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CARACTERIZACIÓN DE BACTERIAS
ANTAGÓNICAS A Fusarium sp, ASOCIADAS
A Capsicum frutescens EN GUACARÍ Y
BOLIVAR, VALLE DEL CAUCA
MARTHA LUCIA VELASCO BELALCAZAR
Universidad Nacional de Colombia Facultad De Ciencias Agropecuarias, Departamento Ciencias Agropecuarias
Sede Palmira 2016
CARACTERIZACIÓN DE BACTERIAS
ANTAGÓNICAS A Fusarium sp, ASOCIADAS
A Capsicum frutescens EN GUACARÍ Y
BOLIVAR, VALLE DEL CAUCA
MARTHA LUCIA VELASCO BELALCAZAR
Tesis presentada como requisito parcial para optar al título de:
Magíster en Ciencias Agrarias
Directores
M.Sc. CELINA TORRES GONZALES
Ph.D. EYDER DANIEL GÓMEZ LÓPEZ
Línea de Investigación:
Protección de Cultivos
Universidad Nacional De Colombia Facultad de Ciencias Agropecuarias, Departamento Ciencias Agropecuarias
Palmira, Colombia 2016
(Dedicatoria o lema)
A mis padres por el apoyo en todo momento, desde el inicio de mis estudios de maestría
A Carlos Alberto Hernández por estar a mi lado desde el principio de este proyecto
de mi vida, por su apoyo incondicional, sus consejos y su impulso a seguir
adelante.
Agradecimientos
Primero quiero agradecer a mis padres por ayudarme hacer posible la conclusión de esta
tesis y de toda la maestría.
Gracias a la Universidad Nacional de Colombia por permitirme la oportunidad de estudiar
y ofrecerme tantos conocimientos, así como también a la plataforma HERMES por el
apoyo económico y de equipos y materiales necesarios para el desarrollo de mi tesis.
Mi gratitud especial a los profesores: Carlos Alberto Huertas Davey, Carlos Germán
Muñoz, Eyder Daniel Gómez y Marina Sánchez y Alexandra Garcia por su tiempo,
consejos y colaboración durante toda la maestría.
Agradezco a mis directores de tesis Eyder Daniel Gómez y Celina Torres por la
confianza, el apoyo y los consejos que me brindaron.
Gracias a mis compañeros del grupo de investigación Carlos Alberto Hernández, Viviana
Sánchez, Claudia Carabalí, Claudia Salazar, Andrés Felipe Vélez, Andrés Felipe Rendón,
Edwin Henao y Ángela Domínguez que me apoyaron en el desarrollo de mi tesis y me
permitieron entrar en su vida brindándome su amistad por todo este tiempo.
Agradezco a Carol Marulanda, Sandra Vivas, Ashlee Arévalo y Felipe Vergara por la
amistad surgida dentro de la Universidad.
A los grupos de investigación: Protección vegetal para el mejoramiento de la
productividad de la Universidad Nacional de Colombia sede Palmira y al grupo de
Biología de plantas y microorganismos de la Universidad del Valle por su apoyo con la
financiación y préstamo de equipos que fueron indispensables para el desarrollo de este
trabajo.
De igual forma, agradezco a la Doctora Paola Andrea Caro y a Mariela López del grupo
de investigación Microambiente de la Universidad Libre – Seccional Cali por su apoyo,
consejos, y momentos brindados indispensables para este trabajo.
Resumen y abstract VII
Resumen
Las bacterias tienen el potencial como controladoras de fitopatógenos ya que pueden
establecer una relación mutualista, brindando protección contra factores bióticos y
abióticos adversosa a la planta, además de proporcionar sustancias promotoras de
crecimiento vegetal o servir como control biológico de fitopatógenos, entre los que se
encuentra Fusarium spp. Este hongo patógeno, en cultivos de ají, es uno de los
principales limitantes, llegando a ocasionar pérdidas por encima del 50% o la pérdida
completa del cultivo. Por ello, y ante la necesidad de encontrar alternativas de manejo a
la marchitez vascular, ocasionada por Fusarium spp., se evaluó la capacidad antagónica
in vitro de 193 aislamientos bacterianos obtenidos del tejido foliar y de la rizosfera del
cultivo de Ají Tabasco, provenientes de los municipios de Guacarí y Bolivar Valle del
Cauca-Colombia. El estudio se realizó en el laboratorio de Microbiología ambiental,
alimentos y salud, de la Universidad Libre – Seccional Cali y laboratorio de diagnóstico
vegetal en la Universidad Nacional de Colombia sede – Palmira. Las bacterias fueron
enfrentadas a seis aislamientos patogénicos pertenecientes al género Fusarium: cinco
de ellos fueron cedidos de una colección de referencia de Universidad Nacional de
Colombia sede Palmira y uno fue aislado en una de las localidades muestreadas en la
presente investigación. Se utilizó el método de cultivo dual y se evaluó el porcentaje de
inhibición del crecimiento radial del patógeno, obteniéndose 68 aislados de las muestras
foliares y 125 de la rizosfera capaces de realizar por lo menos un antagonismo frente a
uno de los aislamientos de Fusarium evaluados. Los aislados con mayor potencial
antagónico fueron caracterizados bioquímica y molecularmente, encontrándose géneros
como Pseudomonas, Bacillus, Serratia, Achromobacter, Alcaligenes, Microbacterium,
Enterobacter, Stenotrophomonas asociadas a la rizosfera y tejido endófito foliar de la
planta de ají tabasco.
Palabras Clave: Ají, biocontrol, endófitos, PCR, rizobacterias
Resumen y abstract VIII
Abstract
The bacteria have the potential of controlling pathogens since they can establish a
mutualism relationship with it host plant, giving them protection against adverse abiotic
and biotic factors. Additionally, the bacteria can provide plant grown promoting
substances or serve as control of plant pathogens, within which is Fusarium spp. This
pathogen fungus is considered one of the most limiting in this crop. Hereby, and given the
need to find alternative management to vascular wilt caused by Fusarium spp., the
antagonistic capacity in vitro of 193 bacterial isolates obtained from tissue and
rizhosphere Tabasco Pepper, from two towns located in the Valle del Cauca-Colombia
was evaluated. El estudio se llevó a cabo en el laboratorio de microbiología del medio
ambiente, la alimentación y la salud, Universidad Libre – Cali and plant diagnostic
laboratory at the National University of Colombia - Palmira. The bacteria were facing 6
pathogenic isolates belonging to the genus Fusarium: 5 of them were assigned a
reference collection of National University of Colombia at Palmira and 1 was isolated in
one of the locations sampled in the present investigation. Method dual culture was used
and the percentage of inhibition of radial growth of the pathogen was evaluated, obtaining
68 strains leaf samples and 125 strains samples rhizosphere capable of performing at
least one antagonism to one of the strains Fusarium evaluated. Of these antagonistic
strains they were chosen which showed better inhibition and was performed a
biochemical and molecular characterization, finding genus as Pseudomonas, Bacillus,
Serratia, Achromobacter, Alcaligenes, Microbacterium, Enterobacter, Stenotrophomonas
associated with the rhizosphere and endophyte leaf tissue of plant Tabasco peppers.
Keywords: Biocontrol, entophytes, PCR, pepper, rizobacterias
IX
Contenido
Pág.
Resumen ........................................................................................................................ VII
Lista de figuras ............................................................................................................... XI
Lista de tablas .............................................................................................................. XV
Abreviaturas .................................................................................................................... 1
Introducción .................................................................................................................... 1
Revisión de literatura ...................................................................................................... 5
1.1 Ají Tabasco Capsicum frutescens .................................................................... 5 1.1.1 Fusarium en Capsicum ......................................................................... 6 1.1.2 Género Fusarium .................................................................................. 9
1.2 Rizosfera ......................................................................................................... 9 1.2.1 Rizobacterias ...................................................................................... 12
1.3 Bacterias endófitas ........................................................................................ 13
2. Objetivos ................................................................................................................. 15
2.1 Objetivo general............................................................................................. 15 2.2 Objetivos específicos ..................................................................................... 15
3. Materiales y Métodos ............................................................................................. 16
3.1 Área de estudio:............................................................................................. 16 3.2 Toma de muestras en campo ........................................................................ 16 3.3 Procesamiento de las muestras en el laboratorio: .......................................... 18
3.3.1 Suelo Rizosferico ................................................................................ 18 3.3.2 Endófitos Foliares ............................................................................... 19
3.4 Conservación de los aislamientos bacterianos .............................................. 21 3.5 Selección de aislamientos y pruebas de antagonismo ................................... 22 3.6 Tasa de crecimiento micelial .......................................................................... 26
Contenido X
3.7 Caracterización Morfológica ...........................................................................26 3.8 Caracterización Bioquímica ............................................................................27
3.8.1 Tinción de Gram ..................................................................................27 3.8.2 Perfil bioquímico ..................................................................................28 3.8.3 Medios de cultivo utilizados .................................................................34
3.9 Caracterización Molecular ..............................................................................35 3.9.1 Extracción y purificación del ADN: .......................................................36 3.9.2 Condiciones para la amplificación de la región ADNr 16s (PCR) .........37
4. Resultados y Discusión ..........................................................................................41
4.1 Antagonismos ................................................................................................41 4.1.1 Antagonismo de los aislamientos rizosfericos ......................................41 4.1.2 Antagonismo de los endófitos foliares ..................................................47
4.2 Caracterización Morfológica ...........................................................................54 4.2.1 Caracterización morfología de rizobacterias ........................................54 4.2.2 Caracterización morfológica de endófitos foliares ................................60
4.3 Caracterización Bioquímica ............................................................................63 4.3.1 Caracterización bioquímica de aislamientos rizosfericos .....................63 4.3.2 Caracterización bioquímica de aislamientos endófitos .........................65 4.3.3 Medios selectivos: ...............................................................................67
4.4 Caracterización molecular ..............................................................................72
5. Conclusiones y recomendaciones ........................................................................79
5.1 Conclusiones ..................................................................................................79 5.2 Recomendaciones ..........................................................................................80
Bibliografía .....................................................................................................................81
Anexos .......................................................................................................................... 103
XI
Lista de figuras
Pág.
Figura 2-1. Algunas interacciones establecidas en la rizosfera entre plantas, hongos
micorrícicos, y bacterias. .............................................................................. 11
Figura 3-1. Mapa del Valle del Cauca ............................................................................. 16
Figura 3-2. Toma de muestras de suelo rizosferico. A- Planta de ají colectada B-
Selección de la raíz; C – Empacado de muestra de suelo para llevar al
laboratorio. ................................................................................................... 17
Figura 3-3. Toma de muestras para endófitos foliares en campo. A- Selección y corte de
hojas por punto cardinal; B- Empaquetamiento y rotulado de las muestras
foliares ......................................................................................................... 17
Figura 3-4. Obtención de aislamientos rizosfericos. A- Agitación del suelo rizosferico por
24 h; B- Diluciones seriadas hasta 10-7; C- Dilución de 10-7 sembrada en
Agar Nutritivo; D- Bacterias de suelo en Agar Nutritivo; E- Aislamiento de una
de las colonias con un asa bacteriológica; F- Cultivo puro con colonias
individuales. ................................................................................................. 19
Figura 3-5. A – Lavado de las muestras foliares; B- Macerado de las hojas de ají; C –
Trasfeerencia de la solución resultante del macerado a tubos de ensayo; D –
Contenido XII
Almacenamiento del macerado foliar a tubos de ensayo; E– siembra de la
solución en Agar Nutritivo; F- Homogenización de la solución en Agar
nutritivo por medio de un asa de vidrio.......................................................... 21
Figura 3-6. Conservación de los aislamientos bacterianos. A- Selección de colonia
individual para sembrar en caldo nutritivo; B- Caldo Nutritivo con la
suspensión bacteriana después de 24 h; C- Almacenamiento del cultivo
bacteriano liquido en tubos eppendorf; D- Incubadora Shaker; E – Asilamiento
de bacteriano guardado a -20°C. .................................................................. 22
Figura 3-7. Cultivos puros de aislamientos de fusarium patogénicos – Anverso ............. 23
Figura 3-8. Colecta en campo de plantas de ají afectadas por Fusarium A- Cultivo de ají
afectado por Fusarium; B- Raíz con síntomas de marchitez por Fusarium. .. 24
Figura 3-9. A- Método de inoculación por inmersión de raíces; B- Tratamientos en
plántulas de ají .............................................................................................. 24
Figura 3-10. Caracterización morfológica de las colonias bacterianas en cultivos primarios
..................................................................................................................... 27
Figura 3-11. A- Bacterias Gram positivas; B- Bacterias Gram negativas ......................... 28
Figura 3-12. A- Tiras API 20E para Gram negativas; B- Tiras API 50CH para Gram
positivas ........................................................................................................ 29
Figura 3-13. Tiras oxidasa: Tira superior positiva y Tira inferior negativa ....................... 29
Figura 3-14. Tiras API 50CH iniciales en orden del 0 -49 ................................................ 31
Figura 3-15. Preparación de inóculo para test de tiras API 50CHB. A – Aislamiento
bacteriano puro; B- Preparación de inóculo en medio selectivo CHB. ........... 32
Figura 3-16. Inoculación del medio 50CHB en los tubos de las galerías ......................... 33
Figura 3-17. A – Pruebas negativas y positivas de las tiras API 20E; B- Pruebas
negativas y positivas de las tiras API 50CH. ................................................. 34
Figura 3-18. Agitación de la suspensión bacteriana en caldo nutritivo ............................ 36
Contenido XIII
Figura 3-19. A- Muestras de PCR en el termociclador; B- Ajuste de condiciones de
amplificación (Tabla 3-2); C- Corriendo la PCR ............................................ 39
Figura 4-1. Número de aislamientos antagónicos obtenidos de las rizosfera de Ají
tabasco (Capsicum frutescens) en cada localidad por salida. ...................... 42
Figura 4-2. Enfrentamiento dual (prueba de antagonismo) del aislamiento RP2B1M5
frente a los seis aislados patogénicos de Fusarium en medio PDA .............. 43
Figura 4-3. Enfrentamiento dual (prueba de antagonismo) del aislamiento RP10B2M31
frente a los seis aislados patogénicos de Fusarium en medio PDA .............. 44
Figura 4-4. Enfrentamiento dual (prueba de antagonismo) del aislamiento RP7G2M8
frente a los seis aislados patogénicos de Fusarium en medio PDA .............. 45
Figura 4-5. Enfrentamiento dual (prueba de antagonismo) del aislamiento RP1G1M16
frente a los seis aislados patogénicos de Fusarium en medio PDA .............. 46
Figura 4-6. Número de aislamientos antagónicos obtenidos de tejido foliar de Ají tabasco
(Capsicum frutescens) en cada localidad por salida. .................................... 47
Figura 4-7. Comparación del número de aislamientos antagónicos de la rizosfera y tejido
foliar ............................................................................................................. 48
Figura 4-8. Enfrentamiento dual (prueba de antagonismo) del aislamiento del tejido foliar
EP9G2M18 frente a los seis aislados patogénicos de Fusarium en medio PDA
..................................................................................................................... 50
Figura 4-9. Enfrentamiento dual (prueba de antagonismo) del aislamiento del tejido foliar
EP8G1M10 frente a los seis aislados patogénicos de Fusarium en medio PDA
..................................................................................................................... 51
Figura 4-10. Enfrentamiento dual (prueba de antagonismo) del aislamiento del tejido
foliar EP5G1M9 frente a los seis aislados patogénicos de Fusarium en medio
PDA ............................................................................................................. 52
Contenido XIV
Figura 4-11. Enfrentamiento dual (prueba de antagonismo) del aislamiento del tejido
foliar EP3B1M4 EP1B2M4 y EP1B3M4 frente a los seis aislados patogénicos
de Fusarium en medio PDA .......................................................................... 53
Figura 4-12. Morfología de rizobacterias en Agar nutriente – Observación al
estereoscopio (5X). ....................................................................................... 57
Figura 4-13. Morfología de algunos aislamientos bacterianos en Agar nutriente – vista
macroscópica................................................................................................ 59
Figura 4-14. Aislamientos bacterianos endófitos en Agar nutriente- vista macroscópica . 61
Figura 4-15. Morfología de la colonia bacteriana de algunos aislamientos endófitos en
Agar nutriente - vista en un estereoscopio .................................................... 62
Figura 4-16. Coloración de algunos aislamientos antagónicos endófitos y de la rizosfera
en Agar King B expuestos a luz UV- Los aislamientos con la letra E,
corresponden a las bacterias endófitas; los aislamientos con la letra R
corresponden a las bacterias rizosfericas. .................................................... 68
Figura 4-17. Aislamientos antagónicos endófitos y de la rizosfera en Agar MacConkey –
Los aislamientos con la letra E, corresponden a las bacterias endófitas; los
aislamientos con la letra R corresponden a las bacterias rizosfericas. .......... 69
Figura 4-18. Coloración de algunos aislamientos antagónicos endófitos y de la rizosfera
sembrados en Agar cetrimida y expuestos a luz UV - Los aislamientos con la
letra E, corresponden a las bacterias endófitas; los aislamientos con la letra R
corresponden a las bacterias rizosfericas. .................................................... 70
Figura 4-19. Visualización en gel de agarosa 1% p/b, de productos de amplificación de la
región ADN ribosomal 16S mediante el primer universal D1. ........................ 72
Figura 4-20. Árbol filogenético de las secuencias de rizobacterias y endófitas obtenidas
mediante la amplificación de la región de ADNr 16S mediante el primer
universal D1, usando el coeficiente de similitud del vecino más cercano
Neighbor joining (bootstrap de 1000 replicas). Raiz Azospirillum melinis
(NR_043483.1) ............................................................................................. 74
XV
Lista de tablas
Pág.
Tabla 2-1. Costos de producción del ají, cultivado en Colombia en el año 2013............... 2
Tabla 2-2. Exportaciones de Ají 2012 – 2014 USD $ - Volumen ....................................... 2
Tabla 2-3. Algunas especies de Fusarium registradas en ají (Capsicum). ........................ 7
Tabla 3-1. “Primers” usados en la amplificación de la región 16S .................................. 37
Tabla 3-2. Condiciones de amplificación del primer usados en este estudio . ................ 38
Tabla 4-1. Resultados de la identificación de los aislados antagonistas de la rizosfera
mediante el sistema API 20E ....................................................................... 64
Tabla 4-2. Resultados de la identificación de los aislados antagonistas de la rizosfera
mediante el sistema API 50CHB .................................................................. 65
Tabla 4-3. Resultados de la identificación de los aislados antagonistas endófitos
mediante el sistema API 20E ....................................................................... 66
Tabla 4-4. Resultados de la identificación de los aislados antagonistas endófitos
mediante el sistema API 50CHB .................................................................. 67
Tabla 4-5. Resultados de la caracterización molecular de los aislamientos endófitos de
hojas y rizobacterias de ají tabasco .............................................................. 75
XVI
Abreviaturas
Abreviatura Término
°C Grados centígrados
2KG 2-Keto-Gluconato
5KG 5-Keto-Gluconato
A.C. Antes de Cristo
ADH Arginina deshidrolasa
ADH Arginina deshidrolasa ADO Adonitol
AMD Starch
AMY Amigdalina
AMY Amygdalina
ARA Arabinosa
ARB Arbutin
Buffer TE Solución Tris – EDTA (Ácido etilendiaminotetracético)
C. Capsicum
CEL Cellobiosa
CIT Utilización del citrato cm. Centímetros
CTAB Bromuro de hexadeciltrimetilamonio
DARA D-Arabinosa
DARL L-arabinosa
DFUC D-Fucosa
DUL Dulcitol
DXYL D-xylosa
EEUU Estados Unidos
ERY Erythol ESC Esculin
et al., Otros
f. sp Forma especial
F. Fusarium
FAO Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura
FRU Fructosa
GAL Galactosa
GEL Gelatinasa
GEL Gelatinasa
GEN Gentiobiosa
GLU Glucosa
GLU Glucosa
GLY Glicerol GLYG Glycogen
GNT Gluconato
H2S Producción de ácido Sulfhídrico
H2S Producción de ácido sulfhídrico ha Hectáreas
IND Producción de indol INO Inositol
INO Inositol
INU Inulin
ISR Inducción de resistencia sistémica
LAC Lactosa
LARA L-arabinosa
LARL L-Arabitol
LDC Lisina descarboxilasa
LDC Lisina descarboxilasa LFUC L-Fucose
LXYL L-xylosa
LYX D-Lyxosa
m. Metros
MAL Maltosa
MAN Manitol
MDG 1-Methyl-D-Glucosida
MDM 1-Methyl-D-Mannosida
MDX ß-Methyl-D-Xyloside
MEL Melobiosa
mg/ ml Miligramos por mililitros
Min Minutos
mL Mililitros
MLZ Melezitosa
mm Milímetros
MNE Manosa
NaCl Cloruro de sodio
NAG N-Acetyl-Glucosamina
ODC Ornitina descarboxilasa ONPG Beta-galactosidasa
OX Citocromo Oxidasa
PCR Reacción de cadena de la polimerasa
PDA Agar papa dextrosa
Contenido XVIII
PGPR Plant grown Promoting rizobacteria – Bacterias promotoras de crecimiento vegetal
QS Quorum sensing
pH Grado de acidez o basicidad de una solución acuosa.
r.p.m Revoluciones por minuto
RAF Raffinosa
RHA Ramnosa
RIB Ribosa
Rizho Raíz
RSI Resistencia sistémica inducida
S.D.S. Dodecilsulfato sódico
SAC Sacarosa
SAL Salicin
SBE Sorbosa
SOR Sorbitol
Sphe Ambiente habitado por microorganismos
TAG D-Tagatosa
TDA Triptófano desaminasa TRE Trehalosa
TUR D-Turanosa
UFC Unidad formadora de colonia
URE Ureasa VP Producción de acetoína (Voges-Proskauer)
XLT Xylitol
μl Microlitros
Introducción 1
Introducción
Capsicum es un género de importancia económica, que pertenece a la familia
Solanaceae. El género incluye por lo menos 32 especies nativas de América tropical
(Moscone et al., 2007), de las cuales C. annuum L., C. baccatum., C. chinense Jacq., C.
fruescens L., y C. pubescens fueron domesticados en el 6000 A.C. por los nativos
americanos (Perry et al., 2007). La superficie destinada a este cultivo en las distintas
regiones del mundo varía notablemente según el uso, tradición, consumo y destino de las
exportaciones. El continente que mayor superficie destina para su producción es Asia
(China e India son los principales productores), que ocupan más del 50 % de la superficie
mundial y el segundo es África. En Europa existe una gran producción y en América, se
destaca la producción de México con 168.632 ha cultivadas, Estados Unidos con 31.000
ha cultivadas y le siguen Argentina, Chile y Venezuela. Argentina es el principal productor
en Sudamérica, ocupando una superficie que varía año a año de 3000 a 6000 ha.
Durante el año 2012 la FAO estimó una superficie de 6700 ha cultivada en ají verdes y
2500 ha de ají para secado (FAO, 2015).
Colombia, por su parte, según la Corporación Colombiana Internacional (CCI), en datos
publicados en la revista Portafolio en el año 2007, reportó que los países a los cuales se
realizó la mayor parte de las exportaciones del ají en el año 2005 fueron Estados Unidos
con el 52% de las exportaciones, Arabia Saudita con un 46% y Canadá y Antillas
Holandesas, cada uno con el 1%. También fue reportado que en el 2006 el departamento
del Valle del Cauca registró la mayor área de la producción nacional de ají con 450
Introducción 4
hectáreas cosechadas, seguido por Sucre con 132 hectáreas y 935 toneladas, y Córdoba
con 112 hectáreas y 487 toneladas producidas. En el resto de departamentos la
producción nacional es de 803 hectáreas cosechadas y una producción de 7.735
toneladas (Portafolio, 2007). Para el año 2013, la FAO presentó algunos indicadores
económicos relacionados con la producción, rendimiento y área cultivada del ají en
Colombia (tabla 2-1).
Tabla 2-1. Producción del ají, cultivado en Colombia en el año 2013
Datos Económicos Valor
Área Cultivada 4000.00 Ha
Rendimiento 74.188.00 Hg/Ha
Producción 29.675.00 Ton
De igual modo, el Ministerios de Agricultura y Desarrollo Rural en el año 2012, reportó
que para los años 2007 y 2011 las hectáreas cosechadas en Colombia fueron 2,176 y
2,045 hectáreas respectivamente. En datos recientes, la revista acción, de la Cámara de
Comercio de Cali, proyectó datos indicadores de exportaciones de ají para Colombia y el
Valle del Cauca, indicando cifras obtenidas del DANE, donde atestigua que el
departamento en los años 2012, 2013 y 2014 con una participación que sobrepasa el
82% del valor total exportado y con el 93% del volumen de producción. Estos datos se
ilustran en la tabla 2-2.
Tabla 2-2. Exportaciones de Ají 2012 – 2014 USD $ - Volumen en toneladas
Año
Colombia
Valle del Cauca
% PART
VALOR
US$
% PART EN
VOLUMEN USD$ Volumen USD$ Volumen
2012 3.573.127 1.766.256 2.795.964 1.580.679 78,2% 89,5%
2013 5.294.055 2.627.665 4.592.759 2.493.227 86,8% 94,9%
2014 3.834.270 1.757.962 3.073.368 1,673.692 80,2% 95,2%
Total 12.701.452 6.151.883 10.462.091 5.747.598 82,4% 93,4%
Introducción 3
Muchas enfermedades causadas por hongos, bacterias y virus ocasionan diferentes
limitaciones durante los estados fenológicos del cultivo, es por esto que los agricultores
suelen presentar problemas para mantener plantas saludables y establecerlas en campo
para una buena producción.
Entre estas enfermedades limitantes para el cultivo del ají se encuentra la pudrición de
raíz y tallo causada por especies del género Fusarium, el cual es un hongo cosmopolita
que existe en muchas formas patogénicas, parasitando más de cien especies de plantas
gimnospermas y angiospermas gracias a los diversos mecanismos que tiene el hongo
para vencer las defensas de las plantas (Bosland, 1988; Prieto et al., 2010; Garcés et al.,
2011; Morales et al., 2014); se presenta principalmente como saprófito en el suelo, o
también como patógeno especializado, denominado forma especial (f. sp.), según la
planta hospedante que afecte. Es posible distinguir patotipos o razas fisiológicas de una
misma forma especial, cuando se determina la variedad de la especie vegetal que ataca
y aún en poblaciones clonales al analizar características moleculares (Garcés et al.,
2001; Álvarez, 2006).
Este hongo patógeno invade el xilema de las raíces y tallos, y produce una enfermedad
que interfiere fundamentalmente sobre el flujo ascendente del agua a través del xilema.
Es evidente que las alteraciones vasculares en los marchitamientos se deben a más de
un factor. Aun cuando el patógeno sea la única causa de la enfermedad, algunos de los
factores responsables del síndrome de ésta provienen directamente del patógeno,
mientras que otros los origina el hospedero en respuesta al patógeno (Agrios, 2005).
Dentro del manejo de los múltiples problemas que afectan la producción del cultivo de ají
causados por Fusarium, el más común es la aplicación de agroquímicos los cuales
perjudican el ecosistema y aumentan la posibilidad de generar resistencia por parte del
hongo, otros microorganismos patógenos y plagas asociadas (Prieto et al., 2010; Morales
et al., 2014). La búsqueda de microorganismos capaces de erradicarlo o manejarlo es
una alternativa favorable para el control de esta enfermedad, la cual es más amigable
con el ambiente, disminuyendo la posibilidad de desarrollar resistencia en los patógenos
y bajar los costos de producción al reducir el uso de agroquímicos.
Entre estos microorganismos con capacidad antagónica se encuentran las bacterias, las
cuales forman parte primordial de un ecosistema y de su funcionamiento óptimo, ya que
Introducción 4
son protagonistas de diversas acciones benéficas para las plantas, destacando su aporte
en la nutrición y protección vegetal (Jaizme y Rodríguez, 2008; Ferrera y Alarcón, 2001).
Existe una extensa literatura que describe el uso potencial de la asociación de bacterias
como agentes estimulantes de crecimiento y sanidad vegetal (Glick, 1995; Hallman et al.,
1997; Ryu et al., 2004; Sturz et al., 2003; Welbaum et al., 2004). Según, Bashan y
Holguin, 1998, estas bacterias realizan asociaciones con casi todas las especies
vegetales y están comúnmente presentes en el ambiente. El grupo más estudiado son
las rizobacterias, las cuales colonizan la raíz y se adhieren a la interface suelo – raíz
llamada rizosfera (Kloepper et al., 1999).
Gray y Smith en el 2005, reportaron que algunas de estas rizobacterias pueden también
encontrarse en el interior de la raíz y establecer poblaciones endófitas. Muchas de estas
son capaces de trascender la endodermis, cruzando desde la corteza de la raíz hasta el
sistema vascular, donde posteriormente prosperan como endófitas en tallo, hojas,
tubérculos y otros órganos (Compant et al., 2005). Además, el alcance de la colonización
de las bacterias endófitas a los órganos y tejidos de la planta refleja la capacidad de las
bacterias para adaptarse selectivamente a estos nichos ecológicos específicos (Nava et
al., 2012; Pérez et al., 2015)
Debido a la cantidad de propiedades positivas que aportan estos microorganismos al
suelo, a las plantas y al ambiente en general, dentro del Macroproyecto de regalías
“Desarrollo de un sistema agroindustrial, rural, competitivo a partir de cultivos promisorios
en una Bioregión del Valle del Cauca” de la Universidad del Valle y en asociación con la
Universidad Nacional de Colombia sede Palmira, se realizaron 200 aislamientos de
rizobacterias y bacterias endófitas asociadas a este cultivo logrando identificar y
caracterizar aquellas que presentaban un antagonismo o control frente a Fusarium.
Revisión de literatura
1.1 Ají Tabasco Capsicum frutescens
El ají tiene una amplia diversidad de formas, tamaños y colores en los frutos. Su
pungencia es utilizada como especia y el pimiento es usado como vegetal. Después del
retorno de Cristobal Colón en 1492 y los viajes posteriores de exploración, los Capsicum
fueron repartidos alrededor del mundo gracias a su adaptación a diferentes regiones
agroclimáticas y su rápida adopción en diferentes culturas para su alimentación,
medicina, y fines ornamentales (Bosland y Votava, 2012; Hayman y Kam 2008; Qin,
2014).
Colombia tiene 1.700 hectáreas de ají sembradas en todo el territorio nacional, con una
producción de 20 mil toneladas al año, y un aumento estimado del 13% anual (Ochoa,
2014), siendo la Costa Caribe y el Valle del Cauca las regiones de mayor producción
(Rada et al., 2011).
En el país, empresas se dedican a la transformación y venta de este fruto, ya sea como
alimento, o como materia prima para la obtención de colorantes y de oleorresinas e
insecticidas biológicos debido a que constituyen una fuente importante de compuestos
como fenoles, flavonoides y antioxidante (Guerrero, 2012).
Revisión de literatura 6
Capsicum frutescens es una planta con tallo de contextura herbácea en la parte superior
y leñosa en la inferior (Cooagrofuturo, 2010; FDA, 1994). Su altura varía de 30 a 120
centímetros y posee una ramificación pseudodicotómica. Las hojas son simples,
alternas, ovaladas, de borde liso y color verde oscuro. Las flores, están localizadas en los
puntos donde se ramifica el tallo, encontrándose de 1 a 5 flores por cada ramificación.
(Muciño et al., 2009; Bonilla, 2015).
Su fruto es una baya con 2 a 4 lóculos, formando cavidades inferiores con divisiones
visibles. Es de forma elíptica y pequeño en tamaño. Al llegar a la madurez su coloración
es rojiza, aunque también se pueden encontrar anaranjadas y en estado inmaduro su
coloración es comúnmente verdosa (FDA, 1994; Bonilla, 2015). En su interior se
encuentran las semillas, de color amarillo, contextura lisa y forma reniforme. Finalmente
esta planta, posee una raíz primaria y ramificada, además de raíces secundarias que
pueden extenderse hasta 120 cm y alcanzar una profundidad aproximada de 40 cm
(FDA, 1994; Cooagrofuturo, 2010; Pino, 2015; Melgarejo et al., 2004; Bonilla, 2015).
La planta es afectada por diversos patógenos a lo largo de su ciclo fenológico
impidiendo su crecimiento y producción (Flor et al., 2007; Velásquez-Valle et al., 2007).
Entre las enfermedades que afectan el cultivo se encuentra la Antracnosis, causada por
el hongo Colletotrichum sp., Cercospora sp.,que afecta las parte foliar, Pythium sp.,
Rhizoctonia sp., Phytophthora sp., afectan el sistema radical de la planta y
Pectobacterium carotovorum produce una licuefacción en el fruto de ají (FDA , 1994;
Dagnoko et al., 2013).
1.1.1 Fusarium en Capsicum
Además de las enfermedades y patógenos antes mencionados, especies del género
Fusarium causan graves problemas fitosanitarios en el cultivo, debido a las
podredumbres y necrosamientos que ocasionan en la raíz al penetrar la planta y obstruir
los vasos del xilema, impidiendo la entrada de nutrientes y afectando su desarrollo
normal. Con este hecho, las hojas comienzan a marchitarse; el proceso puede continuar
hasta que la planta completa se marchita y finalmente muere (Summerell, et al., 2003;
Leslie y Summerell, 2006).
Revisión de literatura 7
Las especies de Fusarium causantes de marchitez, siguen un patrón similar de infección;
penetran por la raíz, colonizan el tallo de las plantas y el sistema vascular, a causa de la
producción de diversos efectores de naturaleza proteica que puede ayudar al patógeno a
suprimir las defensas de las plantas logrando su penetración (Turlier et al., 1994;
González et al., 2012). Además, producen metabolitos secundarios como las
micotoxinas, que contaminan los productos de consumo humano y animal (Moretti, 2009;
Chiotta et al., 2015).
Las pudriciones del cuello de la raíz en ají y pimentón causadas por Fusarium, son
limitantes en la producción de ají en Colombia y en varios países del mundo, dado que
pueden ocasionar pérdidas por encima del 50% o la pérdida completa del cultivo cuando
las condiciones son favorables para el desarrollo del patógeno (Singh and Singh, 2004;
Madhavi et al., 2006 Citado por: Sundaramoorthy et al., 2011; Santos, 2010; Velásquez
et al., 2004; Clavijo, 2014).
La tabla 2-3 muestra algunas de las especies de Fusarium que afectan al cultivo de
Capsicum; modificada por Clavijo, (2014):
Tabla 2-3. Algunas especies de Fusarium registradas en ají (Capsicum).
Especie Países Bibliografía
F. oxysporum f. sp.
vasinfectum
México, Suroeste de Estados
Unidos, Sur América y Europa
Oelke y Bosland, 2001;
Miller, et al., 1996, Sherfy
Mac Nab, 1986
F. oxysporum f. sp.
capsici Bl. y Riv Estados Unidos, México
Rivelli, 1989 Citado por:
Oelke y Bosland, 2001;
Velásquez, 2001
F. oxysporumf. sp.
radicis-lycopersici México
Apocada et al., 2004
F. oxysporum Israel, Pakistán, México, Provincia
de Almería (España)
Oelke y Bosland, 2001;
Miller, et al., 1996; Mushtaq y
Hashmi, 1997; Vásquez et
al., 2009; Pérez et. al., 2014
Revisión de literatura 8
Tabla 2-3: (Continuación)
Especie Países Bibliografía
F. solani
Israel, Canadá, Pakistán, Italia,
México, EEUU, Nigeria, Taiwán
Provincia de China.
Oelke y Bosland, 2001;
Miller, et al., 1996; Yang et
al.,; 2009; Mushtaq y
Hashmi, 1997; Tosi et al.,
2000; Rivera, 2009; Santos,
2010; Agarwal et al., 2007
F. equiseti Corda Israel Oelke y Bosland, 2001;
Miller, et al., 1996
F. semitectum Berk Israel Oelke y Bosland, 2001;
Miller, et al., 1996
F. javanicum Koord Israel Oelke y Bosland, 2001;
Miller, et al., 1996
F. culmorum (W. G.
Smith) Israel
Oelke y Bosland, 2001;
Miller, et al., 1996
F. avenaceum (Fr)
Sacc Israel
Oelke y Bosland, 2001;
Miller, et al., 1996
F. moniliforme
(Sheldon) Snyd Israel, Pakistán
Oelke y Bosland, 2001;
Miller, et al., 1996
Fusarium lactis Bélgica y Alberta, (Canadá) Yang et al.,; 2009; Mushtaq y
Hashmi, 1997
Fusarium
subglutinans Canadá
Utkhede y Mathur, 2003
Fusarium
anthophilum
Pakistán Mushtaq y Hashmi, 1997
F. proliferatum Pakistán Mushtaq y Hashmi, 1997
F. lateritium México Vásquez et al., 2004;
Vásquez et al., 2009
F. concentricum China Wang et. al., 2013
Revisión de literatura 9
1.1.2 Género Fusarium
El género Fusarium pertenece al reino Fungi, phyllum Ascomycota, clase
Sordariomycetes, orden Hypocreales y familia Nectriaceae. Se estima que a este género
pertenecen 178 especies (Leslie y Summerell 2006; Moretti, 2009; Lombard et al., 2015;
Roskov et al., 2016). Se conocen los teleomorfos ó formas perfectas de algunas especies
de Fusarium, las cuales se incluyen en los géneros Giberella, Nectria, Albonectria,
Haematonectria (Gams y Nirenberg, 1989; Leslie y Summerell 2006).
En cuanto a su morfología, las macroconidias son un carácter importante en la
identificación de especies de este género y en muchos casos la morfología de esta
conidio es suficiente para identificar una especie (Leslie y Summerell, 2006).
Adicionalmente puede producir otras estructuras como esporodoquios, meso y
microconidios, fialides, clamidosporas, entre otros (Gams y Nirenberg, 1989; Suarez,
2001; Leslie y Summerell 2006).
Las colonias de las distintas especies de Fusarium son de crecimiento moderado o
rápido, tienen diversos colores como blanco, rosado pálido, rojo, anaranjado, purpura,
celeste, verde aceituna o pardo (Samson et al., 2004). Algunas especies presentan
zonas concéntricas de distinta morfología macroscópica debido a la secuencia luz -
obscuridad (Carrillo, 2003; Samson et al., 2004; Leslie y Summerell 2006).
Debido a su gran variabilidad genética y su amplia distribución, el manejo de las especies
del género Fusarium resulta difícil. Por ello se ha empleado inductores de resistencia,
productos de origen botánico y microorganismos como bacterias, para hallar estrategias
de manejo que contribuyan al control de este hongo patógeno (Rodríguez y Montilla,
2001; El- Khallal, 2007).
1.2 Rizosfera
La rizosfera es un entorno de suelo afectado por las raíces que posee una gran actividad
física, química y, biológica, pues representa una interface de comunicación entre las
plantas, el suelo y microorganismos (Sánchez de Praguer et al., 2007). En esta
comunicación llevada a cabo por la raíz y su entorno y viceversa, la planta traslada entre
el 30 y 60% del carbono neto proveniente de la fotosíntesis y lo libera a través de las
Revisión de literatura 10
rizodeposiciones (Read et al., 1999; Crews, et al., 2003; Marschner, 1995; citado por
Sánchez de Praguer et al., 2007 y Paz et al., 2006).
Algunas rizodeposiciones originadas en la rizosfera, son los exudados radicales, los
cuales se caracterizan por ser diversos y propios de células vivas. Estos tienen como
función la movilización directa e indirecta de nutrientes, así como también la matriz de
protección y lubricación, que facilita la colonización de las raíces en el suelo. De igual
forma, modifican la estructura y actividad biológica del suelo y algunos de ellos
constituyen la base de fitohormonas, vitaminas y factores de crecimiento (Curl y
Truelove, 1986; Marschner, 1995; Oliveros et al., 2009).
Otras rizodeposiciones involucran, lisados, secreciones, mucílagos, mucígel, compuestos
gaseosos y nutrientes minerales (Marschner et al., 1995; González et al., 1991; Rovira et
al., 1961). Los lisados, se caracterizan por ser el resultado de la autolisis y degradación
de células epidérmicas y corticales, además de la acción de metabolitos microbianos que
actúan como fuente de materiales orgánicos para las poblaciones microbianas
(Marschner et al., 1995; Sánchez de Praguer, 2006; Paz et al., 2006).
Las secreciones, son compuestos de alto peso molecular que atraviesan las membranas
celulares. Una de estas secreciones son las enzimas, que catalizan la degradación de los
materiales orgánicos e inorgánicos presentes naturalmente en el suelo rizosferico
(Marschner et al., 1995; Sánchez de Praguer et al., 2007).
Los mucilagos y el mucígel, son materiales orgánicos y gelatinosos que protegen y
lubrican la zona de crecimiento radical. También intervienen en la disponibilidad y
absorción de minerales, así como la formación de agregados en el suelo (Siqueira y
Franco, 1988; Sánchez de Praguer, 2006; Sánchez de Praguer et al., 2007; Oliveros et
al., 2009).
Por otro parte, los compuestos gaseosos son compuestos volátiles que pueden afectar
positiva o negativamente la actividad microbiana en la zona rizosferica y más allá de ella
(Curl y Truelove, 1986; Siqueira y Franco, 1988; Marschner, 1995; Cardoso y Freitas,
1992 y Sanchez de Praguer et al., 2007). Del mismos modo, los nutrientes minerales
como el fósforo, nitrógeno, potasio, etc, juegan un papel importante en el desarrollo de la
planta pues contribuyen a la nutrición mineral de la misma (Oliveros et al., 2009; Sánchez
de Praguer et al., 2007; Sánchez de Praguer, 2006; Paz et al., 2006).
Revisión de literatura 11
Aunque la rizosfera no es una zona uniforme, es posible diferenciar en ella algunas
regiones como el rizoplano y la endorrizosfera. Su delimitación se encuentra en un
alcance de 1-5 mm de espesor (Wild, 1992; Sánchez de Praguer et al., 2007). (Figura 2-
1).
Fuentes: Tomado de Bonfante y Anca, 2009.
Figura 2-1. Algunas interacciones establecidas en la rizosfera entre plantas, hongos
micorrícicos, y bacterias.
Los microorganismos que se establecen en cada una de estas regiones, se han
especializado en estos hábitats a través de procesos coevolutivos y varían dependiendo
de las especies de plantas, edad, condiciones sanitarias y ambientales. (Foster, Rovira y
Cock, 1983; siqueira y Franco, 1988; Cardoso y Freitas, 1992; Wild, 1992; Sánchez de P,
2007). Existen tres tipos de organismos que habitan la endorizosfera: 1. Los que
establecen simbiosis con la planta hospedera; 2. Los que hacen daño al hospedero
parasitando tejido vegetal y 3. Los que viven en el tejido muerto de la raíz (Foster, Rovira
y Cock, 1983; Sánchez de P et al., 2007).
Revisión de literatura 12
Algunos de los organismos que establecen simbiosis con la planta hospedera y son
habitantes de la endorizosfera, interactúan con el hospedero y mientras usan las fuentes
de energía de la raíz, proveen beneficios a la planta, estableciendo complementos en los
ciclos nutricionales (Sánchez de P et al., 2007), entre los que se destacan las bacterias.
1.2.1 Rizobacterias
Las bacterias que colonizan las raíces se les conoce como “rizobacterias” (Schroth y
Hancook 1982; Hilie and Saunders, 2008) y pueden ejercer diferentes tipos de efectos en
las plantas hospedantes. Uno de ellos, es el benéfico, relacionado con la promoción del
crecimiento de la planta y/o como agentes de control biológico (Kloepper y Schroth 1981;
Hilie and Saunders, 2008). Estas bacterias también conocidas como bacterias
promotoras de crecimiento vegetal o PGPR (Plant grown Promoting rizobacteria),
contribuyen a la protección de la planta contra patógenos radicales y foliares, además
promueven el crecimiento mediante dos tipos de mecanismos: indirectos y directos, o en
combinación (Kloepper et al., 1993; Glick, 1995; Shah, 2009).
Los mecanismos indirectos se caracterizan porque las PGPR ocasionan la disminución o
eliminación de microorganismos fitopatógenos (hongos, bacterias y nematodos, entre
otros), ya sea a través de la producción de sustancias antimicrobianas, sideróforos,
enzimas líticas, o la combinación de éstas. De igual manera, pueden actuar compitiendo
por nutrimentos o espacio en el nicho ecológico, así como por estimulación de las
defensas naturales de la planta mediante mecanismos conocidos como resistencia
sistémica inducida (RSI). Esta última induce la resistencia de tejidos sistémicos al ataque
por fitopatógenos mediante la emisión de compuestos orgánicos volátiles, ácido
jasmónico, ácido salicílico y etileno que participan en la protección de las plantas
(Kloepper et al., 1993; Glick, 1995; Shah, 2009).
Los mecanismos directos incrementan la disponibilidad de nutrimentos en la rizosfera al
influir en el metabolismo de las plantas y mejorar su nutrición. Estos mecanismos son:
fijación de nitrógeno; síntesis de fitohormonas (auxinas, giberelinas, citocininas),
vitaminas y enzimas; solubilización de fósforo inorgánico y mineralización de fosfato
orgánico; oxidación de sulfuros; incremento en la permeabilidad de la raíz; producción de
nitritos; acumulación de nitratos; y reducción de la toxicidad por metales pesados (Glick
Revisión de literatura 13
1995; Amorin y Melo 2002; Dobbelaere et al., 2003; Hernández et ál. 2004, Khalid et ál.,
2004; Kloepper et ál. 2004, Podile y Kishore 2006, Reyes et ál., 2008, Bhattacharyya y
Jha 2012, Singh y Singh 2013; Esquivel et al., 2013; Ramírez et al., 2015).
Otros mecanismos bacterianos que contribuyen al biocontrol son la interferencia de
señales de quorum sensing (QS), la inhibición en la formación de biopelículas y
producción de toxinas por el patógeno (Howell y Stipanovic 1980; Shanahan et al., 1992;
Podile y Kishore 2006; Kim et al., 2009; Ko et al., 2009; Kaymak 2011; Bhattacharyya
y Jha 2012; Singh y Singh 2013; Ramírez et al., 2015).
Por último, la selección de rizobacterias como potenciales agentes de control biológico
constituye un campo de investigación y desarrollo en expansión (Yadegari et al., 2010)
debido a sus perspectivas de aplicación en agroecosistemas sustentables con un gran
potencial en la agricultura moderna.
1.3 Bacterias endófitas
Las bacterias promotoras del crecimiento vegetal pueden penetrar al interior de las raíces
y establecerse como poblaciones endófitas. Muchas de ellas tienen la capacidad de
trascender las barreras de la endodermis, atravesar la corteza de la raíz hasta el sistema
vascular y, como consecuencia, vivir como endófitos en tallos, hojas, tubérculos y otros
órganos sin causar perjuicio a la planta (Reinhold-Hurek y Hurek, 1998; Kloepper et al.,
1999; Mazzanti y Gutiérrez, 2003; Pérez et al., 2013). Las rutas de acceso son las
raíces, estomas o alguna herida en la planta, ya que pueden vivir en el sistema vascular
y espacios intra o intercelulares (Zinniel et al., 2002).
La población total de endófitos puede variar debido a factores como la edad de la planta,
condiciones ambientales y el tipo de tejido (Zinniel et al., 2002; Elbeltagy et al., 2001). Se
ha considerado que las bacterias endófitas podrían tener algunas ventajas competitivas
sobre las rizosféricas, ya que la disponibilidad de nutrientes es mayor en el interior de las
plantas y el número de microorganismos endófitos es menor que el de los rizosféricos
(James, 1995). Además, las bacterias endófitas se encuentran mejor protegidas que las
Revisión de literatura 14
rizosféricas de las condiciones adversas que se presentan en el medio ambiente (Rives
et al., 2007).
Las primeras evidencias de asociación entre microorganismos endófitos y plantas, se
originaron de observaciones en tejidos y hojas fosilizadas, lo que soporta la inferencia de
que la asociación planta- endófito pudo haber ocurrido junto con la aparición de las
primeras plantas en la tierra (Strobel, 2003). Como resultado de esa larga asociación es
posible que algunos de estos microorganismos endófitos hayan adquirido un sistema
genético para transferir información desde la planta hospedera a ellos, o viceversa. Este
posiblemente sería un mecanismo rápido y seguro de adaptación a diferentes ambientes
y a la planta hospedera (Germaine, et al., 2004; Tsavkelova et al., 2007).
Las bacterias endófitas juegan un papel importante en las actividades fisiológicas de los
hospedantes, e influyen en el mejoramiento al estrés abiótico y resistencia a
enfermedades, insectos y nemátodos (Carroll, 1988; Hallmann y Sikora, 1996; Azevedo
et al., 2000; Sturz y Nowak, 2000; Pérez et al., 2013). Estas producen metabolitos
secundarios de gran importancia (Li et al., 2000; Strobel, 2002; Pérez et al., 2013) y sería
una fuente de nuevos fármacos y programas de gestión contra enfermedades de las
plantas (Murray et al., 1992; Azevedo et al., 2000; Berg et al., 2004).
En la última década un interés creciente ha sido dirigido hacia los microorganismos
endófitos, los cuales al estar menos afectados por el estrés ambiental y más aclimatados
con su hospedero (Sturz y Nowak, 2000; Peña y Reyes, 2007) podrían representar una
mayor ventaja ecológica. Sin embargo, la presencia de bacterias endófitas y su papel
dependen probablemente del cultivar y de su coevolución con la especie microbiana
(Yanni et al., 2001; Peña y Reyes, 2007).
Se considera que muchas comunidades bacterianas endófitas, son el producto de un
proceso de colonización iniciado en la zona de la raíz (Welbaum et al., 2005), sin
embargo pueden provenir de otras fuentes como, la filosfera o la espermosfera (Hallman
et al., 1997). A pesar de sus diferentes nichos ecológicos, las rizobacterias de vida libre
y bacterias endófitas utilizan algunos mecanismos similares para promover el crecimiento
de plantas y controlar los patógenos (Bloemberg et al., 2001, Ryu et al., 2004)
2. Objetivos
2.1 Objetivo general
Caracterizar morfológica, bioquímica y molecularmente bacterias PGPR aisladas de
ají tabasco (Capsicum frutescens) con antagonismo a Fusarium spp.
2.2 Objetivos específicos
1. Determinar el efecto inhibitorio y/o controlador de las bacterias aisladas de la
rizosfera y tejido foliar frente Fusarium spp.
2. Identificar morfológica, bioquímica y molecularmente las bacterias con potencial
antagónico asociadas al cultivo de Ají tabasco en dos localidades del Valle del
Cauca.
Materiales y Métodos 16
3. Materiales y Métodos
3.1 Área de estudio:
Esta investigación Se realizó en los Municipios de Guacarí y Bolívar, Valle del Cauca
Fuente: http://www.tulua.gov.co/mapas.shtml?apc=m1m1--&x=1481902
Figura 3-1. Mapa del Valle del Cauca
3.2 Toma de muestras en campo
Se realizó un muestreo totalmente aleatorio y se colectaron 15 plantas por cada
localidad, tomando submuestras de suelo rizosferico de las planta de ají (Figura 3-2).
Municipio de Bolívar valle 4°25’00.47’’N- 76°08’54.53’’O T°: 28°C 939 m.s.n.m
Municipio de Guacarí Corregimiento de Guacas. 5 Lotes de 0.75 hectáreas T°: 28°C 3°45’21,68’’N – 76°11’57,72’’O 971 m.s.n.m
Revisión de literatura 17
Posteriormente se guardaron en bolsas plásticas, se rotularon y llevaron al laboratorio de
Diagnostico Vegetal en la Universidad Nacional de Colombia sede Palmira.
A B C
Figura 3-2. Toma de muestras de suelo rizosferico. A- Planta de ají colectada B-
Selección de la raíz; C – Empacado de muestra de suelo para llevar al laboratorio.
Paralelo al muestreo de suelo rizsosferico, se realizó el muestreo de follaje para verificar
presencia de endófitos mediante el protocolo de Morales y Rodríguez 2006. Se tomaron
tres hojas sanas por cada punto cardinal de la planta (3 órganos/punto cardinal/planta)
(Figura 3-3). Estos muestreos fueron realizados en el tercer y octavo mes del cultivo para
cada localidad. Al finalizar la toma de muestras foliares se depositaron en bolsas de
papel debidamente rotuladas y se llevaron al laboratorio de Microbiología ambiental,
alimentos y salud, de la Universidad Libre – Seccional Cali.
Figura 3-3. Toma de muestras para endófitos foliares en campo. A- Selección y corte de
hojas por punto cardinal; B- Empaque y rotulado de las muestras foliares
Materiales y Métodos 18
3.3 Procesamiento de las muestras en el laboratorio:
3.3.1 Suelo Rizosferico
El procesamiento del suelo se llevó a cabo en el laboratorio de diagnóstico vegetal de la
Universidad de Nacional de Colombia, sede Palmira, donde se depositaron 100 gr de
suelo en un erlenmeyer con 200 ml de agua destilada estéril y se agitó durante 24 horas
(Figura 3-4a). Una vez homogenizada la muestra, se extrajo 1 ml de la solución madre y
se realizó una dilución seriada de 10-1 hasta 10-7, luego se tomó 40 μL de la dilución 10-7
y se sembraron en medio agar nutritivo por triplicado. Posteriormente las cajas fueron
incubadas a 28°C durante 24 – 48 horas (Figura 3-4b). Cuando aparecieron las primeras
colonias bacterianas, se realizaron las descripciones morfológicas y se transfirieron a
otras cajas Petri con medio de agar nutritivo para llevarlas a cultivo puro y en colonias
aisladas (Figura 3-4c). Cada aislamiento bacteriano, fue debidamente rotulado de
acuerdo con el siguiente código: R (Rizosfera); P (Planta); B1 (Bolívar primer muestreo),
B2 (Bolívar segundo muestreo) o G1 (Guacarí primer muestreo), G2 (Guacarí segundo
muestreo) y M (Número de bacterias en la caja).
Ejemplo:
RP2B2M4; Aislamiento proveniente de la rizosfera de la segunda planta muestreada,
perteneciente a la localidad de Bolívar realizada en la segunda salida y la bacteria
número cuatro de la caja.
Revisión de literatura 19
AB
C D
E F
Figura 3-4. Obtención de aislamientos rizosfericos. A- Agitación del suelo rizosferico por
24 h; B- Diluciones seriadas hasta 10-7; C- Dilución de 10-7 sembrada en Agar Nutritivo;
D- Bacterias de suelo en Agar Nutritivo; E- Aislamiento de una de las colonias con un asa
bacteriológica; F- Cultivo puro con colonias individuales.
3.3.2 Endófitos Foliares
El procesamiento de muestras foliares se llevó a cabo en el laboratorio de Microbiología
ambiental, alimentos y salud, de la Universidad Libre – Seccional Cali y en el Laboratorio
de investigaciones microbiológicas de la Universidad del Valle, y siguiendo el protocolo
propuesto por Pérez et al., (2010) con algunas modificaciones: se seleccionaron seis
hojas de cada planta de ají, las cuales fueron lavadas con hipoclorito de sodio al 0,1% 1
min, alcohol al 70% 1 min y agua destilada estéril (Figura 3-5a). En seguida de este
Materiales y Métodos 20
proceso, las muestras foliares fueron maceradas con ayuda de un mortero creando una
suspensión madre donde se tomó 1 ml y se llevó a un tubo de ensayo con 9 ml de agua
destilada estéril (Figura 3-5b). Posteriormente, esta solución se llevó al vórtex hasta
homogenizarla, de esta última se tomaron 100 μL y se vertieron a una caja Petri con agar
nutritivo. Esta solución fue extendida en todo el medio con un asa de vidrio estéril y
finalmente llevada a la incubadora a 28°C. Pasados 24 – 48 horas, las colonias de las
diferentes bacterias presentes fueron aisladas y transferidas a otra caja petri con agar
nutriente, para la obtención de cultivos puros que permitiesen la toma de datos y su
conservación.
Cada aislamiento bacteriano, fue debidamente rotulado de acuerdo al siguiente código: E
(Endófito foliar); P (Planta); B1 (Bolívar primer muestreo), B2 (Bolívar segundo muestreo)
o G1 (Guacarí primer muestreo), G2 (Guacarí segundo muestreo) y M (Número de
bacterias en la caja).
Ejemplo:
EP4B1M9; Aislamiento proveniente de la rizosfera de la cuarta planta muestreada,
perteneciente a la localidad de Bolívar realizada en la primera salida y la bacteria número
nueve de la caja.
Revisión de literatura 21
A B C
D E F
Figura 3-5. A – Lavado de las muestras foliares; B- Macerado de las hojas de ají; C –
Trasfererencia de la solución resultante del macerado a tubos de ensayo; D –
Almacenamiento del macerado foliar a tubos de ensayo; E– siembra de la solución en
Agar Nutritivo; F- Homogenización de la solución en Agar nutritivo por medio de un asa
de vidrio
3.4 Conservación de los aislamientos bacterianos
Se siguió el protocolo de Morales et al., 2010 sobre el método de conservación a -20 °C.
Para este procedimiento se utilizó caldo nutritivo preparado de acuerdo con las
instrucciones de la casa comercial. Se sirvieron 5 ml de este medio en crioviales y se
esterilizaron en autoclave. Una vez estéril el medio, se inocularon los microorganismos
para su crecimiento. Se ubicaron en una incubadora shaker a 28 °C entre 18 – 24 horas y
se observó su crecimiento. Posteriormente se realizó la siembra de estos crecimientos
para garantizar el mismo inóculo. Una vez confirmada la pureza, se tomaron 800 μL de
la suspensión bacteriana en el caldo nutritivo y se pasaron a tubos ependorff
adicionándole 200 μL de glicerol al 30% (Figura 3-6).
Materiales y Métodos 22
A B C
D E
Figura 3-6. Conservación de los aislamientos bacterianos. A- Selección de colonia
individual para sembrar en caldo nutritivo; B- Caldo Nutritivo con la suspensión
bacteriana después de 24 h; C- Almacenamiento del cultivo bacteriano liquido en tubos
eppendorf; D- Incubadora Shaker; E – Asilamiento de bacteriano guardado a -20°C.
3.5 Selección de aislamientos y pruebas de antagonismo
Para observar el potencial antagónico in vitro de las bacterias, se utilizaron aislamientos
patogénicos pertenecientes al género Fusarium (Figura 3-7). 5 de ellos (F70, F58, F54,
F52, F09), fueron cedidos de una colección de referencia de la Universidad Nacional de
Colombia sede Palmira (obtenidos en el trabajo de Clavijo, 2014) y 1 (FB) fue aislado de
plantas de ají tabasco en el municipio de Bolívar Valle del Cauca (Figura 3-8). Debido a
que los cinco aislamientos cedidos se encontraban en latencia e inactivos, se decidió
realizar pruebas de patogenicidad para corroborar su patogenicidad y evaluar el hongo
aislado del municipio de Bolívar.
Revisión de literatura 23
Figura 3-7. Cultivos puros de aislamientos de Fusarium patogénicos – Anverso
Materiales y Métodos 24
A
B C
B
Figura 3-8. Colecta en campo de plantas de ají afectadas por Fusarium A- Cultivo de ají
afectado por Fusarium; B- Raíz con síntomas de marchitez por Fusarium.
Las pruebas de patogenicidad se realizaron siguiendo el método de inoculación por
inmersión de raíces (figura 3-9a), y aplicación del inóculo a una concentración de 106
esporas/ml siguiendo el protocolo utilizado por Clavijo, 2014. Se inocularon un total de 15
plantas por tratamiento, es decir, por cada aislamiento de Fusarium y el control (figura 3-
9b).
Figura 3-9. A- Método de inoculación por inmersión de raíces; B- Tratamientos en
plántulas de ají
Para realizar las pruebas antagónicas, se utilizó el método de cultivo dual, que consistió
en un enfrentamiento equitativo de las bacterias y los patógenos en cajas Petri. El
patógeno fue sembrado en el centro de la caja junto con un aislamiento bacteriano a una
Revisión de literatura 25
distancia de 3 cm respecto al Fusarium. Los ensayos se sembraron por triplicado en PDA
a 28°C, y al mismo tiempo se realizó un control del crecimiento del aislamiento del
patógeno utilizado Acosta et al., 2007.
El porcentaje de inhibición del crecimiento del patógeno se calculó empleando la fórmula
de Acosta et al., 2007.
% inhibición= ((R1-R2) / R1)* 100
Donde R2 representó el crecimiento del hongo en presencia de bacterias y R1 el
crecimiento del control.
El comportamiento de inhibición mostrado por los diferentes aislamientos se agrupó de la
siguiente manera (Benítez et al., 2007):
Negativo: ausencia de zona de inhibición o un porcentaje menor de 10% y
crecimiento normal del patógeno, de forma similar al control.
Baja: ausencia de zona de inhibición o con un porcentaje entre 10–39% y con
disminución en el crecimiento del patógeno.
Media: ausencia de zona de inhibición o un porcentaje entre 40–69% y con
disminución en el crecimiento del patógeno.
Positivo: presencia de zona de inhibición definida o en un porcentaje entre 70–
100%.
Las bacterias con mayor potencial antagónico frente a los aislamientos fúngicos
evaluados fueron caracterizadas para su identificación respectiva.
Materiales y Métodos 26
3.6 Tasa de crecimiento micelial
La tasa de crecimiento micelial se midió en centímetros por día, se determinó teniendo en
cuenta el radio de crecimiento de la colonia fúngica calculando su magnitud mediante la
expresión sugerida por Mead, 1993: T.C= (Cf -Ci)/ (Tf-Ti).
Dónde:
Cf: es el crecimiento final expresado en cm.
Ci: es el crecimiento inicial (día uno) expresado en cm.
Tf: es el tiempo final
Ti: es el tiempo inicial
3.7 Caracterización Morfológica
Para la caracterización morfológica se siguió el protocolo de Stanchi et al., 2007
observando al microscopio y al estéreoscopio las variables físicas de las bacterias.
Forma, tamaño, borde, elevación, color y pared celular con tinciones de gram. La
descripción se realizó para los aislamientos que produjeron antagonismo y sobre las
colonias formadas (agrupamiento bacteriano originado por el crecimiento y observable
macroscópicamente), de forma aislada, tomando de ejemplo la siguiente información
(Figura 3-10).
Revisión de literatura 27
Tomado de: Stanchi et al., 2007
Figura 3-10. Caracterización morfológica de las colonias bacterianas aisladas.
3.8 Caracterización Bioquímica
3.8.1 Tinción de Gram
Las tinciones de Gram se realizaron con colonias de aislamientos bacterianos puros de
24 horas. Una vez se tuvieron las colonias aisladas, se tomó una pequeña masa del
microorganismo y se realizó un frotis en un portaobjeto. Se le aplicaron los colorantes
para tinción y visualización de las células, las cuales fueron observadas al máximo
objetivo para una buena visualización de colores y formas (Figura 3-11).
Materiales y Métodos 28
Figura 3-11. A- Bacterias Gram positivas; B- Bacterias Gram negativas
3.8.2 Perfil bioquímico
Una vez establecido el tipo de pared celular de las bacterias por la tinción de Gram, se
realizó el perfil bioquímico. Se utilizó un sistema rápido de identificación con Tiras API
20E y 50CH (Índice Analítico de Perfil) en las bacterias Gram positivas y Gram negativas
ya establecidas (Figura 3-12).
Revisión de literatura 29
Figura 3-12. A- Tiras API 20E para Gram negativas; B- Tiras API 50CH para Gram positivas
Test de Oxidasa:
Se realizó a las 24 horas de siembra de las colonias bacterianas. Se tomó la tirilla estéril
y con un isopo de madera estéril se trasfirió una UFC (Unidad formadora de colonia)
bacteriana pura; se observó por aproximadamente tres minutos y en ese tiempo el área
de inoculación se debía tornar azul oscuro a púrpura, lo que significaba que los
resultados fueran positivos. De lo contrario, si no dio cambio en estos tres minutos, la
prueba era negativa (Figura 3-13).
.
Figura 3-13. Tiras oxidasa: Tira superior positiva y Tira inferior negativa
Materiales y Métodos 30
Gram Negativas
Para las bacterias Gram negativas se emplearon las Tiras API 20E las cuales permiten la
identificación y caracterización de Enterobacterias. Estas tiras contienen 21 tubos o
pocillos con reactivos, los cuales incluyen el sustrato (Figura 3-13a). Para obtener el perfil
bioquímico se siguieron las instrucciones del fabricante que se describen a continuación:
Preparación de la Galería:
1. Se repartieron aproximadamente 5 ml de agua destilada en los alveolos donde
fueron ubicadas las tiras, para crear una atmosfera húmeda.
2. Se marcó debidamente la galería en la lengüeta lateral de la cámara.
Preparación del Inóculo:
1. Se utilizó solución salina (NaCl) 0.85% como medio de suspensión para la
bacteria a identificar. Para esto, se tomaron tres colonias puras e individuales
sobre medio agar y preferiblemente de cultivos jóvenes (18-24 horas). Se
mezclaron hasta homogenizar y obtener una suspensión bacteriológica similar al
estándar de turbidez de MacFarland N° 5, el cual es utilizado para saber el
número de bacterias por mililitro, o UFC según una escala que va de 0.5 a 10.
2. Con ayuda de una pipeta, se introdujo la suspensión bacteriana en los tubos de la
galería evitando la formación de burbujas en el fondo. Para las pruebas CIT, VP Y
GEL se llenó el tubo y la cúpula, y para las otras pruebas se llenaron únicamente
los tubos.
3. Para las pruebas ADH, LDC, ODC, H2S, URE se creó una atmosfera de
anaerobiosis llenando la cúpula con parafina.
4. Finalmente se selló y se incubó a 36°C durante 24 horas.
Gram Positivas
Para las bacterias Gram positivas se utilizaron las Tiras API 50CH y se siguieron las
instrucciones del fabricante que se describen a continuación:
Revisión de literatura 31
Preparación de las galerías
1. Se preparó una cámara de incubación y se rotuló debidamente en la lengüeta
lateral de la cámara.
2. Se repartieron 10 ml de agua destilada en los alveolos del fondo donde iban las
tiras, para crear una atmosfera húmeda.
3. Se sacaron cada una de las filas de su embalaje y se separaron siguiendo el
orden, de 0-9, 10 – 19, 20 – 29, 30 – 39 y 40 – 49 (Figura 3-14).
Figura 3-14. Tiras API 50CH iniciales en orden del 0 -49
Preparación del inóculo
1. Se cultivó el microorganismo en Agar Nutritivo
2. Se verificó la pureza de la cepa sembrándola nuevamente en agar nutritivo
Materiales y Métodos 32
3. Se tomó el cultivo mediante una asa bacteriana estéril y se introdujo en el medio
de inoculación Api 50CHB/E (ref. 50 410) obtenido de la casa comercial (Figura 3-
15).
Figura 3-15. Preparación de inóculo para test de tiras API 50CHB. A – Aislamiento
bacteriano puro; B- Preparación de inóculo en medio selectivo CHB.
4. Se agitó la solución del medio con la bacteria hasta homogenizar y se repartió la
suspensión bacteriana con la ayuda de una pipeta estéril en los 50 tubos de la
galería (Figura 3-16).
5. Finalmente se selló y se incubó a 36°C durante 24 - 48 horas.
Revisión de literatura 33
Figura 3-16. Inoculación del medio 50CHB en los tubos de las galerías
Lectura e interpretación
La lectura e interpretación de los resultados obtenidos por las tiras API se obtuvieron a
partir de los colores ya establecidos como positivos o negativos de parte de la casa
comercial biomérieux (Figura 3-17), y a partir de un perfil numérico y un catálogo analítico
con la ayuda del software de identificación apiweb TM.
Materiales y Métodos 34
Fuente: Tomado de https://apiweb.biomerieux.com/
Figura 3-17. A – Pruebas negativas y positivas de las tiras API 20E; B- Pruebas
negativas y positivas de las tiras API 50CH.
3.8.3 Medios de cultivo utilizados
Se manejaron algunos medios específicos y otros generales para el crecimiento de los
aislamientos obtenidos de la rizosfera y el tejido endófito foliar, así como también para las
pruebas antagónicas entre las bacterias y los hongos.
Entre estos medio, se utilizó el agar nutritivo el cual en un medio general para el
crecimiento de los aislamientos bacterianos, es utilizado para el cultivo de
microorganismos poco exigentes en sus requerimientos nutricionales y está compuestos
de pluripeptona, extracto de carne, cloruro de sodio y agar; del mismo modo, pero en
menor proporción, se empleó el medio tripticasa de soya para este mismo propósito. Este
favorece el desarrollo y aislamiento de microorganismos aerobios, anaerobios
facultativos y estrictos.
Para las pruebas antagónicas y para el crecimiento de los Fusarium se utilizó el medio
PDA (papa, dextrosa, agar) y en menor proporción se hizo uso del medio agar sabouraud
(peptonas y glucosa) para el crecimiento de estos ya que pueden crecer hongos y
desarrollarse cierto tipo de bacterias.
Para el almacenamiento y extracción de ADN se utilizaron los medios líquidos Caldo
Nutritivo (pluripeptona y extracto de carne) el cual es utilizado para propósitos generales
Revisión de literatura 35
con microorganismos y Caldo LB (Luria Bertani) Compuesto de extracto de levadura,
cloruro de sodio y peptona de caseína logrando proporcionar los nutrientes necesarios
para el desarrollo óptimo de la mayoría de los microorganismos.
Los medios específicos utilizados fueron:
Agar MacConkey para clasificar bacterias pertenecientes al grupo de Enterobacterias y
fermentadoras de lactosa. Está compuesto de sales biliares, colorantes como cristal
violeta y rojo neutro, lactosa, peptona y cloruro sódico.
Agar Cetrimida, utilizado para el aislamiento selectivo de algunas bacterias
pertenecientes al género Pseudomas en especial a la especie Pseudomona aeruginosa.
Su composición es peptona de gelatina, cloruro de magnesio, sulfato de potasio, agar y
cetrimida.
Agar King B, Utilizado para la selección de bacterias del género Pseudomonas. Está
compuesto de tripteína, peptona de carne, fosfato dipotásico, sulfato de magnesio y agar.
Estos dos últimos permiten determinar la presencia y/o producción de sideróforos como
piocianinas, pioverdinas y fluoresceínas.
3.9 Caracterización Molecular
Para la caracterización molecular, previamente se seleccionaron las bacterias que
presentaron potencial antagónico frente a los seis aislamientos patogénicos. Estas
bacterias provienen de cultivo puro y fueron sembradas en caldo nutritivo e incubadas
durante 24 horas en agitación constante mediante un shaker a 180 r.p.m (Figura 3-18).
Materiales y Métodos 36
Figura 3-18. Agitación de la suspensión bacteriana en caldo nutritivo
3.9.1 Extracción y purificación del ADN:
Se partió de la suspensión bacteriana en caldo nutritivo y se siguió el protocolo de Merino
& Giusiano, 2011 con modificaciones:
Método del CTAB
1. Se centrifugó el cultivo bacteriano a 13000 r.p.m. por 10 min en frío para la
obtención de la masa bacteriana.
2. Se suspendió la masa bacteriana en 60 μL de Buffer TE ( Tris – HCl 100 mM pH
7.2; Edta 100 mM)
3. Se le agregaron 50 μL de S.D.S. al 0.5%
4. Se le añadieron 50 μL de solución de lisozima 10 mg/ ml y 5 μL de proteínasa K
(20 mg/mL).
5. Se incubaron las muestras a 37°C por 1 hora.
Revisión de literatura 37
6. Se adicionaron 100 μL de NaCl 5 M para la desnaturalización de las proteínas.
7. Se añadieron 80 μL de CTAB agitando con vórtex por 2 min
8. Se incubó la muestra a 65°C por 10 min
9. Se agregaron 800 μL de cloroformo – Alcohol isoamilico (24:1) y se mezcló en el
vórtex.
10. Se centrifugó la muestra a 13000 r.p.m. por 5 min en frio
11. Una vez obtenidas las tres fases, se rescató la fase acuosa de la superficie y se
transfirió a un tubo eppendorf limpio.
12. Se agregaron 500 μL de cloroformo – Alcohol isoamilico (24:1)
13. Se centrifugó la muestra a 13000 r.p.m. por 5 min en frio
14. Se pasó la fase acuosa a un tubo eppendorf limpio y se agregaron 600 μL de
isopropanol frio más 50 μL de acetato de sodio para después mesclar durante 5
min por inversión.
15. Centrifugar la muestra a 13000 r.p.m. por 5 min en frio
16. Se lavó el ADN con 30 μL de etanol al 70% y centrifugar a 13000 r.p.m. por 5 min
17. Se secó el ADN en baño de agua a 35°C
18. Finalmente se suspendió la muestra en 50 μL de TE y conservó a -20°C.
3.9.2 Condiciones para la amplificación de la región ADNr 16s
(PCR)
La técnica de PCR se realizó usando una mezcla de volumen final de 15 μL, preparado
con 2 μL de muestra de ADN (20 ng), 7,5 μL de mezcla GoTaq ®Green Master Mix (1,5
mM MgCl2; 200 nM dNTPs), 1 μL de cada primer (10 ng / μL) (tabla 2) y 3,5 μL de agua
libre de DNAsas.
Tabla 3-1. “Primers” usados en la amplificación de la región 16S
Primer Secuencia
fD1 5’-CCGAATTCGTCGACAACAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’
rD1 5’-CCCGGGATCCAAGCTTAAGGAGGTGATCCAGCC-3’
Materiales y Métodos 38
Las condiciones de amplificación para los “primers” se describen en la tabla 3-2.
Tabla 3-2. Condiciones de amplificación del primer usados en este estudio - Fuente:
Weisburg et al., 1991.
fD1
Desnaturalización inicial 95°C por 2 min
Número de ciclos 30
Desnaturalización 95°C por 30 seg
Anillaje 65°C por 4 min
Extensión 72°C por 4 min
Extensión final 72°C por 5 min
La reacción de PCR se llevó a cabo en un termiciclador multigen optimax y fue
visualizada mediante electroforesis (90 minutos a 50V) en gel de agarosa al 1% en buffer
TBE 0.5X con adición de 1μL de SYBR safe. Para determinar el tamaño de los
fragmentos se usó un marcador de peso molecular GeneRuler 100 pb. La visualización
se realizó en un transiluminador UV.
Secuenciación de los productos de PCR obtenidos
La secuenciación de los productos de PCR fue realizada en el instituto de
Biotecnología de Corea, de la Empresa MACROGEN, a la cual se enviaron 21 μL del
producto de PCR amplificado, en microtubos Eppendorf de 1,7 ml debidamente
rotulados.
Análisis de las secuencias e identificación a nivel de especie
Una vez se obtuvieron las secuencias generadas por Macrogen en Corea, se
procedió a la limpieza de las mismas. Dicho proceso, se realizó con ayuda del
programa BioEdit 7.2.5. Las secuencias limpias se compararon en el programa
BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) obtenido a través de NCBI (National
Center for Biotecnology Information).
Revisión de literatura 39
A B
C
Figura 3-19. A- Muestras de PCR en el termociclador; B- Ajuste de condiciones de
amplificación (Tabla 3-2); C- Corriendo la PCR
Resultados y Discusión 41
4. Resultados y Discusión
Se obtuvieron 193 aislamientos bacterianos, de los cuales 68 provenían de muestras
foliares y 125 de suelo rizosferico. Estos aislamientos fueron clasificados de acuerdo a
su lugar de procedencia, tipo de muestra (Rizosfera – endófitos foliares) y su capacidad
antagónica.
4.1 Antagonismos
4.1.1 Antagonismo de los aislamientos rizosfericos
De los 125 aislamientos bacterianos de la rizosfera de plantas de ají tabasco, 64
produjeron antagonismo en por lo menos uno de los aislamientos de Fusarium spp
evaluados. De Guacarí se obtuvieron 31 aislamientos bacterianos antagónicos, mientras
que de la localidad de Bolívar se aislaron 33 (Anexo A).
En la figura 4-1 se observa el número de aislamientos obtenidos en las localidades,
indicando que de las muestras colectadas en la segunda visita a cada localidad (cuando
el cultivo tenía entre 8 a 9 meses), se obtuvo un mayor número de aislados con potencial
antagónico frente a los Fusarium evaluados. Lo encontrado podría estar asociado con la
edad de la planta, pues se ha indicado que las interacciones mutualistas entre especies
vegetales y microorganismos se presentan o varían, dependiendo del grado de evolución
e interacción desarrollada a través del tiempo (Grayston et al., 1998; Walker et al., 2003).
De la misma forma, el haber obtenido mayor número de aislamientos en la rizosfera en
comparación con las encontradas en los órganos aéreos, estaría relacionado con las
interacciones antes nombradas, sumado al hecho de que la planta libera a la rizosfera
entre el 10 a 60% de los fotoasimilados entre los que se encuentran aminoácidos, ácidos
Materiales y Métodos 42
orgánicos, azúcares, fenoles y proteínas, entre otros (Grayston et al., 1998; Walker et
al., 2003; Paz et al., 2006; Praguer et al., 2007).
Figura 4-1. Número de aislamientos antagónicos obtenidos de las rizosfera de Ají
tabasco (Capsicum frutescens) en cada localidad por salida.
En cuanto al potencial antagónico evaluado mediante el porcentaje de inhibición se
destacan los aislados RP15B1M1, RP10B2M31, RP2B1M9, RP7B2M4, RP8B2M22,
RP8B2M27, RP2B1M5, de la localidad de Bolívar, que presentaron antagonismo en los
seis hongos patogénicos seleccionados. De igual forma para localidad de Guacarí los
aislados RP14G1M5, RP1G2M2, RP6G2M4, RP7G2M11, RP3G2M13, RP7G2M2,
RP7G2M8, RP9G2M8, RP1G1M16, RP1G1M2 presentaron un comportamiento similar
en la inhibición de los seis hongos patógenos.
A continuación se ilustran algunos de estas inhibiciones en las figuras 4-2, 4-3, 4-4, 4-5.
El crecimiento micelial de cada uno de los aislamientos patogénicos creciendo sin
presencia de la bacteria (controles) se presentan en la figura 3-7.
Revisión de literatura 43
Figura 4-2. Enfrentamiento dual (prueba de antagonismo) del aislamiento RP2B1M5
frente a los seis aislados patogénicos de Fusarium en medio PDA
Materiales y Métodos 44
Figura 4-3. Enfrentamiento dual (prueba de antagonismo) del aislamiento RP10B2M31 frente a los seis
aislados patogénicos de Fusarium en medio PDA
Revisión de literatura 45
Figura 4-4. Enfrentamiento dual (prueba de antagonismo) del aislamiento RP7G2M8 frente a los
seis aislados patogénicos de Fusarium en medio PDA
Materiales y Métodos 46
Figura 4-5. Enfrentamiento dual (prueba de antagonismo) del aislamiento RP1G1M16
frente a los seis aislados patogénicos de Fusarium en medio PDA
Revisión de literatura 47
4.1.2 Antagonismo de los endófitos foliares
De los 68 aislamientos bacterianos obtenidos de las hojas de ají tabasco Capsicum
frutescens, 50 produjeron antagonismo en por lo menos uno de los Fusarium spp
evaluados. De Guacarí se obtuvieron 21 aislamientos bacterianos antagónicos, mientras
que la localidad de Bolívar se aislaron 29 (Anexo B y Figura 4 -6).
Figura 4-6. Número de aislamientos antagónicos obtenidos de tejido foliar endofito de Ají
tabasco (Capsicum frutescens) en cada localidad por salida.
Estos resultados muestran una tendencia similar a la hallada en la rizosfera ya que se
obtuvo (para el caso de la localidad de Bolívar), un mayor número de aislamientos en el
segundo muestreo (cuando el cultivo tenía entre 8 a 9 meses), sin embargo no sucedió lo
mismo en la localidad de Guacarí.
Materiales y Métodos 48
Por otro lado, se encontró que la proporción de aislamientos antagónicos fue mayor en
el tejido foliar endófito que en la rizosfera, si se tiene en cuenta que en las hojas, de 68
aislados el 74% presentaron potencial antagónico, mientras que en la rizosfera de 125
aislados, el 51% presentaron antagonismo (Figura 4-7). Lo anterior, podría explicarse por
la ecología de los organismos endófitos, los cuales a menudo son menos abundantes,
pero con rutas metabólicas y funciones especializadas (Kobayashi y Palumbo, 2000;
Sziderics et al., 2007; Egamberdieva y Lugtenberg, 2014), mientras que en la rizosfera se
encuentran un gran número de microorganismos no solo benéficos si no también
patógenos y de vida libre, entre otros. Por ello, se ha reportado que la concentración de
bacterias por gramo de suelo hallada alrededor de las raíces, es mayor que en el resto
de la planta (106 a 108 células/ gr de suelo) posiblemente a los altos niveles de nutrientes
que se hallan en la zona que rodea a las raíces y permiten el desarrollo de poblaciones
microbianas (Lynch, 1990 y Calvo et al., 2008).
6461
N aislados antagonicos
N aislados NO antagonicos
50
18
N aislados antagonicos
N aislados NO antagonicos
Figura 4-7. Comparación del número de aislamientos antagónicos en la rizosfera (A) y
tejido foliar endófito (B).
Por otra parte, los aislamientos destacados en las pruebas de antagonismo fueron
EP1B2M4, EP2B2M4, EP3B1M4, EP3B2M12, EP4B2M16, EP8B2M28, de la localidad
de Bolívar, pues presentaron potencial antagónico a los seis hongos patogénicos
A B
Revisión de literatura 49
seleccionados. De igual forma para la localidad de Guacarí, los aislados EP5G1M9,
EP5G1M10, EP8G1M10, EP9G2M18 presentaron un comportamiento similar en la
inhibición de los seis hongos patógenos.
A continuación, en las figuras 4-8, 4-9, 4-10, 4-11 se ilustra algunos de los aislamientos
bacterianos que producen inhibición frente a los fusarium patogénicos evaluados.
Materiales y Métodos 50
Figura 4-8. Enfrentamiento dual (prueba de antagonismo) del aislamiento del tejido foliar EP9G2M18 frente
a los seis aislados patogénicos de Fusarium en medio PDA
Revisión de literatura 51
Figura 4-9. Enfrentamiento dual (prueba de antagonismo) del aislamiento del tejido foliar EP8G1M10 frente
a los seis aislados patogénicos de Fusarium en medio PDA
Materiales y Métodos 52
Figura 4-10. Enfrentamiento dual (prueba de antagonismo) del aislamiento del tejido
foliar EP5G1M9 frente a los seis aislados patogénicos de Fusarium en medio PDA
Revisión de literatura 53
Figura 4-11. Enfrentamiento dual (prueba de antagonismo) del aislamiento de los tejido foliar EP3B1M4
EP1B2M4 y EP1B3M4 frente a los seis aislados patogénicos de Fusarium en medio PDA
Materiales y Métodos 54
Finalmente, de los aislamientos bacterianos que presentaron antagonismo, se
seleccionaron los que produjeron mayor porcentaje de inhibición, en por lo menos cuatro
de los seis aislamientos de Fusarium evaluados.
De la rizosfera los aislamientos fueron: RP2B1M9, RP15B1M1, RP15B2M2,
RP10B2M31, RP2B1M9, RP7B2M2, RP7B2M4, RP7B2M5, RP8B2M27, RP2B1M5,
RP14G1M5, RP1G2M2, RP4G2M3, RP6G2M4, RP7G2M11, RP3G2M13, RP7G2M2,
RP7G2M4, RP7G2M4.1, RP7G2M8, RP7G2M8.1, RP9G2M8, RP1G2M16, RP1G1M2,
RP10G2M16.
Y de los endófitos foliares fueron: EP1B1M8, EP1B2M1, EP1B2M4, EP2B2M4,
EP2B2M7, EP2G2M10, EP3B1M4, EP3B2M13, EP3G2M4, EP4B2M16, EP4B2M18,
EP5B2M17, EP5B2M21, EP5B2M7, EP5G1M9, EP5G1M10, EP6G1M14, EP7G2M15,
EP8B2M28, EP8G1M10, EP10G1M9, EP9G2M18, EP9G1M16, EP15G1M16.
A estos se les realizó la caracterización bioquímica y molecular.
4.2 Caracterización Morfológica
La caracterización morfológica fue realizada a los aislamientos bacterianos de la rizosfera
(Anexo C) y endófitos foliares (Anexo D) con capacidad antagónica frente a por lo menos
uno de los Fusarium patogénicos. Se describió la morfología de la colonia y la forma de
la célula del microorganismo.
4.2.1 Caracterización morfología de rizobacterias
Los resultados obtenidos en la caracterización morfológica de las rizobacterias, indican
que los aislamientos antagónicos frente a los Fusarium spp., evaluados, fueron en su
gran mayoría de forma bacilar (97%) en comparación con las células en forma de coco
(3%). De igual forma, se encontró que el 64% de los microorganismos antagónicos
aislados son gram positivos. Mientras, el 36% restante son gram negativos (Anexo C).
Por otra parte, en la morfología de las colonias bacterianas se observó una gran
diversidad. Sobresalen las colonias de coloración blanca, forma circular, margen entero,
elevación plana y densidad brillante con porcentajes de 46%, 63%, 57%, 37% y 66%
respectivamente. A continuación, en las figura. 4-12 y 4-13 se ilustran algunas de las
formas encontradas en la caracterización morfológica de las rizobacterias.
Revisión de literatura 55
A BC
D E F
G H I
J K L
Materiales y Métodos 56
M N
P R
O
Q
S T U
V W X
Revisión de literatura 57
A.A
Y Z
B.B
Figura 4-12. Morfología de rizobacterias en Agar nutriente – Observación al
estereoscopio (5X).
En la figura 4-12, literal A. se observa una colonia de color blanco, forma circular, margen
entera con una elevación umbonada y una superficie brillante; B. Colonia circular, color
amarillo, margen entera o lisa, elevación convexa y superficie brillante; C. Colonia
oboide, color beige, margen entera o lisa, elevación convexa, superficie brillante; D.
Colonia circular, margen entera o lisa, color blanco, elevación plano convexa y superficie
opaca; E. Colonia circular acuminada, color beige, margen entera o lisa, elevación
convexa; superficie cremosa, brillante; F. Colonia irregular, color blanco crema, margen
ondulada, elevación convexa, y superficie brillante; G. Colonia Irregular, color blanco
beige, margen ondulada, elevación plana y superficie brillante, cremosa; H. Colonia
circular concéntrica, color blanco, elevación plana convexa, superficie brillante, margen
lisa o entera; I. Colonia de forma circular, margen entera, elevación plana, superficie
brillante y traslucida, hialina; J. Colonia de forma irregular, color blanco, margen o borde
filamentoso, elevación convexa, superficie brillante; K. Colonia de forma circular, color
amarillo, borde o margen filamentoso, elevación convexa, superficie brillante; L. Colonia
de forma filamentosa, color blanco crema, borde filamentoso, elevación plana, superficie
brillante, cremosa; M. Colonia rizoide, Color amarillo, borde lobulado, elevación plana,
Materiales y Métodos 58
superficie brillante; N. Colonia circular concéntrica, color blanco, borde entero, elevación
plana, densidad brillante, superficie cremosa; O. Colonia rizoide, color blanco, borde
ondulado, elevación plana, densidad brillante, superficie cremosa; P. Colonia circular
concéntrica, color blanco, borde entero, elevación acuminada, densidad brillante,
superficie rugosa; Q. Colonia circular, color blanco, borde ondulado, elevación convexa,
densidad opaca, superficie rugosa; R.Colonia circular, color amarillo, borde entero,
elevación convexa, densidad brillante, superficie cremosa; S. Colonia circular, color
blanco, borde entero, elevación convexa, densidad brillante, superficie cremosa y lisa; T.
Colonia circular, color blanco, borde ondulado, elevación convexa, densidad opaca,
superficie rugosa y seca; U. Colonia circular, color blanco, borde ondulado, elevación
convexa, densidad opaca, superficie rugosa y seca; V. Colonia circular, color blanco,
borde entero, elevación crateriforme, densidad brillante, superficie cremosa; W. Colonia
circular, color blanco, borde entero, elevación crateriforme, densidad brillante, superficie
cremosa; X. Colonia irregular, color blanco, borde entero, elevación convexa, superficie
seca y rugosa; Y. Colonia irregular, color blanco, borde ondulado, elevación plana,
superficie seca y rugosa; Z. Colonia irregular, color blanco, borde ondulado, elevación
plana, superficie seca y rugosa; A.A. Colonia irregular, color hialino, borde filamentoso,
elevación plana, superficie brillante; B.B. Colonia circular, color blanco, borde entero,
elevación convexa, superficie seca y rugosa.
Los literales P, Q, T, U, V, W, X, Z y B.B. poseen estructuras con una apariencia
tridimensional que sobresalen del medio reflejando sus caracteristicas microscópicas.
Estas colonias bacterianas se destacan sobre las otras estructuras, pues tienden a
cambiar su morfologica con el paso del tiempo.
Revisión de literatura 59
Figura 4-13. Morfología de algunos aislamientos bacterianos en Agar nutriente – vista
macroscópica
Materiales y Métodos 60
La descripción detallada de las características morfológicas como color, forma, margen,
elevación y densidad para cada uno de los aislamientos rizosfericos se muestra en el
Anexo C.
4.2.2 Caracterización morfológica de endófitos foliares
Los resultados obtenidos en la caracterización morfológica de los endófitos foliares
antagónicos frente a los Fusarium spp., evaluados, indican que la forma bacilar fue la
más predominante entre los aislados encontrados, con un 90% en comparación con los
cocos (10%).
Por otra parte, en la morfología de las colonias bacterianas endófitas predominaron las
colonias de forma circular, color blanco, margen entero, elevación convexa y densidad
brillante con porcentajes de 90%, 50%, 74%, 66%, y 78% respectivamente. De igual
forma, se encontró que el 66% de los aislados antagónicos son gram positivos, mientras
que el 34% restante fue gram negativo.
A continuación, en las figuras. 4-14 y 4-15 se ilustra algunas de las formas encontradas
en la caracterización morfológica de los endófitos foliares.
Revisión de literatura 61
Figura 4-14. Aislamientos bacterianos endófitos en Agar nutriente- vista macroscópica
Materiales y Métodos 62
A B C
D E F
G H I
J K L
Figura 4-15. Morfología de la colonia bacteriana de algunos aislamientos endófitos en
Agar nutritivo - vista en un estereoscopio
Revisión de literatura 63
A. Colonia de color blanco amarillo, de forma circular, con margen lisa, elevación
convexa, una densidad o consistencia viscosa y una superficie brillante; B. Colonia de
color blanco, margen filamentoso, elevación umbonada, superficie brillante, cremosa; C.
Forma circular, color amarillo, margen ondulada, elevación convexa, superficie brillante,
cremosa; D. Forma irregular, color amarillo, margen ondulada, elevación umbonada,
superficie brillante, rugosa; E. Color hialina, forma irregular, margen ondulada, elevación
plana, densidad superficie traslucida, rugosa; F. Color amarillo, forma circular
concentrica, margen ondulada, elevación acuminada, superficie brillante, cremosa; G.
Color blanco, forma circular, margen ondulada, elevación papilada, superficie opaca,
rugosa; H. Color rosado, margen ondulada, forma irregular, elevación plana, superficie
brillante, rugosa; I. Forma Circular, color blanco, elevación Umbonada, margen ondulada,
superficie opaca, rugosa; J. Forma circular, color blanco, margen entera, elevación
convexa, superficie brillante, cremosa; K. Color amarillo, Forma circular, margen entera,
elevación convexa, superficie brillante, cremosa; L. Color amarillo, forma irregular,
margen ondulada, elevación umbonada, superficie brillante.
Los literales D, E, G, H, I, L, poseen estructuras con una apariencia sobresalen de las
colonias convencionales mostrando sus caracteristicas microscópicas. Estas colonias
bacterianas se destacan sobre las otras estructuras, pues tienden a cambiar su
estructura morfologica con el paso del tiempo.
La descripción detallada de las características morfológicas como color, forma, margen,
elevación y densidad para cada uno de los aislamientos endófitos foliares se muestra en
el Anexo D.
4.3 Caracterización Bioquímica
4.3.1 Caracterización bioquímica de aislamientos rizosfericos
Los resultados de la caracterización bioquímica de las rizobacterias con el sistema de
identificación Tiras API 20E y 50CHB, indican que de los 25 aislamientos de rizobacterias
identificados, 8 pertenecen al género Pseudomonas los que equivalen a 32% de la
población de aislados antagonistas. De este género, la especie Pseudomonas
aeruginosa presentó seis individuos, seguida de P. putida y P. fluorescens con un
individuo cada una. También se observa que las especies Bacillus amyloliquefaciens y
Chryseobacterium indologenes presentaron siete y tres aislamientos respectivamente.
Materiales y Métodos 64
Las especies Myroides spp/Chryseobacterium indologenes, Aeromonas hydrophila,
Bacillus megaterium, Bacillus smithii, Bacillus subtilis/amyloliquefaciens, Bordetella spp,
Serratia rubidae, Stenotrophomonas maltophilia presentaron un individuo cada una (tabla
4-1 y tabla 4-2)
Tabla 4-1. Resultados de la identificación de los aislados antagonistas de la rizosfera
mediante el sistema API 20E
Aislamiento Cepa identificada Posibilidad (%)
RP9G2M8 Pseudomonas aeruginosa 100
RP6G2M4 Serratia rubidae 81
RP7G2M4,1 Pseudomonas aeruginosa 99
RP7B2M4 Chryseobacterium indologenes 67
RP2B1M9 Bordetella spp 60
RP1G1M2 Aeromonas hydrophila 60
RP7B2M2 Chryseobacterium indologenes 54
RP14G1M5 Pseudomonas aeruginosa 55
RP7G2M8,1 Pseudomonas aeruginosa 99
RP7G2M8 Pseudomonas aeruginosa 99
RP7B2M5 Myroides spp/Chryseobacterium indologenes 87
RP8B2M22 Stenotrophomonas maltophilia 90
RP7G2M4 Pseudomonas putida 99
RP1G1M16 Pseudomonas aeruginosa 96
RP10G2M16 Pseudomonas fluorescens 99
RP1G2M2 Chryseobacterium indologenes 54
Las especies se determinaron de acuerdo al perfil bioquímico obtenido mediante el
sistema de tiras API 20E y 50CHB para los cuales de acuerdo al resultado arrojado en
cada una de las pruebas realizadas permite la aproximación a género y en algunos casos
especies y mediante el uso del API web se determinó el porcentaje de posibilidad de
indetificacion para cada uno de los casos.
Revisión de literatura 65
Tabla 4-2. Resultados de la identificación de los aislados antagonistas de la rizosfera
mediante el sistema API 50CHB
Aislamiento Cepa identificada Posibilidad (%)
RP8B2M27 Bacillus amyloliquefaciens 99
RP15B1M2 Bacillus amyloliquefaciens 95
RP4G2M3 Bacillus megaterium 60
RP7G2M11 Bacillus amyloliquefaciens 99
RP7G2M2 Bacillus amyloliquefaciens 96
RP3G2M13 Bacillus smithii 65
RP10B2M31 Bacillus subtilis/amyloliquefaciens 99
RP15B1M1 Bacillus amyloliquefaciens 96
RP2B1M5 Bacillus amyloliquefaciens 90
Los resultados obtenidos de cada prueba bioquímica realizada mediante las tiras API con
base en la colorimetría o cambio de color del medio de inoculación se muestran en los
Anexos E y F.
4.3.2 Caracterización bioquímica de aislamientos endófitos
Los resultados ofrecidos por el sistema de identificación API 20E y 50CHB, muestran que
de los 24 aislamientos endófitos identificados, 9 pertenecen al género Pseudomonas los
que equivalen a un 38% de la población de aislados antagonistas. De este género, la
especie Pseudomonas aeruginosa presentó cinco individuos, seguida de P. oryzihibants
y P. fluorescens/putida con dos individuos cada una. También se encontró que las
especies Geobacillus thermoglucosidasius y Bacillus mycoides/ thurigiendisis
presentaron dos aislamientos cada una. Finalmente se encontró que las especies
Aneurinibacillus aneurinilyticus, Bacillus smithii, Enterobacter amnigenus, Enterobacter
cloacae, estaban representadas con un individuo respectivamente.
Materiales y Métodos 66
Tabla 4-3. Resultados de la identificación de los aislados antagonistas endófitos
mediante el sistema API 20E
Aislamiento Cepa identificada Posibilidad (%)
EP5G1M9 Enterobacter cloacae 37
EP8B2M28 Stenotrophomonas maltophilia 81
EP6G1M14 Enterobacter amnigenus 37
EP3B2M13 Pseudomonas aeruginosa 18
EP15G1M16 Pseudomonas aeruginosa 77
EP5B2M7 Pseudomonas oryzihibants 81
EP10G1M9 Pseudomonas fluorescens/putida 90
EP5B2M17 Pseudomonas oryzihibants 81
EP2G2M10 Pseudomonas fluorescens/putida 90
EP8G1M10 Pseudomonas aeruginosa 77
EP9G2M18 Pseudomonas aeruginosa 77
EP7G2M15 Stenotrophomonas maltophilia 80
EP9G1M16 Pseudomonas aeruginosa 77
Adicional a estas pruebas para enterobacterias, se realizaron pruebas con las tiras API
50CHB para caracterizar bioquímicamente las bacterias Gram positivas (Anexo F).
Resultados y Discusión 67
Tabla 4-4. Resultados de la identificación de los aislados antagonistas endófitos
mediante el sistema API 50CHB
Aislamiento Cepa identificada Posibilidad (%)
EP5G1M10 Bacillus subtilis/amiloliquenfaciens 99
EP2B2M7 Bacillus smithii 65
EP1B2M1 Bacillus mycoides/ thurigiensis 70
EP1B1M8 Geobacillus thermoglucosidasius 55
EP1B2M4 Bacillus mycoides/ thurigiendisis 73
EP3G2M4 Geobacillus thermoglucosidasius 98
EP2B2M4 Geobacillus thermoglucosidasius 50
EP4B2M18 Aneurinibacillus aneurinilyticus 99
EP4B2M16 Bacillus subtilis/amiloliquenfaciens 99
EP3B1M4 Bacillus subtilis 99
EP5B2M21 Bacillus subtilis/amiloliquenfaciens 99
Los resultados obtenidos de cada prueba bioquímica realizada mediante las tiras API con
base en la colorimetría o cambio de color del medio de inoculación se muestran en los
Anexos G y H.
4.3.3 Medios selectivos:
Los resultados obtenidos en los medios selectivos utilizados para determinar algunas
características de las bacterias antagónicas a Fusarium y posibles promotoras de
crecimiento de las plantas de ají se ilustran en las figuras. 4-16, 4-17 y 4-18.
Resultados y Discusión 68
Figura 4-16. Coloración de algunos aislamientos antagónicos endófitos y de la rizosfera
en Agar King B expuestos a luz UV- Los aislamientos con la letra E, corresponden a las
bacterias endófitas; los aislamientos con la letra R corresponden a las bacterias
rizosfericas.
Resultados y discusión 69
Figura 4-17. Aislamientos antagónicos endófitos y de la rizosfera en Agar MacConkey –
Los aislamientos con la letra E, corresponden a las bacterias endófitas; los aislamientos
con la letra R corresponden a las bacterias rizosfericas.
Resultados y Discusión 70
Figura 4-18. Coloración de algunos aislamientos antagónicos endófitos y de la rizosfera
sembrados en Agar cetrimida y expuestos a luz UV - Los aislamientos con la letra E,
corresponden a las bacterias endófitas; los aislamientos con la letra R corresponden a las
bacterias rizosfericas.
De acuerdo con los resultados observados en medio King B, King A o cetrimida, los
aislamientos antagónicos bacterianos RP9G2M18, EP9G2M8, EP8B2M28, EP9G1M16,
EP14G1M5, EP7GM11, EP7G2M4, EP8G1M10, RP7G2M8,1 son productores de
piocianinas, pioverdinas y fluoresceínas los cuales son pigmentos verdosos, azules o
amarillos cuando son expuestos a luz UV. Estos pigmentos son un indicador cualitativo
de la presencia de algunos sideróforos, que a su vez se pueden clasificar en catecolatos
(fenolatos), hidroximatos e hidroxicarboxilatos. Estos sideróforos forman complejos
octaédricos hexadentados con el metal y algunos son más eficaces que otros para
quelatar el hierro (Marahiel, 1997; Crosa y Walsh, 2002; Aguado – Santacruz et al.,
2012). Igualmente, estos autores reportan que algunas especies del género
Resultados y discusión 71
Pseudomonas producen sideróforos del tipo hidroximato, entre los que también se
encuentran la ferribactina, pseudobactina y pioverdinas del tipo catecol.
Según autores como O’Sullivan y O’Gara, 1992; Dowling et al., 1996, los sideróforos
involucran un mecanismo de secuestrar el hierro y otros minerales, disponibles en el
medio y con esto limitar el crecimiento de microorganismos fitopatógenos como
Fusarium. Este es un mecanismo de producción de crecimiento muy difundido entre las
bacterias, inclusive en las que son más reconocidas por otras actividades de estimulación
de crecimiento.
Así pues, las bacterias con la capacidad de producir estos compuestos y secuestrar el
hierro del ambiente, ocasionan que este metal no se encuentre disponible para otros
microorganismos que carezcan del sistema de asimilación específico para reconocer
dicho complejo. De esta manera, al utilizar todo o la mayoría del hierro disponible en el
suelo suprime o inhibe el crecimiento de otros microorganismos patógenos presentes en
la rizosfera (Compant et al., 2005; Schroth y Hancock, 1982) como lo observado in vitro.
Además de suprimir la presencia de patógenos con necesidades de hierro para su
supervivencia, estos sideróforos, pueden actuar como activadores eficientes de los
sistemas de resistencia sistémica inducida en las plantas como lo muestran algunos
trabajos previos de investigación (Ran et al., 2005; Meziane et al., 2005; Bakker et al.,
2007).
Por otro lado, los resultados obtenidos en el medio MacConkey (Fig. 4-17) muestran los
aislamientos de enterobacterias bacilares gram negrativas, que permiten diferenciar
aquellos que utilizan o no lactosa, el cual es el único hidrato de carbono en el medio.
Algunos de los aislamientos antagónicos bacterianos visualizados como enterobacterias
en el medio fueron EP6G1M14, EP5G1M9, EP10G1M9, EP15G1M16, RP7B2M4,
RP3G2M13, RP9G2M8, RP7G2M11, RP7G2M4, RP7G2M8, P7B2M2 produciendo
colonias de color rojo, morado o fucsia, debido a la conversión del colorante indicador
rojo neutro (rojo por debajo de Ph 6,8) a partir de ácidos mixtos. Contrario a esto, las
colonias que no fueron enterobacterias fermentadoras de lactosa aparecieron incoloras o
trasparentes, inhibidas por las sales biliares y el violeta genciana del medio o por ser
Gram positivas (Koneman y Allen, 2008). Según lo reportado por Farro y Graus, 2013,
estas enterobacterias se encuentran en la mayoría de suelos creciendo rápidamente en
Resultados y Discusión 72
medios de cultivo y en diferentes sustratos orgánicos de bajo costo. Muchas de estas
han sido empleadas como promotoras de crecimiento vegetal logrando un incremento en
la germinación de cultivos de maíz (Torres et al., 2003; Rani et al., 2011; Ogbo and
Okonkwo, 2012), así como también en el número de pelos absorbentes (Schoebitz,
2006), número de raíces laterales, altura, biomasa radical, biomas aérea y rendimiento
(Torres et al., 2003; Schoebit, 2006; Schoebitz et al., 2009; Rani et al., 2011; Koo and
Cho, 2009; Criollo et al., 2012; Ogbo and Okonkwo, 2012; Sánchez et al., 2012; Morales
et al., 2011), además de aumento en la concentración de fósforo (Cordero et al., 2008) y
nitrógeno (Beracochea, 2011) en los tejidos vegetales.
4.4 Caracterización molecular
Tras la identificación de los aislados bacterianos antagónicos por medios bioquímicos, se
confirmó la identificación de las especies de estos géneros mediante la secuenciación
genómica. Se secuenciaron 49 aislados pertenecientes a la rizosfera y tejido foliar
endófito de plantas de ají tabasco (Capsicum frutescens).
Se secuenciaron los nucleótidos de la región conservada ADN ribosomal 16S (ADNr 16S)
y el producto fue visualizado por electroforesis en gel de agarosa. Se obtuvo un
fragmento de ≈1200 pb de cada aislado, como se puede apreciar en la figura 4-19.
1200 pb
Figura 4-19. Visualización en gel de agarosa 1% p/b, de productos de amplificación de la
región ADN ribosomal 16S mediante el cebador universal D1.
Una vez obtenidas las secuencias completas de cada uno de los aislados, se determinó
la identidad a nivel de especie, mediante el programa BLAST (Basic Local Alignment
Resultados y discusión 73
Search Tool) obtenida a través del NCBI (Nacional center for biotechnology Information,
2016).
Los resultados de la identificación se muestran en la tabla 4-5 y figura 4-20, donde se
observa que el género Pseudomonas fue el predominante de los aislados de la planta de
ají con 17 individuos del total de aislamientos secuenciados. De estos individuos, nueve
fueron encontrados en el tejido foliar endófito y los ocho restantes en la rizosfera. En este
género se destaca la especie Pseudomona aeruginosa con 11 individuos, de los cuales
cinco fueron aislados de tejido foliar endófito y seis de la rizosfera. Las especies
Pseudomona fluorescens y Pseudomona putida presentaron dos individuos aislados de
tejido foliar endófito y uno de la rizosfera cada una.
Por otro lado, el género Bacillus presenta de igual manera un papel sobresaliente dentro
de las especies encontradas, debido a que se aislaron 17 individuos del total de
aislamientos secuenciados. En estos aislados del género Bacillus, predominó la especie
Bacillus amyloliquefaciens la cual presentó ocho individuos, de los cuales siete fueron
hallados en la rizosfera y uno en tejido foliar endófito. La especie Bacillus subtilis, Bacillus
pumilus, Bacillus simplex y Bacillus thuringiensis presentaron 3, 2, 2 y 2 aislamientos
respectivamente.
Resultados y Discusión 74
RP2B1M5 Bacillus amyloliquefaciens
RP10B2M31 Bacillus amyloliquefaciens
RP7G2M11 Bacillus amyloliquefaciens
RP15B1M2 Bacillus amyloliquefaciens
RP15B1M1 Bacillus amyloliquefaciens
RP7G2M2 Bacillus amyloliquefaciens
RP8B2M27 Bacillus amyloliquefaciens
RP3G2M13 Bacillus pumilus
RP4G2M3 Bacillus pumilus
Azospirillum_melinis_NR_043483.1
RP8B2M22 Stenotrophomonas maltophilia
RP1G1M2 Achromobacter xylosoxidans
RP6G2M4 Serratia sp.
RP9G2M8 Pseudomonas aeruginosa
RP1G2M2 Alcaligenes faecalis
RP7B2M2 Alcaligenes faecalis
RP2B1M9 Alcaligenes faecalis
RP7B2M4 Alcaligenes faecalis
RP7B2M5 Stenotrophomonas maltophilia
RP7G2M8,1 Pseudomonas aeruginosa
RP7G2M8 Pseudomonas aeruginosa
RP7G2M4,1 Pseudomonas aeruginosa
RP1G1M16 Pseudomonas aeruginosa
RP14G1M5 Pseudomonas aeruginosa
RP7G2M4 Pseudomonas putida
RP10G2M16 Pseudomonas fluorescens
0.05
EP2B2M7 Bacillus simplex
EP4B2M18 Bacillus simplex
EP1B2M1 Bacillus thuringiensis
EP1B1M8 Microbacterium arborescens
EP2B2M4 Microbacterium arborescens
Azospirillum_melinis NR_043483.1
EP7G2M15 Stenotrophomonas maltophilia
EP8B2M28 Stenotrophomonas maltophilia
EP8G1M10 Pseudomonas aeruginosa
EP15G1M16 Pseudomonas aeruginosa
EP5B2M7 Pseudomonas aeruginosa
EP5B2M17 Pseudomonas aeruginosa
EP10G1M9 Pseduomonas putida
EP2G2M10 Pseudomonas putida
EP3B2M13 Pseudomonas aeruginosa
EP9G1M16 Pseudomonaaeruginosa
EP9G2M18 Pseudomonaaeruginosa
EP1B2M4 Bacillus thuringiensis
EP3B1M4 Bacillus subtilis
EP5B2M21 Bacillus amyloliquefaciens
EP4B2M16 Bacillus subtilis
EP5G1M10 Bacillus subtilis
EP3G2M4 Microbacterium arborescens
EP5G1M9 Enterobacter cloacae
EP6G1M14 Enterobacter cloacae
0.05
Figura 4-20. Árbol filogenético de las secuencias de rizobacterias (A) y endófitas (B)
obtenidas mediante la amplificación de la región de ADNr 16S mediante el cebador
universal D1, usando el coeficiente de similitud del vecino más cercano (Neighbor joining
bootstrap de 1000 replicas). Raiz Azospirillum melinis (NR_043483.1)
Aparte de estas especies representadas por estos dos géneros, también se encuentran
las especies Alcaligenes faecalis y Stenotrophomonas maltophilia cada una con cuatro
individuos totales. La primera estuvo presente solo en la rizosfera, mientras que la
segunda se encontró tanto en rizosfera como en hojas. También se hallaron las especies
Enterobacter cloacae y Microbacterium sp., encontradas en el tejido foliar endófito.
A B
Resultados y discusión 75
Finalmente se observan con un individuo las especies Achromobacter xylosoxidans y
Serratia sp., en la rizosfera y Microbacterium arborescens en el tejido foliar.
Tabla 4-5. Resultados de la caracterización molecular de los aislamientos endófitos de
hojas y rizobacterias de ají tabasco
Código del aislamiento Especie Accesión (Gen Bank) %
identificación
RP1G1M2 Achromobacter xylosoxidans KR136349.1
98
RP1G2M2 Alcaligenes faecalis CP013119.1
84
RP7B2M2 Alcaligenes faecalis CP013119.1 92
RP2B1M9 Alcaligenes faecalis KT013265.1 95
RP7B2M4 Alcaligenes faecalis CP013119.1 92
EP5B2M21 Bacillus amyloliquefaciens KT964221.1 94
RP8B2M27 Bacillus amyloliquefaciens KT964221.1 93
RP15B1M2 Bacillus amyloliquefaciens CP014783.1 98
RP7G2M11 Bacillus amyloliquefaciens KJ767314.1 97
RP7G2M2 Bacillus amyloliquefaciens CP006058.1 94
RP10B2M31 Bacillus amyloliquefaciens KM658261.1 94
RP15B1M1 Bacillus amyloliquefaciens JN999864.1 95
RP2B1M5 Bacillus amyloliquefaciens KT964221.1 99
RP4G2M3 Bacillus pumilus KC250106.1 95
RP3G2M13 Bacillus pumilus KM438074.1 94
EP2B2M7 Bacillus simplex KT216588.1 99
EP4B2M18 Bacillus simplex KT216588.1 93
EP3B1M4 Bacillus subtilis KR055730.1 92
EP5G1M10 Bacillus subtilis KP408227.1 90
EP4B2M16 Bacillus subtilis KU764381.1 92
EP1B2M1 Bacillus thuringiensis HQ694054.1 98
EP1B2M4 Bacillus thuringiensis KF150502.1 91
EP6G1M14 Enterobacter cloacae CP009850.1 84
EP5G1M9 Enterobacter cloacae CP003737.1 83
EP1B1M8 Microbacterium arborescens JF416209.1 97
EP2B2M4 Microbacterium arborescens KF465976.1 83
EP3G2M4 Microbacterium sp. JQ659424.1 98
EP9G1M16 Pseudomonas aeruginosa GQ203623.1 85
EP9G2M18 Pseudomonas aeruginosa KF979140.1 85
EP3B2M13 Pseudomonas aeruginosa KC662503.1 96
EP15G1M16 Pseudomonas aeruginosa KC662503.1 96
Resultados y Discusión 76
Tabla 4-5: (Continuación)
Código del aislamiento Especie Accesión (Gen Bank) %
identificación
EP8G1M10 Pseudomonas aeruginosa DQ083947.1 95
RP7G2M4,1 Pseudomonas aeruginosa EF378660.1 96
RP14G1M5 Pseudomonas aeruginosa JQ660572.1 96
RP7G2M8,1 Pseudomonas aeruginosa JF513134.1 95
RP1G1M16 Pseudomonas aeruginosa JF513134.1 99
RP7G2M8 Pseudomonas aeruginosa CP013989.1 86
RP9G2M8 Pseudomonas aeruginosa CP013989.1 86
EP5B2M17 Pseudomonas fluorescens JN029804.1 99
EP5B2M7 Pseudomonas fluorescens JN029804.1 99
RP10G2M16 Pseudomonas fluorescens JN029804.1 99
EP2G2M10 Pseudomonas putida FJ788425.1 96
EP10G1M9 Pseduomonas putida FJ788425.1 96
RP7G2M4 Pseudomonas putida KU187966.1 96
RP6G2M4 Serratia sp. CP005927.1 96
EP8B2M28 Stenotrophomonas maltophilia HM755666.1 96
EP7G2M15 Stenotrophomonas maltophilia HM755666.1 96
RP8B2M22 Stenotrophomonas maltophilia GQ889255.1 96
RP7B2M5 Stenotrophomonas maltophilia KT748642.1 97
Los aislamientos bacterianos de la rizosfera RP7G2M4,1, RP14G1M5, RP7G2M8,
RP1G1M16, RP10G2M16, RP7G2M8,1, RP9G2M8, RP8B2M27, RP15B1M2, RP4G2M3,
RP7G2M11, RP7G2M2, RP3G2M13, RP10B2M31, RP15B1M1, RP2B1M5 y los
endófitos EP9G1M16, EP9G2M18, EP5B2M17, EP2G2M10, EP3B2M13, EP15G1M16,
EP5B2M7, EP10G1M9, EP8G1M10, EP3B1M4, EP5G1M10, EP5B2M21, EP2B2M7,
EP4B2M16, EP1B2M1, EP4B2M18, EP1B2M4 pertenecen a los géneros Pseudomona y
Bacillus y presentaron los mayores porcentajes de inhibición del patógeno.
Estos resultados coinciden con lo reportado en la literatura, puesto que estos dos
géneros poseen mecanismos de acción directa e indirecta como bacterias promotoras de
crecimiento vegetal debido a su capacidad de producir fitohormonas, liberar ácido
indolácetico (AIA), giberelinas o citoquininas en la rizósfera de las plantas, ejerciendo un
efecto estimulador del crecimiento (Lugtenberg y Kamilova, 2009; Sarabia et al., 2012).
Además de tener la capacidad de controlar patógenos sintetizando moléculas
antifúngicas (Whipps, 2001), producir enzimas como quitinasas, glucanasas y proteasas
Resultados y discusión 77
que degradan y rompen las paredes celulares de los hongos o servir como competencia
presentado una agresiva colonización y desplazando a otras bacterias u hongos
perjudiciales para las plantas (Lugtenberg y Kamilova, 2009). Sumado a esto, estudios
realizados por Toyoda y Utsimi (1991) muestran que cepas de Pseudomonas cepacia y
Pseudomonas solanacearum son capaces de hidrolizar el ácido fusárico, el cual es el
agente causante del marchitamiento por infección de Fusarium.
De igual manera se reporta que en el año 2015 estudios realizados por Castillo y
colaboradores encontraron que especies del género Bacillus presentaron un efecto
antagonista in vitro sobre Rhizoctonia solani con una inhibición del micelio de 40 a 67%.
Al realizar la caracterización por secuenciación del gen 16S del ADNr determinaron que
los aislamientos pertenecían a las especies de B. subtilis, B. pumilus y a B. atrophaeus,
quienes están reportadas con efecto antagónico sobre otros organismos fitopatógenos.
De igual modo, los resultados concuerdan con el trabajo de Vega et al., 2005 quienes
realizaron el primer reconocimiento de la diversidad de bacterias endófitas en diversos
tejidos de café, encontrando bacterias del género Bacillus, Pseudomonas, Serratia y
Stenotrophomonas, entre otras. Estos autores también reportaron el primer estudio que
informó la presencia de bacterias endófitas en las semillas café. El posible papel de estas
bacterias en la biología de la planta de café es desconocido.
Sin embargo, estudios recientes (Elhalag et al., 2015), demuestran la actividad
antagónica de Stenotrophomonas maltophilia contra Ralstonia solanacearum bajo
diferentes condiciones de aplicación y su capacidad para actuar como promotora de
crecimiento vegetal (Morgado et al., 2015).
Otros estudios (Yee Liu et al., 2012), nombran a la especie Enterobacter cloacae como
una bacteria endófita encontrada en plantas de tomate infectadas con Ralstonia
solanacearum. Esta bacteria también se ha reportado como promotora de crecimiento
vegetal con capacidad de producir AIA (Malik & Sindhu, 2011) y la utilización de la
enzima 1-aminociclopropano-1-carboxilato (precursor del etileno) metabolizandola en
alfa-cetobutirato y amoniaco (Jorquera et al., 2012). Esta reacción metabólica disminuye
el estrés en la planta generado por altas concentraciones de esta hormona, afectando a
algunas bacterias fitopatógenas; además proporciona resistencia a hidrocarburos
poliaromáticos, desecación, salinidad y metales pesados como níquel y calcio (Bal et al.,
Resultados y Discusión 78
2012). También es capaz de producir compuestos volátiles como acetoina y 2,3-
butanodiol que actúan de forma directa como fitohormonas y estimulan de forma indirecta
a la promoción del crecimiento vegeta (Farag et al., 2013).
En cuanto al género Microbacterium, varios autores reportan su capacidad de
solubilización de fosfato en especies como el Capscium annuum, Lupinus montanus,
entre otras (Oliveira et al., 2009; Bhattacharyya y Jha 2012; Babana et al., 2013; Rojas et
al., 2015). De manera similar las especies Alcaligenes faecalis y Achromobacter
xylosoxidans han sido reportadas como promotoras de crecimiento vegetal en diferentes
hospederos, produciendo hormonas como auxinas y AIA, así como también fijando
nitrógeno atmosférico (Cortés et al., 2014).
Así pues, los resultados encontrados en este estudio se constituyen como una fuente
importante y promisoria para el manejo de enfermedades y mejoramiento de la
productividad en el ají.
Conclusiones y Recomendaciones 79
5. Conclusiones y recomendaciones
5.1 Conclusiones
De la rizósfera y tejido foliar endófito de ají tabasco se identificaron ocho géneros de
bacterias correspondientes a Serratia, Achromobacter, Alcaligenes, Microbacterium,
Enterobacter, Stenotrophomonas, Bacillus, Pseudomonas que presentan capacidad
antagónica frente a los aislados de Fusarium.
La morfología, perfil bioquímica y caracterización molecular permitió determinar que
los géneros Pseudomonas y Bacillus, fueron los más representativos en cuanto
abundancia de aislados de plantas de Capsicum frutescens y capacidad antagónica
frente a Fusarium, de las cuales las especies Pseudomona aeruginosa y Bacillus
amyloliquefaciens fueron las más predominantes en el estudio y se encontraron
asociadas tanto a tejido foliar como a rizosfera.
Los aislamientos RP9G2M18 EP9G2M8 EP8B2M28 EP9G1M16 EP14G1M5
EP7GM11 EP7G2M4 EP8G1M10 RP7G2M8,1 presentaron caracteristicas
promotoras de crecimiento realacionadas con la producción de sideroforos.
Las especies Achromobacter xylosoxidans, Alcaligenes faecalis, Enterobacter
cloacae, Microbacterium spp., y Stenotrophomonas maltophilia, se constituyen como
nuevos reporte de bacterias asociadas a la rizosfera o tejido vegetal endófito de
plantas de ají tabasco Capsicum frutescens, en el Valle del Cauca – Colombia.
Conclusiones y Recomendaciones 80
5.2 Recomendaciones
Realizar pruebas de invernadero y en campo con las cepas que presentaron
antagonismo frente a Fusarium.
Determinar los mecanismos biológicos mediante los cuales las bacterias con
capacidad antagónica actúan dentro de la planta.
Evaluar las bacterias con capacidad antagónica frente a otros patógenos del ají.
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Anexos 103
Anexos
Anexo A: Promedio del porcentaje de inhibición de los aislamientos bacterianos de la
rizosfera de Ají Tabasco (Capsicum frutescens) frente a los seis aislados de Fusarium
patogénicos evaluados
N° Aislamiento Bacterianos F701 F58 F54 F52 F09 FB
1 RP15B1M1* 24,4 5,6 59 67 40 77,8
2 RP15B2M2* 14,4 0 0 56 44 77,8
3 RP10B1M20 0 5,6 11 4 2 8,9
4 RP9B1M26 0 0 0 0 0 0
5 RP10B2M31*2 69 57,8 63,3 61,1 62,2 53,3
6 RP10B2M33 0 36,7 0 0 0 0
7 RP10B2M34 0 0 0 0 0 0
8 RP10B2M35 0 0 0 0 54 36,7
9 RP10B2M37 0 0 0 0 0 0
10 RP1B1M9* 13 37 19 52 47 40
11 RP1B2M6 0 51,1 0 0 22 11
12 RP1B2M7 0 0 0 0 13 0
13 RP1B2M8 11 12 19 0 18 17,4
14 RP2B1M6 0 27,8 0 0 0 2,2
15 RP2B1M7 0 0 0 0 0 0
16 RP2B1M8 0 0 0 0 0 9,2
17 RP2B1M9* 13 37 19 52 47 40
18 RP3B1M11 0 35,6 0 0 0 40
19 RP3B1M5 0 0 0 38 26 0
20 RP3B2M2 0 0 0 0 64 32
21 RP3B2M4 0 0 0 0 0 42,2
22 RP3B2M5 46 0 0 31 0 0
23 RP4B1M1 0 0 0 0 0 0
24 RP4B1M2 0 0 0 0 0 0
25 RP4B1M3 0 0 0 0 0 0
26 RP4B2M30 22 33,3 0 0 20 34,4
27 RP5B2M1 0 0 0 0 0 0
1 F70, F58, F54, F52, F09 (colección de referencia de aislamientos de Fusarium de la Universidad Nacional de Colombia
sede Palmira, obtenidos en el trabajo de Clavijo, 2014) y FB obtenido en el municipio de Bolívar Valle. *Corresponde a los aislamientos que presentaron antagonismos en por lo menos cuatro de los seis hongos patogénicos
evaluados y fueron seleccionados para la extracción de ADN.
Anexos 104
Anexo A: (Continuación)
N° Aislamiento Bacterianos F703 F58 F54 F52 F09 FB
28 RP5B2M3 0 0 0 0 0 0
29 RP5B2M4 0 0 0 0 0 0
30 RP5B2M2 0 0 0 0 0 0
31 RP6B1M10 0 0 0 0 0 0
32 RP6B1M13 0 0 0 0 0 0
33 RP6B2M12 0 0 0 0 0 0
34 RP6B2M15 0 0 0 0 0 0
35 RP6B2M14 0 0 0 0 0 42,2
36 RP7B1M17 0 0 0 0 0 0
37 RP7B2M1 0 43,3 0 0 36 26,9
38 RP7B2M2* 61 28 39 53 47 0
39 RP7B2M3 0 0 0 0 0 16,7
40 RP7B2M4* 33 43,3 39 38 44 16
41 RP7B2M5* 30 37,8 0 31 43 44,4
42 RP8B1M25 0 0 0 0 0 41
43 RP8B2M22* 60 46 80 54 73 30
44 RP8B2M23 0 25,6 0 0 0 31,1
45 RP8B2M26 0 0 0 0 0 25,6
46 RP8B2M27* 59 69 55,6 49 61,1 85,6
47 RP9B1M26 0 0 0 0 0 58
48 RP9B2M3 0 27,8 0 0 26 35,6
49 RP1B1M3 0 0 0 0 0 0
50 RP9B1M26 0 0 0 0 0 44,4
51 RP9B1M6 0 0 0 0 0 0
52 RP2B1M5* 64 59 87 77 77 90
53 RP11B1M8 0 0 0 0 0 0
54 RP11B1M10 0 0 0 0 0 0
55 RP11B1M11 0 0 0 0 0 0
56 RP12B1M9 0 0 0 0 0 0
57 RP12B1M20 0 0 0 0 0 0
58 RP12B2M21 0 0 0 0 0 0
59 RP12B2M22 0 0 0 0 0 0
60 RP13B1M5 0 0 0 0 0 0
61 RP13B2M6 0 0 0 0 0 0
62 RP14B2M3 0 0 0 0 0 0
3 F70, F58, F54, F52, F09 (colección de referencia de aislamientos de Fusarium de la Universidad Nacional de Colombia
sede Palmira, obtenidos en el trabajo de Clavijo, 2014) y FB obtenido en el municipio de Bolívar Valle.
Anexos 105
Anexo A: (Continuación)
N° Aislamiento Bacterianos F70 F58 F54 F52 F09 FB
63 RP14B2M9 0 0 0 0 0 0
64 RP14B2M10 0 0 0 0 0 0
65 RP11G1M43,1 0 17 0 0 0 0
66 RP14G1M5* 86 46,7 64 74 83 92
67 RP1G1M8 0 0 0 0 0 0
68 RP1G2M2* 63 74 60 67 76 99
69 RP1G2M1 0 0 0 0 0 0
70 RP1G1M15 0 50 36 0 0 6,7
71 RP2G1M5 0 0 0 0 0 0
72 RP2G1M6 0 0 0 0 0 0
73 RP2G2M8 0 0 0 0 0 0
74 RP2G2M7 22,2 19,4 0 0 24 41,1
75 RP3G2M2 0 0 0 0 60 63
76 RP3G2M10 0 0 0 0 0 43,3
77 RP3G2M11 0 27 35,6 0 0 51
78 RP3G2M12 0 0 0 0 27,8 0
79 RP3G2M9 0 0 29 0 0 0
80 RP4G2M1 0 0 0 0 0 0
81 RP4G2M5 0 0 0 0 0 0
82 RP4G2M6 0 0 0 0 0 0
83 RP4G2M3* 0 3,3 24 66,7 24,4 45,6
84 RP5G2M8 0 0 0 0 0 0
85 RP5G1M10 0 0 0 0 0 0
86 RP5G1M11 0 28 6 28 58 0
87 RP5G2M10 0 0 0 0 0 0
88 RP6G2M18 0 0 0 59 0 31,1
89 RP6G2M4* 42 76 66 67 64 12,2
90 RP6G2M5 0 35,6 15 20 0 31,1
91 RP6G2M8 27,8 0 0 0 0 47,8
92 RP7G2M11* 31 45 64 61,1 40 41,1
93 RP7G2M12 0 0 0 0 0 0
94 RP3G2M13* 22 23 36 28 42 51,1
95 RP7G2M2* 37 58,9 60 39 61,1 69
96 RP7G2M3 0 0 0 0 19 0
97 RP7G2M4* 0 0 70 26 0 0
98 RP7G2M5 30 0 22 11,2 0 0
99 RP7G2M30 67,8 0 0 0 0 0
100 RP7G2M8* 50 46,7 40 63 41 31,1
101 RP8G1M14 0 14 0 0 0 43,9
Anexos 106
Anexo A: (Continuación)
N° Aislamiento Bacterianos F70 F58 F54 F52 F09 FB
102 RP8G1M37 0 19 0 0 0 35,9
103 RP8G2M9 0 0 0 0 0 0
104 RP8G2M21 0 0 0 0 0 0
105 RP8G2M3 0 20 0 0 0 8,9
106 RP9G2M7 0 0 0 0 0 0
107 RP9G1M3 0 0 0 0 0 0
108 RP9G1M5 0 0 0 0 0 0
109 RP9G2M8* 79 73 81,1 82 75,6 93
110 RP1G1M16* 81 83 91 73 81,1 97
11 RP10G2M16* 0 52 67 56 62 67
112 RP1G1M2* 64 86 50 84 50 84
113 RP7G2M6 0 0 0 0 0 0
114 RP11G1M1 0 0 0 0 0 0
115 RP11G1M6 0 0 0 0 0 0
116 RP11G2M10 0 0 0 0 0 0
117 RP12G2M4 0 0 0 0 0 0
118 RP12G2M15 0 0 0 0 0 0
119 RP12G1M3 0 0 0 0 0 0
120 RP13G1M7 0 0 0 0 0 0
121 RP13G1M5 0 0 0 0 0 0
122 RP13G2M11 0 0 0 0 0 0
123 RP14G2M7 0 0 0 0 0 0
124 RP15G2M6 0 0 0 0 0 0
125 RP15G2M4 0 0 0 0 0 0
Anexos 107
ANEXO B: Promedio del porcentaje de inhibición de los aislamientos bacterianos
endófitos foliares frente a los seis aislados de Fusarium patogénicos evaluados
N° Aislamiento Bacteriano
F704 F58 F54 F52 F09 FB
1 EP1B1M8* 8 11 14 6 22 0
2 EP1B2M1*5 47 28 0 0 27 20
3 EP1B2M2 0 0 0 0 0 19
4 EP1B2M3 0 0 0 0 0 0
5 EP1B2M4* 42 56 28 18 42 44
6 EP1G1M15 0 0 0 0 0 12
7 EP2B1M5 0 0 0 0 0 0
8 EP2B2M4* 61 66 48 33 48 46
9 EP2B2M5 0 0 0 0 0 0
10 EP2B2M6 0 0 0 0 0 39
11 EP2B2M7* 0 18,9 0 12 27 18
12 EP2B2M8 33 0 0 0 0 27
13 EP2B2M9 0 0 0 0 0 0
14 EP2G2M10* 20 0 0 13 20 22
15 EP2G2M4 0 0 32,2 6 0 37
16 EP3B1M4* 87 59 72 56 76 78
17 EP3B2M12* 50 29 22 18 22 41
18 EP3B2M13* 0 0 27,8 0 22,2 24
19 EP3G2M4* 67 33 0 0 0 63
20 EP4B2M4 0 0 0 0 0 0
21 EP4B2M14 0 0 0 0 0 0
22 EP4B2M15 0 0 0 0 24,4 0
23 EP4B2M16* 44,4 69 48,9 48 52 83
24 EP4B2M18* 0 0 25,6 30 27,8 18
25 EP4G2M1 0 32,2 38,9 4 0 0
26 EP4G2M8 60 0 32,2 0 0 11
27 EP5B1M10 0 0 0 0 0 0
28 EP5B2M17* 26 0 15,6 11 0 0
4 F70, F58, F54, F52, F09 (colección de referencia de aislamientos de Fusarium de la Universidad Nacional de Colombia
sede Palmira, obtenidos en el trabajo de Clavijo, 2014) y FB obtenido en el municipio de Bolívar Valle.
5 Corresponde a los aislamientos que presentaron antagonismos en por lo menos cuatro de los seis hongos patogénicos
evaluados y fueron seleccionados para la extracción de ADN.
Anexos 108
Anexo B: (Continuación)
N° Aislamiento Bacteriano
F706 F58 F54 F52 F09 FB
29 EP5B2M19 0 0 26,7 0 0 0
30 EP5B2M21* 0 15,6 40 38,9 0 24
31 EP5B2M22 0 0 0 0 30 0
32 EP5B2M7* 0 24 19 13 33 33
33 EP5G1M9* 50 13 0 17 33 8
34 EP5G1M10* 76 77 87 82 83 86
35 EP5G1M14 0 57,8 0 0 0 34
36 EP6B2M20 0 0 52 50 0 8
37 EP6B2M22 0 28 26 0 18 0
38 EP6B2M23 36,7 0 27,8 0 0 12
39 EP6B2M25 8 28 0 11 0 14
40 EP6G1M14* 0 64,4 0 0 28 0
41 EP6G2M14 6 18 0 13 28 14
42 EP7B1M6 0 0 0 0 0 0
43 EP7B2M26 0 0 0 0 22,2 0
44 EP7G2M15* 0 0 37 22 0 26
45 EP8BM6 0 0 16 0 28 47
46 EP8B2M28* 52 58 51,1 37 50 89
47 EP8G2M14 0 0 0 0 0 0
48 EP8G2M9 13 32 0 0 24 38
49 EP10G1M9* 50 22 0 0 0 0
50 EP8G1M20 0 17 0 0 0 0
51 EP8Gverde 71 80 62 69 67 89
52 EP9B1M3 0 0 0 0 0 0
53 EP9B2M9 0 0 47,8 0 0 17
54 EP9G2M18* 67 71 70 68 67 71
55 EP9G1M16* 44 19 27 34 0 33
56 EP10G2M18 0 0 0 0 22 48
57 EP10B1M13 0 0 0 0 0 0
58 EP10B2M7 0 0 16 0 13 21
59 EP10G1M7 3 16 11 27 0 0
6 F70, F58, F54, F52, F09 (colección de referencia de aislamientos de Fusarium de la Universidad Nacional de Colombia
sede Palmira, obtenidos en el trabajo de Clavijo, 2014) y FB obtenido en el municipio de Bolívar Valle.
Anexos 109
Tabla 4-2: (Continuación)
N° Aislamiento Bacteriano
F707 F58 F54 F52 F09 FB
60 EP12B1M8 0 0 0 0 0 0
61 EP15G1M16* 66,7 11,1 38,9 0 0 44
62 EP1G1M10 0 0 0 0 0 17
63 EP2G2M16 0 0 0 0 0 0
64 EP3B2M11 0 0 0 0 0 0
65 EP3B2M10 0 0 0 0 0 0
66 EP7B2M29 0 0 13 0 28 0
67 EP8G2M17 0 0 0 0 0 0
68 EP4G2M6 0 0 0 0 0 0
7 F70, F58, F54, F52, F09 (colección de referencia de aislamientos de Fusarium de la Universidad Nacional de Colombia
sede Palmira, obtenidos en el trabajo de Clavijo, 2014) y FB obtenido en el municipio de Bolívar Valle.
Anexos 110
ANEXO C: Caracterización Morfológica de las rizobacterias antagónicas a los
aislamientos de Fusarium evaluados.
Aislamiento Bacteriano
Gram Morfología Características de colonias
Color Forma Margen Elevación Densidad
RP15B1M1 + Bacilo Blanca Irregular Ondulado Plana Estriada
RP15B1M2 + Bacilo Blanca Irregular Ondulado Plana Estriada
RP10B1M20 + Bacilo Blanca Circular Entera Convexa Brillante
RP10B2M31 + Bacilo Blanco Irregular Ondulada Estriada Brillante
RP10B2M33 + Bacilo Beige Circular Lisa Brillante Brillante
RP10B2M35 + Bacilo Blanca Circular Lisa Plana Brillante
RP1B1M9 + Bacilo Naranja Circular Entera Convexa Brillante
RP1B2M6 + Bacilo Amarillo crema
Circular Entera Convexa Brillante
RP1B2M7 + Bacilo Blanco crema
Circular Entera Plana Brillante
RP1B2M8 Bacilo Amarillo Circular Entera Convexa Brillante
RP2B1M6 + Bacilo Hialina Irregular Lobulado Plana Traslucida
RP2B1M9 - Bacilo Blanca Circular Entera Plana Opaca
RP3B1M11 + Bacilo Blanca crema
Irregular Entera Plana Brillante
RP3B2M2 + Bacilo Beige Circular concéntrica Ondulado Umbonada Opaca
RP3B1M4 + Coco Blanca Circular Lisa Umbonada Opaca
RP3B2M5 + Bacilo Amarilla Irregular Lobulado Plana Brillante
RP4B2M30 + Bacilo Blanca crema
Circular lobulada Convexa Opaca
RP6B2M14 + Bacilo Beige Circular Entera Plana Brillante
RP7B2M1 + Bacilo Blanca Circular Entera Plana Brillante
RP7B2M2 - Bacilo Naranja Circular Entera Convexa Brillante
RP7B2M3 + Bacilo Amarilla crema
Circular Entera Convexa Brillante
RP7B2M4 - Bacilo Amarilla hialina
Circular Entera Plana Brillante
RP7B2M5 - Bacilo Blanca crema
Entera Entera Plana Brillante
RP8B1M25 + Bacilo Beige Circular Entera Elevada Brillante
RP8B2M22 - Bacilo Blanca Circular Entera Convexa Brillante
RP8B2M23 + Bacilo Blanca Rizoide Ondulada Umbonada Opaca
RP8B2M26 + Bacilo Blanca Rizoide Entera Plana Opaca
RP8B2M27 + Bacilo Blanca Irregular crestada Lobulada Plana Opaca
RP9B2M3 - Bacilo Amarilla Circular Ondulado Plana Traslucida
RP9B1M26 + Bacilo Naranja Circular Entera Convexa Brillante
RP2B1M5 + Bacilo
Blanca Beige
Circular Aserrado Umbonada Brillante
RP11G1M43,1 - Bacilo Grisácea afelpada
Circular Ondulado Convexa Opaca
RP14G1M5 - Bacilo Verde Circular Entera Convexa Brillante
RP1G2M2 + Bacilo Blanca invasiva
RP1G1M15 - Bacilo Amarilla crema
Circular Aserrada Umbonada Brillante
Anexos 111
Anexo C: (Continuación)
Aislamiento Bacteriano
Gram Morfología Características de colonias
Color Forma Margen Elevación Densidad
RP2G2M7 + Bacilo Amarillo crema
Circular Entero Convexa Brillante
RP3G2M2 - Bacilo Grisácea Circular Entero Convexa Brillante
RP3G2M10 - Cocos Blanca Circular Entera Convexa Opaca
RP3G2M11 + Bacilo Amarilla Circular Entera Convexa Brillante
RP3G2M12 + Bacilo Blanca Circular Entera Convexa Brillante
RP3G2M9 + Bacilo Blanca Irregular Ondulado Plana Estriada
RP4G2M3 + Bacilo Blanca Irregular estriada Lobulado Umbonada Brillante
RP5G1M11 - Bacilo Amarilla Irregular Filamentosa Umbonada Brillante
RP6G2M18 + Bacilo Blanca hialina
Circular Lisa Convexa Traslucida
RP6G2M4 - Bacilo Naranja crema
Circular Entero Umbonada Brillante
RP6G2M5 + Bacilo Beige circular Entero plana Brillante
RP6G2M8 + Bacilo Blanca Filamentosa Filamentosa Plana Traslucida
RP7G2M11 + Bacilo Blanca Rizoide Entero Convexa Opaca
RP3G2M13 + Bacilo Hialina Irregular Lobulado Plana Traslucida
RP7G2M2 + Bacilo Beige Rizoide viscosa Ondulado Umbonada Brillante
RP7G2M3 + Bacilo Beige Irregular Ondulado Plana Brillante
RP7G2M4,1 - Bacilo Verde Circular Entero Convexa Brillante
RP7G2M4 - Bacilo Blanca Irregular Lobulado Plana Brillante
RP7G2M5 + Bacilo Blanca Circular Entera Convexa Opaca
RP7G2M30 + Bacilo Beige Circular Entero Plana Brillante
RP7G2M8 - Bacilo Verde Circular Entero Convexa Brillante
RP8G1M14 - Bacilo Blanca crema
Circular Entero Elevada Brillante
RP8G1M37 - Bacilo Blanca crema
Circular Entero Elevada Brillante
RP8G2M3 + Bacilo Beige Circular Ondulado Elevada Brillante
RP9G2M8 - Bacilo Verde Circular Lisa Convexa Brillante
RP1G1M16 - Bacilo Verde Rizoide Aserrada Elevada Brillante
RP10G2M16 - Bacilo Verde Irregular Lisa Plana Brillante
RP1G1M2 - Bacilo Blanca Irregular Lobulada Plana Brillante
Anexos 112
ANEXO D: Caracterización Morfológica de las endófitas foliares antagónicas a los
aislamientos de Fusarium evaluados
Aislamiento Bacteriano
Test de
Gram Morfología
Características de colonias
Color Forma Margen Elevación Densidad
EP1B1M8 + Bacilo Amarilla Circular Entera Convexa Brillante
EP1B2M1 + Bacilo Beige Circular Entera Convexa Brillante
EP1B2M2 - Bacilo Blanca Circular Entera Convexa Brillante
EP1B2M4 + Bacilo Amarillo crema Circular Entera Elevada Brillante
EP1G1M15 + Bacilo Hialina Circular Entera Elevada Brillante
EP2B2M4 + Bacilo Blanca Irregular Ondulado Plana Opaca
EP2B2M6 + Bacilo Blanca Circular Entera Convexa Opaca
EP2B2M7 + Bacilo Beige Circular Entera Convexa Brillante
EP2B2M8 + Bacilo Blanca Circular Entera Convexa Brillante
EP2G2M10 - Bacilo corto Blanca Circular Entera Convexa Brillante
EP2G2M4 + Bacilo Naranja Circular Entera Convexa Brillante
EP3B1M4 + Bacilos Blanca Circular Entera Convexa Brillante
EP3B2M12 + Bacilo Blanca Filamentosa Lobulada Umbeliforme Brillante
EP3B2M13 - Bacilo Blanca Circular Entera Convexa Opaca
EP3G2M4 + Bacilo Amarilla Circular Entera Convexa Brillante
EP4B2M15 + Bacilo Amarillo hialino Circular Entera Convexa Brillante, traslucida
EP4B2M16 + Bacilo corto Blanca Circular Entera planoconvexa opaca
EP4B2M18 + Bacilo Blanco crema Circular Entera Pulvinada Brillante
EP4G2M1 + Bacilo corto Amarilla Circular Entera Convexa Brillante
EP4G2M8 + Bacilos largos Blanca Circular Entera Convexa Brillante
EP5B2M17 - Bacilo Crema/ Pequeña Circular Entera Convexa Brillante
EP5B2M19 + Bacilos Pequeños Amarilla hialina en los
bordes Circular Entera Convexa Traslucida
EP5B2M21 - Cocobacilo Naranja Circular Entera Convexa Brillante
EP5B2M22 + cocos Beige Circular Entera Convexa Brillante
EP5B2M7 - Bacilo Crema/ Pequeña Circular Entera Convexa Brillante
EP5G1M9 - Bacilo Blanca Circular Entera Convexa Brillante
EP5G1M10 + Bacilo Blanca con Beige Circular Entera Elevada Brillante
EP5G1M14 - Bacilo corto Amarilla hialina Circular Entera Convexa Brillante
EP6B2M20 + Bacilo Blanca Irregular Ondulado Plana Opaca
EP6B2M22 + Bacilo Rosada Circular Entera Convexa Brillante
EP6B2M23 + Bacilo Blanca con amarillo Circular estriada
Ondulado Papilada Brillante
EP6B2M25 + Bacilo Blanca Circular Filamentosa Pulvinada Brillante
EP6G1M14 - Bacilo Naranja Circular Entera Convexa Brillante
EP7B2M26 + Bacilo Beige Circular Entera Convexa Brillante
EP7G2M15 - Bacilo corto Amarilla clara Circular Entera Convexa Brillante
Anexos 113
Anexo D: (Continuación)
Aislamiento Bacteriano
Test de
Gram Morfología
Características de colonias
Color Forma Margen Elevación Densidad
EP8B1M6 + Bacilo Amarilla Rizoide Filamentosa Convexa Brillante
EP8B2M28 - Bacilo Blanca Irregular Ondulado PlanoConvexa Brillante
EP8G2M9 + Bacilo Blanca Circular Entera Pulvinada Opaca
EG10M9 + Bacilo Amarilla crema Circular Filamentosa Convexa Brillante
EP8G1M20 + Cocos grandes Amarilla Circular Lobulada Umbeliforme Brillante
EP8G1M10 - Bacilo Verde Circular Entera Convexa Brillante
EP9B2M9 + Bacilo Blanco crema Irregular Entera Convexa Brillante
EP9G2M18 - Bacilo verde opaca Circular entera Convexa Brillante
EP9G1M16 - Bacilo Verdosa Irregular Entera Convexa Brillante
EP10G2M18 - Bacilos cortos Blanca Rizoide Filamentosa Convexa Opaca
EP10B2M7 + Cocos grandes Amarilla Circular Entera Elevada Brillante
EP10G1M9 - Bacilos Blanca Rizoide Filamentosa Pulvinada Opaca
EP15G1M16 - Bacilo corto Crema / Pequeña Circular Entera Convexa Brillante
EP1G1M10 + Bacilo corto Blanca Irregular Filamentosa Mamelonada Brillante
EP7B2M29 + Cocos Amarilla crema Circular Entera Convexa Brillante
Anexos 114
ANEXO E: Resultados de la caracterización bioquímica de los aislados antagonistas de las rizobacterias- mediante el sistema API 20E
ONPG ADH LDC ODC CIT H2S URE TDA IND VP GEL GLU MAN INO SOR RHA SAC MEL AMY ARA OX NO2 N2
RP7B2M5 - - - - + - + - - - + - - - - - - - - - - - +
RP7G2M4 - - - - + - - - - - - + - - - - - + - + + - +
RP6G2M4 + - - + + - - - - + + - - - - - - - - - - + -
RP7B2M2 + - - - + - + - - + + - - - - - - - - - - + -
RP2B1M9 - - - - + - - - - + - - - - - - - - - - + - +
RP7G2M8 - - - - + - + - - - + + - - - - - + - + + - +
RP7G2M8,1 - - - - + - + - - - + + - - - - - + - + + - +
RP14G1M5 - - - - + - - - - - + + - - - - - + - + + + -
RP7B2M4 + - - - + - + - - - + + - - - - - - - + + - +
RP9G2M8 - - - - + - + - - - + + - - - - - + - + + - +
RP1G1M2 + - - - + - - - - + - - + - - - + - + + + + -
RP7G2M4,1 - - - - + - + - - - + + - - - - - + - + + - +
RP8B2M22 - - - - - - - - - - + - - - - - - - - - -
- +
RP1G1M16 - + - - + - - - - - - - - - - - - + - - +
+ -
RP10G2M16 - + - - + - - - - - - - - - - - - + - - + - +
RP1G2M2 + - - - + - + - - + + - - - - - - - - - - + -
Anexos 115
Beta-Galactosidasa (ONPG), Arginina Deshidrolasa (ADH), Lisina Descarboxilasa (LDC),
Ornitina Descarboxilasa (ODC), Utilización del Citrato (CIT), Producción de H2S (H2S),
Ureasa (URE), Triptófano Desaminasa (TDA), Producción de Indol (IND), Producción de
acetoína (Voges-Proskauer) (VP), Gelatinasa (GEL), Fermentación/oxidación de glucosa
(GLU), Fermentación/oxidación de Manitol (MAN), Fermentación/oxidación de Inositol
(INO), Fermentación/oxidación de Sorbitol (SOR), Fermentación/oxidación de Ramnosa
(RHA), Fermentación/oxidación de Sacarosa (SAC), Fermentación/oxidación de
Melobiosa (MEL), Fermentación/oxidación de Amigdalina (AMY), Fermentación/oxidación
de Arabinosa (ARA), Citocromo oxidasa (OX).
Anexos 116
ANEXO F: Resultados de la caracterización bioquímica de los aislados antagonistas de la rizosfera – Mediante tiras API 50CHB
RP8B2M27 RP15B1M2 RP4G2M3 RP7G2M11 RP7G2M2 RP3G2M13 RP10B2M31 RP15B1M1 P2B1M5
0 + + + + + + + + +
GLY + + + + + + + + +
ERY - - - - - - - - -
DARA - - - - - - - - -
LARA + + + + + + + + +
RIB + + - + + + + + +
DXYL + + - + + + + + +
LXYL - - - - - - - - -
ADO - - - - - - - - -
MDX - - - - - - - - -
GAL - - - - - - - - -
GLU + + + + + + + + +
FRU + + + + + + + + +
MNE + + + + + + + + +
SBE - - - - - - - - -
RHA - - - - - - - - -
DUL - - - - - - - - -
INO + + + + + - + + +
MAN + + + + + - + + +
SOR + + + + + - + + +
MDM - - - - - - - - -
MDG + + - + + - + + +
NAG - - + - - - - - -
AMY + + + - + - - - -
ARB + + + + + - + + +
ESC + + + + + + + + +
Anexos 117
Anexo F: (Continuación)
RP8B2M27 RP15B1M2 RP4G2M3 RP7G2M11 RP7G2M2 RP3G2M13 RP10B2M31 RP15B1M1 P2B1M5
SAL + + + + + - + + +
CEL + + + + + - + + +
MAL + + + + + - + + +
LAC - - - + - - + + +
MEL + + - + + + + + +
SAC + + + + + - + + +
TRE + + + + + + + + +
INU + + - - + - - - -
MLZ - - + - - - - - -
RAF + + - + + - + + +
AMD + + - + + - + + +
GLYG + + - + + - + + +
XLT - - + - - - - - -
GEN - - - + - - + + +
TUR - - + - - - - - -
LYX - - - - - - - - -
TAG - - - - - - - - -
DFUC - - - - - + - - -
LFUC - - - - - - - - -
DARL - - + - - - - - -
LARL - - - - - - - - -
GNT - - - - - - - - -
2KG - - - - - - - - -
5KG - - - - - - - - -
Anexos 118
Glycerol (GLY), Eritritol (ERY), D- Arabinosa (DARA), L- Arabinosa (LARA), Ribosa (RIB), D- Xylosa (DXYL), L- Xylosa (LXYL),
Adonitol (ADO), ß-Metil-D-Xylosida (MDX), Galactosa (GAL), Glucosa (GLU), Fructosa (FRU), Manosa (MNE), Sorbosa (SBE),
Ramnosa (RHA), Dulcitol (DUL), Inositol (INO), Manitol (MAN), Sorbitol (SOR), 1-Metil-D-Manósido (MDM), 1-Metil-D-Glucósido
(MDG), N-Acetol-Glucosamina (NAG), Amygdalina (AMY), Arbutin (ARB), Esculin (ESC), Salicin (SAL), Celobiosa (CEL), Maltosa
(MAL), Lactosa (LAC), Melobiosa (MEL), Sucrosa (SAC), Trehalosa (TRE), Inulin (INU), Melecitosa (MLZ), Rafinosa (RAF), Almidon
(AMD), Glucógeno (GLYG), Xylitol (XLT), Gentiobiosa (GEN), D-turanosa (TUR), D-lyxosa (LYX), D-tagatosa (TAG), D-fucosa
(DFUC), L-fucosa (LFUC), D-arabitol (DARL), L-arabitol (LARL), Gluconato (GNT), 2-Keto-Gluconato (2KG), 5-Keto-Gluconate
(5KG).
Anexos 119
ANEXO G: Resultados de la caracterización bioquímica de los aislados antagonistas endófitos mediante tiras API 20E
Beta-Galactosidasa (ONPG), Arginina Deshidrolasa (ADH), Lisina Descarboxilasa (LDC), Ornitina Descarboxilasa (ODC), Utilización
del Citrato (CIT), Producción de H2S (H2S), Ureasa (URE), Triptófano Desaminasa (TDA), Producción de Indol (IND), Producción
de acetoína (Voges-Proskauer) (VP), Gelatinasa (GEL), Fermentación/oxidación de glucosa (GLU), Fermentación/oxidación de
Manitol (MAN), Fermentación/oxidación de Inositol (INO), Fermentación/oxidación de Sorbitol (SOR), Fermentación/oxidación de
Ramnosa (RHA), Fermentación/oxidación de Sacarosa (SAC), Fermentación/oxidación de Melobiosa (MEL),
Fermentación/oxidación de Amigdalina (AMY), Fermentación/oxidación de Arabinosa (ARA), Citocromo oxidasa (OX).
ONPG ADH LDC ODC CIT H2S URE TDA IND VP GEL GLU MAN INO SOR RHA SAC MEL AMY ARA OX
EP5GM9 + + - + + - - - - + - + + - - + + + + + -
EP8B2M28 - - - - - - - - - - + - - - - - - - - - -
EP6G1M14 + + - + + - - - - + - + + - - + + + + + -
EP3B2M13 - + - - + - - - - - + - - - - - - - - - -
EP15G1M16 - + - - + - - - - - + - - - - - - - - - -
EP10G2M18 + - - - - - - - - + - - + - - - - - - - -
EP5B2M7 - - - - + - - - - - - - - - - - - - - - -
EP10G1M9 - + - - + - - - - - - - - - - - - + - - +
EP5G1M14 + - - - + - - - - + - + + + + + + + + + -
EP5B2M17 - - - - + - - - - - - - - - - - - - - - -
EP2G2M10 - + - - + - - - - - - - - - - - - - - - +
EP7G2M15 - - - - + - - - - - + - - - - - - - - - -
EP8G1M10 - + - - + - - - - - + - - - - - - - - + +
EP9G2M18 - + - - + - - - - - + - - - - - - - - + +
EP9G1M16 - + - - + - - - - - + - - - - - - - - + +
Anexos 120
ANEXO H: Resultados de la caracterización bioquímica de los aislados antagonistas endófitos – Mediante tiras API 50CHB
EP5GM10 EP2B2M7 EP4B2M16 EP1B2M1 EP1B1M8 EP1B2M4 EP3G2M4 EP2B2M14 EP4B2M18 EP3B1M4 EP5B2M21
0 + + + - + - + + - + +
GLY + + + - - - + + - + +
ERY - - - - - - - - - - -
DARA - - - - - - - - - - -
LARA + + + - + - + + + + +
RIB + + + + - + - - + + +
DXYL + + + - + - + - + + +
LXYL - - - - - - - - - - -
ADO - - - - - - - - - - -
MDX - - - - - - - - - - -
GAL - - - - + - + - + - -
GLU + + + + + + + + - + +
FRU + + + + + + + + - + +
MNE + + + + + + + + - + +
SBE - - - - - - - - - - -
RHA - - - - + - + - - - -
DUL - - - - - - - - - - -
INO + - + - - - - + - + +
MAN + - + - + - + + - + +
SOR + - + - - - - + - + +
MDM - - - - - - - - - - -
MDG + - + - - - - - - + +
NAG - - - + + + + + - - -
AMY - - + - + - - + - - -
Anexos 121
Anexo H: (Continuación)
EP5GM10 EP2B2M7 EP4B2M16 EP1B2M1 EP1B1M8 EP1B2M4 EP3G2M4 EP2B2M14 EP4B2M18 EP3B1M4 EP5B2M21
ARB + - + + + + - + - + +
ESC + + + + + + + + - + +
SAL + - + + + + - + - + +
CEL + - + - + - - + - + +
MAL + - + + + + + + - + +
LAC + - - - - - - - - + +
MEL + + + - - - - - - + +
SAC + - + + + - + + - + +
TRE + + + + + + + + - + +
INU - - + - - - - - - - -
MLZ - - - - + - + + - - -
RAF + - + - - - + - - + +
AMD + - + + - + - - - + +
GLYG + - + + - + - - - + +
XLT - - - - - - - + - - -
GEN + - - - - - - - - + +
TUR - - - - + - + + - - -
LYX - - - - - - - - - - -
TAG - - - - - - - - - - -
DFUC - + - - - - - - + - -
LFUC - - - - - - - - - - -
DARL - - - - - - - + - - -
LARL - - - - - - - - - - -
Anexos 122
Anexo H: (Continuación)
EP5GM10 EP2B2M7 EP4B2M16 EP1B2M1 EP1B1M8 EP1B2M4 EP3G2M4 EP2B2M14 EP4B2M18 EP3B1M4 EP5B2M21
GNT - - - - - - - - - - -
2KG - - - - - - - - - - -
5KG - - - - - - - - - - -
Glycerol (GLY), Eritritol (ERY), D- Arabinosa (DARA), L- Arabinosa (LARA), Ribosa (RIB), D- Xylosa (DXYL), L- Xylosa (LXYL),
Adonitol (ADO), ß-Metil-D-Xylosida (MDX), Galactosa (GAL), Glucosa (GLU), Fructosa (FRU), Manosa (MNE), Sorbosa (SBE),
Ramnosa (RHA), Dulcitol (DUL), Inositol (INO), Manitol (MAN), Sorbitol (SOR), 1-Metil-D-Manósido (MDM), 1-Metil-D-Glucósido
(MDG), N-Acetol-Glucosamina (NAG), Amygdalina (AMY), Arbutin (ARB), Esculin (ESC), Salicin (SAL), Celobiosa (CEL), Maltosa
(MAL), Lactosa (LAC), Melobiosa (MEL), Sucrosa (SAC), Trehalosa (TRE), Inulin (INU), Melecitosa (MLZ), Rafinosa (RAF), Almidon
(AMD), Glucógeno (GLYG), Xylitol (XLT), Gentiobiosa (GEN), D-turanosa (TUR), D-lyxosa (LYX), D-tagatosa (TAG), D-fucosa
(DFUC), L-fucosa (LFUC), D-arabitol (DARL), L-arabitol (LARL), Gluconato (GNT), 2-Keto-Gluconato (2KG), 5-Keto-Gluconate
(5KG).