UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

DECANATO

PROYECTO DE TESIS

TÍTULO: Caracterización de cepas nativas de Azospirillum spp. y su efecto

como promotoras del desarrollo vegetativo de arroz (Oryza

sativa).

AUTORES: MUÑOZ CIEZA, Harold Ángel

PATROCINADOR: Msc. Carmen Rosa Carreño Farfán

APROBADO POR:

PRESIDENTE DEL JURADO MIEMBRO SECRETARIO

MIEMBRO VOCAL JEFE CENTRO INVESTIGACION

JEFE DEPARTAMENTO DECANO

Lambayeque, Febrero del 2008

UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

DECANATO

PROYECTO DE TESIS

TÍTULO :

Caracterización de cepas nativas de Azospirillum spp

y su efecto como promotoras del desarrollo

vegetativo del arroz (Oryza sativa).

AUTORES :

GARCIA PASTOR, Franklin Ignacio

MUÑOZ CIEZA, Harold Ángel

ASESOR : Msc. Carmen Rosa Carreño Farfán

UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

OFICINA DE GRADOS Y TITULOS

PROYECTO DE TESIS

I. GENERALIDADES

1. Título del Proyecto

Caracterización de cepas nativas de Azospirillum spp y su efecto como

promotoras del desarrollo vegetativo del arroz (Oryza sativa).

2. Personal investigador

2.1 Autores:

GARCIA PASTOR, Franklin Ignacio

MUÑOZ CIEZA, Harold Ángel

2.2 Asesor:

Msc. Carmen Rosa Carreño Farfán

3. Carrera profesional / Especialidad

Biología/ Microbiología – Parasitología

4. Tipo de investigación

4.1. De acuerdo al fin que se persigue

Aplicada

4.2. De acuerdo a la técnica de contrastación

Experimental

5. Régimen de investigación

Libre

6. Localidad e Institución donde se desarrollará el Proyecto

Lambayeque, Laboratorio de Microbiología y Parasitología de la Facultad de

Ciencias Biológicas. Invernadero de la Facultad de Agronomía. Universidad

Nacional Pedro Ruiz Gallo.

7. Duración del Proyecto

9 meses

8. Fechas probables de inicio y terminación

8.1. Inicio: Noviembre 2008

8.2. Terminación: Julio 2009

9. Cronograma de actividades

ACTIVIDADES2008 - 2009

NOV DIC ENE FEB MAR ABR MAY JUN JUL

FASE DE PLANEAMIENTO

Revisión bibliográfica X X X

Elaboración del Proyecto

X X

Presentación del Proyecto

X X

Aprobación del Proyecto

Implementación del Proyecto

X

FASE DE INVESTIGACIÓN

Recolección de muestras

X X X

Procesamiento de muestras

X X X

Registro de datos X X X

Análisis estadístico de datos

X X

FASE DE COMUNICACIÓN

Análisis de Interpretación

X X

Elaboración del informe X X

Presentación y sustentación

X

10. Recursos disponibles

10.1 Personal

Se contará con el personal encargado del servicio técnico del Laboratorio de

Microbiología y Parasitología. Facultad de Ciencias Biológicas, “Universidad

Nacional Pedro Ruiz Gallo”.

10.2. Equipos e Instrumentos

- Autoclave marca FANEN, autoclave vertical mod. 415.

- Biorreactores tipo tanque Batch en flujo de aire descendente.

- Estufa marca PRECISIÓN SCIENTIFICO P.S 30 -110ºC.

- Horno marca THELCO. Temp Range to 200ºC.

- Microscopio L200 eléctrico binocular marca ZEIS.

- Balanza analítica marca EXCELL BH – 150. Cap: 150g DIv: 0.005g.

- Cocina eléctrica marca CHARITO de una hornilla.

- Moledor manual marca CORONA. Acero inoxidable.

- pHmetro BIOCHEMICALS INSTRUMENTS S.R.L. Portátil con

compensación automática de Temperatura. Rango 0.0 a 14,0 pH,

margen de error +/- 0.1.

- Espectrofotómetro marca Génesis

- Cámara Digital Pentax 8.2 megapixeles

- Memoria USB KINGTONS, 4 Gb.

- Computadora Pentium IV.

10.3. Material y Reactivos

- Matraces de 250 mL

- Asas bacteriológicas

- Reactivos para la tinción de Gram

- Tubos de vidrio (13 x100 mm y 15x 150 mm)

- Placas de Petri

- Pipetas de 1 mL y 10 mL

- Láminas portaobjetos

- Láminas cubreobjetos

- Solución salina fisiológica estéril.

- Viales

- Jeringas de 1 mL y 5 mL

- Espátula

10.4. Local

Laboratorio de Microbiología – Parasitología de la Facultad de Ciencias

Biológicas, Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo.

11.0 Presupuesto

02.00 Bienes S/.

2050,00

02.06 Material de escritorio S/. 130,00

- 04 juegos de etiquetas

- 03 lápices marcador

- 04 millares de papel Bond A4 75 g

- 06 lapiceros

- 06 lápices

- 02 correctores de tinta

- 04 rollos de pabilo

- 03 cuadernos

- 03 cintas de embalaje

02.09 Material de Laboratorio S/. 570,00

- Medio libre de nitrógeno con azul de bromotimol (NFb)

- Agar medio infusión de papa (BMS)

- Agar nutritivo

- Agar

- Solución salina fisiológica estéril

- Peróxido de hidrógeno

- Placas de Petri

- Frascos de boca ancha

- Tubos de dilución

- Tubos para pruebas bioquímicas

- Pipetas de 1 mL, 10 mL

- 04 asas bacteriológicas

- Agitadores de Vidrio

- Caja de Láminas portaobjetos

- Caja de Láminas cubreobjetos

- Algodón

- Jeringas de 5 mL, 1 mL

02.14 Material de impresión S/. 450,00

- 04 cartuchos de tinta para impresora en negro y a colores

- Memoria USB Kingston 4GB

02.16 Material fotográfico S/. 900,00

- Cámara digital

- Fotografías

03.00 Servicios S/. 2000,000

03.01 Pasajes y subvenciones S/. 800,00

- Movilidad a Lambayeque, 4 días por semana

- Movilidad a Chiclayo – Pomalca y viceversa

- Internet

- Impresiones: tipeos en computadora, copias fotostáticas

- Encuadernación

03.15 Publicaciones S/.300,00

- Publicación información total 6 ejemplares

03.24 Otros S/. 900,00

- Procesado revelado de películas: Fotografías y diapositivas

- Biorreactor tanque aireado con flujo descendente

- Análisis físico-químico del suelo

TOTAL S/. 4050,000

12. Financiación

El Presente proyecto de investigación será autofinanciado con el apoyo de la

Facultad de Ciencias Biológicas, Departamento Académico de Microbiología y

Parasitología de la Universidad Nacional “Pedro Ruiz Gallo”.

II. PLAN DE INVESTIGACIÓN

1. REALIDAD PROBLEMÁTICA

El arroz (Oryza sativa L.) es el alimento básico para más de la mitad de la

población mundial, y representa el segundo cereal con más hectáreas sembradas a

nivel mundial después del trigo. El Perú ocupa la posición 14 en producción a nivel

mundial con 1 664 700 Tm de arroz al año, superado por Colombia (2 100 000 Tm) y

Brasil (10 940 500 Tm), siendo China el mayor productor del mundo con 592 873 253

Tm anuales (Infoagro, 2008).

La forma más conocida y empleada para suplir las necesidades de nitrógeno

de los cultivos de arroz es la fertilización química, la cual representa una manera

rápida de reponer el nitrógeno perdido, sin embargo, bajo un manejo inadecuado

representa un riesgo ecológico por contaminación del suelo y del agua. Existe

discrepancia entre la cantidad de fertilizante nitrogenado aplicado y la que es

realmente utilizada por la planta (“bajo coeficiente de utilización”). Se ha determinado

que el nitrógeno aplicado a un cultivo está expuesto a pérdidas hasta del 67 %,

quedando un exceso de compuestos nitrogenados en el ecosistema lo que representa

la mayor fuente de contaminación por nitrógeno, tanto en la atmosfera (óxidos de N),

como en las aguas superficiales y profundas (nitratos).

La utilización de biofertilizantes constituidos por microorganismos que fijan el

nitrógeno, solubilizan nutrientes, producen hormonas y estimulan la protección frente

al ataque de plagas y patógenos, representa una alternativa para disminuir el uso de

fertilizantes químicos. Estos microorganismos denominados promotores del

crecimiento vegetal (PGPR) incluyen a bacterias del género Azospirillum spp. , de vida

libre, presentes en suelos a nivel mundial y capaz de fijar nitrógeno molecular del

medio ambiente, producir fitohormonas e incrementar la productividad agrícola.

A pesar de que existen productos comerciales de Azospirillum, su aplicación no

siempre es efectiva, por lo cual se prefiere el uso de microorganismos nativos,

adaptados a las condiciones climáticas y que puedan competir exitosamente con la

biota nativa.

1.1. Identificación del Problema

Uso irracional de fertilizantes químicos en gramíneas.

1.2. Delimitación del Problema

Caracterización de cepas nativas de Azospirillum spp. y su efecto en el

desarrollo vegetativo de Oryza sativa L. “arroz”.

2. PROBLEMA CIENTÍFICO

¿Cuál son las características de las cepas nativas de Azospirillum spp. y cuál es

su efecto como promotoras del desarrollo vegetativo de Oryza sativa L. “arroz” ?

3. HIPOTESIS

Cepas nativas de Azospirillum spp. fijan nitrógeno asimbióticamente, producen

ácido indolacético e incrementan el desarrollo vegetativo de Oryza sativa L.

“arroz”.

4. JUSTIFICACIÓN E IMPORTANCIA

Una de las principales actividades económicas en la región

Lambayeque es la agricultura, contando con 70,000 hectáreas de cultivo como el arroz

(MINAG, 2008). Para lograr rendimientos notables se requiere el uso de fertilizantes

químicos que suplementen su crecimiento pero a la vez su uso desmedido y

prolongado ocasiona graves consecuencias como infertilidad de suelos y por ende una

disminución en el potencial agrícola. Ante la problemática y buscando alternativas se

ha prestado especial atención al estudio de los microorganismos promotores del

crecimiento vegetal y a sus beneficios para la agricultura.

Las bacterias promotoras del crecimiento vegetal como Azospirillum spp tienen

la capacidad de fijar elementos nutritivos para la planta como nitrógeno y producir

metabolitos fitohormonales de interés agrícola, entre los que destaca el ácido indol

acético (AIA), que desempeña un papel fundamental en el crecimiento de los cultivos,

manteniendo la calidad de los suelos agrícolas por más tiempo, promoviendo de esta

manera el crecimiento de las plantas, y evitando la infección del tejido vegetal por

patógenos.

Una vez que las bacterias promotoras del crecimiento vegetal han sido

aisladas, deben ser caracterizadas en laboratorio e investigadas en su efectividad

sobre el desarrollo vegetativo en invernadero como requisito indispensable para su

inoculación y comercialización principal en campos, como biofertilizantes.

5. OBJETIVOS

5.1. Aislar cepas nativas de Azospirillum spp. de la rizósfera de Oryza sativa L.

“arroz” en campos agrícolas comerciales de Lambayeque.

5.2. Identificar fenotípica y bioquímicamente cepas nativas de Azospirillum spp.

5.3. Cuantificar el nitrógeno fijado por cepas nativas de Azospirillum spp.

5.4. Cuantificar el acido Indolacético producido por cepas nativas de

Azospirillum spp.

5.5. Determinar en condiciones de invernadero el efecto de la inoculación de

cepas nativas seleccionadas de Azospirillum spp. fijadoras de nitrógeno y

productoras de ácido indol acético en el desarrollo vegetativo Oryza sativa L.

“arroz”.

6. ANTECEDENTES

6.1. El Nitrógeno como nutriente

Todos los seres vivos necesitan nitrógeno (N2) para formar aminoácidos,

proteínas y ácidos nucleicos, pero el nitrógeno en la atmósfera no está presente de

forma que se pueda utilizar (Gardnier, 2005). El crecimiento del cultivo de arroz

depende de factores como el clima, agua y nutrientes accesibles a la planta (Murillo y

González, 1982). El nitrógeno es el nutriente más importante, y casi todos los suelos

son deficientes en este elemento (Cordero, 1993). Este elemento es absorbido en

forma de amonio (NH4+) o nitratos (NO3-) por las raíces vegetales, y es utilizado en el

interior de los tejidos para la síntesis de aminoácidos, que son translocados a las hojas

en donde se sintetizan las proteínas (Murillo y González, 1982).

La forma más conocida y empleada para suplir las necesidades de nitrógeno

de los cultivos de arroz es la fertilización química, la cual representa una manera

rápida de reponer el nitrógeno perdido. Sin embargo, bajo un manejo inadecuado

representa un riesgo ecológico por contaminación del suelo y del agua (Vergara y

Rangel, 1990). La dosis recomendada de nitrógeno varía según la variedad y el

sistema de cultivo empleado, pero en promedio es de 120 kg N/Ha. Se sugiere aplicar

el 40-50 % de la dosis en la fase de macollamiento, y el resto (50-60 %) en la época

de diferenciación del primordio floral. Para la fertilización del arroz de secano se puede

utilizar urea, sulfato de amonio o nitrato de amonio (Cordero, 1993).

Se conoce que el nitrógeno aplicado a un cultivo está expuesto a pérdidas

hasta del 67 %, por lo que para mejorar la eficiencia de la fertilización ésta se fracciona

entre dos y cuatro aplicaciones, durante el macollamiento, o sea cuando las plántulas

presentan cuatro hojas completamente desplegadas, y durante la formación de la

panícula, para favorecer la fase reproductiva (etapa de diferenciación del primordio

floral). No se recomienda fertilizar a la siembra, pues durante la fase de plántula la

absorción de nitrógeno es casi nula (Conitta, 1991).

Los síntomas de carencia de nitrógeno en los vegetales son: amarillamiento de

las hojas más viejas, empezando por el ápice y avanzando hasta la base , crecimiento

lento, tallos delgados, raíces con escaso desarrollo, floración restringida con notable

reflejo en la fructificación siendo los frutos pequeños y la maduración acelerada. Los

vegetales ahíjan poco y deficientemente así como son más susceptibles al ataque de

plagas, enfermedades y heladas (Horticasa, 2008).

6.2. Acido Indol acético como promotor del crecimiento vegetal.

El nombre de auxina es dado a un grupo de compuestos que estimulan la

elongación vegetal. El ácido indol acético (AIA) es la forma predominante, sin

embargo, evidencia reciente sugiere que existen otras auxinas indólicas naturales en

las plantas. Aunque las auxinas están en toda la planta, las mayores concentraciones

se localizan en las regiones meristemáticas en crecimiento activo. Se les encuentra

tanto como moléculas libres o en formas conjugadas inactivas. La concentración de

auxina libre en planta varía de 1 a 100 mg/Kg peso fresco. Las auxinas han sido

implicadas en la regulación de procesos fisiológicos como promoción del crecimiento y

diferenciación celular, y por lo tanto en el crecimiento en longitud de la planta,

estimulación del crecimiento y maduración de frutos, floración, senectud, geotropismo,

fototropismo, retardo de caída de hojas, flores y frutos jóvenes y la dominancia apical

(Gonzales et al., 1999).

La dominancia apical está relacionada con el transporte de auxina por medio

de un mecanismo dependiente de energía alejándose en forma basipétala desde el

punto apical de la planta hacia su base. Este flujo de auxina reprime el desarrollo de

brotes axilares laterales a lo largo del tallo, manteniendo de esta forma la dominancia

apical (Arteca, 1996). Las auxinas son producidas en las pantas a partir del

catabolismo de triptófano lo cual se observó en ensayos en donde al colocar triptófano

éste era catabolizado por el tejido en AIA, aumentando su concentración en el mismo

(Salisbury et al., 1994; Taiz y Zeiger, 2006).

6.3. Azospirillum como promotor del crecimiento en gramíneas

El género Azospirillum fue descubierto por Beijerinck, quien lo nombró como

Spirillum lipoferum en 1925 (Döbereiner, 1980), y fue caracterizado por Döbereiner y

Day en la década de 1970 (Okon et al., 1976, citados por Vergara y Rangel, 1990). En

1978 fue reclasificado por Tarrand, Krieg y Döbereiner, quienes basados en estudios

de homología del ADN describieron el nuevo género Azospirillum, con dos especies:

A. lipoferum y A. brasilense.

El género Azospirillum, comprende bacterias del suelo de vida libre,

rizobacterias consideradas promotoras de crecimiento vegetal por su capacidad de

fijación de nitrógeno atmosférico y producción de fitohormonas, sideróforos y

mejoramiento del sistema de absorción radical y relación agua/planta (Tarrant, 1978;

Dobereiner, 1991; Okon y Labandera, 1994; Baldani, 1999; Cassán, et al., 2003)

Azospirillum es una α-proteobacteria, Gram negativa que utiliza como fuente

nitrogenada sustratos como el amonio, nitrato, nitrito, aminoácidos y nitrógeno

molecular. En condiciones desfavorables como desecación y carencia de nutrientes,

pueden enquistar, recubriéndose de una capa de polisacáridos, produciendo una

acumulación de gránulos de β-hidroxibutirato, que sirven a la bacteria de reserva de

fuente carbonada. Presenta quimiotaxis positiva hacia ácidos orgánicos, azucares,

aminoácidos, compuestos aromáticos y hacia exudados radicales. Esta capacidad de

migración es altamente dependiente de la actividad del suelo. Este género tiende a

dirigirse hacia lugares donde la concentración de oxigeno es la adecuada (aerotaxia).

Su comportamiento le permite a la bacteria dirigirse hacia un nicho ecológico

apropiado en la rizósfera donde realiza la fijación biológica de nitrógeno y sustancias

estimuladoras del crecimiento. (Collados, 2006).

Glick et al., (1999) sostienen que en la microbiota del suelo conviven distintos

géneros bacterianos. Estos se encuentran preferentemente interactuando con las

raíces de las plantas y su acción puede ser benéfica, perjudicial o neutral desde el

punto de vista del desarrollo y crecimiento vegetal. Aquellas bacterias rizosféricas

como Azospirillum spp. capaces de impactar positivamente sobre el crecimiento de

cualquier especie vegetal, son comúnmente conocidas como Bacterias Promotoras del

Crecimiento Vegetal PGPR (Plant Growth Promoting Rhizobacteria).

Las bacterias del género Azospirillum han sido, a la fecha, las más estudiadas

entre las PGPR. Según una revisión de Okon y Labandera González (1994) que reúne

información de 20 años de experimentación a campo, el porcentaje de éxito debido a

la inoculación con Azospirillum es de 60 a 70%. Estos ensayos fueron realizados en

diferentes suelos y regiones climáticas, y con distintos cultivos de importancia

agronómica, logrando incrementos en rendimiento del orden del 5 a 30%. Asimismo

Motsara et al. (1995) determinaron que en cultivos como arroz, maíz, trigo y caña de

azúcar, Azospirillum puede incrementar el rendimiento entre 15 y 30 %.

Azospirillum produce sustancias promotoras del crecimiento, como ácido indol

acético, citocininas, giberelinas (Monzón de Asconegui, 2003; Cacciari et al, 1989),

sustancias que estimulan la densidad y largo de los pelos radicales, la aparición de

raíces laterales y el volumen radical; permitiendo que el potencial de absorción de

nutrientes y agua se eleve, beneficio que en el caso de los cultivos de zonas áridas y

semiáridas constituye una ventaja aún mayor (Di Barbaro et al. 2005).

Se ha demostrado que las plantas inoculadas con Azospirillum spp. absorben

más rápido minerales de la solución y, consecuentemente, acumulan más materia

seca, N, P y K en tallos y hojas (Puente y Peticari, 2006). Las fitohormonas podrían

ser las responsables del mejor crecimiento de la raíz y de la parte aérea de las plantas

debido a que los efectos de la inoculación son similares a los que se observan cuando

las plantas son tratadas con estas sustancias.( Tien et al., 1979)

7. MATERIAL Y MÉTODOS

7.1. Material

7.1.1 Material biológico

- Muestras de rizósfera de Oryza sativa L. “arroz” obtenidas de campos

agrícolas del distrito de Pomalca, provincia de Chiclayo, región de

Lambayeque.

- Semillas de arroz Oryza sativa L. “arroz”

7.1.2 Material de laboratorio

- Placas de Petri

- Láminas portaobjetos y laminillas cubreobjetos

- Tubos de vidrio (13 x 100 mm y 15 x 150 mm)

- Pipetas de 1 mL y 10 mL.

- Asas bacteriológicas

- Agitador de vidrio

- Bolsas de algodón de 500 g

7.1.2. Medios de Cultivo (Anexo 1)

- Agar Nutritivo

- Medio libre de nitrógeno con azul de bromotimol (NFb) semisólido

- Medio libre de nitrógeno con azul de bromotimol (NFb) sólido

- Medio Rojo de Congo Acido málico

-Caldo extracto de suelo 10%

-Caldo tripticasa de soya suplementada con triptofano

7.1.3. Reactivos y Colorantes

- Colorantes para tinción de Gram.

- Peróxido de hidrógeno.

- Tiras reactivas para oxidasa.

- Azul de bromotimol.

- Reactivo de Salkowski

- Solución Oxidante para determinación de Amonio

- Solución salina fisiológica estéril

- Hipoclorito de sodio (NaClO) al 5%

- Solución acuosa de Rojo de Congo (1:400)

7.1.4. Otros

- Semillas de Oryza sativa L. “arroz”

- Extracto de levadura.

- Fertilizante nitrogenado: Urea (46% N)

- Macetas.

- Biorreactor tanque tipo Batch con flujo de aire descendente.

- Tamizador.

- Espátulas.

- Bolsas plásticas.

7.2. Métodos

7.2.1 Población y muestra de estudio

La población estará constituida por bacterias del genero Azospirillum presentes

en la rizósfera de Oryza sativa L. “arroz”, de campos agrícolas del distrito de Pomalca,

provincia de Chiclayo en la región de Lambayeque y la muestra estará constituida por

96 cepas de Azospirillum spp.; número que fue calculado según la fórmula

mencionada por Alvitres (Alvitres, 2000)

Z2 (p.q) T2n =

3,84 (0,20 x 0,80)

0,0064

T2

n =

n = 96

Donde:

n = tamaño de muestra

Z = 1,96 (α = 0,05), valor estándar

p = 0,20, presencia de Azospirillum spp. en la rizósfera de arroz.

q = ausencia, 1 – p: 0,80

T = error permitido: 8%

7.2.2. Primera Fase: Aislamiento, identificación y selección de cepas nativas de

Azospirillum spp. fijadoras de nitrógeno.

a. Zona de muestreo

Para aislar cepas nativas de Azospirillum sp. fijadoras de nitrógeno se

tomarán muestras de raíces de cultivos de arroz, establecidos en campos

agrícolas del distrito de Pomalca, provincia de Chiclayo, región de Lambayeque.

El distrito de Pomalca está comprendido entre los paralelos 6º 45’ y

6º 46’ de latitud sur y los meridianos 79º 46’ y 79º 48’ de longitud oeste. La zona

presenta un clima subtropical árido, con un rango de temperatura media de 35,7ºC

hasta máxima absoluta de 32,5 ºC.

b. Obtención de muestras de rizósfera

Cada muestra consistirá en extraer todas las raíces de plantas de arroz,

cultivadas en campos comerciales del distrito de Pomalca, región de Lambayeque

y que se encuentren al final del ciclo vegetativo poco antes de la cosecha. Cada

una de las muestras será depositada en bolsas plásticas debidamente etiquetadas

e inmediatamente serán transportadas para su procesamiento en el laboratorio de

Microbiología y Parasitología de la Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad

Nacional Pedro Ruiz Gallo, Lambayeque.

c. Aislamiento de cultivos puros de bacterias fijadoras de nitrógeno.

(Dobereiner, 1980)

Se tomarán las raíces de las plantas de arroz y se lavarán

generosamente con agua potable hasta eliminar el suelo remanente. A

continuación se cortarán secciones de raíces de aproximadamente 5 cm de

longitud (desde el extremo final hacia arriba), se depositarán en un vaso de

precipitación y desinfectarán superficialmente con hipoclorito de sodio (NaClO) al

2 % durante 5 minutos y luego se enjuagarán dos veces consecutivas con agua

destilada estéril. Después se depositarán las raíces en una mayólica desinfestada

con alcohol, y se cortarán en fragmentos de un tamaño aproximado de 2 cm de

longitud y luego se enjuagarán con agua destilada estéril.

Se realizará el enriquecimiento de cada una de las muestras para favorecer el

crecimiento de microorganismos fijadores de nitrógeno para lo cual las raíces se

depositarán (con pinza o con asa bacteriológica en anillo) de 10 a 15 mm por

debajo de la superficie en tubos con 6 mL de medio libre de nitrógeno con azul de

bromotimol (NFb) semisólido, a razón de un fragmento por tubo. La incubación se

realizará en aerobiosis a 28º C por 1 semana y se seleccionaran los tubos donde

se observe el viraje del color del medio de verde a azul y la presencia de una

película gruesa blanquecina ubicada entre 3 a 5 mm bajo la superficie. Se tomará

una alícuota de la película y se preparará una suspensión en 1 mL de solución

salina fisiológica estéril, y luego se sembrará por agotamiento y estría en placas

con medio NFb sólido complementado con 20 mg/L de extracto de levadura y se

incubarán a 28º C durante 5 días, transcurrido los cuales en caso positivo se

observarán colonias blanquecinas y pequeñas con viraje del medio del verde al

color azul.

A continuación, se realizará tinción de Gram y en caso de que se

observen bacilos pequeños Gram negativos, se seleccionará la colonia y se

sembrará (puntura) en medio NFb semisólido en aerobiosis a 28º C por 1 semana

hasta que se observe el viraje del color del medio de verde al azul y la presencia

de una película gruesa blanquecina entre 3 a 5 mm bajo la superficie. En caso

positivo se tomará una alícuota y se sembrará por agotamiento y estría en placas

de Petri que contengan medio Rojo Congo ácido málico por 48 a 72 h a 28°C.

Luego se seleccionaran las colonias rojo escarlata, y se realizara tinción de Gram

para confirmar la morfología y reacción, y se sembrarán en placas de Petri con

agar nutritivo y posteriormente en viales con la finalidad de obtener cultivos puros

para su posterior caracterización.

d. Identificación a nivel de género de Azospirillum spp.

La identificación a nivel de género de las bacterias nativas fijadoras de

nitrógeno se realizará en función de las características morfológicas y fisiológicas

según el Manual de Bergey de Bacteriología Determinativa (Holt et al., 1994)

e. Detección y cuantificación de ácido Indolacético, AIA “in Vitro”

Se obtendrá una suspensión celular en solución salina fisiológica 0.85%

estéril de cada una de las cepas nativas de Azospirillum spp. cultivadas

previamente en agar nutritivo por 48 horas, y se ajustará su concentración en

1x108 UFC mL-1 con ayuda de una cámara de Neubauer. A continuación se

inoculará 1mL de cada suspensión bacteriana de Azospirillum spp. en tubos de 15

x 150 mm conteniendo 5 mL de caldo tripticasa soya suplementado con triptófano

(0,01 g L -1), a 30 °C durante 72 horas. Luego se centrifugará a 1000 rpm durante

15 minutos.

Se transferirán 0,4 mL del sobrenadante hacia tubos de 13 x 75 mm y se

agregarán 1,6 mL de reactivo Salkowski modificado (relación 4:1). Se mezclarán y

dejarán en reposo en oscuridad durante 30 minutos, posteriormente se observará

una coloración violácea y se medirá la absorvancia en el espectrofotómetro a 530

nm. Las concentraciones se calcularán ajustando la curva de calibración.

f. Cuantificación de la fijación biológica de nitrógeno, FNB “in vitro.”

Se obtendrá una suspensión celular en solución salina fisiológica 0.85%

estéril de cada una de las cepas nativas de Azospirillum spp. cultivadas

previamente en agar nutritivo por 48 horas, y se ajustará su concentración en

1x108 UFC mL-1 con ayuda de una cámara de Neubauer. A continuación se

inoculará 1mL de cada suspensión bacteriana de Azospirillum spp. en tubos de

15 x 150 mm conteniendo 5 mL de caldo extracto de suelo al 10% a 30ºC durante

72 horas en agitación constante (150 rpm). Luego se transferirán 5 mL del caldo

cultivado a frascos de penicilina de 50 mL y se agregarán 15 mL de KCl 2M, y se

dejarán en agitación constante (150 rpm) durante 1 hora y luego se dejarán en

reposo durante 1 hora adicional.

Posteriormente se tomarán 10 mL del sobrenadante y se centrifugarán

(2000 rpm) durante 20 minutos. Luego se verterá el sobrenadante hacia tubos de

dilución (la biomasa quedará en el fondo del tubo de centrífuga), se añadirán

0,4 mL de solución alcohólica de fenol al 10 %, 0,4 mL de nitroprusiato de sodio al

0,5 % y 1 mL de solución oxidante, y se agitarán para mezclar. Se dejarán en

reposo durante 1 hora. Finalmente se leerán las absorvancias en

espectrofotómeto a 632,9 nm y se calcularán las concentraciones en una recta

patrón construidas a partir de diluciones sucesivas de un patrón de 100 ppm de

cloruro de amonio.

7.2.3 Segunda Fase: Efecto de cepas nativas de Azospirillum spp. fijadoras de

nitrógeno y productoras de ácido indolacético en el desarrollo vegetativo de

Oryza sativa L. “arroz” en condiciones de invernadero.

Para determinar el efecto de la inoculación de Azospirillum spp. en el

desarrollo vegetativo de Oryza sativa L. “arroz”, se obtendrá una suspensión

bacteriana en solución salina fisiológica de cada una de las cuatro cepas nativas

de Azospirillum spp. seleccionadas, y se hará dos inoculaciones una al momento

de la siembra y la segunda 35 días después de la siembra.

a. Siembra de semillas de Oryza sativa L. “arroz”

var. INIA 508-Tinajones.

Se utilizará un suelo de textura franco – arcillosa procedente de un

campo comercial de arroz, ubicado en el distrito de Pomalca, provincia de

Chiclayo, región Lambayeque.

Después de la caracterización físico – química, el suelo se

esterilizara en autoclave a 121°C, 15 libras de presión durante 3 horas y se

repartirá en macetas de 2,5 Kg de capacidad a razón de 2 Kg por maceta. A

continuación se realizará un riego hasta la saturación del suelo y se sembrarán

semillas de arroz var. INIA 508-Tinajones (diez por maceta), aproximadamente a

0.5 cm de profundidad. A los 35 días después de la siembra, las plántulas serán

raleadas eliminando las más pequeñas y dejando las cuatro más vigorosas por

maceta.

b. Fertilización nitrogenada

La dosis utilizada para la fertilización química será de 120 kg N/Ha

(100%), que en el experimento equivaldrá a 0,817 g de urea por maceta y se

aplicará en forma de disolución acuosa. La fertilización se fraccionará en dos

partes, la mitad a la siembra y la otra mitad 35 días después.

c. Inoculación de las cepas de Azospirillum spp.

Cada una de las cuatro cepas nativas de Azospirillum spp. que presenten

los valores mayores en la producción de ácido indol acético y en la fijación de

nitrógeno será cultivada en agar nutritivo (placas de Petri) a 30 °C por 48 horas.

La biomasa desarrollada se cosechará con solución salina fisiológica estéril y se

estandarizará su concentración entre 600 y 900 millones de células/mL.

Se realizaran dos inoculaciones, la primera a la siembra, añadiendo 20

mL de la suspensión de bacterias a cada una de las macetas y la segunda

inoculación se realizará 35 días después de la siembra, aplicando 10 mL de la

suspensión en la base de cada una de las plantas.

d. Determinación del peso de la biomasa seca aérea y radicular.

Transcurridos 70 días después de la siembra, las plantas serán extraídas

cuidadosamente y se separará el sistema aéreo del sistema radicular. Las raíces

se lavaran para eliminar el suelo adherido y para determinar el peso de la biomasa

seca, raíces y follaje serán introducidas en bolsas de papel y secadas a 80 °C por

48 horas en el caso del follaje, y a 100 °C por 24 horas en el caso de las raíces.

Transcurrido el tiempo de secado las muestras se pesaran en una balanza

analítica y se calculará el promedio g/planta en cada maceta.

7.2.4. Análisis estadístico de los datos

Los datos obtenidos se someterán a un Análisis de Varianza (ANAVA),

para determinar las diferencias estadísticas entre tratamientos y se empleará la

prueba discriminatoria de Tukey (α = 0.05) para determinar su nivel de significancia

entre ellos (Padrón, 1996).

7.2.5. Tipo de estudio y Diseño de contrastación de hipótesis

El trabajo de investigación será realizado en dos fases: en la primera fase

descriptiva se ejecutará el aislamiento, identificación a nivel de género, detección

y cuantificación de ácido indolacético y de la fijación biológica de nitrógeno “in

vitro”.

En la segunda fase correspondiente a una investigación experimental se

determinará el efecto de la inoculación de cepas nativas fijadoras de nitrógeno y

productoras de ácido indolacético en el desarrollo vegetativo de Oryza sativa L.

“arroz” en condiciones de invernadero. Se utilizará un diseño clásico experimental

completamente aleatorio (DCA), con 15 tratamientos y tres repeticiones,

totalizando 45 unidades experimentales.

Los tratamientos corresponderán a: 4 cepas de Azospirillum spp. nativas

fijadoras de nitrógeno (cepa 1, cepa 2, cepa 3, y cepa 4), dos testigos químicos

(fertilizante nitrogenado con 50% de urea y 100% urea ), 9 tratamientos que

combinan cada cepa con fertilizante nitrogenado al 50% y al 100% ( cepa 1 más

50% de urea , cepa 1 más 100% de urea, cepa 2 más 50% de urea, cepa 2 más

100% de urea, cepa 3 más 50% de urea, cepa 3 más 100% de urea, cepa 4 más

50% de urea y cepa 4 más 100% de urea) y un testigo absoluto (sin inóculo y sin

fertilizante).

8. Referencias bibliográficas

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ANEXO 1

MEDIOS DE CULTIVO

Medio libre de nitrógeno con azul de bromotimol, NFb (Motsara et al., 1995.)

COMPOSICIÓN g/L

Ácido málico 5

KOH 4

K2HPO4 0,5

FeSO4·7H2O trazas

MnSO4·7H2O 0,01

MgSO4·7H2O 0,01

NaCl 0,02

CaCl2 0,01

Na2MoO4 0,002

Azul de bromotimol (0,5 % m/v en etanol) 2 ml

Biotina 0,1 mg

Agua destilada 1000 ml

Ajustar el pH a 6,8 - 7,0 (color verde) con NaOH. Para medio semisólido añadir 2 g

de agar. Para medio sólido añadir 20 mg de extracto de levadura y 15 g de agar.

Medio rojo de Congo ácido málico

COMPOSICIÓN g/L

Ácido málico 5,0

K2HPO4 0,5

MgSO4.7H2O 0,2

NaCl 0,1

Extracto de levadura 0,5

FeCl3.6H2O 0,015

KOH 4,8

Solución acuosa de Rojo de Congo (1:400) 15 mL

Agua destilada 1 000 mL

Colocar la solución acuosa de Rojo de Congo al final, y ajustar el pH a 7,2. Para medio

solido añadir 20g de Agar.

Agar nutritivo (AN)

COMPOSICIÓN g/L

Peptona 5 Extracto de carne 3

Agar 15

Agua destilada 1000 ml

Ajustar el pH a 7,0

Caldo tripticasa soya suplementado con triptófano

COMPOSICIÓN g/L

Peptona de caseína 17.0g

Peptona de harina de soya 3.0g

D(+)Glucosa (o dextrosa) 2.5g

Cloruro de sodio 5.0g

Fosfato dipotásico 2.5g

Triptófano 0.01g

Agua destilada 1000 ml

Disolver por calentamiento y agitación, ajustar a pH 7,3.

Caldo extracto de suelo

COMPOSICIÓN g/L

K2HPO4 0,4

MgCl2 0,1

MgSO4.7H2O 0,05

FeCl3 0,01

CaCl2 0,1

Triptona 1,0

Extracto de levadura 1,0

Extracto de suelo al 10% 250 mL

Agua destilada 750 mL

Ajustar a pH 7,3. Para obtener extracto de suelo al 10 %, depositar en un matraz

250 g de suelo agrícola y 500 mL de agua destilada. Hervir 2 horas, completar a 500

mL con agua destilada y filtrar. Tomar sobrenadante 25 mL del filtrado y completar a

250 mL con agua destilada

ANEXO 2

Reactivo de Salkowski

COMPOSICIÓN g/L

H2SO4 Concentrado 150 mL

Agua destilada 250 mL

FeCl3 0.5 M en H2O destilada 7.5 mL

4 mL de reactivo + 1 mL de muestra

Solución oxidante para determinación de Amonio

COMPOSICIÓN g/L

Citrato de sodio 20g

Hidróxido de sodio 1g

Hipoclorito de sodioal 5% 2mL (Lejía comercial)

Agua destilada 100mL

_____________________________Msc. Carmen Rosa Carreño Farfán

Firma asesora

_____________________________Franklin Ignacio García Pastor

Firma autor (s)

_____________________________Harold Ángel Muñoz Cieza

Firma autor (s)

_____________________________Fecha de Presentación