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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL CENTRO INTERDISCIPLINARIO DE INVESTIGACIÓN
PARA EL DERROLLO INTEGRAL REGIONAL UNIDAD SINALOA
“Caracterización genómica de Candidatus Liberibacter y otros microorganismos asociados a la enfermedad del Huanglongbing (HLB) en limón
mexicano”
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRÍA EN RECURSOS NATURALES Y MEDIO AMBIENTE
PRESENTA
IIA. JAEL ARELY CERVANTES SANTOS
GUASAVE, SINALOA, MÉXICO; DICIEMBRE DEL 2017
El presente trabajo de tesis se llevó a cabo en el Laboratorio de Biología Molecular
de Fitopatógenos del Departamento de Biotecnología Agrícola del Centro
Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo Integral Regional Unidad
Sinaloa del Instituto Politécnico Nacional (CIIDIR-IPN Unidad Sinaloa), bajo la
dirección de la Dra. Norma Elena Leyva López. El presente trabajo fue apoyado
económicamente a través de los proyectos SIP-IPN y CONACYT (PROINNOVA
242999). Adicionalmente, se agradece al IPN al Consejo Nacional de Ciencia y
Tecnología (CONACYT) por las becas otorgadas.
DEDICATORIA
Con todo mi cariño y mi amor para mis padres que hic ieron todo en la
vida para que yo pudiera lograr mis sueños, por motivarme a seguir
formándome como profesional para mi segundo logro, a ustedes por
s iempre mi corazón y mi agradecimiento. Los amo mucho.
A mi segunda mamá María Elena Santos Cervantes por todo su apoyo
incondicional en e l transcurso de mi carrera profes ional y mi maestr ía,
por su confianza y por darme esos consejos que se que es por mi bien. Con
toda mi admiración y cariño.
La preparación es la l lave del éxito
Alexander Graham Bel l
AGRADECIMIENTOS
A dios por darme fuerza y fe para lograr algo que cre ía imposible de
lograr .
A mis padres a quienes jamás encontraré la forma de agradecer e l car iño,
comprensión y apoyo brindado en los momentos buenos y malos de mi
vida, gracias por creer en mí y no dejarme caer . Este es mi segundo logro
que también es de ustedes . Los amo demasiado.
A mi t ía Malena que s iempre estuvo l ista para br indarme toda su ayuda,
gracias por su confianza y saberme escuchar y or ientar en cada una de
las s ituaciones que se presentaban, ahora me toca regresar un poquito de
todo lo inmenso que me ha otorgado. Muchas gracias la quiero mucho.
A mis hermanos Martín y Daniel por las r isas , las peleas , porque
s iempre están incondicionalmente para mi, los quiero.
A t i José Ernesto te dedico otro de mi logros y gracias por estar ahí tan
incondicional para mi, por tu apoyo, por saberme escuchar, por tu cariño
y compañía, por hacerme sonreír de cualquier forma solo por no verme
tr iste , también gracias por alentarme en mis momentos más bajos que
sentía no lograr mis retos . Por eso y muchas cosas más. Te amo.
A la Dra. Norma Elena Leyva López por darme la oportunidad de seguir
con mi formación profes ional , por su dedicación, paciencia, es base
fundamental de mi desarrol lo como persona, con e l cual por sus consejos ,
enseñanza y sabiduría sé cómo afrontar de la mejor manera los problemas
y obstáculos que a diario me voy a enfrentar . Mi admiración y respeto
Muchas Gracias .
Al Dr. Jesús Méndez Lozano y al Dr. Héctor Esparza Leal quienes me apoyaron
como parte de mi comité ́ de tes is , gracias por enriquecer mi formación
profesional y personalmente con sus val iosas sugerencias y conse jos .
Al Dr. Edgar Rodríguez por su gran apoyo a largo de mi trabajo de tes is
a pesar de no estar en mi comité , s iempre estuvo para apoyarme en todo
momento. Mi admiración y respeto, Muchas Gracias .
A mis amigos y compañeros del laboratorio , Zeiby, Carlos , Paulina,
Bric ia , María José y Edvin, que han s ido como hermanos y buenos amigos
en e l transcurso de mi maestr ía , como olvidar esos momentos de alegr ía ,
enojo y carr i i la . Gracias , los quiero.
A mis hermanitas virólogas, Karina, Gady y Cindy, por esos coffee t ime
de largas charlas que me hacían más agradables mis días , por su amistad
gracias , las quiero.
A mis compañeros virólogos Krysia, Nata, Tavo, Erika y Juanjo.
Gracias , s iempre seré la viróloga adoptada.
A mis compañeros de maestr ía , generación 2015-2017.
En especial a todas las personas y amigos, que s iempre están ahí
apoyándome y dándome fuerzas para sal ir adelante y no dejarme caer
fáci lmente. Ustedes son a quienes jamás encontraré la forma de agradecer
e l car iño, compresión, apoyo y motivación en los buenos y malos
momentos. Muchas gracias .
I
ÍNDICE GENERAL
ÍNDICE GENERAL………………………………………………………….................
I
ÍNDICE DE FIGURAS …………………………………………………………............ IV
ÍNDICE DE CUADROS…………………………………………………………........... V
GLOSARIO…………………………………………………………………………….... VI
RESUMEN…………………………………………………………………………….... VIII
ABSTRACT…………………………………………………………………………….. IX
1. INTRODUCCIÓN……………………………………………..…………………….. 1
2. ANTECEDENTES……………………………………………..……………………..
2.1 Limón mexicano……………………………………………………................
2.2 Importancia económica de los cítricos en México…………………............
2.3 Enfermedades que afectan el cultivo de limón mexicano………...............
2.4 Huanglongbing ………………………………………………………..............
2.4.1 Síntomas de HLB en hoja…………………………………............
2.4.2 Síntomas de HLB en frutos………………………………..............
2.5 Impacto económico del HLB en México…………………………….............
2.6 Organismos asociados al Huaglongbing……………………………...........
2.6.1 Candidatus Liberibacter spp………………………………............
2.6.2 Candidatus Phytoplasmas spp……………………………............
2.6.3 Bacterias endófitas ....................................................................
3
3
3
4
5
6
7
8
8
8
13
14
3. JUSTIFICACIÓN………………………………........................................................ 17
II
4. OBJETIVOS............................................................................................................
4.1 Objetivo general………………………………………………………………..
4.2 Objetivos específicos ………………………………………………………....
19
19
19
5. HIPÓTESIS............................................................................................................. 19
6. MATERIALES Y MÉTODOS……………………………….........…………................
6.1 Material vegetal…………………………………………………………..........
6.2 Colecta y procesamiento de la muestra............…...……………………….
6.3 Extracción de DNA....................................................................................
6.4 Extracción de DNA con el kit comercial Dneasy Plant Mini Kit.................
6.5 Detección de Candidatus Liberibacter asiaticus.…………………………...
6.6 Enriquecimiento del DNA de Ca. L. asiaticus y bacterias endófitas……...
6.7 Amplificación del genoma de Ca. L. asiaticus ………………..……………
6.8 Validación del enriquecimiento y amplificación por PCR en tiempo real...
6.9 Secuenciación masiva y análisis ……………………………..……………..
20
20
20
21
21
22
23
25
26
27
7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN…………………………....………………..……........
7.1 Primer ensayo...........................................................................................
7.1.1 Colecta de muestras.........................................................................
7.1.2 Detección de Candidatus Liberibacter, Candidatus Phytoplasma y
otros microorganismos en muestras de limón mexicano con
síntomas de HLB.............................................................................
7.1.3 Validación del enriquecimiento del DNA microbiano por PCR en
tiempo Real...................................................................................
7.1.4 Amplificación del genoma de Ca. L. asiaticus..................................
7.2 Segundo ensayo.......................................................................................
7.2.1 Colecta de muestras........................................................................
7.2.2 Detección de Candidatus Liberibacter, Candidatus Phytoplasma y
otros microorganismos en muestras de limón mexicano con
28
28
28
28
30
32
33
34
III
síntomas de HLB.............................................................................
7.2.3 Validación del enriquecimiento del DNA microbiano por PCR en
tiempo real......................................................................................
7.2.4 Identificación y ensamblado parcial de la bacteria “Candidatus
Liberibacter asiaticus”.....................................................................
34
36
37
7.2.5 Identificación de mircoorganismos endófitos……………………...... 42
8. CONCLUSIONES...................................................................................................
9. PERSPECTIVAS FUTURAS…………………………………………………………...
44
45
10. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS…………...................................................... 46
IV
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Distribución de la enfermedad Huanglongbing en
México……………......………………………….…………………….........
6
Figura 2. Síntomas de HLB en hojas de limón mexicano (Citrus
aurantofolia)…………………………………………………………...........
7
Figura 3. Síntomas característicos en frutos de árboles de naranja dulce
infectados con HLB…………………………………………………….......
8
Figura 4. Microscopia electrónica de células de Candidatus Liberibacter en
cítricos......……………………………………………………....................
9
Figura 5. Detección de Candidatus Liberibacter asiaticus en muestras de
limón mexicano mediante PCR punto final....………………………......
28
Figura 6. Detección de Candidatus Phytoplasma spp. en muestras de limón
mexicano mediante PCR anidado.…………………………………........
29
Figura 7. Detección generalista de bacterias en muestras de limón mexicano
mediante PCR punto final.......................………………………………...
29
Figura 8. Confirmación de la eliminación del DNA de planta en las muestras
enriquecidas en comparación de las muestras no enriquecidas..…....
30
Figura 9. Confirmación de la presencia de Candidatus Liberibacter asiaticus
en muestras enriquecidas en comparación con las muestras no
enriquecidas.…………………………………..........................................
31
Figura 10. Amplificación del genoma completo por amplificación por
desplazamiento múltiple (MDA) utilizando el REPLI-g Mini Kit
(QIAGEN)................................…………………….................................
32
Figura 11. Detección de bacterias generalistas en DNA amplificado mediante
PCR punto final.....………………………...............................................
33
Figura 12. Detección de Candidatus Liberibacter asiaticus en muestra de limón
mexicano mediante PCR punto final.....………………………………….
34
Figura 13. Detección de Candidatus Phytoplasma spp. en muestra de limón
mexicano mediante PCR anidado.…………………………………........
35
Figura 14. Detección generalista de bacterias en muestra de limón mexicano
mediante PCR punto final......…………………………………................
35
Confirmación de la eliminación del DNA de planta en la muestra A9
V
Figura 15. enriquecida en comparación de las muestras no enriquecida..…….... 36
Figura 16. Confirmación de la presencia de Candidatus Liberibacter asiaticus
en muestra enriquecida en comparación con la muestra no
enriquecida...........................................................................................
37
Figura 17. Análisis de calidad de las secuencias crudas....................................... 38
Figura 18. Análisis de la calidad de las secuencias procesadas........................... 38
Figura 19. Representación del alineamiento de contigs generados de novo vs
genoma de Candidatus Liberibacter asiaticus A4................................
41
V
ÍNDICE DE CUADROS
Cuadro 1. Descripción de los primers utilizados para la detección de
Candidatus Liberibacter spp. en muestras de limón
mexicano……………......………………………….…………………….....
22
Cuadro 2. Descripción de los primers utilizados para la detección de
Candidatus Phytoplasma spp. y bacterias generalistas en muestras
de limón mexicano.……………......………………………….……………
23
Cuadro 3. Praparación del buffer de desnaturalización (D1) y el buffer de
neutralización (N1)................................................................................
25
Cuadro 4. Preparación del master mix para el DNA
genómico……………………………………………………......................
26
Cuadro 5. Primers utilizados para la detección por PCR en tiempo real de
Candidatus Liberibacter asiaticus y DNA de planta en muestras de
limón mexicano.....................................................................................
27
Cuadro 6. Resultados de la detección por PCR en tiempo real de Candidatus
Liberibacter asiaticus………………………………….............................
33
Cuadro 7. Información sobre las bibliotecas realizadas........................................ 37
Cuadro 8. Mapeo de lecturas con la referencia de NCBI - Candidatus
Liberibacter asiaticus.…………………………………............................
39
Cuadro 9. Reporte BLAST de ensamble NL1CL1SS01 y NL1CL1SS02 bacteria
“Candidatus Liberibacter asiaticus......…………………………………...
41
Cuadro 10. Comparación de identidad con bases de datos biológicas (NCBI-
BLAST)......…………………………………............................................
42
Cuadro 11. Comparación de identidad de microorganismos con bases de datos
biológicas (NCBI-BLAST).....................................................................
43
VI
GLOSARIO
DNA. Abreviatura del ácido desoxiribonucleico. Es la molécula que contiene y
transmite la información genética de los organismos excepto en algunos tipos de
virus (retrovirus). Está formada por dos cadenas complementarias de nucleótidos
que se enrollan entre sí formando una doble hélice que se mantiene unida por
enlaces de hidrógeno entre bases complementarias. Los cuatro nucleótidos que
forman el DNA contienen las bases adenina (A), guanina (G), citosina (C) y timina
(T).
Electroforesis. Cualquiera de varias técnicas para la separación de
macromoléculas, basadas en la migración sobre un gel u otro medio sometido a
un fuerte campo eléctrico.
Enfermedad. Cualquier mal funcionamiento de las células y tejidos del
hospedante, que resulta de la irritación continua por un agente patogénico o factor
ambiental y que lleva al desarrollo de síntomas.
Floema. Tejido vegetal constituido por los vasos o conductos que transportan la
savia elaborada.
Hospedante. Planta que es invadida por un parásito y de la cual este obtiene sus
nutrientes.
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR por sus siglas en inglés). La PCR
es un método in vitro de síntesis de DNA en el que un segmento particular de éste
es específicamente amplificado al ser delimitado por un par de cebadores o
iniciadores que lo flanquean. Su copiado se logra en forma exponencial a través
de repetidos ciclos de diferentes periodos y temperaturas de incubación en
presencia de una enzima DNA polimerasa termoestable.
PCR anidado. Variante de la PCR punto final que comprende dos rondas de
amplificación con distintos pares de iniciadores o primers en cada una, con el fin
de incrementar la sensibilidad de detección. Primero se realiza una reacción con
los iniciadores externos para amplificar una región de DNA más extensa, que
VII
contiene el segmento diana. Después, con este producto de amplificación, se
ejecuta una segunda PCR con los iniciadores internos para amplificar la región
específica.
Primer. También conocido como oligonucleótido o cebador; corta secuencia de
ácido nucleico que contiene un grupo hidroxilo 3 ́; que forma pares de bases con
una hebra patrón complementaria y actúa como punto de inicio para la adición de
nucleótidos, con la finalidad de copiar la hebra patrón.
Síntoma. Reacciones o alteraciones internas y externas que sufre una planta
como resultado de su enfermedad.
VIII
RESUMEN
La citricultura es de suma importancia económica y social para México, su
producción, procesamiento e industrialización es una fuente de empleo importante
en el sector rural. Sin embargo, en los últimos años este sector es amenazado por
el Huanglongbing (HLB), que ha sido descrita como la enfermedad más
destructiva de los cítricos y está presente en las principales citriculturas del
mundo, incluido México. El HLB es causado por bacterias del género Candidatus
Liberibacter que a la fecha no se ha logrado su cultivo in vitro, lo que ha limitado
su estudio. La mayoría de las investigaciones se basan en el desarrollo de
estrategias de diagnóstico y recientemente se han realizado algunos estudios
genéticos y bioquímicos sobre la respuesta de la planta a la infección por el
patógeno e incluso ya se han secuenciado los genomas de Ca. Liberibacter
asiaticus, Ca. Liberibacter americanus y Ca. Liberibacter africanus proveniente de
insecto y plantas de naranja en Estados Unidos, Brasil, África y China. En México
se ha identificado a Candidatus Liberibacter asiaticus asociado al HLB pero no se
ha secuenciado el genoma de la bacteria. El comportamiento de la enfermedad en
limón mexicano ha sido devastador, a pesar que en los primeros estudios se
consideraba inicialmente al limón como una especie tolerante, sugiriendo que éste
podría ser diferente al caracterizado genómicamente en otros países. Por lo que el
objetivo de este trabajo fue caracterizar genómicamente a Candidatus Liberibacter
y otros microorganismos asociados con la enfermedad Huanglongbing (HLB) en
limón mexicano. Se utilizaron técnicas de enriquecimiento de DNA y
secuenciación masiva, los resultados obtenidos muestran que, aunque el
protocolo de enriquecimiento logró casi eliminar el DNA genómico de limón,
permanece el DNA de cloroplastos y mitocondrias de la planta, obteniendo un 0.1
a 0.2% de lecturas secuenciadas de CLas, obteniéndose aprox. 17,008 nt de
1,230,021 nt. Por otra parte se obtuvieron pocas secuencias de microorganismos
endófitos, esto se puede deber a las pocas lecturas que se encontraron de DNA
microbiano. Por lo que se suguiere que en futuros estudios deberán utilizarse
estrategias alternas para excluir dichos organelos.
IX
ABSTRACT
Citriculture is of great economic and social importance in Mexico, its
production, processing and industrialization is a major source of employment in the
rural sector. However, in recent years this sector has been threatened by
Huanglongbing (HLB), which has been described as the most destructive citrus
disease in the world, including Mexico. HLB is caused by a bacteria of the genus
Candidatus Liberibacter that to date has not been achieved in vitro culture, which
has limited its study. Most of the research is based on the development of
diagnostic strategies and recently some genetic and biochemical studies have
been carried out on citrus plants in response to pathogen infection and even the
genomes of Candidatus Liberibacter asiaticus, Candidatus Liberibacter americanus
and Candidatus Liberibacter africanus from insect and orange plants in the United
States, Brazil, Africa and China. In Mexico, it has only identified the causal agent
but the genome of the bacterium has not been sequenced, although the behavior
of HLB in mexican lime has been devastating, even though it was initially
considered to be a tolerant species, suggesting that it could be different from
genomically characterized in other countries. Therefore the objective of this work
was to characterize the Candidatus Liberibacter genome and to identify other
microorganisms associated with Huanglongbing disease (HLB) in mexican lime.
We used DNA enrichment techniques and massive sequencing, the results show
that although the enrichment protocol almost eliminated the genomic DNA of the
mexican lime, the DNA of chloroplasts and mitochondria of the plant remains,
obtaining 0.1 to 0.2% of readings sequenced of CLas, obtaining approx. 17,008 nt
of 1,230,021 nt. On the other hand, few sequences of endophytic microorganisms
were obtained, this may be due to the few readings that were found of microbial
DNA.It is suggested that in future studies alternative strategies should be used to
exclude said organelles.
1
1. INTRODUCCIÓN
La citricultura en México es una actividad de gran importancia económica ya
que es una fuente de empleos y de ingresos, con un valor aproximado de 20,450
millones de pesos. Esta superficie está plantada principalmente de naranja (Citrus
sinensis L. Osbeck) y limón mexicano (Citrus aurantifolia) distribuidas en 28
estados de la República Mexicana (SIAP-SAGARPA, 2016). Sin embargo,
actualmente se encuentra amenazada por la enfermedad del Huanglongbing
(HLB).
El agente causal del HLB es una bacteria Gram-negativa del subgrupo de las
α-proteobacterias, Candidatus Liberibacter (CL). A la fecha se conocen cuatro
especies: Candidatus Liberibacter asiaticus, ampliamente distribuida en los países
asiáticos y en el continente americano en países como EUA, Cuba, República
Dominicana, Belice y México; Candidatus Liberibacter africanus; registrada en
países africanos; Candidatus Liberibacter americanus, presente en Brasil y Asia.
Y recientemente se ha reportado una nueva especie, Candidatus Liberibacter
caribbeanus encontrada en Colombia. Además de las bacterias del grupo
Candidatus Liberibacter, Candidatus Phytoplasma phoenicium (Brasil), Candidatus
Phytoplasma asteris (China y México) y Candidatus Phytoplasma aurantifolia
(China), se han encontrado asociadas a los síntomas del HLB (Bové, 2006;
Teixeira et al., 2008; Chen et al., 2009; Lou et al., 2014; Arratia, 2014; Keremane
et al., 2015).
Candidatus Liberibacter y Candidatus Phytoplasma se hospedan en el
floema de las plantas, interfiriendo en el transporte de compuestos orgánicos.
Diversos autores han relacionado dicha interrupción con modificaciones en la ultra
estructura de la planta, provocando los síntomas visibles en los órganos aéreos de
la planta (moteado difuso y acorchamiento de la nervadura). Además, una
disminución en la disponibilidad de ortofosfato (Araya et al., 2006). Lo que trae
como consecuencia una acumulación masiva de almidón en cloroplastos,
desintegración de la estructura de los tilacoides y modificación de las membranas
fotosintéticas (Sasek et al., 1985; Yelle et al., 1989).
2
Hasta la fecha se han secuenciado los genomas de Candidatus Liberibacter
asiaticus, Candidatus Liberibacter americanus y Candidatus Liberibacter africanus.
Candidatus Liberibacter asiaticus se ha secuenciado en 9 ocasiones, 5
provenientes de Diaphorina citri con un tamaño de 1.23 MB en Florida (Duan et al.,
2009), 1.26 MB en Guangdong, China (Li et al., 2013), 1.19 MB en Japón (Katoh
et al., 2014), 1.23 MB en Guangdong, China (Wu et al., 2015a) y 1.25 MB en
Texas, USA (Kunta et al., 2017). También se ha secuenciado el genoma a partir de
árboles de mandarina con un tamaño de 1.21 MB en Guangdong, China (Zheng
et al., 2014a), árboles de limón real con un tamaño de 1.15 MB en California
(Zheng et al., 2014b), en árboles de naranja con un tamaño de 1.20 MB en San
Gabriel, California (Wu et al., 2015b) y en árboles de cítricos con un tamaño de
1.22 MB en Florida (Zheng et al., 2015).
Además de las bacterias causantes del HLB existen bacterias endófitas de
plantas que benefician directa o indirectamente al hospedante, por ejemplo, como
biocontrol de patógenos y tienen la capacidad de influir en los procesos biológicos
en sus hospedantes, tales como el estado nutricional, metabolismo y reproducción
(Meyer y Hoy, 2008). Estudios realizados en aislados de Diaphorina citri se ha
confirmado la presencia de Ca. Carsonella y Wolbachia (Meyer y Hoy, 2008; Saha
et al., 2012). Hasta la fecha la interacción del hospedante con otros
microorganismos es poco conocida, así mismo el papel que juegan estos
organismos dentro de su hospedante. Por lo que el objetivo de este trabajo fue
caracterizar genómicamente a Candidatus Liberibacter y otros microorganismos
asociados con la enfermedad Huanglongbing (HLB) en limón mexicano.
3
2. ANTECEDENTES
2.1 Limón mexicano
El limón ‘mexicano’ (Citrus aurantifolia, Christm., Swingle) también conocido
como limón verde o lima agria, es originario de Asia (posiblemente del
Archipiélago de India), desde donde fue trasportado a Egipto, Europa y
posteriormente a América (Eckert y Eask, 1989; Dussel, 2002). El cultivo de limón
mexicano se desarrolla principalmente en las regiones tropicales, subtropicales y
semi-tropicales del planeta. El limón mexicano llegó al país para ocupar un lugar
importante en la citricultura nacional. El limón mexicano puede ser un arbusto o
llegar a medir entre dos a cuatro metros de altura, con ramas delgadas, que
poseen espinas cortas. Los frutos del limón mexicano son de forma redonda-oval
de colores que van del verde oscuro brillante al amarillo, alcanzando tamaños que
no sobrepasan los 6.5 cm y tiene abundantes semillas, además de su jugo ácido y
un alto contenido de aceite esencial en la cáscara (Davies y Albrigo et al., 1994).
El limón mexicano se ubica dentro de las limas ácidas, junto con el limón persa
(Citrus latifolia, Tanaka); sin embargo, en términos generales, el limón mexicano
presenta diferencias en composición química respecto al limón persa. Algunas de
estas diferencias son; mayor acidez, alto contenido de aceite esencial, mejor
calidad de este aceite y menor cantidad de vitamina C (Dussel, 2002).
2.2 Importancia económica de los cítricos en México
Para México, la actividad citrícola representa una fuente importante de
empleos y de ingresos, con un valor aproximado de 20,450 millones de pesos
(SIAP-SAGARPA, 2016), y de la cual se generan más de 70,000 empleos directos,
250,000 indirectos y la contratación de 28 millones de jornales al año. Los cítricos
se producen en 28 estados. México es el segundo productor en la categoría de
limas y limones con una producción de 2.14 millones de toneladas, siendo
superado únicamente por India (2.5 millones de toneladas) (FAOSTAT, 2014).
4
2.3 Enfermedades que afectan a los cítricos
Los cítricos en general son afectados por diversas plagas y enfermedades
que tienen repercusiones en el desarrollo normal de los árboles y ocasionan daños
en el rendimiento y calidad de los frutos. En la actualidad, las enfermedades más
importantes que afectan a los cítricos son transmitidas por insectos que actúan
como vectores de agentes patógenos y ocasionan importantes pérdidas a la
citricultura. Entre las enfermedades más importantes que afectan el cultivo de
cítricos figura la tristeza de los cítricos, la cual es considerada como una de las
enfermedades más devastadoras dentro de la citricultura. El agente causante de la
enfermedad es el Virus de la tristeza de los cítricos (CTV) un miembro de la familia
Closteroviridae trasmitido por varias especies de áfidos, siendo su vector principal
Toxoptera citricida (Román et al., 2004). El Wood pocket o manchado sectorial del
fruto es una enfermedad ocasionada por un desorden genético que se presenta en
plantas de limón persa, la expresión de los síntomas depende de las condiciones
ambientales, principalmente de la temperatura y ambiente seco. La severidad de
los síntomas es variable, según las condiciones ambientales de cada año. La
leprosis de los cítricos causada por Citrus leprosis virus C (CiLV-C) o Citrus
leprosis virus N (CiLV-N) transmitida por varias especies de áfidos siendo su
vector principal Bravipalpus phoenicis, B. obovatus y B. californicus, además de
CTV también es una de las enfermedades más devastadoras en la industria
citrícola (SENASICA, 2013). El Stubborn de los cítricos es una enfermedad que
resulta importante sobre árboles jóvenes en ciertas áreas calientes y desérticas
siendo Spiroplasma citri el agente causal de la enfermedad. Otra enfermedad es la
clorosis variegada de los cítricos, cuyo agente causal es la bacteria Gram negativa
Xylella fastidiosa, la cual se encuentra limitada al xilema. La enfermedad llamada
Huanglongbing es causada por una bacteria todavía no cultivable que se restringe
al floema, perteneciente a la subdivisión α-proteobacteria conocida como
Candidatus Liberibacter spp. El HLB es una enfermedad devastadora de los
cítricos que está afectando a todas las áreas productoras de cítricos en el mundo.
Sin embargo, cabe mencionar que se han asociado a los mismos síntomas de la
5
enfermedad a otros organismos del género Candidatus Phytoplasma (Teixeira et
al., 2008; Chen et al., 2009).
2.4 Huanglongbing
La enfermedad es conocida como blotchy mottle, citrus greening,
enverdecimiento de los cítricos, yellow dragon disease y yellow shoot disease,
aunque el nombre oficial es “Huanglongbing” (HLB) que en mandarín significa
enfermedad del dragón amarillo, ya que hace referencia a la presencia de ramas
amarillentas presentes en las plantas de cítricos enfermas (da Graça, 1991;
Halbert y Manjunath, 2004). El HLB se considera actualmente como la enfermedad
más devastadora de los cítricos en el mundo (Halbert y Manjunath, 2004; Bové,
2006; Beattie et al., 2008).
La enfermedad es originaria de Asia su primera detección fue en 1890 en
China, también esta presente en Tailandia (1921), Vietnam (1934), Sudáfrica
(1947), Indonesia (1948), Filipinas (1950), Taiwán (1950), India (1966), Malasia
(1970), Arabia Saudita (1984) y Papua Nueva Guinea (2002). En África se
encuentra distribuida por la región oriental y meridional, aunque también está
presente en Camerún (1990). Ha sido reportada también en Sri Lanka,
Madagascar, Islas Reunión y Mauricio en el Océano Índico, en Santa Helena en el
Océano Atlántico y Yemen en la Península Arábica. Recientemente se ha
informado la presencia de la enfermedad en Brasil (2004), Florida (2005), Cuba
(2006), Luisiana (2008), República Dominicana (2008), Honduras (2009), Belice
(2009), México (2009), Guatemala (2010), Nicaragua (2010), Puerto Rico (2010),
Costa Rica (2011), Jamaica (2011), Argentina (2012), República Dominicana
(2012), Paraguay (2013), Barbados (2014) y Colombia (2014).
En México la primera detección de árboles con síntomas de HLB y la
confirmación de la presencia de Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) se hizó
en El Cuyo, Yucatán en julio de 2009. Hasta la fecha se ha reportado la detección
del HLB en 24 de 28 estados citrícolas que son Yucatán, Quintana Roo, Nayarit,
Jalisco, Sinaloa, Colima, Michoacán, Campeche, Baja California Sur, Hidalgo,
6
Chiapas, Tabasco, Zacatecas, Puebla, Guerrero, Oaxaca, Tamaulipas, Veracruz,
Baja California, Nuevo León, Querétaro, San Luis Potosí, Morelos y Sonora.
Encontrándose también la presencia del psílido vector sin presencia de la
enfermedad en el estado de Coahuila como se muestra en la figura 1 (SENASICA,
2017).
Figura 1. Distribución de la enfermedad del Huanglongbing en México.
Fuente: SENASICA, 2017.
2.4.1 Síntomas de HLB en hojas
Entre los síntomas de infección más comunes está la clorosis de las hojas,
misma que puede confundirse con la carencia de zinc. Los árboles afectados por
HLB pierden su capacidad productiva dependiendo de las variedades y la edad de
la planta afectada (Brlansky et al., 2007; Etxberria et al., 2009). Los tejidos a lo
7
largo de la nervadura de las hojas recién formadas y las venas secundarias se
tornan amarillos y la clorosis se difunde sobre las nervaduras laterales hasta que
la hoja se cae. Las hojas jóvenes afectadas permanecen de tamaño pequeño,
ocurriendo el proceso de forma más severa. En general presentan síntomas
parecidos a deficiencia de minerales de zinc, hierro, calcio, magnesio y
manganeso; presentan manchas circulares o angulares de color amarillo,
llegándose a tornar amarillas con manchas verdes (Timmer et al., 2003) (Figura 2).
Figura 2. Síntomas de HLB en hojas de limón mexicano (Citrus aurantifolia).
Fuente: http://www.senasica.gob.mx
2.4.2 Síntomas de HLB en frutos
Los frutos de cítricos dulces afectados contienen una baja cantidad de jugo,
además de poca concentración de sólidos solubles y azúcares, por lo que son
ácidos y no pueden utilizarse en la industria (sabor amargo). El fruto queda
deforme y se reduce su tamaño, internamente el fruto puede presentar diferentes
grados de maduración (lados oscuros, amarillos y otros verdes) (Bové, 2006;
Sagaram et al., 2009). En limón mexicano no se han detectado síntomas de
torcedura de frutos, maduración invertida o aborto de semillas, asociados a la
enfermedad del HLB (Robles et al., 2013) (Figura 3).
8
Figura 3. Síntomas característicos en frutos de árboles de naranja dulce infectados con HLB. A, deformación de frutos y columela central asimétrica; B, presencia de semillas atrofiadas y abortadas Fuente: Dirección General de Sanidad Vegetal
2.5 Impacto económico del HLB en México
En México antes de la llegada del HLB, se producían 1.3 millones de
toneladas de limón mexicano en cerca de 88 mil hectáreas con un valor de 3182
MDP; tan solo ocho años después, en el 2016, se redujó la producción y su valor
en un 23% (SIAP-SAGARPA, 2016). Bajo este contexto, el estado de Colima es
en donde se han observado las mayores pérdidas asociadas al HLB. Antes de su
llegada contribuía con el 48% de la producción nacional (626,895 ton) al contar
con un rendimiento de 23 ton/ha y actualmente la producción es de 218,203 ton
con un rendimiento de tan sólo 12 ton/ha, lo que representa una reducción de
producción del 58%.
2.6 Organismos asociados al Huanglongbing 2.6.1 Candidatus Liberibacter spp.
El organismo casual del HLB más ampliamente conocido es Candidatus
Liberibacter spp. Este patógeno es una bacteria gram negativa restringida al
floema y pertenece a la subdivisión α-Proteobacteria (Bové, 2006) (Figura 4).
A B
9
Figura 4. Microscopia electrónica de células de Ca. Liberibacter en cítricos. Fuente: Bové, 2006
Cuatro especies han sido identificadas, cada una causando los mismos
síntomas, pero con algunas características diferentes: Candidatus Liberibacter
africanus (CLaf), sensible al calor (20-25 ºC) y restringida a África (Bové, 2006);
Candidatus Liberibacter asiáticus (CLas), tolerante al calor (≤ 35ºC) y ampliamente
distribuida en el mundo (Asia, Oceanía y América) (Teixeira et al., 2005; Bové,
2006) y Candidatus Liberibacter americanus (CLam), sensible al calor (≤ 32ºC) y
presente sólo en Brasil, teniendo un 96% de similitud de la secuencia del gen 16S
rRNA de CLas o CLaf (Teixeira et al., 2005). Recientemente se ha reportado una
nueva especie, Candidatus Liberibacter caribbeanus presente en Diaphorina citri
distribuida en Colombia, es aproximadamente un 92-96% similar a Liberibacter
basandose en el análisis de secuencia del 16S rDNA, todavía no se conoce si
Candidatus Liberibacter caribbeanus se puede cultivar y si provoca los síntomas
del HLB en cítricos. Se reportó un título de la bacteria en psílido muy alto
(Keremane et al., 2015).
La transmisión de la bacteria ocurre en la naturaleza a través de insectos
psílidos; Diaphorina citri kuwayama, para las formas americana y asiática de
Candidatus liberibacter y Trioza erytreae del Guercio, para la especie africana.
También puede transmitirse experimentalmente a través de injerto y de la planta
parásita Cuscuta sp. Otra forma importante de diseminar el patógeno a grandes
10
distancias es mediante el traslado de yemas y plantas contaminadas, razón por la
cual los países afectados han implementado programas de certificación estrictos,
mediante los cuales garantizan que las plantas que llevan a campo están libres de
éste y otros patógenos (Duan et al., 2008).
Hasta la fecha se han secuenciado los genomas de Candidatus Liberibacter
asiaticus, Candidatus Liberibacter americanus y Candidatus Liberibacter africanus.
Candidatus Liberibacter asiaticus se ha secuenciado en nueve ocasiones, cinco
provenientes de Diaphorina citri con un tamaño de 1.23 MB en Florida (Duan et al.,
2009), 1.26 MB en Guangdong, China (Li et al., 2013), 1.19 MB en Japón (Katoh
et al., 2014), 1.23 MB en Guangdong, China (Wu et al., 2015a) y 1.25 MB en
Texas, USA (Kunta et al., 2017). También se ha secuenciado el genoma a partir de
árboles de mandarina con un tamaño de 1.21 MB en Guangdong, China (Zheng
et al., 2014a), árboles de limón real con un tamaño de 1.15 MB en California
(Zheng et al., 2014b), en árboles de naranja con un tamaño de 1.20 MB en San
Gabriel, California (Wu et al., 2015b) y en árboles de cítricos con un tamaño de
1.22 MB en Florida (Zheng et al., 2015).
Hasta el momento solo hay dos genomas completos de Candidatus
Liberibacter asiaticus, el genoma de 1.23 MB tiene un contenido medio de GC del
36.5%. También tiene 14 genes que codifican para NADH-deshidrogenasa,
componente principal de la cadena de transporte de electrones. Presenta una
ausencia de polifosfato quinasa y disfosfatasa inorgánica que metabolizan el
pirofosfato a fósforo inorgánico y ADP, debido a la falta de enzimas claves
implicadas con la fosforilación oxidativa, así como la ausencia de diversas
oxidasas terminales, se puede concluir que tiene una capacidad aeróbica limitada.
Como se ha predicho anteriormente CLas tiene la capacidad de metabolizar
glucosa y fructosa, pero no manosa, galactosa, ramnosa o celulosa (Duan et al.,
2009). Se encontró que tiene genes que codifican para una ATP/ADP translocasa
además de su ATP sintasa, lo que le permite sintetizar ATP, así como captar esta
fuente de energía directamente de su entorno. Dada a la presencia de genes del
ciclo del ácido tricarboxilico (TCA), sugiere que puede utilizar una serie de
11
aminoácidos como fuente de energía. (Glutamato, alanina, aspartato, glicina,
serina, treonina, metionina, cisteina, arginina, prolina, histidina, tirosina,
fenilalanina y triptofano; con excepción del triptofano y prolina, todos los demás
son componentes de la savia del floema) (Duan et al., 2009). CLas presenta genes
znvABC que pueden permitir que las bacterias capten este micronutriente del
floema, dando como resultado una deficiencia local de zinc y por lo tanto la
mimetización de los síntomas entre plantas con HLB o deficientes de zinc (Duan et
al., 2009). CLas presenta 30 genes implicados en la síntesis de flagelos; sin
embargo, a través de microscopía electrónica no hay evidencia que CLas este
flagelada (Bové, 2006) (figura 4). Pero se encontró que tiene un gen que codifica
la proteína del interruptor de motor de flagella, tres genes que codifican la proteína
motora de los flagelos y una proteína de motilidad de quimiotaxis (motB, motC y
motD) que parece ser un pseudogene (tal vez esto sea la causa de la falta de la
estructura).
Se reportaron dos genes circulares tipo bacteriófagos en el genoma de CLas
UF506, denominados SC1 y SC2, SC1 es un fago completamente funcional, con
un ciclo lítico que aparentemente se activa cuando su bacteria hospedante está
presente en plantas, pero no cuando está en psílidos. Y SC2 se replica como
plásmido de escisión cuando está presente en las plantas o psílidos, sugiriendo
que los genes del tipo bacteriófago son importantes para la infección y la
expresión de virulencia (Zhang et al., 2010).
El segundo genoma se obtuvo de la cepa japonesa Ishi-1 con un tamaño de
1.19 MB con un contenido de GC de 36.32 %. Una comparación entre CLas Ishi-1
y psy62 reveló 291 sustituciones de bases, pero la mayor diferencia en la cepa
Ishi-1 es la ausencia del fragmento de 33 KB. En psy62 este fragmento codifica 40
secuencias codificantes, donde se encuentra el gen de la polimerasa tipo
bacteriófago, entre los genes SC1 y SC2 en la región profágica. Ishi-1 solamente
cuenta con un gen de polimerasa tipo bacteriófago, mientras que psy62 tiene 2.
Por el contrario, gxpsy y UF506 llevan 3 genes. Ishi-1 transporta 2 genes de DNA
ligasa dependientes de NAD (CGUJ_05393, 05515), mientras que psy62
12
transporta 3 (CLIBASIA_00050, 05395, 05515). Estas diferencias sugieren que
Ishi-1 es distinta a otras cepas de Estados Unidos y China (Katoh et al., 2014).
En estudios de transcriptómica se encontró que Candidatus Liberibacter
asiaticus expresa diferencialmente genes críticos para la supervivencia y/o
patogenicidad en cualquiera de los hospedantes. Se han encontrado 182 genes
regulados en planta en comparación con el psílido, 16 genes regulados en psílido
y 183 no mostraron diferencias. Los genes implicados con la regulación
transcripcional, el sistema de transporte, sistema de secreción, el montaje de
flagelos, vía metabólica y la resistencia a estrés se cambian significativamente en
un hopedante para adaptarse a los distintos ambientes de planta e insecto (Yan et
al., 2013).
También hasta la fecha se ha secuenciado Candidatus Liberibacter
americanus en 2 ocasiones obtenidos de árboles de cítricos con un tamaño de
1.17 MB en Brasil (Lin et al., 2013) y 1.19 MB en Sao Paulo (Wulff et al., 2014).
Hasta el momento solo un hay un genoma completo de Candidatus Liberibacter
americanus, este genoma de 1.19 MB tiene un contenido medio de GC del
31.12%. CLam carece de tolC, que se encuentra en CLas. TolC es un componente
necesario del sistema de secreción tipo I, tanto para la secreción tipo I de
compuestos ofensivos como hemolisinas y el eflujo tipo I de compuestos
defensivos de plantas como las fitoalexinas (Reddy et al., 2007; Wulff et al., 2014).
Además de carecer de tolC, CLam también está perdiendo otros componentes del
sistema de secreción tipo I, incluyendo una proteína de fusión de membrana
predicha en CLas y ATPasa de secreción de tipo I encontrada en CLas. Al igual
que CLas no se encontraron las enzimas extracelulares en CLam, tales como
celulasas, pectinasas o endoglucanasas. También no se encontraron genes
implicados en la secreción tipo III o tipo IV (Duan et al., 2009; Wulff et al., 2014).
CLam parece tener mayor capacidad metabólica para algunos aminoácidos y
vitaminas que CLas, Lam_114 codifica para una enzima implicada en la segunda
etapa de la biosíntesis de la arginina que está ausente en CLas (Wulff et al.,
2014). CLam y CLas causan moteados asimétricos en hojas de cítricos; sin
13
embargo, los cítricos infectados por CLam sufren más síntomas que se asemejan
a la deficiencia de minerales, mostrando un amarillamiento mucho más intenso
(Lopes et al., 2009). CLam carece de un represor transcripcional rirA que
responde al hierro (Fe) y esta presente en otros genomas de Liberibacter así como
en la mayoría de otras α-proteobacterias. Aunque CLam carece del represor rirA,
CLas tiene un grupo de genes de transporte y asimilación de Fe (FTR1, Lam_506,
Lam_507, CKC_01660 y CKC_01665) y una peroxidasa dependiente de Fe
(Lam_508 y CKC_01670). Esta capacidad posiblemente más alta para la
absorción de Fe por CLam y la falta del represor pueden explicar el mayor fenotipo
de deficiencia del mineral observado en plantas de cítricos afectadas con CLam en
comparación con CLas (Wulff et al., 2014).
Y finalmente Candidatus Liberibacter africanus solamente se ha secuenciado
una vez a partir de Trioza erytreae con un tamaño de 1.19 MB en South África (Lin
et al., 2015).
2.6.2 Candidatus Phytoplasma spp.
Además de las bacterias del género candidato Liberibacter, se han
encontrado asociados a los síntomas del HLB a Candidatus Phytoplasma
phoenicium en Brasil (Teixeira, 2008), Candidatus Phytoplasma Asteris en China y
México (Chen et al., 2009; Arratia et al., 2014) y recientemente a Candidatus
Phytoplasma Aurantifolia en China (Lou et al., 2014). Los fitoplasmas son
bacterias patógenas de plantas que pueden causar pérdidas devastadoras en
diversos cultivos, tanto de bajo como de alto valor comercial alrededor del mundo
(Bertaccini, 2007, Lee et al., 2000). Estos patógenos son parásitos obligados de
plantas e insectos, y en la mayoría de los casos necesitan ambos hospedantes
para dispersarse en la naturaleza. En plantas permanecen principalmente
restringidos al floema (Doi et al., 1967; Whitcomb y Tully, 1989) e invaden
totalmente a la planta al moverse a través de los poros de los tubos cribosos que
dividen el floema.
14
Los fitoplasmas se transmiten a sus hospedantes por medio de insectos
vectores que se alimentan de los compuestos del floema de las plantas y se
replican intracelularmente tanto en la planta como en el insecto. Son parásitos
obligados, que necesitan de ambos hospedantes para dispersarse como lo han
comprobado estudios recientes y esta característica provoca la incapacidad para
poderlos cultivar in vitro (Bai et al., 2006).
2.6.3 Bacterias endófitas
Los microorganismos endosimbiontes o endófitos son aquellos organismos
que residen en el interior de otro organismo. Los endosimbiontes tienen la
capacidad de influir en los procesos biológicos en sus huéspedes, tales como el
estado nutricional, metabolismo y reproducción. Los endosimbiontes en insectos
se clasifican como endosimbiontes primarios o secundarios. Los simbiontes
primarios (obligados) son esenciales para el insecto debido a su papel en la
administración de nutrientes, mientras que simbiontes secundarios tienen un papel
útil, pero no es esencial para la supervivencia de insectos (El-Sayed y Ibrahim,
2015). En aislados de Diaphorina citri de diferentes orígenes geográficos se ha
confirmado la presencia de Wolbachia, Candidatus Carsonella ruddii y Candidatus
Profftella armatura, los cuales pueden influir en la fisiología y metabolismo del
psíllido (Meyer y Hoy, 2008; Saha et al., 2012; Chu et al., 2016).
Se han realizado algunos estudios sobre la presencia de endófitos en
cítricos. El hongo Physoderma citri fue uno de los primeros hongos endófitos que
se reportaron en Citrus sinensis (7). Además, se han aislado varias especies de
bacterias a partir del xilema de las raíces de limón rugoso (Citrus jambhiri)
destacando Achromobacter spp., Acinetobacter baumanni, A. lwoffii, Alcaligenes-
Moraxella spp., Alcaligenes sp., Arthrobacter spp., Bacillus spp., Burkholderia
cepacia, Citrobacter freundii, Corynebacterium spp., Curtobacterium
flaccumfaciens, Enterobacter cloacae, E. aerogenes, Methylobacterium
extorquens, Pantoea agglomerans, Pseudomonas aeruginosa y Pseudomonas spp
(Araújo et al., 2001; Gardner et al., 1982; Gardner et al., 1985).
15
Araújo et al. (2002) evaluaron la comunidad bacteriana en cítricos sanos,
cítricos asintomáticos y cítricos infectados por Xylella fastidiosa. Los aislados
dominantes fueron Bacillus pumilus, Curtobacterium flaccumfaciens, Enterobacter
cloacae, Methylobacterium spp. (incluyendo Methylobacterium extorquens, M.
Fujisawaense, M. Mesophilicum, M. Radiotolerans y M. Zatmanii), Nocardia sp.,
Pantoea agglomerans y Xanthomonas campestris. Encontrándose con mayor
frecuencia Curtobacterium flaccumfaciens en cítricos asintomáticos. Por el
contrario, se observó una relación entre los síntomas de la clorosis variegada
causada por Xylella fastidiosa y la frecuencia de las especies Methylobacterium,
que fue el género más frecuente en plantas sintomáticas, mientras que P.
agglomerans se aisló frecuentemente de plantas de mandarina y naranja dulce
independientemente si las plantas eran asintomáticas o sintomáticas (Araújo et al.,
2002).
Estudios de metagenómica confirmaron la presencia en mayor proporción de
la bacteria causante del HLB Candidatus Liberibacter (83.7%), seguido por
Nitrospina gracilis (7.15%) en muestras de floema de cítricos infectados con HLB.
En este mismo estudio se descartó la presencia de viroides conocidos presentes
en el floema (Tyler et al., 2009).
Un estudio de caracterización de la comunidad microbiana en plantas de
cítricos infectados con CLas tratados con antibióticos encontraron 58 Phylos, los
más abundantes fueron las Proteobacterias (44.1%), Firmicutes (23.5%),
Actinobacterias (12.4%), Bacteroidetes (6.6%) y Cianobacterias (3.2%). Las
muestras tratadas con antibióticos mostraron una diversidad bacteriana menor con
respecto al control. Las células bacterianas en estrecha proximidad pueden ser
capaces de modificar su microambiente, lo que hace la composición de la
comunidad microbiana un factor importante en la capacidad de CLas causar la
progresión del HLB (Zhang et al., 2013).
Las poblaciones microbianas de la rizósfera juegan un papel importante en el
ecosistema e influyen en un gran número de procesos importantes como la
16
adquisición de nutrientes, el ciclo del nitrógeno, el ciclo del carbono, etc.
(Nannipieri et al., 2003, Cardon y Whitbeck, 2007). El HLB afecta la estructura y la
composición de la comunidad bacteriana de la rizosfera de cítricos (Trivedi et al.,
2011). CLas causa una reducción significativa en la diversidad y abundancia de
grupos bacterianos pertenecientes a las Proteobacterias, las Proteobacterias
pertenecen al grupo bacteriano dominante en la rizosfera de varias especies de
plantas (Cardon y Whitbeck, 2007). En contraste promovió la diversidad y
abundancia de bacterias pertenecientes a Actinomycetes, Firmicutes y
Acidobacteria (Trivedi et al., 2011).
17
3. JUSTIFICACIÓN
La industria citrícola es de suma importancia económica y social para
México, se estima que existen cerca de medio millón de hectáreas para este
propósito; las cuales se destinan principalmente a naranja (Citrus sinensis L.
Osbeck) y limón mexicano (Citrus aurantifolia). Sin embargo, en los últimos años
el sector citrícola está siendo afectado por la dispersión de la enfermedad
conocida como Huanglongbing (HLB) o Greening, que ha sido descrita como la
enfermedad más destructiva de los cítricos y está presente en las principales
citriculturas del mundo. La enfermedad de HLB es causada por bacterias del
género Candidatus Liberibacter spp. de la que se conocen actualmente cuatro
especies; Ca. Liberibacter asiaticus, Ca. Liberibacter africanus, Ca. Liberibacter
americanus y Ca. Liberibacter caribbeanus. Adicionalmente, también se ha
asociado con el HLB a Candidatus Phytoplasma phoenicium y Candidatus
Phytoplasma asteris. Recientemente se han realizado estudios genéticos sobre la
respuesta de la planta a la infección por Candidatus Liberibacter spp. e incluso ya
se han secuenciado los genomas de Candidatus Liberibacter asiaticus,
Candidatus Liberibacter americanus y Candidatus Liberibacter africanus. Se ha
encontrado limitaciones metabólicas en estas bacterias sugiriendo la hipótesis
alternativa que Candidatus Liberibacter no son capaces de causar el HLB
independientemente y puede requerir de la microflora endófita para proporcionar
las rutas metabólicas que faltan y quizá provocar el síndrome de la enfermedad
plena. Además se conoce que existe una simbiosis entre el psílido Diaphorina citri
y otros microorganismos, influyendo en el metabolismo y reproducción de este
vector. Para poder tener elementos para el manejo de la enfermedad en la
citricultura mexicana se debe orientar esfuerzos para conocer la interacción
microorganismo-planta para el desarrollo de la enfermedad. Por lo que el objetivo
de este trabajo es caracterizar genómicamente a Candidatus Liberibacter asiaticus
y otros microorganismos asociados con la enfermedad Huanglongbing (HLB) en
limón mexicano utilizando metagenómica para incrementar el conocimiento sobre
18
los microorganismos parásitos no cultivables causales de la enfermedad del HLB
en México, que permita proponer herramientas biotecnológicas para su control.
19
4. OBJETIVOS 4.1 Objetivo general
Caracterizar genómicamente a Candidatus Liberibacter e identificar otros
microorganismos asociados a la enfermedad Huanglongbing (HLB) en limón
mexicano.
4.2 Objetivos específicos
1. Obtener el DNA microbiano de Candidatus Liberibacter y microorganismos
endófitos asociados a la enfermedad Huanglongbing (HLB) en limón mexicano.
2. Secuenciar y ensamblar el genoma Candidatus Liberibacter asociado a la
enfermedad Huanglongbing (HLB) en limón mexicano.
3. Identificar molecularmente microorganismos endófitos asociados a la
enfermedad Huanglongbing (HLB) en limón mexicano.
5. Hipótesis Candidatus Liberibacter asiaticus asociada a la enfermedad de Huanglongbing en
árboles de limón mexicano presenta características genómicas diferenciales a los
genomas identificados en otras especies de cítricos y se acompaña de
poblaciones de microorganismos endófitos.
20
6. Materiales y métodos 6.1 Material vegetal
Para este estudio con la idea de mantener al patógeno en invernadero bajo
condiciones controladas se utilizaron 140 plantas de limón mexicano que se
inocularon a través de dos injertos de yemas de 2-3 cm de largo infectadas con
CLas. Los injertos (yema) se cubrieron con cinta de plástico durante tres semanas
para evitar deshidratación y favorecer la transmisión. Para posteriormente
seleccionar las muestras que presentaban un mayor título de la bacteria.
6.2 Colecta y procesamiento de la muestra
Se realizaron dos muestreos, el primer muestreo se llevó a cabo en el estado
de Colima, ya que es uno de los principales estados productores de cítricos en el
país y el 100% de las huertas de limón mexicano se encuentran severamente
afectadas por Huanglongbing (HLB). Se colectaron varetas sintomáticas de limón
mexicano y se trasladaron al laboratorio de Biología Molecular de Fitopatógenos,
CIIDIR, Unidad Sinaloa, para los análisis correspondientes. Y el segundo
muestreo se llevó a cabo en el invernadero de las instalaciones del CIIDIR-IPN
Unidad Sinaloa donde se colectó muestras foliares de seis plantas a los cuatro
meses posteriores a la inoculación de CLas. Cada muestra consistió de la quinta
hoja madura de siete varetas por planta.
Posteriormente cada muestra se lavó con agua corriente y jabón, dándole un
último enjuague con agua destilada. Las muestras se colocaron en etanol al 70%
por 45 seg, se decantó el residuo de etanol, luego se agregó hipoclorito de sodio
al 1.5% por 15 min con agitación constante. Se decantó el residuo y se hicieron 3
lavados con agua estéril en campana previamente esterilizada. Las muestras se
secaron con papel secante estéril y se separó la nervadura de la lámina. El tejido
foliar se congeló con nitrógeno líquido y posteriormente se liofilizó (Labconco,
Kansas City, MO) durante 72 hrs. Las muestras liofilizadas se pulverizaron en un
molino TissueLyser (Qiagen, Valencia, CA) durante 1 min a 30 Hz.
21
6.3 Extracción de DNA por el método de CTAB al 3%
La extracción de DNA se realizó por el método del CTAB al 3%, con algunas
modificaciones (Zhang et al., 1998). Para la extracción de cada muestra se utilizó
20 mg de tejido liofilizado. A cada muestra se le adicionó 800 µL del buffer CTAB
al 3% (1.4 M NaCl, 20 mM EDTA, 100 mM Tris-HCl, pH 8, 0.2% β-mercaptoetanol)
precalentado a 60°C. Posteriormente se incubó a 60°C por 30 min y se adicionó a
cada muestra 600 µL de cloroformo:alcohol isoamílico (24:1), se agitó por
inversión varias veces. Las muestras se centrifugaron a 13,000 rpm durante 10
min y se recuperó el sobrenadante. Después se adicionaron 15 µL de enzima
RNAsa (100 µg/µL) y se incubó por 20 min a 37°C. Posteriormente se adicionaron
600 µL de cloroformo: alcohol isoamílico (24:1), se agitó por inversión varias veces
y se centrifugó a 13,000 rpm por 10 min. Se recuperó el sobrenadante y se
precipitó el DNA con 600 µL de isopropanol (-20°C) al 100%. Se centrifugó
inmediatamente por 10 min a 13,000 rpm y se eliminó el sobrenadante. La pastilla
obtenida se lavó con 1,000 µL de etanol al 70% y se centrifugó por 4 min a 13,000
rpm. Finalmente se dejó secar la pastilla que contenía el DNA y se resuspendió en
30 µL de agua bidestilada estéril. El DNA obtenido se almacenó a -20°C para su
análisis posterior. Una vez extraído el DNA, se procedió a verificar su integridad
mediante electroforesis en un gel de agarosa al 0.8% y para verificar la pureza y
calidad del DNA se utilizó un espectrofotómetro NanoDrop ND-2000 UV–Vis
Spectrophotometer (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA) obteniendo la
concentración de DNA en ng/uL. Las relaciones A260/ A280 (DNA/proteína) se
registraron para verificar la pureza y calidad del DNA extraído, considerándose
como valores de referencia A260/ A280 > 1.8.
6.4 Extracción de DNA con el kit comercial DNeasy Plant Mini Kit
Se adicionaron 20 mg de tejido pulverizado dentro de un tubo Eppendorf de
1.5 mL previamente etiquetado y se le añadió 400 µL del buffer de lisis AP1 y 20
µL de RNasa A (20 mg/mL) y se incubó 10 min a 65°C, mezclando por inversión
cada 5 min. Posteriormente se agregó 130 µL del buffer de precipitación AP2, se
22
mezcló e incubó por 5 min en hielo. Posteriormente, se centrifugó a 15,899 xg por
5 min, se añadió el sobrenadante a la columna QIA Shredder mini spin, y se
centrifugó a 15,899 xg por 2 min. Se recuperaron 450 µL, y se adicionó 1.5
volúmenes del buffer AP3 (675 µL). Se transfirió a la columna DNeasy mini spin y
se centrifugó a 6,021 xg por 1min. Se descartó la fracción que atravesó la
columna, se añadió 500 µL del buffer AW y se centrifugó a 6,021 xg durante 1 min.
Se añadió a la columna otros 500 µL del buffer AW y se centrifugó a 15,899 xg
durante 2 min. Se transfirió la columna a un tubo nuevo y se añadió 100 µL del
buffer AE se incubó durante 5 min a temperatura ambiente. Posteriormente se
centrifugó a 6,021 xg por 1 min para eluir. El DNA genómico se almacenó a -20°C,
para usos posteriores.
6.5 Detección de Candidatus Liberibacter asiaticus
Para la confirmación de la presencia de Candidatus Liberibacter asiaticus en
las varetas con síntomas de HLB colectadas se utilizó la técnica de PCR punto
final con los primers A2 y J5 (Cuadro 1) que amplifican un fragmento de 703 pb y
669 pb del β-operon de Ca. L. asiaticus y Ca. L. Africanus, respectivamente
(Hocquellet, 1999).
Cuadro 1. Descripción de los primers utilizados para la detección de Candidatus Liberibacter spp. en muestras de limón mexicano.
PRIMERS SECUENCIA
A2 5´ TATTAAAGGTTGACCTTTCGAGTTT 3´
J5 5´ ACAAAAGCAGAAATAGCACGAACAA 3´
El ensayo de PCR se realizó en tubos Eppendorf de 0.2 mL con un volumen
total de reacción de 25 µL, conteniendo 1 X de buffer, 2 mM de MgCl₂, 0.2 mM de
nucleótidos trifosfatados (dNTP´s), se utilizaron las siguientes concentraciones: 1
X de buffer, 2 mM de MgCl₂, 0.2 mM de nucleótidos trifosfatados (dNTP´s), 1
unidad de Taq DNA polimerasa (Invitrogen Life Technologies) y 0.2 pmol de cada
primer. Las mezclas se incubaron en un termociclador automático (iCycler™,
23
BIORAD, E.U.A.). Se utilizaron las siguientes condiciones: un ciclo a 94ºC por 2
min.; 35 ciclos de 30 s a 94ºC, 30 s a 62ºC , 1 min a 72ºC; y finalmente un ciclo a
72ºC por 10 min.
Se realizó PCR anidado utilizando los primers R16mfF2/R16mR1 y
R16F2n/R16R2 que amplifican un fragmento de 1250 pb que corresponde a
Candidatus Phytoplasma spp. (Gundersen y Lee, 1996), y por último, se realizó
PCR punto final utilizando los primers generalistas para bacterias F2C/C que
amplifican un fragmento de 1392 a 1406 pb de la región 16S del rDNA (Shi et al.,
1997) (Cuadro 2).
Cuadro 2. Descripción de los primers utilizados para la detección de Candidatus Phytoplasma spp. y bacterias generalistas en muestras de limón mexicano.
PRIMERS SECUENCIA
R16mF2 5´ CATGCAAGTCGAACGGA 3´
R16MR1 5´ CTTAACCCCAATCATCGA 3´
R16MF2n 5´ GAACGGCGGTGTGTACAAACCC 3´
R16R2 5´ TGACGGGCGGTGTGTACACCCG 3´
F2C 5´ AGAGTTTGATCATGGCTC 3´
C 5´ ACGGGCGGTGTGTAC 3´
6.6 Enriquecimiento del DNA de Ca. L. asiaticus y bacterias endófitas
El DNA bacteriano seleccionado se enriqueció de acuerdo con las
especificaciones del proveedor del kit NEB-Next microbiome DNA enrichment
(New England BioLabs, Inc., Ipswich, MA). Este kit facilita el enriquecimiento del
DNA microbiano mediante la unión selectiva y eliminación del DNA metilado (CpG)
del hospedante en este caso el DNA de la planta.Está basado en el uso de perlas
magnéticas recubiertas con la proteína MBD2-Fc; el dominio MBD2 de esta
proteína se une específicamente al DNA metilado CpG (planta) dejando el DNA no
metilado CpG (bacterias) en el sobrenadante y el fragmento Fc se une fácilmente
24
a la proteína A (perla). Primero se resuspendió la proteína A de las perlas
magnéticas y se homogenizó suavemente con la ayuda de la micropipeta. En un
tubo eppendorf de 1.6 mL, se añadió 16 µL de la proteína MBD2-Fc y 160 µL de la
proteína A de las perlas magnéticas, la mezcla resultante se homogenizó
suavemente con la ayuda de la micropipeta. Posteriormente la mezcla de perlas
proteína se colocó en un agitador giratorio durante 10 min a temperatura
ambiente. Posteriormente el tubo con la mezcla se colocó en una gradilla
magnética durante 5 min hasta que las perlas se colocaron en la pared del tubo y
la solución adquiera un tono transparente, se retiró con cuidado el sobrenadante
con una pipeta sin tocar las perlas. Se añadió 1 mL de 1x buffer de unión/ lavado
(mantener en hielo) en el tubo para lavar las perlas y se homogenizó suavemente
con la ayuda de la micropipeta. Se dejaron reposar las perlas durante 3 min a
temperatura ambiente, transcurrido el tiempo se colocaron en la gradilla magnética
durante 5 min hasta que las perlas se colocaron en la pared del tubo y la solución
adquiera un tono transparente. Se retiró cuidadosamente el sobrenadante con una
pipeta sin tocar las perlas. El paso de lavado se volvió a repetir. Se añadió 160 µL
de 1x Buffer de lavado/ unión (mantener en hielo) para volver a suspender las
perlas. Se añadió aproximadamente 1 µg de DNA al tubo que contiene las perlas
magnéticas. Se incubó la reacción durante 15 min a temperatura ambiente con
agitación. Después de la incubación se colocó en la gradilla magnética durante 5
min. Se retiró cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta, sin tocar a las
perlas, y se guardó en un tubo de microcentrífuga limpio.
El sobrenadante con el DNA microbiano se purificó mediante precipitación
por etanol, se le añadió 2.5 volúmenes (400 µL) y se incubó a -20°C toda la noche.
Posteriormente se centrifugó la muestra a 13000 rpm por 30 min. Se removió el
etanol residual y se secó la pastilla al aíre. Por último se resuspendió la pastilla en
30 µL de agua agua bidestilada estéril.
25
6.7 Amplificación del genoma de Ca. L. asiaticus
El DNA enriquecido para Ca. L. asiaticus se amplificó de acuerdo con las
especificaciones del proveedor del mini kit REPLI-g (Qiagen, Inc., Valencia, CA).
Este kit se basa en la tecnología de MDA, que lleva a cabo la amplificación
isotérmica del genoma utilizando una DNA polimerasa capaz de copiar hasta 100
kb sin disociarse del molde del DNA genómico. La DNA polimerasa tiene una
actividad 3'-5 'exonucleasa de corrección para mantener la alta fidelidad durante la
replicación y se utiliza en presencia de primers resistentes a exonucleasa para
lograr altos rendimientos de producto de DNA. Primeramente, se debe preparar
suficiente Buffer D1 (tampón de desnaturalización) y buffer N1 (tampón de
neutralización) para el número total de reacciones de amplificación de todo el
genoma (Cuadro 3).
Cuadro 3. Preparación del buffer de desnaturalización (D1) y el buffer de neutralización (N1).
Se colocó 5 µL de DNA molde en un tubo de microcentrífuga. Después se
añadió 5 µL de buffer D1 al DNA. Se mezcló mediante agitación y se centrífugó.
Posteriormente se incubó las muestras a temperatura ambiente durante 3 min. Se
añadió 10 µL de buffer N1 a las muestras. Se mezcló mediante agitación y se
centrifugo. Se descongeló la DNA polimerasa en hielo. Se descongelaron todos
los otros componentes a temperatura ambiente, se agitaron en vórtex y se
centrifugaron. El buffer de reacción puede formar un precipitado después de la
descongelación. El precipitado se disolvió por agitación durante 10 s. Se preparó
una mezcla sobre hielo de acuerdo con el Cuadro 4.
COMPONENTES BUFFER D1 BUFFER N1 Buffer DLB 9 µL - Stop solution - 12 µL Agua libre de nucleasas 32 µL 68 µL Volumen total 41 µL 80 µL
26
Cuadro 4. Preparación del master mix para el DNA genómico.
COMPONENTE
VOLUMEN POR REACCIÓN
5 µL gDNA
Agua libre de nucleasas - Buffer de reacción mini REPLI-g 29 µL DNA polimerasa 1 µL Volumen total 30 µL
Se mezcló y centrifugó brevemente. Posteriormente se agregó 30 µL de la
mezcla y 20 µL del DNA desnaturalizado. Se incubó a 30°C durante 16 h.
Después de la incubación a 30°C, se calentó el termoblock a 65°C. Se inactivó la
DNA polimerasa mediante el calentamiento de la muestra durante 3 min a 65°C.
Se almacenó el DNA amplificado a -20°C para el almacenamiento a largo plazo.
6.8 Validación del enriquecimiento y amplificación por PCR en tiempo real
Se llevaron a cabo dos ensayos de PCR en tiempo real para la detección de
Candidatus Liberibacter asiaticus y DNA de planta en muestras enriquecidas y
muestras amplificadas. En el primer caso se implementó un ensayo cuantitativo en
tiempo real, usando SYBRB Green I y primers específicos basados en la región
16S rDNA de Candidatus Liberibacter asiaticus (Li et al., 2006) y como control
endógeno se utilizó 18S rRNA (Cuadro 5).
Para la PCR en tiempo real se utilizó el termociclador 7500 Fast Real-Time
PCR System (Applied Biosystems, Foster City, California) en una reacción de 10
µL la cual se conformó por la siguiente concentración de reactivos: 100 ng de DNA
genómico total, 250 nM de cada primer (HLBas/ HLBr), la mezcla se preparó
utilizando SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Estados Unidos).
Para la reacción del 18S rRNA solo cambia 250 nM del primer 18S (sonda VIC/
MGB/ primers). El protocolo estándar de amplificación fue de 50°C durante 2 min
y 95°C durante 10 min seguido de 95°C por 20 s siguiendo de 40 o 50 ciclos a
95°C por 1 s y 58°C por 40 s.
27
Cuadro 5. Primers utilizados para la detección por PCR en tiempo real de Candidatus Liberibacter
asiaticus y DNA de planta en muestras de limón mexicano. PRIMERS SECUENCIA
HLBas 5´ TCGAGCGCGTATGCAATACG 3´
HLBr 5´ GCGTTATCCCGTAGAAAAAGGTAG 3´
6.9 Secuenciación Masiva y análisis
El DNA enriquecido fue secuenciado utilizando Illumina MiSeq (Illumina, Inc.,
San Diego, CA). Se utilizó la secuencia del genoma completo de la cepa
"Candidatus Liberibacter asiaticus" A4 como referencia, utilizando el software
BLAST. Para conocer el grado de identidad genética existentes con secuencias ya
reportadas y depositadas en el banco de genes, las secuencias obtenidas de la
comunidad microbiana se compararon con secuencias reportadas en el Banco de
genes (Gen Bank), del Centro Internacional para Información en Biotecnología
(NCBI, National Center for Biotechnology information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)
empleando el programa BLASTn de dicha página.
28
7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 7.1 Primer ensayo 7.1.1 Colecta de muestras
Se colectó un total de cinco árboles sintomáticos de limón mexicano en un
huerto de la localidad de Tecomán, Colima, donde previamente elf grupo de
trabajo ya había identificado la presencia de Candidatus Liberibacter asiaticus y
Candidatus Phytoplasma asteris. Los árboles de limón presentaron los síntomas
característicos de la enfermedad: moteados asimétricos y manchas de formas
irregulares.
7.1.2 Detección de Candidatus Liberibacter, Candidatus Phytoplasma y otros microorganismos en muestras de limón mexicano con síntomas de HLB
Mediante la técnica de PCR punto final, utilizando los primers A2 y J5, se
amplificó el fragmento esperado de 703 pb del β-operon de Ca. L. asiaticus
(Figura 5), siendo positivas las cinco muestras de Colima analizadas provenientes
del huerto de Tecomán, Colima.
Figura 5. Detección de Candidatus Liberibacter asiaticus en muestras de limón mexicano mediante PCR punto final. Carril 1, marcador de peso molecular 1 kb plus (Invitrogen Life Technologies, Brasil); carriles 2 y 3 control negativo; carril 4, control positivo; carriles 5 al 10, muestras de limón mexicano colectadas en Colima.
Mediante la técnica de PCR anidado, utilizando los primers
R16mfF2/R16mR1 y R16F2n/R16R2, se amplificó el fragmento esperado de 1250
pb que corresponde a Candidatus Phytoplasma spp., siendo positivas dos de
cinco muestras analizadas (Figura 6).
703 pb
29
Figura 6. Detección de Candidatus Phytoplasma spp. en muestras de limón mexicano mediante PCR anidado. Carril 1, marcador de peso molecular 1 kb plus (Invitrogen Life Technologies, Brasil); carriles 2 al 3, controles negativos; carril 4, control positivo; carriles 5 al 9, muestras de limón mexicano colectadas en Colima.
Mediante la técnica de PCR punto final, utilizando los primers generalistas
para bacterias F2C y C, se amplifico un fragmento de aproximadamente entre
1392 a 1406 pb de la región 16S del DNAr (Figura 7), siendo positivas las 5 de 6
muestras analizadas. La muestra del carril 9 es una muestra negativa para
Candidatus Liberibacter asiaticus y a Candidatus Phytoplasma.
Figura 7. Detección generalista de bacterias en muestras de limón mexicano mediante PCR punto final. Carril 1, marcador de peso molecular 1 kb plus (Invitrogen Life Technologies, Brasil); carril 2 , control negativo; carril 3, control positivo; carriles 4 al 9, muestras de limón mexicano colectadas en Colima.
1392-1406 pb
1250 pb
30
7.1.3. Validación del enriquecimiento del DNA microbiano por PCR en tiempo real
A partir de los resultados del PCR punto final se seleccionaron dos muestras
para validación del enriquecimiento, una sintomática y otra asintomática. El kit de
enriquecimiento utiliza un método basado en perlas magnéticas que se unen
selectivamente al DNA metilado en sitios CpG de la planta. Dejando en el
sobrenadante el DNA microbiano no metilado en sitios CpG. Para poder validar si
se retiró el DNA de la planta se realizó un PCR en tiempo real utilizando el control
18S del rRNA y podemos observar que tanto en las muestras sintomáticas como
asintomáticas logramos retirar aproximadamente más de 1000 veces el DNA de la
planta (Figura 8). En comparacion con los resultados de Feehery et al. (2013)
donde reportan una disminución de las lecturas hasta 50 veces en comparación
con los genomas de referencia en muestras de DNA de la saliva humana, sangre
humana y una muestra de sangre infectada con malaria.
Figura 8. Confirmación de la eliminación del DNA de planta en las muestras enriquecidas en comparación de las muestras no enriquecidas. Barra verde representa las muestras sintomáticas; barra naranja representa las muestras asintomáticas.
31
Para confirmar la presencia de CLas en las muestras enriquecidas se realizó
un PCR en tiempo real utilizando los primers HLB-as y HLB-r logrando detectar la
bacteria tanto en los DNA originales como en los DNA enriquecidos, sin afectar a
la abundancia de la bacteria en las muestras enriquecidas (Figura 9), se puede
observar que en las muestras enriquecidas hay más células de CLas por ng de
planta. En comparación con estudios previos, donde lograron aumentar las
secuencias de DNA de bacterias de 8-11 veces, en el presente estudio se logró
amplificar más de 1000 veces las células de CLas por ng de planta. Feehery et al.
(2013) midieron el índice de diversidad de Shannon-Wiener de 149 especies
bacterianas en la saliva antes y después del enriquecimiento, obteniendo un índice
de 4.72 en las muestras de saliva no enriquecidas, mientras que la muestra
enriquecida tenía un índice de 4.80. Lo que demuestra que la diversidad
bacteriana y la abundancia permanecen conservadas en muestras enriquecidas.
Pocos estudios del draf del genoma de Candidatus Liberibacter asiaticus utilizán
este método de enriqueciemiento obteniendo solamente un draft por las pocas
lecturas de la bacteria (Zheng et al., 2014a; Zheng et al., 2014b; Wu et al.,
2015b; Zheng et al., 2015).
Figura 9. Confirmación de la presencia de Candidatus Liberibacter asiaticus en muestras enriquecidas en comparación con las muestras no enriquecidas. A, muestras sintomáticas; B, muestras asintomáticas.
A B
32
7.1.4 Amplificación del genoma de Ca. L. asiaticus
Los resultados basados en los productos de DNA amplificado observados en
geles de agarosa al 1% y mediante los valores mayores a 1.8 de la relación
A260/A280 (DNA/ Proteína) y ~2 de la relación A260/A230 (DNA/ solventes
orgánicos) determinados en un espectrofotómetro NanoDrop ND-2000 (NanoDrop
Technologies, USA) sugieren que la amplificación del DNA con el REPLI-g Mini Kit
es de buena calidad (Figura 10).
Figura 10. Amplificación del genoma completo por amplificación por desplazamiento múltiple (MDA) utilizando el REPLI-g Mini Kit (QIAGEN).
Para confirmar la presencia de CLas en las muestras amplificadas se realizó
un PCR en tiempo real utilizando los primers HLB-as y HLB-r, no se logró detectar
a CLas en las muestras amplificadas (Cuadro 6), sugiriendo que el kit pudo
beneficiar la amplificación del genoma de otras bacterias. Al igual que esté trabajo,
los artículos del draf del genoma de Candidatus Liberibacter han utilizado la
metodología de MDA usando dos diferentes kits REPLI-g y GenomiPhi versión 2.
Estos kits se basan en el mismo principio utilizando la polimerasa Phi 29 que es
una enzima derivada de un fago que proporciona una fidelidad hasta 1000 veces
superior en comparación con la Taq polimerasa. Por el bajo título de la bacteria
presente en las muestras se obtienen pocas lecturas (Wulff et al., 2013; Zheng et
al., 2014a; Zheng et al., 2014b; Wu et al., 2015a; Wu et al., 2015b; Zheng et al.,
2015; Kunta et al., 2017).
33
1 2 3 4 5 6 7
Cuadro 6. Resultados de la detección por PCR en tiempo real de Candidatus Liberibacter asiaticus.
Mediante la técnica de PCR punto final, utilizando los primers generalistas
para bacterias F2C y C, que amplifican un fragmento de 1392 a 1406 pb de la
región 16S del DNAr (Figura 11), confirmamos que si hay DNA microbiano en los
DNA amplificados. Dado que el tejido inicial no se desinfectó superficialmente se
realizó un segundo ensayo partiendo de otras muestras.
Figura 11. Detección de bacterias generalistas en muestras amplificadas de limón mexicano mediante PCR punto final. Carril 1, marcador de peso molecular 1 kb plus (Invitrogen Life Technologies, Brasil); carril 2 , control negativo; carril 3, control positivo; carriles 4 al 7, DNA amplificados.
7.2 Segundo ensayo
De acuerdo a los resultados obtenidos en el primer ensayo donde logramos
retirar más de 1000 veces el DNA de la planta; pero al momento de amplificar este
DNA no logramos detectar a la bacteria de Candidatus Liberibacter asiaticus. Por
cuestiones de la colecta, esta fue realizada cuando la incidencia de la enfermedad
era baja y a la fecha el 100% de los árboles en Colima están infectados, por lo que
se decidio cambiar de material vegetal.
Sample Name Target Name CT Mean
DNA A9B HLB Undetermined
DNA A9B Enriquecido HLB Undetermined
DNA A10A Enriquecido HLB Undetermined
1392-1406 pb
34
1 2 3 4 5
7.2.1 Material vegetal
Se colectaron muestras foliares de cinco plantas a los cuatro meses
posteriores a la inoculación de CLas, ubicadas en el invernadero de las
instalaciones del CIIDIR-IPN Unidad Sinaloa. Cada muestra consistió de la quinta
hoja madura de siete varetas por planta. Cada muestra foliar fue desinfectada
superficialmente para posteriormente realizarle los análisis correspondientes.
7.2.2 Detección de Candidatus Liberibacter, Candidatus Phytoplasma y otros microorganismos en muestra de limón mexicano
El DNA de la muestra 9 se obtuvó utilizando el Dneasy Plant Mini kit,
proporcionándonos un DNA de buena calidad. Posteriormente se implentó la
técnica de PCR punto final, utilizando los primers A2 y J5, logrando amplificar el
fragmento esperado de 703 pb del β-operon de Ca. L. asiaticus (Figura 12), siendo
positiva la muestra de invernadero analizada.
Figura 12. Detección de Candidatus Liberibacter asiaticus en muestras de limón mexicano mediante PCR punto final. Carril 1, marcador de peso molecular 1 kb plus (Invitrogen Life Technologies, Brasil); carriles 2 control negativo; carril 3 y 4, control positivo; carril 5, muestra de limón mexicano colectadas en invernadero.
El DNA de limón mexicano seleccionado fue utilizado para la detección de
Candidatus Phytoplasma spp., utilizando la técnica de PCR anidado, utilizando los
primers R16mfF2/R16mR1 y R16F2n/R16R2, no amplificó el fragmento esperado
de 1250 pb (Figura 13), siendo negativa la muestra analizada.
703 pb
35
1 2 3 4 5 6
Figura 13. Detección de Candidatus Phytoplasma spp. en muestras de limón mexicano mediante PCR anidado. Carril 1, marcador de peso molecular 1 kb plus (Invitrogen Life Technologies, Brasil); carril 2, control negativo; carril 3, control positivo; carriles 4 y 5, control negativo; carril 6, muestra de limón mexicano colectada en invernadero.
Mediante la técnica de PCR punto final, utilizando los primers generalistas
para bacterias F2C y C, se amplificó el fragmento esperado de 1392 a 1406 pb de
la región 16S del DNAr (Figura 14), siendo positiva la muestra analizada.
Figura 14. Detección generalista de bacterias en muestras de limón mexicano mediante PCR convencional. Carril 1, marcador de peso molecular 1 kb plus (Invitrogen Life Technologies, Brasil); carril 2 , control negativo; carril 3, control positivo; carriles 4, muestra de limón mexicano colectada en invernadero.
1250 pb
1392-1406 pb
36
7.2.3 Validación del enriquecimiento del DNA microbiano por PCR en tiempo real
Para realizar el enriquecimiento del DNA se seleccionó la muestra 9
previamente identificada como positiva para CLas. Con base a los resultados de
PCR en tiempo real, la muestra tenía una concentración del patógeno de 7809
células/100 ng de DNA. Para poder validar si se retiró el DNA de la planta se
realizó un PCR en tiempo real utilizando el control 18S del rRNA y podemos
observar que en la muestra A9 enriquecida logramos retirar aproximadamente
más de 1000 veces el DNA de la planta (Figura 15).
Figura 15. Confirmación de la eliminación del DNA de planta en la muestra enriquecida en comparación de la muestra no enriquecida.
Para confirmar la presencia de CLas en la muestra enriquecida se realizó un
PCR en tiempo real utilizando los primers HLB-as y HLB-r logrando detectar la
bacteria tanto en el DNA original como en el DNA enriquecido, sin afectar a la
abundancia de la bacteria en la muestra enriquecida (Figura 16). Estudios
realizados por Feehery et al., 2013 han demostrado que el método de
enriquecimiento usando MBD-FC enriquece de manera uniforme el DNA
microbiano, reflejando con precisión la diversidad de especies microbianas en la
muestra original.
37
Figura 16. Confirmación de la presencia de Candidatus Liberibacter asiaticus en muestra enriquecida en comparación con la muestra no enriquecida.
7.2.4 Identificación y ensamblado parcial de bacteria “Candidatus Liberibacter asiaticus”
Se realizaron dos bibliotecas NL1CL1SS01 y NL1CL1SS02. En el Cuadro 7
se muestra el número total de lecturas por cada biblioteca.
Cuadro 7. Información sobre las bibliotecas realizadas
La calidad de los datos es de suma importancia para análisis posteriores.
Los resultados completos obtenidos se muestran en las Figuras 17 y 18. Se filtró
en calidades de phred=30, se filtraron los adaptadores de acuerdo al protocolo de
secuenciación en MiSeq y finalmente se cortaron los 15 primeros y últimos
nucleótidos a todas las lecturas de cada muestra. La calidad de las secuencias del
extremo R2 o Reverse indican una caída de calidad a partir de la base ±140. Esta
condición no es tan crítica debido a que son pocas las secuencias de Candidatus
Liberibacter asiaticus. La calidad de phred está relacionada con las probabilidades
Nombre Muestra Lecturas totales Bases totales
NL1CL1SS01 NL1CL1SS01 351,778 105,885,178
NL1CL1SS02 NL1CL1SS02 574,622 172,961,222
38
A
B
A
B
de error de las bases nucleotidicas, un puntaje de calidad de 30 a una base, las
posibilidades de que esta base este incorrecta es de 1 en 1000 (Ewing y Green,
1998).
Figura 17. Análisis de calidad de las secuencias crudas. A, biblioteca NL1CL1SS01; B, biblioteca
NL1CL1SS02.
Figura 18. Análisis de calidad de las secuencias procesadas. A, biblioteca NL1CL1SS01; B, biblioteca NL1CL1SS02.
39
Para el ensamblaje se aplicó el pipeline de A5-pipeline Software, se calculó
el número ideal de k-mers y se utilizaron 12 núcleos para aplicar el algoritmo
Bruijin Graph en el ensamblaje de novo final. Se realizó el mapeo de las lecturas
con la referencia del NCBI obteniendo alrededor de 351,778 y 574,622 lecturas
totales pareadas, logrando obtener 2,076 y 1,244 lecutras alineadas (Cuadro 8).
Se obtuvo una cobertura de 1.4% del genoma, las secuencias de los fragmentos
obtenidos mostraron un 100% de similitud con la cepa de Candidatus Liberibacter
asiaticus A4 (Zheng et al., 2014a); obteniéndose aproximadamente 17,008 nt de
1,230,021 nt, logrando mapear 34 secuencias de 37 (Figura 19). En comparación
con las lecturas totales obtenidas, los genomas en draft de Candidatus
Liberibacter asiaticus identificaron un total de 721,209 lecturas (Zheng et al.,
2014a); 48,362 (Zheng et al., 2014b); 213,418 (Zheng et al., 2015); 5,854,876
(Wu al., 2015a); 61,528 (Wu al., 2015b); 32,768 (Kunta et al., 2017).
Cuadro 8. Mapeo de lecturas con la referencia de NCBI - Candidatus Liberibacter asiaticus.
Nombre de los archivos
NL1CL1SS01_S28_L001_R1_001.fastq.gz
NL1CL1SS01_S28_L001_R2_001.fastq.gz
NL1CL1SS02_S29_L001_R1_001.fastq.gz
NL1CL1SS02_S29_L001_R2_001.fastq.gz
Número de lecturas totales
(pareadas)
351,778 574,622
Lecturas alineadas
2,076 1,244
Bases alineadas
493,261 307,918
Longitud mínima y
máxima de lecturas
#Max: 270
#Min: 50
#Max: 270
#Min: 50
40
Figura 19. Representación del alineamiento de contigs generados de novo vs genoma de
Candidatus liberibacter A4.
El reporte BLAST de ensamble de las bibliotecas NL1CL1SS01 y
NL1CL1SS02 para la bacteria “Candidatus Liberibacter asiaticus” se muestran en
el cuadro 9. Hasta la fecha Candidatus Liberibacter asiaticus se ha secuenciado
en 9 ocasiones, solamente 2 genomas completos a partir del psilído vector. Los
demás genomas están en draft por las pocas lecturas encontradas de CLas, 5 de
estos genomas son obtenidos a partir del psilído y 4 a partir de cítricos (Duan et
al., 2009; Li et al., 2013; Katoh et al., 2014; Zheng et al., 2014a; Zheng et al.,
2014b; Wu et al., 2015a; Wu et al., 2015b; Zheng et al., 2015; Kunta et al., 2017).
41
Cuadro 9. Reporte BLAST de ensamble NL1CL1SS01 y NL1CL1SS02 bacteria “Candidatus Liberibacter asiaticus”
CONTIG NAME
NCBI ID IDENTITY MATCH LENGTH DESCRIPTION
NODE_19_length_540_cov_0.9878 93
gi|523263977|gb|KC811108. 1|
85.14 74 Candidatus Actinomarina minuta clone MedDCM-OCT- S23-C8 genomic sequence
NODE_34_length_484_cov_0.7675 07
gi|827608033|gb|CP004021. 1|
86.98 484 Candidatus Liberibacter africanus PTSAPSY, complete genome
NODE_73_length_411_cov_1.0070 4
gi|255957603|dbj|AB473581. 1|
100
411 Candidatus Liberibacter asiaticus genes for hypothetical proteins, DNA-directed DNA polymerase, VRR- NUC domain protein, complete cds, isolate: Thai1
La comparación de resultados basados en NCBI arrojaron que las
secuencias en mayor proporción fueron de DNA del cloroplasto, así como
fragmentos del genoma de limón (Cuadro 10). Existe la hipótesis de que las
mitocondrias y cloroplastos surgieron por la incorporación de bacterias de vida
libre en las células eucarioticas primitivas, fomando orgánulos endosimbióticos
(Lodish et al., 2006), con esta hipótesis podemos entender los resultados
obtenidos de la secuenciación donde obtuvimos la mayor parte de las secuencias
de los cloroplastos del limón mexicano. Wulff et al., 2013 obtuvieron el genoma
completo de CLam combinando las estrategias de MDA y electroforesis de
campos pulsados (PFGE). Estudios de fitoplasmas han obtenido el genoma
completo utilizando las metodologías de centrifugación en gradiente de
bisbemcimidas y cloruro de cesio (CsCl), y PFGE (Kube et al., 2008; Andersen et
al., 2013). Esto nos sugiere que utilizando estas metodologías podríamos separar
el DNA genómico de la planta, DNA de cloroplastos y mitocondrias, dejando
solamente el dna bacteriano.
42
Cuadro 10. Comparación de identidad con bases de datos biológicas (NCBI-BLAST).
BLAST-IDENTIDAD
SGI ORGANISMO
100 675269873 Citrusaurantiifoliachloroplast,completegenome100 567876880 Citrusclementinahypotheticalprotein(CICLE_v10010936mg)
mRNA,completecds100 985446072 Citrusclementinahypotheticalprotein(CICLE_v10015894mg)
mRNA,completecds100 567921695 PREDICTED:Citrussinensisequilibrativenucleotidetransporter
3-like(LOC102609436),mRNA100 24461847 Poncirustrifoliatacitrustristezavirusresistancegenelocus,
completesequence100 985450858 PREDICTED:Citrussinensisabscisicacid8'-hydroxylase2
(LOC102630489),mRNA100 690260263 PREDICTED:CitrussinensisprobablemethyltransferasePMT14
(LOC102630472),transcriptvariantX2,mRNA100 985429608 PREDICTED:CitrussinensisSH3domain-containingprotein1-like
(LOC102623905),transcriptvariantX1,mRNA99.02 985428775 PREDICTED:CitrussinensisLRRreceptor-likeserine/threonine-
proteinkinaseGSO1(LOC102618777),mRNA97.22 985465969 Citruslimonplastid,completegenome
7.2.5 identificacion de microorganismos endófitos
Por otra parte se encontraron pocas secuencias de diferentes
microorganismos en nuestras bibliotecas (Cuadro 11). Esto se puede deber a las
pocas lecturas que se encontraron de DNA microbiano. Existen muy pocos
estudios sobre la comunidad microbiana en cítricos con HLB, solamente el estudio
de caracterización de la comunidad microbiana en plantas de cítricos infectados
con CLas tratados con antibióticos donde encontraron 58 Phylos, los más
abundantes fueron las Proteobacterias (44.1%), Firmicutes (23.5%),
Actinobacterias (12.4%), Bacteroidetes (6.6%) y Cianobacterias (3.2%). En esté
estudio las muestras tratadas con antibióticos mostraron una diversidad bacteriana
menor con respecto al control. Las células bacterianas en estrecha proximidad
pueden ser capaces de modificar su microambiente, lo que hace la composición
de la comunidad microbiana un factor importante en la capacidad de CLas causar
la progresión del HLB (Zhang et al., 2013).
43
Cuadro 11. Comparación de identidad de microorganismos con bases de datos biológicas (NCBI-BLAST).
IDENTITY SGI ORGANISM100 940652111 CandidatusLiberibacterasiaticusstrainA4,completegenome100 255342900 PedobacterheparinusDSM2366,completegenome100 123652006 Protopolystomaxenopodisgenomeassembly
P_xenopodis_South_Africa,scaffoldPXEA_contig0143797100 985431870 ParastrongyloidestrichosurigenomeassemblyP_trichosuri_KNP,
scaffoldPTRK_scaffold0000032100 1163012991 SaccharomycesparadoxusstrainUWOPS91-917.1chromosomeIV,
completesequence99.4 985433545 Streptococcusequisubsp.zooepidemicusCY,completegenome
99.26 985434023 CitrusendogenouspararetrovirusstrainSPBR01polyproteingene,completecds
99.07 985461089 CaenorhabditiselegansgenomeassemblyC_elegans_Bristol_N2_v1_5_4,scaffoldCELN2_contig0000178
98.46 985451256 StrongyloidesrattigenomeassemblyS_ratti_ED321,scaffoldsrae_chrx_scaffold0000002
98.46 985451256 StrongyloidesrattigenomeassemblyS_ratti_ED321,scaffoldsrae_chrx_scaffold0000002
98.68 985451890 AscoidearubescensDSM1968hypotheticalproteinpartialmRNA98.34 985433309 TrichobilharziaregentigenomeassemblyT_regenti_v1_0_4,scaffold
TRE_scaffold001207797.85 333119514 StreptococcusparauberisKCTC11537,completegenome96.62 985435420 HymenolepisdiminutagenomeassemblyH_diminuta_Denmark,
scaffoldHDID_scaffold000003196.46 343887266 HymenolepisnanagenomeassemblyH_nana_Japan,scaffold
HNAJ_contig000221491.87 985429521 Campylobacterjejunisubsp.doylei269.97,completegenome90.07 985467947 ThelaziacallipaedagenomeassemblyT_callipaeda_Ticino,scaffold
TCLT_contig000030089.8 24461847 Nippostrongylusbrasiliensisgenomeassembly
N_brasiliensis_RM07_v1_5_4,scaffoldNBR_scaffold000090089.76 567872512 Schistosomamargrebowieigenomeassembly
S_margrebowiei_Zambia,scaffoldSMRZ_contig000958083.8 24461847 StreptococcusbovisplasmidpSBO1Repgeneforreplicationprotein,
completecds82.67 24461847 BorreliamiyamotoistrainCT13-2396plasmidlp72,completesequence
44
8. CONCLUSIONES
1. Se logró disminuir más de 1000 veces el DNA de la planta y mantener la
abundancia del DNA microbiano.
2. Candidatus Liberibacter asiaticus conservó su título o concentración en la
muestra enriquecida.
3. El mapeo preliminar de las secuencias obtenidas indica la presencia de
genomas cloroplastidiales y de genoma de planta que no corresponde con los
esperado para el ensamblado, solamente se obtuvo un 0.1 a 0.2% de lecturas
secuenciadas de CLas.
4. Se obtuvo una cobertura de 1.4% del genoma, las secuencias de los
fragmentos obtenidos mostraron un 100% de similitud con la cepa de
Candidatus Liberibacter asiaticus A4; obteniéndose aproximadamente 17,008
nt de 1,230,021 nt, logrando mapear 34 secuencias de 37.
5. Por otra parte se encontraron pocas secuencias de diferentes
microorganismos en nuestras biblioteca, esto se puede deber a las pocas
lecturas que se encontraron de DNA microbiano
45
9. PERSPECTIVAS FUTURAS
1. Los resultados obtenidos muestran que, aunque el protocolo de enriquecimiento
logró casi eliminar el DNA genómico de limón, permanece el DNA de cloroplastos
y mitocondrias de la planta, por lo que se suguiere que en futuros estudios
deberán utilizarse estrategias alternas para excluirlos, como gradientes de
sacarosa, gradientes de centrifugación utilizando bisbencimidas con cloruro de
cesio o también utilizando la metodología de electroforesis de campos pulsados
(PFGE).
2. El DNA genómico excluido de DNA de cloroplastos y mitocondrias puede se
entonces ser procesado utilizando el kit NEB-Next microbiome DNA
enrichment(New England BioLabs, Inc., Ipswich, MA) para eliminar el DNA
genómico de limón y enriquecer el DNA genómico bacteriano.
3. Los resultados del presente trabajo suguieren que, al eliminar el DNA de
cloroplastos y mitocondrias de la planta, el DNA enriquecido si podría utilizarse
para amplificar genomas bacterianos completos usando la amplificación por
desplazamiento múltiple (MDA) con el kit REPLI-g.
4. Una estrategia adicional sería inocular plantas de teresita (Catharanthus roseus)
a través de la planta parásita Cuscuta y solventar el problema del bajo título de la
bacteria Candidatus Liberibacter asiaticus en su hospedero natural.
5. Otra opción para obtener el genoma completo de CLas sería realizar la
extracción del DNA a partir del psilído.
46
10. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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