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Caracterización Morfológica de losHemocitos del Pulpo Rojo, Octopus maya
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Authors Pascual-Jiménez, C.; Hernández-Franyutti, A.A.; Gómez-Guzmán,I.
Download date 07/09/2021 09:43:44
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Proceedings of the 64th Gulf and Caribbean Fisheries Institute October 31 - November 5, 2011 Puerto Morelos, Mexico
Caracterización Morfológica de los Hemocitos del Pulpo Rojo, Octopus maya
Morphological Characterization of Haemocytes of the Red Octopus, Octopus maya
La Caractérisation Morphologique des Hémocytes de la Pieuvre Rouge, Octopus maya
CRISTINA PASCUAL JIMÉNEZ1*, ARLETTE A. HERNÁNDEZ FRANYUTTI2, y IVÁN GÓMEZ GUZMÁN2 1Universidad Nacional Autónoma de México, Facultad de Ciencias Unidad Sisal,
Puerto de Abrigo s/n Sisal, Yucatán, México. *[email protected]. 2Laboratorio de Acuicultura Tropical, Área de
Biología de la Reproducción, División de Ciencias Biológicas, Universidad Juárez Autónoma de Tabasco, México.
RESUMEN
El pulpo rojo, Octopus maya, es una especie endémica de México de gran importancia económica que se distribuye en la
Península de Yucatán. La biología reproductiva, y la dinámica poblacional son algunos de los aspectos más estudiados de la especie,
pero se cuenta con un escaso conocimiento acerca de su sistema inmunológico. Los hemocitos o células sanguíneas constituyen una parte esencial de los mecanismos de defensa de los invertebrados marinos, por lo cual, el objetivo del presente trabajo fue realizar la
caracterización morfológica de los hemocitos de la hemolinfa y del órgano hematopoyético u órgano blanco, tomando en cuenta
criterios cualitativos y cuantitativos. Se compararon nueve tinciones siendo la más adecuada la tinción de Wright para frotis
sanguíneo. De acuerdo a las características del núcleo y presencia de gránulos citoplasmáticos las células fueron clasificadas en
granulares y hialinas. El diámetro del núcleo y de la célula fueron medidos (100X programa Axio Vision Carl Zeiss), y analizados
como criterios cuantitativos de diferenciación celular a través de un análisis de “T” o Mann Withney de acuerdo a la distribución y varianza de los datos. El diámetro del núcleo de los hemocitos granulosos fue significativamente mayor que el de los hemocitos
hialinos (p < 0.05). Los resultados señalan que el diámetro celular de los hemocitos del órgano blanco fue significativamente mayor
al diámetro de los hemocitos periféricos, lo cual pudiera estar asociado con la maduración de las células hematopoyéticas. Los resultados constituyen una base morfológica para la caracterización de los hemocitos de O. maya y datos de referencia para estudios
posteriores sobre respuesta inmune celular en el grupo Octopoda.
PALABRAS CLAVE: Hemocitos, pulpo rojo, Octopus maya, hematopoyético
INTRODUCCIÓN
El pulpo rojo, Octopus maya, es una especie endémica de la Península de Yucatán, México que sostiene una importante
pesquería. Su distribución es la más reducida entre todas las especies de cefalópodos con valor comercial. Durante mucho
tiempo fue confundido con el pulpo patón, Octopus vulgaris, especie ampliamente distribuida en el Atlántico, el Mediterrá-
neo, el Caribe y el Golfo de México. Los aspectos reproductivos de O. maya, como presentar desarrollo directo, así como el
número y tamaño de los huevos, permitieron su clasificación como otra especie (Voss y Solis 1966).
Los estudios sobre la biología de O. maya se han enfocado principalmente a aspectos ecológicos, reproductivos y sobre
genética poblacional (Ford 1992, Solis-Ramírez et al. 1997, Juárez 2011), sin embargo, el sistema inmunológico ha sido
poco estudiado. Las células periféricas o hemocitos se consideran la primera línea de los mecanismos de defensa de los
invertebrados. Los estudios realizados hasta ahora en cefalópodos señalan que los hemocitos presentan capacidad fagocítica,
de encapsulación y neutralización de sustancias extrañas, y que también participan en procesos de inflamación y regenera-
ción de heridas (Beuerlein et al. 2002). El órgano hematopoyético de los cefalópodos es comúnmente conocido como el
“órgano blanco”, aunque también es referido como la glándula de Hensen y glándula de Faussek (Stuart 1968, Cowden
1972). El órgano blanco esta localizado en el lóbulo orbital justo por debajo de los ojos y consiste de varios lóbulos, los
cuales están interconectados. Es un órgano de fácil ubicación y acceso, lo cual facilitó su temprana descripción a través de
análisis histológicos (Bolognari 1949, Cowden y Curtis 1974). Dos tipos de células, los hemocitoblastos y leucoblastos han
sido descritas en el órgano blanco de los cefalópodos. Los hemocitoblastos son células reticulares con un gran volumen
celular, abundante retículo endoplásmico y nucleólos, al parecer estas células son transformados en leucoblastos después de
una reducción del volumen celular y en el tamaño del núcleo. En los senos del órgano blanco, los leucocitos se desprenden
de los cordones y rápidamente entran al sistema circulatorio. Los hemocitos periféricos de O. vulgaris han sido clasificados
en hialinos y granulares (Novoa et al. 2002) de acuerdo a las características morfológicas observadas por microscopía
electrónica, lo cual incluye la presencia de gránulos y el radio citoplasmático.
En crustáceos, en donde ha sido ampliamente estudiado el sistema inmunológico, se ha observado que la amplificación
de los mecanismos de defensa está asociada al sistema profenoloxidasa (proFO) que se encuentra en el interior de los
gránulos de los hemocitos (Söderhal 1982, Söderhall y Smith 1983). El sistema es liberado directamente por estimulación
de los hemocitos con beta-glucanos (ßG) o lipopolisacaridos (LPS) de hongos y bacterias (Söderhäll y Häll 1984) o a través
de proteínas séricas de reconocimiento que alertan a los hemocitos (Vargas-Albores et al. 1996, 1997). El sistema proFO al
activarse genera algunos factores que estimulan a los hemocitos para eliminar el material extraño por medio de procesos
como fagocitosis, formación de nódulos y encapsulamiento (Söderhäll y Häll 1984, Sung et al. 1998). Uno de los mecanis-
mos más importantes de la respuesta inmunitaria realizada por los hemocitos es la fagocitosis. Durante el proceso se origina
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el fagolisosoma y se liberan sustancias líticas como el
peroxido, superóxido y derivados del óxido nítrico, los
cuales son biológicamente muy reactivos (Muñoz et al.
2000, Campa-Córdova et al. 2002). Este proceso es
conocido como estallido respiratorio y juega un papel muy
importante en la actividad microbicida de los hemocitos
(Song y Hsieh 1994).
Muchos de los mecanismos de defensa descritos en
invertebrados están vinculados a los hemocitos, lo cual
implica que el mantenimiento de la integridad biológica
depende fuertemente de la respuesta de estas células.
Desde este perspectiva, un mayor conocimiento de los
subtipos celulares otorga información básica para lograr un
mejor entendimiento del sistema inmunológico de las
especies. En el caso del pulpo Octopus maya existe poca
información al respecto, por lo cual, el objetivo del
presente trabajo fue caracterizar morfológicamente a los
hemocitos periféricos y del tejido hematopoyético, a través
de criterios cualitativos y cuantitativos.
MÉTODOS
Captura, Trasporte, y Mantenimiento de los
Organismos
Se colectaron sesenta y seis pulpos, en tres muestreos,
mediante el método de gareteo. Brevemente; en una
embarcación dotada de dos carrizos o jimbas de cuatro a
cinco metros de longitud, colocadas cada una en la proa y
popa respectivamente, a lo largo de éstas y a un costado del
bote se atan líneas de hilo nylon las cuales tienen en el
extremo libre de la línea una jaiba como carnada. El bote
entonces, se deja a la deriva; las líneas cuyo cebo es
atrapado por el pulpo manifiestan tensión y de inmediato se
extrae al organismo. En el presente trabajo la captura de
organismos se realizo en tres de los principales puertos de
captura comercial de O. maya; Seybaplaya, Sisal y Ría
Lagartos. El peso total de los organismos capturados
estuvo dentro del intervalo de 100.67 a 1,934.2 g. Los
pulpos recién capturados fueron colocados en un estanque
cerrado con capacidad de 250 L con agua de mar circulante
por medio de una bomba de agua sumergible. Una vez
capturados en promedio 20 organismos, la embarcación se
dirigió al muelle donde esperaba una camioneta y se
conecto el estanque de colecta a otro estanque de igual
capacidad con el objetivo de mantener en circulación el
agua durante el traslado al laboratorio de la UNAM
ubicado en Sisal, México. Los traslados tuvieron de cinco a
siete horas de duración. La temperatura de trasporte osciló
de 25 a 28ºC, y para disminuir el estrés generada por la
interacción entre los organismos, se colocaron tubos de
PVC de cuatro pulgadas, como refugios individuales. Una
vez en el laboratorio los organismos fueron colocados
individualmente en tanques de 80 L de capacidad, a una
temperatura de 27 a 28°C. Se utilizó aireación constante y
flujo de agua de mar pasada por filtros de 5 µm, a una tasa
de recambio equivalente al 300 % diario. En tales condicio-
nes es posible mantener niveles de nitrógeno amoniacal y
nitrito por debajo de 0.1 mg/L, el nitrato por debajo de 50
mg/L y de pH entre 7.7 y 8.2, estos valores han sido
recomendados como adecuados para el mantenimiento en
cautiverio de diferentes especies de Octopus, incluyendo a
O. maya (Hanlon y Forsythe 1985).
Obtención de Hemolinfa y Manejo del Órgano Blanco
El material de plástico y cristalería fue lavado con
ETOXA-CLEAN (Sigma) y la solución fisiológica
utilizada, (Alsever) fue filtrada con un Acrodisco de 0.2
µm para evitar reacción celular por endotoxinas. Al día
siguiente a la captura, los organismos fueron anestesiados
con baja temperatura, a 11ºC menos de la temperatura de
mantenimiento por varios minutos, esto permite que los
organismos se mantengan vivos para mantener la presión
arterial durante la extracción de la muestra (Cruz 2009).
Para ello se realizó una incisión profunda en el área dorsal
anterior a los ojos por medio de un bisturí, y la aorta dorsal
se obstruyó para mantener el pulso, se introdujo por
punción un catéter, el cual desembocó a un vial estéril de 5
ml; dependiendo del diámetro visual de la aorta, se usaron
agujas de 0.70 x 20 mm (21 ml/min) o de 0.90 x 25 mm
(35 ml/min). La muestra se mantuvo en frío de 4 a 8 °C. Se
utilizaron seis pulpos para la extracción del órgano blanco.
El tejido se colocó dentro de un vial con 2.0 ml de Alsever
formol al 10% para la fijación. Posteriormente fueron
macerados con un homogenizador por dos a tres minutos, y
filtrado a través de 60 - 80 µm para separar las células
(Sritunyalucksana et al. 2005).
Tinción y Caracterización de los Hemocitos
Se colocaron 10 µl de hemolinfa fresca en un portaob-
jetos limpio, seco y desgrasado para cada individuo,
haciendo de dos a cuatro frotis por muestra; se dejaron
secar a temperatura ambiente y fijados en metanol al 100%
durante un minuto, posteriormente fueron secados a
temperatura ambiente y teñidos. Se probaron nueve
técnicas de tinción para células; Giemsa, Hematoxilina y
Eosina variante de Gill, Wright para vertebrados de sangre
fría, Wright para aves, Tricrómica de Mallory, Azul de
toluidina, Sudan negro III, Rosa de bengala, Wright para
frotis sanguíneo (Humanson 1979, Ford 1992, Aguilar et
al. 1996, Sritunyalucksana et al. 2005). Siendo la última
técnica de tinción la mas adecuada para señalar la forma y
tamaño de la célula, del núcleo y de los gránulos citoplas-
máticos. Estas tres características fueron utilizadas para
caracterizar a los hemocitos en hialinas y granulares. Se
hizo el mismo procedimiento de coloración para los frotis
del órgano blanco. Los hemocitos se observaron en
objetivo de 100X en microscopio óptico Zeiss en campo
claro. Para criterios cuantitativos se midió el diámetro
celular y del núcleo con el programa AxioVision Rel.
4.7.2, 12.2008 de Carl Zeiss, Imaging Systems.
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Análisis Estadístico
Se corroboró la homogeneidad de varianza y la
distribución normal. Se realizaron análisis pareados (de T o
Mann Whithney) para determinar diferencias en el
diámetro del núcleo y de las células de acuerdo al sexo de
los pulpos, al tipo celular de los hemocitos periféricos, y al
tejido (hemolinfa y órgano blanco). Se trabajó con un 95%
de confianza con el programa Statistica versión 7 (Zar
1974).
RESULTADOS
Se analizaron un total de 108 frotis. La técnica de
Wright para frotis sanguíneo fue la más adecuada para
diferenciar los gránulos, por la coloración del citoplasma y
las características del núcleo. En base a estos criterios las
células fueron clasificadas como hemocitos granulosos y
hialinos. Los granulosos presentaron un diámetro celular de
5.58 µm + 0.78 µm. Su citoplasma se tiñó de rosa claro
albergando de 3 a 16 gránulos de diferente tamaño, los
cueles se tiñeron de violeta oscuro. Su núcleo se tiñó
también en violeta oscuro, de tamaño menor respecto al
cuerpo celular, con un diámetro de 3.68 µm + 0.82 µm, en
diversas formas (circular, amorfo u ovalado). Los hemoci-
tos granulosos pueden diferenciarse en dos subtipos: de
gránulos grandes, y los semigranulosos, con gránulos de
menor tamaño (Figura 1). Las células hialinas presentaron
un diámetro celular de 5.23 µm + 0.95 µm, el citoplasma
teñido de rosa claro, libre de gránulos o con la presencia de
uno o dos gránulos pequeños, con un núcleo teñido de
violeta intenso, el cual representa gran proporción del
cuerpo celular, con un valor promedio de diámetro de 3.16
µm + 0.61 µm, generalmente circular a oval (Figura 2). Los
hemocitos del órgano blanco se pueden clasificar en tres
grupos, nucleocitos, hialinocitos y granulocitos, presentan-
do diversidad morfológica, resultando en cinco clasifica-
ciones (Figura 3).
El diámetro de los hemocitos y de su núcleo fueron
utilizados como criterios cuantitativos para caracterizar los
subtipos celulares en la hemolinfa y también para comparar
a los hemocitos del órgano blanco con los periféricos. El
análisis de T indica que los hemocitos granulares tienen un
núcleo significativamente más grande que el de los
hemocitos hialinos (p < 0.05) (Figura 4). El diámetro
celular no presentó diferencia significativa entre los
hemocitos hialinos y granulares, con valores promedio de
5.23 y 5.58 µm, respectivamente. Los hemocitos del
órgano blanco (diámetro 10.50 a 11.97 µm) son mucho
mayores en tamaño que los hemocitos periféricos
(diámetro 5.23 a 5.58 µm). El diámetro celular y del núcleo
de los hemocitos periféricos y del órgano blanco no
presentó homogeneidad de varianza, por lo cual, se utilizó
un análisis no paramétrico (Mann Withney) para comparar-
los. Los resultados indican que el diámetro celular y el del
núcleo fue significativamente mayor en los hemocitos del
órgano blanco que en los de la hemolinfa (p < 0.05) (Figura
5). El diámetro celular en los hemocitos del órgano blanco
Figure 1. Hemocitos Granulares (HG) periféricos del Pul-po rojo, Octopus maya. Preparaciones con tinción Wright para frotis sanguíneo a 1000X. Barra correspondiente a 2 µm. Se señalan subestructuras celulares como: Gránulos (G); Grandes gránulos (GG); Citoplasma (C); y Núcleo (N).
Figure 2. Hemocitos Hialinos (H) periféricos del Pul Prepa-raciones con tinción Wright para frotis sanguíneo a 1000X. Barra correspondiente a 2 µm. po rojo, Octopus maya. Se señalan subestructuras celulares: Citoplasma (C); y Núcleo (N).
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no variaron significativamente entre granulares y hialinos,
pero sí presentó una diferencia en el tamaño celular el
nucleocito granuloso, siendo el de menor tamaño con
10.50 µm de diámetro.
DISCUSIÓN
La tinción de Wright para frotis sanguíneo resultó
adecuada para teñir los hemocitos de Octopus maya. Se
trata de un colorante directo, ya que no requiere de un
mordiente para actuar con el tejido. Sus sales ácidas y
básicas se unen a los componentes del núcleo y del
citoplasma. Esto da como resultados la observación clara y
precisa de las estructuras internas de los hemocitos con
mayor facilidad que las observadas con otras técnicas, sin
necesidad de usar otros colorantes para el contraste o
alguna técnica microscópica para la obtención de resulta-
dos, como la tinción de Giemsa reportado por González y
Arenas (2002), en el estudio sobre el ostión del norte,
Agropecten purpuratus, que se observó en microscopía de
contraste de fases. O también la tinción de May Grünwald-
Giemsa reportado por Delgado, et al. (2001) en el caracol
de río, Biomphalaria glabrata, donde se hizo un contraste
con el colorante de Wright y se observaron con microsco-
pía electrónica de barrido.
Los hemocitos de la hemolinfa y del órgano blanco del
pulpo Octopus maya son clasificados por primera vez con
base en criterios cualitativos, así como el primer estudio de
clasificación de hemocitos con base en características
cuantitativas del diámetro celular, del núcleo y de los
gránulos citoplasmáticos para el grupo Octopoda. Los
resultados obtenidos coinciden con las clasificaciones
hechas para moluscos permitiendo diferenciar y clasificar a
los hemocitos circulatorios del pulpo Octopus maya en
granulocitos y hialinocitos.
La clasificación de los hemocitos en la hemolinfa del
Octopus maya contrastan con los resultados presentados
por Novoa et al., (2002) en el pulpo común Octopus
vulgaris con microscopía electrónica de barrido, al mostrar
en su clasificación solo dos tipos de granulocitos en la
hemolinfa; del tipo I con núcleo en forma de riñón, con un
alto número de vacuolas y de gránulos electrodensos en su
citoplasma; y el tipo II con nucleólos, un alto número de
vacuolas y pocos gránulos electrodensos; estos hemocitos
podrían estar dentro de la clasificación hecha con la tinción
de Wright para granulocitos, correspondiendo a los
granulares con gránulos grandes, y los del tipo II corres-
pondiendo a los semigranuloso, o de gránulos de menor
tamaño.
Figure 3. Diámetro de núcleo y de los hemocitos del ór-gano hematopoyético del Pulpo Rojo, Octopus maya. Se referencian los subtipos celulares como:
Nucleocito hialino Nucleocito granuloso Hialinocito Granulocito Semigranulocito
Figure 5. Diámetro de núcleo y de los hemocitos de la he-molinfa y del órgano hematopoyético del Pulpo Rojo, Oc-topus maya. El tamaño de los hemocitos difirió entre los tejidos de manera significativa (p < 0.05) en el diámetro celular, lo cual pudiera estar asociado con la maduración de las células hematopoyéticas.
Figure 4. Diámetro del núcleo de los hemocitos periféricos del pulpo rojo Octopus maya. Valores promedio + E.S.
Señala diferencia significativa entre los subtipos celulares, hialinos y granulares, valor de p < 0.05.
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to primario con núcleo grande vesicular y mayor cantidad
de citoplasma, con niveles relativamente altos de ARN; el
leucoblasto secundario, de mayor tamaño con nucleólos
pequeños, el leucoblasto terciario frecuentemente observa-
do en fase mitótica, y el leucoblasto maduro, que se
distingue por su forma nuclear irregular con gránulos en el
citoplasma. En otros trabajos realizados en el órgano
blanco, el hemocito inmaduro es referenciado como
hemocitoblasto, y utilizan el término leucoblasto para los
hemocitos maduros (Ford 1997, Novoa 2002). No obstante
a las diferencias en la terminología, la descripción de la
maduración de los hemocitos del órgano blanco encontra-
dos en el presente trabajo corresponde con los estudios
realizados por Cowden (1972).
Los resultados obtenidos constituyen una base
morfológica para la caracterización y posible maduración
de los hemocitos del pulpo O. maya, así como datos de
referencia para estudios posteriores sobre respuesta inmune
celular en el grupo Octopoda.
AGRADECIMIENTOS Este estudio fue financiado por el proyecto de Fondo Mixto de
Fomento a la Investigación Científica y Tecnológica CONACYT-Gobierno del Estado de Yucatán, México. FOMIX 0108675. Los autores
queremos agradecer a Ariadna B. Sánchez Arteaga y Vianey E. Sosa Coh
por su participación en la obtención de las muestras de hemolinfa, a Estefany López Ripol, a Luis Yan y a Reyna Calva Fierro por encargarse
de la captura de los organismos, y finalmente a Richard Mena Loria por la
adaptación del sistema para el transporte de los pulpos.
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La medición del diámetro de las células en la hemolin-
fa no presentó diferencias significativas entre los subtipos
celulares, pero el diámetro del núcleo de los hemocitos
granulosos fue significativamente mayor que el de los
hemocitos hialinos. Existen pocos reportes en donde la
medición de las subestructuras de los hemocitos hayan sido
utilizados como criterios cualitativos de clasificación, por
lo cual los resultados de este trabajo son difíciles de
comparar, no obstante, existe un reporte del ostión
Agropecten purpuratus, donde los hialinocitos presentan
un menor tamaño celular, de 7.2 + 0.26 µm, en compara-
ción con los granulocitos de 12.5 + 0.35 µm (González y
Arenas 2002).
La presencia de gránulos intracelulares, el tamaño y
sus características, como ser fuertemente refringentes en
observaciones en campo claro, así como el número de
gránulos por hemocito han sido elementos altamente
utilizados para caracterizar los subtipos celulares en
vertebrados y invertebrados, ya que los gránulos están
vinculados a complejidad celular y a características
funcionales. Los gránulos de los hemocitos han sido
asociados con las funciones de producción de anión
superoxido de acuerdo a los estudios realizados por
González y Arenas (2002) en el ostión del norte, Agropec-
ten purpuratus. Cruz (2009), señala que el contenido de los
gránulos podría estar vinculado con los componentes del
sistema profenoloxidasa en Octopus maya. En los crustá-
ceos, grupo ampliamente estudiado, se ha encontrado que
el sistema profenoloxidasa está en el interior de los
gránulos de los granulocitos y semigranulosos, los cuales
son activados por componentes de bacterias y hongos (β-
glucanos o lipopolisacáridos), generando la degranulación
del profenoloxidasa, el cual es activado en el plasma por
una enzima tipo serin- proteasa según Johansson y
Söderhäll (1989).
El análisis de los hemocitos del órgano blanco
permitió diferenciar a los hemocitos en nucleocitos,
granulocitos y hialinocitos, mostrando tres subtipos
celulares para los granulocitos, dos para los hialinocitos,
diferenciados con base en la forma y tamaño del núcleo,
así como el contenido granular. Estos resultados contrastan
con los obtenidos por Ford (1992) en donde solo se
diferenciaron dos subtipos celulares del órgano blanco: los
hemocitoblastos, células reticulares con gran volumen de
citoplasma, abundante retículo endoplásmico rugoso, con
nucléolos; y los leucoblastos, vistos en la luz de los lóbulos
presentando una disminución del volumen citoplasmático y
del tamaño celular, y un núcleo bien formado. En el
presente estudio, el diámetro celular de los hemocitos del
órgano blanco fue significativamente mayor al diámetro de
los hemocitos periféricos, lo cual pudiera estar asociado
con la maduración de las células hematopoyéticas. Cowden
(1972), trabajó en la maduración del leucoblasto utilizando
cortes histológicos del órgano blanco de O. vulgaris;
diferenciando cuatro estadios de maduración: el leucoblas-
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