aplicaccedilatildeo sobre o gel de amido de papeacuteis de filtro Whatman ndegl embebidos com a soluccedilatildeo de
coloraccedilatildeo Em seguida incubou-se durante 15 minutos a 37degC
A soluccedilatildeo de incubaccedilatildeo conteacutem inosina 37 mM MTT 24 mM XOD 0004 Uml uma
gota de azul de Meldola (SIGMA) (10 vv em aacutegua bidestilada) e uma soluccedilatildeo de tampatildeo
de incubaccedilatildeo pH = 75 constituiacuteda por KH2P04 005 M e NaOH 004 M
bull MDH
Na detecccedilatildeo da actividade enzimaacutetica de MDH foi utilizado o meacutetodo de sandwich
apoacutes a sua separaccedilatildeo electroforeacutetica em gel de amido Em seguida incubou-se durante 15
minutos a 37degC O meacutetodo de sandwich consiste na aplicaccedilatildeo de uma fatia de gel de amido
entre duas folhas de papel de filtro Whatman ndegl embebido com a soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo
A soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo utilizada na detecccedilatildeo da MDH conteacutem NAD 1 mM MTT
2 mM e piruvato de soacutedio (quantidades vestigiais) Esta soluccedilatildeo foi feita com um tampatildeo de
incubaccedilatildeo pH = 74 constituiacutedo por aacutecido maacutelico 0222 M Tris 050 M e MgCl2 002 M
bull PGP
A detecccedilatildeo da actividade enzimaacutetica de PGD foi feita pelo meacutetodo de sandwich apoacutes a
sua separaccedilatildeo electroforeacutetica em gel de amido
A soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo conteacutem quantidades vestigiais de aacutecido 6-fosfoglucoacutenico
NADP MTT e uma gota de azul de Meldola (05 pv em aacutegua bidestilada) dissolvidos num
tampatildeo de pH = 74 constituiacutedo por Tris 01 M HisHCl 01 M Imidazol 0015 M e MgCl2
0005 M
36
Material e Meacutetodos
bull GPI
A detecccedilatildeo da actividade enzimaacutetica de GPI foi feita pelo meacutetodo de sandwich apoacutes a
sua separaccedilatildeo electroforeacutetica em gel de amido
A soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo conteacutem frutose-6-fosfato 55 mM NADP 22 mM MTT
4 mM desidrogenase da glucose-6-fosfato (G6PD) 14 Uml e uma gota de azul de Meldola
(05 pv em aacutegua bidestilada) dissolvidos num tampatildeo de pH = 74 constituiacutedo por Tris 01
M HisHCl 01 M Imidazol 0015 M e MgCl2 0005 M
bull MPI
Detectou-se a actividade enzimaacutetica de MPI pelo meacutetodo de sandwich apoacutes a sua
separaccedilatildeo electroforeacutetica em gel de amido
A soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo conteacutem manose-6-fosfato 42 mM NADP 13 mM MTT
24 mM e uma gota de azul de Meldola (05 pv em aacutegua bidestilada) dissolvidos num
tampatildeo de pH = 74 constituiacutedo por Tris 01 M HisHCl 01 M Imidazol 0015 M e MgCl2
0005 M Por fim adicionaram-se as enzimas isomerase da glucose-6-fosfato (GPI) 3 Uml e
desidrogenase da glucose-6-fosfato (G6PD) 5 Uml
bull ALBeTF
A detecccedilatildeo de ALB e de TF foi efectuada atraveacutes do meacutetodo de coloraccedilatildeo geral de
proteiacutenas descrito para a HB utilizando-se Coomasie R-250 sem fixaccedilatildeo
bull GCcedil
A visualizaccedilatildeo de GC efectuou-se por detecccedilatildeo imunoenzimaacutetica apoacutes transferecircncia da
proteiacutena para uma membrana de nitrocelulose (045 pm SCHLEICHER amp SCHULL)
segundo a teacutecnica descrita por FERRAND (1995)
37
Material e Meacutetodos
Apoacutes esse processo de transferecircncia as membranas de nitrocelulose foram lavadas 3
vezes (15 minutos) numa soluccedilatildeo de Tween 20 (MERCK) 0025 (vv) em soro fisioloacutegico
tamponado com fosfato (PBS Na2HP04 50 mM KH2P04 18mM NaCl 147 mM pH = 71) e
bloqueadas numa soluccedilatildeo de leite em poacute magro (5 pv em PBS) durante 18 h com agitaccedilatildeo
permanente e agrave temperatura ambiente
Depois da primeira lavagem aplicou-se o antisoro (anti-GC humana ATAB 81936)
diluiacutedo 1170 em PBS com 1 (pv) de albumina seacuterica bovina (SIGMA) durante 1 h agrave
temperatura ambiente
Repetiu-se novamente a lavagem segundo o processo jaacute referido seguindo-se a
aplicaccedilatildeo do segundo antisoro (anticorpos contra imunoglobulinas caprinas desenvolvidos em
coelho e conjugados com uma peroxidase ATAB 83806) diluiacutedo 1600 em PBS com 1
(pv) de albumina seacuterica bovina (SIGMA) durante 1 h agrave temperatura ambiente
Depois de duas lavagens (5 minutos) com Tween 20PBS procedeu-se agrave detecccedilatildeo da
GC com uma soluccedilatildeo de 9-amino-2-etilcarbazol 004 (pv) e de metanol 20 (vv) em PBS
As bandas correspondentes agrave actividade peroxidaacutesica aparecem rapidamente bloqueando-se a
reacccedilatildeo com aacutegua bidestilada
26 - MEacuteTODOS DE CAacuteLCULO
As frequecircncias geacutenicas foram calculadas por contagem directa de genes a partir da
distribuiccedilatildeo fenotiacutepica obtida
O caacutelculo dos valores de heterozigotia meacutedia (H) da proporccedilatildeo de loci polimoacuterficos
(P) do nuacutemero meacutedio de alelos por locus (ria) estatiacutesticas F e frequecircncias fenotiacutepicas
esperadas segundo o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg foi efectuado com a utilizaccedilatildeo do
programa BIOSYS versatildeo 17 (SWOFFORD amp SELANDER 1989)
O caacutelculo de distacircncias geneacuteticas e obtenccedilatildeo de dendrogramas foi efectuado com o
programa PHYLIP versatildeo 35 (FELSENTEIN 1993)
38
Resultados e Discussatildeo
3 - RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
31 - ANAacuteLISE DOS MEacuteTODOS DE SEPARACcedilAtildeO
De entre os 12 loci estudados neste trabalho detectaram-se 5 monomoacuterficos
(PEPB DIA GPI MDH e PGD) e 7 polimoacuterficos (HB CAII NP MPI ALB TF e GC)
Loci monomoacuterficos
bull PEPB
A utilizaccedilatildeo de teacutecnicas de electroforese em gel de amido permitiu a detecccedilatildeo de
um soacute fenoacutetipo (figura 311) correspondente a indiviacuteduos homozigoacuteticos para o alelo
PEPB2 descrito por DEL LAMA et ai (1992) No entanto na raccedila Minhota detectou-se
um indiviacuteduo heterozigoacutetico
O fenoacutetipo PEPB 2 apresenta um padratildeo com duas bandas uma de grande
intensidade e outra secundaacuteria mais anoacutedica de menor intensidade No indiviacuteduo
heterozigoacutetico 2-1 (natildeo representado) observou-se um padratildeo de trecircs bandas sendo a
terceira mais anoacutedica e menos intensa
A quase inexistecircncia de PEPB1 nas raccedilas estudadas estaacute de acordo com o referido
em DEL LAMA et ai (1992) que sugere a fixaccedilatildeo de PEPB2 na maior parte das
populaccedilotildees de bovinos de origem europeia (com excepccedilatildeo das raccedilas italianas Marchigiana
e Chianina)
39
Resultados e Discussatildeo
+
Figura 311 Fenoacutetipos de PEPB observados por electroforese convencional em gel de amido
bull DIA
Os resultados obtidos para a enzima DIA revelaram ausecircncia de polimorfismo
electroforeacutetico (figura 312) Resultados semelhantes foram tambeacutem obtidos em vaacuterias
raccedilas autoacutectones espanholas (GONZALEZ et ai 1987 IGLESIAS 1989 ARRANZ et ai
1992)
MAKAVEEV (1979 in IGLESIAS 1989) detectou polimorfismo desta enzima em
eritroacutecitos de buacutefalos da Bulgaacuteria e nas raccedilas bovinas Frisia e Simmental descrevendo dois
alelos codominantes DIAA e DIAB
Figura 312 Padratildeo de DIA observado por electroforese convencional em gel de amido
40
Resultados e Discussatildeo
Natildeo se detectou variaccedilatildeo electroforeacutetica para o locus GPI Estes resultados natildeo se
podem comparar com os obtidos noutras raccedilas por natildeo ter sido possiacutevel consultar outros
trabalhos onde se descrevesse variaccedilatildeo do locus GPI em gado bovino
A figura 313 apresenta o padratildeo obtido para esta enzima observando-se trecircs
bandas duas com grande intensidade e uma banda mais anoacutedica de menor intensidade
Figura 313 Padratildeo de GPI obtido em hemolisados por electroforese convencional em gel de amido
bull MDH
A enzima MDH revelou-se monomoacuterfiacuteca Este resultado eacute concordante com outros
estudos (ARRANZ et ai 1992)
Na figura 314 observa-se o padratildeo de bandas detectado por electroforese
convencional em gel de amido
Figura 314 Padratildeo de MDH observado por electroforese convencional em gel de amido
41
Resultados e Discussatildeo
bull PGD
A enzima PGD revelou-se monomoacuterfica para as raccedilas Barrosatilde e Minhota tambeacutem
neste caso natildeo se encontrou qualquer referecircncia bibliograacutefica relativa a um possiacutevel
polimorfismo deste locus em gado bovino
Na figura 315 observa-se o padratildeo obtido para esta enzima Em amostras
armazenadas por um longo periacuteodo de tempo detectaram-se duas bandas sendo a mais
anoacutedica a que revela menor intensidade as amostras mais recentes apresentam um padratildeo
electroforeacutetico com uma soacute banda
Figura 315 Padratildeo de PGD observado por electroforese convencional em gel de amido
Loci polimoacuterficos
bull HB
A electroforese convencional natildeo permite discriminar os electromorfos de HB No
entanto a utilizaccedilatildeo de sistemas de focagem isoeleacutectrica conduz agrave detecccedilatildeo de
polimorfismo nesta proteiacutena observando-se dois fenoacutetipos HB A e HB AB
Na figura 316 observa-se o padratildeo electroforeacutetico desta moleacutecula resultante da
expressatildeo de dois alelos codominantes HBA e HBB Resultados idecircnticos estatildeo
descritos em raccedilas bovinas da Peniacutensulas Ibeacuterica (VICENTE 1978 KiDD et ai 1980
IGLESIAS 1989)
42
Resultados e Discussatildeo
+ -HBB
HBA
AB AB A A
Figura 316 Separaccedilatildeo de hemoglobina nativa por focagem isoeleacutectrica
bull poundAH
A utilizaccedilatildeo de electroforese em gel de amido e focagem isoeleacutectrica permitiu
identificar trecircs fenoacutetipos CAII F CAII FS e CAII S atribuiacutedos agrave expressatildeo de dois alelos
codominantes CAF e CAS (figuras 317 e 318) Poreacutem a separaccedilatildeo por electroforese em
gel de amido implica alguma morosidade (tempos de corrida muito longos) e em amostras
coaguladas o erro de leitura pode ser superior a 20 Estas dificuldades satildeo minimizadas
quando se recorre a focagem isoeleacutectrica
Assim a separaccedilatildeo da enzima CAII por focagem isoeleacutectrica oferece vaacuterias vantagens
nomeadamente
bull rapidez e simplicidade de execuccedilatildeo
bull utilizaccedilatildeo de pequenas quantidades de material bioloacutegico
bull maior nuacutemero de amostras fenotipadas por corrida
bull possibilidade de utilizaccedilatildeo de amostras coaguladas
43
Resultados e Discussatildeo
F F F S FS FS F S FS
Figura 317 Fenoacutetipos de CAII observados sob luz ultravioleta apoacutes separaccedilatildeo por electroforese convencional em gel de amido e coloraccedilatildeo com diacetato de fluoresceina
CAIIF
| CAIIS
Figura 318 Fenoacutetipos de CAII observados por focagem isoeleacutectrica apoacutes coloraccedilatildeo geral de proteiacutenas
bull NP
A expressatildeo fenotiacutepica de NP resulta das combinaccedilotildees possiacuteveis entre um alelo
dominante NPH e um recessivo NPL (ANSAY 1973) Este facto implica que apenas em
presenccedila do feno tipo NP L eacute possiacutevel fazer corresponder um genoacutetipo (jaacute que o fenoacutetipo NP H
pode corresponder aos genoacutetipos HH e HL e o fenoacutetipo NP L corresponde ao genoacutetipo LL)
Na figura 319 apresenta-se o padratildeo obtido para a proteiacutena apoacutes separaccedilatildeo
electroforeacutetica em gel de amido
44
+
w
FS FS ]
Resultados e Discussatildeo
H L L H L L
Figura 319 Fenoacutetipos de NP detectados por electroforese convencional em gel de amido
bull MPI
Na raccedila Minhota detectaram-se quatro fenoacutetipos MPI AB MPI B MPI BC e MPI C
anteriormente descritos por ANSAY (1973) em bovinos na raccedila Barrosatilde apenas se observam
os trecircs uacuteltimos fenoacutetipos De acordo com o mesmo autor os fenoacutetipos encontrados nesta raccedila
resultam da combinaccedilatildeo de dois alelos codominantes MPIB e MPPC enquanto que MPIA
aparece na raccedila Minhota com uma frequecircncia reduzida
Como se pode observar pela anaacutelise da figura 3110 MPIA aparece como o alelo
mais anoacutedico MPIC como o mais catoacutedico e o alelo mais frequente MPIB situa-se numa
posiccedilatildeo intermeacutedia em relaccedilatildeo aos anteriores Contudo a intensidade das bandas eacute muito
fraca tornando-se quase imperceptiacutevel em alguns casos Esta grande dificuldade em obter um
contraste de bandas adequado mesmo apoacutes longos periacuteodos de incubaccedilatildeo a 37degC poderaacute
eventualmente levar a uma incorrecta interpretaccedilatildeo dos fenoacutetipos Assim a utilizaccedilatildeo de
sistemas de focagem isoeleacutectrica na determinaccedilatildeo destes fenoacutetipos seria aconselhaacutevel a fim
de verificar os resultados obtidos por electroforese convencional
45
Resultados e Discussatildeo
Figura 3110 Fenoacutetipos de MPI observados por electroforese convencional em gel de amido
bull ALB
A separaccedilatildeo por focagem isoeleacutectrica permitiu detectar polimorfismo em ALB Cada
indiviacuteduo homozigoacutetico aparece com trecircs bandas duas de maior intensidade e uma mais
aciacutedica com menor intensidade os indiviacuteduos heterozigoacuteticos podem apresentar ateacute seis
bandas
Esta heterogeneidade nos padrotildees de ALB tem sido interpretada como o resultado da
capacidade desta proteiacutena se ligar a vaacuterias substacircncias diferentes (FERRAND 1995) Com a
inclusatildeo de ureia (8M) na matriz de separaccedilatildeo reagente que provoca a desnaturaccedilatildeo da
proteiacutena levando a uma alteraccedilatildeo do seu pi para uma zona mais baacutesica do gradiente
conseguem-se obter padrotildees de bandas mais simples e mais definidos (KAWAGUCHI 1973
FERRAND 1995)
Na figura 3111 apresentam-se os padrotildees observados que foram interpretados como
sendo determinados por trecircs alelos codominantes ALBA ALBB e ALBV
GAHNE et ai (1977) e IGLESIAS (1989) detectaram por electroforese em gel de
poliacrilamida e de amido respectivamente dois variantes em gado bovino ALBA e
ALBB A utilizaccedilatildeo de focagem isoeleacutectrica veio confirmar a existecircncia destes dois alelos e
acrescentar um terceiro designado por ALBV com uma mobilidade mais aciacutedico do que
ALBA
46
Resultados e Discussatildeo
A B A B A B B B A B A G
Figura 3111 Fenoacutetipos de ALB determinados em amostras de plasma por focagem isoeleacutectrica na presenccedila de ureia 8M
ARRANZ et ai (1992) revelaram a existecircncia de um outro variante (ALBD) com
mobilidade electroforeacutetica intermeacutedia entre ALBA e ALBB ainda natildeo descrito em
nenhuma raccedila autoacutectone espanhola Este alelo poderaacute corresponder ao alelo ALBV
encontrado neste trabalho apesar de apresentar um pi mais aacutecidico do que ALBA (ARRANZ
comunicaccedilatildeo pessoal)
Desta forma a teacutecnica de separaccedilatildeo por focagem isoeleacutectrica provou ser eficaz na
separaccedilatildeo dos variantes de ALB tal como jaacute foi demonstrado no gato (BELL et ai 1994) na
ovelha (ERHARDT amp SIMIANER 1993) e no coelho (FERRAND amp ROCHA 1992)
bull TF
A transferrina eacute um dos marcadores mais importantes no estudo e caracterizaccedilatildeo
geneacutetica de raccedilas bovinas devido ao seu elevado polimorfismo No entanto a sua fenotipagem
natildeo eacute simples existindo frequentemente problemas de resoluccedilatildeo e de separaccedilatildeo das bandas
(IGLESIAS 1989)
A fim de averiguar qual a melhor forma de separar os diferentes produtos geacutenicos
descritos no locus TF testaram-se vaacuterios sistemas electroforeacuteticos em geacuteis de agarose numa
vasta gama de sistemas tampatildeo Esta teacutecnica natildeo ofereceu resultados satisfatoacuterios pelo que se
passou agrave separaccedilatildeo da TF por focagem isoeleacutectrica recorrendo a matrizes de poliacrilamida
47
Resultados e Discussatildeo
com diferentes concentraccedilotildees de ureia (6M e 8M) tambeacutem neste caso natildeo se conseguiram
resultados positivos
Este tipo de dificuldades encontradas na fenotipagem da TF por focagem isoeleacutectrica
tinham jaacute sido descritos noutras espeacutecies nomeadamente na cabra (ERHARDT 1986) e no
coelho (FERRAND 1995) No entanto TSUJI et ai (1989) demostraram ser possiacutevel fenotipar
esta proteiacutena em bovinos por focagem isoeleacutectrica sem grandes problemas e sem qualquer
aditivo na matriz de poliacrilamida
Desta forma a utilizaccedilatildeo de uma teacutecnica de focagem isoeleacutectrica com um gradiente de
pH 35-65 reforccedilado em 40-65 permitiu separar os produtos geacutenicos do locus TF Contudo
os padrotildees obtidos nem sempre eram definidos tornando-se dificilmente interpretaacuteveis
Na tentativa de melhorar os padrotildees de resoluccedilatildeo e de verificar se a variaccedilatildeo detectada
natildeo resultava de diferenccedilas no estado feacuterrico da moleacutecula de TF ou ainda da existecircncia de
aacutecidos siaacutelicos ligados agrave moleacutecula procedeu-se agrave sua separaccedilatildeo apoacutes vaacuterios tratamentos das
amostras
A remoccedilatildeo dos aacutecidos siaacutelicos atraveacutes do tratamento das amostras com neuraminidase
natildeo permitiu a obtenccedilatildeo de bandas definidas este tratamento natildeo altera significativamente o
padratildeo das bandas de TF de bovinos como jaacute tinha sido descrito por PENHALLOU et ai
(1991)
A obtenccedilatildeo de TF no estado apofeacuterrico foi conseguida submetendo as amostras a um
tratamento com EDTA-dissoacutedico Neste caso observa-se que apoTF apresenta uma
mobilidade menor e um padratildeo de bandas mais simples mas ainda sem uma definiccedilatildeo
adequada
A forma Fe2TF foi obtida mediante vaacuterios tratamentos com dadores de Fe (ver capiacutetulo
Material e Meacutetodos) Os resultados soacute se mostraram satisfatoacuterios atraveacutes da saturaccedilatildeo da
moleacutecula de TF com uma soluccedilatildeo de sulfato de amoacutenio feacuterrico provavelmente por causar uma
maior estabilidade da moleacutecula ao longo da sua separaccedilatildeo por focagem isoeleacutectrica com
elevadas voltagens pois segundo WELCHS (1990) a forma difeacuterrica da transferrina eacute mais
resistente agrave desnaturaccedilatildeo e ao calor do que a forma apoTF
48
Resultados e Discussatildeo
Estatildeo descritos pelo menos oito alelos no locus TF TFAl TFA2 TFB TFD1
TFD2 TFE TFF e TFG os mais comuns no gado europeu (Bos taurus) satildeo TFA
TFD1 TFD2 e TFE (JAMIESON 1965) No gado asiaacutetico e africano (Bos indicus) ocorrem
aleacutem das formas anteriores os alelos TFB e TFF
Na figura 3112 apresenta-se o proteinograma obtido com a utilizaccedilatildeo de amostras
saturadas com Fe Esta teacutecnica permitiu a separaccedilatildeo de TFD em TFD1 e TFD2 e a
detecccedilatildeo de todos os outros fenoacutetipos descritos em bovinos europeus Assim observaram-se
quatro alelos codominantes TFA TFD1 TFD2 e TFE
A expressatildeo fenotiacutepica dos alelos em homozigotia caracteriza-se pela presenccedila de dois
dupletos de bandas aparecendo a banda mais aciacutedica de cada dupleto com intensidade mais
fraca Os indiviacuteduos herozigoacuteticos podem apresentar ateacute oito bandas
Figura 3112 Fenoacutetipos de TF determinados por focagem isoeleacutectrica apartir de amostras saturadas com uma soluccedilatildeo de sulfato de amoacutenio feacuterrico
IGLESIAS (1989) detectou TFA e TFD nas cinco raccedilas de bovinos da Galiza o
variante TFE na raccedila Cachena espanhola e um outro variante raro TFR com mobilidade
mais lenta na raccedila Rubia Galega
bull QQ
A GC eacute uma proteiacutena plasmaacutetica que demonstra um elevado grau de heterogeneidade
geneacutetica em mamiacuteferos (FERRAND 1995)
A separaccedilatildeo de GC em focagem isoeleacutectrica seguida da utilizaccedilatildeo de immunoblotting
melhorou de forma consideraacutevel a capacidade de investigar a variaccedilatildeo desta proteiacutena em
49
Resultados e Discussatildeo
diferentes espeacutecies (JUNEJA et ai 1987 PENEDO amp JUNEJA 1989 STRATIL et ai 1990
KALAacuteB et ai 1990 STERN et ai 1992 VANKAN amp BELL 1992 FERRAND 1995)
Nas figuras 3113 e 3114 apresentam-se alguns dos fenoacutetipos obtidos na separaccedilatildeo
da GC por focagem isoeleacutectrica Verifica-se que em amostras tratadas com neuraminidase o
padratildeo de bandas se apresenta mais simplificado surgindo no entanto duas bandas (uma
mais baacutesica e uma mais aciacutedica) de natureza desconhecida Os padrotildees observados foram
interpretados como sendo determinados por dois alelos GCF e GCS
mdashGCF
S F S FS S FS F F S FS 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Figura 3113 Fenoacutetipos de GC determinados por focagem isoeleacutectrica amostras 1 8 9 e 10 tratadas com neuraminidase amostras 2 a 7 diluiacutedas em aacutegua bidestilada
S1 $ l S- -
FS S S S F S FS S FS F S
Figura 3114 Fenoacutetipos de GC determinados em amostras de plasma tratados com neuraminidase apoacutes focagem isoeleacutectrica
Nota-se a existecircncia de dois alelos codominantes GCF e GCS sendo o segundo
mais aciacutedico do que o primeiro
50
Resultados e Discussatildeo
32 - ANAacuteLISE FAMILIAR
A realizaccedilatildeo da anaacutelise familiar relativo ao conjunto de loci polimoacuterficos estudados
observa-se no estudo de 27 pares matildeefilho Esta situaccedilatildeo resulta da grande dificuldade
existente na obtenccedilatildeo de informaccedilatildeo sobre os machos
Os resultados apresentam-se nas tabelas 321 a 326 natildeo foi possiacutevel testar o
equiliacutebrio de Hardy-Weinberg devido ao reduzido tamanho da amostra bem como ao facto de
vaacuterios alelos ocorrerem em baixa frequecircncia
Refira-se que natildeo foi detectado qualquer caso de exclusatildeo matildeefilho
Tabela 321 Sistema CAII Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica em 27 pares matildeefilho Os valores esperados segundo o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg estatildeo indicados entre parecircntesis
Total
4 (32) 17
(122) 6
(116) 27
Tabela 322 Sistema NP Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica em 27 pares matildeefilho Os valores esperados segundo o equiliacutebrio de Hardy--Weinberg estatildeo indicados entre parecircntesis
Total
14
(114)
13
(156)
27
^ ^ ^ Filho
Matildee - ^ F
Fenoacutetipos
F f~ (11)
FS 2
(21)
S
Total 3
Fenoacutetipos
FS S
3
(21)
10 5
(61) (40)
1 5
(40) (76)
14 10
- v ^ ^ Filho Fenoacutetipos
Matildee - ^ H L
Fenoacutetipos
H 10 4
(77) (37)
L 5 8
(37) (119)
Total 15 12
51
Resultados e Discussatildeo
Tabela 323 Sistema MPI Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica em 26 pares matildeefilho Os valores esperados segundo o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg estatildeo indicados entre parecircntesis
^ Filho Fenoacutetipos Total
Matildee ^ ~ ^ A AB AC B BC c Fenoacutetipos
A 0 0 0 - - - 0
(00) (00) (00) (00)
AB 0 0 0 0 0 - 0
(00) (00) (00) (00) (00) (00)
AC 0 0 0 - 0 0 0
(00) (00) (00) (00) (00) (00)
B - 0 - 24 1 - 25
(00) (242) (06) (248)
BC - 0 0 1 0 0 1
(00) (00) (06) (06) (00) (12)
C - - 0 - 0 0 0
(00) (00) (00) (00)
Total 0 0 0 25 1 0 26
Tabela 324 Sistema ALB Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica em 27 pares matildeefilho Os valores esperados segundo o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg estatildeo indicados entre parecircntesis
^ ^ Filho Fenoacutetipos Total
M atilde e ^ ^ - s ^ ^ A AB AV B BV V
Fenoacutetipos
A 24 2 0 - - - 26
(251) (04) (02) (257)
AB 0 0 0 0 0 -
0
(04) (04) (00) (00) (00) (08)
AG 1 0 0 - 0 0 1
(02) (00) (02) (00) (00) (04)
B - 0 - 0 0 - 0
(00) (00) (00) (00)
BG - 0 0 0 0 0 0
(00) (00) (00) (00) (00) (00)
G - - 0 - 0 0 0
(00) (00) (00) (00)
Total 25 2 0 0 0 0 27
52
Resultados e Discussatildeo
Tabela 325 Sistema TF Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica em 27 pares matildeefilho Os valores esperados segundo o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg estatildeo indicados entre parecircntesis
Filho Fenoacutetipos Total
Matildee ^ A ADI AD2 AE Dl D1D2 DIE D2 D2E E
Fenoacutetipos
A 6
(51)
1
(14)
4
(21)
1
(03)
12
(89)
ADI 1 2 0 0 0 0 0 - - - 3
(14) (24) (06) (01) (04) (06) (01) (56)
AD2 2 0 5 0 - 0 - 2 0 - 9
(21) (06) (36) (01) (06) (08) (01) (79)
AE 0 0 0 0 - - 0 - 0 0 0
(03) (01) (01) (06) (01) (01) (00) (13) Dl 0
(04) 1
(01)
1
(02)
0
(00)
- 2
(07)
D1D2 - 0 1 - 0 0 0 0 0 - 1
(06) (06) (02) (10) (00) (02) (00) (26) DIE - 0 - 0 0 0 0 - 0 0 0
(01) (01) (00) (00) (02) (00) (00) (04)
D2 0
(08) 0
(02)
0
(03)
0
(01)
- 0
(14) D2E - - 0 0 - 0 0 0 0 0 0
(01) (01) (00) (00) (01) (02) (00) (05) E 0
(00) 0
(00)
0
(00)
0
(00)
0
(00)
Total 9 3 10 1 1 1 0 2 0 0 27
Tabela 326 Sistema GC Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica em 27 pares matildeefilho Os valores esperados segundo o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg estatildeo indicados entre parecircntesis
- - ^ F i l h o Fenoacutetipos Total
Matildee ^ ^ 1 2-1 2
Fenoacutetipos
1 17 2 19
(156) (31) (187)
2-1 5 2 0 7
(31) (38) (06) (75)
2 _ 1 0 1
(06) (01) (07)
Total 22 5 0 27
53
Resultados e Discussatildeo
33 - ANAacuteLISE POPULACIONAL LOCUS A LOCUS
Neste capiacutetulo faz-se a anaacutelise populacional dos loci polimoacuterficos e ainda dos loci
PEPB e DIA para os quais natildeo se detectou variaccedilatildeo na raccedila Barrosatilde A sua inclusatildeo justifica-
-se pelo facto de serem polimoacuterficos noutras raccedilas bovinas ou em espeacutecies aparentadas
bull PEPB
O locus PEPB revelou-se monomoacuterfico nas trecircs populaccedilotildees de bovinos de raccedila
Barrosatilde e Minhota tendo sido detectado um uacutenico produto geacutenico PEPB2 (observado um
indiviacuteduo heterozigoacutetico da raccedila Minhota) No entanto este locus eacute referido como polimoacuterfico
em raccedilas bovinas criadas no Brasil onde se detectaram dois alelos codominantes PEPB1 e
PEPB2 (DEL LAMA et ai 1992)
O alelo PEPB2 estaacute fixado nas raccedilas de origem europeia incluindo as estudadas neste
trabalho excepto nas raccedilas italianas Marchigiana e Chianina nas quais PEPB1 apresenta
frequecircncias geacutenicas entre 011 e 014 (tabela 331)
Tabela 331 Frequecircncias geacutenicas de PEPB em vaacuterias raccedilas bovinas
N
Frequecircncias geacutenicas N PEPB1 PEPB2 Referecircncia
Barrosatilde inscrita 141 - 100 Este trabalho
Barrosatilde natildeo inscrita 153 - 100 t i
Minhota 62 001 plusmn0003 099 plusmn 0003 ec
Blonde dAquitaine 13 - 100 DEL LAMAetal 1992)
Charolesa 118 - 100 laquo
Chianina 83 014 plusmn003 086 plusmn 003 t t
Hereford 79 - 100 et
Frisia 125 - 100 t t
Jersey 139 - 100
Limousine 24 - 100
Marchigiana 85 011 plusmn002 089 plusmn 002 te
Simmental 75 - 100 t t
54
Resultados e Discussatildeo
bull DIA
Pela anaacutelise da tabela 332 verifica-se natildeo existir variaccedilatildeo geneacutetica neste locus nas
raccedilas bovinas apresentadas estando fixado o alelo DIAS os resultados obtidos estatildeo de
acordo com os jaacute publicados por outros autores (GONZALEZ et ai 1987 IGLESIAS 1989) Por
outro lado nas populaccedilotildees de buacutefalos ocorre um segundo alelo DIAF com frequecircncias
entre 019 e 021
Tabela 332 Frequecircncias geacutenicas de DIA em vaacuterias populaccedilotildees de raccedilas bovinas e buacutefalos
Frequecircncias geacutenicas
N DIAF DIAS Referecircncia
Portugal
Barrosatilde inscrita 141
Barrosatilde natildeo inscrita 153
Minhota 62
Espanha
Cachena 71
Caldelana 60
Frieiresa 33
Limiana 39
Rubia Gallega 168
Vianesa 40
Sayaguesa (Zamora) 147
Morucha (Salamanca) 101
Alistana Sanabresa 157
Blanca Cacerena 62
Caacuterdena Andaluza 25
Asturiana de los Vallegraves 127
Asturiana de la Montana 106
Bulgaacuteria
Buacutefalo 122
Murrah (Buacutefalo) 51
raquo IGLESIAS (1989)
- 100 Este trabalho
- 100
- 100 a
- 100 IGLESIAS (1989)
- 100
- 100
- 100
- 100
- 100
- 100 GONZALEZ et al (19
- 100
- 100 st
- 100 st
- 100
- 100
- 100
019 + 00 081 plusmn00 MAKAVEEV(1984
021 plusmn00 079 plusmn 00 laquo
55
Resultados e Discussatildeo
bull HB
Os resultados obtidos no estudo de HB permitiram distinguir dois fenoacutetipos definidos
por dois alelos HBA e HBB (tabela 333)
Tabela 333 Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica de HB em populaccedilotildees das raccedilas Barrosatilde e Minhota Os valores esperados de acordo com o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg estatildeo indicados entre parecircntesis
Fenoacutetipos N HBA HBAB HBB
Barrosatilde inscrita 141 141
Barrosatilde natildeo inscrita 153 153
Minhota 62 56 6 0
(561) (58) (01)
As frequecircncias geacutenicas das raccedilas estudadas bem como outras jaacute publicadas referentes a
vaacuterias raccedilas bovinas europeias e a duas espeacutecies de buacutefalos encontram-se discriminadas na
tabela 334
A elevada frequecircncia do alelo HBA nas raccedilas estudadas (fixado na raccedila Barrosatilde)
situam-nas juntamente com outras raccedilas bovinas do centro e sul da Europa onde este alelo
ocorre com frequecircncias entre 080-098 (VICENTE 1978) Nas restantes raccedilas europeias
HBA ocorre com uma ampla margem de variaccedilatildeo (038 - 100) apresentando-se quase
sempre como o alelo mais frequente
No caso dos buacutefalos observa-se uma inversatildeo nos valores das frequecircncias geacutenicas
sendo o alelo HBB o mais frequente
A presenccedila de HBB nos bovinos europeus apesar de em baixa frequecircncia pode ser
indicativo de uma origem a partir de raccedilas asiaacuteticas ou africanas jaacute que eacute nestes continentes
que este alelo ocorre com frequecircncia mais elevadas as frequecircncias geacutenicas mais elevadas estatildeo
descritas no gado zebu da Aacutefrica (BRAEND 1971 VICENTE 1978)
56
Resultados e Discussatildeo
Tabela 334 Frequecircncias geacutenicas de HB em vaacuterias populaccedilotildees de raccedilas bovinas e buacutefalos
N
Frequecircncias geacutenicas
N HBA HBB Referecircncia
Portugal
Barrosatilde inscrita 141 100 - Este trabalho
Barrosatilde natildeo inscrita 153 100 -
Minhota 62 095 plusmn 002 005 plusmn 002
Mertolenga 147 093 plusmn 002 007 plusmn 002 KTOD et ai (1980)
Alentejana 155 096 plusmn 001 004 plusmn001 IacuteIacute
Mirandesa 107 099+001 001 plusmn001 NOBRE (S data)
Espanha
Cachena 71 091 + 002 009 plusmn 002 IGLESIAS (1989)
Caldelana 60 097 plusmn 002 003 plusmn 002
Frieiresa 33 095 plusmn 003 005 plusmn 003
Limiana 39 090 plusmn 003 010 plusmn003
Rubia Gallega 168 093 plusmn 001 007 plusmn001 ce
Vianesa 40 098 plusmn 002 002 plusmn002
Sayaguesa (Zamora) 147 083 plusmn002 017 plusmn002 GONZALEZ et al ( 1987)
Morucha (Salamanca) 101 084 plusmn 003 016 plusmn003 ce
Alistana Sanabresa 157 099 plusmn 001 001 plusmn001
Blanca Cacerefia 62 071 plusmn 004 029 plusmn 004 laquo
Caacuterdena Andaluza 25 096 plusmn 003 004 plusmn 003 IacuteIacute
Asturiana de los Vallegraves 127 091 plusmn002 009 plusmn002
Pirenaica 383 084 plusmn 001 016 plusmn001 VICENTE (1978)
Tudanca 42 065 plusmn 005 035 plusmn 005 laquo
Morena del N O 25 100 -
Frisona 97 100 - laquo
Asturiana de la Montaria 106 079+003 021 plusmn003
De Lidia 124 079 plusmn 003 021 plusmn003 KlDDeacutetal (1980)
Retinta 164 081 plusmn002 019 plusmn002
Itaacutelia
Chianina 264 096 plusmn 001 004 plusmn 001 CARENZiera (1970)
Marchigiana 112 099 plusmn001 001 plusmn001
Bulgaacuteria
Sofia Brown 173 089 plusmn 002 011 plusmn002 MAKAVEEV (1970)
Buacutefalo 77 009 plusmn 002 091 plusmn002 MAKAVEEV(1984)
Murrah (Buacutefalo) 51 015 plusmn004 085 plusmn 004 ce
G Bretanha
Jersey 467 038 plusmn 002 062 plusmn 002 LARSENefa (1974)
in IGLESIAS (1989)
57
Resultados e Discussatildeo
A frequecircncia obtida para HBB na raccedila Minhota (005) aproxima-a das raccedilas do sul da
Europa onde este alelo ocorre com uma frequecircncia de aproximadamente 01 Por outro lado a
completa ausecircncia de HBB na raccedila Barrosatilde eacute um resultado interessante mas para o qual natildeo
eacute possiacutevel fornecer actualmente uma explicaccedilatildeo satisfatoacuteria
CAII
A distribuiccedilatildeo dos fenoacutetipos observados para o locus CAII apresenta-se na tabela
335
Tabela 335 Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica de CAU em populaccedilotildees das raccedilas Barrosatilde e Minhota Entre parecircntesis indicam-se os valores esperados de acordo com o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg
Fenoacutetipos N CA F CAFS CAS
Barrosatilde inscrita 141 17 58 66
(149) (622) (639)
Barrosatilde natildeo inscrita 153 20 71 62
(200) (710) (620)
Minhota 62 3 13 46
(14) (162) (444)
x2
0651 1 0420
0000 1 0995
Os valores do teste de 2 nas populaccedilotildees de raccedila Barrosatilde demonstram natildeo haver
desvios significativos ao equiliacutebrio de Hardy-Weinberg apesar de se observar um ligeiro
excesso de homozigoacuteticos F na populaccedilatildeo de raccedila Barrosatilde (inscrita) Para a raccedila Minhota natildeo
foi possiacutevel testar o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg
Na tabela 336 apresentam-se as frequecircncias geacutenicas de CAII nas populaccedilotildees
estudadas bem como as publicadas por outros autores
O locus CAII apresenta-se polimoacuterfico na maior parte das populaccedilotildees bovinas
europeias sendo o alelo CAIIS o que ocorre com frequecircncia mais elevada
58
Resultados e Discussatildeo
Tabela 336 Frequecircncias geacutemeas de CAU em vaacuterias populaccedilotildees de raccedilas bovinas e de buacutefalos
N
Frequecircncias geacutenicas N CAS CAF Referecircncia
Portugal
Barrosatilde inscrita 141 068 plusmn 003 032 plusmn 003 Este trabalho
Barrosatilde natildeo inscrita 153 064+003 036 plusmn 003
Minhota 62 085 plusmn 003 015+003 Iacute Iacute
Mertolenga 147 085 plusmn 002 015+002 Kn)Deiacutea(1980)
Alentejana 155 091 plusmn 002 009 plusmn 002
Mirandesa 107 099 + 001 001+001 NOBRE (S data)
Espanha
Cachena 71 077 + 004 023 plusmn 004 IGLESIAS (1989)
Caldelana 60 096 plusmn 002 004 plusmn 002 ce
Frieiresa 33 094 + 003 006 plusmn 003
Limiana 39 083 + 004 017 plusmn 004
Rubia Gallega 168 089 plusmn 002 011+002
Vianesa 40 086 + 004 014 plusmn 004
Sayaguesa 147 072 plusmn 003 028+003 GONZALEZ eacutetal (1987)
Morucha 101 072 plusmn 003 028 plusmn 003 a
Alistana Sanabresa 157 092 plusmn 002 008+002 iacute iacute
Blanca Cacerena 62 067 plusmn 004 033 plusmn 004 IacuteIacute
Caacuterdena Andaluza 25 100
Asturiana de los Vallegraves 127 087 plusmn 002 013+002 laquo
Asturiana de la Montaria 106 077 plusmn003 023 plusmn 003 IacuteIacute
Tudanca 42 076 plusmn 005 024 plusmn 005 VICENTE (1978)
Morena del NO 25 092 plusmn 004 008 plusmn 004
De Lidia 124 061+003 039 plusmn 003 KjDDetal (1980)
Retinta 164 065 + 003 035+003 iacuteiacute
Bulgaacuteria
Buacutefalo 263 007 + 001 093+001 MAKAVEEV(1984)
Murran (Buacutefalo) 51 020 plusmn 004 080 plusmn 004 laquo
Alemanha
Frisia 550 083 plusmn 001 017 + 001 THTNNES eacutetal (1976)
Suiacuteccedila
Simmental 1039 079 + 001 021+001 KAgraveSTLIeacutetal (1980)
Castanha Suiacuteccedila 546 087 plusmn 001 013+001
Friburg 223 084 + 002 016+002
in IGLESIAS (1989)
59
Resultados e Discussatildeo
As frequecircncias aleacutelicas de CAIPS e CAIPF nas raccedilas Cachena espanhola e Barrosatilde
portuguesa satildeo idecircnticas o que poderaacute eventualmente indicar estar-se em presenccedila de uma soacute
raccedila com designaccedilotildees diferentes nos dois paiacuteses Esta hipoacutetese eacute reforccedilada pelo facto de natildeo
haver diferenccedilas significativas entre dados morfomeacutetricos obtidos nas duas raccedilas (LEAL 1995)
Nos buacutefalos observa-se mais uma vez uma inversatildeo nas frequecircncias dos dois alelos do
locus CAII em relaccedilatildeo aos bovinos sendo CAF o mais frequente com valores situados entre
080 e 093
bull NP
Pela anaacutelise das tabelas 337 e 338 verifiacuteca-se a presenccedila dos dois alelos descritos
neste locus nas vaacuterias raccedilas bovinas sendo NPL o mais frequente nas raccedilas europeias (052 e
099) Observa-se uma grande similaridade entre os valores das frequecircncias geacutenicas o que natildeo
permite diferenciar as raccedilas estudadas neste trabalho das restantes
Tabela 337 Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica de NP em populaccedilotildees das raccedilas Barrosatilde e Minhota
N
Fenoacutetipos
N NP H NPL
Barrosatilde inscrita 141 69 72
Barrosatilde natildeo inscrita 153 55 98
Minhota 62 19 43
60
Resultados e Discussatildeo
Tabela 338 Frequecircncias geacutenicas para NP em vaacuterias populaccedilotildees e raccedilas bovinas
N
Frequecircncias geacutenicas
N NPH NPL Referecircncia
Portugal
Barrosatilde inscrita 141 029 plusmn 003 071 plusmn 003 Este trabalho
Barrosatilde natildeo inscrita 153 020 plusmn 002 080 plusmn 002 cc
Minhota 62 017 + 004 083 + 004
Espanha
Cachena 71 020 plusmn 003 080 plusmn 003 IGLESIAS (1989)
Caldelana 60 013+003 087 plusmn 003 t t
Frieiresa 33 011+004 089 plusmn 004
Limiana 39 008 plusmn 003 092 plusmn 003
Rubia Gallega 168 015+002 085 plusmn 002
Vianesa 40 013 + 004 087 plusmn 004 t i
Sayaguesa 147 014 + 002 086 plusmn 002 GONZALEZ et ai ( 1987)
Morucha 101 020 plusmn 003 080 plusmn 003
Alistana Sanabresa 157 001+001 099 + 001
Blanca Cacerena 62 048 plusmn 005 052 plusmn 005 laquo
Caacuterdena Andaluza 25 004 plusmn 003 096 plusmn 003 IacuteIacute
Asturiana de los Vallegraves 127 028 plusmn 003 072 plusmn 003
Asturiana de la Montana 106 026 plusmn 003 074 plusmn 003
Beacutelgica
Charolesa 130 026 plusmn 003 074 + 003 ANSAY amp HANSET (1972)
Frisia 91 006 plusmn 002 094 plusmn 002 t t
in IGLESIAS (1989)
MPI
A distribuiccedilatildeo dos fenoacutetipos observados para o locus MPI apresenta-se na tabela 339
Das trecircs populaccedilotildees estudadas apenas a raccedila Minhota apresenta valores observados
proacuteximos dos valores esperados segundo o formalismo de Hardy-Weinberg Por outro lado
apesar de natildeo ter sido possiacutevel testar o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg nas restantes populaccedilotildees
a aparente diferenccedila entre valores observados e esperados poderaacute dever-se a um excesso de
indiviacuteduos homozigoacuteticos para MPIC Este resultado poderaacute estar relacionado com o
processo de amostragem ou com outras causas como o acasalamento entre indiviacuteduos
61
Resultados e Discussatildeo
aparentados a existecircncia de sub-populaccedilotildees de tamanho pequeno ou ainda a um reduzido
nuacutemero de machos reprodutores
Tabela 339 Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica de MPI em populaccedilotildees das raccedilas Barrosatilde e Minhota Entre parecircntesis indicam-se os valores esperados de acordo com o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg
Fenoacutetipos N MPIA MPIAB MPIAC MPIB MPIBC MPIC
Barrosatilde inscrita 138 - - - 131 6 1
(1301) (78) (01)
Barrosatilde natildeo inscrita 1 5 2 - - - 147 4 1
(1460) (59) (01)
Minhota 61 0 3 0 56 2 0
(00) (29) (01) (561) (19) (00)
A anaacutelise da tabela 3310 permite verificar que MPIB e MPIC ocorrem nas duas
raccedilas de bovinos estudadas sendo MPIB o alelo mais comum nas trecircs populaccedilotildees A
ocorrecircncia de MPI A na raccedila Minhota contraria o descrito por ANSAY (1973) quando afirma
a exclusividade do fenoacutetipo AB na raccedila Charolesa
Tabela 3310 Frequecircncias geacutenicas de MPI nas populaccedilotildees estudadas
N
Frequecircncias geacutenicas
N MPPA MPPB MPIC
Barrosatilde inscrita 138 - 097 + 001 003+001
Barrosatilde natildeo inscrita 152 - 098 + 001 002+001
Minhota 61 002 plusmn 001 096 plusmn002 002 plusmn 001
A informaccedilatildeo disponiacutevel sobre este marcador em anteriores trabalhos de anaacutelise
geneacutetica em bovinos eacute quase inexistente Tal poderaacute dever-se agraves dificuldades de visualizaccedilatildeo
encontradas na sua fenotipagem por electroforese convencional A detecccedilatildeo de MPI estaacute
descrita em tecidos musculares e em leucoacutecitos neste trabalho utilizaram-se eritroacutecitos para o
estudo de variaccedilatildeo geneacutetica desta proteiacutena mas eacute provaacutevel que a sua expressatildeo ocorra apenas
na fracccedilatildeo leucocitaacuteria (natildeo separada) o que explicaria precisamente a sua fraca actividade
62
Resultados e Discussatildeo
ALB
A distribuiccedilatildeo dos fenoacutetipos observados para o locus ALB apresenta-se na tabela
3311
Apesar de natildeo ter sido possiacutevel testar o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg todas as
amostras estudadas mostram desvios muito reduzidos entre valores observados e esperados
Tabela 3311 Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica de ALB em populaccedilotildees das raccedilas Barrosatilde e Minhota Entre parecircntesis indicam-se os valores esperados de acordo com o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg
N
Fenoacutetipos N ALBA ALBAB ALBB ALBBV ALBAV ALB V
Barrosatilde inscrita 142 137 3 - - 2 -(1370) (30) (00) (00) (20) (00)
Barrosatilde natildeo inscrita 153 145 5 1 - 2 -(1440) (68) (01) (01) (20) (00)
Minhota 62 59
(590)
3 (30) (00)
Na tabela 3312 estatildeo discriminadas as frequecircncias geacutenicas estimadas para as
populaccedilotildees estudadas bem como as de outras populaccedilotildees de bovinos da Europa e de buacutefalos
da Bulgaacuteria
Verifica-se que ALBA eacute o alelo mais comum encontrando-se aparentemente fixado
em vaacuterias raccedilas bovinas de origem europeia
Como jaacute referido para HB a presenccedila de ALBB nas raccedilas europeias parece
relacionar-se com a sua localizaccedilatildeo geograacutefica verificando-se que de uma maneira geral a sua
frequecircncia aumenta agrave medida que nos aproximamos do sul da Europa e de Aacutefrica eacute no gado
zebu africano que este alelo ocorre com frequecircncias mais elevadas variando entre 030 e 060
(VICENTE 1978) Assim a presenccedila de ALBB no gado europeu poderaacute indicar a passagem
pela Europa de bovinos oriundos de Aacutefrica (CECCHINI amp Nus 1986) Eacute de notar que apenas a
raccedila Minhota e algumas das restantes raccedilas da Peniacutensula Ibeacuterica natildeo apresentam ALBB
63
Resultados e Discussatildeo
Tabela 3312 Frequecircncias geacutenicas de ALB em vaacuterias populaccedilotildees de raccedilas bovinas e em buacutefalos
Frequecircncias geacutenicas
N ALBA (F) ALBB (S) ALBV Referecircncia
Portugal
Barrosatilde inscrita 142 098 + 001 001 plusmn 001 001 plusmn001 Este trabalho
Barrosatilde natildeo inscrita 153 097 + 001 002+001 001 plusmn001
Minhota 62 098 plusmn 001 - 002 plusmn 001
Mertolenga 147 084 plusmn 002 016 + 002 - KlDDetal (1980)
Alentejana 155 094+001 006 plusmn 001 -
Mirandesa 106 094 + 002 006 plusmn 002 - NOBRE (S data)
Espanha -
Cachena 71 098 + 001 002+001 - IGLESIAS (1989)
Caldelana 60 098 plusmn 001 002 + 001 -
Frieiresa 33 100 - - raquo
Limiana 39 097 + 002 003 plusmn 002 -
Rubia Gallega 201 099 plusmn 000 001 plusmn000 -
Vianesa 40 093 + 003 007 + 003 -
Sayaguesa 147 096 plusmn001 004 plusmn 001 - GONZALEZ et al (1987)
Moracha 101 089 plusmn 002 011+002 -
Alistaria Sanabresa 157 090 plusmn 002 010 plusmn002 -
Blanca Cacerena 62 056 plusmn 005 044 plusmn 005 -
Caacuterdena Andaluza 25 100 - -
Asturiana de los Vallegraves 127 099 + 001 001 plusmn001 -
Asturiana de la Montana 106 099 plusmn001 001 plusmn001 -
Pirenaica 265 092 + 001 008 plusmn001 - VICENTE (1978)
Tudanca 42 100 - -
Morena del N O 25 092 + 004 008 plusmn 004 -
Frisona 97 100 - -
De Lidia 124 100 - - KIDDeacutetal (1980)
Retinta 164 097 + 001 003 plusmn001 -
Itaacutelia
Chinina 264 089 + 001 011 plusmn001 - CARENZIeacutetal (1970)
Marchigiana 124 074 + 003 026 plusmn 003 -
Beacutelgica
Pied vermelha Este-Flandern 503 100 - - BOUQUET amp VAN de WEGHE (1972)
Vermelha Oeste-Flandern 155 100 - -
Pied preta 174 100 - -
Pied vermelha-Campine 265 100 - -
w IGLESIAS (1989)
(Continua)
64
Resultados e Discussatildeo
Tabela 3312 Frequecircncias geacutenicas de ALB em vaacuterias populaccedilotildees de raccedilas bovinas e de buacutefalos (continuaccedilatildeo)
Frequecircncias geacutenicas N ALBA (F) ALBB (S) ALBV Referecircncia
Bulgaacuteria
Sofia Brow 170 096+001 004 + 001 - M A K A V E E V ( 1 9 7 0 )
Buacutefalo 225 047 plusmn 002 053 plusmn 002 - M A K A V E E V ( 1 9 8 4 )
Murrah (Buacutefalo) 76 012+003 088 plusmn 003 -
G Bretanha
Charolesa 99 084 plusmn 003 016 + 003 - SPOONER amp OLIVER (1969)
Frisia 1422 100 - -
Hereford 215 099 plusmn 001 001+001 -
Jersey 217 100 - -
laquo IGLESIAS (1989)
Neste trabalho descreve-se tambeacutem o alelo ALBV com uma frequecircncia de 001 e
002 nas raccedilas Barrosatilde e Minhota respectivamente Este alelo natildeo se encontra descrito em
qualquer raccedila europeia podendo a sua detecccedilatildeo estar relacionada com a capacidade resolvente
da teacutecnica de focagem isoeleacutectrica utilizada na separaccedilatildeo de ALB
TF
A transferrina eacute provavelmente o mais informativo dos sistemas polimoacuterficos estudados
em virtude do nuacutemero de alelos que apresenta
A distribuiccedilatildeo dos fenoacutetipos observados para o locus TF apresenta-se na tabela 3313
E possiacutevel verificar a existecircncia de equiliacutebrio de Hardy-Weinberg em todas as populaccedilotildees
estudadas
Da anaacutelise das frequecircncias geacutenicas expressas na tabela 3314 verifica-se que este locus
apresenta quatro produtos geacutenicos na maioria das raccedilas europeias sendo os alelos TFA e
TFD (incluindo os subtipos TFD1 e TFD2) os que apresentam frequecircncias mais elevadas
(027 a 092 para o alelo TFA e 026 a 073 para o alelo TFD)
Observa-se tambeacutem que a frequecircncia de TFD2 nas raccedilas estudadas eacute mais elevada do
que a de TFD1 como ocorre na maioria das raccedilas ibeacutericas
65
Resultados e Discussatildeo
No que se refere a TFE verifica-se que a sua frequecircncia eacute relativamente baixa nas
raccedilas europeias (001 e 022) e estaacute mesmo ausente em quase todas as raccedilas da regiatildeo da
Galiza (com excepccedilatildeo da raccedila Cachena espanhola e Rubia Gallega) e na raccedila Minhota Note-se
a grande semelhanccedila entre os valores de frequecircncias geacutenicas deste alelo na raccedila Cachena
espanhola (005) e nas populaccedilotildees de raccedila Barrosatilde (004 e 003) o que mais uma vez sugere
uma grande proximidade entre as duas Apesar de ocorrer em baixa frequecircncia nos bovinos
europeus a presenccedila de TFE nestas raccedilas pode indicar uma proveniecircncia asiaacutetica ou africana
pois eacute nestes continentes que aquele alelo eacute mais comum (BRAEND 1971)
66
Resultados e Discussatildeo
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Resultados e Discussatildeo
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Resultados e Discussatildeo
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69
Resultados e Discussatildeo
bull GC
A distribuiccedilatildeo dos fenoacutetipos observados para o locus GC apresenta-se na tabela 3315
A sua anaacutelise permite verificar a existecircncia de diferenccedilas entre os valores observados e
esperados para raccedila Barrosatilde (populaccedilatildeo inscrita no Livro Genealoacutegico) Este desvio ao
equiliacutebrio de Hardy-Weinberg deve-se agrave existecircncia de um excesso de homozigoacuteticos
sugerindo assim a ocorrecircncia de uma possiacutevel subestruturaccedilatildeo na populaccedilatildeo
Nas restantes amostras estudadas natildeo foi possiacutevel aplicar o teste de Contudo a
diferenccedila entre valores observados e esperados de acordo com o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg
eacute praticamente inexistente na populaccedilatildeo Barrosatilde natildeo inscrita e pouco acentuada na raccedila
Minhota
Tabela 3315 Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica de GC em populaccedilotildees das raccedilas Barrosatilde e Minhota Entre parecircntesis indicam-se os valores esperados de acordo com o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg
Fenoacutetipos N GCS GCFS GCF
Barrosatilde inscrita 142 98 35 8
(945) (419) (45)
Barrosatilde natildeo inscrita 153 109 40 4
(1087) (406) (37)
Minhota 62 54 5 3
(514) (101) (04)
x2
3913 1 0048
A distribuiccedilatildeo das frequecircncias geacutenicas apresentada na tabela 3316 mostra que GCS eacute
o alelo mais comum nas raccedilas europeias (com excepccedilatildeo da raccedila Frisia da Sueacutecia) As raccedilas
estudadas neste trabalho tecircm frequecircncias aleacutelicas para este locus que as aproximam das raccedilas
espanholas
70
Resultados e Discussatildeo
Tabela 3316 Frequecircncias geacutenicas de GC em vaacuterias populaccedilotildees de raccedilas bovinas
Frequecircncias geacutenicas
N GCF(ouA) GCS(ouB) GCC Referecircncia
Portugal
Barrosatilde inscrita
Barrosatilde natildeo inscrita
Minhota
Alentejana
Mirandesa
Espanha
De Lidia
Frisona
Beacutelgica
Branca e azul
Flemish vermelha
Campine vermelha e branca
Preta e branca
Flemish branca e vermelha
Sueacutecia
Vermelha e Branca
Frisia
141 018 plusmn0023
153 016 plusmn002
62 009 plusmn 003
028 plusmn 004
97 020 plusmn 003
1306 008 plusmn001
124 015 plusmn002
2323 031 plusmn001
431 016 plusmn001
299 012 plusmn001
299 019 plusmn002
140 006 plusmn 001
1030 039 plusmn001
273 079 plusmn 002
082 plusmn 002
084 plusmn 002
091 plusmn003
072 plusmn 004
080 plusmn 003
092 plusmn 001
085 plusmn 002
069 plusmn 001
084 plusmn 001
088 plusmn 001
081 plusmn002
065 plusmn 003
061 plusmn001
021 plusmn002
029 plusmn 003
Este trabalho
CUNHA (1994)
NOBRE (S data)
PIEDRAFUA et ai (1984)
VAN de WEGHE et ai (1982)
GAHNE(1963)
in PIEDRAFUA et ai (1984)
71
Resultados e Discussatildeo
34 - ANAacuteLISE POPULACIONAL CONJUNTA
341 - Diversidade geneacutetica na raccedila Barrosatilde
As estimativas da variabilidade geneacutetica das populaccedilotildees de bovinos das raccedilas Barrosatilde e
Minhota efectuaram-se considerando apenas 6 loci polimoacuterficos HB CAII MPI ALB TF e
GC
Tabela 341 Estimativa da variabilidade geneacutetica (6 loci) atraveacutes dos valores de heterozigotia observada (Ho) e esperada (He) nas populaccedilotildees estudadas
Barrosatilde inscrita Barrosatilde natildeo inscrita Minhota Locus
Ho He Ho He Ho He
HB 0000 0000 0000 0000 0097 0093
CAH 0411 0441 0464 0464 0210 0262
MPI 0043 0056 0026 0039 0082 0080
ALB 0035 0035 0046 0058 0048 0048
TF 0603 0590 0556 0595 0694 0638
GC 0248 0297 0261 0265 0081 0163
Os resultados expressos na tabela 341 mostram em geral a ausecircncia de diferenccedilas
significativas entre os valores de heterozigotia observada (Ho) e heterozigotia esperada (He)
para os loci estudados Deve contudo notar-se que na raccedila Minhota e quanto ao locus GC o
valor de He eacute aproximadamente o dobro da Ho Nos restantes loci o ligeiro desvio observado
entre Ho e He sugere em geral um deacutefice de heterozigoacuteticos
Nas duas populaccedilotildees de raccedila Barrosatilde os sistemas TF e CAII satildeo os que apresentam
valores de heterozigotia mais elevados Pelo contraacuterio os loci MPI e ALB mostram valores de
heterozigotia baixos possivelmente devido ao excesso de homozigoacuteticos (MPI B e ALB A)
detectados nas trecircs populaccedilotildees
Na tabela 342 apresentam-se os valores do nuacutemero meacutedio de alelos por locus (ria)
percentagem de loci polimoacuterficos (P) heterozigotia meacutedia observada (Ho) e heterozigotia
esperada (He) nas populaccedilotildees de bovinos estudados Estes valores devem ser interpretados
72
Resultados e Discussatildeo
tendo em conta o facto de os 6 loci investigados serem polimoacuterficos em pelo menos uma
populaccedilatildeo
Tabela 342 Variabilidade geneacutetica detectada em trecircs populaccedilotildees de bovinos atraveacutes da anaacutelise de 6 loci polimoacuterficos N - efectivo meacutedio estudado por locus na - nuacutemero meacutedio de alelos por locus P - proporccedilatildeo de loci polimoacuterficos Ho - heterozigotia observada He - heterozigotia meacutedia esperada Entre parecircntesis indicam-se os valores do desvio padratildeo
Raccedila Populaccedilatildeo N na P Ho He
Barrosatilde inscrita 1407 233 833 0223 0237
(06) (042) (0100) (0100)
Barrosatilde natildeo inscrita 1528 233 833 0226 0237
(02) (042) (0098) (0101)
Minhota 618 233 1000 0202 0214
(02) (021) (0101) (0090)
A sua anaacutelise permite verificar em primeiro lugar a ocorrecircncia de uma grande
semelhanccedila entre os valores de H nas duas raccedilas estudadas Barrosatilde e Minhota revelando a
existecircncia de uma variabilidade geneacutetica idecircntica nas trecircs populaccedilotildees de bovinos Observa-se
tambeacutem que os valores de heterozigotia meacutedia observada (Ho) natildeo diferem significativamente
dos valores de heterozigotia esperados (He) nas trecircs populaccedilotildees sendo o valor mais elevado o
encontrado na populaccedilatildeo de raccedila Barrosatilde (237)
Os elevados valores de P (833 na raccedila Barrosatilde e 100 na raccedila Minhota) resultam
do facto de apenas se terem utilizado loci polimoacuterficos nesta anaacutelise e o nuacutemero meacutedio de
alelos por locus (na) eacute igual nas trecircs populaccedilotildees estudadas (233)
A tabela 343 apresenta estimativas de FB Frr e FST para as trecircs populaccedilotildees de
bovinos Os valores de Fis indicam a existecircncia de uma acentuada deficiecircncia de
heterozigoacuteticos nos loci MPI e GC Nos restantes loci verifica-se por um lado a tendecircncia
para um excesso de heterozigoacuteticos nos loci HB e TF (com valores de -0051 e -0021
respectivamente) e por outro lado para uma ligeira deficiecircncia de heterozigoacuteticos nos loci
CAII e ALB (com valores de 0066 e 0072 respectivamente) A meacutedia ponderada de FiS
mostra uma deficiecircncia de heterozigoacuteticos de 48
73
Resultados e Discussatildeo
Tabela 343 Distribuiccedilatildeo relativa da diversidade geneacutetica nas trecircs populaccedilotildees de bovinos Hs-heterozigotia intrapopulacional HT-heterozigotia total Valores das estatiacutesticas F para 6 loci analisados
Locus H s Hx Fis FIT FST
HB 0030 0031 -0051 -0016 0033
CAII 0387 0404 0066 0104 0041
MPI 0058 0059 0130 0133 0004
ALB 0046 0047 0072 0075 0004
TF 0605 0627 -0021 0015 0036
GC 0241 0244 0183 0193 0012
Meacutedia 0228 0235 0048 0078 0031
As estimativas de FST indicam a existecircncia de um baixo grau de diferenciaccedilatildeo
populacional nos bovinos estudados Os valores de FST para os 6 loci analisados podem
considerar-se baixos (entre 0004 e 0041) apresentando uma meacutedia ponderada de 0031
Assim soacute uma pequena parte da diversidade geneacutetica (31) se deve a diferenccedilas entre as
populaccedilotildees sendo muito maior a diversidade dentro de cada populaccedilatildeo do que entre as
populaccedilotildees
Os baixos valores de FST encontrados para os loci MPI e ALB resultam de frequecircncias
elevadas de MPIB e ALBA respectivamente e traduzem uma grande homogeneidade entre
as raccedilas bovinas estudadas natildeo se detectando subestruturaccedilatildeo populacional
342 - Comparaccedilatildeo com outras raccedilas ibeacutericas
Tendo em conta o pequeno nuacutemero de loci comuns a este e a outros estudos
estimaram-se diferentes valores de heterozigotia meacutedia consoante o nuacutemero de loci de que se
dispunha Na tabela 344 e 345 apresentam-se valores de heterozigotia meacutedia para as
diferentes raccedilas obtidos a partir de quatro (FF) e cinco loci (FF+) respectivamente bem como
os valores de na P e os respectivos desvios padratildeo em vaacuterias raccedilas de bovinos ibeacutericos
A diversidade geneacutetica do bovino Barrosatilde avaliada pela taxa meacutedia de heterozigotia
(0281-0272 e 0249-0260 para 5 e 4 loci respectivamente) parece ocupar uma posiccedilatildeo
74
Resultados e Discussatildeo
intermeacutedia no seio das raccedilas ibeacutericas Tambeacutem o grau de variabilidade geneacutetica nos bovinos
avaliado por paracircmetros como o nuacutemero meacutedio de alelos por locus e a proporccedilatildeo de loci
polimoacuterficos (P) demonstra que as raccedilas estudadas neste trabalho ocupam uma posiccedilatildeo
intermeacutedia quando comparadas com outras raccedilas ibeacutericas
A anaacutelise das tabelas 344 e 345 mostra que todas as medidas de diversidade geneacutetica
(H P e de na) apresentam valores idecircnticos Esta semelhanccedila permite supor que o processo de
domesticaccedilatildeo iniciado haacute menos de 10000 anos natildeo levou a uma grande diferenciaccedilatildeo
geneacutetica entre as raccedilas pelo menos relativamente aos marcadores geneacuteticos estudados neste
trabalho Desta forma verifica-se que as principais diferenccedilas entre as raccedilas resultam de
pequenas alteraccedilotildees das suas frequecircncias geacutenicas provavelmente causadas pelo baixo nuacutemero
de animais destinados agrave reproduccedilatildeo (mais marcado nos machos) e pelos cruzamentos dirigidos
em cada raccedila
Por outro lado este baixo niacutevel de diferenciaccedilatildeo geneacutetica deveraacute estar tambeacutem
associado ao facto de na origem das raccedilas bovinas ibeacutericas se encontrar um uacutenico processo de
domesticaccedilatildeo seguido provavelmente de um processo de expansatildeo populacional bastante
recente do Proacuteximo Oriente ateacute agrave Europa Adicionalmente estima-se que a diferenciaccedilatildeo dos
bovinos em raccedilas autoacutectones soacute teraacute ocorrido nos uacuteltimos 300 anos (LOFTUS et ai 1994)
Neste contexto os eventuais estrangulamentos do efectivo populacional (bottleneck)
e efeitos de fundador ocorridos durante o periacuteodo inicial da domesticaccedilatildeo do gado bovino e
capazes de afectar de forma muito diferente vaacuterios nuacutecleos populacionais natildeo satildeo detectados
na Peniacutensula Ibeacuterica
75
Resultados e Discussatildeo
Tabela 344 Variabilidade geneacutetica em vaacuterias raccedilas de bovinos atraveacutes da anaacutelise de 4 loci polimoacuterficos N - efectivo meacutedio estudado por locus ria - nuacutemero meacutedio de alelos por locus P-- proporccedilatildeo de loci polimoacuterficos yent - heterozigotia meacutedia esperada Entre parecircntesis indicam-se os valores do desvio padratildeo
Raccedila Populaccedilatildeo N nbdquo P H +
Portugal
Barrosatilde inscrita 1410(00) 23 (05) 750 0249 (0135)
Barrosatilde natildeo inscrita 1530 (00) 23 (05) 755 0260(0135)
Minhota 620 (00) 20 (00) 1000 0216 (0094)
Mertolenga 1470 (00) 23 (03) 1000 0315 (0097)
Alentejana 1550(00) 23 (03) 1000 0239 (0123)
Mirandesa 1065 (03) 20 (00) 1000 0159(0110)
Espanha
Cachena 710 (00) 23 (03) 1000 0279(0111)
Caldelana 600 (00) 20 (00) 1000 0166 (0107)
Frieiresa 330 (00) 18(03) 750 0177(0112)
Limiana 390 (00) 20 (00) 1000 0246 (0087)
Rubia Gallega 1845(95) 25 (05) 1000 0215(0110)
Vianesa 400 (00) 20 (00) 1000 0221 (0087)
Sayaguesa 1470 (00) 23 (03) 1000 0320 (0094)
Morucha 1010(00) 23 (03) 1000 0361 (0084)
Alistaria Sanabresa 1570 (00) 23 (03) 1000 0213 (0104)
Blanca Cacerefia 618 (03) 20 (00) 1000 0377 (0078)
Caacuterdena Andaluza 250 (00) 15(03) 500 0131 (0106)
Asturiana de los Vallegraves 1265 (05) 23 (03) 1000 0237(0107)
Asturiana de la Montana 1060 (00) 23 (03) 1000 0280 (0088)
Tudanca 420 (00) 20 (04) 750 0321 (0109)
Morena del N O 250 (00) 18 (03) 750 0203 (0108)
Frisona 6540 (00) 18 (05) 500 0203 (0130)
De Lidia 1240 (00) 23 (03) 1000 0367(0135)
Retinta 1640 (00) 23 (03) 1000 0338 (0107)
76
Resultados e Discussatildeo
Tabela 345 Variabilidade geneacutetica em vaacuterias raccedilas de bovinos atraveacutes da anaacutelise de 5 loci polimoacuterficos N - efectivo meacutedio estudado por locus na - nuacutemero meacutedio de alelos por locus P--proporccedilatildeo de loci polimoacuterficos H^ - heterozigotia meacutedia esperada Entre parecircntesis indicam-se os valores do desvio padratildeo
Raccedila Populaccedilatildeo N na P i r Portugal
Barrosatilde inscrita 1410 (00) 22 (04) 800 0281 (0109)
Barrosatilde natildeo inscrita 1530(00) 22 (04) 800 0272 (0105)
Minhota 620 (00) 20 (00) 1000 0229 (0074)
Espanha Cachena 710 (00) 22 (02) 1000 0289 (0087)
Caldelana 600 (00) 20 (00) 1000 0180 (0084)
Frieiresa 330 (00) 18 (02) 800 0180 (0087)
Limiana 390 (00) 20 (00) 1000 0226(0071)
Rubia Gallega 1812(81) 24 (04) 1000 0223 (0086)
Vianesa 400 (00) 20 (00) 1000 0374 (0168)
Sayaguesa 1470 (00) 22 (02) 1000 0305 (0074)
Morucha 1010 (00) 22 (02) 1000 0353 (0066)
Alistaria Sanabresa 1570 (00) 22 (02) 1000 0174 (0089)
Blanca Cacerefla 616 (02) 20(00) 1000 0402 (0065)
Caacuterdena Andaluza 250 (00) 16(02) 600 0120 (0083)
Asturiana de los Vallegraves 1266 (04) 22 (02) 1000 0270 (0089)
Asturiana de la Montaria 1060(00) 22 (02) 1000 0301 (0072)
343 - Diferenciaccedilatildeo geneacutetica
Nas tabelas 346 e 347 apresentam-se as distacircncias geneacuteticas de Nei (NEI 1978)
calculadas para 23 (4 loci HB CAII ALB e TF) e 15 (5 loci HB CAII ALB TF e NP)
raccedilas bovinas ibeacutericas respectivamente Da sua anaacutelise ressalta o facto de aqueles valores
serem na sua maioria bastante baixos
De entre as raccedilas bovinas ibeacutericas estudadas a Frisona e a Cachena demonstram estar
mais proacuteximas da raccedila Barrosatilde com valores de DNei de 0092 (4 loci) e de 0104 (5 loci)
respectivamente Por outro lado as raccedilas Asturiana de la Montana e Vianesa aparecem como
as mais diferenciadas DNei= 0334 (4 loci ) e Dgtjei= 0330 (5 loci) respectivamente
77
Resultados e Discussatildeo
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Resultados e Discussatildeo
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80
Resultados e Discussatildeo
No que se refere agrave raccedila Minhota verifica-se que a Frieiresa eacute a que estaacute mais proacutexima
(valores de 0077 e 0074 para 4 e 5 loci respectivamente) e que mais um vez eacute a Asturiana de
la Montana a mais diferenciada das raccedilas (valores de 0389 e 0349 para 4 e 5 loci respectivamente)
A diferenciaccedilatildeo geneacutetica entre as raccedilas bovinas ibeacutericas encontra-se representada nos
dendrogramas construiacutedos pelos meacutetodos de agrupamento NJ (Neighbor-joining SATTOU amp
NEI 1987) e UPGMA (Unweightedpair-group arithmetic average SNEATH amp SOKAL 1973)
(figuras 341 342 343 e 344) Foram realizados testes de reamostragem do tipo
bootstrap (100 reacuteplicas) para a anaacutelise da consistecircncia dos padrotildees de ramificaccedilatildeo
apresentando-se os seus valores entre parecircntesis
A anaacutelise conjunta dos quatro dendrogramas permite verificar uma falta de consistecircncia
nos vaacuterios padrotildees de ramificaccedilatildeo para as raccedilas bovinas ibeacutericas associada a valores de
bootstrap em geral muito reduzidos De facto observa-se que o padratildeo de ramificaccedilatildeo dos
dendrogramas se altera consoante o meacutetodo de agrupamento usado e o nuacutemero de loci considerados Estas alteraccedilotildees nos agrupamentos das diferentes raccedilas devem-se
provavelmente agrave instabilidade causada pelo reduzido nuacutemero de loci polimoacuterficos utilizados
neste estudo bem como ao facto de as frequecircncias geacutenicas serem muito semelhantes em todas
as populaccedilotildees estudadas
Deve contudo referir-se que a raccedila Barrosatilde aparece normalmente associada a vaacuterias
raccedilas do norte da Peniacutensula Ibeacuterica nomeadamente a Cachena (Galiza) a Asturiana de la
Montana (Astuacuterias) a Sayaquesa e a Morucha (Salamanca)
No que se refere agrave raccedila Minhota esta aparece vaacuterias vezes associada agraves raccedilas Rubia
Gallega Frisona Asturiana de los Vallegraves e Frieiresa
81
Resultados e Discussatildeo
(18)
(14)
(11)
(5)
(3)
Sayaquesa
(39)
[32)
(21)1-
- -HsT
(49)
(1)
(3)
(18)
(8)
(13)1
(12)
19)
(16T
De Lidia
(99) Asturiana de la Montana
Tudanca bullMorucha
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Minhota -Asturiana de los Vallegraves Rubia Gallega
Frieiresa Alentejana
(65)
Mertolenga -Vianesa
Blanra Cacerefla
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i (39)r
Mirandesa Caacuterdena Andaluza Morena NO
Caldelana Alistano Sanabresa
Figura 341 Dendrograma construiacutedo com base nas distacircncias geneacuteticas de NEI (1978) entre 23 raccedilas de bovinos (4 loci HBCAII ALB e TF) atraveacutes do meacutetodo de agrupamento NJ Os valores de probabilidade de ocorrecircncia de cada agrupamento obtidos atraveacutes de um teste de bootstrap indicam-se entre parecircntesis
82
Resultados e Discussatildeo
Morucha
Cachena Sayaquesa
Rubia Gallega Asturiana de los Vallegraves Freiresa
Frisona Minhota Alentejana Mertolenga
(43) ( 2 8 gt - ^ C a W e l a l
( iacute 7gtrl - Mirandesa L__ Alistano Sanabresa
Caacuterdena Andaluza Vianesa
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De Lidia Tudanca
Asturiana de la Montana Morena NO Blanca Cacerena
Figura 342 Dendrograma construiacutedo com base nas distacircncias geneacuteticas de NEI (1978) entre 23 raccedilas de bovinos (4 loci HB CAII ALB e TF) atraveacutes do meacutetodo de agrupamento UPGMA Os valores de probabilidade de ocorrecircncia de cada agrupamento obtidos atraveacutes de um teste de bootstrap indicam-se entre parecircntesis
83
Resultados e Discussatildeo
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Alistano Sanabresa _ _ Rabia Galkga
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Figura 343 Dendrograma construiacutedo com base nas distacircncias geneacuteticas de NEI (1978) entre 15 raccedilas de bovinos (5 loci HB CAII ALB TF e NP) atraveacutes do meacutetodo de agrupamento NJ Os valores de probabilidade de ocorrecircncia de cada agrupamento obtidos atraveacutes de um teste de bootstrap indicam-se entre parecircntesis
(21)
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Alistano Sanabresa
(37)
(61)
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Asturiana de la Montana
Figura 344 Dendrograma construiacutedo com base nas distacircncias geneacuteticas de NEI (1978) entre 15 raccedilas de bovinos (5 loci HB CAII ALB TF e NP) atraveacutes do meacutetodo de agrupamento UPGMA Os valores de probabilidade de ocorrecircncia de cada agrupamento obtidos atraveacutes de um teste de bootstrap indicam-se entre parecircntesis
84
Resultados e Discussatildeo
No seu conjunto estes resultados natildeo satildeo suficientes para o estabelecimento de uma
histoacuteria evolutiva das actuais raccedilas bovinas ibeacutericas nem para a separaccedilatildeo da raccedila Barrosatilde das
restantes Consequentemente natildeo eacute possiacutevel neste momento fazer corresponder a anaacutelise da
diversidade e estrutura geneacutetica das populaccedilotildees ibeacutericas de gado bovino com alguma das
hipoacuteteses evolutivas propostas por diversos autores com base em evidecircncia morfoloacutegica
(VALLEJO 1978 IGLESIAS 1989 CORDEIRO 1986 JORGE 1996)
De acordo com essa evidecircncia a raccedila Barrosatilde (e tambeacutem a Cachena) derivaria do
denominado tronco mauritaacutenico (Bos primigenius opisthonomus) ou seja de populaccedilotildees
originaacuterias do Norte de Aacutefrica que teriam passado para o sul da Peniacutensula Ibeacuterica alcanccedilando
mais tarde o Norte de Portugal e de Espanha Por outro lado a filiaccedilatildeo da raccedila Minhota
segundo JORGE (1996) deriva do tronco aquitacircnico (Bos primigenius primigenius) tal como a
maior parte das raccedilas da Galiza das Astuacuterias e dos Pirineacuteus
Embora os resultados apresentados neste trabalho pareccedilam de facto indicar que as
raccedilas Barrosatilde e Minhota derivam de troncos diferentes eacute necessaacuterio aprofundar de forma
muito consideraacutevel a investigaccedilatildeo sobre a estrutura geneacutetica das raccedilas bovinas ibeacutericas antes de
se poder formular conclusotildees mais sustentadas
85
Con8ideraccedil8es Finais
4 - CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
O trabalho desenvolvido nesta dissertaccedilatildeo permitiu o estudo de alguns sistemas
geneacuteticos polimoacuterficos jaacute descritos em bovinos (HB CAII NP MPI ALB TF e GC) nas
raccedilas Barrosatilde e Minhota Permitiu ainda a aplicaccedilatildeo de teacutecnicas de separaccedilatildeo electroforeacuteticas
mais eficazes em alguns desses sistemas
Vaacuterias limitaccedilotildees durante a execuccedilatildeo praacutetica deste trabalho obrigaram de alguma
forma a alteraccedilotildees no programa inicial Entre elas devem referir-se
1 a recolha de amostras de sangue mostrou-se difiacutecil e demorada sendo necessaacuteria a
coordenaccedilatildeo de esforccedilos de vaacuterias entidades (Direcccedilatildeo Regional de Agricultura de
Entre Douro e Minho e brigadas de Sanidade Animal locais) de veterinaacuterios e de
criadores de bovinos retirando tempo agrave execuccedilatildeo praacutetica do trabalho
2 a afinaccedilatildeo de vaacuterias teacutecnicas electroforeacuteticas para certos marcadores geneacuteticos
envolveu um consideraacutevel esforccedilo de investigaccedilatildeo
3 a impossibilidade de apurar atempadamente as teacutecnicas de separaccedilatildeo ou de
visualizaccedilatildeo para a amilase a ceruloplasmina e a poacutes-transferrina
4 a escassa bibliografia sobre o bovino Barrosatilde e sobre as teacutecnicas utilizadas neste
trabalho em gado bovino
Apesar das limitaccedilotildees considera-se que este trabalho se reveste de alguma importacircncia
pelo facto de constituir um contributo para a caracterizaccedilatildeo geneacutetica de uma raccedila bovina muito
peculiar A este respeito entendeu-se que numa primeira fase se procederia ao estudo de um
conjunto de proteiacutenas polimoacuterficas de forma a poder iniciar uma comparaccedilatildeo com outras raccedilas
bovinas nomeadamente ibeacutericas para as quais jaacute existem resultados publicados Por outro
86
Consideraccedilotildees Finais
lado o estabelecimento de um conjunto de teacutecnicas de fenotipagem dos loci considerados
permite desde logo a sua aplicaccedilatildeo em questotildees de identificaccedilatildeo individual e de anaacutelise da
paternidade
Eacute contudo evidente que o aprofundamento deste trabalho deveraacute necessariamente
evoluir na direcccedilatildeo da anaacutelise molecular da variaccedilatildeo geneacutetica Adicionalmente seraacute do maior
interesse alargar o domiacutenio de investigaccedilatildeo agraves restantes raccedilas bovinas autoacutectones
Em face do exposto entende-se ser possiacutevel definir trecircs linhas de investigaccedilatildeo para os
proacuteximos anos
1 - ampliaccedilatildeo da bateria de sistemas geneacuteticos polimoacuterficos detectados em proteiacutenas do
sangue e do leite
2 - anaacutelise da variabilidade geneacutetica de um conjunto de microssateacutelites se possiacutevel
associados a algumas das proteiacutenas polimoacuterficas jaacute descritas
3 - estudo do polimorfismo da moleacutecula de DNA-mitocondrial
De uma forma geral pode assim considerar-se que os principais objectivos definidos
no iniacutecio deste trabalho foram alcanccedilados pelo que se apresentam em seguida as conclusotildees
87
Conclusotildees
5 - CONCLUSOtildeES
A utilizaccedilatildeo de um sistema de focagem isoeleacutectrica permitiu detectar a existecircncia de
polimorfismo geneacutetico na hemoglobina distinguindo-se dois produtos geacutenicos na raccedila bovina
Minhota HBA e HBB Na raccedila Barrosatilde HBA foi o uacutenico produto geacutenico encontrado
A utilizaccedilatildeo de um sistema de focagem isoeleacutectrica permitiu a detecccedilatildeo de dois
produtos geacutenicos no locus CAII (CAIPF e CAIPS) e revelou-se mais eficaz de que as
teacutecnicas de separaccedilatildeo convencional em gel de amido
A investigaccedilatildeo realizada permitiu detectar a ocorrecircncia de polimorfismo geneacutetico de
MPI atraveacutes de um sistema electroforeacutetico em gel de amido tendo-se detectado trecircs produtos
geacutenicos (MPIA MPIB e MPIC) A fraca actividade de MPI e a grande dificuldade na
obtenccedilatildeo de um contraste de bandas adequado poderaacute dever-se ao facto de a sua expressatildeo soacute
ocorrer na fracccedilatildeo leucocitaacuteria do sangue
A aplicaccedilatildeo de um sistema de focagem isoeleacutectrica na presenccedila de ureia (8M) revelou-
-se muito eficaz na separaccedilatildeo de ALB e permitiu detectar pela primeira vez um novo variante
ALBV ligeiramente mais aciacutedico do que ALBA
A combinaccedilatildeo de uma teacutecnica de focagem isoeleacutectrica com um preacutevio tratamento das
amostras a fim de saturar a moleacutecula de TF com Fe permitiu a detecccedilatildeo de quatro produtos
geacutenicos (TF A TFD1 TFD2 e TFE) nas raccedilas estudadas
88
Conclusotildees
A combinaccedilatildeo de uma teacutecnica de focagem isoeleacutectrica com a detecccedilatildeo por
immunoblotting permitiu detectar dois produtos geacutenicos no locus GC (GCA e GCB) O
tratamento de amostras com neuraminidase permitiu a obtenccedilatildeo de padrotildees mais simples do
que os conseguidos com amostras nativas Esta simplificaccedilatildeo resulta da provaacutevel remoccedilatildeo de
aacutecidos siaacutelicos ligados agrave moleacutecula de GC
Natildeo se detectou nenhum caso de exclusatildeo na anaacutelise de segregaccedilatildeo de 27 pares
matildeefilho feita separadamente para cada locus
Verifiacutecou-se a presenccedila de dois alelos raros HBB e PEPB1 na raccedila Minhota Estes
alelos poderatildeo ser utilizados na distinccedilatildeo das duas raccedilas estudadas
Foi encontrado um valor de heterozigotia meacutedia de 0237 em populaccedilotildees de raccedila
Barrosatilde indicativo de uma variabilidade geneacutetica intermeacutedia em relaccedilatildeo agrave generalidade das
raccedilas ibeacutericas As diferenccedilas observadas entre as vaacuterias raccedilas ibeacutericas poderatildeo reflectir
fenoacutemenos histoacuterico-evolutivos muito recentes dada a sua proximidade e grande semelhanccedila
Foi observado um reduzido niacutevel de diferenciaccedilatildeo entre as raccedilas Barrosatilde e Minhota
(FST= 0031) demonstrando-se que a maior parte da diversidade geneacutetica se atribui a diferenccedilas
intrapopulacionais Este valor de FST pode considerar-se baixo quando comparado com o
obtido no estudo de outras espeacutecies animais sugerindo um elevado fluxo geacutenico
interpopulacional Por outro lado reflecte ainda uma histoacuteria demograacutefica muito recente
A utilizaccedilatildeo de meacutetodos de agrupamento NJ e UPGMA obtidos a partir de matrizes de
distacircncias geneacuteticas de Nei natildeo permitiu separar a raccedila Barrosatilde das restantes raccedilas ibeacutericas
89
Referecircncias Bibliograacuteficas
6 - REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
AMORIM A (1983) Contribuiccedilatildeo para o conhecimento da Geneacutetica Humana Estudo de Geneacutetica Bioquiacutemica
Formal e Populacional e de Ligaccedilatildeo Factorial Tese de Doutoramento Faculdade de Ciecircncias do
Porto
AMORIM A KOMPF J SCHUNTER F amp RITTER H (1982) Aminolevulinate dehydratase (EC42124)
Linkage analysis Hum Genet 61 48-49
ANSAY M (1973) Techniques microelectrophoretiques dans lanalyse de la multipliciteacute enzymatique chez les
bovins Deacutetection Eacutelectrophoreacutetique des Polymorphismes Biochimiques Chez les Mammifegraveres
Application a LEacutetude Geacuteneacutetique des Populations Centre National de la Recherche Scientifique
Paris 43-58
ARANA A pound amp ZARAGOZA P (1986) Nueva electroforetica dei enzima NADH-Diafrosa (DIA-2) detectada
en la espeacutecie Oryctolagus cuniculus (L) Zootecnia XXXV ndeg 7-12 125-130
ARAUacuteJO J (1986) Contribuiccedilatildeo para o estudo dos bovinos de raccedila Barrosatilde Relatoacuterio de estaacutegio da
licenciatura em Engenharia Zooteacutecnica Universidade dos Accedilores
ARNOLD I C J amp Bouw J (1989) A new allele of glucose phosphate isomerase in dogs Animal Genetics
20 217-220
ARRANZ J J BAYON Y amp SAN PRIMITIVO F (1992) Biochemical polymorphisms in Spanish Avilena-
-Negra Ibeacuterica cattle Animal Genetics 23 (suppl 1) 19
ARRANZ J J BAYON Y amp SAN PRIMITIVO F (1996) Comparison of protein markers and microsatellites in
differentiation of cattle populations Animal Genetics 27 415-419
ASHTON G C (1965) Cattle serum transferrins A balanced polymorphism Genetics 52 983-997
90
Referecircncias Bibliograacuteficas
BAINES J amp MEacuteLEK J (1980) Egipto - Deuses Templos e Faraoacutes Grandes Culturas e Civilizaccedilotildees Ciacuterculo
de Leitores
BELL K ARTHUR H amp ANDERSON I L (1994) Esterase and albumin polymorphism in the domestic cat
(Felis catus) XXIV International Conference on Animal Genetics Praga Julho 1994
BEKENEV V A amp ORLOVA G V (1991) Polymorphism of erytrocytic enzymes in Large White pig breeds in
Siberia Animal Genetics 22 (suppl 1) 23-24
BOWLING A T amp CLARK R S (1988) Excess of heacuteteacuterozygotes at albumin locus in American Standardbred
horses Animal Genetics 19 331-341
BOWLING A T GORDON L PENEDO M C T WICTUM E amp BEEBOUT J (1990) A single gel for
determining genetic of equine erythrocyte carbonic anhydrase (CA) and catalase (Cat) Animal
Genetics 21 191-197
BRADLEY D G MACHUGH D E CUNNINGHAM P amp LOFTUS R T (1996) Mitochondrial diversity and
the origins of African and European cattle Proceeding of the National Academy of Sciences of USA
93 5131-5135
BRAEND M (1971) Studies on the relationships between cattle breeds in Africa Asia and Europe Evidence
obtained by studies of blood groups and protein polymorphisms World Review of Animal Production
VIO (1) 10-14
BRAEND M (1988) Haemoglobin polymorphism in Norwegian Red Cattle Animal Genetics 19 59-62
BRAEND M NESSE 1 L amp EFREMOV G D (1988) Expression and genetics of caprine haemoglobins
Animal Genetics 18 223-231
BROWN L B KANE H amp AYRES H (1993) Vital signs WW Norton e Co pp 323 New York
CARTER D C HE X M MUNSON S EL TWIGG P D GERNERT K M BROOM M B amp MILLER T
Y (1989) Three dimensional structure of human serum albumin Science 244 1195-1198
CECCHINI G amp Nus M D (1986) Literature review on cattle blood polymorphisms and preliminary results
of analysis in East African Zebu in Ethiopia Agric Subtrop and Ttropicale 3 (80) 433-463
91
Referocircicias Bibliograacuteficas
CiacuteZovAacute D STRATIL A MULLER E amp CEPICA S (1993) A new partially deficient transferrin variant in
the pig Animal Genetics 24 305-306
CLARKE S W TUCKER E M amp OSTERHOFF D R (1989) Blood groups and biochemical polymorphism
in the Namaqua sheep breed Animal Genetics 20 279-286
CLUTTON-BROCK J (1992) Domestication of animals In Jomes S Martin R Pilbeam D (eds) The
Cambridge Encyclopedia of Human Evolution pp 380-385 Cambridge University Press
CORDEIRO J P (1986) As raccedilas bovinas em Portugal - Sua Origem O meacutedico veterinaacuterio I (1) 29-39
CRISTOFALO G Cozzi M C amp VALIATI P (1992) Identification of a new variant in the equine serum
alB-glycoprotein (A1B) system Animal Genetics 23 (suppl 1) 24
CUNHA L M (1994) Caracterizaccedilatildeo Morfo-Funcional e Geneacutetica da Raccedila Bovina Alentejana Trabalho de
fim de curso apresentado agrave Escola Superior Agraacuteria de Beja
DEL LAMA S N DEL LAMA M A MESTRINER M A amp MORTARI N (1992) Peptidase B polymorphism
in cattle erythrocytes Biochem Genet 30 247-255
DRATCH P TATE M KRAAY G J amp GERWING V (1992) Plasma proteins differentiating European red
deer and North American elk Animal Genetics 23 (suppl 1) 32
EGGEN A amp FRIES R (1995) An integrated cytogenetic and meiotic map of the bovine genome Animal
Genetics 26 215-236
ERHARDT G (1986) Transferrin variants in sheep separation and characterization by polyacrylamide gel
electrophoresis and isoelectric focusing Animal Genetics 17 343-352
ERHARDT G (1991) Genetic polymorphism of vitamin D binding protein and serum albumin in sheep
Animal Genetics 22 (suppl 1) 28-29
ERHARDT G amp SIMIANER H (1993) Linkage between the loci for serum albumin and vitamin D binding
protein (GC) in sheep Animal Genetics 24 301-303
EPSTEIN H amp MASON I L (1984) Cattle In Mason I L (ed) Evolution of domesticated animals pp 7-
-27 Longman
92
Referecircncias Bibliograacuteficas
FAO (1993) A diversidade da Natureza Um patrimoacutenio valioso Documento produzido pela FAO Divisatildeo de
informaccedilatildeo - Out de 1993 Veterinaacuteria Teacutecnica 10 10-12
FAO (1996) World Watch List for Domestic Animal Diversity 2a ediccedilatildeo FAOUNEP pp 334 Roma
FARNDALE B M HUBBARD D E amp ANDERSON L L (1992) A new PGD variant in New Zeland
Thoroughbred horses Animal Genetics 23 (suppl 1) 24
FELSENSTEIN J (1993) PHYLIP (Phylogeny Inference Package) Version 35 Distributed by the autor Seattle
University of Washington
FERNANDES M T S (1996) Raccedilas de bovinos autoacutectones Um importante recurso geneacutetico animal portuguecircs
a preservar e a defender Veterinaacuteria Teacutecnica 12 10-15
FERRAND N (1995) Variaccedilatildeo geneacutetica de proteiacutenas em populaccedilotildees de coelho (Oryctolagus cuniculus) -
- Anaacutelise da diferenciaccedilatildeo subespecifica subestruturaccedilatildeo expansatildeo geograacutefica e domesticaccedilatildeo
Dissertaccedilatildeo de Doutoramento em Biologia apresentada agrave Faculdade de Ciecircncias da Universidade do
Porto
FERRAND N amp ROCHA J (1991) Genetic polymorphism of serum albumin in wild rabbits populations
Animal Genetics 22 (suppl 1) 36
FORBES P MACKEITH B amp PEBERDY R (1986) Mamiacuteferos Ungulados e Lagomorfos Ciacuterculo de Leitores
FRIES R EGGEN A amp WOMACK J E (1993) The bovine genome map Mammalian Genome 4 405-428
GAHNE B(1963) Inherited variation in the post-albumin of cattle serum Hereditas 50126-135
GAHNE B JUNEJA R K amp GROLMUS J (1977) Horizontal polyacrylamine gel electrophoresis for the
simultaneous phenotyping of transferrin post-transferrin albumin and post-albumin in the blood
plasma of cattle Arum Bid Grps Biochem Genet 8127-137
GARCIA L S VICENTE M V BECERRA A L YEBRA F A RODRIcircGUES M F amp LOacutePEZ J M S
(1992) Razas Bovinas Autoacutectonas de Galicia - I Razas Morenas Galegas (Recursos Xeneacuteticos a
Conservar) Xunta de Galicia
GARCIA M ROSAacuteRIO J amp ANTUNES M (1981) Bovinos em Portugal Direcccedilatildeo dos Serviccedilos Veterinaacuterios -
- DGSV pp 44-78 Lisboa
93
Referecircncias Bibliograacuteficas
GLOWATZKI-MULLIS M L GAILLARD C WIGGER G amp FRIES R (1995) Microsatellite-based
parentage control in cattle Animal Genetics 26 7-12
GONCcedilALVES GARCIA M L (1964) A Raccedila Bovina Barrosatilde Boletim Pecuaacuterio n deg 1 Ano XXXII DGSP
pp 103-172 Lisboa
GONZALEZ P TUNON MJ amp VALLEJO M (1987) Genetic relationships between Spanish native breeds of
cattle Animal Genetics 18 249-256
HALL S B L COTHRAN E G amp KING J A (1991) Variability of manosephosphate isomerase (MPI)
from haemolysate in 14 horse breeds Animal Genetics 22 (suppl 1) 22
HARRIS H amp HOPKINSON D A (1976) Handbook of enzyme electrophoresis in human genetics North-
-Holland Publishers
HEMMER H (1990) Domestication The decline of environmental appreciation Cambridge University Press
HERZOG S (1988) Polymorphism and genetic control of erythrocyte 6-phosphogluconate dehydrogenase in
the genus Cervus Animal Genetics 19 291-294
HERZOG S (1989) Genetic polymorphism of transferrin in fallow deer Cervus dama L Animal Genetics 20
421-426
IGLESIAS A B (1989) Estrutura y relaciones geneacuteticas de razas bovinas mediante marcadores geneacuteticos
(Polimorfismos Bioquiacutemicos) Dissertaccedilatildeo de Doutoramento em Biologia apresentada agrave Faculdade de
Biologia da Universidade de Santiago
JAMIESON A (1965) The genetics of transferrins in cattle Heredity 20 419-441
JANZEN M K amp COTHRAN E G (1991) A new PGD variant from North American horses of feral origin
Animal Genetics 22 (suppl 1) 21-22
JORGE E S (1996) Bovinos da raccedila Minhota Contribuiccedilatildeo para a sua histoacuteria Veterinaacuteria Teacutecnica 10 10-
-18
94
Referecircncias Bibliograacuteficas
JUNEJA R K GAHNE B amp STRATIL A (1987) Polymorphic plasma postalbumins of some domestic
animals (pig Po2 horse XK and dog Pa proteins) identified as homologous Animal Genetics 18 119-
-124
JUNEJA R K KURYL J GAHNE B amp ZURKOWSKI M (1989) Linkage between the loci for transferrin
and ceruloplasmin in pigs Animal Genetics 20 307-311
KALAB P STRATIL A amp GLASNAacuteK V (1990) Genetic polymorphism of serum vitamin D-binding protein
(GC) in sheep and mouflon Animal Genetic 21 317-321
KAWAGUCHI T (1973) Polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of serum albumin into three
bands Clinica ChimicaActa 45 85-92
KIDD K K STONE W H CRIMELLA C CARENZI C CASATI M amp ROGNONI G (1980)
Immunogenetic and population genetic analyses of Iberian cattle Anim Blood Grps Biochem Genet
11 21-38
KRISTJANSSON F K (1963) Genetic control of two pre-albumins in pigs Genetics 48 1059-1063
KRISTJANSSON F K amp HICKMAN C G (1965) Subdivision of the allele TF D for transferrins in Holstein
and Ayrshire cattle Genetics 52 627-630
KUROSAWA Y amp TANAKA K (1988) Electrophoretic variants of serum transferrin in wild pig populations of
Japan Animal Genetics 19 31-35
LEAL C (1995) Apreciaccedilatildeo fenotiacutepica de um nuacutecleo de bovinos de raccedila Barrosatilde e amostragem para sua
caracterizaccedilatildeo geneacutetica Relatoacuterio de estaacutegio de licenciatura em Biologia - Ramo Cientiacutefico
Tecnoloacutegico em Ecologia e Recursos Zooloacutegicos Faculdade de Ciecircncias da Universidade do Porto
LITT M amp LUTTY J A (1989) A hipervariable microsatellite revealed by in vitro amplification of a
dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene American Jornal of Human Genetics 44
397-401
LOFTUS R T MACHUGH D E NGERE L O BALAIN D S BADI A M BRADLEY D G amp
CUNNINGHAM E P (1994a) Mitochondrial genetic variation in European African and Indian cattle
populations Animal Genetics 25 265-271
95
Referecircncias Bibliograacuteficas
LOFTUS R T MACHUGH B E BRADLEY B G SHARP P M amp CUNNINGHAM P (1994b) Evidence
for two independent domestications of cattle Proceeding of the National Academy of Sciences of USA
91 2757-2761
MACHUGH D E LOFTUS R T BRADLEY B G SHARP P M amp CUNNINGHAM P (1994)
Microsatellite DNA variation and among European cattle breeds Proceedings of the Royal Society of
London B 256 25-31
MACHUGH B E SHRIVER M B LOFTUS R T CUNNINGHAM P amp BRADLEY B G (1997)
Microsatellite DNA Variation and the Evolution Domestication and Phylogeography of taurine and
zebu cattle (Bos taunts and Bos indicus) Genetics 146 1071-1086
MARTINS R (1982) Conservaccedilatildeo e melhoramento dos bovinos de raccedila Barrosatilde Relatoacuterio de estaacutegio de
licenciatura em Produccedilatildeo Animal Instituto Universitaacuterio de Traacutes-os-Montes e Alto Douro
MIRANDA DO VALE J (1949) Gado Bissulco Livraria Saacute da Costa Lisboa
MORAIS M L (1992) Estudo Desenvolvimento e Optimizaccedilatildeo de Teacutecnicas de Separaccedilatildeo e Detecccedilatildeo
Especiacutefica de Proteiacutenas Dissertaccedilatildeo de Mestrado em Biologia Celular apresentada agrave Faculdade de
Ciecircncias da Universidade de Coimbra
NEI M (1978) Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small number of individuals
Genetics 89 583-590
NICHOLS E A CHAPMAN V M amp RUDDLE F H (1973) Polymorphism and linkage for
Mannosephosphate isomerase in Mus musculus Biochem Genet 8 47-53
NOBRE J M (s data) Caracterizaccedilatildeo geneacutetica da raccedila bovina Mirandesa Trabalho de fim de curso
efectuado na Estaccedilatildeo Nacional de Selecccedilatildeo e Reproduccedilatildeo Animal Curso de Engenharia Zooteacutecnica da
Universidade de Eacutevora
PENEDO M C T FOWLER M E BOWLING A T ANDERSON B L amp GORDON L (1988) Genetic
variation in the Wood of llamas Llama glama and alpaca Llama pacos Animal Genetics 19 267-
-276
PENEDO M C T amp JUNEJA R K (1989) Polymorphic plasma postalbumin (PO) of llamas and alpacas
identified as GC Protein Animal Genetics 20 221-223
96
Referecircncias Bibliograacuteficas
PENHALLOW R C MASON A B amp WOODWORTH R C (1991) Electrophoretic characterization of
human equine and bovine transferrins Comp Biochem Physiol 98B 41-45
PEREIRA A A (1997) Caracterizaccedilatildeo Geneacutetica de Algumas Subpopulaccedilotildees de Truta de Rio Salmo trutta L
da Bacia Hidrograacutefica do Rio Lima Dissertaccedilatildeo de Mestrado em Ecologia Aplicada apresentada agrave
Faculdade de Ciecircncias da Universidade do Porto
PIEDRAFITA J TEJEDOR M T amp ZARAGAZA L (1984) Post-Albuminas y Post-Transferrinas en
poblaciones bovinas Espafiolas Frisona y De Lidia Comunicacioacuten Presentada A La 34deg Reunion
Anual De La Federacioacuten Europea de Zootecnia 114-121
POVEY S CORNEY G LEWIS W H P ROBSON E B PARRINGTON J M amp HARRIS H (1972) The
genetics of peptidase C in man Ann Hum Genet 35 455-465
PRETSCH W amp MERKLE S (1990) Glucose Phosphate Isomerase Enzyme - Activity Mutants in Mus
musculus Genetical and Biochemical Characterization Biochemical Genetics 28 97-110
RASERO R D I STASIO L amp BERRA G P (1993) Polymorphism of erythocyte glucosephosphae isomerase
in sheep Animal Genetics 24 63-64
RITTER EL FRIEDRICHSON U amp SCHMITT J (1974) Genetic variation of Manose phosphate isomerase in
Man Humangenetik 22 261
RITTER H amp SCHMITT J (1973) Genetic polymorphism of Manose phosphate isomerase in Primates
Humangenetik 19 325-326
ROCHA J KOtildeMPF J FERRAND N AMORIM A amp RITTER H (1991) Separation of human alloalbumin
variants by isoelectric focusing Electrophoresis 12 313-314
ROGERSON J (1991) Biacuteblia- Os Caminhos de Deus Grandes Culturas e Civilizaccedilotildees Ciacuterculo de Leitores
RON M BAND M YANAI A amp WELLER J L (1994) Mapping quantitative trait loci with DNA
microsatellites in a commercial dairy cattle population Animal Genetics 25 259-264
RUSSEL G (1996) The analysis of genetic diversity in cattle to preserve future breeding options (Online)
Available http wwwribbsrcacukcdiv_wwwinformhtm (1996 November 29)
97
Referecircncias Bibliograacuteficas
SAITOU N amp NEI M (1987) The neighbor-joining method a new method for reconstructing phylogenetic
trees Mol Biol Evol 4 406-425
SANTOS O C M (1995) Caracterizaccedilatildeo Geneacutetica de Populaccedilotildees de Lebre Ibeacuterica (Lepus granatensis) e
Lebre Europeia (Lepus europaeus) - Aspectos Bioquiacutemicos e Populacionais Dissertaccedilatildeo de Mestrado
em Ecologia Aplicada apresentada agrave Faculdade de Ciecircncias da Universidade do Porto
SARAIVA J A (1993) Histoacuteria de Portugal Publicaccedilotildees Europa-Ameacuterica
SARTORE G STORMONT C MORRIS B G amp GRUNDER A A (1969) Multiple electrophoretic forms of
Carbonic Anhydrase in red cells of domestic cattle (Bos taurus) and American buffalo (Bison bison)
Genetics 61823-831
SCHNEIDER H SCHNEIDER M P C SILVA B T F amp SALZANO F M (1990) Transferrin and albumin
polymorphisms in buffaloes from Brazil Animal Genetics 21 335-337
SEATH P H A amp SOKAL R R (1973) Numeric Taxonomy W H Freeman amp Co
SELVARAJ O S MUKHERJEE T K DHALIWAL S S TAN S G amp BARKER J S F (1991) Biochemical
polymorphisms in the local goats of South-East Asia Animal Genetics 22 (suppl 1) 32
STERN C M MILLER S A amp SCHANFIELD M S (1992) Differentiation of wapiti and Eurasian red deer
by isoelectric focusing electrophoresis of GC on agarose gels Animal Genetics 23 (suppl 1) 23
STORMONT C amp SUZUKI Y (1963) Genetic control of albumin phenotypes in horses Proceeding of the
Society for Experimental Biology and Medicine 144 673-675
STRATIL A GLASNAacuteK V BOBAacuteK P CiacutezovAacute D GAacuteBRISOVAacute E amp KALAB P (1990) Variation of some
serum proteins in red deer Cervus elaphus L Animal Genetics 21 285-293
SWOFFORD D L amp SELANDER R B (1989) BIOSYS-1 A computer program for the analysis of allelic
variation in population genetics and biochemical systematics Release 17 Illinois Natural History
Survey
TASHIAN R E (1989) The carbonic anhydrases widening perspectives on their evolution expression and
function BioEssays 10 186-192
98
Referecircncias Bibliograacuteficas
TASHIAN R E amp CARTER N D (1976) Biochemical Genetics of Carbonic Anhydrase In Harris H (ed)
Advances in Human Genetics 7 1-56 Plenum
TATE M L amp MCEWAN K M (1992) Genetic polymorphism of erytrocyte diaphorase in red deer Cervus
elaphusL Animal Genetics 23 449-452
TSUJI S SAOAMITSU Y amp GOTO N (1989) Ultrathin-leyer isoelectric focusing for bovine serum
transferrin phenotyping Biochem Genet 27 425-429
TUCKER E M amp YOUNG J D (1988) Genetic control of red-cell nucleoside transport and its association
with the B blood-group locus and nucleoside phosphorylase activity in sheep Biochem Genet 26 489-
-501
TUNON M J GONZALEZ P amp VALLEJO M (1989) Genetic relationships between 14 native Spanish
breeds of goat Animal Genetics 20 205-212
USHA A P (1996) Cattle diversity by blood typing (Online) Available http
wwwribbsrcacukcdiv_wwwinfobhtm ( 1996)
USHA A P SIMPSON S P amp WILLIAMS J L (1995) Probability of random sire exclusion using
microsatellite markers for parentage verification Animal Genetics 26 155-161
VANDEBERG J amp AIVALIOTIS M (1990) Mannose-6-phosphate isomerase polymorphism in baboon
erythrocytes Biochemical Genetics 28 495-501
VAN DE WEGHE A VAN ZEVEREN A amp BOUQUET Y (1982) The vitamin D binding protein in domestic
animals Comp Biochem Physiol 73B 977-982
VAN DE WEGHE A YABLANSKI T S VAN ZEVEREN A amp BOUQUET Y (1988) A third variant of glucose
phosphate isomerase in pigs Animal Genetics 19 55-58
VANKAN D M amp BELL K (1992 a) A new allele in Australian goats Animal Genetics 23 453-456
VANKAN D M amp BELL K (1992 b) Genetic polymorphism of vitamin D-binding protein (GC) in Australian
goats Animal Genetics 23 457-462
VICENTE M V (1978) Razas vacunas autoacutectonas en vias de extincioacuten (Aportaciones al estuacutedio geneacutetico)
Fundacioacuten Juan March Serie Universitaacuteria LXK 10-51
99
Referecircncias Bibliograacuteficas
VIEIRA J (1993) Utilizaccedilatildeo de marcadores geneacuteticos na caracterizaccedilatildeo e certificaccedilatildeo de populaccedilotildees
domeacutesticas e selvagens de coelho (Oryctolagus cunicuius) Dissertaccedilatildeo de Mestrado apresentada agrave
Faculdade de Ciecircncias da Universidade do Porto
VIEIRA J amp FERRAND N (1995) Four new alleles at the mannose-6-phosphate isomerase locus in rabbit
Animal Genetics 26 37-38
WANG S FOOTE W C amp BUNCH T D (1990) Transferrin and haemoglobin polymorphism in
domesticated goats in the USA Animal Genetics 21 91-94
WEBER J L amp MAY P E (1989) Abundant class of human DNA polymorphisms which can be typed using
the polymerase chain reaction American Jornal of Human Genetics 44 388-396
WELCHS S (1990) A comparison of the structure and properties of serum transferrin from 17 animal species
Comp Biochem Physiol 97 B (3) 417-427
100
ANEXO
Anexos
RESUMO E CONCLUSOtildeES
Neste trabalho apresenta-se uma contribuiccedilatildeo para o estudo geneacutetico da raccedila bovina Barrosatilde e de uma outra raccedila (Minhota) atraveacutes da anaacutelise da variaccedilatildeo geneacutetica de proteiacutenas detectada pela utilizaccedilatildeo de sistemas electroforeacuteticos convencionais e por focagem isoeleacutectrica
Definiram-se os seguintes objectivos fundamentais
1 estudo da variabilidade geneacutetica da raccedila Barrosatilde ao niacutevel das proteiacutenas eritrocitaacuterias e plasmaacuteticas 2 desenvolvimento e afinaccedilatildeo de teacutecnicas de separaccedilatildeo de proteiacutenas por electroforese e focagem
isoeleacutectrica e sua detecccedilatildeo especiacutefica (histoquiacutemica e imunoloacutegica) 3 anaacutelise familiar dos polimorfismos encontrados 4 avaliaccedilatildeo do grau de diferenciaccedilatildeo geneacutetica existente entre a raccedila Barrosatilde e outras raccedilas bovinas
Escolheu-se um conjunto de 12 sistemas geneacuteticos (sete dos quais se revelaram polimoacuterficos) que pudesse satisfazer os objectivos fundamentais do trabalho
Assim apoacutes desenvolvimento de teacutecnicas de separaccedilatildeo para os sistemas geneacuteticos considerados procedeu-se a uma anaacutelise familiar baseada nos polimorfismos encontrados nas populaccedilotildees de raccedila Barrosatilde ao estudo de distribuiccedilatildeo populacional dos fenoacutetipos das duas raccedilas estudadas e de outras raccedilas bovinas da Europa (principalmente da Peniacutensula Ibeacuterica)
Com base neste trabalho obtiveram-se as seguintes conclusotildees
bull a utilizaccedilatildeo de um sistema de focagem isoeleacutectrica permitiu detectar a existecircncia de polimorfismo geneacutetico na hemoglobina distinguindo-se dois produtos geacutenicos na raccedila bovina Minhota HBA e HBB Na raccedila Barrosatilde HBA foi o uacutenico produto geacutenico encontrado
bull a utilizaccedilatildeo de um sistema de focagem isoeleacutectrica permitiu a detecccedilatildeo de dois produtos geacutenicos no locus CAII (CAIIF e CAIPS) e revelou-se mais eficaz de que as teacutecnicas de separaccedilatildeo convencional em gel de amido
bull a investigaccedilatildeo realizada permitiu detectar a ocorrecircncia de polimorfismo geneacutetico de MPI atraveacutes de um sistema electroforeacutetico em gel de amido tendo-se detectado trecircs produtos geacutenicos (MPIA MPIB e MPIC) A fraca actividade de MPI e a grande dificuldade na obtenccedilatildeo de um contraste de bandas adequado poderaacute dever-se ao facto de a sua expressatildeo soacute ocorrer na fracccedilatildeo leucocitaacuteria do sangue
bull a aplicaccedilatildeo de um sistema de focagem isoeleacutectrica na presenccedila de ureia (8M) revelou-se muito eficaz na separaccedilatildeo de ALB e permitiu detectar pela primeira vez um novo variante ALBV ligeiramente mais aciacutedico do que ALB A
bull a combinaccedilatildeo de uma teacutecnica de focagem isoeleacutectrica com um preacutevio tratamento das amostras a fim de saturar a moleacutecula de TF com Fe permitiu a detecccedilatildeo de quatro produtos geacutenicos (TFA TFD1 TFD2 e TFE) nas raccedilas estudadas
bull a combinaccedilatildeo de uma teacutecnica de focagem isoeleacutectrica com a detecccedilatildeo por immunoblotting permitiu detectar dois produtos geacutenicos no locus GC (GCA e GCB) O tratamento de amostras com neuraminidase permitiu a obtenccedilatildeo de padrotildees mais simples do que os conseguidos com amostras nativas Esta simplificaccedilatildeo resulta da provaacutevel remoccedilatildeo de aacutecidos siaacutelicos ligados agrave moleacutecula de GC
bull natildeo se detectou nenhum caso de exclusatildeo na anaacutelise de segregaccedilatildeo de 27 pares matildeefilho feita separadamente para cada locus
bull verificou-se a presenccedila de dois alelos raros HBB e PEPB1 na raccedila Minhota Estes alelos poderatildeo ser utilizados na distinccedilatildeo das duas raccedilas estudadas
I
Anexos
bull foi encontrado um valor de heterozigotia meacutedia de 0237 em populaccedilotildees de raccedila Barrosatilde indicativo de uma variabilidade geneacutetica intermeacutedia em relaccedilatildeo agrave generalidade das raccedilas ibeacutericas As diferenccedilas observadas entre as vaacuterias raccedilas ibeacutericas poderatildeo reflectir fenoacutemenos histoacuterico-evolutivos muito recentes dada a sua proximidade e grande semelhanccedila
bull foi observado um reduzido niacutevel de diferenciaccedilatildeo entre as raccedilas Barrosatilde e Minhota (FST = 0031) demonstrando-se que a maior parte da diversidade geneacutetica se atribui a diferenccedilas intrapopulacionais Este valor de FST pode considerar-se baixo quando comparado com o obtido no estudo de outras espeacutecies animais sugerindo um elevado fluxo geacutemeo interpopulacional Por outro lado reflecte ainda uma histoacuteria demograacutefica muito recente
bull a utilizaccedilatildeo de meacutetodos de agrupamento NJ e UPGMA obtidos a partir de matrizes de distacircncias geneacuteticas de Nei natildeo permitiu separar a raccedila Barrosatilde das restantes raccedilas ibeacutericas
II
Anexos
Tabela A Frequecircncias geacutenicas para os vaacuterios sistemas polimoacuterficos encontrados na raccedila Barrosatilde (indiviacuteduos inscritos e natildeo inscritos) utilizadas na anaacutelise familiar
LOCUS ALELOS FREQUEcircNCIA GEacuteNICA
CAII 294 035
065
NP 294 H
L
024
076
MPI 290 A
B
C
000
098
002
ALB 294 A
B
V
097
002
001
TF 294 A
Dl
D2
E
057
016
023
004
GC 294 083 017
TTI
Introduccedilatildeo
1 - INTRODUCcedilAtildeO
O crescente interesse demonstrado pelas raccedilas bovinas autoacutectones permitiu o
aparecimento nos uacuteltimos anos de uma conjuntura poliacutetica e econoacutemica claramente favoraacutevel
agrave sua conservaccedilatildeo Este interesse reflecte-se por exemplo na criaccedilatildeo de incentivos agrave produccedilatildeo
(ajudas comunitaacuterias e medidas agroambientais) ou no apelo ao consumo de produtos de
qualidade certificada Estas circunstacircncias implicam contudo a necessidade de uma maior
capacidade de produccedilatildeo que em sistemas agriacutecolas tecnicamente pouco desenvolvidos poderaacute
estar associada a programas de melhoramento geneacutetico e consequentemente a eventuais
perdas de diversidade geneacutetica (FAO 1994 LoFTUS et ai1994 FERNANDES 1996)
Em Portugal existe um nuacutemero consideraacutevel de raccedilas bovinas autoacutectones que se
encontram ainda pouco estudadas Na verdade a maior parte dos trabalhos sobre elas
realizados envolve anaacutelises fenotiacutepicas estando ainda por investigar a estrutura geneacutetica das
suas populaccedilotildees o seu grau de proximidade a sua origem e evoluccedilatildeo recente
No seio das raccedilas nacionais a raccedila Barrosatilde apresenta um conjunto de caracteriacutesticas
morfoloacutegicas muito peculiares que incluem um perfil cocircncavo da cabeccedila uma saliecircncia das
arcadas orbitarias e cornos em forma de lira alta Este conjunto de particularidades tem
suscitado opiniotildees controversas sobre a sua origem (GONCcedilALVES GARCIA 1964 GARCIA et ai 1981 LEAL 1995) Por outro lado eacute claramente uma raccedila emblemaacutetica da regiatildeo noroeste
de Portugal associada a uma agricultura de subsistecircncia e a um patrimoacutenio cultural que se
torna necessaacuterio conservar (GONCcedilALVES GARCIA 1964 GARCIA et ai 1981 LEAL 1995)
A sua aacuterea de distribuiccedilatildeo abrange apenas 17 concelhos pertencentes a 4 distritos Vila
Real Viana do Castelo Braga e Porto Actualmente a existecircncia de problemas de produccedilatildeo eacute
responsaacutevel pela progressiva diminuiccedilatildeo de alguns nuacutecleos populacionais apesar dos esforccedilos
de certas entidades para o evitar (MARTINS 1982 LEAL 1995)
i
Introduccedilatildeo
Em face do exposto torna-se necessaacuterio alargar a investigaccedilatildeo sobre esta raccedila bovina
nomeadamente atraveacutes da sua caracterizaccedilatildeo geneacutetica Espera-se assim poder contribuir para
o estabelecimento de um plano de conservaccedilatildeo da Barrosatilde e simultaneamente aprofundar o
estado actual do conhecimento sobre a geneacutetica das suas populaccedilotildees
2
Introduccedilatildeo
11 - A DOMESTICACcedilAtildeO
111 - Evidecircncia histoacuterica da domesticaccedilatildeo do gado bovino
Haacute cerca de 15000 anos verificavam-se profundas mudanccedilas climaacuteticas na Terra Os
glaciares recuaram para Norte a temperatura tornou-se mais amena uma maior aacuterea
geograacutefica tornou-se habitaacutevel O Homem teve entatildeo de vencer dificuldades impostas pela
Natureza inventando a agricultura e a criaccedilatildeo de gado passando de caccedilador noacutemada a
agricultor e a pastor (SARAIVA 1993)
O iniacutecio da agricultura e a primeira domesticaccedilatildeo de animais por parte do Homem estaacute
datada de 10000 anos aC (final do Paleoliacutetico) numa regiatildeo conhecida por Crescente Feacutertil
no Proacuteximo Oriente O primeiro animal domesticado teraacute sido o catildeo seguindo-se a ovelha a
cabra e o gado bovino jaacute no Neoliacutetico (8000 anos aC) (HEMMER 1990 CLUTTON-BROCK
1992)
A domesticaccedilatildeo do gado bovino foi provavelmente um processo gradual Eacute natural
que no princiacutepio apenas alguns animais (essencialmente fecircmeas) fossem retirados das manadas
de auroques selvagens e criados isoladamente natildeo levando de imediato ao aparecimento de
diferenccedilas morfoloacutegicas claras Esta hipoacutetese eacute apoiada por registos arqueozooloacutegicos onde a
forma proto-domesticada natildeo se distingue da forma selvagem (LOFTUS et ai 1994)
A expansatildeo neoliacutetica em direcccedilatildeo agrave Europa teraacute levado milhares de anos seguindo uma
via mariacutetima (mar Mediterracircneo) e uma via continental (atraveacutes dos Balcatildes e pelo curso do
Danuacutebio) Da Siciacutelia a revoluccedilatildeo neoliacutetica espalhou-se por toda a bacia mediterracircnea
ocidental atingindo a Peniacutensula Ibeacuterica e a costa atlacircntica e trazendo consigo a arte a
agricultura e a criaccedilatildeo de gado Desta forma soacute no 5 deg mileacutenio aC chegaram agrave Peniacutensula
Ibeacuterica as praacuteticas agriacutecolas e a pastoriacutecia (SARAIVA 1993)
Desde o Neoliacutetico que o gado bovino domesticado (Bos taurus) tem um papel muito
importante para o Homem As grandes civilizaccedilotildees da Antiguidade datildeo-nos testemunhos
escritos e trabalhos artiacutesticos indicando a sua importacircncia na alimentaccedilatildeo (carne leite) nos
trabalhos agriacutecolas na guerra na arquitectura e mesmo na religiatildeo
3
Introduccedilatildeo
Durante o periacuteodo compreendido entre o iniacutecio do Neoliacutetico ateacute agraves idades do Cobre e
do Bronze a domesticaccedilatildeo dos bovinos levou a uma contiacutenua diminuiccedilatildeo do tamanho corporal
dos animais na Europa Posteriormente este processo teraacute sido interrompido com a introduccedilatildeo
de gado bovino trazido de Roma e muitas raccedilas extinguiram-se apoacutes a queda do Impeacuterio
Romano (EPSTEIN amp MASON 1984)
Esta tendecircncia continuou a observar-se durante a Idade Meacutedia e soacute com a Revoluccedilatildeo
Industrial e a necessidade de abastecer as grandes cidades se produziu um incremento na
criaccedilatildeo de gado (EPSTEIN amp MASON 1984)
Neste domiacutenio a modernizaccedilatildeo da agricultura e a produccedilatildeo intensiva de alimentos teraacute
originado uma contiacutenua diminuiccedilatildeo dos efectivos populacionais de muitas raccedilas autoacutectones
evidente sobretudo durante a uacuteltima metade deste seacuteculo Estas circunstacircncias determinaram
assim a sensibilizaccedilatildeo da sociedade para as consequecircncias do empobrecimento de diversidade
geneacutetica do gado bovino permitindo o estabelecimento de linhas de investigaccedilatildeo destinadas agrave
sua gestatildeo e conservaccedilatildeo (BROWN et ai 1993 FAO 1996)
112 - Paleontologia arqueozoologia
De acordo com os actuais dados paleontoloacutegicos o mais antigo ruminante do Velho
Mundo teraacute aparecido no Mioceno (Gelocus) caracterizando-se pela ausecircncia de incisivos na
mandiacutebula superior e possuindo jaacute uma conformaccedilatildeo do esqueleto idecircntica agrave dos bovinos
actuais (IGLESIAS 1989 e GARCIA et ai 1992) Esta forma viria a originar posteriormente os
quatro geacuteneros actuais de ruminantes Ovis Capra Antilope e Bos (IGLESIAS 1989)
A evidecircncia paleontoloacutegica indica tambeacutem que teratildeo existido na Europa diferentes
espeacutecies de boviacutedeos actualmente extintas Destas apenas o auroque sobreviveu ateacute agrave Idade
Meacutedia havendo documentos escritos que se referem ao local e data da morte do uacuteltimo
exemplar (Poloacutenia 1627) (LOFTUS et ai 1994)
As primeiras representaccedilotildees de bovinos feitas pelo Homem devem precisamente
referir-se a auroques sendo um dos exemplos mais conhecidos constituiacutedo pelas pinturas
rupestres das grutas de Lascaux (Franccedila) (figura 111)
4
Introduccedilatildeo
Figura 111 Pintura rupestre nas paredes de grutas em Lascaux Franccedila Datando de haacute cerca de 15000 anos Reproduzido de FORBES (1986)
Soacute mais tarde surge a evidecircncia de que o processo de domesticaccedilatildeo se poderaacute ter
iniciado De facto alguns achados neoliacuteticos (8000 a 5500 anos aC) provenientes da
Anatoacutelia parecem indicar a presenccedila de animais jaacute domesticados Esta regiatildeo do Sudoeste
Asiaacutetico poderaacute assim constituir o centro de domesticaccedilatildeo do gado bovino a partir de
populaccedilotildees selvagens da subespeacutecie asiaacutetica do auroque (Bos primigenius namadicus)
(EPSTEIN amp MASON 1984)
Outra evidecircncia adicional eacute fornecida pela descoberta de ossos e dentes de um animal
sensivelmente mais pequeno do que o auroque (Iraque 5000 anos aC) bem como por um
primeiro testemunho escrito onde se descreve em placas de argila uma cabeccedila de vaca
(Mesopotacircmia 5000 anos aC) (ROGERSON 1991)
Muitos outros achados arqueoloacutegicos e paleontoloacutegicos foram encontrados na
Mesopotacircmia (4000 anos aC) e no vale do rio Nilo (4000 anos aC) mostrando um bovino
totalmente domesticado e de longos cornos (EPSTEIN amp MASON 1984)
A consolidaccedilatildeo do processo de domesticaccedilatildeo eacute a partir desta altura inquestionaacutevel
tornando-se abundantes os registos de bovinos domesticados na Mesopotacircmia e vale do Nilo
A este respeito devem referir-se especialmente as numerosas esculturas relevos pinturas e
textos em papiro que relatam pormenores da vida quotidiana do povo egiacutepcio e onde aparecem
diversas cenas que mostram a importacircncia do gado bovino na agricultura e na alimentaccedilatildeo
(figura 112)
5
Introduccedilatildeo
Figura 112 Desenho ilustrativo de uma ordenha 5a dinastia Reproduzido de BAINES
amp MEacuteLEK (1980)
A partir desta altura as descobertas arqueozooloacutegicas satildeo testemunho de uma
expansatildeo do gado bovino Assim existem registos datados de haacute cerca de 2000 e 3000 anos
aC que sugerem a ocorrecircncia no Norte de Aacutefrica de animais de enormes cornos em forma de
lira (EPSTEIN amp MASON 1984)
Tal expansatildeo daacute-se tambeacutem pela Turquia indo ateacute ao Caacuteucaso e agrave Ruacutessia e chega
tambeacutem agrave Europa onde nas regiotildees do Norte foram encontrados objectos de arte da idade do
Cobre e do Bronze que representam bovinos e datam do iniacutecio do Cristianismo (EPSTEIN amp
MASON 1984)
A migraccedilatildeo para oriente estaacute tambeacutem bem documentada atraveacutes de numerosos restos
arqueozooloacutegicos descobertos em toda a Aacutesia Eacute contudo nesta regiatildeo geograacutefica que se
pode observar a transiccedilatildeo de gado bovino sem bossa (Bos taurus) para outro com bossa (Bos
indicus) Segundo alguns autores as raccedilas de Bos indiens ou gado zebu derivariam das raccedilas
de Bos taurus ou gado taurino atraveacutes de um processo de selecccedilatildeo (EPSTEIN amp MASON
1984) Alternativamente estes dados podem tambeacutem ser interpretados como a ocorrecircncia de
dois processos de domesticaccedilatildeo independentes seguidos do contacto entre as duas populaccedilotildees
domeacutesticas de gado bovino
Adicionalmente deve salientar-se que a evidecircncia descrita eacute ainda muito incompleta
pelo que a interpretaccedilatildeo dos dados deve ser feita com bastante precauccedilatildeo A tiacutetulo de
exemplo refiram-se os achados arqueozooloacutegicos efectuados na Peniacutensula dos Balcatildes e na
6
Introduccedilatildeo
Macedoacutenia Grega (6200 anos aC) Segundo EPSTEIN amp MASON (1984) estes achados
sugerem que o Sul da Europa poderia constituir o primeiro centro de domesticaccedilatildeo do gado
bovino a partir de onde se teria iniciado a sua expansatildeo em direcccedilatildeo ao resto do continente
europeu Ruacutessia e Sudoeste Asiaacutetico
113 - Anaacutelise geneacutetica
A investigaccedilatildeo sobre a geneacutetica das diferentes raccedilas de gado bovino tem contribuiacutedo de
forma muito significativa para a compreensatildeo da sua histoacuteria dos padrotildees de diversidade que
actualmente as caracterizam e do seu grau de parentesco Os resultados actualmente
disponiacuteveis reportam-se a trecircs domiacutenios principais grupos sanguiacuteneos variaccedilatildeo geneacutetica de
proteiacutenas e polimorfismos do DNA (DNA mitocondrial e microssateacutelites)
Grupos sanguiacuteneos
A primeira tentativa para avaliar o grau de diferenciaccedilatildeo geneacutetica entre raccedilas bovinas e
caracterizar a sua diversidade data do iniacutecio de deacutecada de 70 e envolveu precisamente o
estudo dos diferentes grupos sanguiacuteneos que iam sendo descritos (RUSSELL 1996 USHA
1996) Contudo a maior parte dos resultados natildeo permitiu a obtenccedilatildeo de conclusotildees
definitivas pelo facto de se trabalhar com um nuacutemero relativamente reduzido de loci que
adicionalmente era pouco polimoacuterfico Deve poreacutem referir-se que se dispotildee actualmente de
uma consideraacutevel quantidade de informaccedilatildeo no que se refere agrave distribuiccedilatildeo da variabilidade dos
grupos sanguiacuteneos nas diferentes raccedilas bovinas conferindo a este conjunto de dados uma
importacircncia natildeo despreziacutevel no estudo de eventuais alteraccedilotildees da estrutura geneacutetica de
populaccedilotildees de gado bovino nos uacuteltimos vinte anos (RUSSELL 1996 USHA 1996)
Proteiacutenas
A introduccedilatildeo de teacutecnicas electroforeacuteticas de separaccedilatildeo de proteiacutenas permitiu aumentar
de forma muito consideraacutevel o nuacutemero de sistemas geneacuteticos polimoacuterficos conhecidos nas
raccedilas bovinas em especial no que se refere a proteiacutenas do sangue e do leite (USHA 1996)
A anaacutelise da sua distribuiccedilatildeo populacional veio demonstrar a ocorrecircncia de dois grupos
principais de bovinos ou duas subespeacutecies (Bos primigenius taurus e Bos primigenius
7
Introduccedilatildeo
indiens) cada um deles caracterizado pela presenccedila de diversos alelos privativos em vaacuterios loci
(BRAEND 1971)
Estes resultados estatildeo de uma maneira geral de acordo com dados morfoloacutegicos
histoacutericos e ainda com a distribuiccedilatildeo geograacutefica conhecida dos principais grupos (EPSTEIN amp
MASON 1984) No entanto o acreacutescimo de informaccedilatildeo fornecido por este tipo de marcadores
foi ainda insuficiente para resolver muitas das interpretaccedilotildees contraditoacuterias publicadas sobre o
tema
Polimorfismo do DNA
A introduccedilatildeo das teacutecnicas de anaacutelise genoacutemica directa e em especial a descoberta do
polimorfismo do DNA-mitocondrial (mtDNA) e dos microssateacutelites forneceram os
instrumentos necessaacuterios a uma detalhada caracterizaccedilatildeo geneacutetica das raccedilas bovinas
A anaacutelise da variaccedilatildeo da moleacutecula de mtDNA permitiu verificar que Bos primigenius
taurus e Bos primigenius indicus teratildeo divergido haacute cerca de 210000 anos uma data muito
anterior agrave indicada pelos dados arqueoloacutegicos para o iniacutecio do processo de domesticaccedilatildeo Eacute
assim muito provaacutevel que tenham ocorrido duas domesticaccedilotildees independentes a partir de duas
subespeacutecies diferentes do auroque Bos primigenius namadicus teraacute dado origem ao gado
zebu na Aacutesia (Vale do Indu) e Bos primigenius primigenius ao gado europeu vindo do
Proacuteximo Oriente (LOFTUS et ai 1994a 1994b)
Muito recentemente BRADLEY et ai (1996) e MACHUGH et ai (1997) sugerem ainda
uma terceira domesticaccedilatildeo independente ocorrida em Aacutefrica Esta evidecircncia resulta tambeacutem
de anaacutelise do polimorfismo do mtDNA indicando uma separaccedilatildeo entre os ancestrais do gado
europeu e africano anterior agrave domesticaccedilatildeo (22000 - 26000 anos) Este terceiro processo de
domesticaccedilatildeo ter-se-ia assim efectuado a partir da subespeacutecie africana do auroque (Bos
primigenius opisthonomus)
A descoberta dos microssateacutelites e do seu elevado grau de polimorfismo data do fim da
deacutecada de 80 (Lm amp LUTY 1989 WEBER amp MAY 1989) e constitui provavelmente a
metodologia mais adequada para estudar a histoacuteria recente da diversificaccedilatildeo das raccedilas bovinas
(MACHUGH et ai 1994 ARRANZ et ai 1996) Os primeiros resultados que envolvem uma
caracterizaccedilatildeo em larga escala de diferentes populaccedilotildees permitiram distinguir mais claramente
a estrutura geneacutetica dos dois grandes grupos de gado bovino (Bos taurus e Bos indicus) e
constituem a base para futuros estudos mais especiacuteficos
8
Introduccedilatildeo
Por outro lado os microssateacutelites permitiram tambeacutem o iniacutecio do projecto de
cartografia do genoma bovino que no fim de 1994 contabilizava 202 marcadores geneacuteticos
(dos quais 144 eram microssateacutelites) regularmente espaccedilados em 90 do seu comprimento
Cerca de um ano depois existiam jaacute mais de 400 microssateacutelites (USHA et ai 1995) levando
EGGEN et ai (1995) a apresentar um trabalho de revisatildeo e consolidaccedilatildeo de informaccedilatildeo jaacute
existente para evitar a ocorrecircncia de possiacuteveis redundacircncias
A aplicaccedilatildeo deste tipo de marcadores natildeo se restringe apenas agrave anaacutelise da diversidade
geneacutetica populacional e agrave construccedilatildeo de mapas geneacuteticos De facto satildeo actualmente escolhidos
para a realizaccedilatildeo de testes de paternidade (GLOWATZKI-MULLIS et ai 1995 USHA et ai 1995
ARRANZ et ai 1996) detecccedilatildeo de loci que determinam a expressatildeo de caracteriacutesticas
quantitativas (QTL) (RON et ai 1994) determinaccedilatildeo do sexo em embriotildees selecccedilatildeo animal
assistida entre outros
No seu conjunto estes resultados tecircm permitido um avanccedilo notaacutevel na compreensatildeo da
evoluccedilatildeo das actuais raccedilas bovinas A prossecuccedilatildeo desta via de investigaccedilatildeo poderaacute levar ao
esclarecimento definitivo do nuacutemero de domesticaccedilotildees independentes que teraacute ocorrido
(EPSTEIN amp MASON 1984 LOFTUS et al 1994a 1994b BRADLEY et al 1996 MACHUGH et
al 1997) a partir das populaccedilotildees selvagens de auroque Seguidamente eacute legiacutetimo esperar que
venha a ser possiacutevel analisar a uma escala mais fina o grau de parentesco geneacutetico entre raccedilas
que ocupem aacutereas geograacuteficas mais reduzidas Neste particular seraacute extremamente interessante
incluir as populaccedilotildees ibeacutericas e em especial a raccedila Barrosatilde
9
Introduccedilatildeo
12 - A DIVERSIDADE DAS RACcedilAS BOVINAS
A domesticaccedilatildeo resultou na criaccedilatildeo de milhares de raccedilas de animais domeacutesticos
geneticamente diferentes e adaptadas agraves necessidades humanas e a uma grande variedade de
condiccedilotildees ambientais (FAO 1993)
121 - As raccedilas ibeacutericas
A grande diversidade de raccedilas bovinas da Peniacutensula Ibeacuterica poderaacute dever-se em parte
agrave introduccedilatildeo de outras raccedilas domeacutesticas que se cruzaram entre si e com bovinos jaacute existentes
na Peniacutensula A introduccedilatildeo de outras raccedilas teraacute sido feita de duas formas distintas
1 - atraveacutes dos movimentos migratoacuterios acompanhando as vaacuterias invasotildees de povos
vindos do oriente como eacute o caso dos Feniacutecios ( seacutec X aC) Gregos (seacutec VII aC) e
Romanos (seacutec III aC) Estes uacuteltimos dominaram completamente a Peniacutensula durante
7 seacuteculos e teratildeo contribuiacutedo para a diversificaccedilatildeo do gado bovino pelo facto de
introduzirem animais de caracteriacutesticas diferentes Supotildee-se que do seu cruzamento
com os bovinos ibeacutericos se teratildeo originado os troncos aquitacircnico e ibeacuterico (MIRANDA
do VALE 1949)
2 - atraveacutes da introduccedilatildeo de animais do Norte de Aacutefrica na sequecircncia da invasatildeo de
povos como os Cartagineses (seacutec V aC) e jaacute na era cristatilde os Mouros (711 dC)
Estes teratildeo introduzido descendentes de Bos primigenius opisthonomus que poderaacute
ter influenciado a formaccedilatildeo de vaacuterias raccedilas ibeacutericas nomeadamente as raccedilas Barrosatilde e
Cachena (APARIacuteCIO 1960 in IGLESIAS 1989 EPSTEIN amp MASON 1984) Estas
poderatildeo assim constituir uma linha que descende do tronco mauritaacutenico (MIRANDA
do VALE 1949)
10
Introduccedilatildeo
Adicionalmente eacute provaacutevel que povos oriundos do Norte da Europa nomeadamente
os Visigodos possam ter introduzido gado bovino dessa regiatildeo Contudo a sua eventual
contribuiccedilatildeo para a diversidade de raccedilas bovinas da Peniacutensula Ibeacuterica estaacute por esclarecer
122 - A raccedila Barrosatilde
Aspectos histoacutericos da dispersatildeo e evoluccedilatildeo do efectivo populacional
O centro de criaccedilatildeo da raccedila Barrosatilde situa-se actualmente na zona do planalto da Serra
do Barroso abrangendo os actuais concelhos de Montalegre Boticas Vieira do Minho
(freguesias de Campos e Ruivatildees) e Cabeceiras de Basto (freguesia de Gondiatildees) Esta regiatildeo
natildeo possui condiccedilotildees agro-climateacutericas que permitam grandes exploraccedilotildees agriacutecolas pelo que
uma parte importante da populaccedilatildeo se dedica agrave criaccedilatildeo de gado (GARCIA et ai 1981
FERNANDES 1996)
Vivendo sobretudo em zonas montanhosas a Barrosatilde eacute utilizada essencialmente como
forccedila de trabalho e na produccedilatildeo de carne de excelente qualidade motivo pelo qual a Uniatildeo
Europeia a reconhece com denominaccedilatildeo de Origem Protegida (FERNANDES 1996)
No seacuteculo passado e iniacutecio do seacuteculo XX existia um grande incentivo para a criaccedilatildeo
desta raccedila devido agrave procura da sua carne muito apreciada em Inglaterra Este incentivo
contribuiu indirectamente para que a estatura dos animais se elevasse (GARCIA et ai 1981) e
para que a zona de criaccedilatildeo se dispersasse pelas aacutereas submontanhosas e pelas planiacutecies do
Entre Douro e Minho ateacute agrave orla mariacutetima chegando mesmo ao concelho de Vila Nova de Gaia
(figura 121) Nestas zonas fazia-se a criaccedilatildeo de novilhos para exploraccedilatildeo como bois de
trabalho e para produccedilatildeo de carne Tal exploraccedilatildeo estaacute bem patente nos paineacuteis de azulejos da
estaccedilatildeo de caminhos de ferro de S Bento no Porto e mesmo nos desenhos das calccediladas nas
principais avenidas desta cidade
li
Introduccedilatildeo
B
bull bull bull _ bull bull bull - bull bull
Figura 121 A) Junta de bois de trabalho de raccedila Barrosatilde B) Fecircmea adulta Barrosatilde C) Macho adulto Barrosatilde Fotografias datadas de 1949 gentilmente cedidas pela Direcccedilatildeo Regional de Agricultura de Entre Douro e Minho - Centro de Produccedilatildeo Animal (DRAEDM)
12
Introduccedilatildeo
Poreacutem a necessidade de maiores produccedilotildees de carne foi conduzindo durante a
segunda metade deste seacuteculo a um progressivo decliacutenio no efectivo populacional da raccedila
Barrosatilde tornando-se mesmo raro poder observar uma junta de bois Recentemente as
alteraccedilotildees verificadas na poliacutetica agraacuteria e ambiental da Uniatildeo Europeia teratildeo permitido
alguma recuperaccedilatildeo Nesse contexto a criaccedilatildeo em 1981 do Livro Genealoacutegico da raccedila
Barrosatilde constitui um passo importante para a certificaccedilatildeo dos animais e o aumento do seu
valor Actualmente o seu efectivo populacional tem crescido continuamente e essa tendecircncia
parece estaacutevel
Segundo dados fornecidos pelo Registo Zooteacutecnico e pela Associaccedilatildeo do Minho dos
Criadores de Bovinos de Raccedila Barrosatilde (AMTOA) existiam em 1996 38002 fecircmeas
reprodutoras inscritas e 375 touros de cobriccedilatildeo (tabela 1221) distribuiacutedos por vaacuterios
concelhos dos distritos de Viana do Castelo Braga Vila Real e Porto (figura 122)
Tabela 1221 Movimento do Registo Zooteacutecnico relativo agrave raccedila Barrosatilde
Vacas Inscritas Postos de Cobriccedilatildeo Vitelos Anos Abatidas Registadas Inscritas Encerrados Recenseados Existecircncias Inscritos 1981 0 4884 4882 1 25 24 0 1982 19 6169 11032 6 42 60 532 1983 31 4436 15437 14 35 81 1593 1984 72 866 16231 13 14 82 2151 1985 47 604 16788 15 15 82 1767 1986 106 1027 17709 18 13 77 2414 1987 72 1186 18823 2 14 89 2632 1988 122 1192 19877 5 7 91 2574 1989 138 718 20506 14 26 103 2532 1990 89 1017 21440 8 7 102 2404 1991 159 1309 22590 14 26 114 2531 1992 52 1902 24440 6 17 125 3203 1993 0 4205 28645 37 87 175 4077 1994 0 6248 34893 58 111 228 4679 1995 340 2447 37000 0 112 340 5759 1996 120 1122 38002 26 61 375 5901
Fonte Registo Zooteacutecnico (cedido pela AM1BA)
Apesar desta situaccedilatildeo favoraacutevel natildeo se pode considerar que a raccedila Barrosatilde natildeo corra
ainda perigo de extinccedilatildeo Na verdade satildeo vaacuterios os factores que tecircm contribuiacutedo para a
diminuiccedilatildeo da sua aacuterea de criaccedilatildeo ou mesmo para a alteraccedilatildeo das caracteriacutesticas destes
animais De entre esses factores deve salientar-se i) a substituiccedilatildeo de Barrosatilde por outras raccedilas
autoacutectones (Minhota Mirandesa Maronesa) ou importadas (Friacutesia Gelbvieh e Parda Suiacuteccedila)
13
Introduccedilatildeo
que fornecem ao agricultor um rendimento superior ii) a progressiva mecanizaccedilatildeo da
agricultura e a diminuiccedilatildeo das aacutereas de pastagem iii) o pequeno nuacutemero de machos
reprodutores associado a um efectivo idoso iv) uma baixa fertilidade meacutedia grandes
intervalos entre partos e elevado nuacutemero de abortos e v) desmotivaccedilatildeo dos produtores mesmo
em face das actuais condiccedilotildees de comercializaccedilatildeo
LEGENDA
| j - -Concelhos de Entre Douro e Minho S Concelhos de Traacutes-os-Montes
ESCALA 11380000
Figura 122 Mapa de distribuiccedilatildeo do actual efectivo Barrosatilde
14
Introduccedilatildeo
Aspectos morfoloacutegicos
O bovino Barrosatilde apresenta uma estatura mediana com 121-130 cm de altura agrave
cernelha e pelagem de cor castanha (variando entre a cor de palha ateacute a cor acerejada) (LEAL
1995) A cabeccedila eacute curta e larga encimada por uma cornamenta em forma de lira alta os
cornos satildeo muito compridos e espessos de cor branca suja com pontas escuras o conjunto
ocular eacute saliente dando-lhe o aspecto de olhos de sapo as orelhas satildeo de tamanho meacutedio os
membros satildeo curtos e pouco ossudos e o pescoccedilo eacute curto bem ligado agrave cabeccedila e com garrote
largo (MARTINS 1982)
Eacute uma raccedila com caracteres sexuais secundaacuterios bem diferenciados Os touros satildeo
normalmente mais escuros particularmente no terccedilo anterior com maior corpulecircncia do que as
fecircmeas mais robustos com barbela mais desenvolvida cabeccedila mais curta e mais larga cornos
mais grossos e ligeiramente mais curtos (GARCIA et ai 1981 MARTINS 1982)
Esta raccedila apresenta duas particularidades morfoloacutegicas que a distinguem de todas as
outras raccedilas grande desenvolvimento coacuterneo e perfil cocircncavo da cabeccedila com acentuado
prognatismo mandibular O elevado crescimento coacuterneo poderaacute estar relacionado com a
selecccedilatildeo dos animais De facto nas populares chegas de touros o animal que sai vencedor seraacute
o touro cobridor das vacas da aldeia Este processo teraacute permitido a primazia de touros de
maior ossatura capital mais potente musculatura ceacutefalo-cervical maior forccedila no acircngulo taacutersico
e consequentemente grande desenvolvimento dos cornos (MIRANDA do VALE in GONCcedilALVES GARCIA 1964 ARAUacuteJO 1986) No que se refere ao acentuado prognatismo
mandibular eacute possiacutevel que em parte esteja relacionado com o grande desenvolvimento
coacuterneo Este teraacute exigido um desenvolvimento correlativo de certos ossos cranianos e o
atrofiamento dos ossos da face (GONCcedilALVES GARCIA 1964)
Origem
A origem da raccedila Barrosatilde e o seu enquadramento com as outras raccedilas da Peniacutensula
Ibeacuterica estaacute ainda por explicar constatando-se uma grande heterogeneidade na opiniatildeo de
diversos autores a este respeito (MARTINS 1982)
Alguns autores referem a existecircncia no Norte de Aacutefrica (vale do Nilo) de um gado
com caracteriacutesticas morfoloacutegicas semelhantes agrave actual raccedila Barrosatilde em especial no que se
refere agrave forma tamanho e espessura dos cornos Este gado eacute normalmente associado agrave
15
Introduccedilatildeo
designaccedilatildeo subespeciacutefica Bos primigenius opisthonomus (embora tambeacutem se refira como Bos
primigenius mauritaniens e como Bos taurus desertorum) e teraacute chegado agrave Peniacutensula Ibeacuterica
atraveacutes de vaacuterias rotas migratoacuterias dos povos norte-africanos A raccedila Barrosatilde poderia assim
ser incluiacuteda no tronco mauritaacutenico tendo como ancestral Bos primigenius mauritanicus
(GARCIA et ai 1981)
Neste contexto poderaacute admitir-se que o gado que corresponde a este grupo se tenha
instalado na Peniacutensula Ibeacuterica provavelmente durante a longa ocupaccedilatildeo Moura (GONCcedilALVES
GARCIA 1964) Posteriormente a raccedila Barrosatilde teraacute sido desalojada pelos troncos ibeacuterico e
aquitacircnico restando apenas um nuacutecleo populacional confinado agraves zonas planaacutelticas do
Barroso onde permaneceu ateacute hoje (GONCcedilALVES GARCIA 1964)
Esta hipoacutetese natildeo eacute contudo partilhada por outros autores que lhe criticam a escassa
evidecircncia (forma e tamanho dos cornos) e portanto uma clara ausecircncia de base cientiacutefica
(IGLESIAS 1989)
Perante o exposto pode verificar-se que a raccedila Barrosatilde apresenta aspectos
morfoloacutegicos e histoacuterico-evolutivos muito peculiares sendo ainda hoje difiacutecil proceder ao seu
enquadramento no seio das restantes raccedilas bovinas ibeacutericas O aprofundamento da investigaccedilatildeo
sobre a estrutura geneacutetica das suas populaccedilotildees poderaacute ser assim uma via para o
esclarecimento das muitas questotildees que permanecem por responder Nestas condiccedilotildees este
trabalho pretende ser uma contribuiccedilatildeo para o conhecimento da geneacutetica das populaccedilotildees da
raccedila bovina Barrosatilde atraveacutes da consecuccedilatildeo dos seguintes objectivos
1 estudo da variabilidade geneacutetica da raccedila Barrosatilde ao niacutevel das proteiacutenas eritrocitaacuterias
e plasmaacuteticas
2 desenvolvimento e afinaccedilatildeo de teacutecnicas de separaccedilatildeo de proteiacutenas por electroforese
e focagem isoeleacutectrica e sua detecccedilatildeo especiacutefica (histoquiacutemica e imunoloacutegica)
3 anaacutelise familiar dos polimorfismos encontrados
4 avaliaccedilatildeo do grau de diferenciaccedilatildeo geneacutetica existente entre a raccedila Barrosatilde e outras
raccedilas bovinas
16
Material e Meacutetodos
2 - MATERIAL E MEacuteTODOS
21 - AMOSTRAGEM E CONSERVACcedilAtildeO DAS AMOSTRAS
211 - Amostragem
Foram recolhidas 356 amostras de sangue correspondente a 294 indiviacuteduos de raccedila
Barrosatilde (dos quais 141 estavam inscritos no Livro Genealoacutegico) e 62 indiviacuteduos de raccedila
Minhota As colheitas efectuaram-se em zonas de intensa criaccedilatildeo da Barrosatilde designadamente
nos concelhos de Arcos de Valdevez Cabeceiras de Basto Fafe Poacutevoa de Lanhoso e
Monccedilatildeo em finais de 1993 durante o ano de 1994 e ainda no periacuteodo de 1996 1997 em
Vieira do Minho
A recolha de sangue em indiviacuteduos de raccedila Minhota foi efectuada com a finalidade de
servir como termo de comparaccedilatildeo geneacutetica uma vez que se realizam cruzamentos entre esta
raccedila e a Barrosatilde
212 - Obtenccedilatildeo e conservaccedilatildeo das amostras de sangue
O sangue foi colhido da veia jugular em tubos contendo 01 ml de EDTA (aacutecido
etilnodiaminotetraceacutetico) dissoacutedico a 10 ou em tubos heparinados
As amostras de sangue foram centrifugadas (10 minutos a 13000 rpm) separando-se
em seguida o plasma dos eritroacutecitos Aos eritroacutecitos foi adicionado meio de glicerol (seis
partes de uma soluccedilatildeo 5 de citrato trissoacutedico 2H20 adicionados a quatro partes de glicerol)
numa proporccedilatildeo aproximada de 21 as amostras foram conservadas a -20degC
17
Material e Meacutetodos
22 - BATERIA DE MARCADORES GENEacuteTICOS SELECCIONADOS
No presente trabalho foi escolhida uma bateria de 12 marcadores geneacuteticos dispersos
no genoma do bovino (figura 5) HB (Hemoglobina) CAII (Anidrase carboacutenica) PEPB
(Peptidase B) DIA (Diaforase) NP (Fosforilase nucleosiacutedica) MDH (Desidrogenase do
malato) PGD (Desidrogenase do aacutecido fosfoglucoacutenico) GPI (Isomerase da fosfoglucose)
MPI (Isomerase da manose-6-fosfato) ALB (Albumina) TF (Transferrina) e GC
(Componente especiacutefico de grupo)
CP SODl TF
PEPC IDH1
AMY1 AMY1A PGM1
4
LDHB PEPB
ADH2 PGM2 ALB GC SOD3
6
IADA
ALDH1
CAII
ME1 PGM3 SOD2
NP
10
CAT HBBq22-q27
PGD IALDH2 DIA4
HP GPIq22-q24
MPI iBF GLOl
LDHA MDH2
Figura 221 Localizaccedilatildeo de vaacuterios loci proteicos no genoma de Bos taurus Com um tom mais carregado indicam-se os marcadores estudados neste trabalho Adaptado de FRIES et ai (1993)
18
Material e Meacutetodos
bull HB
A hemoglobina eacute responsaacutevel pelo transporte do oxigeacutenio dos pulmotildees para os tecidos
A sua estrutura eacute tetrameacuterica tendo cada uma das quatro subunidades um grupo prosteacutetico -
- heme - com um aacutetomo de ferro no centro A fracccedilatildeo principal da hemoglobina de mamiacuteferos
adultos eacute composta por duas cadeias a e duas cadeias P (BRAEND 1971 CECCHINI amp Nus
1986)
O locus da HB foi um dos primeiros a ser estudado apresentando polimorfismo em
vaacuterios mamiacuteferos (CECCHJM amp Nus 1986 BRAEND et ai 1988 CLARKE et ai 1989 WANG
et ai 1990 SELVARAJ et ai 1991) Em 1955 CABANNE amp SERAIN (in BRAEND 1988)
descrevem pela primeira vez o polimorfismo da HB em bovinos do Norte da Aacutefrica
Posteriormente muitos estudos foram efectuados descrevendo-se 13 variantes (raros na sua
maioria) com diferenccedilas apenas nas cadeias beta (CECCHINI amp Nus 1986 BRAEND 1988)
bull CAII-EC4211
A CAII eacute uma metaloenzima com grande distribuiccedilatildeo nos animais e nas plantas
(TASHIAN 1989) Catalisa de forma reversiacutevel a hidrataccedilatildeo do C02 em H2C03 (CECCHINI amp
Nus 1986 TASHIAN 1989) O seu papel fisioloacutegico ainda natildeo eacute bem conhecido mas eacute
possiacutevel que tenha participaccedilatildeo na manutenccedilatildeo do balanccedilo osmoacutetico (TASHIAN 1989)
A ocorrecircncia de variaccedilatildeo geneacutetica na CAII estaacute descrita em muitas espeacutecies de
mamiacuteferos tendo sido descritos dois loci polimoacuterficos (CAI e CAII) (TASHIAN amp CARTER
1976 CLARICE et ai 1989 SELVARAJ et ai 1991)
SARTORE et ai (1969) foram os primeiros a detectar polimorfismo electroforeacutetico da
anidrase carboacutenica em bovinos domeacutesticos e buacutefalos americanos Nos eritroacutecitos de bovinos
apenas se exprime a anidrase carboacutenica II que apresenta geralmente 2 alelos codominantes
autossoacutemicos (CAIPF e CAIPS) (SARTORE et ai 1969 TASHIAN amp CARTER 1976) Mais
tarde foram encontrados 3 novos alelos (C Z e X) (CECCHINI amp Nus 1986)
19
Material e Meacutetodos
bull PEPB-EC3412
As peptidases formam um conjunto de enzimas capazes de hidrolisar di- e tripeacuteptidos
caracterizando-se pela sua especificidade em relaccedilatildeo a diversos substratos bem como atraveacutes
da sua distribuiccedilatildeo tecidular
A PEPB apresenta uma estrutura monomeacuterica tendo sido descrita como polimoacuterfica
em algumas raccedilas brasileiras de bovinos de origem europeia e indiana (DEL LAMA et ai
1992)
bull DIA-EC1643
A enzima monomeacuterica DIA (NADH - Methemoglobina redutase) tambeacutem conhecida
por citocromo bs redutase faz parte de um grupo de enzimas que catalisam a reduccedilatildeo da
methemoglobina (IGLESIAS 1989 VIEIRA 1993 kRAHhetal 1986)
O seu polimorfismo geneacutetico foi detectado em vaacuterias espeacutecies de Ungulados incluindo
os bovinos (CLARKE et ai 1989 IGLESIAS 1989 SELVARAJ et ai 1991 TATE amp McEWAN
1992)
bull NP-EC2421
A enzima NP encontra-se distribuiacuteda por vaacuterios tecidos e oacutergatildeos e catalisa
reversivelmente a fosforoacutelise dos nucleosiacutedeos puriacutenicos levando agrave formaccedilatildeo das respectivas
bases e ribose-1-fosfato (IGLESIAS 1989)
O polimorfismo geneacutetico desta enzima foi detectado em vaacuterias espeacutecies de mamiacuteferos
incluindo os bovinos (ANSAY 1973 HARRIS amp HOPKINSON 1978 TUKER amp YOUNG 1988
CLARKE eacutetal 1989 IGLESIAS 1989 FERRAND 1995)
20
Material e Meacutetodos
bull MDH-ECl 1137
A MDH eacute uma oxirredutase dimeacuterica na maioria dos mamiacuteferos responsaacutevel pela
oxidaccedilatildeo do L-malato em oxoglutarato com NAD como aceitador A reacccedilatildeo eacute reversiacutevel em
presenccedila de NADH e oxaloacetato A enzima diz-se NAD especiacutefica pelo facto da reacccedilatildeo soacute
ocorrer na presenccedila deste cofactor (MORAIS 1992 PEREIRA 1997)
A ocorrecircncia de variaccedilatildeo geneacutetica neste locus foi descrita para vaacuterios mamiacuteferos
(HARRIS amp HOPKINSON 1978 TUNOacuteN et ai 1989 SELVARAJ et ai 1991) Contudo
relativamente aos bovinos natildeo foi possiacutevel encontrar referecircncias quanto ao seu polimorfismo
bull PGD-EC11144
A PGD eacute uma enzima dimeacuterica envolvida na via das pentoses-fosfato catalisando a
conversatildeo de 6-fosfogluconato em ribose-5-fosfato
O polimorfismo geneacutetico do locus PGD estaacute descrito em diversas espeacutecies de
Ungulados (HERZOG 1988 PENEDO et ai 1988 BEKENEV amp ORLO VA 1991 KUROSAWA amp
TANAKA 1991 JANZEN amp COTHRAN 1991 FERNDALE et al 1992) Contudo relativamente
aos bovinos natildeo foi possiacutevel encontrar referecircncias quanto ao seu polimorfismo
bull GPI-EC5319
A isomerase da fosfoglucose cataliza a reacccedilatildeo reversiacutevel de conversatildeo de glucose-
-6-fosfato em frutose-6-fosfato (HARRIS amp HOPKINSON 1978 PRETSCHei ai 1990)
Eacute uma enzima dimeacuterica com polimorfismo geneacutetico em vaacuterias espeacutecies de mamiacuteferos
nomeadamente no catildeo (ARNOLD amp Bouw 1989) no porco (VAN DE WEGHE et ai 1988
BEKENEV amp ORLO VA 1991) na ovelha (RASERO et ai 1993) em lamas e alpacas (PENEDO et
ai 1988) e no Homem (HARRIS amp HOPKINSON 1978)
21
Material e Meacutetodos
bull MPI-EC5318
A MPI eacute uma enzima monomeacuterica de acccedilatildeo cataliacutetica que permite a isomerizaccedilatildeo de D-
-manose-6-fosfato em D-frutose-6-fosfato
Em diversas espeacutecies de mamiacuteferos nomeadamente no Homem (RlTTER et ai 1974)
em babuiacutenos (RITTER amp SCHMITT 1973) e ratos (NICHOLS et ai 1973 VANDEBERG amp
AIVALIOTIS 1990) esta enzima natildeo apresenta actividade em eritroacutecitos sendo poreacutem
detectada em diversos tecidos como rim fiacutegado e o muacutesculo Mais tarde demonstrou-se a
possibilidade de proceder a esta detecccedilatildeo em hemolisados de cavalos coelhos e lebres (HALL
et ai 1991 VIEIRA amp FERRAND 1995 SANTOS 1995)
O polimorfismo geneacutetico de MPI em bovinos foi descrito por ANSAY (1973)
apresentando trecircs alelos autossoacutemicos codominantes (MPPA MPIB e MPIC)
bull ALB
A albumina eacute a proteiacutena mais abundante no plasma dos mamiacuteferos e apresenta uma
estrutura monomeacuterica A sua funccedilatildeo estaacute relacionada com processos de transporte e de
regulaccedilatildeo do balanccedilo osmoacutetico (CECCHTNI amp Nus 1986 CARTER et al 1989)
O polimorfismo geneacutetico da albumina estaacute descrito em vaacuterias espeacutecies de Ungulados
(STORMONT et ai 1963 BOWLING amp CLARK 1988 PENEDO et ai 1988 ERHARDT 1991
SELVARAJeacutetfa 1991CRISTOFALOpounda 1992 ERHARDT amp SlMIANER 1993)
EFREMOV e ASHTON em 1965 (in CECCHTNI amp Nus 1986) descrevem pela primeira vez
polimorfismo geneacutetico em raccedilas bovinas inglesas Inicialmente encontraram-se dois alelos
(ALBA ou ALBF e ALBB ou ALBS) por electroforese aacutecida Mais tarde descreveram-
-se outros alelos em raccedilas britacircnicas (ALBH e ALBG) e em raccedilas africanas (ALBD
ALBE e ALBF) (CECCHINI amp Nus 1986) ABE et ai em 1971 descrevem o alelo ALBX
(in CECCHTNI amp Nus 1986)
22
Material e Meacutetodos
bull TF
A transferrina eacute uma 3-globulina seacuterica responsaacutevel pelo transporte do ferro Possui
uma estrutura monomeacuterica glicosilada (CECCHINI amp Nus 1986 WELCHS 1990 PENHALLOW
et ai 1991 CUNHA 1994)
O polimorfismo geneacutetico desta proteiacutena foi detectado em vaacuterias espeacutecies de Ungulados
(KRISTJANSSON 1963 STORMONT et ai 1963 ASHTON 1965 GAHNE et ai 1977 CECCHJNI
amp Nus 1986 ERHARD 1986 KUROSAWA amp TANAKA 1988 PENEDO et ai 1988 CLARKE et
ai 1989 HERZOG 1989 JUNEJA et ai 1989 TSUJI et ai 1989 SCHNEIDER et ai 1990
STRATIL et ai 1990 WANG et ai 1990 SELVARAJ et ai 1991 DRATCH et ai 1992
VANKAN amp BELL 1992a CIacuteZovket ai 1993 ERHARD et ai 1993)
ASHTON em 1965 descreveu pela primeira vez o polimorfismo geneacutetico de TF em
bovinos estando actualmente descritos sete alelos TFA TFB TFD1 TFD2 TFE
TFF e TFG (CECCHTNI amp Nus 1986) A subdivisatildeo do alelo TFD em TFD1 e TFD2 foi
descrita por KRISTJANSSON amp HICKMAN (1965)
Nos bovinos os loci TF e CP encontram-se ligados como tem sido descrito para vaacuterias
espeacutecies de mamiacuteferos (JUNEJA et ai 1989)
bull GC
A GC apresenta uma estrutura monomeacuterica e o seu polimorfismo geneacutetico estaacute descrito
em vaacuterias espeacutecies de Ungulados (GAHNE 1963 KRISTJANSSON 1963 JUNEJA et ai 1987
PENEDO et ai 1988 PENEDO amp JUNEJA 1989 KALAacuteB et ai 1990 ERHARDT 1991 VANKAN
amp BELL 1992b STERN et ai 1992 ERHARDT amp SIMIANER 1993 STRATIL et ai 1995)
Nos bovinos o polimorfismo geneacutetico da GC foi inicialmente descrito por GAHNE
(1963) e ASHTON (1963) in GAHNE et ai 1977) mas soacute mais tarde foi possiacutevel obter
frequecircncias geacutenicas para este locus (alelos GCA e GCB) em diferentes raccedilas europeias
(GAHNE et ai 1977) A utilizaccedilatildeo de novas teacutecnicas de separaccedilatildeo permitiu distinguir um
terceiro alelo GCC (VAN DE WEGHE 1982)
23
Material e Meacutetodos
A existecircncia de ligaccedilatildeo factorial entre os loci ALB e GC foi demostrada no Homem
em primeiro lugar e depois nos cavalos nos bovinos e na ovelha (VAN DE WEGHE 1982
ERHARDT amp SlMIANER 1993)
23 - TRATAMENTO DAS AMOSTRAS
bull HB
A separaccedilatildeo da moleacutecula HB por focagem isoeleacutectrica foi feita mediante a utilizaccedilatildeo de
hemolisados diluiacutedos 18 em aacutegua bidestilada
bull CAII
A separaccedilatildeo electroforeacutetica de CAII foi realizada em gel de amido e em focagem
isoeleacutectrica No primeiro caso as amostras foram simplesmente tratadas com tolueno
enquanto no segundo se procedeu ainda agrave sua reduccedilatildeo com uma soluccedilatildeo de ditiotreitol
(DTT) 120 mM (100 uacute de amostra natildeo diluiacuteda e 20 pi de DTT 120 mM) durante 1 h a 37degC
Quando se utilizou focagem isoeleacutectrica aleacutem do tratamento jaacute referido foi necessaacuterio
realizar uma diluiccedilatildeo final de 110 com aacutegua bidestilada
bull PEPB DIA NP MDH PGP GPI e MPI
As separaccedilotildees electroforeacuteticas de PEPB DIA NP MDH PGD GPI e MPI em gel de
amido foram efectuadas com hemolisados natildeo diluiacutedos submetidos ao mesmo tratamento
descrito para CAII quando separada por electroforese convencional
24
Material e Meacutetodos
bull ALB
Na separaccedilatildeo de ALB por focagem isoeleacutectrica utilizaram-se amostras de plasma
diluiacutedas com aacutegua bidestilada na proporccedilatildeo de 170
bull TF
Na separaccedilatildeo de TF efectuada por focagem isoeleacutectrica utilizaram-se amostras de
plasma submetidas a vaacuterios tipos de tratamento para comparaccedilatildeo dos padrotildees de bandas
obtidos
1 Remoccedilatildeo dos resiacuteduos de aacutecido siaacutelico da moleacutecula de TF
diluiccedilatildeo 13 com neuraminidase durante 1 h a 37 degC
2 Remoccedilatildeo do Fe da moleacutecula de TF
diluiccedilatildeo 13 com EDTA-dissoacutedico (20) 2 h antes da aplicaccedilatildeo para remoccedilatildeo dos
aacutetomos de Fe da moleacutecula de TF
3 Saturaccedilatildeo em Fe da moleacutecula de TF
31 - diluiccedilatildeo 13 com soluccedilatildeo de sulfato de amoacutenio feacuterrico 015 (pv) em aacutecido
ciacutetrico 60 mM seguida de incubaccedilatildeo agrave temperatura ambiente 18 h A utilizaccedilatildeo
de uma razatildeo ligante Fe de 201 permite uma raacutepida saturaccedilatildeo da moleacutecula de
TF (FERRAND 1995)
32 - diluiccedilatildeo 13 com soluccedilatildeo de sulfato de amoacutenio ferroso 015 (pv) em aacutecido
ciacutetrico 60 mM seguida de incubaccedilatildeo agrave temperatura ambiente 18 h
33 - diluiccedilatildeo 13 com soluccedilatildeo de citrato de amoacutenio feacuterrico 015 (pv) em aacutecido
ciacutetrico 60 mM seguida de incubaccedilatildeo agrave temperatura ambiente 18 h
34 - diluiccedilatildeo 13 com soluccedilatildeo de citrato feacuterrico 015 (pv) em aacutecido ciacutetrico
60 mM seguida de incubaccedilatildeo agrave temperatura ambiente 18 h
35 - diluiccedilatildeo 13 com soluccedilatildeo de cloreto de ferro 015 (pv) em aacutecido ciacutetrico
60 mM seguida de incubaccedilatildeo agrave temperatura ambiente 18 h
25
Material e Meacutetodos
Antes da inserccedilatildeo as amostras foram parcialmente purificadas atraveacutes da adiccedilatildeo de 5
volumes de uma soluccedilatildeo de rivanol 06 (pv) em tampatildeo Tris HC1 005 M (ajusta-se o pH
para valores de 91 com Tris 1 M) seguida de centrifugaccedilatildeo
bull GCcedil
A fim de proceder agrave remoccedilatildeo dos resiacuteduos de aacutecido siaacutelico existente nas cadeias de
hidratos de carbono ligadas agrave moleacutecula GC as amostras de plasma foram submetidas a uma
incubaccedilatildeo com uma soluccedilatildeo de neuraminidase Clostridium perfringens SIGMA type V 18
Uml) na proporccedilatildeo de 13 durante 18 h a 37degC acrescentando-se posteriormente aacutegua
bidestilada ateacute agrave obtenccedilatildeo de uma diluiccedilatildeo final de 14 Paralelamente procedeu-se a uma
diluiccedilatildeo das amostras com aacutegua bidestilada (19) para comparaccedilatildeo dos padrotildees de bandas
obtidos
24 - MEacuteTODOS DE SEPARACcedilAtildeO
Electroforese convencional
Nas teacutecnicas de electroforese convencional foram utilizados vaacuterios sistemas de tampatildeo
para os geacuteis e para as pontes conforme a proteiacutena em estudo
Focagem isoeleacutectrica
Os sistemas de focagem isoeleacutectrica utilizados na separaccedilatildeo de proteiacutenas foram
realizados em matrizes de poliacrilamida (T = 5 C = 3) com dimensotildees 230xl00x03mm
Os geacuteis foram aplicados sobre uma peliacutecula de suporte GELFIX (SERVA) permitindo o seu
manuseamento adequado
A adiccedilatildeo de soluccedilotildees de TEMED 10 (pv) e persulfato de amoacutenio (PSA) 10 (pv)
permitiu a polimerizaccedilatildeo do gel agrave temperatura ambiente (24 horas) ou a 37 degC durante 1 h
As separaccedilotildees por focagem isoeleacutectrica decorreram sobre placa de arrefecimento a
aproximadamente 10degC (8 - 12degC)
26
Material e Meacutetodos
HB
A separaccedilatildeo da moleacutecula de HB foi realizada por focagem isoeleacutectrica em gradiente de
pH livre segundo a teacutecnica descrita por FERRAND (1995) com algumas modificaccedilotildees
A composiccedilatildeo da soluccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo e os paracircmetros eleacutectricos utilizados estatildeo
indicados nas tabelas 241 e 242 respectivamente
Tabela 241 Soluccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo utilizada para a separaccedilatildeo da moleacutecula nativa de HB por focagem isoeleacutectrica
Componentes da soluccedilatildeo Quantidades
Acrilamida 28 (pv)
Bisacrilamida 2 (pv)
Sacarose
Anfoacutelitos 5-8 (SIGMA)
7-9 (PHARMACIA)
Aacutegua bidestilada TEMED 10 (vv)
PSA 10 (pv)
18 ml
08 ml
2 g
300 p1
300 ul
ateacute 10 ml volume final
10 ul
70 ul
Tabela 242 Paracircmetros eleacutectricos utilizados na focagem isoeleacutectrica de HB
Voltagem (V) Corrente (mA) Potecircncia (W) Tempo (T)
Preacute focagem 1500 25 1
2
3
30 min
15 min
15 min
Focagem 1500 25 15 2h 30 min
As soluccedilotildees para os eleacutectrodos foram aacutecido aspaacutertico 004 M (acircnodo) e NaOH 01 M
(caacutetodo) As amostras foram aplicadas a 15 cm do caacutetodo tendo sido inseridas com o auxiacutelio
de um aplicador de borracha silicone (SERVA)
27
Material e Meacutetodos
bull CAII
A separaccedilatildeo de CAII fez-se em gel de amido (15 pv SIGMA) conforme o descrito
por AMORIM (1983) com algumas modificaccedilotildees e ainda por focagem isoeleacutectrica em
gradiente de pH livre
Utilizam-se os seguintes sistemas tampatildeo para a separaccedilatildeo por electroforese em gel de
amido
Tampatildeo das Pontes Tris 0250 M pH = 76 Aacutecido ciacutetrico 0067 M
Tampatildeo do Gel Diluiccedilatildeo 110 do tampatildeo das pH = 76 pontes
As amostras foram inseridas em meio Sephadex G-200 (PHARMACIA) na proporccedilatildeo
de 11 As electroforeses foram realizadas em placa de arrefecimento (8degC) e com um
gradiente de potencial de 5 Vcm durante 16 h
A teacutecnica utilizada para a separaccedilatildeo de CAII por focagem isoeleacutectrica foi a descrita por
BOWLING et ai (1990) com algumas modificaccedilotildees A composiccedilatildeo da soluccedilatildeo de
polimerizaccedilatildeo e os paracircmetros eleacutectricos utilizados estatildeo indicados nas tabelas 243 e 244
respectivamente
As soluccedilotildees para os eleacutectrodos foram aacutecido aspaacutertico 004 M (acircnodo) e NaOH 01 M
(caacutetodo) As amostras foram inseridas com o auxiacutelio de um aplicador de borracha silicone
(SERVA) colocado a 15 cm do caacutetodo
28
Material e Meacutetodos
Tabela 243 Soluccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo utilizada na separaccedilatildeo de CAII por focagem isoeleacutectrica
Componentes da soluccedilatildeo
Acrilamida 28 (pv)
Bisacrilamida 2 (pv)
Sacarose
Anfoacutelitos 4-65 (PHARMACIA)
Anfoacutelitos 35-10 (PHARMACIA)
Aacutegua bidestilada TEMED 10 (vv)
PSA 10 (pv)
Quantidades 18 ml
08 ml
2 g
500 |ol
100 ul
ateacute 10 ml volume final
10 ul
70 ul
Tabela 244 Paracircmetros eleacutectricos utilizados na separaccedilatildeo de CAII por focagem isoeleacutectrica
Voltagem (V) Corrente (mA) Potecircncia (W) Tempo (T)
Preacute focagem 1500 25 1
3
5
30 min
15 min
15 min
Focagem 2500 25 8
10
12
30 min
30 min
30 min
bull PEPB
A separaccedilatildeo da PEPB foi realizada em gel de amido (15 pv SIGMA) de acordo
com a teacutecnica descrita por POVEY et ai (1972) com algumas modificaccedilotildees
29
Material e Meacutetodos
Utilizou-se o seguinte sistema tampatildeo
Tampatildeo das Pontes Tris 01 M
pH = 74 NaH2P04 01 M
Tampatildeo do Gel Diluiccedilatildeo 110 do tampatildeo das
pH = 74 pontes
As amostras satildeo inseridas em meio Sephadex G-200 (PHARMACIA) na proporccedilatildeo de
11 As electroforeses foram realizadas em placas de arrefecimento (8degC) e com um gradiente
de potencial de 5 Vcm durante 16 h
bull DIA
No caso da separaccedilatildeo de DIA a teacutecnica eacute idecircntica agrave utilizada para CAII electroforese
em gel de amido (15 pv SIGMA) conforme o descrito por AMORIM (1983) com algumas
modificaccedilotildees
bull NP MDH PGD GPJ e MPI
As separaccedilotildees das enzimas NP MDH PGD GPI e MPI fizeram-se em simultacircneo por
electroforese em gel de amido (15 pv SIGMA) conforme o descrito por AMORIM et ai
(1982) com algumas modificaccedilotildees
Utilizou-se o seguinte sistema tampatildeo
1130 M
0400 M
0020 M 0010 M
Tampatildeo das Pontes NaOH
pH = 60 Aacutecido ciacutetrico
Tampatildeo do Gel HisHCl
pH = 60 NaOH
30
Material e Meacutetodos
As amostras foram inseridas em meio Sephadex G-200 (PHARMACIA) na proporccedilatildeo
de 11 As electroforeses foram realizadas em placas de arrefecimento (8degC) e com um
gradiente de potencial de 8 Vcm durante 15 h
ALB
Nas tabelas 245 e 246 indicam-se respectivamente a composiccedilatildeo da soluccedilatildeo de
polimerizaccedilatildeo para a separaccedilatildeo de ALB por focagem isoeleacutectrica segundo a teacutecnica descrita
por ROCHA et ai (1991) com algumas modificaccedilotildees e os paracircmetros eleacutectricos
Tabela 245 Soluccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo utilizada para a separaccedilatildeo de ALB por focagem isoeleacutectrica
Componentes da soluccedilatildeo Quantidades
Acrilamida 28 (pv)
Bisacrilamida 2 (pv)
Ureia
Anfoacutelitos 5-6 (PHARMACIA)
Anfoacutelitos 5-8 (PHARMACIA)
Anfoacutelitos 6-8 (PHARMACIA)
Aacutegua bidestilada TEMED 10 (vv)
PSA 10 (pv)
18 ml
08 ml
48 g
250 ni
250 ni
125 ul
ateacute 10 ml volume final
30 ul
70 ul
Tabela 246 Paracircmetros eleacutectricos utilizados na separaccedilatildeo de ALB por focagem isoeleacutectrica
Voltagem (V) Corrente (mA) Potecircncia (W) Tempo (T)
Preacute focagem 1500 25
Focagem 1500 25
1 30 min
2 15 min
3 15 min
4 3 h
5 30 min
31
Material e Meacutetodos
As soluccedilotildees para os eleacutectrodos foram aacutecido aspaacutertico 004 M (acircnodo) e NaOH 1 M
(caacutetodo) As amostras foram aplicadas a 15 cm do caacutetodo com o auxiacutelio de um aplicador de
borracha silicone (SERVA)
TF
A separaccedilatildeo da moleacutecula de TF foi efectuada por focagem isoeleacutectrica A composiccedilatildeo
da soluccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo e os paracircmetros eleacutectricos utilizados estatildeo indicados nas tabelas
247 e 248 respectivamente
Tabela 247 Soluccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo utilizada para a separaccedilatildeo da TF por focagem isoeleacutectrica
Componentes da soluccedilatildeo Quantidades
Acrilamida 28 (pv)
Bisacrilamida 2 (pv)
Sacarose
Anfoacutelitos 35-5(LKB)
Anfoacutelitos 4-65 (PHARMACIA)
Aacutegua bidestilada
TEMED 10 (vv) PSA 10 (pv)
18 ml
08 ml
2 g
100 ul
500 ul
ateacute 10 ml volume final
30 ul
70 ul
Tabela 248 Paracircmetros eleacutectricos utilizados na separaccedilatildeo de TF por focagem isoeleacutectrica
Voltagem (V) Corrente (mA) Potecircncia (W) Tempo (T)
Preacute focagem 1500 25
Focagem 2500 25
l 20 min
2 10 min
3 10 min
8 30 min
10 30 min
12 30 min
32
Material e Meacutetodos
As soluccedilotildees para os eleacutectrodos foram de aacutecido aspaacutertico 004 M (acircnodo) e de NaOH
1 M (caacutetodo) As amostras foram aplicadas a 15 cm do caacutetodo com o auxiacutelio de um aplicador
de borracha silicone (SERVA)
GC
Nas tabelas 249 e 2410 apresenta-se respectivamente a composiccedilatildeo da soluccedilatildeo de
polimerizaccedilatildeo e os paracircmetros eleacutectricos utilizados na focagem isoeleacutectrica de GC
Tabela 249 Soluccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo utilizada para a separaccedilatildeo da GC por focagem isoeleacutectrica
Componentes da soluccedilatildeo Quantidades
Acrilamida 28 (pv)
Bisacrilamida 2 (pv)
Sacarose
Anfoacutelitos 45-54 (PHARMACIA)
Anfoacutelitos 4-6 (LKB)
Aacutegua bidestilada TEMED 10 (vv)
PSA 10 (pv)
18 ml
08 ml
2 g
437 ul
188 (il
eacute 10 ml volume final
10 ul
70 ul
Tabela 2410 Paracircmetros eleacutectricos utilizados na separaccedilatildeo de GC por focagem isoeleacutectrica
Voltagem (V) Corrente (mA) Potecircncia (W) Tempo (T)
Preacute focagem 1500 25
Focagem 1500 25
1 30 min
2 15 min
3 15 min
4 3 h
5 30 min
33
Material e Meacutetodos
Para os eleacutectrodos foram utilizadas soluccedilotildees de aacutecido aspaacutertico 004 M (acircnodo) e de
NaOH 02 M (caacutetodo) As amostras foram inseridas com o auxiacutelio de um aplicador de
borracha silicone (SERVA) colocado a 15 cm do caacutetodo
25 - MEacuteTODOS DE DETECCcedilAtildeO
Apoacutes a separaccedilatildeo das proteiacutenas os padrotildees electroforeacuteticos foram geralmente obtidos
por detecccedilatildeo especiacutefica aproveitando a actividade cataliacutetica das enzimas Noutros casos a
revelaccedilatildeo foi feita por coloraccedilatildeo geral de proteiacutenas
bull HB
A visualizaccedilatildeo da HB foi obtida mediante coloraccedilatildeo geral de proteiacutenas segundo o
seguinte procedimento
Fixaccedilatildeo
Imersatildeo do gel numa soluccedilatildeo de aacutecido tricloroaceacutetico 125 (pv) durante 10 minutos
Coloraccedilatildeo geral de proteiacutenas
Coloraccedilatildeo com uma soluccedilatildeo de Coomassie R-250 0115 (pv) numa mistura de aacutecido
aceacuteticoetanolaacutegua destilada (42571) apoacutes aquecimento seguida de filtraccedilatildeo durante
5-10 minutos A descoloraccedilatildeo eacute feita com aacutecido aceacutetico etanol e aacutegua destilada
aquecida a cerca de 60degC ateacute se obter o contraste desejado
bull CAII
Apoacutes separaccedilatildeo por electroforese em gel de amido visualizou-se a CAII pela sua
actividade esteraacutesica adicionando-se diacetato de fluoresceiacutena (em quantidades vestigiais que
34
Material e Meacutetodos
foram previamente dissolvidas em 200 uacute de acetona) a uma soluccedilatildeo de incubaccedilatildeo tamponada
(pH = 66) Esta soluccedilatildeo de incubaccedilatildeo eacute composta por aacutecido ciacutetrico 27 mM e Na2HP04
116 mM e foi aplicada sobre o gel de amido com o auxiacutelio de papeacuteis de filtro Whatman ndegl
Em seguida incubou-se durante 30 minutos a 37degC A observaccedilatildeo das bandas de CAII (devido
agrave sua capacidade esteraacutesica) eacute feita sob luz ultravioleta
Apoacutes separaccedilatildeo por focagem isoeleacutectrica utilizou-se uma coloraccedilatildeo geral de proteiacutenas
para visualizaccedilatildeo da CAII segundo o meacutetodo descrito para a HB sem fixaccedilatildeo
bull PEPB
A detecccedilatildeo da PEPB apoacutes a separaccedilatildeo electroforeacutetica foi feita atraveacutes da aplicaccedilatildeo
sobre o gel de amido de papeacuteis de filtro Whatman ndegl embebidos numa soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo
seguindo-se uma incubaccedilatildeo de 30 minutos a 37degC
A soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo conteacutem o substrato da PEPB L-leucilglicil-glicina 0004 M
veneno de cobra da espeacutecie Agkistrodon piscivorus piscivorus 04 (pv) MTT 24 mM e
metosulfato de fenazina (PMS) 03 mM num tampatildeo de pH = 80 (Tris HC1005 M)
bull DIA
Apoacutes a separaccedilatildeo por electroforese em gel de amido a identificaccedilatildeo da DIA foi obtida
pela adiccedilatildeo de uma soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo a uma fatia do gel A incubaccedilatildeo decorreu durante 2
horas a 37degC
A soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo foi realizada em duas fases
Io - colocou-se 26-diclorofenol-indofenol (DCIP) 01 mM com um tampatildeo de
pH = 85 (Tris HC1 005M) adicionando-se agrave mistura aacutegua bidestilada ateacute perfazer
50 ml Em seguida filtrou-se a soluccedilatildeo
2o - agrave soluccedilatildeo filtrada adicionou-se MTT 03 mM e NADH 02 mM e agitou-se antes
de verter sobre a fatia de gel de amido
35
Material e Meacutetodos
bull NP
A detecccedilatildeo da enzima NP apoacutes a separaccedilatildeo por electroforese foi feita atraveacutes da
aplicaccedilatildeo sobre o gel de amido de papeacuteis de filtro Whatman ndegl embebidos com a soluccedilatildeo de
coloraccedilatildeo Em seguida incubou-se durante 15 minutos a 37degC
A soluccedilatildeo de incubaccedilatildeo conteacutem inosina 37 mM MTT 24 mM XOD 0004 Uml uma
gota de azul de Meldola (SIGMA) (10 vv em aacutegua bidestilada) e uma soluccedilatildeo de tampatildeo
de incubaccedilatildeo pH = 75 constituiacuteda por KH2P04 005 M e NaOH 004 M
bull MDH
Na detecccedilatildeo da actividade enzimaacutetica de MDH foi utilizado o meacutetodo de sandwich
apoacutes a sua separaccedilatildeo electroforeacutetica em gel de amido Em seguida incubou-se durante 15
minutos a 37degC O meacutetodo de sandwich consiste na aplicaccedilatildeo de uma fatia de gel de amido
entre duas folhas de papel de filtro Whatman ndegl embebido com a soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo
A soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo utilizada na detecccedilatildeo da MDH conteacutem NAD 1 mM MTT
2 mM e piruvato de soacutedio (quantidades vestigiais) Esta soluccedilatildeo foi feita com um tampatildeo de
incubaccedilatildeo pH = 74 constituiacutedo por aacutecido maacutelico 0222 M Tris 050 M e MgCl2 002 M
bull PGP
A detecccedilatildeo da actividade enzimaacutetica de PGD foi feita pelo meacutetodo de sandwich apoacutes a
sua separaccedilatildeo electroforeacutetica em gel de amido
A soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo conteacutem quantidades vestigiais de aacutecido 6-fosfoglucoacutenico
NADP MTT e uma gota de azul de Meldola (05 pv em aacutegua bidestilada) dissolvidos num
tampatildeo de pH = 74 constituiacutedo por Tris 01 M HisHCl 01 M Imidazol 0015 M e MgCl2
0005 M
36
Material e Meacutetodos
bull GPI
A detecccedilatildeo da actividade enzimaacutetica de GPI foi feita pelo meacutetodo de sandwich apoacutes a
sua separaccedilatildeo electroforeacutetica em gel de amido
A soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo conteacutem frutose-6-fosfato 55 mM NADP 22 mM MTT
4 mM desidrogenase da glucose-6-fosfato (G6PD) 14 Uml e uma gota de azul de Meldola
(05 pv em aacutegua bidestilada) dissolvidos num tampatildeo de pH = 74 constituiacutedo por Tris 01
M HisHCl 01 M Imidazol 0015 M e MgCl2 0005 M
bull MPI
Detectou-se a actividade enzimaacutetica de MPI pelo meacutetodo de sandwich apoacutes a sua
separaccedilatildeo electroforeacutetica em gel de amido
A soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo conteacutem manose-6-fosfato 42 mM NADP 13 mM MTT
24 mM e uma gota de azul de Meldola (05 pv em aacutegua bidestilada) dissolvidos num
tampatildeo de pH = 74 constituiacutedo por Tris 01 M HisHCl 01 M Imidazol 0015 M e MgCl2
0005 M Por fim adicionaram-se as enzimas isomerase da glucose-6-fosfato (GPI) 3 Uml e
desidrogenase da glucose-6-fosfato (G6PD) 5 Uml
bull ALBeTF
A detecccedilatildeo de ALB e de TF foi efectuada atraveacutes do meacutetodo de coloraccedilatildeo geral de
proteiacutenas descrito para a HB utilizando-se Coomasie R-250 sem fixaccedilatildeo
bull GCcedil
A visualizaccedilatildeo de GC efectuou-se por detecccedilatildeo imunoenzimaacutetica apoacutes transferecircncia da
proteiacutena para uma membrana de nitrocelulose (045 pm SCHLEICHER amp SCHULL)
segundo a teacutecnica descrita por FERRAND (1995)
37
Material e Meacutetodos
Apoacutes esse processo de transferecircncia as membranas de nitrocelulose foram lavadas 3
vezes (15 minutos) numa soluccedilatildeo de Tween 20 (MERCK) 0025 (vv) em soro fisioloacutegico
tamponado com fosfato (PBS Na2HP04 50 mM KH2P04 18mM NaCl 147 mM pH = 71) e
bloqueadas numa soluccedilatildeo de leite em poacute magro (5 pv em PBS) durante 18 h com agitaccedilatildeo
permanente e agrave temperatura ambiente
Depois da primeira lavagem aplicou-se o antisoro (anti-GC humana ATAB 81936)
diluiacutedo 1170 em PBS com 1 (pv) de albumina seacuterica bovina (SIGMA) durante 1 h agrave
temperatura ambiente
Repetiu-se novamente a lavagem segundo o processo jaacute referido seguindo-se a
aplicaccedilatildeo do segundo antisoro (anticorpos contra imunoglobulinas caprinas desenvolvidos em
coelho e conjugados com uma peroxidase ATAB 83806) diluiacutedo 1600 em PBS com 1
(pv) de albumina seacuterica bovina (SIGMA) durante 1 h agrave temperatura ambiente
Depois de duas lavagens (5 minutos) com Tween 20PBS procedeu-se agrave detecccedilatildeo da
GC com uma soluccedilatildeo de 9-amino-2-etilcarbazol 004 (pv) e de metanol 20 (vv) em PBS
As bandas correspondentes agrave actividade peroxidaacutesica aparecem rapidamente bloqueando-se a
reacccedilatildeo com aacutegua bidestilada
26 - MEacuteTODOS DE CAacuteLCULO
As frequecircncias geacutenicas foram calculadas por contagem directa de genes a partir da
distribuiccedilatildeo fenotiacutepica obtida
O caacutelculo dos valores de heterozigotia meacutedia (H) da proporccedilatildeo de loci polimoacuterficos
(P) do nuacutemero meacutedio de alelos por locus (ria) estatiacutesticas F e frequecircncias fenotiacutepicas
esperadas segundo o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg foi efectuado com a utilizaccedilatildeo do
programa BIOSYS versatildeo 17 (SWOFFORD amp SELANDER 1989)
O caacutelculo de distacircncias geneacuteticas e obtenccedilatildeo de dendrogramas foi efectuado com o
programa PHYLIP versatildeo 35 (FELSENTEIN 1993)
38
Resultados e Discussatildeo
3 - RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
31 - ANAacuteLISE DOS MEacuteTODOS DE SEPARACcedilAtildeO
De entre os 12 loci estudados neste trabalho detectaram-se 5 monomoacuterficos
(PEPB DIA GPI MDH e PGD) e 7 polimoacuterficos (HB CAII NP MPI ALB TF e GC)
Loci monomoacuterficos
bull PEPB
A utilizaccedilatildeo de teacutecnicas de electroforese em gel de amido permitiu a detecccedilatildeo de
um soacute fenoacutetipo (figura 311) correspondente a indiviacuteduos homozigoacuteticos para o alelo
PEPB2 descrito por DEL LAMA et ai (1992) No entanto na raccedila Minhota detectou-se
um indiviacuteduo heterozigoacutetico
O fenoacutetipo PEPB 2 apresenta um padratildeo com duas bandas uma de grande
intensidade e outra secundaacuteria mais anoacutedica de menor intensidade No indiviacuteduo
heterozigoacutetico 2-1 (natildeo representado) observou-se um padratildeo de trecircs bandas sendo a
terceira mais anoacutedica e menos intensa
A quase inexistecircncia de PEPB1 nas raccedilas estudadas estaacute de acordo com o referido
em DEL LAMA et ai (1992) que sugere a fixaccedilatildeo de PEPB2 na maior parte das
populaccedilotildees de bovinos de origem europeia (com excepccedilatildeo das raccedilas italianas Marchigiana
e Chianina)
39
Resultados e Discussatildeo
+
Figura 311 Fenoacutetipos de PEPB observados por electroforese convencional em gel de amido
bull DIA
Os resultados obtidos para a enzima DIA revelaram ausecircncia de polimorfismo
electroforeacutetico (figura 312) Resultados semelhantes foram tambeacutem obtidos em vaacuterias
raccedilas autoacutectones espanholas (GONZALEZ et ai 1987 IGLESIAS 1989 ARRANZ et ai
1992)
MAKAVEEV (1979 in IGLESIAS 1989) detectou polimorfismo desta enzima em
eritroacutecitos de buacutefalos da Bulgaacuteria e nas raccedilas bovinas Frisia e Simmental descrevendo dois
alelos codominantes DIAA e DIAB
Figura 312 Padratildeo de DIA observado por electroforese convencional em gel de amido
40
Resultados e Discussatildeo
Natildeo se detectou variaccedilatildeo electroforeacutetica para o locus GPI Estes resultados natildeo se
podem comparar com os obtidos noutras raccedilas por natildeo ter sido possiacutevel consultar outros
trabalhos onde se descrevesse variaccedilatildeo do locus GPI em gado bovino
A figura 313 apresenta o padratildeo obtido para esta enzima observando-se trecircs
bandas duas com grande intensidade e uma banda mais anoacutedica de menor intensidade
Figura 313 Padratildeo de GPI obtido em hemolisados por electroforese convencional em gel de amido
bull MDH
A enzima MDH revelou-se monomoacuterfiacuteca Este resultado eacute concordante com outros
estudos (ARRANZ et ai 1992)
Na figura 314 observa-se o padratildeo de bandas detectado por electroforese
convencional em gel de amido
Figura 314 Padratildeo de MDH observado por electroforese convencional em gel de amido
41
Resultados e Discussatildeo
bull PGD
A enzima PGD revelou-se monomoacuterfica para as raccedilas Barrosatilde e Minhota tambeacutem
neste caso natildeo se encontrou qualquer referecircncia bibliograacutefica relativa a um possiacutevel
polimorfismo deste locus em gado bovino
Na figura 315 observa-se o padratildeo obtido para esta enzima Em amostras
armazenadas por um longo periacuteodo de tempo detectaram-se duas bandas sendo a mais
anoacutedica a que revela menor intensidade as amostras mais recentes apresentam um padratildeo
electroforeacutetico com uma soacute banda
Figura 315 Padratildeo de PGD observado por electroforese convencional em gel de amido
Loci polimoacuterficos
bull HB
A electroforese convencional natildeo permite discriminar os electromorfos de HB No
entanto a utilizaccedilatildeo de sistemas de focagem isoeleacutectrica conduz agrave detecccedilatildeo de
polimorfismo nesta proteiacutena observando-se dois fenoacutetipos HB A e HB AB
Na figura 316 observa-se o padratildeo electroforeacutetico desta moleacutecula resultante da
expressatildeo de dois alelos codominantes HBA e HBB Resultados idecircnticos estatildeo
descritos em raccedilas bovinas da Peniacutensulas Ibeacuterica (VICENTE 1978 KiDD et ai 1980
IGLESIAS 1989)
42
Resultados e Discussatildeo
+ -HBB
HBA
AB AB A A
Figura 316 Separaccedilatildeo de hemoglobina nativa por focagem isoeleacutectrica
bull poundAH
A utilizaccedilatildeo de electroforese em gel de amido e focagem isoeleacutectrica permitiu
identificar trecircs fenoacutetipos CAII F CAII FS e CAII S atribuiacutedos agrave expressatildeo de dois alelos
codominantes CAF e CAS (figuras 317 e 318) Poreacutem a separaccedilatildeo por electroforese em
gel de amido implica alguma morosidade (tempos de corrida muito longos) e em amostras
coaguladas o erro de leitura pode ser superior a 20 Estas dificuldades satildeo minimizadas
quando se recorre a focagem isoeleacutectrica
Assim a separaccedilatildeo da enzima CAII por focagem isoeleacutectrica oferece vaacuterias vantagens
nomeadamente
bull rapidez e simplicidade de execuccedilatildeo
bull utilizaccedilatildeo de pequenas quantidades de material bioloacutegico
bull maior nuacutemero de amostras fenotipadas por corrida
bull possibilidade de utilizaccedilatildeo de amostras coaguladas
43
Resultados e Discussatildeo
F F F S FS FS F S FS
Figura 317 Fenoacutetipos de CAII observados sob luz ultravioleta apoacutes separaccedilatildeo por electroforese convencional em gel de amido e coloraccedilatildeo com diacetato de fluoresceina
CAIIF
| CAIIS
Figura 318 Fenoacutetipos de CAII observados por focagem isoeleacutectrica apoacutes coloraccedilatildeo geral de proteiacutenas
bull NP
A expressatildeo fenotiacutepica de NP resulta das combinaccedilotildees possiacuteveis entre um alelo
dominante NPH e um recessivo NPL (ANSAY 1973) Este facto implica que apenas em
presenccedila do feno tipo NP L eacute possiacutevel fazer corresponder um genoacutetipo (jaacute que o fenoacutetipo NP H
pode corresponder aos genoacutetipos HH e HL e o fenoacutetipo NP L corresponde ao genoacutetipo LL)
Na figura 319 apresenta-se o padratildeo obtido para a proteiacutena apoacutes separaccedilatildeo
electroforeacutetica em gel de amido
44
+
w
FS FS ]
Resultados e Discussatildeo
H L L H L L
Figura 319 Fenoacutetipos de NP detectados por electroforese convencional em gel de amido
bull MPI
Na raccedila Minhota detectaram-se quatro fenoacutetipos MPI AB MPI B MPI BC e MPI C
anteriormente descritos por ANSAY (1973) em bovinos na raccedila Barrosatilde apenas se observam
os trecircs uacuteltimos fenoacutetipos De acordo com o mesmo autor os fenoacutetipos encontrados nesta raccedila
resultam da combinaccedilatildeo de dois alelos codominantes MPIB e MPPC enquanto que MPIA
aparece na raccedila Minhota com uma frequecircncia reduzida
Como se pode observar pela anaacutelise da figura 3110 MPIA aparece como o alelo
mais anoacutedico MPIC como o mais catoacutedico e o alelo mais frequente MPIB situa-se numa
posiccedilatildeo intermeacutedia em relaccedilatildeo aos anteriores Contudo a intensidade das bandas eacute muito
fraca tornando-se quase imperceptiacutevel em alguns casos Esta grande dificuldade em obter um
contraste de bandas adequado mesmo apoacutes longos periacuteodos de incubaccedilatildeo a 37degC poderaacute
eventualmente levar a uma incorrecta interpretaccedilatildeo dos fenoacutetipos Assim a utilizaccedilatildeo de
sistemas de focagem isoeleacutectrica na determinaccedilatildeo destes fenoacutetipos seria aconselhaacutevel a fim
de verificar os resultados obtidos por electroforese convencional
45
Resultados e Discussatildeo
Figura 3110 Fenoacutetipos de MPI observados por electroforese convencional em gel de amido
bull ALB
A separaccedilatildeo por focagem isoeleacutectrica permitiu detectar polimorfismo em ALB Cada
indiviacuteduo homozigoacutetico aparece com trecircs bandas duas de maior intensidade e uma mais
aciacutedica com menor intensidade os indiviacuteduos heterozigoacuteticos podem apresentar ateacute seis
bandas
Esta heterogeneidade nos padrotildees de ALB tem sido interpretada como o resultado da
capacidade desta proteiacutena se ligar a vaacuterias substacircncias diferentes (FERRAND 1995) Com a
inclusatildeo de ureia (8M) na matriz de separaccedilatildeo reagente que provoca a desnaturaccedilatildeo da
proteiacutena levando a uma alteraccedilatildeo do seu pi para uma zona mais baacutesica do gradiente
conseguem-se obter padrotildees de bandas mais simples e mais definidos (KAWAGUCHI 1973
FERRAND 1995)
Na figura 3111 apresentam-se os padrotildees observados que foram interpretados como
sendo determinados por trecircs alelos codominantes ALBA ALBB e ALBV
GAHNE et ai (1977) e IGLESIAS (1989) detectaram por electroforese em gel de
poliacrilamida e de amido respectivamente dois variantes em gado bovino ALBA e
ALBB A utilizaccedilatildeo de focagem isoeleacutectrica veio confirmar a existecircncia destes dois alelos e
acrescentar um terceiro designado por ALBV com uma mobilidade mais aciacutedico do que
ALBA
46
Resultados e Discussatildeo
A B A B A B B B A B A G
Figura 3111 Fenoacutetipos de ALB determinados em amostras de plasma por focagem isoeleacutectrica na presenccedila de ureia 8M
ARRANZ et ai (1992) revelaram a existecircncia de um outro variante (ALBD) com
mobilidade electroforeacutetica intermeacutedia entre ALBA e ALBB ainda natildeo descrito em
nenhuma raccedila autoacutectone espanhola Este alelo poderaacute corresponder ao alelo ALBV
encontrado neste trabalho apesar de apresentar um pi mais aacutecidico do que ALBA (ARRANZ
comunicaccedilatildeo pessoal)
Desta forma a teacutecnica de separaccedilatildeo por focagem isoeleacutectrica provou ser eficaz na
separaccedilatildeo dos variantes de ALB tal como jaacute foi demonstrado no gato (BELL et ai 1994) na
ovelha (ERHARDT amp SIMIANER 1993) e no coelho (FERRAND amp ROCHA 1992)
bull TF
A transferrina eacute um dos marcadores mais importantes no estudo e caracterizaccedilatildeo
geneacutetica de raccedilas bovinas devido ao seu elevado polimorfismo No entanto a sua fenotipagem
natildeo eacute simples existindo frequentemente problemas de resoluccedilatildeo e de separaccedilatildeo das bandas
(IGLESIAS 1989)
A fim de averiguar qual a melhor forma de separar os diferentes produtos geacutenicos
descritos no locus TF testaram-se vaacuterios sistemas electroforeacuteticos em geacuteis de agarose numa
vasta gama de sistemas tampatildeo Esta teacutecnica natildeo ofereceu resultados satisfatoacuterios pelo que se
passou agrave separaccedilatildeo da TF por focagem isoeleacutectrica recorrendo a matrizes de poliacrilamida
47
Resultados e Discussatildeo
com diferentes concentraccedilotildees de ureia (6M e 8M) tambeacutem neste caso natildeo se conseguiram
resultados positivos
Este tipo de dificuldades encontradas na fenotipagem da TF por focagem isoeleacutectrica
tinham jaacute sido descritos noutras espeacutecies nomeadamente na cabra (ERHARDT 1986) e no
coelho (FERRAND 1995) No entanto TSUJI et ai (1989) demostraram ser possiacutevel fenotipar
esta proteiacutena em bovinos por focagem isoeleacutectrica sem grandes problemas e sem qualquer
aditivo na matriz de poliacrilamida
Desta forma a utilizaccedilatildeo de uma teacutecnica de focagem isoeleacutectrica com um gradiente de
pH 35-65 reforccedilado em 40-65 permitiu separar os produtos geacutenicos do locus TF Contudo
os padrotildees obtidos nem sempre eram definidos tornando-se dificilmente interpretaacuteveis
Na tentativa de melhorar os padrotildees de resoluccedilatildeo e de verificar se a variaccedilatildeo detectada
natildeo resultava de diferenccedilas no estado feacuterrico da moleacutecula de TF ou ainda da existecircncia de
aacutecidos siaacutelicos ligados agrave moleacutecula procedeu-se agrave sua separaccedilatildeo apoacutes vaacuterios tratamentos das
amostras
A remoccedilatildeo dos aacutecidos siaacutelicos atraveacutes do tratamento das amostras com neuraminidase
natildeo permitiu a obtenccedilatildeo de bandas definidas este tratamento natildeo altera significativamente o
padratildeo das bandas de TF de bovinos como jaacute tinha sido descrito por PENHALLOU et ai
(1991)
A obtenccedilatildeo de TF no estado apofeacuterrico foi conseguida submetendo as amostras a um
tratamento com EDTA-dissoacutedico Neste caso observa-se que apoTF apresenta uma
mobilidade menor e um padratildeo de bandas mais simples mas ainda sem uma definiccedilatildeo
adequada
A forma Fe2TF foi obtida mediante vaacuterios tratamentos com dadores de Fe (ver capiacutetulo
Material e Meacutetodos) Os resultados soacute se mostraram satisfatoacuterios atraveacutes da saturaccedilatildeo da
moleacutecula de TF com uma soluccedilatildeo de sulfato de amoacutenio feacuterrico provavelmente por causar uma
maior estabilidade da moleacutecula ao longo da sua separaccedilatildeo por focagem isoeleacutectrica com
elevadas voltagens pois segundo WELCHS (1990) a forma difeacuterrica da transferrina eacute mais
resistente agrave desnaturaccedilatildeo e ao calor do que a forma apoTF
48
Resultados e Discussatildeo
Estatildeo descritos pelo menos oito alelos no locus TF TFAl TFA2 TFB TFD1
TFD2 TFE TFF e TFG os mais comuns no gado europeu (Bos taurus) satildeo TFA
TFD1 TFD2 e TFE (JAMIESON 1965) No gado asiaacutetico e africano (Bos indicus) ocorrem
aleacutem das formas anteriores os alelos TFB e TFF
Na figura 3112 apresenta-se o proteinograma obtido com a utilizaccedilatildeo de amostras
saturadas com Fe Esta teacutecnica permitiu a separaccedilatildeo de TFD em TFD1 e TFD2 e a
detecccedilatildeo de todos os outros fenoacutetipos descritos em bovinos europeus Assim observaram-se
quatro alelos codominantes TFA TFD1 TFD2 e TFE
A expressatildeo fenotiacutepica dos alelos em homozigotia caracteriza-se pela presenccedila de dois
dupletos de bandas aparecendo a banda mais aciacutedica de cada dupleto com intensidade mais
fraca Os indiviacuteduos herozigoacuteticos podem apresentar ateacute oito bandas
Figura 3112 Fenoacutetipos de TF determinados por focagem isoeleacutectrica apartir de amostras saturadas com uma soluccedilatildeo de sulfato de amoacutenio feacuterrico
IGLESIAS (1989) detectou TFA e TFD nas cinco raccedilas de bovinos da Galiza o
variante TFE na raccedila Cachena espanhola e um outro variante raro TFR com mobilidade
mais lenta na raccedila Rubia Galega
bull QQ
A GC eacute uma proteiacutena plasmaacutetica que demonstra um elevado grau de heterogeneidade
geneacutetica em mamiacuteferos (FERRAND 1995)
A separaccedilatildeo de GC em focagem isoeleacutectrica seguida da utilizaccedilatildeo de immunoblotting
melhorou de forma consideraacutevel a capacidade de investigar a variaccedilatildeo desta proteiacutena em
49
Resultados e Discussatildeo
diferentes espeacutecies (JUNEJA et ai 1987 PENEDO amp JUNEJA 1989 STRATIL et ai 1990
KALAacuteB et ai 1990 STERN et ai 1992 VANKAN amp BELL 1992 FERRAND 1995)
Nas figuras 3113 e 3114 apresentam-se alguns dos fenoacutetipos obtidos na separaccedilatildeo
da GC por focagem isoeleacutectrica Verifica-se que em amostras tratadas com neuraminidase o
padratildeo de bandas se apresenta mais simplificado surgindo no entanto duas bandas (uma
mais baacutesica e uma mais aciacutedica) de natureza desconhecida Os padrotildees observados foram
interpretados como sendo determinados por dois alelos GCF e GCS
mdashGCF
S F S FS S FS F F S FS 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Figura 3113 Fenoacutetipos de GC determinados por focagem isoeleacutectrica amostras 1 8 9 e 10 tratadas com neuraminidase amostras 2 a 7 diluiacutedas em aacutegua bidestilada
S1 $ l S- -
FS S S S F S FS S FS F S
Figura 3114 Fenoacutetipos de GC determinados em amostras de plasma tratados com neuraminidase apoacutes focagem isoeleacutectrica
Nota-se a existecircncia de dois alelos codominantes GCF e GCS sendo o segundo
mais aciacutedico do que o primeiro
50
Resultados e Discussatildeo
32 - ANAacuteLISE FAMILIAR
A realizaccedilatildeo da anaacutelise familiar relativo ao conjunto de loci polimoacuterficos estudados
observa-se no estudo de 27 pares matildeefilho Esta situaccedilatildeo resulta da grande dificuldade
existente na obtenccedilatildeo de informaccedilatildeo sobre os machos
Os resultados apresentam-se nas tabelas 321 a 326 natildeo foi possiacutevel testar o
equiliacutebrio de Hardy-Weinberg devido ao reduzido tamanho da amostra bem como ao facto de
vaacuterios alelos ocorrerem em baixa frequecircncia
Refira-se que natildeo foi detectado qualquer caso de exclusatildeo matildeefilho
Tabela 321 Sistema CAII Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica em 27 pares matildeefilho Os valores esperados segundo o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg estatildeo indicados entre parecircntesis
Total
4 (32) 17
(122) 6
(116) 27
Tabela 322 Sistema NP Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica em 27 pares matildeefilho Os valores esperados segundo o equiliacutebrio de Hardy--Weinberg estatildeo indicados entre parecircntesis
Total
14
(114)
13
(156)
27
^ ^ ^ Filho
Matildee - ^ F
Fenoacutetipos
F f~ (11)
FS 2
(21)
S
Total 3
Fenoacutetipos
FS S
3
(21)
10 5
(61) (40)
1 5
(40) (76)
14 10
- v ^ ^ Filho Fenoacutetipos
Matildee - ^ H L
Fenoacutetipos
H 10 4
(77) (37)
L 5 8
(37) (119)
Total 15 12
51
Resultados e Discussatildeo
Tabela 323 Sistema MPI Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica em 26 pares matildeefilho Os valores esperados segundo o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg estatildeo indicados entre parecircntesis
^ Filho Fenoacutetipos Total
Matildee ^ ~ ^ A AB AC B BC c Fenoacutetipos
A 0 0 0 - - - 0
(00) (00) (00) (00)
AB 0 0 0 0 0 - 0
(00) (00) (00) (00) (00) (00)
AC 0 0 0 - 0 0 0
(00) (00) (00) (00) (00) (00)
B - 0 - 24 1 - 25
(00) (242) (06) (248)
BC - 0 0 1 0 0 1
(00) (00) (06) (06) (00) (12)
C - - 0 - 0 0 0
(00) (00) (00) (00)
Total 0 0 0 25 1 0 26
Tabela 324 Sistema ALB Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica em 27 pares matildeefilho Os valores esperados segundo o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg estatildeo indicados entre parecircntesis
^ ^ Filho Fenoacutetipos Total
M atilde e ^ ^ - s ^ ^ A AB AV B BV V
Fenoacutetipos
A 24 2 0 - - - 26
(251) (04) (02) (257)
AB 0 0 0 0 0 -
0
(04) (04) (00) (00) (00) (08)
AG 1 0 0 - 0 0 1
(02) (00) (02) (00) (00) (04)
B - 0 - 0 0 - 0
(00) (00) (00) (00)
BG - 0 0 0 0 0 0
(00) (00) (00) (00) (00) (00)
G - - 0 - 0 0 0
(00) (00) (00) (00)
Total 25 2 0 0 0 0 27
52
Resultados e Discussatildeo
Tabela 325 Sistema TF Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica em 27 pares matildeefilho Os valores esperados segundo o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg estatildeo indicados entre parecircntesis
Filho Fenoacutetipos Total
Matildee ^ A ADI AD2 AE Dl D1D2 DIE D2 D2E E
Fenoacutetipos
A 6
(51)
1
(14)
4
(21)
1
(03)
12
(89)
ADI 1 2 0 0 0 0 0 - - - 3
(14) (24) (06) (01) (04) (06) (01) (56)
AD2 2 0 5 0 - 0 - 2 0 - 9
(21) (06) (36) (01) (06) (08) (01) (79)
AE 0 0 0 0 - - 0 - 0 0 0
(03) (01) (01) (06) (01) (01) (00) (13) Dl 0
(04) 1
(01)
1
(02)
0
(00)
- 2
(07)
D1D2 - 0 1 - 0 0 0 0 0 - 1
(06) (06) (02) (10) (00) (02) (00) (26) DIE - 0 - 0 0 0 0 - 0 0 0
(01) (01) (00) (00) (02) (00) (00) (04)
D2 0
(08) 0
(02)
0
(03)
0
(01)
- 0
(14) D2E - - 0 0 - 0 0 0 0 0 0
(01) (01) (00) (00) (01) (02) (00) (05) E 0
(00) 0
(00)
0
(00)
0
(00)
0
(00)
Total 9 3 10 1 1 1 0 2 0 0 27
Tabela 326 Sistema GC Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica em 27 pares matildeefilho Os valores esperados segundo o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg estatildeo indicados entre parecircntesis
- - ^ F i l h o Fenoacutetipos Total
Matildee ^ ^ 1 2-1 2
Fenoacutetipos
1 17 2 19
(156) (31) (187)
2-1 5 2 0 7
(31) (38) (06) (75)
2 _ 1 0 1
(06) (01) (07)
Total 22 5 0 27
53
Resultados e Discussatildeo
33 - ANAacuteLISE POPULACIONAL LOCUS A LOCUS
Neste capiacutetulo faz-se a anaacutelise populacional dos loci polimoacuterficos e ainda dos loci
PEPB e DIA para os quais natildeo se detectou variaccedilatildeo na raccedila Barrosatilde A sua inclusatildeo justifica-
-se pelo facto de serem polimoacuterficos noutras raccedilas bovinas ou em espeacutecies aparentadas
bull PEPB
O locus PEPB revelou-se monomoacuterfico nas trecircs populaccedilotildees de bovinos de raccedila
Barrosatilde e Minhota tendo sido detectado um uacutenico produto geacutenico PEPB2 (observado um
indiviacuteduo heterozigoacutetico da raccedila Minhota) No entanto este locus eacute referido como polimoacuterfico
em raccedilas bovinas criadas no Brasil onde se detectaram dois alelos codominantes PEPB1 e
PEPB2 (DEL LAMA et ai 1992)
O alelo PEPB2 estaacute fixado nas raccedilas de origem europeia incluindo as estudadas neste
trabalho excepto nas raccedilas italianas Marchigiana e Chianina nas quais PEPB1 apresenta
frequecircncias geacutenicas entre 011 e 014 (tabela 331)
Tabela 331 Frequecircncias geacutenicas de PEPB em vaacuterias raccedilas bovinas
N
Frequecircncias geacutenicas N PEPB1 PEPB2 Referecircncia
Barrosatilde inscrita 141 - 100 Este trabalho
Barrosatilde natildeo inscrita 153 - 100 t i
Minhota 62 001 plusmn0003 099 plusmn 0003 ec
Blonde dAquitaine 13 - 100 DEL LAMAetal 1992)
Charolesa 118 - 100 laquo
Chianina 83 014 plusmn003 086 plusmn 003 t t
Hereford 79 - 100 et
Frisia 125 - 100 t t
Jersey 139 - 100
Limousine 24 - 100
Marchigiana 85 011 plusmn002 089 plusmn 002 te
Simmental 75 - 100 t t
54
Resultados e Discussatildeo
bull DIA
Pela anaacutelise da tabela 332 verifica-se natildeo existir variaccedilatildeo geneacutetica neste locus nas
raccedilas bovinas apresentadas estando fixado o alelo DIAS os resultados obtidos estatildeo de
acordo com os jaacute publicados por outros autores (GONZALEZ et ai 1987 IGLESIAS 1989) Por
outro lado nas populaccedilotildees de buacutefalos ocorre um segundo alelo DIAF com frequecircncias
entre 019 e 021
Tabela 332 Frequecircncias geacutenicas de DIA em vaacuterias populaccedilotildees de raccedilas bovinas e buacutefalos
Frequecircncias geacutenicas
N DIAF DIAS Referecircncia
Portugal
Barrosatilde inscrita 141
Barrosatilde natildeo inscrita 153
Minhota 62
Espanha
Cachena 71
Caldelana 60
Frieiresa 33
Limiana 39
Rubia Gallega 168
Vianesa 40
Sayaguesa (Zamora) 147
Morucha (Salamanca) 101
Alistana Sanabresa 157
Blanca Cacerena 62
Caacuterdena Andaluza 25
Asturiana de los Vallegraves 127
Asturiana de la Montana 106
Bulgaacuteria
Buacutefalo 122
Murrah (Buacutefalo) 51
raquo IGLESIAS (1989)
- 100 Este trabalho
- 100
- 100 a
- 100 IGLESIAS (1989)
- 100
- 100
- 100
- 100
- 100
- 100 GONZALEZ et al (19
- 100
- 100 st
- 100 st
- 100
- 100
- 100
019 + 00 081 plusmn00 MAKAVEEV(1984
021 plusmn00 079 plusmn 00 laquo
55
Resultados e Discussatildeo
bull HB
Os resultados obtidos no estudo de HB permitiram distinguir dois fenoacutetipos definidos
por dois alelos HBA e HBB (tabela 333)
Tabela 333 Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica de HB em populaccedilotildees das raccedilas Barrosatilde e Minhota Os valores esperados de acordo com o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg estatildeo indicados entre parecircntesis
Fenoacutetipos N HBA HBAB HBB
Barrosatilde inscrita 141 141
Barrosatilde natildeo inscrita 153 153
Minhota 62 56 6 0
(561) (58) (01)
As frequecircncias geacutenicas das raccedilas estudadas bem como outras jaacute publicadas referentes a
vaacuterias raccedilas bovinas europeias e a duas espeacutecies de buacutefalos encontram-se discriminadas na
tabela 334
A elevada frequecircncia do alelo HBA nas raccedilas estudadas (fixado na raccedila Barrosatilde)
situam-nas juntamente com outras raccedilas bovinas do centro e sul da Europa onde este alelo
ocorre com frequecircncias entre 080-098 (VICENTE 1978) Nas restantes raccedilas europeias
HBA ocorre com uma ampla margem de variaccedilatildeo (038 - 100) apresentando-se quase
sempre como o alelo mais frequente
No caso dos buacutefalos observa-se uma inversatildeo nos valores das frequecircncias geacutenicas
sendo o alelo HBB o mais frequente
A presenccedila de HBB nos bovinos europeus apesar de em baixa frequecircncia pode ser
indicativo de uma origem a partir de raccedilas asiaacuteticas ou africanas jaacute que eacute nestes continentes
que este alelo ocorre com frequecircncia mais elevadas as frequecircncias geacutenicas mais elevadas estatildeo
descritas no gado zebu da Aacutefrica (BRAEND 1971 VICENTE 1978)
56
Resultados e Discussatildeo
Tabela 334 Frequecircncias geacutenicas de HB em vaacuterias populaccedilotildees de raccedilas bovinas e buacutefalos
N
Frequecircncias geacutenicas
N HBA HBB Referecircncia
Portugal
Barrosatilde inscrita 141 100 - Este trabalho
Barrosatilde natildeo inscrita 153 100 -
Minhota 62 095 plusmn 002 005 plusmn 002
Mertolenga 147 093 plusmn 002 007 plusmn 002 KTOD et ai (1980)
Alentejana 155 096 plusmn 001 004 plusmn001 IacuteIacute
Mirandesa 107 099+001 001 plusmn001 NOBRE (S data)
Espanha
Cachena 71 091 + 002 009 plusmn 002 IGLESIAS (1989)
Caldelana 60 097 plusmn 002 003 plusmn 002
Frieiresa 33 095 plusmn 003 005 plusmn 003
Limiana 39 090 plusmn 003 010 plusmn003
Rubia Gallega 168 093 plusmn 001 007 plusmn001 ce
Vianesa 40 098 plusmn 002 002 plusmn002
Sayaguesa (Zamora) 147 083 plusmn002 017 plusmn002 GONZALEZ et al ( 1987)
Morucha (Salamanca) 101 084 plusmn 003 016 plusmn003 ce
Alistana Sanabresa 157 099 plusmn 001 001 plusmn001
Blanca Cacerefia 62 071 plusmn 004 029 plusmn 004 laquo
Caacuterdena Andaluza 25 096 plusmn 003 004 plusmn 003 IacuteIacute
Asturiana de los Vallegraves 127 091 plusmn002 009 plusmn002
Pirenaica 383 084 plusmn 001 016 plusmn001 VICENTE (1978)
Tudanca 42 065 plusmn 005 035 plusmn 005 laquo
Morena del N O 25 100 -
Frisona 97 100 - laquo
Asturiana de la Montaria 106 079+003 021 plusmn003
De Lidia 124 079 plusmn 003 021 plusmn003 KlDDeacutetal (1980)
Retinta 164 081 plusmn002 019 plusmn002
Itaacutelia
Chianina 264 096 plusmn 001 004 plusmn 001 CARENZiera (1970)
Marchigiana 112 099 plusmn001 001 plusmn001
Bulgaacuteria
Sofia Brown 173 089 plusmn 002 011 plusmn002 MAKAVEEV (1970)
Buacutefalo 77 009 plusmn 002 091 plusmn002 MAKAVEEV(1984)
Murrah (Buacutefalo) 51 015 plusmn004 085 plusmn 004 ce
G Bretanha
Jersey 467 038 plusmn 002 062 plusmn 002 LARSENefa (1974)
in IGLESIAS (1989)
57
Resultados e Discussatildeo
A frequecircncia obtida para HBB na raccedila Minhota (005) aproxima-a das raccedilas do sul da
Europa onde este alelo ocorre com uma frequecircncia de aproximadamente 01 Por outro lado a
completa ausecircncia de HBB na raccedila Barrosatilde eacute um resultado interessante mas para o qual natildeo
eacute possiacutevel fornecer actualmente uma explicaccedilatildeo satisfatoacuteria
CAII
A distribuiccedilatildeo dos fenoacutetipos observados para o locus CAII apresenta-se na tabela
335
Tabela 335 Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica de CAU em populaccedilotildees das raccedilas Barrosatilde e Minhota Entre parecircntesis indicam-se os valores esperados de acordo com o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg
Fenoacutetipos N CA F CAFS CAS
Barrosatilde inscrita 141 17 58 66
(149) (622) (639)
Barrosatilde natildeo inscrita 153 20 71 62
(200) (710) (620)
Minhota 62 3 13 46
(14) (162) (444)
x2
0651 1 0420
0000 1 0995
Os valores do teste de 2 nas populaccedilotildees de raccedila Barrosatilde demonstram natildeo haver
desvios significativos ao equiliacutebrio de Hardy-Weinberg apesar de se observar um ligeiro
excesso de homozigoacuteticos F na populaccedilatildeo de raccedila Barrosatilde (inscrita) Para a raccedila Minhota natildeo
foi possiacutevel testar o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg
Na tabela 336 apresentam-se as frequecircncias geacutenicas de CAII nas populaccedilotildees
estudadas bem como as publicadas por outros autores
O locus CAII apresenta-se polimoacuterfico na maior parte das populaccedilotildees bovinas
europeias sendo o alelo CAIIS o que ocorre com frequecircncia mais elevada
58
Resultados e Discussatildeo
Tabela 336 Frequecircncias geacutemeas de CAU em vaacuterias populaccedilotildees de raccedilas bovinas e de buacutefalos
N
Frequecircncias geacutenicas N CAS CAF Referecircncia
Portugal
Barrosatilde inscrita 141 068 plusmn 003 032 plusmn 003 Este trabalho
Barrosatilde natildeo inscrita 153 064+003 036 plusmn 003
Minhota 62 085 plusmn 003 015+003 Iacute Iacute
Mertolenga 147 085 plusmn 002 015+002 Kn)Deiacutea(1980)
Alentejana 155 091 plusmn 002 009 plusmn 002
Mirandesa 107 099 + 001 001+001 NOBRE (S data)
Espanha
Cachena 71 077 + 004 023 plusmn 004 IGLESIAS (1989)
Caldelana 60 096 plusmn 002 004 plusmn 002 ce
Frieiresa 33 094 + 003 006 plusmn 003
Limiana 39 083 + 004 017 plusmn 004
Rubia Gallega 168 089 plusmn 002 011+002
Vianesa 40 086 + 004 014 plusmn 004
Sayaguesa 147 072 plusmn 003 028+003 GONZALEZ eacutetal (1987)
Morucha 101 072 plusmn 003 028 plusmn 003 a
Alistana Sanabresa 157 092 plusmn 002 008+002 iacute iacute
Blanca Cacerena 62 067 plusmn 004 033 plusmn 004 IacuteIacute
Caacuterdena Andaluza 25 100
Asturiana de los Vallegraves 127 087 plusmn 002 013+002 laquo
Asturiana de la Montaria 106 077 plusmn003 023 plusmn 003 IacuteIacute
Tudanca 42 076 plusmn 005 024 plusmn 005 VICENTE (1978)
Morena del NO 25 092 plusmn 004 008 plusmn 004
De Lidia 124 061+003 039 plusmn 003 KjDDetal (1980)
Retinta 164 065 + 003 035+003 iacuteiacute
Bulgaacuteria
Buacutefalo 263 007 + 001 093+001 MAKAVEEV(1984)
Murran (Buacutefalo) 51 020 plusmn 004 080 plusmn 004 laquo
Alemanha
Frisia 550 083 plusmn 001 017 + 001 THTNNES eacutetal (1976)
Suiacuteccedila
Simmental 1039 079 + 001 021+001 KAgraveSTLIeacutetal (1980)
Castanha Suiacuteccedila 546 087 plusmn 001 013+001
Friburg 223 084 + 002 016+002
in IGLESIAS (1989)
59
Resultados e Discussatildeo
As frequecircncias aleacutelicas de CAIPS e CAIPF nas raccedilas Cachena espanhola e Barrosatilde
portuguesa satildeo idecircnticas o que poderaacute eventualmente indicar estar-se em presenccedila de uma soacute
raccedila com designaccedilotildees diferentes nos dois paiacuteses Esta hipoacutetese eacute reforccedilada pelo facto de natildeo
haver diferenccedilas significativas entre dados morfomeacutetricos obtidos nas duas raccedilas (LEAL 1995)
Nos buacutefalos observa-se mais uma vez uma inversatildeo nas frequecircncias dos dois alelos do
locus CAII em relaccedilatildeo aos bovinos sendo CAF o mais frequente com valores situados entre
080 e 093
bull NP
Pela anaacutelise das tabelas 337 e 338 verifiacuteca-se a presenccedila dos dois alelos descritos
neste locus nas vaacuterias raccedilas bovinas sendo NPL o mais frequente nas raccedilas europeias (052 e
099) Observa-se uma grande similaridade entre os valores das frequecircncias geacutenicas o que natildeo
permite diferenciar as raccedilas estudadas neste trabalho das restantes
Tabela 337 Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica de NP em populaccedilotildees das raccedilas Barrosatilde e Minhota
N
Fenoacutetipos
N NP H NPL
Barrosatilde inscrita 141 69 72
Barrosatilde natildeo inscrita 153 55 98
Minhota 62 19 43
60
Resultados e Discussatildeo
Tabela 338 Frequecircncias geacutenicas para NP em vaacuterias populaccedilotildees e raccedilas bovinas
N
Frequecircncias geacutenicas
N NPH NPL Referecircncia
Portugal
Barrosatilde inscrita 141 029 plusmn 003 071 plusmn 003 Este trabalho
Barrosatilde natildeo inscrita 153 020 plusmn 002 080 plusmn 002 cc
Minhota 62 017 + 004 083 + 004
Espanha
Cachena 71 020 plusmn 003 080 plusmn 003 IGLESIAS (1989)
Caldelana 60 013+003 087 plusmn 003 t t
Frieiresa 33 011+004 089 plusmn 004
Limiana 39 008 plusmn 003 092 plusmn 003
Rubia Gallega 168 015+002 085 plusmn 002
Vianesa 40 013 + 004 087 plusmn 004 t i
Sayaguesa 147 014 + 002 086 plusmn 002 GONZALEZ et ai ( 1987)
Morucha 101 020 plusmn 003 080 plusmn 003
Alistana Sanabresa 157 001+001 099 + 001
Blanca Cacerena 62 048 plusmn 005 052 plusmn 005 laquo
Caacuterdena Andaluza 25 004 plusmn 003 096 plusmn 003 IacuteIacute
Asturiana de los Vallegraves 127 028 plusmn 003 072 plusmn 003
Asturiana de la Montana 106 026 plusmn 003 074 plusmn 003
Beacutelgica
Charolesa 130 026 plusmn 003 074 + 003 ANSAY amp HANSET (1972)
Frisia 91 006 plusmn 002 094 plusmn 002 t t
in IGLESIAS (1989)
MPI
A distribuiccedilatildeo dos fenoacutetipos observados para o locus MPI apresenta-se na tabela 339
Das trecircs populaccedilotildees estudadas apenas a raccedila Minhota apresenta valores observados
proacuteximos dos valores esperados segundo o formalismo de Hardy-Weinberg Por outro lado
apesar de natildeo ter sido possiacutevel testar o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg nas restantes populaccedilotildees
a aparente diferenccedila entre valores observados e esperados poderaacute dever-se a um excesso de
indiviacuteduos homozigoacuteticos para MPIC Este resultado poderaacute estar relacionado com o
processo de amostragem ou com outras causas como o acasalamento entre indiviacuteduos
61
Resultados e Discussatildeo
aparentados a existecircncia de sub-populaccedilotildees de tamanho pequeno ou ainda a um reduzido
nuacutemero de machos reprodutores
Tabela 339 Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica de MPI em populaccedilotildees das raccedilas Barrosatilde e Minhota Entre parecircntesis indicam-se os valores esperados de acordo com o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg
Fenoacutetipos N MPIA MPIAB MPIAC MPIB MPIBC MPIC
Barrosatilde inscrita 138 - - - 131 6 1
(1301) (78) (01)
Barrosatilde natildeo inscrita 1 5 2 - - - 147 4 1
(1460) (59) (01)
Minhota 61 0 3 0 56 2 0
(00) (29) (01) (561) (19) (00)
A anaacutelise da tabela 3310 permite verificar que MPIB e MPIC ocorrem nas duas
raccedilas de bovinos estudadas sendo MPIB o alelo mais comum nas trecircs populaccedilotildees A
ocorrecircncia de MPI A na raccedila Minhota contraria o descrito por ANSAY (1973) quando afirma
a exclusividade do fenoacutetipo AB na raccedila Charolesa
Tabela 3310 Frequecircncias geacutenicas de MPI nas populaccedilotildees estudadas
N
Frequecircncias geacutenicas
N MPPA MPPB MPIC
Barrosatilde inscrita 138 - 097 + 001 003+001
Barrosatilde natildeo inscrita 152 - 098 + 001 002+001
Minhota 61 002 plusmn 001 096 plusmn002 002 plusmn 001
A informaccedilatildeo disponiacutevel sobre este marcador em anteriores trabalhos de anaacutelise
geneacutetica em bovinos eacute quase inexistente Tal poderaacute dever-se agraves dificuldades de visualizaccedilatildeo
encontradas na sua fenotipagem por electroforese convencional A detecccedilatildeo de MPI estaacute
descrita em tecidos musculares e em leucoacutecitos neste trabalho utilizaram-se eritroacutecitos para o
estudo de variaccedilatildeo geneacutetica desta proteiacutena mas eacute provaacutevel que a sua expressatildeo ocorra apenas
na fracccedilatildeo leucocitaacuteria (natildeo separada) o que explicaria precisamente a sua fraca actividade
62
Resultados e Discussatildeo
ALB
A distribuiccedilatildeo dos fenoacutetipos observados para o locus ALB apresenta-se na tabela
3311
Apesar de natildeo ter sido possiacutevel testar o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg todas as
amostras estudadas mostram desvios muito reduzidos entre valores observados e esperados
Tabela 3311 Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica de ALB em populaccedilotildees das raccedilas Barrosatilde e Minhota Entre parecircntesis indicam-se os valores esperados de acordo com o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg
N
Fenoacutetipos N ALBA ALBAB ALBB ALBBV ALBAV ALB V
Barrosatilde inscrita 142 137 3 - - 2 -(1370) (30) (00) (00) (20) (00)
Barrosatilde natildeo inscrita 153 145 5 1 - 2 -(1440) (68) (01) (01) (20) (00)
Minhota 62 59
(590)
3 (30) (00)
Na tabela 3312 estatildeo discriminadas as frequecircncias geacutenicas estimadas para as
populaccedilotildees estudadas bem como as de outras populaccedilotildees de bovinos da Europa e de buacutefalos
da Bulgaacuteria
Verifica-se que ALBA eacute o alelo mais comum encontrando-se aparentemente fixado
em vaacuterias raccedilas bovinas de origem europeia
Como jaacute referido para HB a presenccedila de ALBB nas raccedilas europeias parece
relacionar-se com a sua localizaccedilatildeo geograacutefica verificando-se que de uma maneira geral a sua
frequecircncia aumenta agrave medida que nos aproximamos do sul da Europa e de Aacutefrica eacute no gado
zebu africano que este alelo ocorre com frequecircncias mais elevadas variando entre 030 e 060
(VICENTE 1978) Assim a presenccedila de ALBB no gado europeu poderaacute indicar a passagem
pela Europa de bovinos oriundos de Aacutefrica (CECCHINI amp Nus 1986) Eacute de notar que apenas a
raccedila Minhota e algumas das restantes raccedilas da Peniacutensula Ibeacuterica natildeo apresentam ALBB
63
Resultados e Discussatildeo
Tabela 3312 Frequecircncias geacutenicas de ALB em vaacuterias populaccedilotildees de raccedilas bovinas e em buacutefalos
Frequecircncias geacutenicas
N ALBA (F) ALBB (S) ALBV Referecircncia
Portugal
Barrosatilde inscrita 142 098 + 001 001 plusmn 001 001 plusmn001 Este trabalho
Barrosatilde natildeo inscrita 153 097 + 001 002+001 001 plusmn001
Minhota 62 098 plusmn 001 - 002 plusmn 001
Mertolenga 147 084 plusmn 002 016 + 002 - KlDDetal (1980)
Alentejana 155 094+001 006 plusmn 001 -
Mirandesa 106 094 + 002 006 plusmn 002 - NOBRE (S data)
Espanha -
Cachena 71 098 + 001 002+001 - IGLESIAS (1989)
Caldelana 60 098 plusmn 001 002 + 001 -
Frieiresa 33 100 - - raquo
Limiana 39 097 + 002 003 plusmn 002 -
Rubia Gallega 201 099 plusmn 000 001 plusmn000 -
Vianesa 40 093 + 003 007 + 003 -
Sayaguesa 147 096 plusmn001 004 plusmn 001 - GONZALEZ et al (1987)
Moracha 101 089 plusmn 002 011+002 -
Alistaria Sanabresa 157 090 plusmn 002 010 plusmn002 -
Blanca Cacerena 62 056 plusmn 005 044 plusmn 005 -
Caacuterdena Andaluza 25 100 - -
Asturiana de los Vallegraves 127 099 + 001 001 plusmn001 -
Asturiana de la Montana 106 099 plusmn001 001 plusmn001 -
Pirenaica 265 092 + 001 008 plusmn001 - VICENTE (1978)
Tudanca 42 100 - -
Morena del N O 25 092 + 004 008 plusmn 004 -
Frisona 97 100 - -
De Lidia 124 100 - - KIDDeacutetal (1980)
Retinta 164 097 + 001 003 plusmn001 -
Itaacutelia
Chinina 264 089 + 001 011 plusmn001 - CARENZIeacutetal (1970)
Marchigiana 124 074 + 003 026 plusmn 003 -
Beacutelgica
Pied vermelha Este-Flandern 503 100 - - BOUQUET amp VAN de WEGHE (1972)
Vermelha Oeste-Flandern 155 100 - -
Pied preta 174 100 - -
Pied vermelha-Campine 265 100 - -
w IGLESIAS (1989)
(Continua)
64
Resultados e Discussatildeo
Tabela 3312 Frequecircncias geacutenicas de ALB em vaacuterias populaccedilotildees de raccedilas bovinas e de buacutefalos (continuaccedilatildeo)
Frequecircncias geacutenicas N ALBA (F) ALBB (S) ALBV Referecircncia
Bulgaacuteria
Sofia Brow 170 096+001 004 + 001 - M A K A V E E V ( 1 9 7 0 )
Buacutefalo 225 047 plusmn 002 053 plusmn 002 - M A K A V E E V ( 1 9 8 4 )
Murrah (Buacutefalo) 76 012+003 088 plusmn 003 -
G Bretanha
Charolesa 99 084 plusmn 003 016 + 003 - SPOONER amp OLIVER (1969)
Frisia 1422 100 - -
Hereford 215 099 plusmn 001 001+001 -
Jersey 217 100 - -
laquo IGLESIAS (1989)
Neste trabalho descreve-se tambeacutem o alelo ALBV com uma frequecircncia de 001 e
002 nas raccedilas Barrosatilde e Minhota respectivamente Este alelo natildeo se encontra descrito em
qualquer raccedila europeia podendo a sua detecccedilatildeo estar relacionada com a capacidade resolvente
da teacutecnica de focagem isoeleacutectrica utilizada na separaccedilatildeo de ALB
TF
A transferrina eacute provavelmente o mais informativo dos sistemas polimoacuterficos estudados
em virtude do nuacutemero de alelos que apresenta
A distribuiccedilatildeo dos fenoacutetipos observados para o locus TF apresenta-se na tabela 3313
E possiacutevel verificar a existecircncia de equiliacutebrio de Hardy-Weinberg em todas as populaccedilotildees
estudadas
Da anaacutelise das frequecircncias geacutenicas expressas na tabela 3314 verifica-se que este locus
apresenta quatro produtos geacutenicos na maioria das raccedilas europeias sendo os alelos TFA e
TFD (incluindo os subtipos TFD1 e TFD2) os que apresentam frequecircncias mais elevadas
(027 a 092 para o alelo TFA e 026 a 073 para o alelo TFD)
Observa-se tambeacutem que a frequecircncia de TFD2 nas raccedilas estudadas eacute mais elevada do
que a de TFD1 como ocorre na maioria das raccedilas ibeacutericas
65
Resultados e Discussatildeo
No que se refere a TFE verifica-se que a sua frequecircncia eacute relativamente baixa nas
raccedilas europeias (001 e 022) e estaacute mesmo ausente em quase todas as raccedilas da regiatildeo da
Galiza (com excepccedilatildeo da raccedila Cachena espanhola e Rubia Gallega) e na raccedila Minhota Note-se
a grande semelhanccedila entre os valores de frequecircncias geacutenicas deste alelo na raccedila Cachena
espanhola (005) e nas populaccedilotildees de raccedila Barrosatilde (004 e 003) o que mais uma vez sugere
uma grande proximidade entre as duas Apesar de ocorrer em baixa frequecircncia nos bovinos
europeus a presenccedila de TFE nestas raccedilas pode indicar uma proveniecircncia asiaacutetica ou africana
pois eacute nestes continentes que aquele alelo eacute mais comum (BRAEND 1971)
66
Resultados e Discussatildeo
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Resultados e Discussatildeo
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68
Resultados e Discussatildeo
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69
Resultados e Discussatildeo
bull GC
A distribuiccedilatildeo dos fenoacutetipos observados para o locus GC apresenta-se na tabela 3315
A sua anaacutelise permite verificar a existecircncia de diferenccedilas entre os valores observados e
esperados para raccedila Barrosatilde (populaccedilatildeo inscrita no Livro Genealoacutegico) Este desvio ao
equiliacutebrio de Hardy-Weinberg deve-se agrave existecircncia de um excesso de homozigoacuteticos
sugerindo assim a ocorrecircncia de uma possiacutevel subestruturaccedilatildeo na populaccedilatildeo
Nas restantes amostras estudadas natildeo foi possiacutevel aplicar o teste de Contudo a
diferenccedila entre valores observados e esperados de acordo com o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg
eacute praticamente inexistente na populaccedilatildeo Barrosatilde natildeo inscrita e pouco acentuada na raccedila
Minhota
Tabela 3315 Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica de GC em populaccedilotildees das raccedilas Barrosatilde e Minhota Entre parecircntesis indicam-se os valores esperados de acordo com o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg
Fenoacutetipos N GCS GCFS GCF
Barrosatilde inscrita 142 98 35 8
(945) (419) (45)
Barrosatilde natildeo inscrita 153 109 40 4
(1087) (406) (37)
Minhota 62 54 5 3
(514) (101) (04)
x2
3913 1 0048
A distribuiccedilatildeo das frequecircncias geacutenicas apresentada na tabela 3316 mostra que GCS eacute
o alelo mais comum nas raccedilas europeias (com excepccedilatildeo da raccedila Frisia da Sueacutecia) As raccedilas
estudadas neste trabalho tecircm frequecircncias aleacutelicas para este locus que as aproximam das raccedilas
espanholas
70
Resultados e Discussatildeo
Tabela 3316 Frequecircncias geacutenicas de GC em vaacuterias populaccedilotildees de raccedilas bovinas
Frequecircncias geacutenicas
N GCF(ouA) GCS(ouB) GCC Referecircncia
Portugal
Barrosatilde inscrita
Barrosatilde natildeo inscrita
Minhota
Alentejana
Mirandesa
Espanha
De Lidia
Frisona
Beacutelgica
Branca e azul
Flemish vermelha
Campine vermelha e branca
Preta e branca
Flemish branca e vermelha
Sueacutecia
Vermelha e Branca
Frisia
141 018 plusmn0023
153 016 plusmn002
62 009 plusmn 003
028 plusmn 004
97 020 plusmn 003
1306 008 plusmn001
124 015 plusmn002
2323 031 plusmn001
431 016 plusmn001
299 012 plusmn001
299 019 plusmn002
140 006 plusmn 001
1030 039 plusmn001
273 079 plusmn 002
082 plusmn 002
084 plusmn 002
091 plusmn003
072 plusmn 004
080 plusmn 003
092 plusmn 001
085 plusmn 002
069 plusmn 001
084 plusmn 001
088 plusmn 001
081 plusmn002
065 plusmn 003
061 plusmn001
021 plusmn002
029 plusmn 003
Este trabalho
CUNHA (1994)
NOBRE (S data)
PIEDRAFUA et ai (1984)
VAN de WEGHE et ai (1982)
GAHNE(1963)
in PIEDRAFUA et ai (1984)
71
Resultados e Discussatildeo
34 - ANAacuteLISE POPULACIONAL CONJUNTA
341 - Diversidade geneacutetica na raccedila Barrosatilde
As estimativas da variabilidade geneacutetica das populaccedilotildees de bovinos das raccedilas Barrosatilde e
Minhota efectuaram-se considerando apenas 6 loci polimoacuterficos HB CAII MPI ALB TF e
GC
Tabela 341 Estimativa da variabilidade geneacutetica (6 loci) atraveacutes dos valores de heterozigotia observada (Ho) e esperada (He) nas populaccedilotildees estudadas
Barrosatilde inscrita Barrosatilde natildeo inscrita Minhota Locus
Ho He Ho He Ho He
HB 0000 0000 0000 0000 0097 0093
CAH 0411 0441 0464 0464 0210 0262
MPI 0043 0056 0026 0039 0082 0080
ALB 0035 0035 0046 0058 0048 0048
TF 0603 0590 0556 0595 0694 0638
GC 0248 0297 0261 0265 0081 0163
Os resultados expressos na tabela 341 mostram em geral a ausecircncia de diferenccedilas
significativas entre os valores de heterozigotia observada (Ho) e heterozigotia esperada (He)
para os loci estudados Deve contudo notar-se que na raccedila Minhota e quanto ao locus GC o
valor de He eacute aproximadamente o dobro da Ho Nos restantes loci o ligeiro desvio observado
entre Ho e He sugere em geral um deacutefice de heterozigoacuteticos
Nas duas populaccedilotildees de raccedila Barrosatilde os sistemas TF e CAII satildeo os que apresentam
valores de heterozigotia mais elevados Pelo contraacuterio os loci MPI e ALB mostram valores de
heterozigotia baixos possivelmente devido ao excesso de homozigoacuteticos (MPI B e ALB A)
detectados nas trecircs populaccedilotildees
Na tabela 342 apresentam-se os valores do nuacutemero meacutedio de alelos por locus (ria)
percentagem de loci polimoacuterficos (P) heterozigotia meacutedia observada (Ho) e heterozigotia
esperada (He) nas populaccedilotildees de bovinos estudados Estes valores devem ser interpretados
72
Resultados e Discussatildeo
tendo em conta o facto de os 6 loci investigados serem polimoacuterficos em pelo menos uma
populaccedilatildeo
Tabela 342 Variabilidade geneacutetica detectada em trecircs populaccedilotildees de bovinos atraveacutes da anaacutelise de 6 loci polimoacuterficos N - efectivo meacutedio estudado por locus na - nuacutemero meacutedio de alelos por locus P - proporccedilatildeo de loci polimoacuterficos Ho - heterozigotia observada He - heterozigotia meacutedia esperada Entre parecircntesis indicam-se os valores do desvio padratildeo
Raccedila Populaccedilatildeo N na P Ho He
Barrosatilde inscrita 1407 233 833 0223 0237
(06) (042) (0100) (0100)
Barrosatilde natildeo inscrita 1528 233 833 0226 0237
(02) (042) (0098) (0101)
Minhota 618 233 1000 0202 0214
(02) (021) (0101) (0090)
A sua anaacutelise permite verificar em primeiro lugar a ocorrecircncia de uma grande
semelhanccedila entre os valores de H nas duas raccedilas estudadas Barrosatilde e Minhota revelando a
existecircncia de uma variabilidade geneacutetica idecircntica nas trecircs populaccedilotildees de bovinos Observa-se
tambeacutem que os valores de heterozigotia meacutedia observada (Ho) natildeo diferem significativamente
dos valores de heterozigotia esperados (He) nas trecircs populaccedilotildees sendo o valor mais elevado o
encontrado na populaccedilatildeo de raccedila Barrosatilde (237)
Os elevados valores de P (833 na raccedila Barrosatilde e 100 na raccedila Minhota) resultam
do facto de apenas se terem utilizado loci polimoacuterficos nesta anaacutelise e o nuacutemero meacutedio de
alelos por locus (na) eacute igual nas trecircs populaccedilotildees estudadas (233)
A tabela 343 apresenta estimativas de FB Frr e FST para as trecircs populaccedilotildees de
bovinos Os valores de Fis indicam a existecircncia de uma acentuada deficiecircncia de
heterozigoacuteticos nos loci MPI e GC Nos restantes loci verifica-se por um lado a tendecircncia
para um excesso de heterozigoacuteticos nos loci HB e TF (com valores de -0051 e -0021
respectivamente) e por outro lado para uma ligeira deficiecircncia de heterozigoacuteticos nos loci
CAII e ALB (com valores de 0066 e 0072 respectivamente) A meacutedia ponderada de FiS
mostra uma deficiecircncia de heterozigoacuteticos de 48
73
Resultados e Discussatildeo
Tabela 343 Distribuiccedilatildeo relativa da diversidade geneacutetica nas trecircs populaccedilotildees de bovinos Hs-heterozigotia intrapopulacional HT-heterozigotia total Valores das estatiacutesticas F para 6 loci analisados
Locus H s Hx Fis FIT FST
HB 0030 0031 -0051 -0016 0033
CAII 0387 0404 0066 0104 0041
MPI 0058 0059 0130 0133 0004
ALB 0046 0047 0072 0075 0004
TF 0605 0627 -0021 0015 0036
GC 0241 0244 0183 0193 0012
Meacutedia 0228 0235 0048 0078 0031
As estimativas de FST indicam a existecircncia de um baixo grau de diferenciaccedilatildeo
populacional nos bovinos estudados Os valores de FST para os 6 loci analisados podem
considerar-se baixos (entre 0004 e 0041) apresentando uma meacutedia ponderada de 0031
Assim soacute uma pequena parte da diversidade geneacutetica (31) se deve a diferenccedilas entre as
populaccedilotildees sendo muito maior a diversidade dentro de cada populaccedilatildeo do que entre as
populaccedilotildees
Os baixos valores de FST encontrados para os loci MPI e ALB resultam de frequecircncias
elevadas de MPIB e ALBA respectivamente e traduzem uma grande homogeneidade entre
as raccedilas bovinas estudadas natildeo se detectando subestruturaccedilatildeo populacional
342 - Comparaccedilatildeo com outras raccedilas ibeacutericas
Tendo em conta o pequeno nuacutemero de loci comuns a este e a outros estudos
estimaram-se diferentes valores de heterozigotia meacutedia consoante o nuacutemero de loci de que se
dispunha Na tabela 344 e 345 apresentam-se valores de heterozigotia meacutedia para as
diferentes raccedilas obtidos a partir de quatro (FF) e cinco loci (FF+) respectivamente bem como
os valores de na P e os respectivos desvios padratildeo em vaacuterias raccedilas de bovinos ibeacutericos
A diversidade geneacutetica do bovino Barrosatilde avaliada pela taxa meacutedia de heterozigotia
(0281-0272 e 0249-0260 para 5 e 4 loci respectivamente) parece ocupar uma posiccedilatildeo
74
Resultados e Discussatildeo
intermeacutedia no seio das raccedilas ibeacutericas Tambeacutem o grau de variabilidade geneacutetica nos bovinos
avaliado por paracircmetros como o nuacutemero meacutedio de alelos por locus e a proporccedilatildeo de loci
polimoacuterficos (P) demonstra que as raccedilas estudadas neste trabalho ocupam uma posiccedilatildeo
intermeacutedia quando comparadas com outras raccedilas ibeacutericas
A anaacutelise das tabelas 344 e 345 mostra que todas as medidas de diversidade geneacutetica
(H P e de na) apresentam valores idecircnticos Esta semelhanccedila permite supor que o processo de
domesticaccedilatildeo iniciado haacute menos de 10000 anos natildeo levou a uma grande diferenciaccedilatildeo
geneacutetica entre as raccedilas pelo menos relativamente aos marcadores geneacuteticos estudados neste
trabalho Desta forma verifica-se que as principais diferenccedilas entre as raccedilas resultam de
pequenas alteraccedilotildees das suas frequecircncias geacutenicas provavelmente causadas pelo baixo nuacutemero
de animais destinados agrave reproduccedilatildeo (mais marcado nos machos) e pelos cruzamentos dirigidos
em cada raccedila
Por outro lado este baixo niacutevel de diferenciaccedilatildeo geneacutetica deveraacute estar tambeacutem
associado ao facto de na origem das raccedilas bovinas ibeacutericas se encontrar um uacutenico processo de
domesticaccedilatildeo seguido provavelmente de um processo de expansatildeo populacional bastante
recente do Proacuteximo Oriente ateacute agrave Europa Adicionalmente estima-se que a diferenciaccedilatildeo dos
bovinos em raccedilas autoacutectones soacute teraacute ocorrido nos uacuteltimos 300 anos (LOFTUS et ai 1994)
Neste contexto os eventuais estrangulamentos do efectivo populacional (bottleneck)
e efeitos de fundador ocorridos durante o periacuteodo inicial da domesticaccedilatildeo do gado bovino e
capazes de afectar de forma muito diferente vaacuterios nuacutecleos populacionais natildeo satildeo detectados
na Peniacutensula Ibeacuterica
75
Resultados e Discussatildeo
Tabela 344 Variabilidade geneacutetica em vaacuterias raccedilas de bovinos atraveacutes da anaacutelise de 4 loci polimoacuterficos N - efectivo meacutedio estudado por locus ria - nuacutemero meacutedio de alelos por locus P-- proporccedilatildeo de loci polimoacuterficos yent - heterozigotia meacutedia esperada Entre parecircntesis indicam-se os valores do desvio padratildeo
Raccedila Populaccedilatildeo N nbdquo P H +
Portugal
Barrosatilde inscrita 1410(00) 23 (05) 750 0249 (0135)
Barrosatilde natildeo inscrita 1530 (00) 23 (05) 755 0260(0135)
Minhota 620 (00) 20 (00) 1000 0216 (0094)
Mertolenga 1470 (00) 23 (03) 1000 0315 (0097)
Alentejana 1550(00) 23 (03) 1000 0239 (0123)
Mirandesa 1065 (03) 20 (00) 1000 0159(0110)
Espanha
Cachena 710 (00) 23 (03) 1000 0279(0111)
Caldelana 600 (00) 20 (00) 1000 0166 (0107)
Frieiresa 330 (00) 18(03) 750 0177(0112)
Limiana 390 (00) 20 (00) 1000 0246 (0087)
Rubia Gallega 1845(95) 25 (05) 1000 0215(0110)
Vianesa 400 (00) 20 (00) 1000 0221 (0087)
Sayaguesa 1470 (00) 23 (03) 1000 0320 (0094)
Morucha 1010(00) 23 (03) 1000 0361 (0084)
Alistaria Sanabresa 1570 (00) 23 (03) 1000 0213 (0104)
Blanca Cacerefia 618 (03) 20 (00) 1000 0377 (0078)
Caacuterdena Andaluza 250 (00) 15(03) 500 0131 (0106)
Asturiana de los Vallegraves 1265 (05) 23 (03) 1000 0237(0107)
Asturiana de la Montana 1060 (00) 23 (03) 1000 0280 (0088)
Tudanca 420 (00) 20 (04) 750 0321 (0109)
Morena del N O 250 (00) 18 (03) 750 0203 (0108)
Frisona 6540 (00) 18 (05) 500 0203 (0130)
De Lidia 1240 (00) 23 (03) 1000 0367(0135)
Retinta 1640 (00) 23 (03) 1000 0338 (0107)
76
Resultados e Discussatildeo
Tabela 345 Variabilidade geneacutetica em vaacuterias raccedilas de bovinos atraveacutes da anaacutelise de 5 loci polimoacuterficos N - efectivo meacutedio estudado por locus na - nuacutemero meacutedio de alelos por locus P--proporccedilatildeo de loci polimoacuterficos H^ - heterozigotia meacutedia esperada Entre parecircntesis indicam-se os valores do desvio padratildeo
Raccedila Populaccedilatildeo N na P i r Portugal
Barrosatilde inscrita 1410 (00) 22 (04) 800 0281 (0109)
Barrosatilde natildeo inscrita 1530(00) 22 (04) 800 0272 (0105)
Minhota 620 (00) 20 (00) 1000 0229 (0074)
Espanha Cachena 710 (00) 22 (02) 1000 0289 (0087)
Caldelana 600 (00) 20 (00) 1000 0180 (0084)
Frieiresa 330 (00) 18 (02) 800 0180 (0087)
Limiana 390 (00) 20 (00) 1000 0226(0071)
Rubia Gallega 1812(81) 24 (04) 1000 0223 (0086)
Vianesa 400 (00) 20 (00) 1000 0374 (0168)
Sayaguesa 1470 (00) 22 (02) 1000 0305 (0074)
Morucha 1010 (00) 22 (02) 1000 0353 (0066)
Alistaria Sanabresa 1570 (00) 22 (02) 1000 0174 (0089)
Blanca Cacerefla 616 (02) 20(00) 1000 0402 (0065)
Caacuterdena Andaluza 250 (00) 16(02) 600 0120 (0083)
Asturiana de los Vallegraves 1266 (04) 22 (02) 1000 0270 (0089)
Asturiana de la Montaria 1060(00) 22 (02) 1000 0301 (0072)
343 - Diferenciaccedilatildeo geneacutetica
Nas tabelas 346 e 347 apresentam-se as distacircncias geneacuteticas de Nei (NEI 1978)
calculadas para 23 (4 loci HB CAII ALB e TF) e 15 (5 loci HB CAII ALB TF e NP)
raccedilas bovinas ibeacutericas respectivamente Da sua anaacutelise ressalta o facto de aqueles valores
serem na sua maioria bastante baixos
De entre as raccedilas bovinas ibeacutericas estudadas a Frisona e a Cachena demonstram estar
mais proacuteximas da raccedila Barrosatilde com valores de DNei de 0092 (4 loci) e de 0104 (5 loci)
respectivamente Por outro lado as raccedilas Asturiana de la Montana e Vianesa aparecem como
as mais diferenciadas DNei= 0334 (4 loci ) e Dgtjei= 0330 (5 loci) respectivamente
77
Resultados e Discussatildeo
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Resultados e Discussatildeo
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80
Resultados e Discussatildeo
No que se refere agrave raccedila Minhota verifica-se que a Frieiresa eacute a que estaacute mais proacutexima
(valores de 0077 e 0074 para 4 e 5 loci respectivamente) e que mais um vez eacute a Asturiana de
la Montana a mais diferenciada das raccedilas (valores de 0389 e 0349 para 4 e 5 loci respectivamente)
A diferenciaccedilatildeo geneacutetica entre as raccedilas bovinas ibeacutericas encontra-se representada nos
dendrogramas construiacutedos pelos meacutetodos de agrupamento NJ (Neighbor-joining SATTOU amp
NEI 1987) e UPGMA (Unweightedpair-group arithmetic average SNEATH amp SOKAL 1973)
(figuras 341 342 343 e 344) Foram realizados testes de reamostragem do tipo
bootstrap (100 reacuteplicas) para a anaacutelise da consistecircncia dos padrotildees de ramificaccedilatildeo
apresentando-se os seus valores entre parecircntesis
A anaacutelise conjunta dos quatro dendrogramas permite verificar uma falta de consistecircncia
nos vaacuterios padrotildees de ramificaccedilatildeo para as raccedilas bovinas ibeacutericas associada a valores de
bootstrap em geral muito reduzidos De facto observa-se que o padratildeo de ramificaccedilatildeo dos
dendrogramas se altera consoante o meacutetodo de agrupamento usado e o nuacutemero de loci considerados Estas alteraccedilotildees nos agrupamentos das diferentes raccedilas devem-se
provavelmente agrave instabilidade causada pelo reduzido nuacutemero de loci polimoacuterficos utilizados
neste estudo bem como ao facto de as frequecircncias geacutenicas serem muito semelhantes em todas
as populaccedilotildees estudadas
Deve contudo referir-se que a raccedila Barrosatilde aparece normalmente associada a vaacuterias
raccedilas do norte da Peniacutensula Ibeacuterica nomeadamente a Cachena (Galiza) a Asturiana de la
Montana (Astuacuterias) a Sayaquesa e a Morucha (Salamanca)
No que se refere agrave raccedila Minhota esta aparece vaacuterias vezes associada agraves raccedilas Rubia
Gallega Frisona Asturiana de los Vallegraves e Frieiresa
81
Resultados e Discussatildeo
(18)
(14)
(11)
(5)
(3)
Sayaquesa
(39)
[32)
(21)1-
- -HsT
(49)
(1)
(3)
(18)
(8)
(13)1
(12)
19)
(16T
De Lidia
(99) Asturiana de la Montana
Tudanca bullMorucha
Cachena Barrosatilde mdashFrisona
Minhota -Asturiana de los Vallegraves Rubia Gallega
Frieiresa Alentejana
(65)
Mertolenga -Vianesa
Blanra Cacerefla
Retinta Linuacuteana
i (39)r
Mirandesa Caacuterdena Andaluza Morena NO
Caldelana Alistano Sanabresa
Figura 341 Dendrograma construiacutedo com base nas distacircncias geneacuteticas de NEI (1978) entre 23 raccedilas de bovinos (4 loci HBCAII ALB e TF) atraveacutes do meacutetodo de agrupamento NJ Os valores de probabilidade de ocorrecircncia de cada agrupamento obtidos atraveacutes de um teste de bootstrap indicam-se entre parecircntesis
82
Resultados e Discussatildeo
Morucha
Cachena Sayaquesa
Rubia Gallega Asturiana de los Vallegraves Freiresa
Frisona Minhota Alentejana Mertolenga
(43) ( 2 8 gt - ^ C a W e l a l
( iacute 7gtrl - Mirandesa L__ Alistano Sanabresa
Caacuterdena Andaluza Vianesa
Barrosatilde Retinta
De Lidia Tudanca
Asturiana de la Montana Morena NO Blanca Cacerena
Figura 342 Dendrograma construiacutedo com base nas distacircncias geneacuteticas de NEI (1978) entre 23 raccedilas de bovinos (4 loci HB CAII ALB e TF) atraveacutes do meacutetodo de agrupamento UPGMA Os valores de probabilidade de ocorrecircncia de cada agrupamento obtidos atraveacutes de um teste de bootstrap indicam-se entre parecircntesis
83
Resultados e Discussatildeo
(42)f
(30)1 I
(7)
2D
(23)1
I mdash l( 2 8 )
r
(49) r (23) r L
i4) I
(18) (23) bull
(28)
(55gt
-Caldelana Caacuterdena Andaluza
Alistano Sanabresa _ _ Rabia Galkga
Minhota Frieiresa
gt Asturiana de los Vallegraves
Asturiana de Ia Montana Barrosatilde
Sayaquesa mdashMorucha
Cachena Limiana
Blanca Cacerena Vianesa
Figura 343 Dendrograma construiacutedo com base nas distacircncias geneacuteticas de NEI (1978) entre 15 raccedilas de bovinos (5 loci HB CAII ALB TF e NP) atraveacutes do meacutetodo de agrupamento NJ Os valores de probabilidade de ocorrecircncia de cada agrupamento obtidos atraveacutes de um teste de bootstrap indicam-se entre parecircntesis
(21)
(18)
(100)
(55)
(15)T r i shyT
C a
(40) |_Caacute
Alistano Sanabresa
(37)
(61)
(46
(29)
^ o i j r mdash
Caldelana Caacuterdena Andaluza
Limiana Vianesa
Rubia Gallega Asturiana de los Vallegraves
(32j~
j2frTL
Frieiresa
Minhota Cachena Morucha
Sayaquesa
Barrosatilde bull Blanca Cacerena
Asturiana de la Montana
Figura 344 Dendrograma construiacutedo com base nas distacircncias geneacuteticas de NEI (1978) entre 15 raccedilas de bovinos (5 loci HB CAII ALB TF e NP) atraveacutes do meacutetodo de agrupamento UPGMA Os valores de probabilidade de ocorrecircncia de cada agrupamento obtidos atraveacutes de um teste de bootstrap indicam-se entre parecircntesis
84
Resultados e Discussatildeo
No seu conjunto estes resultados natildeo satildeo suficientes para o estabelecimento de uma
histoacuteria evolutiva das actuais raccedilas bovinas ibeacutericas nem para a separaccedilatildeo da raccedila Barrosatilde das
restantes Consequentemente natildeo eacute possiacutevel neste momento fazer corresponder a anaacutelise da
diversidade e estrutura geneacutetica das populaccedilotildees ibeacutericas de gado bovino com alguma das
hipoacuteteses evolutivas propostas por diversos autores com base em evidecircncia morfoloacutegica
(VALLEJO 1978 IGLESIAS 1989 CORDEIRO 1986 JORGE 1996)
De acordo com essa evidecircncia a raccedila Barrosatilde (e tambeacutem a Cachena) derivaria do
denominado tronco mauritaacutenico (Bos primigenius opisthonomus) ou seja de populaccedilotildees
originaacuterias do Norte de Aacutefrica que teriam passado para o sul da Peniacutensula Ibeacuterica alcanccedilando
mais tarde o Norte de Portugal e de Espanha Por outro lado a filiaccedilatildeo da raccedila Minhota
segundo JORGE (1996) deriva do tronco aquitacircnico (Bos primigenius primigenius) tal como a
maior parte das raccedilas da Galiza das Astuacuterias e dos Pirineacuteus
Embora os resultados apresentados neste trabalho pareccedilam de facto indicar que as
raccedilas Barrosatilde e Minhota derivam de troncos diferentes eacute necessaacuterio aprofundar de forma
muito consideraacutevel a investigaccedilatildeo sobre a estrutura geneacutetica das raccedilas bovinas ibeacutericas antes de
se poder formular conclusotildees mais sustentadas
85
Con8ideraccedil8es Finais
4 - CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
O trabalho desenvolvido nesta dissertaccedilatildeo permitiu o estudo de alguns sistemas
geneacuteticos polimoacuterficos jaacute descritos em bovinos (HB CAII NP MPI ALB TF e GC) nas
raccedilas Barrosatilde e Minhota Permitiu ainda a aplicaccedilatildeo de teacutecnicas de separaccedilatildeo electroforeacuteticas
mais eficazes em alguns desses sistemas
Vaacuterias limitaccedilotildees durante a execuccedilatildeo praacutetica deste trabalho obrigaram de alguma
forma a alteraccedilotildees no programa inicial Entre elas devem referir-se
1 a recolha de amostras de sangue mostrou-se difiacutecil e demorada sendo necessaacuteria a
coordenaccedilatildeo de esforccedilos de vaacuterias entidades (Direcccedilatildeo Regional de Agricultura de
Entre Douro e Minho e brigadas de Sanidade Animal locais) de veterinaacuterios e de
criadores de bovinos retirando tempo agrave execuccedilatildeo praacutetica do trabalho
2 a afinaccedilatildeo de vaacuterias teacutecnicas electroforeacuteticas para certos marcadores geneacuteticos
envolveu um consideraacutevel esforccedilo de investigaccedilatildeo
3 a impossibilidade de apurar atempadamente as teacutecnicas de separaccedilatildeo ou de
visualizaccedilatildeo para a amilase a ceruloplasmina e a poacutes-transferrina
4 a escassa bibliografia sobre o bovino Barrosatilde e sobre as teacutecnicas utilizadas neste
trabalho em gado bovino
Apesar das limitaccedilotildees considera-se que este trabalho se reveste de alguma importacircncia
pelo facto de constituir um contributo para a caracterizaccedilatildeo geneacutetica de uma raccedila bovina muito
peculiar A este respeito entendeu-se que numa primeira fase se procederia ao estudo de um
conjunto de proteiacutenas polimoacuterficas de forma a poder iniciar uma comparaccedilatildeo com outras raccedilas
bovinas nomeadamente ibeacutericas para as quais jaacute existem resultados publicados Por outro
86
Consideraccedilotildees Finais
lado o estabelecimento de um conjunto de teacutecnicas de fenotipagem dos loci considerados
permite desde logo a sua aplicaccedilatildeo em questotildees de identificaccedilatildeo individual e de anaacutelise da
paternidade
Eacute contudo evidente que o aprofundamento deste trabalho deveraacute necessariamente
evoluir na direcccedilatildeo da anaacutelise molecular da variaccedilatildeo geneacutetica Adicionalmente seraacute do maior
interesse alargar o domiacutenio de investigaccedilatildeo agraves restantes raccedilas bovinas autoacutectones
Em face do exposto entende-se ser possiacutevel definir trecircs linhas de investigaccedilatildeo para os
proacuteximos anos
1 - ampliaccedilatildeo da bateria de sistemas geneacuteticos polimoacuterficos detectados em proteiacutenas do
sangue e do leite
2 - anaacutelise da variabilidade geneacutetica de um conjunto de microssateacutelites se possiacutevel
associados a algumas das proteiacutenas polimoacuterficas jaacute descritas
3 - estudo do polimorfismo da moleacutecula de DNA-mitocondrial
De uma forma geral pode assim considerar-se que os principais objectivos definidos
no iniacutecio deste trabalho foram alcanccedilados pelo que se apresentam em seguida as conclusotildees
87
Conclusotildees
5 - CONCLUSOtildeES
A utilizaccedilatildeo de um sistema de focagem isoeleacutectrica permitiu detectar a existecircncia de
polimorfismo geneacutetico na hemoglobina distinguindo-se dois produtos geacutenicos na raccedila bovina
Minhota HBA e HBB Na raccedila Barrosatilde HBA foi o uacutenico produto geacutenico encontrado
A utilizaccedilatildeo de um sistema de focagem isoeleacutectrica permitiu a detecccedilatildeo de dois
produtos geacutenicos no locus CAII (CAIPF e CAIPS) e revelou-se mais eficaz de que as
teacutecnicas de separaccedilatildeo convencional em gel de amido
A investigaccedilatildeo realizada permitiu detectar a ocorrecircncia de polimorfismo geneacutetico de
MPI atraveacutes de um sistema electroforeacutetico em gel de amido tendo-se detectado trecircs produtos
geacutenicos (MPIA MPIB e MPIC) A fraca actividade de MPI e a grande dificuldade na
obtenccedilatildeo de um contraste de bandas adequado poderaacute dever-se ao facto de a sua expressatildeo soacute
ocorrer na fracccedilatildeo leucocitaacuteria do sangue
A aplicaccedilatildeo de um sistema de focagem isoeleacutectrica na presenccedila de ureia (8M) revelou-
-se muito eficaz na separaccedilatildeo de ALB e permitiu detectar pela primeira vez um novo variante
ALBV ligeiramente mais aciacutedico do que ALBA
A combinaccedilatildeo de uma teacutecnica de focagem isoeleacutectrica com um preacutevio tratamento das
amostras a fim de saturar a moleacutecula de TF com Fe permitiu a detecccedilatildeo de quatro produtos
geacutenicos (TF A TFD1 TFD2 e TFE) nas raccedilas estudadas
88
Conclusotildees
A combinaccedilatildeo de uma teacutecnica de focagem isoeleacutectrica com a detecccedilatildeo por
immunoblotting permitiu detectar dois produtos geacutenicos no locus GC (GCA e GCB) O
tratamento de amostras com neuraminidase permitiu a obtenccedilatildeo de padrotildees mais simples do
que os conseguidos com amostras nativas Esta simplificaccedilatildeo resulta da provaacutevel remoccedilatildeo de
aacutecidos siaacutelicos ligados agrave moleacutecula de GC
Natildeo se detectou nenhum caso de exclusatildeo na anaacutelise de segregaccedilatildeo de 27 pares
matildeefilho feita separadamente para cada locus
Verifiacutecou-se a presenccedila de dois alelos raros HBB e PEPB1 na raccedila Minhota Estes
alelos poderatildeo ser utilizados na distinccedilatildeo das duas raccedilas estudadas
Foi encontrado um valor de heterozigotia meacutedia de 0237 em populaccedilotildees de raccedila
Barrosatilde indicativo de uma variabilidade geneacutetica intermeacutedia em relaccedilatildeo agrave generalidade das
raccedilas ibeacutericas As diferenccedilas observadas entre as vaacuterias raccedilas ibeacutericas poderatildeo reflectir
fenoacutemenos histoacuterico-evolutivos muito recentes dada a sua proximidade e grande semelhanccedila
Foi observado um reduzido niacutevel de diferenciaccedilatildeo entre as raccedilas Barrosatilde e Minhota
(FST= 0031) demonstrando-se que a maior parte da diversidade geneacutetica se atribui a diferenccedilas
intrapopulacionais Este valor de FST pode considerar-se baixo quando comparado com o
obtido no estudo de outras espeacutecies animais sugerindo um elevado fluxo geacutenico
interpopulacional Por outro lado reflecte ainda uma histoacuteria demograacutefica muito recente
A utilizaccedilatildeo de meacutetodos de agrupamento NJ e UPGMA obtidos a partir de matrizes de
distacircncias geneacuteticas de Nei natildeo permitiu separar a raccedila Barrosatilde das restantes raccedilas ibeacutericas
89
Referecircncias Bibliograacuteficas
6 - REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
AMORIM A (1983) Contribuiccedilatildeo para o conhecimento da Geneacutetica Humana Estudo de Geneacutetica Bioquiacutemica
Formal e Populacional e de Ligaccedilatildeo Factorial Tese de Doutoramento Faculdade de Ciecircncias do
Porto
AMORIM A KOMPF J SCHUNTER F amp RITTER H (1982) Aminolevulinate dehydratase (EC42124)
Linkage analysis Hum Genet 61 48-49
ANSAY M (1973) Techniques microelectrophoretiques dans lanalyse de la multipliciteacute enzymatique chez les
bovins Deacutetection Eacutelectrophoreacutetique des Polymorphismes Biochimiques Chez les Mammifegraveres
Application a LEacutetude Geacuteneacutetique des Populations Centre National de la Recherche Scientifique
Paris 43-58
ARANA A pound amp ZARAGOZA P (1986) Nueva electroforetica dei enzima NADH-Diafrosa (DIA-2) detectada
en la espeacutecie Oryctolagus cuniculus (L) Zootecnia XXXV ndeg 7-12 125-130
ARAUacuteJO J (1986) Contribuiccedilatildeo para o estudo dos bovinos de raccedila Barrosatilde Relatoacuterio de estaacutegio da
licenciatura em Engenharia Zooteacutecnica Universidade dos Accedilores
ARNOLD I C J amp Bouw J (1989) A new allele of glucose phosphate isomerase in dogs Animal Genetics
20 217-220
ARRANZ J J BAYON Y amp SAN PRIMITIVO F (1992) Biochemical polymorphisms in Spanish Avilena-
-Negra Ibeacuterica cattle Animal Genetics 23 (suppl 1) 19
ARRANZ J J BAYON Y amp SAN PRIMITIVO F (1996) Comparison of protein markers and microsatellites in
differentiation of cattle populations Animal Genetics 27 415-419
ASHTON G C (1965) Cattle serum transferrins A balanced polymorphism Genetics 52 983-997
90
Referecircncias Bibliograacuteficas
BAINES J amp MEacuteLEK J (1980) Egipto - Deuses Templos e Faraoacutes Grandes Culturas e Civilizaccedilotildees Ciacuterculo
de Leitores
BELL K ARTHUR H amp ANDERSON I L (1994) Esterase and albumin polymorphism in the domestic cat
(Felis catus) XXIV International Conference on Animal Genetics Praga Julho 1994
BEKENEV V A amp ORLOVA G V (1991) Polymorphism of erytrocytic enzymes in Large White pig breeds in
Siberia Animal Genetics 22 (suppl 1) 23-24
BOWLING A T amp CLARK R S (1988) Excess of heacuteteacuterozygotes at albumin locus in American Standardbred
horses Animal Genetics 19 331-341
BOWLING A T GORDON L PENEDO M C T WICTUM E amp BEEBOUT J (1990) A single gel for
determining genetic of equine erythrocyte carbonic anhydrase (CA) and catalase (Cat) Animal
Genetics 21 191-197
BRADLEY D G MACHUGH D E CUNNINGHAM P amp LOFTUS R T (1996) Mitochondrial diversity and
the origins of African and European cattle Proceeding of the National Academy of Sciences of USA
93 5131-5135
BRAEND M (1971) Studies on the relationships between cattle breeds in Africa Asia and Europe Evidence
obtained by studies of blood groups and protein polymorphisms World Review of Animal Production
VIO (1) 10-14
BRAEND M (1988) Haemoglobin polymorphism in Norwegian Red Cattle Animal Genetics 19 59-62
BRAEND M NESSE 1 L amp EFREMOV G D (1988) Expression and genetics of caprine haemoglobins
Animal Genetics 18 223-231
BROWN L B KANE H amp AYRES H (1993) Vital signs WW Norton e Co pp 323 New York
CARTER D C HE X M MUNSON S EL TWIGG P D GERNERT K M BROOM M B amp MILLER T
Y (1989) Three dimensional structure of human serum albumin Science 244 1195-1198
CECCHINI G amp Nus M D (1986) Literature review on cattle blood polymorphisms and preliminary results
of analysis in East African Zebu in Ethiopia Agric Subtrop and Ttropicale 3 (80) 433-463
91
Referocircicias Bibliograacuteficas
CiacuteZovAacute D STRATIL A MULLER E amp CEPICA S (1993) A new partially deficient transferrin variant in
the pig Animal Genetics 24 305-306
CLARKE S W TUCKER E M amp OSTERHOFF D R (1989) Blood groups and biochemical polymorphism
in the Namaqua sheep breed Animal Genetics 20 279-286
CLUTTON-BROCK J (1992) Domestication of animals In Jomes S Martin R Pilbeam D (eds) The
Cambridge Encyclopedia of Human Evolution pp 380-385 Cambridge University Press
CORDEIRO J P (1986) As raccedilas bovinas em Portugal - Sua Origem O meacutedico veterinaacuterio I (1) 29-39
CRISTOFALO G Cozzi M C amp VALIATI P (1992) Identification of a new variant in the equine serum
alB-glycoprotein (A1B) system Animal Genetics 23 (suppl 1) 24
CUNHA L M (1994) Caracterizaccedilatildeo Morfo-Funcional e Geneacutetica da Raccedila Bovina Alentejana Trabalho de
fim de curso apresentado agrave Escola Superior Agraacuteria de Beja
DEL LAMA S N DEL LAMA M A MESTRINER M A amp MORTARI N (1992) Peptidase B polymorphism
in cattle erythrocytes Biochem Genet 30 247-255
DRATCH P TATE M KRAAY G J amp GERWING V (1992) Plasma proteins differentiating European red
deer and North American elk Animal Genetics 23 (suppl 1) 32
EGGEN A amp FRIES R (1995) An integrated cytogenetic and meiotic map of the bovine genome Animal
Genetics 26 215-236
ERHARDT G (1986) Transferrin variants in sheep separation and characterization by polyacrylamide gel
electrophoresis and isoelectric focusing Animal Genetics 17 343-352
ERHARDT G (1991) Genetic polymorphism of vitamin D binding protein and serum albumin in sheep
Animal Genetics 22 (suppl 1) 28-29
ERHARDT G amp SIMIANER H (1993) Linkage between the loci for serum albumin and vitamin D binding
protein (GC) in sheep Animal Genetics 24 301-303
EPSTEIN H amp MASON I L (1984) Cattle In Mason I L (ed) Evolution of domesticated animals pp 7-
-27 Longman
92
Referecircncias Bibliograacuteficas
FAO (1993) A diversidade da Natureza Um patrimoacutenio valioso Documento produzido pela FAO Divisatildeo de
informaccedilatildeo - Out de 1993 Veterinaacuteria Teacutecnica 10 10-12
FAO (1996) World Watch List for Domestic Animal Diversity 2a ediccedilatildeo FAOUNEP pp 334 Roma
FARNDALE B M HUBBARD D E amp ANDERSON L L (1992) A new PGD variant in New Zeland
Thoroughbred horses Animal Genetics 23 (suppl 1) 24
FELSENSTEIN J (1993) PHYLIP (Phylogeny Inference Package) Version 35 Distributed by the autor Seattle
University of Washington
FERNANDES M T S (1996) Raccedilas de bovinos autoacutectones Um importante recurso geneacutetico animal portuguecircs
a preservar e a defender Veterinaacuteria Teacutecnica 12 10-15
FERRAND N (1995) Variaccedilatildeo geneacutetica de proteiacutenas em populaccedilotildees de coelho (Oryctolagus cuniculus) -
- Anaacutelise da diferenciaccedilatildeo subespecifica subestruturaccedilatildeo expansatildeo geograacutefica e domesticaccedilatildeo
Dissertaccedilatildeo de Doutoramento em Biologia apresentada agrave Faculdade de Ciecircncias da Universidade do
Porto
FERRAND N amp ROCHA J (1991) Genetic polymorphism of serum albumin in wild rabbits populations
Animal Genetics 22 (suppl 1) 36
FORBES P MACKEITH B amp PEBERDY R (1986) Mamiacuteferos Ungulados e Lagomorfos Ciacuterculo de Leitores
FRIES R EGGEN A amp WOMACK J E (1993) The bovine genome map Mammalian Genome 4 405-428
GAHNE B(1963) Inherited variation in the post-albumin of cattle serum Hereditas 50126-135
GAHNE B JUNEJA R K amp GROLMUS J (1977) Horizontal polyacrylamine gel electrophoresis for the
simultaneous phenotyping of transferrin post-transferrin albumin and post-albumin in the blood
plasma of cattle Arum Bid Grps Biochem Genet 8127-137
GARCIA L S VICENTE M V BECERRA A L YEBRA F A RODRIcircGUES M F amp LOacutePEZ J M S
(1992) Razas Bovinas Autoacutectonas de Galicia - I Razas Morenas Galegas (Recursos Xeneacuteticos a
Conservar) Xunta de Galicia
GARCIA M ROSAacuteRIO J amp ANTUNES M (1981) Bovinos em Portugal Direcccedilatildeo dos Serviccedilos Veterinaacuterios -
- DGSV pp 44-78 Lisboa
93
Referecircncias Bibliograacuteficas
GLOWATZKI-MULLIS M L GAILLARD C WIGGER G amp FRIES R (1995) Microsatellite-based
parentage control in cattle Animal Genetics 26 7-12
GONCcedilALVES GARCIA M L (1964) A Raccedila Bovina Barrosatilde Boletim Pecuaacuterio n deg 1 Ano XXXII DGSP
pp 103-172 Lisboa
GONZALEZ P TUNON MJ amp VALLEJO M (1987) Genetic relationships between Spanish native breeds of
cattle Animal Genetics 18 249-256
HALL S B L COTHRAN E G amp KING J A (1991) Variability of manosephosphate isomerase (MPI)
from haemolysate in 14 horse breeds Animal Genetics 22 (suppl 1) 22
HARRIS H amp HOPKINSON D A (1976) Handbook of enzyme electrophoresis in human genetics North-
-Holland Publishers
HEMMER H (1990) Domestication The decline of environmental appreciation Cambridge University Press
HERZOG S (1988) Polymorphism and genetic control of erythrocyte 6-phosphogluconate dehydrogenase in
the genus Cervus Animal Genetics 19 291-294
HERZOG S (1989) Genetic polymorphism of transferrin in fallow deer Cervus dama L Animal Genetics 20
421-426
IGLESIAS A B (1989) Estrutura y relaciones geneacuteticas de razas bovinas mediante marcadores geneacuteticos
(Polimorfismos Bioquiacutemicos) Dissertaccedilatildeo de Doutoramento em Biologia apresentada agrave Faculdade de
Biologia da Universidade de Santiago
JAMIESON A (1965) The genetics of transferrins in cattle Heredity 20 419-441
JANZEN M K amp COTHRAN E G (1991) A new PGD variant from North American horses of feral origin
Animal Genetics 22 (suppl 1) 21-22
JORGE E S (1996) Bovinos da raccedila Minhota Contribuiccedilatildeo para a sua histoacuteria Veterinaacuteria Teacutecnica 10 10-
-18
94
Referecircncias Bibliograacuteficas
JUNEJA R K GAHNE B amp STRATIL A (1987) Polymorphic plasma postalbumins of some domestic
animals (pig Po2 horse XK and dog Pa proteins) identified as homologous Animal Genetics 18 119-
-124
JUNEJA R K KURYL J GAHNE B amp ZURKOWSKI M (1989) Linkage between the loci for transferrin
and ceruloplasmin in pigs Animal Genetics 20 307-311
KALAB P STRATIL A amp GLASNAacuteK V (1990) Genetic polymorphism of serum vitamin D-binding protein
(GC) in sheep and mouflon Animal Genetic 21 317-321
KAWAGUCHI T (1973) Polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of serum albumin into three
bands Clinica ChimicaActa 45 85-92
KIDD K K STONE W H CRIMELLA C CARENZI C CASATI M amp ROGNONI G (1980)
Immunogenetic and population genetic analyses of Iberian cattle Anim Blood Grps Biochem Genet
11 21-38
KRISTJANSSON F K (1963) Genetic control of two pre-albumins in pigs Genetics 48 1059-1063
KRISTJANSSON F K amp HICKMAN C G (1965) Subdivision of the allele TF D for transferrins in Holstein
and Ayrshire cattle Genetics 52 627-630
KUROSAWA Y amp TANAKA K (1988) Electrophoretic variants of serum transferrin in wild pig populations of
Japan Animal Genetics 19 31-35
LEAL C (1995) Apreciaccedilatildeo fenotiacutepica de um nuacutecleo de bovinos de raccedila Barrosatilde e amostragem para sua
caracterizaccedilatildeo geneacutetica Relatoacuterio de estaacutegio de licenciatura em Biologia - Ramo Cientiacutefico
Tecnoloacutegico em Ecologia e Recursos Zooloacutegicos Faculdade de Ciecircncias da Universidade do Porto
LITT M amp LUTTY J A (1989) A hipervariable microsatellite revealed by in vitro amplification of a
dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene American Jornal of Human Genetics 44
397-401
LOFTUS R T MACHUGH D E NGERE L O BALAIN D S BADI A M BRADLEY D G amp
CUNNINGHAM E P (1994a) Mitochondrial genetic variation in European African and Indian cattle
populations Animal Genetics 25 265-271
95
Referecircncias Bibliograacuteficas
LOFTUS R T MACHUGH B E BRADLEY B G SHARP P M amp CUNNINGHAM P (1994b) Evidence
for two independent domestications of cattle Proceeding of the National Academy of Sciences of USA
91 2757-2761
MACHUGH D E LOFTUS R T BRADLEY B G SHARP P M amp CUNNINGHAM P (1994)
Microsatellite DNA variation and among European cattle breeds Proceedings of the Royal Society of
London B 256 25-31
MACHUGH B E SHRIVER M B LOFTUS R T CUNNINGHAM P amp BRADLEY B G (1997)
Microsatellite DNA Variation and the Evolution Domestication and Phylogeography of taurine and
zebu cattle (Bos taunts and Bos indicus) Genetics 146 1071-1086
MARTINS R (1982) Conservaccedilatildeo e melhoramento dos bovinos de raccedila Barrosatilde Relatoacuterio de estaacutegio de
licenciatura em Produccedilatildeo Animal Instituto Universitaacuterio de Traacutes-os-Montes e Alto Douro
MIRANDA DO VALE J (1949) Gado Bissulco Livraria Saacute da Costa Lisboa
MORAIS M L (1992) Estudo Desenvolvimento e Optimizaccedilatildeo de Teacutecnicas de Separaccedilatildeo e Detecccedilatildeo
Especiacutefica de Proteiacutenas Dissertaccedilatildeo de Mestrado em Biologia Celular apresentada agrave Faculdade de
Ciecircncias da Universidade de Coimbra
NEI M (1978) Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small number of individuals
Genetics 89 583-590
NICHOLS E A CHAPMAN V M amp RUDDLE F H (1973) Polymorphism and linkage for
Mannosephosphate isomerase in Mus musculus Biochem Genet 8 47-53
NOBRE J M (s data) Caracterizaccedilatildeo geneacutetica da raccedila bovina Mirandesa Trabalho de fim de curso
efectuado na Estaccedilatildeo Nacional de Selecccedilatildeo e Reproduccedilatildeo Animal Curso de Engenharia Zooteacutecnica da
Universidade de Eacutevora
PENEDO M C T FOWLER M E BOWLING A T ANDERSON B L amp GORDON L (1988) Genetic
variation in the Wood of llamas Llama glama and alpaca Llama pacos Animal Genetics 19 267-
-276
PENEDO M C T amp JUNEJA R K (1989) Polymorphic plasma postalbumin (PO) of llamas and alpacas
identified as GC Protein Animal Genetics 20 221-223
96
Referecircncias Bibliograacuteficas
PENHALLOW R C MASON A B amp WOODWORTH R C (1991) Electrophoretic characterization of
human equine and bovine transferrins Comp Biochem Physiol 98B 41-45
PEREIRA A A (1997) Caracterizaccedilatildeo Geneacutetica de Algumas Subpopulaccedilotildees de Truta de Rio Salmo trutta L
da Bacia Hidrograacutefica do Rio Lima Dissertaccedilatildeo de Mestrado em Ecologia Aplicada apresentada agrave
Faculdade de Ciecircncias da Universidade do Porto
PIEDRAFITA J TEJEDOR M T amp ZARAGAZA L (1984) Post-Albuminas y Post-Transferrinas en
poblaciones bovinas Espafiolas Frisona y De Lidia Comunicacioacuten Presentada A La 34deg Reunion
Anual De La Federacioacuten Europea de Zootecnia 114-121
POVEY S CORNEY G LEWIS W H P ROBSON E B PARRINGTON J M amp HARRIS H (1972) The
genetics of peptidase C in man Ann Hum Genet 35 455-465
PRETSCH W amp MERKLE S (1990) Glucose Phosphate Isomerase Enzyme - Activity Mutants in Mus
musculus Genetical and Biochemical Characterization Biochemical Genetics 28 97-110
RASERO R D I STASIO L amp BERRA G P (1993) Polymorphism of erythocyte glucosephosphae isomerase
in sheep Animal Genetics 24 63-64
RITTER EL FRIEDRICHSON U amp SCHMITT J (1974) Genetic variation of Manose phosphate isomerase in
Man Humangenetik 22 261
RITTER H amp SCHMITT J (1973) Genetic polymorphism of Manose phosphate isomerase in Primates
Humangenetik 19 325-326
ROCHA J KOtildeMPF J FERRAND N AMORIM A amp RITTER H (1991) Separation of human alloalbumin
variants by isoelectric focusing Electrophoresis 12 313-314
ROGERSON J (1991) Biacuteblia- Os Caminhos de Deus Grandes Culturas e Civilizaccedilotildees Ciacuterculo de Leitores
RON M BAND M YANAI A amp WELLER J L (1994) Mapping quantitative trait loci with DNA
microsatellites in a commercial dairy cattle population Animal Genetics 25 259-264
RUSSEL G (1996) The analysis of genetic diversity in cattle to preserve future breeding options (Online)
Available http wwwribbsrcacukcdiv_wwwinformhtm (1996 November 29)
97
Referecircncias Bibliograacuteficas
SAITOU N amp NEI M (1987) The neighbor-joining method a new method for reconstructing phylogenetic
trees Mol Biol Evol 4 406-425
SANTOS O C M (1995) Caracterizaccedilatildeo Geneacutetica de Populaccedilotildees de Lebre Ibeacuterica (Lepus granatensis) e
Lebre Europeia (Lepus europaeus) - Aspectos Bioquiacutemicos e Populacionais Dissertaccedilatildeo de Mestrado
em Ecologia Aplicada apresentada agrave Faculdade de Ciecircncias da Universidade do Porto
SARAIVA J A (1993) Histoacuteria de Portugal Publicaccedilotildees Europa-Ameacuterica
SARTORE G STORMONT C MORRIS B G amp GRUNDER A A (1969) Multiple electrophoretic forms of
Carbonic Anhydrase in red cells of domestic cattle (Bos taurus) and American buffalo (Bison bison)
Genetics 61823-831
SCHNEIDER H SCHNEIDER M P C SILVA B T F amp SALZANO F M (1990) Transferrin and albumin
polymorphisms in buffaloes from Brazil Animal Genetics 21 335-337
SEATH P H A amp SOKAL R R (1973) Numeric Taxonomy W H Freeman amp Co
SELVARAJ O S MUKHERJEE T K DHALIWAL S S TAN S G amp BARKER J S F (1991) Biochemical
polymorphisms in the local goats of South-East Asia Animal Genetics 22 (suppl 1) 32
STERN C M MILLER S A amp SCHANFIELD M S (1992) Differentiation of wapiti and Eurasian red deer
by isoelectric focusing electrophoresis of GC on agarose gels Animal Genetics 23 (suppl 1) 23
STORMONT C amp SUZUKI Y (1963) Genetic control of albumin phenotypes in horses Proceeding of the
Society for Experimental Biology and Medicine 144 673-675
STRATIL A GLASNAacuteK V BOBAacuteK P CiacutezovAacute D GAacuteBRISOVAacute E amp KALAB P (1990) Variation of some
serum proteins in red deer Cervus elaphus L Animal Genetics 21 285-293
SWOFFORD D L amp SELANDER R B (1989) BIOSYS-1 A computer program for the analysis of allelic
variation in population genetics and biochemical systematics Release 17 Illinois Natural History
Survey
TASHIAN R E (1989) The carbonic anhydrases widening perspectives on their evolution expression and
function BioEssays 10 186-192
98
Referecircncias Bibliograacuteficas
TASHIAN R E amp CARTER N D (1976) Biochemical Genetics of Carbonic Anhydrase In Harris H (ed)
Advances in Human Genetics 7 1-56 Plenum
TATE M L amp MCEWAN K M (1992) Genetic polymorphism of erytrocyte diaphorase in red deer Cervus
elaphusL Animal Genetics 23 449-452
TSUJI S SAOAMITSU Y amp GOTO N (1989) Ultrathin-leyer isoelectric focusing for bovine serum
transferrin phenotyping Biochem Genet 27 425-429
TUCKER E M amp YOUNG J D (1988) Genetic control of red-cell nucleoside transport and its association
with the B blood-group locus and nucleoside phosphorylase activity in sheep Biochem Genet 26 489-
-501
TUNON M J GONZALEZ P amp VALLEJO M (1989) Genetic relationships between 14 native Spanish
breeds of goat Animal Genetics 20 205-212
USHA A P (1996) Cattle diversity by blood typing (Online) Available http
wwwribbsrcacukcdiv_wwwinfobhtm ( 1996)
USHA A P SIMPSON S P amp WILLIAMS J L (1995) Probability of random sire exclusion using
microsatellite markers for parentage verification Animal Genetics 26 155-161
VANDEBERG J amp AIVALIOTIS M (1990) Mannose-6-phosphate isomerase polymorphism in baboon
erythrocytes Biochemical Genetics 28 495-501
VAN DE WEGHE A VAN ZEVEREN A amp BOUQUET Y (1982) The vitamin D binding protein in domestic
animals Comp Biochem Physiol 73B 977-982
VAN DE WEGHE A YABLANSKI T S VAN ZEVEREN A amp BOUQUET Y (1988) A third variant of glucose
phosphate isomerase in pigs Animal Genetics 19 55-58
VANKAN D M amp BELL K (1992 a) A new allele in Australian goats Animal Genetics 23 453-456
VANKAN D M amp BELL K (1992 b) Genetic polymorphism of vitamin D-binding protein (GC) in Australian
goats Animal Genetics 23 457-462
VICENTE M V (1978) Razas vacunas autoacutectonas en vias de extincioacuten (Aportaciones al estuacutedio geneacutetico)
Fundacioacuten Juan March Serie Universitaacuteria LXK 10-51
99
Referecircncias Bibliograacuteficas
VIEIRA J (1993) Utilizaccedilatildeo de marcadores geneacuteticos na caracterizaccedilatildeo e certificaccedilatildeo de populaccedilotildees
domeacutesticas e selvagens de coelho (Oryctolagus cunicuius) Dissertaccedilatildeo de Mestrado apresentada agrave
Faculdade de Ciecircncias da Universidade do Porto
VIEIRA J amp FERRAND N (1995) Four new alleles at the mannose-6-phosphate isomerase locus in rabbit
Animal Genetics 26 37-38
WANG S FOOTE W C amp BUNCH T D (1990) Transferrin and haemoglobin polymorphism in
domesticated goats in the USA Animal Genetics 21 91-94
WEBER J L amp MAY P E (1989) Abundant class of human DNA polymorphisms which can be typed using
the polymerase chain reaction American Jornal of Human Genetics 44 388-396
WELCHS S (1990) A comparison of the structure and properties of serum transferrin from 17 animal species
Comp Biochem Physiol 97 B (3) 417-427
100
ANEXO
Anexos
RESUMO E CONCLUSOtildeES
Neste trabalho apresenta-se uma contribuiccedilatildeo para o estudo geneacutetico da raccedila bovina Barrosatilde e de uma outra raccedila (Minhota) atraveacutes da anaacutelise da variaccedilatildeo geneacutetica de proteiacutenas detectada pela utilizaccedilatildeo de sistemas electroforeacuteticos convencionais e por focagem isoeleacutectrica
Definiram-se os seguintes objectivos fundamentais
1 estudo da variabilidade geneacutetica da raccedila Barrosatilde ao niacutevel das proteiacutenas eritrocitaacuterias e plasmaacuteticas 2 desenvolvimento e afinaccedilatildeo de teacutecnicas de separaccedilatildeo de proteiacutenas por electroforese e focagem
isoeleacutectrica e sua detecccedilatildeo especiacutefica (histoquiacutemica e imunoloacutegica) 3 anaacutelise familiar dos polimorfismos encontrados 4 avaliaccedilatildeo do grau de diferenciaccedilatildeo geneacutetica existente entre a raccedila Barrosatilde e outras raccedilas bovinas
Escolheu-se um conjunto de 12 sistemas geneacuteticos (sete dos quais se revelaram polimoacuterficos) que pudesse satisfazer os objectivos fundamentais do trabalho
Assim apoacutes desenvolvimento de teacutecnicas de separaccedilatildeo para os sistemas geneacuteticos considerados procedeu-se a uma anaacutelise familiar baseada nos polimorfismos encontrados nas populaccedilotildees de raccedila Barrosatilde ao estudo de distribuiccedilatildeo populacional dos fenoacutetipos das duas raccedilas estudadas e de outras raccedilas bovinas da Europa (principalmente da Peniacutensula Ibeacuterica)
Com base neste trabalho obtiveram-se as seguintes conclusotildees
bull a utilizaccedilatildeo de um sistema de focagem isoeleacutectrica permitiu detectar a existecircncia de polimorfismo geneacutetico na hemoglobina distinguindo-se dois produtos geacutenicos na raccedila bovina Minhota HBA e HBB Na raccedila Barrosatilde HBA foi o uacutenico produto geacutenico encontrado
bull a utilizaccedilatildeo de um sistema de focagem isoeleacutectrica permitiu a detecccedilatildeo de dois produtos geacutenicos no locus CAII (CAIIF e CAIPS) e revelou-se mais eficaz de que as teacutecnicas de separaccedilatildeo convencional em gel de amido
bull a investigaccedilatildeo realizada permitiu detectar a ocorrecircncia de polimorfismo geneacutetico de MPI atraveacutes de um sistema electroforeacutetico em gel de amido tendo-se detectado trecircs produtos geacutenicos (MPIA MPIB e MPIC) A fraca actividade de MPI e a grande dificuldade na obtenccedilatildeo de um contraste de bandas adequado poderaacute dever-se ao facto de a sua expressatildeo soacute ocorrer na fracccedilatildeo leucocitaacuteria do sangue
bull a aplicaccedilatildeo de um sistema de focagem isoeleacutectrica na presenccedila de ureia (8M) revelou-se muito eficaz na separaccedilatildeo de ALB e permitiu detectar pela primeira vez um novo variante ALBV ligeiramente mais aciacutedico do que ALB A
bull a combinaccedilatildeo de uma teacutecnica de focagem isoeleacutectrica com um preacutevio tratamento das amostras a fim de saturar a moleacutecula de TF com Fe permitiu a detecccedilatildeo de quatro produtos geacutenicos (TFA TFD1 TFD2 e TFE) nas raccedilas estudadas
bull a combinaccedilatildeo de uma teacutecnica de focagem isoeleacutectrica com a detecccedilatildeo por immunoblotting permitiu detectar dois produtos geacutenicos no locus GC (GCA e GCB) O tratamento de amostras com neuraminidase permitiu a obtenccedilatildeo de padrotildees mais simples do que os conseguidos com amostras nativas Esta simplificaccedilatildeo resulta da provaacutevel remoccedilatildeo de aacutecidos siaacutelicos ligados agrave moleacutecula de GC
bull natildeo se detectou nenhum caso de exclusatildeo na anaacutelise de segregaccedilatildeo de 27 pares matildeefilho feita separadamente para cada locus
bull verificou-se a presenccedila de dois alelos raros HBB e PEPB1 na raccedila Minhota Estes alelos poderatildeo ser utilizados na distinccedilatildeo das duas raccedilas estudadas
I
Anexos
bull foi encontrado um valor de heterozigotia meacutedia de 0237 em populaccedilotildees de raccedila Barrosatilde indicativo de uma variabilidade geneacutetica intermeacutedia em relaccedilatildeo agrave generalidade das raccedilas ibeacutericas As diferenccedilas observadas entre as vaacuterias raccedilas ibeacutericas poderatildeo reflectir fenoacutemenos histoacuterico-evolutivos muito recentes dada a sua proximidade e grande semelhanccedila
bull foi observado um reduzido niacutevel de diferenciaccedilatildeo entre as raccedilas Barrosatilde e Minhota (FST = 0031) demonstrando-se que a maior parte da diversidade geneacutetica se atribui a diferenccedilas intrapopulacionais Este valor de FST pode considerar-se baixo quando comparado com o obtido no estudo de outras espeacutecies animais sugerindo um elevado fluxo geacutemeo interpopulacional Por outro lado reflecte ainda uma histoacuteria demograacutefica muito recente
bull a utilizaccedilatildeo de meacutetodos de agrupamento NJ e UPGMA obtidos a partir de matrizes de distacircncias geneacuteticas de Nei natildeo permitiu separar a raccedila Barrosatilde das restantes raccedilas ibeacutericas
II
Anexos
Tabela A Frequecircncias geacutenicas para os vaacuterios sistemas polimoacuterficos encontrados na raccedila Barrosatilde (indiviacuteduos inscritos e natildeo inscritos) utilizadas na anaacutelise familiar
LOCUS ALELOS FREQUEcircNCIA GEacuteNICA
CAII 294 035
065
NP 294 H
L
024
076
MPI 290 A
B
C
000
098
002
ALB 294 A
B
V
097
002
001
TF 294 A
Dl
D2
E
057
016
023
004
GC 294 083 017
TTI
Introduccedilatildeo
Em face do exposto torna-se necessaacuterio alargar a investigaccedilatildeo sobre esta raccedila bovina
nomeadamente atraveacutes da sua caracterizaccedilatildeo geneacutetica Espera-se assim poder contribuir para
o estabelecimento de um plano de conservaccedilatildeo da Barrosatilde e simultaneamente aprofundar o
estado actual do conhecimento sobre a geneacutetica das suas populaccedilotildees
2
Introduccedilatildeo
11 - A DOMESTICACcedilAtildeO
111 - Evidecircncia histoacuterica da domesticaccedilatildeo do gado bovino
Haacute cerca de 15000 anos verificavam-se profundas mudanccedilas climaacuteticas na Terra Os
glaciares recuaram para Norte a temperatura tornou-se mais amena uma maior aacuterea
geograacutefica tornou-se habitaacutevel O Homem teve entatildeo de vencer dificuldades impostas pela
Natureza inventando a agricultura e a criaccedilatildeo de gado passando de caccedilador noacutemada a
agricultor e a pastor (SARAIVA 1993)
O iniacutecio da agricultura e a primeira domesticaccedilatildeo de animais por parte do Homem estaacute
datada de 10000 anos aC (final do Paleoliacutetico) numa regiatildeo conhecida por Crescente Feacutertil
no Proacuteximo Oriente O primeiro animal domesticado teraacute sido o catildeo seguindo-se a ovelha a
cabra e o gado bovino jaacute no Neoliacutetico (8000 anos aC) (HEMMER 1990 CLUTTON-BROCK
1992)
A domesticaccedilatildeo do gado bovino foi provavelmente um processo gradual Eacute natural
que no princiacutepio apenas alguns animais (essencialmente fecircmeas) fossem retirados das manadas
de auroques selvagens e criados isoladamente natildeo levando de imediato ao aparecimento de
diferenccedilas morfoloacutegicas claras Esta hipoacutetese eacute apoiada por registos arqueozooloacutegicos onde a
forma proto-domesticada natildeo se distingue da forma selvagem (LOFTUS et ai 1994)
A expansatildeo neoliacutetica em direcccedilatildeo agrave Europa teraacute levado milhares de anos seguindo uma
via mariacutetima (mar Mediterracircneo) e uma via continental (atraveacutes dos Balcatildes e pelo curso do
Danuacutebio) Da Siciacutelia a revoluccedilatildeo neoliacutetica espalhou-se por toda a bacia mediterracircnea
ocidental atingindo a Peniacutensula Ibeacuterica e a costa atlacircntica e trazendo consigo a arte a
agricultura e a criaccedilatildeo de gado Desta forma soacute no 5 deg mileacutenio aC chegaram agrave Peniacutensula
Ibeacuterica as praacuteticas agriacutecolas e a pastoriacutecia (SARAIVA 1993)
Desde o Neoliacutetico que o gado bovino domesticado (Bos taurus) tem um papel muito
importante para o Homem As grandes civilizaccedilotildees da Antiguidade datildeo-nos testemunhos
escritos e trabalhos artiacutesticos indicando a sua importacircncia na alimentaccedilatildeo (carne leite) nos
trabalhos agriacutecolas na guerra na arquitectura e mesmo na religiatildeo
3
Introduccedilatildeo
Durante o periacuteodo compreendido entre o iniacutecio do Neoliacutetico ateacute agraves idades do Cobre e
do Bronze a domesticaccedilatildeo dos bovinos levou a uma contiacutenua diminuiccedilatildeo do tamanho corporal
dos animais na Europa Posteriormente este processo teraacute sido interrompido com a introduccedilatildeo
de gado bovino trazido de Roma e muitas raccedilas extinguiram-se apoacutes a queda do Impeacuterio
Romano (EPSTEIN amp MASON 1984)
Esta tendecircncia continuou a observar-se durante a Idade Meacutedia e soacute com a Revoluccedilatildeo
Industrial e a necessidade de abastecer as grandes cidades se produziu um incremento na
criaccedilatildeo de gado (EPSTEIN amp MASON 1984)
Neste domiacutenio a modernizaccedilatildeo da agricultura e a produccedilatildeo intensiva de alimentos teraacute
originado uma contiacutenua diminuiccedilatildeo dos efectivos populacionais de muitas raccedilas autoacutectones
evidente sobretudo durante a uacuteltima metade deste seacuteculo Estas circunstacircncias determinaram
assim a sensibilizaccedilatildeo da sociedade para as consequecircncias do empobrecimento de diversidade
geneacutetica do gado bovino permitindo o estabelecimento de linhas de investigaccedilatildeo destinadas agrave
sua gestatildeo e conservaccedilatildeo (BROWN et ai 1993 FAO 1996)
112 - Paleontologia arqueozoologia
De acordo com os actuais dados paleontoloacutegicos o mais antigo ruminante do Velho
Mundo teraacute aparecido no Mioceno (Gelocus) caracterizando-se pela ausecircncia de incisivos na
mandiacutebula superior e possuindo jaacute uma conformaccedilatildeo do esqueleto idecircntica agrave dos bovinos
actuais (IGLESIAS 1989 e GARCIA et ai 1992) Esta forma viria a originar posteriormente os
quatro geacuteneros actuais de ruminantes Ovis Capra Antilope e Bos (IGLESIAS 1989)
A evidecircncia paleontoloacutegica indica tambeacutem que teratildeo existido na Europa diferentes
espeacutecies de boviacutedeos actualmente extintas Destas apenas o auroque sobreviveu ateacute agrave Idade
Meacutedia havendo documentos escritos que se referem ao local e data da morte do uacuteltimo
exemplar (Poloacutenia 1627) (LOFTUS et ai 1994)
As primeiras representaccedilotildees de bovinos feitas pelo Homem devem precisamente
referir-se a auroques sendo um dos exemplos mais conhecidos constituiacutedo pelas pinturas
rupestres das grutas de Lascaux (Franccedila) (figura 111)
4
Introduccedilatildeo
Figura 111 Pintura rupestre nas paredes de grutas em Lascaux Franccedila Datando de haacute cerca de 15000 anos Reproduzido de FORBES (1986)
Soacute mais tarde surge a evidecircncia de que o processo de domesticaccedilatildeo se poderaacute ter
iniciado De facto alguns achados neoliacuteticos (8000 a 5500 anos aC) provenientes da
Anatoacutelia parecem indicar a presenccedila de animais jaacute domesticados Esta regiatildeo do Sudoeste
Asiaacutetico poderaacute assim constituir o centro de domesticaccedilatildeo do gado bovino a partir de
populaccedilotildees selvagens da subespeacutecie asiaacutetica do auroque (Bos primigenius namadicus)
(EPSTEIN amp MASON 1984)
Outra evidecircncia adicional eacute fornecida pela descoberta de ossos e dentes de um animal
sensivelmente mais pequeno do que o auroque (Iraque 5000 anos aC) bem como por um
primeiro testemunho escrito onde se descreve em placas de argila uma cabeccedila de vaca
(Mesopotacircmia 5000 anos aC) (ROGERSON 1991)
Muitos outros achados arqueoloacutegicos e paleontoloacutegicos foram encontrados na
Mesopotacircmia (4000 anos aC) e no vale do rio Nilo (4000 anos aC) mostrando um bovino
totalmente domesticado e de longos cornos (EPSTEIN amp MASON 1984)
A consolidaccedilatildeo do processo de domesticaccedilatildeo eacute a partir desta altura inquestionaacutevel
tornando-se abundantes os registos de bovinos domesticados na Mesopotacircmia e vale do Nilo
A este respeito devem referir-se especialmente as numerosas esculturas relevos pinturas e
textos em papiro que relatam pormenores da vida quotidiana do povo egiacutepcio e onde aparecem
diversas cenas que mostram a importacircncia do gado bovino na agricultura e na alimentaccedilatildeo
(figura 112)
5
Introduccedilatildeo
Figura 112 Desenho ilustrativo de uma ordenha 5a dinastia Reproduzido de BAINES
amp MEacuteLEK (1980)
A partir desta altura as descobertas arqueozooloacutegicas satildeo testemunho de uma
expansatildeo do gado bovino Assim existem registos datados de haacute cerca de 2000 e 3000 anos
aC que sugerem a ocorrecircncia no Norte de Aacutefrica de animais de enormes cornos em forma de
lira (EPSTEIN amp MASON 1984)
Tal expansatildeo daacute-se tambeacutem pela Turquia indo ateacute ao Caacuteucaso e agrave Ruacutessia e chega
tambeacutem agrave Europa onde nas regiotildees do Norte foram encontrados objectos de arte da idade do
Cobre e do Bronze que representam bovinos e datam do iniacutecio do Cristianismo (EPSTEIN amp
MASON 1984)
A migraccedilatildeo para oriente estaacute tambeacutem bem documentada atraveacutes de numerosos restos
arqueozooloacutegicos descobertos em toda a Aacutesia Eacute contudo nesta regiatildeo geograacutefica que se
pode observar a transiccedilatildeo de gado bovino sem bossa (Bos taurus) para outro com bossa (Bos
indicus) Segundo alguns autores as raccedilas de Bos indiens ou gado zebu derivariam das raccedilas
de Bos taurus ou gado taurino atraveacutes de um processo de selecccedilatildeo (EPSTEIN amp MASON
1984) Alternativamente estes dados podem tambeacutem ser interpretados como a ocorrecircncia de
dois processos de domesticaccedilatildeo independentes seguidos do contacto entre as duas populaccedilotildees
domeacutesticas de gado bovino
Adicionalmente deve salientar-se que a evidecircncia descrita eacute ainda muito incompleta
pelo que a interpretaccedilatildeo dos dados deve ser feita com bastante precauccedilatildeo A tiacutetulo de
exemplo refiram-se os achados arqueozooloacutegicos efectuados na Peniacutensula dos Balcatildes e na
6
Introduccedilatildeo
Macedoacutenia Grega (6200 anos aC) Segundo EPSTEIN amp MASON (1984) estes achados
sugerem que o Sul da Europa poderia constituir o primeiro centro de domesticaccedilatildeo do gado
bovino a partir de onde se teria iniciado a sua expansatildeo em direcccedilatildeo ao resto do continente
europeu Ruacutessia e Sudoeste Asiaacutetico
113 - Anaacutelise geneacutetica
A investigaccedilatildeo sobre a geneacutetica das diferentes raccedilas de gado bovino tem contribuiacutedo de
forma muito significativa para a compreensatildeo da sua histoacuteria dos padrotildees de diversidade que
actualmente as caracterizam e do seu grau de parentesco Os resultados actualmente
disponiacuteveis reportam-se a trecircs domiacutenios principais grupos sanguiacuteneos variaccedilatildeo geneacutetica de
proteiacutenas e polimorfismos do DNA (DNA mitocondrial e microssateacutelites)
Grupos sanguiacuteneos
A primeira tentativa para avaliar o grau de diferenciaccedilatildeo geneacutetica entre raccedilas bovinas e
caracterizar a sua diversidade data do iniacutecio de deacutecada de 70 e envolveu precisamente o
estudo dos diferentes grupos sanguiacuteneos que iam sendo descritos (RUSSELL 1996 USHA
1996) Contudo a maior parte dos resultados natildeo permitiu a obtenccedilatildeo de conclusotildees
definitivas pelo facto de se trabalhar com um nuacutemero relativamente reduzido de loci que
adicionalmente era pouco polimoacuterfico Deve poreacutem referir-se que se dispotildee actualmente de
uma consideraacutevel quantidade de informaccedilatildeo no que se refere agrave distribuiccedilatildeo da variabilidade dos
grupos sanguiacuteneos nas diferentes raccedilas bovinas conferindo a este conjunto de dados uma
importacircncia natildeo despreziacutevel no estudo de eventuais alteraccedilotildees da estrutura geneacutetica de
populaccedilotildees de gado bovino nos uacuteltimos vinte anos (RUSSELL 1996 USHA 1996)
Proteiacutenas
A introduccedilatildeo de teacutecnicas electroforeacuteticas de separaccedilatildeo de proteiacutenas permitiu aumentar
de forma muito consideraacutevel o nuacutemero de sistemas geneacuteticos polimoacuterficos conhecidos nas
raccedilas bovinas em especial no que se refere a proteiacutenas do sangue e do leite (USHA 1996)
A anaacutelise da sua distribuiccedilatildeo populacional veio demonstrar a ocorrecircncia de dois grupos
principais de bovinos ou duas subespeacutecies (Bos primigenius taurus e Bos primigenius
7
Introduccedilatildeo
indiens) cada um deles caracterizado pela presenccedila de diversos alelos privativos em vaacuterios loci
(BRAEND 1971)
Estes resultados estatildeo de uma maneira geral de acordo com dados morfoloacutegicos
histoacutericos e ainda com a distribuiccedilatildeo geograacutefica conhecida dos principais grupos (EPSTEIN amp
MASON 1984) No entanto o acreacutescimo de informaccedilatildeo fornecido por este tipo de marcadores
foi ainda insuficiente para resolver muitas das interpretaccedilotildees contraditoacuterias publicadas sobre o
tema
Polimorfismo do DNA
A introduccedilatildeo das teacutecnicas de anaacutelise genoacutemica directa e em especial a descoberta do
polimorfismo do DNA-mitocondrial (mtDNA) e dos microssateacutelites forneceram os
instrumentos necessaacuterios a uma detalhada caracterizaccedilatildeo geneacutetica das raccedilas bovinas
A anaacutelise da variaccedilatildeo da moleacutecula de mtDNA permitiu verificar que Bos primigenius
taurus e Bos primigenius indicus teratildeo divergido haacute cerca de 210000 anos uma data muito
anterior agrave indicada pelos dados arqueoloacutegicos para o iniacutecio do processo de domesticaccedilatildeo Eacute
assim muito provaacutevel que tenham ocorrido duas domesticaccedilotildees independentes a partir de duas
subespeacutecies diferentes do auroque Bos primigenius namadicus teraacute dado origem ao gado
zebu na Aacutesia (Vale do Indu) e Bos primigenius primigenius ao gado europeu vindo do
Proacuteximo Oriente (LOFTUS et ai 1994a 1994b)
Muito recentemente BRADLEY et ai (1996) e MACHUGH et ai (1997) sugerem ainda
uma terceira domesticaccedilatildeo independente ocorrida em Aacutefrica Esta evidecircncia resulta tambeacutem
de anaacutelise do polimorfismo do mtDNA indicando uma separaccedilatildeo entre os ancestrais do gado
europeu e africano anterior agrave domesticaccedilatildeo (22000 - 26000 anos) Este terceiro processo de
domesticaccedilatildeo ter-se-ia assim efectuado a partir da subespeacutecie africana do auroque (Bos
primigenius opisthonomus)
A descoberta dos microssateacutelites e do seu elevado grau de polimorfismo data do fim da
deacutecada de 80 (Lm amp LUTY 1989 WEBER amp MAY 1989) e constitui provavelmente a
metodologia mais adequada para estudar a histoacuteria recente da diversificaccedilatildeo das raccedilas bovinas
(MACHUGH et ai 1994 ARRANZ et ai 1996) Os primeiros resultados que envolvem uma
caracterizaccedilatildeo em larga escala de diferentes populaccedilotildees permitiram distinguir mais claramente
a estrutura geneacutetica dos dois grandes grupos de gado bovino (Bos taurus e Bos indicus) e
constituem a base para futuros estudos mais especiacuteficos
8
Introduccedilatildeo
Por outro lado os microssateacutelites permitiram tambeacutem o iniacutecio do projecto de
cartografia do genoma bovino que no fim de 1994 contabilizava 202 marcadores geneacuteticos
(dos quais 144 eram microssateacutelites) regularmente espaccedilados em 90 do seu comprimento
Cerca de um ano depois existiam jaacute mais de 400 microssateacutelites (USHA et ai 1995) levando
EGGEN et ai (1995) a apresentar um trabalho de revisatildeo e consolidaccedilatildeo de informaccedilatildeo jaacute
existente para evitar a ocorrecircncia de possiacuteveis redundacircncias
A aplicaccedilatildeo deste tipo de marcadores natildeo se restringe apenas agrave anaacutelise da diversidade
geneacutetica populacional e agrave construccedilatildeo de mapas geneacuteticos De facto satildeo actualmente escolhidos
para a realizaccedilatildeo de testes de paternidade (GLOWATZKI-MULLIS et ai 1995 USHA et ai 1995
ARRANZ et ai 1996) detecccedilatildeo de loci que determinam a expressatildeo de caracteriacutesticas
quantitativas (QTL) (RON et ai 1994) determinaccedilatildeo do sexo em embriotildees selecccedilatildeo animal
assistida entre outros
No seu conjunto estes resultados tecircm permitido um avanccedilo notaacutevel na compreensatildeo da
evoluccedilatildeo das actuais raccedilas bovinas A prossecuccedilatildeo desta via de investigaccedilatildeo poderaacute levar ao
esclarecimento definitivo do nuacutemero de domesticaccedilotildees independentes que teraacute ocorrido
(EPSTEIN amp MASON 1984 LOFTUS et al 1994a 1994b BRADLEY et al 1996 MACHUGH et
al 1997) a partir das populaccedilotildees selvagens de auroque Seguidamente eacute legiacutetimo esperar que
venha a ser possiacutevel analisar a uma escala mais fina o grau de parentesco geneacutetico entre raccedilas
que ocupem aacutereas geograacuteficas mais reduzidas Neste particular seraacute extremamente interessante
incluir as populaccedilotildees ibeacutericas e em especial a raccedila Barrosatilde
9
Introduccedilatildeo
12 - A DIVERSIDADE DAS RACcedilAS BOVINAS
A domesticaccedilatildeo resultou na criaccedilatildeo de milhares de raccedilas de animais domeacutesticos
geneticamente diferentes e adaptadas agraves necessidades humanas e a uma grande variedade de
condiccedilotildees ambientais (FAO 1993)
121 - As raccedilas ibeacutericas
A grande diversidade de raccedilas bovinas da Peniacutensula Ibeacuterica poderaacute dever-se em parte
agrave introduccedilatildeo de outras raccedilas domeacutesticas que se cruzaram entre si e com bovinos jaacute existentes
na Peniacutensula A introduccedilatildeo de outras raccedilas teraacute sido feita de duas formas distintas
1 - atraveacutes dos movimentos migratoacuterios acompanhando as vaacuterias invasotildees de povos
vindos do oriente como eacute o caso dos Feniacutecios ( seacutec X aC) Gregos (seacutec VII aC) e
Romanos (seacutec III aC) Estes uacuteltimos dominaram completamente a Peniacutensula durante
7 seacuteculos e teratildeo contribuiacutedo para a diversificaccedilatildeo do gado bovino pelo facto de
introduzirem animais de caracteriacutesticas diferentes Supotildee-se que do seu cruzamento
com os bovinos ibeacutericos se teratildeo originado os troncos aquitacircnico e ibeacuterico (MIRANDA
do VALE 1949)
2 - atraveacutes da introduccedilatildeo de animais do Norte de Aacutefrica na sequecircncia da invasatildeo de
povos como os Cartagineses (seacutec V aC) e jaacute na era cristatilde os Mouros (711 dC)
Estes teratildeo introduzido descendentes de Bos primigenius opisthonomus que poderaacute
ter influenciado a formaccedilatildeo de vaacuterias raccedilas ibeacutericas nomeadamente as raccedilas Barrosatilde e
Cachena (APARIacuteCIO 1960 in IGLESIAS 1989 EPSTEIN amp MASON 1984) Estas
poderatildeo assim constituir uma linha que descende do tronco mauritaacutenico (MIRANDA
do VALE 1949)
10
Introduccedilatildeo
Adicionalmente eacute provaacutevel que povos oriundos do Norte da Europa nomeadamente
os Visigodos possam ter introduzido gado bovino dessa regiatildeo Contudo a sua eventual
contribuiccedilatildeo para a diversidade de raccedilas bovinas da Peniacutensula Ibeacuterica estaacute por esclarecer
122 - A raccedila Barrosatilde
Aspectos histoacutericos da dispersatildeo e evoluccedilatildeo do efectivo populacional
O centro de criaccedilatildeo da raccedila Barrosatilde situa-se actualmente na zona do planalto da Serra
do Barroso abrangendo os actuais concelhos de Montalegre Boticas Vieira do Minho
(freguesias de Campos e Ruivatildees) e Cabeceiras de Basto (freguesia de Gondiatildees) Esta regiatildeo
natildeo possui condiccedilotildees agro-climateacutericas que permitam grandes exploraccedilotildees agriacutecolas pelo que
uma parte importante da populaccedilatildeo se dedica agrave criaccedilatildeo de gado (GARCIA et ai 1981
FERNANDES 1996)
Vivendo sobretudo em zonas montanhosas a Barrosatilde eacute utilizada essencialmente como
forccedila de trabalho e na produccedilatildeo de carne de excelente qualidade motivo pelo qual a Uniatildeo
Europeia a reconhece com denominaccedilatildeo de Origem Protegida (FERNANDES 1996)
No seacuteculo passado e iniacutecio do seacuteculo XX existia um grande incentivo para a criaccedilatildeo
desta raccedila devido agrave procura da sua carne muito apreciada em Inglaterra Este incentivo
contribuiu indirectamente para que a estatura dos animais se elevasse (GARCIA et ai 1981) e
para que a zona de criaccedilatildeo se dispersasse pelas aacutereas submontanhosas e pelas planiacutecies do
Entre Douro e Minho ateacute agrave orla mariacutetima chegando mesmo ao concelho de Vila Nova de Gaia
(figura 121) Nestas zonas fazia-se a criaccedilatildeo de novilhos para exploraccedilatildeo como bois de
trabalho e para produccedilatildeo de carne Tal exploraccedilatildeo estaacute bem patente nos paineacuteis de azulejos da
estaccedilatildeo de caminhos de ferro de S Bento no Porto e mesmo nos desenhos das calccediladas nas
principais avenidas desta cidade
li
Introduccedilatildeo
B
bull bull bull _ bull bull bull - bull bull
Figura 121 A) Junta de bois de trabalho de raccedila Barrosatilde B) Fecircmea adulta Barrosatilde C) Macho adulto Barrosatilde Fotografias datadas de 1949 gentilmente cedidas pela Direcccedilatildeo Regional de Agricultura de Entre Douro e Minho - Centro de Produccedilatildeo Animal (DRAEDM)
12
Introduccedilatildeo
Poreacutem a necessidade de maiores produccedilotildees de carne foi conduzindo durante a
segunda metade deste seacuteculo a um progressivo decliacutenio no efectivo populacional da raccedila
Barrosatilde tornando-se mesmo raro poder observar uma junta de bois Recentemente as
alteraccedilotildees verificadas na poliacutetica agraacuteria e ambiental da Uniatildeo Europeia teratildeo permitido
alguma recuperaccedilatildeo Nesse contexto a criaccedilatildeo em 1981 do Livro Genealoacutegico da raccedila
Barrosatilde constitui um passo importante para a certificaccedilatildeo dos animais e o aumento do seu
valor Actualmente o seu efectivo populacional tem crescido continuamente e essa tendecircncia
parece estaacutevel
Segundo dados fornecidos pelo Registo Zooteacutecnico e pela Associaccedilatildeo do Minho dos
Criadores de Bovinos de Raccedila Barrosatilde (AMTOA) existiam em 1996 38002 fecircmeas
reprodutoras inscritas e 375 touros de cobriccedilatildeo (tabela 1221) distribuiacutedos por vaacuterios
concelhos dos distritos de Viana do Castelo Braga Vila Real e Porto (figura 122)
Tabela 1221 Movimento do Registo Zooteacutecnico relativo agrave raccedila Barrosatilde
Vacas Inscritas Postos de Cobriccedilatildeo Vitelos Anos Abatidas Registadas Inscritas Encerrados Recenseados Existecircncias Inscritos 1981 0 4884 4882 1 25 24 0 1982 19 6169 11032 6 42 60 532 1983 31 4436 15437 14 35 81 1593 1984 72 866 16231 13 14 82 2151 1985 47 604 16788 15 15 82 1767 1986 106 1027 17709 18 13 77 2414 1987 72 1186 18823 2 14 89 2632 1988 122 1192 19877 5 7 91 2574 1989 138 718 20506 14 26 103 2532 1990 89 1017 21440 8 7 102 2404 1991 159 1309 22590 14 26 114 2531 1992 52 1902 24440 6 17 125 3203 1993 0 4205 28645 37 87 175 4077 1994 0 6248 34893 58 111 228 4679 1995 340 2447 37000 0 112 340 5759 1996 120 1122 38002 26 61 375 5901
Fonte Registo Zooteacutecnico (cedido pela AM1BA)
Apesar desta situaccedilatildeo favoraacutevel natildeo se pode considerar que a raccedila Barrosatilde natildeo corra
ainda perigo de extinccedilatildeo Na verdade satildeo vaacuterios os factores que tecircm contribuiacutedo para a
diminuiccedilatildeo da sua aacuterea de criaccedilatildeo ou mesmo para a alteraccedilatildeo das caracteriacutesticas destes
animais De entre esses factores deve salientar-se i) a substituiccedilatildeo de Barrosatilde por outras raccedilas
autoacutectones (Minhota Mirandesa Maronesa) ou importadas (Friacutesia Gelbvieh e Parda Suiacuteccedila)
13
Introduccedilatildeo
que fornecem ao agricultor um rendimento superior ii) a progressiva mecanizaccedilatildeo da
agricultura e a diminuiccedilatildeo das aacutereas de pastagem iii) o pequeno nuacutemero de machos
reprodutores associado a um efectivo idoso iv) uma baixa fertilidade meacutedia grandes
intervalos entre partos e elevado nuacutemero de abortos e v) desmotivaccedilatildeo dos produtores mesmo
em face das actuais condiccedilotildees de comercializaccedilatildeo
LEGENDA
| j - -Concelhos de Entre Douro e Minho S Concelhos de Traacutes-os-Montes
ESCALA 11380000
Figura 122 Mapa de distribuiccedilatildeo do actual efectivo Barrosatilde
14
Introduccedilatildeo
Aspectos morfoloacutegicos
O bovino Barrosatilde apresenta uma estatura mediana com 121-130 cm de altura agrave
cernelha e pelagem de cor castanha (variando entre a cor de palha ateacute a cor acerejada) (LEAL
1995) A cabeccedila eacute curta e larga encimada por uma cornamenta em forma de lira alta os
cornos satildeo muito compridos e espessos de cor branca suja com pontas escuras o conjunto
ocular eacute saliente dando-lhe o aspecto de olhos de sapo as orelhas satildeo de tamanho meacutedio os
membros satildeo curtos e pouco ossudos e o pescoccedilo eacute curto bem ligado agrave cabeccedila e com garrote
largo (MARTINS 1982)
Eacute uma raccedila com caracteres sexuais secundaacuterios bem diferenciados Os touros satildeo
normalmente mais escuros particularmente no terccedilo anterior com maior corpulecircncia do que as
fecircmeas mais robustos com barbela mais desenvolvida cabeccedila mais curta e mais larga cornos
mais grossos e ligeiramente mais curtos (GARCIA et ai 1981 MARTINS 1982)
Esta raccedila apresenta duas particularidades morfoloacutegicas que a distinguem de todas as
outras raccedilas grande desenvolvimento coacuterneo e perfil cocircncavo da cabeccedila com acentuado
prognatismo mandibular O elevado crescimento coacuterneo poderaacute estar relacionado com a
selecccedilatildeo dos animais De facto nas populares chegas de touros o animal que sai vencedor seraacute
o touro cobridor das vacas da aldeia Este processo teraacute permitido a primazia de touros de
maior ossatura capital mais potente musculatura ceacutefalo-cervical maior forccedila no acircngulo taacutersico
e consequentemente grande desenvolvimento dos cornos (MIRANDA do VALE in GONCcedilALVES GARCIA 1964 ARAUacuteJO 1986) No que se refere ao acentuado prognatismo
mandibular eacute possiacutevel que em parte esteja relacionado com o grande desenvolvimento
coacuterneo Este teraacute exigido um desenvolvimento correlativo de certos ossos cranianos e o
atrofiamento dos ossos da face (GONCcedilALVES GARCIA 1964)
Origem
A origem da raccedila Barrosatilde e o seu enquadramento com as outras raccedilas da Peniacutensula
Ibeacuterica estaacute ainda por explicar constatando-se uma grande heterogeneidade na opiniatildeo de
diversos autores a este respeito (MARTINS 1982)
Alguns autores referem a existecircncia no Norte de Aacutefrica (vale do Nilo) de um gado
com caracteriacutesticas morfoloacutegicas semelhantes agrave actual raccedila Barrosatilde em especial no que se
refere agrave forma tamanho e espessura dos cornos Este gado eacute normalmente associado agrave
15
Introduccedilatildeo
designaccedilatildeo subespeciacutefica Bos primigenius opisthonomus (embora tambeacutem se refira como Bos
primigenius mauritaniens e como Bos taurus desertorum) e teraacute chegado agrave Peniacutensula Ibeacuterica
atraveacutes de vaacuterias rotas migratoacuterias dos povos norte-africanos A raccedila Barrosatilde poderia assim
ser incluiacuteda no tronco mauritaacutenico tendo como ancestral Bos primigenius mauritanicus
(GARCIA et ai 1981)
Neste contexto poderaacute admitir-se que o gado que corresponde a este grupo se tenha
instalado na Peniacutensula Ibeacuterica provavelmente durante a longa ocupaccedilatildeo Moura (GONCcedilALVES
GARCIA 1964) Posteriormente a raccedila Barrosatilde teraacute sido desalojada pelos troncos ibeacuterico e
aquitacircnico restando apenas um nuacutecleo populacional confinado agraves zonas planaacutelticas do
Barroso onde permaneceu ateacute hoje (GONCcedilALVES GARCIA 1964)
Esta hipoacutetese natildeo eacute contudo partilhada por outros autores que lhe criticam a escassa
evidecircncia (forma e tamanho dos cornos) e portanto uma clara ausecircncia de base cientiacutefica
(IGLESIAS 1989)
Perante o exposto pode verificar-se que a raccedila Barrosatilde apresenta aspectos
morfoloacutegicos e histoacuterico-evolutivos muito peculiares sendo ainda hoje difiacutecil proceder ao seu
enquadramento no seio das restantes raccedilas bovinas ibeacutericas O aprofundamento da investigaccedilatildeo
sobre a estrutura geneacutetica das suas populaccedilotildees poderaacute ser assim uma via para o
esclarecimento das muitas questotildees que permanecem por responder Nestas condiccedilotildees este
trabalho pretende ser uma contribuiccedilatildeo para o conhecimento da geneacutetica das populaccedilotildees da
raccedila bovina Barrosatilde atraveacutes da consecuccedilatildeo dos seguintes objectivos
1 estudo da variabilidade geneacutetica da raccedila Barrosatilde ao niacutevel das proteiacutenas eritrocitaacuterias
e plasmaacuteticas
2 desenvolvimento e afinaccedilatildeo de teacutecnicas de separaccedilatildeo de proteiacutenas por electroforese
e focagem isoeleacutectrica e sua detecccedilatildeo especiacutefica (histoquiacutemica e imunoloacutegica)
3 anaacutelise familiar dos polimorfismos encontrados
4 avaliaccedilatildeo do grau de diferenciaccedilatildeo geneacutetica existente entre a raccedila Barrosatilde e outras
raccedilas bovinas
16
Material e Meacutetodos
2 - MATERIAL E MEacuteTODOS
21 - AMOSTRAGEM E CONSERVACcedilAtildeO DAS AMOSTRAS
211 - Amostragem
Foram recolhidas 356 amostras de sangue correspondente a 294 indiviacuteduos de raccedila
Barrosatilde (dos quais 141 estavam inscritos no Livro Genealoacutegico) e 62 indiviacuteduos de raccedila
Minhota As colheitas efectuaram-se em zonas de intensa criaccedilatildeo da Barrosatilde designadamente
nos concelhos de Arcos de Valdevez Cabeceiras de Basto Fafe Poacutevoa de Lanhoso e
Monccedilatildeo em finais de 1993 durante o ano de 1994 e ainda no periacuteodo de 1996 1997 em
Vieira do Minho
A recolha de sangue em indiviacuteduos de raccedila Minhota foi efectuada com a finalidade de
servir como termo de comparaccedilatildeo geneacutetica uma vez que se realizam cruzamentos entre esta
raccedila e a Barrosatilde
212 - Obtenccedilatildeo e conservaccedilatildeo das amostras de sangue
O sangue foi colhido da veia jugular em tubos contendo 01 ml de EDTA (aacutecido
etilnodiaminotetraceacutetico) dissoacutedico a 10 ou em tubos heparinados
As amostras de sangue foram centrifugadas (10 minutos a 13000 rpm) separando-se
em seguida o plasma dos eritroacutecitos Aos eritroacutecitos foi adicionado meio de glicerol (seis
partes de uma soluccedilatildeo 5 de citrato trissoacutedico 2H20 adicionados a quatro partes de glicerol)
numa proporccedilatildeo aproximada de 21 as amostras foram conservadas a -20degC
17
Material e Meacutetodos
22 - BATERIA DE MARCADORES GENEacuteTICOS SELECCIONADOS
No presente trabalho foi escolhida uma bateria de 12 marcadores geneacuteticos dispersos
no genoma do bovino (figura 5) HB (Hemoglobina) CAII (Anidrase carboacutenica) PEPB
(Peptidase B) DIA (Diaforase) NP (Fosforilase nucleosiacutedica) MDH (Desidrogenase do
malato) PGD (Desidrogenase do aacutecido fosfoglucoacutenico) GPI (Isomerase da fosfoglucose)
MPI (Isomerase da manose-6-fosfato) ALB (Albumina) TF (Transferrina) e GC
(Componente especiacutefico de grupo)
CP SODl TF
PEPC IDH1
AMY1 AMY1A PGM1
4
LDHB PEPB
ADH2 PGM2 ALB GC SOD3
6
IADA
ALDH1
CAII
ME1 PGM3 SOD2
NP
10
CAT HBBq22-q27
PGD IALDH2 DIA4
HP GPIq22-q24
MPI iBF GLOl
LDHA MDH2
Figura 221 Localizaccedilatildeo de vaacuterios loci proteicos no genoma de Bos taurus Com um tom mais carregado indicam-se os marcadores estudados neste trabalho Adaptado de FRIES et ai (1993)
18
Material e Meacutetodos
bull HB
A hemoglobina eacute responsaacutevel pelo transporte do oxigeacutenio dos pulmotildees para os tecidos
A sua estrutura eacute tetrameacuterica tendo cada uma das quatro subunidades um grupo prosteacutetico -
- heme - com um aacutetomo de ferro no centro A fracccedilatildeo principal da hemoglobina de mamiacuteferos
adultos eacute composta por duas cadeias a e duas cadeias P (BRAEND 1971 CECCHINI amp Nus
1986)
O locus da HB foi um dos primeiros a ser estudado apresentando polimorfismo em
vaacuterios mamiacuteferos (CECCHJM amp Nus 1986 BRAEND et ai 1988 CLARKE et ai 1989 WANG
et ai 1990 SELVARAJ et ai 1991) Em 1955 CABANNE amp SERAIN (in BRAEND 1988)
descrevem pela primeira vez o polimorfismo da HB em bovinos do Norte da Aacutefrica
Posteriormente muitos estudos foram efectuados descrevendo-se 13 variantes (raros na sua
maioria) com diferenccedilas apenas nas cadeias beta (CECCHINI amp Nus 1986 BRAEND 1988)
bull CAII-EC4211
A CAII eacute uma metaloenzima com grande distribuiccedilatildeo nos animais e nas plantas
(TASHIAN 1989) Catalisa de forma reversiacutevel a hidrataccedilatildeo do C02 em H2C03 (CECCHINI amp
Nus 1986 TASHIAN 1989) O seu papel fisioloacutegico ainda natildeo eacute bem conhecido mas eacute
possiacutevel que tenha participaccedilatildeo na manutenccedilatildeo do balanccedilo osmoacutetico (TASHIAN 1989)
A ocorrecircncia de variaccedilatildeo geneacutetica na CAII estaacute descrita em muitas espeacutecies de
mamiacuteferos tendo sido descritos dois loci polimoacuterficos (CAI e CAII) (TASHIAN amp CARTER
1976 CLARICE et ai 1989 SELVARAJ et ai 1991)
SARTORE et ai (1969) foram os primeiros a detectar polimorfismo electroforeacutetico da
anidrase carboacutenica em bovinos domeacutesticos e buacutefalos americanos Nos eritroacutecitos de bovinos
apenas se exprime a anidrase carboacutenica II que apresenta geralmente 2 alelos codominantes
autossoacutemicos (CAIPF e CAIPS) (SARTORE et ai 1969 TASHIAN amp CARTER 1976) Mais
tarde foram encontrados 3 novos alelos (C Z e X) (CECCHINI amp Nus 1986)
19
Material e Meacutetodos
bull PEPB-EC3412
As peptidases formam um conjunto de enzimas capazes de hidrolisar di- e tripeacuteptidos
caracterizando-se pela sua especificidade em relaccedilatildeo a diversos substratos bem como atraveacutes
da sua distribuiccedilatildeo tecidular
A PEPB apresenta uma estrutura monomeacuterica tendo sido descrita como polimoacuterfica
em algumas raccedilas brasileiras de bovinos de origem europeia e indiana (DEL LAMA et ai
1992)
bull DIA-EC1643
A enzima monomeacuterica DIA (NADH - Methemoglobina redutase) tambeacutem conhecida
por citocromo bs redutase faz parte de um grupo de enzimas que catalisam a reduccedilatildeo da
methemoglobina (IGLESIAS 1989 VIEIRA 1993 kRAHhetal 1986)
O seu polimorfismo geneacutetico foi detectado em vaacuterias espeacutecies de Ungulados incluindo
os bovinos (CLARKE et ai 1989 IGLESIAS 1989 SELVARAJ et ai 1991 TATE amp McEWAN
1992)
bull NP-EC2421
A enzima NP encontra-se distribuiacuteda por vaacuterios tecidos e oacutergatildeos e catalisa
reversivelmente a fosforoacutelise dos nucleosiacutedeos puriacutenicos levando agrave formaccedilatildeo das respectivas
bases e ribose-1-fosfato (IGLESIAS 1989)
O polimorfismo geneacutetico desta enzima foi detectado em vaacuterias espeacutecies de mamiacuteferos
incluindo os bovinos (ANSAY 1973 HARRIS amp HOPKINSON 1978 TUKER amp YOUNG 1988
CLARKE eacutetal 1989 IGLESIAS 1989 FERRAND 1995)
20
Material e Meacutetodos
bull MDH-ECl 1137
A MDH eacute uma oxirredutase dimeacuterica na maioria dos mamiacuteferos responsaacutevel pela
oxidaccedilatildeo do L-malato em oxoglutarato com NAD como aceitador A reacccedilatildeo eacute reversiacutevel em
presenccedila de NADH e oxaloacetato A enzima diz-se NAD especiacutefica pelo facto da reacccedilatildeo soacute
ocorrer na presenccedila deste cofactor (MORAIS 1992 PEREIRA 1997)
A ocorrecircncia de variaccedilatildeo geneacutetica neste locus foi descrita para vaacuterios mamiacuteferos
(HARRIS amp HOPKINSON 1978 TUNOacuteN et ai 1989 SELVARAJ et ai 1991) Contudo
relativamente aos bovinos natildeo foi possiacutevel encontrar referecircncias quanto ao seu polimorfismo
bull PGD-EC11144
A PGD eacute uma enzima dimeacuterica envolvida na via das pentoses-fosfato catalisando a
conversatildeo de 6-fosfogluconato em ribose-5-fosfato
O polimorfismo geneacutetico do locus PGD estaacute descrito em diversas espeacutecies de
Ungulados (HERZOG 1988 PENEDO et ai 1988 BEKENEV amp ORLO VA 1991 KUROSAWA amp
TANAKA 1991 JANZEN amp COTHRAN 1991 FERNDALE et al 1992) Contudo relativamente
aos bovinos natildeo foi possiacutevel encontrar referecircncias quanto ao seu polimorfismo
bull GPI-EC5319
A isomerase da fosfoglucose cataliza a reacccedilatildeo reversiacutevel de conversatildeo de glucose-
-6-fosfato em frutose-6-fosfato (HARRIS amp HOPKINSON 1978 PRETSCHei ai 1990)
Eacute uma enzima dimeacuterica com polimorfismo geneacutetico em vaacuterias espeacutecies de mamiacuteferos
nomeadamente no catildeo (ARNOLD amp Bouw 1989) no porco (VAN DE WEGHE et ai 1988
BEKENEV amp ORLO VA 1991) na ovelha (RASERO et ai 1993) em lamas e alpacas (PENEDO et
ai 1988) e no Homem (HARRIS amp HOPKINSON 1978)
21
Material e Meacutetodos
bull MPI-EC5318
A MPI eacute uma enzima monomeacuterica de acccedilatildeo cataliacutetica que permite a isomerizaccedilatildeo de D-
-manose-6-fosfato em D-frutose-6-fosfato
Em diversas espeacutecies de mamiacuteferos nomeadamente no Homem (RlTTER et ai 1974)
em babuiacutenos (RITTER amp SCHMITT 1973) e ratos (NICHOLS et ai 1973 VANDEBERG amp
AIVALIOTIS 1990) esta enzima natildeo apresenta actividade em eritroacutecitos sendo poreacutem
detectada em diversos tecidos como rim fiacutegado e o muacutesculo Mais tarde demonstrou-se a
possibilidade de proceder a esta detecccedilatildeo em hemolisados de cavalos coelhos e lebres (HALL
et ai 1991 VIEIRA amp FERRAND 1995 SANTOS 1995)
O polimorfismo geneacutetico de MPI em bovinos foi descrito por ANSAY (1973)
apresentando trecircs alelos autossoacutemicos codominantes (MPPA MPIB e MPIC)
bull ALB
A albumina eacute a proteiacutena mais abundante no plasma dos mamiacuteferos e apresenta uma
estrutura monomeacuterica A sua funccedilatildeo estaacute relacionada com processos de transporte e de
regulaccedilatildeo do balanccedilo osmoacutetico (CECCHTNI amp Nus 1986 CARTER et al 1989)
O polimorfismo geneacutetico da albumina estaacute descrito em vaacuterias espeacutecies de Ungulados
(STORMONT et ai 1963 BOWLING amp CLARK 1988 PENEDO et ai 1988 ERHARDT 1991
SELVARAJeacutetfa 1991CRISTOFALOpounda 1992 ERHARDT amp SlMIANER 1993)
EFREMOV e ASHTON em 1965 (in CECCHTNI amp Nus 1986) descrevem pela primeira vez
polimorfismo geneacutetico em raccedilas bovinas inglesas Inicialmente encontraram-se dois alelos
(ALBA ou ALBF e ALBB ou ALBS) por electroforese aacutecida Mais tarde descreveram-
-se outros alelos em raccedilas britacircnicas (ALBH e ALBG) e em raccedilas africanas (ALBD
ALBE e ALBF) (CECCHINI amp Nus 1986) ABE et ai em 1971 descrevem o alelo ALBX
(in CECCHTNI amp Nus 1986)
22
Material e Meacutetodos
bull TF
A transferrina eacute uma 3-globulina seacuterica responsaacutevel pelo transporte do ferro Possui
uma estrutura monomeacuterica glicosilada (CECCHINI amp Nus 1986 WELCHS 1990 PENHALLOW
et ai 1991 CUNHA 1994)
O polimorfismo geneacutetico desta proteiacutena foi detectado em vaacuterias espeacutecies de Ungulados
(KRISTJANSSON 1963 STORMONT et ai 1963 ASHTON 1965 GAHNE et ai 1977 CECCHJNI
amp Nus 1986 ERHARD 1986 KUROSAWA amp TANAKA 1988 PENEDO et ai 1988 CLARKE et
ai 1989 HERZOG 1989 JUNEJA et ai 1989 TSUJI et ai 1989 SCHNEIDER et ai 1990
STRATIL et ai 1990 WANG et ai 1990 SELVARAJ et ai 1991 DRATCH et ai 1992
VANKAN amp BELL 1992a CIacuteZovket ai 1993 ERHARD et ai 1993)
ASHTON em 1965 descreveu pela primeira vez o polimorfismo geneacutetico de TF em
bovinos estando actualmente descritos sete alelos TFA TFB TFD1 TFD2 TFE
TFF e TFG (CECCHTNI amp Nus 1986) A subdivisatildeo do alelo TFD em TFD1 e TFD2 foi
descrita por KRISTJANSSON amp HICKMAN (1965)
Nos bovinos os loci TF e CP encontram-se ligados como tem sido descrito para vaacuterias
espeacutecies de mamiacuteferos (JUNEJA et ai 1989)
bull GC
A GC apresenta uma estrutura monomeacuterica e o seu polimorfismo geneacutetico estaacute descrito
em vaacuterias espeacutecies de Ungulados (GAHNE 1963 KRISTJANSSON 1963 JUNEJA et ai 1987
PENEDO et ai 1988 PENEDO amp JUNEJA 1989 KALAacuteB et ai 1990 ERHARDT 1991 VANKAN
amp BELL 1992b STERN et ai 1992 ERHARDT amp SIMIANER 1993 STRATIL et ai 1995)
Nos bovinos o polimorfismo geneacutetico da GC foi inicialmente descrito por GAHNE
(1963) e ASHTON (1963) in GAHNE et ai 1977) mas soacute mais tarde foi possiacutevel obter
frequecircncias geacutenicas para este locus (alelos GCA e GCB) em diferentes raccedilas europeias
(GAHNE et ai 1977) A utilizaccedilatildeo de novas teacutecnicas de separaccedilatildeo permitiu distinguir um
terceiro alelo GCC (VAN DE WEGHE 1982)
23
Material e Meacutetodos
A existecircncia de ligaccedilatildeo factorial entre os loci ALB e GC foi demostrada no Homem
em primeiro lugar e depois nos cavalos nos bovinos e na ovelha (VAN DE WEGHE 1982
ERHARDT amp SlMIANER 1993)
23 - TRATAMENTO DAS AMOSTRAS
bull HB
A separaccedilatildeo da moleacutecula HB por focagem isoeleacutectrica foi feita mediante a utilizaccedilatildeo de
hemolisados diluiacutedos 18 em aacutegua bidestilada
bull CAII
A separaccedilatildeo electroforeacutetica de CAII foi realizada em gel de amido e em focagem
isoeleacutectrica No primeiro caso as amostras foram simplesmente tratadas com tolueno
enquanto no segundo se procedeu ainda agrave sua reduccedilatildeo com uma soluccedilatildeo de ditiotreitol
(DTT) 120 mM (100 uacute de amostra natildeo diluiacuteda e 20 pi de DTT 120 mM) durante 1 h a 37degC
Quando se utilizou focagem isoeleacutectrica aleacutem do tratamento jaacute referido foi necessaacuterio
realizar uma diluiccedilatildeo final de 110 com aacutegua bidestilada
bull PEPB DIA NP MDH PGP GPI e MPI
As separaccedilotildees electroforeacuteticas de PEPB DIA NP MDH PGD GPI e MPI em gel de
amido foram efectuadas com hemolisados natildeo diluiacutedos submetidos ao mesmo tratamento
descrito para CAII quando separada por electroforese convencional
24
Material e Meacutetodos
bull ALB
Na separaccedilatildeo de ALB por focagem isoeleacutectrica utilizaram-se amostras de plasma
diluiacutedas com aacutegua bidestilada na proporccedilatildeo de 170
bull TF
Na separaccedilatildeo de TF efectuada por focagem isoeleacutectrica utilizaram-se amostras de
plasma submetidas a vaacuterios tipos de tratamento para comparaccedilatildeo dos padrotildees de bandas
obtidos
1 Remoccedilatildeo dos resiacuteduos de aacutecido siaacutelico da moleacutecula de TF
diluiccedilatildeo 13 com neuraminidase durante 1 h a 37 degC
2 Remoccedilatildeo do Fe da moleacutecula de TF
diluiccedilatildeo 13 com EDTA-dissoacutedico (20) 2 h antes da aplicaccedilatildeo para remoccedilatildeo dos
aacutetomos de Fe da moleacutecula de TF
3 Saturaccedilatildeo em Fe da moleacutecula de TF
31 - diluiccedilatildeo 13 com soluccedilatildeo de sulfato de amoacutenio feacuterrico 015 (pv) em aacutecido
ciacutetrico 60 mM seguida de incubaccedilatildeo agrave temperatura ambiente 18 h A utilizaccedilatildeo
de uma razatildeo ligante Fe de 201 permite uma raacutepida saturaccedilatildeo da moleacutecula de
TF (FERRAND 1995)
32 - diluiccedilatildeo 13 com soluccedilatildeo de sulfato de amoacutenio ferroso 015 (pv) em aacutecido
ciacutetrico 60 mM seguida de incubaccedilatildeo agrave temperatura ambiente 18 h
33 - diluiccedilatildeo 13 com soluccedilatildeo de citrato de amoacutenio feacuterrico 015 (pv) em aacutecido
ciacutetrico 60 mM seguida de incubaccedilatildeo agrave temperatura ambiente 18 h
34 - diluiccedilatildeo 13 com soluccedilatildeo de citrato feacuterrico 015 (pv) em aacutecido ciacutetrico
60 mM seguida de incubaccedilatildeo agrave temperatura ambiente 18 h
35 - diluiccedilatildeo 13 com soluccedilatildeo de cloreto de ferro 015 (pv) em aacutecido ciacutetrico
60 mM seguida de incubaccedilatildeo agrave temperatura ambiente 18 h
25
Material e Meacutetodos
Antes da inserccedilatildeo as amostras foram parcialmente purificadas atraveacutes da adiccedilatildeo de 5
volumes de uma soluccedilatildeo de rivanol 06 (pv) em tampatildeo Tris HC1 005 M (ajusta-se o pH
para valores de 91 com Tris 1 M) seguida de centrifugaccedilatildeo
bull GCcedil
A fim de proceder agrave remoccedilatildeo dos resiacuteduos de aacutecido siaacutelico existente nas cadeias de
hidratos de carbono ligadas agrave moleacutecula GC as amostras de plasma foram submetidas a uma
incubaccedilatildeo com uma soluccedilatildeo de neuraminidase Clostridium perfringens SIGMA type V 18
Uml) na proporccedilatildeo de 13 durante 18 h a 37degC acrescentando-se posteriormente aacutegua
bidestilada ateacute agrave obtenccedilatildeo de uma diluiccedilatildeo final de 14 Paralelamente procedeu-se a uma
diluiccedilatildeo das amostras com aacutegua bidestilada (19) para comparaccedilatildeo dos padrotildees de bandas
obtidos
24 - MEacuteTODOS DE SEPARACcedilAtildeO
Electroforese convencional
Nas teacutecnicas de electroforese convencional foram utilizados vaacuterios sistemas de tampatildeo
para os geacuteis e para as pontes conforme a proteiacutena em estudo
Focagem isoeleacutectrica
Os sistemas de focagem isoeleacutectrica utilizados na separaccedilatildeo de proteiacutenas foram
realizados em matrizes de poliacrilamida (T = 5 C = 3) com dimensotildees 230xl00x03mm
Os geacuteis foram aplicados sobre uma peliacutecula de suporte GELFIX (SERVA) permitindo o seu
manuseamento adequado
A adiccedilatildeo de soluccedilotildees de TEMED 10 (pv) e persulfato de amoacutenio (PSA) 10 (pv)
permitiu a polimerizaccedilatildeo do gel agrave temperatura ambiente (24 horas) ou a 37 degC durante 1 h
As separaccedilotildees por focagem isoeleacutectrica decorreram sobre placa de arrefecimento a
aproximadamente 10degC (8 - 12degC)
26
Material e Meacutetodos
HB
A separaccedilatildeo da moleacutecula de HB foi realizada por focagem isoeleacutectrica em gradiente de
pH livre segundo a teacutecnica descrita por FERRAND (1995) com algumas modificaccedilotildees
A composiccedilatildeo da soluccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo e os paracircmetros eleacutectricos utilizados estatildeo
indicados nas tabelas 241 e 242 respectivamente
Tabela 241 Soluccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo utilizada para a separaccedilatildeo da moleacutecula nativa de HB por focagem isoeleacutectrica
Componentes da soluccedilatildeo Quantidades
Acrilamida 28 (pv)
Bisacrilamida 2 (pv)
Sacarose
Anfoacutelitos 5-8 (SIGMA)
7-9 (PHARMACIA)
Aacutegua bidestilada TEMED 10 (vv)
PSA 10 (pv)
18 ml
08 ml
2 g
300 p1
300 ul
ateacute 10 ml volume final
10 ul
70 ul
Tabela 242 Paracircmetros eleacutectricos utilizados na focagem isoeleacutectrica de HB
Voltagem (V) Corrente (mA) Potecircncia (W) Tempo (T)
Preacute focagem 1500 25 1
2
3
30 min
15 min
15 min
Focagem 1500 25 15 2h 30 min
As soluccedilotildees para os eleacutectrodos foram aacutecido aspaacutertico 004 M (acircnodo) e NaOH 01 M
(caacutetodo) As amostras foram aplicadas a 15 cm do caacutetodo tendo sido inseridas com o auxiacutelio
de um aplicador de borracha silicone (SERVA)
27
Material e Meacutetodos
bull CAII
A separaccedilatildeo de CAII fez-se em gel de amido (15 pv SIGMA) conforme o descrito
por AMORIM (1983) com algumas modificaccedilotildees e ainda por focagem isoeleacutectrica em
gradiente de pH livre
Utilizam-se os seguintes sistemas tampatildeo para a separaccedilatildeo por electroforese em gel de
amido
Tampatildeo das Pontes Tris 0250 M pH = 76 Aacutecido ciacutetrico 0067 M
Tampatildeo do Gel Diluiccedilatildeo 110 do tampatildeo das pH = 76 pontes
As amostras foram inseridas em meio Sephadex G-200 (PHARMACIA) na proporccedilatildeo
de 11 As electroforeses foram realizadas em placa de arrefecimento (8degC) e com um
gradiente de potencial de 5 Vcm durante 16 h
A teacutecnica utilizada para a separaccedilatildeo de CAII por focagem isoeleacutectrica foi a descrita por
BOWLING et ai (1990) com algumas modificaccedilotildees A composiccedilatildeo da soluccedilatildeo de
polimerizaccedilatildeo e os paracircmetros eleacutectricos utilizados estatildeo indicados nas tabelas 243 e 244
respectivamente
As soluccedilotildees para os eleacutectrodos foram aacutecido aspaacutertico 004 M (acircnodo) e NaOH 01 M
(caacutetodo) As amostras foram inseridas com o auxiacutelio de um aplicador de borracha silicone
(SERVA) colocado a 15 cm do caacutetodo
28
Material e Meacutetodos
Tabela 243 Soluccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo utilizada na separaccedilatildeo de CAII por focagem isoeleacutectrica
Componentes da soluccedilatildeo
Acrilamida 28 (pv)
Bisacrilamida 2 (pv)
Sacarose
Anfoacutelitos 4-65 (PHARMACIA)
Anfoacutelitos 35-10 (PHARMACIA)
Aacutegua bidestilada TEMED 10 (vv)
PSA 10 (pv)
Quantidades 18 ml
08 ml
2 g
500 |ol
100 ul
ateacute 10 ml volume final
10 ul
70 ul
Tabela 244 Paracircmetros eleacutectricos utilizados na separaccedilatildeo de CAII por focagem isoeleacutectrica
Voltagem (V) Corrente (mA) Potecircncia (W) Tempo (T)
Preacute focagem 1500 25 1
3
5
30 min
15 min
15 min
Focagem 2500 25 8
10
12
30 min
30 min
30 min
bull PEPB
A separaccedilatildeo da PEPB foi realizada em gel de amido (15 pv SIGMA) de acordo
com a teacutecnica descrita por POVEY et ai (1972) com algumas modificaccedilotildees
29
Material e Meacutetodos
Utilizou-se o seguinte sistema tampatildeo
Tampatildeo das Pontes Tris 01 M
pH = 74 NaH2P04 01 M
Tampatildeo do Gel Diluiccedilatildeo 110 do tampatildeo das
pH = 74 pontes
As amostras satildeo inseridas em meio Sephadex G-200 (PHARMACIA) na proporccedilatildeo de
11 As electroforeses foram realizadas em placas de arrefecimento (8degC) e com um gradiente
de potencial de 5 Vcm durante 16 h
bull DIA
No caso da separaccedilatildeo de DIA a teacutecnica eacute idecircntica agrave utilizada para CAII electroforese
em gel de amido (15 pv SIGMA) conforme o descrito por AMORIM (1983) com algumas
modificaccedilotildees
bull NP MDH PGD GPJ e MPI
As separaccedilotildees das enzimas NP MDH PGD GPI e MPI fizeram-se em simultacircneo por
electroforese em gel de amido (15 pv SIGMA) conforme o descrito por AMORIM et ai
(1982) com algumas modificaccedilotildees
Utilizou-se o seguinte sistema tampatildeo
1130 M
0400 M
0020 M 0010 M
Tampatildeo das Pontes NaOH
pH = 60 Aacutecido ciacutetrico
Tampatildeo do Gel HisHCl
pH = 60 NaOH
30
Material e Meacutetodos
As amostras foram inseridas em meio Sephadex G-200 (PHARMACIA) na proporccedilatildeo
de 11 As electroforeses foram realizadas em placas de arrefecimento (8degC) e com um
gradiente de potencial de 8 Vcm durante 15 h
ALB
Nas tabelas 245 e 246 indicam-se respectivamente a composiccedilatildeo da soluccedilatildeo de
polimerizaccedilatildeo para a separaccedilatildeo de ALB por focagem isoeleacutectrica segundo a teacutecnica descrita
por ROCHA et ai (1991) com algumas modificaccedilotildees e os paracircmetros eleacutectricos
Tabela 245 Soluccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo utilizada para a separaccedilatildeo de ALB por focagem isoeleacutectrica
Componentes da soluccedilatildeo Quantidades
Acrilamida 28 (pv)
Bisacrilamida 2 (pv)
Ureia
Anfoacutelitos 5-6 (PHARMACIA)
Anfoacutelitos 5-8 (PHARMACIA)
Anfoacutelitos 6-8 (PHARMACIA)
Aacutegua bidestilada TEMED 10 (vv)
PSA 10 (pv)
18 ml
08 ml
48 g
250 ni
250 ni
125 ul
ateacute 10 ml volume final
30 ul
70 ul
Tabela 246 Paracircmetros eleacutectricos utilizados na separaccedilatildeo de ALB por focagem isoeleacutectrica
Voltagem (V) Corrente (mA) Potecircncia (W) Tempo (T)
Preacute focagem 1500 25
Focagem 1500 25
1 30 min
2 15 min
3 15 min
4 3 h
5 30 min
31
Material e Meacutetodos
As soluccedilotildees para os eleacutectrodos foram aacutecido aspaacutertico 004 M (acircnodo) e NaOH 1 M
(caacutetodo) As amostras foram aplicadas a 15 cm do caacutetodo com o auxiacutelio de um aplicador de
borracha silicone (SERVA)
TF
A separaccedilatildeo da moleacutecula de TF foi efectuada por focagem isoeleacutectrica A composiccedilatildeo
da soluccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo e os paracircmetros eleacutectricos utilizados estatildeo indicados nas tabelas
247 e 248 respectivamente
Tabela 247 Soluccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo utilizada para a separaccedilatildeo da TF por focagem isoeleacutectrica
Componentes da soluccedilatildeo Quantidades
Acrilamida 28 (pv)
Bisacrilamida 2 (pv)
Sacarose
Anfoacutelitos 35-5(LKB)
Anfoacutelitos 4-65 (PHARMACIA)
Aacutegua bidestilada
TEMED 10 (vv) PSA 10 (pv)
18 ml
08 ml
2 g
100 ul
500 ul
ateacute 10 ml volume final
30 ul
70 ul
Tabela 248 Paracircmetros eleacutectricos utilizados na separaccedilatildeo de TF por focagem isoeleacutectrica
Voltagem (V) Corrente (mA) Potecircncia (W) Tempo (T)
Preacute focagem 1500 25
Focagem 2500 25
l 20 min
2 10 min
3 10 min
8 30 min
10 30 min
12 30 min
32
Material e Meacutetodos
As soluccedilotildees para os eleacutectrodos foram de aacutecido aspaacutertico 004 M (acircnodo) e de NaOH
1 M (caacutetodo) As amostras foram aplicadas a 15 cm do caacutetodo com o auxiacutelio de um aplicador
de borracha silicone (SERVA)
GC
Nas tabelas 249 e 2410 apresenta-se respectivamente a composiccedilatildeo da soluccedilatildeo de
polimerizaccedilatildeo e os paracircmetros eleacutectricos utilizados na focagem isoeleacutectrica de GC
Tabela 249 Soluccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo utilizada para a separaccedilatildeo da GC por focagem isoeleacutectrica
Componentes da soluccedilatildeo Quantidades
Acrilamida 28 (pv)
Bisacrilamida 2 (pv)
Sacarose
Anfoacutelitos 45-54 (PHARMACIA)
Anfoacutelitos 4-6 (LKB)
Aacutegua bidestilada TEMED 10 (vv)
PSA 10 (pv)
18 ml
08 ml
2 g
437 ul
188 (il
eacute 10 ml volume final
10 ul
70 ul
Tabela 2410 Paracircmetros eleacutectricos utilizados na separaccedilatildeo de GC por focagem isoeleacutectrica
Voltagem (V) Corrente (mA) Potecircncia (W) Tempo (T)
Preacute focagem 1500 25
Focagem 1500 25
1 30 min
2 15 min
3 15 min
4 3 h
5 30 min
33
Material e Meacutetodos
Para os eleacutectrodos foram utilizadas soluccedilotildees de aacutecido aspaacutertico 004 M (acircnodo) e de
NaOH 02 M (caacutetodo) As amostras foram inseridas com o auxiacutelio de um aplicador de
borracha silicone (SERVA) colocado a 15 cm do caacutetodo
25 - MEacuteTODOS DE DETECCcedilAtildeO
Apoacutes a separaccedilatildeo das proteiacutenas os padrotildees electroforeacuteticos foram geralmente obtidos
por detecccedilatildeo especiacutefica aproveitando a actividade cataliacutetica das enzimas Noutros casos a
revelaccedilatildeo foi feita por coloraccedilatildeo geral de proteiacutenas
bull HB
A visualizaccedilatildeo da HB foi obtida mediante coloraccedilatildeo geral de proteiacutenas segundo o
seguinte procedimento
Fixaccedilatildeo
Imersatildeo do gel numa soluccedilatildeo de aacutecido tricloroaceacutetico 125 (pv) durante 10 minutos
Coloraccedilatildeo geral de proteiacutenas
Coloraccedilatildeo com uma soluccedilatildeo de Coomassie R-250 0115 (pv) numa mistura de aacutecido
aceacuteticoetanolaacutegua destilada (42571) apoacutes aquecimento seguida de filtraccedilatildeo durante
5-10 minutos A descoloraccedilatildeo eacute feita com aacutecido aceacutetico etanol e aacutegua destilada
aquecida a cerca de 60degC ateacute se obter o contraste desejado
bull CAII
Apoacutes separaccedilatildeo por electroforese em gel de amido visualizou-se a CAII pela sua
actividade esteraacutesica adicionando-se diacetato de fluoresceiacutena (em quantidades vestigiais que
34
Material e Meacutetodos
foram previamente dissolvidas em 200 uacute de acetona) a uma soluccedilatildeo de incubaccedilatildeo tamponada
(pH = 66) Esta soluccedilatildeo de incubaccedilatildeo eacute composta por aacutecido ciacutetrico 27 mM e Na2HP04
116 mM e foi aplicada sobre o gel de amido com o auxiacutelio de papeacuteis de filtro Whatman ndegl
Em seguida incubou-se durante 30 minutos a 37degC A observaccedilatildeo das bandas de CAII (devido
agrave sua capacidade esteraacutesica) eacute feita sob luz ultravioleta
Apoacutes separaccedilatildeo por focagem isoeleacutectrica utilizou-se uma coloraccedilatildeo geral de proteiacutenas
para visualizaccedilatildeo da CAII segundo o meacutetodo descrito para a HB sem fixaccedilatildeo
bull PEPB
A detecccedilatildeo da PEPB apoacutes a separaccedilatildeo electroforeacutetica foi feita atraveacutes da aplicaccedilatildeo
sobre o gel de amido de papeacuteis de filtro Whatman ndegl embebidos numa soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo
seguindo-se uma incubaccedilatildeo de 30 minutos a 37degC
A soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo conteacutem o substrato da PEPB L-leucilglicil-glicina 0004 M
veneno de cobra da espeacutecie Agkistrodon piscivorus piscivorus 04 (pv) MTT 24 mM e
metosulfato de fenazina (PMS) 03 mM num tampatildeo de pH = 80 (Tris HC1005 M)
bull DIA
Apoacutes a separaccedilatildeo por electroforese em gel de amido a identificaccedilatildeo da DIA foi obtida
pela adiccedilatildeo de uma soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo a uma fatia do gel A incubaccedilatildeo decorreu durante 2
horas a 37degC
A soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo foi realizada em duas fases
Io - colocou-se 26-diclorofenol-indofenol (DCIP) 01 mM com um tampatildeo de
pH = 85 (Tris HC1 005M) adicionando-se agrave mistura aacutegua bidestilada ateacute perfazer
50 ml Em seguida filtrou-se a soluccedilatildeo
2o - agrave soluccedilatildeo filtrada adicionou-se MTT 03 mM e NADH 02 mM e agitou-se antes
de verter sobre a fatia de gel de amido
35
Material e Meacutetodos
bull NP
A detecccedilatildeo da enzima NP apoacutes a separaccedilatildeo por electroforese foi feita atraveacutes da
aplicaccedilatildeo sobre o gel de amido de papeacuteis de filtro Whatman ndegl embebidos com a soluccedilatildeo de
coloraccedilatildeo Em seguida incubou-se durante 15 minutos a 37degC
A soluccedilatildeo de incubaccedilatildeo conteacutem inosina 37 mM MTT 24 mM XOD 0004 Uml uma
gota de azul de Meldola (SIGMA) (10 vv em aacutegua bidestilada) e uma soluccedilatildeo de tampatildeo
de incubaccedilatildeo pH = 75 constituiacuteda por KH2P04 005 M e NaOH 004 M
bull MDH
Na detecccedilatildeo da actividade enzimaacutetica de MDH foi utilizado o meacutetodo de sandwich
apoacutes a sua separaccedilatildeo electroforeacutetica em gel de amido Em seguida incubou-se durante 15
minutos a 37degC O meacutetodo de sandwich consiste na aplicaccedilatildeo de uma fatia de gel de amido
entre duas folhas de papel de filtro Whatman ndegl embebido com a soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo
A soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo utilizada na detecccedilatildeo da MDH conteacutem NAD 1 mM MTT
2 mM e piruvato de soacutedio (quantidades vestigiais) Esta soluccedilatildeo foi feita com um tampatildeo de
incubaccedilatildeo pH = 74 constituiacutedo por aacutecido maacutelico 0222 M Tris 050 M e MgCl2 002 M
bull PGP
A detecccedilatildeo da actividade enzimaacutetica de PGD foi feita pelo meacutetodo de sandwich apoacutes a
sua separaccedilatildeo electroforeacutetica em gel de amido
A soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo conteacutem quantidades vestigiais de aacutecido 6-fosfoglucoacutenico
NADP MTT e uma gota de azul de Meldola (05 pv em aacutegua bidestilada) dissolvidos num
tampatildeo de pH = 74 constituiacutedo por Tris 01 M HisHCl 01 M Imidazol 0015 M e MgCl2
0005 M
36
Material e Meacutetodos
bull GPI
A detecccedilatildeo da actividade enzimaacutetica de GPI foi feita pelo meacutetodo de sandwich apoacutes a
sua separaccedilatildeo electroforeacutetica em gel de amido
A soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo conteacutem frutose-6-fosfato 55 mM NADP 22 mM MTT
4 mM desidrogenase da glucose-6-fosfato (G6PD) 14 Uml e uma gota de azul de Meldola
(05 pv em aacutegua bidestilada) dissolvidos num tampatildeo de pH = 74 constituiacutedo por Tris 01
M HisHCl 01 M Imidazol 0015 M e MgCl2 0005 M
bull MPI
Detectou-se a actividade enzimaacutetica de MPI pelo meacutetodo de sandwich apoacutes a sua
separaccedilatildeo electroforeacutetica em gel de amido
A soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo conteacutem manose-6-fosfato 42 mM NADP 13 mM MTT
24 mM e uma gota de azul de Meldola (05 pv em aacutegua bidestilada) dissolvidos num
tampatildeo de pH = 74 constituiacutedo por Tris 01 M HisHCl 01 M Imidazol 0015 M e MgCl2
0005 M Por fim adicionaram-se as enzimas isomerase da glucose-6-fosfato (GPI) 3 Uml e
desidrogenase da glucose-6-fosfato (G6PD) 5 Uml
bull ALBeTF
A detecccedilatildeo de ALB e de TF foi efectuada atraveacutes do meacutetodo de coloraccedilatildeo geral de
proteiacutenas descrito para a HB utilizando-se Coomasie R-250 sem fixaccedilatildeo
bull GCcedil
A visualizaccedilatildeo de GC efectuou-se por detecccedilatildeo imunoenzimaacutetica apoacutes transferecircncia da
proteiacutena para uma membrana de nitrocelulose (045 pm SCHLEICHER amp SCHULL)
segundo a teacutecnica descrita por FERRAND (1995)
37
Material e Meacutetodos
Apoacutes esse processo de transferecircncia as membranas de nitrocelulose foram lavadas 3
vezes (15 minutos) numa soluccedilatildeo de Tween 20 (MERCK) 0025 (vv) em soro fisioloacutegico
tamponado com fosfato (PBS Na2HP04 50 mM KH2P04 18mM NaCl 147 mM pH = 71) e
bloqueadas numa soluccedilatildeo de leite em poacute magro (5 pv em PBS) durante 18 h com agitaccedilatildeo
permanente e agrave temperatura ambiente
Depois da primeira lavagem aplicou-se o antisoro (anti-GC humana ATAB 81936)
diluiacutedo 1170 em PBS com 1 (pv) de albumina seacuterica bovina (SIGMA) durante 1 h agrave
temperatura ambiente
Repetiu-se novamente a lavagem segundo o processo jaacute referido seguindo-se a
aplicaccedilatildeo do segundo antisoro (anticorpos contra imunoglobulinas caprinas desenvolvidos em
coelho e conjugados com uma peroxidase ATAB 83806) diluiacutedo 1600 em PBS com 1
(pv) de albumina seacuterica bovina (SIGMA) durante 1 h agrave temperatura ambiente
Depois de duas lavagens (5 minutos) com Tween 20PBS procedeu-se agrave detecccedilatildeo da
GC com uma soluccedilatildeo de 9-amino-2-etilcarbazol 004 (pv) e de metanol 20 (vv) em PBS
As bandas correspondentes agrave actividade peroxidaacutesica aparecem rapidamente bloqueando-se a
reacccedilatildeo com aacutegua bidestilada
26 - MEacuteTODOS DE CAacuteLCULO
As frequecircncias geacutenicas foram calculadas por contagem directa de genes a partir da
distribuiccedilatildeo fenotiacutepica obtida
O caacutelculo dos valores de heterozigotia meacutedia (H) da proporccedilatildeo de loci polimoacuterficos
(P) do nuacutemero meacutedio de alelos por locus (ria) estatiacutesticas F e frequecircncias fenotiacutepicas
esperadas segundo o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg foi efectuado com a utilizaccedilatildeo do
programa BIOSYS versatildeo 17 (SWOFFORD amp SELANDER 1989)
O caacutelculo de distacircncias geneacuteticas e obtenccedilatildeo de dendrogramas foi efectuado com o
programa PHYLIP versatildeo 35 (FELSENTEIN 1993)
38
Resultados e Discussatildeo
3 - RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
31 - ANAacuteLISE DOS MEacuteTODOS DE SEPARACcedilAtildeO
De entre os 12 loci estudados neste trabalho detectaram-se 5 monomoacuterficos
(PEPB DIA GPI MDH e PGD) e 7 polimoacuterficos (HB CAII NP MPI ALB TF e GC)
Loci monomoacuterficos
bull PEPB
A utilizaccedilatildeo de teacutecnicas de electroforese em gel de amido permitiu a detecccedilatildeo de
um soacute fenoacutetipo (figura 311) correspondente a indiviacuteduos homozigoacuteticos para o alelo
PEPB2 descrito por DEL LAMA et ai (1992) No entanto na raccedila Minhota detectou-se
um indiviacuteduo heterozigoacutetico
O fenoacutetipo PEPB 2 apresenta um padratildeo com duas bandas uma de grande
intensidade e outra secundaacuteria mais anoacutedica de menor intensidade No indiviacuteduo
heterozigoacutetico 2-1 (natildeo representado) observou-se um padratildeo de trecircs bandas sendo a
terceira mais anoacutedica e menos intensa
A quase inexistecircncia de PEPB1 nas raccedilas estudadas estaacute de acordo com o referido
em DEL LAMA et ai (1992) que sugere a fixaccedilatildeo de PEPB2 na maior parte das
populaccedilotildees de bovinos de origem europeia (com excepccedilatildeo das raccedilas italianas Marchigiana
e Chianina)
39
Resultados e Discussatildeo
+
Figura 311 Fenoacutetipos de PEPB observados por electroforese convencional em gel de amido
bull DIA
Os resultados obtidos para a enzima DIA revelaram ausecircncia de polimorfismo
electroforeacutetico (figura 312) Resultados semelhantes foram tambeacutem obtidos em vaacuterias
raccedilas autoacutectones espanholas (GONZALEZ et ai 1987 IGLESIAS 1989 ARRANZ et ai
1992)
MAKAVEEV (1979 in IGLESIAS 1989) detectou polimorfismo desta enzima em
eritroacutecitos de buacutefalos da Bulgaacuteria e nas raccedilas bovinas Frisia e Simmental descrevendo dois
alelos codominantes DIAA e DIAB
Figura 312 Padratildeo de DIA observado por electroforese convencional em gel de amido
40
Resultados e Discussatildeo
Natildeo se detectou variaccedilatildeo electroforeacutetica para o locus GPI Estes resultados natildeo se
podem comparar com os obtidos noutras raccedilas por natildeo ter sido possiacutevel consultar outros
trabalhos onde se descrevesse variaccedilatildeo do locus GPI em gado bovino
A figura 313 apresenta o padratildeo obtido para esta enzima observando-se trecircs
bandas duas com grande intensidade e uma banda mais anoacutedica de menor intensidade
Figura 313 Padratildeo de GPI obtido em hemolisados por electroforese convencional em gel de amido
bull MDH
A enzima MDH revelou-se monomoacuterfiacuteca Este resultado eacute concordante com outros
estudos (ARRANZ et ai 1992)
Na figura 314 observa-se o padratildeo de bandas detectado por electroforese
convencional em gel de amido
Figura 314 Padratildeo de MDH observado por electroforese convencional em gel de amido
41
Resultados e Discussatildeo
bull PGD
A enzima PGD revelou-se monomoacuterfica para as raccedilas Barrosatilde e Minhota tambeacutem
neste caso natildeo se encontrou qualquer referecircncia bibliograacutefica relativa a um possiacutevel
polimorfismo deste locus em gado bovino
Na figura 315 observa-se o padratildeo obtido para esta enzima Em amostras
armazenadas por um longo periacuteodo de tempo detectaram-se duas bandas sendo a mais
anoacutedica a que revela menor intensidade as amostras mais recentes apresentam um padratildeo
electroforeacutetico com uma soacute banda
Figura 315 Padratildeo de PGD observado por electroforese convencional em gel de amido
Loci polimoacuterficos
bull HB
A electroforese convencional natildeo permite discriminar os electromorfos de HB No
entanto a utilizaccedilatildeo de sistemas de focagem isoeleacutectrica conduz agrave detecccedilatildeo de
polimorfismo nesta proteiacutena observando-se dois fenoacutetipos HB A e HB AB
Na figura 316 observa-se o padratildeo electroforeacutetico desta moleacutecula resultante da
expressatildeo de dois alelos codominantes HBA e HBB Resultados idecircnticos estatildeo
descritos em raccedilas bovinas da Peniacutensulas Ibeacuterica (VICENTE 1978 KiDD et ai 1980
IGLESIAS 1989)
42
Resultados e Discussatildeo
+ -HBB
HBA
AB AB A A
Figura 316 Separaccedilatildeo de hemoglobina nativa por focagem isoeleacutectrica
bull poundAH
A utilizaccedilatildeo de electroforese em gel de amido e focagem isoeleacutectrica permitiu
identificar trecircs fenoacutetipos CAII F CAII FS e CAII S atribuiacutedos agrave expressatildeo de dois alelos
codominantes CAF e CAS (figuras 317 e 318) Poreacutem a separaccedilatildeo por electroforese em
gel de amido implica alguma morosidade (tempos de corrida muito longos) e em amostras
coaguladas o erro de leitura pode ser superior a 20 Estas dificuldades satildeo minimizadas
quando se recorre a focagem isoeleacutectrica
Assim a separaccedilatildeo da enzima CAII por focagem isoeleacutectrica oferece vaacuterias vantagens
nomeadamente
bull rapidez e simplicidade de execuccedilatildeo
bull utilizaccedilatildeo de pequenas quantidades de material bioloacutegico
bull maior nuacutemero de amostras fenotipadas por corrida
bull possibilidade de utilizaccedilatildeo de amostras coaguladas
43
Resultados e Discussatildeo
F F F S FS FS F S FS
Figura 317 Fenoacutetipos de CAII observados sob luz ultravioleta apoacutes separaccedilatildeo por electroforese convencional em gel de amido e coloraccedilatildeo com diacetato de fluoresceina
CAIIF
| CAIIS
Figura 318 Fenoacutetipos de CAII observados por focagem isoeleacutectrica apoacutes coloraccedilatildeo geral de proteiacutenas
bull NP
A expressatildeo fenotiacutepica de NP resulta das combinaccedilotildees possiacuteveis entre um alelo
dominante NPH e um recessivo NPL (ANSAY 1973) Este facto implica que apenas em
presenccedila do feno tipo NP L eacute possiacutevel fazer corresponder um genoacutetipo (jaacute que o fenoacutetipo NP H
pode corresponder aos genoacutetipos HH e HL e o fenoacutetipo NP L corresponde ao genoacutetipo LL)
Na figura 319 apresenta-se o padratildeo obtido para a proteiacutena apoacutes separaccedilatildeo
electroforeacutetica em gel de amido
44
+
w
FS FS ]
Resultados e Discussatildeo
H L L H L L
Figura 319 Fenoacutetipos de NP detectados por electroforese convencional em gel de amido
bull MPI
Na raccedila Minhota detectaram-se quatro fenoacutetipos MPI AB MPI B MPI BC e MPI C
anteriormente descritos por ANSAY (1973) em bovinos na raccedila Barrosatilde apenas se observam
os trecircs uacuteltimos fenoacutetipos De acordo com o mesmo autor os fenoacutetipos encontrados nesta raccedila
resultam da combinaccedilatildeo de dois alelos codominantes MPIB e MPPC enquanto que MPIA
aparece na raccedila Minhota com uma frequecircncia reduzida
Como se pode observar pela anaacutelise da figura 3110 MPIA aparece como o alelo
mais anoacutedico MPIC como o mais catoacutedico e o alelo mais frequente MPIB situa-se numa
posiccedilatildeo intermeacutedia em relaccedilatildeo aos anteriores Contudo a intensidade das bandas eacute muito
fraca tornando-se quase imperceptiacutevel em alguns casos Esta grande dificuldade em obter um
contraste de bandas adequado mesmo apoacutes longos periacuteodos de incubaccedilatildeo a 37degC poderaacute
eventualmente levar a uma incorrecta interpretaccedilatildeo dos fenoacutetipos Assim a utilizaccedilatildeo de
sistemas de focagem isoeleacutectrica na determinaccedilatildeo destes fenoacutetipos seria aconselhaacutevel a fim
de verificar os resultados obtidos por electroforese convencional
45
Resultados e Discussatildeo
Figura 3110 Fenoacutetipos de MPI observados por electroforese convencional em gel de amido
bull ALB
A separaccedilatildeo por focagem isoeleacutectrica permitiu detectar polimorfismo em ALB Cada
indiviacuteduo homozigoacutetico aparece com trecircs bandas duas de maior intensidade e uma mais
aciacutedica com menor intensidade os indiviacuteduos heterozigoacuteticos podem apresentar ateacute seis
bandas
Esta heterogeneidade nos padrotildees de ALB tem sido interpretada como o resultado da
capacidade desta proteiacutena se ligar a vaacuterias substacircncias diferentes (FERRAND 1995) Com a
inclusatildeo de ureia (8M) na matriz de separaccedilatildeo reagente que provoca a desnaturaccedilatildeo da
proteiacutena levando a uma alteraccedilatildeo do seu pi para uma zona mais baacutesica do gradiente
conseguem-se obter padrotildees de bandas mais simples e mais definidos (KAWAGUCHI 1973
FERRAND 1995)
Na figura 3111 apresentam-se os padrotildees observados que foram interpretados como
sendo determinados por trecircs alelos codominantes ALBA ALBB e ALBV
GAHNE et ai (1977) e IGLESIAS (1989) detectaram por electroforese em gel de
poliacrilamida e de amido respectivamente dois variantes em gado bovino ALBA e
ALBB A utilizaccedilatildeo de focagem isoeleacutectrica veio confirmar a existecircncia destes dois alelos e
acrescentar um terceiro designado por ALBV com uma mobilidade mais aciacutedico do que
ALBA
46
Resultados e Discussatildeo
A B A B A B B B A B A G
Figura 3111 Fenoacutetipos de ALB determinados em amostras de plasma por focagem isoeleacutectrica na presenccedila de ureia 8M
ARRANZ et ai (1992) revelaram a existecircncia de um outro variante (ALBD) com
mobilidade electroforeacutetica intermeacutedia entre ALBA e ALBB ainda natildeo descrito em
nenhuma raccedila autoacutectone espanhola Este alelo poderaacute corresponder ao alelo ALBV
encontrado neste trabalho apesar de apresentar um pi mais aacutecidico do que ALBA (ARRANZ
comunicaccedilatildeo pessoal)
Desta forma a teacutecnica de separaccedilatildeo por focagem isoeleacutectrica provou ser eficaz na
separaccedilatildeo dos variantes de ALB tal como jaacute foi demonstrado no gato (BELL et ai 1994) na
ovelha (ERHARDT amp SIMIANER 1993) e no coelho (FERRAND amp ROCHA 1992)
bull TF
A transferrina eacute um dos marcadores mais importantes no estudo e caracterizaccedilatildeo
geneacutetica de raccedilas bovinas devido ao seu elevado polimorfismo No entanto a sua fenotipagem
natildeo eacute simples existindo frequentemente problemas de resoluccedilatildeo e de separaccedilatildeo das bandas
(IGLESIAS 1989)
A fim de averiguar qual a melhor forma de separar os diferentes produtos geacutenicos
descritos no locus TF testaram-se vaacuterios sistemas electroforeacuteticos em geacuteis de agarose numa
vasta gama de sistemas tampatildeo Esta teacutecnica natildeo ofereceu resultados satisfatoacuterios pelo que se
passou agrave separaccedilatildeo da TF por focagem isoeleacutectrica recorrendo a matrizes de poliacrilamida
47
Resultados e Discussatildeo
com diferentes concentraccedilotildees de ureia (6M e 8M) tambeacutem neste caso natildeo se conseguiram
resultados positivos
Este tipo de dificuldades encontradas na fenotipagem da TF por focagem isoeleacutectrica
tinham jaacute sido descritos noutras espeacutecies nomeadamente na cabra (ERHARDT 1986) e no
coelho (FERRAND 1995) No entanto TSUJI et ai (1989) demostraram ser possiacutevel fenotipar
esta proteiacutena em bovinos por focagem isoeleacutectrica sem grandes problemas e sem qualquer
aditivo na matriz de poliacrilamida
Desta forma a utilizaccedilatildeo de uma teacutecnica de focagem isoeleacutectrica com um gradiente de
pH 35-65 reforccedilado em 40-65 permitiu separar os produtos geacutenicos do locus TF Contudo
os padrotildees obtidos nem sempre eram definidos tornando-se dificilmente interpretaacuteveis
Na tentativa de melhorar os padrotildees de resoluccedilatildeo e de verificar se a variaccedilatildeo detectada
natildeo resultava de diferenccedilas no estado feacuterrico da moleacutecula de TF ou ainda da existecircncia de
aacutecidos siaacutelicos ligados agrave moleacutecula procedeu-se agrave sua separaccedilatildeo apoacutes vaacuterios tratamentos das
amostras
A remoccedilatildeo dos aacutecidos siaacutelicos atraveacutes do tratamento das amostras com neuraminidase
natildeo permitiu a obtenccedilatildeo de bandas definidas este tratamento natildeo altera significativamente o
padratildeo das bandas de TF de bovinos como jaacute tinha sido descrito por PENHALLOU et ai
(1991)
A obtenccedilatildeo de TF no estado apofeacuterrico foi conseguida submetendo as amostras a um
tratamento com EDTA-dissoacutedico Neste caso observa-se que apoTF apresenta uma
mobilidade menor e um padratildeo de bandas mais simples mas ainda sem uma definiccedilatildeo
adequada
A forma Fe2TF foi obtida mediante vaacuterios tratamentos com dadores de Fe (ver capiacutetulo
Material e Meacutetodos) Os resultados soacute se mostraram satisfatoacuterios atraveacutes da saturaccedilatildeo da
moleacutecula de TF com uma soluccedilatildeo de sulfato de amoacutenio feacuterrico provavelmente por causar uma
maior estabilidade da moleacutecula ao longo da sua separaccedilatildeo por focagem isoeleacutectrica com
elevadas voltagens pois segundo WELCHS (1990) a forma difeacuterrica da transferrina eacute mais
resistente agrave desnaturaccedilatildeo e ao calor do que a forma apoTF
48
Resultados e Discussatildeo
Estatildeo descritos pelo menos oito alelos no locus TF TFAl TFA2 TFB TFD1
TFD2 TFE TFF e TFG os mais comuns no gado europeu (Bos taurus) satildeo TFA
TFD1 TFD2 e TFE (JAMIESON 1965) No gado asiaacutetico e africano (Bos indicus) ocorrem
aleacutem das formas anteriores os alelos TFB e TFF
Na figura 3112 apresenta-se o proteinograma obtido com a utilizaccedilatildeo de amostras
saturadas com Fe Esta teacutecnica permitiu a separaccedilatildeo de TFD em TFD1 e TFD2 e a
detecccedilatildeo de todos os outros fenoacutetipos descritos em bovinos europeus Assim observaram-se
quatro alelos codominantes TFA TFD1 TFD2 e TFE
A expressatildeo fenotiacutepica dos alelos em homozigotia caracteriza-se pela presenccedila de dois
dupletos de bandas aparecendo a banda mais aciacutedica de cada dupleto com intensidade mais
fraca Os indiviacuteduos herozigoacuteticos podem apresentar ateacute oito bandas
Figura 3112 Fenoacutetipos de TF determinados por focagem isoeleacutectrica apartir de amostras saturadas com uma soluccedilatildeo de sulfato de amoacutenio feacuterrico
IGLESIAS (1989) detectou TFA e TFD nas cinco raccedilas de bovinos da Galiza o
variante TFE na raccedila Cachena espanhola e um outro variante raro TFR com mobilidade
mais lenta na raccedila Rubia Galega
bull QQ
A GC eacute uma proteiacutena plasmaacutetica que demonstra um elevado grau de heterogeneidade
geneacutetica em mamiacuteferos (FERRAND 1995)
A separaccedilatildeo de GC em focagem isoeleacutectrica seguida da utilizaccedilatildeo de immunoblotting
melhorou de forma consideraacutevel a capacidade de investigar a variaccedilatildeo desta proteiacutena em
49
Resultados e Discussatildeo
diferentes espeacutecies (JUNEJA et ai 1987 PENEDO amp JUNEJA 1989 STRATIL et ai 1990
KALAacuteB et ai 1990 STERN et ai 1992 VANKAN amp BELL 1992 FERRAND 1995)
Nas figuras 3113 e 3114 apresentam-se alguns dos fenoacutetipos obtidos na separaccedilatildeo
da GC por focagem isoeleacutectrica Verifica-se que em amostras tratadas com neuraminidase o
padratildeo de bandas se apresenta mais simplificado surgindo no entanto duas bandas (uma
mais baacutesica e uma mais aciacutedica) de natureza desconhecida Os padrotildees observados foram
interpretados como sendo determinados por dois alelos GCF e GCS
mdashGCF
S F S FS S FS F F S FS 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Figura 3113 Fenoacutetipos de GC determinados por focagem isoeleacutectrica amostras 1 8 9 e 10 tratadas com neuraminidase amostras 2 a 7 diluiacutedas em aacutegua bidestilada
S1 $ l S- -
FS S S S F S FS S FS F S
Figura 3114 Fenoacutetipos de GC determinados em amostras de plasma tratados com neuraminidase apoacutes focagem isoeleacutectrica
Nota-se a existecircncia de dois alelos codominantes GCF e GCS sendo o segundo
mais aciacutedico do que o primeiro
50
Resultados e Discussatildeo
32 - ANAacuteLISE FAMILIAR
A realizaccedilatildeo da anaacutelise familiar relativo ao conjunto de loci polimoacuterficos estudados
observa-se no estudo de 27 pares matildeefilho Esta situaccedilatildeo resulta da grande dificuldade
existente na obtenccedilatildeo de informaccedilatildeo sobre os machos
Os resultados apresentam-se nas tabelas 321 a 326 natildeo foi possiacutevel testar o
equiliacutebrio de Hardy-Weinberg devido ao reduzido tamanho da amostra bem como ao facto de
vaacuterios alelos ocorrerem em baixa frequecircncia
Refira-se que natildeo foi detectado qualquer caso de exclusatildeo matildeefilho
Tabela 321 Sistema CAII Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica em 27 pares matildeefilho Os valores esperados segundo o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg estatildeo indicados entre parecircntesis
Total
4 (32) 17
(122) 6
(116) 27
Tabela 322 Sistema NP Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica em 27 pares matildeefilho Os valores esperados segundo o equiliacutebrio de Hardy--Weinberg estatildeo indicados entre parecircntesis
Total
14
(114)
13
(156)
27
^ ^ ^ Filho
Matildee - ^ F
Fenoacutetipos
F f~ (11)
FS 2
(21)
S
Total 3
Fenoacutetipos
FS S
3
(21)
10 5
(61) (40)
1 5
(40) (76)
14 10
- v ^ ^ Filho Fenoacutetipos
Matildee - ^ H L
Fenoacutetipos
H 10 4
(77) (37)
L 5 8
(37) (119)
Total 15 12
51
Resultados e Discussatildeo
Tabela 323 Sistema MPI Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica em 26 pares matildeefilho Os valores esperados segundo o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg estatildeo indicados entre parecircntesis
^ Filho Fenoacutetipos Total
Matildee ^ ~ ^ A AB AC B BC c Fenoacutetipos
A 0 0 0 - - - 0
(00) (00) (00) (00)
AB 0 0 0 0 0 - 0
(00) (00) (00) (00) (00) (00)
AC 0 0 0 - 0 0 0
(00) (00) (00) (00) (00) (00)
B - 0 - 24 1 - 25
(00) (242) (06) (248)
BC - 0 0 1 0 0 1
(00) (00) (06) (06) (00) (12)
C - - 0 - 0 0 0
(00) (00) (00) (00)
Total 0 0 0 25 1 0 26
Tabela 324 Sistema ALB Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica em 27 pares matildeefilho Os valores esperados segundo o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg estatildeo indicados entre parecircntesis
^ ^ Filho Fenoacutetipos Total
M atilde e ^ ^ - s ^ ^ A AB AV B BV V
Fenoacutetipos
A 24 2 0 - - - 26
(251) (04) (02) (257)
AB 0 0 0 0 0 -
0
(04) (04) (00) (00) (00) (08)
AG 1 0 0 - 0 0 1
(02) (00) (02) (00) (00) (04)
B - 0 - 0 0 - 0
(00) (00) (00) (00)
BG - 0 0 0 0 0 0
(00) (00) (00) (00) (00) (00)
G - - 0 - 0 0 0
(00) (00) (00) (00)
Total 25 2 0 0 0 0 27
52
Resultados e Discussatildeo
Tabela 325 Sistema TF Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica em 27 pares matildeefilho Os valores esperados segundo o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg estatildeo indicados entre parecircntesis
Filho Fenoacutetipos Total
Matildee ^ A ADI AD2 AE Dl D1D2 DIE D2 D2E E
Fenoacutetipos
A 6
(51)
1
(14)
4
(21)
1
(03)
12
(89)
ADI 1 2 0 0 0 0 0 - - - 3
(14) (24) (06) (01) (04) (06) (01) (56)
AD2 2 0 5 0 - 0 - 2 0 - 9
(21) (06) (36) (01) (06) (08) (01) (79)
AE 0 0 0 0 - - 0 - 0 0 0
(03) (01) (01) (06) (01) (01) (00) (13) Dl 0
(04) 1
(01)
1
(02)
0
(00)
- 2
(07)
D1D2 - 0 1 - 0 0 0 0 0 - 1
(06) (06) (02) (10) (00) (02) (00) (26) DIE - 0 - 0 0 0 0 - 0 0 0
(01) (01) (00) (00) (02) (00) (00) (04)
D2 0
(08) 0
(02)
0
(03)
0
(01)
- 0
(14) D2E - - 0 0 - 0 0 0 0 0 0
(01) (01) (00) (00) (01) (02) (00) (05) E 0
(00) 0
(00)
0
(00)
0
(00)
0
(00)
Total 9 3 10 1 1 1 0 2 0 0 27
Tabela 326 Sistema GC Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica em 27 pares matildeefilho Os valores esperados segundo o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg estatildeo indicados entre parecircntesis
- - ^ F i l h o Fenoacutetipos Total
Matildee ^ ^ 1 2-1 2
Fenoacutetipos
1 17 2 19
(156) (31) (187)
2-1 5 2 0 7
(31) (38) (06) (75)
2 _ 1 0 1
(06) (01) (07)
Total 22 5 0 27
53
Resultados e Discussatildeo
33 - ANAacuteLISE POPULACIONAL LOCUS A LOCUS
Neste capiacutetulo faz-se a anaacutelise populacional dos loci polimoacuterficos e ainda dos loci
PEPB e DIA para os quais natildeo se detectou variaccedilatildeo na raccedila Barrosatilde A sua inclusatildeo justifica-
-se pelo facto de serem polimoacuterficos noutras raccedilas bovinas ou em espeacutecies aparentadas
bull PEPB
O locus PEPB revelou-se monomoacuterfico nas trecircs populaccedilotildees de bovinos de raccedila
Barrosatilde e Minhota tendo sido detectado um uacutenico produto geacutenico PEPB2 (observado um
indiviacuteduo heterozigoacutetico da raccedila Minhota) No entanto este locus eacute referido como polimoacuterfico
em raccedilas bovinas criadas no Brasil onde se detectaram dois alelos codominantes PEPB1 e
PEPB2 (DEL LAMA et ai 1992)
O alelo PEPB2 estaacute fixado nas raccedilas de origem europeia incluindo as estudadas neste
trabalho excepto nas raccedilas italianas Marchigiana e Chianina nas quais PEPB1 apresenta
frequecircncias geacutenicas entre 011 e 014 (tabela 331)
Tabela 331 Frequecircncias geacutenicas de PEPB em vaacuterias raccedilas bovinas
N
Frequecircncias geacutenicas N PEPB1 PEPB2 Referecircncia
Barrosatilde inscrita 141 - 100 Este trabalho
Barrosatilde natildeo inscrita 153 - 100 t i
Minhota 62 001 plusmn0003 099 plusmn 0003 ec
Blonde dAquitaine 13 - 100 DEL LAMAetal 1992)
Charolesa 118 - 100 laquo
Chianina 83 014 plusmn003 086 plusmn 003 t t
Hereford 79 - 100 et
Frisia 125 - 100 t t
Jersey 139 - 100
Limousine 24 - 100
Marchigiana 85 011 plusmn002 089 plusmn 002 te
Simmental 75 - 100 t t
54
Resultados e Discussatildeo
bull DIA
Pela anaacutelise da tabela 332 verifica-se natildeo existir variaccedilatildeo geneacutetica neste locus nas
raccedilas bovinas apresentadas estando fixado o alelo DIAS os resultados obtidos estatildeo de
acordo com os jaacute publicados por outros autores (GONZALEZ et ai 1987 IGLESIAS 1989) Por
outro lado nas populaccedilotildees de buacutefalos ocorre um segundo alelo DIAF com frequecircncias
entre 019 e 021
Tabela 332 Frequecircncias geacutenicas de DIA em vaacuterias populaccedilotildees de raccedilas bovinas e buacutefalos
Frequecircncias geacutenicas
N DIAF DIAS Referecircncia
Portugal
Barrosatilde inscrita 141
Barrosatilde natildeo inscrita 153
Minhota 62
Espanha
Cachena 71
Caldelana 60
Frieiresa 33
Limiana 39
Rubia Gallega 168
Vianesa 40
Sayaguesa (Zamora) 147
Morucha (Salamanca) 101
Alistana Sanabresa 157
Blanca Cacerena 62
Caacuterdena Andaluza 25
Asturiana de los Vallegraves 127
Asturiana de la Montana 106
Bulgaacuteria
Buacutefalo 122
Murrah (Buacutefalo) 51
raquo IGLESIAS (1989)
- 100 Este trabalho
- 100
- 100 a
- 100 IGLESIAS (1989)
- 100
- 100
- 100
- 100
- 100
- 100 GONZALEZ et al (19
- 100
- 100 st
- 100 st
- 100
- 100
- 100
019 + 00 081 plusmn00 MAKAVEEV(1984
021 plusmn00 079 plusmn 00 laquo
55
Resultados e Discussatildeo
bull HB
Os resultados obtidos no estudo de HB permitiram distinguir dois fenoacutetipos definidos
por dois alelos HBA e HBB (tabela 333)
Tabela 333 Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica de HB em populaccedilotildees das raccedilas Barrosatilde e Minhota Os valores esperados de acordo com o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg estatildeo indicados entre parecircntesis
Fenoacutetipos N HBA HBAB HBB
Barrosatilde inscrita 141 141
Barrosatilde natildeo inscrita 153 153
Minhota 62 56 6 0
(561) (58) (01)
As frequecircncias geacutenicas das raccedilas estudadas bem como outras jaacute publicadas referentes a
vaacuterias raccedilas bovinas europeias e a duas espeacutecies de buacutefalos encontram-se discriminadas na
tabela 334
A elevada frequecircncia do alelo HBA nas raccedilas estudadas (fixado na raccedila Barrosatilde)
situam-nas juntamente com outras raccedilas bovinas do centro e sul da Europa onde este alelo
ocorre com frequecircncias entre 080-098 (VICENTE 1978) Nas restantes raccedilas europeias
HBA ocorre com uma ampla margem de variaccedilatildeo (038 - 100) apresentando-se quase
sempre como o alelo mais frequente
No caso dos buacutefalos observa-se uma inversatildeo nos valores das frequecircncias geacutenicas
sendo o alelo HBB o mais frequente
A presenccedila de HBB nos bovinos europeus apesar de em baixa frequecircncia pode ser
indicativo de uma origem a partir de raccedilas asiaacuteticas ou africanas jaacute que eacute nestes continentes
que este alelo ocorre com frequecircncia mais elevadas as frequecircncias geacutenicas mais elevadas estatildeo
descritas no gado zebu da Aacutefrica (BRAEND 1971 VICENTE 1978)
56
Resultados e Discussatildeo
Tabela 334 Frequecircncias geacutenicas de HB em vaacuterias populaccedilotildees de raccedilas bovinas e buacutefalos
N
Frequecircncias geacutenicas
N HBA HBB Referecircncia
Portugal
Barrosatilde inscrita 141 100 - Este trabalho
Barrosatilde natildeo inscrita 153 100 -
Minhota 62 095 plusmn 002 005 plusmn 002
Mertolenga 147 093 plusmn 002 007 plusmn 002 KTOD et ai (1980)
Alentejana 155 096 plusmn 001 004 plusmn001 IacuteIacute
Mirandesa 107 099+001 001 plusmn001 NOBRE (S data)
Espanha
Cachena 71 091 + 002 009 plusmn 002 IGLESIAS (1989)
Caldelana 60 097 plusmn 002 003 plusmn 002
Frieiresa 33 095 plusmn 003 005 plusmn 003
Limiana 39 090 plusmn 003 010 plusmn003
Rubia Gallega 168 093 plusmn 001 007 plusmn001 ce
Vianesa 40 098 plusmn 002 002 plusmn002
Sayaguesa (Zamora) 147 083 plusmn002 017 plusmn002 GONZALEZ et al ( 1987)
Morucha (Salamanca) 101 084 plusmn 003 016 plusmn003 ce
Alistana Sanabresa 157 099 plusmn 001 001 plusmn001
Blanca Cacerefia 62 071 plusmn 004 029 plusmn 004 laquo
Caacuterdena Andaluza 25 096 plusmn 003 004 plusmn 003 IacuteIacute
Asturiana de los Vallegraves 127 091 plusmn002 009 plusmn002
Pirenaica 383 084 plusmn 001 016 plusmn001 VICENTE (1978)
Tudanca 42 065 plusmn 005 035 plusmn 005 laquo
Morena del N O 25 100 -
Frisona 97 100 - laquo
Asturiana de la Montaria 106 079+003 021 plusmn003
De Lidia 124 079 plusmn 003 021 plusmn003 KlDDeacutetal (1980)
Retinta 164 081 plusmn002 019 plusmn002
Itaacutelia
Chianina 264 096 plusmn 001 004 plusmn 001 CARENZiera (1970)
Marchigiana 112 099 plusmn001 001 plusmn001
Bulgaacuteria
Sofia Brown 173 089 plusmn 002 011 plusmn002 MAKAVEEV (1970)
Buacutefalo 77 009 plusmn 002 091 plusmn002 MAKAVEEV(1984)
Murrah (Buacutefalo) 51 015 plusmn004 085 plusmn 004 ce
G Bretanha
Jersey 467 038 plusmn 002 062 plusmn 002 LARSENefa (1974)
in IGLESIAS (1989)
57
Resultados e Discussatildeo
A frequecircncia obtida para HBB na raccedila Minhota (005) aproxima-a das raccedilas do sul da
Europa onde este alelo ocorre com uma frequecircncia de aproximadamente 01 Por outro lado a
completa ausecircncia de HBB na raccedila Barrosatilde eacute um resultado interessante mas para o qual natildeo
eacute possiacutevel fornecer actualmente uma explicaccedilatildeo satisfatoacuteria
CAII
A distribuiccedilatildeo dos fenoacutetipos observados para o locus CAII apresenta-se na tabela
335
Tabela 335 Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica de CAU em populaccedilotildees das raccedilas Barrosatilde e Minhota Entre parecircntesis indicam-se os valores esperados de acordo com o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg
Fenoacutetipos N CA F CAFS CAS
Barrosatilde inscrita 141 17 58 66
(149) (622) (639)
Barrosatilde natildeo inscrita 153 20 71 62
(200) (710) (620)
Minhota 62 3 13 46
(14) (162) (444)
x2
0651 1 0420
0000 1 0995
Os valores do teste de 2 nas populaccedilotildees de raccedila Barrosatilde demonstram natildeo haver
desvios significativos ao equiliacutebrio de Hardy-Weinberg apesar de se observar um ligeiro
excesso de homozigoacuteticos F na populaccedilatildeo de raccedila Barrosatilde (inscrita) Para a raccedila Minhota natildeo
foi possiacutevel testar o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg
Na tabela 336 apresentam-se as frequecircncias geacutenicas de CAII nas populaccedilotildees
estudadas bem como as publicadas por outros autores
O locus CAII apresenta-se polimoacuterfico na maior parte das populaccedilotildees bovinas
europeias sendo o alelo CAIIS o que ocorre com frequecircncia mais elevada
58
Resultados e Discussatildeo
Tabela 336 Frequecircncias geacutemeas de CAU em vaacuterias populaccedilotildees de raccedilas bovinas e de buacutefalos
N
Frequecircncias geacutenicas N CAS CAF Referecircncia
Portugal
Barrosatilde inscrita 141 068 plusmn 003 032 plusmn 003 Este trabalho
Barrosatilde natildeo inscrita 153 064+003 036 plusmn 003
Minhota 62 085 plusmn 003 015+003 Iacute Iacute
Mertolenga 147 085 plusmn 002 015+002 Kn)Deiacutea(1980)
Alentejana 155 091 plusmn 002 009 plusmn 002
Mirandesa 107 099 + 001 001+001 NOBRE (S data)
Espanha
Cachena 71 077 + 004 023 plusmn 004 IGLESIAS (1989)
Caldelana 60 096 plusmn 002 004 plusmn 002 ce
Frieiresa 33 094 + 003 006 plusmn 003
Limiana 39 083 + 004 017 plusmn 004
Rubia Gallega 168 089 plusmn 002 011+002
Vianesa 40 086 + 004 014 plusmn 004
Sayaguesa 147 072 plusmn 003 028+003 GONZALEZ eacutetal (1987)
Morucha 101 072 plusmn 003 028 plusmn 003 a
Alistana Sanabresa 157 092 plusmn 002 008+002 iacute iacute
Blanca Cacerena 62 067 plusmn 004 033 plusmn 004 IacuteIacute
Caacuterdena Andaluza 25 100
Asturiana de los Vallegraves 127 087 plusmn 002 013+002 laquo
Asturiana de la Montaria 106 077 plusmn003 023 plusmn 003 IacuteIacute
Tudanca 42 076 plusmn 005 024 plusmn 005 VICENTE (1978)
Morena del NO 25 092 plusmn 004 008 plusmn 004
De Lidia 124 061+003 039 plusmn 003 KjDDetal (1980)
Retinta 164 065 + 003 035+003 iacuteiacute
Bulgaacuteria
Buacutefalo 263 007 + 001 093+001 MAKAVEEV(1984)
Murran (Buacutefalo) 51 020 plusmn 004 080 plusmn 004 laquo
Alemanha
Frisia 550 083 plusmn 001 017 + 001 THTNNES eacutetal (1976)
Suiacuteccedila
Simmental 1039 079 + 001 021+001 KAgraveSTLIeacutetal (1980)
Castanha Suiacuteccedila 546 087 plusmn 001 013+001
Friburg 223 084 + 002 016+002
in IGLESIAS (1989)
59
Resultados e Discussatildeo
As frequecircncias aleacutelicas de CAIPS e CAIPF nas raccedilas Cachena espanhola e Barrosatilde
portuguesa satildeo idecircnticas o que poderaacute eventualmente indicar estar-se em presenccedila de uma soacute
raccedila com designaccedilotildees diferentes nos dois paiacuteses Esta hipoacutetese eacute reforccedilada pelo facto de natildeo
haver diferenccedilas significativas entre dados morfomeacutetricos obtidos nas duas raccedilas (LEAL 1995)
Nos buacutefalos observa-se mais uma vez uma inversatildeo nas frequecircncias dos dois alelos do
locus CAII em relaccedilatildeo aos bovinos sendo CAF o mais frequente com valores situados entre
080 e 093
bull NP
Pela anaacutelise das tabelas 337 e 338 verifiacuteca-se a presenccedila dos dois alelos descritos
neste locus nas vaacuterias raccedilas bovinas sendo NPL o mais frequente nas raccedilas europeias (052 e
099) Observa-se uma grande similaridade entre os valores das frequecircncias geacutenicas o que natildeo
permite diferenciar as raccedilas estudadas neste trabalho das restantes
Tabela 337 Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica de NP em populaccedilotildees das raccedilas Barrosatilde e Minhota
N
Fenoacutetipos
N NP H NPL
Barrosatilde inscrita 141 69 72
Barrosatilde natildeo inscrita 153 55 98
Minhota 62 19 43
60
Resultados e Discussatildeo
Tabela 338 Frequecircncias geacutenicas para NP em vaacuterias populaccedilotildees e raccedilas bovinas
N
Frequecircncias geacutenicas
N NPH NPL Referecircncia
Portugal
Barrosatilde inscrita 141 029 plusmn 003 071 plusmn 003 Este trabalho
Barrosatilde natildeo inscrita 153 020 plusmn 002 080 plusmn 002 cc
Minhota 62 017 + 004 083 + 004
Espanha
Cachena 71 020 plusmn 003 080 plusmn 003 IGLESIAS (1989)
Caldelana 60 013+003 087 plusmn 003 t t
Frieiresa 33 011+004 089 plusmn 004
Limiana 39 008 plusmn 003 092 plusmn 003
Rubia Gallega 168 015+002 085 plusmn 002
Vianesa 40 013 + 004 087 plusmn 004 t i
Sayaguesa 147 014 + 002 086 plusmn 002 GONZALEZ et ai ( 1987)
Morucha 101 020 plusmn 003 080 plusmn 003
Alistana Sanabresa 157 001+001 099 + 001
Blanca Cacerena 62 048 plusmn 005 052 plusmn 005 laquo
Caacuterdena Andaluza 25 004 plusmn 003 096 plusmn 003 IacuteIacute
Asturiana de los Vallegraves 127 028 plusmn 003 072 plusmn 003
Asturiana de la Montana 106 026 plusmn 003 074 plusmn 003
Beacutelgica
Charolesa 130 026 plusmn 003 074 + 003 ANSAY amp HANSET (1972)
Frisia 91 006 plusmn 002 094 plusmn 002 t t
in IGLESIAS (1989)
MPI
A distribuiccedilatildeo dos fenoacutetipos observados para o locus MPI apresenta-se na tabela 339
Das trecircs populaccedilotildees estudadas apenas a raccedila Minhota apresenta valores observados
proacuteximos dos valores esperados segundo o formalismo de Hardy-Weinberg Por outro lado
apesar de natildeo ter sido possiacutevel testar o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg nas restantes populaccedilotildees
a aparente diferenccedila entre valores observados e esperados poderaacute dever-se a um excesso de
indiviacuteduos homozigoacuteticos para MPIC Este resultado poderaacute estar relacionado com o
processo de amostragem ou com outras causas como o acasalamento entre indiviacuteduos
61
Resultados e Discussatildeo
aparentados a existecircncia de sub-populaccedilotildees de tamanho pequeno ou ainda a um reduzido
nuacutemero de machos reprodutores
Tabela 339 Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica de MPI em populaccedilotildees das raccedilas Barrosatilde e Minhota Entre parecircntesis indicam-se os valores esperados de acordo com o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg
Fenoacutetipos N MPIA MPIAB MPIAC MPIB MPIBC MPIC
Barrosatilde inscrita 138 - - - 131 6 1
(1301) (78) (01)
Barrosatilde natildeo inscrita 1 5 2 - - - 147 4 1
(1460) (59) (01)
Minhota 61 0 3 0 56 2 0
(00) (29) (01) (561) (19) (00)
A anaacutelise da tabela 3310 permite verificar que MPIB e MPIC ocorrem nas duas
raccedilas de bovinos estudadas sendo MPIB o alelo mais comum nas trecircs populaccedilotildees A
ocorrecircncia de MPI A na raccedila Minhota contraria o descrito por ANSAY (1973) quando afirma
a exclusividade do fenoacutetipo AB na raccedila Charolesa
Tabela 3310 Frequecircncias geacutenicas de MPI nas populaccedilotildees estudadas
N
Frequecircncias geacutenicas
N MPPA MPPB MPIC
Barrosatilde inscrita 138 - 097 + 001 003+001
Barrosatilde natildeo inscrita 152 - 098 + 001 002+001
Minhota 61 002 plusmn 001 096 plusmn002 002 plusmn 001
A informaccedilatildeo disponiacutevel sobre este marcador em anteriores trabalhos de anaacutelise
geneacutetica em bovinos eacute quase inexistente Tal poderaacute dever-se agraves dificuldades de visualizaccedilatildeo
encontradas na sua fenotipagem por electroforese convencional A detecccedilatildeo de MPI estaacute
descrita em tecidos musculares e em leucoacutecitos neste trabalho utilizaram-se eritroacutecitos para o
estudo de variaccedilatildeo geneacutetica desta proteiacutena mas eacute provaacutevel que a sua expressatildeo ocorra apenas
na fracccedilatildeo leucocitaacuteria (natildeo separada) o que explicaria precisamente a sua fraca actividade
62
Resultados e Discussatildeo
ALB
A distribuiccedilatildeo dos fenoacutetipos observados para o locus ALB apresenta-se na tabela
3311
Apesar de natildeo ter sido possiacutevel testar o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg todas as
amostras estudadas mostram desvios muito reduzidos entre valores observados e esperados
Tabela 3311 Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica de ALB em populaccedilotildees das raccedilas Barrosatilde e Minhota Entre parecircntesis indicam-se os valores esperados de acordo com o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg
N
Fenoacutetipos N ALBA ALBAB ALBB ALBBV ALBAV ALB V
Barrosatilde inscrita 142 137 3 - - 2 -(1370) (30) (00) (00) (20) (00)
Barrosatilde natildeo inscrita 153 145 5 1 - 2 -(1440) (68) (01) (01) (20) (00)
Minhota 62 59
(590)
3 (30) (00)
Na tabela 3312 estatildeo discriminadas as frequecircncias geacutenicas estimadas para as
populaccedilotildees estudadas bem como as de outras populaccedilotildees de bovinos da Europa e de buacutefalos
da Bulgaacuteria
Verifica-se que ALBA eacute o alelo mais comum encontrando-se aparentemente fixado
em vaacuterias raccedilas bovinas de origem europeia
Como jaacute referido para HB a presenccedila de ALBB nas raccedilas europeias parece
relacionar-se com a sua localizaccedilatildeo geograacutefica verificando-se que de uma maneira geral a sua
frequecircncia aumenta agrave medida que nos aproximamos do sul da Europa e de Aacutefrica eacute no gado
zebu africano que este alelo ocorre com frequecircncias mais elevadas variando entre 030 e 060
(VICENTE 1978) Assim a presenccedila de ALBB no gado europeu poderaacute indicar a passagem
pela Europa de bovinos oriundos de Aacutefrica (CECCHINI amp Nus 1986) Eacute de notar que apenas a
raccedila Minhota e algumas das restantes raccedilas da Peniacutensula Ibeacuterica natildeo apresentam ALBB
63
Resultados e Discussatildeo
Tabela 3312 Frequecircncias geacutenicas de ALB em vaacuterias populaccedilotildees de raccedilas bovinas e em buacutefalos
Frequecircncias geacutenicas
N ALBA (F) ALBB (S) ALBV Referecircncia
Portugal
Barrosatilde inscrita 142 098 + 001 001 plusmn 001 001 plusmn001 Este trabalho
Barrosatilde natildeo inscrita 153 097 + 001 002+001 001 plusmn001
Minhota 62 098 plusmn 001 - 002 plusmn 001
Mertolenga 147 084 plusmn 002 016 + 002 - KlDDetal (1980)
Alentejana 155 094+001 006 plusmn 001 -
Mirandesa 106 094 + 002 006 plusmn 002 - NOBRE (S data)
Espanha -
Cachena 71 098 + 001 002+001 - IGLESIAS (1989)
Caldelana 60 098 plusmn 001 002 + 001 -
Frieiresa 33 100 - - raquo
Limiana 39 097 + 002 003 plusmn 002 -
Rubia Gallega 201 099 plusmn 000 001 plusmn000 -
Vianesa 40 093 + 003 007 + 003 -
Sayaguesa 147 096 plusmn001 004 plusmn 001 - GONZALEZ et al (1987)
Moracha 101 089 plusmn 002 011+002 -
Alistaria Sanabresa 157 090 plusmn 002 010 plusmn002 -
Blanca Cacerena 62 056 plusmn 005 044 plusmn 005 -
Caacuterdena Andaluza 25 100 - -
Asturiana de los Vallegraves 127 099 + 001 001 plusmn001 -
Asturiana de la Montana 106 099 plusmn001 001 plusmn001 -
Pirenaica 265 092 + 001 008 plusmn001 - VICENTE (1978)
Tudanca 42 100 - -
Morena del N O 25 092 + 004 008 plusmn 004 -
Frisona 97 100 - -
De Lidia 124 100 - - KIDDeacutetal (1980)
Retinta 164 097 + 001 003 plusmn001 -
Itaacutelia
Chinina 264 089 + 001 011 plusmn001 - CARENZIeacutetal (1970)
Marchigiana 124 074 + 003 026 plusmn 003 -
Beacutelgica
Pied vermelha Este-Flandern 503 100 - - BOUQUET amp VAN de WEGHE (1972)
Vermelha Oeste-Flandern 155 100 - -
Pied preta 174 100 - -
Pied vermelha-Campine 265 100 - -
w IGLESIAS (1989)
(Continua)
64
Resultados e Discussatildeo
Tabela 3312 Frequecircncias geacutenicas de ALB em vaacuterias populaccedilotildees de raccedilas bovinas e de buacutefalos (continuaccedilatildeo)
Frequecircncias geacutenicas N ALBA (F) ALBB (S) ALBV Referecircncia
Bulgaacuteria
Sofia Brow 170 096+001 004 + 001 - M A K A V E E V ( 1 9 7 0 )
Buacutefalo 225 047 plusmn 002 053 plusmn 002 - M A K A V E E V ( 1 9 8 4 )
Murrah (Buacutefalo) 76 012+003 088 plusmn 003 -
G Bretanha
Charolesa 99 084 plusmn 003 016 + 003 - SPOONER amp OLIVER (1969)
Frisia 1422 100 - -
Hereford 215 099 plusmn 001 001+001 -
Jersey 217 100 - -
laquo IGLESIAS (1989)
Neste trabalho descreve-se tambeacutem o alelo ALBV com uma frequecircncia de 001 e
002 nas raccedilas Barrosatilde e Minhota respectivamente Este alelo natildeo se encontra descrito em
qualquer raccedila europeia podendo a sua detecccedilatildeo estar relacionada com a capacidade resolvente
da teacutecnica de focagem isoeleacutectrica utilizada na separaccedilatildeo de ALB
TF
A transferrina eacute provavelmente o mais informativo dos sistemas polimoacuterficos estudados
em virtude do nuacutemero de alelos que apresenta
A distribuiccedilatildeo dos fenoacutetipos observados para o locus TF apresenta-se na tabela 3313
E possiacutevel verificar a existecircncia de equiliacutebrio de Hardy-Weinberg em todas as populaccedilotildees
estudadas
Da anaacutelise das frequecircncias geacutenicas expressas na tabela 3314 verifica-se que este locus
apresenta quatro produtos geacutenicos na maioria das raccedilas europeias sendo os alelos TFA e
TFD (incluindo os subtipos TFD1 e TFD2) os que apresentam frequecircncias mais elevadas
(027 a 092 para o alelo TFA e 026 a 073 para o alelo TFD)
Observa-se tambeacutem que a frequecircncia de TFD2 nas raccedilas estudadas eacute mais elevada do
que a de TFD1 como ocorre na maioria das raccedilas ibeacutericas
65
Resultados e Discussatildeo
No que se refere a TFE verifica-se que a sua frequecircncia eacute relativamente baixa nas
raccedilas europeias (001 e 022) e estaacute mesmo ausente em quase todas as raccedilas da regiatildeo da
Galiza (com excepccedilatildeo da raccedila Cachena espanhola e Rubia Gallega) e na raccedila Minhota Note-se
a grande semelhanccedila entre os valores de frequecircncias geacutenicas deste alelo na raccedila Cachena
espanhola (005) e nas populaccedilotildees de raccedila Barrosatilde (004 e 003) o que mais uma vez sugere
uma grande proximidade entre as duas Apesar de ocorrer em baixa frequecircncia nos bovinos
europeus a presenccedila de TFE nestas raccedilas pode indicar uma proveniecircncia asiaacutetica ou africana
pois eacute nestes continentes que aquele alelo eacute mais comum (BRAEND 1971)
66
Resultados e Discussatildeo
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Resultados e Discussatildeo
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Resultados e Discussatildeo
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69
Resultados e Discussatildeo
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A distribuiccedilatildeo dos fenoacutetipos observados para o locus GC apresenta-se na tabela 3315
A sua anaacutelise permite verificar a existecircncia de diferenccedilas entre os valores observados e
esperados para raccedila Barrosatilde (populaccedilatildeo inscrita no Livro Genealoacutegico) Este desvio ao
equiliacutebrio de Hardy-Weinberg deve-se agrave existecircncia de um excesso de homozigoacuteticos
sugerindo assim a ocorrecircncia de uma possiacutevel subestruturaccedilatildeo na populaccedilatildeo
Nas restantes amostras estudadas natildeo foi possiacutevel aplicar o teste de Contudo a
diferenccedila entre valores observados e esperados de acordo com o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg
eacute praticamente inexistente na populaccedilatildeo Barrosatilde natildeo inscrita e pouco acentuada na raccedila
Minhota
Tabela 3315 Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica de GC em populaccedilotildees das raccedilas Barrosatilde e Minhota Entre parecircntesis indicam-se os valores esperados de acordo com o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg
Fenoacutetipos N GCS GCFS GCF
Barrosatilde inscrita 142 98 35 8
(945) (419) (45)
Barrosatilde natildeo inscrita 153 109 40 4
(1087) (406) (37)
Minhota 62 54 5 3
(514) (101) (04)
x2
3913 1 0048
A distribuiccedilatildeo das frequecircncias geacutenicas apresentada na tabela 3316 mostra que GCS eacute
o alelo mais comum nas raccedilas europeias (com excepccedilatildeo da raccedila Frisia da Sueacutecia) As raccedilas
estudadas neste trabalho tecircm frequecircncias aleacutelicas para este locus que as aproximam das raccedilas
espanholas
70
Resultados e Discussatildeo
Tabela 3316 Frequecircncias geacutenicas de GC em vaacuterias populaccedilotildees de raccedilas bovinas
Frequecircncias geacutenicas
N GCF(ouA) GCS(ouB) GCC Referecircncia
Portugal
Barrosatilde inscrita
Barrosatilde natildeo inscrita
Minhota
Alentejana
Mirandesa
Espanha
De Lidia
Frisona
Beacutelgica
Branca e azul
Flemish vermelha
Campine vermelha e branca
Preta e branca
Flemish branca e vermelha
Sueacutecia
Vermelha e Branca
Frisia
141 018 plusmn0023
153 016 plusmn002
62 009 plusmn 003
028 plusmn 004
97 020 plusmn 003
1306 008 plusmn001
124 015 plusmn002
2323 031 plusmn001
431 016 plusmn001
299 012 plusmn001
299 019 plusmn002
140 006 plusmn 001
1030 039 plusmn001
273 079 plusmn 002
082 plusmn 002
084 plusmn 002
091 plusmn003
072 plusmn 004
080 plusmn 003
092 plusmn 001
085 plusmn 002
069 plusmn 001
084 plusmn 001
088 plusmn 001
081 plusmn002
065 plusmn 003
061 plusmn001
021 plusmn002
029 plusmn 003
Este trabalho
CUNHA (1994)
NOBRE (S data)
PIEDRAFUA et ai (1984)
VAN de WEGHE et ai (1982)
GAHNE(1963)
in PIEDRAFUA et ai (1984)
71
Resultados e Discussatildeo
34 - ANAacuteLISE POPULACIONAL CONJUNTA
341 - Diversidade geneacutetica na raccedila Barrosatilde
As estimativas da variabilidade geneacutetica das populaccedilotildees de bovinos das raccedilas Barrosatilde e
Minhota efectuaram-se considerando apenas 6 loci polimoacuterficos HB CAII MPI ALB TF e
GC
Tabela 341 Estimativa da variabilidade geneacutetica (6 loci) atraveacutes dos valores de heterozigotia observada (Ho) e esperada (He) nas populaccedilotildees estudadas
Barrosatilde inscrita Barrosatilde natildeo inscrita Minhota Locus
Ho He Ho He Ho He
HB 0000 0000 0000 0000 0097 0093
CAH 0411 0441 0464 0464 0210 0262
MPI 0043 0056 0026 0039 0082 0080
ALB 0035 0035 0046 0058 0048 0048
TF 0603 0590 0556 0595 0694 0638
GC 0248 0297 0261 0265 0081 0163
Os resultados expressos na tabela 341 mostram em geral a ausecircncia de diferenccedilas
significativas entre os valores de heterozigotia observada (Ho) e heterozigotia esperada (He)
para os loci estudados Deve contudo notar-se que na raccedila Minhota e quanto ao locus GC o
valor de He eacute aproximadamente o dobro da Ho Nos restantes loci o ligeiro desvio observado
entre Ho e He sugere em geral um deacutefice de heterozigoacuteticos
Nas duas populaccedilotildees de raccedila Barrosatilde os sistemas TF e CAII satildeo os que apresentam
valores de heterozigotia mais elevados Pelo contraacuterio os loci MPI e ALB mostram valores de
heterozigotia baixos possivelmente devido ao excesso de homozigoacuteticos (MPI B e ALB A)
detectados nas trecircs populaccedilotildees
Na tabela 342 apresentam-se os valores do nuacutemero meacutedio de alelos por locus (ria)
percentagem de loci polimoacuterficos (P) heterozigotia meacutedia observada (Ho) e heterozigotia
esperada (He) nas populaccedilotildees de bovinos estudados Estes valores devem ser interpretados
72
Resultados e Discussatildeo
tendo em conta o facto de os 6 loci investigados serem polimoacuterficos em pelo menos uma
populaccedilatildeo
Tabela 342 Variabilidade geneacutetica detectada em trecircs populaccedilotildees de bovinos atraveacutes da anaacutelise de 6 loci polimoacuterficos N - efectivo meacutedio estudado por locus na - nuacutemero meacutedio de alelos por locus P - proporccedilatildeo de loci polimoacuterficos Ho - heterozigotia observada He - heterozigotia meacutedia esperada Entre parecircntesis indicam-se os valores do desvio padratildeo
Raccedila Populaccedilatildeo N na P Ho He
Barrosatilde inscrita 1407 233 833 0223 0237
(06) (042) (0100) (0100)
Barrosatilde natildeo inscrita 1528 233 833 0226 0237
(02) (042) (0098) (0101)
Minhota 618 233 1000 0202 0214
(02) (021) (0101) (0090)
A sua anaacutelise permite verificar em primeiro lugar a ocorrecircncia de uma grande
semelhanccedila entre os valores de H nas duas raccedilas estudadas Barrosatilde e Minhota revelando a
existecircncia de uma variabilidade geneacutetica idecircntica nas trecircs populaccedilotildees de bovinos Observa-se
tambeacutem que os valores de heterozigotia meacutedia observada (Ho) natildeo diferem significativamente
dos valores de heterozigotia esperados (He) nas trecircs populaccedilotildees sendo o valor mais elevado o
encontrado na populaccedilatildeo de raccedila Barrosatilde (237)
Os elevados valores de P (833 na raccedila Barrosatilde e 100 na raccedila Minhota) resultam
do facto de apenas se terem utilizado loci polimoacuterficos nesta anaacutelise e o nuacutemero meacutedio de
alelos por locus (na) eacute igual nas trecircs populaccedilotildees estudadas (233)
A tabela 343 apresenta estimativas de FB Frr e FST para as trecircs populaccedilotildees de
bovinos Os valores de Fis indicam a existecircncia de uma acentuada deficiecircncia de
heterozigoacuteticos nos loci MPI e GC Nos restantes loci verifica-se por um lado a tendecircncia
para um excesso de heterozigoacuteticos nos loci HB e TF (com valores de -0051 e -0021
respectivamente) e por outro lado para uma ligeira deficiecircncia de heterozigoacuteticos nos loci
CAII e ALB (com valores de 0066 e 0072 respectivamente) A meacutedia ponderada de FiS
mostra uma deficiecircncia de heterozigoacuteticos de 48
73
Resultados e Discussatildeo
Tabela 343 Distribuiccedilatildeo relativa da diversidade geneacutetica nas trecircs populaccedilotildees de bovinos Hs-heterozigotia intrapopulacional HT-heterozigotia total Valores das estatiacutesticas F para 6 loci analisados
Locus H s Hx Fis FIT FST
HB 0030 0031 -0051 -0016 0033
CAII 0387 0404 0066 0104 0041
MPI 0058 0059 0130 0133 0004
ALB 0046 0047 0072 0075 0004
TF 0605 0627 -0021 0015 0036
GC 0241 0244 0183 0193 0012
Meacutedia 0228 0235 0048 0078 0031
As estimativas de FST indicam a existecircncia de um baixo grau de diferenciaccedilatildeo
populacional nos bovinos estudados Os valores de FST para os 6 loci analisados podem
considerar-se baixos (entre 0004 e 0041) apresentando uma meacutedia ponderada de 0031
Assim soacute uma pequena parte da diversidade geneacutetica (31) se deve a diferenccedilas entre as
populaccedilotildees sendo muito maior a diversidade dentro de cada populaccedilatildeo do que entre as
populaccedilotildees
Os baixos valores de FST encontrados para os loci MPI e ALB resultam de frequecircncias
elevadas de MPIB e ALBA respectivamente e traduzem uma grande homogeneidade entre
as raccedilas bovinas estudadas natildeo se detectando subestruturaccedilatildeo populacional
342 - Comparaccedilatildeo com outras raccedilas ibeacutericas
Tendo em conta o pequeno nuacutemero de loci comuns a este e a outros estudos
estimaram-se diferentes valores de heterozigotia meacutedia consoante o nuacutemero de loci de que se
dispunha Na tabela 344 e 345 apresentam-se valores de heterozigotia meacutedia para as
diferentes raccedilas obtidos a partir de quatro (FF) e cinco loci (FF+) respectivamente bem como
os valores de na P e os respectivos desvios padratildeo em vaacuterias raccedilas de bovinos ibeacutericos
A diversidade geneacutetica do bovino Barrosatilde avaliada pela taxa meacutedia de heterozigotia
(0281-0272 e 0249-0260 para 5 e 4 loci respectivamente) parece ocupar uma posiccedilatildeo
74
Resultados e Discussatildeo
intermeacutedia no seio das raccedilas ibeacutericas Tambeacutem o grau de variabilidade geneacutetica nos bovinos
avaliado por paracircmetros como o nuacutemero meacutedio de alelos por locus e a proporccedilatildeo de loci
polimoacuterficos (P) demonstra que as raccedilas estudadas neste trabalho ocupam uma posiccedilatildeo
intermeacutedia quando comparadas com outras raccedilas ibeacutericas
A anaacutelise das tabelas 344 e 345 mostra que todas as medidas de diversidade geneacutetica
(H P e de na) apresentam valores idecircnticos Esta semelhanccedila permite supor que o processo de
domesticaccedilatildeo iniciado haacute menos de 10000 anos natildeo levou a uma grande diferenciaccedilatildeo
geneacutetica entre as raccedilas pelo menos relativamente aos marcadores geneacuteticos estudados neste
trabalho Desta forma verifica-se que as principais diferenccedilas entre as raccedilas resultam de
pequenas alteraccedilotildees das suas frequecircncias geacutenicas provavelmente causadas pelo baixo nuacutemero
de animais destinados agrave reproduccedilatildeo (mais marcado nos machos) e pelos cruzamentos dirigidos
em cada raccedila
Por outro lado este baixo niacutevel de diferenciaccedilatildeo geneacutetica deveraacute estar tambeacutem
associado ao facto de na origem das raccedilas bovinas ibeacutericas se encontrar um uacutenico processo de
domesticaccedilatildeo seguido provavelmente de um processo de expansatildeo populacional bastante
recente do Proacuteximo Oriente ateacute agrave Europa Adicionalmente estima-se que a diferenciaccedilatildeo dos
bovinos em raccedilas autoacutectones soacute teraacute ocorrido nos uacuteltimos 300 anos (LOFTUS et ai 1994)
Neste contexto os eventuais estrangulamentos do efectivo populacional (bottleneck)
e efeitos de fundador ocorridos durante o periacuteodo inicial da domesticaccedilatildeo do gado bovino e
capazes de afectar de forma muito diferente vaacuterios nuacutecleos populacionais natildeo satildeo detectados
na Peniacutensula Ibeacuterica
75
Resultados e Discussatildeo
Tabela 344 Variabilidade geneacutetica em vaacuterias raccedilas de bovinos atraveacutes da anaacutelise de 4 loci polimoacuterficos N - efectivo meacutedio estudado por locus ria - nuacutemero meacutedio de alelos por locus P-- proporccedilatildeo de loci polimoacuterficos yent - heterozigotia meacutedia esperada Entre parecircntesis indicam-se os valores do desvio padratildeo
Raccedila Populaccedilatildeo N nbdquo P H +
Portugal
Barrosatilde inscrita 1410(00) 23 (05) 750 0249 (0135)
Barrosatilde natildeo inscrita 1530 (00) 23 (05) 755 0260(0135)
Minhota 620 (00) 20 (00) 1000 0216 (0094)
Mertolenga 1470 (00) 23 (03) 1000 0315 (0097)
Alentejana 1550(00) 23 (03) 1000 0239 (0123)
Mirandesa 1065 (03) 20 (00) 1000 0159(0110)
Espanha
Cachena 710 (00) 23 (03) 1000 0279(0111)
Caldelana 600 (00) 20 (00) 1000 0166 (0107)
Frieiresa 330 (00) 18(03) 750 0177(0112)
Limiana 390 (00) 20 (00) 1000 0246 (0087)
Rubia Gallega 1845(95) 25 (05) 1000 0215(0110)
Vianesa 400 (00) 20 (00) 1000 0221 (0087)
Sayaguesa 1470 (00) 23 (03) 1000 0320 (0094)
Morucha 1010(00) 23 (03) 1000 0361 (0084)
Alistaria Sanabresa 1570 (00) 23 (03) 1000 0213 (0104)
Blanca Cacerefia 618 (03) 20 (00) 1000 0377 (0078)
Caacuterdena Andaluza 250 (00) 15(03) 500 0131 (0106)
Asturiana de los Vallegraves 1265 (05) 23 (03) 1000 0237(0107)
Asturiana de la Montana 1060 (00) 23 (03) 1000 0280 (0088)
Tudanca 420 (00) 20 (04) 750 0321 (0109)
Morena del N O 250 (00) 18 (03) 750 0203 (0108)
Frisona 6540 (00) 18 (05) 500 0203 (0130)
De Lidia 1240 (00) 23 (03) 1000 0367(0135)
Retinta 1640 (00) 23 (03) 1000 0338 (0107)
76
Resultados e Discussatildeo
Tabela 345 Variabilidade geneacutetica em vaacuterias raccedilas de bovinos atraveacutes da anaacutelise de 5 loci polimoacuterficos N - efectivo meacutedio estudado por locus na - nuacutemero meacutedio de alelos por locus P--proporccedilatildeo de loci polimoacuterficos H^ - heterozigotia meacutedia esperada Entre parecircntesis indicam-se os valores do desvio padratildeo
Raccedila Populaccedilatildeo N na P i r Portugal
Barrosatilde inscrita 1410 (00) 22 (04) 800 0281 (0109)
Barrosatilde natildeo inscrita 1530(00) 22 (04) 800 0272 (0105)
Minhota 620 (00) 20 (00) 1000 0229 (0074)
Espanha Cachena 710 (00) 22 (02) 1000 0289 (0087)
Caldelana 600 (00) 20 (00) 1000 0180 (0084)
Frieiresa 330 (00) 18 (02) 800 0180 (0087)
Limiana 390 (00) 20 (00) 1000 0226(0071)
Rubia Gallega 1812(81) 24 (04) 1000 0223 (0086)
Vianesa 400 (00) 20 (00) 1000 0374 (0168)
Sayaguesa 1470 (00) 22 (02) 1000 0305 (0074)
Morucha 1010 (00) 22 (02) 1000 0353 (0066)
Alistaria Sanabresa 1570 (00) 22 (02) 1000 0174 (0089)
Blanca Cacerefla 616 (02) 20(00) 1000 0402 (0065)
Caacuterdena Andaluza 250 (00) 16(02) 600 0120 (0083)
Asturiana de los Vallegraves 1266 (04) 22 (02) 1000 0270 (0089)
Asturiana de la Montaria 1060(00) 22 (02) 1000 0301 (0072)
343 - Diferenciaccedilatildeo geneacutetica
Nas tabelas 346 e 347 apresentam-se as distacircncias geneacuteticas de Nei (NEI 1978)
calculadas para 23 (4 loci HB CAII ALB e TF) e 15 (5 loci HB CAII ALB TF e NP)
raccedilas bovinas ibeacutericas respectivamente Da sua anaacutelise ressalta o facto de aqueles valores
serem na sua maioria bastante baixos
De entre as raccedilas bovinas ibeacutericas estudadas a Frisona e a Cachena demonstram estar
mais proacuteximas da raccedila Barrosatilde com valores de DNei de 0092 (4 loci) e de 0104 (5 loci)
respectivamente Por outro lado as raccedilas Asturiana de la Montana e Vianesa aparecem como
as mais diferenciadas DNei= 0334 (4 loci ) e Dgtjei= 0330 (5 loci) respectivamente
77
Resultados e Discussatildeo
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Resultados e Discussatildeo
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Resultados e Discussatildeo
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80
Resultados e Discussatildeo
No que se refere agrave raccedila Minhota verifica-se que a Frieiresa eacute a que estaacute mais proacutexima
(valores de 0077 e 0074 para 4 e 5 loci respectivamente) e que mais um vez eacute a Asturiana de
la Montana a mais diferenciada das raccedilas (valores de 0389 e 0349 para 4 e 5 loci respectivamente)
A diferenciaccedilatildeo geneacutetica entre as raccedilas bovinas ibeacutericas encontra-se representada nos
dendrogramas construiacutedos pelos meacutetodos de agrupamento NJ (Neighbor-joining SATTOU amp
NEI 1987) e UPGMA (Unweightedpair-group arithmetic average SNEATH amp SOKAL 1973)
(figuras 341 342 343 e 344) Foram realizados testes de reamostragem do tipo
bootstrap (100 reacuteplicas) para a anaacutelise da consistecircncia dos padrotildees de ramificaccedilatildeo
apresentando-se os seus valores entre parecircntesis
A anaacutelise conjunta dos quatro dendrogramas permite verificar uma falta de consistecircncia
nos vaacuterios padrotildees de ramificaccedilatildeo para as raccedilas bovinas ibeacutericas associada a valores de
bootstrap em geral muito reduzidos De facto observa-se que o padratildeo de ramificaccedilatildeo dos
dendrogramas se altera consoante o meacutetodo de agrupamento usado e o nuacutemero de loci considerados Estas alteraccedilotildees nos agrupamentos das diferentes raccedilas devem-se
provavelmente agrave instabilidade causada pelo reduzido nuacutemero de loci polimoacuterficos utilizados
neste estudo bem como ao facto de as frequecircncias geacutenicas serem muito semelhantes em todas
as populaccedilotildees estudadas
Deve contudo referir-se que a raccedila Barrosatilde aparece normalmente associada a vaacuterias
raccedilas do norte da Peniacutensula Ibeacuterica nomeadamente a Cachena (Galiza) a Asturiana de la
Montana (Astuacuterias) a Sayaquesa e a Morucha (Salamanca)
No que se refere agrave raccedila Minhota esta aparece vaacuterias vezes associada agraves raccedilas Rubia
Gallega Frisona Asturiana de los Vallegraves e Frieiresa
81
Resultados e Discussatildeo
(18)
(14)
(11)
(5)
(3)
Sayaquesa
(39)
[32)
(21)1-
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(49)
(1)
(3)
(18)
(8)
(13)1
(12)
19)
(16T
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(99) Asturiana de la Montana
Tudanca bullMorucha
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Minhota -Asturiana de los Vallegraves Rubia Gallega
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(65)
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Caldelana Alistano Sanabresa
Figura 341 Dendrograma construiacutedo com base nas distacircncias geneacuteticas de NEI (1978) entre 23 raccedilas de bovinos (4 loci HBCAII ALB e TF) atraveacutes do meacutetodo de agrupamento NJ Os valores de probabilidade de ocorrecircncia de cada agrupamento obtidos atraveacutes de um teste de bootstrap indicam-se entre parecircntesis
82
Resultados e Discussatildeo
Morucha
Cachena Sayaquesa
Rubia Gallega Asturiana de los Vallegraves Freiresa
Frisona Minhota Alentejana Mertolenga
(43) ( 2 8 gt - ^ C a W e l a l
( iacute 7gtrl - Mirandesa L__ Alistano Sanabresa
Caacuterdena Andaluza Vianesa
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De Lidia Tudanca
Asturiana de la Montana Morena NO Blanca Cacerena
Figura 342 Dendrograma construiacutedo com base nas distacircncias geneacuteticas de NEI (1978) entre 23 raccedilas de bovinos (4 loci HB CAII ALB e TF) atraveacutes do meacutetodo de agrupamento UPGMA Os valores de probabilidade de ocorrecircncia de cada agrupamento obtidos atraveacutes de um teste de bootstrap indicam-se entre parecircntesis
83
Resultados e Discussatildeo
(42)f
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Figura 343 Dendrograma construiacutedo com base nas distacircncias geneacuteticas de NEI (1978) entre 15 raccedilas de bovinos (5 loci HB CAII ALB TF e NP) atraveacutes do meacutetodo de agrupamento NJ Os valores de probabilidade de ocorrecircncia de cada agrupamento obtidos atraveacutes de um teste de bootstrap indicam-se entre parecircntesis
(21)
(18)
(100)
(55)
(15)T r i shyT
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Alistano Sanabresa
(37)
(61)
(46
(29)
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Frieiresa
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Asturiana de la Montana
Figura 344 Dendrograma construiacutedo com base nas distacircncias geneacuteticas de NEI (1978) entre 15 raccedilas de bovinos (5 loci HB CAII ALB TF e NP) atraveacutes do meacutetodo de agrupamento UPGMA Os valores de probabilidade de ocorrecircncia de cada agrupamento obtidos atraveacutes de um teste de bootstrap indicam-se entre parecircntesis
84
Resultados e Discussatildeo
No seu conjunto estes resultados natildeo satildeo suficientes para o estabelecimento de uma
histoacuteria evolutiva das actuais raccedilas bovinas ibeacutericas nem para a separaccedilatildeo da raccedila Barrosatilde das
restantes Consequentemente natildeo eacute possiacutevel neste momento fazer corresponder a anaacutelise da
diversidade e estrutura geneacutetica das populaccedilotildees ibeacutericas de gado bovino com alguma das
hipoacuteteses evolutivas propostas por diversos autores com base em evidecircncia morfoloacutegica
(VALLEJO 1978 IGLESIAS 1989 CORDEIRO 1986 JORGE 1996)
De acordo com essa evidecircncia a raccedila Barrosatilde (e tambeacutem a Cachena) derivaria do
denominado tronco mauritaacutenico (Bos primigenius opisthonomus) ou seja de populaccedilotildees
originaacuterias do Norte de Aacutefrica que teriam passado para o sul da Peniacutensula Ibeacuterica alcanccedilando
mais tarde o Norte de Portugal e de Espanha Por outro lado a filiaccedilatildeo da raccedila Minhota
segundo JORGE (1996) deriva do tronco aquitacircnico (Bos primigenius primigenius) tal como a
maior parte das raccedilas da Galiza das Astuacuterias e dos Pirineacuteus
Embora os resultados apresentados neste trabalho pareccedilam de facto indicar que as
raccedilas Barrosatilde e Minhota derivam de troncos diferentes eacute necessaacuterio aprofundar de forma
muito consideraacutevel a investigaccedilatildeo sobre a estrutura geneacutetica das raccedilas bovinas ibeacutericas antes de
se poder formular conclusotildees mais sustentadas
85
Con8ideraccedil8es Finais
4 - CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
O trabalho desenvolvido nesta dissertaccedilatildeo permitiu o estudo de alguns sistemas
geneacuteticos polimoacuterficos jaacute descritos em bovinos (HB CAII NP MPI ALB TF e GC) nas
raccedilas Barrosatilde e Minhota Permitiu ainda a aplicaccedilatildeo de teacutecnicas de separaccedilatildeo electroforeacuteticas
mais eficazes em alguns desses sistemas
Vaacuterias limitaccedilotildees durante a execuccedilatildeo praacutetica deste trabalho obrigaram de alguma
forma a alteraccedilotildees no programa inicial Entre elas devem referir-se
1 a recolha de amostras de sangue mostrou-se difiacutecil e demorada sendo necessaacuteria a
coordenaccedilatildeo de esforccedilos de vaacuterias entidades (Direcccedilatildeo Regional de Agricultura de
Entre Douro e Minho e brigadas de Sanidade Animal locais) de veterinaacuterios e de
criadores de bovinos retirando tempo agrave execuccedilatildeo praacutetica do trabalho
2 a afinaccedilatildeo de vaacuterias teacutecnicas electroforeacuteticas para certos marcadores geneacuteticos
envolveu um consideraacutevel esforccedilo de investigaccedilatildeo
3 a impossibilidade de apurar atempadamente as teacutecnicas de separaccedilatildeo ou de
visualizaccedilatildeo para a amilase a ceruloplasmina e a poacutes-transferrina
4 a escassa bibliografia sobre o bovino Barrosatilde e sobre as teacutecnicas utilizadas neste
trabalho em gado bovino
Apesar das limitaccedilotildees considera-se que este trabalho se reveste de alguma importacircncia
pelo facto de constituir um contributo para a caracterizaccedilatildeo geneacutetica de uma raccedila bovina muito
peculiar A este respeito entendeu-se que numa primeira fase se procederia ao estudo de um
conjunto de proteiacutenas polimoacuterficas de forma a poder iniciar uma comparaccedilatildeo com outras raccedilas
bovinas nomeadamente ibeacutericas para as quais jaacute existem resultados publicados Por outro
86
Consideraccedilotildees Finais
lado o estabelecimento de um conjunto de teacutecnicas de fenotipagem dos loci considerados
permite desde logo a sua aplicaccedilatildeo em questotildees de identificaccedilatildeo individual e de anaacutelise da
paternidade
Eacute contudo evidente que o aprofundamento deste trabalho deveraacute necessariamente
evoluir na direcccedilatildeo da anaacutelise molecular da variaccedilatildeo geneacutetica Adicionalmente seraacute do maior
interesse alargar o domiacutenio de investigaccedilatildeo agraves restantes raccedilas bovinas autoacutectones
Em face do exposto entende-se ser possiacutevel definir trecircs linhas de investigaccedilatildeo para os
proacuteximos anos
1 - ampliaccedilatildeo da bateria de sistemas geneacuteticos polimoacuterficos detectados em proteiacutenas do
sangue e do leite
2 - anaacutelise da variabilidade geneacutetica de um conjunto de microssateacutelites se possiacutevel
associados a algumas das proteiacutenas polimoacuterficas jaacute descritas
3 - estudo do polimorfismo da moleacutecula de DNA-mitocondrial
De uma forma geral pode assim considerar-se que os principais objectivos definidos
no iniacutecio deste trabalho foram alcanccedilados pelo que se apresentam em seguida as conclusotildees
87
Conclusotildees
5 - CONCLUSOtildeES
A utilizaccedilatildeo de um sistema de focagem isoeleacutectrica permitiu detectar a existecircncia de
polimorfismo geneacutetico na hemoglobina distinguindo-se dois produtos geacutenicos na raccedila bovina
Minhota HBA e HBB Na raccedila Barrosatilde HBA foi o uacutenico produto geacutenico encontrado
A utilizaccedilatildeo de um sistema de focagem isoeleacutectrica permitiu a detecccedilatildeo de dois
produtos geacutenicos no locus CAII (CAIPF e CAIPS) e revelou-se mais eficaz de que as
teacutecnicas de separaccedilatildeo convencional em gel de amido
A investigaccedilatildeo realizada permitiu detectar a ocorrecircncia de polimorfismo geneacutetico de
MPI atraveacutes de um sistema electroforeacutetico em gel de amido tendo-se detectado trecircs produtos
geacutenicos (MPIA MPIB e MPIC) A fraca actividade de MPI e a grande dificuldade na
obtenccedilatildeo de um contraste de bandas adequado poderaacute dever-se ao facto de a sua expressatildeo soacute
ocorrer na fracccedilatildeo leucocitaacuteria do sangue
A aplicaccedilatildeo de um sistema de focagem isoeleacutectrica na presenccedila de ureia (8M) revelou-
-se muito eficaz na separaccedilatildeo de ALB e permitiu detectar pela primeira vez um novo variante
ALBV ligeiramente mais aciacutedico do que ALBA
A combinaccedilatildeo de uma teacutecnica de focagem isoeleacutectrica com um preacutevio tratamento das
amostras a fim de saturar a moleacutecula de TF com Fe permitiu a detecccedilatildeo de quatro produtos
geacutenicos (TF A TFD1 TFD2 e TFE) nas raccedilas estudadas
88
Conclusotildees
A combinaccedilatildeo de uma teacutecnica de focagem isoeleacutectrica com a detecccedilatildeo por
immunoblotting permitiu detectar dois produtos geacutenicos no locus GC (GCA e GCB) O
tratamento de amostras com neuraminidase permitiu a obtenccedilatildeo de padrotildees mais simples do
que os conseguidos com amostras nativas Esta simplificaccedilatildeo resulta da provaacutevel remoccedilatildeo de
aacutecidos siaacutelicos ligados agrave moleacutecula de GC
Natildeo se detectou nenhum caso de exclusatildeo na anaacutelise de segregaccedilatildeo de 27 pares
matildeefilho feita separadamente para cada locus
Verifiacutecou-se a presenccedila de dois alelos raros HBB e PEPB1 na raccedila Minhota Estes
alelos poderatildeo ser utilizados na distinccedilatildeo das duas raccedilas estudadas
Foi encontrado um valor de heterozigotia meacutedia de 0237 em populaccedilotildees de raccedila
Barrosatilde indicativo de uma variabilidade geneacutetica intermeacutedia em relaccedilatildeo agrave generalidade das
raccedilas ibeacutericas As diferenccedilas observadas entre as vaacuterias raccedilas ibeacutericas poderatildeo reflectir
fenoacutemenos histoacuterico-evolutivos muito recentes dada a sua proximidade e grande semelhanccedila
Foi observado um reduzido niacutevel de diferenciaccedilatildeo entre as raccedilas Barrosatilde e Minhota
(FST= 0031) demonstrando-se que a maior parte da diversidade geneacutetica se atribui a diferenccedilas
intrapopulacionais Este valor de FST pode considerar-se baixo quando comparado com o
obtido no estudo de outras espeacutecies animais sugerindo um elevado fluxo geacutenico
interpopulacional Por outro lado reflecte ainda uma histoacuteria demograacutefica muito recente
A utilizaccedilatildeo de meacutetodos de agrupamento NJ e UPGMA obtidos a partir de matrizes de
distacircncias geneacuteticas de Nei natildeo permitiu separar a raccedila Barrosatilde das restantes raccedilas ibeacutericas
89
Referecircncias Bibliograacuteficas
6 - REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
AMORIM A (1983) Contribuiccedilatildeo para o conhecimento da Geneacutetica Humana Estudo de Geneacutetica Bioquiacutemica
Formal e Populacional e de Ligaccedilatildeo Factorial Tese de Doutoramento Faculdade de Ciecircncias do
Porto
AMORIM A KOMPF J SCHUNTER F amp RITTER H (1982) Aminolevulinate dehydratase (EC42124)
Linkage analysis Hum Genet 61 48-49
ANSAY M (1973) Techniques microelectrophoretiques dans lanalyse de la multipliciteacute enzymatique chez les
bovins Deacutetection Eacutelectrophoreacutetique des Polymorphismes Biochimiques Chez les Mammifegraveres
Application a LEacutetude Geacuteneacutetique des Populations Centre National de la Recherche Scientifique
Paris 43-58
ARANA A pound amp ZARAGOZA P (1986) Nueva electroforetica dei enzima NADH-Diafrosa (DIA-2) detectada
en la espeacutecie Oryctolagus cuniculus (L) Zootecnia XXXV ndeg 7-12 125-130
ARAUacuteJO J (1986) Contribuiccedilatildeo para o estudo dos bovinos de raccedila Barrosatilde Relatoacuterio de estaacutegio da
licenciatura em Engenharia Zooteacutecnica Universidade dos Accedilores
ARNOLD I C J amp Bouw J (1989) A new allele of glucose phosphate isomerase in dogs Animal Genetics
20 217-220
ARRANZ J J BAYON Y amp SAN PRIMITIVO F (1992) Biochemical polymorphisms in Spanish Avilena-
-Negra Ibeacuterica cattle Animal Genetics 23 (suppl 1) 19
ARRANZ J J BAYON Y amp SAN PRIMITIVO F (1996) Comparison of protein markers and microsatellites in
differentiation of cattle populations Animal Genetics 27 415-419
ASHTON G C (1965) Cattle serum transferrins A balanced polymorphism Genetics 52 983-997
90
Referecircncias Bibliograacuteficas
BAINES J amp MEacuteLEK J (1980) Egipto - Deuses Templos e Faraoacutes Grandes Culturas e Civilizaccedilotildees Ciacuterculo
de Leitores
BELL K ARTHUR H amp ANDERSON I L (1994) Esterase and albumin polymorphism in the domestic cat
(Felis catus) XXIV International Conference on Animal Genetics Praga Julho 1994
BEKENEV V A amp ORLOVA G V (1991) Polymorphism of erytrocytic enzymes in Large White pig breeds in
Siberia Animal Genetics 22 (suppl 1) 23-24
BOWLING A T amp CLARK R S (1988) Excess of heacuteteacuterozygotes at albumin locus in American Standardbred
horses Animal Genetics 19 331-341
BOWLING A T GORDON L PENEDO M C T WICTUM E amp BEEBOUT J (1990) A single gel for
determining genetic of equine erythrocyte carbonic anhydrase (CA) and catalase (Cat) Animal
Genetics 21 191-197
BRADLEY D G MACHUGH D E CUNNINGHAM P amp LOFTUS R T (1996) Mitochondrial diversity and
the origins of African and European cattle Proceeding of the National Academy of Sciences of USA
93 5131-5135
BRAEND M (1971) Studies on the relationships between cattle breeds in Africa Asia and Europe Evidence
obtained by studies of blood groups and protein polymorphisms World Review of Animal Production
VIO (1) 10-14
BRAEND M (1988) Haemoglobin polymorphism in Norwegian Red Cattle Animal Genetics 19 59-62
BRAEND M NESSE 1 L amp EFREMOV G D (1988) Expression and genetics of caprine haemoglobins
Animal Genetics 18 223-231
BROWN L B KANE H amp AYRES H (1993) Vital signs WW Norton e Co pp 323 New York
CARTER D C HE X M MUNSON S EL TWIGG P D GERNERT K M BROOM M B amp MILLER T
Y (1989) Three dimensional structure of human serum albumin Science 244 1195-1198
CECCHINI G amp Nus M D (1986) Literature review on cattle blood polymorphisms and preliminary results
of analysis in East African Zebu in Ethiopia Agric Subtrop and Ttropicale 3 (80) 433-463
91
Referocircicias Bibliograacuteficas
CiacuteZovAacute D STRATIL A MULLER E amp CEPICA S (1993) A new partially deficient transferrin variant in
the pig Animal Genetics 24 305-306
CLARKE S W TUCKER E M amp OSTERHOFF D R (1989) Blood groups and biochemical polymorphism
in the Namaqua sheep breed Animal Genetics 20 279-286
CLUTTON-BROCK J (1992) Domestication of animals In Jomes S Martin R Pilbeam D (eds) The
Cambridge Encyclopedia of Human Evolution pp 380-385 Cambridge University Press
CORDEIRO J P (1986) As raccedilas bovinas em Portugal - Sua Origem O meacutedico veterinaacuterio I (1) 29-39
CRISTOFALO G Cozzi M C amp VALIATI P (1992) Identification of a new variant in the equine serum
alB-glycoprotein (A1B) system Animal Genetics 23 (suppl 1) 24
CUNHA L M (1994) Caracterizaccedilatildeo Morfo-Funcional e Geneacutetica da Raccedila Bovina Alentejana Trabalho de
fim de curso apresentado agrave Escola Superior Agraacuteria de Beja
DEL LAMA S N DEL LAMA M A MESTRINER M A amp MORTARI N (1992) Peptidase B polymorphism
in cattle erythrocytes Biochem Genet 30 247-255
DRATCH P TATE M KRAAY G J amp GERWING V (1992) Plasma proteins differentiating European red
deer and North American elk Animal Genetics 23 (suppl 1) 32
EGGEN A amp FRIES R (1995) An integrated cytogenetic and meiotic map of the bovine genome Animal
Genetics 26 215-236
ERHARDT G (1986) Transferrin variants in sheep separation and characterization by polyacrylamide gel
electrophoresis and isoelectric focusing Animal Genetics 17 343-352
ERHARDT G (1991) Genetic polymorphism of vitamin D binding protein and serum albumin in sheep
Animal Genetics 22 (suppl 1) 28-29
ERHARDT G amp SIMIANER H (1993) Linkage between the loci for serum albumin and vitamin D binding
protein (GC) in sheep Animal Genetics 24 301-303
EPSTEIN H amp MASON I L (1984) Cattle In Mason I L (ed) Evolution of domesticated animals pp 7-
-27 Longman
92
Referecircncias Bibliograacuteficas
FAO (1993) A diversidade da Natureza Um patrimoacutenio valioso Documento produzido pela FAO Divisatildeo de
informaccedilatildeo - Out de 1993 Veterinaacuteria Teacutecnica 10 10-12
FAO (1996) World Watch List for Domestic Animal Diversity 2a ediccedilatildeo FAOUNEP pp 334 Roma
FARNDALE B M HUBBARD D E amp ANDERSON L L (1992) A new PGD variant in New Zeland
Thoroughbred horses Animal Genetics 23 (suppl 1) 24
FELSENSTEIN J (1993) PHYLIP (Phylogeny Inference Package) Version 35 Distributed by the autor Seattle
University of Washington
FERNANDES M T S (1996) Raccedilas de bovinos autoacutectones Um importante recurso geneacutetico animal portuguecircs
a preservar e a defender Veterinaacuteria Teacutecnica 12 10-15
FERRAND N (1995) Variaccedilatildeo geneacutetica de proteiacutenas em populaccedilotildees de coelho (Oryctolagus cuniculus) -
- Anaacutelise da diferenciaccedilatildeo subespecifica subestruturaccedilatildeo expansatildeo geograacutefica e domesticaccedilatildeo
Dissertaccedilatildeo de Doutoramento em Biologia apresentada agrave Faculdade de Ciecircncias da Universidade do
Porto
FERRAND N amp ROCHA J (1991) Genetic polymorphism of serum albumin in wild rabbits populations
Animal Genetics 22 (suppl 1) 36
FORBES P MACKEITH B amp PEBERDY R (1986) Mamiacuteferos Ungulados e Lagomorfos Ciacuterculo de Leitores
FRIES R EGGEN A amp WOMACK J E (1993) The bovine genome map Mammalian Genome 4 405-428
GAHNE B(1963) Inherited variation in the post-albumin of cattle serum Hereditas 50126-135
GAHNE B JUNEJA R K amp GROLMUS J (1977) Horizontal polyacrylamine gel electrophoresis for the
simultaneous phenotyping of transferrin post-transferrin albumin and post-albumin in the blood
plasma of cattle Arum Bid Grps Biochem Genet 8127-137
GARCIA L S VICENTE M V BECERRA A L YEBRA F A RODRIcircGUES M F amp LOacutePEZ J M S
(1992) Razas Bovinas Autoacutectonas de Galicia - I Razas Morenas Galegas (Recursos Xeneacuteticos a
Conservar) Xunta de Galicia
GARCIA M ROSAacuteRIO J amp ANTUNES M (1981) Bovinos em Portugal Direcccedilatildeo dos Serviccedilos Veterinaacuterios -
- DGSV pp 44-78 Lisboa
93
Referecircncias Bibliograacuteficas
GLOWATZKI-MULLIS M L GAILLARD C WIGGER G amp FRIES R (1995) Microsatellite-based
parentage control in cattle Animal Genetics 26 7-12
GONCcedilALVES GARCIA M L (1964) A Raccedila Bovina Barrosatilde Boletim Pecuaacuterio n deg 1 Ano XXXII DGSP
pp 103-172 Lisboa
GONZALEZ P TUNON MJ amp VALLEJO M (1987) Genetic relationships between Spanish native breeds of
cattle Animal Genetics 18 249-256
HALL S B L COTHRAN E G amp KING J A (1991) Variability of manosephosphate isomerase (MPI)
from haemolysate in 14 horse breeds Animal Genetics 22 (suppl 1) 22
HARRIS H amp HOPKINSON D A (1976) Handbook of enzyme electrophoresis in human genetics North-
-Holland Publishers
HEMMER H (1990) Domestication The decline of environmental appreciation Cambridge University Press
HERZOG S (1988) Polymorphism and genetic control of erythrocyte 6-phosphogluconate dehydrogenase in
the genus Cervus Animal Genetics 19 291-294
HERZOG S (1989) Genetic polymorphism of transferrin in fallow deer Cervus dama L Animal Genetics 20
421-426
IGLESIAS A B (1989) Estrutura y relaciones geneacuteticas de razas bovinas mediante marcadores geneacuteticos
(Polimorfismos Bioquiacutemicos) Dissertaccedilatildeo de Doutoramento em Biologia apresentada agrave Faculdade de
Biologia da Universidade de Santiago
JAMIESON A (1965) The genetics of transferrins in cattle Heredity 20 419-441
JANZEN M K amp COTHRAN E G (1991) A new PGD variant from North American horses of feral origin
Animal Genetics 22 (suppl 1) 21-22
JORGE E S (1996) Bovinos da raccedila Minhota Contribuiccedilatildeo para a sua histoacuteria Veterinaacuteria Teacutecnica 10 10-
-18
94
Referecircncias Bibliograacuteficas
JUNEJA R K GAHNE B amp STRATIL A (1987) Polymorphic plasma postalbumins of some domestic
animals (pig Po2 horse XK and dog Pa proteins) identified as homologous Animal Genetics 18 119-
-124
JUNEJA R K KURYL J GAHNE B amp ZURKOWSKI M (1989) Linkage between the loci for transferrin
and ceruloplasmin in pigs Animal Genetics 20 307-311
KALAB P STRATIL A amp GLASNAacuteK V (1990) Genetic polymorphism of serum vitamin D-binding protein
(GC) in sheep and mouflon Animal Genetic 21 317-321
KAWAGUCHI T (1973) Polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of serum albumin into three
bands Clinica ChimicaActa 45 85-92
KIDD K K STONE W H CRIMELLA C CARENZI C CASATI M amp ROGNONI G (1980)
Immunogenetic and population genetic analyses of Iberian cattle Anim Blood Grps Biochem Genet
11 21-38
KRISTJANSSON F K (1963) Genetic control of two pre-albumins in pigs Genetics 48 1059-1063
KRISTJANSSON F K amp HICKMAN C G (1965) Subdivision of the allele TF D for transferrins in Holstein
and Ayrshire cattle Genetics 52 627-630
KUROSAWA Y amp TANAKA K (1988) Electrophoretic variants of serum transferrin in wild pig populations of
Japan Animal Genetics 19 31-35
LEAL C (1995) Apreciaccedilatildeo fenotiacutepica de um nuacutecleo de bovinos de raccedila Barrosatilde e amostragem para sua
caracterizaccedilatildeo geneacutetica Relatoacuterio de estaacutegio de licenciatura em Biologia - Ramo Cientiacutefico
Tecnoloacutegico em Ecologia e Recursos Zooloacutegicos Faculdade de Ciecircncias da Universidade do Porto
LITT M amp LUTTY J A (1989) A hipervariable microsatellite revealed by in vitro amplification of a
dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene American Jornal of Human Genetics 44
397-401
LOFTUS R T MACHUGH D E NGERE L O BALAIN D S BADI A M BRADLEY D G amp
CUNNINGHAM E P (1994a) Mitochondrial genetic variation in European African and Indian cattle
populations Animal Genetics 25 265-271
95
Referecircncias Bibliograacuteficas
LOFTUS R T MACHUGH B E BRADLEY B G SHARP P M amp CUNNINGHAM P (1994b) Evidence
for two independent domestications of cattle Proceeding of the National Academy of Sciences of USA
91 2757-2761
MACHUGH D E LOFTUS R T BRADLEY B G SHARP P M amp CUNNINGHAM P (1994)
Microsatellite DNA variation and among European cattle breeds Proceedings of the Royal Society of
London B 256 25-31
MACHUGH B E SHRIVER M B LOFTUS R T CUNNINGHAM P amp BRADLEY B G (1997)
Microsatellite DNA Variation and the Evolution Domestication and Phylogeography of taurine and
zebu cattle (Bos taunts and Bos indicus) Genetics 146 1071-1086
MARTINS R (1982) Conservaccedilatildeo e melhoramento dos bovinos de raccedila Barrosatilde Relatoacuterio de estaacutegio de
licenciatura em Produccedilatildeo Animal Instituto Universitaacuterio de Traacutes-os-Montes e Alto Douro
MIRANDA DO VALE J (1949) Gado Bissulco Livraria Saacute da Costa Lisboa
MORAIS M L (1992) Estudo Desenvolvimento e Optimizaccedilatildeo de Teacutecnicas de Separaccedilatildeo e Detecccedilatildeo
Especiacutefica de Proteiacutenas Dissertaccedilatildeo de Mestrado em Biologia Celular apresentada agrave Faculdade de
Ciecircncias da Universidade de Coimbra
NEI M (1978) Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small number of individuals
Genetics 89 583-590
NICHOLS E A CHAPMAN V M amp RUDDLE F H (1973) Polymorphism and linkage for
Mannosephosphate isomerase in Mus musculus Biochem Genet 8 47-53
NOBRE J M (s data) Caracterizaccedilatildeo geneacutetica da raccedila bovina Mirandesa Trabalho de fim de curso
efectuado na Estaccedilatildeo Nacional de Selecccedilatildeo e Reproduccedilatildeo Animal Curso de Engenharia Zooteacutecnica da
Universidade de Eacutevora
PENEDO M C T FOWLER M E BOWLING A T ANDERSON B L amp GORDON L (1988) Genetic
variation in the Wood of llamas Llama glama and alpaca Llama pacos Animal Genetics 19 267-
-276
PENEDO M C T amp JUNEJA R K (1989) Polymorphic plasma postalbumin (PO) of llamas and alpacas
identified as GC Protein Animal Genetics 20 221-223
96
Referecircncias Bibliograacuteficas
PENHALLOW R C MASON A B amp WOODWORTH R C (1991) Electrophoretic characterization of
human equine and bovine transferrins Comp Biochem Physiol 98B 41-45
PEREIRA A A (1997) Caracterizaccedilatildeo Geneacutetica de Algumas Subpopulaccedilotildees de Truta de Rio Salmo trutta L
da Bacia Hidrograacutefica do Rio Lima Dissertaccedilatildeo de Mestrado em Ecologia Aplicada apresentada agrave
Faculdade de Ciecircncias da Universidade do Porto
PIEDRAFITA J TEJEDOR M T amp ZARAGAZA L (1984) Post-Albuminas y Post-Transferrinas en
poblaciones bovinas Espafiolas Frisona y De Lidia Comunicacioacuten Presentada A La 34deg Reunion
Anual De La Federacioacuten Europea de Zootecnia 114-121
POVEY S CORNEY G LEWIS W H P ROBSON E B PARRINGTON J M amp HARRIS H (1972) The
genetics of peptidase C in man Ann Hum Genet 35 455-465
PRETSCH W amp MERKLE S (1990) Glucose Phosphate Isomerase Enzyme - Activity Mutants in Mus
musculus Genetical and Biochemical Characterization Biochemical Genetics 28 97-110
RASERO R D I STASIO L amp BERRA G P (1993) Polymorphism of erythocyte glucosephosphae isomerase
in sheep Animal Genetics 24 63-64
RITTER EL FRIEDRICHSON U amp SCHMITT J (1974) Genetic variation of Manose phosphate isomerase in
Man Humangenetik 22 261
RITTER H amp SCHMITT J (1973) Genetic polymorphism of Manose phosphate isomerase in Primates
Humangenetik 19 325-326
ROCHA J KOtildeMPF J FERRAND N AMORIM A amp RITTER H (1991) Separation of human alloalbumin
variants by isoelectric focusing Electrophoresis 12 313-314
ROGERSON J (1991) Biacuteblia- Os Caminhos de Deus Grandes Culturas e Civilizaccedilotildees Ciacuterculo de Leitores
RON M BAND M YANAI A amp WELLER J L (1994) Mapping quantitative trait loci with DNA
microsatellites in a commercial dairy cattle population Animal Genetics 25 259-264
RUSSEL G (1996) The analysis of genetic diversity in cattle to preserve future breeding options (Online)
Available http wwwribbsrcacukcdiv_wwwinformhtm (1996 November 29)
97
Referecircncias Bibliograacuteficas
SAITOU N amp NEI M (1987) The neighbor-joining method a new method for reconstructing phylogenetic
trees Mol Biol Evol 4 406-425
SANTOS O C M (1995) Caracterizaccedilatildeo Geneacutetica de Populaccedilotildees de Lebre Ibeacuterica (Lepus granatensis) e
Lebre Europeia (Lepus europaeus) - Aspectos Bioquiacutemicos e Populacionais Dissertaccedilatildeo de Mestrado
em Ecologia Aplicada apresentada agrave Faculdade de Ciecircncias da Universidade do Porto
SARAIVA J A (1993) Histoacuteria de Portugal Publicaccedilotildees Europa-Ameacuterica
SARTORE G STORMONT C MORRIS B G amp GRUNDER A A (1969) Multiple electrophoretic forms of
Carbonic Anhydrase in red cells of domestic cattle (Bos taurus) and American buffalo (Bison bison)
Genetics 61823-831
SCHNEIDER H SCHNEIDER M P C SILVA B T F amp SALZANO F M (1990) Transferrin and albumin
polymorphisms in buffaloes from Brazil Animal Genetics 21 335-337
SEATH P H A amp SOKAL R R (1973) Numeric Taxonomy W H Freeman amp Co
SELVARAJ O S MUKHERJEE T K DHALIWAL S S TAN S G amp BARKER J S F (1991) Biochemical
polymorphisms in the local goats of South-East Asia Animal Genetics 22 (suppl 1) 32
STERN C M MILLER S A amp SCHANFIELD M S (1992) Differentiation of wapiti and Eurasian red deer
by isoelectric focusing electrophoresis of GC on agarose gels Animal Genetics 23 (suppl 1) 23
STORMONT C amp SUZUKI Y (1963) Genetic control of albumin phenotypes in horses Proceeding of the
Society for Experimental Biology and Medicine 144 673-675
STRATIL A GLASNAacuteK V BOBAacuteK P CiacutezovAacute D GAacuteBRISOVAacute E amp KALAB P (1990) Variation of some
serum proteins in red deer Cervus elaphus L Animal Genetics 21 285-293
SWOFFORD D L amp SELANDER R B (1989) BIOSYS-1 A computer program for the analysis of allelic
variation in population genetics and biochemical systematics Release 17 Illinois Natural History
Survey
TASHIAN R E (1989) The carbonic anhydrases widening perspectives on their evolution expression and
function BioEssays 10 186-192
98
Referecircncias Bibliograacuteficas
TASHIAN R E amp CARTER N D (1976) Biochemical Genetics of Carbonic Anhydrase In Harris H (ed)
Advances in Human Genetics 7 1-56 Plenum
TATE M L amp MCEWAN K M (1992) Genetic polymorphism of erytrocyte diaphorase in red deer Cervus
elaphusL Animal Genetics 23 449-452
TSUJI S SAOAMITSU Y amp GOTO N (1989) Ultrathin-leyer isoelectric focusing for bovine serum
transferrin phenotyping Biochem Genet 27 425-429
TUCKER E M amp YOUNG J D (1988) Genetic control of red-cell nucleoside transport and its association
with the B blood-group locus and nucleoside phosphorylase activity in sheep Biochem Genet 26 489-
-501
TUNON M J GONZALEZ P amp VALLEJO M (1989) Genetic relationships between 14 native Spanish
breeds of goat Animal Genetics 20 205-212
USHA A P (1996) Cattle diversity by blood typing (Online) Available http
wwwribbsrcacukcdiv_wwwinfobhtm ( 1996)
USHA A P SIMPSON S P amp WILLIAMS J L (1995) Probability of random sire exclusion using
microsatellite markers for parentage verification Animal Genetics 26 155-161
VANDEBERG J amp AIVALIOTIS M (1990) Mannose-6-phosphate isomerase polymorphism in baboon
erythrocytes Biochemical Genetics 28 495-501
VAN DE WEGHE A VAN ZEVEREN A amp BOUQUET Y (1982) The vitamin D binding protein in domestic
animals Comp Biochem Physiol 73B 977-982
VAN DE WEGHE A YABLANSKI T S VAN ZEVEREN A amp BOUQUET Y (1988) A third variant of glucose
phosphate isomerase in pigs Animal Genetics 19 55-58
VANKAN D M amp BELL K (1992 a) A new allele in Australian goats Animal Genetics 23 453-456
VANKAN D M amp BELL K (1992 b) Genetic polymorphism of vitamin D-binding protein (GC) in Australian
goats Animal Genetics 23 457-462
VICENTE M V (1978) Razas vacunas autoacutectonas en vias de extincioacuten (Aportaciones al estuacutedio geneacutetico)
Fundacioacuten Juan March Serie Universitaacuteria LXK 10-51
99
Referecircncias Bibliograacuteficas
VIEIRA J (1993) Utilizaccedilatildeo de marcadores geneacuteticos na caracterizaccedilatildeo e certificaccedilatildeo de populaccedilotildees
domeacutesticas e selvagens de coelho (Oryctolagus cunicuius) Dissertaccedilatildeo de Mestrado apresentada agrave
Faculdade de Ciecircncias da Universidade do Porto
VIEIRA J amp FERRAND N (1995) Four new alleles at the mannose-6-phosphate isomerase locus in rabbit
Animal Genetics 26 37-38
WANG S FOOTE W C amp BUNCH T D (1990) Transferrin and haemoglobin polymorphism in
domesticated goats in the USA Animal Genetics 21 91-94
WEBER J L amp MAY P E (1989) Abundant class of human DNA polymorphisms which can be typed using
the polymerase chain reaction American Jornal of Human Genetics 44 388-396
WELCHS S (1990) A comparison of the structure and properties of serum transferrin from 17 animal species
Comp Biochem Physiol 97 B (3) 417-427
100
ANEXO
Anexos
RESUMO E CONCLUSOtildeES
Neste trabalho apresenta-se uma contribuiccedilatildeo para o estudo geneacutetico da raccedila bovina Barrosatilde e de uma outra raccedila (Minhota) atraveacutes da anaacutelise da variaccedilatildeo geneacutetica de proteiacutenas detectada pela utilizaccedilatildeo de sistemas electroforeacuteticos convencionais e por focagem isoeleacutectrica
Definiram-se os seguintes objectivos fundamentais
1 estudo da variabilidade geneacutetica da raccedila Barrosatilde ao niacutevel das proteiacutenas eritrocitaacuterias e plasmaacuteticas 2 desenvolvimento e afinaccedilatildeo de teacutecnicas de separaccedilatildeo de proteiacutenas por electroforese e focagem
isoeleacutectrica e sua detecccedilatildeo especiacutefica (histoquiacutemica e imunoloacutegica) 3 anaacutelise familiar dos polimorfismos encontrados 4 avaliaccedilatildeo do grau de diferenciaccedilatildeo geneacutetica existente entre a raccedila Barrosatilde e outras raccedilas bovinas
Escolheu-se um conjunto de 12 sistemas geneacuteticos (sete dos quais se revelaram polimoacuterficos) que pudesse satisfazer os objectivos fundamentais do trabalho
Assim apoacutes desenvolvimento de teacutecnicas de separaccedilatildeo para os sistemas geneacuteticos considerados procedeu-se a uma anaacutelise familiar baseada nos polimorfismos encontrados nas populaccedilotildees de raccedila Barrosatilde ao estudo de distribuiccedilatildeo populacional dos fenoacutetipos das duas raccedilas estudadas e de outras raccedilas bovinas da Europa (principalmente da Peniacutensula Ibeacuterica)
Com base neste trabalho obtiveram-se as seguintes conclusotildees
bull a utilizaccedilatildeo de um sistema de focagem isoeleacutectrica permitiu detectar a existecircncia de polimorfismo geneacutetico na hemoglobina distinguindo-se dois produtos geacutenicos na raccedila bovina Minhota HBA e HBB Na raccedila Barrosatilde HBA foi o uacutenico produto geacutenico encontrado
bull a utilizaccedilatildeo de um sistema de focagem isoeleacutectrica permitiu a detecccedilatildeo de dois produtos geacutenicos no locus CAII (CAIIF e CAIPS) e revelou-se mais eficaz de que as teacutecnicas de separaccedilatildeo convencional em gel de amido
bull a investigaccedilatildeo realizada permitiu detectar a ocorrecircncia de polimorfismo geneacutetico de MPI atraveacutes de um sistema electroforeacutetico em gel de amido tendo-se detectado trecircs produtos geacutenicos (MPIA MPIB e MPIC) A fraca actividade de MPI e a grande dificuldade na obtenccedilatildeo de um contraste de bandas adequado poderaacute dever-se ao facto de a sua expressatildeo soacute ocorrer na fracccedilatildeo leucocitaacuteria do sangue
bull a aplicaccedilatildeo de um sistema de focagem isoeleacutectrica na presenccedila de ureia (8M) revelou-se muito eficaz na separaccedilatildeo de ALB e permitiu detectar pela primeira vez um novo variante ALBV ligeiramente mais aciacutedico do que ALB A
bull a combinaccedilatildeo de uma teacutecnica de focagem isoeleacutectrica com um preacutevio tratamento das amostras a fim de saturar a moleacutecula de TF com Fe permitiu a detecccedilatildeo de quatro produtos geacutenicos (TFA TFD1 TFD2 e TFE) nas raccedilas estudadas
bull a combinaccedilatildeo de uma teacutecnica de focagem isoeleacutectrica com a detecccedilatildeo por immunoblotting permitiu detectar dois produtos geacutenicos no locus GC (GCA e GCB) O tratamento de amostras com neuraminidase permitiu a obtenccedilatildeo de padrotildees mais simples do que os conseguidos com amostras nativas Esta simplificaccedilatildeo resulta da provaacutevel remoccedilatildeo de aacutecidos siaacutelicos ligados agrave moleacutecula de GC
bull natildeo se detectou nenhum caso de exclusatildeo na anaacutelise de segregaccedilatildeo de 27 pares matildeefilho feita separadamente para cada locus
bull verificou-se a presenccedila de dois alelos raros HBB e PEPB1 na raccedila Minhota Estes alelos poderatildeo ser utilizados na distinccedilatildeo das duas raccedilas estudadas
I
Anexos
bull foi encontrado um valor de heterozigotia meacutedia de 0237 em populaccedilotildees de raccedila Barrosatilde indicativo de uma variabilidade geneacutetica intermeacutedia em relaccedilatildeo agrave generalidade das raccedilas ibeacutericas As diferenccedilas observadas entre as vaacuterias raccedilas ibeacutericas poderatildeo reflectir fenoacutemenos histoacuterico-evolutivos muito recentes dada a sua proximidade e grande semelhanccedila
bull foi observado um reduzido niacutevel de diferenciaccedilatildeo entre as raccedilas Barrosatilde e Minhota (FST = 0031) demonstrando-se que a maior parte da diversidade geneacutetica se atribui a diferenccedilas intrapopulacionais Este valor de FST pode considerar-se baixo quando comparado com o obtido no estudo de outras espeacutecies animais sugerindo um elevado fluxo geacutemeo interpopulacional Por outro lado reflecte ainda uma histoacuteria demograacutefica muito recente
bull a utilizaccedilatildeo de meacutetodos de agrupamento NJ e UPGMA obtidos a partir de matrizes de distacircncias geneacuteticas de Nei natildeo permitiu separar a raccedila Barrosatilde das restantes raccedilas ibeacutericas
II
Anexos
Tabela A Frequecircncias geacutenicas para os vaacuterios sistemas polimoacuterficos encontrados na raccedila Barrosatilde (indiviacuteduos inscritos e natildeo inscritos) utilizadas na anaacutelise familiar
LOCUS ALELOS FREQUEcircNCIA GEacuteNICA
CAII 294 035
065
NP 294 H
L
024
076
MPI 290 A
B
C
000
098
002
ALB 294 A
B
V
097
002
001
TF 294 A
Dl
D2
E
057
016
023
004
GC 294 083 017
TTI
Introduccedilatildeo
11 - A DOMESTICACcedilAtildeO
111 - Evidecircncia histoacuterica da domesticaccedilatildeo do gado bovino
Haacute cerca de 15000 anos verificavam-se profundas mudanccedilas climaacuteticas na Terra Os
glaciares recuaram para Norte a temperatura tornou-se mais amena uma maior aacuterea
geograacutefica tornou-se habitaacutevel O Homem teve entatildeo de vencer dificuldades impostas pela
Natureza inventando a agricultura e a criaccedilatildeo de gado passando de caccedilador noacutemada a
agricultor e a pastor (SARAIVA 1993)
O iniacutecio da agricultura e a primeira domesticaccedilatildeo de animais por parte do Homem estaacute
datada de 10000 anos aC (final do Paleoliacutetico) numa regiatildeo conhecida por Crescente Feacutertil
no Proacuteximo Oriente O primeiro animal domesticado teraacute sido o catildeo seguindo-se a ovelha a
cabra e o gado bovino jaacute no Neoliacutetico (8000 anos aC) (HEMMER 1990 CLUTTON-BROCK
1992)
A domesticaccedilatildeo do gado bovino foi provavelmente um processo gradual Eacute natural
que no princiacutepio apenas alguns animais (essencialmente fecircmeas) fossem retirados das manadas
de auroques selvagens e criados isoladamente natildeo levando de imediato ao aparecimento de
diferenccedilas morfoloacutegicas claras Esta hipoacutetese eacute apoiada por registos arqueozooloacutegicos onde a
forma proto-domesticada natildeo se distingue da forma selvagem (LOFTUS et ai 1994)
A expansatildeo neoliacutetica em direcccedilatildeo agrave Europa teraacute levado milhares de anos seguindo uma
via mariacutetima (mar Mediterracircneo) e uma via continental (atraveacutes dos Balcatildes e pelo curso do
Danuacutebio) Da Siciacutelia a revoluccedilatildeo neoliacutetica espalhou-se por toda a bacia mediterracircnea
ocidental atingindo a Peniacutensula Ibeacuterica e a costa atlacircntica e trazendo consigo a arte a
agricultura e a criaccedilatildeo de gado Desta forma soacute no 5 deg mileacutenio aC chegaram agrave Peniacutensula
Ibeacuterica as praacuteticas agriacutecolas e a pastoriacutecia (SARAIVA 1993)
Desde o Neoliacutetico que o gado bovino domesticado (Bos taurus) tem um papel muito
importante para o Homem As grandes civilizaccedilotildees da Antiguidade datildeo-nos testemunhos
escritos e trabalhos artiacutesticos indicando a sua importacircncia na alimentaccedilatildeo (carne leite) nos
trabalhos agriacutecolas na guerra na arquitectura e mesmo na religiatildeo
3
Introduccedilatildeo
Durante o periacuteodo compreendido entre o iniacutecio do Neoliacutetico ateacute agraves idades do Cobre e
do Bronze a domesticaccedilatildeo dos bovinos levou a uma contiacutenua diminuiccedilatildeo do tamanho corporal
dos animais na Europa Posteriormente este processo teraacute sido interrompido com a introduccedilatildeo
de gado bovino trazido de Roma e muitas raccedilas extinguiram-se apoacutes a queda do Impeacuterio
Romano (EPSTEIN amp MASON 1984)
Esta tendecircncia continuou a observar-se durante a Idade Meacutedia e soacute com a Revoluccedilatildeo
Industrial e a necessidade de abastecer as grandes cidades se produziu um incremento na
criaccedilatildeo de gado (EPSTEIN amp MASON 1984)
Neste domiacutenio a modernizaccedilatildeo da agricultura e a produccedilatildeo intensiva de alimentos teraacute
originado uma contiacutenua diminuiccedilatildeo dos efectivos populacionais de muitas raccedilas autoacutectones
evidente sobretudo durante a uacuteltima metade deste seacuteculo Estas circunstacircncias determinaram
assim a sensibilizaccedilatildeo da sociedade para as consequecircncias do empobrecimento de diversidade
geneacutetica do gado bovino permitindo o estabelecimento de linhas de investigaccedilatildeo destinadas agrave
sua gestatildeo e conservaccedilatildeo (BROWN et ai 1993 FAO 1996)
112 - Paleontologia arqueozoologia
De acordo com os actuais dados paleontoloacutegicos o mais antigo ruminante do Velho
Mundo teraacute aparecido no Mioceno (Gelocus) caracterizando-se pela ausecircncia de incisivos na
mandiacutebula superior e possuindo jaacute uma conformaccedilatildeo do esqueleto idecircntica agrave dos bovinos
actuais (IGLESIAS 1989 e GARCIA et ai 1992) Esta forma viria a originar posteriormente os
quatro geacuteneros actuais de ruminantes Ovis Capra Antilope e Bos (IGLESIAS 1989)
A evidecircncia paleontoloacutegica indica tambeacutem que teratildeo existido na Europa diferentes
espeacutecies de boviacutedeos actualmente extintas Destas apenas o auroque sobreviveu ateacute agrave Idade
Meacutedia havendo documentos escritos que se referem ao local e data da morte do uacuteltimo
exemplar (Poloacutenia 1627) (LOFTUS et ai 1994)
As primeiras representaccedilotildees de bovinos feitas pelo Homem devem precisamente
referir-se a auroques sendo um dos exemplos mais conhecidos constituiacutedo pelas pinturas
rupestres das grutas de Lascaux (Franccedila) (figura 111)
4
Introduccedilatildeo
Figura 111 Pintura rupestre nas paredes de grutas em Lascaux Franccedila Datando de haacute cerca de 15000 anos Reproduzido de FORBES (1986)
Soacute mais tarde surge a evidecircncia de que o processo de domesticaccedilatildeo se poderaacute ter
iniciado De facto alguns achados neoliacuteticos (8000 a 5500 anos aC) provenientes da
Anatoacutelia parecem indicar a presenccedila de animais jaacute domesticados Esta regiatildeo do Sudoeste
Asiaacutetico poderaacute assim constituir o centro de domesticaccedilatildeo do gado bovino a partir de
populaccedilotildees selvagens da subespeacutecie asiaacutetica do auroque (Bos primigenius namadicus)
(EPSTEIN amp MASON 1984)
Outra evidecircncia adicional eacute fornecida pela descoberta de ossos e dentes de um animal
sensivelmente mais pequeno do que o auroque (Iraque 5000 anos aC) bem como por um
primeiro testemunho escrito onde se descreve em placas de argila uma cabeccedila de vaca
(Mesopotacircmia 5000 anos aC) (ROGERSON 1991)
Muitos outros achados arqueoloacutegicos e paleontoloacutegicos foram encontrados na
Mesopotacircmia (4000 anos aC) e no vale do rio Nilo (4000 anos aC) mostrando um bovino
totalmente domesticado e de longos cornos (EPSTEIN amp MASON 1984)
A consolidaccedilatildeo do processo de domesticaccedilatildeo eacute a partir desta altura inquestionaacutevel
tornando-se abundantes os registos de bovinos domesticados na Mesopotacircmia e vale do Nilo
A este respeito devem referir-se especialmente as numerosas esculturas relevos pinturas e
textos em papiro que relatam pormenores da vida quotidiana do povo egiacutepcio e onde aparecem
diversas cenas que mostram a importacircncia do gado bovino na agricultura e na alimentaccedilatildeo
(figura 112)
5
Introduccedilatildeo
Figura 112 Desenho ilustrativo de uma ordenha 5a dinastia Reproduzido de BAINES
amp MEacuteLEK (1980)
A partir desta altura as descobertas arqueozooloacutegicas satildeo testemunho de uma
expansatildeo do gado bovino Assim existem registos datados de haacute cerca de 2000 e 3000 anos
aC que sugerem a ocorrecircncia no Norte de Aacutefrica de animais de enormes cornos em forma de
lira (EPSTEIN amp MASON 1984)
Tal expansatildeo daacute-se tambeacutem pela Turquia indo ateacute ao Caacuteucaso e agrave Ruacutessia e chega
tambeacutem agrave Europa onde nas regiotildees do Norte foram encontrados objectos de arte da idade do
Cobre e do Bronze que representam bovinos e datam do iniacutecio do Cristianismo (EPSTEIN amp
MASON 1984)
A migraccedilatildeo para oriente estaacute tambeacutem bem documentada atraveacutes de numerosos restos
arqueozooloacutegicos descobertos em toda a Aacutesia Eacute contudo nesta regiatildeo geograacutefica que se
pode observar a transiccedilatildeo de gado bovino sem bossa (Bos taurus) para outro com bossa (Bos
indicus) Segundo alguns autores as raccedilas de Bos indiens ou gado zebu derivariam das raccedilas
de Bos taurus ou gado taurino atraveacutes de um processo de selecccedilatildeo (EPSTEIN amp MASON
1984) Alternativamente estes dados podem tambeacutem ser interpretados como a ocorrecircncia de
dois processos de domesticaccedilatildeo independentes seguidos do contacto entre as duas populaccedilotildees
domeacutesticas de gado bovino
Adicionalmente deve salientar-se que a evidecircncia descrita eacute ainda muito incompleta
pelo que a interpretaccedilatildeo dos dados deve ser feita com bastante precauccedilatildeo A tiacutetulo de
exemplo refiram-se os achados arqueozooloacutegicos efectuados na Peniacutensula dos Balcatildes e na
6
Introduccedilatildeo
Macedoacutenia Grega (6200 anos aC) Segundo EPSTEIN amp MASON (1984) estes achados
sugerem que o Sul da Europa poderia constituir o primeiro centro de domesticaccedilatildeo do gado
bovino a partir de onde se teria iniciado a sua expansatildeo em direcccedilatildeo ao resto do continente
europeu Ruacutessia e Sudoeste Asiaacutetico
113 - Anaacutelise geneacutetica
A investigaccedilatildeo sobre a geneacutetica das diferentes raccedilas de gado bovino tem contribuiacutedo de
forma muito significativa para a compreensatildeo da sua histoacuteria dos padrotildees de diversidade que
actualmente as caracterizam e do seu grau de parentesco Os resultados actualmente
disponiacuteveis reportam-se a trecircs domiacutenios principais grupos sanguiacuteneos variaccedilatildeo geneacutetica de
proteiacutenas e polimorfismos do DNA (DNA mitocondrial e microssateacutelites)
Grupos sanguiacuteneos
A primeira tentativa para avaliar o grau de diferenciaccedilatildeo geneacutetica entre raccedilas bovinas e
caracterizar a sua diversidade data do iniacutecio de deacutecada de 70 e envolveu precisamente o
estudo dos diferentes grupos sanguiacuteneos que iam sendo descritos (RUSSELL 1996 USHA
1996) Contudo a maior parte dos resultados natildeo permitiu a obtenccedilatildeo de conclusotildees
definitivas pelo facto de se trabalhar com um nuacutemero relativamente reduzido de loci que
adicionalmente era pouco polimoacuterfico Deve poreacutem referir-se que se dispotildee actualmente de
uma consideraacutevel quantidade de informaccedilatildeo no que se refere agrave distribuiccedilatildeo da variabilidade dos
grupos sanguiacuteneos nas diferentes raccedilas bovinas conferindo a este conjunto de dados uma
importacircncia natildeo despreziacutevel no estudo de eventuais alteraccedilotildees da estrutura geneacutetica de
populaccedilotildees de gado bovino nos uacuteltimos vinte anos (RUSSELL 1996 USHA 1996)
Proteiacutenas
A introduccedilatildeo de teacutecnicas electroforeacuteticas de separaccedilatildeo de proteiacutenas permitiu aumentar
de forma muito consideraacutevel o nuacutemero de sistemas geneacuteticos polimoacuterficos conhecidos nas
raccedilas bovinas em especial no que se refere a proteiacutenas do sangue e do leite (USHA 1996)
A anaacutelise da sua distribuiccedilatildeo populacional veio demonstrar a ocorrecircncia de dois grupos
principais de bovinos ou duas subespeacutecies (Bos primigenius taurus e Bos primigenius
7
Introduccedilatildeo
indiens) cada um deles caracterizado pela presenccedila de diversos alelos privativos em vaacuterios loci
(BRAEND 1971)
Estes resultados estatildeo de uma maneira geral de acordo com dados morfoloacutegicos
histoacutericos e ainda com a distribuiccedilatildeo geograacutefica conhecida dos principais grupos (EPSTEIN amp
MASON 1984) No entanto o acreacutescimo de informaccedilatildeo fornecido por este tipo de marcadores
foi ainda insuficiente para resolver muitas das interpretaccedilotildees contraditoacuterias publicadas sobre o
tema
Polimorfismo do DNA
A introduccedilatildeo das teacutecnicas de anaacutelise genoacutemica directa e em especial a descoberta do
polimorfismo do DNA-mitocondrial (mtDNA) e dos microssateacutelites forneceram os
instrumentos necessaacuterios a uma detalhada caracterizaccedilatildeo geneacutetica das raccedilas bovinas
A anaacutelise da variaccedilatildeo da moleacutecula de mtDNA permitiu verificar que Bos primigenius
taurus e Bos primigenius indicus teratildeo divergido haacute cerca de 210000 anos uma data muito
anterior agrave indicada pelos dados arqueoloacutegicos para o iniacutecio do processo de domesticaccedilatildeo Eacute
assim muito provaacutevel que tenham ocorrido duas domesticaccedilotildees independentes a partir de duas
subespeacutecies diferentes do auroque Bos primigenius namadicus teraacute dado origem ao gado
zebu na Aacutesia (Vale do Indu) e Bos primigenius primigenius ao gado europeu vindo do
Proacuteximo Oriente (LOFTUS et ai 1994a 1994b)
Muito recentemente BRADLEY et ai (1996) e MACHUGH et ai (1997) sugerem ainda
uma terceira domesticaccedilatildeo independente ocorrida em Aacutefrica Esta evidecircncia resulta tambeacutem
de anaacutelise do polimorfismo do mtDNA indicando uma separaccedilatildeo entre os ancestrais do gado
europeu e africano anterior agrave domesticaccedilatildeo (22000 - 26000 anos) Este terceiro processo de
domesticaccedilatildeo ter-se-ia assim efectuado a partir da subespeacutecie africana do auroque (Bos
primigenius opisthonomus)
A descoberta dos microssateacutelites e do seu elevado grau de polimorfismo data do fim da
deacutecada de 80 (Lm amp LUTY 1989 WEBER amp MAY 1989) e constitui provavelmente a
metodologia mais adequada para estudar a histoacuteria recente da diversificaccedilatildeo das raccedilas bovinas
(MACHUGH et ai 1994 ARRANZ et ai 1996) Os primeiros resultados que envolvem uma
caracterizaccedilatildeo em larga escala de diferentes populaccedilotildees permitiram distinguir mais claramente
a estrutura geneacutetica dos dois grandes grupos de gado bovino (Bos taurus e Bos indicus) e
constituem a base para futuros estudos mais especiacuteficos
8
Introduccedilatildeo
Por outro lado os microssateacutelites permitiram tambeacutem o iniacutecio do projecto de
cartografia do genoma bovino que no fim de 1994 contabilizava 202 marcadores geneacuteticos
(dos quais 144 eram microssateacutelites) regularmente espaccedilados em 90 do seu comprimento
Cerca de um ano depois existiam jaacute mais de 400 microssateacutelites (USHA et ai 1995) levando
EGGEN et ai (1995) a apresentar um trabalho de revisatildeo e consolidaccedilatildeo de informaccedilatildeo jaacute
existente para evitar a ocorrecircncia de possiacuteveis redundacircncias
A aplicaccedilatildeo deste tipo de marcadores natildeo se restringe apenas agrave anaacutelise da diversidade
geneacutetica populacional e agrave construccedilatildeo de mapas geneacuteticos De facto satildeo actualmente escolhidos
para a realizaccedilatildeo de testes de paternidade (GLOWATZKI-MULLIS et ai 1995 USHA et ai 1995
ARRANZ et ai 1996) detecccedilatildeo de loci que determinam a expressatildeo de caracteriacutesticas
quantitativas (QTL) (RON et ai 1994) determinaccedilatildeo do sexo em embriotildees selecccedilatildeo animal
assistida entre outros
No seu conjunto estes resultados tecircm permitido um avanccedilo notaacutevel na compreensatildeo da
evoluccedilatildeo das actuais raccedilas bovinas A prossecuccedilatildeo desta via de investigaccedilatildeo poderaacute levar ao
esclarecimento definitivo do nuacutemero de domesticaccedilotildees independentes que teraacute ocorrido
(EPSTEIN amp MASON 1984 LOFTUS et al 1994a 1994b BRADLEY et al 1996 MACHUGH et
al 1997) a partir das populaccedilotildees selvagens de auroque Seguidamente eacute legiacutetimo esperar que
venha a ser possiacutevel analisar a uma escala mais fina o grau de parentesco geneacutetico entre raccedilas
que ocupem aacutereas geograacuteficas mais reduzidas Neste particular seraacute extremamente interessante
incluir as populaccedilotildees ibeacutericas e em especial a raccedila Barrosatilde
9
Introduccedilatildeo
12 - A DIVERSIDADE DAS RACcedilAS BOVINAS
A domesticaccedilatildeo resultou na criaccedilatildeo de milhares de raccedilas de animais domeacutesticos
geneticamente diferentes e adaptadas agraves necessidades humanas e a uma grande variedade de
condiccedilotildees ambientais (FAO 1993)
121 - As raccedilas ibeacutericas
A grande diversidade de raccedilas bovinas da Peniacutensula Ibeacuterica poderaacute dever-se em parte
agrave introduccedilatildeo de outras raccedilas domeacutesticas que se cruzaram entre si e com bovinos jaacute existentes
na Peniacutensula A introduccedilatildeo de outras raccedilas teraacute sido feita de duas formas distintas
1 - atraveacutes dos movimentos migratoacuterios acompanhando as vaacuterias invasotildees de povos
vindos do oriente como eacute o caso dos Feniacutecios ( seacutec X aC) Gregos (seacutec VII aC) e
Romanos (seacutec III aC) Estes uacuteltimos dominaram completamente a Peniacutensula durante
7 seacuteculos e teratildeo contribuiacutedo para a diversificaccedilatildeo do gado bovino pelo facto de
introduzirem animais de caracteriacutesticas diferentes Supotildee-se que do seu cruzamento
com os bovinos ibeacutericos se teratildeo originado os troncos aquitacircnico e ibeacuterico (MIRANDA
do VALE 1949)
2 - atraveacutes da introduccedilatildeo de animais do Norte de Aacutefrica na sequecircncia da invasatildeo de
povos como os Cartagineses (seacutec V aC) e jaacute na era cristatilde os Mouros (711 dC)
Estes teratildeo introduzido descendentes de Bos primigenius opisthonomus que poderaacute
ter influenciado a formaccedilatildeo de vaacuterias raccedilas ibeacutericas nomeadamente as raccedilas Barrosatilde e
Cachena (APARIacuteCIO 1960 in IGLESIAS 1989 EPSTEIN amp MASON 1984) Estas
poderatildeo assim constituir uma linha que descende do tronco mauritaacutenico (MIRANDA
do VALE 1949)
10
Introduccedilatildeo
Adicionalmente eacute provaacutevel que povos oriundos do Norte da Europa nomeadamente
os Visigodos possam ter introduzido gado bovino dessa regiatildeo Contudo a sua eventual
contribuiccedilatildeo para a diversidade de raccedilas bovinas da Peniacutensula Ibeacuterica estaacute por esclarecer
122 - A raccedila Barrosatilde
Aspectos histoacutericos da dispersatildeo e evoluccedilatildeo do efectivo populacional
O centro de criaccedilatildeo da raccedila Barrosatilde situa-se actualmente na zona do planalto da Serra
do Barroso abrangendo os actuais concelhos de Montalegre Boticas Vieira do Minho
(freguesias de Campos e Ruivatildees) e Cabeceiras de Basto (freguesia de Gondiatildees) Esta regiatildeo
natildeo possui condiccedilotildees agro-climateacutericas que permitam grandes exploraccedilotildees agriacutecolas pelo que
uma parte importante da populaccedilatildeo se dedica agrave criaccedilatildeo de gado (GARCIA et ai 1981
FERNANDES 1996)
Vivendo sobretudo em zonas montanhosas a Barrosatilde eacute utilizada essencialmente como
forccedila de trabalho e na produccedilatildeo de carne de excelente qualidade motivo pelo qual a Uniatildeo
Europeia a reconhece com denominaccedilatildeo de Origem Protegida (FERNANDES 1996)
No seacuteculo passado e iniacutecio do seacuteculo XX existia um grande incentivo para a criaccedilatildeo
desta raccedila devido agrave procura da sua carne muito apreciada em Inglaterra Este incentivo
contribuiu indirectamente para que a estatura dos animais se elevasse (GARCIA et ai 1981) e
para que a zona de criaccedilatildeo se dispersasse pelas aacutereas submontanhosas e pelas planiacutecies do
Entre Douro e Minho ateacute agrave orla mariacutetima chegando mesmo ao concelho de Vila Nova de Gaia
(figura 121) Nestas zonas fazia-se a criaccedilatildeo de novilhos para exploraccedilatildeo como bois de
trabalho e para produccedilatildeo de carne Tal exploraccedilatildeo estaacute bem patente nos paineacuteis de azulejos da
estaccedilatildeo de caminhos de ferro de S Bento no Porto e mesmo nos desenhos das calccediladas nas
principais avenidas desta cidade
li
Introduccedilatildeo
B
bull bull bull _ bull bull bull - bull bull
Figura 121 A) Junta de bois de trabalho de raccedila Barrosatilde B) Fecircmea adulta Barrosatilde C) Macho adulto Barrosatilde Fotografias datadas de 1949 gentilmente cedidas pela Direcccedilatildeo Regional de Agricultura de Entre Douro e Minho - Centro de Produccedilatildeo Animal (DRAEDM)
12
Introduccedilatildeo
Poreacutem a necessidade de maiores produccedilotildees de carne foi conduzindo durante a
segunda metade deste seacuteculo a um progressivo decliacutenio no efectivo populacional da raccedila
Barrosatilde tornando-se mesmo raro poder observar uma junta de bois Recentemente as
alteraccedilotildees verificadas na poliacutetica agraacuteria e ambiental da Uniatildeo Europeia teratildeo permitido
alguma recuperaccedilatildeo Nesse contexto a criaccedilatildeo em 1981 do Livro Genealoacutegico da raccedila
Barrosatilde constitui um passo importante para a certificaccedilatildeo dos animais e o aumento do seu
valor Actualmente o seu efectivo populacional tem crescido continuamente e essa tendecircncia
parece estaacutevel
Segundo dados fornecidos pelo Registo Zooteacutecnico e pela Associaccedilatildeo do Minho dos
Criadores de Bovinos de Raccedila Barrosatilde (AMTOA) existiam em 1996 38002 fecircmeas
reprodutoras inscritas e 375 touros de cobriccedilatildeo (tabela 1221) distribuiacutedos por vaacuterios
concelhos dos distritos de Viana do Castelo Braga Vila Real e Porto (figura 122)
Tabela 1221 Movimento do Registo Zooteacutecnico relativo agrave raccedila Barrosatilde
Vacas Inscritas Postos de Cobriccedilatildeo Vitelos Anos Abatidas Registadas Inscritas Encerrados Recenseados Existecircncias Inscritos 1981 0 4884 4882 1 25 24 0 1982 19 6169 11032 6 42 60 532 1983 31 4436 15437 14 35 81 1593 1984 72 866 16231 13 14 82 2151 1985 47 604 16788 15 15 82 1767 1986 106 1027 17709 18 13 77 2414 1987 72 1186 18823 2 14 89 2632 1988 122 1192 19877 5 7 91 2574 1989 138 718 20506 14 26 103 2532 1990 89 1017 21440 8 7 102 2404 1991 159 1309 22590 14 26 114 2531 1992 52 1902 24440 6 17 125 3203 1993 0 4205 28645 37 87 175 4077 1994 0 6248 34893 58 111 228 4679 1995 340 2447 37000 0 112 340 5759 1996 120 1122 38002 26 61 375 5901
Fonte Registo Zooteacutecnico (cedido pela AM1BA)
Apesar desta situaccedilatildeo favoraacutevel natildeo se pode considerar que a raccedila Barrosatilde natildeo corra
ainda perigo de extinccedilatildeo Na verdade satildeo vaacuterios os factores que tecircm contribuiacutedo para a
diminuiccedilatildeo da sua aacuterea de criaccedilatildeo ou mesmo para a alteraccedilatildeo das caracteriacutesticas destes
animais De entre esses factores deve salientar-se i) a substituiccedilatildeo de Barrosatilde por outras raccedilas
autoacutectones (Minhota Mirandesa Maronesa) ou importadas (Friacutesia Gelbvieh e Parda Suiacuteccedila)
13
Introduccedilatildeo
que fornecem ao agricultor um rendimento superior ii) a progressiva mecanizaccedilatildeo da
agricultura e a diminuiccedilatildeo das aacutereas de pastagem iii) o pequeno nuacutemero de machos
reprodutores associado a um efectivo idoso iv) uma baixa fertilidade meacutedia grandes
intervalos entre partos e elevado nuacutemero de abortos e v) desmotivaccedilatildeo dos produtores mesmo
em face das actuais condiccedilotildees de comercializaccedilatildeo
LEGENDA
| j - -Concelhos de Entre Douro e Minho S Concelhos de Traacutes-os-Montes
ESCALA 11380000
Figura 122 Mapa de distribuiccedilatildeo do actual efectivo Barrosatilde
14
Introduccedilatildeo
Aspectos morfoloacutegicos
O bovino Barrosatilde apresenta uma estatura mediana com 121-130 cm de altura agrave
cernelha e pelagem de cor castanha (variando entre a cor de palha ateacute a cor acerejada) (LEAL
1995) A cabeccedila eacute curta e larga encimada por uma cornamenta em forma de lira alta os
cornos satildeo muito compridos e espessos de cor branca suja com pontas escuras o conjunto
ocular eacute saliente dando-lhe o aspecto de olhos de sapo as orelhas satildeo de tamanho meacutedio os
membros satildeo curtos e pouco ossudos e o pescoccedilo eacute curto bem ligado agrave cabeccedila e com garrote
largo (MARTINS 1982)
Eacute uma raccedila com caracteres sexuais secundaacuterios bem diferenciados Os touros satildeo
normalmente mais escuros particularmente no terccedilo anterior com maior corpulecircncia do que as
fecircmeas mais robustos com barbela mais desenvolvida cabeccedila mais curta e mais larga cornos
mais grossos e ligeiramente mais curtos (GARCIA et ai 1981 MARTINS 1982)
Esta raccedila apresenta duas particularidades morfoloacutegicas que a distinguem de todas as
outras raccedilas grande desenvolvimento coacuterneo e perfil cocircncavo da cabeccedila com acentuado
prognatismo mandibular O elevado crescimento coacuterneo poderaacute estar relacionado com a
selecccedilatildeo dos animais De facto nas populares chegas de touros o animal que sai vencedor seraacute
o touro cobridor das vacas da aldeia Este processo teraacute permitido a primazia de touros de
maior ossatura capital mais potente musculatura ceacutefalo-cervical maior forccedila no acircngulo taacutersico
e consequentemente grande desenvolvimento dos cornos (MIRANDA do VALE in GONCcedilALVES GARCIA 1964 ARAUacuteJO 1986) No que se refere ao acentuado prognatismo
mandibular eacute possiacutevel que em parte esteja relacionado com o grande desenvolvimento
coacuterneo Este teraacute exigido um desenvolvimento correlativo de certos ossos cranianos e o
atrofiamento dos ossos da face (GONCcedilALVES GARCIA 1964)
Origem
A origem da raccedila Barrosatilde e o seu enquadramento com as outras raccedilas da Peniacutensula
Ibeacuterica estaacute ainda por explicar constatando-se uma grande heterogeneidade na opiniatildeo de
diversos autores a este respeito (MARTINS 1982)
Alguns autores referem a existecircncia no Norte de Aacutefrica (vale do Nilo) de um gado
com caracteriacutesticas morfoloacutegicas semelhantes agrave actual raccedila Barrosatilde em especial no que se
refere agrave forma tamanho e espessura dos cornos Este gado eacute normalmente associado agrave
15
Introduccedilatildeo
designaccedilatildeo subespeciacutefica Bos primigenius opisthonomus (embora tambeacutem se refira como Bos
primigenius mauritaniens e como Bos taurus desertorum) e teraacute chegado agrave Peniacutensula Ibeacuterica
atraveacutes de vaacuterias rotas migratoacuterias dos povos norte-africanos A raccedila Barrosatilde poderia assim
ser incluiacuteda no tronco mauritaacutenico tendo como ancestral Bos primigenius mauritanicus
(GARCIA et ai 1981)
Neste contexto poderaacute admitir-se que o gado que corresponde a este grupo se tenha
instalado na Peniacutensula Ibeacuterica provavelmente durante a longa ocupaccedilatildeo Moura (GONCcedilALVES
GARCIA 1964) Posteriormente a raccedila Barrosatilde teraacute sido desalojada pelos troncos ibeacuterico e
aquitacircnico restando apenas um nuacutecleo populacional confinado agraves zonas planaacutelticas do
Barroso onde permaneceu ateacute hoje (GONCcedilALVES GARCIA 1964)
Esta hipoacutetese natildeo eacute contudo partilhada por outros autores que lhe criticam a escassa
evidecircncia (forma e tamanho dos cornos) e portanto uma clara ausecircncia de base cientiacutefica
(IGLESIAS 1989)
Perante o exposto pode verificar-se que a raccedila Barrosatilde apresenta aspectos
morfoloacutegicos e histoacuterico-evolutivos muito peculiares sendo ainda hoje difiacutecil proceder ao seu
enquadramento no seio das restantes raccedilas bovinas ibeacutericas O aprofundamento da investigaccedilatildeo
sobre a estrutura geneacutetica das suas populaccedilotildees poderaacute ser assim uma via para o
esclarecimento das muitas questotildees que permanecem por responder Nestas condiccedilotildees este
trabalho pretende ser uma contribuiccedilatildeo para o conhecimento da geneacutetica das populaccedilotildees da
raccedila bovina Barrosatilde atraveacutes da consecuccedilatildeo dos seguintes objectivos
1 estudo da variabilidade geneacutetica da raccedila Barrosatilde ao niacutevel das proteiacutenas eritrocitaacuterias
e plasmaacuteticas
2 desenvolvimento e afinaccedilatildeo de teacutecnicas de separaccedilatildeo de proteiacutenas por electroforese
e focagem isoeleacutectrica e sua detecccedilatildeo especiacutefica (histoquiacutemica e imunoloacutegica)
3 anaacutelise familiar dos polimorfismos encontrados
4 avaliaccedilatildeo do grau de diferenciaccedilatildeo geneacutetica existente entre a raccedila Barrosatilde e outras
raccedilas bovinas
16
Material e Meacutetodos
2 - MATERIAL E MEacuteTODOS
21 - AMOSTRAGEM E CONSERVACcedilAtildeO DAS AMOSTRAS
211 - Amostragem
Foram recolhidas 356 amostras de sangue correspondente a 294 indiviacuteduos de raccedila
Barrosatilde (dos quais 141 estavam inscritos no Livro Genealoacutegico) e 62 indiviacuteduos de raccedila
Minhota As colheitas efectuaram-se em zonas de intensa criaccedilatildeo da Barrosatilde designadamente
nos concelhos de Arcos de Valdevez Cabeceiras de Basto Fafe Poacutevoa de Lanhoso e
Monccedilatildeo em finais de 1993 durante o ano de 1994 e ainda no periacuteodo de 1996 1997 em
Vieira do Minho
A recolha de sangue em indiviacuteduos de raccedila Minhota foi efectuada com a finalidade de
servir como termo de comparaccedilatildeo geneacutetica uma vez que se realizam cruzamentos entre esta
raccedila e a Barrosatilde
212 - Obtenccedilatildeo e conservaccedilatildeo das amostras de sangue
O sangue foi colhido da veia jugular em tubos contendo 01 ml de EDTA (aacutecido
etilnodiaminotetraceacutetico) dissoacutedico a 10 ou em tubos heparinados
As amostras de sangue foram centrifugadas (10 minutos a 13000 rpm) separando-se
em seguida o plasma dos eritroacutecitos Aos eritroacutecitos foi adicionado meio de glicerol (seis
partes de uma soluccedilatildeo 5 de citrato trissoacutedico 2H20 adicionados a quatro partes de glicerol)
numa proporccedilatildeo aproximada de 21 as amostras foram conservadas a -20degC
17
Material e Meacutetodos
22 - BATERIA DE MARCADORES GENEacuteTICOS SELECCIONADOS
No presente trabalho foi escolhida uma bateria de 12 marcadores geneacuteticos dispersos
no genoma do bovino (figura 5) HB (Hemoglobina) CAII (Anidrase carboacutenica) PEPB
(Peptidase B) DIA (Diaforase) NP (Fosforilase nucleosiacutedica) MDH (Desidrogenase do
malato) PGD (Desidrogenase do aacutecido fosfoglucoacutenico) GPI (Isomerase da fosfoglucose)
MPI (Isomerase da manose-6-fosfato) ALB (Albumina) TF (Transferrina) e GC
(Componente especiacutefico de grupo)
CP SODl TF
PEPC IDH1
AMY1 AMY1A PGM1
4
LDHB PEPB
ADH2 PGM2 ALB GC SOD3
6
IADA
ALDH1
CAII
ME1 PGM3 SOD2
NP
10
CAT HBBq22-q27
PGD IALDH2 DIA4
HP GPIq22-q24
MPI iBF GLOl
LDHA MDH2
Figura 221 Localizaccedilatildeo de vaacuterios loci proteicos no genoma de Bos taurus Com um tom mais carregado indicam-se os marcadores estudados neste trabalho Adaptado de FRIES et ai (1993)
18
Material e Meacutetodos
bull HB
A hemoglobina eacute responsaacutevel pelo transporte do oxigeacutenio dos pulmotildees para os tecidos
A sua estrutura eacute tetrameacuterica tendo cada uma das quatro subunidades um grupo prosteacutetico -
- heme - com um aacutetomo de ferro no centro A fracccedilatildeo principal da hemoglobina de mamiacuteferos
adultos eacute composta por duas cadeias a e duas cadeias P (BRAEND 1971 CECCHINI amp Nus
1986)
O locus da HB foi um dos primeiros a ser estudado apresentando polimorfismo em
vaacuterios mamiacuteferos (CECCHJM amp Nus 1986 BRAEND et ai 1988 CLARKE et ai 1989 WANG
et ai 1990 SELVARAJ et ai 1991) Em 1955 CABANNE amp SERAIN (in BRAEND 1988)
descrevem pela primeira vez o polimorfismo da HB em bovinos do Norte da Aacutefrica
Posteriormente muitos estudos foram efectuados descrevendo-se 13 variantes (raros na sua
maioria) com diferenccedilas apenas nas cadeias beta (CECCHINI amp Nus 1986 BRAEND 1988)
bull CAII-EC4211
A CAII eacute uma metaloenzima com grande distribuiccedilatildeo nos animais e nas plantas
(TASHIAN 1989) Catalisa de forma reversiacutevel a hidrataccedilatildeo do C02 em H2C03 (CECCHINI amp
Nus 1986 TASHIAN 1989) O seu papel fisioloacutegico ainda natildeo eacute bem conhecido mas eacute
possiacutevel que tenha participaccedilatildeo na manutenccedilatildeo do balanccedilo osmoacutetico (TASHIAN 1989)
A ocorrecircncia de variaccedilatildeo geneacutetica na CAII estaacute descrita em muitas espeacutecies de
mamiacuteferos tendo sido descritos dois loci polimoacuterficos (CAI e CAII) (TASHIAN amp CARTER
1976 CLARICE et ai 1989 SELVARAJ et ai 1991)
SARTORE et ai (1969) foram os primeiros a detectar polimorfismo electroforeacutetico da
anidrase carboacutenica em bovinos domeacutesticos e buacutefalos americanos Nos eritroacutecitos de bovinos
apenas se exprime a anidrase carboacutenica II que apresenta geralmente 2 alelos codominantes
autossoacutemicos (CAIPF e CAIPS) (SARTORE et ai 1969 TASHIAN amp CARTER 1976) Mais
tarde foram encontrados 3 novos alelos (C Z e X) (CECCHINI amp Nus 1986)
19
Material e Meacutetodos
bull PEPB-EC3412
As peptidases formam um conjunto de enzimas capazes de hidrolisar di- e tripeacuteptidos
caracterizando-se pela sua especificidade em relaccedilatildeo a diversos substratos bem como atraveacutes
da sua distribuiccedilatildeo tecidular
A PEPB apresenta uma estrutura monomeacuterica tendo sido descrita como polimoacuterfica
em algumas raccedilas brasileiras de bovinos de origem europeia e indiana (DEL LAMA et ai
1992)
bull DIA-EC1643
A enzima monomeacuterica DIA (NADH - Methemoglobina redutase) tambeacutem conhecida
por citocromo bs redutase faz parte de um grupo de enzimas que catalisam a reduccedilatildeo da
methemoglobina (IGLESIAS 1989 VIEIRA 1993 kRAHhetal 1986)
O seu polimorfismo geneacutetico foi detectado em vaacuterias espeacutecies de Ungulados incluindo
os bovinos (CLARKE et ai 1989 IGLESIAS 1989 SELVARAJ et ai 1991 TATE amp McEWAN
1992)
bull NP-EC2421
A enzima NP encontra-se distribuiacuteda por vaacuterios tecidos e oacutergatildeos e catalisa
reversivelmente a fosforoacutelise dos nucleosiacutedeos puriacutenicos levando agrave formaccedilatildeo das respectivas
bases e ribose-1-fosfato (IGLESIAS 1989)
O polimorfismo geneacutetico desta enzima foi detectado em vaacuterias espeacutecies de mamiacuteferos
incluindo os bovinos (ANSAY 1973 HARRIS amp HOPKINSON 1978 TUKER amp YOUNG 1988
CLARKE eacutetal 1989 IGLESIAS 1989 FERRAND 1995)
20
Material e Meacutetodos
bull MDH-ECl 1137
A MDH eacute uma oxirredutase dimeacuterica na maioria dos mamiacuteferos responsaacutevel pela
oxidaccedilatildeo do L-malato em oxoglutarato com NAD como aceitador A reacccedilatildeo eacute reversiacutevel em
presenccedila de NADH e oxaloacetato A enzima diz-se NAD especiacutefica pelo facto da reacccedilatildeo soacute
ocorrer na presenccedila deste cofactor (MORAIS 1992 PEREIRA 1997)
A ocorrecircncia de variaccedilatildeo geneacutetica neste locus foi descrita para vaacuterios mamiacuteferos
(HARRIS amp HOPKINSON 1978 TUNOacuteN et ai 1989 SELVARAJ et ai 1991) Contudo
relativamente aos bovinos natildeo foi possiacutevel encontrar referecircncias quanto ao seu polimorfismo
bull PGD-EC11144
A PGD eacute uma enzima dimeacuterica envolvida na via das pentoses-fosfato catalisando a
conversatildeo de 6-fosfogluconato em ribose-5-fosfato
O polimorfismo geneacutetico do locus PGD estaacute descrito em diversas espeacutecies de
Ungulados (HERZOG 1988 PENEDO et ai 1988 BEKENEV amp ORLO VA 1991 KUROSAWA amp
TANAKA 1991 JANZEN amp COTHRAN 1991 FERNDALE et al 1992) Contudo relativamente
aos bovinos natildeo foi possiacutevel encontrar referecircncias quanto ao seu polimorfismo
bull GPI-EC5319
A isomerase da fosfoglucose cataliza a reacccedilatildeo reversiacutevel de conversatildeo de glucose-
-6-fosfato em frutose-6-fosfato (HARRIS amp HOPKINSON 1978 PRETSCHei ai 1990)
Eacute uma enzima dimeacuterica com polimorfismo geneacutetico em vaacuterias espeacutecies de mamiacuteferos
nomeadamente no catildeo (ARNOLD amp Bouw 1989) no porco (VAN DE WEGHE et ai 1988
BEKENEV amp ORLO VA 1991) na ovelha (RASERO et ai 1993) em lamas e alpacas (PENEDO et
ai 1988) e no Homem (HARRIS amp HOPKINSON 1978)
21
Material e Meacutetodos
bull MPI-EC5318
A MPI eacute uma enzima monomeacuterica de acccedilatildeo cataliacutetica que permite a isomerizaccedilatildeo de D-
-manose-6-fosfato em D-frutose-6-fosfato
Em diversas espeacutecies de mamiacuteferos nomeadamente no Homem (RlTTER et ai 1974)
em babuiacutenos (RITTER amp SCHMITT 1973) e ratos (NICHOLS et ai 1973 VANDEBERG amp
AIVALIOTIS 1990) esta enzima natildeo apresenta actividade em eritroacutecitos sendo poreacutem
detectada em diversos tecidos como rim fiacutegado e o muacutesculo Mais tarde demonstrou-se a
possibilidade de proceder a esta detecccedilatildeo em hemolisados de cavalos coelhos e lebres (HALL
et ai 1991 VIEIRA amp FERRAND 1995 SANTOS 1995)
O polimorfismo geneacutetico de MPI em bovinos foi descrito por ANSAY (1973)
apresentando trecircs alelos autossoacutemicos codominantes (MPPA MPIB e MPIC)
bull ALB
A albumina eacute a proteiacutena mais abundante no plasma dos mamiacuteferos e apresenta uma
estrutura monomeacuterica A sua funccedilatildeo estaacute relacionada com processos de transporte e de
regulaccedilatildeo do balanccedilo osmoacutetico (CECCHTNI amp Nus 1986 CARTER et al 1989)
O polimorfismo geneacutetico da albumina estaacute descrito em vaacuterias espeacutecies de Ungulados
(STORMONT et ai 1963 BOWLING amp CLARK 1988 PENEDO et ai 1988 ERHARDT 1991
SELVARAJeacutetfa 1991CRISTOFALOpounda 1992 ERHARDT amp SlMIANER 1993)
EFREMOV e ASHTON em 1965 (in CECCHTNI amp Nus 1986) descrevem pela primeira vez
polimorfismo geneacutetico em raccedilas bovinas inglesas Inicialmente encontraram-se dois alelos
(ALBA ou ALBF e ALBB ou ALBS) por electroforese aacutecida Mais tarde descreveram-
-se outros alelos em raccedilas britacircnicas (ALBH e ALBG) e em raccedilas africanas (ALBD
ALBE e ALBF) (CECCHINI amp Nus 1986) ABE et ai em 1971 descrevem o alelo ALBX
(in CECCHTNI amp Nus 1986)
22
Material e Meacutetodos
bull TF
A transferrina eacute uma 3-globulina seacuterica responsaacutevel pelo transporte do ferro Possui
uma estrutura monomeacuterica glicosilada (CECCHINI amp Nus 1986 WELCHS 1990 PENHALLOW
et ai 1991 CUNHA 1994)
O polimorfismo geneacutetico desta proteiacutena foi detectado em vaacuterias espeacutecies de Ungulados
(KRISTJANSSON 1963 STORMONT et ai 1963 ASHTON 1965 GAHNE et ai 1977 CECCHJNI
amp Nus 1986 ERHARD 1986 KUROSAWA amp TANAKA 1988 PENEDO et ai 1988 CLARKE et
ai 1989 HERZOG 1989 JUNEJA et ai 1989 TSUJI et ai 1989 SCHNEIDER et ai 1990
STRATIL et ai 1990 WANG et ai 1990 SELVARAJ et ai 1991 DRATCH et ai 1992
VANKAN amp BELL 1992a CIacuteZovket ai 1993 ERHARD et ai 1993)
ASHTON em 1965 descreveu pela primeira vez o polimorfismo geneacutetico de TF em
bovinos estando actualmente descritos sete alelos TFA TFB TFD1 TFD2 TFE
TFF e TFG (CECCHTNI amp Nus 1986) A subdivisatildeo do alelo TFD em TFD1 e TFD2 foi
descrita por KRISTJANSSON amp HICKMAN (1965)
Nos bovinos os loci TF e CP encontram-se ligados como tem sido descrito para vaacuterias
espeacutecies de mamiacuteferos (JUNEJA et ai 1989)
bull GC
A GC apresenta uma estrutura monomeacuterica e o seu polimorfismo geneacutetico estaacute descrito
em vaacuterias espeacutecies de Ungulados (GAHNE 1963 KRISTJANSSON 1963 JUNEJA et ai 1987
PENEDO et ai 1988 PENEDO amp JUNEJA 1989 KALAacuteB et ai 1990 ERHARDT 1991 VANKAN
amp BELL 1992b STERN et ai 1992 ERHARDT amp SIMIANER 1993 STRATIL et ai 1995)
Nos bovinos o polimorfismo geneacutetico da GC foi inicialmente descrito por GAHNE
(1963) e ASHTON (1963) in GAHNE et ai 1977) mas soacute mais tarde foi possiacutevel obter
frequecircncias geacutenicas para este locus (alelos GCA e GCB) em diferentes raccedilas europeias
(GAHNE et ai 1977) A utilizaccedilatildeo de novas teacutecnicas de separaccedilatildeo permitiu distinguir um
terceiro alelo GCC (VAN DE WEGHE 1982)
23
Material e Meacutetodos
A existecircncia de ligaccedilatildeo factorial entre os loci ALB e GC foi demostrada no Homem
em primeiro lugar e depois nos cavalos nos bovinos e na ovelha (VAN DE WEGHE 1982
ERHARDT amp SlMIANER 1993)
23 - TRATAMENTO DAS AMOSTRAS
bull HB
A separaccedilatildeo da moleacutecula HB por focagem isoeleacutectrica foi feita mediante a utilizaccedilatildeo de
hemolisados diluiacutedos 18 em aacutegua bidestilada
bull CAII
A separaccedilatildeo electroforeacutetica de CAII foi realizada em gel de amido e em focagem
isoeleacutectrica No primeiro caso as amostras foram simplesmente tratadas com tolueno
enquanto no segundo se procedeu ainda agrave sua reduccedilatildeo com uma soluccedilatildeo de ditiotreitol
(DTT) 120 mM (100 uacute de amostra natildeo diluiacuteda e 20 pi de DTT 120 mM) durante 1 h a 37degC
Quando se utilizou focagem isoeleacutectrica aleacutem do tratamento jaacute referido foi necessaacuterio
realizar uma diluiccedilatildeo final de 110 com aacutegua bidestilada
bull PEPB DIA NP MDH PGP GPI e MPI
As separaccedilotildees electroforeacuteticas de PEPB DIA NP MDH PGD GPI e MPI em gel de
amido foram efectuadas com hemolisados natildeo diluiacutedos submetidos ao mesmo tratamento
descrito para CAII quando separada por electroforese convencional
24
Material e Meacutetodos
bull ALB
Na separaccedilatildeo de ALB por focagem isoeleacutectrica utilizaram-se amostras de plasma
diluiacutedas com aacutegua bidestilada na proporccedilatildeo de 170
bull TF
Na separaccedilatildeo de TF efectuada por focagem isoeleacutectrica utilizaram-se amostras de
plasma submetidas a vaacuterios tipos de tratamento para comparaccedilatildeo dos padrotildees de bandas
obtidos
1 Remoccedilatildeo dos resiacuteduos de aacutecido siaacutelico da moleacutecula de TF
diluiccedilatildeo 13 com neuraminidase durante 1 h a 37 degC
2 Remoccedilatildeo do Fe da moleacutecula de TF
diluiccedilatildeo 13 com EDTA-dissoacutedico (20) 2 h antes da aplicaccedilatildeo para remoccedilatildeo dos
aacutetomos de Fe da moleacutecula de TF
3 Saturaccedilatildeo em Fe da moleacutecula de TF
31 - diluiccedilatildeo 13 com soluccedilatildeo de sulfato de amoacutenio feacuterrico 015 (pv) em aacutecido
ciacutetrico 60 mM seguida de incubaccedilatildeo agrave temperatura ambiente 18 h A utilizaccedilatildeo
de uma razatildeo ligante Fe de 201 permite uma raacutepida saturaccedilatildeo da moleacutecula de
TF (FERRAND 1995)
32 - diluiccedilatildeo 13 com soluccedilatildeo de sulfato de amoacutenio ferroso 015 (pv) em aacutecido
ciacutetrico 60 mM seguida de incubaccedilatildeo agrave temperatura ambiente 18 h
33 - diluiccedilatildeo 13 com soluccedilatildeo de citrato de amoacutenio feacuterrico 015 (pv) em aacutecido
ciacutetrico 60 mM seguida de incubaccedilatildeo agrave temperatura ambiente 18 h
34 - diluiccedilatildeo 13 com soluccedilatildeo de citrato feacuterrico 015 (pv) em aacutecido ciacutetrico
60 mM seguida de incubaccedilatildeo agrave temperatura ambiente 18 h
35 - diluiccedilatildeo 13 com soluccedilatildeo de cloreto de ferro 015 (pv) em aacutecido ciacutetrico
60 mM seguida de incubaccedilatildeo agrave temperatura ambiente 18 h
25
Material e Meacutetodos
Antes da inserccedilatildeo as amostras foram parcialmente purificadas atraveacutes da adiccedilatildeo de 5
volumes de uma soluccedilatildeo de rivanol 06 (pv) em tampatildeo Tris HC1 005 M (ajusta-se o pH
para valores de 91 com Tris 1 M) seguida de centrifugaccedilatildeo
bull GCcedil
A fim de proceder agrave remoccedilatildeo dos resiacuteduos de aacutecido siaacutelico existente nas cadeias de
hidratos de carbono ligadas agrave moleacutecula GC as amostras de plasma foram submetidas a uma
incubaccedilatildeo com uma soluccedilatildeo de neuraminidase Clostridium perfringens SIGMA type V 18
Uml) na proporccedilatildeo de 13 durante 18 h a 37degC acrescentando-se posteriormente aacutegua
bidestilada ateacute agrave obtenccedilatildeo de uma diluiccedilatildeo final de 14 Paralelamente procedeu-se a uma
diluiccedilatildeo das amostras com aacutegua bidestilada (19) para comparaccedilatildeo dos padrotildees de bandas
obtidos
24 - MEacuteTODOS DE SEPARACcedilAtildeO
Electroforese convencional
Nas teacutecnicas de electroforese convencional foram utilizados vaacuterios sistemas de tampatildeo
para os geacuteis e para as pontes conforme a proteiacutena em estudo
Focagem isoeleacutectrica
Os sistemas de focagem isoeleacutectrica utilizados na separaccedilatildeo de proteiacutenas foram
realizados em matrizes de poliacrilamida (T = 5 C = 3) com dimensotildees 230xl00x03mm
Os geacuteis foram aplicados sobre uma peliacutecula de suporte GELFIX (SERVA) permitindo o seu
manuseamento adequado
A adiccedilatildeo de soluccedilotildees de TEMED 10 (pv) e persulfato de amoacutenio (PSA) 10 (pv)
permitiu a polimerizaccedilatildeo do gel agrave temperatura ambiente (24 horas) ou a 37 degC durante 1 h
As separaccedilotildees por focagem isoeleacutectrica decorreram sobre placa de arrefecimento a
aproximadamente 10degC (8 - 12degC)
26
Material e Meacutetodos
HB
A separaccedilatildeo da moleacutecula de HB foi realizada por focagem isoeleacutectrica em gradiente de
pH livre segundo a teacutecnica descrita por FERRAND (1995) com algumas modificaccedilotildees
A composiccedilatildeo da soluccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo e os paracircmetros eleacutectricos utilizados estatildeo
indicados nas tabelas 241 e 242 respectivamente
Tabela 241 Soluccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo utilizada para a separaccedilatildeo da moleacutecula nativa de HB por focagem isoeleacutectrica
Componentes da soluccedilatildeo Quantidades
Acrilamida 28 (pv)
Bisacrilamida 2 (pv)
Sacarose
Anfoacutelitos 5-8 (SIGMA)
7-9 (PHARMACIA)
Aacutegua bidestilada TEMED 10 (vv)
PSA 10 (pv)
18 ml
08 ml
2 g
300 p1
300 ul
ateacute 10 ml volume final
10 ul
70 ul
Tabela 242 Paracircmetros eleacutectricos utilizados na focagem isoeleacutectrica de HB
Voltagem (V) Corrente (mA) Potecircncia (W) Tempo (T)
Preacute focagem 1500 25 1
2
3
30 min
15 min
15 min
Focagem 1500 25 15 2h 30 min
As soluccedilotildees para os eleacutectrodos foram aacutecido aspaacutertico 004 M (acircnodo) e NaOH 01 M
(caacutetodo) As amostras foram aplicadas a 15 cm do caacutetodo tendo sido inseridas com o auxiacutelio
de um aplicador de borracha silicone (SERVA)
27
Material e Meacutetodos
bull CAII
A separaccedilatildeo de CAII fez-se em gel de amido (15 pv SIGMA) conforme o descrito
por AMORIM (1983) com algumas modificaccedilotildees e ainda por focagem isoeleacutectrica em
gradiente de pH livre
Utilizam-se os seguintes sistemas tampatildeo para a separaccedilatildeo por electroforese em gel de
amido
Tampatildeo das Pontes Tris 0250 M pH = 76 Aacutecido ciacutetrico 0067 M
Tampatildeo do Gel Diluiccedilatildeo 110 do tampatildeo das pH = 76 pontes
As amostras foram inseridas em meio Sephadex G-200 (PHARMACIA) na proporccedilatildeo
de 11 As electroforeses foram realizadas em placa de arrefecimento (8degC) e com um
gradiente de potencial de 5 Vcm durante 16 h
A teacutecnica utilizada para a separaccedilatildeo de CAII por focagem isoeleacutectrica foi a descrita por
BOWLING et ai (1990) com algumas modificaccedilotildees A composiccedilatildeo da soluccedilatildeo de
polimerizaccedilatildeo e os paracircmetros eleacutectricos utilizados estatildeo indicados nas tabelas 243 e 244
respectivamente
As soluccedilotildees para os eleacutectrodos foram aacutecido aspaacutertico 004 M (acircnodo) e NaOH 01 M
(caacutetodo) As amostras foram inseridas com o auxiacutelio de um aplicador de borracha silicone
(SERVA) colocado a 15 cm do caacutetodo
28
Material e Meacutetodos
Tabela 243 Soluccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo utilizada na separaccedilatildeo de CAII por focagem isoeleacutectrica
Componentes da soluccedilatildeo
Acrilamida 28 (pv)
Bisacrilamida 2 (pv)
Sacarose
Anfoacutelitos 4-65 (PHARMACIA)
Anfoacutelitos 35-10 (PHARMACIA)
Aacutegua bidestilada TEMED 10 (vv)
PSA 10 (pv)
Quantidades 18 ml
08 ml
2 g
500 |ol
100 ul
ateacute 10 ml volume final
10 ul
70 ul
Tabela 244 Paracircmetros eleacutectricos utilizados na separaccedilatildeo de CAII por focagem isoeleacutectrica
Voltagem (V) Corrente (mA) Potecircncia (W) Tempo (T)
Preacute focagem 1500 25 1
3
5
30 min
15 min
15 min
Focagem 2500 25 8
10
12
30 min
30 min
30 min
bull PEPB
A separaccedilatildeo da PEPB foi realizada em gel de amido (15 pv SIGMA) de acordo
com a teacutecnica descrita por POVEY et ai (1972) com algumas modificaccedilotildees
29
Material e Meacutetodos
Utilizou-se o seguinte sistema tampatildeo
Tampatildeo das Pontes Tris 01 M
pH = 74 NaH2P04 01 M
Tampatildeo do Gel Diluiccedilatildeo 110 do tampatildeo das
pH = 74 pontes
As amostras satildeo inseridas em meio Sephadex G-200 (PHARMACIA) na proporccedilatildeo de
11 As electroforeses foram realizadas em placas de arrefecimento (8degC) e com um gradiente
de potencial de 5 Vcm durante 16 h
bull DIA
No caso da separaccedilatildeo de DIA a teacutecnica eacute idecircntica agrave utilizada para CAII electroforese
em gel de amido (15 pv SIGMA) conforme o descrito por AMORIM (1983) com algumas
modificaccedilotildees
bull NP MDH PGD GPJ e MPI
As separaccedilotildees das enzimas NP MDH PGD GPI e MPI fizeram-se em simultacircneo por
electroforese em gel de amido (15 pv SIGMA) conforme o descrito por AMORIM et ai
(1982) com algumas modificaccedilotildees
Utilizou-se o seguinte sistema tampatildeo
1130 M
0400 M
0020 M 0010 M
Tampatildeo das Pontes NaOH
pH = 60 Aacutecido ciacutetrico
Tampatildeo do Gel HisHCl
pH = 60 NaOH
30
Material e Meacutetodos
As amostras foram inseridas em meio Sephadex G-200 (PHARMACIA) na proporccedilatildeo
de 11 As electroforeses foram realizadas em placas de arrefecimento (8degC) e com um
gradiente de potencial de 8 Vcm durante 15 h
ALB
Nas tabelas 245 e 246 indicam-se respectivamente a composiccedilatildeo da soluccedilatildeo de
polimerizaccedilatildeo para a separaccedilatildeo de ALB por focagem isoeleacutectrica segundo a teacutecnica descrita
por ROCHA et ai (1991) com algumas modificaccedilotildees e os paracircmetros eleacutectricos
Tabela 245 Soluccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo utilizada para a separaccedilatildeo de ALB por focagem isoeleacutectrica
Componentes da soluccedilatildeo Quantidades
Acrilamida 28 (pv)
Bisacrilamida 2 (pv)
Ureia
Anfoacutelitos 5-6 (PHARMACIA)
Anfoacutelitos 5-8 (PHARMACIA)
Anfoacutelitos 6-8 (PHARMACIA)
Aacutegua bidestilada TEMED 10 (vv)
PSA 10 (pv)
18 ml
08 ml
48 g
250 ni
250 ni
125 ul
ateacute 10 ml volume final
30 ul
70 ul
Tabela 246 Paracircmetros eleacutectricos utilizados na separaccedilatildeo de ALB por focagem isoeleacutectrica
Voltagem (V) Corrente (mA) Potecircncia (W) Tempo (T)
Preacute focagem 1500 25
Focagem 1500 25
1 30 min
2 15 min
3 15 min
4 3 h
5 30 min
31
Material e Meacutetodos
As soluccedilotildees para os eleacutectrodos foram aacutecido aspaacutertico 004 M (acircnodo) e NaOH 1 M
(caacutetodo) As amostras foram aplicadas a 15 cm do caacutetodo com o auxiacutelio de um aplicador de
borracha silicone (SERVA)
TF
A separaccedilatildeo da moleacutecula de TF foi efectuada por focagem isoeleacutectrica A composiccedilatildeo
da soluccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo e os paracircmetros eleacutectricos utilizados estatildeo indicados nas tabelas
247 e 248 respectivamente
Tabela 247 Soluccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo utilizada para a separaccedilatildeo da TF por focagem isoeleacutectrica
Componentes da soluccedilatildeo Quantidades
Acrilamida 28 (pv)
Bisacrilamida 2 (pv)
Sacarose
Anfoacutelitos 35-5(LKB)
Anfoacutelitos 4-65 (PHARMACIA)
Aacutegua bidestilada
TEMED 10 (vv) PSA 10 (pv)
18 ml
08 ml
2 g
100 ul
500 ul
ateacute 10 ml volume final
30 ul
70 ul
Tabela 248 Paracircmetros eleacutectricos utilizados na separaccedilatildeo de TF por focagem isoeleacutectrica
Voltagem (V) Corrente (mA) Potecircncia (W) Tempo (T)
Preacute focagem 1500 25
Focagem 2500 25
l 20 min
2 10 min
3 10 min
8 30 min
10 30 min
12 30 min
32
Material e Meacutetodos
As soluccedilotildees para os eleacutectrodos foram de aacutecido aspaacutertico 004 M (acircnodo) e de NaOH
1 M (caacutetodo) As amostras foram aplicadas a 15 cm do caacutetodo com o auxiacutelio de um aplicador
de borracha silicone (SERVA)
GC
Nas tabelas 249 e 2410 apresenta-se respectivamente a composiccedilatildeo da soluccedilatildeo de
polimerizaccedilatildeo e os paracircmetros eleacutectricos utilizados na focagem isoeleacutectrica de GC
Tabela 249 Soluccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo utilizada para a separaccedilatildeo da GC por focagem isoeleacutectrica
Componentes da soluccedilatildeo Quantidades
Acrilamida 28 (pv)
Bisacrilamida 2 (pv)
Sacarose
Anfoacutelitos 45-54 (PHARMACIA)
Anfoacutelitos 4-6 (LKB)
Aacutegua bidestilada TEMED 10 (vv)
PSA 10 (pv)
18 ml
08 ml
2 g
437 ul
188 (il
eacute 10 ml volume final
10 ul
70 ul
Tabela 2410 Paracircmetros eleacutectricos utilizados na separaccedilatildeo de GC por focagem isoeleacutectrica
Voltagem (V) Corrente (mA) Potecircncia (W) Tempo (T)
Preacute focagem 1500 25
Focagem 1500 25
1 30 min
2 15 min
3 15 min
4 3 h
5 30 min
33
Material e Meacutetodos
Para os eleacutectrodos foram utilizadas soluccedilotildees de aacutecido aspaacutertico 004 M (acircnodo) e de
NaOH 02 M (caacutetodo) As amostras foram inseridas com o auxiacutelio de um aplicador de
borracha silicone (SERVA) colocado a 15 cm do caacutetodo
25 - MEacuteTODOS DE DETECCcedilAtildeO
Apoacutes a separaccedilatildeo das proteiacutenas os padrotildees electroforeacuteticos foram geralmente obtidos
por detecccedilatildeo especiacutefica aproveitando a actividade cataliacutetica das enzimas Noutros casos a
revelaccedilatildeo foi feita por coloraccedilatildeo geral de proteiacutenas
bull HB
A visualizaccedilatildeo da HB foi obtida mediante coloraccedilatildeo geral de proteiacutenas segundo o
seguinte procedimento
Fixaccedilatildeo
Imersatildeo do gel numa soluccedilatildeo de aacutecido tricloroaceacutetico 125 (pv) durante 10 minutos
Coloraccedilatildeo geral de proteiacutenas
Coloraccedilatildeo com uma soluccedilatildeo de Coomassie R-250 0115 (pv) numa mistura de aacutecido
aceacuteticoetanolaacutegua destilada (42571) apoacutes aquecimento seguida de filtraccedilatildeo durante
5-10 minutos A descoloraccedilatildeo eacute feita com aacutecido aceacutetico etanol e aacutegua destilada
aquecida a cerca de 60degC ateacute se obter o contraste desejado
bull CAII
Apoacutes separaccedilatildeo por electroforese em gel de amido visualizou-se a CAII pela sua
actividade esteraacutesica adicionando-se diacetato de fluoresceiacutena (em quantidades vestigiais que
34
Material e Meacutetodos
foram previamente dissolvidas em 200 uacute de acetona) a uma soluccedilatildeo de incubaccedilatildeo tamponada
(pH = 66) Esta soluccedilatildeo de incubaccedilatildeo eacute composta por aacutecido ciacutetrico 27 mM e Na2HP04
116 mM e foi aplicada sobre o gel de amido com o auxiacutelio de papeacuteis de filtro Whatman ndegl
Em seguida incubou-se durante 30 minutos a 37degC A observaccedilatildeo das bandas de CAII (devido
agrave sua capacidade esteraacutesica) eacute feita sob luz ultravioleta
Apoacutes separaccedilatildeo por focagem isoeleacutectrica utilizou-se uma coloraccedilatildeo geral de proteiacutenas
para visualizaccedilatildeo da CAII segundo o meacutetodo descrito para a HB sem fixaccedilatildeo
bull PEPB
A detecccedilatildeo da PEPB apoacutes a separaccedilatildeo electroforeacutetica foi feita atraveacutes da aplicaccedilatildeo
sobre o gel de amido de papeacuteis de filtro Whatman ndegl embebidos numa soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo
seguindo-se uma incubaccedilatildeo de 30 minutos a 37degC
A soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo conteacutem o substrato da PEPB L-leucilglicil-glicina 0004 M
veneno de cobra da espeacutecie Agkistrodon piscivorus piscivorus 04 (pv) MTT 24 mM e
metosulfato de fenazina (PMS) 03 mM num tampatildeo de pH = 80 (Tris HC1005 M)
bull DIA
Apoacutes a separaccedilatildeo por electroforese em gel de amido a identificaccedilatildeo da DIA foi obtida
pela adiccedilatildeo de uma soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo a uma fatia do gel A incubaccedilatildeo decorreu durante 2
horas a 37degC
A soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo foi realizada em duas fases
Io - colocou-se 26-diclorofenol-indofenol (DCIP) 01 mM com um tampatildeo de
pH = 85 (Tris HC1 005M) adicionando-se agrave mistura aacutegua bidestilada ateacute perfazer
50 ml Em seguida filtrou-se a soluccedilatildeo
2o - agrave soluccedilatildeo filtrada adicionou-se MTT 03 mM e NADH 02 mM e agitou-se antes
de verter sobre a fatia de gel de amido
35
Material e Meacutetodos
bull NP
A detecccedilatildeo da enzima NP apoacutes a separaccedilatildeo por electroforese foi feita atraveacutes da
aplicaccedilatildeo sobre o gel de amido de papeacuteis de filtro Whatman ndegl embebidos com a soluccedilatildeo de
coloraccedilatildeo Em seguida incubou-se durante 15 minutos a 37degC
A soluccedilatildeo de incubaccedilatildeo conteacutem inosina 37 mM MTT 24 mM XOD 0004 Uml uma
gota de azul de Meldola (SIGMA) (10 vv em aacutegua bidestilada) e uma soluccedilatildeo de tampatildeo
de incubaccedilatildeo pH = 75 constituiacuteda por KH2P04 005 M e NaOH 004 M
bull MDH
Na detecccedilatildeo da actividade enzimaacutetica de MDH foi utilizado o meacutetodo de sandwich
apoacutes a sua separaccedilatildeo electroforeacutetica em gel de amido Em seguida incubou-se durante 15
minutos a 37degC O meacutetodo de sandwich consiste na aplicaccedilatildeo de uma fatia de gel de amido
entre duas folhas de papel de filtro Whatman ndegl embebido com a soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo
A soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo utilizada na detecccedilatildeo da MDH conteacutem NAD 1 mM MTT
2 mM e piruvato de soacutedio (quantidades vestigiais) Esta soluccedilatildeo foi feita com um tampatildeo de
incubaccedilatildeo pH = 74 constituiacutedo por aacutecido maacutelico 0222 M Tris 050 M e MgCl2 002 M
bull PGP
A detecccedilatildeo da actividade enzimaacutetica de PGD foi feita pelo meacutetodo de sandwich apoacutes a
sua separaccedilatildeo electroforeacutetica em gel de amido
A soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo conteacutem quantidades vestigiais de aacutecido 6-fosfoglucoacutenico
NADP MTT e uma gota de azul de Meldola (05 pv em aacutegua bidestilada) dissolvidos num
tampatildeo de pH = 74 constituiacutedo por Tris 01 M HisHCl 01 M Imidazol 0015 M e MgCl2
0005 M
36
Material e Meacutetodos
bull GPI
A detecccedilatildeo da actividade enzimaacutetica de GPI foi feita pelo meacutetodo de sandwich apoacutes a
sua separaccedilatildeo electroforeacutetica em gel de amido
A soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo conteacutem frutose-6-fosfato 55 mM NADP 22 mM MTT
4 mM desidrogenase da glucose-6-fosfato (G6PD) 14 Uml e uma gota de azul de Meldola
(05 pv em aacutegua bidestilada) dissolvidos num tampatildeo de pH = 74 constituiacutedo por Tris 01
M HisHCl 01 M Imidazol 0015 M e MgCl2 0005 M
bull MPI
Detectou-se a actividade enzimaacutetica de MPI pelo meacutetodo de sandwich apoacutes a sua
separaccedilatildeo electroforeacutetica em gel de amido
A soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo conteacutem manose-6-fosfato 42 mM NADP 13 mM MTT
24 mM e uma gota de azul de Meldola (05 pv em aacutegua bidestilada) dissolvidos num
tampatildeo de pH = 74 constituiacutedo por Tris 01 M HisHCl 01 M Imidazol 0015 M e MgCl2
0005 M Por fim adicionaram-se as enzimas isomerase da glucose-6-fosfato (GPI) 3 Uml e
desidrogenase da glucose-6-fosfato (G6PD) 5 Uml
bull ALBeTF
A detecccedilatildeo de ALB e de TF foi efectuada atraveacutes do meacutetodo de coloraccedilatildeo geral de
proteiacutenas descrito para a HB utilizando-se Coomasie R-250 sem fixaccedilatildeo
bull GCcedil
A visualizaccedilatildeo de GC efectuou-se por detecccedilatildeo imunoenzimaacutetica apoacutes transferecircncia da
proteiacutena para uma membrana de nitrocelulose (045 pm SCHLEICHER amp SCHULL)
segundo a teacutecnica descrita por FERRAND (1995)
37
Material e Meacutetodos
Apoacutes esse processo de transferecircncia as membranas de nitrocelulose foram lavadas 3
vezes (15 minutos) numa soluccedilatildeo de Tween 20 (MERCK) 0025 (vv) em soro fisioloacutegico
tamponado com fosfato (PBS Na2HP04 50 mM KH2P04 18mM NaCl 147 mM pH = 71) e
bloqueadas numa soluccedilatildeo de leite em poacute magro (5 pv em PBS) durante 18 h com agitaccedilatildeo
permanente e agrave temperatura ambiente
Depois da primeira lavagem aplicou-se o antisoro (anti-GC humana ATAB 81936)
diluiacutedo 1170 em PBS com 1 (pv) de albumina seacuterica bovina (SIGMA) durante 1 h agrave
temperatura ambiente
Repetiu-se novamente a lavagem segundo o processo jaacute referido seguindo-se a
aplicaccedilatildeo do segundo antisoro (anticorpos contra imunoglobulinas caprinas desenvolvidos em
coelho e conjugados com uma peroxidase ATAB 83806) diluiacutedo 1600 em PBS com 1
(pv) de albumina seacuterica bovina (SIGMA) durante 1 h agrave temperatura ambiente
Depois de duas lavagens (5 minutos) com Tween 20PBS procedeu-se agrave detecccedilatildeo da
GC com uma soluccedilatildeo de 9-amino-2-etilcarbazol 004 (pv) e de metanol 20 (vv) em PBS
As bandas correspondentes agrave actividade peroxidaacutesica aparecem rapidamente bloqueando-se a
reacccedilatildeo com aacutegua bidestilada
26 - MEacuteTODOS DE CAacuteLCULO
As frequecircncias geacutenicas foram calculadas por contagem directa de genes a partir da
distribuiccedilatildeo fenotiacutepica obtida
O caacutelculo dos valores de heterozigotia meacutedia (H) da proporccedilatildeo de loci polimoacuterficos
(P) do nuacutemero meacutedio de alelos por locus (ria) estatiacutesticas F e frequecircncias fenotiacutepicas
esperadas segundo o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg foi efectuado com a utilizaccedilatildeo do
programa BIOSYS versatildeo 17 (SWOFFORD amp SELANDER 1989)
O caacutelculo de distacircncias geneacuteticas e obtenccedilatildeo de dendrogramas foi efectuado com o
programa PHYLIP versatildeo 35 (FELSENTEIN 1993)
38
Resultados e Discussatildeo
3 - RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
31 - ANAacuteLISE DOS MEacuteTODOS DE SEPARACcedilAtildeO
De entre os 12 loci estudados neste trabalho detectaram-se 5 monomoacuterficos
(PEPB DIA GPI MDH e PGD) e 7 polimoacuterficos (HB CAII NP MPI ALB TF e GC)
Loci monomoacuterficos
bull PEPB
A utilizaccedilatildeo de teacutecnicas de electroforese em gel de amido permitiu a detecccedilatildeo de
um soacute fenoacutetipo (figura 311) correspondente a indiviacuteduos homozigoacuteticos para o alelo
PEPB2 descrito por DEL LAMA et ai (1992) No entanto na raccedila Minhota detectou-se
um indiviacuteduo heterozigoacutetico
O fenoacutetipo PEPB 2 apresenta um padratildeo com duas bandas uma de grande
intensidade e outra secundaacuteria mais anoacutedica de menor intensidade No indiviacuteduo
heterozigoacutetico 2-1 (natildeo representado) observou-se um padratildeo de trecircs bandas sendo a
terceira mais anoacutedica e menos intensa
A quase inexistecircncia de PEPB1 nas raccedilas estudadas estaacute de acordo com o referido
em DEL LAMA et ai (1992) que sugere a fixaccedilatildeo de PEPB2 na maior parte das
populaccedilotildees de bovinos de origem europeia (com excepccedilatildeo das raccedilas italianas Marchigiana
e Chianina)
39
Resultados e Discussatildeo
+
Figura 311 Fenoacutetipos de PEPB observados por electroforese convencional em gel de amido
bull DIA
Os resultados obtidos para a enzima DIA revelaram ausecircncia de polimorfismo
electroforeacutetico (figura 312) Resultados semelhantes foram tambeacutem obtidos em vaacuterias
raccedilas autoacutectones espanholas (GONZALEZ et ai 1987 IGLESIAS 1989 ARRANZ et ai
1992)
MAKAVEEV (1979 in IGLESIAS 1989) detectou polimorfismo desta enzima em
eritroacutecitos de buacutefalos da Bulgaacuteria e nas raccedilas bovinas Frisia e Simmental descrevendo dois
alelos codominantes DIAA e DIAB
Figura 312 Padratildeo de DIA observado por electroforese convencional em gel de amido
40
Resultados e Discussatildeo
Natildeo se detectou variaccedilatildeo electroforeacutetica para o locus GPI Estes resultados natildeo se
podem comparar com os obtidos noutras raccedilas por natildeo ter sido possiacutevel consultar outros
trabalhos onde se descrevesse variaccedilatildeo do locus GPI em gado bovino
A figura 313 apresenta o padratildeo obtido para esta enzima observando-se trecircs
bandas duas com grande intensidade e uma banda mais anoacutedica de menor intensidade
Figura 313 Padratildeo de GPI obtido em hemolisados por electroforese convencional em gel de amido
bull MDH
A enzima MDH revelou-se monomoacuterfiacuteca Este resultado eacute concordante com outros
estudos (ARRANZ et ai 1992)
Na figura 314 observa-se o padratildeo de bandas detectado por electroforese
convencional em gel de amido
Figura 314 Padratildeo de MDH observado por electroforese convencional em gel de amido
41
Resultados e Discussatildeo
bull PGD
A enzima PGD revelou-se monomoacuterfica para as raccedilas Barrosatilde e Minhota tambeacutem
neste caso natildeo se encontrou qualquer referecircncia bibliograacutefica relativa a um possiacutevel
polimorfismo deste locus em gado bovino
Na figura 315 observa-se o padratildeo obtido para esta enzima Em amostras
armazenadas por um longo periacuteodo de tempo detectaram-se duas bandas sendo a mais
anoacutedica a que revela menor intensidade as amostras mais recentes apresentam um padratildeo
electroforeacutetico com uma soacute banda
Figura 315 Padratildeo de PGD observado por electroforese convencional em gel de amido
Loci polimoacuterficos
bull HB
A electroforese convencional natildeo permite discriminar os electromorfos de HB No
entanto a utilizaccedilatildeo de sistemas de focagem isoeleacutectrica conduz agrave detecccedilatildeo de
polimorfismo nesta proteiacutena observando-se dois fenoacutetipos HB A e HB AB
Na figura 316 observa-se o padratildeo electroforeacutetico desta moleacutecula resultante da
expressatildeo de dois alelos codominantes HBA e HBB Resultados idecircnticos estatildeo
descritos em raccedilas bovinas da Peniacutensulas Ibeacuterica (VICENTE 1978 KiDD et ai 1980
IGLESIAS 1989)
42
Resultados e Discussatildeo
+ -HBB
HBA
AB AB A A
Figura 316 Separaccedilatildeo de hemoglobina nativa por focagem isoeleacutectrica
bull poundAH
A utilizaccedilatildeo de electroforese em gel de amido e focagem isoeleacutectrica permitiu
identificar trecircs fenoacutetipos CAII F CAII FS e CAII S atribuiacutedos agrave expressatildeo de dois alelos
codominantes CAF e CAS (figuras 317 e 318) Poreacutem a separaccedilatildeo por electroforese em
gel de amido implica alguma morosidade (tempos de corrida muito longos) e em amostras
coaguladas o erro de leitura pode ser superior a 20 Estas dificuldades satildeo minimizadas
quando se recorre a focagem isoeleacutectrica
Assim a separaccedilatildeo da enzima CAII por focagem isoeleacutectrica oferece vaacuterias vantagens
nomeadamente
bull rapidez e simplicidade de execuccedilatildeo
bull utilizaccedilatildeo de pequenas quantidades de material bioloacutegico
bull maior nuacutemero de amostras fenotipadas por corrida
bull possibilidade de utilizaccedilatildeo de amostras coaguladas
43
Resultados e Discussatildeo
F F F S FS FS F S FS
Figura 317 Fenoacutetipos de CAII observados sob luz ultravioleta apoacutes separaccedilatildeo por electroforese convencional em gel de amido e coloraccedilatildeo com diacetato de fluoresceina
CAIIF
| CAIIS
Figura 318 Fenoacutetipos de CAII observados por focagem isoeleacutectrica apoacutes coloraccedilatildeo geral de proteiacutenas
bull NP
A expressatildeo fenotiacutepica de NP resulta das combinaccedilotildees possiacuteveis entre um alelo
dominante NPH e um recessivo NPL (ANSAY 1973) Este facto implica que apenas em
presenccedila do feno tipo NP L eacute possiacutevel fazer corresponder um genoacutetipo (jaacute que o fenoacutetipo NP H
pode corresponder aos genoacutetipos HH e HL e o fenoacutetipo NP L corresponde ao genoacutetipo LL)
Na figura 319 apresenta-se o padratildeo obtido para a proteiacutena apoacutes separaccedilatildeo
electroforeacutetica em gel de amido
44
+
w
FS FS ]
Resultados e Discussatildeo
H L L H L L
Figura 319 Fenoacutetipos de NP detectados por electroforese convencional em gel de amido
bull MPI
Na raccedila Minhota detectaram-se quatro fenoacutetipos MPI AB MPI B MPI BC e MPI C
anteriormente descritos por ANSAY (1973) em bovinos na raccedila Barrosatilde apenas se observam
os trecircs uacuteltimos fenoacutetipos De acordo com o mesmo autor os fenoacutetipos encontrados nesta raccedila
resultam da combinaccedilatildeo de dois alelos codominantes MPIB e MPPC enquanto que MPIA
aparece na raccedila Minhota com uma frequecircncia reduzida
Como se pode observar pela anaacutelise da figura 3110 MPIA aparece como o alelo
mais anoacutedico MPIC como o mais catoacutedico e o alelo mais frequente MPIB situa-se numa
posiccedilatildeo intermeacutedia em relaccedilatildeo aos anteriores Contudo a intensidade das bandas eacute muito
fraca tornando-se quase imperceptiacutevel em alguns casos Esta grande dificuldade em obter um
contraste de bandas adequado mesmo apoacutes longos periacuteodos de incubaccedilatildeo a 37degC poderaacute
eventualmente levar a uma incorrecta interpretaccedilatildeo dos fenoacutetipos Assim a utilizaccedilatildeo de
sistemas de focagem isoeleacutectrica na determinaccedilatildeo destes fenoacutetipos seria aconselhaacutevel a fim
de verificar os resultados obtidos por electroforese convencional
45
Resultados e Discussatildeo
Figura 3110 Fenoacutetipos de MPI observados por electroforese convencional em gel de amido
bull ALB
A separaccedilatildeo por focagem isoeleacutectrica permitiu detectar polimorfismo em ALB Cada
indiviacuteduo homozigoacutetico aparece com trecircs bandas duas de maior intensidade e uma mais
aciacutedica com menor intensidade os indiviacuteduos heterozigoacuteticos podem apresentar ateacute seis
bandas
Esta heterogeneidade nos padrotildees de ALB tem sido interpretada como o resultado da
capacidade desta proteiacutena se ligar a vaacuterias substacircncias diferentes (FERRAND 1995) Com a
inclusatildeo de ureia (8M) na matriz de separaccedilatildeo reagente que provoca a desnaturaccedilatildeo da
proteiacutena levando a uma alteraccedilatildeo do seu pi para uma zona mais baacutesica do gradiente
conseguem-se obter padrotildees de bandas mais simples e mais definidos (KAWAGUCHI 1973
FERRAND 1995)
Na figura 3111 apresentam-se os padrotildees observados que foram interpretados como
sendo determinados por trecircs alelos codominantes ALBA ALBB e ALBV
GAHNE et ai (1977) e IGLESIAS (1989) detectaram por electroforese em gel de
poliacrilamida e de amido respectivamente dois variantes em gado bovino ALBA e
ALBB A utilizaccedilatildeo de focagem isoeleacutectrica veio confirmar a existecircncia destes dois alelos e
acrescentar um terceiro designado por ALBV com uma mobilidade mais aciacutedico do que
ALBA
46
Resultados e Discussatildeo
A B A B A B B B A B A G
Figura 3111 Fenoacutetipos de ALB determinados em amostras de plasma por focagem isoeleacutectrica na presenccedila de ureia 8M
ARRANZ et ai (1992) revelaram a existecircncia de um outro variante (ALBD) com
mobilidade electroforeacutetica intermeacutedia entre ALBA e ALBB ainda natildeo descrito em
nenhuma raccedila autoacutectone espanhola Este alelo poderaacute corresponder ao alelo ALBV
encontrado neste trabalho apesar de apresentar um pi mais aacutecidico do que ALBA (ARRANZ
comunicaccedilatildeo pessoal)
Desta forma a teacutecnica de separaccedilatildeo por focagem isoeleacutectrica provou ser eficaz na
separaccedilatildeo dos variantes de ALB tal como jaacute foi demonstrado no gato (BELL et ai 1994) na
ovelha (ERHARDT amp SIMIANER 1993) e no coelho (FERRAND amp ROCHA 1992)
bull TF
A transferrina eacute um dos marcadores mais importantes no estudo e caracterizaccedilatildeo
geneacutetica de raccedilas bovinas devido ao seu elevado polimorfismo No entanto a sua fenotipagem
natildeo eacute simples existindo frequentemente problemas de resoluccedilatildeo e de separaccedilatildeo das bandas
(IGLESIAS 1989)
A fim de averiguar qual a melhor forma de separar os diferentes produtos geacutenicos
descritos no locus TF testaram-se vaacuterios sistemas electroforeacuteticos em geacuteis de agarose numa
vasta gama de sistemas tampatildeo Esta teacutecnica natildeo ofereceu resultados satisfatoacuterios pelo que se
passou agrave separaccedilatildeo da TF por focagem isoeleacutectrica recorrendo a matrizes de poliacrilamida
47
Resultados e Discussatildeo
com diferentes concentraccedilotildees de ureia (6M e 8M) tambeacutem neste caso natildeo se conseguiram
resultados positivos
Este tipo de dificuldades encontradas na fenotipagem da TF por focagem isoeleacutectrica
tinham jaacute sido descritos noutras espeacutecies nomeadamente na cabra (ERHARDT 1986) e no
coelho (FERRAND 1995) No entanto TSUJI et ai (1989) demostraram ser possiacutevel fenotipar
esta proteiacutena em bovinos por focagem isoeleacutectrica sem grandes problemas e sem qualquer
aditivo na matriz de poliacrilamida
Desta forma a utilizaccedilatildeo de uma teacutecnica de focagem isoeleacutectrica com um gradiente de
pH 35-65 reforccedilado em 40-65 permitiu separar os produtos geacutenicos do locus TF Contudo
os padrotildees obtidos nem sempre eram definidos tornando-se dificilmente interpretaacuteveis
Na tentativa de melhorar os padrotildees de resoluccedilatildeo e de verificar se a variaccedilatildeo detectada
natildeo resultava de diferenccedilas no estado feacuterrico da moleacutecula de TF ou ainda da existecircncia de
aacutecidos siaacutelicos ligados agrave moleacutecula procedeu-se agrave sua separaccedilatildeo apoacutes vaacuterios tratamentos das
amostras
A remoccedilatildeo dos aacutecidos siaacutelicos atraveacutes do tratamento das amostras com neuraminidase
natildeo permitiu a obtenccedilatildeo de bandas definidas este tratamento natildeo altera significativamente o
padratildeo das bandas de TF de bovinos como jaacute tinha sido descrito por PENHALLOU et ai
(1991)
A obtenccedilatildeo de TF no estado apofeacuterrico foi conseguida submetendo as amostras a um
tratamento com EDTA-dissoacutedico Neste caso observa-se que apoTF apresenta uma
mobilidade menor e um padratildeo de bandas mais simples mas ainda sem uma definiccedilatildeo
adequada
A forma Fe2TF foi obtida mediante vaacuterios tratamentos com dadores de Fe (ver capiacutetulo
Material e Meacutetodos) Os resultados soacute se mostraram satisfatoacuterios atraveacutes da saturaccedilatildeo da
moleacutecula de TF com uma soluccedilatildeo de sulfato de amoacutenio feacuterrico provavelmente por causar uma
maior estabilidade da moleacutecula ao longo da sua separaccedilatildeo por focagem isoeleacutectrica com
elevadas voltagens pois segundo WELCHS (1990) a forma difeacuterrica da transferrina eacute mais
resistente agrave desnaturaccedilatildeo e ao calor do que a forma apoTF
48
Resultados e Discussatildeo
Estatildeo descritos pelo menos oito alelos no locus TF TFAl TFA2 TFB TFD1
TFD2 TFE TFF e TFG os mais comuns no gado europeu (Bos taurus) satildeo TFA
TFD1 TFD2 e TFE (JAMIESON 1965) No gado asiaacutetico e africano (Bos indicus) ocorrem
aleacutem das formas anteriores os alelos TFB e TFF
Na figura 3112 apresenta-se o proteinograma obtido com a utilizaccedilatildeo de amostras
saturadas com Fe Esta teacutecnica permitiu a separaccedilatildeo de TFD em TFD1 e TFD2 e a
detecccedilatildeo de todos os outros fenoacutetipos descritos em bovinos europeus Assim observaram-se
quatro alelos codominantes TFA TFD1 TFD2 e TFE
A expressatildeo fenotiacutepica dos alelos em homozigotia caracteriza-se pela presenccedila de dois
dupletos de bandas aparecendo a banda mais aciacutedica de cada dupleto com intensidade mais
fraca Os indiviacuteduos herozigoacuteticos podem apresentar ateacute oito bandas
Figura 3112 Fenoacutetipos de TF determinados por focagem isoeleacutectrica apartir de amostras saturadas com uma soluccedilatildeo de sulfato de amoacutenio feacuterrico
IGLESIAS (1989) detectou TFA e TFD nas cinco raccedilas de bovinos da Galiza o
variante TFE na raccedila Cachena espanhola e um outro variante raro TFR com mobilidade
mais lenta na raccedila Rubia Galega
bull QQ
A GC eacute uma proteiacutena plasmaacutetica que demonstra um elevado grau de heterogeneidade
geneacutetica em mamiacuteferos (FERRAND 1995)
A separaccedilatildeo de GC em focagem isoeleacutectrica seguida da utilizaccedilatildeo de immunoblotting
melhorou de forma consideraacutevel a capacidade de investigar a variaccedilatildeo desta proteiacutena em
49
Resultados e Discussatildeo
diferentes espeacutecies (JUNEJA et ai 1987 PENEDO amp JUNEJA 1989 STRATIL et ai 1990
KALAacuteB et ai 1990 STERN et ai 1992 VANKAN amp BELL 1992 FERRAND 1995)
Nas figuras 3113 e 3114 apresentam-se alguns dos fenoacutetipos obtidos na separaccedilatildeo
da GC por focagem isoeleacutectrica Verifica-se que em amostras tratadas com neuraminidase o
padratildeo de bandas se apresenta mais simplificado surgindo no entanto duas bandas (uma
mais baacutesica e uma mais aciacutedica) de natureza desconhecida Os padrotildees observados foram
interpretados como sendo determinados por dois alelos GCF e GCS
mdashGCF
S F S FS S FS F F S FS 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Figura 3113 Fenoacutetipos de GC determinados por focagem isoeleacutectrica amostras 1 8 9 e 10 tratadas com neuraminidase amostras 2 a 7 diluiacutedas em aacutegua bidestilada
S1 $ l S- -
FS S S S F S FS S FS F S
Figura 3114 Fenoacutetipos de GC determinados em amostras de plasma tratados com neuraminidase apoacutes focagem isoeleacutectrica
Nota-se a existecircncia de dois alelos codominantes GCF e GCS sendo o segundo
mais aciacutedico do que o primeiro
50
Resultados e Discussatildeo
32 - ANAacuteLISE FAMILIAR
A realizaccedilatildeo da anaacutelise familiar relativo ao conjunto de loci polimoacuterficos estudados
observa-se no estudo de 27 pares matildeefilho Esta situaccedilatildeo resulta da grande dificuldade
existente na obtenccedilatildeo de informaccedilatildeo sobre os machos
Os resultados apresentam-se nas tabelas 321 a 326 natildeo foi possiacutevel testar o
equiliacutebrio de Hardy-Weinberg devido ao reduzido tamanho da amostra bem como ao facto de
vaacuterios alelos ocorrerem em baixa frequecircncia
Refira-se que natildeo foi detectado qualquer caso de exclusatildeo matildeefilho
Tabela 321 Sistema CAII Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica em 27 pares matildeefilho Os valores esperados segundo o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg estatildeo indicados entre parecircntesis
Total
4 (32) 17
(122) 6
(116) 27
Tabela 322 Sistema NP Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica em 27 pares matildeefilho Os valores esperados segundo o equiliacutebrio de Hardy--Weinberg estatildeo indicados entre parecircntesis
Total
14
(114)
13
(156)
27
^ ^ ^ Filho
Matildee - ^ F
Fenoacutetipos
F f~ (11)
FS 2
(21)
S
Total 3
Fenoacutetipos
FS S
3
(21)
10 5
(61) (40)
1 5
(40) (76)
14 10
- v ^ ^ Filho Fenoacutetipos
Matildee - ^ H L
Fenoacutetipos
H 10 4
(77) (37)
L 5 8
(37) (119)
Total 15 12
51
Resultados e Discussatildeo
Tabela 323 Sistema MPI Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica em 26 pares matildeefilho Os valores esperados segundo o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg estatildeo indicados entre parecircntesis
^ Filho Fenoacutetipos Total
Matildee ^ ~ ^ A AB AC B BC c Fenoacutetipos
A 0 0 0 - - - 0
(00) (00) (00) (00)
AB 0 0 0 0 0 - 0
(00) (00) (00) (00) (00) (00)
AC 0 0 0 - 0 0 0
(00) (00) (00) (00) (00) (00)
B - 0 - 24 1 - 25
(00) (242) (06) (248)
BC - 0 0 1 0 0 1
(00) (00) (06) (06) (00) (12)
C - - 0 - 0 0 0
(00) (00) (00) (00)
Total 0 0 0 25 1 0 26
Tabela 324 Sistema ALB Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica em 27 pares matildeefilho Os valores esperados segundo o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg estatildeo indicados entre parecircntesis
^ ^ Filho Fenoacutetipos Total
M atilde e ^ ^ - s ^ ^ A AB AV B BV V
Fenoacutetipos
A 24 2 0 - - - 26
(251) (04) (02) (257)
AB 0 0 0 0 0 -
0
(04) (04) (00) (00) (00) (08)
AG 1 0 0 - 0 0 1
(02) (00) (02) (00) (00) (04)
B - 0 - 0 0 - 0
(00) (00) (00) (00)
BG - 0 0 0 0 0 0
(00) (00) (00) (00) (00) (00)
G - - 0 - 0 0 0
(00) (00) (00) (00)
Total 25 2 0 0 0 0 27
52
Resultados e Discussatildeo
Tabela 325 Sistema TF Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica em 27 pares matildeefilho Os valores esperados segundo o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg estatildeo indicados entre parecircntesis
Filho Fenoacutetipos Total
Matildee ^ A ADI AD2 AE Dl D1D2 DIE D2 D2E E
Fenoacutetipos
A 6
(51)
1
(14)
4
(21)
1
(03)
12
(89)
ADI 1 2 0 0 0 0 0 - - - 3
(14) (24) (06) (01) (04) (06) (01) (56)
AD2 2 0 5 0 - 0 - 2 0 - 9
(21) (06) (36) (01) (06) (08) (01) (79)
AE 0 0 0 0 - - 0 - 0 0 0
(03) (01) (01) (06) (01) (01) (00) (13) Dl 0
(04) 1
(01)
1
(02)
0
(00)
- 2
(07)
D1D2 - 0 1 - 0 0 0 0 0 - 1
(06) (06) (02) (10) (00) (02) (00) (26) DIE - 0 - 0 0 0 0 - 0 0 0
(01) (01) (00) (00) (02) (00) (00) (04)
D2 0
(08) 0
(02)
0
(03)
0
(01)
- 0
(14) D2E - - 0 0 - 0 0 0 0 0 0
(01) (01) (00) (00) (01) (02) (00) (05) E 0
(00) 0
(00)
0
(00)
0
(00)
0
(00)
Total 9 3 10 1 1 1 0 2 0 0 27
Tabela 326 Sistema GC Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica em 27 pares matildeefilho Os valores esperados segundo o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg estatildeo indicados entre parecircntesis
- - ^ F i l h o Fenoacutetipos Total
Matildee ^ ^ 1 2-1 2
Fenoacutetipos
1 17 2 19
(156) (31) (187)
2-1 5 2 0 7
(31) (38) (06) (75)
2 _ 1 0 1
(06) (01) (07)
Total 22 5 0 27
53
Resultados e Discussatildeo
33 - ANAacuteLISE POPULACIONAL LOCUS A LOCUS
Neste capiacutetulo faz-se a anaacutelise populacional dos loci polimoacuterficos e ainda dos loci
PEPB e DIA para os quais natildeo se detectou variaccedilatildeo na raccedila Barrosatilde A sua inclusatildeo justifica-
-se pelo facto de serem polimoacuterficos noutras raccedilas bovinas ou em espeacutecies aparentadas
bull PEPB
O locus PEPB revelou-se monomoacuterfico nas trecircs populaccedilotildees de bovinos de raccedila
Barrosatilde e Minhota tendo sido detectado um uacutenico produto geacutenico PEPB2 (observado um
indiviacuteduo heterozigoacutetico da raccedila Minhota) No entanto este locus eacute referido como polimoacuterfico
em raccedilas bovinas criadas no Brasil onde se detectaram dois alelos codominantes PEPB1 e
PEPB2 (DEL LAMA et ai 1992)
O alelo PEPB2 estaacute fixado nas raccedilas de origem europeia incluindo as estudadas neste
trabalho excepto nas raccedilas italianas Marchigiana e Chianina nas quais PEPB1 apresenta
frequecircncias geacutenicas entre 011 e 014 (tabela 331)
Tabela 331 Frequecircncias geacutenicas de PEPB em vaacuterias raccedilas bovinas
N
Frequecircncias geacutenicas N PEPB1 PEPB2 Referecircncia
Barrosatilde inscrita 141 - 100 Este trabalho
Barrosatilde natildeo inscrita 153 - 100 t i
Minhota 62 001 plusmn0003 099 plusmn 0003 ec
Blonde dAquitaine 13 - 100 DEL LAMAetal 1992)
Charolesa 118 - 100 laquo
Chianina 83 014 plusmn003 086 plusmn 003 t t
Hereford 79 - 100 et
Frisia 125 - 100 t t
Jersey 139 - 100
Limousine 24 - 100
Marchigiana 85 011 plusmn002 089 plusmn 002 te
Simmental 75 - 100 t t
54
Resultados e Discussatildeo
bull DIA
Pela anaacutelise da tabela 332 verifica-se natildeo existir variaccedilatildeo geneacutetica neste locus nas
raccedilas bovinas apresentadas estando fixado o alelo DIAS os resultados obtidos estatildeo de
acordo com os jaacute publicados por outros autores (GONZALEZ et ai 1987 IGLESIAS 1989) Por
outro lado nas populaccedilotildees de buacutefalos ocorre um segundo alelo DIAF com frequecircncias
entre 019 e 021
Tabela 332 Frequecircncias geacutenicas de DIA em vaacuterias populaccedilotildees de raccedilas bovinas e buacutefalos
Frequecircncias geacutenicas
N DIAF DIAS Referecircncia
Portugal
Barrosatilde inscrita 141
Barrosatilde natildeo inscrita 153
Minhota 62
Espanha
Cachena 71
Caldelana 60
Frieiresa 33
Limiana 39
Rubia Gallega 168
Vianesa 40
Sayaguesa (Zamora) 147
Morucha (Salamanca) 101
Alistana Sanabresa 157
Blanca Cacerena 62
Caacuterdena Andaluza 25
Asturiana de los Vallegraves 127
Asturiana de la Montana 106
Bulgaacuteria
Buacutefalo 122
Murrah (Buacutefalo) 51
raquo IGLESIAS (1989)
- 100 Este trabalho
- 100
- 100 a
- 100 IGLESIAS (1989)
- 100
- 100
- 100
- 100
- 100
- 100 GONZALEZ et al (19
- 100
- 100 st
- 100 st
- 100
- 100
- 100
019 + 00 081 plusmn00 MAKAVEEV(1984
021 plusmn00 079 plusmn 00 laquo
55
Resultados e Discussatildeo
bull HB
Os resultados obtidos no estudo de HB permitiram distinguir dois fenoacutetipos definidos
por dois alelos HBA e HBB (tabela 333)
Tabela 333 Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica de HB em populaccedilotildees das raccedilas Barrosatilde e Minhota Os valores esperados de acordo com o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg estatildeo indicados entre parecircntesis
Fenoacutetipos N HBA HBAB HBB
Barrosatilde inscrita 141 141
Barrosatilde natildeo inscrita 153 153
Minhota 62 56 6 0
(561) (58) (01)
As frequecircncias geacutenicas das raccedilas estudadas bem como outras jaacute publicadas referentes a
vaacuterias raccedilas bovinas europeias e a duas espeacutecies de buacutefalos encontram-se discriminadas na
tabela 334
A elevada frequecircncia do alelo HBA nas raccedilas estudadas (fixado na raccedila Barrosatilde)
situam-nas juntamente com outras raccedilas bovinas do centro e sul da Europa onde este alelo
ocorre com frequecircncias entre 080-098 (VICENTE 1978) Nas restantes raccedilas europeias
HBA ocorre com uma ampla margem de variaccedilatildeo (038 - 100) apresentando-se quase
sempre como o alelo mais frequente
No caso dos buacutefalos observa-se uma inversatildeo nos valores das frequecircncias geacutenicas
sendo o alelo HBB o mais frequente
A presenccedila de HBB nos bovinos europeus apesar de em baixa frequecircncia pode ser
indicativo de uma origem a partir de raccedilas asiaacuteticas ou africanas jaacute que eacute nestes continentes
que este alelo ocorre com frequecircncia mais elevadas as frequecircncias geacutenicas mais elevadas estatildeo
descritas no gado zebu da Aacutefrica (BRAEND 1971 VICENTE 1978)
56
Resultados e Discussatildeo
Tabela 334 Frequecircncias geacutenicas de HB em vaacuterias populaccedilotildees de raccedilas bovinas e buacutefalos
N
Frequecircncias geacutenicas
N HBA HBB Referecircncia
Portugal
Barrosatilde inscrita 141 100 - Este trabalho
Barrosatilde natildeo inscrita 153 100 -
Minhota 62 095 plusmn 002 005 plusmn 002
Mertolenga 147 093 plusmn 002 007 plusmn 002 KTOD et ai (1980)
Alentejana 155 096 plusmn 001 004 plusmn001 IacuteIacute
Mirandesa 107 099+001 001 plusmn001 NOBRE (S data)
Espanha
Cachena 71 091 + 002 009 plusmn 002 IGLESIAS (1989)
Caldelana 60 097 plusmn 002 003 plusmn 002
Frieiresa 33 095 plusmn 003 005 plusmn 003
Limiana 39 090 plusmn 003 010 plusmn003
Rubia Gallega 168 093 plusmn 001 007 plusmn001 ce
Vianesa 40 098 plusmn 002 002 plusmn002
Sayaguesa (Zamora) 147 083 plusmn002 017 plusmn002 GONZALEZ et al ( 1987)
Morucha (Salamanca) 101 084 plusmn 003 016 plusmn003 ce
Alistana Sanabresa 157 099 plusmn 001 001 plusmn001
Blanca Cacerefia 62 071 plusmn 004 029 plusmn 004 laquo
Caacuterdena Andaluza 25 096 plusmn 003 004 plusmn 003 IacuteIacute
Asturiana de los Vallegraves 127 091 plusmn002 009 plusmn002
Pirenaica 383 084 plusmn 001 016 plusmn001 VICENTE (1978)
Tudanca 42 065 plusmn 005 035 plusmn 005 laquo
Morena del N O 25 100 -
Frisona 97 100 - laquo
Asturiana de la Montaria 106 079+003 021 plusmn003
De Lidia 124 079 plusmn 003 021 plusmn003 KlDDeacutetal (1980)
Retinta 164 081 plusmn002 019 plusmn002
Itaacutelia
Chianina 264 096 plusmn 001 004 plusmn 001 CARENZiera (1970)
Marchigiana 112 099 plusmn001 001 plusmn001
Bulgaacuteria
Sofia Brown 173 089 plusmn 002 011 plusmn002 MAKAVEEV (1970)
Buacutefalo 77 009 plusmn 002 091 plusmn002 MAKAVEEV(1984)
Murrah (Buacutefalo) 51 015 plusmn004 085 plusmn 004 ce
G Bretanha
Jersey 467 038 plusmn 002 062 plusmn 002 LARSENefa (1974)
in IGLESIAS (1989)
57
Resultados e Discussatildeo
A frequecircncia obtida para HBB na raccedila Minhota (005) aproxima-a das raccedilas do sul da
Europa onde este alelo ocorre com uma frequecircncia de aproximadamente 01 Por outro lado a
completa ausecircncia de HBB na raccedila Barrosatilde eacute um resultado interessante mas para o qual natildeo
eacute possiacutevel fornecer actualmente uma explicaccedilatildeo satisfatoacuteria
CAII
A distribuiccedilatildeo dos fenoacutetipos observados para o locus CAII apresenta-se na tabela
335
Tabela 335 Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica de CAU em populaccedilotildees das raccedilas Barrosatilde e Minhota Entre parecircntesis indicam-se os valores esperados de acordo com o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg
Fenoacutetipos N CA F CAFS CAS
Barrosatilde inscrita 141 17 58 66
(149) (622) (639)
Barrosatilde natildeo inscrita 153 20 71 62
(200) (710) (620)
Minhota 62 3 13 46
(14) (162) (444)
x2
0651 1 0420
0000 1 0995
Os valores do teste de 2 nas populaccedilotildees de raccedila Barrosatilde demonstram natildeo haver
desvios significativos ao equiliacutebrio de Hardy-Weinberg apesar de se observar um ligeiro
excesso de homozigoacuteticos F na populaccedilatildeo de raccedila Barrosatilde (inscrita) Para a raccedila Minhota natildeo
foi possiacutevel testar o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg
Na tabela 336 apresentam-se as frequecircncias geacutenicas de CAII nas populaccedilotildees
estudadas bem como as publicadas por outros autores
O locus CAII apresenta-se polimoacuterfico na maior parte das populaccedilotildees bovinas
europeias sendo o alelo CAIIS o que ocorre com frequecircncia mais elevada
58
Resultados e Discussatildeo
Tabela 336 Frequecircncias geacutemeas de CAU em vaacuterias populaccedilotildees de raccedilas bovinas e de buacutefalos
N
Frequecircncias geacutenicas N CAS CAF Referecircncia
Portugal
Barrosatilde inscrita 141 068 plusmn 003 032 plusmn 003 Este trabalho
Barrosatilde natildeo inscrita 153 064+003 036 plusmn 003
Minhota 62 085 plusmn 003 015+003 Iacute Iacute
Mertolenga 147 085 plusmn 002 015+002 Kn)Deiacutea(1980)
Alentejana 155 091 plusmn 002 009 plusmn 002
Mirandesa 107 099 + 001 001+001 NOBRE (S data)
Espanha
Cachena 71 077 + 004 023 plusmn 004 IGLESIAS (1989)
Caldelana 60 096 plusmn 002 004 plusmn 002 ce
Frieiresa 33 094 + 003 006 plusmn 003
Limiana 39 083 + 004 017 plusmn 004
Rubia Gallega 168 089 plusmn 002 011+002
Vianesa 40 086 + 004 014 plusmn 004
Sayaguesa 147 072 plusmn 003 028+003 GONZALEZ eacutetal (1987)
Morucha 101 072 plusmn 003 028 plusmn 003 a
Alistana Sanabresa 157 092 plusmn 002 008+002 iacute iacute
Blanca Cacerena 62 067 plusmn 004 033 plusmn 004 IacuteIacute
Caacuterdena Andaluza 25 100
Asturiana de los Vallegraves 127 087 plusmn 002 013+002 laquo
Asturiana de la Montaria 106 077 plusmn003 023 plusmn 003 IacuteIacute
Tudanca 42 076 plusmn 005 024 plusmn 005 VICENTE (1978)
Morena del NO 25 092 plusmn 004 008 plusmn 004
De Lidia 124 061+003 039 plusmn 003 KjDDetal (1980)
Retinta 164 065 + 003 035+003 iacuteiacute
Bulgaacuteria
Buacutefalo 263 007 + 001 093+001 MAKAVEEV(1984)
Murran (Buacutefalo) 51 020 plusmn 004 080 plusmn 004 laquo
Alemanha
Frisia 550 083 plusmn 001 017 + 001 THTNNES eacutetal (1976)
Suiacuteccedila
Simmental 1039 079 + 001 021+001 KAgraveSTLIeacutetal (1980)
Castanha Suiacuteccedila 546 087 plusmn 001 013+001
Friburg 223 084 + 002 016+002
in IGLESIAS (1989)
59
Resultados e Discussatildeo
As frequecircncias aleacutelicas de CAIPS e CAIPF nas raccedilas Cachena espanhola e Barrosatilde
portuguesa satildeo idecircnticas o que poderaacute eventualmente indicar estar-se em presenccedila de uma soacute
raccedila com designaccedilotildees diferentes nos dois paiacuteses Esta hipoacutetese eacute reforccedilada pelo facto de natildeo
haver diferenccedilas significativas entre dados morfomeacutetricos obtidos nas duas raccedilas (LEAL 1995)
Nos buacutefalos observa-se mais uma vez uma inversatildeo nas frequecircncias dos dois alelos do
locus CAII em relaccedilatildeo aos bovinos sendo CAF o mais frequente com valores situados entre
080 e 093
bull NP
Pela anaacutelise das tabelas 337 e 338 verifiacuteca-se a presenccedila dos dois alelos descritos
neste locus nas vaacuterias raccedilas bovinas sendo NPL o mais frequente nas raccedilas europeias (052 e
099) Observa-se uma grande similaridade entre os valores das frequecircncias geacutenicas o que natildeo
permite diferenciar as raccedilas estudadas neste trabalho das restantes
Tabela 337 Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica de NP em populaccedilotildees das raccedilas Barrosatilde e Minhota
N
Fenoacutetipos
N NP H NPL
Barrosatilde inscrita 141 69 72
Barrosatilde natildeo inscrita 153 55 98
Minhota 62 19 43
60
Resultados e Discussatildeo
Tabela 338 Frequecircncias geacutenicas para NP em vaacuterias populaccedilotildees e raccedilas bovinas
N
Frequecircncias geacutenicas
N NPH NPL Referecircncia
Portugal
Barrosatilde inscrita 141 029 plusmn 003 071 plusmn 003 Este trabalho
Barrosatilde natildeo inscrita 153 020 plusmn 002 080 plusmn 002 cc
Minhota 62 017 + 004 083 + 004
Espanha
Cachena 71 020 plusmn 003 080 plusmn 003 IGLESIAS (1989)
Caldelana 60 013+003 087 plusmn 003 t t
Frieiresa 33 011+004 089 plusmn 004
Limiana 39 008 plusmn 003 092 plusmn 003
Rubia Gallega 168 015+002 085 plusmn 002
Vianesa 40 013 + 004 087 plusmn 004 t i
Sayaguesa 147 014 + 002 086 plusmn 002 GONZALEZ et ai ( 1987)
Morucha 101 020 plusmn 003 080 plusmn 003
Alistana Sanabresa 157 001+001 099 + 001
Blanca Cacerena 62 048 plusmn 005 052 plusmn 005 laquo
Caacuterdena Andaluza 25 004 plusmn 003 096 plusmn 003 IacuteIacute
Asturiana de los Vallegraves 127 028 plusmn 003 072 plusmn 003
Asturiana de la Montana 106 026 plusmn 003 074 plusmn 003
Beacutelgica
Charolesa 130 026 plusmn 003 074 + 003 ANSAY amp HANSET (1972)
Frisia 91 006 plusmn 002 094 plusmn 002 t t
in IGLESIAS (1989)
MPI
A distribuiccedilatildeo dos fenoacutetipos observados para o locus MPI apresenta-se na tabela 339
Das trecircs populaccedilotildees estudadas apenas a raccedila Minhota apresenta valores observados
proacuteximos dos valores esperados segundo o formalismo de Hardy-Weinberg Por outro lado
apesar de natildeo ter sido possiacutevel testar o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg nas restantes populaccedilotildees
a aparente diferenccedila entre valores observados e esperados poderaacute dever-se a um excesso de
indiviacuteduos homozigoacuteticos para MPIC Este resultado poderaacute estar relacionado com o
processo de amostragem ou com outras causas como o acasalamento entre indiviacuteduos
61
Resultados e Discussatildeo
aparentados a existecircncia de sub-populaccedilotildees de tamanho pequeno ou ainda a um reduzido
nuacutemero de machos reprodutores
Tabela 339 Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica de MPI em populaccedilotildees das raccedilas Barrosatilde e Minhota Entre parecircntesis indicam-se os valores esperados de acordo com o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg
Fenoacutetipos N MPIA MPIAB MPIAC MPIB MPIBC MPIC
Barrosatilde inscrita 138 - - - 131 6 1
(1301) (78) (01)
Barrosatilde natildeo inscrita 1 5 2 - - - 147 4 1
(1460) (59) (01)
Minhota 61 0 3 0 56 2 0
(00) (29) (01) (561) (19) (00)
A anaacutelise da tabela 3310 permite verificar que MPIB e MPIC ocorrem nas duas
raccedilas de bovinos estudadas sendo MPIB o alelo mais comum nas trecircs populaccedilotildees A
ocorrecircncia de MPI A na raccedila Minhota contraria o descrito por ANSAY (1973) quando afirma
a exclusividade do fenoacutetipo AB na raccedila Charolesa
Tabela 3310 Frequecircncias geacutenicas de MPI nas populaccedilotildees estudadas
N
Frequecircncias geacutenicas
N MPPA MPPB MPIC
Barrosatilde inscrita 138 - 097 + 001 003+001
Barrosatilde natildeo inscrita 152 - 098 + 001 002+001
Minhota 61 002 plusmn 001 096 plusmn002 002 plusmn 001
A informaccedilatildeo disponiacutevel sobre este marcador em anteriores trabalhos de anaacutelise
geneacutetica em bovinos eacute quase inexistente Tal poderaacute dever-se agraves dificuldades de visualizaccedilatildeo
encontradas na sua fenotipagem por electroforese convencional A detecccedilatildeo de MPI estaacute
descrita em tecidos musculares e em leucoacutecitos neste trabalho utilizaram-se eritroacutecitos para o
estudo de variaccedilatildeo geneacutetica desta proteiacutena mas eacute provaacutevel que a sua expressatildeo ocorra apenas
na fracccedilatildeo leucocitaacuteria (natildeo separada) o que explicaria precisamente a sua fraca actividade
62
Resultados e Discussatildeo
ALB
A distribuiccedilatildeo dos fenoacutetipos observados para o locus ALB apresenta-se na tabela
3311
Apesar de natildeo ter sido possiacutevel testar o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg todas as
amostras estudadas mostram desvios muito reduzidos entre valores observados e esperados
Tabela 3311 Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica de ALB em populaccedilotildees das raccedilas Barrosatilde e Minhota Entre parecircntesis indicam-se os valores esperados de acordo com o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg
N
Fenoacutetipos N ALBA ALBAB ALBB ALBBV ALBAV ALB V
Barrosatilde inscrita 142 137 3 - - 2 -(1370) (30) (00) (00) (20) (00)
Barrosatilde natildeo inscrita 153 145 5 1 - 2 -(1440) (68) (01) (01) (20) (00)
Minhota 62 59
(590)
3 (30) (00)
Na tabela 3312 estatildeo discriminadas as frequecircncias geacutenicas estimadas para as
populaccedilotildees estudadas bem como as de outras populaccedilotildees de bovinos da Europa e de buacutefalos
da Bulgaacuteria
Verifica-se que ALBA eacute o alelo mais comum encontrando-se aparentemente fixado
em vaacuterias raccedilas bovinas de origem europeia
Como jaacute referido para HB a presenccedila de ALBB nas raccedilas europeias parece
relacionar-se com a sua localizaccedilatildeo geograacutefica verificando-se que de uma maneira geral a sua
frequecircncia aumenta agrave medida que nos aproximamos do sul da Europa e de Aacutefrica eacute no gado
zebu africano que este alelo ocorre com frequecircncias mais elevadas variando entre 030 e 060
(VICENTE 1978) Assim a presenccedila de ALBB no gado europeu poderaacute indicar a passagem
pela Europa de bovinos oriundos de Aacutefrica (CECCHINI amp Nus 1986) Eacute de notar que apenas a
raccedila Minhota e algumas das restantes raccedilas da Peniacutensula Ibeacuterica natildeo apresentam ALBB
63
Resultados e Discussatildeo
Tabela 3312 Frequecircncias geacutenicas de ALB em vaacuterias populaccedilotildees de raccedilas bovinas e em buacutefalos
Frequecircncias geacutenicas
N ALBA (F) ALBB (S) ALBV Referecircncia
Portugal
Barrosatilde inscrita 142 098 + 001 001 plusmn 001 001 plusmn001 Este trabalho
Barrosatilde natildeo inscrita 153 097 + 001 002+001 001 plusmn001
Minhota 62 098 plusmn 001 - 002 plusmn 001
Mertolenga 147 084 plusmn 002 016 + 002 - KlDDetal (1980)
Alentejana 155 094+001 006 plusmn 001 -
Mirandesa 106 094 + 002 006 plusmn 002 - NOBRE (S data)
Espanha -
Cachena 71 098 + 001 002+001 - IGLESIAS (1989)
Caldelana 60 098 plusmn 001 002 + 001 -
Frieiresa 33 100 - - raquo
Limiana 39 097 + 002 003 plusmn 002 -
Rubia Gallega 201 099 plusmn 000 001 plusmn000 -
Vianesa 40 093 + 003 007 + 003 -
Sayaguesa 147 096 plusmn001 004 plusmn 001 - GONZALEZ et al (1987)
Moracha 101 089 plusmn 002 011+002 -
Alistaria Sanabresa 157 090 plusmn 002 010 plusmn002 -
Blanca Cacerena 62 056 plusmn 005 044 plusmn 005 -
Caacuterdena Andaluza 25 100 - -
Asturiana de los Vallegraves 127 099 + 001 001 plusmn001 -
Asturiana de la Montana 106 099 plusmn001 001 plusmn001 -
Pirenaica 265 092 + 001 008 plusmn001 - VICENTE (1978)
Tudanca 42 100 - -
Morena del N O 25 092 + 004 008 plusmn 004 -
Frisona 97 100 - -
De Lidia 124 100 - - KIDDeacutetal (1980)
Retinta 164 097 + 001 003 plusmn001 -
Itaacutelia
Chinina 264 089 + 001 011 plusmn001 - CARENZIeacutetal (1970)
Marchigiana 124 074 + 003 026 plusmn 003 -
Beacutelgica
Pied vermelha Este-Flandern 503 100 - - BOUQUET amp VAN de WEGHE (1972)
Vermelha Oeste-Flandern 155 100 - -
Pied preta 174 100 - -
Pied vermelha-Campine 265 100 - -
w IGLESIAS (1989)
(Continua)
64
Resultados e Discussatildeo
Tabela 3312 Frequecircncias geacutenicas de ALB em vaacuterias populaccedilotildees de raccedilas bovinas e de buacutefalos (continuaccedilatildeo)
Frequecircncias geacutenicas N ALBA (F) ALBB (S) ALBV Referecircncia
Bulgaacuteria
Sofia Brow 170 096+001 004 + 001 - M A K A V E E V ( 1 9 7 0 )
Buacutefalo 225 047 plusmn 002 053 plusmn 002 - M A K A V E E V ( 1 9 8 4 )
Murrah (Buacutefalo) 76 012+003 088 plusmn 003 -
G Bretanha
Charolesa 99 084 plusmn 003 016 + 003 - SPOONER amp OLIVER (1969)
Frisia 1422 100 - -
Hereford 215 099 plusmn 001 001+001 -
Jersey 217 100 - -
laquo IGLESIAS (1989)
Neste trabalho descreve-se tambeacutem o alelo ALBV com uma frequecircncia de 001 e
002 nas raccedilas Barrosatilde e Minhota respectivamente Este alelo natildeo se encontra descrito em
qualquer raccedila europeia podendo a sua detecccedilatildeo estar relacionada com a capacidade resolvente
da teacutecnica de focagem isoeleacutectrica utilizada na separaccedilatildeo de ALB
TF
A transferrina eacute provavelmente o mais informativo dos sistemas polimoacuterficos estudados
em virtude do nuacutemero de alelos que apresenta
A distribuiccedilatildeo dos fenoacutetipos observados para o locus TF apresenta-se na tabela 3313
E possiacutevel verificar a existecircncia de equiliacutebrio de Hardy-Weinberg em todas as populaccedilotildees
estudadas
Da anaacutelise das frequecircncias geacutenicas expressas na tabela 3314 verifica-se que este locus
apresenta quatro produtos geacutenicos na maioria das raccedilas europeias sendo os alelos TFA e
TFD (incluindo os subtipos TFD1 e TFD2) os que apresentam frequecircncias mais elevadas
(027 a 092 para o alelo TFA e 026 a 073 para o alelo TFD)
Observa-se tambeacutem que a frequecircncia de TFD2 nas raccedilas estudadas eacute mais elevada do
que a de TFD1 como ocorre na maioria das raccedilas ibeacutericas
65
Resultados e Discussatildeo
No que se refere a TFE verifica-se que a sua frequecircncia eacute relativamente baixa nas
raccedilas europeias (001 e 022) e estaacute mesmo ausente em quase todas as raccedilas da regiatildeo da
Galiza (com excepccedilatildeo da raccedila Cachena espanhola e Rubia Gallega) e na raccedila Minhota Note-se
a grande semelhanccedila entre os valores de frequecircncias geacutenicas deste alelo na raccedila Cachena
espanhola (005) e nas populaccedilotildees de raccedila Barrosatilde (004 e 003) o que mais uma vez sugere
uma grande proximidade entre as duas Apesar de ocorrer em baixa frequecircncia nos bovinos
europeus a presenccedila de TFE nestas raccedilas pode indicar uma proveniecircncia asiaacutetica ou africana
pois eacute nestes continentes que aquele alelo eacute mais comum (BRAEND 1971)
66
Resultados e Discussatildeo
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Resultados e Discussatildeo
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68
Resultados e Discussatildeo
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69
Resultados e Discussatildeo
bull GC
A distribuiccedilatildeo dos fenoacutetipos observados para o locus GC apresenta-se na tabela 3315
A sua anaacutelise permite verificar a existecircncia de diferenccedilas entre os valores observados e
esperados para raccedila Barrosatilde (populaccedilatildeo inscrita no Livro Genealoacutegico) Este desvio ao
equiliacutebrio de Hardy-Weinberg deve-se agrave existecircncia de um excesso de homozigoacuteticos
sugerindo assim a ocorrecircncia de uma possiacutevel subestruturaccedilatildeo na populaccedilatildeo
Nas restantes amostras estudadas natildeo foi possiacutevel aplicar o teste de Contudo a
diferenccedila entre valores observados e esperados de acordo com o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg
eacute praticamente inexistente na populaccedilatildeo Barrosatilde natildeo inscrita e pouco acentuada na raccedila
Minhota
Tabela 3315 Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica de GC em populaccedilotildees das raccedilas Barrosatilde e Minhota Entre parecircntesis indicam-se os valores esperados de acordo com o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg
Fenoacutetipos N GCS GCFS GCF
Barrosatilde inscrita 142 98 35 8
(945) (419) (45)
Barrosatilde natildeo inscrita 153 109 40 4
(1087) (406) (37)
Minhota 62 54 5 3
(514) (101) (04)
x2
3913 1 0048
A distribuiccedilatildeo das frequecircncias geacutenicas apresentada na tabela 3316 mostra que GCS eacute
o alelo mais comum nas raccedilas europeias (com excepccedilatildeo da raccedila Frisia da Sueacutecia) As raccedilas
estudadas neste trabalho tecircm frequecircncias aleacutelicas para este locus que as aproximam das raccedilas
espanholas
70
Resultados e Discussatildeo
Tabela 3316 Frequecircncias geacutenicas de GC em vaacuterias populaccedilotildees de raccedilas bovinas
Frequecircncias geacutenicas
N GCF(ouA) GCS(ouB) GCC Referecircncia
Portugal
Barrosatilde inscrita
Barrosatilde natildeo inscrita
Minhota
Alentejana
Mirandesa
Espanha
De Lidia
Frisona
Beacutelgica
Branca e azul
Flemish vermelha
Campine vermelha e branca
Preta e branca
Flemish branca e vermelha
Sueacutecia
Vermelha e Branca
Frisia
141 018 plusmn0023
153 016 plusmn002
62 009 plusmn 003
028 plusmn 004
97 020 plusmn 003
1306 008 plusmn001
124 015 plusmn002
2323 031 plusmn001
431 016 plusmn001
299 012 plusmn001
299 019 plusmn002
140 006 plusmn 001
1030 039 plusmn001
273 079 plusmn 002
082 plusmn 002
084 plusmn 002
091 plusmn003
072 plusmn 004
080 plusmn 003
092 plusmn 001
085 plusmn 002
069 plusmn 001
084 plusmn 001
088 plusmn 001
081 plusmn002
065 plusmn 003
061 plusmn001
021 plusmn002
029 plusmn 003
Este trabalho
CUNHA (1994)
NOBRE (S data)
PIEDRAFUA et ai (1984)
VAN de WEGHE et ai (1982)
GAHNE(1963)
in PIEDRAFUA et ai (1984)
71
Resultados e Discussatildeo
34 - ANAacuteLISE POPULACIONAL CONJUNTA
341 - Diversidade geneacutetica na raccedila Barrosatilde
As estimativas da variabilidade geneacutetica das populaccedilotildees de bovinos das raccedilas Barrosatilde e
Minhota efectuaram-se considerando apenas 6 loci polimoacuterficos HB CAII MPI ALB TF e
GC
Tabela 341 Estimativa da variabilidade geneacutetica (6 loci) atraveacutes dos valores de heterozigotia observada (Ho) e esperada (He) nas populaccedilotildees estudadas
Barrosatilde inscrita Barrosatilde natildeo inscrita Minhota Locus
Ho He Ho He Ho He
HB 0000 0000 0000 0000 0097 0093
CAH 0411 0441 0464 0464 0210 0262
MPI 0043 0056 0026 0039 0082 0080
ALB 0035 0035 0046 0058 0048 0048
TF 0603 0590 0556 0595 0694 0638
GC 0248 0297 0261 0265 0081 0163
Os resultados expressos na tabela 341 mostram em geral a ausecircncia de diferenccedilas
significativas entre os valores de heterozigotia observada (Ho) e heterozigotia esperada (He)
para os loci estudados Deve contudo notar-se que na raccedila Minhota e quanto ao locus GC o
valor de He eacute aproximadamente o dobro da Ho Nos restantes loci o ligeiro desvio observado
entre Ho e He sugere em geral um deacutefice de heterozigoacuteticos
Nas duas populaccedilotildees de raccedila Barrosatilde os sistemas TF e CAII satildeo os que apresentam
valores de heterozigotia mais elevados Pelo contraacuterio os loci MPI e ALB mostram valores de
heterozigotia baixos possivelmente devido ao excesso de homozigoacuteticos (MPI B e ALB A)
detectados nas trecircs populaccedilotildees
Na tabela 342 apresentam-se os valores do nuacutemero meacutedio de alelos por locus (ria)
percentagem de loci polimoacuterficos (P) heterozigotia meacutedia observada (Ho) e heterozigotia
esperada (He) nas populaccedilotildees de bovinos estudados Estes valores devem ser interpretados
72
Resultados e Discussatildeo
tendo em conta o facto de os 6 loci investigados serem polimoacuterficos em pelo menos uma
populaccedilatildeo
Tabela 342 Variabilidade geneacutetica detectada em trecircs populaccedilotildees de bovinos atraveacutes da anaacutelise de 6 loci polimoacuterficos N - efectivo meacutedio estudado por locus na - nuacutemero meacutedio de alelos por locus P - proporccedilatildeo de loci polimoacuterficos Ho - heterozigotia observada He - heterozigotia meacutedia esperada Entre parecircntesis indicam-se os valores do desvio padratildeo
Raccedila Populaccedilatildeo N na P Ho He
Barrosatilde inscrita 1407 233 833 0223 0237
(06) (042) (0100) (0100)
Barrosatilde natildeo inscrita 1528 233 833 0226 0237
(02) (042) (0098) (0101)
Minhota 618 233 1000 0202 0214
(02) (021) (0101) (0090)
A sua anaacutelise permite verificar em primeiro lugar a ocorrecircncia de uma grande
semelhanccedila entre os valores de H nas duas raccedilas estudadas Barrosatilde e Minhota revelando a
existecircncia de uma variabilidade geneacutetica idecircntica nas trecircs populaccedilotildees de bovinos Observa-se
tambeacutem que os valores de heterozigotia meacutedia observada (Ho) natildeo diferem significativamente
dos valores de heterozigotia esperados (He) nas trecircs populaccedilotildees sendo o valor mais elevado o
encontrado na populaccedilatildeo de raccedila Barrosatilde (237)
Os elevados valores de P (833 na raccedila Barrosatilde e 100 na raccedila Minhota) resultam
do facto de apenas se terem utilizado loci polimoacuterficos nesta anaacutelise e o nuacutemero meacutedio de
alelos por locus (na) eacute igual nas trecircs populaccedilotildees estudadas (233)
A tabela 343 apresenta estimativas de FB Frr e FST para as trecircs populaccedilotildees de
bovinos Os valores de Fis indicam a existecircncia de uma acentuada deficiecircncia de
heterozigoacuteticos nos loci MPI e GC Nos restantes loci verifica-se por um lado a tendecircncia
para um excesso de heterozigoacuteticos nos loci HB e TF (com valores de -0051 e -0021
respectivamente) e por outro lado para uma ligeira deficiecircncia de heterozigoacuteticos nos loci
CAII e ALB (com valores de 0066 e 0072 respectivamente) A meacutedia ponderada de FiS
mostra uma deficiecircncia de heterozigoacuteticos de 48
73
Resultados e Discussatildeo
Tabela 343 Distribuiccedilatildeo relativa da diversidade geneacutetica nas trecircs populaccedilotildees de bovinos Hs-heterozigotia intrapopulacional HT-heterozigotia total Valores das estatiacutesticas F para 6 loci analisados
Locus H s Hx Fis FIT FST
HB 0030 0031 -0051 -0016 0033
CAII 0387 0404 0066 0104 0041
MPI 0058 0059 0130 0133 0004
ALB 0046 0047 0072 0075 0004
TF 0605 0627 -0021 0015 0036
GC 0241 0244 0183 0193 0012
Meacutedia 0228 0235 0048 0078 0031
As estimativas de FST indicam a existecircncia de um baixo grau de diferenciaccedilatildeo
populacional nos bovinos estudados Os valores de FST para os 6 loci analisados podem
considerar-se baixos (entre 0004 e 0041) apresentando uma meacutedia ponderada de 0031
Assim soacute uma pequena parte da diversidade geneacutetica (31) se deve a diferenccedilas entre as
populaccedilotildees sendo muito maior a diversidade dentro de cada populaccedilatildeo do que entre as
populaccedilotildees
Os baixos valores de FST encontrados para os loci MPI e ALB resultam de frequecircncias
elevadas de MPIB e ALBA respectivamente e traduzem uma grande homogeneidade entre
as raccedilas bovinas estudadas natildeo se detectando subestruturaccedilatildeo populacional
342 - Comparaccedilatildeo com outras raccedilas ibeacutericas
Tendo em conta o pequeno nuacutemero de loci comuns a este e a outros estudos
estimaram-se diferentes valores de heterozigotia meacutedia consoante o nuacutemero de loci de que se
dispunha Na tabela 344 e 345 apresentam-se valores de heterozigotia meacutedia para as
diferentes raccedilas obtidos a partir de quatro (FF) e cinco loci (FF+) respectivamente bem como
os valores de na P e os respectivos desvios padratildeo em vaacuterias raccedilas de bovinos ibeacutericos
A diversidade geneacutetica do bovino Barrosatilde avaliada pela taxa meacutedia de heterozigotia
(0281-0272 e 0249-0260 para 5 e 4 loci respectivamente) parece ocupar uma posiccedilatildeo
74
Resultados e Discussatildeo
intermeacutedia no seio das raccedilas ibeacutericas Tambeacutem o grau de variabilidade geneacutetica nos bovinos
avaliado por paracircmetros como o nuacutemero meacutedio de alelos por locus e a proporccedilatildeo de loci
polimoacuterficos (P) demonstra que as raccedilas estudadas neste trabalho ocupam uma posiccedilatildeo
intermeacutedia quando comparadas com outras raccedilas ibeacutericas
A anaacutelise das tabelas 344 e 345 mostra que todas as medidas de diversidade geneacutetica
(H P e de na) apresentam valores idecircnticos Esta semelhanccedila permite supor que o processo de
domesticaccedilatildeo iniciado haacute menos de 10000 anos natildeo levou a uma grande diferenciaccedilatildeo
geneacutetica entre as raccedilas pelo menos relativamente aos marcadores geneacuteticos estudados neste
trabalho Desta forma verifica-se que as principais diferenccedilas entre as raccedilas resultam de
pequenas alteraccedilotildees das suas frequecircncias geacutenicas provavelmente causadas pelo baixo nuacutemero
de animais destinados agrave reproduccedilatildeo (mais marcado nos machos) e pelos cruzamentos dirigidos
em cada raccedila
Por outro lado este baixo niacutevel de diferenciaccedilatildeo geneacutetica deveraacute estar tambeacutem
associado ao facto de na origem das raccedilas bovinas ibeacutericas se encontrar um uacutenico processo de
domesticaccedilatildeo seguido provavelmente de um processo de expansatildeo populacional bastante
recente do Proacuteximo Oriente ateacute agrave Europa Adicionalmente estima-se que a diferenciaccedilatildeo dos
bovinos em raccedilas autoacutectones soacute teraacute ocorrido nos uacuteltimos 300 anos (LOFTUS et ai 1994)
Neste contexto os eventuais estrangulamentos do efectivo populacional (bottleneck)
e efeitos de fundador ocorridos durante o periacuteodo inicial da domesticaccedilatildeo do gado bovino e
capazes de afectar de forma muito diferente vaacuterios nuacutecleos populacionais natildeo satildeo detectados
na Peniacutensula Ibeacuterica
75
Resultados e Discussatildeo
Tabela 344 Variabilidade geneacutetica em vaacuterias raccedilas de bovinos atraveacutes da anaacutelise de 4 loci polimoacuterficos N - efectivo meacutedio estudado por locus ria - nuacutemero meacutedio de alelos por locus P-- proporccedilatildeo de loci polimoacuterficos yent - heterozigotia meacutedia esperada Entre parecircntesis indicam-se os valores do desvio padratildeo
Raccedila Populaccedilatildeo N nbdquo P H +
Portugal
Barrosatilde inscrita 1410(00) 23 (05) 750 0249 (0135)
Barrosatilde natildeo inscrita 1530 (00) 23 (05) 755 0260(0135)
Minhota 620 (00) 20 (00) 1000 0216 (0094)
Mertolenga 1470 (00) 23 (03) 1000 0315 (0097)
Alentejana 1550(00) 23 (03) 1000 0239 (0123)
Mirandesa 1065 (03) 20 (00) 1000 0159(0110)
Espanha
Cachena 710 (00) 23 (03) 1000 0279(0111)
Caldelana 600 (00) 20 (00) 1000 0166 (0107)
Frieiresa 330 (00) 18(03) 750 0177(0112)
Limiana 390 (00) 20 (00) 1000 0246 (0087)
Rubia Gallega 1845(95) 25 (05) 1000 0215(0110)
Vianesa 400 (00) 20 (00) 1000 0221 (0087)
Sayaguesa 1470 (00) 23 (03) 1000 0320 (0094)
Morucha 1010(00) 23 (03) 1000 0361 (0084)
Alistaria Sanabresa 1570 (00) 23 (03) 1000 0213 (0104)
Blanca Cacerefia 618 (03) 20 (00) 1000 0377 (0078)
Caacuterdena Andaluza 250 (00) 15(03) 500 0131 (0106)
Asturiana de los Vallegraves 1265 (05) 23 (03) 1000 0237(0107)
Asturiana de la Montana 1060 (00) 23 (03) 1000 0280 (0088)
Tudanca 420 (00) 20 (04) 750 0321 (0109)
Morena del N O 250 (00) 18 (03) 750 0203 (0108)
Frisona 6540 (00) 18 (05) 500 0203 (0130)
De Lidia 1240 (00) 23 (03) 1000 0367(0135)
Retinta 1640 (00) 23 (03) 1000 0338 (0107)
76
Resultados e Discussatildeo
Tabela 345 Variabilidade geneacutetica em vaacuterias raccedilas de bovinos atraveacutes da anaacutelise de 5 loci polimoacuterficos N - efectivo meacutedio estudado por locus na - nuacutemero meacutedio de alelos por locus P--proporccedilatildeo de loci polimoacuterficos H^ - heterozigotia meacutedia esperada Entre parecircntesis indicam-se os valores do desvio padratildeo
Raccedila Populaccedilatildeo N na P i r Portugal
Barrosatilde inscrita 1410 (00) 22 (04) 800 0281 (0109)
Barrosatilde natildeo inscrita 1530(00) 22 (04) 800 0272 (0105)
Minhota 620 (00) 20 (00) 1000 0229 (0074)
Espanha Cachena 710 (00) 22 (02) 1000 0289 (0087)
Caldelana 600 (00) 20 (00) 1000 0180 (0084)
Frieiresa 330 (00) 18 (02) 800 0180 (0087)
Limiana 390 (00) 20 (00) 1000 0226(0071)
Rubia Gallega 1812(81) 24 (04) 1000 0223 (0086)
Vianesa 400 (00) 20 (00) 1000 0374 (0168)
Sayaguesa 1470 (00) 22 (02) 1000 0305 (0074)
Morucha 1010 (00) 22 (02) 1000 0353 (0066)
Alistaria Sanabresa 1570 (00) 22 (02) 1000 0174 (0089)
Blanca Cacerefla 616 (02) 20(00) 1000 0402 (0065)
Caacuterdena Andaluza 250 (00) 16(02) 600 0120 (0083)
Asturiana de los Vallegraves 1266 (04) 22 (02) 1000 0270 (0089)
Asturiana de la Montaria 1060(00) 22 (02) 1000 0301 (0072)
343 - Diferenciaccedilatildeo geneacutetica
Nas tabelas 346 e 347 apresentam-se as distacircncias geneacuteticas de Nei (NEI 1978)
calculadas para 23 (4 loci HB CAII ALB e TF) e 15 (5 loci HB CAII ALB TF e NP)
raccedilas bovinas ibeacutericas respectivamente Da sua anaacutelise ressalta o facto de aqueles valores
serem na sua maioria bastante baixos
De entre as raccedilas bovinas ibeacutericas estudadas a Frisona e a Cachena demonstram estar
mais proacuteximas da raccedila Barrosatilde com valores de DNei de 0092 (4 loci) e de 0104 (5 loci)
respectivamente Por outro lado as raccedilas Asturiana de la Montana e Vianesa aparecem como
as mais diferenciadas DNei= 0334 (4 loci ) e Dgtjei= 0330 (5 loci) respectivamente
77
Resultados e Discussatildeo
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Resultados e Discussatildeo
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79
Resultados e Discussatildeo
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80
Resultados e Discussatildeo
No que se refere agrave raccedila Minhota verifica-se que a Frieiresa eacute a que estaacute mais proacutexima
(valores de 0077 e 0074 para 4 e 5 loci respectivamente) e que mais um vez eacute a Asturiana de
la Montana a mais diferenciada das raccedilas (valores de 0389 e 0349 para 4 e 5 loci respectivamente)
A diferenciaccedilatildeo geneacutetica entre as raccedilas bovinas ibeacutericas encontra-se representada nos
dendrogramas construiacutedos pelos meacutetodos de agrupamento NJ (Neighbor-joining SATTOU amp
NEI 1987) e UPGMA (Unweightedpair-group arithmetic average SNEATH amp SOKAL 1973)
(figuras 341 342 343 e 344) Foram realizados testes de reamostragem do tipo
bootstrap (100 reacuteplicas) para a anaacutelise da consistecircncia dos padrotildees de ramificaccedilatildeo
apresentando-se os seus valores entre parecircntesis
A anaacutelise conjunta dos quatro dendrogramas permite verificar uma falta de consistecircncia
nos vaacuterios padrotildees de ramificaccedilatildeo para as raccedilas bovinas ibeacutericas associada a valores de
bootstrap em geral muito reduzidos De facto observa-se que o padratildeo de ramificaccedilatildeo dos
dendrogramas se altera consoante o meacutetodo de agrupamento usado e o nuacutemero de loci considerados Estas alteraccedilotildees nos agrupamentos das diferentes raccedilas devem-se
provavelmente agrave instabilidade causada pelo reduzido nuacutemero de loci polimoacuterficos utilizados
neste estudo bem como ao facto de as frequecircncias geacutenicas serem muito semelhantes em todas
as populaccedilotildees estudadas
Deve contudo referir-se que a raccedila Barrosatilde aparece normalmente associada a vaacuterias
raccedilas do norte da Peniacutensula Ibeacuterica nomeadamente a Cachena (Galiza) a Asturiana de la
Montana (Astuacuterias) a Sayaquesa e a Morucha (Salamanca)
No que se refere agrave raccedila Minhota esta aparece vaacuterias vezes associada agraves raccedilas Rubia
Gallega Frisona Asturiana de los Vallegraves e Frieiresa
81
Resultados e Discussatildeo
(18)
(14)
(11)
(5)
(3)
Sayaquesa
(39)
[32)
(21)1-
- -HsT
(49)
(1)
(3)
(18)
(8)
(13)1
(12)
19)
(16T
De Lidia
(99) Asturiana de la Montana
Tudanca bullMorucha
Cachena Barrosatilde mdashFrisona
Minhota -Asturiana de los Vallegraves Rubia Gallega
Frieiresa Alentejana
(65)
Mertolenga -Vianesa
Blanra Cacerefla
Retinta Linuacuteana
i (39)r
Mirandesa Caacuterdena Andaluza Morena NO
Caldelana Alistano Sanabresa
Figura 341 Dendrograma construiacutedo com base nas distacircncias geneacuteticas de NEI (1978) entre 23 raccedilas de bovinos (4 loci HBCAII ALB e TF) atraveacutes do meacutetodo de agrupamento NJ Os valores de probabilidade de ocorrecircncia de cada agrupamento obtidos atraveacutes de um teste de bootstrap indicam-se entre parecircntesis
82
Resultados e Discussatildeo
Morucha
Cachena Sayaquesa
Rubia Gallega Asturiana de los Vallegraves Freiresa
Frisona Minhota Alentejana Mertolenga
(43) ( 2 8 gt - ^ C a W e l a l
( iacute 7gtrl - Mirandesa L__ Alistano Sanabresa
Caacuterdena Andaluza Vianesa
Barrosatilde Retinta
De Lidia Tudanca
Asturiana de la Montana Morena NO Blanca Cacerena
Figura 342 Dendrograma construiacutedo com base nas distacircncias geneacuteticas de NEI (1978) entre 23 raccedilas de bovinos (4 loci HB CAII ALB e TF) atraveacutes do meacutetodo de agrupamento UPGMA Os valores de probabilidade de ocorrecircncia de cada agrupamento obtidos atraveacutes de um teste de bootstrap indicam-se entre parecircntesis
83
Resultados e Discussatildeo
(42)f
(30)1 I
(7)
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(23)1
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(49) r (23) r L
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Alistano Sanabresa _ _ Rabia Galkga
Minhota Frieiresa
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Asturiana de Ia Montana Barrosatilde
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Cachena Limiana
Blanca Cacerena Vianesa
Figura 343 Dendrograma construiacutedo com base nas distacircncias geneacuteticas de NEI (1978) entre 15 raccedilas de bovinos (5 loci HB CAII ALB TF e NP) atraveacutes do meacutetodo de agrupamento NJ Os valores de probabilidade de ocorrecircncia de cada agrupamento obtidos atraveacutes de um teste de bootstrap indicam-se entre parecircntesis
(21)
(18)
(100)
(55)
(15)T r i shyT
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Alistano Sanabresa
(37)
(61)
(46
(29)
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Caldelana Caacuterdena Andaluza
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Rubia Gallega Asturiana de los Vallegraves
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Frieiresa
Minhota Cachena Morucha
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Asturiana de la Montana
Figura 344 Dendrograma construiacutedo com base nas distacircncias geneacuteticas de NEI (1978) entre 15 raccedilas de bovinos (5 loci HB CAII ALB TF e NP) atraveacutes do meacutetodo de agrupamento UPGMA Os valores de probabilidade de ocorrecircncia de cada agrupamento obtidos atraveacutes de um teste de bootstrap indicam-se entre parecircntesis
84
Resultados e Discussatildeo
No seu conjunto estes resultados natildeo satildeo suficientes para o estabelecimento de uma
histoacuteria evolutiva das actuais raccedilas bovinas ibeacutericas nem para a separaccedilatildeo da raccedila Barrosatilde das
restantes Consequentemente natildeo eacute possiacutevel neste momento fazer corresponder a anaacutelise da
diversidade e estrutura geneacutetica das populaccedilotildees ibeacutericas de gado bovino com alguma das
hipoacuteteses evolutivas propostas por diversos autores com base em evidecircncia morfoloacutegica
(VALLEJO 1978 IGLESIAS 1989 CORDEIRO 1986 JORGE 1996)
De acordo com essa evidecircncia a raccedila Barrosatilde (e tambeacutem a Cachena) derivaria do
denominado tronco mauritaacutenico (Bos primigenius opisthonomus) ou seja de populaccedilotildees
originaacuterias do Norte de Aacutefrica que teriam passado para o sul da Peniacutensula Ibeacuterica alcanccedilando
mais tarde o Norte de Portugal e de Espanha Por outro lado a filiaccedilatildeo da raccedila Minhota
segundo JORGE (1996) deriva do tronco aquitacircnico (Bos primigenius primigenius) tal como a
maior parte das raccedilas da Galiza das Astuacuterias e dos Pirineacuteus
Embora os resultados apresentados neste trabalho pareccedilam de facto indicar que as
raccedilas Barrosatilde e Minhota derivam de troncos diferentes eacute necessaacuterio aprofundar de forma
muito consideraacutevel a investigaccedilatildeo sobre a estrutura geneacutetica das raccedilas bovinas ibeacutericas antes de
se poder formular conclusotildees mais sustentadas
85
Con8ideraccedil8es Finais
4 - CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
O trabalho desenvolvido nesta dissertaccedilatildeo permitiu o estudo de alguns sistemas
geneacuteticos polimoacuterficos jaacute descritos em bovinos (HB CAII NP MPI ALB TF e GC) nas
raccedilas Barrosatilde e Minhota Permitiu ainda a aplicaccedilatildeo de teacutecnicas de separaccedilatildeo electroforeacuteticas
mais eficazes em alguns desses sistemas
Vaacuterias limitaccedilotildees durante a execuccedilatildeo praacutetica deste trabalho obrigaram de alguma
forma a alteraccedilotildees no programa inicial Entre elas devem referir-se
1 a recolha de amostras de sangue mostrou-se difiacutecil e demorada sendo necessaacuteria a
coordenaccedilatildeo de esforccedilos de vaacuterias entidades (Direcccedilatildeo Regional de Agricultura de
Entre Douro e Minho e brigadas de Sanidade Animal locais) de veterinaacuterios e de
criadores de bovinos retirando tempo agrave execuccedilatildeo praacutetica do trabalho
2 a afinaccedilatildeo de vaacuterias teacutecnicas electroforeacuteticas para certos marcadores geneacuteticos
envolveu um consideraacutevel esforccedilo de investigaccedilatildeo
3 a impossibilidade de apurar atempadamente as teacutecnicas de separaccedilatildeo ou de
visualizaccedilatildeo para a amilase a ceruloplasmina e a poacutes-transferrina
4 a escassa bibliografia sobre o bovino Barrosatilde e sobre as teacutecnicas utilizadas neste
trabalho em gado bovino
Apesar das limitaccedilotildees considera-se que este trabalho se reveste de alguma importacircncia
pelo facto de constituir um contributo para a caracterizaccedilatildeo geneacutetica de uma raccedila bovina muito
peculiar A este respeito entendeu-se que numa primeira fase se procederia ao estudo de um
conjunto de proteiacutenas polimoacuterficas de forma a poder iniciar uma comparaccedilatildeo com outras raccedilas
bovinas nomeadamente ibeacutericas para as quais jaacute existem resultados publicados Por outro
86
Consideraccedilotildees Finais
lado o estabelecimento de um conjunto de teacutecnicas de fenotipagem dos loci considerados
permite desde logo a sua aplicaccedilatildeo em questotildees de identificaccedilatildeo individual e de anaacutelise da
paternidade
Eacute contudo evidente que o aprofundamento deste trabalho deveraacute necessariamente
evoluir na direcccedilatildeo da anaacutelise molecular da variaccedilatildeo geneacutetica Adicionalmente seraacute do maior
interesse alargar o domiacutenio de investigaccedilatildeo agraves restantes raccedilas bovinas autoacutectones
Em face do exposto entende-se ser possiacutevel definir trecircs linhas de investigaccedilatildeo para os
proacuteximos anos
1 - ampliaccedilatildeo da bateria de sistemas geneacuteticos polimoacuterficos detectados em proteiacutenas do
sangue e do leite
2 - anaacutelise da variabilidade geneacutetica de um conjunto de microssateacutelites se possiacutevel
associados a algumas das proteiacutenas polimoacuterficas jaacute descritas
3 - estudo do polimorfismo da moleacutecula de DNA-mitocondrial
De uma forma geral pode assim considerar-se que os principais objectivos definidos
no iniacutecio deste trabalho foram alcanccedilados pelo que se apresentam em seguida as conclusotildees
87
Conclusotildees
5 - CONCLUSOtildeES
A utilizaccedilatildeo de um sistema de focagem isoeleacutectrica permitiu detectar a existecircncia de
polimorfismo geneacutetico na hemoglobina distinguindo-se dois produtos geacutenicos na raccedila bovina
Minhota HBA e HBB Na raccedila Barrosatilde HBA foi o uacutenico produto geacutenico encontrado
A utilizaccedilatildeo de um sistema de focagem isoeleacutectrica permitiu a detecccedilatildeo de dois
produtos geacutenicos no locus CAII (CAIPF e CAIPS) e revelou-se mais eficaz de que as
teacutecnicas de separaccedilatildeo convencional em gel de amido
A investigaccedilatildeo realizada permitiu detectar a ocorrecircncia de polimorfismo geneacutetico de
MPI atraveacutes de um sistema electroforeacutetico em gel de amido tendo-se detectado trecircs produtos
geacutenicos (MPIA MPIB e MPIC) A fraca actividade de MPI e a grande dificuldade na
obtenccedilatildeo de um contraste de bandas adequado poderaacute dever-se ao facto de a sua expressatildeo soacute
ocorrer na fracccedilatildeo leucocitaacuteria do sangue
A aplicaccedilatildeo de um sistema de focagem isoeleacutectrica na presenccedila de ureia (8M) revelou-
-se muito eficaz na separaccedilatildeo de ALB e permitiu detectar pela primeira vez um novo variante
ALBV ligeiramente mais aciacutedico do que ALBA
A combinaccedilatildeo de uma teacutecnica de focagem isoeleacutectrica com um preacutevio tratamento das
amostras a fim de saturar a moleacutecula de TF com Fe permitiu a detecccedilatildeo de quatro produtos
geacutenicos (TF A TFD1 TFD2 e TFE) nas raccedilas estudadas
88
Conclusotildees
A combinaccedilatildeo de uma teacutecnica de focagem isoeleacutectrica com a detecccedilatildeo por
immunoblotting permitiu detectar dois produtos geacutenicos no locus GC (GCA e GCB) O
tratamento de amostras com neuraminidase permitiu a obtenccedilatildeo de padrotildees mais simples do
que os conseguidos com amostras nativas Esta simplificaccedilatildeo resulta da provaacutevel remoccedilatildeo de
aacutecidos siaacutelicos ligados agrave moleacutecula de GC
Natildeo se detectou nenhum caso de exclusatildeo na anaacutelise de segregaccedilatildeo de 27 pares
matildeefilho feita separadamente para cada locus
Verifiacutecou-se a presenccedila de dois alelos raros HBB e PEPB1 na raccedila Minhota Estes
alelos poderatildeo ser utilizados na distinccedilatildeo das duas raccedilas estudadas
Foi encontrado um valor de heterozigotia meacutedia de 0237 em populaccedilotildees de raccedila
Barrosatilde indicativo de uma variabilidade geneacutetica intermeacutedia em relaccedilatildeo agrave generalidade das
raccedilas ibeacutericas As diferenccedilas observadas entre as vaacuterias raccedilas ibeacutericas poderatildeo reflectir
fenoacutemenos histoacuterico-evolutivos muito recentes dada a sua proximidade e grande semelhanccedila
Foi observado um reduzido niacutevel de diferenciaccedilatildeo entre as raccedilas Barrosatilde e Minhota
(FST= 0031) demonstrando-se que a maior parte da diversidade geneacutetica se atribui a diferenccedilas
intrapopulacionais Este valor de FST pode considerar-se baixo quando comparado com o
obtido no estudo de outras espeacutecies animais sugerindo um elevado fluxo geacutenico
interpopulacional Por outro lado reflecte ainda uma histoacuteria demograacutefica muito recente
A utilizaccedilatildeo de meacutetodos de agrupamento NJ e UPGMA obtidos a partir de matrizes de
distacircncias geneacuteticas de Nei natildeo permitiu separar a raccedila Barrosatilde das restantes raccedilas ibeacutericas
89
Referecircncias Bibliograacuteficas
6 - REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
AMORIM A (1983) Contribuiccedilatildeo para o conhecimento da Geneacutetica Humana Estudo de Geneacutetica Bioquiacutemica
Formal e Populacional e de Ligaccedilatildeo Factorial Tese de Doutoramento Faculdade de Ciecircncias do
Porto
AMORIM A KOMPF J SCHUNTER F amp RITTER H (1982) Aminolevulinate dehydratase (EC42124)
Linkage analysis Hum Genet 61 48-49
ANSAY M (1973) Techniques microelectrophoretiques dans lanalyse de la multipliciteacute enzymatique chez les
bovins Deacutetection Eacutelectrophoreacutetique des Polymorphismes Biochimiques Chez les Mammifegraveres
Application a LEacutetude Geacuteneacutetique des Populations Centre National de la Recherche Scientifique
Paris 43-58
ARANA A pound amp ZARAGOZA P (1986) Nueva electroforetica dei enzima NADH-Diafrosa (DIA-2) detectada
en la espeacutecie Oryctolagus cuniculus (L) Zootecnia XXXV ndeg 7-12 125-130
ARAUacuteJO J (1986) Contribuiccedilatildeo para o estudo dos bovinos de raccedila Barrosatilde Relatoacuterio de estaacutegio da
licenciatura em Engenharia Zooteacutecnica Universidade dos Accedilores
ARNOLD I C J amp Bouw J (1989) A new allele of glucose phosphate isomerase in dogs Animal Genetics
20 217-220
ARRANZ J J BAYON Y amp SAN PRIMITIVO F (1992) Biochemical polymorphisms in Spanish Avilena-
-Negra Ibeacuterica cattle Animal Genetics 23 (suppl 1) 19
ARRANZ J J BAYON Y amp SAN PRIMITIVO F (1996) Comparison of protein markers and microsatellites in
differentiation of cattle populations Animal Genetics 27 415-419
ASHTON G C (1965) Cattle serum transferrins A balanced polymorphism Genetics 52 983-997
90
Referecircncias Bibliograacuteficas
BAINES J amp MEacuteLEK J (1980) Egipto - Deuses Templos e Faraoacutes Grandes Culturas e Civilizaccedilotildees Ciacuterculo
de Leitores
BELL K ARTHUR H amp ANDERSON I L (1994) Esterase and albumin polymorphism in the domestic cat
(Felis catus) XXIV International Conference on Animal Genetics Praga Julho 1994
BEKENEV V A amp ORLOVA G V (1991) Polymorphism of erytrocytic enzymes in Large White pig breeds in
Siberia Animal Genetics 22 (suppl 1) 23-24
BOWLING A T amp CLARK R S (1988) Excess of heacuteteacuterozygotes at albumin locus in American Standardbred
horses Animal Genetics 19 331-341
BOWLING A T GORDON L PENEDO M C T WICTUM E amp BEEBOUT J (1990) A single gel for
determining genetic of equine erythrocyte carbonic anhydrase (CA) and catalase (Cat) Animal
Genetics 21 191-197
BRADLEY D G MACHUGH D E CUNNINGHAM P amp LOFTUS R T (1996) Mitochondrial diversity and
the origins of African and European cattle Proceeding of the National Academy of Sciences of USA
93 5131-5135
BRAEND M (1971) Studies on the relationships between cattle breeds in Africa Asia and Europe Evidence
obtained by studies of blood groups and protein polymorphisms World Review of Animal Production
VIO (1) 10-14
BRAEND M (1988) Haemoglobin polymorphism in Norwegian Red Cattle Animal Genetics 19 59-62
BRAEND M NESSE 1 L amp EFREMOV G D (1988) Expression and genetics of caprine haemoglobins
Animal Genetics 18 223-231
BROWN L B KANE H amp AYRES H (1993) Vital signs WW Norton e Co pp 323 New York
CARTER D C HE X M MUNSON S EL TWIGG P D GERNERT K M BROOM M B amp MILLER T
Y (1989) Three dimensional structure of human serum albumin Science 244 1195-1198
CECCHINI G amp Nus M D (1986) Literature review on cattle blood polymorphisms and preliminary results
of analysis in East African Zebu in Ethiopia Agric Subtrop and Ttropicale 3 (80) 433-463
91
Referocircicias Bibliograacuteficas
CiacuteZovAacute D STRATIL A MULLER E amp CEPICA S (1993) A new partially deficient transferrin variant in
the pig Animal Genetics 24 305-306
CLARKE S W TUCKER E M amp OSTERHOFF D R (1989) Blood groups and biochemical polymorphism
in the Namaqua sheep breed Animal Genetics 20 279-286
CLUTTON-BROCK J (1992) Domestication of animals In Jomes S Martin R Pilbeam D (eds) The
Cambridge Encyclopedia of Human Evolution pp 380-385 Cambridge University Press
CORDEIRO J P (1986) As raccedilas bovinas em Portugal - Sua Origem O meacutedico veterinaacuterio I (1) 29-39
CRISTOFALO G Cozzi M C amp VALIATI P (1992) Identification of a new variant in the equine serum
alB-glycoprotein (A1B) system Animal Genetics 23 (suppl 1) 24
CUNHA L M (1994) Caracterizaccedilatildeo Morfo-Funcional e Geneacutetica da Raccedila Bovina Alentejana Trabalho de
fim de curso apresentado agrave Escola Superior Agraacuteria de Beja
DEL LAMA S N DEL LAMA M A MESTRINER M A amp MORTARI N (1992) Peptidase B polymorphism
in cattle erythrocytes Biochem Genet 30 247-255
DRATCH P TATE M KRAAY G J amp GERWING V (1992) Plasma proteins differentiating European red
deer and North American elk Animal Genetics 23 (suppl 1) 32
EGGEN A amp FRIES R (1995) An integrated cytogenetic and meiotic map of the bovine genome Animal
Genetics 26 215-236
ERHARDT G (1986) Transferrin variants in sheep separation and characterization by polyacrylamide gel
electrophoresis and isoelectric focusing Animal Genetics 17 343-352
ERHARDT G (1991) Genetic polymorphism of vitamin D binding protein and serum albumin in sheep
Animal Genetics 22 (suppl 1) 28-29
ERHARDT G amp SIMIANER H (1993) Linkage between the loci for serum albumin and vitamin D binding
protein (GC) in sheep Animal Genetics 24 301-303
EPSTEIN H amp MASON I L (1984) Cattle In Mason I L (ed) Evolution of domesticated animals pp 7-
-27 Longman
92
Referecircncias Bibliograacuteficas
FAO (1993) A diversidade da Natureza Um patrimoacutenio valioso Documento produzido pela FAO Divisatildeo de
informaccedilatildeo - Out de 1993 Veterinaacuteria Teacutecnica 10 10-12
FAO (1996) World Watch List for Domestic Animal Diversity 2a ediccedilatildeo FAOUNEP pp 334 Roma
FARNDALE B M HUBBARD D E amp ANDERSON L L (1992) A new PGD variant in New Zeland
Thoroughbred horses Animal Genetics 23 (suppl 1) 24
FELSENSTEIN J (1993) PHYLIP (Phylogeny Inference Package) Version 35 Distributed by the autor Seattle
University of Washington
FERNANDES M T S (1996) Raccedilas de bovinos autoacutectones Um importante recurso geneacutetico animal portuguecircs
a preservar e a defender Veterinaacuteria Teacutecnica 12 10-15
FERRAND N (1995) Variaccedilatildeo geneacutetica de proteiacutenas em populaccedilotildees de coelho (Oryctolagus cuniculus) -
- Anaacutelise da diferenciaccedilatildeo subespecifica subestruturaccedilatildeo expansatildeo geograacutefica e domesticaccedilatildeo
Dissertaccedilatildeo de Doutoramento em Biologia apresentada agrave Faculdade de Ciecircncias da Universidade do
Porto
FERRAND N amp ROCHA J (1991) Genetic polymorphism of serum albumin in wild rabbits populations
Animal Genetics 22 (suppl 1) 36
FORBES P MACKEITH B amp PEBERDY R (1986) Mamiacuteferos Ungulados e Lagomorfos Ciacuterculo de Leitores
FRIES R EGGEN A amp WOMACK J E (1993) The bovine genome map Mammalian Genome 4 405-428
GAHNE B(1963) Inherited variation in the post-albumin of cattle serum Hereditas 50126-135
GAHNE B JUNEJA R K amp GROLMUS J (1977) Horizontal polyacrylamine gel electrophoresis for the
simultaneous phenotyping of transferrin post-transferrin albumin and post-albumin in the blood
plasma of cattle Arum Bid Grps Biochem Genet 8127-137
GARCIA L S VICENTE M V BECERRA A L YEBRA F A RODRIcircGUES M F amp LOacutePEZ J M S
(1992) Razas Bovinas Autoacutectonas de Galicia - I Razas Morenas Galegas (Recursos Xeneacuteticos a
Conservar) Xunta de Galicia
GARCIA M ROSAacuteRIO J amp ANTUNES M (1981) Bovinos em Portugal Direcccedilatildeo dos Serviccedilos Veterinaacuterios -
- DGSV pp 44-78 Lisboa
93
Referecircncias Bibliograacuteficas
GLOWATZKI-MULLIS M L GAILLARD C WIGGER G amp FRIES R (1995) Microsatellite-based
parentage control in cattle Animal Genetics 26 7-12
GONCcedilALVES GARCIA M L (1964) A Raccedila Bovina Barrosatilde Boletim Pecuaacuterio n deg 1 Ano XXXII DGSP
pp 103-172 Lisboa
GONZALEZ P TUNON MJ amp VALLEJO M (1987) Genetic relationships between Spanish native breeds of
cattle Animal Genetics 18 249-256
HALL S B L COTHRAN E G amp KING J A (1991) Variability of manosephosphate isomerase (MPI)
from haemolysate in 14 horse breeds Animal Genetics 22 (suppl 1) 22
HARRIS H amp HOPKINSON D A (1976) Handbook of enzyme electrophoresis in human genetics North-
-Holland Publishers
HEMMER H (1990) Domestication The decline of environmental appreciation Cambridge University Press
HERZOG S (1988) Polymorphism and genetic control of erythrocyte 6-phosphogluconate dehydrogenase in
the genus Cervus Animal Genetics 19 291-294
HERZOG S (1989) Genetic polymorphism of transferrin in fallow deer Cervus dama L Animal Genetics 20
421-426
IGLESIAS A B (1989) Estrutura y relaciones geneacuteticas de razas bovinas mediante marcadores geneacuteticos
(Polimorfismos Bioquiacutemicos) Dissertaccedilatildeo de Doutoramento em Biologia apresentada agrave Faculdade de
Biologia da Universidade de Santiago
JAMIESON A (1965) The genetics of transferrins in cattle Heredity 20 419-441
JANZEN M K amp COTHRAN E G (1991) A new PGD variant from North American horses of feral origin
Animal Genetics 22 (suppl 1) 21-22
JORGE E S (1996) Bovinos da raccedila Minhota Contribuiccedilatildeo para a sua histoacuteria Veterinaacuteria Teacutecnica 10 10-
-18
94
Referecircncias Bibliograacuteficas
JUNEJA R K GAHNE B amp STRATIL A (1987) Polymorphic plasma postalbumins of some domestic
animals (pig Po2 horse XK and dog Pa proteins) identified as homologous Animal Genetics 18 119-
-124
JUNEJA R K KURYL J GAHNE B amp ZURKOWSKI M (1989) Linkage between the loci for transferrin
and ceruloplasmin in pigs Animal Genetics 20 307-311
KALAB P STRATIL A amp GLASNAacuteK V (1990) Genetic polymorphism of serum vitamin D-binding protein
(GC) in sheep and mouflon Animal Genetic 21 317-321
KAWAGUCHI T (1973) Polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of serum albumin into three
bands Clinica ChimicaActa 45 85-92
KIDD K K STONE W H CRIMELLA C CARENZI C CASATI M amp ROGNONI G (1980)
Immunogenetic and population genetic analyses of Iberian cattle Anim Blood Grps Biochem Genet
11 21-38
KRISTJANSSON F K (1963) Genetic control of two pre-albumins in pigs Genetics 48 1059-1063
KRISTJANSSON F K amp HICKMAN C G (1965) Subdivision of the allele TF D for transferrins in Holstein
and Ayrshire cattle Genetics 52 627-630
KUROSAWA Y amp TANAKA K (1988) Electrophoretic variants of serum transferrin in wild pig populations of
Japan Animal Genetics 19 31-35
LEAL C (1995) Apreciaccedilatildeo fenotiacutepica de um nuacutecleo de bovinos de raccedila Barrosatilde e amostragem para sua
caracterizaccedilatildeo geneacutetica Relatoacuterio de estaacutegio de licenciatura em Biologia - Ramo Cientiacutefico
Tecnoloacutegico em Ecologia e Recursos Zooloacutegicos Faculdade de Ciecircncias da Universidade do Porto
LITT M amp LUTTY J A (1989) A hipervariable microsatellite revealed by in vitro amplification of a
dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene American Jornal of Human Genetics 44
397-401
LOFTUS R T MACHUGH D E NGERE L O BALAIN D S BADI A M BRADLEY D G amp
CUNNINGHAM E P (1994a) Mitochondrial genetic variation in European African and Indian cattle
populations Animal Genetics 25 265-271
95
Referecircncias Bibliograacuteficas
LOFTUS R T MACHUGH B E BRADLEY B G SHARP P M amp CUNNINGHAM P (1994b) Evidence
for two independent domestications of cattle Proceeding of the National Academy of Sciences of USA
91 2757-2761
MACHUGH D E LOFTUS R T BRADLEY B G SHARP P M amp CUNNINGHAM P (1994)
Microsatellite DNA variation and among European cattle breeds Proceedings of the Royal Society of
London B 256 25-31
MACHUGH B E SHRIVER M B LOFTUS R T CUNNINGHAM P amp BRADLEY B G (1997)
Microsatellite DNA Variation and the Evolution Domestication and Phylogeography of taurine and
zebu cattle (Bos taunts and Bos indicus) Genetics 146 1071-1086
MARTINS R (1982) Conservaccedilatildeo e melhoramento dos bovinos de raccedila Barrosatilde Relatoacuterio de estaacutegio de
licenciatura em Produccedilatildeo Animal Instituto Universitaacuterio de Traacutes-os-Montes e Alto Douro
MIRANDA DO VALE J (1949) Gado Bissulco Livraria Saacute da Costa Lisboa
MORAIS M L (1992) Estudo Desenvolvimento e Optimizaccedilatildeo de Teacutecnicas de Separaccedilatildeo e Detecccedilatildeo
Especiacutefica de Proteiacutenas Dissertaccedilatildeo de Mestrado em Biologia Celular apresentada agrave Faculdade de
Ciecircncias da Universidade de Coimbra
NEI M (1978) Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small number of individuals
Genetics 89 583-590
NICHOLS E A CHAPMAN V M amp RUDDLE F H (1973) Polymorphism and linkage for
Mannosephosphate isomerase in Mus musculus Biochem Genet 8 47-53
NOBRE J M (s data) Caracterizaccedilatildeo geneacutetica da raccedila bovina Mirandesa Trabalho de fim de curso
efectuado na Estaccedilatildeo Nacional de Selecccedilatildeo e Reproduccedilatildeo Animal Curso de Engenharia Zooteacutecnica da
Universidade de Eacutevora
PENEDO M C T FOWLER M E BOWLING A T ANDERSON B L amp GORDON L (1988) Genetic
variation in the Wood of llamas Llama glama and alpaca Llama pacos Animal Genetics 19 267-
-276
PENEDO M C T amp JUNEJA R K (1989) Polymorphic plasma postalbumin (PO) of llamas and alpacas
identified as GC Protein Animal Genetics 20 221-223
96
Referecircncias Bibliograacuteficas
PENHALLOW R C MASON A B amp WOODWORTH R C (1991) Electrophoretic characterization of
human equine and bovine transferrins Comp Biochem Physiol 98B 41-45
PEREIRA A A (1997) Caracterizaccedilatildeo Geneacutetica de Algumas Subpopulaccedilotildees de Truta de Rio Salmo trutta L
da Bacia Hidrograacutefica do Rio Lima Dissertaccedilatildeo de Mestrado em Ecologia Aplicada apresentada agrave
Faculdade de Ciecircncias da Universidade do Porto
PIEDRAFITA J TEJEDOR M T amp ZARAGAZA L (1984) Post-Albuminas y Post-Transferrinas en
poblaciones bovinas Espafiolas Frisona y De Lidia Comunicacioacuten Presentada A La 34deg Reunion
Anual De La Federacioacuten Europea de Zootecnia 114-121
POVEY S CORNEY G LEWIS W H P ROBSON E B PARRINGTON J M amp HARRIS H (1972) The
genetics of peptidase C in man Ann Hum Genet 35 455-465
PRETSCH W amp MERKLE S (1990) Glucose Phosphate Isomerase Enzyme - Activity Mutants in Mus
musculus Genetical and Biochemical Characterization Biochemical Genetics 28 97-110
RASERO R D I STASIO L amp BERRA G P (1993) Polymorphism of erythocyte glucosephosphae isomerase
in sheep Animal Genetics 24 63-64
RITTER EL FRIEDRICHSON U amp SCHMITT J (1974) Genetic variation of Manose phosphate isomerase in
Man Humangenetik 22 261
RITTER H amp SCHMITT J (1973) Genetic polymorphism of Manose phosphate isomerase in Primates
Humangenetik 19 325-326
ROCHA J KOtildeMPF J FERRAND N AMORIM A amp RITTER H (1991) Separation of human alloalbumin
variants by isoelectric focusing Electrophoresis 12 313-314
ROGERSON J (1991) Biacuteblia- Os Caminhos de Deus Grandes Culturas e Civilizaccedilotildees Ciacuterculo de Leitores
RON M BAND M YANAI A amp WELLER J L (1994) Mapping quantitative trait loci with DNA
microsatellites in a commercial dairy cattle population Animal Genetics 25 259-264
RUSSEL G (1996) The analysis of genetic diversity in cattle to preserve future breeding options (Online)
Available http wwwribbsrcacukcdiv_wwwinformhtm (1996 November 29)
97
Referecircncias Bibliograacuteficas
SAITOU N amp NEI M (1987) The neighbor-joining method a new method for reconstructing phylogenetic
trees Mol Biol Evol 4 406-425
SANTOS O C M (1995) Caracterizaccedilatildeo Geneacutetica de Populaccedilotildees de Lebre Ibeacuterica (Lepus granatensis) e
Lebre Europeia (Lepus europaeus) - Aspectos Bioquiacutemicos e Populacionais Dissertaccedilatildeo de Mestrado
em Ecologia Aplicada apresentada agrave Faculdade de Ciecircncias da Universidade do Porto
SARAIVA J A (1993) Histoacuteria de Portugal Publicaccedilotildees Europa-Ameacuterica
SARTORE G STORMONT C MORRIS B G amp GRUNDER A A (1969) Multiple electrophoretic forms of
Carbonic Anhydrase in red cells of domestic cattle (Bos taurus) and American buffalo (Bison bison)
Genetics 61823-831
SCHNEIDER H SCHNEIDER M P C SILVA B T F amp SALZANO F M (1990) Transferrin and albumin
polymorphisms in buffaloes from Brazil Animal Genetics 21 335-337
SEATH P H A amp SOKAL R R (1973) Numeric Taxonomy W H Freeman amp Co
SELVARAJ O S MUKHERJEE T K DHALIWAL S S TAN S G amp BARKER J S F (1991) Biochemical
polymorphisms in the local goats of South-East Asia Animal Genetics 22 (suppl 1) 32
STERN C M MILLER S A amp SCHANFIELD M S (1992) Differentiation of wapiti and Eurasian red deer
by isoelectric focusing electrophoresis of GC on agarose gels Animal Genetics 23 (suppl 1) 23
STORMONT C amp SUZUKI Y (1963) Genetic control of albumin phenotypes in horses Proceeding of the
Society for Experimental Biology and Medicine 144 673-675
STRATIL A GLASNAacuteK V BOBAacuteK P CiacutezovAacute D GAacuteBRISOVAacute E amp KALAB P (1990) Variation of some
serum proteins in red deer Cervus elaphus L Animal Genetics 21 285-293
SWOFFORD D L amp SELANDER R B (1989) BIOSYS-1 A computer program for the analysis of allelic
variation in population genetics and biochemical systematics Release 17 Illinois Natural History
Survey
TASHIAN R E (1989) The carbonic anhydrases widening perspectives on their evolution expression and
function BioEssays 10 186-192
98
Referecircncias Bibliograacuteficas
TASHIAN R E amp CARTER N D (1976) Biochemical Genetics of Carbonic Anhydrase In Harris H (ed)
Advances in Human Genetics 7 1-56 Plenum
TATE M L amp MCEWAN K M (1992) Genetic polymorphism of erytrocyte diaphorase in red deer Cervus
elaphusL Animal Genetics 23 449-452
TSUJI S SAOAMITSU Y amp GOTO N (1989) Ultrathin-leyer isoelectric focusing for bovine serum
transferrin phenotyping Biochem Genet 27 425-429
TUCKER E M amp YOUNG J D (1988) Genetic control of red-cell nucleoside transport and its association
with the B blood-group locus and nucleoside phosphorylase activity in sheep Biochem Genet 26 489-
-501
TUNON M J GONZALEZ P amp VALLEJO M (1989) Genetic relationships between 14 native Spanish
breeds of goat Animal Genetics 20 205-212
USHA A P (1996) Cattle diversity by blood typing (Online) Available http
wwwribbsrcacukcdiv_wwwinfobhtm ( 1996)
USHA A P SIMPSON S P amp WILLIAMS J L (1995) Probability of random sire exclusion using
microsatellite markers for parentage verification Animal Genetics 26 155-161
VANDEBERG J amp AIVALIOTIS M (1990) Mannose-6-phosphate isomerase polymorphism in baboon
erythrocytes Biochemical Genetics 28 495-501
VAN DE WEGHE A VAN ZEVEREN A amp BOUQUET Y (1982) The vitamin D binding protein in domestic
animals Comp Biochem Physiol 73B 977-982
VAN DE WEGHE A YABLANSKI T S VAN ZEVEREN A amp BOUQUET Y (1988) A third variant of glucose
phosphate isomerase in pigs Animal Genetics 19 55-58
VANKAN D M amp BELL K (1992 a) A new allele in Australian goats Animal Genetics 23 453-456
VANKAN D M amp BELL K (1992 b) Genetic polymorphism of vitamin D-binding protein (GC) in Australian
goats Animal Genetics 23 457-462
VICENTE M V (1978) Razas vacunas autoacutectonas en vias de extincioacuten (Aportaciones al estuacutedio geneacutetico)
Fundacioacuten Juan March Serie Universitaacuteria LXK 10-51
99
Referecircncias Bibliograacuteficas
VIEIRA J (1993) Utilizaccedilatildeo de marcadores geneacuteticos na caracterizaccedilatildeo e certificaccedilatildeo de populaccedilotildees
domeacutesticas e selvagens de coelho (Oryctolagus cunicuius) Dissertaccedilatildeo de Mestrado apresentada agrave
Faculdade de Ciecircncias da Universidade do Porto
VIEIRA J amp FERRAND N (1995) Four new alleles at the mannose-6-phosphate isomerase locus in rabbit
Animal Genetics 26 37-38
WANG S FOOTE W C amp BUNCH T D (1990) Transferrin and haemoglobin polymorphism in
domesticated goats in the USA Animal Genetics 21 91-94
WEBER J L amp MAY P E (1989) Abundant class of human DNA polymorphisms which can be typed using
the polymerase chain reaction American Jornal of Human Genetics 44 388-396
WELCHS S (1990) A comparison of the structure and properties of serum transferrin from 17 animal species
Comp Biochem Physiol 97 B (3) 417-427
100
ANEXO
Anexos
RESUMO E CONCLUSOtildeES
Neste trabalho apresenta-se uma contribuiccedilatildeo para o estudo geneacutetico da raccedila bovina Barrosatilde e de uma outra raccedila (Minhota) atraveacutes da anaacutelise da variaccedilatildeo geneacutetica de proteiacutenas detectada pela utilizaccedilatildeo de sistemas electroforeacuteticos convencionais e por focagem isoeleacutectrica
Definiram-se os seguintes objectivos fundamentais
1 estudo da variabilidade geneacutetica da raccedila Barrosatilde ao niacutevel das proteiacutenas eritrocitaacuterias e plasmaacuteticas 2 desenvolvimento e afinaccedilatildeo de teacutecnicas de separaccedilatildeo de proteiacutenas por electroforese e focagem
isoeleacutectrica e sua detecccedilatildeo especiacutefica (histoquiacutemica e imunoloacutegica) 3 anaacutelise familiar dos polimorfismos encontrados 4 avaliaccedilatildeo do grau de diferenciaccedilatildeo geneacutetica existente entre a raccedila Barrosatilde e outras raccedilas bovinas
Escolheu-se um conjunto de 12 sistemas geneacuteticos (sete dos quais se revelaram polimoacuterficos) que pudesse satisfazer os objectivos fundamentais do trabalho
Assim apoacutes desenvolvimento de teacutecnicas de separaccedilatildeo para os sistemas geneacuteticos considerados procedeu-se a uma anaacutelise familiar baseada nos polimorfismos encontrados nas populaccedilotildees de raccedila Barrosatilde ao estudo de distribuiccedilatildeo populacional dos fenoacutetipos das duas raccedilas estudadas e de outras raccedilas bovinas da Europa (principalmente da Peniacutensula Ibeacuterica)
Com base neste trabalho obtiveram-se as seguintes conclusotildees
bull a utilizaccedilatildeo de um sistema de focagem isoeleacutectrica permitiu detectar a existecircncia de polimorfismo geneacutetico na hemoglobina distinguindo-se dois produtos geacutenicos na raccedila bovina Minhota HBA e HBB Na raccedila Barrosatilde HBA foi o uacutenico produto geacutenico encontrado
bull a utilizaccedilatildeo de um sistema de focagem isoeleacutectrica permitiu a detecccedilatildeo de dois produtos geacutenicos no locus CAII (CAIIF e CAIPS) e revelou-se mais eficaz de que as teacutecnicas de separaccedilatildeo convencional em gel de amido
bull a investigaccedilatildeo realizada permitiu detectar a ocorrecircncia de polimorfismo geneacutetico de MPI atraveacutes de um sistema electroforeacutetico em gel de amido tendo-se detectado trecircs produtos geacutenicos (MPIA MPIB e MPIC) A fraca actividade de MPI e a grande dificuldade na obtenccedilatildeo de um contraste de bandas adequado poderaacute dever-se ao facto de a sua expressatildeo soacute ocorrer na fracccedilatildeo leucocitaacuteria do sangue
bull a aplicaccedilatildeo de um sistema de focagem isoeleacutectrica na presenccedila de ureia (8M) revelou-se muito eficaz na separaccedilatildeo de ALB e permitiu detectar pela primeira vez um novo variante ALBV ligeiramente mais aciacutedico do que ALB A
bull a combinaccedilatildeo de uma teacutecnica de focagem isoeleacutectrica com um preacutevio tratamento das amostras a fim de saturar a moleacutecula de TF com Fe permitiu a detecccedilatildeo de quatro produtos geacutenicos (TFA TFD1 TFD2 e TFE) nas raccedilas estudadas
bull a combinaccedilatildeo de uma teacutecnica de focagem isoeleacutectrica com a detecccedilatildeo por immunoblotting permitiu detectar dois produtos geacutenicos no locus GC (GCA e GCB) O tratamento de amostras com neuraminidase permitiu a obtenccedilatildeo de padrotildees mais simples do que os conseguidos com amostras nativas Esta simplificaccedilatildeo resulta da provaacutevel remoccedilatildeo de aacutecidos siaacutelicos ligados agrave moleacutecula de GC
bull natildeo se detectou nenhum caso de exclusatildeo na anaacutelise de segregaccedilatildeo de 27 pares matildeefilho feita separadamente para cada locus
bull verificou-se a presenccedila de dois alelos raros HBB e PEPB1 na raccedila Minhota Estes alelos poderatildeo ser utilizados na distinccedilatildeo das duas raccedilas estudadas
I
Anexos
bull foi encontrado um valor de heterozigotia meacutedia de 0237 em populaccedilotildees de raccedila Barrosatilde indicativo de uma variabilidade geneacutetica intermeacutedia em relaccedilatildeo agrave generalidade das raccedilas ibeacutericas As diferenccedilas observadas entre as vaacuterias raccedilas ibeacutericas poderatildeo reflectir fenoacutemenos histoacuterico-evolutivos muito recentes dada a sua proximidade e grande semelhanccedila
bull foi observado um reduzido niacutevel de diferenciaccedilatildeo entre as raccedilas Barrosatilde e Minhota (FST = 0031) demonstrando-se que a maior parte da diversidade geneacutetica se atribui a diferenccedilas intrapopulacionais Este valor de FST pode considerar-se baixo quando comparado com o obtido no estudo de outras espeacutecies animais sugerindo um elevado fluxo geacutemeo interpopulacional Por outro lado reflecte ainda uma histoacuteria demograacutefica muito recente
bull a utilizaccedilatildeo de meacutetodos de agrupamento NJ e UPGMA obtidos a partir de matrizes de distacircncias geneacuteticas de Nei natildeo permitiu separar a raccedila Barrosatilde das restantes raccedilas ibeacutericas
II
Anexos
Tabela A Frequecircncias geacutenicas para os vaacuterios sistemas polimoacuterficos encontrados na raccedila Barrosatilde (indiviacuteduos inscritos e natildeo inscritos) utilizadas na anaacutelise familiar
LOCUS ALELOS FREQUEcircNCIA GEacuteNICA
CAII 294 035
065
NP 294 H
L
024
076
MPI 290 A
B
C
000
098
002
ALB 294 A
B
V
097
002
001
TF 294 A
Dl
D2
E
057
016
023
004
GC 294 083 017
TTI
Introduccedilatildeo
Durante o periacuteodo compreendido entre o iniacutecio do Neoliacutetico ateacute agraves idades do Cobre e
do Bronze a domesticaccedilatildeo dos bovinos levou a uma contiacutenua diminuiccedilatildeo do tamanho corporal
dos animais na Europa Posteriormente este processo teraacute sido interrompido com a introduccedilatildeo
de gado bovino trazido de Roma e muitas raccedilas extinguiram-se apoacutes a queda do Impeacuterio
Romano (EPSTEIN amp MASON 1984)
Esta tendecircncia continuou a observar-se durante a Idade Meacutedia e soacute com a Revoluccedilatildeo
Industrial e a necessidade de abastecer as grandes cidades se produziu um incremento na
criaccedilatildeo de gado (EPSTEIN amp MASON 1984)
Neste domiacutenio a modernizaccedilatildeo da agricultura e a produccedilatildeo intensiva de alimentos teraacute
originado uma contiacutenua diminuiccedilatildeo dos efectivos populacionais de muitas raccedilas autoacutectones
evidente sobretudo durante a uacuteltima metade deste seacuteculo Estas circunstacircncias determinaram
assim a sensibilizaccedilatildeo da sociedade para as consequecircncias do empobrecimento de diversidade
geneacutetica do gado bovino permitindo o estabelecimento de linhas de investigaccedilatildeo destinadas agrave
sua gestatildeo e conservaccedilatildeo (BROWN et ai 1993 FAO 1996)
112 - Paleontologia arqueozoologia
De acordo com os actuais dados paleontoloacutegicos o mais antigo ruminante do Velho
Mundo teraacute aparecido no Mioceno (Gelocus) caracterizando-se pela ausecircncia de incisivos na
mandiacutebula superior e possuindo jaacute uma conformaccedilatildeo do esqueleto idecircntica agrave dos bovinos
actuais (IGLESIAS 1989 e GARCIA et ai 1992) Esta forma viria a originar posteriormente os
quatro geacuteneros actuais de ruminantes Ovis Capra Antilope e Bos (IGLESIAS 1989)
A evidecircncia paleontoloacutegica indica tambeacutem que teratildeo existido na Europa diferentes
espeacutecies de boviacutedeos actualmente extintas Destas apenas o auroque sobreviveu ateacute agrave Idade
Meacutedia havendo documentos escritos que se referem ao local e data da morte do uacuteltimo
exemplar (Poloacutenia 1627) (LOFTUS et ai 1994)
As primeiras representaccedilotildees de bovinos feitas pelo Homem devem precisamente
referir-se a auroques sendo um dos exemplos mais conhecidos constituiacutedo pelas pinturas
rupestres das grutas de Lascaux (Franccedila) (figura 111)
4
Introduccedilatildeo
Figura 111 Pintura rupestre nas paredes de grutas em Lascaux Franccedila Datando de haacute cerca de 15000 anos Reproduzido de FORBES (1986)
Soacute mais tarde surge a evidecircncia de que o processo de domesticaccedilatildeo se poderaacute ter
iniciado De facto alguns achados neoliacuteticos (8000 a 5500 anos aC) provenientes da
Anatoacutelia parecem indicar a presenccedila de animais jaacute domesticados Esta regiatildeo do Sudoeste
Asiaacutetico poderaacute assim constituir o centro de domesticaccedilatildeo do gado bovino a partir de
populaccedilotildees selvagens da subespeacutecie asiaacutetica do auroque (Bos primigenius namadicus)
(EPSTEIN amp MASON 1984)
Outra evidecircncia adicional eacute fornecida pela descoberta de ossos e dentes de um animal
sensivelmente mais pequeno do que o auroque (Iraque 5000 anos aC) bem como por um
primeiro testemunho escrito onde se descreve em placas de argila uma cabeccedila de vaca
(Mesopotacircmia 5000 anos aC) (ROGERSON 1991)
Muitos outros achados arqueoloacutegicos e paleontoloacutegicos foram encontrados na
Mesopotacircmia (4000 anos aC) e no vale do rio Nilo (4000 anos aC) mostrando um bovino
totalmente domesticado e de longos cornos (EPSTEIN amp MASON 1984)
A consolidaccedilatildeo do processo de domesticaccedilatildeo eacute a partir desta altura inquestionaacutevel
tornando-se abundantes os registos de bovinos domesticados na Mesopotacircmia e vale do Nilo
A este respeito devem referir-se especialmente as numerosas esculturas relevos pinturas e
textos em papiro que relatam pormenores da vida quotidiana do povo egiacutepcio e onde aparecem
diversas cenas que mostram a importacircncia do gado bovino na agricultura e na alimentaccedilatildeo
(figura 112)
5
Introduccedilatildeo
Figura 112 Desenho ilustrativo de uma ordenha 5a dinastia Reproduzido de BAINES
amp MEacuteLEK (1980)
A partir desta altura as descobertas arqueozooloacutegicas satildeo testemunho de uma
expansatildeo do gado bovino Assim existem registos datados de haacute cerca de 2000 e 3000 anos
aC que sugerem a ocorrecircncia no Norte de Aacutefrica de animais de enormes cornos em forma de
lira (EPSTEIN amp MASON 1984)
Tal expansatildeo daacute-se tambeacutem pela Turquia indo ateacute ao Caacuteucaso e agrave Ruacutessia e chega
tambeacutem agrave Europa onde nas regiotildees do Norte foram encontrados objectos de arte da idade do
Cobre e do Bronze que representam bovinos e datam do iniacutecio do Cristianismo (EPSTEIN amp
MASON 1984)
A migraccedilatildeo para oriente estaacute tambeacutem bem documentada atraveacutes de numerosos restos
arqueozooloacutegicos descobertos em toda a Aacutesia Eacute contudo nesta regiatildeo geograacutefica que se
pode observar a transiccedilatildeo de gado bovino sem bossa (Bos taurus) para outro com bossa (Bos
indicus) Segundo alguns autores as raccedilas de Bos indiens ou gado zebu derivariam das raccedilas
de Bos taurus ou gado taurino atraveacutes de um processo de selecccedilatildeo (EPSTEIN amp MASON
1984) Alternativamente estes dados podem tambeacutem ser interpretados como a ocorrecircncia de
dois processos de domesticaccedilatildeo independentes seguidos do contacto entre as duas populaccedilotildees
domeacutesticas de gado bovino
Adicionalmente deve salientar-se que a evidecircncia descrita eacute ainda muito incompleta
pelo que a interpretaccedilatildeo dos dados deve ser feita com bastante precauccedilatildeo A tiacutetulo de
exemplo refiram-se os achados arqueozooloacutegicos efectuados na Peniacutensula dos Balcatildes e na
6
Introduccedilatildeo
Macedoacutenia Grega (6200 anos aC) Segundo EPSTEIN amp MASON (1984) estes achados
sugerem que o Sul da Europa poderia constituir o primeiro centro de domesticaccedilatildeo do gado
bovino a partir de onde se teria iniciado a sua expansatildeo em direcccedilatildeo ao resto do continente
europeu Ruacutessia e Sudoeste Asiaacutetico
113 - Anaacutelise geneacutetica
A investigaccedilatildeo sobre a geneacutetica das diferentes raccedilas de gado bovino tem contribuiacutedo de
forma muito significativa para a compreensatildeo da sua histoacuteria dos padrotildees de diversidade que
actualmente as caracterizam e do seu grau de parentesco Os resultados actualmente
disponiacuteveis reportam-se a trecircs domiacutenios principais grupos sanguiacuteneos variaccedilatildeo geneacutetica de
proteiacutenas e polimorfismos do DNA (DNA mitocondrial e microssateacutelites)
Grupos sanguiacuteneos
A primeira tentativa para avaliar o grau de diferenciaccedilatildeo geneacutetica entre raccedilas bovinas e
caracterizar a sua diversidade data do iniacutecio de deacutecada de 70 e envolveu precisamente o
estudo dos diferentes grupos sanguiacuteneos que iam sendo descritos (RUSSELL 1996 USHA
1996) Contudo a maior parte dos resultados natildeo permitiu a obtenccedilatildeo de conclusotildees
definitivas pelo facto de se trabalhar com um nuacutemero relativamente reduzido de loci que
adicionalmente era pouco polimoacuterfico Deve poreacutem referir-se que se dispotildee actualmente de
uma consideraacutevel quantidade de informaccedilatildeo no que se refere agrave distribuiccedilatildeo da variabilidade dos
grupos sanguiacuteneos nas diferentes raccedilas bovinas conferindo a este conjunto de dados uma
importacircncia natildeo despreziacutevel no estudo de eventuais alteraccedilotildees da estrutura geneacutetica de
populaccedilotildees de gado bovino nos uacuteltimos vinte anos (RUSSELL 1996 USHA 1996)
Proteiacutenas
A introduccedilatildeo de teacutecnicas electroforeacuteticas de separaccedilatildeo de proteiacutenas permitiu aumentar
de forma muito consideraacutevel o nuacutemero de sistemas geneacuteticos polimoacuterficos conhecidos nas
raccedilas bovinas em especial no que se refere a proteiacutenas do sangue e do leite (USHA 1996)
A anaacutelise da sua distribuiccedilatildeo populacional veio demonstrar a ocorrecircncia de dois grupos
principais de bovinos ou duas subespeacutecies (Bos primigenius taurus e Bos primigenius
7
Introduccedilatildeo
indiens) cada um deles caracterizado pela presenccedila de diversos alelos privativos em vaacuterios loci
(BRAEND 1971)
Estes resultados estatildeo de uma maneira geral de acordo com dados morfoloacutegicos
histoacutericos e ainda com a distribuiccedilatildeo geograacutefica conhecida dos principais grupos (EPSTEIN amp
MASON 1984) No entanto o acreacutescimo de informaccedilatildeo fornecido por este tipo de marcadores
foi ainda insuficiente para resolver muitas das interpretaccedilotildees contraditoacuterias publicadas sobre o
tema
Polimorfismo do DNA
A introduccedilatildeo das teacutecnicas de anaacutelise genoacutemica directa e em especial a descoberta do
polimorfismo do DNA-mitocondrial (mtDNA) e dos microssateacutelites forneceram os
instrumentos necessaacuterios a uma detalhada caracterizaccedilatildeo geneacutetica das raccedilas bovinas
A anaacutelise da variaccedilatildeo da moleacutecula de mtDNA permitiu verificar que Bos primigenius
taurus e Bos primigenius indicus teratildeo divergido haacute cerca de 210000 anos uma data muito
anterior agrave indicada pelos dados arqueoloacutegicos para o iniacutecio do processo de domesticaccedilatildeo Eacute
assim muito provaacutevel que tenham ocorrido duas domesticaccedilotildees independentes a partir de duas
subespeacutecies diferentes do auroque Bos primigenius namadicus teraacute dado origem ao gado
zebu na Aacutesia (Vale do Indu) e Bos primigenius primigenius ao gado europeu vindo do
Proacuteximo Oriente (LOFTUS et ai 1994a 1994b)
Muito recentemente BRADLEY et ai (1996) e MACHUGH et ai (1997) sugerem ainda
uma terceira domesticaccedilatildeo independente ocorrida em Aacutefrica Esta evidecircncia resulta tambeacutem
de anaacutelise do polimorfismo do mtDNA indicando uma separaccedilatildeo entre os ancestrais do gado
europeu e africano anterior agrave domesticaccedilatildeo (22000 - 26000 anos) Este terceiro processo de
domesticaccedilatildeo ter-se-ia assim efectuado a partir da subespeacutecie africana do auroque (Bos
primigenius opisthonomus)
A descoberta dos microssateacutelites e do seu elevado grau de polimorfismo data do fim da
deacutecada de 80 (Lm amp LUTY 1989 WEBER amp MAY 1989) e constitui provavelmente a
metodologia mais adequada para estudar a histoacuteria recente da diversificaccedilatildeo das raccedilas bovinas
(MACHUGH et ai 1994 ARRANZ et ai 1996) Os primeiros resultados que envolvem uma
caracterizaccedilatildeo em larga escala de diferentes populaccedilotildees permitiram distinguir mais claramente
a estrutura geneacutetica dos dois grandes grupos de gado bovino (Bos taurus e Bos indicus) e
constituem a base para futuros estudos mais especiacuteficos
8
Introduccedilatildeo
Por outro lado os microssateacutelites permitiram tambeacutem o iniacutecio do projecto de
cartografia do genoma bovino que no fim de 1994 contabilizava 202 marcadores geneacuteticos
(dos quais 144 eram microssateacutelites) regularmente espaccedilados em 90 do seu comprimento
Cerca de um ano depois existiam jaacute mais de 400 microssateacutelites (USHA et ai 1995) levando
EGGEN et ai (1995) a apresentar um trabalho de revisatildeo e consolidaccedilatildeo de informaccedilatildeo jaacute
existente para evitar a ocorrecircncia de possiacuteveis redundacircncias
A aplicaccedilatildeo deste tipo de marcadores natildeo se restringe apenas agrave anaacutelise da diversidade
geneacutetica populacional e agrave construccedilatildeo de mapas geneacuteticos De facto satildeo actualmente escolhidos
para a realizaccedilatildeo de testes de paternidade (GLOWATZKI-MULLIS et ai 1995 USHA et ai 1995
ARRANZ et ai 1996) detecccedilatildeo de loci que determinam a expressatildeo de caracteriacutesticas
quantitativas (QTL) (RON et ai 1994) determinaccedilatildeo do sexo em embriotildees selecccedilatildeo animal
assistida entre outros
No seu conjunto estes resultados tecircm permitido um avanccedilo notaacutevel na compreensatildeo da
evoluccedilatildeo das actuais raccedilas bovinas A prossecuccedilatildeo desta via de investigaccedilatildeo poderaacute levar ao
esclarecimento definitivo do nuacutemero de domesticaccedilotildees independentes que teraacute ocorrido
(EPSTEIN amp MASON 1984 LOFTUS et al 1994a 1994b BRADLEY et al 1996 MACHUGH et
al 1997) a partir das populaccedilotildees selvagens de auroque Seguidamente eacute legiacutetimo esperar que
venha a ser possiacutevel analisar a uma escala mais fina o grau de parentesco geneacutetico entre raccedilas
que ocupem aacutereas geograacuteficas mais reduzidas Neste particular seraacute extremamente interessante
incluir as populaccedilotildees ibeacutericas e em especial a raccedila Barrosatilde
9
Introduccedilatildeo
12 - A DIVERSIDADE DAS RACcedilAS BOVINAS
A domesticaccedilatildeo resultou na criaccedilatildeo de milhares de raccedilas de animais domeacutesticos
geneticamente diferentes e adaptadas agraves necessidades humanas e a uma grande variedade de
condiccedilotildees ambientais (FAO 1993)
121 - As raccedilas ibeacutericas
A grande diversidade de raccedilas bovinas da Peniacutensula Ibeacuterica poderaacute dever-se em parte
agrave introduccedilatildeo de outras raccedilas domeacutesticas que se cruzaram entre si e com bovinos jaacute existentes
na Peniacutensula A introduccedilatildeo de outras raccedilas teraacute sido feita de duas formas distintas
1 - atraveacutes dos movimentos migratoacuterios acompanhando as vaacuterias invasotildees de povos
vindos do oriente como eacute o caso dos Feniacutecios ( seacutec X aC) Gregos (seacutec VII aC) e
Romanos (seacutec III aC) Estes uacuteltimos dominaram completamente a Peniacutensula durante
7 seacuteculos e teratildeo contribuiacutedo para a diversificaccedilatildeo do gado bovino pelo facto de
introduzirem animais de caracteriacutesticas diferentes Supotildee-se que do seu cruzamento
com os bovinos ibeacutericos se teratildeo originado os troncos aquitacircnico e ibeacuterico (MIRANDA
do VALE 1949)
2 - atraveacutes da introduccedilatildeo de animais do Norte de Aacutefrica na sequecircncia da invasatildeo de
povos como os Cartagineses (seacutec V aC) e jaacute na era cristatilde os Mouros (711 dC)
Estes teratildeo introduzido descendentes de Bos primigenius opisthonomus que poderaacute
ter influenciado a formaccedilatildeo de vaacuterias raccedilas ibeacutericas nomeadamente as raccedilas Barrosatilde e
Cachena (APARIacuteCIO 1960 in IGLESIAS 1989 EPSTEIN amp MASON 1984) Estas
poderatildeo assim constituir uma linha que descende do tronco mauritaacutenico (MIRANDA
do VALE 1949)
10
Introduccedilatildeo
Adicionalmente eacute provaacutevel que povos oriundos do Norte da Europa nomeadamente
os Visigodos possam ter introduzido gado bovino dessa regiatildeo Contudo a sua eventual
contribuiccedilatildeo para a diversidade de raccedilas bovinas da Peniacutensula Ibeacuterica estaacute por esclarecer
122 - A raccedila Barrosatilde
Aspectos histoacutericos da dispersatildeo e evoluccedilatildeo do efectivo populacional
O centro de criaccedilatildeo da raccedila Barrosatilde situa-se actualmente na zona do planalto da Serra
do Barroso abrangendo os actuais concelhos de Montalegre Boticas Vieira do Minho
(freguesias de Campos e Ruivatildees) e Cabeceiras de Basto (freguesia de Gondiatildees) Esta regiatildeo
natildeo possui condiccedilotildees agro-climateacutericas que permitam grandes exploraccedilotildees agriacutecolas pelo que
uma parte importante da populaccedilatildeo se dedica agrave criaccedilatildeo de gado (GARCIA et ai 1981
FERNANDES 1996)
Vivendo sobretudo em zonas montanhosas a Barrosatilde eacute utilizada essencialmente como
forccedila de trabalho e na produccedilatildeo de carne de excelente qualidade motivo pelo qual a Uniatildeo
Europeia a reconhece com denominaccedilatildeo de Origem Protegida (FERNANDES 1996)
No seacuteculo passado e iniacutecio do seacuteculo XX existia um grande incentivo para a criaccedilatildeo
desta raccedila devido agrave procura da sua carne muito apreciada em Inglaterra Este incentivo
contribuiu indirectamente para que a estatura dos animais se elevasse (GARCIA et ai 1981) e
para que a zona de criaccedilatildeo se dispersasse pelas aacutereas submontanhosas e pelas planiacutecies do
Entre Douro e Minho ateacute agrave orla mariacutetima chegando mesmo ao concelho de Vila Nova de Gaia
(figura 121) Nestas zonas fazia-se a criaccedilatildeo de novilhos para exploraccedilatildeo como bois de
trabalho e para produccedilatildeo de carne Tal exploraccedilatildeo estaacute bem patente nos paineacuteis de azulejos da
estaccedilatildeo de caminhos de ferro de S Bento no Porto e mesmo nos desenhos das calccediladas nas
principais avenidas desta cidade
li
Introduccedilatildeo
B
bull bull bull _ bull bull bull - bull bull
Figura 121 A) Junta de bois de trabalho de raccedila Barrosatilde B) Fecircmea adulta Barrosatilde C) Macho adulto Barrosatilde Fotografias datadas de 1949 gentilmente cedidas pela Direcccedilatildeo Regional de Agricultura de Entre Douro e Minho - Centro de Produccedilatildeo Animal (DRAEDM)
12
Introduccedilatildeo
Poreacutem a necessidade de maiores produccedilotildees de carne foi conduzindo durante a
segunda metade deste seacuteculo a um progressivo decliacutenio no efectivo populacional da raccedila
Barrosatilde tornando-se mesmo raro poder observar uma junta de bois Recentemente as
alteraccedilotildees verificadas na poliacutetica agraacuteria e ambiental da Uniatildeo Europeia teratildeo permitido
alguma recuperaccedilatildeo Nesse contexto a criaccedilatildeo em 1981 do Livro Genealoacutegico da raccedila
Barrosatilde constitui um passo importante para a certificaccedilatildeo dos animais e o aumento do seu
valor Actualmente o seu efectivo populacional tem crescido continuamente e essa tendecircncia
parece estaacutevel
Segundo dados fornecidos pelo Registo Zooteacutecnico e pela Associaccedilatildeo do Minho dos
Criadores de Bovinos de Raccedila Barrosatilde (AMTOA) existiam em 1996 38002 fecircmeas
reprodutoras inscritas e 375 touros de cobriccedilatildeo (tabela 1221) distribuiacutedos por vaacuterios
concelhos dos distritos de Viana do Castelo Braga Vila Real e Porto (figura 122)
Tabela 1221 Movimento do Registo Zooteacutecnico relativo agrave raccedila Barrosatilde
Vacas Inscritas Postos de Cobriccedilatildeo Vitelos Anos Abatidas Registadas Inscritas Encerrados Recenseados Existecircncias Inscritos 1981 0 4884 4882 1 25 24 0 1982 19 6169 11032 6 42 60 532 1983 31 4436 15437 14 35 81 1593 1984 72 866 16231 13 14 82 2151 1985 47 604 16788 15 15 82 1767 1986 106 1027 17709 18 13 77 2414 1987 72 1186 18823 2 14 89 2632 1988 122 1192 19877 5 7 91 2574 1989 138 718 20506 14 26 103 2532 1990 89 1017 21440 8 7 102 2404 1991 159 1309 22590 14 26 114 2531 1992 52 1902 24440 6 17 125 3203 1993 0 4205 28645 37 87 175 4077 1994 0 6248 34893 58 111 228 4679 1995 340 2447 37000 0 112 340 5759 1996 120 1122 38002 26 61 375 5901
Fonte Registo Zooteacutecnico (cedido pela AM1BA)
Apesar desta situaccedilatildeo favoraacutevel natildeo se pode considerar que a raccedila Barrosatilde natildeo corra
ainda perigo de extinccedilatildeo Na verdade satildeo vaacuterios os factores que tecircm contribuiacutedo para a
diminuiccedilatildeo da sua aacuterea de criaccedilatildeo ou mesmo para a alteraccedilatildeo das caracteriacutesticas destes
animais De entre esses factores deve salientar-se i) a substituiccedilatildeo de Barrosatilde por outras raccedilas
autoacutectones (Minhota Mirandesa Maronesa) ou importadas (Friacutesia Gelbvieh e Parda Suiacuteccedila)
13
Introduccedilatildeo
que fornecem ao agricultor um rendimento superior ii) a progressiva mecanizaccedilatildeo da
agricultura e a diminuiccedilatildeo das aacutereas de pastagem iii) o pequeno nuacutemero de machos
reprodutores associado a um efectivo idoso iv) uma baixa fertilidade meacutedia grandes
intervalos entre partos e elevado nuacutemero de abortos e v) desmotivaccedilatildeo dos produtores mesmo
em face das actuais condiccedilotildees de comercializaccedilatildeo
LEGENDA
| j - -Concelhos de Entre Douro e Minho S Concelhos de Traacutes-os-Montes
ESCALA 11380000
Figura 122 Mapa de distribuiccedilatildeo do actual efectivo Barrosatilde
14
Introduccedilatildeo
Aspectos morfoloacutegicos
O bovino Barrosatilde apresenta uma estatura mediana com 121-130 cm de altura agrave
cernelha e pelagem de cor castanha (variando entre a cor de palha ateacute a cor acerejada) (LEAL
1995) A cabeccedila eacute curta e larga encimada por uma cornamenta em forma de lira alta os
cornos satildeo muito compridos e espessos de cor branca suja com pontas escuras o conjunto
ocular eacute saliente dando-lhe o aspecto de olhos de sapo as orelhas satildeo de tamanho meacutedio os
membros satildeo curtos e pouco ossudos e o pescoccedilo eacute curto bem ligado agrave cabeccedila e com garrote
largo (MARTINS 1982)
Eacute uma raccedila com caracteres sexuais secundaacuterios bem diferenciados Os touros satildeo
normalmente mais escuros particularmente no terccedilo anterior com maior corpulecircncia do que as
fecircmeas mais robustos com barbela mais desenvolvida cabeccedila mais curta e mais larga cornos
mais grossos e ligeiramente mais curtos (GARCIA et ai 1981 MARTINS 1982)
Esta raccedila apresenta duas particularidades morfoloacutegicas que a distinguem de todas as
outras raccedilas grande desenvolvimento coacuterneo e perfil cocircncavo da cabeccedila com acentuado
prognatismo mandibular O elevado crescimento coacuterneo poderaacute estar relacionado com a
selecccedilatildeo dos animais De facto nas populares chegas de touros o animal que sai vencedor seraacute
o touro cobridor das vacas da aldeia Este processo teraacute permitido a primazia de touros de
maior ossatura capital mais potente musculatura ceacutefalo-cervical maior forccedila no acircngulo taacutersico
e consequentemente grande desenvolvimento dos cornos (MIRANDA do VALE in GONCcedilALVES GARCIA 1964 ARAUacuteJO 1986) No que se refere ao acentuado prognatismo
mandibular eacute possiacutevel que em parte esteja relacionado com o grande desenvolvimento
coacuterneo Este teraacute exigido um desenvolvimento correlativo de certos ossos cranianos e o
atrofiamento dos ossos da face (GONCcedilALVES GARCIA 1964)
Origem
A origem da raccedila Barrosatilde e o seu enquadramento com as outras raccedilas da Peniacutensula
Ibeacuterica estaacute ainda por explicar constatando-se uma grande heterogeneidade na opiniatildeo de
diversos autores a este respeito (MARTINS 1982)
Alguns autores referem a existecircncia no Norte de Aacutefrica (vale do Nilo) de um gado
com caracteriacutesticas morfoloacutegicas semelhantes agrave actual raccedila Barrosatilde em especial no que se
refere agrave forma tamanho e espessura dos cornos Este gado eacute normalmente associado agrave
15
Introduccedilatildeo
designaccedilatildeo subespeciacutefica Bos primigenius opisthonomus (embora tambeacutem se refira como Bos
primigenius mauritaniens e como Bos taurus desertorum) e teraacute chegado agrave Peniacutensula Ibeacuterica
atraveacutes de vaacuterias rotas migratoacuterias dos povos norte-africanos A raccedila Barrosatilde poderia assim
ser incluiacuteda no tronco mauritaacutenico tendo como ancestral Bos primigenius mauritanicus
(GARCIA et ai 1981)
Neste contexto poderaacute admitir-se que o gado que corresponde a este grupo se tenha
instalado na Peniacutensula Ibeacuterica provavelmente durante a longa ocupaccedilatildeo Moura (GONCcedilALVES
GARCIA 1964) Posteriormente a raccedila Barrosatilde teraacute sido desalojada pelos troncos ibeacuterico e
aquitacircnico restando apenas um nuacutecleo populacional confinado agraves zonas planaacutelticas do
Barroso onde permaneceu ateacute hoje (GONCcedilALVES GARCIA 1964)
Esta hipoacutetese natildeo eacute contudo partilhada por outros autores que lhe criticam a escassa
evidecircncia (forma e tamanho dos cornos) e portanto uma clara ausecircncia de base cientiacutefica
(IGLESIAS 1989)
Perante o exposto pode verificar-se que a raccedila Barrosatilde apresenta aspectos
morfoloacutegicos e histoacuterico-evolutivos muito peculiares sendo ainda hoje difiacutecil proceder ao seu
enquadramento no seio das restantes raccedilas bovinas ibeacutericas O aprofundamento da investigaccedilatildeo
sobre a estrutura geneacutetica das suas populaccedilotildees poderaacute ser assim uma via para o
esclarecimento das muitas questotildees que permanecem por responder Nestas condiccedilotildees este
trabalho pretende ser uma contribuiccedilatildeo para o conhecimento da geneacutetica das populaccedilotildees da
raccedila bovina Barrosatilde atraveacutes da consecuccedilatildeo dos seguintes objectivos
1 estudo da variabilidade geneacutetica da raccedila Barrosatilde ao niacutevel das proteiacutenas eritrocitaacuterias
e plasmaacuteticas
2 desenvolvimento e afinaccedilatildeo de teacutecnicas de separaccedilatildeo de proteiacutenas por electroforese
e focagem isoeleacutectrica e sua detecccedilatildeo especiacutefica (histoquiacutemica e imunoloacutegica)
3 anaacutelise familiar dos polimorfismos encontrados
4 avaliaccedilatildeo do grau de diferenciaccedilatildeo geneacutetica existente entre a raccedila Barrosatilde e outras
raccedilas bovinas
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Material e Meacutetodos
2 - MATERIAL E MEacuteTODOS
21 - AMOSTRAGEM E CONSERVACcedilAtildeO DAS AMOSTRAS
211 - Amostragem
Foram recolhidas 356 amostras de sangue correspondente a 294 indiviacuteduos de raccedila
Barrosatilde (dos quais 141 estavam inscritos no Livro Genealoacutegico) e 62 indiviacuteduos de raccedila
Minhota As colheitas efectuaram-se em zonas de intensa criaccedilatildeo da Barrosatilde designadamente
nos concelhos de Arcos de Valdevez Cabeceiras de Basto Fafe Poacutevoa de Lanhoso e
Monccedilatildeo em finais de 1993 durante o ano de 1994 e ainda no periacuteodo de 1996 1997 em
Vieira do Minho
A recolha de sangue em indiviacuteduos de raccedila Minhota foi efectuada com a finalidade de
servir como termo de comparaccedilatildeo geneacutetica uma vez que se realizam cruzamentos entre esta
raccedila e a Barrosatilde
212 - Obtenccedilatildeo e conservaccedilatildeo das amostras de sangue
O sangue foi colhido da veia jugular em tubos contendo 01 ml de EDTA (aacutecido
etilnodiaminotetraceacutetico) dissoacutedico a 10 ou em tubos heparinados
As amostras de sangue foram centrifugadas (10 minutos a 13000 rpm) separando-se
em seguida o plasma dos eritroacutecitos Aos eritroacutecitos foi adicionado meio de glicerol (seis
partes de uma soluccedilatildeo 5 de citrato trissoacutedico 2H20 adicionados a quatro partes de glicerol)
numa proporccedilatildeo aproximada de 21 as amostras foram conservadas a -20degC
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Material e Meacutetodos
22 - BATERIA DE MARCADORES GENEacuteTICOS SELECCIONADOS
No presente trabalho foi escolhida uma bateria de 12 marcadores geneacuteticos dispersos
no genoma do bovino (figura 5) HB (Hemoglobina) CAII (Anidrase carboacutenica) PEPB
(Peptidase B) DIA (Diaforase) NP (Fosforilase nucleosiacutedica) MDH (Desidrogenase do
malato) PGD (Desidrogenase do aacutecido fosfoglucoacutenico) GPI (Isomerase da fosfoglucose)
MPI (Isomerase da manose-6-fosfato) ALB (Albumina) TF (Transferrina) e GC
(Componente especiacutefico de grupo)
CP SODl TF
PEPC IDH1
AMY1 AMY1A PGM1
4
LDHB PEPB
ADH2 PGM2 ALB GC SOD3
6
IADA
ALDH1
CAII
ME1 PGM3 SOD2
NP
10
CAT HBBq22-q27
PGD IALDH2 DIA4
HP GPIq22-q24
MPI iBF GLOl
LDHA MDH2
Figura 221 Localizaccedilatildeo de vaacuterios loci proteicos no genoma de Bos taurus Com um tom mais carregado indicam-se os marcadores estudados neste trabalho Adaptado de FRIES et ai (1993)
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Material e Meacutetodos
bull HB
A hemoglobina eacute responsaacutevel pelo transporte do oxigeacutenio dos pulmotildees para os tecidos
A sua estrutura eacute tetrameacuterica tendo cada uma das quatro subunidades um grupo prosteacutetico -
- heme - com um aacutetomo de ferro no centro A fracccedilatildeo principal da hemoglobina de mamiacuteferos
adultos eacute composta por duas cadeias a e duas cadeias P (BRAEND 1971 CECCHINI amp Nus
1986)
O locus da HB foi um dos primeiros a ser estudado apresentando polimorfismo em
vaacuterios mamiacuteferos (CECCHJM amp Nus 1986 BRAEND et ai 1988 CLARKE et ai 1989 WANG
et ai 1990 SELVARAJ et ai 1991) Em 1955 CABANNE amp SERAIN (in BRAEND 1988)
descrevem pela primeira vez o polimorfismo da HB em bovinos do Norte da Aacutefrica
Posteriormente muitos estudos foram efectuados descrevendo-se 13 variantes (raros na sua
maioria) com diferenccedilas apenas nas cadeias beta (CECCHINI amp Nus 1986 BRAEND 1988)
bull CAII-EC4211
A CAII eacute uma metaloenzima com grande distribuiccedilatildeo nos animais e nas plantas
(TASHIAN 1989) Catalisa de forma reversiacutevel a hidrataccedilatildeo do C02 em H2C03 (CECCHINI amp
Nus 1986 TASHIAN 1989) O seu papel fisioloacutegico ainda natildeo eacute bem conhecido mas eacute
possiacutevel que tenha participaccedilatildeo na manutenccedilatildeo do balanccedilo osmoacutetico (TASHIAN 1989)
A ocorrecircncia de variaccedilatildeo geneacutetica na CAII estaacute descrita em muitas espeacutecies de
mamiacuteferos tendo sido descritos dois loci polimoacuterficos (CAI e CAII) (TASHIAN amp CARTER
1976 CLARICE et ai 1989 SELVARAJ et ai 1991)
SARTORE et ai (1969) foram os primeiros a detectar polimorfismo electroforeacutetico da
anidrase carboacutenica em bovinos domeacutesticos e buacutefalos americanos Nos eritroacutecitos de bovinos
apenas se exprime a anidrase carboacutenica II que apresenta geralmente 2 alelos codominantes
autossoacutemicos (CAIPF e CAIPS) (SARTORE et ai 1969 TASHIAN amp CARTER 1976) Mais
tarde foram encontrados 3 novos alelos (C Z e X) (CECCHINI amp Nus 1986)
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Material e Meacutetodos
bull PEPB-EC3412
As peptidases formam um conjunto de enzimas capazes de hidrolisar di- e tripeacuteptidos
caracterizando-se pela sua especificidade em relaccedilatildeo a diversos substratos bem como atraveacutes
da sua distribuiccedilatildeo tecidular
A PEPB apresenta uma estrutura monomeacuterica tendo sido descrita como polimoacuterfica
em algumas raccedilas brasileiras de bovinos de origem europeia e indiana (DEL LAMA et ai
1992)
bull DIA-EC1643
A enzima monomeacuterica DIA (NADH - Methemoglobina redutase) tambeacutem conhecida
por citocromo bs redutase faz parte de um grupo de enzimas que catalisam a reduccedilatildeo da
methemoglobina (IGLESIAS 1989 VIEIRA 1993 kRAHhetal 1986)
O seu polimorfismo geneacutetico foi detectado em vaacuterias espeacutecies de Ungulados incluindo
os bovinos (CLARKE et ai 1989 IGLESIAS 1989 SELVARAJ et ai 1991 TATE amp McEWAN
1992)
bull NP-EC2421
A enzima NP encontra-se distribuiacuteda por vaacuterios tecidos e oacutergatildeos e catalisa
reversivelmente a fosforoacutelise dos nucleosiacutedeos puriacutenicos levando agrave formaccedilatildeo das respectivas
bases e ribose-1-fosfato (IGLESIAS 1989)
O polimorfismo geneacutetico desta enzima foi detectado em vaacuterias espeacutecies de mamiacuteferos
incluindo os bovinos (ANSAY 1973 HARRIS amp HOPKINSON 1978 TUKER amp YOUNG 1988
CLARKE eacutetal 1989 IGLESIAS 1989 FERRAND 1995)
20
Material e Meacutetodos
bull MDH-ECl 1137
A MDH eacute uma oxirredutase dimeacuterica na maioria dos mamiacuteferos responsaacutevel pela
oxidaccedilatildeo do L-malato em oxoglutarato com NAD como aceitador A reacccedilatildeo eacute reversiacutevel em
presenccedila de NADH e oxaloacetato A enzima diz-se NAD especiacutefica pelo facto da reacccedilatildeo soacute
ocorrer na presenccedila deste cofactor (MORAIS 1992 PEREIRA 1997)
A ocorrecircncia de variaccedilatildeo geneacutetica neste locus foi descrita para vaacuterios mamiacuteferos
(HARRIS amp HOPKINSON 1978 TUNOacuteN et ai 1989 SELVARAJ et ai 1991) Contudo
relativamente aos bovinos natildeo foi possiacutevel encontrar referecircncias quanto ao seu polimorfismo
bull PGD-EC11144
A PGD eacute uma enzima dimeacuterica envolvida na via das pentoses-fosfato catalisando a
conversatildeo de 6-fosfogluconato em ribose-5-fosfato
O polimorfismo geneacutetico do locus PGD estaacute descrito em diversas espeacutecies de
Ungulados (HERZOG 1988 PENEDO et ai 1988 BEKENEV amp ORLO VA 1991 KUROSAWA amp
TANAKA 1991 JANZEN amp COTHRAN 1991 FERNDALE et al 1992) Contudo relativamente
aos bovinos natildeo foi possiacutevel encontrar referecircncias quanto ao seu polimorfismo
bull GPI-EC5319
A isomerase da fosfoglucose cataliza a reacccedilatildeo reversiacutevel de conversatildeo de glucose-
-6-fosfato em frutose-6-fosfato (HARRIS amp HOPKINSON 1978 PRETSCHei ai 1990)
Eacute uma enzima dimeacuterica com polimorfismo geneacutetico em vaacuterias espeacutecies de mamiacuteferos
nomeadamente no catildeo (ARNOLD amp Bouw 1989) no porco (VAN DE WEGHE et ai 1988
BEKENEV amp ORLO VA 1991) na ovelha (RASERO et ai 1993) em lamas e alpacas (PENEDO et
ai 1988) e no Homem (HARRIS amp HOPKINSON 1978)
21
Material e Meacutetodos
bull MPI-EC5318
A MPI eacute uma enzima monomeacuterica de acccedilatildeo cataliacutetica que permite a isomerizaccedilatildeo de D-
-manose-6-fosfato em D-frutose-6-fosfato
Em diversas espeacutecies de mamiacuteferos nomeadamente no Homem (RlTTER et ai 1974)
em babuiacutenos (RITTER amp SCHMITT 1973) e ratos (NICHOLS et ai 1973 VANDEBERG amp
AIVALIOTIS 1990) esta enzima natildeo apresenta actividade em eritroacutecitos sendo poreacutem
detectada em diversos tecidos como rim fiacutegado e o muacutesculo Mais tarde demonstrou-se a
possibilidade de proceder a esta detecccedilatildeo em hemolisados de cavalos coelhos e lebres (HALL
et ai 1991 VIEIRA amp FERRAND 1995 SANTOS 1995)
O polimorfismo geneacutetico de MPI em bovinos foi descrito por ANSAY (1973)
apresentando trecircs alelos autossoacutemicos codominantes (MPPA MPIB e MPIC)
bull ALB
A albumina eacute a proteiacutena mais abundante no plasma dos mamiacuteferos e apresenta uma
estrutura monomeacuterica A sua funccedilatildeo estaacute relacionada com processos de transporte e de
regulaccedilatildeo do balanccedilo osmoacutetico (CECCHTNI amp Nus 1986 CARTER et al 1989)
O polimorfismo geneacutetico da albumina estaacute descrito em vaacuterias espeacutecies de Ungulados
(STORMONT et ai 1963 BOWLING amp CLARK 1988 PENEDO et ai 1988 ERHARDT 1991
SELVARAJeacutetfa 1991CRISTOFALOpounda 1992 ERHARDT amp SlMIANER 1993)
EFREMOV e ASHTON em 1965 (in CECCHTNI amp Nus 1986) descrevem pela primeira vez
polimorfismo geneacutetico em raccedilas bovinas inglesas Inicialmente encontraram-se dois alelos
(ALBA ou ALBF e ALBB ou ALBS) por electroforese aacutecida Mais tarde descreveram-
-se outros alelos em raccedilas britacircnicas (ALBH e ALBG) e em raccedilas africanas (ALBD
ALBE e ALBF) (CECCHINI amp Nus 1986) ABE et ai em 1971 descrevem o alelo ALBX
(in CECCHTNI amp Nus 1986)
22
Material e Meacutetodos
bull TF
A transferrina eacute uma 3-globulina seacuterica responsaacutevel pelo transporte do ferro Possui
uma estrutura monomeacuterica glicosilada (CECCHINI amp Nus 1986 WELCHS 1990 PENHALLOW
et ai 1991 CUNHA 1994)
O polimorfismo geneacutetico desta proteiacutena foi detectado em vaacuterias espeacutecies de Ungulados
(KRISTJANSSON 1963 STORMONT et ai 1963 ASHTON 1965 GAHNE et ai 1977 CECCHJNI
amp Nus 1986 ERHARD 1986 KUROSAWA amp TANAKA 1988 PENEDO et ai 1988 CLARKE et
ai 1989 HERZOG 1989 JUNEJA et ai 1989 TSUJI et ai 1989 SCHNEIDER et ai 1990
STRATIL et ai 1990 WANG et ai 1990 SELVARAJ et ai 1991 DRATCH et ai 1992
VANKAN amp BELL 1992a CIacuteZovket ai 1993 ERHARD et ai 1993)
ASHTON em 1965 descreveu pela primeira vez o polimorfismo geneacutetico de TF em
bovinos estando actualmente descritos sete alelos TFA TFB TFD1 TFD2 TFE
TFF e TFG (CECCHTNI amp Nus 1986) A subdivisatildeo do alelo TFD em TFD1 e TFD2 foi
descrita por KRISTJANSSON amp HICKMAN (1965)
Nos bovinos os loci TF e CP encontram-se ligados como tem sido descrito para vaacuterias
espeacutecies de mamiacuteferos (JUNEJA et ai 1989)
bull GC
A GC apresenta uma estrutura monomeacuterica e o seu polimorfismo geneacutetico estaacute descrito
em vaacuterias espeacutecies de Ungulados (GAHNE 1963 KRISTJANSSON 1963 JUNEJA et ai 1987
PENEDO et ai 1988 PENEDO amp JUNEJA 1989 KALAacuteB et ai 1990 ERHARDT 1991 VANKAN
amp BELL 1992b STERN et ai 1992 ERHARDT amp SIMIANER 1993 STRATIL et ai 1995)
Nos bovinos o polimorfismo geneacutetico da GC foi inicialmente descrito por GAHNE
(1963) e ASHTON (1963) in GAHNE et ai 1977) mas soacute mais tarde foi possiacutevel obter
frequecircncias geacutenicas para este locus (alelos GCA e GCB) em diferentes raccedilas europeias
(GAHNE et ai 1977) A utilizaccedilatildeo de novas teacutecnicas de separaccedilatildeo permitiu distinguir um
terceiro alelo GCC (VAN DE WEGHE 1982)
23
Material e Meacutetodos
A existecircncia de ligaccedilatildeo factorial entre os loci ALB e GC foi demostrada no Homem
em primeiro lugar e depois nos cavalos nos bovinos e na ovelha (VAN DE WEGHE 1982
ERHARDT amp SlMIANER 1993)
23 - TRATAMENTO DAS AMOSTRAS
bull HB
A separaccedilatildeo da moleacutecula HB por focagem isoeleacutectrica foi feita mediante a utilizaccedilatildeo de
hemolisados diluiacutedos 18 em aacutegua bidestilada
bull CAII
A separaccedilatildeo electroforeacutetica de CAII foi realizada em gel de amido e em focagem
isoeleacutectrica No primeiro caso as amostras foram simplesmente tratadas com tolueno
enquanto no segundo se procedeu ainda agrave sua reduccedilatildeo com uma soluccedilatildeo de ditiotreitol
(DTT) 120 mM (100 uacute de amostra natildeo diluiacuteda e 20 pi de DTT 120 mM) durante 1 h a 37degC
Quando se utilizou focagem isoeleacutectrica aleacutem do tratamento jaacute referido foi necessaacuterio
realizar uma diluiccedilatildeo final de 110 com aacutegua bidestilada
bull PEPB DIA NP MDH PGP GPI e MPI
As separaccedilotildees electroforeacuteticas de PEPB DIA NP MDH PGD GPI e MPI em gel de
amido foram efectuadas com hemolisados natildeo diluiacutedos submetidos ao mesmo tratamento
descrito para CAII quando separada por electroforese convencional
24
Material e Meacutetodos
bull ALB
Na separaccedilatildeo de ALB por focagem isoeleacutectrica utilizaram-se amostras de plasma
diluiacutedas com aacutegua bidestilada na proporccedilatildeo de 170
bull TF
Na separaccedilatildeo de TF efectuada por focagem isoeleacutectrica utilizaram-se amostras de
plasma submetidas a vaacuterios tipos de tratamento para comparaccedilatildeo dos padrotildees de bandas
obtidos
1 Remoccedilatildeo dos resiacuteduos de aacutecido siaacutelico da moleacutecula de TF
diluiccedilatildeo 13 com neuraminidase durante 1 h a 37 degC
2 Remoccedilatildeo do Fe da moleacutecula de TF
diluiccedilatildeo 13 com EDTA-dissoacutedico (20) 2 h antes da aplicaccedilatildeo para remoccedilatildeo dos
aacutetomos de Fe da moleacutecula de TF
3 Saturaccedilatildeo em Fe da moleacutecula de TF
31 - diluiccedilatildeo 13 com soluccedilatildeo de sulfato de amoacutenio feacuterrico 015 (pv) em aacutecido
ciacutetrico 60 mM seguida de incubaccedilatildeo agrave temperatura ambiente 18 h A utilizaccedilatildeo
de uma razatildeo ligante Fe de 201 permite uma raacutepida saturaccedilatildeo da moleacutecula de
TF (FERRAND 1995)
32 - diluiccedilatildeo 13 com soluccedilatildeo de sulfato de amoacutenio ferroso 015 (pv) em aacutecido
ciacutetrico 60 mM seguida de incubaccedilatildeo agrave temperatura ambiente 18 h
33 - diluiccedilatildeo 13 com soluccedilatildeo de citrato de amoacutenio feacuterrico 015 (pv) em aacutecido
ciacutetrico 60 mM seguida de incubaccedilatildeo agrave temperatura ambiente 18 h
34 - diluiccedilatildeo 13 com soluccedilatildeo de citrato feacuterrico 015 (pv) em aacutecido ciacutetrico
60 mM seguida de incubaccedilatildeo agrave temperatura ambiente 18 h
35 - diluiccedilatildeo 13 com soluccedilatildeo de cloreto de ferro 015 (pv) em aacutecido ciacutetrico
60 mM seguida de incubaccedilatildeo agrave temperatura ambiente 18 h
25
Material e Meacutetodos
Antes da inserccedilatildeo as amostras foram parcialmente purificadas atraveacutes da adiccedilatildeo de 5
volumes de uma soluccedilatildeo de rivanol 06 (pv) em tampatildeo Tris HC1 005 M (ajusta-se o pH
para valores de 91 com Tris 1 M) seguida de centrifugaccedilatildeo
bull GCcedil
A fim de proceder agrave remoccedilatildeo dos resiacuteduos de aacutecido siaacutelico existente nas cadeias de
hidratos de carbono ligadas agrave moleacutecula GC as amostras de plasma foram submetidas a uma
incubaccedilatildeo com uma soluccedilatildeo de neuraminidase Clostridium perfringens SIGMA type V 18
Uml) na proporccedilatildeo de 13 durante 18 h a 37degC acrescentando-se posteriormente aacutegua
bidestilada ateacute agrave obtenccedilatildeo de uma diluiccedilatildeo final de 14 Paralelamente procedeu-se a uma
diluiccedilatildeo das amostras com aacutegua bidestilada (19) para comparaccedilatildeo dos padrotildees de bandas
obtidos
24 - MEacuteTODOS DE SEPARACcedilAtildeO
Electroforese convencional
Nas teacutecnicas de electroforese convencional foram utilizados vaacuterios sistemas de tampatildeo
para os geacuteis e para as pontes conforme a proteiacutena em estudo
Focagem isoeleacutectrica
Os sistemas de focagem isoeleacutectrica utilizados na separaccedilatildeo de proteiacutenas foram
realizados em matrizes de poliacrilamida (T = 5 C = 3) com dimensotildees 230xl00x03mm
Os geacuteis foram aplicados sobre uma peliacutecula de suporte GELFIX (SERVA) permitindo o seu
manuseamento adequado
A adiccedilatildeo de soluccedilotildees de TEMED 10 (pv) e persulfato de amoacutenio (PSA) 10 (pv)
permitiu a polimerizaccedilatildeo do gel agrave temperatura ambiente (24 horas) ou a 37 degC durante 1 h
As separaccedilotildees por focagem isoeleacutectrica decorreram sobre placa de arrefecimento a
aproximadamente 10degC (8 - 12degC)
26
Material e Meacutetodos
HB
A separaccedilatildeo da moleacutecula de HB foi realizada por focagem isoeleacutectrica em gradiente de
pH livre segundo a teacutecnica descrita por FERRAND (1995) com algumas modificaccedilotildees
A composiccedilatildeo da soluccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo e os paracircmetros eleacutectricos utilizados estatildeo
indicados nas tabelas 241 e 242 respectivamente
Tabela 241 Soluccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo utilizada para a separaccedilatildeo da moleacutecula nativa de HB por focagem isoeleacutectrica
Componentes da soluccedilatildeo Quantidades
Acrilamida 28 (pv)
Bisacrilamida 2 (pv)
Sacarose
Anfoacutelitos 5-8 (SIGMA)
7-9 (PHARMACIA)
Aacutegua bidestilada TEMED 10 (vv)
PSA 10 (pv)
18 ml
08 ml
2 g
300 p1
300 ul
ateacute 10 ml volume final
10 ul
70 ul
Tabela 242 Paracircmetros eleacutectricos utilizados na focagem isoeleacutectrica de HB
Voltagem (V) Corrente (mA) Potecircncia (W) Tempo (T)
Preacute focagem 1500 25 1
2
3
30 min
15 min
15 min
Focagem 1500 25 15 2h 30 min
As soluccedilotildees para os eleacutectrodos foram aacutecido aspaacutertico 004 M (acircnodo) e NaOH 01 M
(caacutetodo) As amostras foram aplicadas a 15 cm do caacutetodo tendo sido inseridas com o auxiacutelio
de um aplicador de borracha silicone (SERVA)
27
Material e Meacutetodos
bull CAII
A separaccedilatildeo de CAII fez-se em gel de amido (15 pv SIGMA) conforme o descrito
por AMORIM (1983) com algumas modificaccedilotildees e ainda por focagem isoeleacutectrica em
gradiente de pH livre
Utilizam-se os seguintes sistemas tampatildeo para a separaccedilatildeo por electroforese em gel de
amido
Tampatildeo das Pontes Tris 0250 M pH = 76 Aacutecido ciacutetrico 0067 M
Tampatildeo do Gel Diluiccedilatildeo 110 do tampatildeo das pH = 76 pontes
As amostras foram inseridas em meio Sephadex G-200 (PHARMACIA) na proporccedilatildeo
de 11 As electroforeses foram realizadas em placa de arrefecimento (8degC) e com um
gradiente de potencial de 5 Vcm durante 16 h
A teacutecnica utilizada para a separaccedilatildeo de CAII por focagem isoeleacutectrica foi a descrita por
BOWLING et ai (1990) com algumas modificaccedilotildees A composiccedilatildeo da soluccedilatildeo de
polimerizaccedilatildeo e os paracircmetros eleacutectricos utilizados estatildeo indicados nas tabelas 243 e 244
respectivamente
As soluccedilotildees para os eleacutectrodos foram aacutecido aspaacutertico 004 M (acircnodo) e NaOH 01 M
(caacutetodo) As amostras foram inseridas com o auxiacutelio de um aplicador de borracha silicone
(SERVA) colocado a 15 cm do caacutetodo
28
Material e Meacutetodos
Tabela 243 Soluccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo utilizada na separaccedilatildeo de CAII por focagem isoeleacutectrica
Componentes da soluccedilatildeo
Acrilamida 28 (pv)
Bisacrilamida 2 (pv)
Sacarose
Anfoacutelitos 4-65 (PHARMACIA)
Anfoacutelitos 35-10 (PHARMACIA)
Aacutegua bidestilada TEMED 10 (vv)
PSA 10 (pv)
Quantidades 18 ml
08 ml
2 g
500 |ol
100 ul
ateacute 10 ml volume final
10 ul
70 ul
Tabela 244 Paracircmetros eleacutectricos utilizados na separaccedilatildeo de CAII por focagem isoeleacutectrica
Voltagem (V) Corrente (mA) Potecircncia (W) Tempo (T)
Preacute focagem 1500 25 1
3
5
30 min
15 min
15 min
Focagem 2500 25 8
10
12
30 min
30 min
30 min
bull PEPB
A separaccedilatildeo da PEPB foi realizada em gel de amido (15 pv SIGMA) de acordo
com a teacutecnica descrita por POVEY et ai (1972) com algumas modificaccedilotildees
29
Material e Meacutetodos
Utilizou-se o seguinte sistema tampatildeo
Tampatildeo das Pontes Tris 01 M
pH = 74 NaH2P04 01 M
Tampatildeo do Gel Diluiccedilatildeo 110 do tampatildeo das
pH = 74 pontes
As amostras satildeo inseridas em meio Sephadex G-200 (PHARMACIA) na proporccedilatildeo de
11 As electroforeses foram realizadas em placas de arrefecimento (8degC) e com um gradiente
de potencial de 5 Vcm durante 16 h
bull DIA
No caso da separaccedilatildeo de DIA a teacutecnica eacute idecircntica agrave utilizada para CAII electroforese
em gel de amido (15 pv SIGMA) conforme o descrito por AMORIM (1983) com algumas
modificaccedilotildees
bull NP MDH PGD GPJ e MPI
As separaccedilotildees das enzimas NP MDH PGD GPI e MPI fizeram-se em simultacircneo por
electroforese em gel de amido (15 pv SIGMA) conforme o descrito por AMORIM et ai
(1982) com algumas modificaccedilotildees
Utilizou-se o seguinte sistema tampatildeo
1130 M
0400 M
0020 M 0010 M
Tampatildeo das Pontes NaOH
pH = 60 Aacutecido ciacutetrico
Tampatildeo do Gel HisHCl
pH = 60 NaOH
30
Material e Meacutetodos
As amostras foram inseridas em meio Sephadex G-200 (PHARMACIA) na proporccedilatildeo
de 11 As electroforeses foram realizadas em placas de arrefecimento (8degC) e com um
gradiente de potencial de 8 Vcm durante 15 h
ALB
Nas tabelas 245 e 246 indicam-se respectivamente a composiccedilatildeo da soluccedilatildeo de
polimerizaccedilatildeo para a separaccedilatildeo de ALB por focagem isoeleacutectrica segundo a teacutecnica descrita
por ROCHA et ai (1991) com algumas modificaccedilotildees e os paracircmetros eleacutectricos
Tabela 245 Soluccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo utilizada para a separaccedilatildeo de ALB por focagem isoeleacutectrica
Componentes da soluccedilatildeo Quantidades
Acrilamida 28 (pv)
Bisacrilamida 2 (pv)
Ureia
Anfoacutelitos 5-6 (PHARMACIA)
Anfoacutelitos 5-8 (PHARMACIA)
Anfoacutelitos 6-8 (PHARMACIA)
Aacutegua bidestilada TEMED 10 (vv)
PSA 10 (pv)
18 ml
08 ml
48 g
250 ni
250 ni
125 ul
ateacute 10 ml volume final
30 ul
70 ul
Tabela 246 Paracircmetros eleacutectricos utilizados na separaccedilatildeo de ALB por focagem isoeleacutectrica
Voltagem (V) Corrente (mA) Potecircncia (W) Tempo (T)
Preacute focagem 1500 25
Focagem 1500 25
1 30 min
2 15 min
3 15 min
4 3 h
5 30 min
31
Material e Meacutetodos
As soluccedilotildees para os eleacutectrodos foram aacutecido aspaacutertico 004 M (acircnodo) e NaOH 1 M
(caacutetodo) As amostras foram aplicadas a 15 cm do caacutetodo com o auxiacutelio de um aplicador de
borracha silicone (SERVA)
TF
A separaccedilatildeo da moleacutecula de TF foi efectuada por focagem isoeleacutectrica A composiccedilatildeo
da soluccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo e os paracircmetros eleacutectricos utilizados estatildeo indicados nas tabelas
247 e 248 respectivamente
Tabela 247 Soluccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo utilizada para a separaccedilatildeo da TF por focagem isoeleacutectrica
Componentes da soluccedilatildeo Quantidades
Acrilamida 28 (pv)
Bisacrilamida 2 (pv)
Sacarose
Anfoacutelitos 35-5(LKB)
Anfoacutelitos 4-65 (PHARMACIA)
Aacutegua bidestilada
TEMED 10 (vv) PSA 10 (pv)
18 ml
08 ml
2 g
100 ul
500 ul
ateacute 10 ml volume final
30 ul
70 ul
Tabela 248 Paracircmetros eleacutectricos utilizados na separaccedilatildeo de TF por focagem isoeleacutectrica
Voltagem (V) Corrente (mA) Potecircncia (W) Tempo (T)
Preacute focagem 1500 25
Focagem 2500 25
l 20 min
2 10 min
3 10 min
8 30 min
10 30 min
12 30 min
32
Material e Meacutetodos
As soluccedilotildees para os eleacutectrodos foram de aacutecido aspaacutertico 004 M (acircnodo) e de NaOH
1 M (caacutetodo) As amostras foram aplicadas a 15 cm do caacutetodo com o auxiacutelio de um aplicador
de borracha silicone (SERVA)
GC
Nas tabelas 249 e 2410 apresenta-se respectivamente a composiccedilatildeo da soluccedilatildeo de
polimerizaccedilatildeo e os paracircmetros eleacutectricos utilizados na focagem isoeleacutectrica de GC
Tabela 249 Soluccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo utilizada para a separaccedilatildeo da GC por focagem isoeleacutectrica
Componentes da soluccedilatildeo Quantidades
Acrilamida 28 (pv)
Bisacrilamida 2 (pv)
Sacarose
Anfoacutelitos 45-54 (PHARMACIA)
Anfoacutelitos 4-6 (LKB)
Aacutegua bidestilada TEMED 10 (vv)
PSA 10 (pv)
18 ml
08 ml
2 g
437 ul
188 (il
eacute 10 ml volume final
10 ul
70 ul
Tabela 2410 Paracircmetros eleacutectricos utilizados na separaccedilatildeo de GC por focagem isoeleacutectrica
Voltagem (V) Corrente (mA) Potecircncia (W) Tempo (T)
Preacute focagem 1500 25
Focagem 1500 25
1 30 min
2 15 min
3 15 min
4 3 h
5 30 min
33
Material e Meacutetodos
Para os eleacutectrodos foram utilizadas soluccedilotildees de aacutecido aspaacutertico 004 M (acircnodo) e de
NaOH 02 M (caacutetodo) As amostras foram inseridas com o auxiacutelio de um aplicador de
borracha silicone (SERVA) colocado a 15 cm do caacutetodo
25 - MEacuteTODOS DE DETECCcedilAtildeO
Apoacutes a separaccedilatildeo das proteiacutenas os padrotildees electroforeacuteticos foram geralmente obtidos
por detecccedilatildeo especiacutefica aproveitando a actividade cataliacutetica das enzimas Noutros casos a
revelaccedilatildeo foi feita por coloraccedilatildeo geral de proteiacutenas
bull HB
A visualizaccedilatildeo da HB foi obtida mediante coloraccedilatildeo geral de proteiacutenas segundo o
seguinte procedimento
Fixaccedilatildeo
Imersatildeo do gel numa soluccedilatildeo de aacutecido tricloroaceacutetico 125 (pv) durante 10 minutos
Coloraccedilatildeo geral de proteiacutenas
Coloraccedilatildeo com uma soluccedilatildeo de Coomassie R-250 0115 (pv) numa mistura de aacutecido
aceacuteticoetanolaacutegua destilada (42571) apoacutes aquecimento seguida de filtraccedilatildeo durante
5-10 minutos A descoloraccedilatildeo eacute feita com aacutecido aceacutetico etanol e aacutegua destilada
aquecida a cerca de 60degC ateacute se obter o contraste desejado
bull CAII
Apoacutes separaccedilatildeo por electroforese em gel de amido visualizou-se a CAII pela sua
actividade esteraacutesica adicionando-se diacetato de fluoresceiacutena (em quantidades vestigiais que
34
Material e Meacutetodos
foram previamente dissolvidas em 200 uacute de acetona) a uma soluccedilatildeo de incubaccedilatildeo tamponada
(pH = 66) Esta soluccedilatildeo de incubaccedilatildeo eacute composta por aacutecido ciacutetrico 27 mM e Na2HP04
116 mM e foi aplicada sobre o gel de amido com o auxiacutelio de papeacuteis de filtro Whatman ndegl
Em seguida incubou-se durante 30 minutos a 37degC A observaccedilatildeo das bandas de CAII (devido
agrave sua capacidade esteraacutesica) eacute feita sob luz ultravioleta
Apoacutes separaccedilatildeo por focagem isoeleacutectrica utilizou-se uma coloraccedilatildeo geral de proteiacutenas
para visualizaccedilatildeo da CAII segundo o meacutetodo descrito para a HB sem fixaccedilatildeo
bull PEPB
A detecccedilatildeo da PEPB apoacutes a separaccedilatildeo electroforeacutetica foi feita atraveacutes da aplicaccedilatildeo
sobre o gel de amido de papeacuteis de filtro Whatman ndegl embebidos numa soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo
seguindo-se uma incubaccedilatildeo de 30 minutos a 37degC
A soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo conteacutem o substrato da PEPB L-leucilglicil-glicina 0004 M
veneno de cobra da espeacutecie Agkistrodon piscivorus piscivorus 04 (pv) MTT 24 mM e
metosulfato de fenazina (PMS) 03 mM num tampatildeo de pH = 80 (Tris HC1005 M)
bull DIA
Apoacutes a separaccedilatildeo por electroforese em gel de amido a identificaccedilatildeo da DIA foi obtida
pela adiccedilatildeo de uma soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo a uma fatia do gel A incubaccedilatildeo decorreu durante 2
horas a 37degC
A soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo foi realizada em duas fases
Io - colocou-se 26-diclorofenol-indofenol (DCIP) 01 mM com um tampatildeo de
pH = 85 (Tris HC1 005M) adicionando-se agrave mistura aacutegua bidestilada ateacute perfazer
50 ml Em seguida filtrou-se a soluccedilatildeo
2o - agrave soluccedilatildeo filtrada adicionou-se MTT 03 mM e NADH 02 mM e agitou-se antes
de verter sobre a fatia de gel de amido
35
Material e Meacutetodos
bull NP
A detecccedilatildeo da enzima NP apoacutes a separaccedilatildeo por electroforese foi feita atraveacutes da
aplicaccedilatildeo sobre o gel de amido de papeacuteis de filtro Whatman ndegl embebidos com a soluccedilatildeo de
coloraccedilatildeo Em seguida incubou-se durante 15 minutos a 37degC
A soluccedilatildeo de incubaccedilatildeo conteacutem inosina 37 mM MTT 24 mM XOD 0004 Uml uma
gota de azul de Meldola (SIGMA) (10 vv em aacutegua bidestilada) e uma soluccedilatildeo de tampatildeo
de incubaccedilatildeo pH = 75 constituiacuteda por KH2P04 005 M e NaOH 004 M
bull MDH
Na detecccedilatildeo da actividade enzimaacutetica de MDH foi utilizado o meacutetodo de sandwich
apoacutes a sua separaccedilatildeo electroforeacutetica em gel de amido Em seguida incubou-se durante 15
minutos a 37degC O meacutetodo de sandwich consiste na aplicaccedilatildeo de uma fatia de gel de amido
entre duas folhas de papel de filtro Whatman ndegl embebido com a soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo
A soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo utilizada na detecccedilatildeo da MDH conteacutem NAD 1 mM MTT
2 mM e piruvato de soacutedio (quantidades vestigiais) Esta soluccedilatildeo foi feita com um tampatildeo de
incubaccedilatildeo pH = 74 constituiacutedo por aacutecido maacutelico 0222 M Tris 050 M e MgCl2 002 M
bull PGP
A detecccedilatildeo da actividade enzimaacutetica de PGD foi feita pelo meacutetodo de sandwich apoacutes a
sua separaccedilatildeo electroforeacutetica em gel de amido
A soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo conteacutem quantidades vestigiais de aacutecido 6-fosfoglucoacutenico
NADP MTT e uma gota de azul de Meldola (05 pv em aacutegua bidestilada) dissolvidos num
tampatildeo de pH = 74 constituiacutedo por Tris 01 M HisHCl 01 M Imidazol 0015 M e MgCl2
0005 M
36
Material e Meacutetodos
bull GPI
A detecccedilatildeo da actividade enzimaacutetica de GPI foi feita pelo meacutetodo de sandwich apoacutes a
sua separaccedilatildeo electroforeacutetica em gel de amido
A soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo conteacutem frutose-6-fosfato 55 mM NADP 22 mM MTT
4 mM desidrogenase da glucose-6-fosfato (G6PD) 14 Uml e uma gota de azul de Meldola
(05 pv em aacutegua bidestilada) dissolvidos num tampatildeo de pH = 74 constituiacutedo por Tris 01
M HisHCl 01 M Imidazol 0015 M e MgCl2 0005 M
bull MPI
Detectou-se a actividade enzimaacutetica de MPI pelo meacutetodo de sandwich apoacutes a sua
separaccedilatildeo electroforeacutetica em gel de amido
A soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo conteacutem manose-6-fosfato 42 mM NADP 13 mM MTT
24 mM e uma gota de azul de Meldola (05 pv em aacutegua bidestilada) dissolvidos num
tampatildeo de pH = 74 constituiacutedo por Tris 01 M HisHCl 01 M Imidazol 0015 M e MgCl2
0005 M Por fim adicionaram-se as enzimas isomerase da glucose-6-fosfato (GPI) 3 Uml e
desidrogenase da glucose-6-fosfato (G6PD) 5 Uml
bull ALBeTF
A detecccedilatildeo de ALB e de TF foi efectuada atraveacutes do meacutetodo de coloraccedilatildeo geral de
proteiacutenas descrito para a HB utilizando-se Coomasie R-250 sem fixaccedilatildeo
bull GCcedil
A visualizaccedilatildeo de GC efectuou-se por detecccedilatildeo imunoenzimaacutetica apoacutes transferecircncia da
proteiacutena para uma membrana de nitrocelulose (045 pm SCHLEICHER amp SCHULL)
segundo a teacutecnica descrita por FERRAND (1995)
37
Material e Meacutetodos
Apoacutes esse processo de transferecircncia as membranas de nitrocelulose foram lavadas 3
vezes (15 minutos) numa soluccedilatildeo de Tween 20 (MERCK) 0025 (vv) em soro fisioloacutegico
tamponado com fosfato (PBS Na2HP04 50 mM KH2P04 18mM NaCl 147 mM pH = 71) e
bloqueadas numa soluccedilatildeo de leite em poacute magro (5 pv em PBS) durante 18 h com agitaccedilatildeo
permanente e agrave temperatura ambiente
Depois da primeira lavagem aplicou-se o antisoro (anti-GC humana ATAB 81936)
diluiacutedo 1170 em PBS com 1 (pv) de albumina seacuterica bovina (SIGMA) durante 1 h agrave
temperatura ambiente
Repetiu-se novamente a lavagem segundo o processo jaacute referido seguindo-se a
aplicaccedilatildeo do segundo antisoro (anticorpos contra imunoglobulinas caprinas desenvolvidos em
coelho e conjugados com uma peroxidase ATAB 83806) diluiacutedo 1600 em PBS com 1
(pv) de albumina seacuterica bovina (SIGMA) durante 1 h agrave temperatura ambiente
Depois de duas lavagens (5 minutos) com Tween 20PBS procedeu-se agrave detecccedilatildeo da
GC com uma soluccedilatildeo de 9-amino-2-etilcarbazol 004 (pv) e de metanol 20 (vv) em PBS
As bandas correspondentes agrave actividade peroxidaacutesica aparecem rapidamente bloqueando-se a
reacccedilatildeo com aacutegua bidestilada
26 - MEacuteTODOS DE CAacuteLCULO
As frequecircncias geacutenicas foram calculadas por contagem directa de genes a partir da
distribuiccedilatildeo fenotiacutepica obtida
O caacutelculo dos valores de heterozigotia meacutedia (H) da proporccedilatildeo de loci polimoacuterficos
(P) do nuacutemero meacutedio de alelos por locus (ria) estatiacutesticas F e frequecircncias fenotiacutepicas
esperadas segundo o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg foi efectuado com a utilizaccedilatildeo do
programa BIOSYS versatildeo 17 (SWOFFORD amp SELANDER 1989)
O caacutelculo de distacircncias geneacuteticas e obtenccedilatildeo de dendrogramas foi efectuado com o
programa PHYLIP versatildeo 35 (FELSENTEIN 1993)
38
Resultados e Discussatildeo
3 - RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
31 - ANAacuteLISE DOS MEacuteTODOS DE SEPARACcedilAtildeO
De entre os 12 loci estudados neste trabalho detectaram-se 5 monomoacuterficos
(PEPB DIA GPI MDH e PGD) e 7 polimoacuterficos (HB CAII NP MPI ALB TF e GC)
Loci monomoacuterficos
bull PEPB
A utilizaccedilatildeo de teacutecnicas de electroforese em gel de amido permitiu a detecccedilatildeo de
um soacute fenoacutetipo (figura 311) correspondente a indiviacuteduos homozigoacuteticos para o alelo
PEPB2 descrito por DEL LAMA et ai (1992) No entanto na raccedila Minhota detectou-se
um indiviacuteduo heterozigoacutetico
O fenoacutetipo PEPB 2 apresenta um padratildeo com duas bandas uma de grande
intensidade e outra secundaacuteria mais anoacutedica de menor intensidade No indiviacuteduo
heterozigoacutetico 2-1 (natildeo representado) observou-se um padratildeo de trecircs bandas sendo a
terceira mais anoacutedica e menos intensa
A quase inexistecircncia de PEPB1 nas raccedilas estudadas estaacute de acordo com o referido
em DEL LAMA et ai (1992) que sugere a fixaccedilatildeo de PEPB2 na maior parte das
populaccedilotildees de bovinos de origem europeia (com excepccedilatildeo das raccedilas italianas Marchigiana
e Chianina)
39
Resultados e Discussatildeo
+
Figura 311 Fenoacutetipos de PEPB observados por electroforese convencional em gel de amido
bull DIA
Os resultados obtidos para a enzima DIA revelaram ausecircncia de polimorfismo
electroforeacutetico (figura 312) Resultados semelhantes foram tambeacutem obtidos em vaacuterias
raccedilas autoacutectones espanholas (GONZALEZ et ai 1987 IGLESIAS 1989 ARRANZ et ai
1992)
MAKAVEEV (1979 in IGLESIAS 1989) detectou polimorfismo desta enzima em
eritroacutecitos de buacutefalos da Bulgaacuteria e nas raccedilas bovinas Frisia e Simmental descrevendo dois
alelos codominantes DIAA e DIAB
Figura 312 Padratildeo de DIA observado por electroforese convencional em gel de amido
40
Resultados e Discussatildeo
Natildeo se detectou variaccedilatildeo electroforeacutetica para o locus GPI Estes resultados natildeo se
podem comparar com os obtidos noutras raccedilas por natildeo ter sido possiacutevel consultar outros
trabalhos onde se descrevesse variaccedilatildeo do locus GPI em gado bovino
A figura 313 apresenta o padratildeo obtido para esta enzima observando-se trecircs
bandas duas com grande intensidade e uma banda mais anoacutedica de menor intensidade
Figura 313 Padratildeo de GPI obtido em hemolisados por electroforese convencional em gel de amido
bull MDH
A enzima MDH revelou-se monomoacuterfiacuteca Este resultado eacute concordante com outros
estudos (ARRANZ et ai 1992)
Na figura 314 observa-se o padratildeo de bandas detectado por electroforese
convencional em gel de amido
Figura 314 Padratildeo de MDH observado por electroforese convencional em gel de amido
41
Resultados e Discussatildeo
bull PGD
A enzima PGD revelou-se monomoacuterfica para as raccedilas Barrosatilde e Minhota tambeacutem
neste caso natildeo se encontrou qualquer referecircncia bibliograacutefica relativa a um possiacutevel
polimorfismo deste locus em gado bovino
Na figura 315 observa-se o padratildeo obtido para esta enzima Em amostras
armazenadas por um longo periacuteodo de tempo detectaram-se duas bandas sendo a mais
anoacutedica a que revela menor intensidade as amostras mais recentes apresentam um padratildeo
electroforeacutetico com uma soacute banda
Figura 315 Padratildeo de PGD observado por electroforese convencional em gel de amido
Loci polimoacuterficos
bull HB
A electroforese convencional natildeo permite discriminar os electromorfos de HB No
entanto a utilizaccedilatildeo de sistemas de focagem isoeleacutectrica conduz agrave detecccedilatildeo de
polimorfismo nesta proteiacutena observando-se dois fenoacutetipos HB A e HB AB
Na figura 316 observa-se o padratildeo electroforeacutetico desta moleacutecula resultante da
expressatildeo de dois alelos codominantes HBA e HBB Resultados idecircnticos estatildeo
descritos em raccedilas bovinas da Peniacutensulas Ibeacuterica (VICENTE 1978 KiDD et ai 1980
IGLESIAS 1989)
42
Resultados e Discussatildeo
+ -HBB
HBA
AB AB A A
Figura 316 Separaccedilatildeo de hemoglobina nativa por focagem isoeleacutectrica
bull poundAH
A utilizaccedilatildeo de electroforese em gel de amido e focagem isoeleacutectrica permitiu
identificar trecircs fenoacutetipos CAII F CAII FS e CAII S atribuiacutedos agrave expressatildeo de dois alelos
codominantes CAF e CAS (figuras 317 e 318) Poreacutem a separaccedilatildeo por electroforese em
gel de amido implica alguma morosidade (tempos de corrida muito longos) e em amostras
coaguladas o erro de leitura pode ser superior a 20 Estas dificuldades satildeo minimizadas
quando se recorre a focagem isoeleacutectrica
Assim a separaccedilatildeo da enzima CAII por focagem isoeleacutectrica oferece vaacuterias vantagens
nomeadamente
bull rapidez e simplicidade de execuccedilatildeo
bull utilizaccedilatildeo de pequenas quantidades de material bioloacutegico
bull maior nuacutemero de amostras fenotipadas por corrida
bull possibilidade de utilizaccedilatildeo de amostras coaguladas
43
Resultados e Discussatildeo
F F F S FS FS F S FS
Figura 317 Fenoacutetipos de CAII observados sob luz ultravioleta apoacutes separaccedilatildeo por electroforese convencional em gel de amido e coloraccedilatildeo com diacetato de fluoresceina
CAIIF
| CAIIS
Figura 318 Fenoacutetipos de CAII observados por focagem isoeleacutectrica apoacutes coloraccedilatildeo geral de proteiacutenas
bull NP
A expressatildeo fenotiacutepica de NP resulta das combinaccedilotildees possiacuteveis entre um alelo
dominante NPH e um recessivo NPL (ANSAY 1973) Este facto implica que apenas em
presenccedila do feno tipo NP L eacute possiacutevel fazer corresponder um genoacutetipo (jaacute que o fenoacutetipo NP H
pode corresponder aos genoacutetipos HH e HL e o fenoacutetipo NP L corresponde ao genoacutetipo LL)
Na figura 319 apresenta-se o padratildeo obtido para a proteiacutena apoacutes separaccedilatildeo
electroforeacutetica em gel de amido
44
+
w
FS FS ]
Resultados e Discussatildeo
H L L H L L
Figura 319 Fenoacutetipos de NP detectados por electroforese convencional em gel de amido
bull MPI
Na raccedila Minhota detectaram-se quatro fenoacutetipos MPI AB MPI B MPI BC e MPI C
anteriormente descritos por ANSAY (1973) em bovinos na raccedila Barrosatilde apenas se observam
os trecircs uacuteltimos fenoacutetipos De acordo com o mesmo autor os fenoacutetipos encontrados nesta raccedila
resultam da combinaccedilatildeo de dois alelos codominantes MPIB e MPPC enquanto que MPIA
aparece na raccedila Minhota com uma frequecircncia reduzida
Como se pode observar pela anaacutelise da figura 3110 MPIA aparece como o alelo
mais anoacutedico MPIC como o mais catoacutedico e o alelo mais frequente MPIB situa-se numa
posiccedilatildeo intermeacutedia em relaccedilatildeo aos anteriores Contudo a intensidade das bandas eacute muito
fraca tornando-se quase imperceptiacutevel em alguns casos Esta grande dificuldade em obter um
contraste de bandas adequado mesmo apoacutes longos periacuteodos de incubaccedilatildeo a 37degC poderaacute
eventualmente levar a uma incorrecta interpretaccedilatildeo dos fenoacutetipos Assim a utilizaccedilatildeo de
sistemas de focagem isoeleacutectrica na determinaccedilatildeo destes fenoacutetipos seria aconselhaacutevel a fim
de verificar os resultados obtidos por electroforese convencional
45
Resultados e Discussatildeo
Figura 3110 Fenoacutetipos de MPI observados por electroforese convencional em gel de amido
bull ALB
A separaccedilatildeo por focagem isoeleacutectrica permitiu detectar polimorfismo em ALB Cada
indiviacuteduo homozigoacutetico aparece com trecircs bandas duas de maior intensidade e uma mais
aciacutedica com menor intensidade os indiviacuteduos heterozigoacuteticos podem apresentar ateacute seis
bandas
Esta heterogeneidade nos padrotildees de ALB tem sido interpretada como o resultado da
capacidade desta proteiacutena se ligar a vaacuterias substacircncias diferentes (FERRAND 1995) Com a
inclusatildeo de ureia (8M) na matriz de separaccedilatildeo reagente que provoca a desnaturaccedilatildeo da
proteiacutena levando a uma alteraccedilatildeo do seu pi para uma zona mais baacutesica do gradiente
conseguem-se obter padrotildees de bandas mais simples e mais definidos (KAWAGUCHI 1973
FERRAND 1995)
Na figura 3111 apresentam-se os padrotildees observados que foram interpretados como
sendo determinados por trecircs alelos codominantes ALBA ALBB e ALBV
GAHNE et ai (1977) e IGLESIAS (1989) detectaram por electroforese em gel de
poliacrilamida e de amido respectivamente dois variantes em gado bovino ALBA e
ALBB A utilizaccedilatildeo de focagem isoeleacutectrica veio confirmar a existecircncia destes dois alelos e
acrescentar um terceiro designado por ALBV com uma mobilidade mais aciacutedico do que
ALBA
46
Resultados e Discussatildeo
A B A B A B B B A B A G
Figura 3111 Fenoacutetipos de ALB determinados em amostras de plasma por focagem isoeleacutectrica na presenccedila de ureia 8M
ARRANZ et ai (1992) revelaram a existecircncia de um outro variante (ALBD) com
mobilidade electroforeacutetica intermeacutedia entre ALBA e ALBB ainda natildeo descrito em
nenhuma raccedila autoacutectone espanhola Este alelo poderaacute corresponder ao alelo ALBV
encontrado neste trabalho apesar de apresentar um pi mais aacutecidico do que ALBA (ARRANZ
comunicaccedilatildeo pessoal)
Desta forma a teacutecnica de separaccedilatildeo por focagem isoeleacutectrica provou ser eficaz na
separaccedilatildeo dos variantes de ALB tal como jaacute foi demonstrado no gato (BELL et ai 1994) na
ovelha (ERHARDT amp SIMIANER 1993) e no coelho (FERRAND amp ROCHA 1992)
bull TF
A transferrina eacute um dos marcadores mais importantes no estudo e caracterizaccedilatildeo
geneacutetica de raccedilas bovinas devido ao seu elevado polimorfismo No entanto a sua fenotipagem
natildeo eacute simples existindo frequentemente problemas de resoluccedilatildeo e de separaccedilatildeo das bandas
(IGLESIAS 1989)
A fim de averiguar qual a melhor forma de separar os diferentes produtos geacutenicos
descritos no locus TF testaram-se vaacuterios sistemas electroforeacuteticos em geacuteis de agarose numa
vasta gama de sistemas tampatildeo Esta teacutecnica natildeo ofereceu resultados satisfatoacuterios pelo que se
passou agrave separaccedilatildeo da TF por focagem isoeleacutectrica recorrendo a matrizes de poliacrilamida
47
Resultados e Discussatildeo
com diferentes concentraccedilotildees de ureia (6M e 8M) tambeacutem neste caso natildeo se conseguiram
resultados positivos
Este tipo de dificuldades encontradas na fenotipagem da TF por focagem isoeleacutectrica
tinham jaacute sido descritos noutras espeacutecies nomeadamente na cabra (ERHARDT 1986) e no
coelho (FERRAND 1995) No entanto TSUJI et ai (1989) demostraram ser possiacutevel fenotipar
esta proteiacutena em bovinos por focagem isoeleacutectrica sem grandes problemas e sem qualquer
aditivo na matriz de poliacrilamida
Desta forma a utilizaccedilatildeo de uma teacutecnica de focagem isoeleacutectrica com um gradiente de
pH 35-65 reforccedilado em 40-65 permitiu separar os produtos geacutenicos do locus TF Contudo
os padrotildees obtidos nem sempre eram definidos tornando-se dificilmente interpretaacuteveis
Na tentativa de melhorar os padrotildees de resoluccedilatildeo e de verificar se a variaccedilatildeo detectada
natildeo resultava de diferenccedilas no estado feacuterrico da moleacutecula de TF ou ainda da existecircncia de
aacutecidos siaacutelicos ligados agrave moleacutecula procedeu-se agrave sua separaccedilatildeo apoacutes vaacuterios tratamentos das
amostras
A remoccedilatildeo dos aacutecidos siaacutelicos atraveacutes do tratamento das amostras com neuraminidase
natildeo permitiu a obtenccedilatildeo de bandas definidas este tratamento natildeo altera significativamente o
padratildeo das bandas de TF de bovinos como jaacute tinha sido descrito por PENHALLOU et ai
(1991)
A obtenccedilatildeo de TF no estado apofeacuterrico foi conseguida submetendo as amostras a um
tratamento com EDTA-dissoacutedico Neste caso observa-se que apoTF apresenta uma
mobilidade menor e um padratildeo de bandas mais simples mas ainda sem uma definiccedilatildeo
adequada
A forma Fe2TF foi obtida mediante vaacuterios tratamentos com dadores de Fe (ver capiacutetulo
Material e Meacutetodos) Os resultados soacute se mostraram satisfatoacuterios atraveacutes da saturaccedilatildeo da
moleacutecula de TF com uma soluccedilatildeo de sulfato de amoacutenio feacuterrico provavelmente por causar uma
maior estabilidade da moleacutecula ao longo da sua separaccedilatildeo por focagem isoeleacutectrica com
elevadas voltagens pois segundo WELCHS (1990) a forma difeacuterrica da transferrina eacute mais
resistente agrave desnaturaccedilatildeo e ao calor do que a forma apoTF
48
Resultados e Discussatildeo
Estatildeo descritos pelo menos oito alelos no locus TF TFAl TFA2 TFB TFD1
TFD2 TFE TFF e TFG os mais comuns no gado europeu (Bos taurus) satildeo TFA
TFD1 TFD2 e TFE (JAMIESON 1965) No gado asiaacutetico e africano (Bos indicus) ocorrem
aleacutem das formas anteriores os alelos TFB e TFF
Na figura 3112 apresenta-se o proteinograma obtido com a utilizaccedilatildeo de amostras
saturadas com Fe Esta teacutecnica permitiu a separaccedilatildeo de TFD em TFD1 e TFD2 e a
detecccedilatildeo de todos os outros fenoacutetipos descritos em bovinos europeus Assim observaram-se
quatro alelos codominantes TFA TFD1 TFD2 e TFE
A expressatildeo fenotiacutepica dos alelos em homozigotia caracteriza-se pela presenccedila de dois
dupletos de bandas aparecendo a banda mais aciacutedica de cada dupleto com intensidade mais
fraca Os indiviacuteduos herozigoacuteticos podem apresentar ateacute oito bandas
Figura 3112 Fenoacutetipos de TF determinados por focagem isoeleacutectrica apartir de amostras saturadas com uma soluccedilatildeo de sulfato de amoacutenio feacuterrico
IGLESIAS (1989) detectou TFA e TFD nas cinco raccedilas de bovinos da Galiza o
variante TFE na raccedila Cachena espanhola e um outro variante raro TFR com mobilidade
mais lenta na raccedila Rubia Galega
bull QQ
A GC eacute uma proteiacutena plasmaacutetica que demonstra um elevado grau de heterogeneidade
geneacutetica em mamiacuteferos (FERRAND 1995)
A separaccedilatildeo de GC em focagem isoeleacutectrica seguida da utilizaccedilatildeo de immunoblotting
melhorou de forma consideraacutevel a capacidade de investigar a variaccedilatildeo desta proteiacutena em
49
Resultados e Discussatildeo
diferentes espeacutecies (JUNEJA et ai 1987 PENEDO amp JUNEJA 1989 STRATIL et ai 1990
KALAacuteB et ai 1990 STERN et ai 1992 VANKAN amp BELL 1992 FERRAND 1995)
Nas figuras 3113 e 3114 apresentam-se alguns dos fenoacutetipos obtidos na separaccedilatildeo
da GC por focagem isoeleacutectrica Verifica-se que em amostras tratadas com neuraminidase o
padratildeo de bandas se apresenta mais simplificado surgindo no entanto duas bandas (uma
mais baacutesica e uma mais aciacutedica) de natureza desconhecida Os padrotildees observados foram
interpretados como sendo determinados por dois alelos GCF e GCS
mdashGCF
S F S FS S FS F F S FS 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Figura 3113 Fenoacutetipos de GC determinados por focagem isoeleacutectrica amostras 1 8 9 e 10 tratadas com neuraminidase amostras 2 a 7 diluiacutedas em aacutegua bidestilada
S1 $ l S- -
FS S S S F S FS S FS F S
Figura 3114 Fenoacutetipos de GC determinados em amostras de plasma tratados com neuraminidase apoacutes focagem isoeleacutectrica
Nota-se a existecircncia de dois alelos codominantes GCF e GCS sendo o segundo
mais aciacutedico do que o primeiro
50
Resultados e Discussatildeo
32 - ANAacuteLISE FAMILIAR
A realizaccedilatildeo da anaacutelise familiar relativo ao conjunto de loci polimoacuterficos estudados
observa-se no estudo de 27 pares matildeefilho Esta situaccedilatildeo resulta da grande dificuldade
existente na obtenccedilatildeo de informaccedilatildeo sobre os machos
Os resultados apresentam-se nas tabelas 321 a 326 natildeo foi possiacutevel testar o
equiliacutebrio de Hardy-Weinberg devido ao reduzido tamanho da amostra bem como ao facto de
vaacuterios alelos ocorrerem em baixa frequecircncia
Refira-se que natildeo foi detectado qualquer caso de exclusatildeo matildeefilho
Tabela 321 Sistema CAII Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica em 27 pares matildeefilho Os valores esperados segundo o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg estatildeo indicados entre parecircntesis
Total
4 (32) 17
(122) 6
(116) 27
Tabela 322 Sistema NP Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica em 27 pares matildeefilho Os valores esperados segundo o equiliacutebrio de Hardy--Weinberg estatildeo indicados entre parecircntesis
Total
14
(114)
13
(156)
27
^ ^ ^ Filho
Matildee - ^ F
Fenoacutetipos
F f~ (11)
FS 2
(21)
S
Total 3
Fenoacutetipos
FS S
3
(21)
10 5
(61) (40)
1 5
(40) (76)
14 10
- v ^ ^ Filho Fenoacutetipos
Matildee - ^ H L
Fenoacutetipos
H 10 4
(77) (37)
L 5 8
(37) (119)
Total 15 12
51
Resultados e Discussatildeo
Tabela 323 Sistema MPI Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica em 26 pares matildeefilho Os valores esperados segundo o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg estatildeo indicados entre parecircntesis
^ Filho Fenoacutetipos Total
Matildee ^ ~ ^ A AB AC B BC c Fenoacutetipos
A 0 0 0 - - - 0
(00) (00) (00) (00)
AB 0 0 0 0 0 - 0
(00) (00) (00) (00) (00) (00)
AC 0 0 0 - 0 0 0
(00) (00) (00) (00) (00) (00)
B - 0 - 24 1 - 25
(00) (242) (06) (248)
BC - 0 0 1 0 0 1
(00) (00) (06) (06) (00) (12)
C - - 0 - 0 0 0
(00) (00) (00) (00)
Total 0 0 0 25 1 0 26
Tabela 324 Sistema ALB Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica em 27 pares matildeefilho Os valores esperados segundo o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg estatildeo indicados entre parecircntesis
^ ^ Filho Fenoacutetipos Total
M atilde e ^ ^ - s ^ ^ A AB AV B BV V
Fenoacutetipos
A 24 2 0 - - - 26
(251) (04) (02) (257)
AB 0 0 0 0 0 -
0
(04) (04) (00) (00) (00) (08)
AG 1 0 0 - 0 0 1
(02) (00) (02) (00) (00) (04)
B - 0 - 0 0 - 0
(00) (00) (00) (00)
BG - 0 0 0 0 0 0
(00) (00) (00) (00) (00) (00)
G - - 0 - 0 0 0
(00) (00) (00) (00)
Total 25 2 0 0 0 0 27
52
Resultados e Discussatildeo
Tabela 325 Sistema TF Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica em 27 pares matildeefilho Os valores esperados segundo o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg estatildeo indicados entre parecircntesis
Filho Fenoacutetipos Total
Matildee ^ A ADI AD2 AE Dl D1D2 DIE D2 D2E E
Fenoacutetipos
A 6
(51)
1
(14)
4
(21)
1
(03)
12
(89)
ADI 1 2 0 0 0 0 0 - - - 3
(14) (24) (06) (01) (04) (06) (01) (56)
AD2 2 0 5 0 - 0 - 2 0 - 9
(21) (06) (36) (01) (06) (08) (01) (79)
AE 0 0 0 0 - - 0 - 0 0 0
(03) (01) (01) (06) (01) (01) (00) (13) Dl 0
(04) 1
(01)
1
(02)
0
(00)
- 2
(07)
D1D2 - 0 1 - 0 0 0 0 0 - 1
(06) (06) (02) (10) (00) (02) (00) (26) DIE - 0 - 0 0 0 0 - 0 0 0
(01) (01) (00) (00) (02) (00) (00) (04)
D2 0
(08) 0
(02)
0
(03)
0
(01)
- 0
(14) D2E - - 0 0 - 0 0 0 0 0 0
(01) (01) (00) (00) (01) (02) (00) (05) E 0
(00) 0
(00)
0
(00)
0
(00)
0
(00)
Total 9 3 10 1 1 1 0 2 0 0 27
Tabela 326 Sistema GC Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica em 27 pares matildeefilho Os valores esperados segundo o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg estatildeo indicados entre parecircntesis
- - ^ F i l h o Fenoacutetipos Total
Matildee ^ ^ 1 2-1 2
Fenoacutetipos
1 17 2 19
(156) (31) (187)
2-1 5 2 0 7
(31) (38) (06) (75)
2 _ 1 0 1
(06) (01) (07)
Total 22 5 0 27
53
Resultados e Discussatildeo
33 - ANAacuteLISE POPULACIONAL LOCUS A LOCUS
Neste capiacutetulo faz-se a anaacutelise populacional dos loci polimoacuterficos e ainda dos loci
PEPB e DIA para os quais natildeo se detectou variaccedilatildeo na raccedila Barrosatilde A sua inclusatildeo justifica-
-se pelo facto de serem polimoacuterficos noutras raccedilas bovinas ou em espeacutecies aparentadas
bull PEPB
O locus PEPB revelou-se monomoacuterfico nas trecircs populaccedilotildees de bovinos de raccedila
Barrosatilde e Minhota tendo sido detectado um uacutenico produto geacutenico PEPB2 (observado um
indiviacuteduo heterozigoacutetico da raccedila Minhota) No entanto este locus eacute referido como polimoacuterfico
em raccedilas bovinas criadas no Brasil onde se detectaram dois alelos codominantes PEPB1 e
PEPB2 (DEL LAMA et ai 1992)
O alelo PEPB2 estaacute fixado nas raccedilas de origem europeia incluindo as estudadas neste
trabalho excepto nas raccedilas italianas Marchigiana e Chianina nas quais PEPB1 apresenta
frequecircncias geacutenicas entre 011 e 014 (tabela 331)
Tabela 331 Frequecircncias geacutenicas de PEPB em vaacuterias raccedilas bovinas
N
Frequecircncias geacutenicas N PEPB1 PEPB2 Referecircncia
Barrosatilde inscrita 141 - 100 Este trabalho
Barrosatilde natildeo inscrita 153 - 100 t i
Minhota 62 001 plusmn0003 099 plusmn 0003 ec
Blonde dAquitaine 13 - 100 DEL LAMAetal 1992)
Charolesa 118 - 100 laquo
Chianina 83 014 plusmn003 086 plusmn 003 t t
Hereford 79 - 100 et
Frisia 125 - 100 t t
Jersey 139 - 100
Limousine 24 - 100
Marchigiana 85 011 plusmn002 089 plusmn 002 te
Simmental 75 - 100 t t
54
Resultados e Discussatildeo
bull DIA
Pela anaacutelise da tabela 332 verifica-se natildeo existir variaccedilatildeo geneacutetica neste locus nas
raccedilas bovinas apresentadas estando fixado o alelo DIAS os resultados obtidos estatildeo de
acordo com os jaacute publicados por outros autores (GONZALEZ et ai 1987 IGLESIAS 1989) Por
outro lado nas populaccedilotildees de buacutefalos ocorre um segundo alelo DIAF com frequecircncias
entre 019 e 021
Tabela 332 Frequecircncias geacutenicas de DIA em vaacuterias populaccedilotildees de raccedilas bovinas e buacutefalos
Frequecircncias geacutenicas
N DIAF DIAS Referecircncia
Portugal
Barrosatilde inscrita 141
Barrosatilde natildeo inscrita 153
Minhota 62
Espanha
Cachena 71
Caldelana 60
Frieiresa 33
Limiana 39
Rubia Gallega 168
Vianesa 40
Sayaguesa (Zamora) 147
Morucha (Salamanca) 101
Alistana Sanabresa 157
Blanca Cacerena 62
Caacuterdena Andaluza 25
Asturiana de los Vallegraves 127
Asturiana de la Montana 106
Bulgaacuteria
Buacutefalo 122
Murrah (Buacutefalo) 51
raquo IGLESIAS (1989)
- 100 Este trabalho
- 100
- 100 a
- 100 IGLESIAS (1989)
- 100
- 100
- 100
- 100
- 100
- 100 GONZALEZ et al (19
- 100
- 100 st
- 100 st
- 100
- 100
- 100
019 + 00 081 plusmn00 MAKAVEEV(1984
021 plusmn00 079 plusmn 00 laquo
55
Resultados e Discussatildeo
bull HB
Os resultados obtidos no estudo de HB permitiram distinguir dois fenoacutetipos definidos
por dois alelos HBA e HBB (tabela 333)
Tabela 333 Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica de HB em populaccedilotildees das raccedilas Barrosatilde e Minhota Os valores esperados de acordo com o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg estatildeo indicados entre parecircntesis
Fenoacutetipos N HBA HBAB HBB
Barrosatilde inscrita 141 141
Barrosatilde natildeo inscrita 153 153
Minhota 62 56 6 0
(561) (58) (01)
As frequecircncias geacutenicas das raccedilas estudadas bem como outras jaacute publicadas referentes a
vaacuterias raccedilas bovinas europeias e a duas espeacutecies de buacutefalos encontram-se discriminadas na
tabela 334
A elevada frequecircncia do alelo HBA nas raccedilas estudadas (fixado na raccedila Barrosatilde)
situam-nas juntamente com outras raccedilas bovinas do centro e sul da Europa onde este alelo
ocorre com frequecircncias entre 080-098 (VICENTE 1978) Nas restantes raccedilas europeias
HBA ocorre com uma ampla margem de variaccedilatildeo (038 - 100) apresentando-se quase
sempre como o alelo mais frequente
No caso dos buacutefalos observa-se uma inversatildeo nos valores das frequecircncias geacutenicas
sendo o alelo HBB o mais frequente
A presenccedila de HBB nos bovinos europeus apesar de em baixa frequecircncia pode ser
indicativo de uma origem a partir de raccedilas asiaacuteticas ou africanas jaacute que eacute nestes continentes
que este alelo ocorre com frequecircncia mais elevadas as frequecircncias geacutenicas mais elevadas estatildeo
descritas no gado zebu da Aacutefrica (BRAEND 1971 VICENTE 1978)
56
Resultados e Discussatildeo
Tabela 334 Frequecircncias geacutenicas de HB em vaacuterias populaccedilotildees de raccedilas bovinas e buacutefalos
N
Frequecircncias geacutenicas
N HBA HBB Referecircncia
Portugal
Barrosatilde inscrita 141 100 - Este trabalho
Barrosatilde natildeo inscrita 153 100 -
Minhota 62 095 plusmn 002 005 plusmn 002
Mertolenga 147 093 plusmn 002 007 plusmn 002 KTOD et ai (1980)
Alentejana 155 096 plusmn 001 004 plusmn001 IacuteIacute
Mirandesa 107 099+001 001 plusmn001 NOBRE (S data)
Espanha
Cachena 71 091 + 002 009 plusmn 002 IGLESIAS (1989)
Caldelana 60 097 plusmn 002 003 plusmn 002
Frieiresa 33 095 plusmn 003 005 plusmn 003
Limiana 39 090 plusmn 003 010 plusmn003
Rubia Gallega 168 093 plusmn 001 007 plusmn001 ce
Vianesa 40 098 plusmn 002 002 plusmn002
Sayaguesa (Zamora) 147 083 plusmn002 017 plusmn002 GONZALEZ et al ( 1987)
Morucha (Salamanca) 101 084 plusmn 003 016 plusmn003 ce
Alistana Sanabresa 157 099 plusmn 001 001 plusmn001
Blanca Cacerefia 62 071 plusmn 004 029 plusmn 004 laquo
Caacuterdena Andaluza 25 096 plusmn 003 004 plusmn 003 IacuteIacute
Asturiana de los Vallegraves 127 091 plusmn002 009 plusmn002
Pirenaica 383 084 plusmn 001 016 plusmn001 VICENTE (1978)
Tudanca 42 065 plusmn 005 035 plusmn 005 laquo
Morena del N O 25 100 -
Frisona 97 100 - laquo
Asturiana de la Montaria 106 079+003 021 plusmn003
De Lidia 124 079 plusmn 003 021 plusmn003 KlDDeacutetal (1980)
Retinta 164 081 plusmn002 019 plusmn002
Itaacutelia
Chianina 264 096 plusmn 001 004 plusmn 001 CARENZiera (1970)
Marchigiana 112 099 plusmn001 001 plusmn001
Bulgaacuteria
Sofia Brown 173 089 plusmn 002 011 plusmn002 MAKAVEEV (1970)
Buacutefalo 77 009 plusmn 002 091 plusmn002 MAKAVEEV(1984)
Murrah (Buacutefalo) 51 015 plusmn004 085 plusmn 004 ce
G Bretanha
Jersey 467 038 plusmn 002 062 plusmn 002 LARSENefa (1974)
in IGLESIAS (1989)
57
Resultados e Discussatildeo
A frequecircncia obtida para HBB na raccedila Minhota (005) aproxima-a das raccedilas do sul da
Europa onde este alelo ocorre com uma frequecircncia de aproximadamente 01 Por outro lado a
completa ausecircncia de HBB na raccedila Barrosatilde eacute um resultado interessante mas para o qual natildeo
eacute possiacutevel fornecer actualmente uma explicaccedilatildeo satisfatoacuteria
CAII
A distribuiccedilatildeo dos fenoacutetipos observados para o locus CAII apresenta-se na tabela
335
Tabela 335 Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica de CAU em populaccedilotildees das raccedilas Barrosatilde e Minhota Entre parecircntesis indicam-se os valores esperados de acordo com o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg
Fenoacutetipos N CA F CAFS CAS
Barrosatilde inscrita 141 17 58 66
(149) (622) (639)
Barrosatilde natildeo inscrita 153 20 71 62
(200) (710) (620)
Minhota 62 3 13 46
(14) (162) (444)
x2
0651 1 0420
0000 1 0995
Os valores do teste de 2 nas populaccedilotildees de raccedila Barrosatilde demonstram natildeo haver
desvios significativos ao equiliacutebrio de Hardy-Weinberg apesar de se observar um ligeiro
excesso de homozigoacuteticos F na populaccedilatildeo de raccedila Barrosatilde (inscrita) Para a raccedila Minhota natildeo
foi possiacutevel testar o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg
Na tabela 336 apresentam-se as frequecircncias geacutenicas de CAII nas populaccedilotildees
estudadas bem como as publicadas por outros autores
O locus CAII apresenta-se polimoacuterfico na maior parte das populaccedilotildees bovinas
europeias sendo o alelo CAIIS o que ocorre com frequecircncia mais elevada
58
Resultados e Discussatildeo
Tabela 336 Frequecircncias geacutemeas de CAU em vaacuterias populaccedilotildees de raccedilas bovinas e de buacutefalos
N
Frequecircncias geacutenicas N CAS CAF Referecircncia
Portugal
Barrosatilde inscrita 141 068 plusmn 003 032 plusmn 003 Este trabalho
Barrosatilde natildeo inscrita 153 064+003 036 plusmn 003
Minhota 62 085 plusmn 003 015+003 Iacute Iacute
Mertolenga 147 085 plusmn 002 015+002 Kn)Deiacutea(1980)
Alentejana 155 091 plusmn 002 009 plusmn 002
Mirandesa 107 099 + 001 001+001 NOBRE (S data)
Espanha
Cachena 71 077 + 004 023 plusmn 004 IGLESIAS (1989)
Caldelana 60 096 plusmn 002 004 plusmn 002 ce
Frieiresa 33 094 + 003 006 plusmn 003
Limiana 39 083 + 004 017 plusmn 004
Rubia Gallega 168 089 plusmn 002 011+002
Vianesa 40 086 + 004 014 plusmn 004
Sayaguesa 147 072 plusmn 003 028+003 GONZALEZ eacutetal (1987)
Morucha 101 072 plusmn 003 028 plusmn 003 a
Alistana Sanabresa 157 092 plusmn 002 008+002 iacute iacute
Blanca Cacerena 62 067 plusmn 004 033 plusmn 004 IacuteIacute
Caacuterdena Andaluza 25 100
Asturiana de los Vallegraves 127 087 plusmn 002 013+002 laquo
Asturiana de la Montaria 106 077 plusmn003 023 plusmn 003 IacuteIacute
Tudanca 42 076 plusmn 005 024 plusmn 005 VICENTE (1978)
Morena del NO 25 092 plusmn 004 008 plusmn 004
De Lidia 124 061+003 039 plusmn 003 KjDDetal (1980)
Retinta 164 065 + 003 035+003 iacuteiacute
Bulgaacuteria
Buacutefalo 263 007 + 001 093+001 MAKAVEEV(1984)
Murran (Buacutefalo) 51 020 plusmn 004 080 plusmn 004 laquo
Alemanha
Frisia 550 083 plusmn 001 017 + 001 THTNNES eacutetal (1976)
Suiacuteccedila
Simmental 1039 079 + 001 021+001 KAgraveSTLIeacutetal (1980)
Castanha Suiacuteccedila 546 087 plusmn 001 013+001
Friburg 223 084 + 002 016+002
in IGLESIAS (1989)
59
Resultados e Discussatildeo
As frequecircncias aleacutelicas de CAIPS e CAIPF nas raccedilas Cachena espanhola e Barrosatilde
portuguesa satildeo idecircnticas o que poderaacute eventualmente indicar estar-se em presenccedila de uma soacute
raccedila com designaccedilotildees diferentes nos dois paiacuteses Esta hipoacutetese eacute reforccedilada pelo facto de natildeo
haver diferenccedilas significativas entre dados morfomeacutetricos obtidos nas duas raccedilas (LEAL 1995)
Nos buacutefalos observa-se mais uma vez uma inversatildeo nas frequecircncias dos dois alelos do
locus CAII em relaccedilatildeo aos bovinos sendo CAF o mais frequente com valores situados entre
080 e 093
bull NP
Pela anaacutelise das tabelas 337 e 338 verifiacuteca-se a presenccedila dos dois alelos descritos
neste locus nas vaacuterias raccedilas bovinas sendo NPL o mais frequente nas raccedilas europeias (052 e
099) Observa-se uma grande similaridade entre os valores das frequecircncias geacutenicas o que natildeo
permite diferenciar as raccedilas estudadas neste trabalho das restantes
Tabela 337 Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica de NP em populaccedilotildees das raccedilas Barrosatilde e Minhota
N
Fenoacutetipos
N NP H NPL
Barrosatilde inscrita 141 69 72
Barrosatilde natildeo inscrita 153 55 98
Minhota 62 19 43
60
Resultados e Discussatildeo
Tabela 338 Frequecircncias geacutenicas para NP em vaacuterias populaccedilotildees e raccedilas bovinas
N
Frequecircncias geacutenicas
N NPH NPL Referecircncia
Portugal
Barrosatilde inscrita 141 029 plusmn 003 071 plusmn 003 Este trabalho
Barrosatilde natildeo inscrita 153 020 plusmn 002 080 plusmn 002 cc
Minhota 62 017 + 004 083 + 004
Espanha
Cachena 71 020 plusmn 003 080 plusmn 003 IGLESIAS (1989)
Caldelana 60 013+003 087 plusmn 003 t t
Frieiresa 33 011+004 089 plusmn 004
Limiana 39 008 plusmn 003 092 plusmn 003
Rubia Gallega 168 015+002 085 plusmn 002
Vianesa 40 013 + 004 087 plusmn 004 t i
Sayaguesa 147 014 + 002 086 plusmn 002 GONZALEZ et ai ( 1987)
Morucha 101 020 plusmn 003 080 plusmn 003
Alistana Sanabresa 157 001+001 099 + 001
Blanca Cacerena 62 048 plusmn 005 052 plusmn 005 laquo
Caacuterdena Andaluza 25 004 plusmn 003 096 plusmn 003 IacuteIacute
Asturiana de los Vallegraves 127 028 plusmn 003 072 plusmn 003
Asturiana de la Montana 106 026 plusmn 003 074 plusmn 003
Beacutelgica
Charolesa 130 026 plusmn 003 074 + 003 ANSAY amp HANSET (1972)
Frisia 91 006 plusmn 002 094 plusmn 002 t t
in IGLESIAS (1989)
MPI
A distribuiccedilatildeo dos fenoacutetipos observados para o locus MPI apresenta-se na tabela 339
Das trecircs populaccedilotildees estudadas apenas a raccedila Minhota apresenta valores observados
proacuteximos dos valores esperados segundo o formalismo de Hardy-Weinberg Por outro lado
apesar de natildeo ter sido possiacutevel testar o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg nas restantes populaccedilotildees
a aparente diferenccedila entre valores observados e esperados poderaacute dever-se a um excesso de
indiviacuteduos homozigoacuteticos para MPIC Este resultado poderaacute estar relacionado com o
processo de amostragem ou com outras causas como o acasalamento entre indiviacuteduos
61
Resultados e Discussatildeo
aparentados a existecircncia de sub-populaccedilotildees de tamanho pequeno ou ainda a um reduzido
nuacutemero de machos reprodutores
Tabela 339 Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica de MPI em populaccedilotildees das raccedilas Barrosatilde e Minhota Entre parecircntesis indicam-se os valores esperados de acordo com o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg
Fenoacutetipos N MPIA MPIAB MPIAC MPIB MPIBC MPIC
Barrosatilde inscrita 138 - - - 131 6 1
(1301) (78) (01)
Barrosatilde natildeo inscrita 1 5 2 - - - 147 4 1
(1460) (59) (01)
Minhota 61 0 3 0 56 2 0
(00) (29) (01) (561) (19) (00)
A anaacutelise da tabela 3310 permite verificar que MPIB e MPIC ocorrem nas duas
raccedilas de bovinos estudadas sendo MPIB o alelo mais comum nas trecircs populaccedilotildees A
ocorrecircncia de MPI A na raccedila Minhota contraria o descrito por ANSAY (1973) quando afirma
a exclusividade do fenoacutetipo AB na raccedila Charolesa
Tabela 3310 Frequecircncias geacutenicas de MPI nas populaccedilotildees estudadas
N
Frequecircncias geacutenicas
N MPPA MPPB MPIC
Barrosatilde inscrita 138 - 097 + 001 003+001
Barrosatilde natildeo inscrita 152 - 098 + 001 002+001
Minhota 61 002 plusmn 001 096 plusmn002 002 plusmn 001
A informaccedilatildeo disponiacutevel sobre este marcador em anteriores trabalhos de anaacutelise
geneacutetica em bovinos eacute quase inexistente Tal poderaacute dever-se agraves dificuldades de visualizaccedilatildeo
encontradas na sua fenotipagem por electroforese convencional A detecccedilatildeo de MPI estaacute
descrita em tecidos musculares e em leucoacutecitos neste trabalho utilizaram-se eritroacutecitos para o
estudo de variaccedilatildeo geneacutetica desta proteiacutena mas eacute provaacutevel que a sua expressatildeo ocorra apenas
na fracccedilatildeo leucocitaacuteria (natildeo separada) o que explicaria precisamente a sua fraca actividade
62
Resultados e Discussatildeo
ALB
A distribuiccedilatildeo dos fenoacutetipos observados para o locus ALB apresenta-se na tabela
3311
Apesar de natildeo ter sido possiacutevel testar o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg todas as
amostras estudadas mostram desvios muito reduzidos entre valores observados e esperados
Tabela 3311 Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica de ALB em populaccedilotildees das raccedilas Barrosatilde e Minhota Entre parecircntesis indicam-se os valores esperados de acordo com o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg
N
Fenoacutetipos N ALBA ALBAB ALBB ALBBV ALBAV ALB V
Barrosatilde inscrita 142 137 3 - - 2 -(1370) (30) (00) (00) (20) (00)
Barrosatilde natildeo inscrita 153 145 5 1 - 2 -(1440) (68) (01) (01) (20) (00)
Minhota 62 59
(590)
3 (30) (00)
Na tabela 3312 estatildeo discriminadas as frequecircncias geacutenicas estimadas para as
populaccedilotildees estudadas bem como as de outras populaccedilotildees de bovinos da Europa e de buacutefalos
da Bulgaacuteria
Verifica-se que ALBA eacute o alelo mais comum encontrando-se aparentemente fixado
em vaacuterias raccedilas bovinas de origem europeia
Como jaacute referido para HB a presenccedila de ALBB nas raccedilas europeias parece
relacionar-se com a sua localizaccedilatildeo geograacutefica verificando-se que de uma maneira geral a sua
frequecircncia aumenta agrave medida que nos aproximamos do sul da Europa e de Aacutefrica eacute no gado
zebu africano que este alelo ocorre com frequecircncias mais elevadas variando entre 030 e 060
(VICENTE 1978) Assim a presenccedila de ALBB no gado europeu poderaacute indicar a passagem
pela Europa de bovinos oriundos de Aacutefrica (CECCHINI amp Nus 1986) Eacute de notar que apenas a
raccedila Minhota e algumas das restantes raccedilas da Peniacutensula Ibeacuterica natildeo apresentam ALBB
63
Resultados e Discussatildeo
Tabela 3312 Frequecircncias geacutenicas de ALB em vaacuterias populaccedilotildees de raccedilas bovinas e em buacutefalos
Frequecircncias geacutenicas
N ALBA (F) ALBB (S) ALBV Referecircncia
Portugal
Barrosatilde inscrita 142 098 + 001 001 plusmn 001 001 plusmn001 Este trabalho
Barrosatilde natildeo inscrita 153 097 + 001 002+001 001 plusmn001
Minhota 62 098 plusmn 001 - 002 plusmn 001
Mertolenga 147 084 plusmn 002 016 + 002 - KlDDetal (1980)
Alentejana 155 094+001 006 plusmn 001 -
Mirandesa 106 094 + 002 006 plusmn 002 - NOBRE (S data)
Espanha -
Cachena 71 098 + 001 002+001 - IGLESIAS (1989)
Caldelana 60 098 plusmn 001 002 + 001 -
Frieiresa 33 100 - - raquo
Limiana 39 097 + 002 003 plusmn 002 -
Rubia Gallega 201 099 plusmn 000 001 plusmn000 -
Vianesa 40 093 + 003 007 + 003 -
Sayaguesa 147 096 plusmn001 004 plusmn 001 - GONZALEZ et al (1987)
Moracha 101 089 plusmn 002 011+002 -
Alistaria Sanabresa 157 090 plusmn 002 010 plusmn002 -
Blanca Cacerena 62 056 plusmn 005 044 plusmn 005 -
Caacuterdena Andaluza 25 100 - -
Asturiana de los Vallegraves 127 099 + 001 001 plusmn001 -
Asturiana de la Montana 106 099 plusmn001 001 plusmn001 -
Pirenaica 265 092 + 001 008 plusmn001 - VICENTE (1978)
Tudanca 42 100 - -
Morena del N O 25 092 + 004 008 plusmn 004 -
Frisona 97 100 - -
De Lidia 124 100 - - KIDDeacutetal (1980)
Retinta 164 097 + 001 003 plusmn001 -
Itaacutelia
Chinina 264 089 + 001 011 plusmn001 - CARENZIeacutetal (1970)
Marchigiana 124 074 + 003 026 plusmn 003 -
Beacutelgica
Pied vermelha Este-Flandern 503 100 - - BOUQUET amp VAN de WEGHE (1972)
Vermelha Oeste-Flandern 155 100 - -
Pied preta 174 100 - -
Pied vermelha-Campine 265 100 - -
w IGLESIAS (1989)
(Continua)
64
Resultados e Discussatildeo
Tabela 3312 Frequecircncias geacutenicas de ALB em vaacuterias populaccedilotildees de raccedilas bovinas e de buacutefalos (continuaccedilatildeo)
Frequecircncias geacutenicas N ALBA (F) ALBB (S) ALBV Referecircncia
Bulgaacuteria
Sofia Brow 170 096+001 004 + 001 - M A K A V E E V ( 1 9 7 0 )
Buacutefalo 225 047 plusmn 002 053 plusmn 002 - M A K A V E E V ( 1 9 8 4 )
Murrah (Buacutefalo) 76 012+003 088 plusmn 003 -
G Bretanha
Charolesa 99 084 plusmn 003 016 + 003 - SPOONER amp OLIVER (1969)
Frisia 1422 100 - -
Hereford 215 099 plusmn 001 001+001 -
Jersey 217 100 - -
laquo IGLESIAS (1989)
Neste trabalho descreve-se tambeacutem o alelo ALBV com uma frequecircncia de 001 e
002 nas raccedilas Barrosatilde e Minhota respectivamente Este alelo natildeo se encontra descrito em
qualquer raccedila europeia podendo a sua detecccedilatildeo estar relacionada com a capacidade resolvente
da teacutecnica de focagem isoeleacutectrica utilizada na separaccedilatildeo de ALB
TF
A transferrina eacute provavelmente o mais informativo dos sistemas polimoacuterficos estudados
em virtude do nuacutemero de alelos que apresenta
A distribuiccedilatildeo dos fenoacutetipos observados para o locus TF apresenta-se na tabela 3313
E possiacutevel verificar a existecircncia de equiliacutebrio de Hardy-Weinberg em todas as populaccedilotildees
estudadas
Da anaacutelise das frequecircncias geacutenicas expressas na tabela 3314 verifica-se que este locus
apresenta quatro produtos geacutenicos na maioria das raccedilas europeias sendo os alelos TFA e
TFD (incluindo os subtipos TFD1 e TFD2) os que apresentam frequecircncias mais elevadas
(027 a 092 para o alelo TFA e 026 a 073 para o alelo TFD)
Observa-se tambeacutem que a frequecircncia de TFD2 nas raccedilas estudadas eacute mais elevada do
que a de TFD1 como ocorre na maioria das raccedilas ibeacutericas
65
Resultados e Discussatildeo
No que se refere a TFE verifica-se que a sua frequecircncia eacute relativamente baixa nas
raccedilas europeias (001 e 022) e estaacute mesmo ausente em quase todas as raccedilas da regiatildeo da
Galiza (com excepccedilatildeo da raccedila Cachena espanhola e Rubia Gallega) e na raccedila Minhota Note-se
a grande semelhanccedila entre os valores de frequecircncias geacutenicas deste alelo na raccedila Cachena
espanhola (005) e nas populaccedilotildees de raccedila Barrosatilde (004 e 003) o que mais uma vez sugere
uma grande proximidade entre as duas Apesar de ocorrer em baixa frequecircncia nos bovinos
europeus a presenccedila de TFE nestas raccedilas pode indicar uma proveniecircncia asiaacutetica ou africana
pois eacute nestes continentes que aquele alelo eacute mais comum (BRAEND 1971)
66
Resultados e Discussatildeo
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Resultados e Discussatildeo
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68
Resultados e Discussatildeo
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69
Resultados e Discussatildeo
bull GC
A distribuiccedilatildeo dos fenoacutetipos observados para o locus GC apresenta-se na tabela 3315
A sua anaacutelise permite verificar a existecircncia de diferenccedilas entre os valores observados e
esperados para raccedila Barrosatilde (populaccedilatildeo inscrita no Livro Genealoacutegico) Este desvio ao
equiliacutebrio de Hardy-Weinberg deve-se agrave existecircncia de um excesso de homozigoacuteticos
sugerindo assim a ocorrecircncia de uma possiacutevel subestruturaccedilatildeo na populaccedilatildeo
Nas restantes amostras estudadas natildeo foi possiacutevel aplicar o teste de Contudo a
diferenccedila entre valores observados e esperados de acordo com o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg
eacute praticamente inexistente na populaccedilatildeo Barrosatilde natildeo inscrita e pouco acentuada na raccedila
Minhota
Tabela 3315 Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica de GC em populaccedilotildees das raccedilas Barrosatilde e Minhota Entre parecircntesis indicam-se os valores esperados de acordo com o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg
Fenoacutetipos N GCS GCFS GCF
Barrosatilde inscrita 142 98 35 8
(945) (419) (45)
Barrosatilde natildeo inscrita 153 109 40 4
(1087) (406) (37)
Minhota 62 54 5 3
(514) (101) (04)
x2
3913 1 0048
A distribuiccedilatildeo das frequecircncias geacutenicas apresentada na tabela 3316 mostra que GCS eacute
o alelo mais comum nas raccedilas europeias (com excepccedilatildeo da raccedila Frisia da Sueacutecia) As raccedilas
estudadas neste trabalho tecircm frequecircncias aleacutelicas para este locus que as aproximam das raccedilas
espanholas
70
Resultados e Discussatildeo
Tabela 3316 Frequecircncias geacutenicas de GC em vaacuterias populaccedilotildees de raccedilas bovinas
Frequecircncias geacutenicas
N GCF(ouA) GCS(ouB) GCC Referecircncia
Portugal
Barrosatilde inscrita
Barrosatilde natildeo inscrita
Minhota
Alentejana
Mirandesa
Espanha
De Lidia
Frisona
Beacutelgica
Branca e azul
Flemish vermelha
Campine vermelha e branca
Preta e branca
Flemish branca e vermelha
Sueacutecia
Vermelha e Branca
Frisia
141 018 plusmn0023
153 016 plusmn002
62 009 plusmn 003
028 plusmn 004
97 020 plusmn 003
1306 008 plusmn001
124 015 plusmn002
2323 031 plusmn001
431 016 plusmn001
299 012 plusmn001
299 019 plusmn002
140 006 plusmn 001
1030 039 plusmn001
273 079 plusmn 002
082 plusmn 002
084 plusmn 002
091 plusmn003
072 plusmn 004
080 plusmn 003
092 plusmn 001
085 plusmn 002
069 plusmn 001
084 plusmn 001
088 plusmn 001
081 plusmn002
065 plusmn 003
061 plusmn001
021 plusmn002
029 plusmn 003
Este trabalho
CUNHA (1994)
NOBRE (S data)
PIEDRAFUA et ai (1984)
VAN de WEGHE et ai (1982)
GAHNE(1963)
in PIEDRAFUA et ai (1984)
71
Resultados e Discussatildeo
34 - ANAacuteLISE POPULACIONAL CONJUNTA
341 - Diversidade geneacutetica na raccedila Barrosatilde
As estimativas da variabilidade geneacutetica das populaccedilotildees de bovinos das raccedilas Barrosatilde e
Minhota efectuaram-se considerando apenas 6 loci polimoacuterficos HB CAII MPI ALB TF e
GC
Tabela 341 Estimativa da variabilidade geneacutetica (6 loci) atraveacutes dos valores de heterozigotia observada (Ho) e esperada (He) nas populaccedilotildees estudadas
Barrosatilde inscrita Barrosatilde natildeo inscrita Minhota Locus
Ho He Ho He Ho He
HB 0000 0000 0000 0000 0097 0093
CAH 0411 0441 0464 0464 0210 0262
MPI 0043 0056 0026 0039 0082 0080
ALB 0035 0035 0046 0058 0048 0048
TF 0603 0590 0556 0595 0694 0638
GC 0248 0297 0261 0265 0081 0163
Os resultados expressos na tabela 341 mostram em geral a ausecircncia de diferenccedilas
significativas entre os valores de heterozigotia observada (Ho) e heterozigotia esperada (He)
para os loci estudados Deve contudo notar-se que na raccedila Minhota e quanto ao locus GC o
valor de He eacute aproximadamente o dobro da Ho Nos restantes loci o ligeiro desvio observado
entre Ho e He sugere em geral um deacutefice de heterozigoacuteticos
Nas duas populaccedilotildees de raccedila Barrosatilde os sistemas TF e CAII satildeo os que apresentam
valores de heterozigotia mais elevados Pelo contraacuterio os loci MPI e ALB mostram valores de
heterozigotia baixos possivelmente devido ao excesso de homozigoacuteticos (MPI B e ALB A)
detectados nas trecircs populaccedilotildees
Na tabela 342 apresentam-se os valores do nuacutemero meacutedio de alelos por locus (ria)
percentagem de loci polimoacuterficos (P) heterozigotia meacutedia observada (Ho) e heterozigotia
esperada (He) nas populaccedilotildees de bovinos estudados Estes valores devem ser interpretados
72
Resultados e Discussatildeo
tendo em conta o facto de os 6 loci investigados serem polimoacuterficos em pelo menos uma
populaccedilatildeo
Tabela 342 Variabilidade geneacutetica detectada em trecircs populaccedilotildees de bovinos atraveacutes da anaacutelise de 6 loci polimoacuterficos N - efectivo meacutedio estudado por locus na - nuacutemero meacutedio de alelos por locus P - proporccedilatildeo de loci polimoacuterficos Ho - heterozigotia observada He - heterozigotia meacutedia esperada Entre parecircntesis indicam-se os valores do desvio padratildeo
Raccedila Populaccedilatildeo N na P Ho He
Barrosatilde inscrita 1407 233 833 0223 0237
(06) (042) (0100) (0100)
Barrosatilde natildeo inscrita 1528 233 833 0226 0237
(02) (042) (0098) (0101)
Minhota 618 233 1000 0202 0214
(02) (021) (0101) (0090)
A sua anaacutelise permite verificar em primeiro lugar a ocorrecircncia de uma grande
semelhanccedila entre os valores de H nas duas raccedilas estudadas Barrosatilde e Minhota revelando a
existecircncia de uma variabilidade geneacutetica idecircntica nas trecircs populaccedilotildees de bovinos Observa-se
tambeacutem que os valores de heterozigotia meacutedia observada (Ho) natildeo diferem significativamente
dos valores de heterozigotia esperados (He) nas trecircs populaccedilotildees sendo o valor mais elevado o
encontrado na populaccedilatildeo de raccedila Barrosatilde (237)
Os elevados valores de P (833 na raccedila Barrosatilde e 100 na raccedila Minhota) resultam
do facto de apenas se terem utilizado loci polimoacuterficos nesta anaacutelise e o nuacutemero meacutedio de
alelos por locus (na) eacute igual nas trecircs populaccedilotildees estudadas (233)
A tabela 343 apresenta estimativas de FB Frr e FST para as trecircs populaccedilotildees de
bovinos Os valores de Fis indicam a existecircncia de uma acentuada deficiecircncia de
heterozigoacuteticos nos loci MPI e GC Nos restantes loci verifica-se por um lado a tendecircncia
para um excesso de heterozigoacuteticos nos loci HB e TF (com valores de -0051 e -0021
respectivamente) e por outro lado para uma ligeira deficiecircncia de heterozigoacuteticos nos loci
CAII e ALB (com valores de 0066 e 0072 respectivamente) A meacutedia ponderada de FiS
mostra uma deficiecircncia de heterozigoacuteticos de 48
73
Resultados e Discussatildeo
Tabela 343 Distribuiccedilatildeo relativa da diversidade geneacutetica nas trecircs populaccedilotildees de bovinos Hs-heterozigotia intrapopulacional HT-heterozigotia total Valores das estatiacutesticas F para 6 loci analisados
Locus H s Hx Fis FIT FST
HB 0030 0031 -0051 -0016 0033
CAII 0387 0404 0066 0104 0041
MPI 0058 0059 0130 0133 0004
ALB 0046 0047 0072 0075 0004
TF 0605 0627 -0021 0015 0036
GC 0241 0244 0183 0193 0012
Meacutedia 0228 0235 0048 0078 0031
As estimativas de FST indicam a existecircncia de um baixo grau de diferenciaccedilatildeo
populacional nos bovinos estudados Os valores de FST para os 6 loci analisados podem
considerar-se baixos (entre 0004 e 0041) apresentando uma meacutedia ponderada de 0031
Assim soacute uma pequena parte da diversidade geneacutetica (31) se deve a diferenccedilas entre as
populaccedilotildees sendo muito maior a diversidade dentro de cada populaccedilatildeo do que entre as
populaccedilotildees
Os baixos valores de FST encontrados para os loci MPI e ALB resultam de frequecircncias
elevadas de MPIB e ALBA respectivamente e traduzem uma grande homogeneidade entre
as raccedilas bovinas estudadas natildeo se detectando subestruturaccedilatildeo populacional
342 - Comparaccedilatildeo com outras raccedilas ibeacutericas
Tendo em conta o pequeno nuacutemero de loci comuns a este e a outros estudos
estimaram-se diferentes valores de heterozigotia meacutedia consoante o nuacutemero de loci de que se
dispunha Na tabela 344 e 345 apresentam-se valores de heterozigotia meacutedia para as
diferentes raccedilas obtidos a partir de quatro (FF) e cinco loci (FF+) respectivamente bem como
os valores de na P e os respectivos desvios padratildeo em vaacuterias raccedilas de bovinos ibeacutericos
A diversidade geneacutetica do bovino Barrosatilde avaliada pela taxa meacutedia de heterozigotia
(0281-0272 e 0249-0260 para 5 e 4 loci respectivamente) parece ocupar uma posiccedilatildeo
74
Resultados e Discussatildeo
intermeacutedia no seio das raccedilas ibeacutericas Tambeacutem o grau de variabilidade geneacutetica nos bovinos
avaliado por paracircmetros como o nuacutemero meacutedio de alelos por locus e a proporccedilatildeo de loci
polimoacuterficos (P) demonstra que as raccedilas estudadas neste trabalho ocupam uma posiccedilatildeo
intermeacutedia quando comparadas com outras raccedilas ibeacutericas
A anaacutelise das tabelas 344 e 345 mostra que todas as medidas de diversidade geneacutetica
(H P e de na) apresentam valores idecircnticos Esta semelhanccedila permite supor que o processo de
domesticaccedilatildeo iniciado haacute menos de 10000 anos natildeo levou a uma grande diferenciaccedilatildeo
geneacutetica entre as raccedilas pelo menos relativamente aos marcadores geneacuteticos estudados neste
trabalho Desta forma verifica-se que as principais diferenccedilas entre as raccedilas resultam de
pequenas alteraccedilotildees das suas frequecircncias geacutenicas provavelmente causadas pelo baixo nuacutemero
de animais destinados agrave reproduccedilatildeo (mais marcado nos machos) e pelos cruzamentos dirigidos
em cada raccedila
Por outro lado este baixo niacutevel de diferenciaccedilatildeo geneacutetica deveraacute estar tambeacutem
associado ao facto de na origem das raccedilas bovinas ibeacutericas se encontrar um uacutenico processo de
domesticaccedilatildeo seguido provavelmente de um processo de expansatildeo populacional bastante
recente do Proacuteximo Oriente ateacute agrave Europa Adicionalmente estima-se que a diferenciaccedilatildeo dos
bovinos em raccedilas autoacutectones soacute teraacute ocorrido nos uacuteltimos 300 anos (LOFTUS et ai 1994)
Neste contexto os eventuais estrangulamentos do efectivo populacional (bottleneck)
e efeitos de fundador ocorridos durante o periacuteodo inicial da domesticaccedilatildeo do gado bovino e
capazes de afectar de forma muito diferente vaacuterios nuacutecleos populacionais natildeo satildeo detectados
na Peniacutensula Ibeacuterica
75
Resultados e Discussatildeo
Tabela 344 Variabilidade geneacutetica em vaacuterias raccedilas de bovinos atraveacutes da anaacutelise de 4 loci polimoacuterficos N - efectivo meacutedio estudado por locus ria - nuacutemero meacutedio de alelos por locus P-- proporccedilatildeo de loci polimoacuterficos yent - heterozigotia meacutedia esperada Entre parecircntesis indicam-se os valores do desvio padratildeo
Raccedila Populaccedilatildeo N nbdquo P H +
Portugal
Barrosatilde inscrita 1410(00) 23 (05) 750 0249 (0135)
Barrosatilde natildeo inscrita 1530 (00) 23 (05) 755 0260(0135)
Minhota 620 (00) 20 (00) 1000 0216 (0094)
Mertolenga 1470 (00) 23 (03) 1000 0315 (0097)
Alentejana 1550(00) 23 (03) 1000 0239 (0123)
Mirandesa 1065 (03) 20 (00) 1000 0159(0110)
Espanha
Cachena 710 (00) 23 (03) 1000 0279(0111)
Caldelana 600 (00) 20 (00) 1000 0166 (0107)
Frieiresa 330 (00) 18(03) 750 0177(0112)
Limiana 390 (00) 20 (00) 1000 0246 (0087)
Rubia Gallega 1845(95) 25 (05) 1000 0215(0110)
Vianesa 400 (00) 20 (00) 1000 0221 (0087)
Sayaguesa 1470 (00) 23 (03) 1000 0320 (0094)
Morucha 1010(00) 23 (03) 1000 0361 (0084)
Alistaria Sanabresa 1570 (00) 23 (03) 1000 0213 (0104)
Blanca Cacerefia 618 (03) 20 (00) 1000 0377 (0078)
Caacuterdena Andaluza 250 (00) 15(03) 500 0131 (0106)
Asturiana de los Vallegraves 1265 (05) 23 (03) 1000 0237(0107)
Asturiana de la Montana 1060 (00) 23 (03) 1000 0280 (0088)
Tudanca 420 (00) 20 (04) 750 0321 (0109)
Morena del N O 250 (00) 18 (03) 750 0203 (0108)
Frisona 6540 (00) 18 (05) 500 0203 (0130)
De Lidia 1240 (00) 23 (03) 1000 0367(0135)
Retinta 1640 (00) 23 (03) 1000 0338 (0107)
76
Resultados e Discussatildeo
Tabela 345 Variabilidade geneacutetica em vaacuterias raccedilas de bovinos atraveacutes da anaacutelise de 5 loci polimoacuterficos N - efectivo meacutedio estudado por locus na - nuacutemero meacutedio de alelos por locus P--proporccedilatildeo de loci polimoacuterficos H^ - heterozigotia meacutedia esperada Entre parecircntesis indicam-se os valores do desvio padratildeo
Raccedila Populaccedilatildeo N na P i r Portugal
Barrosatilde inscrita 1410 (00) 22 (04) 800 0281 (0109)
Barrosatilde natildeo inscrita 1530(00) 22 (04) 800 0272 (0105)
Minhota 620 (00) 20 (00) 1000 0229 (0074)
Espanha Cachena 710 (00) 22 (02) 1000 0289 (0087)
Caldelana 600 (00) 20 (00) 1000 0180 (0084)
Frieiresa 330 (00) 18 (02) 800 0180 (0087)
Limiana 390 (00) 20 (00) 1000 0226(0071)
Rubia Gallega 1812(81) 24 (04) 1000 0223 (0086)
Vianesa 400 (00) 20 (00) 1000 0374 (0168)
Sayaguesa 1470 (00) 22 (02) 1000 0305 (0074)
Morucha 1010 (00) 22 (02) 1000 0353 (0066)
Alistaria Sanabresa 1570 (00) 22 (02) 1000 0174 (0089)
Blanca Cacerefla 616 (02) 20(00) 1000 0402 (0065)
Caacuterdena Andaluza 250 (00) 16(02) 600 0120 (0083)
Asturiana de los Vallegraves 1266 (04) 22 (02) 1000 0270 (0089)
Asturiana de la Montaria 1060(00) 22 (02) 1000 0301 (0072)
343 - Diferenciaccedilatildeo geneacutetica
Nas tabelas 346 e 347 apresentam-se as distacircncias geneacuteticas de Nei (NEI 1978)
calculadas para 23 (4 loci HB CAII ALB e TF) e 15 (5 loci HB CAII ALB TF e NP)
raccedilas bovinas ibeacutericas respectivamente Da sua anaacutelise ressalta o facto de aqueles valores
serem na sua maioria bastante baixos
De entre as raccedilas bovinas ibeacutericas estudadas a Frisona e a Cachena demonstram estar
mais proacuteximas da raccedila Barrosatilde com valores de DNei de 0092 (4 loci) e de 0104 (5 loci)
respectivamente Por outro lado as raccedilas Asturiana de la Montana e Vianesa aparecem como
as mais diferenciadas DNei= 0334 (4 loci ) e Dgtjei= 0330 (5 loci) respectivamente
77
Resultados e Discussatildeo
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79
Resultados e Discussatildeo
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80
Resultados e Discussatildeo
No que se refere agrave raccedila Minhota verifica-se que a Frieiresa eacute a que estaacute mais proacutexima
(valores de 0077 e 0074 para 4 e 5 loci respectivamente) e que mais um vez eacute a Asturiana de
la Montana a mais diferenciada das raccedilas (valores de 0389 e 0349 para 4 e 5 loci respectivamente)
A diferenciaccedilatildeo geneacutetica entre as raccedilas bovinas ibeacutericas encontra-se representada nos
dendrogramas construiacutedos pelos meacutetodos de agrupamento NJ (Neighbor-joining SATTOU amp
NEI 1987) e UPGMA (Unweightedpair-group arithmetic average SNEATH amp SOKAL 1973)
(figuras 341 342 343 e 344) Foram realizados testes de reamostragem do tipo
bootstrap (100 reacuteplicas) para a anaacutelise da consistecircncia dos padrotildees de ramificaccedilatildeo
apresentando-se os seus valores entre parecircntesis
A anaacutelise conjunta dos quatro dendrogramas permite verificar uma falta de consistecircncia
nos vaacuterios padrotildees de ramificaccedilatildeo para as raccedilas bovinas ibeacutericas associada a valores de
bootstrap em geral muito reduzidos De facto observa-se que o padratildeo de ramificaccedilatildeo dos
dendrogramas se altera consoante o meacutetodo de agrupamento usado e o nuacutemero de loci considerados Estas alteraccedilotildees nos agrupamentos das diferentes raccedilas devem-se
provavelmente agrave instabilidade causada pelo reduzido nuacutemero de loci polimoacuterficos utilizados
neste estudo bem como ao facto de as frequecircncias geacutenicas serem muito semelhantes em todas
as populaccedilotildees estudadas
Deve contudo referir-se que a raccedila Barrosatilde aparece normalmente associada a vaacuterias
raccedilas do norte da Peniacutensula Ibeacuterica nomeadamente a Cachena (Galiza) a Asturiana de la
Montana (Astuacuterias) a Sayaquesa e a Morucha (Salamanca)
No que se refere agrave raccedila Minhota esta aparece vaacuterias vezes associada agraves raccedilas Rubia
Gallega Frisona Asturiana de los Vallegraves e Frieiresa
81
Resultados e Discussatildeo
(18)
(14)
(11)
(5)
(3)
Sayaquesa
(39)
[32)
(21)1-
- -HsT
(49)
(1)
(3)
(18)
(8)
(13)1
(12)
19)
(16T
De Lidia
(99) Asturiana de la Montana
Tudanca bullMorucha
Cachena Barrosatilde mdashFrisona
Minhota -Asturiana de los Vallegraves Rubia Gallega
Frieiresa Alentejana
(65)
Mertolenga -Vianesa
Blanra Cacerefla
Retinta Linuacuteana
i (39)r
Mirandesa Caacuterdena Andaluza Morena NO
Caldelana Alistano Sanabresa
Figura 341 Dendrograma construiacutedo com base nas distacircncias geneacuteticas de NEI (1978) entre 23 raccedilas de bovinos (4 loci HBCAII ALB e TF) atraveacutes do meacutetodo de agrupamento NJ Os valores de probabilidade de ocorrecircncia de cada agrupamento obtidos atraveacutes de um teste de bootstrap indicam-se entre parecircntesis
82
Resultados e Discussatildeo
Morucha
Cachena Sayaquesa
Rubia Gallega Asturiana de los Vallegraves Freiresa
Frisona Minhota Alentejana Mertolenga
(43) ( 2 8 gt - ^ C a W e l a l
( iacute 7gtrl - Mirandesa L__ Alistano Sanabresa
Caacuterdena Andaluza Vianesa
Barrosatilde Retinta
De Lidia Tudanca
Asturiana de la Montana Morena NO Blanca Cacerena
Figura 342 Dendrograma construiacutedo com base nas distacircncias geneacuteticas de NEI (1978) entre 23 raccedilas de bovinos (4 loci HB CAII ALB e TF) atraveacutes do meacutetodo de agrupamento UPGMA Os valores de probabilidade de ocorrecircncia de cada agrupamento obtidos atraveacutes de um teste de bootstrap indicam-se entre parecircntesis
83
Resultados e Discussatildeo
(42)f
(30)1 I
(7)
2D
(23)1
I mdash l( 2 8 )
r
(49) r (23) r L
i4) I
(18) (23) bull
(28)
(55gt
-Caldelana Caacuterdena Andaluza
Alistano Sanabresa _ _ Rabia Galkga
Minhota Frieiresa
gt Asturiana de los Vallegraves
Asturiana de Ia Montana Barrosatilde
Sayaquesa mdashMorucha
Cachena Limiana
Blanca Cacerena Vianesa
Figura 343 Dendrograma construiacutedo com base nas distacircncias geneacuteticas de NEI (1978) entre 15 raccedilas de bovinos (5 loci HB CAII ALB TF e NP) atraveacutes do meacutetodo de agrupamento NJ Os valores de probabilidade de ocorrecircncia de cada agrupamento obtidos atraveacutes de um teste de bootstrap indicam-se entre parecircntesis
(21)
(18)
(100)
(55)
(15)T r i shyT
C a
(40) |_Caacute
Alistano Sanabresa
(37)
(61)
(46
(29)
^ o i j r mdash
Caldelana Caacuterdena Andaluza
Limiana Vianesa
Rubia Gallega Asturiana de los Vallegraves
(32j~
j2frTL
Frieiresa
Minhota Cachena Morucha
Sayaquesa
Barrosatilde bull Blanca Cacerena
Asturiana de la Montana
Figura 344 Dendrograma construiacutedo com base nas distacircncias geneacuteticas de NEI (1978) entre 15 raccedilas de bovinos (5 loci HB CAII ALB TF e NP) atraveacutes do meacutetodo de agrupamento UPGMA Os valores de probabilidade de ocorrecircncia de cada agrupamento obtidos atraveacutes de um teste de bootstrap indicam-se entre parecircntesis
84
Resultados e Discussatildeo
No seu conjunto estes resultados natildeo satildeo suficientes para o estabelecimento de uma
histoacuteria evolutiva das actuais raccedilas bovinas ibeacutericas nem para a separaccedilatildeo da raccedila Barrosatilde das
restantes Consequentemente natildeo eacute possiacutevel neste momento fazer corresponder a anaacutelise da
diversidade e estrutura geneacutetica das populaccedilotildees ibeacutericas de gado bovino com alguma das
hipoacuteteses evolutivas propostas por diversos autores com base em evidecircncia morfoloacutegica
(VALLEJO 1978 IGLESIAS 1989 CORDEIRO 1986 JORGE 1996)
De acordo com essa evidecircncia a raccedila Barrosatilde (e tambeacutem a Cachena) derivaria do
denominado tronco mauritaacutenico (Bos primigenius opisthonomus) ou seja de populaccedilotildees
originaacuterias do Norte de Aacutefrica que teriam passado para o sul da Peniacutensula Ibeacuterica alcanccedilando
mais tarde o Norte de Portugal e de Espanha Por outro lado a filiaccedilatildeo da raccedila Minhota
segundo JORGE (1996) deriva do tronco aquitacircnico (Bos primigenius primigenius) tal como a
maior parte das raccedilas da Galiza das Astuacuterias e dos Pirineacuteus
Embora os resultados apresentados neste trabalho pareccedilam de facto indicar que as
raccedilas Barrosatilde e Minhota derivam de troncos diferentes eacute necessaacuterio aprofundar de forma
muito consideraacutevel a investigaccedilatildeo sobre a estrutura geneacutetica das raccedilas bovinas ibeacutericas antes de
se poder formular conclusotildees mais sustentadas
85
Con8ideraccedil8es Finais
4 - CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
O trabalho desenvolvido nesta dissertaccedilatildeo permitiu o estudo de alguns sistemas
geneacuteticos polimoacuterficos jaacute descritos em bovinos (HB CAII NP MPI ALB TF e GC) nas
raccedilas Barrosatilde e Minhota Permitiu ainda a aplicaccedilatildeo de teacutecnicas de separaccedilatildeo electroforeacuteticas
mais eficazes em alguns desses sistemas
Vaacuterias limitaccedilotildees durante a execuccedilatildeo praacutetica deste trabalho obrigaram de alguma
forma a alteraccedilotildees no programa inicial Entre elas devem referir-se
1 a recolha de amostras de sangue mostrou-se difiacutecil e demorada sendo necessaacuteria a
coordenaccedilatildeo de esforccedilos de vaacuterias entidades (Direcccedilatildeo Regional de Agricultura de
Entre Douro e Minho e brigadas de Sanidade Animal locais) de veterinaacuterios e de
criadores de bovinos retirando tempo agrave execuccedilatildeo praacutetica do trabalho
2 a afinaccedilatildeo de vaacuterias teacutecnicas electroforeacuteticas para certos marcadores geneacuteticos
envolveu um consideraacutevel esforccedilo de investigaccedilatildeo
3 a impossibilidade de apurar atempadamente as teacutecnicas de separaccedilatildeo ou de
visualizaccedilatildeo para a amilase a ceruloplasmina e a poacutes-transferrina
4 a escassa bibliografia sobre o bovino Barrosatilde e sobre as teacutecnicas utilizadas neste
trabalho em gado bovino
Apesar das limitaccedilotildees considera-se que este trabalho se reveste de alguma importacircncia
pelo facto de constituir um contributo para a caracterizaccedilatildeo geneacutetica de uma raccedila bovina muito
peculiar A este respeito entendeu-se que numa primeira fase se procederia ao estudo de um
conjunto de proteiacutenas polimoacuterficas de forma a poder iniciar uma comparaccedilatildeo com outras raccedilas
bovinas nomeadamente ibeacutericas para as quais jaacute existem resultados publicados Por outro
86
Consideraccedilotildees Finais
lado o estabelecimento de um conjunto de teacutecnicas de fenotipagem dos loci considerados
permite desde logo a sua aplicaccedilatildeo em questotildees de identificaccedilatildeo individual e de anaacutelise da
paternidade
Eacute contudo evidente que o aprofundamento deste trabalho deveraacute necessariamente
evoluir na direcccedilatildeo da anaacutelise molecular da variaccedilatildeo geneacutetica Adicionalmente seraacute do maior
interesse alargar o domiacutenio de investigaccedilatildeo agraves restantes raccedilas bovinas autoacutectones
Em face do exposto entende-se ser possiacutevel definir trecircs linhas de investigaccedilatildeo para os
proacuteximos anos
1 - ampliaccedilatildeo da bateria de sistemas geneacuteticos polimoacuterficos detectados em proteiacutenas do
sangue e do leite
2 - anaacutelise da variabilidade geneacutetica de um conjunto de microssateacutelites se possiacutevel
associados a algumas das proteiacutenas polimoacuterficas jaacute descritas
3 - estudo do polimorfismo da moleacutecula de DNA-mitocondrial
De uma forma geral pode assim considerar-se que os principais objectivos definidos
no iniacutecio deste trabalho foram alcanccedilados pelo que se apresentam em seguida as conclusotildees
87
Conclusotildees
5 - CONCLUSOtildeES
A utilizaccedilatildeo de um sistema de focagem isoeleacutectrica permitiu detectar a existecircncia de
polimorfismo geneacutetico na hemoglobina distinguindo-se dois produtos geacutenicos na raccedila bovina
Minhota HBA e HBB Na raccedila Barrosatilde HBA foi o uacutenico produto geacutenico encontrado
A utilizaccedilatildeo de um sistema de focagem isoeleacutectrica permitiu a detecccedilatildeo de dois
produtos geacutenicos no locus CAII (CAIPF e CAIPS) e revelou-se mais eficaz de que as
teacutecnicas de separaccedilatildeo convencional em gel de amido
A investigaccedilatildeo realizada permitiu detectar a ocorrecircncia de polimorfismo geneacutetico de
MPI atraveacutes de um sistema electroforeacutetico em gel de amido tendo-se detectado trecircs produtos
geacutenicos (MPIA MPIB e MPIC) A fraca actividade de MPI e a grande dificuldade na
obtenccedilatildeo de um contraste de bandas adequado poderaacute dever-se ao facto de a sua expressatildeo soacute
ocorrer na fracccedilatildeo leucocitaacuteria do sangue
A aplicaccedilatildeo de um sistema de focagem isoeleacutectrica na presenccedila de ureia (8M) revelou-
-se muito eficaz na separaccedilatildeo de ALB e permitiu detectar pela primeira vez um novo variante
ALBV ligeiramente mais aciacutedico do que ALBA
A combinaccedilatildeo de uma teacutecnica de focagem isoeleacutectrica com um preacutevio tratamento das
amostras a fim de saturar a moleacutecula de TF com Fe permitiu a detecccedilatildeo de quatro produtos
geacutenicos (TF A TFD1 TFD2 e TFE) nas raccedilas estudadas
88
Conclusotildees
A combinaccedilatildeo de uma teacutecnica de focagem isoeleacutectrica com a detecccedilatildeo por
immunoblotting permitiu detectar dois produtos geacutenicos no locus GC (GCA e GCB) O
tratamento de amostras com neuraminidase permitiu a obtenccedilatildeo de padrotildees mais simples do
que os conseguidos com amostras nativas Esta simplificaccedilatildeo resulta da provaacutevel remoccedilatildeo de
aacutecidos siaacutelicos ligados agrave moleacutecula de GC
Natildeo se detectou nenhum caso de exclusatildeo na anaacutelise de segregaccedilatildeo de 27 pares
matildeefilho feita separadamente para cada locus
Verifiacutecou-se a presenccedila de dois alelos raros HBB e PEPB1 na raccedila Minhota Estes
alelos poderatildeo ser utilizados na distinccedilatildeo das duas raccedilas estudadas
Foi encontrado um valor de heterozigotia meacutedia de 0237 em populaccedilotildees de raccedila
Barrosatilde indicativo de uma variabilidade geneacutetica intermeacutedia em relaccedilatildeo agrave generalidade das
raccedilas ibeacutericas As diferenccedilas observadas entre as vaacuterias raccedilas ibeacutericas poderatildeo reflectir
fenoacutemenos histoacuterico-evolutivos muito recentes dada a sua proximidade e grande semelhanccedila
Foi observado um reduzido niacutevel de diferenciaccedilatildeo entre as raccedilas Barrosatilde e Minhota
(FST= 0031) demonstrando-se que a maior parte da diversidade geneacutetica se atribui a diferenccedilas
intrapopulacionais Este valor de FST pode considerar-se baixo quando comparado com o
obtido no estudo de outras espeacutecies animais sugerindo um elevado fluxo geacutenico
interpopulacional Por outro lado reflecte ainda uma histoacuteria demograacutefica muito recente
A utilizaccedilatildeo de meacutetodos de agrupamento NJ e UPGMA obtidos a partir de matrizes de
distacircncias geneacuteticas de Nei natildeo permitiu separar a raccedila Barrosatilde das restantes raccedilas ibeacutericas
89
Referecircncias Bibliograacuteficas
6 - REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
AMORIM A (1983) Contribuiccedilatildeo para o conhecimento da Geneacutetica Humana Estudo de Geneacutetica Bioquiacutemica
Formal e Populacional e de Ligaccedilatildeo Factorial Tese de Doutoramento Faculdade de Ciecircncias do
Porto
AMORIM A KOMPF J SCHUNTER F amp RITTER H (1982) Aminolevulinate dehydratase (EC42124)
Linkage analysis Hum Genet 61 48-49
ANSAY M (1973) Techniques microelectrophoretiques dans lanalyse de la multipliciteacute enzymatique chez les
bovins Deacutetection Eacutelectrophoreacutetique des Polymorphismes Biochimiques Chez les Mammifegraveres
Application a LEacutetude Geacuteneacutetique des Populations Centre National de la Recherche Scientifique
Paris 43-58
ARANA A pound amp ZARAGOZA P (1986) Nueva electroforetica dei enzima NADH-Diafrosa (DIA-2) detectada
en la espeacutecie Oryctolagus cuniculus (L) Zootecnia XXXV ndeg 7-12 125-130
ARAUacuteJO J (1986) Contribuiccedilatildeo para o estudo dos bovinos de raccedila Barrosatilde Relatoacuterio de estaacutegio da
licenciatura em Engenharia Zooteacutecnica Universidade dos Accedilores
ARNOLD I C J amp Bouw J (1989) A new allele of glucose phosphate isomerase in dogs Animal Genetics
20 217-220
ARRANZ J J BAYON Y amp SAN PRIMITIVO F (1992) Biochemical polymorphisms in Spanish Avilena-
-Negra Ibeacuterica cattle Animal Genetics 23 (suppl 1) 19
ARRANZ J J BAYON Y amp SAN PRIMITIVO F (1996) Comparison of protein markers and microsatellites in
differentiation of cattle populations Animal Genetics 27 415-419
ASHTON G C (1965) Cattle serum transferrins A balanced polymorphism Genetics 52 983-997
90
Referecircncias Bibliograacuteficas
BAINES J amp MEacuteLEK J (1980) Egipto - Deuses Templos e Faraoacutes Grandes Culturas e Civilizaccedilotildees Ciacuterculo
de Leitores
BELL K ARTHUR H amp ANDERSON I L (1994) Esterase and albumin polymorphism in the domestic cat
(Felis catus) XXIV International Conference on Animal Genetics Praga Julho 1994
BEKENEV V A amp ORLOVA G V (1991) Polymorphism of erytrocytic enzymes in Large White pig breeds in
Siberia Animal Genetics 22 (suppl 1) 23-24
BOWLING A T amp CLARK R S (1988) Excess of heacuteteacuterozygotes at albumin locus in American Standardbred
horses Animal Genetics 19 331-341
BOWLING A T GORDON L PENEDO M C T WICTUM E amp BEEBOUT J (1990) A single gel for
determining genetic of equine erythrocyte carbonic anhydrase (CA) and catalase (Cat) Animal
Genetics 21 191-197
BRADLEY D G MACHUGH D E CUNNINGHAM P amp LOFTUS R T (1996) Mitochondrial diversity and
the origins of African and European cattle Proceeding of the National Academy of Sciences of USA
93 5131-5135
BRAEND M (1971) Studies on the relationships between cattle breeds in Africa Asia and Europe Evidence
obtained by studies of blood groups and protein polymorphisms World Review of Animal Production
VIO (1) 10-14
BRAEND M (1988) Haemoglobin polymorphism in Norwegian Red Cattle Animal Genetics 19 59-62
BRAEND M NESSE 1 L amp EFREMOV G D (1988) Expression and genetics of caprine haemoglobins
Animal Genetics 18 223-231
BROWN L B KANE H amp AYRES H (1993) Vital signs WW Norton e Co pp 323 New York
CARTER D C HE X M MUNSON S EL TWIGG P D GERNERT K M BROOM M B amp MILLER T
Y (1989) Three dimensional structure of human serum albumin Science 244 1195-1198
CECCHINI G amp Nus M D (1986) Literature review on cattle blood polymorphisms and preliminary results
of analysis in East African Zebu in Ethiopia Agric Subtrop and Ttropicale 3 (80) 433-463
91
Referocircicias Bibliograacuteficas
CiacuteZovAacute D STRATIL A MULLER E amp CEPICA S (1993) A new partially deficient transferrin variant in
the pig Animal Genetics 24 305-306
CLARKE S W TUCKER E M amp OSTERHOFF D R (1989) Blood groups and biochemical polymorphism
in the Namaqua sheep breed Animal Genetics 20 279-286
CLUTTON-BROCK J (1992) Domestication of animals In Jomes S Martin R Pilbeam D (eds) The
Cambridge Encyclopedia of Human Evolution pp 380-385 Cambridge University Press
CORDEIRO J P (1986) As raccedilas bovinas em Portugal - Sua Origem O meacutedico veterinaacuterio I (1) 29-39
CRISTOFALO G Cozzi M C amp VALIATI P (1992) Identification of a new variant in the equine serum
alB-glycoprotein (A1B) system Animal Genetics 23 (suppl 1) 24
CUNHA L M (1994) Caracterizaccedilatildeo Morfo-Funcional e Geneacutetica da Raccedila Bovina Alentejana Trabalho de
fim de curso apresentado agrave Escola Superior Agraacuteria de Beja
DEL LAMA S N DEL LAMA M A MESTRINER M A amp MORTARI N (1992) Peptidase B polymorphism
in cattle erythrocytes Biochem Genet 30 247-255
DRATCH P TATE M KRAAY G J amp GERWING V (1992) Plasma proteins differentiating European red
deer and North American elk Animal Genetics 23 (suppl 1) 32
EGGEN A amp FRIES R (1995) An integrated cytogenetic and meiotic map of the bovine genome Animal
Genetics 26 215-236
ERHARDT G (1986) Transferrin variants in sheep separation and characterization by polyacrylamide gel
electrophoresis and isoelectric focusing Animal Genetics 17 343-352
ERHARDT G (1991) Genetic polymorphism of vitamin D binding protein and serum albumin in sheep
Animal Genetics 22 (suppl 1) 28-29
ERHARDT G amp SIMIANER H (1993) Linkage between the loci for serum albumin and vitamin D binding
protein (GC) in sheep Animal Genetics 24 301-303
EPSTEIN H amp MASON I L (1984) Cattle In Mason I L (ed) Evolution of domesticated animals pp 7-
-27 Longman
92
Referecircncias Bibliograacuteficas
FAO (1993) A diversidade da Natureza Um patrimoacutenio valioso Documento produzido pela FAO Divisatildeo de
informaccedilatildeo - Out de 1993 Veterinaacuteria Teacutecnica 10 10-12
FAO (1996) World Watch List for Domestic Animal Diversity 2a ediccedilatildeo FAOUNEP pp 334 Roma
FARNDALE B M HUBBARD D E amp ANDERSON L L (1992) A new PGD variant in New Zeland
Thoroughbred horses Animal Genetics 23 (suppl 1) 24
FELSENSTEIN J (1993) PHYLIP (Phylogeny Inference Package) Version 35 Distributed by the autor Seattle
University of Washington
FERNANDES M T S (1996) Raccedilas de bovinos autoacutectones Um importante recurso geneacutetico animal portuguecircs
a preservar e a defender Veterinaacuteria Teacutecnica 12 10-15
FERRAND N (1995) Variaccedilatildeo geneacutetica de proteiacutenas em populaccedilotildees de coelho (Oryctolagus cuniculus) -
- Anaacutelise da diferenciaccedilatildeo subespecifica subestruturaccedilatildeo expansatildeo geograacutefica e domesticaccedilatildeo
Dissertaccedilatildeo de Doutoramento em Biologia apresentada agrave Faculdade de Ciecircncias da Universidade do
Porto
FERRAND N amp ROCHA J (1991) Genetic polymorphism of serum albumin in wild rabbits populations
Animal Genetics 22 (suppl 1) 36
FORBES P MACKEITH B amp PEBERDY R (1986) Mamiacuteferos Ungulados e Lagomorfos Ciacuterculo de Leitores
FRIES R EGGEN A amp WOMACK J E (1993) The bovine genome map Mammalian Genome 4 405-428
GAHNE B(1963) Inherited variation in the post-albumin of cattle serum Hereditas 50126-135
GAHNE B JUNEJA R K amp GROLMUS J (1977) Horizontal polyacrylamine gel electrophoresis for the
simultaneous phenotyping of transferrin post-transferrin albumin and post-albumin in the blood
plasma of cattle Arum Bid Grps Biochem Genet 8127-137
GARCIA L S VICENTE M V BECERRA A L YEBRA F A RODRIcircGUES M F amp LOacutePEZ J M S
(1992) Razas Bovinas Autoacutectonas de Galicia - I Razas Morenas Galegas (Recursos Xeneacuteticos a
Conservar) Xunta de Galicia
GARCIA M ROSAacuteRIO J amp ANTUNES M (1981) Bovinos em Portugal Direcccedilatildeo dos Serviccedilos Veterinaacuterios -
- DGSV pp 44-78 Lisboa
93
Referecircncias Bibliograacuteficas
GLOWATZKI-MULLIS M L GAILLARD C WIGGER G amp FRIES R (1995) Microsatellite-based
parentage control in cattle Animal Genetics 26 7-12
GONCcedilALVES GARCIA M L (1964) A Raccedila Bovina Barrosatilde Boletim Pecuaacuterio n deg 1 Ano XXXII DGSP
pp 103-172 Lisboa
GONZALEZ P TUNON MJ amp VALLEJO M (1987) Genetic relationships between Spanish native breeds of
cattle Animal Genetics 18 249-256
HALL S B L COTHRAN E G amp KING J A (1991) Variability of manosephosphate isomerase (MPI)
from haemolysate in 14 horse breeds Animal Genetics 22 (suppl 1) 22
HARRIS H amp HOPKINSON D A (1976) Handbook of enzyme electrophoresis in human genetics North-
-Holland Publishers
HEMMER H (1990) Domestication The decline of environmental appreciation Cambridge University Press
HERZOG S (1988) Polymorphism and genetic control of erythrocyte 6-phosphogluconate dehydrogenase in
the genus Cervus Animal Genetics 19 291-294
HERZOG S (1989) Genetic polymorphism of transferrin in fallow deer Cervus dama L Animal Genetics 20
421-426
IGLESIAS A B (1989) Estrutura y relaciones geneacuteticas de razas bovinas mediante marcadores geneacuteticos
(Polimorfismos Bioquiacutemicos) Dissertaccedilatildeo de Doutoramento em Biologia apresentada agrave Faculdade de
Biologia da Universidade de Santiago
JAMIESON A (1965) The genetics of transferrins in cattle Heredity 20 419-441
JANZEN M K amp COTHRAN E G (1991) A new PGD variant from North American horses of feral origin
Animal Genetics 22 (suppl 1) 21-22
JORGE E S (1996) Bovinos da raccedila Minhota Contribuiccedilatildeo para a sua histoacuteria Veterinaacuteria Teacutecnica 10 10-
-18
94
Referecircncias Bibliograacuteficas
JUNEJA R K GAHNE B amp STRATIL A (1987) Polymorphic plasma postalbumins of some domestic
animals (pig Po2 horse XK and dog Pa proteins) identified as homologous Animal Genetics 18 119-
-124
JUNEJA R K KURYL J GAHNE B amp ZURKOWSKI M (1989) Linkage between the loci for transferrin
and ceruloplasmin in pigs Animal Genetics 20 307-311
KALAB P STRATIL A amp GLASNAacuteK V (1990) Genetic polymorphism of serum vitamin D-binding protein
(GC) in sheep and mouflon Animal Genetic 21 317-321
KAWAGUCHI T (1973) Polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of serum albumin into three
bands Clinica ChimicaActa 45 85-92
KIDD K K STONE W H CRIMELLA C CARENZI C CASATI M amp ROGNONI G (1980)
Immunogenetic and population genetic analyses of Iberian cattle Anim Blood Grps Biochem Genet
11 21-38
KRISTJANSSON F K (1963) Genetic control of two pre-albumins in pigs Genetics 48 1059-1063
KRISTJANSSON F K amp HICKMAN C G (1965) Subdivision of the allele TF D for transferrins in Holstein
and Ayrshire cattle Genetics 52 627-630
KUROSAWA Y amp TANAKA K (1988) Electrophoretic variants of serum transferrin in wild pig populations of
Japan Animal Genetics 19 31-35
LEAL C (1995) Apreciaccedilatildeo fenotiacutepica de um nuacutecleo de bovinos de raccedila Barrosatilde e amostragem para sua
caracterizaccedilatildeo geneacutetica Relatoacuterio de estaacutegio de licenciatura em Biologia - Ramo Cientiacutefico
Tecnoloacutegico em Ecologia e Recursos Zooloacutegicos Faculdade de Ciecircncias da Universidade do Porto
LITT M amp LUTTY J A (1989) A hipervariable microsatellite revealed by in vitro amplification of a
dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene American Jornal of Human Genetics 44
397-401
LOFTUS R T MACHUGH D E NGERE L O BALAIN D S BADI A M BRADLEY D G amp
CUNNINGHAM E P (1994a) Mitochondrial genetic variation in European African and Indian cattle
populations Animal Genetics 25 265-271
95
Referecircncias Bibliograacuteficas
LOFTUS R T MACHUGH B E BRADLEY B G SHARP P M amp CUNNINGHAM P (1994b) Evidence
for two independent domestications of cattle Proceeding of the National Academy of Sciences of USA
91 2757-2761
MACHUGH D E LOFTUS R T BRADLEY B G SHARP P M amp CUNNINGHAM P (1994)
Microsatellite DNA variation and among European cattle breeds Proceedings of the Royal Society of
London B 256 25-31
MACHUGH B E SHRIVER M B LOFTUS R T CUNNINGHAM P amp BRADLEY B G (1997)
Microsatellite DNA Variation and the Evolution Domestication and Phylogeography of taurine and
zebu cattle (Bos taunts and Bos indicus) Genetics 146 1071-1086
MARTINS R (1982) Conservaccedilatildeo e melhoramento dos bovinos de raccedila Barrosatilde Relatoacuterio de estaacutegio de
licenciatura em Produccedilatildeo Animal Instituto Universitaacuterio de Traacutes-os-Montes e Alto Douro
MIRANDA DO VALE J (1949) Gado Bissulco Livraria Saacute da Costa Lisboa
MORAIS M L (1992) Estudo Desenvolvimento e Optimizaccedilatildeo de Teacutecnicas de Separaccedilatildeo e Detecccedilatildeo
Especiacutefica de Proteiacutenas Dissertaccedilatildeo de Mestrado em Biologia Celular apresentada agrave Faculdade de
Ciecircncias da Universidade de Coimbra
NEI M (1978) Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small number of individuals
Genetics 89 583-590
NICHOLS E A CHAPMAN V M amp RUDDLE F H (1973) Polymorphism and linkage for
Mannosephosphate isomerase in Mus musculus Biochem Genet 8 47-53
NOBRE J M (s data) Caracterizaccedilatildeo geneacutetica da raccedila bovina Mirandesa Trabalho de fim de curso
efectuado na Estaccedilatildeo Nacional de Selecccedilatildeo e Reproduccedilatildeo Animal Curso de Engenharia Zooteacutecnica da
Universidade de Eacutevora
PENEDO M C T FOWLER M E BOWLING A T ANDERSON B L amp GORDON L (1988) Genetic
variation in the Wood of llamas Llama glama and alpaca Llama pacos Animal Genetics 19 267-
-276
PENEDO M C T amp JUNEJA R K (1989) Polymorphic plasma postalbumin (PO) of llamas and alpacas
identified as GC Protein Animal Genetics 20 221-223
96
Referecircncias Bibliograacuteficas
PENHALLOW R C MASON A B amp WOODWORTH R C (1991) Electrophoretic characterization of
human equine and bovine transferrins Comp Biochem Physiol 98B 41-45
PEREIRA A A (1997) Caracterizaccedilatildeo Geneacutetica de Algumas Subpopulaccedilotildees de Truta de Rio Salmo trutta L
da Bacia Hidrograacutefica do Rio Lima Dissertaccedilatildeo de Mestrado em Ecologia Aplicada apresentada agrave
Faculdade de Ciecircncias da Universidade do Porto
PIEDRAFITA J TEJEDOR M T amp ZARAGAZA L (1984) Post-Albuminas y Post-Transferrinas en
poblaciones bovinas Espafiolas Frisona y De Lidia Comunicacioacuten Presentada A La 34deg Reunion
Anual De La Federacioacuten Europea de Zootecnia 114-121
POVEY S CORNEY G LEWIS W H P ROBSON E B PARRINGTON J M amp HARRIS H (1972) The
genetics of peptidase C in man Ann Hum Genet 35 455-465
PRETSCH W amp MERKLE S (1990) Glucose Phosphate Isomerase Enzyme - Activity Mutants in Mus
musculus Genetical and Biochemical Characterization Biochemical Genetics 28 97-110
RASERO R D I STASIO L amp BERRA G P (1993) Polymorphism of erythocyte glucosephosphae isomerase
in sheep Animal Genetics 24 63-64
RITTER EL FRIEDRICHSON U amp SCHMITT J (1974) Genetic variation of Manose phosphate isomerase in
Man Humangenetik 22 261
RITTER H amp SCHMITT J (1973) Genetic polymorphism of Manose phosphate isomerase in Primates
Humangenetik 19 325-326
ROCHA J KOtildeMPF J FERRAND N AMORIM A amp RITTER H (1991) Separation of human alloalbumin
variants by isoelectric focusing Electrophoresis 12 313-314
ROGERSON J (1991) Biacuteblia- Os Caminhos de Deus Grandes Culturas e Civilizaccedilotildees Ciacuterculo de Leitores
RON M BAND M YANAI A amp WELLER J L (1994) Mapping quantitative trait loci with DNA
microsatellites in a commercial dairy cattle population Animal Genetics 25 259-264
RUSSEL G (1996) The analysis of genetic diversity in cattle to preserve future breeding options (Online)
Available http wwwribbsrcacukcdiv_wwwinformhtm (1996 November 29)
97
Referecircncias Bibliograacuteficas
SAITOU N amp NEI M (1987) The neighbor-joining method a new method for reconstructing phylogenetic
trees Mol Biol Evol 4 406-425
SANTOS O C M (1995) Caracterizaccedilatildeo Geneacutetica de Populaccedilotildees de Lebre Ibeacuterica (Lepus granatensis) e
Lebre Europeia (Lepus europaeus) - Aspectos Bioquiacutemicos e Populacionais Dissertaccedilatildeo de Mestrado
em Ecologia Aplicada apresentada agrave Faculdade de Ciecircncias da Universidade do Porto
SARAIVA J A (1993) Histoacuteria de Portugal Publicaccedilotildees Europa-Ameacuterica
SARTORE G STORMONT C MORRIS B G amp GRUNDER A A (1969) Multiple electrophoretic forms of
Carbonic Anhydrase in red cells of domestic cattle (Bos taurus) and American buffalo (Bison bison)
Genetics 61823-831
SCHNEIDER H SCHNEIDER M P C SILVA B T F amp SALZANO F M (1990) Transferrin and albumin
polymorphisms in buffaloes from Brazil Animal Genetics 21 335-337
SEATH P H A amp SOKAL R R (1973) Numeric Taxonomy W H Freeman amp Co
SELVARAJ O S MUKHERJEE T K DHALIWAL S S TAN S G amp BARKER J S F (1991) Biochemical
polymorphisms in the local goats of South-East Asia Animal Genetics 22 (suppl 1) 32
STERN C M MILLER S A amp SCHANFIELD M S (1992) Differentiation of wapiti and Eurasian red deer
by isoelectric focusing electrophoresis of GC on agarose gels Animal Genetics 23 (suppl 1) 23
STORMONT C amp SUZUKI Y (1963) Genetic control of albumin phenotypes in horses Proceeding of the
Society for Experimental Biology and Medicine 144 673-675
STRATIL A GLASNAacuteK V BOBAacuteK P CiacutezovAacute D GAacuteBRISOVAacute E amp KALAB P (1990) Variation of some
serum proteins in red deer Cervus elaphus L Animal Genetics 21 285-293
SWOFFORD D L amp SELANDER R B (1989) BIOSYS-1 A computer program for the analysis of allelic
variation in population genetics and biochemical systematics Release 17 Illinois Natural History
Survey
TASHIAN R E (1989) The carbonic anhydrases widening perspectives on their evolution expression and
function BioEssays 10 186-192
98
Referecircncias Bibliograacuteficas
TASHIAN R E amp CARTER N D (1976) Biochemical Genetics of Carbonic Anhydrase In Harris H (ed)
Advances in Human Genetics 7 1-56 Plenum
TATE M L amp MCEWAN K M (1992) Genetic polymorphism of erytrocyte diaphorase in red deer Cervus
elaphusL Animal Genetics 23 449-452
TSUJI S SAOAMITSU Y amp GOTO N (1989) Ultrathin-leyer isoelectric focusing for bovine serum
transferrin phenotyping Biochem Genet 27 425-429
TUCKER E M amp YOUNG J D (1988) Genetic control of red-cell nucleoside transport and its association
with the B blood-group locus and nucleoside phosphorylase activity in sheep Biochem Genet 26 489-
-501
TUNON M J GONZALEZ P amp VALLEJO M (1989) Genetic relationships between 14 native Spanish
breeds of goat Animal Genetics 20 205-212
USHA A P (1996) Cattle diversity by blood typing (Online) Available http
wwwribbsrcacukcdiv_wwwinfobhtm ( 1996)
USHA A P SIMPSON S P amp WILLIAMS J L (1995) Probability of random sire exclusion using
microsatellite markers for parentage verification Animal Genetics 26 155-161
VANDEBERG J amp AIVALIOTIS M (1990) Mannose-6-phosphate isomerase polymorphism in baboon
erythrocytes Biochemical Genetics 28 495-501
VAN DE WEGHE A VAN ZEVEREN A amp BOUQUET Y (1982) The vitamin D binding protein in domestic
animals Comp Biochem Physiol 73B 977-982
VAN DE WEGHE A YABLANSKI T S VAN ZEVEREN A amp BOUQUET Y (1988) A third variant of glucose
phosphate isomerase in pigs Animal Genetics 19 55-58
VANKAN D M amp BELL K (1992 a) A new allele in Australian goats Animal Genetics 23 453-456
VANKAN D M amp BELL K (1992 b) Genetic polymorphism of vitamin D-binding protein (GC) in Australian
goats Animal Genetics 23 457-462
VICENTE M V (1978) Razas vacunas autoacutectonas en vias de extincioacuten (Aportaciones al estuacutedio geneacutetico)
Fundacioacuten Juan March Serie Universitaacuteria LXK 10-51
99
Referecircncias Bibliograacuteficas
VIEIRA J (1993) Utilizaccedilatildeo de marcadores geneacuteticos na caracterizaccedilatildeo e certificaccedilatildeo de populaccedilotildees
domeacutesticas e selvagens de coelho (Oryctolagus cunicuius) Dissertaccedilatildeo de Mestrado apresentada agrave
Faculdade de Ciecircncias da Universidade do Porto
VIEIRA J amp FERRAND N (1995) Four new alleles at the mannose-6-phosphate isomerase locus in rabbit
Animal Genetics 26 37-38
WANG S FOOTE W C amp BUNCH T D (1990) Transferrin and haemoglobin polymorphism in
domesticated goats in the USA Animal Genetics 21 91-94
WEBER J L amp MAY P E (1989) Abundant class of human DNA polymorphisms which can be typed using
the polymerase chain reaction American Jornal of Human Genetics 44 388-396
WELCHS S (1990) A comparison of the structure and properties of serum transferrin from 17 animal species
Comp Biochem Physiol 97 B (3) 417-427
100
ANEXO
Anexos
RESUMO E CONCLUSOtildeES
Neste trabalho apresenta-se uma contribuiccedilatildeo para o estudo geneacutetico da raccedila bovina Barrosatilde e de uma outra raccedila (Minhota) atraveacutes da anaacutelise da variaccedilatildeo geneacutetica de proteiacutenas detectada pela utilizaccedilatildeo de sistemas electroforeacuteticos convencionais e por focagem isoeleacutectrica
Definiram-se os seguintes objectivos fundamentais
1 estudo da variabilidade geneacutetica da raccedila Barrosatilde ao niacutevel das proteiacutenas eritrocitaacuterias e plasmaacuteticas 2 desenvolvimento e afinaccedilatildeo de teacutecnicas de separaccedilatildeo de proteiacutenas por electroforese e focagem
isoeleacutectrica e sua detecccedilatildeo especiacutefica (histoquiacutemica e imunoloacutegica) 3 anaacutelise familiar dos polimorfismos encontrados 4 avaliaccedilatildeo do grau de diferenciaccedilatildeo geneacutetica existente entre a raccedila Barrosatilde e outras raccedilas bovinas
Escolheu-se um conjunto de 12 sistemas geneacuteticos (sete dos quais se revelaram polimoacuterficos) que pudesse satisfazer os objectivos fundamentais do trabalho
Assim apoacutes desenvolvimento de teacutecnicas de separaccedilatildeo para os sistemas geneacuteticos considerados procedeu-se a uma anaacutelise familiar baseada nos polimorfismos encontrados nas populaccedilotildees de raccedila Barrosatilde ao estudo de distribuiccedilatildeo populacional dos fenoacutetipos das duas raccedilas estudadas e de outras raccedilas bovinas da Europa (principalmente da Peniacutensula Ibeacuterica)
Com base neste trabalho obtiveram-se as seguintes conclusotildees
bull a utilizaccedilatildeo de um sistema de focagem isoeleacutectrica permitiu detectar a existecircncia de polimorfismo geneacutetico na hemoglobina distinguindo-se dois produtos geacutenicos na raccedila bovina Minhota HBA e HBB Na raccedila Barrosatilde HBA foi o uacutenico produto geacutenico encontrado
bull a utilizaccedilatildeo de um sistema de focagem isoeleacutectrica permitiu a detecccedilatildeo de dois produtos geacutenicos no locus CAII (CAIIF e CAIPS) e revelou-se mais eficaz de que as teacutecnicas de separaccedilatildeo convencional em gel de amido
bull a investigaccedilatildeo realizada permitiu detectar a ocorrecircncia de polimorfismo geneacutetico de MPI atraveacutes de um sistema electroforeacutetico em gel de amido tendo-se detectado trecircs produtos geacutenicos (MPIA MPIB e MPIC) A fraca actividade de MPI e a grande dificuldade na obtenccedilatildeo de um contraste de bandas adequado poderaacute dever-se ao facto de a sua expressatildeo soacute ocorrer na fracccedilatildeo leucocitaacuteria do sangue
bull a aplicaccedilatildeo de um sistema de focagem isoeleacutectrica na presenccedila de ureia (8M) revelou-se muito eficaz na separaccedilatildeo de ALB e permitiu detectar pela primeira vez um novo variante ALBV ligeiramente mais aciacutedico do que ALB A
bull a combinaccedilatildeo de uma teacutecnica de focagem isoeleacutectrica com um preacutevio tratamento das amostras a fim de saturar a moleacutecula de TF com Fe permitiu a detecccedilatildeo de quatro produtos geacutenicos (TFA TFD1 TFD2 e TFE) nas raccedilas estudadas
bull a combinaccedilatildeo de uma teacutecnica de focagem isoeleacutectrica com a detecccedilatildeo por immunoblotting permitiu detectar dois produtos geacutenicos no locus GC (GCA e GCB) O tratamento de amostras com neuraminidase permitiu a obtenccedilatildeo de padrotildees mais simples do que os conseguidos com amostras nativas Esta simplificaccedilatildeo resulta da provaacutevel remoccedilatildeo de aacutecidos siaacutelicos ligados agrave moleacutecula de GC
bull natildeo se detectou nenhum caso de exclusatildeo na anaacutelise de segregaccedilatildeo de 27 pares matildeefilho feita separadamente para cada locus
bull verificou-se a presenccedila de dois alelos raros HBB e PEPB1 na raccedila Minhota Estes alelos poderatildeo ser utilizados na distinccedilatildeo das duas raccedilas estudadas
I
Anexos
bull foi encontrado um valor de heterozigotia meacutedia de 0237 em populaccedilotildees de raccedila Barrosatilde indicativo de uma variabilidade geneacutetica intermeacutedia em relaccedilatildeo agrave generalidade das raccedilas ibeacutericas As diferenccedilas observadas entre as vaacuterias raccedilas ibeacutericas poderatildeo reflectir fenoacutemenos histoacuterico-evolutivos muito recentes dada a sua proximidade e grande semelhanccedila
bull foi observado um reduzido niacutevel de diferenciaccedilatildeo entre as raccedilas Barrosatilde e Minhota (FST = 0031) demonstrando-se que a maior parte da diversidade geneacutetica se atribui a diferenccedilas intrapopulacionais Este valor de FST pode considerar-se baixo quando comparado com o obtido no estudo de outras espeacutecies animais sugerindo um elevado fluxo geacutemeo interpopulacional Por outro lado reflecte ainda uma histoacuteria demograacutefica muito recente
bull a utilizaccedilatildeo de meacutetodos de agrupamento NJ e UPGMA obtidos a partir de matrizes de distacircncias geneacuteticas de Nei natildeo permitiu separar a raccedila Barrosatilde das restantes raccedilas ibeacutericas
II
Anexos
Tabela A Frequecircncias geacutenicas para os vaacuterios sistemas polimoacuterficos encontrados na raccedila Barrosatilde (indiviacuteduos inscritos e natildeo inscritos) utilizadas na anaacutelise familiar
LOCUS ALELOS FREQUEcircNCIA GEacuteNICA
CAII 294 035
065
NP 294 H
L
024
076
MPI 290 A
B
C
000
098
002
ALB 294 A
B
V
097
002
001
TF 294 A
Dl
D2
E
057
016
023
004
GC 294 083 017
TTI
Introduccedilatildeo
Figura 111 Pintura rupestre nas paredes de grutas em Lascaux Franccedila Datando de haacute cerca de 15000 anos Reproduzido de FORBES (1986)
Soacute mais tarde surge a evidecircncia de que o processo de domesticaccedilatildeo se poderaacute ter
iniciado De facto alguns achados neoliacuteticos (8000 a 5500 anos aC) provenientes da
Anatoacutelia parecem indicar a presenccedila de animais jaacute domesticados Esta regiatildeo do Sudoeste
Asiaacutetico poderaacute assim constituir o centro de domesticaccedilatildeo do gado bovino a partir de
populaccedilotildees selvagens da subespeacutecie asiaacutetica do auroque (Bos primigenius namadicus)
(EPSTEIN amp MASON 1984)
Outra evidecircncia adicional eacute fornecida pela descoberta de ossos e dentes de um animal
sensivelmente mais pequeno do que o auroque (Iraque 5000 anos aC) bem como por um
primeiro testemunho escrito onde se descreve em placas de argila uma cabeccedila de vaca
(Mesopotacircmia 5000 anos aC) (ROGERSON 1991)
Muitos outros achados arqueoloacutegicos e paleontoloacutegicos foram encontrados na
Mesopotacircmia (4000 anos aC) e no vale do rio Nilo (4000 anos aC) mostrando um bovino
totalmente domesticado e de longos cornos (EPSTEIN amp MASON 1984)
A consolidaccedilatildeo do processo de domesticaccedilatildeo eacute a partir desta altura inquestionaacutevel
tornando-se abundantes os registos de bovinos domesticados na Mesopotacircmia e vale do Nilo
A este respeito devem referir-se especialmente as numerosas esculturas relevos pinturas e
textos em papiro que relatam pormenores da vida quotidiana do povo egiacutepcio e onde aparecem
diversas cenas que mostram a importacircncia do gado bovino na agricultura e na alimentaccedilatildeo
(figura 112)
5
Introduccedilatildeo
Figura 112 Desenho ilustrativo de uma ordenha 5a dinastia Reproduzido de BAINES
amp MEacuteLEK (1980)
A partir desta altura as descobertas arqueozooloacutegicas satildeo testemunho de uma
expansatildeo do gado bovino Assim existem registos datados de haacute cerca de 2000 e 3000 anos
aC que sugerem a ocorrecircncia no Norte de Aacutefrica de animais de enormes cornos em forma de
lira (EPSTEIN amp MASON 1984)
Tal expansatildeo daacute-se tambeacutem pela Turquia indo ateacute ao Caacuteucaso e agrave Ruacutessia e chega
tambeacutem agrave Europa onde nas regiotildees do Norte foram encontrados objectos de arte da idade do
Cobre e do Bronze que representam bovinos e datam do iniacutecio do Cristianismo (EPSTEIN amp
MASON 1984)
A migraccedilatildeo para oriente estaacute tambeacutem bem documentada atraveacutes de numerosos restos
arqueozooloacutegicos descobertos em toda a Aacutesia Eacute contudo nesta regiatildeo geograacutefica que se
pode observar a transiccedilatildeo de gado bovino sem bossa (Bos taurus) para outro com bossa (Bos
indicus) Segundo alguns autores as raccedilas de Bos indiens ou gado zebu derivariam das raccedilas
de Bos taurus ou gado taurino atraveacutes de um processo de selecccedilatildeo (EPSTEIN amp MASON
1984) Alternativamente estes dados podem tambeacutem ser interpretados como a ocorrecircncia de
dois processos de domesticaccedilatildeo independentes seguidos do contacto entre as duas populaccedilotildees
domeacutesticas de gado bovino
Adicionalmente deve salientar-se que a evidecircncia descrita eacute ainda muito incompleta
pelo que a interpretaccedilatildeo dos dados deve ser feita com bastante precauccedilatildeo A tiacutetulo de
exemplo refiram-se os achados arqueozooloacutegicos efectuados na Peniacutensula dos Balcatildes e na
6
Introduccedilatildeo
Macedoacutenia Grega (6200 anos aC) Segundo EPSTEIN amp MASON (1984) estes achados
sugerem que o Sul da Europa poderia constituir o primeiro centro de domesticaccedilatildeo do gado
bovino a partir de onde se teria iniciado a sua expansatildeo em direcccedilatildeo ao resto do continente
europeu Ruacutessia e Sudoeste Asiaacutetico
113 - Anaacutelise geneacutetica
A investigaccedilatildeo sobre a geneacutetica das diferentes raccedilas de gado bovino tem contribuiacutedo de
forma muito significativa para a compreensatildeo da sua histoacuteria dos padrotildees de diversidade que
actualmente as caracterizam e do seu grau de parentesco Os resultados actualmente
disponiacuteveis reportam-se a trecircs domiacutenios principais grupos sanguiacuteneos variaccedilatildeo geneacutetica de
proteiacutenas e polimorfismos do DNA (DNA mitocondrial e microssateacutelites)
Grupos sanguiacuteneos
A primeira tentativa para avaliar o grau de diferenciaccedilatildeo geneacutetica entre raccedilas bovinas e
caracterizar a sua diversidade data do iniacutecio de deacutecada de 70 e envolveu precisamente o
estudo dos diferentes grupos sanguiacuteneos que iam sendo descritos (RUSSELL 1996 USHA
1996) Contudo a maior parte dos resultados natildeo permitiu a obtenccedilatildeo de conclusotildees
definitivas pelo facto de se trabalhar com um nuacutemero relativamente reduzido de loci que
adicionalmente era pouco polimoacuterfico Deve poreacutem referir-se que se dispotildee actualmente de
uma consideraacutevel quantidade de informaccedilatildeo no que se refere agrave distribuiccedilatildeo da variabilidade dos
grupos sanguiacuteneos nas diferentes raccedilas bovinas conferindo a este conjunto de dados uma
importacircncia natildeo despreziacutevel no estudo de eventuais alteraccedilotildees da estrutura geneacutetica de
populaccedilotildees de gado bovino nos uacuteltimos vinte anos (RUSSELL 1996 USHA 1996)
Proteiacutenas
A introduccedilatildeo de teacutecnicas electroforeacuteticas de separaccedilatildeo de proteiacutenas permitiu aumentar
de forma muito consideraacutevel o nuacutemero de sistemas geneacuteticos polimoacuterficos conhecidos nas
raccedilas bovinas em especial no que se refere a proteiacutenas do sangue e do leite (USHA 1996)
A anaacutelise da sua distribuiccedilatildeo populacional veio demonstrar a ocorrecircncia de dois grupos
principais de bovinos ou duas subespeacutecies (Bos primigenius taurus e Bos primigenius
7
Introduccedilatildeo
indiens) cada um deles caracterizado pela presenccedila de diversos alelos privativos em vaacuterios loci
(BRAEND 1971)
Estes resultados estatildeo de uma maneira geral de acordo com dados morfoloacutegicos
histoacutericos e ainda com a distribuiccedilatildeo geograacutefica conhecida dos principais grupos (EPSTEIN amp
MASON 1984) No entanto o acreacutescimo de informaccedilatildeo fornecido por este tipo de marcadores
foi ainda insuficiente para resolver muitas das interpretaccedilotildees contraditoacuterias publicadas sobre o
tema
Polimorfismo do DNA
A introduccedilatildeo das teacutecnicas de anaacutelise genoacutemica directa e em especial a descoberta do
polimorfismo do DNA-mitocondrial (mtDNA) e dos microssateacutelites forneceram os
instrumentos necessaacuterios a uma detalhada caracterizaccedilatildeo geneacutetica das raccedilas bovinas
A anaacutelise da variaccedilatildeo da moleacutecula de mtDNA permitiu verificar que Bos primigenius
taurus e Bos primigenius indicus teratildeo divergido haacute cerca de 210000 anos uma data muito
anterior agrave indicada pelos dados arqueoloacutegicos para o iniacutecio do processo de domesticaccedilatildeo Eacute
assim muito provaacutevel que tenham ocorrido duas domesticaccedilotildees independentes a partir de duas
subespeacutecies diferentes do auroque Bos primigenius namadicus teraacute dado origem ao gado
zebu na Aacutesia (Vale do Indu) e Bos primigenius primigenius ao gado europeu vindo do
Proacuteximo Oriente (LOFTUS et ai 1994a 1994b)
Muito recentemente BRADLEY et ai (1996) e MACHUGH et ai (1997) sugerem ainda
uma terceira domesticaccedilatildeo independente ocorrida em Aacutefrica Esta evidecircncia resulta tambeacutem
de anaacutelise do polimorfismo do mtDNA indicando uma separaccedilatildeo entre os ancestrais do gado
europeu e africano anterior agrave domesticaccedilatildeo (22000 - 26000 anos) Este terceiro processo de
domesticaccedilatildeo ter-se-ia assim efectuado a partir da subespeacutecie africana do auroque (Bos
primigenius opisthonomus)
A descoberta dos microssateacutelites e do seu elevado grau de polimorfismo data do fim da
deacutecada de 80 (Lm amp LUTY 1989 WEBER amp MAY 1989) e constitui provavelmente a
metodologia mais adequada para estudar a histoacuteria recente da diversificaccedilatildeo das raccedilas bovinas
(MACHUGH et ai 1994 ARRANZ et ai 1996) Os primeiros resultados que envolvem uma
caracterizaccedilatildeo em larga escala de diferentes populaccedilotildees permitiram distinguir mais claramente
a estrutura geneacutetica dos dois grandes grupos de gado bovino (Bos taurus e Bos indicus) e
constituem a base para futuros estudos mais especiacuteficos
8
Introduccedilatildeo
Por outro lado os microssateacutelites permitiram tambeacutem o iniacutecio do projecto de
cartografia do genoma bovino que no fim de 1994 contabilizava 202 marcadores geneacuteticos
(dos quais 144 eram microssateacutelites) regularmente espaccedilados em 90 do seu comprimento
Cerca de um ano depois existiam jaacute mais de 400 microssateacutelites (USHA et ai 1995) levando
EGGEN et ai (1995) a apresentar um trabalho de revisatildeo e consolidaccedilatildeo de informaccedilatildeo jaacute
existente para evitar a ocorrecircncia de possiacuteveis redundacircncias
A aplicaccedilatildeo deste tipo de marcadores natildeo se restringe apenas agrave anaacutelise da diversidade
geneacutetica populacional e agrave construccedilatildeo de mapas geneacuteticos De facto satildeo actualmente escolhidos
para a realizaccedilatildeo de testes de paternidade (GLOWATZKI-MULLIS et ai 1995 USHA et ai 1995
ARRANZ et ai 1996) detecccedilatildeo de loci que determinam a expressatildeo de caracteriacutesticas
quantitativas (QTL) (RON et ai 1994) determinaccedilatildeo do sexo em embriotildees selecccedilatildeo animal
assistida entre outros
No seu conjunto estes resultados tecircm permitido um avanccedilo notaacutevel na compreensatildeo da
evoluccedilatildeo das actuais raccedilas bovinas A prossecuccedilatildeo desta via de investigaccedilatildeo poderaacute levar ao
esclarecimento definitivo do nuacutemero de domesticaccedilotildees independentes que teraacute ocorrido
(EPSTEIN amp MASON 1984 LOFTUS et al 1994a 1994b BRADLEY et al 1996 MACHUGH et
al 1997) a partir das populaccedilotildees selvagens de auroque Seguidamente eacute legiacutetimo esperar que
venha a ser possiacutevel analisar a uma escala mais fina o grau de parentesco geneacutetico entre raccedilas
que ocupem aacutereas geograacuteficas mais reduzidas Neste particular seraacute extremamente interessante
incluir as populaccedilotildees ibeacutericas e em especial a raccedila Barrosatilde
9
Introduccedilatildeo
12 - A DIVERSIDADE DAS RACcedilAS BOVINAS
A domesticaccedilatildeo resultou na criaccedilatildeo de milhares de raccedilas de animais domeacutesticos
geneticamente diferentes e adaptadas agraves necessidades humanas e a uma grande variedade de
condiccedilotildees ambientais (FAO 1993)
121 - As raccedilas ibeacutericas
A grande diversidade de raccedilas bovinas da Peniacutensula Ibeacuterica poderaacute dever-se em parte
agrave introduccedilatildeo de outras raccedilas domeacutesticas que se cruzaram entre si e com bovinos jaacute existentes
na Peniacutensula A introduccedilatildeo de outras raccedilas teraacute sido feita de duas formas distintas
1 - atraveacutes dos movimentos migratoacuterios acompanhando as vaacuterias invasotildees de povos
vindos do oriente como eacute o caso dos Feniacutecios ( seacutec X aC) Gregos (seacutec VII aC) e
Romanos (seacutec III aC) Estes uacuteltimos dominaram completamente a Peniacutensula durante
7 seacuteculos e teratildeo contribuiacutedo para a diversificaccedilatildeo do gado bovino pelo facto de
introduzirem animais de caracteriacutesticas diferentes Supotildee-se que do seu cruzamento
com os bovinos ibeacutericos se teratildeo originado os troncos aquitacircnico e ibeacuterico (MIRANDA
do VALE 1949)
2 - atraveacutes da introduccedilatildeo de animais do Norte de Aacutefrica na sequecircncia da invasatildeo de
povos como os Cartagineses (seacutec V aC) e jaacute na era cristatilde os Mouros (711 dC)
Estes teratildeo introduzido descendentes de Bos primigenius opisthonomus que poderaacute
ter influenciado a formaccedilatildeo de vaacuterias raccedilas ibeacutericas nomeadamente as raccedilas Barrosatilde e
Cachena (APARIacuteCIO 1960 in IGLESIAS 1989 EPSTEIN amp MASON 1984) Estas
poderatildeo assim constituir uma linha que descende do tronco mauritaacutenico (MIRANDA
do VALE 1949)
10
Introduccedilatildeo
Adicionalmente eacute provaacutevel que povos oriundos do Norte da Europa nomeadamente
os Visigodos possam ter introduzido gado bovino dessa regiatildeo Contudo a sua eventual
contribuiccedilatildeo para a diversidade de raccedilas bovinas da Peniacutensula Ibeacuterica estaacute por esclarecer
122 - A raccedila Barrosatilde
Aspectos histoacutericos da dispersatildeo e evoluccedilatildeo do efectivo populacional
O centro de criaccedilatildeo da raccedila Barrosatilde situa-se actualmente na zona do planalto da Serra
do Barroso abrangendo os actuais concelhos de Montalegre Boticas Vieira do Minho
(freguesias de Campos e Ruivatildees) e Cabeceiras de Basto (freguesia de Gondiatildees) Esta regiatildeo
natildeo possui condiccedilotildees agro-climateacutericas que permitam grandes exploraccedilotildees agriacutecolas pelo que
uma parte importante da populaccedilatildeo se dedica agrave criaccedilatildeo de gado (GARCIA et ai 1981
FERNANDES 1996)
Vivendo sobretudo em zonas montanhosas a Barrosatilde eacute utilizada essencialmente como
forccedila de trabalho e na produccedilatildeo de carne de excelente qualidade motivo pelo qual a Uniatildeo
Europeia a reconhece com denominaccedilatildeo de Origem Protegida (FERNANDES 1996)
No seacuteculo passado e iniacutecio do seacuteculo XX existia um grande incentivo para a criaccedilatildeo
desta raccedila devido agrave procura da sua carne muito apreciada em Inglaterra Este incentivo
contribuiu indirectamente para que a estatura dos animais se elevasse (GARCIA et ai 1981) e
para que a zona de criaccedilatildeo se dispersasse pelas aacutereas submontanhosas e pelas planiacutecies do
Entre Douro e Minho ateacute agrave orla mariacutetima chegando mesmo ao concelho de Vila Nova de Gaia
(figura 121) Nestas zonas fazia-se a criaccedilatildeo de novilhos para exploraccedilatildeo como bois de
trabalho e para produccedilatildeo de carne Tal exploraccedilatildeo estaacute bem patente nos paineacuteis de azulejos da
estaccedilatildeo de caminhos de ferro de S Bento no Porto e mesmo nos desenhos das calccediladas nas
principais avenidas desta cidade
li
Introduccedilatildeo
B
bull bull bull _ bull bull bull - bull bull
Figura 121 A) Junta de bois de trabalho de raccedila Barrosatilde B) Fecircmea adulta Barrosatilde C) Macho adulto Barrosatilde Fotografias datadas de 1949 gentilmente cedidas pela Direcccedilatildeo Regional de Agricultura de Entre Douro e Minho - Centro de Produccedilatildeo Animal (DRAEDM)
12
Introduccedilatildeo
Poreacutem a necessidade de maiores produccedilotildees de carne foi conduzindo durante a
segunda metade deste seacuteculo a um progressivo decliacutenio no efectivo populacional da raccedila
Barrosatilde tornando-se mesmo raro poder observar uma junta de bois Recentemente as
alteraccedilotildees verificadas na poliacutetica agraacuteria e ambiental da Uniatildeo Europeia teratildeo permitido
alguma recuperaccedilatildeo Nesse contexto a criaccedilatildeo em 1981 do Livro Genealoacutegico da raccedila
Barrosatilde constitui um passo importante para a certificaccedilatildeo dos animais e o aumento do seu
valor Actualmente o seu efectivo populacional tem crescido continuamente e essa tendecircncia
parece estaacutevel
Segundo dados fornecidos pelo Registo Zooteacutecnico e pela Associaccedilatildeo do Minho dos
Criadores de Bovinos de Raccedila Barrosatilde (AMTOA) existiam em 1996 38002 fecircmeas
reprodutoras inscritas e 375 touros de cobriccedilatildeo (tabela 1221) distribuiacutedos por vaacuterios
concelhos dos distritos de Viana do Castelo Braga Vila Real e Porto (figura 122)
Tabela 1221 Movimento do Registo Zooteacutecnico relativo agrave raccedila Barrosatilde
Vacas Inscritas Postos de Cobriccedilatildeo Vitelos Anos Abatidas Registadas Inscritas Encerrados Recenseados Existecircncias Inscritos 1981 0 4884 4882 1 25 24 0 1982 19 6169 11032 6 42 60 532 1983 31 4436 15437 14 35 81 1593 1984 72 866 16231 13 14 82 2151 1985 47 604 16788 15 15 82 1767 1986 106 1027 17709 18 13 77 2414 1987 72 1186 18823 2 14 89 2632 1988 122 1192 19877 5 7 91 2574 1989 138 718 20506 14 26 103 2532 1990 89 1017 21440 8 7 102 2404 1991 159 1309 22590 14 26 114 2531 1992 52 1902 24440 6 17 125 3203 1993 0 4205 28645 37 87 175 4077 1994 0 6248 34893 58 111 228 4679 1995 340 2447 37000 0 112 340 5759 1996 120 1122 38002 26 61 375 5901
Fonte Registo Zooteacutecnico (cedido pela AM1BA)
Apesar desta situaccedilatildeo favoraacutevel natildeo se pode considerar que a raccedila Barrosatilde natildeo corra
ainda perigo de extinccedilatildeo Na verdade satildeo vaacuterios os factores que tecircm contribuiacutedo para a
diminuiccedilatildeo da sua aacuterea de criaccedilatildeo ou mesmo para a alteraccedilatildeo das caracteriacutesticas destes
animais De entre esses factores deve salientar-se i) a substituiccedilatildeo de Barrosatilde por outras raccedilas
autoacutectones (Minhota Mirandesa Maronesa) ou importadas (Friacutesia Gelbvieh e Parda Suiacuteccedila)
13
Introduccedilatildeo
que fornecem ao agricultor um rendimento superior ii) a progressiva mecanizaccedilatildeo da
agricultura e a diminuiccedilatildeo das aacutereas de pastagem iii) o pequeno nuacutemero de machos
reprodutores associado a um efectivo idoso iv) uma baixa fertilidade meacutedia grandes
intervalos entre partos e elevado nuacutemero de abortos e v) desmotivaccedilatildeo dos produtores mesmo
em face das actuais condiccedilotildees de comercializaccedilatildeo
LEGENDA
| j - -Concelhos de Entre Douro e Minho S Concelhos de Traacutes-os-Montes
ESCALA 11380000
Figura 122 Mapa de distribuiccedilatildeo do actual efectivo Barrosatilde
14
Introduccedilatildeo
Aspectos morfoloacutegicos
O bovino Barrosatilde apresenta uma estatura mediana com 121-130 cm de altura agrave
cernelha e pelagem de cor castanha (variando entre a cor de palha ateacute a cor acerejada) (LEAL
1995) A cabeccedila eacute curta e larga encimada por uma cornamenta em forma de lira alta os
cornos satildeo muito compridos e espessos de cor branca suja com pontas escuras o conjunto
ocular eacute saliente dando-lhe o aspecto de olhos de sapo as orelhas satildeo de tamanho meacutedio os
membros satildeo curtos e pouco ossudos e o pescoccedilo eacute curto bem ligado agrave cabeccedila e com garrote
largo (MARTINS 1982)
Eacute uma raccedila com caracteres sexuais secundaacuterios bem diferenciados Os touros satildeo
normalmente mais escuros particularmente no terccedilo anterior com maior corpulecircncia do que as
fecircmeas mais robustos com barbela mais desenvolvida cabeccedila mais curta e mais larga cornos
mais grossos e ligeiramente mais curtos (GARCIA et ai 1981 MARTINS 1982)
Esta raccedila apresenta duas particularidades morfoloacutegicas que a distinguem de todas as
outras raccedilas grande desenvolvimento coacuterneo e perfil cocircncavo da cabeccedila com acentuado
prognatismo mandibular O elevado crescimento coacuterneo poderaacute estar relacionado com a
selecccedilatildeo dos animais De facto nas populares chegas de touros o animal que sai vencedor seraacute
o touro cobridor das vacas da aldeia Este processo teraacute permitido a primazia de touros de
maior ossatura capital mais potente musculatura ceacutefalo-cervical maior forccedila no acircngulo taacutersico
e consequentemente grande desenvolvimento dos cornos (MIRANDA do VALE in GONCcedilALVES GARCIA 1964 ARAUacuteJO 1986) No que se refere ao acentuado prognatismo
mandibular eacute possiacutevel que em parte esteja relacionado com o grande desenvolvimento
coacuterneo Este teraacute exigido um desenvolvimento correlativo de certos ossos cranianos e o
atrofiamento dos ossos da face (GONCcedilALVES GARCIA 1964)
Origem
A origem da raccedila Barrosatilde e o seu enquadramento com as outras raccedilas da Peniacutensula
Ibeacuterica estaacute ainda por explicar constatando-se uma grande heterogeneidade na opiniatildeo de
diversos autores a este respeito (MARTINS 1982)
Alguns autores referem a existecircncia no Norte de Aacutefrica (vale do Nilo) de um gado
com caracteriacutesticas morfoloacutegicas semelhantes agrave actual raccedila Barrosatilde em especial no que se
refere agrave forma tamanho e espessura dos cornos Este gado eacute normalmente associado agrave
15
Introduccedilatildeo
designaccedilatildeo subespeciacutefica Bos primigenius opisthonomus (embora tambeacutem se refira como Bos
primigenius mauritaniens e como Bos taurus desertorum) e teraacute chegado agrave Peniacutensula Ibeacuterica
atraveacutes de vaacuterias rotas migratoacuterias dos povos norte-africanos A raccedila Barrosatilde poderia assim
ser incluiacuteda no tronco mauritaacutenico tendo como ancestral Bos primigenius mauritanicus
(GARCIA et ai 1981)
Neste contexto poderaacute admitir-se que o gado que corresponde a este grupo se tenha
instalado na Peniacutensula Ibeacuterica provavelmente durante a longa ocupaccedilatildeo Moura (GONCcedilALVES
GARCIA 1964) Posteriormente a raccedila Barrosatilde teraacute sido desalojada pelos troncos ibeacuterico e
aquitacircnico restando apenas um nuacutecleo populacional confinado agraves zonas planaacutelticas do
Barroso onde permaneceu ateacute hoje (GONCcedilALVES GARCIA 1964)
Esta hipoacutetese natildeo eacute contudo partilhada por outros autores que lhe criticam a escassa
evidecircncia (forma e tamanho dos cornos) e portanto uma clara ausecircncia de base cientiacutefica
(IGLESIAS 1989)
Perante o exposto pode verificar-se que a raccedila Barrosatilde apresenta aspectos
morfoloacutegicos e histoacuterico-evolutivos muito peculiares sendo ainda hoje difiacutecil proceder ao seu
enquadramento no seio das restantes raccedilas bovinas ibeacutericas O aprofundamento da investigaccedilatildeo
sobre a estrutura geneacutetica das suas populaccedilotildees poderaacute ser assim uma via para o
esclarecimento das muitas questotildees que permanecem por responder Nestas condiccedilotildees este
trabalho pretende ser uma contribuiccedilatildeo para o conhecimento da geneacutetica das populaccedilotildees da
raccedila bovina Barrosatilde atraveacutes da consecuccedilatildeo dos seguintes objectivos
1 estudo da variabilidade geneacutetica da raccedila Barrosatilde ao niacutevel das proteiacutenas eritrocitaacuterias
e plasmaacuteticas
2 desenvolvimento e afinaccedilatildeo de teacutecnicas de separaccedilatildeo de proteiacutenas por electroforese
e focagem isoeleacutectrica e sua detecccedilatildeo especiacutefica (histoquiacutemica e imunoloacutegica)
3 anaacutelise familiar dos polimorfismos encontrados
4 avaliaccedilatildeo do grau de diferenciaccedilatildeo geneacutetica existente entre a raccedila Barrosatilde e outras
raccedilas bovinas
16
Material e Meacutetodos
2 - MATERIAL E MEacuteTODOS
21 - AMOSTRAGEM E CONSERVACcedilAtildeO DAS AMOSTRAS
211 - Amostragem
Foram recolhidas 356 amostras de sangue correspondente a 294 indiviacuteduos de raccedila
Barrosatilde (dos quais 141 estavam inscritos no Livro Genealoacutegico) e 62 indiviacuteduos de raccedila
Minhota As colheitas efectuaram-se em zonas de intensa criaccedilatildeo da Barrosatilde designadamente
nos concelhos de Arcos de Valdevez Cabeceiras de Basto Fafe Poacutevoa de Lanhoso e
Monccedilatildeo em finais de 1993 durante o ano de 1994 e ainda no periacuteodo de 1996 1997 em
Vieira do Minho
A recolha de sangue em indiviacuteduos de raccedila Minhota foi efectuada com a finalidade de
servir como termo de comparaccedilatildeo geneacutetica uma vez que se realizam cruzamentos entre esta
raccedila e a Barrosatilde
212 - Obtenccedilatildeo e conservaccedilatildeo das amostras de sangue
O sangue foi colhido da veia jugular em tubos contendo 01 ml de EDTA (aacutecido
etilnodiaminotetraceacutetico) dissoacutedico a 10 ou em tubos heparinados
As amostras de sangue foram centrifugadas (10 minutos a 13000 rpm) separando-se
em seguida o plasma dos eritroacutecitos Aos eritroacutecitos foi adicionado meio de glicerol (seis
partes de uma soluccedilatildeo 5 de citrato trissoacutedico 2H20 adicionados a quatro partes de glicerol)
numa proporccedilatildeo aproximada de 21 as amostras foram conservadas a -20degC
17
Material e Meacutetodos
22 - BATERIA DE MARCADORES GENEacuteTICOS SELECCIONADOS
No presente trabalho foi escolhida uma bateria de 12 marcadores geneacuteticos dispersos
no genoma do bovino (figura 5) HB (Hemoglobina) CAII (Anidrase carboacutenica) PEPB
(Peptidase B) DIA (Diaforase) NP (Fosforilase nucleosiacutedica) MDH (Desidrogenase do
malato) PGD (Desidrogenase do aacutecido fosfoglucoacutenico) GPI (Isomerase da fosfoglucose)
MPI (Isomerase da manose-6-fosfato) ALB (Albumina) TF (Transferrina) e GC
(Componente especiacutefico de grupo)
CP SODl TF
PEPC IDH1
AMY1 AMY1A PGM1
4
LDHB PEPB
ADH2 PGM2 ALB GC SOD3
6
IADA
ALDH1
CAII
ME1 PGM3 SOD2
NP
10
CAT HBBq22-q27
PGD IALDH2 DIA4
HP GPIq22-q24
MPI iBF GLOl
LDHA MDH2
Figura 221 Localizaccedilatildeo de vaacuterios loci proteicos no genoma de Bos taurus Com um tom mais carregado indicam-se os marcadores estudados neste trabalho Adaptado de FRIES et ai (1993)
18
Material e Meacutetodos
bull HB
A hemoglobina eacute responsaacutevel pelo transporte do oxigeacutenio dos pulmotildees para os tecidos
A sua estrutura eacute tetrameacuterica tendo cada uma das quatro subunidades um grupo prosteacutetico -
- heme - com um aacutetomo de ferro no centro A fracccedilatildeo principal da hemoglobina de mamiacuteferos
adultos eacute composta por duas cadeias a e duas cadeias P (BRAEND 1971 CECCHINI amp Nus
1986)
O locus da HB foi um dos primeiros a ser estudado apresentando polimorfismo em
vaacuterios mamiacuteferos (CECCHJM amp Nus 1986 BRAEND et ai 1988 CLARKE et ai 1989 WANG
et ai 1990 SELVARAJ et ai 1991) Em 1955 CABANNE amp SERAIN (in BRAEND 1988)
descrevem pela primeira vez o polimorfismo da HB em bovinos do Norte da Aacutefrica
Posteriormente muitos estudos foram efectuados descrevendo-se 13 variantes (raros na sua
maioria) com diferenccedilas apenas nas cadeias beta (CECCHINI amp Nus 1986 BRAEND 1988)
bull CAII-EC4211
A CAII eacute uma metaloenzima com grande distribuiccedilatildeo nos animais e nas plantas
(TASHIAN 1989) Catalisa de forma reversiacutevel a hidrataccedilatildeo do C02 em H2C03 (CECCHINI amp
Nus 1986 TASHIAN 1989) O seu papel fisioloacutegico ainda natildeo eacute bem conhecido mas eacute
possiacutevel que tenha participaccedilatildeo na manutenccedilatildeo do balanccedilo osmoacutetico (TASHIAN 1989)
A ocorrecircncia de variaccedilatildeo geneacutetica na CAII estaacute descrita em muitas espeacutecies de
mamiacuteferos tendo sido descritos dois loci polimoacuterficos (CAI e CAII) (TASHIAN amp CARTER
1976 CLARICE et ai 1989 SELVARAJ et ai 1991)
SARTORE et ai (1969) foram os primeiros a detectar polimorfismo electroforeacutetico da
anidrase carboacutenica em bovinos domeacutesticos e buacutefalos americanos Nos eritroacutecitos de bovinos
apenas se exprime a anidrase carboacutenica II que apresenta geralmente 2 alelos codominantes
autossoacutemicos (CAIPF e CAIPS) (SARTORE et ai 1969 TASHIAN amp CARTER 1976) Mais
tarde foram encontrados 3 novos alelos (C Z e X) (CECCHINI amp Nus 1986)
19
Material e Meacutetodos
bull PEPB-EC3412
As peptidases formam um conjunto de enzimas capazes de hidrolisar di- e tripeacuteptidos
caracterizando-se pela sua especificidade em relaccedilatildeo a diversos substratos bem como atraveacutes
da sua distribuiccedilatildeo tecidular
A PEPB apresenta uma estrutura monomeacuterica tendo sido descrita como polimoacuterfica
em algumas raccedilas brasileiras de bovinos de origem europeia e indiana (DEL LAMA et ai
1992)
bull DIA-EC1643
A enzima monomeacuterica DIA (NADH - Methemoglobina redutase) tambeacutem conhecida
por citocromo bs redutase faz parte de um grupo de enzimas que catalisam a reduccedilatildeo da
methemoglobina (IGLESIAS 1989 VIEIRA 1993 kRAHhetal 1986)
O seu polimorfismo geneacutetico foi detectado em vaacuterias espeacutecies de Ungulados incluindo
os bovinos (CLARKE et ai 1989 IGLESIAS 1989 SELVARAJ et ai 1991 TATE amp McEWAN
1992)
bull NP-EC2421
A enzima NP encontra-se distribuiacuteda por vaacuterios tecidos e oacutergatildeos e catalisa
reversivelmente a fosforoacutelise dos nucleosiacutedeos puriacutenicos levando agrave formaccedilatildeo das respectivas
bases e ribose-1-fosfato (IGLESIAS 1989)
O polimorfismo geneacutetico desta enzima foi detectado em vaacuterias espeacutecies de mamiacuteferos
incluindo os bovinos (ANSAY 1973 HARRIS amp HOPKINSON 1978 TUKER amp YOUNG 1988
CLARKE eacutetal 1989 IGLESIAS 1989 FERRAND 1995)
20
Material e Meacutetodos
bull MDH-ECl 1137
A MDH eacute uma oxirredutase dimeacuterica na maioria dos mamiacuteferos responsaacutevel pela
oxidaccedilatildeo do L-malato em oxoglutarato com NAD como aceitador A reacccedilatildeo eacute reversiacutevel em
presenccedila de NADH e oxaloacetato A enzima diz-se NAD especiacutefica pelo facto da reacccedilatildeo soacute
ocorrer na presenccedila deste cofactor (MORAIS 1992 PEREIRA 1997)
A ocorrecircncia de variaccedilatildeo geneacutetica neste locus foi descrita para vaacuterios mamiacuteferos
(HARRIS amp HOPKINSON 1978 TUNOacuteN et ai 1989 SELVARAJ et ai 1991) Contudo
relativamente aos bovinos natildeo foi possiacutevel encontrar referecircncias quanto ao seu polimorfismo
bull PGD-EC11144
A PGD eacute uma enzima dimeacuterica envolvida na via das pentoses-fosfato catalisando a
conversatildeo de 6-fosfogluconato em ribose-5-fosfato
O polimorfismo geneacutetico do locus PGD estaacute descrito em diversas espeacutecies de
Ungulados (HERZOG 1988 PENEDO et ai 1988 BEKENEV amp ORLO VA 1991 KUROSAWA amp
TANAKA 1991 JANZEN amp COTHRAN 1991 FERNDALE et al 1992) Contudo relativamente
aos bovinos natildeo foi possiacutevel encontrar referecircncias quanto ao seu polimorfismo
bull GPI-EC5319
A isomerase da fosfoglucose cataliza a reacccedilatildeo reversiacutevel de conversatildeo de glucose-
-6-fosfato em frutose-6-fosfato (HARRIS amp HOPKINSON 1978 PRETSCHei ai 1990)
Eacute uma enzima dimeacuterica com polimorfismo geneacutetico em vaacuterias espeacutecies de mamiacuteferos
nomeadamente no catildeo (ARNOLD amp Bouw 1989) no porco (VAN DE WEGHE et ai 1988
BEKENEV amp ORLO VA 1991) na ovelha (RASERO et ai 1993) em lamas e alpacas (PENEDO et
ai 1988) e no Homem (HARRIS amp HOPKINSON 1978)
21
Material e Meacutetodos
bull MPI-EC5318
A MPI eacute uma enzima monomeacuterica de acccedilatildeo cataliacutetica que permite a isomerizaccedilatildeo de D-
-manose-6-fosfato em D-frutose-6-fosfato
Em diversas espeacutecies de mamiacuteferos nomeadamente no Homem (RlTTER et ai 1974)
em babuiacutenos (RITTER amp SCHMITT 1973) e ratos (NICHOLS et ai 1973 VANDEBERG amp
AIVALIOTIS 1990) esta enzima natildeo apresenta actividade em eritroacutecitos sendo poreacutem
detectada em diversos tecidos como rim fiacutegado e o muacutesculo Mais tarde demonstrou-se a
possibilidade de proceder a esta detecccedilatildeo em hemolisados de cavalos coelhos e lebres (HALL
et ai 1991 VIEIRA amp FERRAND 1995 SANTOS 1995)
O polimorfismo geneacutetico de MPI em bovinos foi descrito por ANSAY (1973)
apresentando trecircs alelos autossoacutemicos codominantes (MPPA MPIB e MPIC)
bull ALB
A albumina eacute a proteiacutena mais abundante no plasma dos mamiacuteferos e apresenta uma
estrutura monomeacuterica A sua funccedilatildeo estaacute relacionada com processos de transporte e de
regulaccedilatildeo do balanccedilo osmoacutetico (CECCHTNI amp Nus 1986 CARTER et al 1989)
O polimorfismo geneacutetico da albumina estaacute descrito em vaacuterias espeacutecies de Ungulados
(STORMONT et ai 1963 BOWLING amp CLARK 1988 PENEDO et ai 1988 ERHARDT 1991
SELVARAJeacutetfa 1991CRISTOFALOpounda 1992 ERHARDT amp SlMIANER 1993)
EFREMOV e ASHTON em 1965 (in CECCHTNI amp Nus 1986) descrevem pela primeira vez
polimorfismo geneacutetico em raccedilas bovinas inglesas Inicialmente encontraram-se dois alelos
(ALBA ou ALBF e ALBB ou ALBS) por electroforese aacutecida Mais tarde descreveram-
-se outros alelos em raccedilas britacircnicas (ALBH e ALBG) e em raccedilas africanas (ALBD
ALBE e ALBF) (CECCHINI amp Nus 1986) ABE et ai em 1971 descrevem o alelo ALBX
(in CECCHTNI amp Nus 1986)
22
Material e Meacutetodos
bull TF
A transferrina eacute uma 3-globulina seacuterica responsaacutevel pelo transporte do ferro Possui
uma estrutura monomeacuterica glicosilada (CECCHINI amp Nus 1986 WELCHS 1990 PENHALLOW
et ai 1991 CUNHA 1994)
O polimorfismo geneacutetico desta proteiacutena foi detectado em vaacuterias espeacutecies de Ungulados
(KRISTJANSSON 1963 STORMONT et ai 1963 ASHTON 1965 GAHNE et ai 1977 CECCHJNI
amp Nus 1986 ERHARD 1986 KUROSAWA amp TANAKA 1988 PENEDO et ai 1988 CLARKE et
ai 1989 HERZOG 1989 JUNEJA et ai 1989 TSUJI et ai 1989 SCHNEIDER et ai 1990
STRATIL et ai 1990 WANG et ai 1990 SELVARAJ et ai 1991 DRATCH et ai 1992
VANKAN amp BELL 1992a CIacuteZovket ai 1993 ERHARD et ai 1993)
ASHTON em 1965 descreveu pela primeira vez o polimorfismo geneacutetico de TF em
bovinos estando actualmente descritos sete alelos TFA TFB TFD1 TFD2 TFE
TFF e TFG (CECCHTNI amp Nus 1986) A subdivisatildeo do alelo TFD em TFD1 e TFD2 foi
descrita por KRISTJANSSON amp HICKMAN (1965)
Nos bovinos os loci TF e CP encontram-se ligados como tem sido descrito para vaacuterias
espeacutecies de mamiacuteferos (JUNEJA et ai 1989)
bull GC
A GC apresenta uma estrutura monomeacuterica e o seu polimorfismo geneacutetico estaacute descrito
em vaacuterias espeacutecies de Ungulados (GAHNE 1963 KRISTJANSSON 1963 JUNEJA et ai 1987
PENEDO et ai 1988 PENEDO amp JUNEJA 1989 KALAacuteB et ai 1990 ERHARDT 1991 VANKAN
amp BELL 1992b STERN et ai 1992 ERHARDT amp SIMIANER 1993 STRATIL et ai 1995)
Nos bovinos o polimorfismo geneacutetico da GC foi inicialmente descrito por GAHNE
(1963) e ASHTON (1963) in GAHNE et ai 1977) mas soacute mais tarde foi possiacutevel obter
frequecircncias geacutenicas para este locus (alelos GCA e GCB) em diferentes raccedilas europeias
(GAHNE et ai 1977) A utilizaccedilatildeo de novas teacutecnicas de separaccedilatildeo permitiu distinguir um
terceiro alelo GCC (VAN DE WEGHE 1982)
23
Material e Meacutetodos
A existecircncia de ligaccedilatildeo factorial entre os loci ALB e GC foi demostrada no Homem
em primeiro lugar e depois nos cavalos nos bovinos e na ovelha (VAN DE WEGHE 1982
ERHARDT amp SlMIANER 1993)
23 - TRATAMENTO DAS AMOSTRAS
bull HB
A separaccedilatildeo da moleacutecula HB por focagem isoeleacutectrica foi feita mediante a utilizaccedilatildeo de
hemolisados diluiacutedos 18 em aacutegua bidestilada
bull CAII
A separaccedilatildeo electroforeacutetica de CAII foi realizada em gel de amido e em focagem
isoeleacutectrica No primeiro caso as amostras foram simplesmente tratadas com tolueno
enquanto no segundo se procedeu ainda agrave sua reduccedilatildeo com uma soluccedilatildeo de ditiotreitol
(DTT) 120 mM (100 uacute de amostra natildeo diluiacuteda e 20 pi de DTT 120 mM) durante 1 h a 37degC
Quando se utilizou focagem isoeleacutectrica aleacutem do tratamento jaacute referido foi necessaacuterio
realizar uma diluiccedilatildeo final de 110 com aacutegua bidestilada
bull PEPB DIA NP MDH PGP GPI e MPI
As separaccedilotildees electroforeacuteticas de PEPB DIA NP MDH PGD GPI e MPI em gel de
amido foram efectuadas com hemolisados natildeo diluiacutedos submetidos ao mesmo tratamento
descrito para CAII quando separada por electroforese convencional
24
Material e Meacutetodos
bull ALB
Na separaccedilatildeo de ALB por focagem isoeleacutectrica utilizaram-se amostras de plasma
diluiacutedas com aacutegua bidestilada na proporccedilatildeo de 170
bull TF
Na separaccedilatildeo de TF efectuada por focagem isoeleacutectrica utilizaram-se amostras de
plasma submetidas a vaacuterios tipos de tratamento para comparaccedilatildeo dos padrotildees de bandas
obtidos
1 Remoccedilatildeo dos resiacuteduos de aacutecido siaacutelico da moleacutecula de TF
diluiccedilatildeo 13 com neuraminidase durante 1 h a 37 degC
2 Remoccedilatildeo do Fe da moleacutecula de TF
diluiccedilatildeo 13 com EDTA-dissoacutedico (20) 2 h antes da aplicaccedilatildeo para remoccedilatildeo dos
aacutetomos de Fe da moleacutecula de TF
3 Saturaccedilatildeo em Fe da moleacutecula de TF
31 - diluiccedilatildeo 13 com soluccedilatildeo de sulfato de amoacutenio feacuterrico 015 (pv) em aacutecido
ciacutetrico 60 mM seguida de incubaccedilatildeo agrave temperatura ambiente 18 h A utilizaccedilatildeo
de uma razatildeo ligante Fe de 201 permite uma raacutepida saturaccedilatildeo da moleacutecula de
TF (FERRAND 1995)
32 - diluiccedilatildeo 13 com soluccedilatildeo de sulfato de amoacutenio ferroso 015 (pv) em aacutecido
ciacutetrico 60 mM seguida de incubaccedilatildeo agrave temperatura ambiente 18 h
33 - diluiccedilatildeo 13 com soluccedilatildeo de citrato de amoacutenio feacuterrico 015 (pv) em aacutecido
ciacutetrico 60 mM seguida de incubaccedilatildeo agrave temperatura ambiente 18 h
34 - diluiccedilatildeo 13 com soluccedilatildeo de citrato feacuterrico 015 (pv) em aacutecido ciacutetrico
60 mM seguida de incubaccedilatildeo agrave temperatura ambiente 18 h
35 - diluiccedilatildeo 13 com soluccedilatildeo de cloreto de ferro 015 (pv) em aacutecido ciacutetrico
60 mM seguida de incubaccedilatildeo agrave temperatura ambiente 18 h
25
Material e Meacutetodos
Antes da inserccedilatildeo as amostras foram parcialmente purificadas atraveacutes da adiccedilatildeo de 5
volumes de uma soluccedilatildeo de rivanol 06 (pv) em tampatildeo Tris HC1 005 M (ajusta-se o pH
para valores de 91 com Tris 1 M) seguida de centrifugaccedilatildeo
bull GCcedil
A fim de proceder agrave remoccedilatildeo dos resiacuteduos de aacutecido siaacutelico existente nas cadeias de
hidratos de carbono ligadas agrave moleacutecula GC as amostras de plasma foram submetidas a uma
incubaccedilatildeo com uma soluccedilatildeo de neuraminidase Clostridium perfringens SIGMA type V 18
Uml) na proporccedilatildeo de 13 durante 18 h a 37degC acrescentando-se posteriormente aacutegua
bidestilada ateacute agrave obtenccedilatildeo de uma diluiccedilatildeo final de 14 Paralelamente procedeu-se a uma
diluiccedilatildeo das amostras com aacutegua bidestilada (19) para comparaccedilatildeo dos padrotildees de bandas
obtidos
24 - MEacuteTODOS DE SEPARACcedilAtildeO
Electroforese convencional
Nas teacutecnicas de electroforese convencional foram utilizados vaacuterios sistemas de tampatildeo
para os geacuteis e para as pontes conforme a proteiacutena em estudo
Focagem isoeleacutectrica
Os sistemas de focagem isoeleacutectrica utilizados na separaccedilatildeo de proteiacutenas foram
realizados em matrizes de poliacrilamida (T = 5 C = 3) com dimensotildees 230xl00x03mm
Os geacuteis foram aplicados sobre uma peliacutecula de suporte GELFIX (SERVA) permitindo o seu
manuseamento adequado
A adiccedilatildeo de soluccedilotildees de TEMED 10 (pv) e persulfato de amoacutenio (PSA) 10 (pv)
permitiu a polimerizaccedilatildeo do gel agrave temperatura ambiente (24 horas) ou a 37 degC durante 1 h
As separaccedilotildees por focagem isoeleacutectrica decorreram sobre placa de arrefecimento a
aproximadamente 10degC (8 - 12degC)
26
Material e Meacutetodos
HB
A separaccedilatildeo da moleacutecula de HB foi realizada por focagem isoeleacutectrica em gradiente de
pH livre segundo a teacutecnica descrita por FERRAND (1995) com algumas modificaccedilotildees
A composiccedilatildeo da soluccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo e os paracircmetros eleacutectricos utilizados estatildeo
indicados nas tabelas 241 e 242 respectivamente
Tabela 241 Soluccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo utilizada para a separaccedilatildeo da moleacutecula nativa de HB por focagem isoeleacutectrica
Componentes da soluccedilatildeo Quantidades
Acrilamida 28 (pv)
Bisacrilamida 2 (pv)
Sacarose
Anfoacutelitos 5-8 (SIGMA)
7-9 (PHARMACIA)
Aacutegua bidestilada TEMED 10 (vv)
PSA 10 (pv)
18 ml
08 ml
2 g
300 p1
300 ul
ateacute 10 ml volume final
10 ul
70 ul
Tabela 242 Paracircmetros eleacutectricos utilizados na focagem isoeleacutectrica de HB
Voltagem (V) Corrente (mA) Potecircncia (W) Tempo (T)
Preacute focagem 1500 25 1
2
3
30 min
15 min
15 min
Focagem 1500 25 15 2h 30 min
As soluccedilotildees para os eleacutectrodos foram aacutecido aspaacutertico 004 M (acircnodo) e NaOH 01 M
(caacutetodo) As amostras foram aplicadas a 15 cm do caacutetodo tendo sido inseridas com o auxiacutelio
de um aplicador de borracha silicone (SERVA)
27
Material e Meacutetodos
bull CAII
A separaccedilatildeo de CAII fez-se em gel de amido (15 pv SIGMA) conforme o descrito
por AMORIM (1983) com algumas modificaccedilotildees e ainda por focagem isoeleacutectrica em
gradiente de pH livre
Utilizam-se os seguintes sistemas tampatildeo para a separaccedilatildeo por electroforese em gel de
amido
Tampatildeo das Pontes Tris 0250 M pH = 76 Aacutecido ciacutetrico 0067 M
Tampatildeo do Gel Diluiccedilatildeo 110 do tampatildeo das pH = 76 pontes
As amostras foram inseridas em meio Sephadex G-200 (PHARMACIA) na proporccedilatildeo
de 11 As electroforeses foram realizadas em placa de arrefecimento (8degC) e com um
gradiente de potencial de 5 Vcm durante 16 h
A teacutecnica utilizada para a separaccedilatildeo de CAII por focagem isoeleacutectrica foi a descrita por
BOWLING et ai (1990) com algumas modificaccedilotildees A composiccedilatildeo da soluccedilatildeo de
polimerizaccedilatildeo e os paracircmetros eleacutectricos utilizados estatildeo indicados nas tabelas 243 e 244
respectivamente
As soluccedilotildees para os eleacutectrodos foram aacutecido aspaacutertico 004 M (acircnodo) e NaOH 01 M
(caacutetodo) As amostras foram inseridas com o auxiacutelio de um aplicador de borracha silicone
(SERVA) colocado a 15 cm do caacutetodo
28
Material e Meacutetodos
Tabela 243 Soluccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo utilizada na separaccedilatildeo de CAII por focagem isoeleacutectrica
Componentes da soluccedilatildeo
Acrilamida 28 (pv)
Bisacrilamida 2 (pv)
Sacarose
Anfoacutelitos 4-65 (PHARMACIA)
Anfoacutelitos 35-10 (PHARMACIA)
Aacutegua bidestilada TEMED 10 (vv)
PSA 10 (pv)
Quantidades 18 ml
08 ml
2 g
500 |ol
100 ul
ateacute 10 ml volume final
10 ul
70 ul
Tabela 244 Paracircmetros eleacutectricos utilizados na separaccedilatildeo de CAII por focagem isoeleacutectrica
Voltagem (V) Corrente (mA) Potecircncia (W) Tempo (T)
Preacute focagem 1500 25 1
3
5
30 min
15 min
15 min
Focagem 2500 25 8
10
12
30 min
30 min
30 min
bull PEPB
A separaccedilatildeo da PEPB foi realizada em gel de amido (15 pv SIGMA) de acordo
com a teacutecnica descrita por POVEY et ai (1972) com algumas modificaccedilotildees
29
Material e Meacutetodos
Utilizou-se o seguinte sistema tampatildeo
Tampatildeo das Pontes Tris 01 M
pH = 74 NaH2P04 01 M
Tampatildeo do Gel Diluiccedilatildeo 110 do tampatildeo das
pH = 74 pontes
As amostras satildeo inseridas em meio Sephadex G-200 (PHARMACIA) na proporccedilatildeo de
11 As electroforeses foram realizadas em placas de arrefecimento (8degC) e com um gradiente
de potencial de 5 Vcm durante 16 h
bull DIA
No caso da separaccedilatildeo de DIA a teacutecnica eacute idecircntica agrave utilizada para CAII electroforese
em gel de amido (15 pv SIGMA) conforme o descrito por AMORIM (1983) com algumas
modificaccedilotildees
bull NP MDH PGD GPJ e MPI
As separaccedilotildees das enzimas NP MDH PGD GPI e MPI fizeram-se em simultacircneo por
electroforese em gel de amido (15 pv SIGMA) conforme o descrito por AMORIM et ai
(1982) com algumas modificaccedilotildees
Utilizou-se o seguinte sistema tampatildeo
1130 M
0400 M
0020 M 0010 M
Tampatildeo das Pontes NaOH
pH = 60 Aacutecido ciacutetrico
Tampatildeo do Gel HisHCl
pH = 60 NaOH
30
Material e Meacutetodos
As amostras foram inseridas em meio Sephadex G-200 (PHARMACIA) na proporccedilatildeo
de 11 As electroforeses foram realizadas em placas de arrefecimento (8degC) e com um
gradiente de potencial de 8 Vcm durante 15 h
ALB
Nas tabelas 245 e 246 indicam-se respectivamente a composiccedilatildeo da soluccedilatildeo de
polimerizaccedilatildeo para a separaccedilatildeo de ALB por focagem isoeleacutectrica segundo a teacutecnica descrita
por ROCHA et ai (1991) com algumas modificaccedilotildees e os paracircmetros eleacutectricos
Tabela 245 Soluccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo utilizada para a separaccedilatildeo de ALB por focagem isoeleacutectrica
Componentes da soluccedilatildeo Quantidades
Acrilamida 28 (pv)
Bisacrilamida 2 (pv)
Ureia
Anfoacutelitos 5-6 (PHARMACIA)
Anfoacutelitos 5-8 (PHARMACIA)
Anfoacutelitos 6-8 (PHARMACIA)
Aacutegua bidestilada TEMED 10 (vv)
PSA 10 (pv)
18 ml
08 ml
48 g
250 ni
250 ni
125 ul
ateacute 10 ml volume final
30 ul
70 ul
Tabela 246 Paracircmetros eleacutectricos utilizados na separaccedilatildeo de ALB por focagem isoeleacutectrica
Voltagem (V) Corrente (mA) Potecircncia (W) Tempo (T)
Preacute focagem 1500 25
Focagem 1500 25
1 30 min
2 15 min
3 15 min
4 3 h
5 30 min
31
Material e Meacutetodos
As soluccedilotildees para os eleacutectrodos foram aacutecido aspaacutertico 004 M (acircnodo) e NaOH 1 M
(caacutetodo) As amostras foram aplicadas a 15 cm do caacutetodo com o auxiacutelio de um aplicador de
borracha silicone (SERVA)
TF
A separaccedilatildeo da moleacutecula de TF foi efectuada por focagem isoeleacutectrica A composiccedilatildeo
da soluccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo e os paracircmetros eleacutectricos utilizados estatildeo indicados nas tabelas
247 e 248 respectivamente
Tabela 247 Soluccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo utilizada para a separaccedilatildeo da TF por focagem isoeleacutectrica
Componentes da soluccedilatildeo Quantidades
Acrilamida 28 (pv)
Bisacrilamida 2 (pv)
Sacarose
Anfoacutelitos 35-5(LKB)
Anfoacutelitos 4-65 (PHARMACIA)
Aacutegua bidestilada
TEMED 10 (vv) PSA 10 (pv)
18 ml
08 ml
2 g
100 ul
500 ul
ateacute 10 ml volume final
30 ul
70 ul
Tabela 248 Paracircmetros eleacutectricos utilizados na separaccedilatildeo de TF por focagem isoeleacutectrica
Voltagem (V) Corrente (mA) Potecircncia (W) Tempo (T)
Preacute focagem 1500 25
Focagem 2500 25
l 20 min
2 10 min
3 10 min
8 30 min
10 30 min
12 30 min
32
Material e Meacutetodos
As soluccedilotildees para os eleacutectrodos foram de aacutecido aspaacutertico 004 M (acircnodo) e de NaOH
1 M (caacutetodo) As amostras foram aplicadas a 15 cm do caacutetodo com o auxiacutelio de um aplicador
de borracha silicone (SERVA)
GC
Nas tabelas 249 e 2410 apresenta-se respectivamente a composiccedilatildeo da soluccedilatildeo de
polimerizaccedilatildeo e os paracircmetros eleacutectricos utilizados na focagem isoeleacutectrica de GC
Tabela 249 Soluccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo utilizada para a separaccedilatildeo da GC por focagem isoeleacutectrica
Componentes da soluccedilatildeo Quantidades
Acrilamida 28 (pv)
Bisacrilamida 2 (pv)
Sacarose
Anfoacutelitos 45-54 (PHARMACIA)
Anfoacutelitos 4-6 (LKB)
Aacutegua bidestilada TEMED 10 (vv)
PSA 10 (pv)
18 ml
08 ml
2 g
437 ul
188 (il
eacute 10 ml volume final
10 ul
70 ul
Tabela 2410 Paracircmetros eleacutectricos utilizados na separaccedilatildeo de GC por focagem isoeleacutectrica
Voltagem (V) Corrente (mA) Potecircncia (W) Tempo (T)
Preacute focagem 1500 25
Focagem 1500 25
1 30 min
2 15 min
3 15 min
4 3 h
5 30 min
33
Material e Meacutetodos
Para os eleacutectrodos foram utilizadas soluccedilotildees de aacutecido aspaacutertico 004 M (acircnodo) e de
NaOH 02 M (caacutetodo) As amostras foram inseridas com o auxiacutelio de um aplicador de
borracha silicone (SERVA) colocado a 15 cm do caacutetodo
25 - MEacuteTODOS DE DETECCcedilAtildeO
Apoacutes a separaccedilatildeo das proteiacutenas os padrotildees electroforeacuteticos foram geralmente obtidos
por detecccedilatildeo especiacutefica aproveitando a actividade cataliacutetica das enzimas Noutros casos a
revelaccedilatildeo foi feita por coloraccedilatildeo geral de proteiacutenas
bull HB
A visualizaccedilatildeo da HB foi obtida mediante coloraccedilatildeo geral de proteiacutenas segundo o
seguinte procedimento
Fixaccedilatildeo
Imersatildeo do gel numa soluccedilatildeo de aacutecido tricloroaceacutetico 125 (pv) durante 10 minutos
Coloraccedilatildeo geral de proteiacutenas
Coloraccedilatildeo com uma soluccedilatildeo de Coomassie R-250 0115 (pv) numa mistura de aacutecido
aceacuteticoetanolaacutegua destilada (42571) apoacutes aquecimento seguida de filtraccedilatildeo durante
5-10 minutos A descoloraccedilatildeo eacute feita com aacutecido aceacutetico etanol e aacutegua destilada
aquecida a cerca de 60degC ateacute se obter o contraste desejado
bull CAII
Apoacutes separaccedilatildeo por electroforese em gel de amido visualizou-se a CAII pela sua
actividade esteraacutesica adicionando-se diacetato de fluoresceiacutena (em quantidades vestigiais que
34
Material e Meacutetodos
foram previamente dissolvidas em 200 uacute de acetona) a uma soluccedilatildeo de incubaccedilatildeo tamponada
(pH = 66) Esta soluccedilatildeo de incubaccedilatildeo eacute composta por aacutecido ciacutetrico 27 mM e Na2HP04
116 mM e foi aplicada sobre o gel de amido com o auxiacutelio de papeacuteis de filtro Whatman ndegl
Em seguida incubou-se durante 30 minutos a 37degC A observaccedilatildeo das bandas de CAII (devido
agrave sua capacidade esteraacutesica) eacute feita sob luz ultravioleta
Apoacutes separaccedilatildeo por focagem isoeleacutectrica utilizou-se uma coloraccedilatildeo geral de proteiacutenas
para visualizaccedilatildeo da CAII segundo o meacutetodo descrito para a HB sem fixaccedilatildeo
bull PEPB
A detecccedilatildeo da PEPB apoacutes a separaccedilatildeo electroforeacutetica foi feita atraveacutes da aplicaccedilatildeo
sobre o gel de amido de papeacuteis de filtro Whatman ndegl embebidos numa soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo
seguindo-se uma incubaccedilatildeo de 30 minutos a 37degC
A soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo conteacutem o substrato da PEPB L-leucilglicil-glicina 0004 M
veneno de cobra da espeacutecie Agkistrodon piscivorus piscivorus 04 (pv) MTT 24 mM e
metosulfato de fenazina (PMS) 03 mM num tampatildeo de pH = 80 (Tris HC1005 M)
bull DIA
Apoacutes a separaccedilatildeo por electroforese em gel de amido a identificaccedilatildeo da DIA foi obtida
pela adiccedilatildeo de uma soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo a uma fatia do gel A incubaccedilatildeo decorreu durante 2
horas a 37degC
A soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo foi realizada em duas fases
Io - colocou-se 26-diclorofenol-indofenol (DCIP) 01 mM com um tampatildeo de
pH = 85 (Tris HC1 005M) adicionando-se agrave mistura aacutegua bidestilada ateacute perfazer
50 ml Em seguida filtrou-se a soluccedilatildeo
2o - agrave soluccedilatildeo filtrada adicionou-se MTT 03 mM e NADH 02 mM e agitou-se antes
de verter sobre a fatia de gel de amido
35
Material e Meacutetodos
bull NP
A detecccedilatildeo da enzima NP apoacutes a separaccedilatildeo por electroforese foi feita atraveacutes da
aplicaccedilatildeo sobre o gel de amido de papeacuteis de filtro Whatman ndegl embebidos com a soluccedilatildeo de
coloraccedilatildeo Em seguida incubou-se durante 15 minutos a 37degC
A soluccedilatildeo de incubaccedilatildeo conteacutem inosina 37 mM MTT 24 mM XOD 0004 Uml uma
gota de azul de Meldola (SIGMA) (10 vv em aacutegua bidestilada) e uma soluccedilatildeo de tampatildeo
de incubaccedilatildeo pH = 75 constituiacuteda por KH2P04 005 M e NaOH 004 M
bull MDH
Na detecccedilatildeo da actividade enzimaacutetica de MDH foi utilizado o meacutetodo de sandwich
apoacutes a sua separaccedilatildeo electroforeacutetica em gel de amido Em seguida incubou-se durante 15
minutos a 37degC O meacutetodo de sandwich consiste na aplicaccedilatildeo de uma fatia de gel de amido
entre duas folhas de papel de filtro Whatman ndegl embebido com a soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo
A soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo utilizada na detecccedilatildeo da MDH conteacutem NAD 1 mM MTT
2 mM e piruvato de soacutedio (quantidades vestigiais) Esta soluccedilatildeo foi feita com um tampatildeo de
incubaccedilatildeo pH = 74 constituiacutedo por aacutecido maacutelico 0222 M Tris 050 M e MgCl2 002 M
bull PGP
A detecccedilatildeo da actividade enzimaacutetica de PGD foi feita pelo meacutetodo de sandwich apoacutes a
sua separaccedilatildeo electroforeacutetica em gel de amido
A soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo conteacutem quantidades vestigiais de aacutecido 6-fosfoglucoacutenico
NADP MTT e uma gota de azul de Meldola (05 pv em aacutegua bidestilada) dissolvidos num
tampatildeo de pH = 74 constituiacutedo por Tris 01 M HisHCl 01 M Imidazol 0015 M e MgCl2
0005 M
36
Material e Meacutetodos
bull GPI
A detecccedilatildeo da actividade enzimaacutetica de GPI foi feita pelo meacutetodo de sandwich apoacutes a
sua separaccedilatildeo electroforeacutetica em gel de amido
A soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo conteacutem frutose-6-fosfato 55 mM NADP 22 mM MTT
4 mM desidrogenase da glucose-6-fosfato (G6PD) 14 Uml e uma gota de azul de Meldola
(05 pv em aacutegua bidestilada) dissolvidos num tampatildeo de pH = 74 constituiacutedo por Tris 01
M HisHCl 01 M Imidazol 0015 M e MgCl2 0005 M
bull MPI
Detectou-se a actividade enzimaacutetica de MPI pelo meacutetodo de sandwich apoacutes a sua
separaccedilatildeo electroforeacutetica em gel de amido
A soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo conteacutem manose-6-fosfato 42 mM NADP 13 mM MTT
24 mM e uma gota de azul de Meldola (05 pv em aacutegua bidestilada) dissolvidos num
tampatildeo de pH = 74 constituiacutedo por Tris 01 M HisHCl 01 M Imidazol 0015 M e MgCl2
0005 M Por fim adicionaram-se as enzimas isomerase da glucose-6-fosfato (GPI) 3 Uml e
desidrogenase da glucose-6-fosfato (G6PD) 5 Uml
bull ALBeTF
A detecccedilatildeo de ALB e de TF foi efectuada atraveacutes do meacutetodo de coloraccedilatildeo geral de
proteiacutenas descrito para a HB utilizando-se Coomasie R-250 sem fixaccedilatildeo
bull GCcedil
A visualizaccedilatildeo de GC efectuou-se por detecccedilatildeo imunoenzimaacutetica apoacutes transferecircncia da
proteiacutena para uma membrana de nitrocelulose (045 pm SCHLEICHER amp SCHULL)
segundo a teacutecnica descrita por FERRAND (1995)
37
Material e Meacutetodos
Apoacutes esse processo de transferecircncia as membranas de nitrocelulose foram lavadas 3
vezes (15 minutos) numa soluccedilatildeo de Tween 20 (MERCK) 0025 (vv) em soro fisioloacutegico
tamponado com fosfato (PBS Na2HP04 50 mM KH2P04 18mM NaCl 147 mM pH = 71) e
bloqueadas numa soluccedilatildeo de leite em poacute magro (5 pv em PBS) durante 18 h com agitaccedilatildeo
permanente e agrave temperatura ambiente
Depois da primeira lavagem aplicou-se o antisoro (anti-GC humana ATAB 81936)
diluiacutedo 1170 em PBS com 1 (pv) de albumina seacuterica bovina (SIGMA) durante 1 h agrave
temperatura ambiente
Repetiu-se novamente a lavagem segundo o processo jaacute referido seguindo-se a
aplicaccedilatildeo do segundo antisoro (anticorpos contra imunoglobulinas caprinas desenvolvidos em
coelho e conjugados com uma peroxidase ATAB 83806) diluiacutedo 1600 em PBS com 1
(pv) de albumina seacuterica bovina (SIGMA) durante 1 h agrave temperatura ambiente
Depois de duas lavagens (5 minutos) com Tween 20PBS procedeu-se agrave detecccedilatildeo da
GC com uma soluccedilatildeo de 9-amino-2-etilcarbazol 004 (pv) e de metanol 20 (vv) em PBS
As bandas correspondentes agrave actividade peroxidaacutesica aparecem rapidamente bloqueando-se a
reacccedilatildeo com aacutegua bidestilada
26 - MEacuteTODOS DE CAacuteLCULO
As frequecircncias geacutenicas foram calculadas por contagem directa de genes a partir da
distribuiccedilatildeo fenotiacutepica obtida
O caacutelculo dos valores de heterozigotia meacutedia (H) da proporccedilatildeo de loci polimoacuterficos
(P) do nuacutemero meacutedio de alelos por locus (ria) estatiacutesticas F e frequecircncias fenotiacutepicas
esperadas segundo o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg foi efectuado com a utilizaccedilatildeo do
programa BIOSYS versatildeo 17 (SWOFFORD amp SELANDER 1989)
O caacutelculo de distacircncias geneacuteticas e obtenccedilatildeo de dendrogramas foi efectuado com o
programa PHYLIP versatildeo 35 (FELSENTEIN 1993)
38
Resultados e Discussatildeo
3 - RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
31 - ANAacuteLISE DOS MEacuteTODOS DE SEPARACcedilAtildeO
De entre os 12 loci estudados neste trabalho detectaram-se 5 monomoacuterficos
(PEPB DIA GPI MDH e PGD) e 7 polimoacuterficos (HB CAII NP MPI ALB TF e GC)
Loci monomoacuterficos
bull PEPB
A utilizaccedilatildeo de teacutecnicas de electroforese em gel de amido permitiu a detecccedilatildeo de
um soacute fenoacutetipo (figura 311) correspondente a indiviacuteduos homozigoacuteticos para o alelo
PEPB2 descrito por DEL LAMA et ai (1992) No entanto na raccedila Minhota detectou-se
um indiviacuteduo heterozigoacutetico
O fenoacutetipo PEPB 2 apresenta um padratildeo com duas bandas uma de grande
intensidade e outra secundaacuteria mais anoacutedica de menor intensidade No indiviacuteduo
heterozigoacutetico 2-1 (natildeo representado) observou-se um padratildeo de trecircs bandas sendo a
terceira mais anoacutedica e menos intensa
A quase inexistecircncia de PEPB1 nas raccedilas estudadas estaacute de acordo com o referido
em DEL LAMA et ai (1992) que sugere a fixaccedilatildeo de PEPB2 na maior parte das
populaccedilotildees de bovinos de origem europeia (com excepccedilatildeo das raccedilas italianas Marchigiana
e Chianina)
39
Resultados e Discussatildeo
+
Figura 311 Fenoacutetipos de PEPB observados por electroforese convencional em gel de amido
bull DIA
Os resultados obtidos para a enzima DIA revelaram ausecircncia de polimorfismo
electroforeacutetico (figura 312) Resultados semelhantes foram tambeacutem obtidos em vaacuterias
raccedilas autoacutectones espanholas (GONZALEZ et ai 1987 IGLESIAS 1989 ARRANZ et ai
1992)
MAKAVEEV (1979 in IGLESIAS 1989) detectou polimorfismo desta enzima em
eritroacutecitos de buacutefalos da Bulgaacuteria e nas raccedilas bovinas Frisia e Simmental descrevendo dois
alelos codominantes DIAA e DIAB
Figura 312 Padratildeo de DIA observado por electroforese convencional em gel de amido
40
Resultados e Discussatildeo
Natildeo se detectou variaccedilatildeo electroforeacutetica para o locus GPI Estes resultados natildeo se
podem comparar com os obtidos noutras raccedilas por natildeo ter sido possiacutevel consultar outros
trabalhos onde se descrevesse variaccedilatildeo do locus GPI em gado bovino
A figura 313 apresenta o padratildeo obtido para esta enzima observando-se trecircs
bandas duas com grande intensidade e uma banda mais anoacutedica de menor intensidade
Figura 313 Padratildeo de GPI obtido em hemolisados por electroforese convencional em gel de amido
bull MDH
A enzima MDH revelou-se monomoacuterfiacuteca Este resultado eacute concordante com outros
estudos (ARRANZ et ai 1992)
Na figura 314 observa-se o padratildeo de bandas detectado por electroforese
convencional em gel de amido
Figura 314 Padratildeo de MDH observado por electroforese convencional em gel de amido
41
Resultados e Discussatildeo
bull PGD
A enzima PGD revelou-se monomoacuterfica para as raccedilas Barrosatilde e Minhota tambeacutem
neste caso natildeo se encontrou qualquer referecircncia bibliograacutefica relativa a um possiacutevel
polimorfismo deste locus em gado bovino
Na figura 315 observa-se o padratildeo obtido para esta enzima Em amostras
armazenadas por um longo periacuteodo de tempo detectaram-se duas bandas sendo a mais
anoacutedica a que revela menor intensidade as amostras mais recentes apresentam um padratildeo
electroforeacutetico com uma soacute banda
Figura 315 Padratildeo de PGD observado por electroforese convencional em gel de amido
Loci polimoacuterficos
bull HB
A electroforese convencional natildeo permite discriminar os electromorfos de HB No
entanto a utilizaccedilatildeo de sistemas de focagem isoeleacutectrica conduz agrave detecccedilatildeo de
polimorfismo nesta proteiacutena observando-se dois fenoacutetipos HB A e HB AB
Na figura 316 observa-se o padratildeo electroforeacutetico desta moleacutecula resultante da
expressatildeo de dois alelos codominantes HBA e HBB Resultados idecircnticos estatildeo
descritos em raccedilas bovinas da Peniacutensulas Ibeacuterica (VICENTE 1978 KiDD et ai 1980
IGLESIAS 1989)
42
Resultados e Discussatildeo
+ -HBB
HBA
AB AB A A
Figura 316 Separaccedilatildeo de hemoglobina nativa por focagem isoeleacutectrica
bull poundAH
A utilizaccedilatildeo de electroforese em gel de amido e focagem isoeleacutectrica permitiu
identificar trecircs fenoacutetipos CAII F CAII FS e CAII S atribuiacutedos agrave expressatildeo de dois alelos
codominantes CAF e CAS (figuras 317 e 318) Poreacutem a separaccedilatildeo por electroforese em
gel de amido implica alguma morosidade (tempos de corrida muito longos) e em amostras
coaguladas o erro de leitura pode ser superior a 20 Estas dificuldades satildeo minimizadas
quando se recorre a focagem isoeleacutectrica
Assim a separaccedilatildeo da enzima CAII por focagem isoeleacutectrica oferece vaacuterias vantagens
nomeadamente
bull rapidez e simplicidade de execuccedilatildeo
bull utilizaccedilatildeo de pequenas quantidades de material bioloacutegico
bull maior nuacutemero de amostras fenotipadas por corrida
bull possibilidade de utilizaccedilatildeo de amostras coaguladas
43
Resultados e Discussatildeo
F F F S FS FS F S FS
Figura 317 Fenoacutetipos de CAII observados sob luz ultravioleta apoacutes separaccedilatildeo por electroforese convencional em gel de amido e coloraccedilatildeo com diacetato de fluoresceina
CAIIF
| CAIIS
Figura 318 Fenoacutetipos de CAII observados por focagem isoeleacutectrica apoacutes coloraccedilatildeo geral de proteiacutenas
bull NP
A expressatildeo fenotiacutepica de NP resulta das combinaccedilotildees possiacuteveis entre um alelo
dominante NPH e um recessivo NPL (ANSAY 1973) Este facto implica que apenas em
presenccedila do feno tipo NP L eacute possiacutevel fazer corresponder um genoacutetipo (jaacute que o fenoacutetipo NP H
pode corresponder aos genoacutetipos HH e HL e o fenoacutetipo NP L corresponde ao genoacutetipo LL)
Na figura 319 apresenta-se o padratildeo obtido para a proteiacutena apoacutes separaccedilatildeo
electroforeacutetica em gel de amido
44
+
w
FS FS ]
Resultados e Discussatildeo
H L L H L L
Figura 319 Fenoacutetipos de NP detectados por electroforese convencional em gel de amido
bull MPI
Na raccedila Minhota detectaram-se quatro fenoacutetipos MPI AB MPI B MPI BC e MPI C
anteriormente descritos por ANSAY (1973) em bovinos na raccedila Barrosatilde apenas se observam
os trecircs uacuteltimos fenoacutetipos De acordo com o mesmo autor os fenoacutetipos encontrados nesta raccedila
resultam da combinaccedilatildeo de dois alelos codominantes MPIB e MPPC enquanto que MPIA
aparece na raccedila Minhota com uma frequecircncia reduzida
Como se pode observar pela anaacutelise da figura 3110 MPIA aparece como o alelo
mais anoacutedico MPIC como o mais catoacutedico e o alelo mais frequente MPIB situa-se numa
posiccedilatildeo intermeacutedia em relaccedilatildeo aos anteriores Contudo a intensidade das bandas eacute muito
fraca tornando-se quase imperceptiacutevel em alguns casos Esta grande dificuldade em obter um
contraste de bandas adequado mesmo apoacutes longos periacuteodos de incubaccedilatildeo a 37degC poderaacute
eventualmente levar a uma incorrecta interpretaccedilatildeo dos fenoacutetipos Assim a utilizaccedilatildeo de
sistemas de focagem isoeleacutectrica na determinaccedilatildeo destes fenoacutetipos seria aconselhaacutevel a fim
de verificar os resultados obtidos por electroforese convencional
45
Resultados e Discussatildeo
Figura 3110 Fenoacutetipos de MPI observados por electroforese convencional em gel de amido
bull ALB
A separaccedilatildeo por focagem isoeleacutectrica permitiu detectar polimorfismo em ALB Cada
indiviacuteduo homozigoacutetico aparece com trecircs bandas duas de maior intensidade e uma mais
aciacutedica com menor intensidade os indiviacuteduos heterozigoacuteticos podem apresentar ateacute seis
bandas
Esta heterogeneidade nos padrotildees de ALB tem sido interpretada como o resultado da
capacidade desta proteiacutena se ligar a vaacuterias substacircncias diferentes (FERRAND 1995) Com a
inclusatildeo de ureia (8M) na matriz de separaccedilatildeo reagente que provoca a desnaturaccedilatildeo da
proteiacutena levando a uma alteraccedilatildeo do seu pi para uma zona mais baacutesica do gradiente
conseguem-se obter padrotildees de bandas mais simples e mais definidos (KAWAGUCHI 1973
FERRAND 1995)
Na figura 3111 apresentam-se os padrotildees observados que foram interpretados como
sendo determinados por trecircs alelos codominantes ALBA ALBB e ALBV
GAHNE et ai (1977) e IGLESIAS (1989) detectaram por electroforese em gel de
poliacrilamida e de amido respectivamente dois variantes em gado bovino ALBA e
ALBB A utilizaccedilatildeo de focagem isoeleacutectrica veio confirmar a existecircncia destes dois alelos e
acrescentar um terceiro designado por ALBV com uma mobilidade mais aciacutedico do que
ALBA
46
Resultados e Discussatildeo
A B A B A B B B A B A G
Figura 3111 Fenoacutetipos de ALB determinados em amostras de plasma por focagem isoeleacutectrica na presenccedila de ureia 8M
ARRANZ et ai (1992) revelaram a existecircncia de um outro variante (ALBD) com
mobilidade electroforeacutetica intermeacutedia entre ALBA e ALBB ainda natildeo descrito em
nenhuma raccedila autoacutectone espanhola Este alelo poderaacute corresponder ao alelo ALBV
encontrado neste trabalho apesar de apresentar um pi mais aacutecidico do que ALBA (ARRANZ
comunicaccedilatildeo pessoal)
Desta forma a teacutecnica de separaccedilatildeo por focagem isoeleacutectrica provou ser eficaz na
separaccedilatildeo dos variantes de ALB tal como jaacute foi demonstrado no gato (BELL et ai 1994) na
ovelha (ERHARDT amp SIMIANER 1993) e no coelho (FERRAND amp ROCHA 1992)
bull TF
A transferrina eacute um dos marcadores mais importantes no estudo e caracterizaccedilatildeo
geneacutetica de raccedilas bovinas devido ao seu elevado polimorfismo No entanto a sua fenotipagem
natildeo eacute simples existindo frequentemente problemas de resoluccedilatildeo e de separaccedilatildeo das bandas
(IGLESIAS 1989)
A fim de averiguar qual a melhor forma de separar os diferentes produtos geacutenicos
descritos no locus TF testaram-se vaacuterios sistemas electroforeacuteticos em geacuteis de agarose numa
vasta gama de sistemas tampatildeo Esta teacutecnica natildeo ofereceu resultados satisfatoacuterios pelo que se
passou agrave separaccedilatildeo da TF por focagem isoeleacutectrica recorrendo a matrizes de poliacrilamida
47
Resultados e Discussatildeo
com diferentes concentraccedilotildees de ureia (6M e 8M) tambeacutem neste caso natildeo se conseguiram
resultados positivos
Este tipo de dificuldades encontradas na fenotipagem da TF por focagem isoeleacutectrica
tinham jaacute sido descritos noutras espeacutecies nomeadamente na cabra (ERHARDT 1986) e no
coelho (FERRAND 1995) No entanto TSUJI et ai (1989) demostraram ser possiacutevel fenotipar
esta proteiacutena em bovinos por focagem isoeleacutectrica sem grandes problemas e sem qualquer
aditivo na matriz de poliacrilamida
Desta forma a utilizaccedilatildeo de uma teacutecnica de focagem isoeleacutectrica com um gradiente de
pH 35-65 reforccedilado em 40-65 permitiu separar os produtos geacutenicos do locus TF Contudo
os padrotildees obtidos nem sempre eram definidos tornando-se dificilmente interpretaacuteveis
Na tentativa de melhorar os padrotildees de resoluccedilatildeo e de verificar se a variaccedilatildeo detectada
natildeo resultava de diferenccedilas no estado feacuterrico da moleacutecula de TF ou ainda da existecircncia de
aacutecidos siaacutelicos ligados agrave moleacutecula procedeu-se agrave sua separaccedilatildeo apoacutes vaacuterios tratamentos das
amostras
A remoccedilatildeo dos aacutecidos siaacutelicos atraveacutes do tratamento das amostras com neuraminidase
natildeo permitiu a obtenccedilatildeo de bandas definidas este tratamento natildeo altera significativamente o
padratildeo das bandas de TF de bovinos como jaacute tinha sido descrito por PENHALLOU et ai
(1991)
A obtenccedilatildeo de TF no estado apofeacuterrico foi conseguida submetendo as amostras a um
tratamento com EDTA-dissoacutedico Neste caso observa-se que apoTF apresenta uma
mobilidade menor e um padratildeo de bandas mais simples mas ainda sem uma definiccedilatildeo
adequada
A forma Fe2TF foi obtida mediante vaacuterios tratamentos com dadores de Fe (ver capiacutetulo
Material e Meacutetodos) Os resultados soacute se mostraram satisfatoacuterios atraveacutes da saturaccedilatildeo da
moleacutecula de TF com uma soluccedilatildeo de sulfato de amoacutenio feacuterrico provavelmente por causar uma
maior estabilidade da moleacutecula ao longo da sua separaccedilatildeo por focagem isoeleacutectrica com
elevadas voltagens pois segundo WELCHS (1990) a forma difeacuterrica da transferrina eacute mais
resistente agrave desnaturaccedilatildeo e ao calor do que a forma apoTF
48
Resultados e Discussatildeo
Estatildeo descritos pelo menos oito alelos no locus TF TFAl TFA2 TFB TFD1
TFD2 TFE TFF e TFG os mais comuns no gado europeu (Bos taurus) satildeo TFA
TFD1 TFD2 e TFE (JAMIESON 1965) No gado asiaacutetico e africano (Bos indicus) ocorrem
aleacutem das formas anteriores os alelos TFB e TFF
Na figura 3112 apresenta-se o proteinograma obtido com a utilizaccedilatildeo de amostras
saturadas com Fe Esta teacutecnica permitiu a separaccedilatildeo de TFD em TFD1 e TFD2 e a
detecccedilatildeo de todos os outros fenoacutetipos descritos em bovinos europeus Assim observaram-se
quatro alelos codominantes TFA TFD1 TFD2 e TFE
A expressatildeo fenotiacutepica dos alelos em homozigotia caracteriza-se pela presenccedila de dois
dupletos de bandas aparecendo a banda mais aciacutedica de cada dupleto com intensidade mais
fraca Os indiviacuteduos herozigoacuteticos podem apresentar ateacute oito bandas
Figura 3112 Fenoacutetipos de TF determinados por focagem isoeleacutectrica apartir de amostras saturadas com uma soluccedilatildeo de sulfato de amoacutenio feacuterrico
IGLESIAS (1989) detectou TFA e TFD nas cinco raccedilas de bovinos da Galiza o
variante TFE na raccedila Cachena espanhola e um outro variante raro TFR com mobilidade
mais lenta na raccedila Rubia Galega
bull QQ
A GC eacute uma proteiacutena plasmaacutetica que demonstra um elevado grau de heterogeneidade
geneacutetica em mamiacuteferos (FERRAND 1995)
A separaccedilatildeo de GC em focagem isoeleacutectrica seguida da utilizaccedilatildeo de immunoblotting
melhorou de forma consideraacutevel a capacidade de investigar a variaccedilatildeo desta proteiacutena em
49
Resultados e Discussatildeo
diferentes espeacutecies (JUNEJA et ai 1987 PENEDO amp JUNEJA 1989 STRATIL et ai 1990
KALAacuteB et ai 1990 STERN et ai 1992 VANKAN amp BELL 1992 FERRAND 1995)
Nas figuras 3113 e 3114 apresentam-se alguns dos fenoacutetipos obtidos na separaccedilatildeo
da GC por focagem isoeleacutectrica Verifica-se que em amostras tratadas com neuraminidase o
padratildeo de bandas se apresenta mais simplificado surgindo no entanto duas bandas (uma
mais baacutesica e uma mais aciacutedica) de natureza desconhecida Os padrotildees observados foram
interpretados como sendo determinados por dois alelos GCF e GCS
mdashGCF
S F S FS S FS F F S FS 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Figura 3113 Fenoacutetipos de GC determinados por focagem isoeleacutectrica amostras 1 8 9 e 10 tratadas com neuraminidase amostras 2 a 7 diluiacutedas em aacutegua bidestilada
S1 $ l S- -
FS S S S F S FS S FS F S
Figura 3114 Fenoacutetipos de GC determinados em amostras de plasma tratados com neuraminidase apoacutes focagem isoeleacutectrica
Nota-se a existecircncia de dois alelos codominantes GCF e GCS sendo o segundo
mais aciacutedico do que o primeiro
50
Resultados e Discussatildeo
32 - ANAacuteLISE FAMILIAR
A realizaccedilatildeo da anaacutelise familiar relativo ao conjunto de loci polimoacuterficos estudados
observa-se no estudo de 27 pares matildeefilho Esta situaccedilatildeo resulta da grande dificuldade
existente na obtenccedilatildeo de informaccedilatildeo sobre os machos
Os resultados apresentam-se nas tabelas 321 a 326 natildeo foi possiacutevel testar o
equiliacutebrio de Hardy-Weinberg devido ao reduzido tamanho da amostra bem como ao facto de
vaacuterios alelos ocorrerem em baixa frequecircncia
Refira-se que natildeo foi detectado qualquer caso de exclusatildeo matildeefilho
Tabela 321 Sistema CAII Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica em 27 pares matildeefilho Os valores esperados segundo o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg estatildeo indicados entre parecircntesis
Total
4 (32) 17
(122) 6
(116) 27
Tabela 322 Sistema NP Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica em 27 pares matildeefilho Os valores esperados segundo o equiliacutebrio de Hardy--Weinberg estatildeo indicados entre parecircntesis
Total
14
(114)
13
(156)
27
^ ^ ^ Filho
Matildee - ^ F
Fenoacutetipos
F f~ (11)
FS 2
(21)
S
Total 3
Fenoacutetipos
FS S
3
(21)
10 5
(61) (40)
1 5
(40) (76)
14 10
- v ^ ^ Filho Fenoacutetipos
Matildee - ^ H L
Fenoacutetipos
H 10 4
(77) (37)
L 5 8
(37) (119)
Total 15 12
51
Resultados e Discussatildeo
Tabela 323 Sistema MPI Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica em 26 pares matildeefilho Os valores esperados segundo o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg estatildeo indicados entre parecircntesis
^ Filho Fenoacutetipos Total
Matildee ^ ~ ^ A AB AC B BC c Fenoacutetipos
A 0 0 0 - - - 0
(00) (00) (00) (00)
AB 0 0 0 0 0 - 0
(00) (00) (00) (00) (00) (00)
AC 0 0 0 - 0 0 0
(00) (00) (00) (00) (00) (00)
B - 0 - 24 1 - 25
(00) (242) (06) (248)
BC - 0 0 1 0 0 1
(00) (00) (06) (06) (00) (12)
C - - 0 - 0 0 0
(00) (00) (00) (00)
Total 0 0 0 25 1 0 26
Tabela 324 Sistema ALB Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica em 27 pares matildeefilho Os valores esperados segundo o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg estatildeo indicados entre parecircntesis
^ ^ Filho Fenoacutetipos Total
M atilde e ^ ^ - s ^ ^ A AB AV B BV V
Fenoacutetipos
A 24 2 0 - - - 26
(251) (04) (02) (257)
AB 0 0 0 0 0 -
0
(04) (04) (00) (00) (00) (08)
AG 1 0 0 - 0 0 1
(02) (00) (02) (00) (00) (04)
B - 0 - 0 0 - 0
(00) (00) (00) (00)
BG - 0 0 0 0 0 0
(00) (00) (00) (00) (00) (00)
G - - 0 - 0 0 0
(00) (00) (00) (00)
Total 25 2 0 0 0 0 27
52
Resultados e Discussatildeo
Tabela 325 Sistema TF Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica em 27 pares matildeefilho Os valores esperados segundo o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg estatildeo indicados entre parecircntesis
Filho Fenoacutetipos Total
Matildee ^ A ADI AD2 AE Dl D1D2 DIE D2 D2E E
Fenoacutetipos
A 6
(51)
1
(14)
4
(21)
1
(03)
12
(89)
ADI 1 2 0 0 0 0 0 - - - 3
(14) (24) (06) (01) (04) (06) (01) (56)
AD2 2 0 5 0 - 0 - 2 0 - 9
(21) (06) (36) (01) (06) (08) (01) (79)
AE 0 0 0 0 - - 0 - 0 0 0
(03) (01) (01) (06) (01) (01) (00) (13) Dl 0
(04) 1
(01)
1
(02)
0
(00)
- 2
(07)
D1D2 - 0 1 - 0 0 0 0 0 - 1
(06) (06) (02) (10) (00) (02) (00) (26) DIE - 0 - 0 0 0 0 - 0 0 0
(01) (01) (00) (00) (02) (00) (00) (04)
D2 0
(08) 0
(02)
0
(03)
0
(01)
- 0
(14) D2E - - 0 0 - 0 0 0 0 0 0
(01) (01) (00) (00) (01) (02) (00) (05) E 0
(00) 0
(00)
0
(00)
0
(00)
0
(00)
Total 9 3 10 1 1 1 0 2 0 0 27
Tabela 326 Sistema GC Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica em 27 pares matildeefilho Os valores esperados segundo o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg estatildeo indicados entre parecircntesis
- - ^ F i l h o Fenoacutetipos Total
Matildee ^ ^ 1 2-1 2
Fenoacutetipos
1 17 2 19
(156) (31) (187)
2-1 5 2 0 7
(31) (38) (06) (75)
2 _ 1 0 1
(06) (01) (07)
Total 22 5 0 27
53
Resultados e Discussatildeo
33 - ANAacuteLISE POPULACIONAL LOCUS A LOCUS
Neste capiacutetulo faz-se a anaacutelise populacional dos loci polimoacuterficos e ainda dos loci
PEPB e DIA para os quais natildeo se detectou variaccedilatildeo na raccedila Barrosatilde A sua inclusatildeo justifica-
-se pelo facto de serem polimoacuterficos noutras raccedilas bovinas ou em espeacutecies aparentadas
bull PEPB
O locus PEPB revelou-se monomoacuterfico nas trecircs populaccedilotildees de bovinos de raccedila
Barrosatilde e Minhota tendo sido detectado um uacutenico produto geacutenico PEPB2 (observado um
indiviacuteduo heterozigoacutetico da raccedila Minhota) No entanto este locus eacute referido como polimoacuterfico
em raccedilas bovinas criadas no Brasil onde se detectaram dois alelos codominantes PEPB1 e
PEPB2 (DEL LAMA et ai 1992)
O alelo PEPB2 estaacute fixado nas raccedilas de origem europeia incluindo as estudadas neste
trabalho excepto nas raccedilas italianas Marchigiana e Chianina nas quais PEPB1 apresenta
frequecircncias geacutenicas entre 011 e 014 (tabela 331)
Tabela 331 Frequecircncias geacutenicas de PEPB em vaacuterias raccedilas bovinas
N
Frequecircncias geacutenicas N PEPB1 PEPB2 Referecircncia
Barrosatilde inscrita 141 - 100 Este trabalho
Barrosatilde natildeo inscrita 153 - 100 t i
Minhota 62 001 plusmn0003 099 plusmn 0003 ec
Blonde dAquitaine 13 - 100 DEL LAMAetal 1992)
Charolesa 118 - 100 laquo
Chianina 83 014 plusmn003 086 plusmn 003 t t
Hereford 79 - 100 et
Frisia 125 - 100 t t
Jersey 139 - 100
Limousine 24 - 100
Marchigiana 85 011 plusmn002 089 plusmn 002 te
Simmental 75 - 100 t t
54
Resultados e Discussatildeo
bull DIA
Pela anaacutelise da tabela 332 verifica-se natildeo existir variaccedilatildeo geneacutetica neste locus nas
raccedilas bovinas apresentadas estando fixado o alelo DIAS os resultados obtidos estatildeo de
acordo com os jaacute publicados por outros autores (GONZALEZ et ai 1987 IGLESIAS 1989) Por
outro lado nas populaccedilotildees de buacutefalos ocorre um segundo alelo DIAF com frequecircncias
entre 019 e 021
Tabela 332 Frequecircncias geacutenicas de DIA em vaacuterias populaccedilotildees de raccedilas bovinas e buacutefalos
Frequecircncias geacutenicas
N DIAF DIAS Referecircncia
Portugal
Barrosatilde inscrita 141
Barrosatilde natildeo inscrita 153
Minhota 62
Espanha
Cachena 71
Caldelana 60
Frieiresa 33
Limiana 39
Rubia Gallega 168
Vianesa 40
Sayaguesa (Zamora) 147
Morucha (Salamanca) 101
Alistana Sanabresa 157
Blanca Cacerena 62
Caacuterdena Andaluza 25
Asturiana de los Vallegraves 127
Asturiana de la Montana 106
Bulgaacuteria
Buacutefalo 122
Murrah (Buacutefalo) 51
raquo IGLESIAS (1989)
- 100 Este trabalho
- 100
- 100 a
- 100 IGLESIAS (1989)
- 100
- 100
- 100
- 100
- 100
- 100 GONZALEZ et al (19
- 100
- 100 st
- 100 st
- 100
- 100
- 100
019 + 00 081 plusmn00 MAKAVEEV(1984
021 plusmn00 079 plusmn 00 laquo
55
Resultados e Discussatildeo
bull HB
Os resultados obtidos no estudo de HB permitiram distinguir dois fenoacutetipos definidos
por dois alelos HBA e HBB (tabela 333)
Tabela 333 Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica de HB em populaccedilotildees das raccedilas Barrosatilde e Minhota Os valores esperados de acordo com o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg estatildeo indicados entre parecircntesis
Fenoacutetipos N HBA HBAB HBB
Barrosatilde inscrita 141 141
Barrosatilde natildeo inscrita 153 153
Minhota 62 56 6 0
(561) (58) (01)
As frequecircncias geacutenicas das raccedilas estudadas bem como outras jaacute publicadas referentes a
vaacuterias raccedilas bovinas europeias e a duas espeacutecies de buacutefalos encontram-se discriminadas na
tabela 334
A elevada frequecircncia do alelo HBA nas raccedilas estudadas (fixado na raccedila Barrosatilde)
situam-nas juntamente com outras raccedilas bovinas do centro e sul da Europa onde este alelo
ocorre com frequecircncias entre 080-098 (VICENTE 1978) Nas restantes raccedilas europeias
HBA ocorre com uma ampla margem de variaccedilatildeo (038 - 100) apresentando-se quase
sempre como o alelo mais frequente
No caso dos buacutefalos observa-se uma inversatildeo nos valores das frequecircncias geacutenicas
sendo o alelo HBB o mais frequente
A presenccedila de HBB nos bovinos europeus apesar de em baixa frequecircncia pode ser
indicativo de uma origem a partir de raccedilas asiaacuteticas ou africanas jaacute que eacute nestes continentes
que este alelo ocorre com frequecircncia mais elevadas as frequecircncias geacutenicas mais elevadas estatildeo
descritas no gado zebu da Aacutefrica (BRAEND 1971 VICENTE 1978)
56
Resultados e Discussatildeo
Tabela 334 Frequecircncias geacutenicas de HB em vaacuterias populaccedilotildees de raccedilas bovinas e buacutefalos
N
Frequecircncias geacutenicas
N HBA HBB Referecircncia
Portugal
Barrosatilde inscrita 141 100 - Este trabalho
Barrosatilde natildeo inscrita 153 100 -
Minhota 62 095 plusmn 002 005 plusmn 002
Mertolenga 147 093 plusmn 002 007 plusmn 002 KTOD et ai (1980)
Alentejana 155 096 plusmn 001 004 plusmn001 IacuteIacute
Mirandesa 107 099+001 001 plusmn001 NOBRE (S data)
Espanha
Cachena 71 091 + 002 009 plusmn 002 IGLESIAS (1989)
Caldelana 60 097 plusmn 002 003 plusmn 002
Frieiresa 33 095 plusmn 003 005 plusmn 003
Limiana 39 090 plusmn 003 010 plusmn003
Rubia Gallega 168 093 plusmn 001 007 plusmn001 ce
Vianesa 40 098 plusmn 002 002 plusmn002
Sayaguesa (Zamora) 147 083 plusmn002 017 plusmn002 GONZALEZ et al ( 1987)
Morucha (Salamanca) 101 084 plusmn 003 016 plusmn003 ce
Alistana Sanabresa 157 099 plusmn 001 001 plusmn001
Blanca Cacerefia 62 071 plusmn 004 029 plusmn 004 laquo
Caacuterdena Andaluza 25 096 plusmn 003 004 plusmn 003 IacuteIacute
Asturiana de los Vallegraves 127 091 plusmn002 009 plusmn002
Pirenaica 383 084 plusmn 001 016 plusmn001 VICENTE (1978)
Tudanca 42 065 plusmn 005 035 plusmn 005 laquo
Morena del N O 25 100 -
Frisona 97 100 - laquo
Asturiana de la Montaria 106 079+003 021 plusmn003
De Lidia 124 079 plusmn 003 021 plusmn003 KlDDeacutetal (1980)
Retinta 164 081 plusmn002 019 plusmn002
Itaacutelia
Chianina 264 096 plusmn 001 004 plusmn 001 CARENZiera (1970)
Marchigiana 112 099 plusmn001 001 plusmn001
Bulgaacuteria
Sofia Brown 173 089 plusmn 002 011 plusmn002 MAKAVEEV (1970)
Buacutefalo 77 009 plusmn 002 091 plusmn002 MAKAVEEV(1984)
Murrah (Buacutefalo) 51 015 plusmn004 085 plusmn 004 ce
G Bretanha
Jersey 467 038 plusmn 002 062 plusmn 002 LARSENefa (1974)
in IGLESIAS (1989)
57
Resultados e Discussatildeo
A frequecircncia obtida para HBB na raccedila Minhota (005) aproxima-a das raccedilas do sul da
Europa onde este alelo ocorre com uma frequecircncia de aproximadamente 01 Por outro lado a
completa ausecircncia de HBB na raccedila Barrosatilde eacute um resultado interessante mas para o qual natildeo
eacute possiacutevel fornecer actualmente uma explicaccedilatildeo satisfatoacuteria
CAII
A distribuiccedilatildeo dos fenoacutetipos observados para o locus CAII apresenta-se na tabela
335
Tabela 335 Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica de CAU em populaccedilotildees das raccedilas Barrosatilde e Minhota Entre parecircntesis indicam-se os valores esperados de acordo com o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg
Fenoacutetipos N CA F CAFS CAS
Barrosatilde inscrita 141 17 58 66
(149) (622) (639)
Barrosatilde natildeo inscrita 153 20 71 62
(200) (710) (620)
Minhota 62 3 13 46
(14) (162) (444)
x2
0651 1 0420
0000 1 0995
Os valores do teste de 2 nas populaccedilotildees de raccedila Barrosatilde demonstram natildeo haver
desvios significativos ao equiliacutebrio de Hardy-Weinberg apesar de se observar um ligeiro
excesso de homozigoacuteticos F na populaccedilatildeo de raccedila Barrosatilde (inscrita) Para a raccedila Minhota natildeo
foi possiacutevel testar o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg
Na tabela 336 apresentam-se as frequecircncias geacutenicas de CAII nas populaccedilotildees
estudadas bem como as publicadas por outros autores
O locus CAII apresenta-se polimoacuterfico na maior parte das populaccedilotildees bovinas
europeias sendo o alelo CAIIS o que ocorre com frequecircncia mais elevada
58
Resultados e Discussatildeo
Tabela 336 Frequecircncias geacutemeas de CAU em vaacuterias populaccedilotildees de raccedilas bovinas e de buacutefalos
N
Frequecircncias geacutenicas N CAS CAF Referecircncia
Portugal
Barrosatilde inscrita 141 068 plusmn 003 032 plusmn 003 Este trabalho
Barrosatilde natildeo inscrita 153 064+003 036 plusmn 003
Minhota 62 085 plusmn 003 015+003 Iacute Iacute
Mertolenga 147 085 plusmn 002 015+002 Kn)Deiacutea(1980)
Alentejana 155 091 plusmn 002 009 plusmn 002
Mirandesa 107 099 + 001 001+001 NOBRE (S data)
Espanha
Cachena 71 077 + 004 023 plusmn 004 IGLESIAS (1989)
Caldelana 60 096 plusmn 002 004 plusmn 002 ce
Frieiresa 33 094 + 003 006 plusmn 003
Limiana 39 083 + 004 017 plusmn 004
Rubia Gallega 168 089 plusmn 002 011+002
Vianesa 40 086 + 004 014 plusmn 004
Sayaguesa 147 072 plusmn 003 028+003 GONZALEZ eacutetal (1987)
Morucha 101 072 plusmn 003 028 plusmn 003 a
Alistana Sanabresa 157 092 plusmn 002 008+002 iacute iacute
Blanca Cacerena 62 067 plusmn 004 033 plusmn 004 IacuteIacute
Caacuterdena Andaluza 25 100
Asturiana de los Vallegraves 127 087 plusmn 002 013+002 laquo
Asturiana de la Montaria 106 077 plusmn003 023 plusmn 003 IacuteIacute
Tudanca 42 076 plusmn 005 024 plusmn 005 VICENTE (1978)
Morena del NO 25 092 plusmn 004 008 plusmn 004
De Lidia 124 061+003 039 plusmn 003 KjDDetal (1980)
Retinta 164 065 + 003 035+003 iacuteiacute
Bulgaacuteria
Buacutefalo 263 007 + 001 093+001 MAKAVEEV(1984)
Murran (Buacutefalo) 51 020 plusmn 004 080 plusmn 004 laquo
Alemanha
Frisia 550 083 plusmn 001 017 + 001 THTNNES eacutetal (1976)
Suiacuteccedila
Simmental 1039 079 + 001 021+001 KAgraveSTLIeacutetal (1980)
Castanha Suiacuteccedila 546 087 plusmn 001 013+001
Friburg 223 084 + 002 016+002
in IGLESIAS (1989)
59
Resultados e Discussatildeo
As frequecircncias aleacutelicas de CAIPS e CAIPF nas raccedilas Cachena espanhola e Barrosatilde
portuguesa satildeo idecircnticas o que poderaacute eventualmente indicar estar-se em presenccedila de uma soacute
raccedila com designaccedilotildees diferentes nos dois paiacuteses Esta hipoacutetese eacute reforccedilada pelo facto de natildeo
haver diferenccedilas significativas entre dados morfomeacutetricos obtidos nas duas raccedilas (LEAL 1995)
Nos buacutefalos observa-se mais uma vez uma inversatildeo nas frequecircncias dos dois alelos do
locus CAII em relaccedilatildeo aos bovinos sendo CAF o mais frequente com valores situados entre
080 e 093
bull NP
Pela anaacutelise das tabelas 337 e 338 verifiacuteca-se a presenccedila dos dois alelos descritos
neste locus nas vaacuterias raccedilas bovinas sendo NPL o mais frequente nas raccedilas europeias (052 e
099) Observa-se uma grande similaridade entre os valores das frequecircncias geacutenicas o que natildeo
permite diferenciar as raccedilas estudadas neste trabalho das restantes
Tabela 337 Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica de NP em populaccedilotildees das raccedilas Barrosatilde e Minhota
N
Fenoacutetipos
N NP H NPL
Barrosatilde inscrita 141 69 72
Barrosatilde natildeo inscrita 153 55 98
Minhota 62 19 43
60
Resultados e Discussatildeo
Tabela 338 Frequecircncias geacutenicas para NP em vaacuterias populaccedilotildees e raccedilas bovinas
N
Frequecircncias geacutenicas
N NPH NPL Referecircncia
Portugal
Barrosatilde inscrita 141 029 plusmn 003 071 plusmn 003 Este trabalho
Barrosatilde natildeo inscrita 153 020 plusmn 002 080 plusmn 002 cc
Minhota 62 017 + 004 083 + 004
Espanha
Cachena 71 020 plusmn 003 080 plusmn 003 IGLESIAS (1989)
Caldelana 60 013+003 087 plusmn 003 t t
Frieiresa 33 011+004 089 plusmn 004
Limiana 39 008 plusmn 003 092 plusmn 003
Rubia Gallega 168 015+002 085 plusmn 002
Vianesa 40 013 + 004 087 plusmn 004 t i
Sayaguesa 147 014 + 002 086 plusmn 002 GONZALEZ et ai ( 1987)
Morucha 101 020 plusmn 003 080 plusmn 003
Alistana Sanabresa 157 001+001 099 + 001
Blanca Cacerena 62 048 plusmn 005 052 plusmn 005 laquo
Caacuterdena Andaluza 25 004 plusmn 003 096 plusmn 003 IacuteIacute
Asturiana de los Vallegraves 127 028 plusmn 003 072 plusmn 003
Asturiana de la Montana 106 026 plusmn 003 074 plusmn 003
Beacutelgica
Charolesa 130 026 plusmn 003 074 + 003 ANSAY amp HANSET (1972)
Frisia 91 006 plusmn 002 094 plusmn 002 t t
in IGLESIAS (1989)
MPI
A distribuiccedilatildeo dos fenoacutetipos observados para o locus MPI apresenta-se na tabela 339
Das trecircs populaccedilotildees estudadas apenas a raccedila Minhota apresenta valores observados
proacuteximos dos valores esperados segundo o formalismo de Hardy-Weinberg Por outro lado
apesar de natildeo ter sido possiacutevel testar o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg nas restantes populaccedilotildees
a aparente diferenccedila entre valores observados e esperados poderaacute dever-se a um excesso de
indiviacuteduos homozigoacuteticos para MPIC Este resultado poderaacute estar relacionado com o
processo de amostragem ou com outras causas como o acasalamento entre indiviacuteduos
61
Resultados e Discussatildeo
aparentados a existecircncia de sub-populaccedilotildees de tamanho pequeno ou ainda a um reduzido
nuacutemero de machos reprodutores
Tabela 339 Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica de MPI em populaccedilotildees das raccedilas Barrosatilde e Minhota Entre parecircntesis indicam-se os valores esperados de acordo com o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg
Fenoacutetipos N MPIA MPIAB MPIAC MPIB MPIBC MPIC
Barrosatilde inscrita 138 - - - 131 6 1
(1301) (78) (01)
Barrosatilde natildeo inscrita 1 5 2 - - - 147 4 1
(1460) (59) (01)
Minhota 61 0 3 0 56 2 0
(00) (29) (01) (561) (19) (00)
A anaacutelise da tabela 3310 permite verificar que MPIB e MPIC ocorrem nas duas
raccedilas de bovinos estudadas sendo MPIB o alelo mais comum nas trecircs populaccedilotildees A
ocorrecircncia de MPI A na raccedila Minhota contraria o descrito por ANSAY (1973) quando afirma
a exclusividade do fenoacutetipo AB na raccedila Charolesa
Tabela 3310 Frequecircncias geacutenicas de MPI nas populaccedilotildees estudadas
N
Frequecircncias geacutenicas
N MPPA MPPB MPIC
Barrosatilde inscrita 138 - 097 + 001 003+001
Barrosatilde natildeo inscrita 152 - 098 + 001 002+001
Minhota 61 002 plusmn 001 096 plusmn002 002 plusmn 001
A informaccedilatildeo disponiacutevel sobre este marcador em anteriores trabalhos de anaacutelise
geneacutetica em bovinos eacute quase inexistente Tal poderaacute dever-se agraves dificuldades de visualizaccedilatildeo
encontradas na sua fenotipagem por electroforese convencional A detecccedilatildeo de MPI estaacute
descrita em tecidos musculares e em leucoacutecitos neste trabalho utilizaram-se eritroacutecitos para o
estudo de variaccedilatildeo geneacutetica desta proteiacutena mas eacute provaacutevel que a sua expressatildeo ocorra apenas
na fracccedilatildeo leucocitaacuteria (natildeo separada) o que explicaria precisamente a sua fraca actividade
62
Resultados e Discussatildeo
ALB
A distribuiccedilatildeo dos fenoacutetipos observados para o locus ALB apresenta-se na tabela
3311
Apesar de natildeo ter sido possiacutevel testar o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg todas as
amostras estudadas mostram desvios muito reduzidos entre valores observados e esperados
Tabela 3311 Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica de ALB em populaccedilotildees das raccedilas Barrosatilde e Minhota Entre parecircntesis indicam-se os valores esperados de acordo com o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg
N
Fenoacutetipos N ALBA ALBAB ALBB ALBBV ALBAV ALB V
Barrosatilde inscrita 142 137 3 - - 2 -(1370) (30) (00) (00) (20) (00)
Barrosatilde natildeo inscrita 153 145 5 1 - 2 -(1440) (68) (01) (01) (20) (00)
Minhota 62 59
(590)
3 (30) (00)
Na tabela 3312 estatildeo discriminadas as frequecircncias geacutenicas estimadas para as
populaccedilotildees estudadas bem como as de outras populaccedilotildees de bovinos da Europa e de buacutefalos
da Bulgaacuteria
Verifica-se que ALBA eacute o alelo mais comum encontrando-se aparentemente fixado
em vaacuterias raccedilas bovinas de origem europeia
Como jaacute referido para HB a presenccedila de ALBB nas raccedilas europeias parece
relacionar-se com a sua localizaccedilatildeo geograacutefica verificando-se que de uma maneira geral a sua
frequecircncia aumenta agrave medida que nos aproximamos do sul da Europa e de Aacutefrica eacute no gado
zebu africano que este alelo ocorre com frequecircncias mais elevadas variando entre 030 e 060
(VICENTE 1978) Assim a presenccedila de ALBB no gado europeu poderaacute indicar a passagem
pela Europa de bovinos oriundos de Aacutefrica (CECCHINI amp Nus 1986) Eacute de notar que apenas a
raccedila Minhota e algumas das restantes raccedilas da Peniacutensula Ibeacuterica natildeo apresentam ALBB
63
Resultados e Discussatildeo
Tabela 3312 Frequecircncias geacutenicas de ALB em vaacuterias populaccedilotildees de raccedilas bovinas e em buacutefalos
Frequecircncias geacutenicas
N ALBA (F) ALBB (S) ALBV Referecircncia
Portugal
Barrosatilde inscrita 142 098 + 001 001 plusmn 001 001 plusmn001 Este trabalho
Barrosatilde natildeo inscrita 153 097 + 001 002+001 001 plusmn001
Minhota 62 098 plusmn 001 - 002 plusmn 001
Mertolenga 147 084 plusmn 002 016 + 002 - KlDDetal (1980)
Alentejana 155 094+001 006 plusmn 001 -
Mirandesa 106 094 + 002 006 plusmn 002 - NOBRE (S data)
Espanha -
Cachena 71 098 + 001 002+001 - IGLESIAS (1989)
Caldelana 60 098 plusmn 001 002 + 001 -
Frieiresa 33 100 - - raquo
Limiana 39 097 + 002 003 plusmn 002 -
Rubia Gallega 201 099 plusmn 000 001 plusmn000 -
Vianesa 40 093 + 003 007 + 003 -
Sayaguesa 147 096 plusmn001 004 plusmn 001 - GONZALEZ et al (1987)
Moracha 101 089 plusmn 002 011+002 -
Alistaria Sanabresa 157 090 plusmn 002 010 plusmn002 -
Blanca Cacerena 62 056 plusmn 005 044 plusmn 005 -
Caacuterdena Andaluza 25 100 - -
Asturiana de los Vallegraves 127 099 + 001 001 plusmn001 -
Asturiana de la Montana 106 099 plusmn001 001 plusmn001 -
Pirenaica 265 092 + 001 008 plusmn001 - VICENTE (1978)
Tudanca 42 100 - -
Morena del N O 25 092 + 004 008 plusmn 004 -
Frisona 97 100 - -
De Lidia 124 100 - - KIDDeacutetal (1980)
Retinta 164 097 + 001 003 plusmn001 -
Itaacutelia
Chinina 264 089 + 001 011 plusmn001 - CARENZIeacutetal (1970)
Marchigiana 124 074 + 003 026 plusmn 003 -
Beacutelgica
Pied vermelha Este-Flandern 503 100 - - BOUQUET amp VAN de WEGHE (1972)
Vermelha Oeste-Flandern 155 100 - -
Pied preta 174 100 - -
Pied vermelha-Campine 265 100 - -
w IGLESIAS (1989)
(Continua)
64
Resultados e Discussatildeo
Tabela 3312 Frequecircncias geacutenicas de ALB em vaacuterias populaccedilotildees de raccedilas bovinas e de buacutefalos (continuaccedilatildeo)
Frequecircncias geacutenicas N ALBA (F) ALBB (S) ALBV Referecircncia
Bulgaacuteria
Sofia Brow 170 096+001 004 + 001 - M A K A V E E V ( 1 9 7 0 )
Buacutefalo 225 047 plusmn 002 053 plusmn 002 - M A K A V E E V ( 1 9 8 4 )
Murrah (Buacutefalo) 76 012+003 088 plusmn 003 -
G Bretanha
Charolesa 99 084 plusmn 003 016 + 003 - SPOONER amp OLIVER (1969)
Frisia 1422 100 - -
Hereford 215 099 plusmn 001 001+001 -
Jersey 217 100 - -
laquo IGLESIAS (1989)
Neste trabalho descreve-se tambeacutem o alelo ALBV com uma frequecircncia de 001 e
002 nas raccedilas Barrosatilde e Minhota respectivamente Este alelo natildeo se encontra descrito em
qualquer raccedila europeia podendo a sua detecccedilatildeo estar relacionada com a capacidade resolvente
da teacutecnica de focagem isoeleacutectrica utilizada na separaccedilatildeo de ALB
TF
A transferrina eacute provavelmente o mais informativo dos sistemas polimoacuterficos estudados
em virtude do nuacutemero de alelos que apresenta
A distribuiccedilatildeo dos fenoacutetipos observados para o locus TF apresenta-se na tabela 3313
E possiacutevel verificar a existecircncia de equiliacutebrio de Hardy-Weinberg em todas as populaccedilotildees
estudadas
Da anaacutelise das frequecircncias geacutenicas expressas na tabela 3314 verifica-se que este locus
apresenta quatro produtos geacutenicos na maioria das raccedilas europeias sendo os alelos TFA e
TFD (incluindo os subtipos TFD1 e TFD2) os que apresentam frequecircncias mais elevadas
(027 a 092 para o alelo TFA e 026 a 073 para o alelo TFD)
Observa-se tambeacutem que a frequecircncia de TFD2 nas raccedilas estudadas eacute mais elevada do
que a de TFD1 como ocorre na maioria das raccedilas ibeacutericas
65
Resultados e Discussatildeo
No que se refere a TFE verifica-se que a sua frequecircncia eacute relativamente baixa nas
raccedilas europeias (001 e 022) e estaacute mesmo ausente em quase todas as raccedilas da regiatildeo da
Galiza (com excepccedilatildeo da raccedila Cachena espanhola e Rubia Gallega) e na raccedila Minhota Note-se
a grande semelhanccedila entre os valores de frequecircncias geacutenicas deste alelo na raccedila Cachena
espanhola (005) e nas populaccedilotildees de raccedila Barrosatilde (004 e 003) o que mais uma vez sugere
uma grande proximidade entre as duas Apesar de ocorrer em baixa frequecircncia nos bovinos
europeus a presenccedila de TFE nestas raccedilas pode indicar uma proveniecircncia asiaacutetica ou africana
pois eacute nestes continentes que aquele alelo eacute mais comum (BRAEND 1971)
66
Resultados e Discussatildeo
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Resultados e Discussatildeo
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Resultados e Discussatildeo
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69
Resultados e Discussatildeo
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A distribuiccedilatildeo dos fenoacutetipos observados para o locus GC apresenta-se na tabela 3315
A sua anaacutelise permite verificar a existecircncia de diferenccedilas entre os valores observados e
esperados para raccedila Barrosatilde (populaccedilatildeo inscrita no Livro Genealoacutegico) Este desvio ao
equiliacutebrio de Hardy-Weinberg deve-se agrave existecircncia de um excesso de homozigoacuteticos
sugerindo assim a ocorrecircncia de uma possiacutevel subestruturaccedilatildeo na populaccedilatildeo
Nas restantes amostras estudadas natildeo foi possiacutevel aplicar o teste de Contudo a
diferenccedila entre valores observados e esperados de acordo com o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg
eacute praticamente inexistente na populaccedilatildeo Barrosatilde natildeo inscrita e pouco acentuada na raccedila
Minhota
Tabela 3315 Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica de GC em populaccedilotildees das raccedilas Barrosatilde e Minhota Entre parecircntesis indicam-se os valores esperados de acordo com o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg
Fenoacutetipos N GCS GCFS GCF
Barrosatilde inscrita 142 98 35 8
(945) (419) (45)
Barrosatilde natildeo inscrita 153 109 40 4
(1087) (406) (37)
Minhota 62 54 5 3
(514) (101) (04)
x2
3913 1 0048
A distribuiccedilatildeo das frequecircncias geacutenicas apresentada na tabela 3316 mostra que GCS eacute
o alelo mais comum nas raccedilas europeias (com excepccedilatildeo da raccedila Frisia da Sueacutecia) As raccedilas
estudadas neste trabalho tecircm frequecircncias aleacutelicas para este locus que as aproximam das raccedilas
espanholas
70
Resultados e Discussatildeo
Tabela 3316 Frequecircncias geacutenicas de GC em vaacuterias populaccedilotildees de raccedilas bovinas
Frequecircncias geacutenicas
N GCF(ouA) GCS(ouB) GCC Referecircncia
Portugal
Barrosatilde inscrita
Barrosatilde natildeo inscrita
Minhota
Alentejana
Mirandesa
Espanha
De Lidia
Frisona
Beacutelgica
Branca e azul
Flemish vermelha
Campine vermelha e branca
Preta e branca
Flemish branca e vermelha
Sueacutecia
Vermelha e Branca
Frisia
141 018 plusmn0023
153 016 plusmn002
62 009 plusmn 003
028 plusmn 004
97 020 plusmn 003
1306 008 plusmn001
124 015 plusmn002
2323 031 plusmn001
431 016 plusmn001
299 012 plusmn001
299 019 plusmn002
140 006 plusmn 001
1030 039 plusmn001
273 079 plusmn 002
082 plusmn 002
084 plusmn 002
091 plusmn003
072 plusmn 004
080 plusmn 003
092 plusmn 001
085 plusmn 002
069 plusmn 001
084 plusmn 001
088 plusmn 001
081 plusmn002
065 plusmn 003
061 plusmn001
021 plusmn002
029 plusmn 003
Este trabalho
CUNHA (1994)
NOBRE (S data)
PIEDRAFUA et ai (1984)
VAN de WEGHE et ai (1982)
GAHNE(1963)
in PIEDRAFUA et ai (1984)
71
Resultados e Discussatildeo
34 - ANAacuteLISE POPULACIONAL CONJUNTA
341 - Diversidade geneacutetica na raccedila Barrosatilde
As estimativas da variabilidade geneacutetica das populaccedilotildees de bovinos das raccedilas Barrosatilde e
Minhota efectuaram-se considerando apenas 6 loci polimoacuterficos HB CAII MPI ALB TF e
GC
Tabela 341 Estimativa da variabilidade geneacutetica (6 loci) atraveacutes dos valores de heterozigotia observada (Ho) e esperada (He) nas populaccedilotildees estudadas
Barrosatilde inscrita Barrosatilde natildeo inscrita Minhota Locus
Ho He Ho He Ho He
HB 0000 0000 0000 0000 0097 0093
CAH 0411 0441 0464 0464 0210 0262
MPI 0043 0056 0026 0039 0082 0080
ALB 0035 0035 0046 0058 0048 0048
TF 0603 0590 0556 0595 0694 0638
GC 0248 0297 0261 0265 0081 0163
Os resultados expressos na tabela 341 mostram em geral a ausecircncia de diferenccedilas
significativas entre os valores de heterozigotia observada (Ho) e heterozigotia esperada (He)
para os loci estudados Deve contudo notar-se que na raccedila Minhota e quanto ao locus GC o
valor de He eacute aproximadamente o dobro da Ho Nos restantes loci o ligeiro desvio observado
entre Ho e He sugere em geral um deacutefice de heterozigoacuteticos
Nas duas populaccedilotildees de raccedila Barrosatilde os sistemas TF e CAII satildeo os que apresentam
valores de heterozigotia mais elevados Pelo contraacuterio os loci MPI e ALB mostram valores de
heterozigotia baixos possivelmente devido ao excesso de homozigoacuteticos (MPI B e ALB A)
detectados nas trecircs populaccedilotildees
Na tabela 342 apresentam-se os valores do nuacutemero meacutedio de alelos por locus (ria)
percentagem de loci polimoacuterficos (P) heterozigotia meacutedia observada (Ho) e heterozigotia
esperada (He) nas populaccedilotildees de bovinos estudados Estes valores devem ser interpretados
72
Resultados e Discussatildeo
tendo em conta o facto de os 6 loci investigados serem polimoacuterficos em pelo menos uma
populaccedilatildeo
Tabela 342 Variabilidade geneacutetica detectada em trecircs populaccedilotildees de bovinos atraveacutes da anaacutelise de 6 loci polimoacuterficos N - efectivo meacutedio estudado por locus na - nuacutemero meacutedio de alelos por locus P - proporccedilatildeo de loci polimoacuterficos Ho - heterozigotia observada He - heterozigotia meacutedia esperada Entre parecircntesis indicam-se os valores do desvio padratildeo
Raccedila Populaccedilatildeo N na P Ho He
Barrosatilde inscrita 1407 233 833 0223 0237
(06) (042) (0100) (0100)
Barrosatilde natildeo inscrita 1528 233 833 0226 0237
(02) (042) (0098) (0101)
Minhota 618 233 1000 0202 0214
(02) (021) (0101) (0090)
A sua anaacutelise permite verificar em primeiro lugar a ocorrecircncia de uma grande
semelhanccedila entre os valores de H nas duas raccedilas estudadas Barrosatilde e Minhota revelando a
existecircncia de uma variabilidade geneacutetica idecircntica nas trecircs populaccedilotildees de bovinos Observa-se
tambeacutem que os valores de heterozigotia meacutedia observada (Ho) natildeo diferem significativamente
dos valores de heterozigotia esperados (He) nas trecircs populaccedilotildees sendo o valor mais elevado o
encontrado na populaccedilatildeo de raccedila Barrosatilde (237)
Os elevados valores de P (833 na raccedila Barrosatilde e 100 na raccedila Minhota) resultam
do facto de apenas se terem utilizado loci polimoacuterficos nesta anaacutelise e o nuacutemero meacutedio de
alelos por locus (na) eacute igual nas trecircs populaccedilotildees estudadas (233)
A tabela 343 apresenta estimativas de FB Frr e FST para as trecircs populaccedilotildees de
bovinos Os valores de Fis indicam a existecircncia de uma acentuada deficiecircncia de
heterozigoacuteticos nos loci MPI e GC Nos restantes loci verifica-se por um lado a tendecircncia
para um excesso de heterozigoacuteticos nos loci HB e TF (com valores de -0051 e -0021
respectivamente) e por outro lado para uma ligeira deficiecircncia de heterozigoacuteticos nos loci
CAII e ALB (com valores de 0066 e 0072 respectivamente) A meacutedia ponderada de FiS
mostra uma deficiecircncia de heterozigoacuteticos de 48
73
Resultados e Discussatildeo
Tabela 343 Distribuiccedilatildeo relativa da diversidade geneacutetica nas trecircs populaccedilotildees de bovinos Hs-heterozigotia intrapopulacional HT-heterozigotia total Valores das estatiacutesticas F para 6 loci analisados
Locus H s Hx Fis FIT FST
HB 0030 0031 -0051 -0016 0033
CAII 0387 0404 0066 0104 0041
MPI 0058 0059 0130 0133 0004
ALB 0046 0047 0072 0075 0004
TF 0605 0627 -0021 0015 0036
GC 0241 0244 0183 0193 0012
Meacutedia 0228 0235 0048 0078 0031
As estimativas de FST indicam a existecircncia de um baixo grau de diferenciaccedilatildeo
populacional nos bovinos estudados Os valores de FST para os 6 loci analisados podem
considerar-se baixos (entre 0004 e 0041) apresentando uma meacutedia ponderada de 0031
Assim soacute uma pequena parte da diversidade geneacutetica (31) se deve a diferenccedilas entre as
populaccedilotildees sendo muito maior a diversidade dentro de cada populaccedilatildeo do que entre as
populaccedilotildees
Os baixos valores de FST encontrados para os loci MPI e ALB resultam de frequecircncias
elevadas de MPIB e ALBA respectivamente e traduzem uma grande homogeneidade entre
as raccedilas bovinas estudadas natildeo se detectando subestruturaccedilatildeo populacional
342 - Comparaccedilatildeo com outras raccedilas ibeacutericas
Tendo em conta o pequeno nuacutemero de loci comuns a este e a outros estudos
estimaram-se diferentes valores de heterozigotia meacutedia consoante o nuacutemero de loci de que se
dispunha Na tabela 344 e 345 apresentam-se valores de heterozigotia meacutedia para as
diferentes raccedilas obtidos a partir de quatro (FF) e cinco loci (FF+) respectivamente bem como
os valores de na P e os respectivos desvios padratildeo em vaacuterias raccedilas de bovinos ibeacutericos
A diversidade geneacutetica do bovino Barrosatilde avaliada pela taxa meacutedia de heterozigotia
(0281-0272 e 0249-0260 para 5 e 4 loci respectivamente) parece ocupar uma posiccedilatildeo
74
Resultados e Discussatildeo
intermeacutedia no seio das raccedilas ibeacutericas Tambeacutem o grau de variabilidade geneacutetica nos bovinos
avaliado por paracircmetros como o nuacutemero meacutedio de alelos por locus e a proporccedilatildeo de loci
polimoacuterficos (P) demonstra que as raccedilas estudadas neste trabalho ocupam uma posiccedilatildeo
intermeacutedia quando comparadas com outras raccedilas ibeacutericas
A anaacutelise das tabelas 344 e 345 mostra que todas as medidas de diversidade geneacutetica
(H P e de na) apresentam valores idecircnticos Esta semelhanccedila permite supor que o processo de
domesticaccedilatildeo iniciado haacute menos de 10000 anos natildeo levou a uma grande diferenciaccedilatildeo
geneacutetica entre as raccedilas pelo menos relativamente aos marcadores geneacuteticos estudados neste
trabalho Desta forma verifica-se que as principais diferenccedilas entre as raccedilas resultam de
pequenas alteraccedilotildees das suas frequecircncias geacutenicas provavelmente causadas pelo baixo nuacutemero
de animais destinados agrave reproduccedilatildeo (mais marcado nos machos) e pelos cruzamentos dirigidos
em cada raccedila
Por outro lado este baixo niacutevel de diferenciaccedilatildeo geneacutetica deveraacute estar tambeacutem
associado ao facto de na origem das raccedilas bovinas ibeacutericas se encontrar um uacutenico processo de
domesticaccedilatildeo seguido provavelmente de um processo de expansatildeo populacional bastante
recente do Proacuteximo Oriente ateacute agrave Europa Adicionalmente estima-se que a diferenciaccedilatildeo dos
bovinos em raccedilas autoacutectones soacute teraacute ocorrido nos uacuteltimos 300 anos (LOFTUS et ai 1994)
Neste contexto os eventuais estrangulamentos do efectivo populacional (bottleneck)
e efeitos de fundador ocorridos durante o periacuteodo inicial da domesticaccedilatildeo do gado bovino e
capazes de afectar de forma muito diferente vaacuterios nuacutecleos populacionais natildeo satildeo detectados
na Peniacutensula Ibeacuterica
75
Resultados e Discussatildeo
Tabela 344 Variabilidade geneacutetica em vaacuterias raccedilas de bovinos atraveacutes da anaacutelise de 4 loci polimoacuterficos N - efectivo meacutedio estudado por locus ria - nuacutemero meacutedio de alelos por locus P-- proporccedilatildeo de loci polimoacuterficos yent - heterozigotia meacutedia esperada Entre parecircntesis indicam-se os valores do desvio padratildeo
Raccedila Populaccedilatildeo N nbdquo P H +
Portugal
Barrosatilde inscrita 1410(00) 23 (05) 750 0249 (0135)
Barrosatilde natildeo inscrita 1530 (00) 23 (05) 755 0260(0135)
Minhota 620 (00) 20 (00) 1000 0216 (0094)
Mertolenga 1470 (00) 23 (03) 1000 0315 (0097)
Alentejana 1550(00) 23 (03) 1000 0239 (0123)
Mirandesa 1065 (03) 20 (00) 1000 0159(0110)
Espanha
Cachena 710 (00) 23 (03) 1000 0279(0111)
Caldelana 600 (00) 20 (00) 1000 0166 (0107)
Frieiresa 330 (00) 18(03) 750 0177(0112)
Limiana 390 (00) 20 (00) 1000 0246 (0087)
Rubia Gallega 1845(95) 25 (05) 1000 0215(0110)
Vianesa 400 (00) 20 (00) 1000 0221 (0087)
Sayaguesa 1470 (00) 23 (03) 1000 0320 (0094)
Morucha 1010(00) 23 (03) 1000 0361 (0084)
Alistaria Sanabresa 1570 (00) 23 (03) 1000 0213 (0104)
Blanca Cacerefia 618 (03) 20 (00) 1000 0377 (0078)
Caacuterdena Andaluza 250 (00) 15(03) 500 0131 (0106)
Asturiana de los Vallegraves 1265 (05) 23 (03) 1000 0237(0107)
Asturiana de la Montana 1060 (00) 23 (03) 1000 0280 (0088)
Tudanca 420 (00) 20 (04) 750 0321 (0109)
Morena del N O 250 (00) 18 (03) 750 0203 (0108)
Frisona 6540 (00) 18 (05) 500 0203 (0130)
De Lidia 1240 (00) 23 (03) 1000 0367(0135)
Retinta 1640 (00) 23 (03) 1000 0338 (0107)
76
Resultados e Discussatildeo
Tabela 345 Variabilidade geneacutetica em vaacuterias raccedilas de bovinos atraveacutes da anaacutelise de 5 loci polimoacuterficos N - efectivo meacutedio estudado por locus na - nuacutemero meacutedio de alelos por locus P--proporccedilatildeo de loci polimoacuterficos H^ - heterozigotia meacutedia esperada Entre parecircntesis indicam-se os valores do desvio padratildeo
Raccedila Populaccedilatildeo N na P i r Portugal
Barrosatilde inscrita 1410 (00) 22 (04) 800 0281 (0109)
Barrosatilde natildeo inscrita 1530(00) 22 (04) 800 0272 (0105)
Minhota 620 (00) 20 (00) 1000 0229 (0074)
Espanha Cachena 710 (00) 22 (02) 1000 0289 (0087)
Caldelana 600 (00) 20 (00) 1000 0180 (0084)
Frieiresa 330 (00) 18 (02) 800 0180 (0087)
Limiana 390 (00) 20 (00) 1000 0226(0071)
Rubia Gallega 1812(81) 24 (04) 1000 0223 (0086)
Vianesa 400 (00) 20 (00) 1000 0374 (0168)
Sayaguesa 1470 (00) 22 (02) 1000 0305 (0074)
Morucha 1010 (00) 22 (02) 1000 0353 (0066)
Alistaria Sanabresa 1570 (00) 22 (02) 1000 0174 (0089)
Blanca Cacerefla 616 (02) 20(00) 1000 0402 (0065)
Caacuterdena Andaluza 250 (00) 16(02) 600 0120 (0083)
Asturiana de los Vallegraves 1266 (04) 22 (02) 1000 0270 (0089)
Asturiana de la Montaria 1060(00) 22 (02) 1000 0301 (0072)
343 - Diferenciaccedilatildeo geneacutetica
Nas tabelas 346 e 347 apresentam-se as distacircncias geneacuteticas de Nei (NEI 1978)
calculadas para 23 (4 loci HB CAII ALB e TF) e 15 (5 loci HB CAII ALB TF e NP)
raccedilas bovinas ibeacutericas respectivamente Da sua anaacutelise ressalta o facto de aqueles valores
serem na sua maioria bastante baixos
De entre as raccedilas bovinas ibeacutericas estudadas a Frisona e a Cachena demonstram estar
mais proacuteximas da raccedila Barrosatilde com valores de DNei de 0092 (4 loci) e de 0104 (5 loci)
respectivamente Por outro lado as raccedilas Asturiana de la Montana e Vianesa aparecem como
as mais diferenciadas DNei= 0334 (4 loci ) e Dgtjei= 0330 (5 loci) respectivamente
77
Resultados e Discussatildeo
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Resultados e Discussatildeo
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Resultados e Discussatildeo
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80
Resultados e Discussatildeo
No que se refere agrave raccedila Minhota verifica-se que a Frieiresa eacute a que estaacute mais proacutexima
(valores de 0077 e 0074 para 4 e 5 loci respectivamente) e que mais um vez eacute a Asturiana de
la Montana a mais diferenciada das raccedilas (valores de 0389 e 0349 para 4 e 5 loci respectivamente)
A diferenciaccedilatildeo geneacutetica entre as raccedilas bovinas ibeacutericas encontra-se representada nos
dendrogramas construiacutedos pelos meacutetodos de agrupamento NJ (Neighbor-joining SATTOU amp
NEI 1987) e UPGMA (Unweightedpair-group arithmetic average SNEATH amp SOKAL 1973)
(figuras 341 342 343 e 344) Foram realizados testes de reamostragem do tipo
bootstrap (100 reacuteplicas) para a anaacutelise da consistecircncia dos padrotildees de ramificaccedilatildeo
apresentando-se os seus valores entre parecircntesis
A anaacutelise conjunta dos quatro dendrogramas permite verificar uma falta de consistecircncia
nos vaacuterios padrotildees de ramificaccedilatildeo para as raccedilas bovinas ibeacutericas associada a valores de
bootstrap em geral muito reduzidos De facto observa-se que o padratildeo de ramificaccedilatildeo dos
dendrogramas se altera consoante o meacutetodo de agrupamento usado e o nuacutemero de loci considerados Estas alteraccedilotildees nos agrupamentos das diferentes raccedilas devem-se
provavelmente agrave instabilidade causada pelo reduzido nuacutemero de loci polimoacuterficos utilizados
neste estudo bem como ao facto de as frequecircncias geacutenicas serem muito semelhantes em todas
as populaccedilotildees estudadas
Deve contudo referir-se que a raccedila Barrosatilde aparece normalmente associada a vaacuterias
raccedilas do norte da Peniacutensula Ibeacuterica nomeadamente a Cachena (Galiza) a Asturiana de la
Montana (Astuacuterias) a Sayaquesa e a Morucha (Salamanca)
No que se refere agrave raccedila Minhota esta aparece vaacuterias vezes associada agraves raccedilas Rubia
Gallega Frisona Asturiana de los Vallegraves e Frieiresa
81
Resultados e Discussatildeo
(18)
(14)
(11)
(5)
(3)
Sayaquesa
(39)
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Caldelana Alistano Sanabresa
Figura 341 Dendrograma construiacutedo com base nas distacircncias geneacuteticas de NEI (1978) entre 23 raccedilas de bovinos (4 loci HBCAII ALB e TF) atraveacutes do meacutetodo de agrupamento NJ Os valores de probabilidade de ocorrecircncia de cada agrupamento obtidos atraveacutes de um teste de bootstrap indicam-se entre parecircntesis
82
Resultados e Discussatildeo
Morucha
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Rubia Gallega Asturiana de los Vallegraves Freiresa
Frisona Minhota Alentejana Mertolenga
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Caacuterdena Andaluza Vianesa
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Asturiana de la Montana Morena NO Blanca Cacerena
Figura 342 Dendrograma construiacutedo com base nas distacircncias geneacuteticas de NEI (1978) entre 23 raccedilas de bovinos (4 loci HB CAII ALB e TF) atraveacutes do meacutetodo de agrupamento UPGMA Os valores de probabilidade de ocorrecircncia de cada agrupamento obtidos atraveacutes de um teste de bootstrap indicam-se entre parecircntesis
83
Resultados e Discussatildeo
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Figura 343 Dendrograma construiacutedo com base nas distacircncias geneacuteticas de NEI (1978) entre 15 raccedilas de bovinos (5 loci HB CAII ALB TF e NP) atraveacutes do meacutetodo de agrupamento NJ Os valores de probabilidade de ocorrecircncia de cada agrupamento obtidos atraveacutes de um teste de bootstrap indicam-se entre parecircntesis
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Alistano Sanabresa
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Frieiresa
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Asturiana de la Montana
Figura 344 Dendrograma construiacutedo com base nas distacircncias geneacuteticas de NEI (1978) entre 15 raccedilas de bovinos (5 loci HB CAII ALB TF e NP) atraveacutes do meacutetodo de agrupamento UPGMA Os valores de probabilidade de ocorrecircncia de cada agrupamento obtidos atraveacutes de um teste de bootstrap indicam-se entre parecircntesis
84
Resultados e Discussatildeo
No seu conjunto estes resultados natildeo satildeo suficientes para o estabelecimento de uma
histoacuteria evolutiva das actuais raccedilas bovinas ibeacutericas nem para a separaccedilatildeo da raccedila Barrosatilde das
restantes Consequentemente natildeo eacute possiacutevel neste momento fazer corresponder a anaacutelise da
diversidade e estrutura geneacutetica das populaccedilotildees ibeacutericas de gado bovino com alguma das
hipoacuteteses evolutivas propostas por diversos autores com base em evidecircncia morfoloacutegica
(VALLEJO 1978 IGLESIAS 1989 CORDEIRO 1986 JORGE 1996)
De acordo com essa evidecircncia a raccedila Barrosatilde (e tambeacutem a Cachena) derivaria do
denominado tronco mauritaacutenico (Bos primigenius opisthonomus) ou seja de populaccedilotildees
originaacuterias do Norte de Aacutefrica que teriam passado para o sul da Peniacutensula Ibeacuterica alcanccedilando
mais tarde o Norte de Portugal e de Espanha Por outro lado a filiaccedilatildeo da raccedila Minhota
segundo JORGE (1996) deriva do tronco aquitacircnico (Bos primigenius primigenius) tal como a
maior parte das raccedilas da Galiza das Astuacuterias e dos Pirineacuteus
Embora os resultados apresentados neste trabalho pareccedilam de facto indicar que as
raccedilas Barrosatilde e Minhota derivam de troncos diferentes eacute necessaacuterio aprofundar de forma
muito consideraacutevel a investigaccedilatildeo sobre a estrutura geneacutetica das raccedilas bovinas ibeacutericas antes de
se poder formular conclusotildees mais sustentadas
85
Con8ideraccedil8es Finais
4 - CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
O trabalho desenvolvido nesta dissertaccedilatildeo permitiu o estudo de alguns sistemas
geneacuteticos polimoacuterficos jaacute descritos em bovinos (HB CAII NP MPI ALB TF e GC) nas
raccedilas Barrosatilde e Minhota Permitiu ainda a aplicaccedilatildeo de teacutecnicas de separaccedilatildeo electroforeacuteticas
mais eficazes em alguns desses sistemas
Vaacuterias limitaccedilotildees durante a execuccedilatildeo praacutetica deste trabalho obrigaram de alguma
forma a alteraccedilotildees no programa inicial Entre elas devem referir-se
1 a recolha de amostras de sangue mostrou-se difiacutecil e demorada sendo necessaacuteria a
coordenaccedilatildeo de esforccedilos de vaacuterias entidades (Direcccedilatildeo Regional de Agricultura de
Entre Douro e Minho e brigadas de Sanidade Animal locais) de veterinaacuterios e de
criadores de bovinos retirando tempo agrave execuccedilatildeo praacutetica do trabalho
2 a afinaccedilatildeo de vaacuterias teacutecnicas electroforeacuteticas para certos marcadores geneacuteticos
envolveu um consideraacutevel esforccedilo de investigaccedilatildeo
3 a impossibilidade de apurar atempadamente as teacutecnicas de separaccedilatildeo ou de
visualizaccedilatildeo para a amilase a ceruloplasmina e a poacutes-transferrina
4 a escassa bibliografia sobre o bovino Barrosatilde e sobre as teacutecnicas utilizadas neste
trabalho em gado bovino
Apesar das limitaccedilotildees considera-se que este trabalho se reveste de alguma importacircncia
pelo facto de constituir um contributo para a caracterizaccedilatildeo geneacutetica de uma raccedila bovina muito
peculiar A este respeito entendeu-se que numa primeira fase se procederia ao estudo de um
conjunto de proteiacutenas polimoacuterficas de forma a poder iniciar uma comparaccedilatildeo com outras raccedilas
bovinas nomeadamente ibeacutericas para as quais jaacute existem resultados publicados Por outro
86
Consideraccedilotildees Finais
lado o estabelecimento de um conjunto de teacutecnicas de fenotipagem dos loci considerados
permite desde logo a sua aplicaccedilatildeo em questotildees de identificaccedilatildeo individual e de anaacutelise da
paternidade
Eacute contudo evidente que o aprofundamento deste trabalho deveraacute necessariamente
evoluir na direcccedilatildeo da anaacutelise molecular da variaccedilatildeo geneacutetica Adicionalmente seraacute do maior
interesse alargar o domiacutenio de investigaccedilatildeo agraves restantes raccedilas bovinas autoacutectones
Em face do exposto entende-se ser possiacutevel definir trecircs linhas de investigaccedilatildeo para os
proacuteximos anos
1 - ampliaccedilatildeo da bateria de sistemas geneacuteticos polimoacuterficos detectados em proteiacutenas do
sangue e do leite
2 - anaacutelise da variabilidade geneacutetica de um conjunto de microssateacutelites se possiacutevel
associados a algumas das proteiacutenas polimoacuterficas jaacute descritas
3 - estudo do polimorfismo da moleacutecula de DNA-mitocondrial
De uma forma geral pode assim considerar-se que os principais objectivos definidos
no iniacutecio deste trabalho foram alcanccedilados pelo que se apresentam em seguida as conclusotildees
87
Conclusotildees
5 - CONCLUSOtildeES
A utilizaccedilatildeo de um sistema de focagem isoeleacutectrica permitiu detectar a existecircncia de
polimorfismo geneacutetico na hemoglobina distinguindo-se dois produtos geacutenicos na raccedila bovina
Minhota HBA e HBB Na raccedila Barrosatilde HBA foi o uacutenico produto geacutenico encontrado
A utilizaccedilatildeo de um sistema de focagem isoeleacutectrica permitiu a detecccedilatildeo de dois
produtos geacutenicos no locus CAII (CAIPF e CAIPS) e revelou-se mais eficaz de que as
teacutecnicas de separaccedilatildeo convencional em gel de amido
A investigaccedilatildeo realizada permitiu detectar a ocorrecircncia de polimorfismo geneacutetico de
MPI atraveacutes de um sistema electroforeacutetico em gel de amido tendo-se detectado trecircs produtos
geacutenicos (MPIA MPIB e MPIC) A fraca actividade de MPI e a grande dificuldade na
obtenccedilatildeo de um contraste de bandas adequado poderaacute dever-se ao facto de a sua expressatildeo soacute
ocorrer na fracccedilatildeo leucocitaacuteria do sangue
A aplicaccedilatildeo de um sistema de focagem isoeleacutectrica na presenccedila de ureia (8M) revelou-
-se muito eficaz na separaccedilatildeo de ALB e permitiu detectar pela primeira vez um novo variante
ALBV ligeiramente mais aciacutedico do que ALBA
A combinaccedilatildeo de uma teacutecnica de focagem isoeleacutectrica com um preacutevio tratamento das
amostras a fim de saturar a moleacutecula de TF com Fe permitiu a detecccedilatildeo de quatro produtos
geacutenicos (TF A TFD1 TFD2 e TFE) nas raccedilas estudadas
88
Conclusotildees
A combinaccedilatildeo de uma teacutecnica de focagem isoeleacutectrica com a detecccedilatildeo por
immunoblotting permitiu detectar dois produtos geacutenicos no locus GC (GCA e GCB) O
tratamento de amostras com neuraminidase permitiu a obtenccedilatildeo de padrotildees mais simples do
que os conseguidos com amostras nativas Esta simplificaccedilatildeo resulta da provaacutevel remoccedilatildeo de
aacutecidos siaacutelicos ligados agrave moleacutecula de GC
Natildeo se detectou nenhum caso de exclusatildeo na anaacutelise de segregaccedilatildeo de 27 pares
matildeefilho feita separadamente para cada locus
Verifiacutecou-se a presenccedila de dois alelos raros HBB e PEPB1 na raccedila Minhota Estes
alelos poderatildeo ser utilizados na distinccedilatildeo das duas raccedilas estudadas
Foi encontrado um valor de heterozigotia meacutedia de 0237 em populaccedilotildees de raccedila
Barrosatilde indicativo de uma variabilidade geneacutetica intermeacutedia em relaccedilatildeo agrave generalidade das
raccedilas ibeacutericas As diferenccedilas observadas entre as vaacuterias raccedilas ibeacutericas poderatildeo reflectir
fenoacutemenos histoacuterico-evolutivos muito recentes dada a sua proximidade e grande semelhanccedila
Foi observado um reduzido niacutevel de diferenciaccedilatildeo entre as raccedilas Barrosatilde e Minhota
(FST= 0031) demonstrando-se que a maior parte da diversidade geneacutetica se atribui a diferenccedilas
intrapopulacionais Este valor de FST pode considerar-se baixo quando comparado com o
obtido no estudo de outras espeacutecies animais sugerindo um elevado fluxo geacutenico
interpopulacional Por outro lado reflecte ainda uma histoacuteria demograacutefica muito recente
A utilizaccedilatildeo de meacutetodos de agrupamento NJ e UPGMA obtidos a partir de matrizes de
distacircncias geneacuteticas de Nei natildeo permitiu separar a raccedila Barrosatilde das restantes raccedilas ibeacutericas
89
Referecircncias Bibliograacuteficas
6 - REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
AMORIM A (1983) Contribuiccedilatildeo para o conhecimento da Geneacutetica Humana Estudo de Geneacutetica Bioquiacutemica
Formal e Populacional e de Ligaccedilatildeo Factorial Tese de Doutoramento Faculdade de Ciecircncias do
Porto
AMORIM A KOMPF J SCHUNTER F amp RITTER H (1982) Aminolevulinate dehydratase (EC42124)
Linkage analysis Hum Genet 61 48-49
ANSAY M (1973) Techniques microelectrophoretiques dans lanalyse de la multipliciteacute enzymatique chez les
bovins Deacutetection Eacutelectrophoreacutetique des Polymorphismes Biochimiques Chez les Mammifegraveres
Application a LEacutetude Geacuteneacutetique des Populations Centre National de la Recherche Scientifique
Paris 43-58
ARANA A pound amp ZARAGOZA P (1986) Nueva electroforetica dei enzima NADH-Diafrosa (DIA-2) detectada
en la espeacutecie Oryctolagus cuniculus (L) Zootecnia XXXV ndeg 7-12 125-130
ARAUacuteJO J (1986) Contribuiccedilatildeo para o estudo dos bovinos de raccedila Barrosatilde Relatoacuterio de estaacutegio da
licenciatura em Engenharia Zooteacutecnica Universidade dos Accedilores
ARNOLD I C J amp Bouw J (1989) A new allele of glucose phosphate isomerase in dogs Animal Genetics
20 217-220
ARRANZ J J BAYON Y amp SAN PRIMITIVO F (1992) Biochemical polymorphisms in Spanish Avilena-
-Negra Ibeacuterica cattle Animal Genetics 23 (suppl 1) 19
ARRANZ J J BAYON Y amp SAN PRIMITIVO F (1996) Comparison of protein markers and microsatellites in
differentiation of cattle populations Animal Genetics 27 415-419
ASHTON G C (1965) Cattle serum transferrins A balanced polymorphism Genetics 52 983-997
90
Referecircncias Bibliograacuteficas
BAINES J amp MEacuteLEK J (1980) Egipto - Deuses Templos e Faraoacutes Grandes Culturas e Civilizaccedilotildees Ciacuterculo
de Leitores
BELL K ARTHUR H amp ANDERSON I L (1994) Esterase and albumin polymorphism in the domestic cat
(Felis catus) XXIV International Conference on Animal Genetics Praga Julho 1994
BEKENEV V A amp ORLOVA G V (1991) Polymorphism of erytrocytic enzymes in Large White pig breeds in
Siberia Animal Genetics 22 (suppl 1) 23-24
BOWLING A T amp CLARK R S (1988) Excess of heacuteteacuterozygotes at albumin locus in American Standardbred
horses Animal Genetics 19 331-341
BOWLING A T GORDON L PENEDO M C T WICTUM E amp BEEBOUT J (1990) A single gel for
determining genetic of equine erythrocyte carbonic anhydrase (CA) and catalase (Cat) Animal
Genetics 21 191-197
BRADLEY D G MACHUGH D E CUNNINGHAM P amp LOFTUS R T (1996) Mitochondrial diversity and
the origins of African and European cattle Proceeding of the National Academy of Sciences of USA
93 5131-5135
BRAEND M (1971) Studies on the relationships between cattle breeds in Africa Asia and Europe Evidence
obtained by studies of blood groups and protein polymorphisms World Review of Animal Production
VIO (1) 10-14
BRAEND M (1988) Haemoglobin polymorphism in Norwegian Red Cattle Animal Genetics 19 59-62
BRAEND M NESSE 1 L amp EFREMOV G D (1988) Expression and genetics of caprine haemoglobins
Animal Genetics 18 223-231
BROWN L B KANE H amp AYRES H (1993) Vital signs WW Norton e Co pp 323 New York
CARTER D C HE X M MUNSON S EL TWIGG P D GERNERT K M BROOM M B amp MILLER T
Y (1989) Three dimensional structure of human serum albumin Science 244 1195-1198
CECCHINI G amp Nus M D (1986) Literature review on cattle blood polymorphisms and preliminary results
of analysis in East African Zebu in Ethiopia Agric Subtrop and Ttropicale 3 (80) 433-463
91
Referocircicias Bibliograacuteficas
CiacuteZovAacute D STRATIL A MULLER E amp CEPICA S (1993) A new partially deficient transferrin variant in
the pig Animal Genetics 24 305-306
CLARKE S W TUCKER E M amp OSTERHOFF D R (1989) Blood groups and biochemical polymorphism
in the Namaqua sheep breed Animal Genetics 20 279-286
CLUTTON-BROCK J (1992) Domestication of animals In Jomes S Martin R Pilbeam D (eds) The
Cambridge Encyclopedia of Human Evolution pp 380-385 Cambridge University Press
CORDEIRO J P (1986) As raccedilas bovinas em Portugal - Sua Origem O meacutedico veterinaacuterio I (1) 29-39
CRISTOFALO G Cozzi M C amp VALIATI P (1992) Identification of a new variant in the equine serum
alB-glycoprotein (A1B) system Animal Genetics 23 (suppl 1) 24
CUNHA L M (1994) Caracterizaccedilatildeo Morfo-Funcional e Geneacutetica da Raccedila Bovina Alentejana Trabalho de
fim de curso apresentado agrave Escola Superior Agraacuteria de Beja
DEL LAMA S N DEL LAMA M A MESTRINER M A amp MORTARI N (1992) Peptidase B polymorphism
in cattle erythrocytes Biochem Genet 30 247-255
DRATCH P TATE M KRAAY G J amp GERWING V (1992) Plasma proteins differentiating European red
deer and North American elk Animal Genetics 23 (suppl 1) 32
EGGEN A amp FRIES R (1995) An integrated cytogenetic and meiotic map of the bovine genome Animal
Genetics 26 215-236
ERHARDT G (1986) Transferrin variants in sheep separation and characterization by polyacrylamide gel
electrophoresis and isoelectric focusing Animal Genetics 17 343-352
ERHARDT G (1991) Genetic polymorphism of vitamin D binding protein and serum albumin in sheep
Animal Genetics 22 (suppl 1) 28-29
ERHARDT G amp SIMIANER H (1993) Linkage between the loci for serum albumin and vitamin D binding
protein (GC) in sheep Animal Genetics 24 301-303
EPSTEIN H amp MASON I L (1984) Cattle In Mason I L (ed) Evolution of domesticated animals pp 7-
-27 Longman
92
Referecircncias Bibliograacuteficas
FAO (1993) A diversidade da Natureza Um patrimoacutenio valioso Documento produzido pela FAO Divisatildeo de
informaccedilatildeo - Out de 1993 Veterinaacuteria Teacutecnica 10 10-12
FAO (1996) World Watch List for Domestic Animal Diversity 2a ediccedilatildeo FAOUNEP pp 334 Roma
FARNDALE B M HUBBARD D E amp ANDERSON L L (1992) A new PGD variant in New Zeland
Thoroughbred horses Animal Genetics 23 (suppl 1) 24
FELSENSTEIN J (1993) PHYLIP (Phylogeny Inference Package) Version 35 Distributed by the autor Seattle
University of Washington
FERNANDES M T S (1996) Raccedilas de bovinos autoacutectones Um importante recurso geneacutetico animal portuguecircs
a preservar e a defender Veterinaacuteria Teacutecnica 12 10-15
FERRAND N (1995) Variaccedilatildeo geneacutetica de proteiacutenas em populaccedilotildees de coelho (Oryctolagus cuniculus) -
- Anaacutelise da diferenciaccedilatildeo subespecifica subestruturaccedilatildeo expansatildeo geograacutefica e domesticaccedilatildeo
Dissertaccedilatildeo de Doutoramento em Biologia apresentada agrave Faculdade de Ciecircncias da Universidade do
Porto
FERRAND N amp ROCHA J (1991) Genetic polymorphism of serum albumin in wild rabbits populations
Animal Genetics 22 (suppl 1) 36
FORBES P MACKEITH B amp PEBERDY R (1986) Mamiacuteferos Ungulados e Lagomorfos Ciacuterculo de Leitores
FRIES R EGGEN A amp WOMACK J E (1993) The bovine genome map Mammalian Genome 4 405-428
GAHNE B(1963) Inherited variation in the post-albumin of cattle serum Hereditas 50126-135
GAHNE B JUNEJA R K amp GROLMUS J (1977) Horizontal polyacrylamine gel electrophoresis for the
simultaneous phenotyping of transferrin post-transferrin albumin and post-albumin in the blood
plasma of cattle Arum Bid Grps Biochem Genet 8127-137
GARCIA L S VICENTE M V BECERRA A L YEBRA F A RODRIcircGUES M F amp LOacutePEZ J M S
(1992) Razas Bovinas Autoacutectonas de Galicia - I Razas Morenas Galegas (Recursos Xeneacuteticos a
Conservar) Xunta de Galicia
GARCIA M ROSAacuteRIO J amp ANTUNES M (1981) Bovinos em Portugal Direcccedilatildeo dos Serviccedilos Veterinaacuterios -
- DGSV pp 44-78 Lisboa
93
Referecircncias Bibliograacuteficas
GLOWATZKI-MULLIS M L GAILLARD C WIGGER G amp FRIES R (1995) Microsatellite-based
parentage control in cattle Animal Genetics 26 7-12
GONCcedilALVES GARCIA M L (1964) A Raccedila Bovina Barrosatilde Boletim Pecuaacuterio n deg 1 Ano XXXII DGSP
pp 103-172 Lisboa
GONZALEZ P TUNON MJ amp VALLEJO M (1987) Genetic relationships between Spanish native breeds of
cattle Animal Genetics 18 249-256
HALL S B L COTHRAN E G amp KING J A (1991) Variability of manosephosphate isomerase (MPI)
from haemolysate in 14 horse breeds Animal Genetics 22 (suppl 1) 22
HARRIS H amp HOPKINSON D A (1976) Handbook of enzyme electrophoresis in human genetics North-
-Holland Publishers
HEMMER H (1990) Domestication The decline of environmental appreciation Cambridge University Press
HERZOG S (1988) Polymorphism and genetic control of erythrocyte 6-phosphogluconate dehydrogenase in
the genus Cervus Animal Genetics 19 291-294
HERZOG S (1989) Genetic polymorphism of transferrin in fallow deer Cervus dama L Animal Genetics 20
421-426
IGLESIAS A B (1989) Estrutura y relaciones geneacuteticas de razas bovinas mediante marcadores geneacuteticos
(Polimorfismos Bioquiacutemicos) Dissertaccedilatildeo de Doutoramento em Biologia apresentada agrave Faculdade de
Biologia da Universidade de Santiago
JAMIESON A (1965) The genetics of transferrins in cattle Heredity 20 419-441
JANZEN M K amp COTHRAN E G (1991) A new PGD variant from North American horses of feral origin
Animal Genetics 22 (suppl 1) 21-22
JORGE E S (1996) Bovinos da raccedila Minhota Contribuiccedilatildeo para a sua histoacuteria Veterinaacuteria Teacutecnica 10 10-
-18
94
Referecircncias Bibliograacuteficas
JUNEJA R K GAHNE B amp STRATIL A (1987) Polymorphic plasma postalbumins of some domestic
animals (pig Po2 horse XK and dog Pa proteins) identified as homologous Animal Genetics 18 119-
-124
JUNEJA R K KURYL J GAHNE B amp ZURKOWSKI M (1989) Linkage between the loci for transferrin
and ceruloplasmin in pigs Animal Genetics 20 307-311
KALAB P STRATIL A amp GLASNAacuteK V (1990) Genetic polymorphism of serum vitamin D-binding protein
(GC) in sheep and mouflon Animal Genetic 21 317-321
KAWAGUCHI T (1973) Polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of serum albumin into three
bands Clinica ChimicaActa 45 85-92
KIDD K K STONE W H CRIMELLA C CARENZI C CASATI M amp ROGNONI G (1980)
Immunogenetic and population genetic analyses of Iberian cattle Anim Blood Grps Biochem Genet
11 21-38
KRISTJANSSON F K (1963) Genetic control of two pre-albumins in pigs Genetics 48 1059-1063
KRISTJANSSON F K amp HICKMAN C G (1965) Subdivision of the allele TF D for transferrins in Holstein
and Ayrshire cattle Genetics 52 627-630
KUROSAWA Y amp TANAKA K (1988) Electrophoretic variants of serum transferrin in wild pig populations of
Japan Animal Genetics 19 31-35
LEAL C (1995) Apreciaccedilatildeo fenotiacutepica de um nuacutecleo de bovinos de raccedila Barrosatilde e amostragem para sua
caracterizaccedilatildeo geneacutetica Relatoacuterio de estaacutegio de licenciatura em Biologia - Ramo Cientiacutefico
Tecnoloacutegico em Ecologia e Recursos Zooloacutegicos Faculdade de Ciecircncias da Universidade do Porto
LITT M amp LUTTY J A (1989) A hipervariable microsatellite revealed by in vitro amplification of a
dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene American Jornal of Human Genetics 44
397-401
LOFTUS R T MACHUGH D E NGERE L O BALAIN D S BADI A M BRADLEY D G amp
CUNNINGHAM E P (1994a) Mitochondrial genetic variation in European African and Indian cattle
populations Animal Genetics 25 265-271
95
Referecircncias Bibliograacuteficas
LOFTUS R T MACHUGH B E BRADLEY B G SHARP P M amp CUNNINGHAM P (1994b) Evidence
for two independent domestications of cattle Proceeding of the National Academy of Sciences of USA
91 2757-2761
MACHUGH D E LOFTUS R T BRADLEY B G SHARP P M amp CUNNINGHAM P (1994)
Microsatellite DNA variation and among European cattle breeds Proceedings of the Royal Society of
London B 256 25-31
MACHUGH B E SHRIVER M B LOFTUS R T CUNNINGHAM P amp BRADLEY B G (1997)
Microsatellite DNA Variation and the Evolution Domestication and Phylogeography of taurine and
zebu cattle (Bos taunts and Bos indicus) Genetics 146 1071-1086
MARTINS R (1982) Conservaccedilatildeo e melhoramento dos bovinos de raccedila Barrosatilde Relatoacuterio de estaacutegio de
licenciatura em Produccedilatildeo Animal Instituto Universitaacuterio de Traacutes-os-Montes e Alto Douro
MIRANDA DO VALE J (1949) Gado Bissulco Livraria Saacute da Costa Lisboa
MORAIS M L (1992) Estudo Desenvolvimento e Optimizaccedilatildeo de Teacutecnicas de Separaccedilatildeo e Detecccedilatildeo
Especiacutefica de Proteiacutenas Dissertaccedilatildeo de Mestrado em Biologia Celular apresentada agrave Faculdade de
Ciecircncias da Universidade de Coimbra
NEI M (1978) Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small number of individuals
Genetics 89 583-590
NICHOLS E A CHAPMAN V M amp RUDDLE F H (1973) Polymorphism and linkage for
Mannosephosphate isomerase in Mus musculus Biochem Genet 8 47-53
NOBRE J M (s data) Caracterizaccedilatildeo geneacutetica da raccedila bovina Mirandesa Trabalho de fim de curso
efectuado na Estaccedilatildeo Nacional de Selecccedilatildeo e Reproduccedilatildeo Animal Curso de Engenharia Zooteacutecnica da
Universidade de Eacutevora
PENEDO M C T FOWLER M E BOWLING A T ANDERSON B L amp GORDON L (1988) Genetic
variation in the Wood of llamas Llama glama and alpaca Llama pacos Animal Genetics 19 267-
-276
PENEDO M C T amp JUNEJA R K (1989) Polymorphic plasma postalbumin (PO) of llamas and alpacas
identified as GC Protein Animal Genetics 20 221-223
96
Referecircncias Bibliograacuteficas
PENHALLOW R C MASON A B amp WOODWORTH R C (1991) Electrophoretic characterization of
human equine and bovine transferrins Comp Biochem Physiol 98B 41-45
PEREIRA A A (1997) Caracterizaccedilatildeo Geneacutetica de Algumas Subpopulaccedilotildees de Truta de Rio Salmo trutta L
da Bacia Hidrograacutefica do Rio Lima Dissertaccedilatildeo de Mestrado em Ecologia Aplicada apresentada agrave
Faculdade de Ciecircncias da Universidade do Porto
PIEDRAFITA J TEJEDOR M T amp ZARAGAZA L (1984) Post-Albuminas y Post-Transferrinas en
poblaciones bovinas Espafiolas Frisona y De Lidia Comunicacioacuten Presentada A La 34deg Reunion
Anual De La Federacioacuten Europea de Zootecnia 114-121
POVEY S CORNEY G LEWIS W H P ROBSON E B PARRINGTON J M amp HARRIS H (1972) The
genetics of peptidase C in man Ann Hum Genet 35 455-465
PRETSCH W amp MERKLE S (1990) Glucose Phosphate Isomerase Enzyme - Activity Mutants in Mus
musculus Genetical and Biochemical Characterization Biochemical Genetics 28 97-110
RASERO R D I STASIO L amp BERRA G P (1993) Polymorphism of erythocyte glucosephosphae isomerase
in sheep Animal Genetics 24 63-64
RITTER EL FRIEDRICHSON U amp SCHMITT J (1974) Genetic variation of Manose phosphate isomerase in
Man Humangenetik 22 261
RITTER H amp SCHMITT J (1973) Genetic polymorphism of Manose phosphate isomerase in Primates
Humangenetik 19 325-326
ROCHA J KOtildeMPF J FERRAND N AMORIM A amp RITTER H (1991) Separation of human alloalbumin
variants by isoelectric focusing Electrophoresis 12 313-314
ROGERSON J (1991) Biacuteblia- Os Caminhos de Deus Grandes Culturas e Civilizaccedilotildees Ciacuterculo de Leitores
RON M BAND M YANAI A amp WELLER J L (1994) Mapping quantitative trait loci with DNA
microsatellites in a commercial dairy cattle population Animal Genetics 25 259-264
RUSSEL G (1996) The analysis of genetic diversity in cattle to preserve future breeding options (Online)
Available http wwwribbsrcacukcdiv_wwwinformhtm (1996 November 29)
97
Referecircncias Bibliograacuteficas
SAITOU N amp NEI M (1987) The neighbor-joining method a new method for reconstructing phylogenetic
trees Mol Biol Evol 4 406-425
SANTOS O C M (1995) Caracterizaccedilatildeo Geneacutetica de Populaccedilotildees de Lebre Ibeacuterica (Lepus granatensis) e
Lebre Europeia (Lepus europaeus) - Aspectos Bioquiacutemicos e Populacionais Dissertaccedilatildeo de Mestrado
em Ecologia Aplicada apresentada agrave Faculdade de Ciecircncias da Universidade do Porto
SARAIVA J A (1993) Histoacuteria de Portugal Publicaccedilotildees Europa-Ameacuterica
SARTORE G STORMONT C MORRIS B G amp GRUNDER A A (1969) Multiple electrophoretic forms of
Carbonic Anhydrase in red cells of domestic cattle (Bos taurus) and American buffalo (Bison bison)
Genetics 61823-831
SCHNEIDER H SCHNEIDER M P C SILVA B T F amp SALZANO F M (1990) Transferrin and albumin
polymorphisms in buffaloes from Brazil Animal Genetics 21 335-337
SEATH P H A amp SOKAL R R (1973) Numeric Taxonomy W H Freeman amp Co
SELVARAJ O S MUKHERJEE T K DHALIWAL S S TAN S G amp BARKER J S F (1991) Biochemical
polymorphisms in the local goats of South-East Asia Animal Genetics 22 (suppl 1) 32
STERN C M MILLER S A amp SCHANFIELD M S (1992) Differentiation of wapiti and Eurasian red deer
by isoelectric focusing electrophoresis of GC on agarose gels Animal Genetics 23 (suppl 1) 23
STORMONT C amp SUZUKI Y (1963) Genetic control of albumin phenotypes in horses Proceeding of the
Society for Experimental Biology and Medicine 144 673-675
STRATIL A GLASNAacuteK V BOBAacuteK P CiacutezovAacute D GAacuteBRISOVAacute E amp KALAB P (1990) Variation of some
serum proteins in red deer Cervus elaphus L Animal Genetics 21 285-293
SWOFFORD D L amp SELANDER R B (1989) BIOSYS-1 A computer program for the analysis of allelic
variation in population genetics and biochemical systematics Release 17 Illinois Natural History
Survey
TASHIAN R E (1989) The carbonic anhydrases widening perspectives on their evolution expression and
function BioEssays 10 186-192
98
Referecircncias Bibliograacuteficas
TASHIAN R E amp CARTER N D (1976) Biochemical Genetics of Carbonic Anhydrase In Harris H (ed)
Advances in Human Genetics 7 1-56 Plenum
TATE M L amp MCEWAN K M (1992) Genetic polymorphism of erytrocyte diaphorase in red deer Cervus
elaphusL Animal Genetics 23 449-452
TSUJI S SAOAMITSU Y amp GOTO N (1989) Ultrathin-leyer isoelectric focusing for bovine serum
transferrin phenotyping Biochem Genet 27 425-429
TUCKER E M amp YOUNG J D (1988) Genetic control of red-cell nucleoside transport and its association
with the B blood-group locus and nucleoside phosphorylase activity in sheep Biochem Genet 26 489-
-501
TUNON M J GONZALEZ P amp VALLEJO M (1989) Genetic relationships between 14 native Spanish
breeds of goat Animal Genetics 20 205-212
USHA A P (1996) Cattle diversity by blood typing (Online) Available http
wwwribbsrcacukcdiv_wwwinfobhtm ( 1996)
USHA A P SIMPSON S P amp WILLIAMS J L (1995) Probability of random sire exclusion using
microsatellite markers for parentage verification Animal Genetics 26 155-161
VANDEBERG J amp AIVALIOTIS M (1990) Mannose-6-phosphate isomerase polymorphism in baboon
erythrocytes Biochemical Genetics 28 495-501
VAN DE WEGHE A VAN ZEVEREN A amp BOUQUET Y (1982) The vitamin D binding protein in domestic
animals Comp Biochem Physiol 73B 977-982
VAN DE WEGHE A YABLANSKI T S VAN ZEVEREN A amp BOUQUET Y (1988) A third variant of glucose
phosphate isomerase in pigs Animal Genetics 19 55-58
VANKAN D M amp BELL K (1992 a) A new allele in Australian goats Animal Genetics 23 453-456
VANKAN D M amp BELL K (1992 b) Genetic polymorphism of vitamin D-binding protein (GC) in Australian
goats Animal Genetics 23 457-462
VICENTE M V (1978) Razas vacunas autoacutectonas en vias de extincioacuten (Aportaciones al estuacutedio geneacutetico)
Fundacioacuten Juan March Serie Universitaacuteria LXK 10-51
99
Referecircncias Bibliograacuteficas
VIEIRA J (1993) Utilizaccedilatildeo de marcadores geneacuteticos na caracterizaccedilatildeo e certificaccedilatildeo de populaccedilotildees
domeacutesticas e selvagens de coelho (Oryctolagus cunicuius) Dissertaccedilatildeo de Mestrado apresentada agrave
Faculdade de Ciecircncias da Universidade do Porto
VIEIRA J amp FERRAND N (1995) Four new alleles at the mannose-6-phosphate isomerase locus in rabbit
Animal Genetics 26 37-38
WANG S FOOTE W C amp BUNCH T D (1990) Transferrin and haemoglobin polymorphism in
domesticated goats in the USA Animal Genetics 21 91-94
WEBER J L amp MAY P E (1989) Abundant class of human DNA polymorphisms which can be typed using
the polymerase chain reaction American Jornal of Human Genetics 44 388-396
WELCHS S (1990) A comparison of the structure and properties of serum transferrin from 17 animal species
Comp Biochem Physiol 97 B (3) 417-427
100
ANEXO
Anexos
RESUMO E CONCLUSOtildeES
Neste trabalho apresenta-se uma contribuiccedilatildeo para o estudo geneacutetico da raccedila bovina Barrosatilde e de uma outra raccedila (Minhota) atraveacutes da anaacutelise da variaccedilatildeo geneacutetica de proteiacutenas detectada pela utilizaccedilatildeo de sistemas electroforeacuteticos convencionais e por focagem isoeleacutectrica
Definiram-se os seguintes objectivos fundamentais
1 estudo da variabilidade geneacutetica da raccedila Barrosatilde ao niacutevel das proteiacutenas eritrocitaacuterias e plasmaacuteticas 2 desenvolvimento e afinaccedilatildeo de teacutecnicas de separaccedilatildeo de proteiacutenas por electroforese e focagem
isoeleacutectrica e sua detecccedilatildeo especiacutefica (histoquiacutemica e imunoloacutegica) 3 anaacutelise familiar dos polimorfismos encontrados 4 avaliaccedilatildeo do grau de diferenciaccedilatildeo geneacutetica existente entre a raccedila Barrosatilde e outras raccedilas bovinas
Escolheu-se um conjunto de 12 sistemas geneacuteticos (sete dos quais se revelaram polimoacuterficos) que pudesse satisfazer os objectivos fundamentais do trabalho
Assim apoacutes desenvolvimento de teacutecnicas de separaccedilatildeo para os sistemas geneacuteticos considerados procedeu-se a uma anaacutelise familiar baseada nos polimorfismos encontrados nas populaccedilotildees de raccedila Barrosatilde ao estudo de distribuiccedilatildeo populacional dos fenoacutetipos das duas raccedilas estudadas e de outras raccedilas bovinas da Europa (principalmente da Peniacutensula Ibeacuterica)
Com base neste trabalho obtiveram-se as seguintes conclusotildees
bull a utilizaccedilatildeo de um sistema de focagem isoeleacutectrica permitiu detectar a existecircncia de polimorfismo geneacutetico na hemoglobina distinguindo-se dois produtos geacutenicos na raccedila bovina Minhota HBA e HBB Na raccedila Barrosatilde HBA foi o uacutenico produto geacutenico encontrado
bull a utilizaccedilatildeo de um sistema de focagem isoeleacutectrica permitiu a detecccedilatildeo de dois produtos geacutenicos no locus CAII (CAIIF e CAIPS) e revelou-se mais eficaz de que as teacutecnicas de separaccedilatildeo convencional em gel de amido
bull a investigaccedilatildeo realizada permitiu detectar a ocorrecircncia de polimorfismo geneacutetico de MPI atraveacutes de um sistema electroforeacutetico em gel de amido tendo-se detectado trecircs produtos geacutenicos (MPIA MPIB e MPIC) A fraca actividade de MPI e a grande dificuldade na obtenccedilatildeo de um contraste de bandas adequado poderaacute dever-se ao facto de a sua expressatildeo soacute ocorrer na fracccedilatildeo leucocitaacuteria do sangue
bull a aplicaccedilatildeo de um sistema de focagem isoeleacutectrica na presenccedila de ureia (8M) revelou-se muito eficaz na separaccedilatildeo de ALB e permitiu detectar pela primeira vez um novo variante ALBV ligeiramente mais aciacutedico do que ALB A
bull a combinaccedilatildeo de uma teacutecnica de focagem isoeleacutectrica com um preacutevio tratamento das amostras a fim de saturar a moleacutecula de TF com Fe permitiu a detecccedilatildeo de quatro produtos geacutenicos (TFA TFD1 TFD2 e TFE) nas raccedilas estudadas
bull a combinaccedilatildeo de uma teacutecnica de focagem isoeleacutectrica com a detecccedilatildeo por immunoblotting permitiu detectar dois produtos geacutenicos no locus GC (GCA e GCB) O tratamento de amostras com neuraminidase permitiu a obtenccedilatildeo de padrotildees mais simples do que os conseguidos com amostras nativas Esta simplificaccedilatildeo resulta da provaacutevel remoccedilatildeo de aacutecidos siaacutelicos ligados agrave moleacutecula de GC
bull natildeo se detectou nenhum caso de exclusatildeo na anaacutelise de segregaccedilatildeo de 27 pares matildeefilho feita separadamente para cada locus
bull verificou-se a presenccedila de dois alelos raros HBB e PEPB1 na raccedila Minhota Estes alelos poderatildeo ser utilizados na distinccedilatildeo das duas raccedilas estudadas
I
Anexos
bull foi encontrado um valor de heterozigotia meacutedia de 0237 em populaccedilotildees de raccedila Barrosatilde indicativo de uma variabilidade geneacutetica intermeacutedia em relaccedilatildeo agrave generalidade das raccedilas ibeacutericas As diferenccedilas observadas entre as vaacuterias raccedilas ibeacutericas poderatildeo reflectir fenoacutemenos histoacuterico-evolutivos muito recentes dada a sua proximidade e grande semelhanccedila
bull foi observado um reduzido niacutevel de diferenciaccedilatildeo entre as raccedilas Barrosatilde e Minhota (FST = 0031) demonstrando-se que a maior parte da diversidade geneacutetica se atribui a diferenccedilas intrapopulacionais Este valor de FST pode considerar-se baixo quando comparado com o obtido no estudo de outras espeacutecies animais sugerindo um elevado fluxo geacutemeo interpopulacional Por outro lado reflecte ainda uma histoacuteria demograacutefica muito recente
bull a utilizaccedilatildeo de meacutetodos de agrupamento NJ e UPGMA obtidos a partir de matrizes de distacircncias geneacuteticas de Nei natildeo permitiu separar a raccedila Barrosatilde das restantes raccedilas ibeacutericas
II
Anexos
Tabela A Frequecircncias geacutenicas para os vaacuterios sistemas polimoacuterficos encontrados na raccedila Barrosatilde (indiviacuteduos inscritos e natildeo inscritos) utilizadas na anaacutelise familiar
LOCUS ALELOS FREQUEcircNCIA GEacuteNICA
CAII 294 035
065
NP 294 H
L
024
076
MPI 290 A
B
C
000
098
002
ALB 294 A
B
V
097
002
001
TF 294 A
Dl
D2
E
057
016
023
004
GC 294 083 017
TTI
Introduccedilatildeo
Figura 112 Desenho ilustrativo de uma ordenha 5a dinastia Reproduzido de BAINES
amp MEacuteLEK (1980)
A partir desta altura as descobertas arqueozooloacutegicas satildeo testemunho de uma
expansatildeo do gado bovino Assim existem registos datados de haacute cerca de 2000 e 3000 anos
aC que sugerem a ocorrecircncia no Norte de Aacutefrica de animais de enormes cornos em forma de
lira (EPSTEIN amp MASON 1984)
Tal expansatildeo daacute-se tambeacutem pela Turquia indo ateacute ao Caacuteucaso e agrave Ruacutessia e chega
tambeacutem agrave Europa onde nas regiotildees do Norte foram encontrados objectos de arte da idade do
Cobre e do Bronze que representam bovinos e datam do iniacutecio do Cristianismo (EPSTEIN amp
MASON 1984)
A migraccedilatildeo para oriente estaacute tambeacutem bem documentada atraveacutes de numerosos restos
arqueozooloacutegicos descobertos em toda a Aacutesia Eacute contudo nesta regiatildeo geograacutefica que se
pode observar a transiccedilatildeo de gado bovino sem bossa (Bos taurus) para outro com bossa (Bos
indicus) Segundo alguns autores as raccedilas de Bos indiens ou gado zebu derivariam das raccedilas
de Bos taurus ou gado taurino atraveacutes de um processo de selecccedilatildeo (EPSTEIN amp MASON
1984) Alternativamente estes dados podem tambeacutem ser interpretados como a ocorrecircncia de
dois processos de domesticaccedilatildeo independentes seguidos do contacto entre as duas populaccedilotildees
domeacutesticas de gado bovino
Adicionalmente deve salientar-se que a evidecircncia descrita eacute ainda muito incompleta
pelo que a interpretaccedilatildeo dos dados deve ser feita com bastante precauccedilatildeo A tiacutetulo de
exemplo refiram-se os achados arqueozooloacutegicos efectuados na Peniacutensula dos Balcatildes e na
6
Introduccedilatildeo
Macedoacutenia Grega (6200 anos aC) Segundo EPSTEIN amp MASON (1984) estes achados
sugerem que o Sul da Europa poderia constituir o primeiro centro de domesticaccedilatildeo do gado
bovino a partir de onde se teria iniciado a sua expansatildeo em direcccedilatildeo ao resto do continente
europeu Ruacutessia e Sudoeste Asiaacutetico
113 - Anaacutelise geneacutetica
A investigaccedilatildeo sobre a geneacutetica das diferentes raccedilas de gado bovino tem contribuiacutedo de
forma muito significativa para a compreensatildeo da sua histoacuteria dos padrotildees de diversidade que
actualmente as caracterizam e do seu grau de parentesco Os resultados actualmente
disponiacuteveis reportam-se a trecircs domiacutenios principais grupos sanguiacuteneos variaccedilatildeo geneacutetica de
proteiacutenas e polimorfismos do DNA (DNA mitocondrial e microssateacutelites)
Grupos sanguiacuteneos
A primeira tentativa para avaliar o grau de diferenciaccedilatildeo geneacutetica entre raccedilas bovinas e
caracterizar a sua diversidade data do iniacutecio de deacutecada de 70 e envolveu precisamente o
estudo dos diferentes grupos sanguiacuteneos que iam sendo descritos (RUSSELL 1996 USHA
1996) Contudo a maior parte dos resultados natildeo permitiu a obtenccedilatildeo de conclusotildees
definitivas pelo facto de se trabalhar com um nuacutemero relativamente reduzido de loci que
adicionalmente era pouco polimoacuterfico Deve poreacutem referir-se que se dispotildee actualmente de
uma consideraacutevel quantidade de informaccedilatildeo no que se refere agrave distribuiccedilatildeo da variabilidade dos
grupos sanguiacuteneos nas diferentes raccedilas bovinas conferindo a este conjunto de dados uma
importacircncia natildeo despreziacutevel no estudo de eventuais alteraccedilotildees da estrutura geneacutetica de
populaccedilotildees de gado bovino nos uacuteltimos vinte anos (RUSSELL 1996 USHA 1996)
Proteiacutenas
A introduccedilatildeo de teacutecnicas electroforeacuteticas de separaccedilatildeo de proteiacutenas permitiu aumentar
de forma muito consideraacutevel o nuacutemero de sistemas geneacuteticos polimoacuterficos conhecidos nas
raccedilas bovinas em especial no que se refere a proteiacutenas do sangue e do leite (USHA 1996)
A anaacutelise da sua distribuiccedilatildeo populacional veio demonstrar a ocorrecircncia de dois grupos
principais de bovinos ou duas subespeacutecies (Bos primigenius taurus e Bos primigenius
7
Introduccedilatildeo
indiens) cada um deles caracterizado pela presenccedila de diversos alelos privativos em vaacuterios loci
(BRAEND 1971)
Estes resultados estatildeo de uma maneira geral de acordo com dados morfoloacutegicos
histoacutericos e ainda com a distribuiccedilatildeo geograacutefica conhecida dos principais grupos (EPSTEIN amp
MASON 1984) No entanto o acreacutescimo de informaccedilatildeo fornecido por este tipo de marcadores
foi ainda insuficiente para resolver muitas das interpretaccedilotildees contraditoacuterias publicadas sobre o
tema
Polimorfismo do DNA
A introduccedilatildeo das teacutecnicas de anaacutelise genoacutemica directa e em especial a descoberta do
polimorfismo do DNA-mitocondrial (mtDNA) e dos microssateacutelites forneceram os
instrumentos necessaacuterios a uma detalhada caracterizaccedilatildeo geneacutetica das raccedilas bovinas
A anaacutelise da variaccedilatildeo da moleacutecula de mtDNA permitiu verificar que Bos primigenius
taurus e Bos primigenius indicus teratildeo divergido haacute cerca de 210000 anos uma data muito
anterior agrave indicada pelos dados arqueoloacutegicos para o iniacutecio do processo de domesticaccedilatildeo Eacute
assim muito provaacutevel que tenham ocorrido duas domesticaccedilotildees independentes a partir de duas
subespeacutecies diferentes do auroque Bos primigenius namadicus teraacute dado origem ao gado
zebu na Aacutesia (Vale do Indu) e Bos primigenius primigenius ao gado europeu vindo do
Proacuteximo Oriente (LOFTUS et ai 1994a 1994b)
Muito recentemente BRADLEY et ai (1996) e MACHUGH et ai (1997) sugerem ainda
uma terceira domesticaccedilatildeo independente ocorrida em Aacutefrica Esta evidecircncia resulta tambeacutem
de anaacutelise do polimorfismo do mtDNA indicando uma separaccedilatildeo entre os ancestrais do gado
europeu e africano anterior agrave domesticaccedilatildeo (22000 - 26000 anos) Este terceiro processo de
domesticaccedilatildeo ter-se-ia assim efectuado a partir da subespeacutecie africana do auroque (Bos
primigenius opisthonomus)
A descoberta dos microssateacutelites e do seu elevado grau de polimorfismo data do fim da
deacutecada de 80 (Lm amp LUTY 1989 WEBER amp MAY 1989) e constitui provavelmente a
metodologia mais adequada para estudar a histoacuteria recente da diversificaccedilatildeo das raccedilas bovinas
(MACHUGH et ai 1994 ARRANZ et ai 1996) Os primeiros resultados que envolvem uma
caracterizaccedilatildeo em larga escala de diferentes populaccedilotildees permitiram distinguir mais claramente
a estrutura geneacutetica dos dois grandes grupos de gado bovino (Bos taurus e Bos indicus) e
constituem a base para futuros estudos mais especiacuteficos
8
Introduccedilatildeo
Por outro lado os microssateacutelites permitiram tambeacutem o iniacutecio do projecto de
cartografia do genoma bovino que no fim de 1994 contabilizava 202 marcadores geneacuteticos
(dos quais 144 eram microssateacutelites) regularmente espaccedilados em 90 do seu comprimento
Cerca de um ano depois existiam jaacute mais de 400 microssateacutelites (USHA et ai 1995) levando
EGGEN et ai (1995) a apresentar um trabalho de revisatildeo e consolidaccedilatildeo de informaccedilatildeo jaacute
existente para evitar a ocorrecircncia de possiacuteveis redundacircncias
A aplicaccedilatildeo deste tipo de marcadores natildeo se restringe apenas agrave anaacutelise da diversidade
geneacutetica populacional e agrave construccedilatildeo de mapas geneacuteticos De facto satildeo actualmente escolhidos
para a realizaccedilatildeo de testes de paternidade (GLOWATZKI-MULLIS et ai 1995 USHA et ai 1995
ARRANZ et ai 1996) detecccedilatildeo de loci que determinam a expressatildeo de caracteriacutesticas
quantitativas (QTL) (RON et ai 1994) determinaccedilatildeo do sexo em embriotildees selecccedilatildeo animal
assistida entre outros
No seu conjunto estes resultados tecircm permitido um avanccedilo notaacutevel na compreensatildeo da
evoluccedilatildeo das actuais raccedilas bovinas A prossecuccedilatildeo desta via de investigaccedilatildeo poderaacute levar ao
esclarecimento definitivo do nuacutemero de domesticaccedilotildees independentes que teraacute ocorrido
(EPSTEIN amp MASON 1984 LOFTUS et al 1994a 1994b BRADLEY et al 1996 MACHUGH et
al 1997) a partir das populaccedilotildees selvagens de auroque Seguidamente eacute legiacutetimo esperar que
venha a ser possiacutevel analisar a uma escala mais fina o grau de parentesco geneacutetico entre raccedilas
que ocupem aacutereas geograacuteficas mais reduzidas Neste particular seraacute extremamente interessante
incluir as populaccedilotildees ibeacutericas e em especial a raccedila Barrosatilde
9
Introduccedilatildeo
12 - A DIVERSIDADE DAS RACcedilAS BOVINAS
A domesticaccedilatildeo resultou na criaccedilatildeo de milhares de raccedilas de animais domeacutesticos
geneticamente diferentes e adaptadas agraves necessidades humanas e a uma grande variedade de
condiccedilotildees ambientais (FAO 1993)
121 - As raccedilas ibeacutericas
A grande diversidade de raccedilas bovinas da Peniacutensula Ibeacuterica poderaacute dever-se em parte
agrave introduccedilatildeo de outras raccedilas domeacutesticas que se cruzaram entre si e com bovinos jaacute existentes
na Peniacutensula A introduccedilatildeo de outras raccedilas teraacute sido feita de duas formas distintas
1 - atraveacutes dos movimentos migratoacuterios acompanhando as vaacuterias invasotildees de povos
vindos do oriente como eacute o caso dos Feniacutecios ( seacutec X aC) Gregos (seacutec VII aC) e
Romanos (seacutec III aC) Estes uacuteltimos dominaram completamente a Peniacutensula durante
7 seacuteculos e teratildeo contribuiacutedo para a diversificaccedilatildeo do gado bovino pelo facto de
introduzirem animais de caracteriacutesticas diferentes Supotildee-se que do seu cruzamento
com os bovinos ibeacutericos se teratildeo originado os troncos aquitacircnico e ibeacuterico (MIRANDA
do VALE 1949)
2 - atraveacutes da introduccedilatildeo de animais do Norte de Aacutefrica na sequecircncia da invasatildeo de
povos como os Cartagineses (seacutec V aC) e jaacute na era cristatilde os Mouros (711 dC)
Estes teratildeo introduzido descendentes de Bos primigenius opisthonomus que poderaacute
ter influenciado a formaccedilatildeo de vaacuterias raccedilas ibeacutericas nomeadamente as raccedilas Barrosatilde e
Cachena (APARIacuteCIO 1960 in IGLESIAS 1989 EPSTEIN amp MASON 1984) Estas
poderatildeo assim constituir uma linha que descende do tronco mauritaacutenico (MIRANDA
do VALE 1949)
10
Introduccedilatildeo
Adicionalmente eacute provaacutevel que povos oriundos do Norte da Europa nomeadamente
os Visigodos possam ter introduzido gado bovino dessa regiatildeo Contudo a sua eventual
contribuiccedilatildeo para a diversidade de raccedilas bovinas da Peniacutensula Ibeacuterica estaacute por esclarecer
122 - A raccedila Barrosatilde
Aspectos histoacutericos da dispersatildeo e evoluccedilatildeo do efectivo populacional
O centro de criaccedilatildeo da raccedila Barrosatilde situa-se actualmente na zona do planalto da Serra
do Barroso abrangendo os actuais concelhos de Montalegre Boticas Vieira do Minho
(freguesias de Campos e Ruivatildees) e Cabeceiras de Basto (freguesia de Gondiatildees) Esta regiatildeo
natildeo possui condiccedilotildees agro-climateacutericas que permitam grandes exploraccedilotildees agriacutecolas pelo que
uma parte importante da populaccedilatildeo se dedica agrave criaccedilatildeo de gado (GARCIA et ai 1981
FERNANDES 1996)
Vivendo sobretudo em zonas montanhosas a Barrosatilde eacute utilizada essencialmente como
forccedila de trabalho e na produccedilatildeo de carne de excelente qualidade motivo pelo qual a Uniatildeo
Europeia a reconhece com denominaccedilatildeo de Origem Protegida (FERNANDES 1996)
No seacuteculo passado e iniacutecio do seacuteculo XX existia um grande incentivo para a criaccedilatildeo
desta raccedila devido agrave procura da sua carne muito apreciada em Inglaterra Este incentivo
contribuiu indirectamente para que a estatura dos animais se elevasse (GARCIA et ai 1981) e
para que a zona de criaccedilatildeo se dispersasse pelas aacutereas submontanhosas e pelas planiacutecies do
Entre Douro e Minho ateacute agrave orla mariacutetima chegando mesmo ao concelho de Vila Nova de Gaia
(figura 121) Nestas zonas fazia-se a criaccedilatildeo de novilhos para exploraccedilatildeo como bois de
trabalho e para produccedilatildeo de carne Tal exploraccedilatildeo estaacute bem patente nos paineacuteis de azulejos da
estaccedilatildeo de caminhos de ferro de S Bento no Porto e mesmo nos desenhos das calccediladas nas
principais avenidas desta cidade
li
Introduccedilatildeo
B
bull bull bull _ bull bull bull - bull bull
Figura 121 A) Junta de bois de trabalho de raccedila Barrosatilde B) Fecircmea adulta Barrosatilde C) Macho adulto Barrosatilde Fotografias datadas de 1949 gentilmente cedidas pela Direcccedilatildeo Regional de Agricultura de Entre Douro e Minho - Centro de Produccedilatildeo Animal (DRAEDM)
12
Introduccedilatildeo
Poreacutem a necessidade de maiores produccedilotildees de carne foi conduzindo durante a
segunda metade deste seacuteculo a um progressivo decliacutenio no efectivo populacional da raccedila
Barrosatilde tornando-se mesmo raro poder observar uma junta de bois Recentemente as
alteraccedilotildees verificadas na poliacutetica agraacuteria e ambiental da Uniatildeo Europeia teratildeo permitido
alguma recuperaccedilatildeo Nesse contexto a criaccedilatildeo em 1981 do Livro Genealoacutegico da raccedila
Barrosatilde constitui um passo importante para a certificaccedilatildeo dos animais e o aumento do seu
valor Actualmente o seu efectivo populacional tem crescido continuamente e essa tendecircncia
parece estaacutevel
Segundo dados fornecidos pelo Registo Zooteacutecnico e pela Associaccedilatildeo do Minho dos
Criadores de Bovinos de Raccedila Barrosatilde (AMTOA) existiam em 1996 38002 fecircmeas
reprodutoras inscritas e 375 touros de cobriccedilatildeo (tabela 1221) distribuiacutedos por vaacuterios
concelhos dos distritos de Viana do Castelo Braga Vila Real e Porto (figura 122)
Tabela 1221 Movimento do Registo Zooteacutecnico relativo agrave raccedila Barrosatilde
Vacas Inscritas Postos de Cobriccedilatildeo Vitelos Anos Abatidas Registadas Inscritas Encerrados Recenseados Existecircncias Inscritos 1981 0 4884 4882 1 25 24 0 1982 19 6169 11032 6 42 60 532 1983 31 4436 15437 14 35 81 1593 1984 72 866 16231 13 14 82 2151 1985 47 604 16788 15 15 82 1767 1986 106 1027 17709 18 13 77 2414 1987 72 1186 18823 2 14 89 2632 1988 122 1192 19877 5 7 91 2574 1989 138 718 20506 14 26 103 2532 1990 89 1017 21440 8 7 102 2404 1991 159 1309 22590 14 26 114 2531 1992 52 1902 24440 6 17 125 3203 1993 0 4205 28645 37 87 175 4077 1994 0 6248 34893 58 111 228 4679 1995 340 2447 37000 0 112 340 5759 1996 120 1122 38002 26 61 375 5901
Fonte Registo Zooteacutecnico (cedido pela AM1BA)
Apesar desta situaccedilatildeo favoraacutevel natildeo se pode considerar que a raccedila Barrosatilde natildeo corra
ainda perigo de extinccedilatildeo Na verdade satildeo vaacuterios os factores que tecircm contribuiacutedo para a
diminuiccedilatildeo da sua aacuterea de criaccedilatildeo ou mesmo para a alteraccedilatildeo das caracteriacutesticas destes
animais De entre esses factores deve salientar-se i) a substituiccedilatildeo de Barrosatilde por outras raccedilas
autoacutectones (Minhota Mirandesa Maronesa) ou importadas (Friacutesia Gelbvieh e Parda Suiacuteccedila)
13
Introduccedilatildeo
que fornecem ao agricultor um rendimento superior ii) a progressiva mecanizaccedilatildeo da
agricultura e a diminuiccedilatildeo das aacutereas de pastagem iii) o pequeno nuacutemero de machos
reprodutores associado a um efectivo idoso iv) uma baixa fertilidade meacutedia grandes
intervalos entre partos e elevado nuacutemero de abortos e v) desmotivaccedilatildeo dos produtores mesmo
em face das actuais condiccedilotildees de comercializaccedilatildeo
LEGENDA
| j - -Concelhos de Entre Douro e Minho S Concelhos de Traacutes-os-Montes
ESCALA 11380000
Figura 122 Mapa de distribuiccedilatildeo do actual efectivo Barrosatilde
14
Introduccedilatildeo
Aspectos morfoloacutegicos
O bovino Barrosatilde apresenta uma estatura mediana com 121-130 cm de altura agrave
cernelha e pelagem de cor castanha (variando entre a cor de palha ateacute a cor acerejada) (LEAL
1995) A cabeccedila eacute curta e larga encimada por uma cornamenta em forma de lira alta os
cornos satildeo muito compridos e espessos de cor branca suja com pontas escuras o conjunto
ocular eacute saliente dando-lhe o aspecto de olhos de sapo as orelhas satildeo de tamanho meacutedio os
membros satildeo curtos e pouco ossudos e o pescoccedilo eacute curto bem ligado agrave cabeccedila e com garrote
largo (MARTINS 1982)
Eacute uma raccedila com caracteres sexuais secundaacuterios bem diferenciados Os touros satildeo
normalmente mais escuros particularmente no terccedilo anterior com maior corpulecircncia do que as
fecircmeas mais robustos com barbela mais desenvolvida cabeccedila mais curta e mais larga cornos
mais grossos e ligeiramente mais curtos (GARCIA et ai 1981 MARTINS 1982)
Esta raccedila apresenta duas particularidades morfoloacutegicas que a distinguem de todas as
outras raccedilas grande desenvolvimento coacuterneo e perfil cocircncavo da cabeccedila com acentuado
prognatismo mandibular O elevado crescimento coacuterneo poderaacute estar relacionado com a
selecccedilatildeo dos animais De facto nas populares chegas de touros o animal que sai vencedor seraacute
o touro cobridor das vacas da aldeia Este processo teraacute permitido a primazia de touros de
maior ossatura capital mais potente musculatura ceacutefalo-cervical maior forccedila no acircngulo taacutersico
e consequentemente grande desenvolvimento dos cornos (MIRANDA do VALE in GONCcedilALVES GARCIA 1964 ARAUacuteJO 1986) No que se refere ao acentuado prognatismo
mandibular eacute possiacutevel que em parte esteja relacionado com o grande desenvolvimento
coacuterneo Este teraacute exigido um desenvolvimento correlativo de certos ossos cranianos e o
atrofiamento dos ossos da face (GONCcedilALVES GARCIA 1964)
Origem
A origem da raccedila Barrosatilde e o seu enquadramento com as outras raccedilas da Peniacutensula
Ibeacuterica estaacute ainda por explicar constatando-se uma grande heterogeneidade na opiniatildeo de
diversos autores a este respeito (MARTINS 1982)
Alguns autores referem a existecircncia no Norte de Aacutefrica (vale do Nilo) de um gado
com caracteriacutesticas morfoloacutegicas semelhantes agrave actual raccedila Barrosatilde em especial no que se
refere agrave forma tamanho e espessura dos cornos Este gado eacute normalmente associado agrave
15
Introduccedilatildeo
designaccedilatildeo subespeciacutefica Bos primigenius opisthonomus (embora tambeacutem se refira como Bos
primigenius mauritaniens e como Bos taurus desertorum) e teraacute chegado agrave Peniacutensula Ibeacuterica
atraveacutes de vaacuterias rotas migratoacuterias dos povos norte-africanos A raccedila Barrosatilde poderia assim
ser incluiacuteda no tronco mauritaacutenico tendo como ancestral Bos primigenius mauritanicus
(GARCIA et ai 1981)
Neste contexto poderaacute admitir-se que o gado que corresponde a este grupo se tenha
instalado na Peniacutensula Ibeacuterica provavelmente durante a longa ocupaccedilatildeo Moura (GONCcedilALVES
GARCIA 1964) Posteriormente a raccedila Barrosatilde teraacute sido desalojada pelos troncos ibeacuterico e
aquitacircnico restando apenas um nuacutecleo populacional confinado agraves zonas planaacutelticas do
Barroso onde permaneceu ateacute hoje (GONCcedilALVES GARCIA 1964)
Esta hipoacutetese natildeo eacute contudo partilhada por outros autores que lhe criticam a escassa
evidecircncia (forma e tamanho dos cornos) e portanto uma clara ausecircncia de base cientiacutefica
(IGLESIAS 1989)
Perante o exposto pode verificar-se que a raccedila Barrosatilde apresenta aspectos
morfoloacutegicos e histoacuterico-evolutivos muito peculiares sendo ainda hoje difiacutecil proceder ao seu
enquadramento no seio das restantes raccedilas bovinas ibeacutericas O aprofundamento da investigaccedilatildeo
sobre a estrutura geneacutetica das suas populaccedilotildees poderaacute ser assim uma via para o
esclarecimento das muitas questotildees que permanecem por responder Nestas condiccedilotildees este
trabalho pretende ser uma contribuiccedilatildeo para o conhecimento da geneacutetica das populaccedilotildees da
raccedila bovina Barrosatilde atraveacutes da consecuccedilatildeo dos seguintes objectivos
1 estudo da variabilidade geneacutetica da raccedila Barrosatilde ao niacutevel das proteiacutenas eritrocitaacuterias
e plasmaacuteticas
2 desenvolvimento e afinaccedilatildeo de teacutecnicas de separaccedilatildeo de proteiacutenas por electroforese
e focagem isoeleacutectrica e sua detecccedilatildeo especiacutefica (histoquiacutemica e imunoloacutegica)
3 anaacutelise familiar dos polimorfismos encontrados
4 avaliaccedilatildeo do grau de diferenciaccedilatildeo geneacutetica existente entre a raccedila Barrosatilde e outras
raccedilas bovinas
16
Material e Meacutetodos
2 - MATERIAL E MEacuteTODOS
21 - AMOSTRAGEM E CONSERVACcedilAtildeO DAS AMOSTRAS
211 - Amostragem
Foram recolhidas 356 amostras de sangue correspondente a 294 indiviacuteduos de raccedila
Barrosatilde (dos quais 141 estavam inscritos no Livro Genealoacutegico) e 62 indiviacuteduos de raccedila
Minhota As colheitas efectuaram-se em zonas de intensa criaccedilatildeo da Barrosatilde designadamente
nos concelhos de Arcos de Valdevez Cabeceiras de Basto Fafe Poacutevoa de Lanhoso e
Monccedilatildeo em finais de 1993 durante o ano de 1994 e ainda no periacuteodo de 1996 1997 em
Vieira do Minho
A recolha de sangue em indiviacuteduos de raccedila Minhota foi efectuada com a finalidade de
servir como termo de comparaccedilatildeo geneacutetica uma vez que se realizam cruzamentos entre esta
raccedila e a Barrosatilde
212 - Obtenccedilatildeo e conservaccedilatildeo das amostras de sangue
O sangue foi colhido da veia jugular em tubos contendo 01 ml de EDTA (aacutecido
etilnodiaminotetraceacutetico) dissoacutedico a 10 ou em tubos heparinados
As amostras de sangue foram centrifugadas (10 minutos a 13000 rpm) separando-se
em seguida o plasma dos eritroacutecitos Aos eritroacutecitos foi adicionado meio de glicerol (seis
partes de uma soluccedilatildeo 5 de citrato trissoacutedico 2H20 adicionados a quatro partes de glicerol)
numa proporccedilatildeo aproximada de 21 as amostras foram conservadas a -20degC
17
Material e Meacutetodos
22 - BATERIA DE MARCADORES GENEacuteTICOS SELECCIONADOS
No presente trabalho foi escolhida uma bateria de 12 marcadores geneacuteticos dispersos
no genoma do bovino (figura 5) HB (Hemoglobina) CAII (Anidrase carboacutenica) PEPB
(Peptidase B) DIA (Diaforase) NP (Fosforilase nucleosiacutedica) MDH (Desidrogenase do
malato) PGD (Desidrogenase do aacutecido fosfoglucoacutenico) GPI (Isomerase da fosfoglucose)
MPI (Isomerase da manose-6-fosfato) ALB (Albumina) TF (Transferrina) e GC
(Componente especiacutefico de grupo)
CP SODl TF
PEPC IDH1
AMY1 AMY1A PGM1
4
LDHB PEPB
ADH2 PGM2 ALB GC SOD3
6
IADA
ALDH1
CAII
ME1 PGM3 SOD2
NP
10
CAT HBBq22-q27
PGD IALDH2 DIA4
HP GPIq22-q24
MPI iBF GLOl
LDHA MDH2
Figura 221 Localizaccedilatildeo de vaacuterios loci proteicos no genoma de Bos taurus Com um tom mais carregado indicam-se os marcadores estudados neste trabalho Adaptado de FRIES et ai (1993)
18
Material e Meacutetodos
bull HB
A hemoglobina eacute responsaacutevel pelo transporte do oxigeacutenio dos pulmotildees para os tecidos
A sua estrutura eacute tetrameacuterica tendo cada uma das quatro subunidades um grupo prosteacutetico -
- heme - com um aacutetomo de ferro no centro A fracccedilatildeo principal da hemoglobina de mamiacuteferos
adultos eacute composta por duas cadeias a e duas cadeias P (BRAEND 1971 CECCHINI amp Nus
1986)
O locus da HB foi um dos primeiros a ser estudado apresentando polimorfismo em
vaacuterios mamiacuteferos (CECCHJM amp Nus 1986 BRAEND et ai 1988 CLARKE et ai 1989 WANG
et ai 1990 SELVARAJ et ai 1991) Em 1955 CABANNE amp SERAIN (in BRAEND 1988)
descrevem pela primeira vez o polimorfismo da HB em bovinos do Norte da Aacutefrica
Posteriormente muitos estudos foram efectuados descrevendo-se 13 variantes (raros na sua
maioria) com diferenccedilas apenas nas cadeias beta (CECCHINI amp Nus 1986 BRAEND 1988)
bull CAII-EC4211
A CAII eacute uma metaloenzima com grande distribuiccedilatildeo nos animais e nas plantas
(TASHIAN 1989) Catalisa de forma reversiacutevel a hidrataccedilatildeo do C02 em H2C03 (CECCHINI amp
Nus 1986 TASHIAN 1989) O seu papel fisioloacutegico ainda natildeo eacute bem conhecido mas eacute
possiacutevel que tenha participaccedilatildeo na manutenccedilatildeo do balanccedilo osmoacutetico (TASHIAN 1989)
A ocorrecircncia de variaccedilatildeo geneacutetica na CAII estaacute descrita em muitas espeacutecies de
mamiacuteferos tendo sido descritos dois loci polimoacuterficos (CAI e CAII) (TASHIAN amp CARTER
1976 CLARICE et ai 1989 SELVARAJ et ai 1991)
SARTORE et ai (1969) foram os primeiros a detectar polimorfismo electroforeacutetico da
anidrase carboacutenica em bovinos domeacutesticos e buacutefalos americanos Nos eritroacutecitos de bovinos
apenas se exprime a anidrase carboacutenica II que apresenta geralmente 2 alelos codominantes
autossoacutemicos (CAIPF e CAIPS) (SARTORE et ai 1969 TASHIAN amp CARTER 1976) Mais
tarde foram encontrados 3 novos alelos (C Z e X) (CECCHINI amp Nus 1986)
19
Material e Meacutetodos
bull PEPB-EC3412
As peptidases formam um conjunto de enzimas capazes de hidrolisar di- e tripeacuteptidos
caracterizando-se pela sua especificidade em relaccedilatildeo a diversos substratos bem como atraveacutes
da sua distribuiccedilatildeo tecidular
A PEPB apresenta uma estrutura monomeacuterica tendo sido descrita como polimoacuterfica
em algumas raccedilas brasileiras de bovinos de origem europeia e indiana (DEL LAMA et ai
1992)
bull DIA-EC1643
A enzima monomeacuterica DIA (NADH - Methemoglobina redutase) tambeacutem conhecida
por citocromo bs redutase faz parte de um grupo de enzimas que catalisam a reduccedilatildeo da
methemoglobina (IGLESIAS 1989 VIEIRA 1993 kRAHhetal 1986)
O seu polimorfismo geneacutetico foi detectado em vaacuterias espeacutecies de Ungulados incluindo
os bovinos (CLARKE et ai 1989 IGLESIAS 1989 SELVARAJ et ai 1991 TATE amp McEWAN
1992)
bull NP-EC2421
A enzima NP encontra-se distribuiacuteda por vaacuterios tecidos e oacutergatildeos e catalisa
reversivelmente a fosforoacutelise dos nucleosiacutedeos puriacutenicos levando agrave formaccedilatildeo das respectivas
bases e ribose-1-fosfato (IGLESIAS 1989)
O polimorfismo geneacutetico desta enzima foi detectado em vaacuterias espeacutecies de mamiacuteferos
incluindo os bovinos (ANSAY 1973 HARRIS amp HOPKINSON 1978 TUKER amp YOUNG 1988
CLARKE eacutetal 1989 IGLESIAS 1989 FERRAND 1995)
20
Material e Meacutetodos
bull MDH-ECl 1137
A MDH eacute uma oxirredutase dimeacuterica na maioria dos mamiacuteferos responsaacutevel pela
oxidaccedilatildeo do L-malato em oxoglutarato com NAD como aceitador A reacccedilatildeo eacute reversiacutevel em
presenccedila de NADH e oxaloacetato A enzima diz-se NAD especiacutefica pelo facto da reacccedilatildeo soacute
ocorrer na presenccedila deste cofactor (MORAIS 1992 PEREIRA 1997)
A ocorrecircncia de variaccedilatildeo geneacutetica neste locus foi descrita para vaacuterios mamiacuteferos
(HARRIS amp HOPKINSON 1978 TUNOacuteN et ai 1989 SELVARAJ et ai 1991) Contudo
relativamente aos bovinos natildeo foi possiacutevel encontrar referecircncias quanto ao seu polimorfismo
bull PGD-EC11144
A PGD eacute uma enzima dimeacuterica envolvida na via das pentoses-fosfato catalisando a
conversatildeo de 6-fosfogluconato em ribose-5-fosfato
O polimorfismo geneacutetico do locus PGD estaacute descrito em diversas espeacutecies de
Ungulados (HERZOG 1988 PENEDO et ai 1988 BEKENEV amp ORLO VA 1991 KUROSAWA amp
TANAKA 1991 JANZEN amp COTHRAN 1991 FERNDALE et al 1992) Contudo relativamente
aos bovinos natildeo foi possiacutevel encontrar referecircncias quanto ao seu polimorfismo
bull GPI-EC5319
A isomerase da fosfoglucose cataliza a reacccedilatildeo reversiacutevel de conversatildeo de glucose-
-6-fosfato em frutose-6-fosfato (HARRIS amp HOPKINSON 1978 PRETSCHei ai 1990)
Eacute uma enzima dimeacuterica com polimorfismo geneacutetico em vaacuterias espeacutecies de mamiacuteferos
nomeadamente no catildeo (ARNOLD amp Bouw 1989) no porco (VAN DE WEGHE et ai 1988
BEKENEV amp ORLO VA 1991) na ovelha (RASERO et ai 1993) em lamas e alpacas (PENEDO et
ai 1988) e no Homem (HARRIS amp HOPKINSON 1978)
21
Material e Meacutetodos
bull MPI-EC5318
A MPI eacute uma enzima monomeacuterica de acccedilatildeo cataliacutetica que permite a isomerizaccedilatildeo de D-
-manose-6-fosfato em D-frutose-6-fosfato
Em diversas espeacutecies de mamiacuteferos nomeadamente no Homem (RlTTER et ai 1974)
em babuiacutenos (RITTER amp SCHMITT 1973) e ratos (NICHOLS et ai 1973 VANDEBERG amp
AIVALIOTIS 1990) esta enzima natildeo apresenta actividade em eritroacutecitos sendo poreacutem
detectada em diversos tecidos como rim fiacutegado e o muacutesculo Mais tarde demonstrou-se a
possibilidade de proceder a esta detecccedilatildeo em hemolisados de cavalos coelhos e lebres (HALL
et ai 1991 VIEIRA amp FERRAND 1995 SANTOS 1995)
O polimorfismo geneacutetico de MPI em bovinos foi descrito por ANSAY (1973)
apresentando trecircs alelos autossoacutemicos codominantes (MPPA MPIB e MPIC)
bull ALB
A albumina eacute a proteiacutena mais abundante no plasma dos mamiacuteferos e apresenta uma
estrutura monomeacuterica A sua funccedilatildeo estaacute relacionada com processos de transporte e de
regulaccedilatildeo do balanccedilo osmoacutetico (CECCHTNI amp Nus 1986 CARTER et al 1989)
O polimorfismo geneacutetico da albumina estaacute descrito em vaacuterias espeacutecies de Ungulados
(STORMONT et ai 1963 BOWLING amp CLARK 1988 PENEDO et ai 1988 ERHARDT 1991
SELVARAJeacutetfa 1991CRISTOFALOpounda 1992 ERHARDT amp SlMIANER 1993)
EFREMOV e ASHTON em 1965 (in CECCHTNI amp Nus 1986) descrevem pela primeira vez
polimorfismo geneacutetico em raccedilas bovinas inglesas Inicialmente encontraram-se dois alelos
(ALBA ou ALBF e ALBB ou ALBS) por electroforese aacutecida Mais tarde descreveram-
-se outros alelos em raccedilas britacircnicas (ALBH e ALBG) e em raccedilas africanas (ALBD
ALBE e ALBF) (CECCHINI amp Nus 1986) ABE et ai em 1971 descrevem o alelo ALBX
(in CECCHTNI amp Nus 1986)
22
Material e Meacutetodos
bull TF
A transferrina eacute uma 3-globulina seacuterica responsaacutevel pelo transporte do ferro Possui
uma estrutura monomeacuterica glicosilada (CECCHINI amp Nus 1986 WELCHS 1990 PENHALLOW
et ai 1991 CUNHA 1994)
O polimorfismo geneacutetico desta proteiacutena foi detectado em vaacuterias espeacutecies de Ungulados
(KRISTJANSSON 1963 STORMONT et ai 1963 ASHTON 1965 GAHNE et ai 1977 CECCHJNI
amp Nus 1986 ERHARD 1986 KUROSAWA amp TANAKA 1988 PENEDO et ai 1988 CLARKE et
ai 1989 HERZOG 1989 JUNEJA et ai 1989 TSUJI et ai 1989 SCHNEIDER et ai 1990
STRATIL et ai 1990 WANG et ai 1990 SELVARAJ et ai 1991 DRATCH et ai 1992
VANKAN amp BELL 1992a CIacuteZovket ai 1993 ERHARD et ai 1993)
ASHTON em 1965 descreveu pela primeira vez o polimorfismo geneacutetico de TF em
bovinos estando actualmente descritos sete alelos TFA TFB TFD1 TFD2 TFE
TFF e TFG (CECCHTNI amp Nus 1986) A subdivisatildeo do alelo TFD em TFD1 e TFD2 foi
descrita por KRISTJANSSON amp HICKMAN (1965)
Nos bovinos os loci TF e CP encontram-se ligados como tem sido descrito para vaacuterias
espeacutecies de mamiacuteferos (JUNEJA et ai 1989)
bull GC
A GC apresenta uma estrutura monomeacuterica e o seu polimorfismo geneacutetico estaacute descrito
em vaacuterias espeacutecies de Ungulados (GAHNE 1963 KRISTJANSSON 1963 JUNEJA et ai 1987
PENEDO et ai 1988 PENEDO amp JUNEJA 1989 KALAacuteB et ai 1990 ERHARDT 1991 VANKAN
amp BELL 1992b STERN et ai 1992 ERHARDT amp SIMIANER 1993 STRATIL et ai 1995)
Nos bovinos o polimorfismo geneacutetico da GC foi inicialmente descrito por GAHNE
(1963) e ASHTON (1963) in GAHNE et ai 1977) mas soacute mais tarde foi possiacutevel obter
frequecircncias geacutenicas para este locus (alelos GCA e GCB) em diferentes raccedilas europeias
(GAHNE et ai 1977) A utilizaccedilatildeo de novas teacutecnicas de separaccedilatildeo permitiu distinguir um
terceiro alelo GCC (VAN DE WEGHE 1982)
23
Material e Meacutetodos
A existecircncia de ligaccedilatildeo factorial entre os loci ALB e GC foi demostrada no Homem
em primeiro lugar e depois nos cavalos nos bovinos e na ovelha (VAN DE WEGHE 1982
ERHARDT amp SlMIANER 1993)
23 - TRATAMENTO DAS AMOSTRAS
bull HB
A separaccedilatildeo da moleacutecula HB por focagem isoeleacutectrica foi feita mediante a utilizaccedilatildeo de
hemolisados diluiacutedos 18 em aacutegua bidestilada
bull CAII
A separaccedilatildeo electroforeacutetica de CAII foi realizada em gel de amido e em focagem
isoeleacutectrica No primeiro caso as amostras foram simplesmente tratadas com tolueno
enquanto no segundo se procedeu ainda agrave sua reduccedilatildeo com uma soluccedilatildeo de ditiotreitol
(DTT) 120 mM (100 uacute de amostra natildeo diluiacuteda e 20 pi de DTT 120 mM) durante 1 h a 37degC
Quando se utilizou focagem isoeleacutectrica aleacutem do tratamento jaacute referido foi necessaacuterio
realizar uma diluiccedilatildeo final de 110 com aacutegua bidestilada
bull PEPB DIA NP MDH PGP GPI e MPI
As separaccedilotildees electroforeacuteticas de PEPB DIA NP MDH PGD GPI e MPI em gel de
amido foram efectuadas com hemolisados natildeo diluiacutedos submetidos ao mesmo tratamento
descrito para CAII quando separada por electroforese convencional
24
Material e Meacutetodos
bull ALB
Na separaccedilatildeo de ALB por focagem isoeleacutectrica utilizaram-se amostras de plasma
diluiacutedas com aacutegua bidestilada na proporccedilatildeo de 170
bull TF
Na separaccedilatildeo de TF efectuada por focagem isoeleacutectrica utilizaram-se amostras de
plasma submetidas a vaacuterios tipos de tratamento para comparaccedilatildeo dos padrotildees de bandas
obtidos
1 Remoccedilatildeo dos resiacuteduos de aacutecido siaacutelico da moleacutecula de TF
diluiccedilatildeo 13 com neuraminidase durante 1 h a 37 degC
2 Remoccedilatildeo do Fe da moleacutecula de TF
diluiccedilatildeo 13 com EDTA-dissoacutedico (20) 2 h antes da aplicaccedilatildeo para remoccedilatildeo dos
aacutetomos de Fe da moleacutecula de TF
3 Saturaccedilatildeo em Fe da moleacutecula de TF
31 - diluiccedilatildeo 13 com soluccedilatildeo de sulfato de amoacutenio feacuterrico 015 (pv) em aacutecido
ciacutetrico 60 mM seguida de incubaccedilatildeo agrave temperatura ambiente 18 h A utilizaccedilatildeo
de uma razatildeo ligante Fe de 201 permite uma raacutepida saturaccedilatildeo da moleacutecula de
TF (FERRAND 1995)
32 - diluiccedilatildeo 13 com soluccedilatildeo de sulfato de amoacutenio ferroso 015 (pv) em aacutecido
ciacutetrico 60 mM seguida de incubaccedilatildeo agrave temperatura ambiente 18 h
33 - diluiccedilatildeo 13 com soluccedilatildeo de citrato de amoacutenio feacuterrico 015 (pv) em aacutecido
ciacutetrico 60 mM seguida de incubaccedilatildeo agrave temperatura ambiente 18 h
34 - diluiccedilatildeo 13 com soluccedilatildeo de citrato feacuterrico 015 (pv) em aacutecido ciacutetrico
60 mM seguida de incubaccedilatildeo agrave temperatura ambiente 18 h
35 - diluiccedilatildeo 13 com soluccedilatildeo de cloreto de ferro 015 (pv) em aacutecido ciacutetrico
60 mM seguida de incubaccedilatildeo agrave temperatura ambiente 18 h
25
Material e Meacutetodos
Antes da inserccedilatildeo as amostras foram parcialmente purificadas atraveacutes da adiccedilatildeo de 5
volumes de uma soluccedilatildeo de rivanol 06 (pv) em tampatildeo Tris HC1 005 M (ajusta-se o pH
para valores de 91 com Tris 1 M) seguida de centrifugaccedilatildeo
bull GCcedil
A fim de proceder agrave remoccedilatildeo dos resiacuteduos de aacutecido siaacutelico existente nas cadeias de
hidratos de carbono ligadas agrave moleacutecula GC as amostras de plasma foram submetidas a uma
incubaccedilatildeo com uma soluccedilatildeo de neuraminidase Clostridium perfringens SIGMA type V 18
Uml) na proporccedilatildeo de 13 durante 18 h a 37degC acrescentando-se posteriormente aacutegua
bidestilada ateacute agrave obtenccedilatildeo de uma diluiccedilatildeo final de 14 Paralelamente procedeu-se a uma
diluiccedilatildeo das amostras com aacutegua bidestilada (19) para comparaccedilatildeo dos padrotildees de bandas
obtidos
24 - MEacuteTODOS DE SEPARACcedilAtildeO
Electroforese convencional
Nas teacutecnicas de electroforese convencional foram utilizados vaacuterios sistemas de tampatildeo
para os geacuteis e para as pontes conforme a proteiacutena em estudo
Focagem isoeleacutectrica
Os sistemas de focagem isoeleacutectrica utilizados na separaccedilatildeo de proteiacutenas foram
realizados em matrizes de poliacrilamida (T = 5 C = 3) com dimensotildees 230xl00x03mm
Os geacuteis foram aplicados sobre uma peliacutecula de suporte GELFIX (SERVA) permitindo o seu
manuseamento adequado
A adiccedilatildeo de soluccedilotildees de TEMED 10 (pv) e persulfato de amoacutenio (PSA) 10 (pv)
permitiu a polimerizaccedilatildeo do gel agrave temperatura ambiente (24 horas) ou a 37 degC durante 1 h
As separaccedilotildees por focagem isoeleacutectrica decorreram sobre placa de arrefecimento a
aproximadamente 10degC (8 - 12degC)
26
Material e Meacutetodos
HB
A separaccedilatildeo da moleacutecula de HB foi realizada por focagem isoeleacutectrica em gradiente de
pH livre segundo a teacutecnica descrita por FERRAND (1995) com algumas modificaccedilotildees
A composiccedilatildeo da soluccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo e os paracircmetros eleacutectricos utilizados estatildeo
indicados nas tabelas 241 e 242 respectivamente
Tabela 241 Soluccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo utilizada para a separaccedilatildeo da moleacutecula nativa de HB por focagem isoeleacutectrica
Componentes da soluccedilatildeo Quantidades
Acrilamida 28 (pv)
Bisacrilamida 2 (pv)
Sacarose
Anfoacutelitos 5-8 (SIGMA)
7-9 (PHARMACIA)
Aacutegua bidestilada TEMED 10 (vv)
PSA 10 (pv)
18 ml
08 ml
2 g
300 p1
300 ul
ateacute 10 ml volume final
10 ul
70 ul
Tabela 242 Paracircmetros eleacutectricos utilizados na focagem isoeleacutectrica de HB
Voltagem (V) Corrente (mA) Potecircncia (W) Tempo (T)
Preacute focagem 1500 25 1
2
3
30 min
15 min
15 min
Focagem 1500 25 15 2h 30 min
As soluccedilotildees para os eleacutectrodos foram aacutecido aspaacutertico 004 M (acircnodo) e NaOH 01 M
(caacutetodo) As amostras foram aplicadas a 15 cm do caacutetodo tendo sido inseridas com o auxiacutelio
de um aplicador de borracha silicone (SERVA)
27
Material e Meacutetodos
bull CAII
A separaccedilatildeo de CAII fez-se em gel de amido (15 pv SIGMA) conforme o descrito
por AMORIM (1983) com algumas modificaccedilotildees e ainda por focagem isoeleacutectrica em
gradiente de pH livre
Utilizam-se os seguintes sistemas tampatildeo para a separaccedilatildeo por electroforese em gel de
amido
Tampatildeo das Pontes Tris 0250 M pH = 76 Aacutecido ciacutetrico 0067 M
Tampatildeo do Gel Diluiccedilatildeo 110 do tampatildeo das pH = 76 pontes
As amostras foram inseridas em meio Sephadex G-200 (PHARMACIA) na proporccedilatildeo
de 11 As electroforeses foram realizadas em placa de arrefecimento (8degC) e com um
gradiente de potencial de 5 Vcm durante 16 h
A teacutecnica utilizada para a separaccedilatildeo de CAII por focagem isoeleacutectrica foi a descrita por
BOWLING et ai (1990) com algumas modificaccedilotildees A composiccedilatildeo da soluccedilatildeo de
polimerizaccedilatildeo e os paracircmetros eleacutectricos utilizados estatildeo indicados nas tabelas 243 e 244
respectivamente
As soluccedilotildees para os eleacutectrodos foram aacutecido aspaacutertico 004 M (acircnodo) e NaOH 01 M
(caacutetodo) As amostras foram inseridas com o auxiacutelio de um aplicador de borracha silicone
(SERVA) colocado a 15 cm do caacutetodo
28
Material e Meacutetodos
Tabela 243 Soluccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo utilizada na separaccedilatildeo de CAII por focagem isoeleacutectrica
Componentes da soluccedilatildeo
Acrilamida 28 (pv)
Bisacrilamida 2 (pv)
Sacarose
Anfoacutelitos 4-65 (PHARMACIA)
Anfoacutelitos 35-10 (PHARMACIA)
Aacutegua bidestilada TEMED 10 (vv)
PSA 10 (pv)
Quantidades 18 ml
08 ml
2 g
500 |ol
100 ul
ateacute 10 ml volume final
10 ul
70 ul
Tabela 244 Paracircmetros eleacutectricos utilizados na separaccedilatildeo de CAII por focagem isoeleacutectrica
Voltagem (V) Corrente (mA) Potecircncia (W) Tempo (T)
Preacute focagem 1500 25 1
3
5
30 min
15 min
15 min
Focagem 2500 25 8
10
12
30 min
30 min
30 min
bull PEPB
A separaccedilatildeo da PEPB foi realizada em gel de amido (15 pv SIGMA) de acordo
com a teacutecnica descrita por POVEY et ai (1972) com algumas modificaccedilotildees
29
Material e Meacutetodos
Utilizou-se o seguinte sistema tampatildeo
Tampatildeo das Pontes Tris 01 M
pH = 74 NaH2P04 01 M
Tampatildeo do Gel Diluiccedilatildeo 110 do tampatildeo das
pH = 74 pontes
As amostras satildeo inseridas em meio Sephadex G-200 (PHARMACIA) na proporccedilatildeo de
11 As electroforeses foram realizadas em placas de arrefecimento (8degC) e com um gradiente
de potencial de 5 Vcm durante 16 h
bull DIA
No caso da separaccedilatildeo de DIA a teacutecnica eacute idecircntica agrave utilizada para CAII electroforese
em gel de amido (15 pv SIGMA) conforme o descrito por AMORIM (1983) com algumas
modificaccedilotildees
bull NP MDH PGD GPJ e MPI
As separaccedilotildees das enzimas NP MDH PGD GPI e MPI fizeram-se em simultacircneo por
electroforese em gel de amido (15 pv SIGMA) conforme o descrito por AMORIM et ai
(1982) com algumas modificaccedilotildees
Utilizou-se o seguinte sistema tampatildeo
1130 M
0400 M
0020 M 0010 M
Tampatildeo das Pontes NaOH
pH = 60 Aacutecido ciacutetrico
Tampatildeo do Gel HisHCl
pH = 60 NaOH
30
Material e Meacutetodos
As amostras foram inseridas em meio Sephadex G-200 (PHARMACIA) na proporccedilatildeo
de 11 As electroforeses foram realizadas em placas de arrefecimento (8degC) e com um
gradiente de potencial de 8 Vcm durante 15 h
ALB
Nas tabelas 245 e 246 indicam-se respectivamente a composiccedilatildeo da soluccedilatildeo de
polimerizaccedilatildeo para a separaccedilatildeo de ALB por focagem isoeleacutectrica segundo a teacutecnica descrita
por ROCHA et ai (1991) com algumas modificaccedilotildees e os paracircmetros eleacutectricos
Tabela 245 Soluccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo utilizada para a separaccedilatildeo de ALB por focagem isoeleacutectrica
Componentes da soluccedilatildeo Quantidades
Acrilamida 28 (pv)
Bisacrilamida 2 (pv)
Ureia
Anfoacutelitos 5-6 (PHARMACIA)
Anfoacutelitos 5-8 (PHARMACIA)
Anfoacutelitos 6-8 (PHARMACIA)
Aacutegua bidestilada TEMED 10 (vv)
PSA 10 (pv)
18 ml
08 ml
48 g
250 ni
250 ni
125 ul
ateacute 10 ml volume final
30 ul
70 ul
Tabela 246 Paracircmetros eleacutectricos utilizados na separaccedilatildeo de ALB por focagem isoeleacutectrica
Voltagem (V) Corrente (mA) Potecircncia (W) Tempo (T)
Preacute focagem 1500 25
Focagem 1500 25
1 30 min
2 15 min
3 15 min
4 3 h
5 30 min
31
Material e Meacutetodos
As soluccedilotildees para os eleacutectrodos foram aacutecido aspaacutertico 004 M (acircnodo) e NaOH 1 M
(caacutetodo) As amostras foram aplicadas a 15 cm do caacutetodo com o auxiacutelio de um aplicador de
borracha silicone (SERVA)
TF
A separaccedilatildeo da moleacutecula de TF foi efectuada por focagem isoeleacutectrica A composiccedilatildeo
da soluccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo e os paracircmetros eleacutectricos utilizados estatildeo indicados nas tabelas
247 e 248 respectivamente
Tabela 247 Soluccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo utilizada para a separaccedilatildeo da TF por focagem isoeleacutectrica
Componentes da soluccedilatildeo Quantidades
Acrilamida 28 (pv)
Bisacrilamida 2 (pv)
Sacarose
Anfoacutelitos 35-5(LKB)
Anfoacutelitos 4-65 (PHARMACIA)
Aacutegua bidestilada
TEMED 10 (vv) PSA 10 (pv)
18 ml
08 ml
2 g
100 ul
500 ul
ateacute 10 ml volume final
30 ul
70 ul
Tabela 248 Paracircmetros eleacutectricos utilizados na separaccedilatildeo de TF por focagem isoeleacutectrica
Voltagem (V) Corrente (mA) Potecircncia (W) Tempo (T)
Preacute focagem 1500 25
Focagem 2500 25
l 20 min
2 10 min
3 10 min
8 30 min
10 30 min
12 30 min
32
Material e Meacutetodos
As soluccedilotildees para os eleacutectrodos foram de aacutecido aspaacutertico 004 M (acircnodo) e de NaOH
1 M (caacutetodo) As amostras foram aplicadas a 15 cm do caacutetodo com o auxiacutelio de um aplicador
de borracha silicone (SERVA)
GC
Nas tabelas 249 e 2410 apresenta-se respectivamente a composiccedilatildeo da soluccedilatildeo de
polimerizaccedilatildeo e os paracircmetros eleacutectricos utilizados na focagem isoeleacutectrica de GC
Tabela 249 Soluccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo utilizada para a separaccedilatildeo da GC por focagem isoeleacutectrica
Componentes da soluccedilatildeo Quantidades
Acrilamida 28 (pv)
Bisacrilamida 2 (pv)
Sacarose
Anfoacutelitos 45-54 (PHARMACIA)
Anfoacutelitos 4-6 (LKB)
Aacutegua bidestilada TEMED 10 (vv)
PSA 10 (pv)
18 ml
08 ml
2 g
437 ul
188 (il
eacute 10 ml volume final
10 ul
70 ul
Tabela 2410 Paracircmetros eleacutectricos utilizados na separaccedilatildeo de GC por focagem isoeleacutectrica
Voltagem (V) Corrente (mA) Potecircncia (W) Tempo (T)
Preacute focagem 1500 25
Focagem 1500 25
1 30 min
2 15 min
3 15 min
4 3 h
5 30 min
33
Material e Meacutetodos
Para os eleacutectrodos foram utilizadas soluccedilotildees de aacutecido aspaacutertico 004 M (acircnodo) e de
NaOH 02 M (caacutetodo) As amostras foram inseridas com o auxiacutelio de um aplicador de
borracha silicone (SERVA) colocado a 15 cm do caacutetodo
25 - MEacuteTODOS DE DETECCcedilAtildeO
Apoacutes a separaccedilatildeo das proteiacutenas os padrotildees electroforeacuteticos foram geralmente obtidos
por detecccedilatildeo especiacutefica aproveitando a actividade cataliacutetica das enzimas Noutros casos a
revelaccedilatildeo foi feita por coloraccedilatildeo geral de proteiacutenas
bull HB
A visualizaccedilatildeo da HB foi obtida mediante coloraccedilatildeo geral de proteiacutenas segundo o
seguinte procedimento
Fixaccedilatildeo
Imersatildeo do gel numa soluccedilatildeo de aacutecido tricloroaceacutetico 125 (pv) durante 10 minutos
Coloraccedilatildeo geral de proteiacutenas
Coloraccedilatildeo com uma soluccedilatildeo de Coomassie R-250 0115 (pv) numa mistura de aacutecido
aceacuteticoetanolaacutegua destilada (42571) apoacutes aquecimento seguida de filtraccedilatildeo durante
5-10 minutos A descoloraccedilatildeo eacute feita com aacutecido aceacutetico etanol e aacutegua destilada
aquecida a cerca de 60degC ateacute se obter o contraste desejado
bull CAII
Apoacutes separaccedilatildeo por electroforese em gel de amido visualizou-se a CAII pela sua
actividade esteraacutesica adicionando-se diacetato de fluoresceiacutena (em quantidades vestigiais que
34
Material e Meacutetodos
foram previamente dissolvidas em 200 uacute de acetona) a uma soluccedilatildeo de incubaccedilatildeo tamponada
(pH = 66) Esta soluccedilatildeo de incubaccedilatildeo eacute composta por aacutecido ciacutetrico 27 mM e Na2HP04
116 mM e foi aplicada sobre o gel de amido com o auxiacutelio de papeacuteis de filtro Whatman ndegl
Em seguida incubou-se durante 30 minutos a 37degC A observaccedilatildeo das bandas de CAII (devido
agrave sua capacidade esteraacutesica) eacute feita sob luz ultravioleta
Apoacutes separaccedilatildeo por focagem isoeleacutectrica utilizou-se uma coloraccedilatildeo geral de proteiacutenas
para visualizaccedilatildeo da CAII segundo o meacutetodo descrito para a HB sem fixaccedilatildeo
bull PEPB
A detecccedilatildeo da PEPB apoacutes a separaccedilatildeo electroforeacutetica foi feita atraveacutes da aplicaccedilatildeo
sobre o gel de amido de papeacuteis de filtro Whatman ndegl embebidos numa soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo
seguindo-se uma incubaccedilatildeo de 30 minutos a 37degC
A soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo conteacutem o substrato da PEPB L-leucilglicil-glicina 0004 M
veneno de cobra da espeacutecie Agkistrodon piscivorus piscivorus 04 (pv) MTT 24 mM e
metosulfato de fenazina (PMS) 03 mM num tampatildeo de pH = 80 (Tris HC1005 M)
bull DIA
Apoacutes a separaccedilatildeo por electroforese em gel de amido a identificaccedilatildeo da DIA foi obtida
pela adiccedilatildeo de uma soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo a uma fatia do gel A incubaccedilatildeo decorreu durante 2
horas a 37degC
A soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo foi realizada em duas fases
Io - colocou-se 26-diclorofenol-indofenol (DCIP) 01 mM com um tampatildeo de
pH = 85 (Tris HC1 005M) adicionando-se agrave mistura aacutegua bidestilada ateacute perfazer
50 ml Em seguida filtrou-se a soluccedilatildeo
2o - agrave soluccedilatildeo filtrada adicionou-se MTT 03 mM e NADH 02 mM e agitou-se antes
de verter sobre a fatia de gel de amido
35
Material e Meacutetodos
bull NP
A detecccedilatildeo da enzima NP apoacutes a separaccedilatildeo por electroforese foi feita atraveacutes da
aplicaccedilatildeo sobre o gel de amido de papeacuteis de filtro Whatman ndegl embebidos com a soluccedilatildeo de
coloraccedilatildeo Em seguida incubou-se durante 15 minutos a 37degC
A soluccedilatildeo de incubaccedilatildeo conteacutem inosina 37 mM MTT 24 mM XOD 0004 Uml uma
gota de azul de Meldola (SIGMA) (10 vv em aacutegua bidestilada) e uma soluccedilatildeo de tampatildeo
de incubaccedilatildeo pH = 75 constituiacuteda por KH2P04 005 M e NaOH 004 M
bull MDH
Na detecccedilatildeo da actividade enzimaacutetica de MDH foi utilizado o meacutetodo de sandwich
apoacutes a sua separaccedilatildeo electroforeacutetica em gel de amido Em seguida incubou-se durante 15
minutos a 37degC O meacutetodo de sandwich consiste na aplicaccedilatildeo de uma fatia de gel de amido
entre duas folhas de papel de filtro Whatman ndegl embebido com a soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo
A soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo utilizada na detecccedilatildeo da MDH conteacutem NAD 1 mM MTT
2 mM e piruvato de soacutedio (quantidades vestigiais) Esta soluccedilatildeo foi feita com um tampatildeo de
incubaccedilatildeo pH = 74 constituiacutedo por aacutecido maacutelico 0222 M Tris 050 M e MgCl2 002 M
bull PGP
A detecccedilatildeo da actividade enzimaacutetica de PGD foi feita pelo meacutetodo de sandwich apoacutes a
sua separaccedilatildeo electroforeacutetica em gel de amido
A soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo conteacutem quantidades vestigiais de aacutecido 6-fosfoglucoacutenico
NADP MTT e uma gota de azul de Meldola (05 pv em aacutegua bidestilada) dissolvidos num
tampatildeo de pH = 74 constituiacutedo por Tris 01 M HisHCl 01 M Imidazol 0015 M e MgCl2
0005 M
36
Material e Meacutetodos
bull GPI
A detecccedilatildeo da actividade enzimaacutetica de GPI foi feita pelo meacutetodo de sandwich apoacutes a
sua separaccedilatildeo electroforeacutetica em gel de amido
A soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo conteacutem frutose-6-fosfato 55 mM NADP 22 mM MTT
4 mM desidrogenase da glucose-6-fosfato (G6PD) 14 Uml e uma gota de azul de Meldola
(05 pv em aacutegua bidestilada) dissolvidos num tampatildeo de pH = 74 constituiacutedo por Tris 01
M HisHCl 01 M Imidazol 0015 M e MgCl2 0005 M
bull MPI
Detectou-se a actividade enzimaacutetica de MPI pelo meacutetodo de sandwich apoacutes a sua
separaccedilatildeo electroforeacutetica em gel de amido
A soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo conteacutem manose-6-fosfato 42 mM NADP 13 mM MTT
24 mM e uma gota de azul de Meldola (05 pv em aacutegua bidestilada) dissolvidos num
tampatildeo de pH = 74 constituiacutedo por Tris 01 M HisHCl 01 M Imidazol 0015 M e MgCl2
0005 M Por fim adicionaram-se as enzimas isomerase da glucose-6-fosfato (GPI) 3 Uml e
desidrogenase da glucose-6-fosfato (G6PD) 5 Uml
bull ALBeTF
A detecccedilatildeo de ALB e de TF foi efectuada atraveacutes do meacutetodo de coloraccedilatildeo geral de
proteiacutenas descrito para a HB utilizando-se Coomasie R-250 sem fixaccedilatildeo
bull GCcedil
A visualizaccedilatildeo de GC efectuou-se por detecccedilatildeo imunoenzimaacutetica apoacutes transferecircncia da
proteiacutena para uma membrana de nitrocelulose (045 pm SCHLEICHER amp SCHULL)
segundo a teacutecnica descrita por FERRAND (1995)
37
Material e Meacutetodos
Apoacutes esse processo de transferecircncia as membranas de nitrocelulose foram lavadas 3
vezes (15 minutos) numa soluccedilatildeo de Tween 20 (MERCK) 0025 (vv) em soro fisioloacutegico
tamponado com fosfato (PBS Na2HP04 50 mM KH2P04 18mM NaCl 147 mM pH = 71) e
bloqueadas numa soluccedilatildeo de leite em poacute magro (5 pv em PBS) durante 18 h com agitaccedilatildeo
permanente e agrave temperatura ambiente
Depois da primeira lavagem aplicou-se o antisoro (anti-GC humana ATAB 81936)
diluiacutedo 1170 em PBS com 1 (pv) de albumina seacuterica bovina (SIGMA) durante 1 h agrave
temperatura ambiente
Repetiu-se novamente a lavagem segundo o processo jaacute referido seguindo-se a
aplicaccedilatildeo do segundo antisoro (anticorpos contra imunoglobulinas caprinas desenvolvidos em
coelho e conjugados com uma peroxidase ATAB 83806) diluiacutedo 1600 em PBS com 1
(pv) de albumina seacuterica bovina (SIGMA) durante 1 h agrave temperatura ambiente
Depois de duas lavagens (5 minutos) com Tween 20PBS procedeu-se agrave detecccedilatildeo da
GC com uma soluccedilatildeo de 9-amino-2-etilcarbazol 004 (pv) e de metanol 20 (vv) em PBS
As bandas correspondentes agrave actividade peroxidaacutesica aparecem rapidamente bloqueando-se a
reacccedilatildeo com aacutegua bidestilada
26 - MEacuteTODOS DE CAacuteLCULO
As frequecircncias geacutenicas foram calculadas por contagem directa de genes a partir da
distribuiccedilatildeo fenotiacutepica obtida
O caacutelculo dos valores de heterozigotia meacutedia (H) da proporccedilatildeo de loci polimoacuterficos
(P) do nuacutemero meacutedio de alelos por locus (ria) estatiacutesticas F e frequecircncias fenotiacutepicas
esperadas segundo o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg foi efectuado com a utilizaccedilatildeo do
programa BIOSYS versatildeo 17 (SWOFFORD amp SELANDER 1989)
O caacutelculo de distacircncias geneacuteticas e obtenccedilatildeo de dendrogramas foi efectuado com o
programa PHYLIP versatildeo 35 (FELSENTEIN 1993)
38
Resultados e Discussatildeo
3 - RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
31 - ANAacuteLISE DOS MEacuteTODOS DE SEPARACcedilAtildeO
De entre os 12 loci estudados neste trabalho detectaram-se 5 monomoacuterficos
(PEPB DIA GPI MDH e PGD) e 7 polimoacuterficos (HB CAII NP MPI ALB TF e GC)
Loci monomoacuterficos
bull PEPB
A utilizaccedilatildeo de teacutecnicas de electroforese em gel de amido permitiu a detecccedilatildeo de
um soacute fenoacutetipo (figura 311) correspondente a indiviacuteduos homozigoacuteticos para o alelo
PEPB2 descrito por DEL LAMA et ai (1992) No entanto na raccedila Minhota detectou-se
um indiviacuteduo heterozigoacutetico
O fenoacutetipo PEPB 2 apresenta um padratildeo com duas bandas uma de grande
intensidade e outra secundaacuteria mais anoacutedica de menor intensidade No indiviacuteduo
heterozigoacutetico 2-1 (natildeo representado) observou-se um padratildeo de trecircs bandas sendo a
terceira mais anoacutedica e menos intensa
A quase inexistecircncia de PEPB1 nas raccedilas estudadas estaacute de acordo com o referido
em DEL LAMA et ai (1992) que sugere a fixaccedilatildeo de PEPB2 na maior parte das
populaccedilotildees de bovinos de origem europeia (com excepccedilatildeo das raccedilas italianas Marchigiana
e Chianina)
39
Resultados e Discussatildeo
+
Figura 311 Fenoacutetipos de PEPB observados por electroforese convencional em gel de amido
bull DIA
Os resultados obtidos para a enzima DIA revelaram ausecircncia de polimorfismo
electroforeacutetico (figura 312) Resultados semelhantes foram tambeacutem obtidos em vaacuterias
raccedilas autoacutectones espanholas (GONZALEZ et ai 1987 IGLESIAS 1989 ARRANZ et ai
1992)
MAKAVEEV (1979 in IGLESIAS 1989) detectou polimorfismo desta enzima em
eritroacutecitos de buacutefalos da Bulgaacuteria e nas raccedilas bovinas Frisia e Simmental descrevendo dois
alelos codominantes DIAA e DIAB
Figura 312 Padratildeo de DIA observado por electroforese convencional em gel de amido
40
Resultados e Discussatildeo
Natildeo se detectou variaccedilatildeo electroforeacutetica para o locus GPI Estes resultados natildeo se
podem comparar com os obtidos noutras raccedilas por natildeo ter sido possiacutevel consultar outros
trabalhos onde se descrevesse variaccedilatildeo do locus GPI em gado bovino
A figura 313 apresenta o padratildeo obtido para esta enzima observando-se trecircs
bandas duas com grande intensidade e uma banda mais anoacutedica de menor intensidade
Figura 313 Padratildeo de GPI obtido em hemolisados por electroforese convencional em gel de amido
bull MDH
A enzima MDH revelou-se monomoacuterfiacuteca Este resultado eacute concordante com outros
estudos (ARRANZ et ai 1992)
Na figura 314 observa-se o padratildeo de bandas detectado por electroforese
convencional em gel de amido
Figura 314 Padratildeo de MDH observado por electroforese convencional em gel de amido
41
Resultados e Discussatildeo
bull PGD
A enzima PGD revelou-se monomoacuterfica para as raccedilas Barrosatilde e Minhota tambeacutem
neste caso natildeo se encontrou qualquer referecircncia bibliograacutefica relativa a um possiacutevel
polimorfismo deste locus em gado bovino
Na figura 315 observa-se o padratildeo obtido para esta enzima Em amostras
armazenadas por um longo periacuteodo de tempo detectaram-se duas bandas sendo a mais
anoacutedica a que revela menor intensidade as amostras mais recentes apresentam um padratildeo
electroforeacutetico com uma soacute banda
Figura 315 Padratildeo de PGD observado por electroforese convencional em gel de amido
Loci polimoacuterficos
bull HB
A electroforese convencional natildeo permite discriminar os electromorfos de HB No
entanto a utilizaccedilatildeo de sistemas de focagem isoeleacutectrica conduz agrave detecccedilatildeo de
polimorfismo nesta proteiacutena observando-se dois fenoacutetipos HB A e HB AB
Na figura 316 observa-se o padratildeo electroforeacutetico desta moleacutecula resultante da
expressatildeo de dois alelos codominantes HBA e HBB Resultados idecircnticos estatildeo
descritos em raccedilas bovinas da Peniacutensulas Ibeacuterica (VICENTE 1978 KiDD et ai 1980
IGLESIAS 1989)
42
Resultados e Discussatildeo
+ -HBB
HBA
AB AB A A
Figura 316 Separaccedilatildeo de hemoglobina nativa por focagem isoeleacutectrica
bull poundAH
A utilizaccedilatildeo de electroforese em gel de amido e focagem isoeleacutectrica permitiu
identificar trecircs fenoacutetipos CAII F CAII FS e CAII S atribuiacutedos agrave expressatildeo de dois alelos
codominantes CAF e CAS (figuras 317 e 318) Poreacutem a separaccedilatildeo por electroforese em
gel de amido implica alguma morosidade (tempos de corrida muito longos) e em amostras
coaguladas o erro de leitura pode ser superior a 20 Estas dificuldades satildeo minimizadas
quando se recorre a focagem isoeleacutectrica
Assim a separaccedilatildeo da enzima CAII por focagem isoeleacutectrica oferece vaacuterias vantagens
nomeadamente
bull rapidez e simplicidade de execuccedilatildeo
bull utilizaccedilatildeo de pequenas quantidades de material bioloacutegico
bull maior nuacutemero de amostras fenotipadas por corrida
bull possibilidade de utilizaccedilatildeo de amostras coaguladas
43
Resultados e Discussatildeo
F F F S FS FS F S FS
Figura 317 Fenoacutetipos de CAII observados sob luz ultravioleta apoacutes separaccedilatildeo por electroforese convencional em gel de amido e coloraccedilatildeo com diacetato de fluoresceina
CAIIF
| CAIIS
Figura 318 Fenoacutetipos de CAII observados por focagem isoeleacutectrica apoacutes coloraccedilatildeo geral de proteiacutenas
bull NP
A expressatildeo fenotiacutepica de NP resulta das combinaccedilotildees possiacuteveis entre um alelo
dominante NPH e um recessivo NPL (ANSAY 1973) Este facto implica que apenas em
presenccedila do feno tipo NP L eacute possiacutevel fazer corresponder um genoacutetipo (jaacute que o fenoacutetipo NP H
pode corresponder aos genoacutetipos HH e HL e o fenoacutetipo NP L corresponde ao genoacutetipo LL)
Na figura 319 apresenta-se o padratildeo obtido para a proteiacutena apoacutes separaccedilatildeo
electroforeacutetica em gel de amido
44
+
w
FS FS ]
Resultados e Discussatildeo
H L L H L L
Figura 319 Fenoacutetipos de NP detectados por electroforese convencional em gel de amido
bull MPI
Na raccedila Minhota detectaram-se quatro fenoacutetipos MPI AB MPI B MPI BC e MPI C
anteriormente descritos por ANSAY (1973) em bovinos na raccedila Barrosatilde apenas se observam
os trecircs uacuteltimos fenoacutetipos De acordo com o mesmo autor os fenoacutetipos encontrados nesta raccedila
resultam da combinaccedilatildeo de dois alelos codominantes MPIB e MPPC enquanto que MPIA
aparece na raccedila Minhota com uma frequecircncia reduzida
Como se pode observar pela anaacutelise da figura 3110 MPIA aparece como o alelo
mais anoacutedico MPIC como o mais catoacutedico e o alelo mais frequente MPIB situa-se numa
posiccedilatildeo intermeacutedia em relaccedilatildeo aos anteriores Contudo a intensidade das bandas eacute muito
fraca tornando-se quase imperceptiacutevel em alguns casos Esta grande dificuldade em obter um
contraste de bandas adequado mesmo apoacutes longos periacuteodos de incubaccedilatildeo a 37degC poderaacute
eventualmente levar a uma incorrecta interpretaccedilatildeo dos fenoacutetipos Assim a utilizaccedilatildeo de
sistemas de focagem isoeleacutectrica na determinaccedilatildeo destes fenoacutetipos seria aconselhaacutevel a fim
de verificar os resultados obtidos por electroforese convencional
45
Resultados e Discussatildeo
Figura 3110 Fenoacutetipos de MPI observados por electroforese convencional em gel de amido
bull ALB
A separaccedilatildeo por focagem isoeleacutectrica permitiu detectar polimorfismo em ALB Cada
indiviacuteduo homozigoacutetico aparece com trecircs bandas duas de maior intensidade e uma mais
aciacutedica com menor intensidade os indiviacuteduos heterozigoacuteticos podem apresentar ateacute seis
bandas
Esta heterogeneidade nos padrotildees de ALB tem sido interpretada como o resultado da
capacidade desta proteiacutena se ligar a vaacuterias substacircncias diferentes (FERRAND 1995) Com a
inclusatildeo de ureia (8M) na matriz de separaccedilatildeo reagente que provoca a desnaturaccedilatildeo da
proteiacutena levando a uma alteraccedilatildeo do seu pi para uma zona mais baacutesica do gradiente
conseguem-se obter padrotildees de bandas mais simples e mais definidos (KAWAGUCHI 1973
FERRAND 1995)
Na figura 3111 apresentam-se os padrotildees observados que foram interpretados como
sendo determinados por trecircs alelos codominantes ALBA ALBB e ALBV
GAHNE et ai (1977) e IGLESIAS (1989) detectaram por electroforese em gel de
poliacrilamida e de amido respectivamente dois variantes em gado bovino ALBA e
ALBB A utilizaccedilatildeo de focagem isoeleacutectrica veio confirmar a existecircncia destes dois alelos e
acrescentar um terceiro designado por ALBV com uma mobilidade mais aciacutedico do que
ALBA
46
Resultados e Discussatildeo
A B A B A B B B A B A G
Figura 3111 Fenoacutetipos de ALB determinados em amostras de plasma por focagem isoeleacutectrica na presenccedila de ureia 8M
ARRANZ et ai (1992) revelaram a existecircncia de um outro variante (ALBD) com
mobilidade electroforeacutetica intermeacutedia entre ALBA e ALBB ainda natildeo descrito em
nenhuma raccedila autoacutectone espanhola Este alelo poderaacute corresponder ao alelo ALBV
encontrado neste trabalho apesar de apresentar um pi mais aacutecidico do que ALBA (ARRANZ
comunicaccedilatildeo pessoal)
Desta forma a teacutecnica de separaccedilatildeo por focagem isoeleacutectrica provou ser eficaz na
separaccedilatildeo dos variantes de ALB tal como jaacute foi demonstrado no gato (BELL et ai 1994) na
ovelha (ERHARDT amp SIMIANER 1993) e no coelho (FERRAND amp ROCHA 1992)
bull TF
A transferrina eacute um dos marcadores mais importantes no estudo e caracterizaccedilatildeo
geneacutetica de raccedilas bovinas devido ao seu elevado polimorfismo No entanto a sua fenotipagem
natildeo eacute simples existindo frequentemente problemas de resoluccedilatildeo e de separaccedilatildeo das bandas
(IGLESIAS 1989)
A fim de averiguar qual a melhor forma de separar os diferentes produtos geacutenicos
descritos no locus TF testaram-se vaacuterios sistemas electroforeacuteticos em geacuteis de agarose numa
vasta gama de sistemas tampatildeo Esta teacutecnica natildeo ofereceu resultados satisfatoacuterios pelo que se
passou agrave separaccedilatildeo da TF por focagem isoeleacutectrica recorrendo a matrizes de poliacrilamida
47
Resultados e Discussatildeo
com diferentes concentraccedilotildees de ureia (6M e 8M) tambeacutem neste caso natildeo se conseguiram
resultados positivos
Este tipo de dificuldades encontradas na fenotipagem da TF por focagem isoeleacutectrica
tinham jaacute sido descritos noutras espeacutecies nomeadamente na cabra (ERHARDT 1986) e no
coelho (FERRAND 1995) No entanto TSUJI et ai (1989) demostraram ser possiacutevel fenotipar
esta proteiacutena em bovinos por focagem isoeleacutectrica sem grandes problemas e sem qualquer
aditivo na matriz de poliacrilamida
Desta forma a utilizaccedilatildeo de uma teacutecnica de focagem isoeleacutectrica com um gradiente de
pH 35-65 reforccedilado em 40-65 permitiu separar os produtos geacutenicos do locus TF Contudo
os padrotildees obtidos nem sempre eram definidos tornando-se dificilmente interpretaacuteveis
Na tentativa de melhorar os padrotildees de resoluccedilatildeo e de verificar se a variaccedilatildeo detectada
natildeo resultava de diferenccedilas no estado feacuterrico da moleacutecula de TF ou ainda da existecircncia de
aacutecidos siaacutelicos ligados agrave moleacutecula procedeu-se agrave sua separaccedilatildeo apoacutes vaacuterios tratamentos das
amostras
A remoccedilatildeo dos aacutecidos siaacutelicos atraveacutes do tratamento das amostras com neuraminidase
natildeo permitiu a obtenccedilatildeo de bandas definidas este tratamento natildeo altera significativamente o
padratildeo das bandas de TF de bovinos como jaacute tinha sido descrito por PENHALLOU et ai
(1991)
A obtenccedilatildeo de TF no estado apofeacuterrico foi conseguida submetendo as amostras a um
tratamento com EDTA-dissoacutedico Neste caso observa-se que apoTF apresenta uma
mobilidade menor e um padratildeo de bandas mais simples mas ainda sem uma definiccedilatildeo
adequada
A forma Fe2TF foi obtida mediante vaacuterios tratamentos com dadores de Fe (ver capiacutetulo
Material e Meacutetodos) Os resultados soacute se mostraram satisfatoacuterios atraveacutes da saturaccedilatildeo da
moleacutecula de TF com uma soluccedilatildeo de sulfato de amoacutenio feacuterrico provavelmente por causar uma
maior estabilidade da moleacutecula ao longo da sua separaccedilatildeo por focagem isoeleacutectrica com
elevadas voltagens pois segundo WELCHS (1990) a forma difeacuterrica da transferrina eacute mais
resistente agrave desnaturaccedilatildeo e ao calor do que a forma apoTF
48
Resultados e Discussatildeo
Estatildeo descritos pelo menos oito alelos no locus TF TFAl TFA2 TFB TFD1
TFD2 TFE TFF e TFG os mais comuns no gado europeu (Bos taurus) satildeo TFA
TFD1 TFD2 e TFE (JAMIESON 1965) No gado asiaacutetico e africano (Bos indicus) ocorrem
aleacutem das formas anteriores os alelos TFB e TFF
Na figura 3112 apresenta-se o proteinograma obtido com a utilizaccedilatildeo de amostras
saturadas com Fe Esta teacutecnica permitiu a separaccedilatildeo de TFD em TFD1 e TFD2 e a
detecccedilatildeo de todos os outros fenoacutetipos descritos em bovinos europeus Assim observaram-se
quatro alelos codominantes TFA TFD1 TFD2 e TFE
A expressatildeo fenotiacutepica dos alelos em homozigotia caracteriza-se pela presenccedila de dois
dupletos de bandas aparecendo a banda mais aciacutedica de cada dupleto com intensidade mais
fraca Os indiviacuteduos herozigoacuteticos podem apresentar ateacute oito bandas
Figura 3112 Fenoacutetipos de TF determinados por focagem isoeleacutectrica apartir de amostras saturadas com uma soluccedilatildeo de sulfato de amoacutenio feacuterrico
IGLESIAS (1989) detectou TFA e TFD nas cinco raccedilas de bovinos da Galiza o
variante TFE na raccedila Cachena espanhola e um outro variante raro TFR com mobilidade
mais lenta na raccedila Rubia Galega
bull QQ
A GC eacute uma proteiacutena plasmaacutetica que demonstra um elevado grau de heterogeneidade
geneacutetica em mamiacuteferos (FERRAND 1995)
A separaccedilatildeo de GC em focagem isoeleacutectrica seguida da utilizaccedilatildeo de immunoblotting
melhorou de forma consideraacutevel a capacidade de investigar a variaccedilatildeo desta proteiacutena em
49
Resultados e Discussatildeo
diferentes espeacutecies (JUNEJA et ai 1987 PENEDO amp JUNEJA 1989 STRATIL et ai 1990
KALAacuteB et ai 1990 STERN et ai 1992 VANKAN amp BELL 1992 FERRAND 1995)
Nas figuras 3113 e 3114 apresentam-se alguns dos fenoacutetipos obtidos na separaccedilatildeo
da GC por focagem isoeleacutectrica Verifica-se que em amostras tratadas com neuraminidase o
padratildeo de bandas se apresenta mais simplificado surgindo no entanto duas bandas (uma
mais baacutesica e uma mais aciacutedica) de natureza desconhecida Os padrotildees observados foram
interpretados como sendo determinados por dois alelos GCF e GCS
mdashGCF
S F S FS S FS F F S FS 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Figura 3113 Fenoacutetipos de GC determinados por focagem isoeleacutectrica amostras 1 8 9 e 10 tratadas com neuraminidase amostras 2 a 7 diluiacutedas em aacutegua bidestilada
S1 $ l S- -
FS S S S F S FS S FS F S
Figura 3114 Fenoacutetipos de GC determinados em amostras de plasma tratados com neuraminidase apoacutes focagem isoeleacutectrica
Nota-se a existecircncia de dois alelos codominantes GCF e GCS sendo o segundo
mais aciacutedico do que o primeiro
50
Resultados e Discussatildeo
32 - ANAacuteLISE FAMILIAR
A realizaccedilatildeo da anaacutelise familiar relativo ao conjunto de loci polimoacuterficos estudados
observa-se no estudo de 27 pares matildeefilho Esta situaccedilatildeo resulta da grande dificuldade
existente na obtenccedilatildeo de informaccedilatildeo sobre os machos
Os resultados apresentam-se nas tabelas 321 a 326 natildeo foi possiacutevel testar o
equiliacutebrio de Hardy-Weinberg devido ao reduzido tamanho da amostra bem como ao facto de
vaacuterios alelos ocorrerem em baixa frequecircncia
Refira-se que natildeo foi detectado qualquer caso de exclusatildeo matildeefilho
Tabela 321 Sistema CAII Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica em 27 pares matildeefilho Os valores esperados segundo o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg estatildeo indicados entre parecircntesis
Total
4 (32) 17
(122) 6
(116) 27
Tabela 322 Sistema NP Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica em 27 pares matildeefilho Os valores esperados segundo o equiliacutebrio de Hardy--Weinberg estatildeo indicados entre parecircntesis
Total
14
(114)
13
(156)
27
^ ^ ^ Filho
Matildee - ^ F
Fenoacutetipos
F f~ (11)
FS 2
(21)
S
Total 3
Fenoacutetipos
FS S
3
(21)
10 5
(61) (40)
1 5
(40) (76)
14 10
- v ^ ^ Filho Fenoacutetipos
Matildee - ^ H L
Fenoacutetipos
H 10 4
(77) (37)
L 5 8
(37) (119)
Total 15 12
51
Resultados e Discussatildeo
Tabela 323 Sistema MPI Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica em 26 pares matildeefilho Os valores esperados segundo o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg estatildeo indicados entre parecircntesis
^ Filho Fenoacutetipos Total
Matildee ^ ~ ^ A AB AC B BC c Fenoacutetipos
A 0 0 0 - - - 0
(00) (00) (00) (00)
AB 0 0 0 0 0 - 0
(00) (00) (00) (00) (00) (00)
AC 0 0 0 - 0 0 0
(00) (00) (00) (00) (00) (00)
B - 0 - 24 1 - 25
(00) (242) (06) (248)
BC - 0 0 1 0 0 1
(00) (00) (06) (06) (00) (12)
C - - 0 - 0 0 0
(00) (00) (00) (00)
Total 0 0 0 25 1 0 26
Tabela 324 Sistema ALB Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica em 27 pares matildeefilho Os valores esperados segundo o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg estatildeo indicados entre parecircntesis
^ ^ Filho Fenoacutetipos Total
M atilde e ^ ^ - s ^ ^ A AB AV B BV V
Fenoacutetipos
A 24 2 0 - - - 26
(251) (04) (02) (257)
AB 0 0 0 0 0 -
0
(04) (04) (00) (00) (00) (08)
AG 1 0 0 - 0 0 1
(02) (00) (02) (00) (00) (04)
B - 0 - 0 0 - 0
(00) (00) (00) (00)
BG - 0 0 0 0 0 0
(00) (00) (00) (00) (00) (00)
G - - 0 - 0 0 0
(00) (00) (00) (00)
Total 25 2 0 0 0 0 27
52
Resultados e Discussatildeo
Tabela 325 Sistema TF Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica em 27 pares matildeefilho Os valores esperados segundo o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg estatildeo indicados entre parecircntesis
Filho Fenoacutetipos Total
Matildee ^ A ADI AD2 AE Dl D1D2 DIE D2 D2E E
Fenoacutetipos
A 6
(51)
1
(14)
4
(21)
1
(03)
12
(89)
ADI 1 2 0 0 0 0 0 - - - 3
(14) (24) (06) (01) (04) (06) (01) (56)
AD2 2 0 5 0 - 0 - 2 0 - 9
(21) (06) (36) (01) (06) (08) (01) (79)
AE 0 0 0 0 - - 0 - 0 0 0
(03) (01) (01) (06) (01) (01) (00) (13) Dl 0
(04) 1
(01)
1
(02)
0
(00)
- 2
(07)
D1D2 - 0 1 - 0 0 0 0 0 - 1
(06) (06) (02) (10) (00) (02) (00) (26) DIE - 0 - 0 0 0 0 - 0 0 0
(01) (01) (00) (00) (02) (00) (00) (04)
D2 0
(08) 0
(02)
0
(03)
0
(01)
- 0
(14) D2E - - 0 0 - 0 0 0 0 0 0
(01) (01) (00) (00) (01) (02) (00) (05) E 0
(00) 0
(00)
0
(00)
0
(00)
0
(00)
Total 9 3 10 1 1 1 0 2 0 0 27
Tabela 326 Sistema GC Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica em 27 pares matildeefilho Os valores esperados segundo o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg estatildeo indicados entre parecircntesis
- - ^ F i l h o Fenoacutetipos Total
Matildee ^ ^ 1 2-1 2
Fenoacutetipos
1 17 2 19
(156) (31) (187)
2-1 5 2 0 7
(31) (38) (06) (75)
2 _ 1 0 1
(06) (01) (07)
Total 22 5 0 27
53
Resultados e Discussatildeo
33 - ANAacuteLISE POPULACIONAL LOCUS A LOCUS
Neste capiacutetulo faz-se a anaacutelise populacional dos loci polimoacuterficos e ainda dos loci
PEPB e DIA para os quais natildeo se detectou variaccedilatildeo na raccedila Barrosatilde A sua inclusatildeo justifica-
-se pelo facto de serem polimoacuterficos noutras raccedilas bovinas ou em espeacutecies aparentadas
bull PEPB
O locus PEPB revelou-se monomoacuterfico nas trecircs populaccedilotildees de bovinos de raccedila
Barrosatilde e Minhota tendo sido detectado um uacutenico produto geacutenico PEPB2 (observado um
indiviacuteduo heterozigoacutetico da raccedila Minhota) No entanto este locus eacute referido como polimoacuterfico
em raccedilas bovinas criadas no Brasil onde se detectaram dois alelos codominantes PEPB1 e
PEPB2 (DEL LAMA et ai 1992)
O alelo PEPB2 estaacute fixado nas raccedilas de origem europeia incluindo as estudadas neste
trabalho excepto nas raccedilas italianas Marchigiana e Chianina nas quais PEPB1 apresenta
frequecircncias geacutenicas entre 011 e 014 (tabela 331)
Tabela 331 Frequecircncias geacutenicas de PEPB em vaacuterias raccedilas bovinas
N
Frequecircncias geacutenicas N PEPB1 PEPB2 Referecircncia
Barrosatilde inscrita 141 - 100 Este trabalho
Barrosatilde natildeo inscrita 153 - 100 t i
Minhota 62 001 plusmn0003 099 plusmn 0003 ec
Blonde dAquitaine 13 - 100 DEL LAMAetal 1992)
Charolesa 118 - 100 laquo
Chianina 83 014 plusmn003 086 plusmn 003 t t
Hereford 79 - 100 et
Frisia 125 - 100 t t
Jersey 139 - 100
Limousine 24 - 100
Marchigiana 85 011 plusmn002 089 plusmn 002 te
Simmental 75 - 100 t t
54
Resultados e Discussatildeo
bull DIA
Pela anaacutelise da tabela 332 verifica-se natildeo existir variaccedilatildeo geneacutetica neste locus nas
raccedilas bovinas apresentadas estando fixado o alelo DIAS os resultados obtidos estatildeo de
acordo com os jaacute publicados por outros autores (GONZALEZ et ai 1987 IGLESIAS 1989) Por
outro lado nas populaccedilotildees de buacutefalos ocorre um segundo alelo DIAF com frequecircncias
entre 019 e 021
Tabela 332 Frequecircncias geacutenicas de DIA em vaacuterias populaccedilotildees de raccedilas bovinas e buacutefalos
Frequecircncias geacutenicas
N DIAF DIAS Referecircncia
Portugal
Barrosatilde inscrita 141
Barrosatilde natildeo inscrita 153
Minhota 62
Espanha
Cachena 71
Caldelana 60
Frieiresa 33
Limiana 39
Rubia Gallega 168
Vianesa 40
Sayaguesa (Zamora) 147
Morucha (Salamanca) 101
Alistana Sanabresa 157
Blanca Cacerena 62
Caacuterdena Andaluza 25
Asturiana de los Vallegraves 127
Asturiana de la Montana 106
Bulgaacuteria
Buacutefalo 122
Murrah (Buacutefalo) 51
raquo IGLESIAS (1989)
- 100 Este trabalho
- 100
- 100 a
- 100 IGLESIAS (1989)
- 100
- 100
- 100
- 100
- 100
- 100 GONZALEZ et al (19
- 100
- 100 st
- 100 st
- 100
- 100
- 100
019 + 00 081 plusmn00 MAKAVEEV(1984
021 plusmn00 079 plusmn 00 laquo
55
Resultados e Discussatildeo
bull HB
Os resultados obtidos no estudo de HB permitiram distinguir dois fenoacutetipos definidos
por dois alelos HBA e HBB (tabela 333)
Tabela 333 Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica de HB em populaccedilotildees das raccedilas Barrosatilde e Minhota Os valores esperados de acordo com o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg estatildeo indicados entre parecircntesis
Fenoacutetipos N HBA HBAB HBB
Barrosatilde inscrita 141 141
Barrosatilde natildeo inscrita 153 153
Minhota 62 56 6 0
(561) (58) (01)
As frequecircncias geacutenicas das raccedilas estudadas bem como outras jaacute publicadas referentes a
vaacuterias raccedilas bovinas europeias e a duas espeacutecies de buacutefalos encontram-se discriminadas na
tabela 334
A elevada frequecircncia do alelo HBA nas raccedilas estudadas (fixado na raccedila Barrosatilde)
situam-nas juntamente com outras raccedilas bovinas do centro e sul da Europa onde este alelo
ocorre com frequecircncias entre 080-098 (VICENTE 1978) Nas restantes raccedilas europeias
HBA ocorre com uma ampla margem de variaccedilatildeo (038 - 100) apresentando-se quase
sempre como o alelo mais frequente
No caso dos buacutefalos observa-se uma inversatildeo nos valores das frequecircncias geacutenicas
sendo o alelo HBB o mais frequente
A presenccedila de HBB nos bovinos europeus apesar de em baixa frequecircncia pode ser
indicativo de uma origem a partir de raccedilas asiaacuteticas ou africanas jaacute que eacute nestes continentes
que este alelo ocorre com frequecircncia mais elevadas as frequecircncias geacutenicas mais elevadas estatildeo
descritas no gado zebu da Aacutefrica (BRAEND 1971 VICENTE 1978)
56
Resultados e Discussatildeo
Tabela 334 Frequecircncias geacutenicas de HB em vaacuterias populaccedilotildees de raccedilas bovinas e buacutefalos
N
Frequecircncias geacutenicas
N HBA HBB Referecircncia
Portugal
Barrosatilde inscrita 141 100 - Este trabalho
Barrosatilde natildeo inscrita 153 100 -
Minhota 62 095 plusmn 002 005 plusmn 002
Mertolenga 147 093 plusmn 002 007 plusmn 002 KTOD et ai (1980)
Alentejana 155 096 plusmn 001 004 plusmn001 IacuteIacute
Mirandesa 107 099+001 001 plusmn001 NOBRE (S data)
Espanha
Cachena 71 091 + 002 009 plusmn 002 IGLESIAS (1989)
Caldelana 60 097 plusmn 002 003 plusmn 002
Frieiresa 33 095 plusmn 003 005 plusmn 003
Limiana 39 090 plusmn 003 010 plusmn003
Rubia Gallega 168 093 plusmn 001 007 plusmn001 ce
Vianesa 40 098 plusmn 002 002 plusmn002
Sayaguesa (Zamora) 147 083 plusmn002 017 plusmn002 GONZALEZ et al ( 1987)
Morucha (Salamanca) 101 084 plusmn 003 016 plusmn003 ce
Alistana Sanabresa 157 099 plusmn 001 001 plusmn001
Blanca Cacerefia 62 071 plusmn 004 029 plusmn 004 laquo
Caacuterdena Andaluza 25 096 plusmn 003 004 plusmn 003 IacuteIacute
Asturiana de los Vallegraves 127 091 plusmn002 009 plusmn002
Pirenaica 383 084 plusmn 001 016 plusmn001 VICENTE (1978)
Tudanca 42 065 plusmn 005 035 plusmn 005 laquo
Morena del N O 25 100 -
Frisona 97 100 - laquo
Asturiana de la Montaria 106 079+003 021 plusmn003
De Lidia 124 079 plusmn 003 021 plusmn003 KlDDeacutetal (1980)
Retinta 164 081 plusmn002 019 plusmn002
Itaacutelia
Chianina 264 096 plusmn 001 004 plusmn 001 CARENZiera (1970)
Marchigiana 112 099 plusmn001 001 plusmn001
Bulgaacuteria
Sofia Brown 173 089 plusmn 002 011 plusmn002 MAKAVEEV (1970)
Buacutefalo 77 009 plusmn 002 091 plusmn002 MAKAVEEV(1984)
Murrah (Buacutefalo) 51 015 plusmn004 085 plusmn 004 ce
G Bretanha
Jersey 467 038 plusmn 002 062 plusmn 002 LARSENefa (1974)
in IGLESIAS (1989)
57
Resultados e Discussatildeo
A frequecircncia obtida para HBB na raccedila Minhota (005) aproxima-a das raccedilas do sul da
Europa onde este alelo ocorre com uma frequecircncia de aproximadamente 01 Por outro lado a
completa ausecircncia de HBB na raccedila Barrosatilde eacute um resultado interessante mas para o qual natildeo
eacute possiacutevel fornecer actualmente uma explicaccedilatildeo satisfatoacuteria
CAII
A distribuiccedilatildeo dos fenoacutetipos observados para o locus CAII apresenta-se na tabela
335
Tabela 335 Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica de CAU em populaccedilotildees das raccedilas Barrosatilde e Minhota Entre parecircntesis indicam-se os valores esperados de acordo com o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg
Fenoacutetipos N CA F CAFS CAS
Barrosatilde inscrita 141 17 58 66
(149) (622) (639)
Barrosatilde natildeo inscrita 153 20 71 62
(200) (710) (620)
Minhota 62 3 13 46
(14) (162) (444)
x2
0651 1 0420
0000 1 0995
Os valores do teste de 2 nas populaccedilotildees de raccedila Barrosatilde demonstram natildeo haver
desvios significativos ao equiliacutebrio de Hardy-Weinberg apesar de se observar um ligeiro
excesso de homozigoacuteticos F na populaccedilatildeo de raccedila Barrosatilde (inscrita) Para a raccedila Minhota natildeo
foi possiacutevel testar o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg
Na tabela 336 apresentam-se as frequecircncias geacutenicas de CAII nas populaccedilotildees
estudadas bem como as publicadas por outros autores
O locus CAII apresenta-se polimoacuterfico na maior parte das populaccedilotildees bovinas
europeias sendo o alelo CAIIS o que ocorre com frequecircncia mais elevada
58
Resultados e Discussatildeo
Tabela 336 Frequecircncias geacutemeas de CAU em vaacuterias populaccedilotildees de raccedilas bovinas e de buacutefalos
N
Frequecircncias geacutenicas N CAS CAF Referecircncia
Portugal
Barrosatilde inscrita 141 068 plusmn 003 032 plusmn 003 Este trabalho
Barrosatilde natildeo inscrita 153 064+003 036 plusmn 003
Minhota 62 085 plusmn 003 015+003 Iacute Iacute
Mertolenga 147 085 plusmn 002 015+002 Kn)Deiacutea(1980)
Alentejana 155 091 plusmn 002 009 plusmn 002
Mirandesa 107 099 + 001 001+001 NOBRE (S data)
Espanha
Cachena 71 077 + 004 023 plusmn 004 IGLESIAS (1989)
Caldelana 60 096 plusmn 002 004 plusmn 002 ce
Frieiresa 33 094 + 003 006 plusmn 003
Limiana 39 083 + 004 017 plusmn 004
Rubia Gallega 168 089 plusmn 002 011+002
Vianesa 40 086 + 004 014 plusmn 004
Sayaguesa 147 072 plusmn 003 028+003 GONZALEZ eacutetal (1987)
Morucha 101 072 plusmn 003 028 plusmn 003 a
Alistana Sanabresa 157 092 plusmn 002 008+002 iacute iacute
Blanca Cacerena 62 067 plusmn 004 033 plusmn 004 IacuteIacute
Caacuterdena Andaluza 25 100
Asturiana de los Vallegraves 127 087 plusmn 002 013+002 laquo
Asturiana de la Montaria 106 077 plusmn003 023 plusmn 003 IacuteIacute
Tudanca 42 076 plusmn 005 024 plusmn 005 VICENTE (1978)
Morena del NO 25 092 plusmn 004 008 plusmn 004
De Lidia 124 061+003 039 plusmn 003 KjDDetal (1980)
Retinta 164 065 + 003 035+003 iacuteiacute
Bulgaacuteria
Buacutefalo 263 007 + 001 093+001 MAKAVEEV(1984)
Murran (Buacutefalo) 51 020 plusmn 004 080 plusmn 004 laquo
Alemanha
Frisia 550 083 plusmn 001 017 + 001 THTNNES eacutetal (1976)
Suiacuteccedila
Simmental 1039 079 + 001 021+001 KAgraveSTLIeacutetal (1980)
Castanha Suiacuteccedila 546 087 plusmn 001 013+001
Friburg 223 084 + 002 016+002
in IGLESIAS (1989)
59
Resultados e Discussatildeo
As frequecircncias aleacutelicas de CAIPS e CAIPF nas raccedilas Cachena espanhola e Barrosatilde
portuguesa satildeo idecircnticas o que poderaacute eventualmente indicar estar-se em presenccedila de uma soacute
raccedila com designaccedilotildees diferentes nos dois paiacuteses Esta hipoacutetese eacute reforccedilada pelo facto de natildeo
haver diferenccedilas significativas entre dados morfomeacutetricos obtidos nas duas raccedilas (LEAL 1995)
Nos buacutefalos observa-se mais uma vez uma inversatildeo nas frequecircncias dos dois alelos do
locus CAII em relaccedilatildeo aos bovinos sendo CAF o mais frequente com valores situados entre
080 e 093
bull NP
Pela anaacutelise das tabelas 337 e 338 verifiacuteca-se a presenccedila dos dois alelos descritos
neste locus nas vaacuterias raccedilas bovinas sendo NPL o mais frequente nas raccedilas europeias (052 e
099) Observa-se uma grande similaridade entre os valores das frequecircncias geacutenicas o que natildeo
permite diferenciar as raccedilas estudadas neste trabalho das restantes
Tabela 337 Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica de NP em populaccedilotildees das raccedilas Barrosatilde e Minhota
N
Fenoacutetipos
N NP H NPL
Barrosatilde inscrita 141 69 72
Barrosatilde natildeo inscrita 153 55 98
Minhota 62 19 43
60
Resultados e Discussatildeo
Tabela 338 Frequecircncias geacutenicas para NP em vaacuterias populaccedilotildees e raccedilas bovinas
N
Frequecircncias geacutenicas
N NPH NPL Referecircncia
Portugal
Barrosatilde inscrita 141 029 plusmn 003 071 plusmn 003 Este trabalho
Barrosatilde natildeo inscrita 153 020 plusmn 002 080 plusmn 002 cc
Minhota 62 017 + 004 083 + 004
Espanha
Cachena 71 020 plusmn 003 080 plusmn 003 IGLESIAS (1989)
Caldelana 60 013+003 087 plusmn 003 t t
Frieiresa 33 011+004 089 plusmn 004
Limiana 39 008 plusmn 003 092 plusmn 003
Rubia Gallega 168 015+002 085 plusmn 002
Vianesa 40 013 + 004 087 plusmn 004 t i
Sayaguesa 147 014 + 002 086 plusmn 002 GONZALEZ et ai ( 1987)
Morucha 101 020 plusmn 003 080 plusmn 003
Alistana Sanabresa 157 001+001 099 + 001
Blanca Cacerena 62 048 plusmn 005 052 plusmn 005 laquo
Caacuterdena Andaluza 25 004 plusmn 003 096 plusmn 003 IacuteIacute
Asturiana de los Vallegraves 127 028 plusmn 003 072 plusmn 003
Asturiana de la Montana 106 026 plusmn 003 074 plusmn 003
Beacutelgica
Charolesa 130 026 plusmn 003 074 + 003 ANSAY amp HANSET (1972)
Frisia 91 006 plusmn 002 094 plusmn 002 t t
in IGLESIAS (1989)
MPI
A distribuiccedilatildeo dos fenoacutetipos observados para o locus MPI apresenta-se na tabela 339
Das trecircs populaccedilotildees estudadas apenas a raccedila Minhota apresenta valores observados
proacuteximos dos valores esperados segundo o formalismo de Hardy-Weinberg Por outro lado
apesar de natildeo ter sido possiacutevel testar o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg nas restantes populaccedilotildees
a aparente diferenccedila entre valores observados e esperados poderaacute dever-se a um excesso de
indiviacuteduos homozigoacuteticos para MPIC Este resultado poderaacute estar relacionado com o
processo de amostragem ou com outras causas como o acasalamento entre indiviacuteduos
61
Resultados e Discussatildeo
aparentados a existecircncia de sub-populaccedilotildees de tamanho pequeno ou ainda a um reduzido
nuacutemero de machos reprodutores
Tabela 339 Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica de MPI em populaccedilotildees das raccedilas Barrosatilde e Minhota Entre parecircntesis indicam-se os valores esperados de acordo com o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg
Fenoacutetipos N MPIA MPIAB MPIAC MPIB MPIBC MPIC
Barrosatilde inscrita 138 - - - 131 6 1
(1301) (78) (01)
Barrosatilde natildeo inscrita 1 5 2 - - - 147 4 1
(1460) (59) (01)
Minhota 61 0 3 0 56 2 0
(00) (29) (01) (561) (19) (00)
A anaacutelise da tabela 3310 permite verificar que MPIB e MPIC ocorrem nas duas
raccedilas de bovinos estudadas sendo MPIB o alelo mais comum nas trecircs populaccedilotildees A
ocorrecircncia de MPI A na raccedila Minhota contraria o descrito por ANSAY (1973) quando afirma
a exclusividade do fenoacutetipo AB na raccedila Charolesa
Tabela 3310 Frequecircncias geacutenicas de MPI nas populaccedilotildees estudadas
N
Frequecircncias geacutenicas
N MPPA MPPB MPIC
Barrosatilde inscrita 138 - 097 + 001 003+001
Barrosatilde natildeo inscrita 152 - 098 + 001 002+001
Minhota 61 002 plusmn 001 096 plusmn002 002 plusmn 001
A informaccedilatildeo disponiacutevel sobre este marcador em anteriores trabalhos de anaacutelise
geneacutetica em bovinos eacute quase inexistente Tal poderaacute dever-se agraves dificuldades de visualizaccedilatildeo
encontradas na sua fenotipagem por electroforese convencional A detecccedilatildeo de MPI estaacute
descrita em tecidos musculares e em leucoacutecitos neste trabalho utilizaram-se eritroacutecitos para o
estudo de variaccedilatildeo geneacutetica desta proteiacutena mas eacute provaacutevel que a sua expressatildeo ocorra apenas
na fracccedilatildeo leucocitaacuteria (natildeo separada) o que explicaria precisamente a sua fraca actividade
62
Resultados e Discussatildeo
ALB
A distribuiccedilatildeo dos fenoacutetipos observados para o locus ALB apresenta-se na tabela
3311
Apesar de natildeo ter sido possiacutevel testar o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg todas as
amostras estudadas mostram desvios muito reduzidos entre valores observados e esperados
Tabela 3311 Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica de ALB em populaccedilotildees das raccedilas Barrosatilde e Minhota Entre parecircntesis indicam-se os valores esperados de acordo com o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg
N
Fenoacutetipos N ALBA ALBAB ALBB ALBBV ALBAV ALB V
Barrosatilde inscrita 142 137 3 - - 2 -(1370) (30) (00) (00) (20) (00)
Barrosatilde natildeo inscrita 153 145 5 1 - 2 -(1440) (68) (01) (01) (20) (00)
Minhota 62 59
(590)
3 (30) (00)
Na tabela 3312 estatildeo discriminadas as frequecircncias geacutenicas estimadas para as
populaccedilotildees estudadas bem como as de outras populaccedilotildees de bovinos da Europa e de buacutefalos
da Bulgaacuteria
Verifica-se que ALBA eacute o alelo mais comum encontrando-se aparentemente fixado
em vaacuterias raccedilas bovinas de origem europeia
Como jaacute referido para HB a presenccedila de ALBB nas raccedilas europeias parece
relacionar-se com a sua localizaccedilatildeo geograacutefica verificando-se que de uma maneira geral a sua
frequecircncia aumenta agrave medida que nos aproximamos do sul da Europa e de Aacutefrica eacute no gado
zebu africano que este alelo ocorre com frequecircncias mais elevadas variando entre 030 e 060
(VICENTE 1978) Assim a presenccedila de ALBB no gado europeu poderaacute indicar a passagem
pela Europa de bovinos oriundos de Aacutefrica (CECCHINI amp Nus 1986) Eacute de notar que apenas a
raccedila Minhota e algumas das restantes raccedilas da Peniacutensula Ibeacuterica natildeo apresentam ALBB
63
Resultados e Discussatildeo
Tabela 3312 Frequecircncias geacutenicas de ALB em vaacuterias populaccedilotildees de raccedilas bovinas e em buacutefalos
Frequecircncias geacutenicas
N ALBA (F) ALBB (S) ALBV Referecircncia
Portugal
Barrosatilde inscrita 142 098 + 001 001 plusmn 001 001 plusmn001 Este trabalho
Barrosatilde natildeo inscrita 153 097 + 001 002+001 001 plusmn001
Minhota 62 098 plusmn 001 - 002 plusmn 001
Mertolenga 147 084 plusmn 002 016 + 002 - KlDDetal (1980)
Alentejana 155 094+001 006 plusmn 001 -
Mirandesa 106 094 + 002 006 plusmn 002 - NOBRE (S data)
Espanha -
Cachena 71 098 + 001 002+001 - IGLESIAS (1989)
Caldelana 60 098 plusmn 001 002 + 001 -
Frieiresa 33 100 - - raquo
Limiana 39 097 + 002 003 plusmn 002 -
Rubia Gallega 201 099 plusmn 000 001 plusmn000 -
Vianesa 40 093 + 003 007 + 003 -
Sayaguesa 147 096 plusmn001 004 plusmn 001 - GONZALEZ et al (1987)
Moracha 101 089 plusmn 002 011+002 -
Alistaria Sanabresa 157 090 plusmn 002 010 plusmn002 -
Blanca Cacerena 62 056 plusmn 005 044 plusmn 005 -
Caacuterdena Andaluza 25 100 - -
Asturiana de los Vallegraves 127 099 + 001 001 plusmn001 -
Asturiana de la Montana 106 099 plusmn001 001 plusmn001 -
Pirenaica 265 092 + 001 008 plusmn001 - VICENTE (1978)
Tudanca 42 100 - -
Morena del N O 25 092 + 004 008 plusmn 004 -
Frisona 97 100 - -
De Lidia 124 100 - - KIDDeacutetal (1980)
Retinta 164 097 + 001 003 plusmn001 -
Itaacutelia
Chinina 264 089 + 001 011 plusmn001 - CARENZIeacutetal (1970)
Marchigiana 124 074 + 003 026 plusmn 003 -
Beacutelgica
Pied vermelha Este-Flandern 503 100 - - BOUQUET amp VAN de WEGHE (1972)
Vermelha Oeste-Flandern 155 100 - -
Pied preta 174 100 - -
Pied vermelha-Campine 265 100 - -
w IGLESIAS (1989)
(Continua)
64
Resultados e Discussatildeo
Tabela 3312 Frequecircncias geacutenicas de ALB em vaacuterias populaccedilotildees de raccedilas bovinas e de buacutefalos (continuaccedilatildeo)
Frequecircncias geacutenicas N ALBA (F) ALBB (S) ALBV Referecircncia
Bulgaacuteria
Sofia Brow 170 096+001 004 + 001 - M A K A V E E V ( 1 9 7 0 )
Buacutefalo 225 047 plusmn 002 053 plusmn 002 - M A K A V E E V ( 1 9 8 4 )
Murrah (Buacutefalo) 76 012+003 088 plusmn 003 -
G Bretanha
Charolesa 99 084 plusmn 003 016 + 003 - SPOONER amp OLIVER (1969)
Frisia 1422 100 - -
Hereford 215 099 plusmn 001 001+001 -
Jersey 217 100 - -
laquo IGLESIAS (1989)
Neste trabalho descreve-se tambeacutem o alelo ALBV com uma frequecircncia de 001 e
002 nas raccedilas Barrosatilde e Minhota respectivamente Este alelo natildeo se encontra descrito em
qualquer raccedila europeia podendo a sua detecccedilatildeo estar relacionada com a capacidade resolvente
da teacutecnica de focagem isoeleacutectrica utilizada na separaccedilatildeo de ALB
TF
A transferrina eacute provavelmente o mais informativo dos sistemas polimoacuterficos estudados
em virtude do nuacutemero de alelos que apresenta
A distribuiccedilatildeo dos fenoacutetipos observados para o locus TF apresenta-se na tabela 3313
E possiacutevel verificar a existecircncia de equiliacutebrio de Hardy-Weinberg em todas as populaccedilotildees
estudadas
Da anaacutelise das frequecircncias geacutenicas expressas na tabela 3314 verifica-se que este locus
apresenta quatro produtos geacutenicos na maioria das raccedilas europeias sendo os alelos TFA e
TFD (incluindo os subtipos TFD1 e TFD2) os que apresentam frequecircncias mais elevadas
(027 a 092 para o alelo TFA e 026 a 073 para o alelo TFD)
Observa-se tambeacutem que a frequecircncia de TFD2 nas raccedilas estudadas eacute mais elevada do
que a de TFD1 como ocorre na maioria das raccedilas ibeacutericas
65
Resultados e Discussatildeo
No que se refere a TFE verifica-se que a sua frequecircncia eacute relativamente baixa nas
raccedilas europeias (001 e 022) e estaacute mesmo ausente em quase todas as raccedilas da regiatildeo da
Galiza (com excepccedilatildeo da raccedila Cachena espanhola e Rubia Gallega) e na raccedila Minhota Note-se
a grande semelhanccedila entre os valores de frequecircncias geacutenicas deste alelo na raccedila Cachena
espanhola (005) e nas populaccedilotildees de raccedila Barrosatilde (004 e 003) o que mais uma vez sugere
uma grande proximidade entre as duas Apesar de ocorrer em baixa frequecircncia nos bovinos
europeus a presenccedila de TFE nestas raccedilas pode indicar uma proveniecircncia asiaacutetica ou africana
pois eacute nestes continentes que aquele alelo eacute mais comum (BRAEND 1971)
66
Resultados e Discussatildeo
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Resultados e Discussatildeo
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Resultados e Discussatildeo
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69
Resultados e Discussatildeo
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A distribuiccedilatildeo dos fenoacutetipos observados para o locus GC apresenta-se na tabela 3315
A sua anaacutelise permite verificar a existecircncia de diferenccedilas entre os valores observados e
esperados para raccedila Barrosatilde (populaccedilatildeo inscrita no Livro Genealoacutegico) Este desvio ao
equiliacutebrio de Hardy-Weinberg deve-se agrave existecircncia de um excesso de homozigoacuteticos
sugerindo assim a ocorrecircncia de uma possiacutevel subestruturaccedilatildeo na populaccedilatildeo
Nas restantes amostras estudadas natildeo foi possiacutevel aplicar o teste de Contudo a
diferenccedila entre valores observados e esperados de acordo com o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg
eacute praticamente inexistente na populaccedilatildeo Barrosatilde natildeo inscrita e pouco acentuada na raccedila
Minhota
Tabela 3315 Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica de GC em populaccedilotildees das raccedilas Barrosatilde e Minhota Entre parecircntesis indicam-se os valores esperados de acordo com o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg
Fenoacutetipos N GCS GCFS GCF
Barrosatilde inscrita 142 98 35 8
(945) (419) (45)
Barrosatilde natildeo inscrita 153 109 40 4
(1087) (406) (37)
Minhota 62 54 5 3
(514) (101) (04)
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3913 1 0048
A distribuiccedilatildeo das frequecircncias geacutenicas apresentada na tabela 3316 mostra que GCS eacute
o alelo mais comum nas raccedilas europeias (com excepccedilatildeo da raccedila Frisia da Sueacutecia) As raccedilas
estudadas neste trabalho tecircm frequecircncias aleacutelicas para este locus que as aproximam das raccedilas
espanholas
70
Resultados e Discussatildeo
Tabela 3316 Frequecircncias geacutenicas de GC em vaacuterias populaccedilotildees de raccedilas bovinas
Frequecircncias geacutenicas
N GCF(ouA) GCS(ouB) GCC Referecircncia
Portugal
Barrosatilde inscrita
Barrosatilde natildeo inscrita
Minhota
Alentejana
Mirandesa
Espanha
De Lidia
Frisona
Beacutelgica
Branca e azul
Flemish vermelha
Campine vermelha e branca
Preta e branca
Flemish branca e vermelha
Sueacutecia
Vermelha e Branca
Frisia
141 018 plusmn0023
153 016 plusmn002
62 009 plusmn 003
028 plusmn 004
97 020 plusmn 003
1306 008 plusmn001
124 015 plusmn002
2323 031 plusmn001
431 016 plusmn001
299 012 plusmn001
299 019 plusmn002
140 006 plusmn 001
1030 039 plusmn001
273 079 plusmn 002
082 plusmn 002
084 plusmn 002
091 plusmn003
072 plusmn 004
080 plusmn 003
092 plusmn 001
085 plusmn 002
069 plusmn 001
084 plusmn 001
088 plusmn 001
081 plusmn002
065 plusmn 003
061 plusmn001
021 plusmn002
029 plusmn 003
Este trabalho
CUNHA (1994)
NOBRE (S data)
PIEDRAFUA et ai (1984)
VAN de WEGHE et ai (1982)
GAHNE(1963)
in PIEDRAFUA et ai (1984)
71
Resultados e Discussatildeo
34 - ANAacuteLISE POPULACIONAL CONJUNTA
341 - Diversidade geneacutetica na raccedila Barrosatilde
As estimativas da variabilidade geneacutetica das populaccedilotildees de bovinos das raccedilas Barrosatilde e
Minhota efectuaram-se considerando apenas 6 loci polimoacuterficos HB CAII MPI ALB TF e
GC
Tabela 341 Estimativa da variabilidade geneacutetica (6 loci) atraveacutes dos valores de heterozigotia observada (Ho) e esperada (He) nas populaccedilotildees estudadas
Barrosatilde inscrita Barrosatilde natildeo inscrita Minhota Locus
Ho He Ho He Ho He
HB 0000 0000 0000 0000 0097 0093
CAH 0411 0441 0464 0464 0210 0262
MPI 0043 0056 0026 0039 0082 0080
ALB 0035 0035 0046 0058 0048 0048
TF 0603 0590 0556 0595 0694 0638
GC 0248 0297 0261 0265 0081 0163
Os resultados expressos na tabela 341 mostram em geral a ausecircncia de diferenccedilas
significativas entre os valores de heterozigotia observada (Ho) e heterozigotia esperada (He)
para os loci estudados Deve contudo notar-se que na raccedila Minhota e quanto ao locus GC o
valor de He eacute aproximadamente o dobro da Ho Nos restantes loci o ligeiro desvio observado
entre Ho e He sugere em geral um deacutefice de heterozigoacuteticos
Nas duas populaccedilotildees de raccedila Barrosatilde os sistemas TF e CAII satildeo os que apresentam
valores de heterozigotia mais elevados Pelo contraacuterio os loci MPI e ALB mostram valores de
heterozigotia baixos possivelmente devido ao excesso de homozigoacuteticos (MPI B e ALB A)
detectados nas trecircs populaccedilotildees
Na tabela 342 apresentam-se os valores do nuacutemero meacutedio de alelos por locus (ria)
percentagem de loci polimoacuterficos (P) heterozigotia meacutedia observada (Ho) e heterozigotia
esperada (He) nas populaccedilotildees de bovinos estudados Estes valores devem ser interpretados
72
Resultados e Discussatildeo
tendo em conta o facto de os 6 loci investigados serem polimoacuterficos em pelo menos uma
populaccedilatildeo
Tabela 342 Variabilidade geneacutetica detectada em trecircs populaccedilotildees de bovinos atraveacutes da anaacutelise de 6 loci polimoacuterficos N - efectivo meacutedio estudado por locus na - nuacutemero meacutedio de alelos por locus P - proporccedilatildeo de loci polimoacuterficos Ho - heterozigotia observada He - heterozigotia meacutedia esperada Entre parecircntesis indicam-se os valores do desvio padratildeo
Raccedila Populaccedilatildeo N na P Ho He
Barrosatilde inscrita 1407 233 833 0223 0237
(06) (042) (0100) (0100)
Barrosatilde natildeo inscrita 1528 233 833 0226 0237
(02) (042) (0098) (0101)
Minhota 618 233 1000 0202 0214
(02) (021) (0101) (0090)
A sua anaacutelise permite verificar em primeiro lugar a ocorrecircncia de uma grande
semelhanccedila entre os valores de H nas duas raccedilas estudadas Barrosatilde e Minhota revelando a
existecircncia de uma variabilidade geneacutetica idecircntica nas trecircs populaccedilotildees de bovinos Observa-se
tambeacutem que os valores de heterozigotia meacutedia observada (Ho) natildeo diferem significativamente
dos valores de heterozigotia esperados (He) nas trecircs populaccedilotildees sendo o valor mais elevado o
encontrado na populaccedilatildeo de raccedila Barrosatilde (237)
Os elevados valores de P (833 na raccedila Barrosatilde e 100 na raccedila Minhota) resultam
do facto de apenas se terem utilizado loci polimoacuterficos nesta anaacutelise e o nuacutemero meacutedio de
alelos por locus (na) eacute igual nas trecircs populaccedilotildees estudadas (233)
A tabela 343 apresenta estimativas de FB Frr e FST para as trecircs populaccedilotildees de
bovinos Os valores de Fis indicam a existecircncia de uma acentuada deficiecircncia de
heterozigoacuteticos nos loci MPI e GC Nos restantes loci verifica-se por um lado a tendecircncia
para um excesso de heterozigoacuteticos nos loci HB e TF (com valores de -0051 e -0021
respectivamente) e por outro lado para uma ligeira deficiecircncia de heterozigoacuteticos nos loci
CAII e ALB (com valores de 0066 e 0072 respectivamente) A meacutedia ponderada de FiS
mostra uma deficiecircncia de heterozigoacuteticos de 48
73
Resultados e Discussatildeo
Tabela 343 Distribuiccedilatildeo relativa da diversidade geneacutetica nas trecircs populaccedilotildees de bovinos Hs-heterozigotia intrapopulacional HT-heterozigotia total Valores das estatiacutesticas F para 6 loci analisados
Locus H s Hx Fis FIT FST
HB 0030 0031 -0051 -0016 0033
CAII 0387 0404 0066 0104 0041
MPI 0058 0059 0130 0133 0004
ALB 0046 0047 0072 0075 0004
TF 0605 0627 -0021 0015 0036
GC 0241 0244 0183 0193 0012
Meacutedia 0228 0235 0048 0078 0031
As estimativas de FST indicam a existecircncia de um baixo grau de diferenciaccedilatildeo
populacional nos bovinos estudados Os valores de FST para os 6 loci analisados podem
considerar-se baixos (entre 0004 e 0041) apresentando uma meacutedia ponderada de 0031
Assim soacute uma pequena parte da diversidade geneacutetica (31) se deve a diferenccedilas entre as
populaccedilotildees sendo muito maior a diversidade dentro de cada populaccedilatildeo do que entre as
populaccedilotildees
Os baixos valores de FST encontrados para os loci MPI e ALB resultam de frequecircncias
elevadas de MPIB e ALBA respectivamente e traduzem uma grande homogeneidade entre
as raccedilas bovinas estudadas natildeo se detectando subestruturaccedilatildeo populacional
342 - Comparaccedilatildeo com outras raccedilas ibeacutericas
Tendo em conta o pequeno nuacutemero de loci comuns a este e a outros estudos
estimaram-se diferentes valores de heterozigotia meacutedia consoante o nuacutemero de loci de que se
dispunha Na tabela 344 e 345 apresentam-se valores de heterozigotia meacutedia para as
diferentes raccedilas obtidos a partir de quatro (FF) e cinco loci (FF+) respectivamente bem como
os valores de na P e os respectivos desvios padratildeo em vaacuterias raccedilas de bovinos ibeacutericos
A diversidade geneacutetica do bovino Barrosatilde avaliada pela taxa meacutedia de heterozigotia
(0281-0272 e 0249-0260 para 5 e 4 loci respectivamente) parece ocupar uma posiccedilatildeo
74
Resultados e Discussatildeo
intermeacutedia no seio das raccedilas ibeacutericas Tambeacutem o grau de variabilidade geneacutetica nos bovinos
avaliado por paracircmetros como o nuacutemero meacutedio de alelos por locus e a proporccedilatildeo de loci
polimoacuterficos (P) demonstra que as raccedilas estudadas neste trabalho ocupam uma posiccedilatildeo
intermeacutedia quando comparadas com outras raccedilas ibeacutericas
A anaacutelise das tabelas 344 e 345 mostra que todas as medidas de diversidade geneacutetica
(H P e de na) apresentam valores idecircnticos Esta semelhanccedila permite supor que o processo de
domesticaccedilatildeo iniciado haacute menos de 10000 anos natildeo levou a uma grande diferenciaccedilatildeo
geneacutetica entre as raccedilas pelo menos relativamente aos marcadores geneacuteticos estudados neste
trabalho Desta forma verifica-se que as principais diferenccedilas entre as raccedilas resultam de
pequenas alteraccedilotildees das suas frequecircncias geacutenicas provavelmente causadas pelo baixo nuacutemero
de animais destinados agrave reproduccedilatildeo (mais marcado nos machos) e pelos cruzamentos dirigidos
em cada raccedila
Por outro lado este baixo niacutevel de diferenciaccedilatildeo geneacutetica deveraacute estar tambeacutem
associado ao facto de na origem das raccedilas bovinas ibeacutericas se encontrar um uacutenico processo de
domesticaccedilatildeo seguido provavelmente de um processo de expansatildeo populacional bastante
recente do Proacuteximo Oriente ateacute agrave Europa Adicionalmente estima-se que a diferenciaccedilatildeo dos
bovinos em raccedilas autoacutectones soacute teraacute ocorrido nos uacuteltimos 300 anos (LOFTUS et ai 1994)
Neste contexto os eventuais estrangulamentos do efectivo populacional (bottleneck)
e efeitos de fundador ocorridos durante o periacuteodo inicial da domesticaccedilatildeo do gado bovino e
capazes de afectar de forma muito diferente vaacuterios nuacutecleos populacionais natildeo satildeo detectados
na Peniacutensula Ibeacuterica
75
Resultados e Discussatildeo
Tabela 344 Variabilidade geneacutetica em vaacuterias raccedilas de bovinos atraveacutes da anaacutelise de 4 loci polimoacuterficos N - efectivo meacutedio estudado por locus ria - nuacutemero meacutedio de alelos por locus P-- proporccedilatildeo de loci polimoacuterficos yent - heterozigotia meacutedia esperada Entre parecircntesis indicam-se os valores do desvio padratildeo
Raccedila Populaccedilatildeo N nbdquo P H +
Portugal
Barrosatilde inscrita 1410(00) 23 (05) 750 0249 (0135)
Barrosatilde natildeo inscrita 1530 (00) 23 (05) 755 0260(0135)
Minhota 620 (00) 20 (00) 1000 0216 (0094)
Mertolenga 1470 (00) 23 (03) 1000 0315 (0097)
Alentejana 1550(00) 23 (03) 1000 0239 (0123)
Mirandesa 1065 (03) 20 (00) 1000 0159(0110)
Espanha
Cachena 710 (00) 23 (03) 1000 0279(0111)
Caldelana 600 (00) 20 (00) 1000 0166 (0107)
Frieiresa 330 (00) 18(03) 750 0177(0112)
Limiana 390 (00) 20 (00) 1000 0246 (0087)
Rubia Gallega 1845(95) 25 (05) 1000 0215(0110)
Vianesa 400 (00) 20 (00) 1000 0221 (0087)
Sayaguesa 1470 (00) 23 (03) 1000 0320 (0094)
Morucha 1010(00) 23 (03) 1000 0361 (0084)
Alistaria Sanabresa 1570 (00) 23 (03) 1000 0213 (0104)
Blanca Cacerefia 618 (03) 20 (00) 1000 0377 (0078)
Caacuterdena Andaluza 250 (00) 15(03) 500 0131 (0106)
Asturiana de los Vallegraves 1265 (05) 23 (03) 1000 0237(0107)
Asturiana de la Montana 1060 (00) 23 (03) 1000 0280 (0088)
Tudanca 420 (00) 20 (04) 750 0321 (0109)
Morena del N O 250 (00) 18 (03) 750 0203 (0108)
Frisona 6540 (00) 18 (05) 500 0203 (0130)
De Lidia 1240 (00) 23 (03) 1000 0367(0135)
Retinta 1640 (00) 23 (03) 1000 0338 (0107)
76
Resultados e Discussatildeo
Tabela 345 Variabilidade geneacutetica em vaacuterias raccedilas de bovinos atraveacutes da anaacutelise de 5 loci polimoacuterficos N - efectivo meacutedio estudado por locus na - nuacutemero meacutedio de alelos por locus P--proporccedilatildeo de loci polimoacuterficos H^ - heterozigotia meacutedia esperada Entre parecircntesis indicam-se os valores do desvio padratildeo
Raccedila Populaccedilatildeo N na P i r Portugal
Barrosatilde inscrita 1410 (00) 22 (04) 800 0281 (0109)
Barrosatilde natildeo inscrita 1530(00) 22 (04) 800 0272 (0105)
Minhota 620 (00) 20 (00) 1000 0229 (0074)
Espanha Cachena 710 (00) 22 (02) 1000 0289 (0087)
Caldelana 600 (00) 20 (00) 1000 0180 (0084)
Frieiresa 330 (00) 18 (02) 800 0180 (0087)
Limiana 390 (00) 20 (00) 1000 0226(0071)
Rubia Gallega 1812(81) 24 (04) 1000 0223 (0086)
Vianesa 400 (00) 20 (00) 1000 0374 (0168)
Sayaguesa 1470 (00) 22 (02) 1000 0305 (0074)
Morucha 1010 (00) 22 (02) 1000 0353 (0066)
Alistaria Sanabresa 1570 (00) 22 (02) 1000 0174 (0089)
Blanca Cacerefla 616 (02) 20(00) 1000 0402 (0065)
Caacuterdena Andaluza 250 (00) 16(02) 600 0120 (0083)
Asturiana de los Vallegraves 1266 (04) 22 (02) 1000 0270 (0089)
Asturiana de la Montaria 1060(00) 22 (02) 1000 0301 (0072)
343 - Diferenciaccedilatildeo geneacutetica
Nas tabelas 346 e 347 apresentam-se as distacircncias geneacuteticas de Nei (NEI 1978)
calculadas para 23 (4 loci HB CAII ALB e TF) e 15 (5 loci HB CAII ALB TF e NP)
raccedilas bovinas ibeacutericas respectivamente Da sua anaacutelise ressalta o facto de aqueles valores
serem na sua maioria bastante baixos
De entre as raccedilas bovinas ibeacutericas estudadas a Frisona e a Cachena demonstram estar
mais proacuteximas da raccedila Barrosatilde com valores de DNei de 0092 (4 loci) e de 0104 (5 loci)
respectivamente Por outro lado as raccedilas Asturiana de la Montana e Vianesa aparecem como
as mais diferenciadas DNei= 0334 (4 loci ) e Dgtjei= 0330 (5 loci) respectivamente
77
Resultados e Discussatildeo
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Resultados e Discussatildeo
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79
Resultados e Discussatildeo
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80
Resultados e Discussatildeo
No que se refere agrave raccedila Minhota verifica-se que a Frieiresa eacute a que estaacute mais proacutexima
(valores de 0077 e 0074 para 4 e 5 loci respectivamente) e que mais um vez eacute a Asturiana de
la Montana a mais diferenciada das raccedilas (valores de 0389 e 0349 para 4 e 5 loci respectivamente)
A diferenciaccedilatildeo geneacutetica entre as raccedilas bovinas ibeacutericas encontra-se representada nos
dendrogramas construiacutedos pelos meacutetodos de agrupamento NJ (Neighbor-joining SATTOU amp
NEI 1987) e UPGMA (Unweightedpair-group arithmetic average SNEATH amp SOKAL 1973)
(figuras 341 342 343 e 344) Foram realizados testes de reamostragem do tipo
bootstrap (100 reacuteplicas) para a anaacutelise da consistecircncia dos padrotildees de ramificaccedilatildeo
apresentando-se os seus valores entre parecircntesis
A anaacutelise conjunta dos quatro dendrogramas permite verificar uma falta de consistecircncia
nos vaacuterios padrotildees de ramificaccedilatildeo para as raccedilas bovinas ibeacutericas associada a valores de
bootstrap em geral muito reduzidos De facto observa-se que o padratildeo de ramificaccedilatildeo dos
dendrogramas se altera consoante o meacutetodo de agrupamento usado e o nuacutemero de loci considerados Estas alteraccedilotildees nos agrupamentos das diferentes raccedilas devem-se
provavelmente agrave instabilidade causada pelo reduzido nuacutemero de loci polimoacuterficos utilizados
neste estudo bem como ao facto de as frequecircncias geacutenicas serem muito semelhantes em todas
as populaccedilotildees estudadas
Deve contudo referir-se que a raccedila Barrosatilde aparece normalmente associada a vaacuterias
raccedilas do norte da Peniacutensula Ibeacuterica nomeadamente a Cachena (Galiza) a Asturiana de la
Montana (Astuacuterias) a Sayaquesa e a Morucha (Salamanca)
No que se refere agrave raccedila Minhota esta aparece vaacuterias vezes associada agraves raccedilas Rubia
Gallega Frisona Asturiana de los Vallegraves e Frieiresa
81
Resultados e Discussatildeo
(18)
(14)
(11)
(5)
(3)
Sayaquesa
(39)
[32)
(21)1-
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(49)
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(3)
(18)
(8)
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19)
(16T
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(99) Asturiana de la Montana
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Minhota -Asturiana de los Vallegraves Rubia Gallega
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(65)
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Mirandesa Caacuterdena Andaluza Morena NO
Caldelana Alistano Sanabresa
Figura 341 Dendrograma construiacutedo com base nas distacircncias geneacuteticas de NEI (1978) entre 23 raccedilas de bovinos (4 loci HBCAII ALB e TF) atraveacutes do meacutetodo de agrupamento NJ Os valores de probabilidade de ocorrecircncia de cada agrupamento obtidos atraveacutes de um teste de bootstrap indicam-se entre parecircntesis
82
Resultados e Discussatildeo
Morucha
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Rubia Gallega Asturiana de los Vallegraves Freiresa
Frisona Minhota Alentejana Mertolenga
(43) ( 2 8 gt - ^ C a W e l a l
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Caacuterdena Andaluza Vianesa
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De Lidia Tudanca
Asturiana de la Montana Morena NO Blanca Cacerena
Figura 342 Dendrograma construiacutedo com base nas distacircncias geneacuteticas de NEI (1978) entre 23 raccedilas de bovinos (4 loci HB CAII ALB e TF) atraveacutes do meacutetodo de agrupamento UPGMA Os valores de probabilidade de ocorrecircncia de cada agrupamento obtidos atraveacutes de um teste de bootstrap indicam-se entre parecircntesis
83
Resultados e Discussatildeo
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Figura 343 Dendrograma construiacutedo com base nas distacircncias geneacuteticas de NEI (1978) entre 15 raccedilas de bovinos (5 loci HB CAII ALB TF e NP) atraveacutes do meacutetodo de agrupamento NJ Os valores de probabilidade de ocorrecircncia de cada agrupamento obtidos atraveacutes de um teste de bootstrap indicam-se entre parecircntesis
(21)
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Alistano Sanabresa
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Frieiresa
Minhota Cachena Morucha
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Asturiana de la Montana
Figura 344 Dendrograma construiacutedo com base nas distacircncias geneacuteticas de NEI (1978) entre 15 raccedilas de bovinos (5 loci HB CAII ALB TF e NP) atraveacutes do meacutetodo de agrupamento UPGMA Os valores de probabilidade de ocorrecircncia de cada agrupamento obtidos atraveacutes de um teste de bootstrap indicam-se entre parecircntesis
84
Resultados e Discussatildeo
No seu conjunto estes resultados natildeo satildeo suficientes para o estabelecimento de uma
histoacuteria evolutiva das actuais raccedilas bovinas ibeacutericas nem para a separaccedilatildeo da raccedila Barrosatilde das
restantes Consequentemente natildeo eacute possiacutevel neste momento fazer corresponder a anaacutelise da
diversidade e estrutura geneacutetica das populaccedilotildees ibeacutericas de gado bovino com alguma das
hipoacuteteses evolutivas propostas por diversos autores com base em evidecircncia morfoloacutegica
(VALLEJO 1978 IGLESIAS 1989 CORDEIRO 1986 JORGE 1996)
De acordo com essa evidecircncia a raccedila Barrosatilde (e tambeacutem a Cachena) derivaria do
denominado tronco mauritaacutenico (Bos primigenius opisthonomus) ou seja de populaccedilotildees
originaacuterias do Norte de Aacutefrica que teriam passado para o sul da Peniacutensula Ibeacuterica alcanccedilando
mais tarde o Norte de Portugal e de Espanha Por outro lado a filiaccedilatildeo da raccedila Minhota
segundo JORGE (1996) deriva do tronco aquitacircnico (Bos primigenius primigenius) tal como a
maior parte das raccedilas da Galiza das Astuacuterias e dos Pirineacuteus
Embora os resultados apresentados neste trabalho pareccedilam de facto indicar que as
raccedilas Barrosatilde e Minhota derivam de troncos diferentes eacute necessaacuterio aprofundar de forma
muito consideraacutevel a investigaccedilatildeo sobre a estrutura geneacutetica das raccedilas bovinas ibeacutericas antes de
se poder formular conclusotildees mais sustentadas
85
Con8ideraccedil8es Finais
4 - CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
O trabalho desenvolvido nesta dissertaccedilatildeo permitiu o estudo de alguns sistemas
geneacuteticos polimoacuterficos jaacute descritos em bovinos (HB CAII NP MPI ALB TF e GC) nas
raccedilas Barrosatilde e Minhota Permitiu ainda a aplicaccedilatildeo de teacutecnicas de separaccedilatildeo electroforeacuteticas
mais eficazes em alguns desses sistemas
Vaacuterias limitaccedilotildees durante a execuccedilatildeo praacutetica deste trabalho obrigaram de alguma
forma a alteraccedilotildees no programa inicial Entre elas devem referir-se
1 a recolha de amostras de sangue mostrou-se difiacutecil e demorada sendo necessaacuteria a
coordenaccedilatildeo de esforccedilos de vaacuterias entidades (Direcccedilatildeo Regional de Agricultura de
Entre Douro e Minho e brigadas de Sanidade Animal locais) de veterinaacuterios e de
criadores de bovinos retirando tempo agrave execuccedilatildeo praacutetica do trabalho
2 a afinaccedilatildeo de vaacuterias teacutecnicas electroforeacuteticas para certos marcadores geneacuteticos
envolveu um consideraacutevel esforccedilo de investigaccedilatildeo
3 a impossibilidade de apurar atempadamente as teacutecnicas de separaccedilatildeo ou de
visualizaccedilatildeo para a amilase a ceruloplasmina e a poacutes-transferrina
4 a escassa bibliografia sobre o bovino Barrosatilde e sobre as teacutecnicas utilizadas neste
trabalho em gado bovino
Apesar das limitaccedilotildees considera-se que este trabalho se reveste de alguma importacircncia
pelo facto de constituir um contributo para a caracterizaccedilatildeo geneacutetica de uma raccedila bovina muito
peculiar A este respeito entendeu-se que numa primeira fase se procederia ao estudo de um
conjunto de proteiacutenas polimoacuterficas de forma a poder iniciar uma comparaccedilatildeo com outras raccedilas
bovinas nomeadamente ibeacutericas para as quais jaacute existem resultados publicados Por outro
86
Consideraccedilotildees Finais
lado o estabelecimento de um conjunto de teacutecnicas de fenotipagem dos loci considerados
permite desde logo a sua aplicaccedilatildeo em questotildees de identificaccedilatildeo individual e de anaacutelise da
paternidade
Eacute contudo evidente que o aprofundamento deste trabalho deveraacute necessariamente
evoluir na direcccedilatildeo da anaacutelise molecular da variaccedilatildeo geneacutetica Adicionalmente seraacute do maior
interesse alargar o domiacutenio de investigaccedilatildeo agraves restantes raccedilas bovinas autoacutectones
Em face do exposto entende-se ser possiacutevel definir trecircs linhas de investigaccedilatildeo para os
proacuteximos anos
1 - ampliaccedilatildeo da bateria de sistemas geneacuteticos polimoacuterficos detectados em proteiacutenas do
sangue e do leite
2 - anaacutelise da variabilidade geneacutetica de um conjunto de microssateacutelites se possiacutevel
associados a algumas das proteiacutenas polimoacuterficas jaacute descritas
3 - estudo do polimorfismo da moleacutecula de DNA-mitocondrial
De uma forma geral pode assim considerar-se que os principais objectivos definidos
no iniacutecio deste trabalho foram alcanccedilados pelo que se apresentam em seguida as conclusotildees
87
Conclusotildees
5 - CONCLUSOtildeES
A utilizaccedilatildeo de um sistema de focagem isoeleacutectrica permitiu detectar a existecircncia de
polimorfismo geneacutetico na hemoglobina distinguindo-se dois produtos geacutenicos na raccedila bovina
Minhota HBA e HBB Na raccedila Barrosatilde HBA foi o uacutenico produto geacutenico encontrado
A utilizaccedilatildeo de um sistema de focagem isoeleacutectrica permitiu a detecccedilatildeo de dois
produtos geacutenicos no locus CAII (CAIPF e CAIPS) e revelou-se mais eficaz de que as
teacutecnicas de separaccedilatildeo convencional em gel de amido
A investigaccedilatildeo realizada permitiu detectar a ocorrecircncia de polimorfismo geneacutetico de
MPI atraveacutes de um sistema electroforeacutetico em gel de amido tendo-se detectado trecircs produtos
geacutenicos (MPIA MPIB e MPIC) A fraca actividade de MPI e a grande dificuldade na
obtenccedilatildeo de um contraste de bandas adequado poderaacute dever-se ao facto de a sua expressatildeo soacute
ocorrer na fracccedilatildeo leucocitaacuteria do sangue
A aplicaccedilatildeo de um sistema de focagem isoeleacutectrica na presenccedila de ureia (8M) revelou-
-se muito eficaz na separaccedilatildeo de ALB e permitiu detectar pela primeira vez um novo variante
ALBV ligeiramente mais aciacutedico do que ALBA
A combinaccedilatildeo de uma teacutecnica de focagem isoeleacutectrica com um preacutevio tratamento das
amostras a fim de saturar a moleacutecula de TF com Fe permitiu a detecccedilatildeo de quatro produtos
geacutenicos (TF A TFD1 TFD2 e TFE) nas raccedilas estudadas
88
Conclusotildees
A combinaccedilatildeo de uma teacutecnica de focagem isoeleacutectrica com a detecccedilatildeo por
immunoblotting permitiu detectar dois produtos geacutenicos no locus GC (GCA e GCB) O
tratamento de amostras com neuraminidase permitiu a obtenccedilatildeo de padrotildees mais simples do
que os conseguidos com amostras nativas Esta simplificaccedilatildeo resulta da provaacutevel remoccedilatildeo de
aacutecidos siaacutelicos ligados agrave moleacutecula de GC
Natildeo se detectou nenhum caso de exclusatildeo na anaacutelise de segregaccedilatildeo de 27 pares
matildeefilho feita separadamente para cada locus
Verifiacutecou-se a presenccedila de dois alelos raros HBB e PEPB1 na raccedila Minhota Estes
alelos poderatildeo ser utilizados na distinccedilatildeo das duas raccedilas estudadas
Foi encontrado um valor de heterozigotia meacutedia de 0237 em populaccedilotildees de raccedila
Barrosatilde indicativo de uma variabilidade geneacutetica intermeacutedia em relaccedilatildeo agrave generalidade das
raccedilas ibeacutericas As diferenccedilas observadas entre as vaacuterias raccedilas ibeacutericas poderatildeo reflectir
fenoacutemenos histoacuterico-evolutivos muito recentes dada a sua proximidade e grande semelhanccedila
Foi observado um reduzido niacutevel de diferenciaccedilatildeo entre as raccedilas Barrosatilde e Minhota
(FST= 0031) demonstrando-se que a maior parte da diversidade geneacutetica se atribui a diferenccedilas
intrapopulacionais Este valor de FST pode considerar-se baixo quando comparado com o
obtido no estudo de outras espeacutecies animais sugerindo um elevado fluxo geacutenico
interpopulacional Por outro lado reflecte ainda uma histoacuteria demograacutefica muito recente
A utilizaccedilatildeo de meacutetodos de agrupamento NJ e UPGMA obtidos a partir de matrizes de
distacircncias geneacuteticas de Nei natildeo permitiu separar a raccedila Barrosatilde das restantes raccedilas ibeacutericas
89
Referecircncias Bibliograacuteficas
6 - REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
AMORIM A (1983) Contribuiccedilatildeo para o conhecimento da Geneacutetica Humana Estudo de Geneacutetica Bioquiacutemica
Formal e Populacional e de Ligaccedilatildeo Factorial Tese de Doutoramento Faculdade de Ciecircncias do
Porto
AMORIM A KOMPF J SCHUNTER F amp RITTER H (1982) Aminolevulinate dehydratase (EC42124)
Linkage analysis Hum Genet 61 48-49
ANSAY M (1973) Techniques microelectrophoretiques dans lanalyse de la multipliciteacute enzymatique chez les
bovins Deacutetection Eacutelectrophoreacutetique des Polymorphismes Biochimiques Chez les Mammifegraveres
Application a LEacutetude Geacuteneacutetique des Populations Centre National de la Recherche Scientifique
Paris 43-58
ARANA A pound amp ZARAGOZA P (1986) Nueva electroforetica dei enzima NADH-Diafrosa (DIA-2) detectada
en la espeacutecie Oryctolagus cuniculus (L) Zootecnia XXXV ndeg 7-12 125-130
ARAUacuteJO J (1986) Contribuiccedilatildeo para o estudo dos bovinos de raccedila Barrosatilde Relatoacuterio de estaacutegio da
licenciatura em Engenharia Zooteacutecnica Universidade dos Accedilores
ARNOLD I C J amp Bouw J (1989) A new allele of glucose phosphate isomerase in dogs Animal Genetics
20 217-220
ARRANZ J J BAYON Y amp SAN PRIMITIVO F (1992) Biochemical polymorphisms in Spanish Avilena-
-Negra Ibeacuterica cattle Animal Genetics 23 (suppl 1) 19
ARRANZ J J BAYON Y amp SAN PRIMITIVO F (1996) Comparison of protein markers and microsatellites in
differentiation of cattle populations Animal Genetics 27 415-419
ASHTON G C (1965) Cattle serum transferrins A balanced polymorphism Genetics 52 983-997
90
Referecircncias Bibliograacuteficas
BAINES J amp MEacuteLEK J (1980) Egipto - Deuses Templos e Faraoacutes Grandes Culturas e Civilizaccedilotildees Ciacuterculo
de Leitores
BELL K ARTHUR H amp ANDERSON I L (1994) Esterase and albumin polymorphism in the domestic cat
(Felis catus) XXIV International Conference on Animal Genetics Praga Julho 1994
BEKENEV V A amp ORLOVA G V (1991) Polymorphism of erytrocytic enzymes in Large White pig breeds in
Siberia Animal Genetics 22 (suppl 1) 23-24
BOWLING A T amp CLARK R S (1988) Excess of heacuteteacuterozygotes at albumin locus in American Standardbred
horses Animal Genetics 19 331-341
BOWLING A T GORDON L PENEDO M C T WICTUM E amp BEEBOUT J (1990) A single gel for
determining genetic of equine erythrocyte carbonic anhydrase (CA) and catalase (Cat) Animal
Genetics 21 191-197
BRADLEY D G MACHUGH D E CUNNINGHAM P amp LOFTUS R T (1996) Mitochondrial diversity and
the origins of African and European cattle Proceeding of the National Academy of Sciences of USA
93 5131-5135
BRAEND M (1971) Studies on the relationships between cattle breeds in Africa Asia and Europe Evidence
obtained by studies of blood groups and protein polymorphisms World Review of Animal Production
VIO (1) 10-14
BRAEND M (1988) Haemoglobin polymorphism in Norwegian Red Cattle Animal Genetics 19 59-62
BRAEND M NESSE 1 L amp EFREMOV G D (1988) Expression and genetics of caprine haemoglobins
Animal Genetics 18 223-231
BROWN L B KANE H amp AYRES H (1993) Vital signs WW Norton e Co pp 323 New York
CARTER D C HE X M MUNSON S EL TWIGG P D GERNERT K M BROOM M B amp MILLER T
Y (1989) Three dimensional structure of human serum albumin Science 244 1195-1198
CECCHINI G amp Nus M D (1986) Literature review on cattle blood polymorphisms and preliminary results
of analysis in East African Zebu in Ethiopia Agric Subtrop and Ttropicale 3 (80) 433-463
91
Referocircicias Bibliograacuteficas
CiacuteZovAacute D STRATIL A MULLER E amp CEPICA S (1993) A new partially deficient transferrin variant in
the pig Animal Genetics 24 305-306
CLARKE S W TUCKER E M amp OSTERHOFF D R (1989) Blood groups and biochemical polymorphism
in the Namaqua sheep breed Animal Genetics 20 279-286
CLUTTON-BROCK J (1992) Domestication of animals In Jomes S Martin R Pilbeam D (eds) The
Cambridge Encyclopedia of Human Evolution pp 380-385 Cambridge University Press
CORDEIRO J P (1986) As raccedilas bovinas em Portugal - Sua Origem O meacutedico veterinaacuterio I (1) 29-39
CRISTOFALO G Cozzi M C amp VALIATI P (1992) Identification of a new variant in the equine serum
alB-glycoprotein (A1B) system Animal Genetics 23 (suppl 1) 24
CUNHA L M (1994) Caracterizaccedilatildeo Morfo-Funcional e Geneacutetica da Raccedila Bovina Alentejana Trabalho de
fim de curso apresentado agrave Escola Superior Agraacuteria de Beja
DEL LAMA S N DEL LAMA M A MESTRINER M A amp MORTARI N (1992) Peptidase B polymorphism
in cattle erythrocytes Biochem Genet 30 247-255
DRATCH P TATE M KRAAY G J amp GERWING V (1992) Plasma proteins differentiating European red
deer and North American elk Animal Genetics 23 (suppl 1) 32
EGGEN A amp FRIES R (1995) An integrated cytogenetic and meiotic map of the bovine genome Animal
Genetics 26 215-236
ERHARDT G (1986) Transferrin variants in sheep separation and characterization by polyacrylamide gel
electrophoresis and isoelectric focusing Animal Genetics 17 343-352
ERHARDT G (1991) Genetic polymorphism of vitamin D binding protein and serum albumin in sheep
Animal Genetics 22 (suppl 1) 28-29
ERHARDT G amp SIMIANER H (1993) Linkage between the loci for serum albumin and vitamin D binding
protein (GC) in sheep Animal Genetics 24 301-303
EPSTEIN H amp MASON I L (1984) Cattle In Mason I L (ed) Evolution of domesticated animals pp 7-
-27 Longman
92
Referecircncias Bibliograacuteficas
FAO (1993) A diversidade da Natureza Um patrimoacutenio valioso Documento produzido pela FAO Divisatildeo de
informaccedilatildeo - Out de 1993 Veterinaacuteria Teacutecnica 10 10-12
FAO (1996) World Watch List for Domestic Animal Diversity 2a ediccedilatildeo FAOUNEP pp 334 Roma
FARNDALE B M HUBBARD D E amp ANDERSON L L (1992) A new PGD variant in New Zeland
Thoroughbred horses Animal Genetics 23 (suppl 1) 24
FELSENSTEIN J (1993) PHYLIP (Phylogeny Inference Package) Version 35 Distributed by the autor Seattle
University of Washington
FERNANDES M T S (1996) Raccedilas de bovinos autoacutectones Um importante recurso geneacutetico animal portuguecircs
a preservar e a defender Veterinaacuteria Teacutecnica 12 10-15
FERRAND N (1995) Variaccedilatildeo geneacutetica de proteiacutenas em populaccedilotildees de coelho (Oryctolagus cuniculus) -
- Anaacutelise da diferenciaccedilatildeo subespecifica subestruturaccedilatildeo expansatildeo geograacutefica e domesticaccedilatildeo
Dissertaccedilatildeo de Doutoramento em Biologia apresentada agrave Faculdade de Ciecircncias da Universidade do
Porto
FERRAND N amp ROCHA J (1991) Genetic polymorphism of serum albumin in wild rabbits populations
Animal Genetics 22 (suppl 1) 36
FORBES P MACKEITH B amp PEBERDY R (1986) Mamiacuteferos Ungulados e Lagomorfos Ciacuterculo de Leitores
FRIES R EGGEN A amp WOMACK J E (1993) The bovine genome map Mammalian Genome 4 405-428
GAHNE B(1963) Inherited variation in the post-albumin of cattle serum Hereditas 50126-135
GAHNE B JUNEJA R K amp GROLMUS J (1977) Horizontal polyacrylamine gel electrophoresis for the
simultaneous phenotyping of transferrin post-transferrin albumin and post-albumin in the blood
plasma of cattle Arum Bid Grps Biochem Genet 8127-137
GARCIA L S VICENTE M V BECERRA A L YEBRA F A RODRIcircGUES M F amp LOacutePEZ J M S
(1992) Razas Bovinas Autoacutectonas de Galicia - I Razas Morenas Galegas (Recursos Xeneacuteticos a
Conservar) Xunta de Galicia
GARCIA M ROSAacuteRIO J amp ANTUNES M (1981) Bovinos em Portugal Direcccedilatildeo dos Serviccedilos Veterinaacuterios -
- DGSV pp 44-78 Lisboa
93
Referecircncias Bibliograacuteficas
GLOWATZKI-MULLIS M L GAILLARD C WIGGER G amp FRIES R (1995) Microsatellite-based
parentage control in cattle Animal Genetics 26 7-12
GONCcedilALVES GARCIA M L (1964) A Raccedila Bovina Barrosatilde Boletim Pecuaacuterio n deg 1 Ano XXXII DGSP
pp 103-172 Lisboa
GONZALEZ P TUNON MJ amp VALLEJO M (1987) Genetic relationships between Spanish native breeds of
cattle Animal Genetics 18 249-256
HALL S B L COTHRAN E G amp KING J A (1991) Variability of manosephosphate isomerase (MPI)
from haemolysate in 14 horse breeds Animal Genetics 22 (suppl 1) 22
HARRIS H amp HOPKINSON D A (1976) Handbook of enzyme electrophoresis in human genetics North-
-Holland Publishers
HEMMER H (1990) Domestication The decline of environmental appreciation Cambridge University Press
HERZOG S (1988) Polymorphism and genetic control of erythrocyte 6-phosphogluconate dehydrogenase in
the genus Cervus Animal Genetics 19 291-294
HERZOG S (1989) Genetic polymorphism of transferrin in fallow deer Cervus dama L Animal Genetics 20
421-426
IGLESIAS A B (1989) Estrutura y relaciones geneacuteticas de razas bovinas mediante marcadores geneacuteticos
(Polimorfismos Bioquiacutemicos) Dissertaccedilatildeo de Doutoramento em Biologia apresentada agrave Faculdade de
Biologia da Universidade de Santiago
JAMIESON A (1965) The genetics of transferrins in cattle Heredity 20 419-441
JANZEN M K amp COTHRAN E G (1991) A new PGD variant from North American horses of feral origin
Animal Genetics 22 (suppl 1) 21-22
JORGE E S (1996) Bovinos da raccedila Minhota Contribuiccedilatildeo para a sua histoacuteria Veterinaacuteria Teacutecnica 10 10-
-18
94
Referecircncias Bibliograacuteficas
JUNEJA R K GAHNE B amp STRATIL A (1987) Polymorphic plasma postalbumins of some domestic
animals (pig Po2 horse XK and dog Pa proteins) identified as homologous Animal Genetics 18 119-
-124
JUNEJA R K KURYL J GAHNE B amp ZURKOWSKI M (1989) Linkage between the loci for transferrin
and ceruloplasmin in pigs Animal Genetics 20 307-311
KALAB P STRATIL A amp GLASNAacuteK V (1990) Genetic polymorphism of serum vitamin D-binding protein
(GC) in sheep and mouflon Animal Genetic 21 317-321
KAWAGUCHI T (1973) Polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of serum albumin into three
bands Clinica ChimicaActa 45 85-92
KIDD K K STONE W H CRIMELLA C CARENZI C CASATI M amp ROGNONI G (1980)
Immunogenetic and population genetic analyses of Iberian cattle Anim Blood Grps Biochem Genet
11 21-38
KRISTJANSSON F K (1963) Genetic control of two pre-albumins in pigs Genetics 48 1059-1063
KRISTJANSSON F K amp HICKMAN C G (1965) Subdivision of the allele TF D for transferrins in Holstein
and Ayrshire cattle Genetics 52 627-630
KUROSAWA Y amp TANAKA K (1988) Electrophoretic variants of serum transferrin in wild pig populations of
Japan Animal Genetics 19 31-35
LEAL C (1995) Apreciaccedilatildeo fenotiacutepica de um nuacutecleo de bovinos de raccedila Barrosatilde e amostragem para sua
caracterizaccedilatildeo geneacutetica Relatoacuterio de estaacutegio de licenciatura em Biologia - Ramo Cientiacutefico
Tecnoloacutegico em Ecologia e Recursos Zooloacutegicos Faculdade de Ciecircncias da Universidade do Porto
LITT M amp LUTTY J A (1989) A hipervariable microsatellite revealed by in vitro amplification of a
dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene American Jornal of Human Genetics 44
397-401
LOFTUS R T MACHUGH D E NGERE L O BALAIN D S BADI A M BRADLEY D G amp
CUNNINGHAM E P (1994a) Mitochondrial genetic variation in European African and Indian cattle
populations Animal Genetics 25 265-271
95
Referecircncias Bibliograacuteficas
LOFTUS R T MACHUGH B E BRADLEY B G SHARP P M amp CUNNINGHAM P (1994b) Evidence
for two independent domestications of cattle Proceeding of the National Academy of Sciences of USA
91 2757-2761
MACHUGH D E LOFTUS R T BRADLEY B G SHARP P M amp CUNNINGHAM P (1994)
Microsatellite DNA variation and among European cattle breeds Proceedings of the Royal Society of
London B 256 25-31
MACHUGH B E SHRIVER M B LOFTUS R T CUNNINGHAM P amp BRADLEY B G (1997)
Microsatellite DNA Variation and the Evolution Domestication and Phylogeography of taurine and
zebu cattle (Bos taunts and Bos indicus) Genetics 146 1071-1086
MARTINS R (1982) Conservaccedilatildeo e melhoramento dos bovinos de raccedila Barrosatilde Relatoacuterio de estaacutegio de
licenciatura em Produccedilatildeo Animal Instituto Universitaacuterio de Traacutes-os-Montes e Alto Douro
MIRANDA DO VALE J (1949) Gado Bissulco Livraria Saacute da Costa Lisboa
MORAIS M L (1992) Estudo Desenvolvimento e Optimizaccedilatildeo de Teacutecnicas de Separaccedilatildeo e Detecccedilatildeo
Especiacutefica de Proteiacutenas Dissertaccedilatildeo de Mestrado em Biologia Celular apresentada agrave Faculdade de
Ciecircncias da Universidade de Coimbra
NEI M (1978) Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small number of individuals
Genetics 89 583-590
NICHOLS E A CHAPMAN V M amp RUDDLE F H (1973) Polymorphism and linkage for
Mannosephosphate isomerase in Mus musculus Biochem Genet 8 47-53
NOBRE J M (s data) Caracterizaccedilatildeo geneacutetica da raccedila bovina Mirandesa Trabalho de fim de curso
efectuado na Estaccedilatildeo Nacional de Selecccedilatildeo e Reproduccedilatildeo Animal Curso de Engenharia Zooteacutecnica da
Universidade de Eacutevora
PENEDO M C T FOWLER M E BOWLING A T ANDERSON B L amp GORDON L (1988) Genetic
variation in the Wood of llamas Llama glama and alpaca Llama pacos Animal Genetics 19 267-
-276
PENEDO M C T amp JUNEJA R K (1989) Polymorphic plasma postalbumin (PO) of llamas and alpacas
identified as GC Protein Animal Genetics 20 221-223
96
Referecircncias Bibliograacuteficas
PENHALLOW R C MASON A B amp WOODWORTH R C (1991) Electrophoretic characterization of
human equine and bovine transferrins Comp Biochem Physiol 98B 41-45
PEREIRA A A (1997) Caracterizaccedilatildeo Geneacutetica de Algumas Subpopulaccedilotildees de Truta de Rio Salmo trutta L
da Bacia Hidrograacutefica do Rio Lima Dissertaccedilatildeo de Mestrado em Ecologia Aplicada apresentada agrave
Faculdade de Ciecircncias da Universidade do Porto
PIEDRAFITA J TEJEDOR M T amp ZARAGAZA L (1984) Post-Albuminas y Post-Transferrinas en
poblaciones bovinas Espafiolas Frisona y De Lidia Comunicacioacuten Presentada A La 34deg Reunion
Anual De La Federacioacuten Europea de Zootecnia 114-121
POVEY S CORNEY G LEWIS W H P ROBSON E B PARRINGTON J M amp HARRIS H (1972) The
genetics of peptidase C in man Ann Hum Genet 35 455-465
PRETSCH W amp MERKLE S (1990) Glucose Phosphate Isomerase Enzyme - Activity Mutants in Mus
musculus Genetical and Biochemical Characterization Biochemical Genetics 28 97-110
RASERO R D I STASIO L amp BERRA G P (1993) Polymorphism of erythocyte glucosephosphae isomerase
in sheep Animal Genetics 24 63-64
RITTER EL FRIEDRICHSON U amp SCHMITT J (1974) Genetic variation of Manose phosphate isomerase in
Man Humangenetik 22 261
RITTER H amp SCHMITT J (1973) Genetic polymorphism of Manose phosphate isomerase in Primates
Humangenetik 19 325-326
ROCHA J KOtildeMPF J FERRAND N AMORIM A amp RITTER H (1991) Separation of human alloalbumin
variants by isoelectric focusing Electrophoresis 12 313-314
ROGERSON J (1991) Biacuteblia- Os Caminhos de Deus Grandes Culturas e Civilizaccedilotildees Ciacuterculo de Leitores
RON M BAND M YANAI A amp WELLER J L (1994) Mapping quantitative trait loci with DNA
microsatellites in a commercial dairy cattle population Animal Genetics 25 259-264
RUSSEL G (1996) The analysis of genetic diversity in cattle to preserve future breeding options (Online)
Available http wwwribbsrcacukcdiv_wwwinformhtm (1996 November 29)
97
Referecircncias Bibliograacuteficas
SAITOU N amp NEI M (1987) The neighbor-joining method a new method for reconstructing phylogenetic
trees Mol Biol Evol 4 406-425
SANTOS O C M (1995) Caracterizaccedilatildeo Geneacutetica de Populaccedilotildees de Lebre Ibeacuterica (Lepus granatensis) e
Lebre Europeia (Lepus europaeus) - Aspectos Bioquiacutemicos e Populacionais Dissertaccedilatildeo de Mestrado
em Ecologia Aplicada apresentada agrave Faculdade de Ciecircncias da Universidade do Porto
SARAIVA J A (1993) Histoacuteria de Portugal Publicaccedilotildees Europa-Ameacuterica
SARTORE G STORMONT C MORRIS B G amp GRUNDER A A (1969) Multiple electrophoretic forms of
Carbonic Anhydrase in red cells of domestic cattle (Bos taurus) and American buffalo (Bison bison)
Genetics 61823-831
SCHNEIDER H SCHNEIDER M P C SILVA B T F amp SALZANO F M (1990) Transferrin and albumin
polymorphisms in buffaloes from Brazil Animal Genetics 21 335-337
SEATH P H A amp SOKAL R R (1973) Numeric Taxonomy W H Freeman amp Co
SELVARAJ O S MUKHERJEE T K DHALIWAL S S TAN S G amp BARKER J S F (1991) Biochemical
polymorphisms in the local goats of South-East Asia Animal Genetics 22 (suppl 1) 32
STERN C M MILLER S A amp SCHANFIELD M S (1992) Differentiation of wapiti and Eurasian red deer
by isoelectric focusing electrophoresis of GC on agarose gels Animal Genetics 23 (suppl 1) 23
STORMONT C amp SUZUKI Y (1963) Genetic control of albumin phenotypes in horses Proceeding of the
Society for Experimental Biology and Medicine 144 673-675
STRATIL A GLASNAacuteK V BOBAacuteK P CiacutezovAacute D GAacuteBRISOVAacute E amp KALAB P (1990) Variation of some
serum proteins in red deer Cervus elaphus L Animal Genetics 21 285-293
SWOFFORD D L amp SELANDER R B (1989) BIOSYS-1 A computer program for the analysis of allelic
variation in population genetics and biochemical systematics Release 17 Illinois Natural History
Survey
TASHIAN R E (1989) The carbonic anhydrases widening perspectives on their evolution expression and
function BioEssays 10 186-192
98
Referecircncias Bibliograacuteficas
TASHIAN R E amp CARTER N D (1976) Biochemical Genetics of Carbonic Anhydrase In Harris H (ed)
Advances in Human Genetics 7 1-56 Plenum
TATE M L amp MCEWAN K M (1992) Genetic polymorphism of erytrocyte diaphorase in red deer Cervus
elaphusL Animal Genetics 23 449-452
TSUJI S SAOAMITSU Y amp GOTO N (1989) Ultrathin-leyer isoelectric focusing for bovine serum
transferrin phenotyping Biochem Genet 27 425-429
TUCKER E M amp YOUNG J D (1988) Genetic control of red-cell nucleoside transport and its association
with the B blood-group locus and nucleoside phosphorylase activity in sheep Biochem Genet 26 489-
-501
TUNON M J GONZALEZ P amp VALLEJO M (1989) Genetic relationships between 14 native Spanish
breeds of goat Animal Genetics 20 205-212
USHA A P (1996) Cattle diversity by blood typing (Online) Available http
wwwribbsrcacukcdiv_wwwinfobhtm ( 1996)
USHA A P SIMPSON S P amp WILLIAMS J L (1995) Probability of random sire exclusion using
microsatellite markers for parentage verification Animal Genetics 26 155-161
VANDEBERG J amp AIVALIOTIS M (1990) Mannose-6-phosphate isomerase polymorphism in baboon
erythrocytes Biochemical Genetics 28 495-501
VAN DE WEGHE A VAN ZEVEREN A amp BOUQUET Y (1982) The vitamin D binding protein in domestic
animals Comp Biochem Physiol 73B 977-982
VAN DE WEGHE A YABLANSKI T S VAN ZEVEREN A amp BOUQUET Y (1988) A third variant of glucose
phosphate isomerase in pigs Animal Genetics 19 55-58
VANKAN D M amp BELL K (1992 a) A new allele in Australian goats Animal Genetics 23 453-456
VANKAN D M amp BELL K (1992 b) Genetic polymorphism of vitamin D-binding protein (GC) in Australian
goats Animal Genetics 23 457-462
VICENTE M V (1978) Razas vacunas autoacutectonas en vias de extincioacuten (Aportaciones al estuacutedio geneacutetico)
Fundacioacuten Juan March Serie Universitaacuteria LXK 10-51
99
Referecircncias Bibliograacuteficas
VIEIRA J (1993) Utilizaccedilatildeo de marcadores geneacuteticos na caracterizaccedilatildeo e certificaccedilatildeo de populaccedilotildees
domeacutesticas e selvagens de coelho (Oryctolagus cunicuius) Dissertaccedilatildeo de Mestrado apresentada agrave
Faculdade de Ciecircncias da Universidade do Porto
VIEIRA J amp FERRAND N (1995) Four new alleles at the mannose-6-phosphate isomerase locus in rabbit
Animal Genetics 26 37-38
WANG S FOOTE W C amp BUNCH T D (1990) Transferrin and haemoglobin polymorphism in
domesticated goats in the USA Animal Genetics 21 91-94
WEBER J L amp MAY P E (1989) Abundant class of human DNA polymorphisms which can be typed using
the polymerase chain reaction American Jornal of Human Genetics 44 388-396
WELCHS S (1990) A comparison of the structure and properties of serum transferrin from 17 animal species
Comp Biochem Physiol 97 B (3) 417-427
100
ANEXO
Anexos
RESUMO E CONCLUSOtildeES
Neste trabalho apresenta-se uma contribuiccedilatildeo para o estudo geneacutetico da raccedila bovina Barrosatilde e de uma outra raccedila (Minhota) atraveacutes da anaacutelise da variaccedilatildeo geneacutetica de proteiacutenas detectada pela utilizaccedilatildeo de sistemas electroforeacuteticos convencionais e por focagem isoeleacutectrica
Definiram-se os seguintes objectivos fundamentais
1 estudo da variabilidade geneacutetica da raccedila Barrosatilde ao niacutevel das proteiacutenas eritrocitaacuterias e plasmaacuteticas 2 desenvolvimento e afinaccedilatildeo de teacutecnicas de separaccedilatildeo de proteiacutenas por electroforese e focagem
isoeleacutectrica e sua detecccedilatildeo especiacutefica (histoquiacutemica e imunoloacutegica) 3 anaacutelise familiar dos polimorfismos encontrados 4 avaliaccedilatildeo do grau de diferenciaccedilatildeo geneacutetica existente entre a raccedila Barrosatilde e outras raccedilas bovinas
Escolheu-se um conjunto de 12 sistemas geneacuteticos (sete dos quais se revelaram polimoacuterficos) que pudesse satisfazer os objectivos fundamentais do trabalho
Assim apoacutes desenvolvimento de teacutecnicas de separaccedilatildeo para os sistemas geneacuteticos considerados procedeu-se a uma anaacutelise familiar baseada nos polimorfismos encontrados nas populaccedilotildees de raccedila Barrosatilde ao estudo de distribuiccedilatildeo populacional dos fenoacutetipos das duas raccedilas estudadas e de outras raccedilas bovinas da Europa (principalmente da Peniacutensula Ibeacuterica)
Com base neste trabalho obtiveram-se as seguintes conclusotildees
bull a utilizaccedilatildeo de um sistema de focagem isoeleacutectrica permitiu detectar a existecircncia de polimorfismo geneacutetico na hemoglobina distinguindo-se dois produtos geacutenicos na raccedila bovina Minhota HBA e HBB Na raccedila Barrosatilde HBA foi o uacutenico produto geacutenico encontrado
bull a utilizaccedilatildeo de um sistema de focagem isoeleacutectrica permitiu a detecccedilatildeo de dois produtos geacutenicos no locus CAII (CAIIF e CAIPS) e revelou-se mais eficaz de que as teacutecnicas de separaccedilatildeo convencional em gel de amido
bull a investigaccedilatildeo realizada permitiu detectar a ocorrecircncia de polimorfismo geneacutetico de MPI atraveacutes de um sistema electroforeacutetico em gel de amido tendo-se detectado trecircs produtos geacutenicos (MPIA MPIB e MPIC) A fraca actividade de MPI e a grande dificuldade na obtenccedilatildeo de um contraste de bandas adequado poderaacute dever-se ao facto de a sua expressatildeo soacute ocorrer na fracccedilatildeo leucocitaacuteria do sangue
bull a aplicaccedilatildeo de um sistema de focagem isoeleacutectrica na presenccedila de ureia (8M) revelou-se muito eficaz na separaccedilatildeo de ALB e permitiu detectar pela primeira vez um novo variante ALBV ligeiramente mais aciacutedico do que ALB A
bull a combinaccedilatildeo de uma teacutecnica de focagem isoeleacutectrica com um preacutevio tratamento das amostras a fim de saturar a moleacutecula de TF com Fe permitiu a detecccedilatildeo de quatro produtos geacutenicos (TFA TFD1 TFD2 e TFE) nas raccedilas estudadas
bull a combinaccedilatildeo de uma teacutecnica de focagem isoeleacutectrica com a detecccedilatildeo por immunoblotting permitiu detectar dois produtos geacutenicos no locus GC (GCA e GCB) O tratamento de amostras com neuraminidase permitiu a obtenccedilatildeo de padrotildees mais simples do que os conseguidos com amostras nativas Esta simplificaccedilatildeo resulta da provaacutevel remoccedilatildeo de aacutecidos siaacutelicos ligados agrave moleacutecula de GC
bull natildeo se detectou nenhum caso de exclusatildeo na anaacutelise de segregaccedilatildeo de 27 pares matildeefilho feita separadamente para cada locus
bull verificou-se a presenccedila de dois alelos raros HBB e PEPB1 na raccedila Minhota Estes alelos poderatildeo ser utilizados na distinccedilatildeo das duas raccedilas estudadas
I
Anexos
bull foi encontrado um valor de heterozigotia meacutedia de 0237 em populaccedilotildees de raccedila Barrosatilde indicativo de uma variabilidade geneacutetica intermeacutedia em relaccedilatildeo agrave generalidade das raccedilas ibeacutericas As diferenccedilas observadas entre as vaacuterias raccedilas ibeacutericas poderatildeo reflectir fenoacutemenos histoacuterico-evolutivos muito recentes dada a sua proximidade e grande semelhanccedila
bull foi observado um reduzido niacutevel de diferenciaccedilatildeo entre as raccedilas Barrosatilde e Minhota (FST = 0031) demonstrando-se que a maior parte da diversidade geneacutetica se atribui a diferenccedilas intrapopulacionais Este valor de FST pode considerar-se baixo quando comparado com o obtido no estudo de outras espeacutecies animais sugerindo um elevado fluxo geacutemeo interpopulacional Por outro lado reflecte ainda uma histoacuteria demograacutefica muito recente
bull a utilizaccedilatildeo de meacutetodos de agrupamento NJ e UPGMA obtidos a partir de matrizes de distacircncias geneacuteticas de Nei natildeo permitiu separar a raccedila Barrosatilde das restantes raccedilas ibeacutericas
II
Anexos
Tabela A Frequecircncias geacutenicas para os vaacuterios sistemas polimoacuterficos encontrados na raccedila Barrosatilde (indiviacuteduos inscritos e natildeo inscritos) utilizadas na anaacutelise familiar
LOCUS ALELOS FREQUEcircNCIA GEacuteNICA
CAII 294 035
065
NP 294 H
L
024
076
MPI 290 A
B
C
000
098
002
ALB 294 A
B
V
097
002
001
TF 294 A
Dl
D2
E
057
016
023
004
GC 294 083 017
TTI
Introduccedilatildeo
Macedoacutenia Grega (6200 anos aC) Segundo EPSTEIN amp MASON (1984) estes achados
sugerem que o Sul da Europa poderia constituir o primeiro centro de domesticaccedilatildeo do gado
bovino a partir de onde se teria iniciado a sua expansatildeo em direcccedilatildeo ao resto do continente
europeu Ruacutessia e Sudoeste Asiaacutetico
113 - Anaacutelise geneacutetica
A investigaccedilatildeo sobre a geneacutetica das diferentes raccedilas de gado bovino tem contribuiacutedo de
forma muito significativa para a compreensatildeo da sua histoacuteria dos padrotildees de diversidade que
actualmente as caracterizam e do seu grau de parentesco Os resultados actualmente
disponiacuteveis reportam-se a trecircs domiacutenios principais grupos sanguiacuteneos variaccedilatildeo geneacutetica de
proteiacutenas e polimorfismos do DNA (DNA mitocondrial e microssateacutelites)
Grupos sanguiacuteneos
A primeira tentativa para avaliar o grau de diferenciaccedilatildeo geneacutetica entre raccedilas bovinas e
caracterizar a sua diversidade data do iniacutecio de deacutecada de 70 e envolveu precisamente o
estudo dos diferentes grupos sanguiacuteneos que iam sendo descritos (RUSSELL 1996 USHA
1996) Contudo a maior parte dos resultados natildeo permitiu a obtenccedilatildeo de conclusotildees
definitivas pelo facto de se trabalhar com um nuacutemero relativamente reduzido de loci que
adicionalmente era pouco polimoacuterfico Deve poreacutem referir-se que se dispotildee actualmente de
uma consideraacutevel quantidade de informaccedilatildeo no que se refere agrave distribuiccedilatildeo da variabilidade dos
grupos sanguiacuteneos nas diferentes raccedilas bovinas conferindo a este conjunto de dados uma
importacircncia natildeo despreziacutevel no estudo de eventuais alteraccedilotildees da estrutura geneacutetica de
populaccedilotildees de gado bovino nos uacuteltimos vinte anos (RUSSELL 1996 USHA 1996)
Proteiacutenas
A introduccedilatildeo de teacutecnicas electroforeacuteticas de separaccedilatildeo de proteiacutenas permitiu aumentar
de forma muito consideraacutevel o nuacutemero de sistemas geneacuteticos polimoacuterficos conhecidos nas
raccedilas bovinas em especial no que se refere a proteiacutenas do sangue e do leite (USHA 1996)
A anaacutelise da sua distribuiccedilatildeo populacional veio demonstrar a ocorrecircncia de dois grupos
principais de bovinos ou duas subespeacutecies (Bos primigenius taurus e Bos primigenius
7
Introduccedilatildeo
indiens) cada um deles caracterizado pela presenccedila de diversos alelos privativos em vaacuterios loci
(BRAEND 1971)
Estes resultados estatildeo de uma maneira geral de acordo com dados morfoloacutegicos
histoacutericos e ainda com a distribuiccedilatildeo geograacutefica conhecida dos principais grupos (EPSTEIN amp
MASON 1984) No entanto o acreacutescimo de informaccedilatildeo fornecido por este tipo de marcadores
foi ainda insuficiente para resolver muitas das interpretaccedilotildees contraditoacuterias publicadas sobre o
tema
Polimorfismo do DNA
A introduccedilatildeo das teacutecnicas de anaacutelise genoacutemica directa e em especial a descoberta do
polimorfismo do DNA-mitocondrial (mtDNA) e dos microssateacutelites forneceram os
instrumentos necessaacuterios a uma detalhada caracterizaccedilatildeo geneacutetica das raccedilas bovinas
A anaacutelise da variaccedilatildeo da moleacutecula de mtDNA permitiu verificar que Bos primigenius
taurus e Bos primigenius indicus teratildeo divergido haacute cerca de 210000 anos uma data muito
anterior agrave indicada pelos dados arqueoloacutegicos para o iniacutecio do processo de domesticaccedilatildeo Eacute
assim muito provaacutevel que tenham ocorrido duas domesticaccedilotildees independentes a partir de duas
subespeacutecies diferentes do auroque Bos primigenius namadicus teraacute dado origem ao gado
zebu na Aacutesia (Vale do Indu) e Bos primigenius primigenius ao gado europeu vindo do
Proacuteximo Oriente (LOFTUS et ai 1994a 1994b)
Muito recentemente BRADLEY et ai (1996) e MACHUGH et ai (1997) sugerem ainda
uma terceira domesticaccedilatildeo independente ocorrida em Aacutefrica Esta evidecircncia resulta tambeacutem
de anaacutelise do polimorfismo do mtDNA indicando uma separaccedilatildeo entre os ancestrais do gado
europeu e africano anterior agrave domesticaccedilatildeo (22000 - 26000 anos) Este terceiro processo de
domesticaccedilatildeo ter-se-ia assim efectuado a partir da subespeacutecie africana do auroque (Bos
primigenius opisthonomus)
A descoberta dos microssateacutelites e do seu elevado grau de polimorfismo data do fim da
deacutecada de 80 (Lm amp LUTY 1989 WEBER amp MAY 1989) e constitui provavelmente a
metodologia mais adequada para estudar a histoacuteria recente da diversificaccedilatildeo das raccedilas bovinas
(MACHUGH et ai 1994 ARRANZ et ai 1996) Os primeiros resultados que envolvem uma
caracterizaccedilatildeo em larga escala de diferentes populaccedilotildees permitiram distinguir mais claramente
a estrutura geneacutetica dos dois grandes grupos de gado bovino (Bos taurus e Bos indicus) e
constituem a base para futuros estudos mais especiacuteficos
8
Introduccedilatildeo
Por outro lado os microssateacutelites permitiram tambeacutem o iniacutecio do projecto de
cartografia do genoma bovino que no fim de 1994 contabilizava 202 marcadores geneacuteticos
(dos quais 144 eram microssateacutelites) regularmente espaccedilados em 90 do seu comprimento
Cerca de um ano depois existiam jaacute mais de 400 microssateacutelites (USHA et ai 1995) levando
EGGEN et ai (1995) a apresentar um trabalho de revisatildeo e consolidaccedilatildeo de informaccedilatildeo jaacute
existente para evitar a ocorrecircncia de possiacuteveis redundacircncias
A aplicaccedilatildeo deste tipo de marcadores natildeo se restringe apenas agrave anaacutelise da diversidade
geneacutetica populacional e agrave construccedilatildeo de mapas geneacuteticos De facto satildeo actualmente escolhidos
para a realizaccedilatildeo de testes de paternidade (GLOWATZKI-MULLIS et ai 1995 USHA et ai 1995
ARRANZ et ai 1996) detecccedilatildeo de loci que determinam a expressatildeo de caracteriacutesticas
quantitativas (QTL) (RON et ai 1994) determinaccedilatildeo do sexo em embriotildees selecccedilatildeo animal
assistida entre outros
No seu conjunto estes resultados tecircm permitido um avanccedilo notaacutevel na compreensatildeo da
evoluccedilatildeo das actuais raccedilas bovinas A prossecuccedilatildeo desta via de investigaccedilatildeo poderaacute levar ao
esclarecimento definitivo do nuacutemero de domesticaccedilotildees independentes que teraacute ocorrido
(EPSTEIN amp MASON 1984 LOFTUS et al 1994a 1994b BRADLEY et al 1996 MACHUGH et
al 1997) a partir das populaccedilotildees selvagens de auroque Seguidamente eacute legiacutetimo esperar que
venha a ser possiacutevel analisar a uma escala mais fina o grau de parentesco geneacutetico entre raccedilas
que ocupem aacutereas geograacuteficas mais reduzidas Neste particular seraacute extremamente interessante
incluir as populaccedilotildees ibeacutericas e em especial a raccedila Barrosatilde
9
Introduccedilatildeo
12 - A DIVERSIDADE DAS RACcedilAS BOVINAS
A domesticaccedilatildeo resultou na criaccedilatildeo de milhares de raccedilas de animais domeacutesticos
geneticamente diferentes e adaptadas agraves necessidades humanas e a uma grande variedade de
condiccedilotildees ambientais (FAO 1993)
121 - As raccedilas ibeacutericas
A grande diversidade de raccedilas bovinas da Peniacutensula Ibeacuterica poderaacute dever-se em parte
agrave introduccedilatildeo de outras raccedilas domeacutesticas que se cruzaram entre si e com bovinos jaacute existentes
na Peniacutensula A introduccedilatildeo de outras raccedilas teraacute sido feita de duas formas distintas
1 - atraveacutes dos movimentos migratoacuterios acompanhando as vaacuterias invasotildees de povos
vindos do oriente como eacute o caso dos Feniacutecios ( seacutec X aC) Gregos (seacutec VII aC) e
Romanos (seacutec III aC) Estes uacuteltimos dominaram completamente a Peniacutensula durante
7 seacuteculos e teratildeo contribuiacutedo para a diversificaccedilatildeo do gado bovino pelo facto de
introduzirem animais de caracteriacutesticas diferentes Supotildee-se que do seu cruzamento
com os bovinos ibeacutericos se teratildeo originado os troncos aquitacircnico e ibeacuterico (MIRANDA
do VALE 1949)
2 - atraveacutes da introduccedilatildeo de animais do Norte de Aacutefrica na sequecircncia da invasatildeo de
povos como os Cartagineses (seacutec V aC) e jaacute na era cristatilde os Mouros (711 dC)
Estes teratildeo introduzido descendentes de Bos primigenius opisthonomus que poderaacute
ter influenciado a formaccedilatildeo de vaacuterias raccedilas ibeacutericas nomeadamente as raccedilas Barrosatilde e
Cachena (APARIacuteCIO 1960 in IGLESIAS 1989 EPSTEIN amp MASON 1984) Estas
poderatildeo assim constituir uma linha que descende do tronco mauritaacutenico (MIRANDA
do VALE 1949)
10
Introduccedilatildeo
Adicionalmente eacute provaacutevel que povos oriundos do Norte da Europa nomeadamente
os Visigodos possam ter introduzido gado bovino dessa regiatildeo Contudo a sua eventual
contribuiccedilatildeo para a diversidade de raccedilas bovinas da Peniacutensula Ibeacuterica estaacute por esclarecer
122 - A raccedila Barrosatilde
Aspectos histoacutericos da dispersatildeo e evoluccedilatildeo do efectivo populacional
O centro de criaccedilatildeo da raccedila Barrosatilde situa-se actualmente na zona do planalto da Serra
do Barroso abrangendo os actuais concelhos de Montalegre Boticas Vieira do Minho
(freguesias de Campos e Ruivatildees) e Cabeceiras de Basto (freguesia de Gondiatildees) Esta regiatildeo
natildeo possui condiccedilotildees agro-climateacutericas que permitam grandes exploraccedilotildees agriacutecolas pelo que
uma parte importante da populaccedilatildeo se dedica agrave criaccedilatildeo de gado (GARCIA et ai 1981
FERNANDES 1996)
Vivendo sobretudo em zonas montanhosas a Barrosatilde eacute utilizada essencialmente como
forccedila de trabalho e na produccedilatildeo de carne de excelente qualidade motivo pelo qual a Uniatildeo
Europeia a reconhece com denominaccedilatildeo de Origem Protegida (FERNANDES 1996)
No seacuteculo passado e iniacutecio do seacuteculo XX existia um grande incentivo para a criaccedilatildeo
desta raccedila devido agrave procura da sua carne muito apreciada em Inglaterra Este incentivo
contribuiu indirectamente para que a estatura dos animais se elevasse (GARCIA et ai 1981) e
para que a zona de criaccedilatildeo se dispersasse pelas aacutereas submontanhosas e pelas planiacutecies do
Entre Douro e Minho ateacute agrave orla mariacutetima chegando mesmo ao concelho de Vila Nova de Gaia
(figura 121) Nestas zonas fazia-se a criaccedilatildeo de novilhos para exploraccedilatildeo como bois de
trabalho e para produccedilatildeo de carne Tal exploraccedilatildeo estaacute bem patente nos paineacuteis de azulejos da
estaccedilatildeo de caminhos de ferro de S Bento no Porto e mesmo nos desenhos das calccediladas nas
principais avenidas desta cidade
li
Introduccedilatildeo
B
bull bull bull _ bull bull bull - bull bull
Figura 121 A) Junta de bois de trabalho de raccedila Barrosatilde B) Fecircmea adulta Barrosatilde C) Macho adulto Barrosatilde Fotografias datadas de 1949 gentilmente cedidas pela Direcccedilatildeo Regional de Agricultura de Entre Douro e Minho - Centro de Produccedilatildeo Animal (DRAEDM)
12
Introduccedilatildeo
Poreacutem a necessidade de maiores produccedilotildees de carne foi conduzindo durante a
segunda metade deste seacuteculo a um progressivo decliacutenio no efectivo populacional da raccedila
Barrosatilde tornando-se mesmo raro poder observar uma junta de bois Recentemente as
alteraccedilotildees verificadas na poliacutetica agraacuteria e ambiental da Uniatildeo Europeia teratildeo permitido
alguma recuperaccedilatildeo Nesse contexto a criaccedilatildeo em 1981 do Livro Genealoacutegico da raccedila
Barrosatilde constitui um passo importante para a certificaccedilatildeo dos animais e o aumento do seu
valor Actualmente o seu efectivo populacional tem crescido continuamente e essa tendecircncia
parece estaacutevel
Segundo dados fornecidos pelo Registo Zooteacutecnico e pela Associaccedilatildeo do Minho dos
Criadores de Bovinos de Raccedila Barrosatilde (AMTOA) existiam em 1996 38002 fecircmeas
reprodutoras inscritas e 375 touros de cobriccedilatildeo (tabela 1221) distribuiacutedos por vaacuterios
concelhos dos distritos de Viana do Castelo Braga Vila Real e Porto (figura 122)
Tabela 1221 Movimento do Registo Zooteacutecnico relativo agrave raccedila Barrosatilde
Vacas Inscritas Postos de Cobriccedilatildeo Vitelos Anos Abatidas Registadas Inscritas Encerrados Recenseados Existecircncias Inscritos 1981 0 4884 4882 1 25 24 0 1982 19 6169 11032 6 42 60 532 1983 31 4436 15437 14 35 81 1593 1984 72 866 16231 13 14 82 2151 1985 47 604 16788 15 15 82 1767 1986 106 1027 17709 18 13 77 2414 1987 72 1186 18823 2 14 89 2632 1988 122 1192 19877 5 7 91 2574 1989 138 718 20506 14 26 103 2532 1990 89 1017 21440 8 7 102 2404 1991 159 1309 22590 14 26 114 2531 1992 52 1902 24440 6 17 125 3203 1993 0 4205 28645 37 87 175 4077 1994 0 6248 34893 58 111 228 4679 1995 340 2447 37000 0 112 340 5759 1996 120 1122 38002 26 61 375 5901
Fonte Registo Zooteacutecnico (cedido pela AM1BA)
Apesar desta situaccedilatildeo favoraacutevel natildeo se pode considerar que a raccedila Barrosatilde natildeo corra
ainda perigo de extinccedilatildeo Na verdade satildeo vaacuterios os factores que tecircm contribuiacutedo para a
diminuiccedilatildeo da sua aacuterea de criaccedilatildeo ou mesmo para a alteraccedilatildeo das caracteriacutesticas destes
animais De entre esses factores deve salientar-se i) a substituiccedilatildeo de Barrosatilde por outras raccedilas
autoacutectones (Minhota Mirandesa Maronesa) ou importadas (Friacutesia Gelbvieh e Parda Suiacuteccedila)
13
Introduccedilatildeo
que fornecem ao agricultor um rendimento superior ii) a progressiva mecanizaccedilatildeo da
agricultura e a diminuiccedilatildeo das aacutereas de pastagem iii) o pequeno nuacutemero de machos
reprodutores associado a um efectivo idoso iv) uma baixa fertilidade meacutedia grandes
intervalos entre partos e elevado nuacutemero de abortos e v) desmotivaccedilatildeo dos produtores mesmo
em face das actuais condiccedilotildees de comercializaccedilatildeo
LEGENDA
| j - -Concelhos de Entre Douro e Minho S Concelhos de Traacutes-os-Montes
ESCALA 11380000
Figura 122 Mapa de distribuiccedilatildeo do actual efectivo Barrosatilde
14
Introduccedilatildeo
Aspectos morfoloacutegicos
O bovino Barrosatilde apresenta uma estatura mediana com 121-130 cm de altura agrave
cernelha e pelagem de cor castanha (variando entre a cor de palha ateacute a cor acerejada) (LEAL
1995) A cabeccedila eacute curta e larga encimada por uma cornamenta em forma de lira alta os
cornos satildeo muito compridos e espessos de cor branca suja com pontas escuras o conjunto
ocular eacute saliente dando-lhe o aspecto de olhos de sapo as orelhas satildeo de tamanho meacutedio os
membros satildeo curtos e pouco ossudos e o pescoccedilo eacute curto bem ligado agrave cabeccedila e com garrote
largo (MARTINS 1982)
Eacute uma raccedila com caracteres sexuais secundaacuterios bem diferenciados Os touros satildeo
normalmente mais escuros particularmente no terccedilo anterior com maior corpulecircncia do que as
fecircmeas mais robustos com barbela mais desenvolvida cabeccedila mais curta e mais larga cornos
mais grossos e ligeiramente mais curtos (GARCIA et ai 1981 MARTINS 1982)
Esta raccedila apresenta duas particularidades morfoloacutegicas que a distinguem de todas as
outras raccedilas grande desenvolvimento coacuterneo e perfil cocircncavo da cabeccedila com acentuado
prognatismo mandibular O elevado crescimento coacuterneo poderaacute estar relacionado com a
selecccedilatildeo dos animais De facto nas populares chegas de touros o animal que sai vencedor seraacute
o touro cobridor das vacas da aldeia Este processo teraacute permitido a primazia de touros de
maior ossatura capital mais potente musculatura ceacutefalo-cervical maior forccedila no acircngulo taacutersico
e consequentemente grande desenvolvimento dos cornos (MIRANDA do VALE in GONCcedilALVES GARCIA 1964 ARAUacuteJO 1986) No que se refere ao acentuado prognatismo
mandibular eacute possiacutevel que em parte esteja relacionado com o grande desenvolvimento
coacuterneo Este teraacute exigido um desenvolvimento correlativo de certos ossos cranianos e o
atrofiamento dos ossos da face (GONCcedilALVES GARCIA 1964)
Origem
A origem da raccedila Barrosatilde e o seu enquadramento com as outras raccedilas da Peniacutensula
Ibeacuterica estaacute ainda por explicar constatando-se uma grande heterogeneidade na opiniatildeo de
diversos autores a este respeito (MARTINS 1982)
Alguns autores referem a existecircncia no Norte de Aacutefrica (vale do Nilo) de um gado
com caracteriacutesticas morfoloacutegicas semelhantes agrave actual raccedila Barrosatilde em especial no que se
refere agrave forma tamanho e espessura dos cornos Este gado eacute normalmente associado agrave
15
Introduccedilatildeo
designaccedilatildeo subespeciacutefica Bos primigenius opisthonomus (embora tambeacutem se refira como Bos
primigenius mauritaniens e como Bos taurus desertorum) e teraacute chegado agrave Peniacutensula Ibeacuterica
atraveacutes de vaacuterias rotas migratoacuterias dos povos norte-africanos A raccedila Barrosatilde poderia assim
ser incluiacuteda no tronco mauritaacutenico tendo como ancestral Bos primigenius mauritanicus
(GARCIA et ai 1981)
Neste contexto poderaacute admitir-se que o gado que corresponde a este grupo se tenha
instalado na Peniacutensula Ibeacuterica provavelmente durante a longa ocupaccedilatildeo Moura (GONCcedilALVES
GARCIA 1964) Posteriormente a raccedila Barrosatilde teraacute sido desalojada pelos troncos ibeacuterico e
aquitacircnico restando apenas um nuacutecleo populacional confinado agraves zonas planaacutelticas do
Barroso onde permaneceu ateacute hoje (GONCcedilALVES GARCIA 1964)
Esta hipoacutetese natildeo eacute contudo partilhada por outros autores que lhe criticam a escassa
evidecircncia (forma e tamanho dos cornos) e portanto uma clara ausecircncia de base cientiacutefica
(IGLESIAS 1989)
Perante o exposto pode verificar-se que a raccedila Barrosatilde apresenta aspectos
morfoloacutegicos e histoacuterico-evolutivos muito peculiares sendo ainda hoje difiacutecil proceder ao seu
enquadramento no seio das restantes raccedilas bovinas ibeacutericas O aprofundamento da investigaccedilatildeo
sobre a estrutura geneacutetica das suas populaccedilotildees poderaacute ser assim uma via para o
esclarecimento das muitas questotildees que permanecem por responder Nestas condiccedilotildees este
trabalho pretende ser uma contribuiccedilatildeo para o conhecimento da geneacutetica das populaccedilotildees da
raccedila bovina Barrosatilde atraveacutes da consecuccedilatildeo dos seguintes objectivos
1 estudo da variabilidade geneacutetica da raccedila Barrosatilde ao niacutevel das proteiacutenas eritrocitaacuterias
e plasmaacuteticas
2 desenvolvimento e afinaccedilatildeo de teacutecnicas de separaccedilatildeo de proteiacutenas por electroforese
e focagem isoeleacutectrica e sua detecccedilatildeo especiacutefica (histoquiacutemica e imunoloacutegica)
3 anaacutelise familiar dos polimorfismos encontrados
4 avaliaccedilatildeo do grau de diferenciaccedilatildeo geneacutetica existente entre a raccedila Barrosatilde e outras
raccedilas bovinas
16
Material e Meacutetodos
2 - MATERIAL E MEacuteTODOS
21 - AMOSTRAGEM E CONSERVACcedilAtildeO DAS AMOSTRAS
211 - Amostragem
Foram recolhidas 356 amostras de sangue correspondente a 294 indiviacuteduos de raccedila
Barrosatilde (dos quais 141 estavam inscritos no Livro Genealoacutegico) e 62 indiviacuteduos de raccedila
Minhota As colheitas efectuaram-se em zonas de intensa criaccedilatildeo da Barrosatilde designadamente
nos concelhos de Arcos de Valdevez Cabeceiras de Basto Fafe Poacutevoa de Lanhoso e
Monccedilatildeo em finais de 1993 durante o ano de 1994 e ainda no periacuteodo de 1996 1997 em
Vieira do Minho
A recolha de sangue em indiviacuteduos de raccedila Minhota foi efectuada com a finalidade de
servir como termo de comparaccedilatildeo geneacutetica uma vez que se realizam cruzamentos entre esta
raccedila e a Barrosatilde
212 - Obtenccedilatildeo e conservaccedilatildeo das amostras de sangue
O sangue foi colhido da veia jugular em tubos contendo 01 ml de EDTA (aacutecido
etilnodiaminotetraceacutetico) dissoacutedico a 10 ou em tubos heparinados
As amostras de sangue foram centrifugadas (10 minutos a 13000 rpm) separando-se
em seguida o plasma dos eritroacutecitos Aos eritroacutecitos foi adicionado meio de glicerol (seis
partes de uma soluccedilatildeo 5 de citrato trissoacutedico 2H20 adicionados a quatro partes de glicerol)
numa proporccedilatildeo aproximada de 21 as amostras foram conservadas a -20degC
17
Material e Meacutetodos
22 - BATERIA DE MARCADORES GENEacuteTICOS SELECCIONADOS
No presente trabalho foi escolhida uma bateria de 12 marcadores geneacuteticos dispersos
no genoma do bovino (figura 5) HB (Hemoglobina) CAII (Anidrase carboacutenica) PEPB
(Peptidase B) DIA (Diaforase) NP (Fosforilase nucleosiacutedica) MDH (Desidrogenase do
malato) PGD (Desidrogenase do aacutecido fosfoglucoacutenico) GPI (Isomerase da fosfoglucose)
MPI (Isomerase da manose-6-fosfato) ALB (Albumina) TF (Transferrina) e GC
(Componente especiacutefico de grupo)
CP SODl TF
PEPC IDH1
AMY1 AMY1A PGM1
4
LDHB PEPB
ADH2 PGM2 ALB GC SOD3
6
IADA
ALDH1
CAII
ME1 PGM3 SOD2
NP
10
CAT HBBq22-q27
PGD IALDH2 DIA4
HP GPIq22-q24
MPI iBF GLOl
LDHA MDH2
Figura 221 Localizaccedilatildeo de vaacuterios loci proteicos no genoma de Bos taurus Com um tom mais carregado indicam-se os marcadores estudados neste trabalho Adaptado de FRIES et ai (1993)
18
Material e Meacutetodos
bull HB
A hemoglobina eacute responsaacutevel pelo transporte do oxigeacutenio dos pulmotildees para os tecidos
A sua estrutura eacute tetrameacuterica tendo cada uma das quatro subunidades um grupo prosteacutetico -
- heme - com um aacutetomo de ferro no centro A fracccedilatildeo principal da hemoglobina de mamiacuteferos
adultos eacute composta por duas cadeias a e duas cadeias P (BRAEND 1971 CECCHINI amp Nus
1986)
O locus da HB foi um dos primeiros a ser estudado apresentando polimorfismo em
vaacuterios mamiacuteferos (CECCHJM amp Nus 1986 BRAEND et ai 1988 CLARKE et ai 1989 WANG
et ai 1990 SELVARAJ et ai 1991) Em 1955 CABANNE amp SERAIN (in BRAEND 1988)
descrevem pela primeira vez o polimorfismo da HB em bovinos do Norte da Aacutefrica
Posteriormente muitos estudos foram efectuados descrevendo-se 13 variantes (raros na sua
maioria) com diferenccedilas apenas nas cadeias beta (CECCHINI amp Nus 1986 BRAEND 1988)
bull CAII-EC4211
A CAII eacute uma metaloenzima com grande distribuiccedilatildeo nos animais e nas plantas
(TASHIAN 1989) Catalisa de forma reversiacutevel a hidrataccedilatildeo do C02 em H2C03 (CECCHINI amp
Nus 1986 TASHIAN 1989) O seu papel fisioloacutegico ainda natildeo eacute bem conhecido mas eacute
possiacutevel que tenha participaccedilatildeo na manutenccedilatildeo do balanccedilo osmoacutetico (TASHIAN 1989)
A ocorrecircncia de variaccedilatildeo geneacutetica na CAII estaacute descrita em muitas espeacutecies de
mamiacuteferos tendo sido descritos dois loci polimoacuterficos (CAI e CAII) (TASHIAN amp CARTER
1976 CLARICE et ai 1989 SELVARAJ et ai 1991)
SARTORE et ai (1969) foram os primeiros a detectar polimorfismo electroforeacutetico da
anidrase carboacutenica em bovinos domeacutesticos e buacutefalos americanos Nos eritroacutecitos de bovinos
apenas se exprime a anidrase carboacutenica II que apresenta geralmente 2 alelos codominantes
autossoacutemicos (CAIPF e CAIPS) (SARTORE et ai 1969 TASHIAN amp CARTER 1976) Mais
tarde foram encontrados 3 novos alelos (C Z e X) (CECCHINI amp Nus 1986)
19
Material e Meacutetodos
bull PEPB-EC3412
As peptidases formam um conjunto de enzimas capazes de hidrolisar di- e tripeacuteptidos
caracterizando-se pela sua especificidade em relaccedilatildeo a diversos substratos bem como atraveacutes
da sua distribuiccedilatildeo tecidular
A PEPB apresenta uma estrutura monomeacuterica tendo sido descrita como polimoacuterfica
em algumas raccedilas brasileiras de bovinos de origem europeia e indiana (DEL LAMA et ai
1992)
bull DIA-EC1643
A enzima monomeacuterica DIA (NADH - Methemoglobina redutase) tambeacutem conhecida
por citocromo bs redutase faz parte de um grupo de enzimas que catalisam a reduccedilatildeo da
methemoglobina (IGLESIAS 1989 VIEIRA 1993 kRAHhetal 1986)
O seu polimorfismo geneacutetico foi detectado em vaacuterias espeacutecies de Ungulados incluindo
os bovinos (CLARKE et ai 1989 IGLESIAS 1989 SELVARAJ et ai 1991 TATE amp McEWAN
1992)
bull NP-EC2421
A enzima NP encontra-se distribuiacuteda por vaacuterios tecidos e oacutergatildeos e catalisa
reversivelmente a fosforoacutelise dos nucleosiacutedeos puriacutenicos levando agrave formaccedilatildeo das respectivas
bases e ribose-1-fosfato (IGLESIAS 1989)
O polimorfismo geneacutetico desta enzima foi detectado em vaacuterias espeacutecies de mamiacuteferos
incluindo os bovinos (ANSAY 1973 HARRIS amp HOPKINSON 1978 TUKER amp YOUNG 1988
CLARKE eacutetal 1989 IGLESIAS 1989 FERRAND 1995)
20
Material e Meacutetodos
bull MDH-ECl 1137
A MDH eacute uma oxirredutase dimeacuterica na maioria dos mamiacuteferos responsaacutevel pela
oxidaccedilatildeo do L-malato em oxoglutarato com NAD como aceitador A reacccedilatildeo eacute reversiacutevel em
presenccedila de NADH e oxaloacetato A enzima diz-se NAD especiacutefica pelo facto da reacccedilatildeo soacute
ocorrer na presenccedila deste cofactor (MORAIS 1992 PEREIRA 1997)
A ocorrecircncia de variaccedilatildeo geneacutetica neste locus foi descrita para vaacuterios mamiacuteferos
(HARRIS amp HOPKINSON 1978 TUNOacuteN et ai 1989 SELVARAJ et ai 1991) Contudo
relativamente aos bovinos natildeo foi possiacutevel encontrar referecircncias quanto ao seu polimorfismo
bull PGD-EC11144
A PGD eacute uma enzima dimeacuterica envolvida na via das pentoses-fosfato catalisando a
conversatildeo de 6-fosfogluconato em ribose-5-fosfato
O polimorfismo geneacutetico do locus PGD estaacute descrito em diversas espeacutecies de
Ungulados (HERZOG 1988 PENEDO et ai 1988 BEKENEV amp ORLO VA 1991 KUROSAWA amp
TANAKA 1991 JANZEN amp COTHRAN 1991 FERNDALE et al 1992) Contudo relativamente
aos bovinos natildeo foi possiacutevel encontrar referecircncias quanto ao seu polimorfismo
bull GPI-EC5319
A isomerase da fosfoglucose cataliza a reacccedilatildeo reversiacutevel de conversatildeo de glucose-
-6-fosfato em frutose-6-fosfato (HARRIS amp HOPKINSON 1978 PRETSCHei ai 1990)
Eacute uma enzima dimeacuterica com polimorfismo geneacutetico em vaacuterias espeacutecies de mamiacuteferos
nomeadamente no catildeo (ARNOLD amp Bouw 1989) no porco (VAN DE WEGHE et ai 1988
BEKENEV amp ORLO VA 1991) na ovelha (RASERO et ai 1993) em lamas e alpacas (PENEDO et
ai 1988) e no Homem (HARRIS amp HOPKINSON 1978)
21
Material e Meacutetodos
bull MPI-EC5318
A MPI eacute uma enzima monomeacuterica de acccedilatildeo cataliacutetica que permite a isomerizaccedilatildeo de D-
-manose-6-fosfato em D-frutose-6-fosfato
Em diversas espeacutecies de mamiacuteferos nomeadamente no Homem (RlTTER et ai 1974)
em babuiacutenos (RITTER amp SCHMITT 1973) e ratos (NICHOLS et ai 1973 VANDEBERG amp
AIVALIOTIS 1990) esta enzima natildeo apresenta actividade em eritroacutecitos sendo poreacutem
detectada em diversos tecidos como rim fiacutegado e o muacutesculo Mais tarde demonstrou-se a
possibilidade de proceder a esta detecccedilatildeo em hemolisados de cavalos coelhos e lebres (HALL
et ai 1991 VIEIRA amp FERRAND 1995 SANTOS 1995)
O polimorfismo geneacutetico de MPI em bovinos foi descrito por ANSAY (1973)
apresentando trecircs alelos autossoacutemicos codominantes (MPPA MPIB e MPIC)
bull ALB
A albumina eacute a proteiacutena mais abundante no plasma dos mamiacuteferos e apresenta uma
estrutura monomeacuterica A sua funccedilatildeo estaacute relacionada com processos de transporte e de
regulaccedilatildeo do balanccedilo osmoacutetico (CECCHTNI amp Nus 1986 CARTER et al 1989)
O polimorfismo geneacutetico da albumina estaacute descrito em vaacuterias espeacutecies de Ungulados
(STORMONT et ai 1963 BOWLING amp CLARK 1988 PENEDO et ai 1988 ERHARDT 1991
SELVARAJeacutetfa 1991CRISTOFALOpounda 1992 ERHARDT amp SlMIANER 1993)
EFREMOV e ASHTON em 1965 (in CECCHTNI amp Nus 1986) descrevem pela primeira vez
polimorfismo geneacutetico em raccedilas bovinas inglesas Inicialmente encontraram-se dois alelos
(ALBA ou ALBF e ALBB ou ALBS) por electroforese aacutecida Mais tarde descreveram-
-se outros alelos em raccedilas britacircnicas (ALBH e ALBG) e em raccedilas africanas (ALBD
ALBE e ALBF) (CECCHINI amp Nus 1986) ABE et ai em 1971 descrevem o alelo ALBX
(in CECCHTNI amp Nus 1986)
22
Material e Meacutetodos
bull TF
A transferrina eacute uma 3-globulina seacuterica responsaacutevel pelo transporte do ferro Possui
uma estrutura monomeacuterica glicosilada (CECCHINI amp Nus 1986 WELCHS 1990 PENHALLOW
et ai 1991 CUNHA 1994)
O polimorfismo geneacutetico desta proteiacutena foi detectado em vaacuterias espeacutecies de Ungulados
(KRISTJANSSON 1963 STORMONT et ai 1963 ASHTON 1965 GAHNE et ai 1977 CECCHJNI
amp Nus 1986 ERHARD 1986 KUROSAWA amp TANAKA 1988 PENEDO et ai 1988 CLARKE et
ai 1989 HERZOG 1989 JUNEJA et ai 1989 TSUJI et ai 1989 SCHNEIDER et ai 1990
STRATIL et ai 1990 WANG et ai 1990 SELVARAJ et ai 1991 DRATCH et ai 1992
VANKAN amp BELL 1992a CIacuteZovket ai 1993 ERHARD et ai 1993)
ASHTON em 1965 descreveu pela primeira vez o polimorfismo geneacutetico de TF em
bovinos estando actualmente descritos sete alelos TFA TFB TFD1 TFD2 TFE
TFF e TFG (CECCHTNI amp Nus 1986) A subdivisatildeo do alelo TFD em TFD1 e TFD2 foi
descrita por KRISTJANSSON amp HICKMAN (1965)
Nos bovinos os loci TF e CP encontram-se ligados como tem sido descrito para vaacuterias
espeacutecies de mamiacuteferos (JUNEJA et ai 1989)
bull GC
A GC apresenta uma estrutura monomeacuterica e o seu polimorfismo geneacutetico estaacute descrito
em vaacuterias espeacutecies de Ungulados (GAHNE 1963 KRISTJANSSON 1963 JUNEJA et ai 1987
PENEDO et ai 1988 PENEDO amp JUNEJA 1989 KALAacuteB et ai 1990 ERHARDT 1991 VANKAN
amp BELL 1992b STERN et ai 1992 ERHARDT amp SIMIANER 1993 STRATIL et ai 1995)
Nos bovinos o polimorfismo geneacutetico da GC foi inicialmente descrito por GAHNE
(1963) e ASHTON (1963) in GAHNE et ai 1977) mas soacute mais tarde foi possiacutevel obter
frequecircncias geacutenicas para este locus (alelos GCA e GCB) em diferentes raccedilas europeias
(GAHNE et ai 1977) A utilizaccedilatildeo de novas teacutecnicas de separaccedilatildeo permitiu distinguir um
terceiro alelo GCC (VAN DE WEGHE 1982)
23
Material e Meacutetodos
A existecircncia de ligaccedilatildeo factorial entre os loci ALB e GC foi demostrada no Homem
em primeiro lugar e depois nos cavalos nos bovinos e na ovelha (VAN DE WEGHE 1982
ERHARDT amp SlMIANER 1993)
23 - TRATAMENTO DAS AMOSTRAS
bull HB
A separaccedilatildeo da moleacutecula HB por focagem isoeleacutectrica foi feita mediante a utilizaccedilatildeo de
hemolisados diluiacutedos 18 em aacutegua bidestilada
bull CAII
A separaccedilatildeo electroforeacutetica de CAII foi realizada em gel de amido e em focagem
isoeleacutectrica No primeiro caso as amostras foram simplesmente tratadas com tolueno
enquanto no segundo se procedeu ainda agrave sua reduccedilatildeo com uma soluccedilatildeo de ditiotreitol
(DTT) 120 mM (100 uacute de amostra natildeo diluiacuteda e 20 pi de DTT 120 mM) durante 1 h a 37degC
Quando se utilizou focagem isoeleacutectrica aleacutem do tratamento jaacute referido foi necessaacuterio
realizar uma diluiccedilatildeo final de 110 com aacutegua bidestilada
bull PEPB DIA NP MDH PGP GPI e MPI
As separaccedilotildees electroforeacuteticas de PEPB DIA NP MDH PGD GPI e MPI em gel de
amido foram efectuadas com hemolisados natildeo diluiacutedos submetidos ao mesmo tratamento
descrito para CAII quando separada por electroforese convencional
24
Material e Meacutetodos
bull ALB
Na separaccedilatildeo de ALB por focagem isoeleacutectrica utilizaram-se amostras de plasma
diluiacutedas com aacutegua bidestilada na proporccedilatildeo de 170
bull TF
Na separaccedilatildeo de TF efectuada por focagem isoeleacutectrica utilizaram-se amostras de
plasma submetidas a vaacuterios tipos de tratamento para comparaccedilatildeo dos padrotildees de bandas
obtidos
1 Remoccedilatildeo dos resiacuteduos de aacutecido siaacutelico da moleacutecula de TF
diluiccedilatildeo 13 com neuraminidase durante 1 h a 37 degC
2 Remoccedilatildeo do Fe da moleacutecula de TF
diluiccedilatildeo 13 com EDTA-dissoacutedico (20) 2 h antes da aplicaccedilatildeo para remoccedilatildeo dos
aacutetomos de Fe da moleacutecula de TF
3 Saturaccedilatildeo em Fe da moleacutecula de TF
31 - diluiccedilatildeo 13 com soluccedilatildeo de sulfato de amoacutenio feacuterrico 015 (pv) em aacutecido
ciacutetrico 60 mM seguida de incubaccedilatildeo agrave temperatura ambiente 18 h A utilizaccedilatildeo
de uma razatildeo ligante Fe de 201 permite uma raacutepida saturaccedilatildeo da moleacutecula de
TF (FERRAND 1995)
32 - diluiccedilatildeo 13 com soluccedilatildeo de sulfato de amoacutenio ferroso 015 (pv) em aacutecido
ciacutetrico 60 mM seguida de incubaccedilatildeo agrave temperatura ambiente 18 h
33 - diluiccedilatildeo 13 com soluccedilatildeo de citrato de amoacutenio feacuterrico 015 (pv) em aacutecido
ciacutetrico 60 mM seguida de incubaccedilatildeo agrave temperatura ambiente 18 h
34 - diluiccedilatildeo 13 com soluccedilatildeo de citrato feacuterrico 015 (pv) em aacutecido ciacutetrico
60 mM seguida de incubaccedilatildeo agrave temperatura ambiente 18 h
35 - diluiccedilatildeo 13 com soluccedilatildeo de cloreto de ferro 015 (pv) em aacutecido ciacutetrico
60 mM seguida de incubaccedilatildeo agrave temperatura ambiente 18 h
25
Material e Meacutetodos
Antes da inserccedilatildeo as amostras foram parcialmente purificadas atraveacutes da adiccedilatildeo de 5
volumes de uma soluccedilatildeo de rivanol 06 (pv) em tampatildeo Tris HC1 005 M (ajusta-se o pH
para valores de 91 com Tris 1 M) seguida de centrifugaccedilatildeo
bull GCcedil
A fim de proceder agrave remoccedilatildeo dos resiacuteduos de aacutecido siaacutelico existente nas cadeias de
hidratos de carbono ligadas agrave moleacutecula GC as amostras de plasma foram submetidas a uma
incubaccedilatildeo com uma soluccedilatildeo de neuraminidase Clostridium perfringens SIGMA type V 18
Uml) na proporccedilatildeo de 13 durante 18 h a 37degC acrescentando-se posteriormente aacutegua
bidestilada ateacute agrave obtenccedilatildeo de uma diluiccedilatildeo final de 14 Paralelamente procedeu-se a uma
diluiccedilatildeo das amostras com aacutegua bidestilada (19) para comparaccedilatildeo dos padrotildees de bandas
obtidos
24 - MEacuteTODOS DE SEPARACcedilAtildeO
Electroforese convencional
Nas teacutecnicas de electroforese convencional foram utilizados vaacuterios sistemas de tampatildeo
para os geacuteis e para as pontes conforme a proteiacutena em estudo
Focagem isoeleacutectrica
Os sistemas de focagem isoeleacutectrica utilizados na separaccedilatildeo de proteiacutenas foram
realizados em matrizes de poliacrilamida (T = 5 C = 3) com dimensotildees 230xl00x03mm
Os geacuteis foram aplicados sobre uma peliacutecula de suporte GELFIX (SERVA) permitindo o seu
manuseamento adequado
A adiccedilatildeo de soluccedilotildees de TEMED 10 (pv) e persulfato de amoacutenio (PSA) 10 (pv)
permitiu a polimerizaccedilatildeo do gel agrave temperatura ambiente (24 horas) ou a 37 degC durante 1 h
As separaccedilotildees por focagem isoeleacutectrica decorreram sobre placa de arrefecimento a
aproximadamente 10degC (8 - 12degC)
26
Material e Meacutetodos
HB
A separaccedilatildeo da moleacutecula de HB foi realizada por focagem isoeleacutectrica em gradiente de
pH livre segundo a teacutecnica descrita por FERRAND (1995) com algumas modificaccedilotildees
A composiccedilatildeo da soluccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo e os paracircmetros eleacutectricos utilizados estatildeo
indicados nas tabelas 241 e 242 respectivamente
Tabela 241 Soluccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo utilizada para a separaccedilatildeo da moleacutecula nativa de HB por focagem isoeleacutectrica
Componentes da soluccedilatildeo Quantidades
Acrilamida 28 (pv)
Bisacrilamida 2 (pv)
Sacarose
Anfoacutelitos 5-8 (SIGMA)
7-9 (PHARMACIA)
Aacutegua bidestilada TEMED 10 (vv)
PSA 10 (pv)
18 ml
08 ml
2 g
300 p1
300 ul
ateacute 10 ml volume final
10 ul
70 ul
Tabela 242 Paracircmetros eleacutectricos utilizados na focagem isoeleacutectrica de HB
Voltagem (V) Corrente (mA) Potecircncia (W) Tempo (T)
Preacute focagem 1500 25 1
2
3
30 min
15 min
15 min
Focagem 1500 25 15 2h 30 min
As soluccedilotildees para os eleacutectrodos foram aacutecido aspaacutertico 004 M (acircnodo) e NaOH 01 M
(caacutetodo) As amostras foram aplicadas a 15 cm do caacutetodo tendo sido inseridas com o auxiacutelio
de um aplicador de borracha silicone (SERVA)
27
Material e Meacutetodos
bull CAII
A separaccedilatildeo de CAII fez-se em gel de amido (15 pv SIGMA) conforme o descrito
por AMORIM (1983) com algumas modificaccedilotildees e ainda por focagem isoeleacutectrica em
gradiente de pH livre
Utilizam-se os seguintes sistemas tampatildeo para a separaccedilatildeo por electroforese em gel de
amido
Tampatildeo das Pontes Tris 0250 M pH = 76 Aacutecido ciacutetrico 0067 M
Tampatildeo do Gel Diluiccedilatildeo 110 do tampatildeo das pH = 76 pontes
As amostras foram inseridas em meio Sephadex G-200 (PHARMACIA) na proporccedilatildeo
de 11 As electroforeses foram realizadas em placa de arrefecimento (8degC) e com um
gradiente de potencial de 5 Vcm durante 16 h
A teacutecnica utilizada para a separaccedilatildeo de CAII por focagem isoeleacutectrica foi a descrita por
BOWLING et ai (1990) com algumas modificaccedilotildees A composiccedilatildeo da soluccedilatildeo de
polimerizaccedilatildeo e os paracircmetros eleacutectricos utilizados estatildeo indicados nas tabelas 243 e 244
respectivamente
As soluccedilotildees para os eleacutectrodos foram aacutecido aspaacutertico 004 M (acircnodo) e NaOH 01 M
(caacutetodo) As amostras foram inseridas com o auxiacutelio de um aplicador de borracha silicone
(SERVA) colocado a 15 cm do caacutetodo
28
Material e Meacutetodos
Tabela 243 Soluccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo utilizada na separaccedilatildeo de CAII por focagem isoeleacutectrica
Componentes da soluccedilatildeo
Acrilamida 28 (pv)
Bisacrilamida 2 (pv)
Sacarose
Anfoacutelitos 4-65 (PHARMACIA)
Anfoacutelitos 35-10 (PHARMACIA)
Aacutegua bidestilada TEMED 10 (vv)
PSA 10 (pv)
Quantidades 18 ml
08 ml
2 g
500 |ol
100 ul
ateacute 10 ml volume final
10 ul
70 ul
Tabela 244 Paracircmetros eleacutectricos utilizados na separaccedilatildeo de CAII por focagem isoeleacutectrica
Voltagem (V) Corrente (mA) Potecircncia (W) Tempo (T)
Preacute focagem 1500 25 1
3
5
30 min
15 min
15 min
Focagem 2500 25 8
10
12
30 min
30 min
30 min
bull PEPB
A separaccedilatildeo da PEPB foi realizada em gel de amido (15 pv SIGMA) de acordo
com a teacutecnica descrita por POVEY et ai (1972) com algumas modificaccedilotildees
29
Material e Meacutetodos
Utilizou-se o seguinte sistema tampatildeo
Tampatildeo das Pontes Tris 01 M
pH = 74 NaH2P04 01 M
Tampatildeo do Gel Diluiccedilatildeo 110 do tampatildeo das
pH = 74 pontes
As amostras satildeo inseridas em meio Sephadex G-200 (PHARMACIA) na proporccedilatildeo de
11 As electroforeses foram realizadas em placas de arrefecimento (8degC) e com um gradiente
de potencial de 5 Vcm durante 16 h
bull DIA
No caso da separaccedilatildeo de DIA a teacutecnica eacute idecircntica agrave utilizada para CAII electroforese
em gel de amido (15 pv SIGMA) conforme o descrito por AMORIM (1983) com algumas
modificaccedilotildees
bull NP MDH PGD GPJ e MPI
As separaccedilotildees das enzimas NP MDH PGD GPI e MPI fizeram-se em simultacircneo por
electroforese em gel de amido (15 pv SIGMA) conforme o descrito por AMORIM et ai
(1982) com algumas modificaccedilotildees
Utilizou-se o seguinte sistema tampatildeo
1130 M
0400 M
0020 M 0010 M
Tampatildeo das Pontes NaOH
pH = 60 Aacutecido ciacutetrico
Tampatildeo do Gel HisHCl
pH = 60 NaOH
30
Material e Meacutetodos
As amostras foram inseridas em meio Sephadex G-200 (PHARMACIA) na proporccedilatildeo
de 11 As electroforeses foram realizadas em placas de arrefecimento (8degC) e com um
gradiente de potencial de 8 Vcm durante 15 h
ALB
Nas tabelas 245 e 246 indicam-se respectivamente a composiccedilatildeo da soluccedilatildeo de
polimerizaccedilatildeo para a separaccedilatildeo de ALB por focagem isoeleacutectrica segundo a teacutecnica descrita
por ROCHA et ai (1991) com algumas modificaccedilotildees e os paracircmetros eleacutectricos
Tabela 245 Soluccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo utilizada para a separaccedilatildeo de ALB por focagem isoeleacutectrica
Componentes da soluccedilatildeo Quantidades
Acrilamida 28 (pv)
Bisacrilamida 2 (pv)
Ureia
Anfoacutelitos 5-6 (PHARMACIA)
Anfoacutelitos 5-8 (PHARMACIA)
Anfoacutelitos 6-8 (PHARMACIA)
Aacutegua bidestilada TEMED 10 (vv)
PSA 10 (pv)
18 ml
08 ml
48 g
250 ni
250 ni
125 ul
ateacute 10 ml volume final
30 ul
70 ul
Tabela 246 Paracircmetros eleacutectricos utilizados na separaccedilatildeo de ALB por focagem isoeleacutectrica
Voltagem (V) Corrente (mA) Potecircncia (W) Tempo (T)
Preacute focagem 1500 25
Focagem 1500 25
1 30 min
2 15 min
3 15 min
4 3 h
5 30 min
31
Material e Meacutetodos
As soluccedilotildees para os eleacutectrodos foram aacutecido aspaacutertico 004 M (acircnodo) e NaOH 1 M
(caacutetodo) As amostras foram aplicadas a 15 cm do caacutetodo com o auxiacutelio de um aplicador de
borracha silicone (SERVA)
TF
A separaccedilatildeo da moleacutecula de TF foi efectuada por focagem isoeleacutectrica A composiccedilatildeo
da soluccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo e os paracircmetros eleacutectricos utilizados estatildeo indicados nas tabelas
247 e 248 respectivamente
Tabela 247 Soluccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo utilizada para a separaccedilatildeo da TF por focagem isoeleacutectrica
Componentes da soluccedilatildeo Quantidades
Acrilamida 28 (pv)
Bisacrilamida 2 (pv)
Sacarose
Anfoacutelitos 35-5(LKB)
Anfoacutelitos 4-65 (PHARMACIA)
Aacutegua bidestilada
TEMED 10 (vv) PSA 10 (pv)
18 ml
08 ml
2 g
100 ul
500 ul
ateacute 10 ml volume final
30 ul
70 ul
Tabela 248 Paracircmetros eleacutectricos utilizados na separaccedilatildeo de TF por focagem isoeleacutectrica
Voltagem (V) Corrente (mA) Potecircncia (W) Tempo (T)
Preacute focagem 1500 25
Focagem 2500 25
l 20 min
2 10 min
3 10 min
8 30 min
10 30 min
12 30 min
32
Material e Meacutetodos
As soluccedilotildees para os eleacutectrodos foram de aacutecido aspaacutertico 004 M (acircnodo) e de NaOH
1 M (caacutetodo) As amostras foram aplicadas a 15 cm do caacutetodo com o auxiacutelio de um aplicador
de borracha silicone (SERVA)
GC
Nas tabelas 249 e 2410 apresenta-se respectivamente a composiccedilatildeo da soluccedilatildeo de
polimerizaccedilatildeo e os paracircmetros eleacutectricos utilizados na focagem isoeleacutectrica de GC
Tabela 249 Soluccedilatildeo de polimerizaccedilatildeo utilizada para a separaccedilatildeo da GC por focagem isoeleacutectrica
Componentes da soluccedilatildeo Quantidades
Acrilamida 28 (pv)
Bisacrilamida 2 (pv)
Sacarose
Anfoacutelitos 45-54 (PHARMACIA)
Anfoacutelitos 4-6 (LKB)
Aacutegua bidestilada TEMED 10 (vv)
PSA 10 (pv)
18 ml
08 ml
2 g
437 ul
188 (il
eacute 10 ml volume final
10 ul
70 ul
Tabela 2410 Paracircmetros eleacutectricos utilizados na separaccedilatildeo de GC por focagem isoeleacutectrica
Voltagem (V) Corrente (mA) Potecircncia (W) Tempo (T)
Preacute focagem 1500 25
Focagem 1500 25
1 30 min
2 15 min
3 15 min
4 3 h
5 30 min
33
Material e Meacutetodos
Para os eleacutectrodos foram utilizadas soluccedilotildees de aacutecido aspaacutertico 004 M (acircnodo) e de
NaOH 02 M (caacutetodo) As amostras foram inseridas com o auxiacutelio de um aplicador de
borracha silicone (SERVA) colocado a 15 cm do caacutetodo
25 - MEacuteTODOS DE DETECCcedilAtildeO
Apoacutes a separaccedilatildeo das proteiacutenas os padrotildees electroforeacuteticos foram geralmente obtidos
por detecccedilatildeo especiacutefica aproveitando a actividade cataliacutetica das enzimas Noutros casos a
revelaccedilatildeo foi feita por coloraccedilatildeo geral de proteiacutenas
bull HB
A visualizaccedilatildeo da HB foi obtida mediante coloraccedilatildeo geral de proteiacutenas segundo o
seguinte procedimento
Fixaccedilatildeo
Imersatildeo do gel numa soluccedilatildeo de aacutecido tricloroaceacutetico 125 (pv) durante 10 minutos
Coloraccedilatildeo geral de proteiacutenas
Coloraccedilatildeo com uma soluccedilatildeo de Coomassie R-250 0115 (pv) numa mistura de aacutecido
aceacuteticoetanolaacutegua destilada (42571) apoacutes aquecimento seguida de filtraccedilatildeo durante
5-10 minutos A descoloraccedilatildeo eacute feita com aacutecido aceacutetico etanol e aacutegua destilada
aquecida a cerca de 60degC ateacute se obter o contraste desejado
bull CAII
Apoacutes separaccedilatildeo por electroforese em gel de amido visualizou-se a CAII pela sua
actividade esteraacutesica adicionando-se diacetato de fluoresceiacutena (em quantidades vestigiais que
34
Material e Meacutetodos
foram previamente dissolvidas em 200 uacute de acetona) a uma soluccedilatildeo de incubaccedilatildeo tamponada
(pH = 66) Esta soluccedilatildeo de incubaccedilatildeo eacute composta por aacutecido ciacutetrico 27 mM e Na2HP04
116 mM e foi aplicada sobre o gel de amido com o auxiacutelio de papeacuteis de filtro Whatman ndegl
Em seguida incubou-se durante 30 minutos a 37degC A observaccedilatildeo das bandas de CAII (devido
agrave sua capacidade esteraacutesica) eacute feita sob luz ultravioleta
Apoacutes separaccedilatildeo por focagem isoeleacutectrica utilizou-se uma coloraccedilatildeo geral de proteiacutenas
para visualizaccedilatildeo da CAII segundo o meacutetodo descrito para a HB sem fixaccedilatildeo
bull PEPB
A detecccedilatildeo da PEPB apoacutes a separaccedilatildeo electroforeacutetica foi feita atraveacutes da aplicaccedilatildeo
sobre o gel de amido de papeacuteis de filtro Whatman ndegl embebidos numa soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo
seguindo-se uma incubaccedilatildeo de 30 minutos a 37degC
A soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo conteacutem o substrato da PEPB L-leucilglicil-glicina 0004 M
veneno de cobra da espeacutecie Agkistrodon piscivorus piscivorus 04 (pv) MTT 24 mM e
metosulfato de fenazina (PMS) 03 mM num tampatildeo de pH = 80 (Tris HC1005 M)
bull DIA
Apoacutes a separaccedilatildeo por electroforese em gel de amido a identificaccedilatildeo da DIA foi obtida
pela adiccedilatildeo de uma soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo a uma fatia do gel A incubaccedilatildeo decorreu durante 2
horas a 37degC
A soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo foi realizada em duas fases
Io - colocou-se 26-diclorofenol-indofenol (DCIP) 01 mM com um tampatildeo de
pH = 85 (Tris HC1 005M) adicionando-se agrave mistura aacutegua bidestilada ateacute perfazer
50 ml Em seguida filtrou-se a soluccedilatildeo
2o - agrave soluccedilatildeo filtrada adicionou-se MTT 03 mM e NADH 02 mM e agitou-se antes
de verter sobre a fatia de gel de amido
35
Material e Meacutetodos
bull NP
A detecccedilatildeo da enzima NP apoacutes a separaccedilatildeo por electroforese foi feita atraveacutes da
aplicaccedilatildeo sobre o gel de amido de papeacuteis de filtro Whatman ndegl embebidos com a soluccedilatildeo de
coloraccedilatildeo Em seguida incubou-se durante 15 minutos a 37degC
A soluccedilatildeo de incubaccedilatildeo conteacutem inosina 37 mM MTT 24 mM XOD 0004 Uml uma
gota de azul de Meldola (SIGMA) (10 vv em aacutegua bidestilada) e uma soluccedilatildeo de tampatildeo
de incubaccedilatildeo pH = 75 constituiacuteda por KH2P04 005 M e NaOH 004 M
bull MDH
Na detecccedilatildeo da actividade enzimaacutetica de MDH foi utilizado o meacutetodo de sandwich
apoacutes a sua separaccedilatildeo electroforeacutetica em gel de amido Em seguida incubou-se durante 15
minutos a 37degC O meacutetodo de sandwich consiste na aplicaccedilatildeo de uma fatia de gel de amido
entre duas folhas de papel de filtro Whatman ndegl embebido com a soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo
A soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo utilizada na detecccedilatildeo da MDH conteacutem NAD 1 mM MTT
2 mM e piruvato de soacutedio (quantidades vestigiais) Esta soluccedilatildeo foi feita com um tampatildeo de
incubaccedilatildeo pH = 74 constituiacutedo por aacutecido maacutelico 0222 M Tris 050 M e MgCl2 002 M
bull PGP
A detecccedilatildeo da actividade enzimaacutetica de PGD foi feita pelo meacutetodo de sandwich apoacutes a
sua separaccedilatildeo electroforeacutetica em gel de amido
A soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo conteacutem quantidades vestigiais de aacutecido 6-fosfoglucoacutenico
NADP MTT e uma gota de azul de Meldola (05 pv em aacutegua bidestilada) dissolvidos num
tampatildeo de pH = 74 constituiacutedo por Tris 01 M HisHCl 01 M Imidazol 0015 M e MgCl2
0005 M
36
Material e Meacutetodos
bull GPI
A detecccedilatildeo da actividade enzimaacutetica de GPI foi feita pelo meacutetodo de sandwich apoacutes a
sua separaccedilatildeo electroforeacutetica em gel de amido
A soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo conteacutem frutose-6-fosfato 55 mM NADP 22 mM MTT
4 mM desidrogenase da glucose-6-fosfato (G6PD) 14 Uml e uma gota de azul de Meldola
(05 pv em aacutegua bidestilada) dissolvidos num tampatildeo de pH = 74 constituiacutedo por Tris 01
M HisHCl 01 M Imidazol 0015 M e MgCl2 0005 M
bull MPI
Detectou-se a actividade enzimaacutetica de MPI pelo meacutetodo de sandwich apoacutes a sua
separaccedilatildeo electroforeacutetica em gel de amido
A soluccedilatildeo de coloraccedilatildeo conteacutem manose-6-fosfato 42 mM NADP 13 mM MTT
24 mM e uma gota de azul de Meldola (05 pv em aacutegua bidestilada) dissolvidos num
tampatildeo de pH = 74 constituiacutedo por Tris 01 M HisHCl 01 M Imidazol 0015 M e MgCl2
0005 M Por fim adicionaram-se as enzimas isomerase da glucose-6-fosfato (GPI) 3 Uml e
desidrogenase da glucose-6-fosfato (G6PD) 5 Uml
bull ALBeTF
A detecccedilatildeo de ALB e de TF foi efectuada atraveacutes do meacutetodo de coloraccedilatildeo geral de
proteiacutenas descrito para a HB utilizando-se Coomasie R-250 sem fixaccedilatildeo
bull GCcedil
A visualizaccedilatildeo de GC efectuou-se por detecccedilatildeo imunoenzimaacutetica apoacutes transferecircncia da
proteiacutena para uma membrana de nitrocelulose (045 pm SCHLEICHER amp SCHULL)
segundo a teacutecnica descrita por FERRAND (1995)
37
Material e Meacutetodos
Apoacutes esse processo de transferecircncia as membranas de nitrocelulose foram lavadas 3
vezes (15 minutos) numa soluccedilatildeo de Tween 20 (MERCK) 0025 (vv) em soro fisioloacutegico
tamponado com fosfato (PBS Na2HP04 50 mM KH2P04 18mM NaCl 147 mM pH = 71) e
bloqueadas numa soluccedilatildeo de leite em poacute magro (5 pv em PBS) durante 18 h com agitaccedilatildeo
permanente e agrave temperatura ambiente
Depois da primeira lavagem aplicou-se o antisoro (anti-GC humana ATAB 81936)
diluiacutedo 1170 em PBS com 1 (pv) de albumina seacuterica bovina (SIGMA) durante 1 h agrave
temperatura ambiente
Repetiu-se novamente a lavagem segundo o processo jaacute referido seguindo-se a
aplicaccedilatildeo do segundo antisoro (anticorpos contra imunoglobulinas caprinas desenvolvidos em
coelho e conjugados com uma peroxidase ATAB 83806) diluiacutedo 1600 em PBS com 1
(pv) de albumina seacuterica bovina (SIGMA) durante 1 h agrave temperatura ambiente
Depois de duas lavagens (5 minutos) com Tween 20PBS procedeu-se agrave detecccedilatildeo da
GC com uma soluccedilatildeo de 9-amino-2-etilcarbazol 004 (pv) e de metanol 20 (vv) em PBS
As bandas correspondentes agrave actividade peroxidaacutesica aparecem rapidamente bloqueando-se a
reacccedilatildeo com aacutegua bidestilada
26 - MEacuteTODOS DE CAacuteLCULO
As frequecircncias geacutenicas foram calculadas por contagem directa de genes a partir da
distribuiccedilatildeo fenotiacutepica obtida
O caacutelculo dos valores de heterozigotia meacutedia (H) da proporccedilatildeo de loci polimoacuterficos
(P) do nuacutemero meacutedio de alelos por locus (ria) estatiacutesticas F e frequecircncias fenotiacutepicas
esperadas segundo o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg foi efectuado com a utilizaccedilatildeo do
programa BIOSYS versatildeo 17 (SWOFFORD amp SELANDER 1989)
O caacutelculo de distacircncias geneacuteticas e obtenccedilatildeo de dendrogramas foi efectuado com o
programa PHYLIP versatildeo 35 (FELSENTEIN 1993)
38
Resultados e Discussatildeo
3 - RESULTADOS E DISCUSSAtildeO
31 - ANAacuteLISE DOS MEacuteTODOS DE SEPARACcedilAtildeO
De entre os 12 loci estudados neste trabalho detectaram-se 5 monomoacuterficos
(PEPB DIA GPI MDH e PGD) e 7 polimoacuterficos (HB CAII NP MPI ALB TF e GC)
Loci monomoacuterficos
bull PEPB
A utilizaccedilatildeo de teacutecnicas de electroforese em gel de amido permitiu a detecccedilatildeo de
um soacute fenoacutetipo (figura 311) correspondente a indiviacuteduos homozigoacuteticos para o alelo
PEPB2 descrito por DEL LAMA et ai (1992) No entanto na raccedila Minhota detectou-se
um indiviacuteduo heterozigoacutetico
O fenoacutetipo PEPB 2 apresenta um padratildeo com duas bandas uma de grande
intensidade e outra secundaacuteria mais anoacutedica de menor intensidade No indiviacuteduo
heterozigoacutetico 2-1 (natildeo representado) observou-se um padratildeo de trecircs bandas sendo a
terceira mais anoacutedica e menos intensa
A quase inexistecircncia de PEPB1 nas raccedilas estudadas estaacute de acordo com o referido
em DEL LAMA et ai (1992) que sugere a fixaccedilatildeo de PEPB2 na maior parte das
populaccedilotildees de bovinos de origem europeia (com excepccedilatildeo das raccedilas italianas Marchigiana
e Chianina)
39
Resultados e Discussatildeo
+
Figura 311 Fenoacutetipos de PEPB observados por electroforese convencional em gel de amido
bull DIA
Os resultados obtidos para a enzima DIA revelaram ausecircncia de polimorfismo
electroforeacutetico (figura 312) Resultados semelhantes foram tambeacutem obtidos em vaacuterias
raccedilas autoacutectones espanholas (GONZALEZ et ai 1987 IGLESIAS 1989 ARRANZ et ai
1992)
MAKAVEEV (1979 in IGLESIAS 1989) detectou polimorfismo desta enzima em
eritroacutecitos de buacutefalos da Bulgaacuteria e nas raccedilas bovinas Frisia e Simmental descrevendo dois
alelos codominantes DIAA e DIAB
Figura 312 Padratildeo de DIA observado por electroforese convencional em gel de amido
40
Resultados e Discussatildeo
Natildeo se detectou variaccedilatildeo electroforeacutetica para o locus GPI Estes resultados natildeo se
podem comparar com os obtidos noutras raccedilas por natildeo ter sido possiacutevel consultar outros
trabalhos onde se descrevesse variaccedilatildeo do locus GPI em gado bovino
A figura 313 apresenta o padratildeo obtido para esta enzima observando-se trecircs
bandas duas com grande intensidade e uma banda mais anoacutedica de menor intensidade
Figura 313 Padratildeo de GPI obtido em hemolisados por electroforese convencional em gel de amido
bull MDH
A enzima MDH revelou-se monomoacuterfiacuteca Este resultado eacute concordante com outros
estudos (ARRANZ et ai 1992)
Na figura 314 observa-se o padratildeo de bandas detectado por electroforese
convencional em gel de amido
Figura 314 Padratildeo de MDH observado por electroforese convencional em gel de amido
41
Resultados e Discussatildeo
bull PGD
A enzima PGD revelou-se monomoacuterfica para as raccedilas Barrosatilde e Minhota tambeacutem
neste caso natildeo se encontrou qualquer referecircncia bibliograacutefica relativa a um possiacutevel
polimorfismo deste locus em gado bovino
Na figura 315 observa-se o padratildeo obtido para esta enzima Em amostras
armazenadas por um longo periacuteodo de tempo detectaram-se duas bandas sendo a mais
anoacutedica a que revela menor intensidade as amostras mais recentes apresentam um padratildeo
electroforeacutetico com uma soacute banda
Figura 315 Padratildeo de PGD observado por electroforese convencional em gel de amido
Loci polimoacuterficos
bull HB
A electroforese convencional natildeo permite discriminar os electromorfos de HB No
entanto a utilizaccedilatildeo de sistemas de focagem isoeleacutectrica conduz agrave detecccedilatildeo de
polimorfismo nesta proteiacutena observando-se dois fenoacutetipos HB A e HB AB
Na figura 316 observa-se o padratildeo electroforeacutetico desta moleacutecula resultante da
expressatildeo de dois alelos codominantes HBA e HBB Resultados idecircnticos estatildeo
descritos em raccedilas bovinas da Peniacutensulas Ibeacuterica (VICENTE 1978 KiDD et ai 1980
IGLESIAS 1989)
42
Resultados e Discussatildeo
+ -HBB
HBA
AB AB A A
Figura 316 Separaccedilatildeo de hemoglobina nativa por focagem isoeleacutectrica
bull poundAH
A utilizaccedilatildeo de electroforese em gel de amido e focagem isoeleacutectrica permitiu
identificar trecircs fenoacutetipos CAII F CAII FS e CAII S atribuiacutedos agrave expressatildeo de dois alelos
codominantes CAF e CAS (figuras 317 e 318) Poreacutem a separaccedilatildeo por electroforese em
gel de amido implica alguma morosidade (tempos de corrida muito longos) e em amostras
coaguladas o erro de leitura pode ser superior a 20 Estas dificuldades satildeo minimizadas
quando se recorre a focagem isoeleacutectrica
Assim a separaccedilatildeo da enzima CAII por focagem isoeleacutectrica oferece vaacuterias vantagens
nomeadamente
bull rapidez e simplicidade de execuccedilatildeo
bull utilizaccedilatildeo de pequenas quantidades de material bioloacutegico
bull maior nuacutemero de amostras fenotipadas por corrida
bull possibilidade de utilizaccedilatildeo de amostras coaguladas
43
Resultados e Discussatildeo
F F F S FS FS F S FS
Figura 317 Fenoacutetipos de CAII observados sob luz ultravioleta apoacutes separaccedilatildeo por electroforese convencional em gel de amido e coloraccedilatildeo com diacetato de fluoresceina
CAIIF
| CAIIS
Figura 318 Fenoacutetipos de CAII observados por focagem isoeleacutectrica apoacutes coloraccedilatildeo geral de proteiacutenas
bull NP
A expressatildeo fenotiacutepica de NP resulta das combinaccedilotildees possiacuteveis entre um alelo
dominante NPH e um recessivo NPL (ANSAY 1973) Este facto implica que apenas em
presenccedila do feno tipo NP L eacute possiacutevel fazer corresponder um genoacutetipo (jaacute que o fenoacutetipo NP H
pode corresponder aos genoacutetipos HH e HL e o fenoacutetipo NP L corresponde ao genoacutetipo LL)
Na figura 319 apresenta-se o padratildeo obtido para a proteiacutena apoacutes separaccedilatildeo
electroforeacutetica em gel de amido
44
+
w
FS FS ]
Resultados e Discussatildeo
H L L H L L
Figura 319 Fenoacutetipos de NP detectados por electroforese convencional em gel de amido
bull MPI
Na raccedila Minhota detectaram-se quatro fenoacutetipos MPI AB MPI B MPI BC e MPI C
anteriormente descritos por ANSAY (1973) em bovinos na raccedila Barrosatilde apenas se observam
os trecircs uacuteltimos fenoacutetipos De acordo com o mesmo autor os fenoacutetipos encontrados nesta raccedila
resultam da combinaccedilatildeo de dois alelos codominantes MPIB e MPPC enquanto que MPIA
aparece na raccedila Minhota com uma frequecircncia reduzida
Como se pode observar pela anaacutelise da figura 3110 MPIA aparece como o alelo
mais anoacutedico MPIC como o mais catoacutedico e o alelo mais frequente MPIB situa-se numa
posiccedilatildeo intermeacutedia em relaccedilatildeo aos anteriores Contudo a intensidade das bandas eacute muito
fraca tornando-se quase imperceptiacutevel em alguns casos Esta grande dificuldade em obter um
contraste de bandas adequado mesmo apoacutes longos periacuteodos de incubaccedilatildeo a 37degC poderaacute
eventualmente levar a uma incorrecta interpretaccedilatildeo dos fenoacutetipos Assim a utilizaccedilatildeo de
sistemas de focagem isoeleacutectrica na determinaccedilatildeo destes fenoacutetipos seria aconselhaacutevel a fim
de verificar os resultados obtidos por electroforese convencional
45
Resultados e Discussatildeo
Figura 3110 Fenoacutetipos de MPI observados por electroforese convencional em gel de amido
bull ALB
A separaccedilatildeo por focagem isoeleacutectrica permitiu detectar polimorfismo em ALB Cada
indiviacuteduo homozigoacutetico aparece com trecircs bandas duas de maior intensidade e uma mais
aciacutedica com menor intensidade os indiviacuteduos heterozigoacuteticos podem apresentar ateacute seis
bandas
Esta heterogeneidade nos padrotildees de ALB tem sido interpretada como o resultado da
capacidade desta proteiacutena se ligar a vaacuterias substacircncias diferentes (FERRAND 1995) Com a
inclusatildeo de ureia (8M) na matriz de separaccedilatildeo reagente que provoca a desnaturaccedilatildeo da
proteiacutena levando a uma alteraccedilatildeo do seu pi para uma zona mais baacutesica do gradiente
conseguem-se obter padrotildees de bandas mais simples e mais definidos (KAWAGUCHI 1973
FERRAND 1995)
Na figura 3111 apresentam-se os padrotildees observados que foram interpretados como
sendo determinados por trecircs alelos codominantes ALBA ALBB e ALBV
GAHNE et ai (1977) e IGLESIAS (1989) detectaram por electroforese em gel de
poliacrilamida e de amido respectivamente dois variantes em gado bovino ALBA e
ALBB A utilizaccedilatildeo de focagem isoeleacutectrica veio confirmar a existecircncia destes dois alelos e
acrescentar um terceiro designado por ALBV com uma mobilidade mais aciacutedico do que
ALBA
46
Resultados e Discussatildeo
A B A B A B B B A B A G
Figura 3111 Fenoacutetipos de ALB determinados em amostras de plasma por focagem isoeleacutectrica na presenccedila de ureia 8M
ARRANZ et ai (1992) revelaram a existecircncia de um outro variante (ALBD) com
mobilidade electroforeacutetica intermeacutedia entre ALBA e ALBB ainda natildeo descrito em
nenhuma raccedila autoacutectone espanhola Este alelo poderaacute corresponder ao alelo ALBV
encontrado neste trabalho apesar de apresentar um pi mais aacutecidico do que ALBA (ARRANZ
comunicaccedilatildeo pessoal)
Desta forma a teacutecnica de separaccedilatildeo por focagem isoeleacutectrica provou ser eficaz na
separaccedilatildeo dos variantes de ALB tal como jaacute foi demonstrado no gato (BELL et ai 1994) na
ovelha (ERHARDT amp SIMIANER 1993) e no coelho (FERRAND amp ROCHA 1992)
bull TF
A transferrina eacute um dos marcadores mais importantes no estudo e caracterizaccedilatildeo
geneacutetica de raccedilas bovinas devido ao seu elevado polimorfismo No entanto a sua fenotipagem
natildeo eacute simples existindo frequentemente problemas de resoluccedilatildeo e de separaccedilatildeo das bandas
(IGLESIAS 1989)
A fim de averiguar qual a melhor forma de separar os diferentes produtos geacutenicos
descritos no locus TF testaram-se vaacuterios sistemas electroforeacuteticos em geacuteis de agarose numa
vasta gama de sistemas tampatildeo Esta teacutecnica natildeo ofereceu resultados satisfatoacuterios pelo que se
passou agrave separaccedilatildeo da TF por focagem isoeleacutectrica recorrendo a matrizes de poliacrilamida
47
Resultados e Discussatildeo
com diferentes concentraccedilotildees de ureia (6M e 8M) tambeacutem neste caso natildeo se conseguiram
resultados positivos
Este tipo de dificuldades encontradas na fenotipagem da TF por focagem isoeleacutectrica
tinham jaacute sido descritos noutras espeacutecies nomeadamente na cabra (ERHARDT 1986) e no
coelho (FERRAND 1995) No entanto TSUJI et ai (1989) demostraram ser possiacutevel fenotipar
esta proteiacutena em bovinos por focagem isoeleacutectrica sem grandes problemas e sem qualquer
aditivo na matriz de poliacrilamida
Desta forma a utilizaccedilatildeo de uma teacutecnica de focagem isoeleacutectrica com um gradiente de
pH 35-65 reforccedilado em 40-65 permitiu separar os produtos geacutenicos do locus TF Contudo
os padrotildees obtidos nem sempre eram definidos tornando-se dificilmente interpretaacuteveis
Na tentativa de melhorar os padrotildees de resoluccedilatildeo e de verificar se a variaccedilatildeo detectada
natildeo resultava de diferenccedilas no estado feacuterrico da moleacutecula de TF ou ainda da existecircncia de
aacutecidos siaacutelicos ligados agrave moleacutecula procedeu-se agrave sua separaccedilatildeo apoacutes vaacuterios tratamentos das
amostras
A remoccedilatildeo dos aacutecidos siaacutelicos atraveacutes do tratamento das amostras com neuraminidase
natildeo permitiu a obtenccedilatildeo de bandas definidas este tratamento natildeo altera significativamente o
padratildeo das bandas de TF de bovinos como jaacute tinha sido descrito por PENHALLOU et ai
(1991)
A obtenccedilatildeo de TF no estado apofeacuterrico foi conseguida submetendo as amostras a um
tratamento com EDTA-dissoacutedico Neste caso observa-se que apoTF apresenta uma
mobilidade menor e um padratildeo de bandas mais simples mas ainda sem uma definiccedilatildeo
adequada
A forma Fe2TF foi obtida mediante vaacuterios tratamentos com dadores de Fe (ver capiacutetulo
Material e Meacutetodos) Os resultados soacute se mostraram satisfatoacuterios atraveacutes da saturaccedilatildeo da
moleacutecula de TF com uma soluccedilatildeo de sulfato de amoacutenio feacuterrico provavelmente por causar uma
maior estabilidade da moleacutecula ao longo da sua separaccedilatildeo por focagem isoeleacutectrica com
elevadas voltagens pois segundo WELCHS (1990) a forma difeacuterrica da transferrina eacute mais
resistente agrave desnaturaccedilatildeo e ao calor do que a forma apoTF
48
Resultados e Discussatildeo
Estatildeo descritos pelo menos oito alelos no locus TF TFAl TFA2 TFB TFD1
TFD2 TFE TFF e TFG os mais comuns no gado europeu (Bos taurus) satildeo TFA
TFD1 TFD2 e TFE (JAMIESON 1965) No gado asiaacutetico e africano (Bos indicus) ocorrem
aleacutem das formas anteriores os alelos TFB e TFF
Na figura 3112 apresenta-se o proteinograma obtido com a utilizaccedilatildeo de amostras
saturadas com Fe Esta teacutecnica permitiu a separaccedilatildeo de TFD em TFD1 e TFD2 e a
detecccedilatildeo de todos os outros fenoacutetipos descritos em bovinos europeus Assim observaram-se
quatro alelos codominantes TFA TFD1 TFD2 e TFE
A expressatildeo fenotiacutepica dos alelos em homozigotia caracteriza-se pela presenccedila de dois
dupletos de bandas aparecendo a banda mais aciacutedica de cada dupleto com intensidade mais
fraca Os indiviacuteduos herozigoacuteticos podem apresentar ateacute oito bandas
Figura 3112 Fenoacutetipos de TF determinados por focagem isoeleacutectrica apartir de amostras saturadas com uma soluccedilatildeo de sulfato de amoacutenio feacuterrico
IGLESIAS (1989) detectou TFA e TFD nas cinco raccedilas de bovinos da Galiza o
variante TFE na raccedila Cachena espanhola e um outro variante raro TFR com mobilidade
mais lenta na raccedila Rubia Galega
bull QQ
A GC eacute uma proteiacutena plasmaacutetica que demonstra um elevado grau de heterogeneidade
geneacutetica em mamiacuteferos (FERRAND 1995)
A separaccedilatildeo de GC em focagem isoeleacutectrica seguida da utilizaccedilatildeo de immunoblotting
melhorou de forma consideraacutevel a capacidade de investigar a variaccedilatildeo desta proteiacutena em
49
Resultados e Discussatildeo
diferentes espeacutecies (JUNEJA et ai 1987 PENEDO amp JUNEJA 1989 STRATIL et ai 1990
KALAacuteB et ai 1990 STERN et ai 1992 VANKAN amp BELL 1992 FERRAND 1995)
Nas figuras 3113 e 3114 apresentam-se alguns dos fenoacutetipos obtidos na separaccedilatildeo
da GC por focagem isoeleacutectrica Verifica-se que em amostras tratadas com neuraminidase o
padratildeo de bandas se apresenta mais simplificado surgindo no entanto duas bandas (uma
mais baacutesica e uma mais aciacutedica) de natureza desconhecida Os padrotildees observados foram
interpretados como sendo determinados por dois alelos GCF e GCS
mdashGCF
S F S FS S FS F F S FS 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Figura 3113 Fenoacutetipos de GC determinados por focagem isoeleacutectrica amostras 1 8 9 e 10 tratadas com neuraminidase amostras 2 a 7 diluiacutedas em aacutegua bidestilada
S1 $ l S- -
FS S S S F S FS S FS F S
Figura 3114 Fenoacutetipos de GC determinados em amostras de plasma tratados com neuraminidase apoacutes focagem isoeleacutectrica
Nota-se a existecircncia de dois alelos codominantes GCF e GCS sendo o segundo
mais aciacutedico do que o primeiro
50
Resultados e Discussatildeo
32 - ANAacuteLISE FAMILIAR
A realizaccedilatildeo da anaacutelise familiar relativo ao conjunto de loci polimoacuterficos estudados
observa-se no estudo de 27 pares matildeefilho Esta situaccedilatildeo resulta da grande dificuldade
existente na obtenccedilatildeo de informaccedilatildeo sobre os machos
Os resultados apresentam-se nas tabelas 321 a 326 natildeo foi possiacutevel testar o
equiliacutebrio de Hardy-Weinberg devido ao reduzido tamanho da amostra bem como ao facto de
vaacuterios alelos ocorrerem em baixa frequecircncia
Refira-se que natildeo foi detectado qualquer caso de exclusatildeo matildeefilho
Tabela 321 Sistema CAII Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica em 27 pares matildeefilho Os valores esperados segundo o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg estatildeo indicados entre parecircntesis
Total
4 (32) 17
(122) 6
(116) 27
Tabela 322 Sistema NP Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica em 27 pares matildeefilho Os valores esperados segundo o equiliacutebrio de Hardy--Weinberg estatildeo indicados entre parecircntesis
Total
14
(114)
13
(156)
27
^ ^ ^ Filho
Matildee - ^ F
Fenoacutetipos
F f~ (11)
FS 2
(21)
S
Total 3
Fenoacutetipos
FS S
3
(21)
10 5
(61) (40)
1 5
(40) (76)
14 10
- v ^ ^ Filho Fenoacutetipos
Matildee - ^ H L
Fenoacutetipos
H 10 4
(77) (37)
L 5 8
(37) (119)
Total 15 12
51
Resultados e Discussatildeo
Tabela 323 Sistema MPI Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica em 26 pares matildeefilho Os valores esperados segundo o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg estatildeo indicados entre parecircntesis
^ Filho Fenoacutetipos Total
Matildee ^ ~ ^ A AB AC B BC c Fenoacutetipos
A 0 0 0 - - - 0
(00) (00) (00) (00)
AB 0 0 0 0 0 - 0
(00) (00) (00) (00) (00) (00)
AC 0 0 0 - 0 0 0
(00) (00) (00) (00) (00) (00)
B - 0 - 24 1 - 25
(00) (242) (06) (248)
BC - 0 0 1 0 0 1
(00) (00) (06) (06) (00) (12)
C - - 0 - 0 0 0
(00) (00) (00) (00)
Total 0 0 0 25 1 0 26
Tabela 324 Sistema ALB Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica em 27 pares matildeefilho Os valores esperados segundo o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg estatildeo indicados entre parecircntesis
^ ^ Filho Fenoacutetipos Total
M atilde e ^ ^ - s ^ ^ A AB AV B BV V
Fenoacutetipos
A 24 2 0 - - - 26
(251) (04) (02) (257)
AB 0 0 0 0 0 -
0
(04) (04) (00) (00) (00) (08)
AG 1 0 0 - 0 0 1
(02) (00) (02) (00) (00) (04)
B - 0 - 0 0 - 0
(00) (00) (00) (00)
BG - 0 0 0 0 0 0
(00) (00) (00) (00) (00) (00)
G - - 0 - 0 0 0
(00) (00) (00) (00)
Total 25 2 0 0 0 0 27
52
Resultados e Discussatildeo
Tabela 325 Sistema TF Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica em 27 pares matildeefilho Os valores esperados segundo o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg estatildeo indicados entre parecircntesis
Filho Fenoacutetipos Total
Matildee ^ A ADI AD2 AE Dl D1D2 DIE D2 D2E E
Fenoacutetipos
A 6
(51)
1
(14)
4
(21)
1
(03)
12
(89)
ADI 1 2 0 0 0 0 0 - - - 3
(14) (24) (06) (01) (04) (06) (01) (56)
AD2 2 0 5 0 - 0 - 2 0 - 9
(21) (06) (36) (01) (06) (08) (01) (79)
AE 0 0 0 0 - - 0 - 0 0 0
(03) (01) (01) (06) (01) (01) (00) (13) Dl 0
(04) 1
(01)
1
(02)
0
(00)
- 2
(07)
D1D2 - 0 1 - 0 0 0 0 0 - 1
(06) (06) (02) (10) (00) (02) (00) (26) DIE - 0 - 0 0 0 0 - 0 0 0
(01) (01) (00) (00) (02) (00) (00) (04)
D2 0
(08) 0
(02)
0
(03)
0
(01)
- 0
(14) D2E - - 0 0 - 0 0 0 0 0 0
(01) (01) (00) (00) (01) (02) (00) (05) E 0
(00) 0
(00)
0
(00)
0
(00)
0
(00)
Total 9 3 10 1 1 1 0 2 0 0 27
Tabela 326 Sistema GC Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica em 27 pares matildeefilho Os valores esperados segundo o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg estatildeo indicados entre parecircntesis
- - ^ F i l h o Fenoacutetipos Total
Matildee ^ ^ 1 2-1 2
Fenoacutetipos
1 17 2 19
(156) (31) (187)
2-1 5 2 0 7
(31) (38) (06) (75)
2 _ 1 0 1
(06) (01) (07)
Total 22 5 0 27
53
Resultados e Discussatildeo
33 - ANAacuteLISE POPULACIONAL LOCUS A LOCUS
Neste capiacutetulo faz-se a anaacutelise populacional dos loci polimoacuterficos e ainda dos loci
PEPB e DIA para os quais natildeo se detectou variaccedilatildeo na raccedila Barrosatilde A sua inclusatildeo justifica-
-se pelo facto de serem polimoacuterficos noutras raccedilas bovinas ou em espeacutecies aparentadas
bull PEPB
O locus PEPB revelou-se monomoacuterfico nas trecircs populaccedilotildees de bovinos de raccedila
Barrosatilde e Minhota tendo sido detectado um uacutenico produto geacutenico PEPB2 (observado um
indiviacuteduo heterozigoacutetico da raccedila Minhota) No entanto este locus eacute referido como polimoacuterfico
em raccedilas bovinas criadas no Brasil onde se detectaram dois alelos codominantes PEPB1 e
PEPB2 (DEL LAMA et ai 1992)
O alelo PEPB2 estaacute fixado nas raccedilas de origem europeia incluindo as estudadas neste
trabalho excepto nas raccedilas italianas Marchigiana e Chianina nas quais PEPB1 apresenta
frequecircncias geacutenicas entre 011 e 014 (tabela 331)
Tabela 331 Frequecircncias geacutenicas de PEPB em vaacuterias raccedilas bovinas
N
Frequecircncias geacutenicas N PEPB1 PEPB2 Referecircncia
Barrosatilde inscrita 141 - 100 Este trabalho
Barrosatilde natildeo inscrita 153 - 100 t i
Minhota 62 001 plusmn0003 099 plusmn 0003 ec
Blonde dAquitaine 13 - 100 DEL LAMAetal 1992)
Charolesa 118 - 100 laquo
Chianina 83 014 plusmn003 086 plusmn 003 t t
Hereford 79 - 100 et
Frisia 125 - 100 t t
Jersey 139 - 100
Limousine 24 - 100
Marchigiana 85 011 plusmn002 089 plusmn 002 te
Simmental 75 - 100 t t
54
Resultados e Discussatildeo
bull DIA
Pela anaacutelise da tabela 332 verifica-se natildeo existir variaccedilatildeo geneacutetica neste locus nas
raccedilas bovinas apresentadas estando fixado o alelo DIAS os resultados obtidos estatildeo de
acordo com os jaacute publicados por outros autores (GONZALEZ et ai 1987 IGLESIAS 1989) Por
outro lado nas populaccedilotildees de buacutefalos ocorre um segundo alelo DIAF com frequecircncias
entre 019 e 021
Tabela 332 Frequecircncias geacutenicas de DIA em vaacuterias populaccedilotildees de raccedilas bovinas e buacutefalos
Frequecircncias geacutenicas
N DIAF DIAS Referecircncia
Portugal
Barrosatilde inscrita 141
Barrosatilde natildeo inscrita 153
Minhota 62
Espanha
Cachena 71
Caldelana 60
Frieiresa 33
Limiana 39
Rubia Gallega 168
Vianesa 40
Sayaguesa (Zamora) 147
Morucha (Salamanca) 101
Alistana Sanabresa 157
Blanca Cacerena 62
Caacuterdena Andaluza 25
Asturiana de los Vallegraves 127
Asturiana de la Montana 106
Bulgaacuteria
Buacutefalo 122
Murrah (Buacutefalo) 51
raquo IGLESIAS (1989)
- 100 Este trabalho
- 100
- 100 a
- 100 IGLESIAS (1989)
- 100
- 100
- 100
- 100
- 100
- 100 GONZALEZ et al (19
- 100
- 100 st
- 100 st
- 100
- 100
- 100
019 + 00 081 plusmn00 MAKAVEEV(1984
021 plusmn00 079 plusmn 00 laquo
55
Resultados e Discussatildeo
bull HB
Os resultados obtidos no estudo de HB permitiram distinguir dois fenoacutetipos definidos
por dois alelos HBA e HBB (tabela 333)
Tabela 333 Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica de HB em populaccedilotildees das raccedilas Barrosatilde e Minhota Os valores esperados de acordo com o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg estatildeo indicados entre parecircntesis
Fenoacutetipos N HBA HBAB HBB
Barrosatilde inscrita 141 141
Barrosatilde natildeo inscrita 153 153
Minhota 62 56 6 0
(561) (58) (01)
As frequecircncias geacutenicas das raccedilas estudadas bem como outras jaacute publicadas referentes a
vaacuterias raccedilas bovinas europeias e a duas espeacutecies de buacutefalos encontram-se discriminadas na
tabela 334
A elevada frequecircncia do alelo HBA nas raccedilas estudadas (fixado na raccedila Barrosatilde)
situam-nas juntamente com outras raccedilas bovinas do centro e sul da Europa onde este alelo
ocorre com frequecircncias entre 080-098 (VICENTE 1978) Nas restantes raccedilas europeias
HBA ocorre com uma ampla margem de variaccedilatildeo (038 - 100) apresentando-se quase
sempre como o alelo mais frequente
No caso dos buacutefalos observa-se uma inversatildeo nos valores das frequecircncias geacutenicas
sendo o alelo HBB o mais frequente
A presenccedila de HBB nos bovinos europeus apesar de em baixa frequecircncia pode ser
indicativo de uma origem a partir de raccedilas asiaacuteticas ou africanas jaacute que eacute nestes continentes
que este alelo ocorre com frequecircncia mais elevadas as frequecircncias geacutenicas mais elevadas estatildeo
descritas no gado zebu da Aacutefrica (BRAEND 1971 VICENTE 1978)
56
Resultados e Discussatildeo
Tabela 334 Frequecircncias geacutenicas de HB em vaacuterias populaccedilotildees de raccedilas bovinas e buacutefalos
N
Frequecircncias geacutenicas
N HBA HBB Referecircncia
Portugal
Barrosatilde inscrita 141 100 - Este trabalho
Barrosatilde natildeo inscrita 153 100 -
Minhota 62 095 plusmn 002 005 plusmn 002
Mertolenga 147 093 plusmn 002 007 plusmn 002 KTOD et ai (1980)
Alentejana 155 096 plusmn 001 004 plusmn001 IacuteIacute
Mirandesa 107 099+001 001 plusmn001 NOBRE (S data)
Espanha
Cachena 71 091 + 002 009 plusmn 002 IGLESIAS (1989)
Caldelana 60 097 plusmn 002 003 plusmn 002
Frieiresa 33 095 plusmn 003 005 plusmn 003
Limiana 39 090 plusmn 003 010 plusmn003
Rubia Gallega 168 093 plusmn 001 007 plusmn001 ce
Vianesa 40 098 plusmn 002 002 plusmn002
Sayaguesa (Zamora) 147 083 plusmn002 017 plusmn002 GONZALEZ et al ( 1987)
Morucha (Salamanca) 101 084 plusmn 003 016 plusmn003 ce
Alistana Sanabresa 157 099 plusmn 001 001 plusmn001
Blanca Cacerefia 62 071 plusmn 004 029 plusmn 004 laquo
Caacuterdena Andaluza 25 096 plusmn 003 004 plusmn 003 IacuteIacute
Asturiana de los Vallegraves 127 091 plusmn002 009 plusmn002
Pirenaica 383 084 plusmn 001 016 plusmn001 VICENTE (1978)
Tudanca 42 065 plusmn 005 035 plusmn 005 laquo
Morena del N O 25 100 -
Frisona 97 100 - laquo
Asturiana de la Montaria 106 079+003 021 plusmn003
De Lidia 124 079 plusmn 003 021 plusmn003 KlDDeacutetal (1980)
Retinta 164 081 plusmn002 019 plusmn002
Itaacutelia
Chianina 264 096 plusmn 001 004 plusmn 001 CARENZiera (1970)
Marchigiana 112 099 plusmn001 001 plusmn001
Bulgaacuteria
Sofia Brown 173 089 plusmn 002 011 plusmn002 MAKAVEEV (1970)
Buacutefalo 77 009 plusmn 002 091 plusmn002 MAKAVEEV(1984)
Murrah (Buacutefalo) 51 015 plusmn004 085 plusmn 004 ce
G Bretanha
Jersey 467 038 plusmn 002 062 plusmn 002 LARSENefa (1974)
in IGLESIAS (1989)
57
Resultados e Discussatildeo
A frequecircncia obtida para HBB na raccedila Minhota (005) aproxima-a das raccedilas do sul da
Europa onde este alelo ocorre com uma frequecircncia de aproximadamente 01 Por outro lado a
completa ausecircncia de HBB na raccedila Barrosatilde eacute um resultado interessante mas para o qual natildeo
eacute possiacutevel fornecer actualmente uma explicaccedilatildeo satisfatoacuteria
CAII
A distribuiccedilatildeo dos fenoacutetipos observados para o locus CAII apresenta-se na tabela
335
Tabela 335 Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica de CAU em populaccedilotildees das raccedilas Barrosatilde e Minhota Entre parecircntesis indicam-se os valores esperados de acordo com o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg
Fenoacutetipos N CA F CAFS CAS
Barrosatilde inscrita 141 17 58 66
(149) (622) (639)
Barrosatilde natildeo inscrita 153 20 71 62
(200) (710) (620)
Minhota 62 3 13 46
(14) (162) (444)
x2
0651 1 0420
0000 1 0995
Os valores do teste de 2 nas populaccedilotildees de raccedila Barrosatilde demonstram natildeo haver
desvios significativos ao equiliacutebrio de Hardy-Weinberg apesar de se observar um ligeiro
excesso de homozigoacuteticos F na populaccedilatildeo de raccedila Barrosatilde (inscrita) Para a raccedila Minhota natildeo
foi possiacutevel testar o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg
Na tabela 336 apresentam-se as frequecircncias geacutenicas de CAII nas populaccedilotildees
estudadas bem como as publicadas por outros autores
O locus CAII apresenta-se polimoacuterfico na maior parte das populaccedilotildees bovinas
europeias sendo o alelo CAIIS o que ocorre com frequecircncia mais elevada
58
Resultados e Discussatildeo
Tabela 336 Frequecircncias geacutemeas de CAU em vaacuterias populaccedilotildees de raccedilas bovinas e de buacutefalos
N
Frequecircncias geacutenicas N CAS CAF Referecircncia
Portugal
Barrosatilde inscrita 141 068 plusmn 003 032 plusmn 003 Este trabalho
Barrosatilde natildeo inscrita 153 064+003 036 plusmn 003
Minhota 62 085 plusmn 003 015+003 Iacute Iacute
Mertolenga 147 085 plusmn 002 015+002 Kn)Deiacutea(1980)
Alentejana 155 091 plusmn 002 009 plusmn 002
Mirandesa 107 099 + 001 001+001 NOBRE (S data)
Espanha
Cachena 71 077 + 004 023 plusmn 004 IGLESIAS (1989)
Caldelana 60 096 plusmn 002 004 plusmn 002 ce
Frieiresa 33 094 + 003 006 plusmn 003
Limiana 39 083 + 004 017 plusmn 004
Rubia Gallega 168 089 plusmn 002 011+002
Vianesa 40 086 + 004 014 plusmn 004
Sayaguesa 147 072 plusmn 003 028+003 GONZALEZ eacutetal (1987)
Morucha 101 072 plusmn 003 028 plusmn 003 a
Alistana Sanabresa 157 092 plusmn 002 008+002 iacute iacute
Blanca Cacerena 62 067 plusmn 004 033 plusmn 004 IacuteIacute
Caacuterdena Andaluza 25 100
Asturiana de los Vallegraves 127 087 plusmn 002 013+002 laquo
Asturiana de la Montaria 106 077 plusmn003 023 plusmn 003 IacuteIacute
Tudanca 42 076 plusmn 005 024 plusmn 005 VICENTE (1978)
Morena del NO 25 092 plusmn 004 008 plusmn 004
De Lidia 124 061+003 039 plusmn 003 KjDDetal (1980)
Retinta 164 065 + 003 035+003 iacuteiacute
Bulgaacuteria
Buacutefalo 263 007 + 001 093+001 MAKAVEEV(1984)
Murran (Buacutefalo) 51 020 plusmn 004 080 plusmn 004 laquo
Alemanha
Frisia 550 083 plusmn 001 017 + 001 THTNNES eacutetal (1976)
Suiacuteccedila
Simmental 1039 079 + 001 021+001 KAgraveSTLIeacutetal (1980)
Castanha Suiacuteccedila 546 087 plusmn 001 013+001
Friburg 223 084 + 002 016+002
in IGLESIAS (1989)
59
Resultados e Discussatildeo
As frequecircncias aleacutelicas de CAIPS e CAIPF nas raccedilas Cachena espanhola e Barrosatilde
portuguesa satildeo idecircnticas o que poderaacute eventualmente indicar estar-se em presenccedila de uma soacute
raccedila com designaccedilotildees diferentes nos dois paiacuteses Esta hipoacutetese eacute reforccedilada pelo facto de natildeo
haver diferenccedilas significativas entre dados morfomeacutetricos obtidos nas duas raccedilas (LEAL 1995)
Nos buacutefalos observa-se mais uma vez uma inversatildeo nas frequecircncias dos dois alelos do
locus CAII em relaccedilatildeo aos bovinos sendo CAF o mais frequente com valores situados entre
080 e 093
bull NP
Pela anaacutelise das tabelas 337 e 338 verifiacuteca-se a presenccedila dos dois alelos descritos
neste locus nas vaacuterias raccedilas bovinas sendo NPL o mais frequente nas raccedilas europeias (052 e
099) Observa-se uma grande similaridade entre os valores das frequecircncias geacutenicas o que natildeo
permite diferenciar as raccedilas estudadas neste trabalho das restantes
Tabela 337 Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica de NP em populaccedilotildees das raccedilas Barrosatilde e Minhota
N
Fenoacutetipos
N NP H NPL
Barrosatilde inscrita 141 69 72
Barrosatilde natildeo inscrita 153 55 98
Minhota 62 19 43
60
Resultados e Discussatildeo
Tabela 338 Frequecircncias geacutenicas para NP em vaacuterias populaccedilotildees e raccedilas bovinas
N
Frequecircncias geacutenicas
N NPH NPL Referecircncia
Portugal
Barrosatilde inscrita 141 029 plusmn 003 071 plusmn 003 Este trabalho
Barrosatilde natildeo inscrita 153 020 plusmn 002 080 plusmn 002 cc
Minhota 62 017 + 004 083 + 004
Espanha
Cachena 71 020 plusmn 003 080 plusmn 003 IGLESIAS (1989)
Caldelana 60 013+003 087 plusmn 003 t t
Frieiresa 33 011+004 089 plusmn 004
Limiana 39 008 plusmn 003 092 plusmn 003
Rubia Gallega 168 015+002 085 plusmn 002
Vianesa 40 013 + 004 087 plusmn 004 t i
Sayaguesa 147 014 + 002 086 plusmn 002 GONZALEZ et ai ( 1987)
Morucha 101 020 plusmn 003 080 plusmn 003
Alistana Sanabresa 157 001+001 099 + 001
Blanca Cacerena 62 048 plusmn 005 052 plusmn 005 laquo
Caacuterdena Andaluza 25 004 plusmn 003 096 plusmn 003 IacuteIacute
Asturiana de los Vallegraves 127 028 plusmn 003 072 plusmn 003
Asturiana de la Montana 106 026 plusmn 003 074 plusmn 003
Beacutelgica
Charolesa 130 026 plusmn 003 074 + 003 ANSAY amp HANSET (1972)
Frisia 91 006 plusmn 002 094 plusmn 002 t t
in IGLESIAS (1989)
MPI
A distribuiccedilatildeo dos fenoacutetipos observados para o locus MPI apresenta-se na tabela 339
Das trecircs populaccedilotildees estudadas apenas a raccedila Minhota apresenta valores observados
proacuteximos dos valores esperados segundo o formalismo de Hardy-Weinberg Por outro lado
apesar de natildeo ter sido possiacutevel testar o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg nas restantes populaccedilotildees
a aparente diferenccedila entre valores observados e esperados poderaacute dever-se a um excesso de
indiviacuteduos homozigoacuteticos para MPIC Este resultado poderaacute estar relacionado com o
processo de amostragem ou com outras causas como o acasalamento entre indiviacuteduos
61
Resultados e Discussatildeo
aparentados a existecircncia de sub-populaccedilotildees de tamanho pequeno ou ainda a um reduzido
nuacutemero de machos reprodutores
Tabela 339 Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica de MPI em populaccedilotildees das raccedilas Barrosatilde e Minhota Entre parecircntesis indicam-se os valores esperados de acordo com o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg
Fenoacutetipos N MPIA MPIAB MPIAC MPIB MPIBC MPIC
Barrosatilde inscrita 138 - - - 131 6 1
(1301) (78) (01)
Barrosatilde natildeo inscrita 1 5 2 - - - 147 4 1
(1460) (59) (01)
Minhota 61 0 3 0 56 2 0
(00) (29) (01) (561) (19) (00)
A anaacutelise da tabela 3310 permite verificar que MPIB e MPIC ocorrem nas duas
raccedilas de bovinos estudadas sendo MPIB o alelo mais comum nas trecircs populaccedilotildees A
ocorrecircncia de MPI A na raccedila Minhota contraria o descrito por ANSAY (1973) quando afirma
a exclusividade do fenoacutetipo AB na raccedila Charolesa
Tabela 3310 Frequecircncias geacutenicas de MPI nas populaccedilotildees estudadas
N
Frequecircncias geacutenicas
N MPPA MPPB MPIC
Barrosatilde inscrita 138 - 097 + 001 003+001
Barrosatilde natildeo inscrita 152 - 098 + 001 002+001
Minhota 61 002 plusmn 001 096 plusmn002 002 plusmn 001
A informaccedilatildeo disponiacutevel sobre este marcador em anteriores trabalhos de anaacutelise
geneacutetica em bovinos eacute quase inexistente Tal poderaacute dever-se agraves dificuldades de visualizaccedilatildeo
encontradas na sua fenotipagem por electroforese convencional A detecccedilatildeo de MPI estaacute
descrita em tecidos musculares e em leucoacutecitos neste trabalho utilizaram-se eritroacutecitos para o
estudo de variaccedilatildeo geneacutetica desta proteiacutena mas eacute provaacutevel que a sua expressatildeo ocorra apenas
na fracccedilatildeo leucocitaacuteria (natildeo separada) o que explicaria precisamente a sua fraca actividade
62
Resultados e Discussatildeo
ALB
A distribuiccedilatildeo dos fenoacutetipos observados para o locus ALB apresenta-se na tabela
3311
Apesar de natildeo ter sido possiacutevel testar o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg todas as
amostras estudadas mostram desvios muito reduzidos entre valores observados e esperados
Tabela 3311 Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica de ALB em populaccedilotildees das raccedilas Barrosatilde e Minhota Entre parecircntesis indicam-se os valores esperados de acordo com o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg
N
Fenoacutetipos N ALBA ALBAB ALBB ALBBV ALBAV ALB V
Barrosatilde inscrita 142 137 3 - - 2 -(1370) (30) (00) (00) (20) (00)
Barrosatilde natildeo inscrita 153 145 5 1 - 2 -(1440) (68) (01) (01) (20) (00)
Minhota 62 59
(590)
3 (30) (00)
Na tabela 3312 estatildeo discriminadas as frequecircncias geacutenicas estimadas para as
populaccedilotildees estudadas bem como as de outras populaccedilotildees de bovinos da Europa e de buacutefalos
da Bulgaacuteria
Verifica-se que ALBA eacute o alelo mais comum encontrando-se aparentemente fixado
em vaacuterias raccedilas bovinas de origem europeia
Como jaacute referido para HB a presenccedila de ALBB nas raccedilas europeias parece
relacionar-se com a sua localizaccedilatildeo geograacutefica verificando-se que de uma maneira geral a sua
frequecircncia aumenta agrave medida que nos aproximamos do sul da Europa e de Aacutefrica eacute no gado
zebu africano que este alelo ocorre com frequecircncias mais elevadas variando entre 030 e 060
(VICENTE 1978) Assim a presenccedila de ALBB no gado europeu poderaacute indicar a passagem
pela Europa de bovinos oriundos de Aacutefrica (CECCHINI amp Nus 1986) Eacute de notar que apenas a
raccedila Minhota e algumas das restantes raccedilas da Peniacutensula Ibeacuterica natildeo apresentam ALBB
63
Resultados e Discussatildeo
Tabela 3312 Frequecircncias geacutenicas de ALB em vaacuterias populaccedilotildees de raccedilas bovinas e em buacutefalos
Frequecircncias geacutenicas
N ALBA (F) ALBB (S) ALBV Referecircncia
Portugal
Barrosatilde inscrita 142 098 + 001 001 plusmn 001 001 plusmn001 Este trabalho
Barrosatilde natildeo inscrita 153 097 + 001 002+001 001 plusmn001
Minhota 62 098 plusmn 001 - 002 plusmn 001
Mertolenga 147 084 plusmn 002 016 + 002 - KlDDetal (1980)
Alentejana 155 094+001 006 plusmn 001 -
Mirandesa 106 094 + 002 006 plusmn 002 - NOBRE (S data)
Espanha -
Cachena 71 098 + 001 002+001 - IGLESIAS (1989)
Caldelana 60 098 plusmn 001 002 + 001 -
Frieiresa 33 100 - - raquo
Limiana 39 097 + 002 003 plusmn 002 -
Rubia Gallega 201 099 plusmn 000 001 plusmn000 -
Vianesa 40 093 + 003 007 + 003 -
Sayaguesa 147 096 plusmn001 004 plusmn 001 - GONZALEZ et al (1987)
Moracha 101 089 plusmn 002 011+002 -
Alistaria Sanabresa 157 090 plusmn 002 010 plusmn002 -
Blanca Cacerena 62 056 plusmn 005 044 plusmn 005 -
Caacuterdena Andaluza 25 100 - -
Asturiana de los Vallegraves 127 099 + 001 001 plusmn001 -
Asturiana de la Montana 106 099 plusmn001 001 plusmn001 -
Pirenaica 265 092 + 001 008 plusmn001 - VICENTE (1978)
Tudanca 42 100 - -
Morena del N O 25 092 + 004 008 plusmn 004 -
Frisona 97 100 - -
De Lidia 124 100 - - KIDDeacutetal (1980)
Retinta 164 097 + 001 003 plusmn001 -
Itaacutelia
Chinina 264 089 + 001 011 plusmn001 - CARENZIeacutetal (1970)
Marchigiana 124 074 + 003 026 plusmn 003 -
Beacutelgica
Pied vermelha Este-Flandern 503 100 - - BOUQUET amp VAN de WEGHE (1972)
Vermelha Oeste-Flandern 155 100 - -
Pied preta 174 100 - -
Pied vermelha-Campine 265 100 - -
w IGLESIAS (1989)
(Continua)
64
Resultados e Discussatildeo
Tabela 3312 Frequecircncias geacutenicas de ALB em vaacuterias populaccedilotildees de raccedilas bovinas e de buacutefalos (continuaccedilatildeo)
Frequecircncias geacutenicas N ALBA (F) ALBB (S) ALBV Referecircncia
Bulgaacuteria
Sofia Brow 170 096+001 004 + 001 - M A K A V E E V ( 1 9 7 0 )
Buacutefalo 225 047 plusmn 002 053 plusmn 002 - M A K A V E E V ( 1 9 8 4 )
Murrah (Buacutefalo) 76 012+003 088 plusmn 003 -
G Bretanha
Charolesa 99 084 plusmn 003 016 + 003 - SPOONER amp OLIVER (1969)
Frisia 1422 100 - -
Hereford 215 099 plusmn 001 001+001 -
Jersey 217 100 - -
laquo IGLESIAS (1989)
Neste trabalho descreve-se tambeacutem o alelo ALBV com uma frequecircncia de 001 e
002 nas raccedilas Barrosatilde e Minhota respectivamente Este alelo natildeo se encontra descrito em
qualquer raccedila europeia podendo a sua detecccedilatildeo estar relacionada com a capacidade resolvente
da teacutecnica de focagem isoeleacutectrica utilizada na separaccedilatildeo de ALB
TF
A transferrina eacute provavelmente o mais informativo dos sistemas polimoacuterficos estudados
em virtude do nuacutemero de alelos que apresenta
A distribuiccedilatildeo dos fenoacutetipos observados para o locus TF apresenta-se na tabela 3313
E possiacutevel verificar a existecircncia de equiliacutebrio de Hardy-Weinberg em todas as populaccedilotildees
estudadas
Da anaacutelise das frequecircncias geacutenicas expressas na tabela 3314 verifica-se que este locus
apresenta quatro produtos geacutenicos na maioria das raccedilas europeias sendo os alelos TFA e
TFD (incluindo os subtipos TFD1 e TFD2) os que apresentam frequecircncias mais elevadas
(027 a 092 para o alelo TFA e 026 a 073 para o alelo TFD)
Observa-se tambeacutem que a frequecircncia de TFD2 nas raccedilas estudadas eacute mais elevada do
que a de TFD1 como ocorre na maioria das raccedilas ibeacutericas
65
Resultados e Discussatildeo
No que se refere a TFE verifica-se que a sua frequecircncia eacute relativamente baixa nas
raccedilas europeias (001 e 022) e estaacute mesmo ausente em quase todas as raccedilas da regiatildeo da
Galiza (com excepccedilatildeo da raccedila Cachena espanhola e Rubia Gallega) e na raccedila Minhota Note-se
a grande semelhanccedila entre os valores de frequecircncias geacutenicas deste alelo na raccedila Cachena
espanhola (005) e nas populaccedilotildees de raccedila Barrosatilde (004 e 003) o que mais uma vez sugere
uma grande proximidade entre as duas Apesar de ocorrer em baixa frequecircncia nos bovinos
europeus a presenccedila de TFE nestas raccedilas pode indicar uma proveniecircncia asiaacutetica ou africana
pois eacute nestes continentes que aquele alelo eacute mais comum (BRAEND 1971)
66
Resultados e Discussatildeo
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Resultados e Discussatildeo
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A distribuiccedilatildeo dos fenoacutetipos observados para o locus GC apresenta-se na tabela 3315
A sua anaacutelise permite verificar a existecircncia de diferenccedilas entre os valores observados e
esperados para raccedila Barrosatilde (populaccedilatildeo inscrita no Livro Genealoacutegico) Este desvio ao
equiliacutebrio de Hardy-Weinberg deve-se agrave existecircncia de um excesso de homozigoacuteticos
sugerindo assim a ocorrecircncia de uma possiacutevel subestruturaccedilatildeo na populaccedilatildeo
Nas restantes amostras estudadas natildeo foi possiacutevel aplicar o teste de Contudo a
diferenccedila entre valores observados e esperados de acordo com o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg
eacute praticamente inexistente na populaccedilatildeo Barrosatilde natildeo inscrita e pouco acentuada na raccedila
Minhota
Tabela 3315 Distribuiccedilatildeo fenotiacutepica de GC em populaccedilotildees das raccedilas Barrosatilde e Minhota Entre parecircntesis indicam-se os valores esperados de acordo com o equiliacutebrio de Hardy-Weinberg
Fenoacutetipos N GCS GCFS GCF
Barrosatilde inscrita 142 98 35 8
(945) (419) (45)
Barrosatilde natildeo inscrita 153 109 40 4
(1087) (406) (37)
Minhota 62 54 5 3
(514) (101) (04)
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3913 1 0048
A distribuiccedilatildeo das frequecircncias geacutenicas apresentada na tabela 3316 mostra que GCS eacute
o alelo mais comum nas raccedilas europeias (com excepccedilatildeo da raccedila Frisia da Sueacutecia) As raccedilas
estudadas neste trabalho tecircm frequecircncias aleacutelicas para este locus que as aproximam das raccedilas
espanholas
70
Resultados e Discussatildeo
Tabela 3316 Frequecircncias geacutenicas de GC em vaacuterias populaccedilotildees de raccedilas bovinas
Frequecircncias geacutenicas
N GCF(ouA) GCS(ouB) GCC Referecircncia
Portugal
Barrosatilde inscrita
Barrosatilde natildeo inscrita
Minhota
Alentejana
Mirandesa
Espanha
De Lidia
Frisona
Beacutelgica
Branca e azul
Flemish vermelha
Campine vermelha e branca
Preta e branca
Flemish branca e vermelha
Sueacutecia
Vermelha e Branca
Frisia
141 018 plusmn0023
153 016 plusmn002
62 009 plusmn 003
028 plusmn 004
97 020 plusmn 003
1306 008 plusmn001
124 015 plusmn002
2323 031 plusmn001
431 016 plusmn001
299 012 plusmn001
299 019 plusmn002
140 006 plusmn 001
1030 039 plusmn001
273 079 plusmn 002
082 plusmn 002
084 plusmn 002
091 plusmn003
072 plusmn 004
080 plusmn 003
092 plusmn 001
085 plusmn 002
069 plusmn 001
084 plusmn 001
088 plusmn 001
081 plusmn002
065 plusmn 003
061 plusmn001
021 plusmn002
029 plusmn 003
Este trabalho
CUNHA (1994)
NOBRE (S data)
PIEDRAFUA et ai (1984)
VAN de WEGHE et ai (1982)
GAHNE(1963)
in PIEDRAFUA et ai (1984)
71
Resultados e Discussatildeo
34 - ANAacuteLISE POPULACIONAL CONJUNTA
341 - Diversidade geneacutetica na raccedila Barrosatilde
As estimativas da variabilidade geneacutetica das populaccedilotildees de bovinos das raccedilas Barrosatilde e
Minhota efectuaram-se considerando apenas 6 loci polimoacuterficos HB CAII MPI ALB TF e
GC
Tabela 341 Estimativa da variabilidade geneacutetica (6 loci) atraveacutes dos valores de heterozigotia observada (Ho) e esperada (He) nas populaccedilotildees estudadas
Barrosatilde inscrita Barrosatilde natildeo inscrita Minhota Locus
Ho He Ho He Ho He
HB 0000 0000 0000 0000 0097 0093
CAH 0411 0441 0464 0464 0210 0262
MPI 0043 0056 0026 0039 0082 0080
ALB 0035 0035 0046 0058 0048 0048
TF 0603 0590 0556 0595 0694 0638
GC 0248 0297 0261 0265 0081 0163
Os resultados expressos na tabela 341 mostram em geral a ausecircncia de diferenccedilas
significativas entre os valores de heterozigotia observada (Ho) e heterozigotia esperada (He)
para os loci estudados Deve contudo notar-se que na raccedila Minhota e quanto ao locus GC o
valor de He eacute aproximadamente o dobro da Ho Nos restantes loci o ligeiro desvio observado
entre Ho e He sugere em geral um deacutefice de heterozigoacuteticos
Nas duas populaccedilotildees de raccedila Barrosatilde os sistemas TF e CAII satildeo os que apresentam
valores de heterozigotia mais elevados Pelo contraacuterio os loci MPI e ALB mostram valores de
heterozigotia baixos possivelmente devido ao excesso de homozigoacuteticos (MPI B e ALB A)
detectados nas trecircs populaccedilotildees
Na tabela 342 apresentam-se os valores do nuacutemero meacutedio de alelos por locus (ria)
percentagem de loci polimoacuterficos (P) heterozigotia meacutedia observada (Ho) e heterozigotia
esperada (He) nas populaccedilotildees de bovinos estudados Estes valores devem ser interpretados
72
Resultados e Discussatildeo
tendo em conta o facto de os 6 loci investigados serem polimoacuterficos em pelo menos uma
populaccedilatildeo
Tabela 342 Variabilidade geneacutetica detectada em trecircs populaccedilotildees de bovinos atraveacutes da anaacutelise de 6 loci polimoacuterficos N - efectivo meacutedio estudado por locus na - nuacutemero meacutedio de alelos por locus P - proporccedilatildeo de loci polimoacuterficos Ho - heterozigotia observada He - heterozigotia meacutedia esperada Entre parecircntesis indicam-se os valores do desvio padratildeo
Raccedila Populaccedilatildeo N na P Ho He
Barrosatilde inscrita 1407 233 833 0223 0237
(06) (042) (0100) (0100)
Barrosatilde natildeo inscrita 1528 233 833 0226 0237
(02) (042) (0098) (0101)
Minhota 618 233 1000 0202 0214
(02) (021) (0101) (0090)
A sua anaacutelise permite verificar em primeiro lugar a ocorrecircncia de uma grande
semelhanccedila entre os valores de H nas duas raccedilas estudadas Barrosatilde e Minhota revelando a
existecircncia de uma variabilidade geneacutetica idecircntica nas trecircs populaccedilotildees de bovinos Observa-se
tambeacutem que os valores de heterozigotia meacutedia observada (Ho) natildeo diferem significativamente
dos valores de heterozigotia esperados (He) nas trecircs populaccedilotildees sendo o valor mais elevado o
encontrado na populaccedilatildeo de raccedila Barrosatilde (237)
Os elevados valores de P (833 na raccedila Barrosatilde e 100 na raccedila Minhota) resultam
do facto de apenas se terem utilizado loci polimoacuterficos nesta anaacutelise e o nuacutemero meacutedio de
alelos por locus (na) eacute igual nas trecircs populaccedilotildees estudadas (233)
A tabela 343 apresenta estimativas de FB Frr e FST para as trecircs populaccedilotildees de
bovinos Os valores de Fis indicam a existecircncia de uma acentuada deficiecircncia de
heterozigoacuteticos nos loci MPI e GC Nos restantes loci verifica-se por um lado a tendecircncia
para um excesso de heterozigoacuteticos nos loci HB e TF (com valores de -0051 e -0021
respectivamente) e por outro lado para uma ligeira deficiecircncia de heterozigoacuteticos nos loci
CAII e ALB (com valores de 0066 e 0072 respectivamente) A meacutedia ponderada de FiS
mostra uma deficiecircncia de heterozigoacuteticos de 48
73
Resultados e Discussatildeo
Tabela 343 Distribuiccedilatildeo relativa da diversidade geneacutetica nas trecircs populaccedilotildees de bovinos Hs-heterozigotia intrapopulacional HT-heterozigotia total Valores das estatiacutesticas F para 6 loci analisados
Locus H s Hx Fis FIT FST
HB 0030 0031 -0051 -0016 0033
CAII 0387 0404 0066 0104 0041
MPI 0058 0059 0130 0133 0004
ALB 0046 0047 0072 0075 0004
TF 0605 0627 -0021 0015 0036
GC 0241 0244 0183 0193 0012
Meacutedia 0228 0235 0048 0078 0031
As estimativas de FST indicam a existecircncia de um baixo grau de diferenciaccedilatildeo
populacional nos bovinos estudados Os valores de FST para os 6 loci analisados podem
considerar-se baixos (entre 0004 e 0041) apresentando uma meacutedia ponderada de 0031
Assim soacute uma pequena parte da diversidade geneacutetica (31) se deve a diferenccedilas entre as
populaccedilotildees sendo muito maior a diversidade dentro de cada populaccedilatildeo do que entre as
populaccedilotildees
Os baixos valores de FST encontrados para os loci MPI e ALB resultam de frequecircncias
elevadas de MPIB e ALBA respectivamente e traduzem uma grande homogeneidade entre
as raccedilas bovinas estudadas natildeo se detectando subestruturaccedilatildeo populacional
342 - Comparaccedilatildeo com outras raccedilas ibeacutericas
Tendo em conta o pequeno nuacutemero de loci comuns a este e a outros estudos
estimaram-se diferentes valores de heterozigotia meacutedia consoante o nuacutemero de loci de que se
dispunha Na tabela 344 e 345 apresentam-se valores de heterozigotia meacutedia para as
diferentes raccedilas obtidos a partir de quatro (FF) e cinco loci (FF+) respectivamente bem como
os valores de na P e os respectivos desvios padratildeo em vaacuterias raccedilas de bovinos ibeacutericos
A diversidade geneacutetica do bovino Barrosatilde avaliada pela taxa meacutedia de heterozigotia
(0281-0272 e 0249-0260 para 5 e 4 loci respectivamente) parece ocupar uma posiccedilatildeo
74
Resultados e Discussatildeo
intermeacutedia no seio das raccedilas ibeacutericas Tambeacutem o grau de variabilidade geneacutetica nos bovinos
avaliado por paracircmetros como o nuacutemero meacutedio de alelos por locus e a proporccedilatildeo de loci
polimoacuterficos (P) demonstra que as raccedilas estudadas neste trabalho ocupam uma posiccedilatildeo
intermeacutedia quando comparadas com outras raccedilas ibeacutericas
A anaacutelise das tabelas 344 e 345 mostra que todas as medidas de diversidade geneacutetica
(H P e de na) apresentam valores idecircnticos Esta semelhanccedila permite supor que o processo de
domesticaccedilatildeo iniciado haacute menos de 10000 anos natildeo levou a uma grande diferenciaccedilatildeo
geneacutetica entre as raccedilas pelo menos relativamente aos marcadores geneacuteticos estudados neste
trabalho Desta forma verifica-se que as principais diferenccedilas entre as raccedilas resultam de
pequenas alteraccedilotildees das suas frequecircncias geacutenicas provavelmente causadas pelo baixo nuacutemero
de animais destinados agrave reproduccedilatildeo (mais marcado nos machos) e pelos cruzamentos dirigidos
em cada raccedila
Por outro lado este baixo niacutevel de diferenciaccedilatildeo geneacutetica deveraacute estar tambeacutem
associado ao facto de na origem das raccedilas bovinas ibeacutericas se encontrar um uacutenico processo de
domesticaccedilatildeo seguido provavelmente de um processo de expansatildeo populacional bastante
recente do Proacuteximo Oriente ateacute agrave Europa Adicionalmente estima-se que a diferenciaccedilatildeo dos
bovinos em raccedilas autoacutectones soacute teraacute ocorrido nos uacuteltimos 300 anos (LOFTUS et ai 1994)
Neste contexto os eventuais estrangulamentos do efectivo populacional (bottleneck)
e efeitos de fundador ocorridos durante o periacuteodo inicial da domesticaccedilatildeo do gado bovino e
capazes de afectar de forma muito diferente vaacuterios nuacutecleos populacionais natildeo satildeo detectados
na Peniacutensula Ibeacuterica
75
Resultados e Discussatildeo
Tabela 344 Variabilidade geneacutetica em vaacuterias raccedilas de bovinos atraveacutes da anaacutelise de 4 loci polimoacuterficos N - efectivo meacutedio estudado por locus ria - nuacutemero meacutedio de alelos por locus P-- proporccedilatildeo de loci polimoacuterficos yent - heterozigotia meacutedia esperada Entre parecircntesis indicam-se os valores do desvio padratildeo
Raccedila Populaccedilatildeo N nbdquo P H +
Portugal
Barrosatilde inscrita 1410(00) 23 (05) 750 0249 (0135)
Barrosatilde natildeo inscrita 1530 (00) 23 (05) 755 0260(0135)
Minhota 620 (00) 20 (00) 1000 0216 (0094)
Mertolenga 1470 (00) 23 (03) 1000 0315 (0097)
Alentejana 1550(00) 23 (03) 1000 0239 (0123)
Mirandesa 1065 (03) 20 (00) 1000 0159(0110)
Espanha
Cachena 710 (00) 23 (03) 1000 0279(0111)
Caldelana 600 (00) 20 (00) 1000 0166 (0107)
Frieiresa 330 (00) 18(03) 750 0177(0112)
Limiana 390 (00) 20 (00) 1000 0246 (0087)
Rubia Gallega 1845(95) 25 (05) 1000 0215(0110)
Vianesa 400 (00) 20 (00) 1000 0221 (0087)
Sayaguesa 1470 (00) 23 (03) 1000 0320 (0094)
Morucha 1010(00) 23 (03) 1000 0361 (0084)
Alistaria Sanabresa 1570 (00) 23 (03) 1000 0213 (0104)
Blanca Cacerefia 618 (03) 20 (00) 1000 0377 (0078)
Caacuterdena Andaluza 250 (00) 15(03) 500 0131 (0106)
Asturiana de los Vallegraves 1265 (05) 23 (03) 1000 0237(0107)
Asturiana de la Montana 1060 (00) 23 (03) 1000 0280 (0088)
Tudanca 420 (00) 20 (04) 750 0321 (0109)
Morena del N O 250 (00) 18 (03) 750 0203 (0108)
Frisona 6540 (00) 18 (05) 500 0203 (0130)
De Lidia 1240 (00) 23 (03) 1000 0367(0135)
Retinta 1640 (00) 23 (03) 1000 0338 (0107)
76
Resultados e Discussatildeo
Tabela 345 Variabilidade geneacutetica em vaacuterias raccedilas de bovinos atraveacutes da anaacutelise de 5 loci polimoacuterficos N - efectivo meacutedio estudado por locus na - nuacutemero meacutedio de alelos por locus P--proporccedilatildeo de loci polimoacuterficos H^ - heterozigotia meacutedia esperada Entre parecircntesis indicam-se os valores do desvio padratildeo
Raccedila Populaccedilatildeo N na P i r Portugal
Barrosatilde inscrita 1410 (00) 22 (04) 800 0281 (0109)
Barrosatilde natildeo inscrita 1530(00) 22 (04) 800 0272 (0105)
Minhota 620 (00) 20 (00) 1000 0229 (0074)
Espanha Cachena 710 (00) 22 (02) 1000 0289 (0087)
Caldelana 600 (00) 20 (00) 1000 0180 (0084)
Frieiresa 330 (00) 18 (02) 800 0180 (0087)
Limiana 390 (00) 20 (00) 1000 0226(0071)
Rubia Gallega 1812(81) 24 (04) 1000 0223 (0086)
Vianesa 400 (00) 20 (00) 1000 0374 (0168)
Sayaguesa 1470 (00) 22 (02) 1000 0305 (0074)
Morucha 1010 (00) 22 (02) 1000 0353 (0066)
Alistaria Sanabresa 1570 (00) 22 (02) 1000 0174 (0089)
Blanca Cacerefla 616 (02) 20(00) 1000 0402 (0065)
Caacuterdena Andaluza 250 (00) 16(02) 600 0120 (0083)
Asturiana de los Vallegraves 1266 (04) 22 (02) 1000 0270 (0089)
Asturiana de la Montaria 1060(00) 22 (02) 1000 0301 (0072)
343 - Diferenciaccedilatildeo geneacutetica
Nas tabelas 346 e 347 apresentam-se as distacircncias geneacuteticas de Nei (NEI 1978)
calculadas para 23 (4 loci HB CAII ALB e TF) e 15 (5 loci HB CAII ALB TF e NP)
raccedilas bovinas ibeacutericas respectivamente Da sua anaacutelise ressalta o facto de aqueles valores
serem na sua maioria bastante baixos
De entre as raccedilas bovinas ibeacutericas estudadas a Frisona e a Cachena demonstram estar
mais proacuteximas da raccedila Barrosatilde com valores de DNei de 0092 (4 loci) e de 0104 (5 loci)
respectivamente Por outro lado as raccedilas Asturiana de la Montana e Vianesa aparecem como
as mais diferenciadas DNei= 0334 (4 loci ) e Dgtjei= 0330 (5 loci) respectivamente
77
Resultados e Discussatildeo
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Resultados e Discussatildeo
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Resultados e Discussatildeo
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80
Resultados e Discussatildeo
No que se refere agrave raccedila Minhota verifica-se que a Frieiresa eacute a que estaacute mais proacutexima
(valores de 0077 e 0074 para 4 e 5 loci respectivamente) e que mais um vez eacute a Asturiana de
la Montana a mais diferenciada das raccedilas (valores de 0389 e 0349 para 4 e 5 loci respectivamente)
A diferenciaccedilatildeo geneacutetica entre as raccedilas bovinas ibeacutericas encontra-se representada nos
dendrogramas construiacutedos pelos meacutetodos de agrupamento NJ (Neighbor-joining SATTOU amp
NEI 1987) e UPGMA (Unweightedpair-group arithmetic average SNEATH amp SOKAL 1973)
(figuras 341 342 343 e 344) Foram realizados testes de reamostragem do tipo
bootstrap (100 reacuteplicas) para a anaacutelise da consistecircncia dos padrotildees de ramificaccedilatildeo
apresentando-se os seus valores entre parecircntesis
A anaacutelise conjunta dos quatro dendrogramas permite verificar uma falta de consistecircncia
nos vaacuterios padrotildees de ramificaccedilatildeo para as raccedilas bovinas ibeacutericas associada a valores de
bootstrap em geral muito reduzidos De facto observa-se que o padratildeo de ramificaccedilatildeo dos
dendrogramas se altera consoante o meacutetodo de agrupamento usado e o nuacutemero de loci considerados Estas alteraccedilotildees nos agrupamentos das diferentes raccedilas devem-se
provavelmente agrave instabilidade causada pelo reduzido nuacutemero de loci polimoacuterficos utilizados
neste estudo bem como ao facto de as frequecircncias geacutenicas serem muito semelhantes em todas
as populaccedilotildees estudadas
Deve contudo referir-se que a raccedila Barrosatilde aparece normalmente associada a vaacuterias
raccedilas do norte da Peniacutensula Ibeacuterica nomeadamente a Cachena (Galiza) a Asturiana de la
Montana (Astuacuterias) a Sayaquesa e a Morucha (Salamanca)
No que se refere agrave raccedila Minhota esta aparece vaacuterias vezes associada agraves raccedilas Rubia
Gallega Frisona Asturiana de los Vallegraves e Frieiresa
81
Resultados e Discussatildeo
(18)
(14)
(11)
(5)
(3)
Sayaquesa
(39)
[32)
(21)1-
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(49)
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(3)
(18)
(8)
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19)
(16T
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(99) Asturiana de la Montana
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(65)
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Mirandesa Caacuterdena Andaluza Morena NO
Caldelana Alistano Sanabresa
Figura 341 Dendrograma construiacutedo com base nas distacircncias geneacuteticas de NEI (1978) entre 23 raccedilas de bovinos (4 loci HBCAII ALB e TF) atraveacutes do meacutetodo de agrupamento NJ Os valores de probabilidade de ocorrecircncia de cada agrupamento obtidos atraveacutes de um teste de bootstrap indicam-se entre parecircntesis
82
Resultados e Discussatildeo
Morucha
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Rubia Gallega Asturiana de los Vallegraves Freiresa
Frisona Minhota Alentejana Mertolenga
(43) ( 2 8 gt - ^ C a W e l a l
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Caacuterdena Andaluza Vianesa
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De Lidia Tudanca
Asturiana de la Montana Morena NO Blanca Cacerena
Figura 342 Dendrograma construiacutedo com base nas distacircncias geneacuteticas de NEI (1978) entre 23 raccedilas de bovinos (4 loci HB CAII ALB e TF) atraveacutes do meacutetodo de agrupamento UPGMA Os valores de probabilidade de ocorrecircncia de cada agrupamento obtidos atraveacutes de um teste de bootstrap indicam-se entre parecircntesis
83
Resultados e Discussatildeo
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Figura 343 Dendrograma construiacutedo com base nas distacircncias geneacuteticas de NEI (1978) entre 15 raccedilas de bovinos (5 loci HB CAII ALB TF e NP) atraveacutes do meacutetodo de agrupamento NJ Os valores de probabilidade de ocorrecircncia de cada agrupamento obtidos atraveacutes de um teste de bootstrap indicam-se entre parecircntesis
(21)
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Alistano Sanabresa
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Frieiresa
Minhota Cachena Morucha
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Asturiana de la Montana
Figura 344 Dendrograma construiacutedo com base nas distacircncias geneacuteticas de NEI (1978) entre 15 raccedilas de bovinos (5 loci HB CAII ALB TF e NP) atraveacutes do meacutetodo de agrupamento UPGMA Os valores de probabilidade de ocorrecircncia de cada agrupamento obtidos atraveacutes de um teste de bootstrap indicam-se entre parecircntesis
84
Resultados e Discussatildeo
No seu conjunto estes resultados natildeo satildeo suficientes para o estabelecimento de uma
histoacuteria evolutiva das actuais raccedilas bovinas ibeacutericas nem para a separaccedilatildeo da raccedila Barrosatilde das
restantes Consequentemente natildeo eacute possiacutevel neste momento fazer corresponder a anaacutelise da
diversidade e estrutura geneacutetica das populaccedilotildees ibeacutericas de gado bovino com alguma das
hipoacuteteses evolutivas propostas por diversos autores com base em evidecircncia morfoloacutegica
(VALLEJO 1978 IGLESIAS 1989 CORDEIRO 1986 JORGE 1996)
De acordo com essa evidecircncia a raccedila Barrosatilde (e tambeacutem a Cachena) derivaria do
denominado tronco mauritaacutenico (Bos primigenius opisthonomus) ou seja de populaccedilotildees
originaacuterias do Norte de Aacutefrica que teriam passado para o sul da Peniacutensula Ibeacuterica alcanccedilando
mais tarde o Norte de Portugal e de Espanha Por outro lado a filiaccedilatildeo da raccedila Minhota
segundo JORGE (1996) deriva do tronco aquitacircnico (Bos primigenius primigenius) tal como a
maior parte das raccedilas da Galiza das Astuacuterias e dos Pirineacuteus
Embora os resultados apresentados neste trabalho pareccedilam de facto indicar que as
raccedilas Barrosatilde e Minhota derivam de troncos diferentes eacute necessaacuterio aprofundar de forma
muito consideraacutevel a investigaccedilatildeo sobre a estrutura geneacutetica das raccedilas bovinas ibeacutericas antes de
se poder formular conclusotildees mais sustentadas
85
Con8ideraccedil8es Finais
4 - CONSIDERACcedilOtildeES FINAIS
O trabalho desenvolvido nesta dissertaccedilatildeo permitiu o estudo de alguns sistemas
geneacuteticos polimoacuterficos jaacute descritos em bovinos (HB CAII NP MPI ALB TF e GC) nas
raccedilas Barrosatilde e Minhota Permitiu ainda a aplicaccedilatildeo de teacutecnicas de separaccedilatildeo electroforeacuteticas
mais eficazes em alguns desses sistemas
Vaacuterias limitaccedilotildees durante a execuccedilatildeo praacutetica deste trabalho obrigaram de alguma
forma a alteraccedilotildees no programa inicial Entre elas devem referir-se
1 a recolha de amostras de sangue mostrou-se difiacutecil e demorada sendo necessaacuteria a
coordenaccedilatildeo de esforccedilos de vaacuterias entidades (Direcccedilatildeo Regional de Agricultura de
Entre Douro e Minho e brigadas de Sanidade Animal locais) de veterinaacuterios e de
criadores de bovinos retirando tempo agrave execuccedilatildeo praacutetica do trabalho
2 a afinaccedilatildeo de vaacuterias teacutecnicas electroforeacuteticas para certos marcadores geneacuteticos
envolveu um consideraacutevel esforccedilo de investigaccedilatildeo
3 a impossibilidade de apurar atempadamente as teacutecnicas de separaccedilatildeo ou de
visualizaccedilatildeo para a amilase a ceruloplasmina e a poacutes-transferrina
4 a escassa bibliografia sobre o bovino Barrosatilde e sobre as teacutecnicas utilizadas neste
trabalho em gado bovino
Apesar das limitaccedilotildees considera-se que este trabalho se reveste de alguma importacircncia
pelo facto de constituir um contributo para a caracterizaccedilatildeo geneacutetica de uma raccedila bovina muito
peculiar A este respeito entendeu-se que numa primeira fase se procederia ao estudo de um
conjunto de proteiacutenas polimoacuterficas de forma a poder iniciar uma comparaccedilatildeo com outras raccedilas
bovinas nomeadamente ibeacutericas para as quais jaacute existem resultados publicados Por outro
86
Consideraccedilotildees Finais
lado o estabelecimento de um conjunto de teacutecnicas de fenotipagem dos loci considerados
permite desde logo a sua aplicaccedilatildeo em questotildees de identificaccedilatildeo individual e de anaacutelise da
paternidade
Eacute contudo evidente que o aprofundamento deste trabalho deveraacute necessariamente
evoluir na direcccedilatildeo da anaacutelise molecular da variaccedilatildeo geneacutetica Adicionalmente seraacute do maior
interesse alargar o domiacutenio de investigaccedilatildeo agraves restantes raccedilas bovinas autoacutectones
Em face do exposto entende-se ser possiacutevel definir trecircs linhas de investigaccedilatildeo para os
proacuteximos anos
1 - ampliaccedilatildeo da bateria de sistemas geneacuteticos polimoacuterficos detectados em proteiacutenas do
sangue e do leite
2 - anaacutelise da variabilidade geneacutetica de um conjunto de microssateacutelites se possiacutevel
associados a algumas das proteiacutenas polimoacuterficas jaacute descritas
3 - estudo do polimorfismo da moleacutecula de DNA-mitocondrial
De uma forma geral pode assim considerar-se que os principais objectivos definidos
no iniacutecio deste trabalho foram alcanccedilados pelo que se apresentam em seguida as conclusotildees
87
Conclusotildees
5 - CONCLUSOtildeES
A utilizaccedilatildeo de um sistema de focagem isoeleacutectrica permitiu detectar a existecircncia de
polimorfismo geneacutetico na hemoglobina distinguindo-se dois produtos geacutenicos na raccedila bovina
Minhota HBA e HBB Na raccedila Barrosatilde HBA foi o uacutenico produto geacutenico encontrado
A utilizaccedilatildeo de um sistema de focagem isoeleacutectrica permitiu a detecccedilatildeo de dois
produtos geacutenicos no locus CAII (CAIPF e CAIPS) e revelou-se mais eficaz de que as
teacutecnicas de separaccedilatildeo convencional em gel de amido
A investigaccedilatildeo realizada permitiu detectar a ocorrecircncia de polimorfismo geneacutetico de
MPI atraveacutes de um sistema electroforeacutetico em gel de amido tendo-se detectado trecircs produtos
geacutenicos (MPIA MPIB e MPIC) A fraca actividade de MPI e a grande dificuldade na
obtenccedilatildeo de um contraste de bandas adequado poderaacute dever-se ao facto de a sua expressatildeo soacute
ocorrer na fracccedilatildeo leucocitaacuteria do sangue
A aplicaccedilatildeo de um sistema de focagem isoeleacutectrica na presenccedila de ureia (8M) revelou-
-se muito eficaz na separaccedilatildeo de ALB e permitiu detectar pela primeira vez um novo variante
ALBV ligeiramente mais aciacutedico do que ALBA
A combinaccedilatildeo de uma teacutecnica de focagem isoeleacutectrica com um preacutevio tratamento das
amostras a fim de saturar a moleacutecula de TF com Fe permitiu a detecccedilatildeo de quatro produtos
geacutenicos (TF A TFD1 TFD2 e TFE) nas raccedilas estudadas
88
Conclusotildees
A combinaccedilatildeo de uma teacutecnica de focagem isoeleacutectrica com a detecccedilatildeo por
immunoblotting permitiu detectar dois produtos geacutenicos no locus GC (GCA e GCB) O
tratamento de amostras com neuraminidase permitiu a obtenccedilatildeo de padrotildees mais simples do
que os conseguidos com amostras nativas Esta simplificaccedilatildeo resulta da provaacutevel remoccedilatildeo de
aacutecidos siaacutelicos ligados agrave moleacutecula de GC
Natildeo se detectou nenhum caso de exclusatildeo na anaacutelise de segregaccedilatildeo de 27 pares
matildeefilho feita separadamente para cada locus
Verifiacutecou-se a presenccedila de dois alelos raros HBB e PEPB1 na raccedila Minhota Estes
alelos poderatildeo ser utilizados na distinccedilatildeo das duas raccedilas estudadas
Foi encontrado um valor de heterozigotia meacutedia de 0237 em populaccedilotildees de raccedila
Barrosatilde indicativo de uma variabilidade geneacutetica intermeacutedia em relaccedilatildeo agrave generalidade das
raccedilas ibeacutericas As diferenccedilas observadas entre as vaacuterias raccedilas ibeacutericas poderatildeo reflectir
fenoacutemenos histoacuterico-evolutivos muito recentes dada a sua proximidade e grande semelhanccedila
Foi observado um reduzido niacutevel de diferenciaccedilatildeo entre as raccedilas Barrosatilde e Minhota
(FST= 0031) demonstrando-se que a maior parte da diversidade geneacutetica se atribui a diferenccedilas
intrapopulacionais Este valor de FST pode considerar-se baixo quando comparado com o
obtido no estudo de outras espeacutecies animais sugerindo um elevado fluxo geacutenico
interpopulacional Por outro lado reflecte ainda uma histoacuteria demograacutefica muito recente
A utilizaccedilatildeo de meacutetodos de agrupamento NJ e UPGMA obtidos a partir de matrizes de
distacircncias geneacuteticas de Nei natildeo permitiu separar a raccedila Barrosatilde das restantes raccedilas ibeacutericas
89
Referecircncias Bibliograacuteficas
6 - REFEREcircNCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
AMORIM A (1983) Contribuiccedilatildeo para o conhecimento da Geneacutetica Humana Estudo de Geneacutetica Bioquiacutemica
Formal e Populacional e de Ligaccedilatildeo Factorial Tese de Doutoramento Faculdade de Ciecircncias do
Porto
AMORIM A KOMPF J SCHUNTER F amp RITTER H (1982) Aminolevulinate dehydratase (EC42124)
Linkage analysis Hum Genet 61 48-49
ANSAY M (1973) Techniques microelectrophoretiques dans lanalyse de la multipliciteacute enzymatique chez les
bovins Deacutetection Eacutelectrophoreacutetique des Polymorphismes Biochimiques Chez les Mammifegraveres
Application a LEacutetude Geacuteneacutetique des Populations Centre National de la Recherche Scientifique
Paris 43-58
ARANA A pound amp ZARAGOZA P (1986) Nueva electroforetica dei enzima NADH-Diafrosa (DIA-2) detectada
en la espeacutecie Oryctolagus cuniculus (L) Zootecnia XXXV ndeg 7-12 125-130
ARAUacuteJO J (1986) Contribuiccedilatildeo para o estudo dos bovinos de raccedila Barrosatilde Relatoacuterio de estaacutegio da
licenciatura em Engenharia Zooteacutecnica Universidade dos Accedilores
ARNOLD I C J amp Bouw J (1989) A new allele of glucose phosphate isomerase in dogs Animal Genetics
20 217-220
ARRANZ J J BAYON Y amp SAN PRIMITIVO F (1992) Biochemical polymorphisms in Spanish Avilena-
-Negra Ibeacuterica cattle Animal Genetics 23 (suppl 1) 19
ARRANZ J J BAYON Y amp SAN PRIMITIVO F (1996) Comparison of protein markers and microsatellites in
differentiation of cattle populations Animal Genetics 27 415-419
ASHTON G C (1965) Cattle serum transferrins A balanced polymorphism Genetics 52 983-997
90
Referecircncias Bibliograacuteficas
BAINES J amp MEacuteLEK J (1980) Egipto - Deuses Templos e Faraoacutes Grandes Culturas e Civilizaccedilotildees Ciacuterculo
de Leitores
BELL K ARTHUR H amp ANDERSON I L (1994) Esterase and albumin polymorphism in the domestic cat
(Felis catus) XXIV International Conference on Animal Genetics Praga Julho 1994
BEKENEV V A amp ORLOVA G V (1991) Polymorphism of erytrocytic enzymes in Large White pig breeds in
Siberia Animal Genetics 22 (suppl 1) 23-24
BOWLING A T amp CLARK R S (1988) Excess of heacuteteacuterozygotes at albumin locus in American Standardbred
horses Animal Genetics 19 331-341
BOWLING A T GORDON L PENEDO M C T WICTUM E amp BEEBOUT J (1990) A single gel for
determining genetic of equine erythrocyte carbonic anhydrase (CA) and catalase (Cat) Animal
Genetics 21 191-197
BRADLEY D G MACHUGH D E CUNNINGHAM P amp LOFTUS R T (1996) Mitochondrial diversity and
the origins of African and European cattle Proceeding of the National Academy of Sciences of USA
93 5131-5135
BRAEND M (1971) Studies on the relationships between cattle breeds in Africa Asia and Europe Evidence
obtained by studies of blood groups and protein polymorphisms World Review of Animal Production
VIO (1) 10-14
BRAEND M (1988) Haemoglobin polymorphism in Norwegian Red Cattle Animal Genetics 19 59-62
BRAEND M NESSE 1 L amp EFREMOV G D (1988) Expression and genetics of caprine haemoglobins
Animal Genetics 18 223-231
BROWN L B KANE H amp AYRES H (1993) Vital signs WW Norton e Co pp 323 New York
CARTER D C HE X M MUNSON S EL TWIGG P D GERNERT K M BROOM M B amp MILLER T
Y (1989) Three dimensional structure of human serum albumin Science 244 1195-1198
CECCHINI G amp Nus M D (1986) Literature review on cattle blood polymorphisms and preliminary results
of analysis in East African Zebu in Ethiopia Agric Subtrop and Ttropicale 3 (80) 433-463
91
Referocircicias Bibliograacuteficas
CiacuteZovAacute D STRATIL A MULLER E amp CEPICA S (1993) A new partially deficient transferrin variant in
the pig Animal Genetics 24 305-306
CLARKE S W TUCKER E M amp OSTERHOFF D R (1989) Blood groups and biochemical polymorphism
in the Namaqua sheep breed Animal Genetics 20 279-286
CLUTTON-BROCK J (1992) Domestication of animals In Jomes S Martin R Pilbeam D (eds) The
Cambridge Encyclopedia of Human Evolution pp 380-385 Cambridge University Press
CORDEIRO J P (1986) As raccedilas bovinas em Portugal - Sua Origem O meacutedico veterinaacuterio I (1) 29-39
CRISTOFALO G Cozzi M C amp VALIATI P (1992) Identification of a new variant in the equine serum
alB-glycoprotein (A1B) system Animal Genetics 23 (suppl 1) 24
CUNHA L M (1994) Caracterizaccedilatildeo Morfo-Funcional e Geneacutetica da Raccedila Bovina Alentejana Trabalho de
fim de curso apresentado agrave Escola Superior Agraacuteria de Beja
DEL LAMA S N DEL LAMA M A MESTRINER M A amp MORTARI N (1992) Peptidase B polymorphism
in cattle erythrocytes Biochem Genet 30 247-255
DRATCH P TATE M KRAAY G J amp GERWING V (1992) Plasma proteins differentiating European red
deer and North American elk Animal Genetics 23 (suppl 1) 32
EGGEN A amp FRIES R (1995) An integrated cytogenetic and meiotic map of the bovine genome Animal
Genetics 26 215-236
ERHARDT G (1986) Transferrin variants in sheep separation and characterization by polyacrylamide gel
electrophoresis and isoelectric focusing Animal Genetics 17 343-352
ERHARDT G (1991) Genetic polymorphism of vitamin D binding protein and serum albumin in sheep
Animal Genetics 22 (suppl 1) 28-29
ERHARDT G amp SIMIANER H (1993) Linkage between the loci for serum albumin and vitamin D binding
protein (GC) in sheep Animal Genetics 24 301-303
EPSTEIN H amp MASON I L (1984) Cattle In Mason I L (ed) Evolution of domesticated animals pp 7-
-27 Longman
92
Referecircncias Bibliograacuteficas
FAO (1993) A diversidade da Natureza Um patrimoacutenio valioso Documento produzido pela FAO Divisatildeo de
informaccedilatildeo - Out de 1993 Veterinaacuteria Teacutecnica 10 10-12
FAO (1996) World Watch List for Domestic Animal Diversity 2a ediccedilatildeo FAOUNEP pp 334 Roma
FARNDALE B M HUBBARD D E amp ANDERSON L L (1992) A new PGD variant in New Zeland
Thoroughbred horses Animal Genetics 23 (suppl 1) 24
FELSENSTEIN J (1993) PHYLIP (Phylogeny Inference Package) Version 35 Distributed by the autor Seattle
University of Washington
FERNANDES M T S (1996) Raccedilas de bovinos autoacutectones Um importante recurso geneacutetico animal portuguecircs
a preservar e a defender Veterinaacuteria Teacutecnica 12 10-15
FERRAND N (1995) Variaccedilatildeo geneacutetica de proteiacutenas em populaccedilotildees de coelho (Oryctolagus cuniculus) -
- Anaacutelise da diferenciaccedilatildeo subespecifica subestruturaccedilatildeo expansatildeo geograacutefica e domesticaccedilatildeo
Dissertaccedilatildeo de Doutoramento em Biologia apresentada agrave Faculdade de Ciecircncias da Universidade do
Porto
FERRAND N amp ROCHA J (1991) Genetic polymorphism of serum albumin in wild rabbits populations
Animal Genetics 22 (suppl 1) 36
FORBES P MACKEITH B amp PEBERDY R (1986) Mamiacuteferos Ungulados e Lagomorfos Ciacuterculo de Leitores
FRIES R EGGEN A amp WOMACK J E (1993) The bovine genome map Mammalian Genome 4 405-428
GAHNE B(1963) Inherited variation in the post-albumin of cattle serum Hereditas 50126-135
GAHNE B JUNEJA R K amp GROLMUS J (1977) Horizontal polyacrylamine gel electrophoresis for the
simultaneous phenotyping of transferrin post-transferrin albumin and post-albumin in the blood
plasma of cattle Arum Bid Grps Biochem Genet 8127-137
GARCIA L S VICENTE M V BECERRA A L YEBRA F A RODRIcircGUES M F amp LOacutePEZ J M S
(1992) Razas Bovinas Autoacutectonas de Galicia - I Razas Morenas Galegas (Recursos Xeneacuteticos a
Conservar) Xunta de Galicia
GARCIA M ROSAacuteRIO J amp ANTUNES M (1981) Bovinos em Portugal Direcccedilatildeo dos Serviccedilos Veterinaacuterios -
- DGSV pp 44-78 Lisboa
93
Referecircncias Bibliograacuteficas
GLOWATZKI-MULLIS M L GAILLARD C WIGGER G amp FRIES R (1995) Microsatellite-based
parentage control in cattle Animal Genetics 26 7-12
GONCcedilALVES GARCIA M L (1964) A Raccedila Bovina Barrosatilde Boletim Pecuaacuterio n deg 1 Ano XXXII DGSP
pp 103-172 Lisboa
GONZALEZ P TUNON MJ amp VALLEJO M (1987) Genetic relationships between Spanish native breeds of
cattle Animal Genetics 18 249-256
HALL S B L COTHRAN E G amp KING J A (1991) Variability of manosephosphate isomerase (MPI)
from haemolysate in 14 horse breeds Animal Genetics 22 (suppl 1) 22
HARRIS H amp HOPKINSON D A (1976) Handbook of enzyme electrophoresis in human genetics North-
-Holland Publishers
HEMMER H (1990) Domestication The decline of environmental appreciation Cambridge University Press
HERZOG S (1988) Polymorphism and genetic control of erythrocyte 6-phosphogluconate dehydrogenase in
the genus Cervus Animal Genetics 19 291-294
HERZOG S (1989) Genetic polymorphism of transferrin in fallow deer Cervus dama L Animal Genetics 20
421-426
IGLESIAS A B (1989) Estrutura y relaciones geneacuteticas de razas bovinas mediante marcadores geneacuteticos
(Polimorfismos Bioquiacutemicos) Dissertaccedilatildeo de Doutoramento em Biologia apresentada agrave Faculdade de
Biologia da Universidade de Santiago
JAMIESON A (1965) The genetics of transferrins in cattle Heredity 20 419-441
JANZEN M K amp COTHRAN E G (1991) A new PGD variant from North American horses of feral origin
Animal Genetics 22 (suppl 1) 21-22
JORGE E S (1996) Bovinos da raccedila Minhota Contribuiccedilatildeo para a sua histoacuteria Veterinaacuteria Teacutecnica 10 10-
-18
94
Referecircncias Bibliograacuteficas
JUNEJA R K GAHNE B amp STRATIL A (1987) Polymorphic plasma postalbumins of some domestic
animals (pig Po2 horse XK and dog Pa proteins) identified as homologous Animal Genetics 18 119-
-124
JUNEJA R K KURYL J GAHNE B amp ZURKOWSKI M (1989) Linkage between the loci for transferrin
and ceruloplasmin in pigs Animal Genetics 20 307-311
KALAB P STRATIL A amp GLASNAacuteK V (1990) Genetic polymorphism of serum vitamin D-binding protein
(GC) in sheep and mouflon Animal Genetic 21 317-321
KAWAGUCHI T (1973) Polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of serum albumin into three
bands Clinica ChimicaActa 45 85-92
KIDD K K STONE W H CRIMELLA C CARENZI C CASATI M amp ROGNONI G (1980)
Immunogenetic and population genetic analyses of Iberian cattle Anim Blood Grps Biochem Genet
11 21-38
KRISTJANSSON F K (1963) Genetic control of two pre-albumins in pigs Genetics 48 1059-1063
KRISTJANSSON F K amp HICKMAN C G (1965) Subdivision of the allele TF D for transferrins in Holstein
and Ayrshire cattle Genetics 52 627-630
KUROSAWA Y amp TANAKA K (1988) Electrophoretic variants of serum transferrin in wild pig populations of
Japan Animal Genetics 19 31-35
LEAL C (1995) Apreciaccedilatildeo fenotiacutepica de um nuacutecleo de bovinos de raccedila Barrosatilde e amostragem para sua
caracterizaccedilatildeo geneacutetica Relatoacuterio de estaacutegio de licenciatura em Biologia - Ramo Cientiacutefico
Tecnoloacutegico em Ecologia e Recursos Zooloacutegicos Faculdade de Ciecircncias da Universidade do Porto
LITT M amp LUTTY J A (1989) A hipervariable microsatellite revealed by in vitro amplification of a
dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene American Jornal of Human Genetics 44
397-401
LOFTUS R T MACHUGH D E NGERE L O BALAIN D S BADI A M BRADLEY D G amp
CUNNINGHAM E P (1994a) Mitochondrial genetic variation in European African and Indian cattle
populations Animal Genetics 25 265-271
95
Referecircncias Bibliograacuteficas
LOFTUS R T MACHUGH B E BRADLEY B G SHARP P M amp CUNNINGHAM P (1994b) Evidence
for two independent domestications of cattle Proceeding of the National Academy of Sciences of USA
91 2757-2761
MACHUGH D E LOFTUS R T BRADLEY B G SHARP P M amp CUNNINGHAM P (1994)
Microsatellite DNA variation and among European cattle breeds Proceedings of the Royal Society of
London B 256 25-31
MACHUGH B E SHRIVER M B LOFTUS R T CUNNINGHAM P amp BRADLEY B G (1997)
Microsatellite DNA Variation and the Evolution Domestication and Phylogeography of taurine and
zebu cattle (Bos taunts and Bos indicus) Genetics 146 1071-1086
MARTINS R (1982) Conservaccedilatildeo e melhoramento dos bovinos de raccedila Barrosatilde Relatoacuterio de estaacutegio de
licenciatura em Produccedilatildeo Animal Instituto Universitaacuterio de Traacutes-os-Montes e Alto Douro
MIRANDA DO VALE J (1949) Gado Bissulco Livraria Saacute da Costa Lisboa
MORAIS M L (1992) Estudo Desenvolvimento e Optimizaccedilatildeo de Teacutecnicas de Separaccedilatildeo e Detecccedilatildeo
Especiacutefica de Proteiacutenas Dissertaccedilatildeo de Mestrado em Biologia Celular apresentada agrave Faculdade de
Ciecircncias da Universidade de Coimbra
NEI M (1978) Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small number of individuals
Genetics 89 583-590
NICHOLS E A CHAPMAN V M amp RUDDLE F H (1973) Polymorphism and linkage for
Mannosephosphate isomerase in Mus musculus Biochem Genet 8 47-53
NOBRE J M (s data) Caracterizaccedilatildeo geneacutetica da raccedila bovina Mirandesa Trabalho de fim de curso
efectuado na Estaccedilatildeo Nacional de Selecccedilatildeo e Reproduccedilatildeo Animal Curso de Engenharia Zooteacutecnica da
Universidade de Eacutevora
PENEDO M C T FOWLER M E BOWLING A T ANDERSON B L amp GORDON L (1988) Genetic
variation in the Wood of llamas Llama glama and alpaca Llama pacos Animal Genetics 19 267-
-276
PENEDO M C T amp JUNEJA R K (1989) Polymorphic plasma postalbumin (PO) of llamas and alpacas
identified as GC Protein Animal Genetics 20 221-223
96
Referecircncias Bibliograacuteficas
PENHALLOW R C MASON A B amp WOODWORTH R C (1991) Electrophoretic characterization of
human equine and bovine transferrins Comp Biochem Physiol 98B 41-45
PEREIRA A A (1997) Caracterizaccedilatildeo Geneacutetica de Algumas Subpopulaccedilotildees de Truta de Rio Salmo trutta L
da Bacia Hidrograacutefica do Rio Lima Dissertaccedilatildeo de Mestrado em Ecologia Aplicada apresentada agrave
Faculdade de Ciecircncias da Universidade do Porto
PIEDRAFITA J TEJEDOR M T amp ZARAGAZA L (1984) Post-Albuminas y Post-Transferrinas en
poblaciones bovinas Espafiolas Frisona y De Lidia Comunicacioacuten Presentada A La 34deg Reunion
Anual De La Federacioacuten Europea de Zootecnia 114-121
POVEY S CORNEY G LEWIS W H P ROBSON E B PARRINGTON J M amp HARRIS H (1972) The
genetics of peptidase C in man Ann Hum Genet 35 455-465
PRETSCH W amp MERKLE S (1990) Glucose Phosphate Isomerase Enzyme - Activity Mutants in Mus
musculus Genetical and Biochemical Characterization Biochemical Genetics 28 97-110
RASERO R D I STASIO L amp BERRA G P (1993) Polymorphism of erythocyte glucosephosphae isomerase
in sheep Animal Genetics 24 63-64
RITTER EL FRIEDRICHSON U amp SCHMITT J (1974) Genetic variation of Manose phosphate isomerase in
Man Humangenetik 22 261
RITTER H amp SCHMITT J (1973) Genetic polymorphism of Manose phosphate isomerase in Primates
Humangenetik 19 325-326
ROCHA J KOtildeMPF J FERRAND N AMORIM A amp RITTER H (1991) Separation of human alloalbumin
variants by isoelectric focusing Electrophoresis 12 313-314
ROGERSON J (1991) Biacuteblia- Os Caminhos de Deus Grandes Culturas e Civilizaccedilotildees Ciacuterculo de Leitores
RON M BAND M YANAI A amp WELLER J L (1994) Mapping quantitative trait loci with DNA
microsatellites in a commercial dairy cattle population Animal Genetics 25 259-264
RUSSEL G (1996) The analysis of genetic diversity in cattle to preserve future breeding options (Online)
Available http wwwribbsrcacukcdiv_wwwinformhtm (1996 November 29)
97
Referecircncias Bibliograacuteficas
SAITOU N amp NEI M (1987) The neighbor-joining method a new method for reconstructing phylogenetic
trees Mol Biol Evol 4 406-425
SANTOS O C M (1995) Caracterizaccedilatildeo Geneacutetica de Populaccedilotildees de Lebre Ibeacuterica (Lepus granatensis) e
Lebre Europeia (Lepus europaeus) - Aspectos Bioquiacutemicos e Populacionais Dissertaccedilatildeo de Mestrado
em Ecologia Aplicada apresentada agrave Faculdade de Ciecircncias da Universidade do Porto
SARAIVA J A (1993) Histoacuteria de Portugal Publicaccedilotildees Europa-Ameacuterica
SARTORE G STORMONT C MORRIS B G amp GRUNDER A A (1969) Multiple electrophoretic forms of
Carbonic Anhydrase in red cells of domestic cattle (Bos taurus) and American buffalo (Bison bison)
Genetics 61823-831
SCHNEIDER H SCHNEIDER M P C SILVA B T F amp SALZANO F M (1990) Transferrin and albumin
polymorphisms in buffaloes from Brazil Animal Genetics 21 335-337
SEATH P H A amp SOKAL R R (1973) Numeric Taxonomy W H Freeman amp Co
SELVARAJ O S MUKHERJEE T K DHALIWAL S S TAN S G amp BARKER J S F (1991) Biochemical
polymorphisms in the local goats of South-East Asia Animal Genetics 22 (suppl 1) 32
STERN C M MILLER S A amp SCHANFIELD M S (1992) Differentiation of wapiti and Eurasian red deer
by isoelectric focusing electrophoresis of GC on agarose gels Animal Genetics 23 (suppl 1) 23
STORMONT C amp SUZUKI Y (1963) Genetic control of albumin phenotypes in horses Proceeding of the
Society for Experimental Biology and Medicine 144 673-675
STRATIL A GLASNAacuteK V BOBAacuteK P CiacutezovAacute D GAacuteBRISOVAacute E amp KALAB P (1990) Variation of some
serum proteins in red deer Cervus elaphus L Animal Genetics 21 285-293
SWOFFORD D L amp SELANDER R B (1989) BIOSYS-1 A computer program for the analysis of allelic
variation in population genetics and biochemical systematics Release 17 Illinois Natural History
Survey
TASHIAN R E (1989) The carbonic anhydrases widening perspectives on their evolution expression and
function BioEssays 10 186-192
98
Referecircncias Bibliograacuteficas
TASHIAN R E amp CARTER N D (1976) Biochemical Genetics of Carbonic Anhydrase In Harris H (ed)
Advances in Human Genetics 7 1-56 Plenum
TATE M L amp MCEWAN K M (1992) Genetic polymorphism of erytrocyte diaphorase in red deer Cervus
elaphusL Animal Genetics 23 449-452
TSUJI S SAOAMITSU Y amp GOTO N (1989) Ultrathin-leyer isoelectric focusing for bovine serum
transferrin phenotyping Biochem Genet 27 425-429
TUCKER E M amp YOUNG J D (1988) Genetic control of red-cell nucleoside transport and its association
with the B blood-group locus and nucleoside phosphorylase activity in sheep Biochem Genet 26 489-
-501
TUNON M J GONZALEZ P amp VALLEJO M (1989) Genetic relationships between 14 native Spanish
breeds of goat Animal Genetics 20 205-212
USHA A P (1996) Cattle diversity by blood typing (Online) Available http
wwwribbsrcacukcdiv_wwwinfobhtm ( 1996)
USHA A P SIMPSON S P amp WILLIAMS J L (1995) Probability of random sire exclusion using
microsatellite markers for parentage verification Animal Genetics 26 155-161
VANDEBERG J amp AIVALIOTIS M (1990) Mannose-6-phosphate isomerase polymorphism in baboon
erythrocytes Biochemical Genetics 28 495-501
VAN DE WEGHE A VAN ZEVEREN A amp BOUQUET Y (1982) The vitamin D binding protein in domestic
animals Comp Biochem Physiol 73B 977-982
VAN DE WEGHE A YABLANSKI T S VAN ZEVEREN A amp BOUQUET Y (1988) A third variant of glucose
phosphate isomerase in pigs Animal Genetics 19 55-58
VANKAN D M amp BELL K (1992 a) A new allele in Australian goats Animal Genetics 23 453-456
VANKAN D M amp BELL K (1992 b) Genetic polymorphism of vitamin D-binding protein (GC) in Australian
goats Animal Genetics 23 457-462
VICENTE M V (1978) Razas vacunas autoacutectonas en vias de extincioacuten (Aportaciones al estuacutedio geneacutetico)
Fundacioacuten Juan March Serie Universitaacuteria LXK 10-51
99
Referecircncias Bibliograacuteficas
VIEIRA J (1993) Utilizaccedilatildeo de marcadores geneacuteticos na caracterizaccedilatildeo e certificaccedilatildeo de populaccedilotildees
domeacutesticas e selvagens de coelho (Oryctolagus cunicuius) Dissertaccedilatildeo de Mestrado apresentada agrave
Faculdade de Ciecircncias da Universidade do Porto
VIEIRA J amp FERRAND N (1995) Four new alleles at the mannose-6-phosphate isomerase locus in rabbit
Animal Genetics 26 37-38
WANG S FOOTE W C amp BUNCH T D (1990) Transferrin and haemoglobin polymorphism in
domesticated goats in the USA Animal Genetics 21 91-94
WEBER J L amp MAY P E (1989) Abundant class of human DNA polymorphisms which can be typed using
the polymerase chain reaction American Jornal of Human Genetics 44 388-396
WELCHS S (1990) A comparison of the structure and properties of serum transferrin from 17 animal species
Comp Biochem Physiol 97 B (3) 417-427
100
ANEXO
Anexos
RESUMO E CONCLUSOtildeES
Neste trabalho apresenta-se uma contribuiccedilatildeo para o estudo geneacutetico da raccedila bovina Barrosatilde e de uma outra raccedila (Minhota) atraveacutes da anaacutelise da variaccedilatildeo geneacutetica de proteiacutenas detectada pela utilizaccedilatildeo de sistemas electroforeacuteticos convencionais e por focagem isoeleacutectrica
Definiram-se os seguintes objectivos fundamentais
1 estudo da variabilidade geneacutetica da raccedila Barrosatilde ao niacutevel das proteiacutenas eritrocitaacuterias e plasmaacuteticas 2 desenvolvimento e afinaccedilatildeo de teacutecnicas de separaccedilatildeo de proteiacutenas por electroforese e focagem
isoeleacutectrica e sua detecccedilatildeo especiacutefica (histoquiacutemica e imunoloacutegica) 3 anaacutelise familiar dos polimorfismos encontrados 4 avaliaccedilatildeo do grau de diferenciaccedilatildeo geneacutetica existente entre a raccedila Barrosatilde e outras raccedilas bovinas
Escolheu-se um conjunto de 12 sistemas geneacuteticos (sete dos quais se revelaram polimoacuterficos) que pudesse satisfazer os objectivos fundamentais do trabalho
Assim apoacutes desenvolvimento de teacutecnicas de separaccedilatildeo para os sistemas geneacuteticos considerados procedeu-se a uma anaacutelise familiar baseada nos polimorfismos encontrados nas populaccedilotildees de raccedila Barrosatilde ao estudo de distribuiccedilatildeo populacional dos fenoacutetipos das duas raccedilas estudadas e de outras raccedilas bovinas da Europa (principalmente da Peniacutensula Ibeacuterica)
Com base neste trabalho obtiveram-se as seguintes conclusotildees
bull a utilizaccedilatildeo de um sistema de focagem isoeleacutectrica permitiu detectar a existecircncia de polimorfismo geneacutetico na hemoglobina distinguindo-se dois produtos geacutenicos na raccedila bovina Minhota HBA e HBB Na raccedila Barrosatilde HBA foi o uacutenico produto geacutenico encontrado
bull a utilizaccedilatildeo de um sistema de focagem isoeleacutectrica permitiu a detecccedilatildeo de dois produtos geacutenicos no locus CAII (CAIIF e CAIPS) e revelou-se mais eficaz de que as teacutecnicas de separaccedilatildeo convencional em gel de amido
bull a investigaccedilatildeo realizada permitiu detectar a ocorrecircncia de polimorfismo geneacutetico de MPI atraveacutes de um sistema electroforeacutetico em gel de amido tendo-se detectado trecircs produtos geacutenicos (MPIA MPIB e MPIC) A fraca actividade de MPI e a grande dificuldade na obtenccedilatildeo de um contraste de bandas adequado poderaacute dever-se ao facto de a sua expressatildeo soacute ocorrer na fracccedilatildeo leucocitaacuteria do sangue
bull a aplicaccedilatildeo de um sistema de focagem isoeleacutectrica na presenccedila de ureia (8M) revelou-se muito eficaz na separaccedilatildeo de ALB e permitiu detectar pela primeira vez um novo variante ALBV ligeiramente mais aciacutedico do que ALB A
bull a combinaccedilatildeo de uma teacutecnica de focagem isoeleacutectrica com um preacutevio tratamento das amostras a fim de saturar a moleacutecula de TF com Fe permitiu a detecccedilatildeo de quatro produtos geacutenicos (TFA TFD1 TFD2 e TFE) nas raccedilas estudadas
bull a combinaccedilatildeo de uma teacutecnica de focagem isoeleacutectrica com a detecccedilatildeo por immunoblotting permitiu detectar dois produtos geacutenicos no locus GC (GCA e GCB) O tratamento de amostras com neuraminidase permitiu a obtenccedilatildeo de padrotildees mais simples do que os conseguidos com amostras nativas Esta simplificaccedilatildeo resulta da provaacutevel remoccedilatildeo de aacutecidos siaacutelicos ligados agrave moleacutecula de GC
bull natildeo se detectou nenhum caso de exclusatildeo na anaacutelise de segregaccedilatildeo de 27 pares matildeefilho feita separadamente para cada locus
bull verificou-se a presenccedila de dois alelos raros HBB e PEPB1 na raccedila Minhota Estes alelos poderatildeo ser utilizados na distinccedilatildeo das duas raccedilas estudadas
I
Anexos
bull foi encontrado um valor de heterozigotia meacutedia de 0237 em populaccedilotildees de raccedila Barrosatilde indicativo de uma variabilidade geneacutetica intermeacutedia em relaccedilatildeo agrave generalidade das raccedilas ibeacutericas As diferenccedilas observadas entre as vaacuterias raccedilas ibeacutericas poderatildeo reflectir fenoacutemenos histoacuterico-evolutivos muito recentes dada a sua proximidade e grande semelhanccedila
bull foi observado um reduzido niacutevel de diferenciaccedilatildeo entre as raccedilas Barrosatilde e Minhota (FST = 0031) demonstrando-se que a maior parte da diversidade geneacutetica se atribui a diferenccedilas intrapopulacionais Este valor de FST pode considerar-se baixo quando comparado com o obtido no estudo de outras espeacutecies animais sugerindo um elevado fluxo geacutemeo interpopulacional Por outro lado reflecte ainda uma histoacuteria demograacutefica muito recente
bull a utilizaccedilatildeo de meacutetodos de agrupamento NJ e UPGMA obtidos a partir de matrizes de distacircncias geneacuteticas de Nei natildeo permitiu separar a raccedila Barrosatilde das restantes raccedilas ibeacutericas
II
Anexos
Tabela A Frequecircncias geacutenicas para os vaacuterios sistemas polimoacuterficos encontrados na raccedila Barrosatilde (indiviacuteduos inscritos e natildeo inscritos) utilizadas na anaacutelise familiar
LOCUS ALELOS FREQUEcircNCIA GEacuteNICA
CAII 294 035
065
NP 294 H
L
024
076
MPI 290 A
B
C
000
098
002
ALB 294 A
B
V
097
002
001
TF 294 A
Dl
D2
E
057
016
023
004
GC 294 083 017
TTI