CAPÍTULO 2 Métodos Histológicos

Métodos histológicos"El arte y la ciencia tienen su punto de encuentto en eI método."

Bulwer

La totalidad del conocimiento actual re-ferido a la estructura y la función de los or-ganismos biológicos tiene su fundamentoen los métodos necesarios para Ia investi-gación de las células y los tejidos. En algu-nos casos, los grandes avances en Ia com-prensión v el conocimiento fueron conse-^cuencia

directa del desa¡rollo de una nue-va técnica. La creación de la microscopiaelectrónica, los métodos de fracciona-miento celular, la inmunohistoquímica yIa tecnología del DNA son eiemplos claros.Es necesario contar con ciertos conoci-mientos respecto de los principios funda-mentales de los métodos aplicados conmayor frecuencia, para que el estudio de lahistología no sea tan sólo un aprendizaiede determinados hechos, sino que ademáspermita adoptar una postura crÍtica frenteá ellos. En consecuencia, se comenzará elestudio de Ia histología con un breve aná-lisis de las generalidades de los métodoshistológicos, si bien a menudo será de granutilidad revisar algunos de estos métodos,

relacionados con el estudio específico delas células y los teiidos.

En general, los métodos histológicos seclasifican en dos grupos: los que se basanen la observación directa de células y teli-dos vivos, y los que analizan materialmuerto o inanimado. En un lugar interme-dio se ubican las técnicas de aislamientode los componentes de células vivas me-diante métodos de cenfrifugación. En to-dos los casos se comienza con el análisismicroscópico, de importancia fundamen-tal para todos Ios métodos histológicos.

Ocular

Prisma

Estativo

Tornillomacrométrico

Tornillomicrométrico

oio

Tubo

Análisis microscópico

EI microscopio es el instrumento másimportante en la histología, debido al pe-ouéño tamaño de las estructuras analiza-das. Cabe destacar que cuando en este textose alude al término "microscopio" siemprese refiere al microscopio óptico, a menosque se especifique otra cosa.

Revólver

Ob¡etivo

Platina

CondensadorTornillo de centrado

Fil tro de luz diurnaBrazo del condensador

DiafragmaFig.2-1. Dibujo esque-mático que muestra unmicroscopio óptico co-mún. (Dibujo cedidogentilmente por Fa. CarlZeiss AG.)

C A P í T U t O

Lámpara Colector Espejo

MÉTODOS HTSTOLOGTCOS 1s

Cuando la luz atraviesa un material bio-lógico, por ejemplo un preparado histoló-gico, cambian sus características, y estasmodificaciones se hacen visibles median-te los sistemas de lentes. El ojo puede di-ferenciar variaciones de intensidad de laluz (contraste entre luz y sombras) y decolor (distintas longitudes de onda). Enconsecuencia, es necesario modificar laluz, para que el preparado se observe co-mo formado por elementos más oscuros ymás claros o de distintos colores. Las cé-lulas y los tejidos no coloreados se suelencaptar con el microscopio como carentesde color y transparentes, porque no pre-sentan suficiente contraste. Con la ayudade tinciones histológicas se logra uná ab-sorción diferencial de la luz, de modo quese visualizan las distintas estructuras.

Poder de resolución y aumento. Estosdos conceptos se emplean para determi-nar la utilidad de un microscopio v se de-ben diferenciar con claridad éntrá sí. Es

Apertura numérica y poder de resolución

La capacidad de refracción o índice derefracción de un medio se define comoIa relación entre la velocidad de Ia luzen el vacío y en el medio en cuestión.porlo tanto, el Índice de refracción es unamedida de la velocidad de dispersión deuna onda luminosa a través del medio,La luz se refracta al atravesar un obieto.El ángulo de refracción será tanto máyorcuanto más finos sean los detalles.

La aperfura numérica (NA) es una me-dida de la capacidad del microscopio deagrupar las refracciones de la Iuz produ-cidas por los detalles finos del objeto, da-do que expresa el tamaño del haz de luzque es captado por el objetivo después de

Fig.2-2. Este dibujo esquemático muestra lamitad del ángulo máximo (u) del haz de luzcaptado por el objetivo.

mucho más importante el poder de reso-lución d, que se define como 1o distanciamínima que debe existir entre dos puntosdel objeto para que se visualicen separa-dos. La calidad de una imagen (claridad yriqueza de detalles) depende del poder deresolución de un microscoDio.

El aumento se define como 1o rclociónentre el tamaño de Ia imagen y del objeto,en valores Lineales. El aumento no denen-de del poder de resolución, pero se tieneen cuenta esta propiedad al elegir el au-mento. En cuanto todos los detalles re-sueltos se visualizan con facilidad, todoaumento ulterior sólo hace más borrosa larmagen, porque no se incrementa el poderde resolución. La imagen no adquiere másdetalles y se habla de aumento vacío.

Microscopio óptico

El microscopio óptico está compuestopor partes mecánicas y ópticas. Los com-

haber atravesado el objeto, Se expresa co-mo N.A = n x sen u, donde n es el índicede refracción del medio que separa el cu-breobjeto del preparado de la lente fron-tal del objetivo, y u es la mitad del ángu-lo superior del haz de luz (fig. 2-2).

Como se vio antes, el poder de resolu-ción es función de Ia apertura numéricay de la longitud de onda de la luz utili-zada,X" (lambda). El poder de resolución(d) se puede expresar según la siguientefórmula:

0,61 x l,/'l -

NA

donde d es la menor distancia entre dospuntos que permite visualizarlos separa-dos. Nótese que cuanto menor sea d, tan-to mayor será el poder de resolución. Da-do que u no puede superar g0o, el senode u debe ser inferior a i.. En consecuen-cia, el NÁ móximo seró de alrededor de1,4, puesto que eI índice de refracción alo sumo se puede acercar a 1,b si sereemplaza el aire que separa el cubreob-jeto y el objetivo con aceite (denominadatécnica con aceite de inmersión para laque se emplean objetivos de inmersiónespeciales). La longitud de onda de laIuz empleada suele ser de alrededor de0,500 pm, que corresponde a la luz ama-rillo-verdosa, para la cual el ojo humanotiene especial sensibilidad. De este mo-do, se obtiene un poder de resolución deaproximadamente 0,25 pm.

20 METODOSHISTOLOGICOS C A P í T L

ponentes ópticos constan de tres sistemasde lentes: condensador, obietivo y ocular

retina del ojo del observador'El aurnento total resultante se determi-

na mediante el producto del aumento delobietivo por el aumento del ocular (even-tualmente se debe multiplicar por un fac-tor que depende del tubo).

E[ poder de resolución depende de lalongitud de onda de la luz utilizada y delas áperturas numéricas del objetivo y elcondensador (el ocular sólo actúa aumen-tando la imagen del obietivo, no meiora elpoder de resolución).

El móximo poder de resolución que sepuede obtener es de 0,2 ¡Jm, pero con lospreparados de rutina habifuales rara vez ex-cede de 0,5 pm.

Como se vio antes, los detalles resueltosse deben aumentar lo suficiente para poderser observados sin esfuerzo, lo cual se lo-gra con el aumento adicional del ocular.Pa¡a obtener el m¡áximo poder de resolu-ción, de alrededor de 0,2 pm, se requiereun aumento de unas 1.000-1.400 veces' da-do que el poder de resolución del ojo, a ladistancia normal de observación (25 cm)'es de aproximadamente 0,2 mm. Como re-gla mnómotécnica vale que, p¿Ira evitar eláumento vacío nunca se debe empleor ma'

Sobre la base del microscopio ópticocomún se han desarrollado varios micros-copios especiales, cada uno de los cualesprésenta ventaias y limitaciones específi-cas, según veremos a continuación.

Microscopio de campo oscuro

El microscopio de campo oscuro se uti-liza para analizar partículas pequeñas,que presentan muy escaso contraste conla microscopia óptica o que se encuentran

de en esta lente la luz desviada o esparci-da por las pequeñas partículas qu_e se_ de-sea investigar. Estas se observan lumino-sas sobre un fondo oscuro (del mismo mo-do que las partículas de polvo se visuali-z¿rn por la dispersión que realizan de laluz de un rayo de sol).

En histología se utiliza a menudo elc¿rmpo oscuro para el anólisis de prepara-dos radioautogróficos (véase más adelan-te), mientras que es una importante aplica-ción clínica la determínación de la espito-queto de la sífilis, el Treponemo pallídum.

Microscopio de conhaste de fase

Los teiidos no coloreados producen muyescaso contraste, dado que no absorbencantidades importantes de luz. Sin emba¡-go, producen cierfo retardo en las longitu-des de onda, de acuerdo con Ia "densidadóptica" variable de los teiidos, es decir, losdistintos índices de refracción. Este retrasovariable de Ias ondas sinusales producecierto desfasamiento entre ellas' Medianteel microscopio de contraste de fase es posi-ble transformoÍ estas diferencias de fose,no visibles, en diferencias de amplitud, esdecir, que las diferencias de refracción en-tre los componentes del tejido se transfor-man en diferencias de intensidad, que pue-den ser captadas por el oio humano. De es-ta manera es posible transformar en visiblescomponentes de las células wvos que, _deotra manera, sólo se observan en tejidosmuertos y teñidos (fig. z-3).

Fig.2-3. Se observan dos fotomicrografías (A yB) de las mismas células vivas (fibroblastosde cultivo de teiido), A obtenida con un mi-croscopio óptico común y B captada con unmicroscopio de contraste de fase. En la imagende contraste de fase se observan con clar¡dadel límite entre las células (flechas), el núcleo(A/), los nucléolos (Nu), mitocondrias alargadas(rVl), lisosomas redondos (L) y otros detallesque apenas se distinguen con el microscopioóptico común. (Según Novikoff y Holtzman.)

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cAP í ru to MÉToDosHtsroLÓctcos 21

Microscopio de interferencia

El microscopio de interferencia estáconstruido sobre la base de principios si-milares al microscopio de contraste de fa-se, dado que también en este caso se utili-zan las diferencias de fase producidas porla luz que atraviesa el objeto. Mientras queeI microscopio de contraste de fase sólo esun instrumento cualitativo, mediante elmicroscopio de interferencia es posibleobtener datos cualtitativos. Esto se lograal dividir la luz de una única fuente en doshaces luminosos, de los cuales uno se en-vía a través del objeto y el otro no se alte-ra, por lo que actúa como haz de referen-cia. Después se vuelven a unir ambos ha-ces, que interfieren entre sí del mismo mo-do que en el microscopio de contraste defase. El haz que atravesó el objeto sufre unretraso respecto al haz de referencia, es de-cir, sufre una modificación de fase. Dadoque el retraso es función del Índice de re-fracción y del espesor, el valor del retasose puede emplear para determina¡ la masapor unidad de superficie del preparado y,en consecuencia, Ia mosa de los elementoscelulares individuale s._ Una varia¡te especial del microscopiode interferencia es el microscopio de cón-traste por interferencia diferencial (tam-bién denominado microscopio de interfe-rencia de Nomarski), en el cual los dos ha-ces luminosos separados tienen polaridadopuesta, por lo que se aumenta el conhas-te y se obtiene una imagen de aspecto fridi-mensional del objeto investigado (hg. 2-a),

Microscopio de luz polarizada

Los componentes cristalinos y fibrososdel material biológico poseen una orienta-ción característica de las moléculas. Enconsecuencia, cuando se ilumina el obie-to con luz polarizada plana (luz que sólovibra en un plano), ésta se divide en doscomponentes con distinta velocidad, esdecir, desfasados entre sÍ. Se habla de es-tructuras birrefringentes o anisótropas (gr.on, no; isos, igual; frope, movimiento). Encontraste, se denomina estructuras isótro-pas a las que no dividen la luz polarizada,por lo que el índice de refracción es igualen todas direcciones.

Se obtienen datos referidos a la anisotro-pía del objeto mediante el microscopio deluz polarizada, llue se diferencia aél ml-croscopio óptico común por tener dos fil-

22 MÉTODOSHISTOLÓGICOS

ha¡ las modificaciones de Ia polarizaciónde la luz que ha atravesado el preparado.

I.a birrefringencia de un objeto depen-de de una estructura regular determináda.En las células y los tejidos puede ser unadisposición asimétrica regular de molécu-las o iones, por ejemplo, en cie¡tas inclu-siones celulares, birrefringencia cristali-na, o una distribución reqular de unida-des submicroscópicas aJimétricas, porejemplo, en Ias fibras musculares, biire-fingencia de forma. En consecuencia, me-diante el microscopio de luz polarizada esposible obtener información respecto a laestructura a nivel molecular. Además, elmicroscopio de luz polarizada se puedeutilizar para el estudio de células vrvos.

Microscopio de fluorescencia

Determinadas sustancias fluorescen, esdecir, tienen la particularidad de irradiarluz de otra longilud de onda (color) al ser

Fig.2-4. Fokde una célulaoído interno cmicroscopiorencia diferecroscopio decia de Nomavese el notabdimensional. >Morup Jorgen

C A P I T I ,

Submicroscópico

Por submicroscópico se entiende Ioque "está por debajo de la resolución delmicroscopio". La denominación está maldefinida y se aplica ocasionalmente conrespecto a las estructuras demasiado pe-queñas para ser reconocidas incluso con

iluminadas. La luz irradiada siempre pre-senta una longitud de onda más larga quela original. Algunos componentes biológi-cos (p. ej., la vitamina A) tienen fluores-cencia natural y se denominan autofluo-rescentes, mientras que otros adquieren Iafluorescencia después de un tratamientocon determinados colorantes fluorescen-¿es, por ejemplo fluoresceína, que emiteuna intensa fluorescencia verdosa al serirradiada con luz azul.

En el microscopio de fluorescencia seilumina el preparado con intensa luz de IaIongitud de onda capaz de activar el colo-rante fluorescente empleado. Esto se llevaa cabo mediante un filtro del color ade-cuado que se coloca por debajo del con-densador: así se filtra la luz antes de queincida en el preparado. Además, se colocaun filtro por encima del obietivo con uncolor correspondiente a la longitud de on-da de la luz que emite el colorante utiliza-do cuando fluoresce. De esta manera se lo-gra que la imagen se forme sólo debido ala emisión de la luz fluorescente. Las es-tructuras fluorescentes se destacan enton-ces en color sobre fondo oscuro (véase fig.2-14), como fuentes luminosas, por lo quees oosible visualizar estructuras de di-meñsiones mucho más pequeñas que elpoder de resolución del microscopio.

En los últimos años se ha observado unnotable incremento en el empleo de la mi-croscopia de fluorescencia, debido funda-mentalmente a la aplicación de colorantesfluorescentes que ie ligan a anticuerposespecíficos, que reaccionan con determi-nados componentes tisulares (véase másadelante en este capítulo).

Fig.2-5. lmagen de las células productoras deinsulina en los islotes de Langerhans del pán-creas, captada con microscopio de barridoconfocal. Se distinguen gránulos citoplasmáticosque contienen insulina mediante reacción con unaniicueroo fluorescente azul contra insulina, sedetermina la presencia de una molécula ligada ala membrana celular (denominada transportado-ra de glucosa) con un anticuerpo fluorescente ro-jo y se observa una molécula localizada sobre elnúcleo celular (llamada factor de transcripciónpara insulina) mediante un anticuerpo fluores-cente verde. (Cedida por L.-1. Larsson.)

el microscopio electrónico. Sin embargo,su uso más frecuente se aplica a estruc-turas demasiado pequeñas para ser de-tectadas con el microscopio óptico (laoalabra comenzó a utilizarse antes de laóra del microscopio electrónico).

Microscopio de barrido confocal

Una limitación de la microscopia defluorescencia radica en la necesidad deque todo el espesor del preparado emitafluorescencia, pero sólo es posible enfocarel objetivo en un plano del corte a Ia vez.En consecuencia, la luz emitida por fluo-rescencia desde zonas del preparado ubi-cadas por encima y por debaio del planofocal puede restar nitidez a Ia imagen. Me-diante el microscopio de barrido confocalse impide esta tendencia, dado que se ex-cluye Ia Iuz no emitida por el plano focal.EI preparado se ilumina por un rayo láserque barre todos los puntos del plano focal,mientras que la luz emitida por el prepa-rado atraviesa una hendidura muy estre-cha que detiene la luz emitida por otrosniveles, distintos del plano focal, De estamanera se logra obtener la informaciónnecesaria para formar una imagen bidi-mensional (fig. z-5) que se registra sobreuna pantalla de televisión. AI recoger conuna computadora una serie de imágenesde distintos planos focales es posible re-construir una imagen tridimensional delobieto.

C A P í T U t O METODOSHISTOLOGICOS 23

Microscopio de luz ultravioleta

Con el empleo de luz ultravioleta conIongitud de onda de alrededor de 2b0 nm,es decir, casi Ia mitad de la luz visible quese uti l iza habitualmente en el microsóo-pio óptico, en principio es posible dupli-car el poder de resolución (disminuir d ala mitad). El microscopio de luz ultravio-leta, cuyo sistema óptico suele estar cons-truido en cuarzo, permite el paso de la luzultravioleta, que es invisible. En conse-cuencia, Ia formación de la imagen se re-gistra en una película fotográfica.

Aunque se logra tn )igero aumentodel poder de resolución mediante estatécnica, la principal importancia del mi-croscopio de luz ultravioleta es que losdcidos nucleicos absorben la luz ultra-violeta de determinada longitud de onda(260 nm), por lo que se pueden detectarcon facil idad.

Microscopio electrónico

La construcción del microscopio elec-trónico representa un verdadero-logro encuanto a incrementos del aumento y delpoder de resolución. En principio se debea que se reemplaza la luz visible, de lon-gitud de onda de alrededor de 500 nm,por un haz de electrones de longitud deonda del orden de 0,005 nm. Dado que d(poder de resolución) es directamenteproporcional a l" (véase pág.20), en teoríala aplicación de un haz de electrones per-mite obtener un poder de resolución muyelevado. Como los electrones no Duedenatravesar las lentes de vidrio, es necesarioreemplazarlas por bobinas electromagné-ticas (denominadas lentes electromagnéti-cas). en cuyos campos electromagnóticoto electrostáticos se modifica el trayectodel haz de electrones, de modo similar acomo se refracta el haz de la luz visible enuna lente de cristal.

El esquema de construcción del mi-croscopio electrónico de transmisión(MET) se presenta en la figura 2-6 (la pa-Iabra transmisión se refiere a que los elec-trones ofrayiesan elobjeto). Se calienta uncátodo filamentoso del metal tungsteno(denominado filamento) en una atmósferade vacío, por Io que emite electrones queson acelerados hacia el ánodo debido auna diferencia de potencial de alrededorde 50-100 kV. Et ánodo tiene Ia forma deuna placa metálica con un orificio (deno-minado apertura) en el centro, a través delcual pasan algunos de los electrones, paraformar un flujo constante o haz de electro-nes. El haz de electrones se enfoca me-diante Ia lente del condensador en el pla-no del objeto, y la Iente del objetivo foimala imagen del objeto. La imagen obtenida


Cátodo

Ánodo

Lente condensadora

Objeto

Lente objetivo

Lente proyectora

lmagen

se aumenta por una lente proyectora, quecorresponde al ocular del microscopio óp-tico. Dado que el haz de electrones es in-visible, la imagen formada se registra porproyección sobre una pantalla fluorescen-te o una película fotográfica. Debido a laescasa movilidad de los electrones en elaire, todo el sistema debe estar en una at-mósfera de vacío.

La formación de Ia imagen en el mi-croscopio electrónico se debe, principal-mente, a la dispersión de los electrones.Así se dispersan los electrones que coli-sionan con los núcleos atómicos y con suselectrones en el objeto, a menudo de ma-nera tal que inciden por fuera de la lenteobjetivo. En consecuencia, la imagen so-bre la pantalla se forma por la ausencio deestos electrones, como "imagen en som-bra". La dispersión de los electrones de-pende del espesor del objeto y de su den-sidad molecular. En especial depende delnúmero atómico de loi átomos presentesen el objeto, dado que Ia dispersión obte-nida es mayor, cuanto más elevado sea elnúmero atómico. La mayoría de los áto-mos de las estructuras biológicas tienennúmero atómico bastante baio v contribu-yen muy poco a la formación

-de la ima-

gen, por lo que se adicionan átomos pesa-dos al preparar los materiales (véase másadelante).

Como se vio antes, el valor del microsco-pio electrónico radica en el gran poder deresolución que se puede obtener, de unos0,2 nm. No obstante, es importante diferen-ciar entre el denominado poder de resolu-ción del instrumento, que es del ordenmencionado y se puede iograr al analiza¡,por ejemplo, polvo metálico, y el denomi-nado poder de resolución del objeto. Esteúltimo es el poder de rcsolución que se

Fig.2-6. Dibtmático de unpio electrónil

C A P i T L

Fig.2-7. Dibujo esque-mático de un microsco-pio electrónico de barri-do. (De Hearle, Sparrow yCross.)

Valor del poder de resolución

Nótese que el poder de resolución asimple vista, a distancia normal de lec-tura, es de alrededor de 0,2 mm, paralos mejores microscopios ópticos, deaproximadamente 0,2 pm, y para losmejores microscopios electrónicos, deunos 0.2 nm.

puede lograr en la investigación de prepa-rados biológicos y es del orden de 2 nm, da-do que depende en gran parte de los proce-dimientos de preparación (véase más ade-lante). Con el poder de resolución prácticoque se puede obtener es posibie lograr ou-mentos útiles superiores a 500.000 veces.

El microscopio electrónico esIá limita-do por el escaso poder de penetración delhaz de electrones. Esto implica la necesi-dad de uti l izar cortes de teiido muy delga-dos (de alrededor de 50 nm). Esta l imita-ción se puede superar en pa-rte medianteel uso del denominado microscopio elec-trónico de alto voltaje, cuyo haz de elec-trones es alrededor de 10 veces más ricoen energía que el que se utiliza en los mi-croscooios electrónicos comunes. El mi'c.or"opio estereoelectrónico permite cor-tes de tejido más gruesos, ya que el mismopreparado es fotografiado desde dos ángu-los algo diferentes. Si después se analizanIas fotografías mediante un estereoscopiose obtiene un notable efecto tridimensio-nal, en el cual la profundidad es mayor,cuanto más grueso es el corte de tejido.

Otra limitación es el requerimiento deutilizor alto vacio, lo cual descarta inves-tigaciones en células vivas.

Microscopio electrónico de barrido

Hasta aquí se analizó el microscopioelectrónico estándar que, como se men-cionó, se denomina microscopio electró-

Fig. 2-8. lmagen de cilias de la tráquea cap-tada con microscopio electrónico de barri-do (Cedida por B. Holma.)

nico de transmisión (MET). Su contrapar-tida es el microscopio electrónico de ba-rrido (MEB) que, en principio y utilidad,es totalmente diferente de los microsco-pios óptico y electrónico de transmisión,pero que representa un importante suple-mento del MET. En el microscopio de ba-rrido los electrones no atraviesan el obie-fo, la imagen se forma indirectamente, através de Ia captación puntual de detallesen la superficie del preparado. El prepara-do se recubre de una delgada capa de unmetal pesado y se bombardea con un hazde electrones muy estrecho (de alrededorde 10 nm de diámetro), que "barre" sobreel objeto en un patrón lineal y lo copia(fig. z-z). Desde cada punto se emitenelectrones secundarios, de modo tal quela intensidad de Ia emisión secundaria va-ría según el ángulo con que incide el hazde electrones sobre la superficie. Este án-gulo depende de las irrógularidades delcontorno de la superficie. La emisión se-cundaria se mide con un detector ubicadocerca del preparado y adaptado a una pan-talla de televisión, cuyos rayos catódicosbarren en forma coordinada con el haz deelectrones "que iluminan". La imagen ob-tenida se visualiza directamente sobre lapantalla y se puede registrar en una foto-grafía o en forma digital.

El MEB forma la imagen de la superfi-cie y no es necesario utilizar cortes ultra-finos, dado que el haz de electrones noatraviesa el preparado . El poder de rcsolu-ción con la microscopia electrónica de ba-rrido só1o es de alrededor de 1.0 nm pero,en contrapartida, la nitidez de la imagenen profundidad es de hasta 10 veces la

Fuente deelectrones

Sistema delentes

"Scanner"(barredor)

Objeto

cAP i ru to

Pantalla de TV

MÉToDosHIjT)LÓGICOS 25

que se obtiene con el microscopio óptico.En consecuencia, se puede lograr unaimagen tridimensional definida de la su-perficie (fig. 2-B).

Microscopio de túnel de barrido(MTB)

Con este instrumento es posible captarla estructura de la superficie de un pre-parado hasta el nivel atómico. El princi-pio se basa en colocar una sonda delgadaa una distancia de hasta 1 nm, por deba-jo de la superficie del preparado. Se apli-ca luego un contacto eléctrico en el ex-tremo de la sonda, que al mismo tiempobarre por sobre la superficie del prepara-do. De este modo se crea un "túnel" deelectrones a través de la hendidura for-mada entre el preparado y Ia sonda.Mientras que ésta se desplaza por sobreel preparado, se mantiene constante lacorriente debido al movimiento automá-tico de la sonda hacia arriba y hacia aba-jo por las irregularidades de la superficiedel preparado. La información obtenidadurante estos movimientos se registra enuna computadora, Ia cual produce una"imagen" de la superficie del preparado.La microscopia de túnel de barrido per-mite, entre otros adelantos, obtener unaimagen de las dos hebras de Ia moléculade DNA.

La microscopia de túnel de barrido estálimitada por la necesidad de que el prepa-rado sea un conductor eléctrico.

Difracción de rayos X

La difracción de rayos X es un paso adi-cional en dirección a Ia resolución de de-talles cada vez más pequeños mediante laaplicación de rayos de longitud de ondamás corta. Los rayos X parecerían ser es-pecialmente adecuados para el análisismicroscópico, dado que se puede aumen-tar el poder de resolución, pero no existenlentes capaces de enfocar y sacar prove-cho de estas longitudes de onda tan cor-tas. En lugar de lentes se debe aplicar elanólisis matemótico,lo cual limita la uti-l idad.

El principio se basa en enviar un estre-cho haz de rayos X a través de Ia muestraque se desea analizar (fig. 2-9). El haz sesepara y se dispersa en un patrón de di-fracción (Iat. fractum, rotura) que se regis-tra en una película fotográfica ubicada pordebajo de la muestra. En la práctica sóloes posible utilizar la difracción de rayos Xen la investigación de estructuras muy or-denadas de naturaleza cristalina o semi-cristalina (de allí que, en ocasiones, se de-nomina cristalografía de rayos X) dadoque, en los demás casos, el patrón de di-


fracción obtenido es casi imposible dedescifrar. Incluso en las estruciuras orde-nadas la falta de imagen formada hace quese pierda información referida a las rela-ciones entre las fases y los rayos secunda-rios, por lo que el patrón de difracción nose corresponde con exactitud con el obje-to investigado. En consecuencia se debetrabajar con aproximaciones e interpreta-ciones, que sólo presentan la estructuramós probable.

Sin embargo, la difracción de rayos Xha tenido importancia fundamental en eIdesarrollo de la biología molecular y hapermitido obtener información esencialrespecto a más de 300 macromoléculas,entre ellas la mioglobina, Ia hemoglobinay el DNA.

Métodos de observación directade células y tejidos vivos

Si bien el objetivo de la histología es ladescripción y la comprensión de Ia es-tructura de las células v de los teiidos vi-vos, lamentablemente, por mot ivós técni -cos, a menudo ha sido necesario seguir elcamino de la investigación de tejidosmuertos y preservados. Los procedimien-tos utilizados implican muchas posibili-dades de modificación del aspecto de lasestructuras debidas a causas técnicas Vdejan sin respuesta numerosas incógnilasreferidas a los procesos celulares vitales.Además, es imposible lograr un controlmás directo sobre el medio que circunda ala célula y crear modificaCiones experi-menta les del mismo.

En consecuencia, existen claras venta-jas en el estudio de células y tejidos vivos;a continuación se verán algunos de losmétodos disponibles.

Fig.2-9. Dibrmático del pridifracción de(Según AmbeSmith.)

Haz de rayos X

C A P I T (

Fig .2-10 . D ibu los decultivo de teiido conec-t ivo embrionario. En ase observa el explantadocomo una masa centralnegra, rodeada del creci-miento más claro. b Y cmuestran el desarrollo aaumentos crec¡entes.(Según Leonhardt.)

- l

l m m 100 pm

b

Cultivo de tejido

El cultivo de teiido es un importantemétodo para eI estudio de poblaciones ce-lulares iivas fuera del organismo. El mé-todo se menciona a menudo como cultivoin vitro. dado que se refiere a frascos dereactivo o de vidrio (Iat. vitro, vidrio), adiferencia de in vivo, es decir, en el orga-nismo vivo.

En Ia actualidad, el cultivo de teiido seclasifica en tres categorías: 1) El cultivo decélulas comprende el cultivo de célulasaisladas, ya no organizadas en un teiido.Las células se pueden transportar a otrofrasco con medio de cultivo, a medida quecrece su número. z) El cultivo de tejidopor lo general comprende la transferenciade un trozo de teiido embrionario (gr.embryon, feto) o explantado a un mediode cultivo. Durante el cultivo crecen ex-crecencias celulares, que suelen ser de ti-po conectivo (fig. 2-10). mientras que iascélulas especializadas del órgano perma-necen en el explantado, donde mantienenalgunas de sus funciones características'3) El cultivo de órganos comprende ei ex-plantado de órganos embrionarios o ma-duros ltotalmente desarrollados), comoórganos completos o partes de ellos. Se in-

Inicios del cultivo de teiido

El cultivo de células eucariotas co-tnenzó a principios de este siglo, comoparte de lá investigación tendiente a de-terminar si los filamentos nerviosos cre-cían desde el cuerpo de la célula nervio-sa hacia el exterior o se formaban por fu-sión de una serie de secciones preforma-das del filamento. Ross Harrison colocópartes de médula espinal del sistemañervioso no desarrollado de una rana enun coágulo l infático y observó, con elmicroscopio, la clara formación directade filamentos netviosos, como prolonga-ciones del cuerpo celular. Otro pionero

tenta mantener la estructura del órgano ysus funciones normales, además de su po-sible evolución ulterior

Las primeras células de mamíferos quese observaron en estado vivo fuera del or-ganismo fueron las células sanguíneas'Eran de fácil acceso y se podían analizaral colocar una gota sobre un portaobieto,cubierta por un cubreobjeto, y sellar losbordes para evitar la evaporación. Si secalentaba a temperatura del cuerpo la pla-tina del microscopio se lograban condi-ciones muy cercanas a las del organismovivo. De esta manera se descubrieron losdistintos tipos de glóbulos blancos y suspropiedades de movimiento independien-ie y-de captación de partículas (véase cap.3). En Ia actualidad estos cultivos a cortoplazo de gtóbulos blancos tienen ampliaáplicación como e.l método mós simpleoara esludiar los cromosomas humanos(más detalles en el cap. 4).

Los estudios más prolongados y Ia in-vestigación de las céiulas en los tejidos or-ganizados u órganos recién fueron_po_si-bles después de la incorporación de loscultivos de teiido. Para los estudios decultivo de teiido se toma la muestra y semantiene estéril (libre de microorganis-mos vivos), porque los factores de creci-

fue Alexis Carrel, quien demostró, entreotros descubrimientos, que los extractos

diante el cultivo de tejidos.Esta técnica clásica de explantado in-

cluido en un coágulo ha experimentadonumerosas mejoras técnicas que incre-mentaron mucho las posibilidades deaplicación.

C A P I T U L O MÉTODOSHISTOLÓGICOS 27

miento también favorecen la formación debacterias y hongos. Después de obtener lamuestra se debe mantener el teiido en unasolución de composición similar a la delos Iíquidos tisulires. Mediante el trata-miento cuidadoso con enzimas digestivascomo tripsina y colagenasa, que degradanel material extracelular tendiente a man-tener unidas las células, se liberan lasuniones entre ellas. El proceso se facilitacon el agregado de sustancias que captancalcio, dado que los iones calcio son nece-sarias para Ia adhesión intercelular. Ade-más se efectúa una separación mecánica.De esta manera, el teiido obtenido se divi-de en células individuales.

Después del agregado de medio nutriti-vo se pueden mantener las células en uncultivo en suspensión, en el que flotan, ose pueden transferir a una superficie devidr io o de p lást ico, a l que sé adhieren.Sobre esta superficie crecen Ias células yforman una capa única, denominada mo-nocapa.

La composición del medio nutriüvo esde importancia crítica para el exito delcultivo de tejido. La meta ideal buscada hasido obtener medios sintéticos con compo-sición química totalmente definida y sin elagregado de sustancias orgánicas naturalescomo, por ejemplo, plasma sanguíneo. Es-te tipo de medio representa las mejorescondiciones para Ia investigación de la in-fluencia de distintas sustancias sobre elcrecimiento y la función de Ias células es-tudiadas, por ejemplo, factores de creci-miento bien definidos. Hasta el momento,Ios medios sintéticos desarrollados sólosatisfacen Ios requerimientos de creci-miento de muy pocos tipos celulares, dadoque la mayoría de las células y tejidos so-lamente se pueden mantener vivos duran-te corto tiempo sin el agregado de suero almedio. En estos últimos casos se habla demedios naturales. Un paso importante hasido Ia posibilidad de agregar antibióticosy disminuir así en gran parte el problemade las infecciones bacterianas en los me-dios de cultivo. La temperatura óptima pa-ra el cultivo de células es de alrededor de37,5.C para las células de los mamíferos(si bien varía en parte para distintos teji-dos). pero para mantener una poblacióncelular durante un período más prolonga-do es necesario recurrir al conqelamenlo.En condiciones normales. las cé'iulas mue-ren debido a la formación de cristales dehielo si se las enfría por debajo del puntode congelación pero, si se toman algunasprecauciones, es posible controlar la for-mación de cristales y entonces se puedencongelar y preservar en nitrógeno líquidoa -196"C durante meses o años. Si despuésse descongelan, estarán en condicionés decontinuar su crecimiento.


Mediante el cultivo de tejidos es posi-ble aislar clones celulares. Un clon celu-lar (gr. klon, rama, brote) es una poblaciónde células idénticas, originadas de Ia mis-ma célula por mitosis (división celular).El establecimiento de un clon celular. de-nominado clonación, se efectúa, en prin-cipio, a través del aislamiento de célulasindividuales, que después generan el clonpor cultivo. A su vez, el clon da origen auna línea celular pura, es decir, un culti-vo compuesto por un único tipo celular.Para muchas de Ias investigaciones que serealizan mediante cultivos de teiido es ne-

::;.".t" el empleo de líneas celulares pu-

También es posible aislar el tipo celularque se desea investigar a partir de unasuspensión mixta, que contenga distintostipos celulares. Un método especialmenteefectivo para este fin es Ia selección celu-lar activada mediante fluorescencia(FACS). Se utilizan anticuerpos que se fi-jan exclusivamente al tipo celular que sedesea aislar. A las moléculas de anticuer-po se le adiciona un colorante fluorescen-te (véanse más detalles más adelante) y seagrega la mezcla a la suspensión mixtá decélulas. El anticuerpo fluorescente se fijaexclusivamente al tipo celular que se de-sea aislar. A continuación se separan lascélulas fluorescentes mediante un cifo-fluorómetro de flujo.

En el cultivo de tejido es importante di-ferenciar enúe líneas celulares primarias vlíneas celulares establecidos.-Una líneácelular primaria aparece en el primer cul-tivo del tejido, denomínado cultivo prima-rio, inmediatamente después de la-obten-

por lo general, después de unas 50 divisio-nes celulares para las células humanas, yla mayor parte de las células mueren.

Por el contrario, las líneas celulares es-tablecidas pueden crecer en cultivos conelevada densidad de población. Una líneacelular establecida puede aparecer espon-tóneamente, es decir, sin causa conocida,debido a que algunas células del cultivoprimario retoma el crecimiento, tras Iocual suele continuar de esa manera. Si es-te tipo de línea celular se transfiere unas70 veces de un frasco de cultivo a otro, seconsidera establecido. Se dice que las cé-lulas que dan origen espontánéamente auna línea celular establecida han sufridouna modificación o transformación es-pontánea, donde las células transformadastienen capacidad para formarse casi sin in-hibiciones. Sin embargo, Ias células tam-bién se pueden transformar si se las expo-

C A P í T U

Fig. 2-11. Dibujo esquemático de hibridacióncelular. Se induce la fusión celular por agrega-do de virus Sendai, que favorece la formaciÓnde un heterocarion y de células híbridas cuan-do éste se divide.

ne a acc iones cancer ígenas como i r rad ia -ciones, agentes químicos o infecclones porvirus cancerígenos. Se obtene una l íneacelular establecida de este t ipo de célulastransformadas a part ir de un tej ido tumo-ral o de un cult ivo primario, después que

este últ imo ha sido expuesto a una accióncancerígena. Se puede entonces establecerun cultivo homogéneo de línea pura porclonación del cultivo primario. Las lÍneascelulares transformadas de crecimiento rá-pido y supervivencia ilimitada (ing' rm-mortal cell )ines) representan un materialespecialmente importante para las investi-gaciones experimentales.

Por último se verá el fenómeno de hibri-dación celular, de gran importancia en lainvestigación de células cultivadas. Las cé-lulas híbridas se forman por fusión celular,es decir, la unión de dos o más células. Lafusión celular se puede producir en formaespontónea, por eiemplo en Ia fecundación,cuando se unen las células sexuales mascu-Iinas y femeninas, pero también se demos-

Células HeLa

En 1954 se exffaio un tumor de endo-metrio de una mujer llamada HenriettaLacks. Una muestra del tejido tumoral seutilizó para generar una línea celular es-tablecida y se han cultivado estas célulastumoialeé desde'entonces. HenriettaLacks falleció al año siguiente peio, en su

tró, alrededor del año 1960, que ocurre enla formación de células híbridas en cultivoscelulares. Sin embargo, recién cuando pocodespués se descubrió que era posible lndu-crr la fusión celula¡ en los cultivos celula-res, mediante el agregado de ciertos virus

[el más usado es e] denominado virus Sen-doi, que incrementa la tendencia a Ia fusiónde lai membranas celulares), cobró real im-oortancia la técnica de Ia hibridación. Me-áiutrt" lu fusión de dos células diferentesdesde el punto de vista genético, la célulaformada contiene dos núcleos con distintocontenido genético, lo que se denomina he-terocarion (fig. 2-11). Algunas de las célu-las formadas tendrán capacidad para divi-dirse y los dos núcleos comienzan Ia divi-sión al mismo tiempo. A su vez, esto a ve-ces también da lugar a la formación de doscélulas, cada una de las cuales contiene unnúcleo. Este núcleo (en cada una de las doscélulas híbridas neoformadas) contiene unacopia de los cromosomas de ambas células;este tioo celular se denomina sincarion.

Entie otras apl icaciones, Ia hibridacióncelular ha contr ibuido a las investigacio-nes sobre el crecimiento de células tumo-rales. donde se han fusionado células nor-males con células cancerosas. La técnicatambién se ha ut i l izado para demostraroue las proteínas de ias membranas celu-láres t ienen capacidad para desplazarsedentro de estas últ imas, como se verá conmavor detal le en el capítulo 3. Una apl ica-ción muv especial es el desarrol lo de an-t icuerpos mónoclonales, cuya uti l izacióntiene gran importancia en las investiga-ciones inmunohistoquímicas (véase másadelante en este capítulo).

Para terminar con el tema de cultivo detej ido se puede decir que, si bien no esuna alternativa, representa una posibili-dad para realizar trabajos experimentalessobre teiidos humanos sin chocar con pro-blemas éticos.

Manipulación experimentalde células vivas

Además de las posibilidades experimen-tales de actuar sobre células y teiidos a tra-vés de las modificaciones del medio circun-

memoria, se denominaron células HeLaIas células cultivadas. En la actualidadse utilizan en cientos de laboratorios y,como la Iínea celular transformada másintensamente estudiada, han contribuidoa dilucidar numerosos interrogantes bio-lógicos y médicos importantes.

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C A P í T U t O METODOSHISTOLOGICOS 29

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Fig.2-12. Tinción supravital de macrófagosde teiido conectivo, por agregado de carmínde litio a un preparado de tejido vivo. Las partí-culas rojas de carmín de litio han sido fagocita-das por los macrófagos. x440.

dante relacionadas con el cultivo de teiido,existen va¡ios métodos para la manipula-ción más o menos directa de células vivas.

Tinciones vital y supravital. Algunoscolorantes relativamente inocuos son caD-tados en forma selectiva por determinadáscélulas yjyas. En consecuencia, la locali-zacíón del colorante se puede utilizar pa-ra detectar estas células o determinadasorganelas, a las que se une el colorantedespués de ser captado. De esta maneratambién se pueden identificar algunassustancias intercelulares.

Para Ia tinción vital se inyecta el colo-rante en el animal vivo. Para la tinción su-pravital se agrega el colorante a las célu-Ias o el tejido vivo después de su extrac-ción del organismo.

El azul tripón y el carmin de litio secomponen de partículas finas y han teni-do importancia definitiva para el estudiode la fagocitosis, es decir, la forma en quedeterminadas células captan partÍculasdel medio (frg. 2-12).

El rojo neutro y el verde lano se utilizanpara el estudio de los glóbulos blancos. Elverde fano tiñe selectivamente las mitocon-drias y el rojo neut¡o para identificar losdistintos subtipos de leucocitos.

La alizarina se une a la matriz ósea neo-formada y le confiere coloración roja. Latinción vital con alizarina ha sido muy

30 MÉTODOS HISTOLÓGICOS

Macrófagos que contienen carmín de litio importante en los trabajos sobre el meca-nismo de crecimiento óseo.

Micromanipulación mecánica. Nume-rosas técnicas, agrupadas bajo Ia denomi-nación micromanipulación o microciru-gía, se han desarroilado sobre la base delmicromanipulador. Este instrumento secompone de un microscopio, en el que elpreparado a estudiar se encuentra en unacámara húmeda de operación, sobre laplatina, En el micromanipulador se mon-tan agujas finas, ganchos o pipetas de vi-drio, cuyos extremos aparecen en el cam-po visual y que se pueden desplazar contanta precisión, que se pueden disecar lascélulas individuales con gran aumento.

Este método de disección ha incrementa-do el conocimiento de la naturaleza fÍsicade las células. Se ha demostrado que el pro-toplasma es viscoso y se han desplazado lasorganelas dentro de la células. También sepuede empujar el núcleo celula¡ dentro delcitoplasma y ha demostrado ser una vesícu-la deformable llena de líquido. Así, se pue-den hacer muescas en él al Dresionar conuna aguja. Con la microdiseición tambiénse demostró muy pronto la existencia deuna membr¿rna celula-r (fig. 2-13).

Fig.2-13. Fotomicrografías (a campo oscuro)de células huevo de rana vivas, que demuestrancómo se procede en la micromanipulaciónmecánica. En a se observan dos invaginacionesen la membrana celular producidas por presióncon dos microelectrodos. En b se visualizan losm¡croelectrodos después de atravesar la mem-brana celular hacia el interior del citoplasma Lamedida incluida representa 100 ¡rm. (SegúnKanno y Loewenstein.)

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C A P I T U

Fig. 2-1 4. Fotomicrogra-fía de una neurona de laretina captada con mi-croscopio de fluorescen-cia. Mediante un microin-yector se inyectó el colo-rante fluorescente amari-llo Lucifer directamenteen la neurona viva. Luegose sacrificó el animal y seefectuó un preparado his-tológico de la retina (Ce-dida por J. Zimmer.)

Los microelectrodos son pipetas muyfinas que contienen soluciones salinasconcentradas. Mediante la micromanipu-lación se inyectan éstas en las células, ydespués se puede medir la diferencia de

Fig,2-15 Fotomicrografía de una célula viva cap-tada con microscopio de contraste de fase. La cé-lula se encuentra en la etapa denominada metafa-se de una división celulat por lo que se observanclaramente los cromosomas. La línea clara angos-ta entre las dos flechas se forma por irradiacióncon un haz de luz ultravioleta de 3 pm de an-cho, que parece haber "desplazado" un corto seg-mento de una hilera de cromosomas paralelos.Esto se confirma al demostrar que los segmentosclaros de cromosomas ya no contienen DNA (me-diante investigación histoquímica, según.el méto-do de Feulgen). x900. (Según Bloom y Ozarslan.)

potencial eléctrico entre el interior de lacélula y el medio (fig. 2-13). De esta mane-ra es posible investigar los potenciales demembrana variables de los teiidos nervio-so y muscular.

Los microinyectores son una varianteespecial de microelectrodos y se puedenemplear para la inyección de cantidadesmicroscópicas (picolitros) de sustanciasdentro de las células. Una aplicación es-pecial es la inyección de un colorante quedifunde en las distintas partes del cito-plasma y que se hace fluorescente con elmicroscopio óptico. Con esta técnica esposible dibujar el contorno de cada célulaindividual en teiidos con estructuras muycomplicadas, por eiemplo, del sistemanervioso central (fig. 2-1'a).

Utilización de haces de rayos angostosy de alta energía. Mediante aparatos es-peciales es posible concentrat protonesén un haz de rayos con un diámetro de2,5 ¡tm, y con inadiación ultravioleta sepueden lograr diámetros de alrededor de1 ¡tm. Este microrrayo es tan angosto quepuede incidir y, en consecuencia, destruirIos componentes individuales del núcleocelular, por ejemplo, parte de un cromoso-ma (fig. 2-15). En el últ imo tiempo se hanutilizado especialmente los rayos lásercon este propósito.

Microcinematografia. Si bien esta téc-nica no implica en sí misma una manipu-lación direlta de células vivas, representaun método importante para su observa-ción. La microcinematografía (gr. kinema,movimiento) es una técnica que registraen una película (como imágenes vivas) looue se observa a través del obietivo de unmicroscopio, mediante una cámara de vi-deo. Tiene especial importancia para elanólisis de movimienúos cuando son de-masiado rápidos o lentos para poder serconsiderados directamente. Por ejemplo,con una aceleración de cien veces es posi-ble observar Ia división celular y, además,se ouede observar cómo se desplazan lasmiiocondrias dentro de Ia célulá viva.

Por el proceso inverso (frenando losmovimientos muy rápidos) es posibleanalizar, por ejemplo, Ios movimientos delas cilias.

Métodos de fraccionamientocelular

Mediante los métodos de fracciona-miento celular es posible separar los dis-tintos componentes celulares y mantener,al mismo tiempo, sus funciones. Por lotanto, los métodos de fraccionamiento ce-lular han jugado un importante papel enla resolución de la organización funcionalde la célula.


Centrifugación diferencial (centrifirga-ción dinámica). Este es el método más uti-lizado para la separación de organelas ce-lulares. Antes de la centrifugación se efec-túa una homogenizacíón. Se colocan pe-queños trozos de tejido en una soluciónadecuada (p.ej., de sacarosa) que contri-buye a mantener intactas las organelas yse opone a su tendencia a agruparse. Des-pués se coloca la solución con los trozosde tejido en un homogenizador, que pue-de tener la forma de un cilindro de vidrio,en el cual rota a gran velocidad una vari-lla de teflón (fig. 2-16). Los trozos de teji-do son aplastados por Ia fricción de la va-rilla contra las paredes del cilindro. Así serompen las membranas celulares y que-dan libres en la solución las organelás ylas inclusiones. Se pueden utilizar otrosmétodos para la homogenización de lascélulas y los tejidos, por ejemplo ultraso-nido. Después de unos minutos de reposose centrifuga el sobrenadante (lat. super-natant, flotante) con velocidad moderaday temperatura apenas superior a OoC. Des-pués de la sedimentación de las partículasmás pesadas se puede hacer sedimentarlas partículas con masa menor, mediantecentrifugaciones con velocidades crecien-tes. La identificación de una fracción y laevaluación de su grado de purezo, eí elcaso de los núcleos celulares, se puedeefectuar por microscopia de contraite defase. Las partículas más pequeñas (es de-cir, la mayoría) deben ser identificadasmediante microscopia electrónica de loscortes ultrafinos del sedimento sólido ob-tenido por centrifugación, el denominado"pellet". De esta manera se tiene la seguri-dad de que las fracciones no contienenmezclas de distintos tipos de organelas.

Centrifugación por gradientes de den-sidad (centrifugación equilibrada). Coneste método es posible obtener mayorcantidad de fracciones mós limpios quecon la centrifugación diferencial. Se ob-tiene el homogenizado como en el casoanterior y se agrega una solución de, poreiemplo, sacarosa. que contiene concen-traciones crecientes de sacarosa a medidaque se acerca al fondo, es decir, con den-sidad creciente. La centrifugación prolon-gada a gran velocidad hace que las partí-culas sedimenten en el sitio que les per-mite su densidad (se detienen cuando al-car:zan una "profundidad" equivalente asu propia densidad).

De esta manera se logra obtener fraccio-nes casi puras de núcleos, elementos nu-cleares, mitocondrias, lisosomas, riboso-mas, retículo endoplasmático y gránulosde secreción. Estos homogenados celula-res fraccionados, en los cuales los compo-nentes mantienen su función biológica, sedenominan sistemas libres de células. El

32 MÉTODOS HISTOLÓGICOS

estudio de estos sistemas libres de célulasha contribuido con gran parte del conoci-miento actual sobre Ia biología molecularde la célula, por ejemplo respecto a la re-plicación y la transcripción del DNA y ala síntesis de proteínas.

En años recientes, los métodos de frac-cionamiento celular han sido suplementa-dos con varias técnicas para la investiga-ción de macromoléculas, entre ellas dis-tintas formas de cromatografía y de elec-troforesis. Sin embargo, estas técnicaspertenecen más a la parte bioquímica dela biología celular y no se las incluirá enesta presentación general (se refiere al lec-tor a textos de biología molecular y bio-química), si bien es obvio que se hará re-ferencia a ellas en relacioñes relevantesde los próximos capítulos.

Preparación e investigaciónde t-eiidos muertos

El estudio directo de células v teiidosvivos sólo tiene aplicaciones l imiiadás. Esdifícil diferenciarlos distintos componen-tes entre sí con la microscopia de transmi-sión, dado que tienen iguál grado de re-fracción de Ia luz. Además, por lo generalel tejido presenta un espesor tal que Ia pe-netración de la luz es demasiado escasa.En consecuencia, se utiliza con muchamayor frecuencia el tejido muerto, que semantiene mediante acciones químicas in-mediatamente después de exiraÍdo y en-tonces se corta en secciones muy delga-das, denominadas cortes histológicos.Después de la t inc ión con d is t in tos colo-rantes se observan los cortes con el mi-croscopio óptico, dado que el mayor con-traste entre los componentes tisulares per-mite diferencia¡los. Es obvio que al prepa-rar los cortes histológicos se debe procu-rar mantener, en lo posible, el aspecto deIas estructuras en el organismo vivo.

Preparación de tejidospara microscopia óptica

Fiiación. Las células se matan con la fi-jación, pata detener los procesos celularesdinómicos con la mayor rapidez posible ymantener la estructura con ias mÍnimasmodificaciones posibles. Esto se logra conla insolubilización de los comDonentesestructura les de Ia célu la y la formaciónde enlaces cruzados. por la acc ión de d is-tintos agentes químicos, los fiiadores. Enel proceso de fijación se estabilizan lasproteínas, porque los fijadores favorecenla formación de enlaces cruzados entre lasmoléculas proteicas. De esta manera semantienen todas las relaciones entre lasestructuras como en la célula viva. Las

C A P I T U L O

Fig. 2-16. D¡bulo esque-mático del procedimientode fraccionam¡ento ce-lular (véase el texto paralos detalles).

oroteínas solubles se unen a las estructu-iales y se transforman así en insolubles.AI mismo tiempo se alcanza cierta fuerzamecánica, que posibilita los pasos si-guientes del proceso de preparación. Al-gunos fijadores como, por ejemplo, eI /or-maldehído y, en especial, el glutaraldehí-

Célula intacta

Ribosomas

do son especialmente efectivos en lo refe-rido a la fbrmación de enlaces transversa-les. Estos dos fijadores, junto con el tetró-xido de osmio, que también forma enlacest¡ansversales, son algunos de los agentesmás efectivos. Mantienen el aspecto de lacélula en condiciones muv similares a las

Centrifugación200.000 g, t hora

cAP í ru to 2 MÉToDosHtsroLÓctcos 33

que se observan con el microscopio decontraste de fase, como control de la es-tructura de las células vivas.

La fijación también produce la inactiva-ción de algunas de las enzimas celulares,las cuales de otro modo iniciarían la auto-digestión o autólisis y conducirían a ladegeneración post mortem (lat. mors,muerte). Además, se eliminan bacterias ymuchos otros microorganismos. que po-drían destruir el tei ido.

En la práctica, la f i jación se l leva a ca-bo por inmersión de un pequeño trozode tejido en el fiiador, apenas se haya to-mado la muestra. Es conveniente real i-zar la extracción del teiido mediantepinzas y una cuchi l la af i lada, y procurarno dañar el tej ido. Para los tej idos huma-nos, esto se puede efectuar durante pro-cedimientos quirúrgicos o por biopsia(gr. bios, vida; opsis, sin), es decir, unamuestra de tej ido extraída del organismovivo. De los tej idos accesibles directos,como la piel, se puede tomar la muestrapor corte con cuchi l lo, pero también esposible tomar muestras de órganos inter-nos como, por ejemplo, el hígado o el r i-ñón, mediante cánulas especiales. Lasb iops ias también se pueden ex t raer du-rante procedimientos como endoscopias(gr. endon, dentro; skopein, ver), es decirestudios internos de cavidades medianteun instrumento munido de una fuenteIuminosa, el endoscopio. Después de Iaextracción del tej ido se lo sumerge en elfijador, en la fiiación por inmersión, adiferencia de la fiiación por perfusión,que se puede apl icar a animales de expe-rimentación. En este caso se inyecta elf i jador en el torrente sanguÍneo del ani-mal vivo anestesiado y el f i lador l legapor vía hematógena rápidamente a todoel tej ido. De esta manera se Iogra matartodas las células de un órgano completoen forma casi instantánea después de in-te r rumpi r Ia admin is t rac ión d 'e ox Ígeno.y se obtiene una f i jación más rápida yuniforme. El método se apl ica en traba-ios muy ex igentes , por e jemplo prepara-dos para microscopia electrónica, en Iosque se destacan con nit idez incluso laspequeñas modif icaciones estructuralespost mortem.

Inclusión y corte. EI tejido fijado se cor-ta en secciones delgadas, que permiten elpaso de la luz. La mayoría de los prepara-dos para microscopia óptica tienen un es-pesor de alrededor de 5-10 ¡rm, para loque se requiere un micrótomo, instrumen-to similar, en principio, a una cortadorade fetas. Para obtener la consistencia ne-cesaria para poder cortar secciones tandelgadas es necesario incluir antes el teii-do en un mater ia l que, a l so l id i [ i carse . leconfiera suficiente dureza. Las sustancias


Fig.2-17. La ilustración muestra el coÉe detejidos incluidos en un micrótomo de parafi-na Tras el corte se reúnen los trozos en seriesobre una pequeña "cinta transportadora" y secolocan en el baño de agua caliente de la dere-cha para que se estiren A continuación semontan sobre portaobjetos y se procesan. So-bre la mesa se ven 7 bloques de parafina, enlos que se dist inguen los trozos de tej ido inclui-dos Cada bloque está f i jado a un pequeño cu-bo de madera que se ajusta al micrótomo du-rante el corte del bloque

adecuadas para este fin, los medios de in-clusión, son tipos de cera insolubles enagua, por Io géneral parafina. En conse-cuencia, antes de Ia inclusión, es necesa-rio deshidratar el tejido. Para ello se pasael tej ido por una serie de soluciones acuo-sas de efanol en concentraciones crecien-tes, hasta l legar al anhidro. El tej ido se su-merge entonces en un l Íquido miscible enetanol y parafina, por ejemplo xileno, pro-ceso denominado "aclaramiento". Des-pués del aclaramiento se coloca el tej idoen parafina líquida, que disuelve ei xilenoy penetra así en ei tejido. Al enfriar, se so-lidifica la parafina y forma, junto con eltej ido incluido, un bloque sól ido o "taco",que es lo que se secciona (f ig.2-17).

A pesar de los cuidados, se producenciertas modificaciones al procesar el taco.El alcohol y el xi leno exfraen grasas y elcalentamiento de la inclusión inactivamuchas enzimas; además, a menudo el te-j ido se contrae de modo perceptible. Paraevitar estos problemas, a veces se efectúaun corte por congelamiento de tejido fija-do o no. Un taco de tej ido congelado t ieneconsistencia suficiente para ser cortadoen un c r iós la to (véase f ig . 2 -33 . pág. a3) .

La técnica de congelación es tan rópidaque se pueden ob tener secc iones en pocosminutos. Se uti l iza, por ejemplo, para de-terminar si el material de una bioosia ex-traída en un acto quirúrgico es benigno omaligno. El resultado de la biopsia se ob-t iene mientras el paciente permanece

C A P í T U

lslote de

anestesiado, por lo que el cirujano puededecidir en el momento el alcance del pro-cedimiento quirúrgico.

Método de congelación-desecación.Con este método se intenta lograr que lavariación estructural y la extracción quí-mica sean las mínimas posibles, paraconservar la actividad enzimática. Secongela rápidamente el trozo de tejido yse lo coloca en una cámara de vacío a ba-ja temperatura, después se seca (se deshi-drata) por evaporación lenta (sublima-ción) del agua.

En la congelación-sustitución se efec-túa primero una fijación moderada y untratamiento con sacarosa, después unacongelación rápida del tejido y a conti-nuación una deshidratación a -B5oC enmetanol puro. Una vez eliminada el aguase transfiere el tejido a un medio de inclu-sión plástico adecuado, que se infiltramientras se incrementa gradualmente latemoeratura hasta alrededor de -20"C. Porúltimo se polimeriza por irradiación conluz ultravioleta el medio de inclusión,que se seca, y ya se puede cortar el tacoterminado.

Fig.2-18. Fotomicrografía que muestra las ga-mas de color del método de tinción histológicade uso más frecuente, la coloración con hematoxilina-eosina (HE). El corte de te¡ido esde páncreas, por lo que se distingue un ¡slotede Langerhans, con células cuyo citoplasma setiñe de color rosa claro con la eosina, y nume-rosos ácinos, con células cuyo citoplasma se ti-ñe de azul liláceo con la hematoxilina en la zo-na basal y de rosa con la eosina, en la porciónaoical. x660.

El método es muy poco agresivo con eltejido y es apropiado para muchos proce-dimientos inmunohistoquímicos (véasemás adelante).

Coloración. Los cortes de teiido se sue-len montar sobre portaobjetos y se colo-rean. La mayoría de los colorantes histoló-gicos se utilizan en solución acuosa, porIo que los cortes incluidos en parafina de-ben ser "desparafinados", mediante untratamiento con xileno, y rehidratados porpasajes por concentraciones decrecientesde alcohol en agua, antes de ser teñidos.Los cortes por congelación se pueden tra-tar con las soluciones acuosas inmediata-mente después de seccionados.

La mavór Darte de los métodos de tin-ción histblógicos se desarrollaron en fun-ción de su capacidad para teñir selectiva-mente los distintos componentes tisula-res. El método de tinción más utilizado esIa combinación de hematoxilina y eosina(HE), que tiñe los componentes nuclearesde azul violáceo, mientras que casi todaslas estructuras citoplasmáticas adquierenuna tonalidad rosada (fig. 2-18). En con-secuencia, la tinción con HE muestra connitidez la forma y la estructura del nú-cleo, además de ia forma y la extensiónde la célula. Cabe destacar, sin embargo,que la tinción histológica es un procedi-miento químico y que se ha producidoun gran desamollo en los métodos que in-forman sobre Ia composición química delas células y los tejidos. Esto se verá conmayor detalle en la sección sobre histo-química.

Después de la tinción, por Io general sedeshidrata y se aclara nuevamente lamuestra de tejido y entonces se monta, esdecir, se cubre con una gota de medio demontaje transparente (Depex, Eukitt). Porúltimo se coloca un cubreobjeto para pro-teger el preparado. Algunos medios demontaje son miscibles en agua, por Io quese puede montar inmediatamente, sin ne-cesidad de deshidratación y aclaramiento.

Preparación de tejidospara microscopia electrónica

Debido al poder de resolución muchomayor del microscopio electrónico, en es-te caso se agudizan las exigencias de man-tener las estructuras originales del tejido.Para la fijación se suele utilizar glutaral-dehído. También se puede emplear feúró-xido de osmio que, además de fijar el teji-do, se une con las membranas lipoprotei-cas y así logra mayor contraste en Ia ima-gen del microscopio electrónico. Esto sedebe al aumento de la dispersión de elec-tlones por la membrana, a causa del eleva-do número atómico del osmio. En conse-cuencia, se habla de "tinción" o contras-

cAP í ru to MÉToDoSHISTOLÓGICOS 35

Fig .2-19 . lmacorte ultrafin(con microscotrónico, aume13.000 veces.muestra la partúbulo renal, ycon claridad urdel túbulo comdeada de partrcélulas vecinalgran riqueza dque facilitan lación de organesrones, por elecondrias (A/). (A B Maunsba<

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tado. EI contrastado con osmio se emoleaa menudo después de la f i jac ión con g lu -taraldehído, que por sí misma no aumen-ta el contraste.

Después de la fijación se deshidrata yse incluye el teiido. Para la inclusión sesuelen utilizar resinas epoxi v distintosmoteriales plr isLicos. que adquieren grandureza después del secado y permiten lasección de cortes ultrafinos.


EI haz de electrones se detiene con faci-lidad, por lo que 1os cortes de tejido utili-zados no deben exceder de 20-100 nm.Desde el punto de vista técnico, el cortede estas secciones ultrafinas es muy di-f Íci l y se necesita un ultramicrótómo.con una cuchi l la de vidrio o de diaman-te. El corte se controla con un microsco-pio y se aumenta el contraste mediantee l pasa ie ráp ido de las secc iones por una

C A P I T U

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Fig.2-2O. Fotomicrograf ía de un corte semif¡'no de tejido de riñón Tras la fijación se incluyóel tejido en plástico y se cortó en secc¡ones de'I

¡rm de espesor, que se colorearon con azulde toluidina x660

solución de acetato de urani lo. Por logenera l no es necesar io e l im inar e l p lás-t ico de inclusión, dado que es homogé-neo y transparente, y además estabi l izael preparado durante el anál isis con elmicroscoDio. Los cortes ultraf inos semontan después de la sección sobre unpequeño ret iculado de cobre, denomina-do "gri l la", que suele estar cubierto poruna película plást ica de sostén muy del-gada. En la observación microscópica(f ig. 2-19), el haz de electrones atraviesael corte por Ios ori f icios de la gri l la.

La gran cal idad técnica que se obtienecon Ia preparación de tej idos para la mi-c roscop ia e iec t rón ica también se ap l i capara la mic roscop ia óp t ica , con los cor -tes semif inos, de alrededor de 1 ¡rm deespesor , y la pos ter io r t inc ión con, pore jemplo , azu l de to lu id ina ( f ig . 2 -20) . Seusa azul de toluidina por su capacidadpara penetrar en los medios de inclu-sión de resinas eDoxi. io cual no ocurrecon los colorantes histológicos comu-nes. Los cortes semif inos también sepueden seccionar después de ser inclui-dos en resinas acrí l icas (en Iugar de re-sinas epoxi), que dan resultados de cal i-dad muy similar y permiten Ia t inción,por ejemplo, con hematoxi l ina y eosina( f ie. 2-2t) .

Congelación y fractura (ing. freeze-cleaving o freeze-fracfu¡e). Es una técni-

Fig.2-21. Fotomicrografía de la córnea Es uncorte semif¡no de tej ido incluido en resinaacrí l ica y teñido con hematoxi l ina-eosina. x440.

ca nueva que se ap l i ca a la inves t igac iónde te j idos por mic roscop ia e lec t rón ica .Consiste en congelar rápidamente el te-j ido en nitrógeno l íquido y luego colo-carlo en vacío, para después fracturarlocon un cuchi l lo o navaia (de modo simi-lar a como se parte un ladri l lo). Se colo-ca entonces vapor de plat ino sobre la su-perf icie de fractura, en ángulo incl ina-do, lo que forma una delgada planti l lade plat ino de esa superf icie, o répl ica,or¿e acentúa las formas del relieve. Ser-efu".ru entonceé la répl ica de plat inomediante la apl icación de partículas decarbón. A continuación se el imina el te-j ido con un ácido fuerte y se monta Ia ré-pl ica de plat ino sobre una gri l la, para laobservación con el microscopio electró-n ico de t ransmis ión , dado que e l hoz deelectrones es capaz de atravesar la répl i-ca de lsada.

Las ventajas del método son evitar lasacciones de los fijadores químicos y de losmedios de deshidratación y de inclusión,por Io que se han podido comparar las es-tructuras de los tejidos fijados y no fijadoscon el microscopio electrónico (f íg. 2-22).El método tiene aplicación especialmenteimportante en la investigación de las es-tructuras internas de las membranas (véa-se con más detal le en el cap. 3).

EI ooder de resolución es de alrededorde 3 nm.

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C A P I T U L O METODOSHTSTOLOGICOS 37

Métodos histoquímicos

El elemento fundamental de los méto-dos histológicos es Ia utilización de ac-ciones físicas y químicas sobre prepara-dos histológicos, paÍa determinar la lo-ca]ización de sustancias químicas en lascéIulas y Ios tejidos. Para ia histoquímicaes esencial la Localización, dado oue elempleo de cortes de tejido puede dlr in-formación sobre la localización, imposi-ble de obtener por determinacioneibio-químicas obtenidas de homogenados deteiidos.

Antes de la reacción histoquímica en síes necesario efectuar una lijación y unapreparación adecuadas, que conserven lasustancia química estudiada y las estruc-turas celular y tisular. Los lípidos son so-Iubles en solventes orgánicos como el xi-leno, por lo que se deben evitar cuando seestudian esos compuestos. Debido a la ac-ción desnaturalizante de los agentes fija-dores sobre las proteínas, la mayoría delas enzimas se inactivan con la fiiaciónpero. por otra parte. algunas enzimas son


solubles y se pierden si no se lleva a cabouna fijación previa a la determinación his-toouímica.

La reacción histoquímica debe inducirla formación de un producto insolublevisible. En consecuencia, debe ser colo-reado o poder transformarse en fluores-cente. Para Ia microscopia electrónica esnecesario que posea

-electrondensidad

suficiente.Se debe considerar la sensibilidad de Ia

reacción histoquímica, dado que los re-sultados negativos no se pueden interpre-tar de inmediato como ausencia de la pro-piedad buscada. Es posible que la canti-dad presente sea demasiado pequeña paraser detectada, o que la sustancia se hayaperdido o modificado durante la prepara-ción previa.

Se pasa gradualmente de los métodosde tinción morfológicos a los procedi-mientos histoquímicos más específicos.Por lo tanto, se verán primero algunasreacciones más generales antes de anali-zar los principales métodos histoquími-

Fig.2-22. lmiréplica de unrealizado porción y fracturcon mrcroscctróníco. La imtra una célulaplexo coroidecse ooservan cel nucleolemaros. x22.400. (B. Van Deurs.)

C A P I T L

Acidofilia y basofilia

Para obtener suficiente contraste de co-lor en los cortes histológicos comunes,por lo general se emplean combinacionesde colorantes ácidos y básicos. Tradicio-nalmente se denomina acidofilia (g..f-1ern, amar) a la capacidad de tinción deIos colorantes ócidos y basofilia ala capa-cidad de tinción de los colorantes bósicos,pero la designación de colorantes "óci'dos" v "bósicos" proviene de la era clási-ca de la histologíá, cuando las definicio-nes de ácidos y bases diferían de las ac-tuales (un ácido es una sustancia capaz deIiberar un protón y una base es una sus-tancia capaz de aceptar un protón). En ellenguaje /risfoquímico, un colorante áci-do (aniónico) tiene capacidad para formarun enlace electrostático (ionógeno) conun grupo tisular con carga positiva. Encontraste, un colorante básico (catiónico)ouede formar un enlace eléctrostático conün grupo tisular con carga negativa.

Así, las uniones entre colorantes ócidos(aniónicos) y bósicos (catiónicos) y losgrupos tisularcs tienen, esencialmente,características electrostó.ticos. En un cortede tejido, el esqueleto proteico y muchasotras macromoléculas contienen gruposionizables, capaces de formar enlaceselectrostáticos con los colorantes. Las dis-tintas proteínas de un corte de teiido tie-nen diferentes puntos isoeléctricos, dadoque varían las composiciones de amino-ácidos. Para las tinciones histológicas co-munes se utiliza un pH del que se conocepor experiencia su buen contraste de co-/o¡. Con el pH elegido, algunos compo-nentes tisulares son acidófilos, mientras

que otros serán basófilos (fig. 2-18), perosiempre en rcIación con el pH, A pH neu-tro, el DNA y el RNA presentan fuerte ba-sofilia, debido a la disociación de los gru-pos fosfato de las moléculas (fig. 2-23).Con ese mismo pH, la mayoría de las pro-teínas citoplasmáticas son acidófilas.

Cuando se desea analizar si la basofiliase debe a los ácidos nucleicos de, por ejem-plo el RNA, antes de la tinción se puedetratar el corte control con Ia enzima ribonu-cleasa. De esta manera se elimina el RNAdel corte control, por lo que las zonaó ricasen RNA ya no serán basófilas. El DNA seidentifica de modo similar, con Ia aplica-ción de la enzima desoxirribonucleasa.

Con la fijación se modifican las propie-dades de las proteínas, debido a la desna-turalización, y el resultado es un aumentode la afinidad por el colorante.

Para algunos métodos de tinción, porejemplo Ia coloración tricrómica de Ma-llory, se utilizan varios colorantes, todosácidos, que tiñen distintas estructuras tisu-lares. Se desconoce el fundamento químicode Ia unión entre los colorantes y los com-ponentes tisulares, debido a que estos mé-iodos no son específicos, desde el punto devista histoquímico. Por el contrario, se de-nominan selectivos cuando tiñen determi-nados componentes tisulares (fi9. 2-2a).Los métodos de tinción selectivos tienen

Flg.2-24. Fotomicrografía de un preparado dela cápsula de un órgano, coloreado por el méto-do de Mallory. Se observa una tinción selecti.va, dado que, entre otras, las numerosas fibrascolágenas del tejido conectivo se colorean deazul intenso. x275.

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Fig. 2-23. Fotomicrograf íade un corte de la médulaesoinal teñido con tionina.En el centro de la imagense distingue una neurona(una célula motora del as-ta anterior, n) con nucléo-lo basófilo y cúmulos ci-toplasmáticos muy ba-sófilos. x440.

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cAP í ru to

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MÉToDoSHISTOLÓGICOS 39

Metacromasia(rojo) Ortocromasia (azul)

Fig.2-25. Dibujo esquemático de la metacro-masia, que muestra la agregación de las molé-culas de colorante sobre la suoerficie de un oo-límero pol ianiónico de elevado peso molecular(p. ej. , un glucosaminoglucano en un cartí lago)con viraje del color azul del colorante a violetarojizo. (Según Bradley y Wolf )

gran valor práctico, dado que el mayor con-traste de color facilita la identificación delos distintos componentes del tejido.

Metacromasia

Cuando se tiñen ciertos comDonentestisulares, como por ejemplo, la mátriz car-tilaginosa, con el colorante azul de tolui-dina, se modifica el color azul a púrpura orojo violáceo por unión con el tej ido. Estavariación cromática se denomina meta-cromasia (gr. meta, variación; kroma, co-lor) y los colorantes capaces de sufrir estatransformación se denominan colorantesmetacromáticos. Pertenecen a este tipo deagentes ciertos colorantes básicos, de loscuales los más importantes son los deriva-dos t iazínicos azul de toluidinay t ionina.

Una solución diluida de un colorantetiazínico es azul, debido a que se encuen-tra como monómero. Si la solución esconcentrada, el colorante se agrega y for-ma polímeros, por lo que el color vira alrojo. Así, un colorante tiazínico puedepresentar distinto color, de acuerdo con eIestado de agregación de las moléculas yes precisamente este estado de agrega-ción, que puede ser modificado por loscomponentes tisulares, el que produce lametacromasia. Si se tiñe un corte con unasolución diluida de azul de toluidina, es-te colorante catiónico forma enlaces elec-trostáticos co.n los sitios aniónicos V, porlos componentes t isularer

"upaces á"'r"t

teñidos metacromáticamente (hay poli-aniones de alto peso molecular), se agre-

40 METODOSHISTOLÓGICOS

gan las moléculas del colorante (fig.2-25).En consecuencia, el colorante vira a rojo.

Los componentes tisulares que se colo-rean por metacromasia son, en su mayorparte, los muy ócidos glucosaminogluca-nos sulfatados de Ia matriz cartilaginosa(fíg. 2-26) y los mastocitos del tejido co-nectivo, que contienen la sustancia po-lianiónica heparina. Las nucleoproteínaspresentan metacromasia moderada.

Métodos basados en la reacciónde Schiffpara grupos aldehído

EI reactivo de Schiff es la leucofucsinaformada por el tratamiento del coloranterojo fucsina con bisulfito. La Ieucofucsinaes incolora, pero forma tn producto deadición estable rojo con los grupos aldehído. Esta reacción se incluye como paso fi-nal de dos importantes métodos de tin-ción histoquímicos: la reacción del ácidoperyódico-Schiff para compuestos ricosen hidratos de carbono y la reacción deFeulgen para DNA.

Método del ácido peryódico-Schitr (PAS).La reacción de PAS se emplea para deter-minar la presencia de macromoléculas ri-cas en hidratos de carbono como el slucó-geno y )as glucoproteínas.

El principio del método de PAS se basaen que el ácido peryódico (HIO*) oxidaprimero los grupos hidroxilo Iibres de dosátomos de carbono adyacentes, por lo quese transforman en grupos aldehÍdo. Almismo tiempo se escinde la unión entrelos átomos de carbono, por lo que se detie-ne la oxidación. Los grupos aldehÍdo neo-formados reaccionan entonces con el

Sit io de unión en elpol ianión

Molécula decolorante

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Fig.2-26. Fotfía de un cortequea teñido crxi l ina-eosina, rtra un ejemplrcromasia. La¡ntensamentecea de la mitade la imagen rhial ino (c), cu1basal se tiñe trcromas¡a. x1 1

C A P I T I

Fig, 2-27. Fotomicrogra-fía de una t inción con elmétodo de PAS de unpreparado de la mucosadel intestino delgado. Enel epitel io se dist inguencélulas cal ici formes de tcolor rojo intenso, que Acontienen secreción(una glucoproteína) quese tiñe con la reacciónde PAS. x275

Fig.2-28. Muestra elprincipio del método deFeulgen, en el que losgrupos púricos del DNAson el iminados por hidró-l isis ácida débil .

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reactivo de Schiff, para dar lugar a la apa-rición del color roTo magenta característi-co (fig. 2-27).

Varios componentes tisulares reaccio-nan con el método de PAS, se dice queson "PAS-positivos", como se verá en lospróximos capítulos.

Para determinar si una sustancia PAS-po-sitiva está compuesta por glucógeno se tra-ta un prepa-rado control con la enzima ami-loso, que escinde el glucógeno específica-mente, antes de realizar la tinción de PAS.

Método de Feulgen. Es un método espe-cífico para la determinación histoquímicade DN,4, sobre la base del contenido dedesoxirribosa en el DNA. Se eliminan losgrupos purínicos del DNA por medio deuna hidrólisis ácida suave. De esta mane-ra se abre el anillo de Ia desoxirribosa y seforma un grupo aldehído [fig. 2-28), que

I- o - P - o :IoI

O HI- o P - O :IoI

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Fig.2-29. Fotomicrografía de un preparado delextremo de la níz de una cebolla, teñida con elmétodo de Feulgen, específico para DNA Só-lo se t iñe de rojo la cromatina del núcleo (quecontiene DNA). El color verde del ci toplasma sedebe al coloranle de contraste verde claro En-tre olras, en el centro de la imagen se dist ingueuna célula en mitosis (división), donde los cro-mosomas están bien teñ¡dos x440

reacciona con el reactivo de Schiff, conaparición del color rqo característico en elsit io que corresponde al DNA (f ig. 2-29).Como conf¡oi se utilizan cortes tratadoscon Ia enzima desoxitibonucleoso antesde la t inción de Feulgen.

Por Io general, Ios materiales positivospara Feulgen se limitan aIa cromatina nu-c}eo¡. Como se verá, en el capítulo 3, lasmitocondrias poseen DNA, pero en canti-dad demasiado pequeña para ser detecta-da con el método de Feulgen.

Determinación histoquímica de lípidos

Después de Ia fijación de los lípidoscon formalina se cortan secciones conge-)adas,para evitar Ia extracción de los l ípi-dos mediante solventes orgánicos. Para lademostración histoquímicase uti l izanmuy a menudo los denominados coloran-tes Sudán. Son casi insolubles en agua,por lo que se utilizan disueltos en alcoholdiluido, que no disuelve las grasas. La"tinción" se oroduce cuando Ias molécu-las del coloránte se distribuyen entre \oslÍpidos y el solvente, en relación coiles-pondiente a Ia solubilidad en los dos me-dios. Pare evitar la extracción del coloran-

C A P I T U L O MÉToDosHI}T)LÓGICOS 41

Fig. 2-30. Fotomicrografía de un corte congela-do de tejido adiposo teñido con rojo Sudánpara los lípidos de los adipocitos (se usó "LightGreen" como colorante de contraste). x440.

te y los lípidos se incluyen los cortes, des-pués de la tinción, en un medio acuoso.

De este modo, Ios colorantes Sudán ti-ñen con intensidad los triacilgliceroles,como por ejemplo, en la tinción de losadipocitos con roio Sudán (fig. 2-30). Elnegro Sudán tiene gran utilidad en Ia tin-ción de las voinas de mielina de las fibrasnerviosas, compuestas por lipoproteínas.

Determinación histoquímica de enzimas

Las enzimas tienen vital imoortancia enel metabolismo celular, dadoque actúancomo catalizadores biológicos de casi to-das las reacciones químicas celuia¡es. Enconsecuencia, es muy importante conocercon exactitud Ia localización histoquímicade las enzimas. Entre los numerosos méto-dos enzimohistoquímicos, algunos tam-bién se pueden utilizar para el microsco-pio electrónico. En estos casos se requiereun producto electrondenso, compuestopor cantidad suficiente de partÍculas pe-queñas para sacar provecho del gran poderde resolución del microscopio electrónico.

Las sustancias que son escindidas oafectadas de alguná manera por las enzi-mas se denominan sustratos. Las enzimasse caracterizan por la especificidad de sus'trato. Así, en muchos casos una enzima ac-túa sólo sobre un único sustrato. Es Dreci-samenle en Ia especificidad de sustraio quese basa la localización histoouímica exactade fas enzimas. dado oue de dislintas ma-neras se obtiene un producto de reacciónvisible que se exprcsá en eI sitio de Ia reac-ción y señala Ia localización de Ia enzima.

Para muchas enzimas, la reacción his-toquímica se puede describir de la si-guiente manera: A es el susfuoto, que seescinde a B + C. Se agrega un reactivo R,


enztma

A ----------------

R

B R ü + C

capaz de formar un complejo insolublec o n B o c o n C [ f i g . 2 - 3 1 ) .

La reacción enzimática se producecuando los cortes se incuban, es decir, secolocan en un líquido que contiene losreactivos necesarios para determinar laactividad enzimática en cuestión.

En el esquema de reacción de la figura2-31, por lo general B.R es incoloro y des-pués de la incubación suele sufrir unairansformación secundaria para dar unprecipitado coloreado, que se observa conel microscopio óptico (f ig. 2-32).

Dado que casi todas las enzimas sonproteínas, Ia mayoría de los fijadores dis-minuye la actividad enzimática, aunqueen grado variable para las distintas enzi-mas. Se conserva la mayor parte posiblede Ia actividad enzimática cuando se sec-cionan en un crióstato cortes congeladosde tej ido no f i jado, entre -10oC y -ZO"C(f ig. 2-33), aunque con el r iesgo de que Iaenzima se extraiga por dilución, cuandose descongele el corte. La f i jación impideo inhibe esta extracción.

Métodos inmunohistoquímicos

EI organismo está en condiciones dereaccionar ante sustancias extrañas o antí-

Benos, y formar anticuerpos especÍficos,que se unen con los antígenos. Por lo gene-ral actúan como antígenos las macromolé-culas proteicas o polisacáridas. Los anti-

Fig. 2-32. Fotomicrografía de la determinaciónde fosfatasa ácida mediante métodos histo-químicos en un corte de tejido renal. Dentro delas células, la fosfatasa ácida está localizada enorganelas redondeadas denominadas lisoso-mas que, en consecuencia, se identifican en la¡magen como granos o esferas negras x870.

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Fig .2-31 . E l rmuestra la forhabitualmentela reacción hcon una enziel texto para lr

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C A P I T I

Fig. 2-33. La ilustración muestra el corte detrozos de tejido en un cr¡óstato. En principiose trata de una cámara fría, en la que se ubicaun micrótomo, que se opera a través de dos ori-f icios en la parte anterior; el corte se vigi la poruna ventana calefaccionada Los cortes de teji-do se congelan instantáneamente al ser extraÍ-dos y se mantienen así a temperatura bajaconstante (p ej -204C), durante todo el proce-so de corte, lo que reviste espec¡al ¡mportanc¡aen enzimohistoquímica

cuerpos son proteínas producidas por lasdenominadas células plasmáticas y circu-Ian por Ia linfa y Ia sangre. Las céluias pro-ductoras de anticuerpos pertenecen al sis-tema inmune del organismo, que protegeal individuo contra las macromoléculasextrañas que intentan ingresar, por ejem-plo, como componentes de bacterias o vi-rus. Así, Ios anticuerpos son un eslabónimportante en la defensa del organismocontra las enfermedades infecciosas [véasecon más detal le en el cap. 16). La reacciónentre un antígeno y su anticuerpo es en ex-tremo esoecífica.

Los métoios inmunohistoquímicos sebasan sobre la utilización de un anticuer-po específico, que se marca mediante un

Fig. 2-35. Fotomicrografía de neuronas teñidasmediante inmunohistoquímica con anticuer-po contra la molécula transmisora seroton¡na(5-hidroxitr iptamina), unido a peroxidasa. Ladeterminación enzimohistoquímica de la peroxi-dasa permite la identi f icación del anticuerpodespués de su unión con el antÍgeno del cortede tejido y da origen a una reacción de color ro-io parduzco x440

enlace químico en una sustancia que sepuede transformar en visible, sin afectar Iatapacidad áel anticuerpo para formar uncomplejo con el antígeno. El principio seilustra con Ia denominada técnica de anti-cuerpo fluorescente. Para localizar Ia pro-teína muscular miosina se inyecta en unconejo miosina purificada de músculo depollo. Al cabo de cierto tiempo, el suerodel coneio contendrá anticuerpos contra elantígeno miosina de pollo. A continuaciónse extrae el anticuerpo del suero del cone-io v se adosa a fluoresceÍna. Cortes histoló-giios extraídos de pollo se bañan en unasolución del anticuerpo fluorescente (anti-

miosina), que se une específicamente conla miosina del corte. El anticuerpo en ex-ceso se elimina por lavado y se analiza elpreparado con el microscopio de fluores-cenc ia ( f igs . 2 -34 ,2-36 y 2 -37) .

En lugar de marcar el anticuerpo confluoresceína se puede adosar a la enzimaperoxidasa, por lo que se pueden identi-f icar complejos antígeno-anticuerpo me-diante la determinación enzimohisto-química de la peroxidasa (f ig. 2-35). Deesta manera es posible ut i l izar el métodopara la microscopia electrónica. Ade-más, se puede acoplar el anticuerpo a laproteína electrondensa que contiene hie-

Fig. 2-34. Fotomicrograf íacaptada con microscop¡ade fluorescencia de un cor-te de músculo de pollo. Elcorte se colorea primerocon anticuerpo fluores-cente contra miosina depollo, y se baña en unasolución del anticuerpo. Laantimiosina se une a lasbandas A ricas en miosina,por lo que éstas se venfluorescentes (blancas enla imagen). x750. (SegúnFinck, Holtzer y Marshall.)


rro, ferrit ina, o a partÍculas de oro, quetambién se puede identif icar con el mi-croscopio e lect rónico ( f ig . 2-36) .

La especificidad de los métodos inmu-nohistoquímicos depende totalmente deque el antígeno utilizado se aísle sin mez-clas con otras sustancias, para que sea po-sible producir anticuerpos puros con lainmunización. En consecuencia, la inves-tigación del grado de pureza del antígenoes un importante control del método. Seobtiene un antígeno totalmente purocuando se Io sintetiza, por ejemplo un po-lipéptido de secuencia de aminoácidosconocida. Es esencial señalar que no esnecesario aislar el anticuerpo primario es-pecífico de la fracción mezclada de anti-cuerpos en el conejo inmunizado ni losanticuerpos específicos anticonejo en lacabra (véase recuadro).

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---+

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En los últ imos años ha sido posible ob-tener gran cant idad de molécuias de ant i -cuerpo totalmente iguales, los denomina-dos anticuerpos monoclonales. La técnicapara formarlos implica una fusión celularde células de mieloma funa lÍnea celulartumoral transformada) murinos con losdenominados linfocitos B, productores deanticuerpo, del timo de ratones previa-mente inmunizados por Ia inyección delantígeno que se desea demostrar con elanticuerpo monoclonal. Después de la fu-sión celular, las denominadas células dehibridoma (híbridas de mieloma) forma-das han adquirido la capacidad de las cé-lulas del mieloma de desarrollar un creci-miento prolongado en cultivos celulares yla capacidad de los linfocitos B de produ-cir determinado anticuerpo. Después deIa clonización de las células híbridas indi-

F¡9.2-36. Di lmático del prinmunohost<Se presentantodos más usterminación hde proteínas rmediante antimarcaoos.

Inmunohistoquímica indirecta

El método inmunohistoquímico antesdescrito también se denomina método di-recto, hoy reemplazado casi totalmentepor una técnica más sensible, Ilamadamétodo indirecto. En principio es unprocedimiento que consta de dos pasos:primero se hace reaccionar el preparadoa analizar con un anticuerpo primario nomarcado dirigido contra el componenteque se desea demostrar. Cuando el anti-cuerpo primario reaccionó con el prepa-rado se elimina el exceso, no fiiado, y sehace reaccionar el preparado con un an-


ticuerpo secundario marcado (p. ej.,fluorescente), dirigido confua el anticuer-po primario. Por ejemplo, si se obtuvo elanticuerpo primario contra una proteínaX del preparado por inyección de X enun conejo, el anticuerpo secundario po-dría ser un anticuerpo de cabra dirigidocontra anticuerpos de conejo en general,obtenido por inyección del anticuerpo deconeio en una cabra. Este método es mássensible porque cada molécula del anti-cuerpo primario reacciona con variasmoléculas del anticuerpo secundariomarcado, v Ia reacción selefuerza.

C A P I T I

Fig. 2-37. Fotomicrogra-fía de un microtúbulo den-tro del citoplasma de fi-broblastos provenientesde un cultivo de tejido, de-mostrado por inmunohis-toquímica mediante lautilización de un anti-cuerpo fuorescente mo-noclonal contra la proteí-na tubulina que conformael microtúbulo. Los micro-túbulos citoplasmáticos sedistinguen de color verdefluorescente sobre fondonegro. x400. (Cedida porH. Hager.)

viduales, cada clon produce grandes cal-tidades de anticuerpo monoclonal idénti-co ( f i l .2-37) .

Los métodos inmunohistoquímicos sonuno de los más importantes utilizados enlas investigaciones histológica y biológicacelula¡. En principio es posible demostrarla localización de cada una de las proteí-nas que se forman en el or8anismo. Porejemplo, en muchos casos se ha podido es-tablecer cuáles son Ias células que formandeterminada hormona, Los anticuerpostambién se pueden forma¡ contra otrasmoléculas, distintas de las proteínas, yasea antígenos en sÍ mismos o, en los casosde moléculas pequeñas, compuestos quese acoplan a sustancias antigénicas comolas proteínas, a veces debido a otro trata-miento. Por ejemplo, se ha podido demos-trar la existencia de pequeñas moléculastransmisoras como la serotonina (s-hidro-xitriptamina) (fig. 2-3s).

Histoquímica con lectinas

Las lectinas son proteínas (en su mayorparte extraÍdas de vegetales, por ejemplo,porotos rojos) que poseen sitios de uniónespecíficos para hidratos de carbono.Dis-tintas lectinas se unen con diferentes mo-léculas de hidratos de carbono o secuen-cias de éstas con notable especificidad.Así, existen lectinas que se unen a gluco-proteínas y glucolípidos específicos de lasuoerficie externa de las membranas celu-larts y a determinados proteoglucanos deltejido conectivo. La utilización histoquí-mica de las lectinas se debe a que, al igual

que a los anticuerpos, se las puede mar-c¿rr, por ejemplo con un colorante fluores-cente o con la enzima peroxidasa, quepermiten su localización en un corte detejido. La histoquÍmica con lectinas tieneamplia aplicación para demostrar la exis-tencia de determinadas secuencias de hi-dratos de carbono en las moléculas de lasmembranas celulares.

Hibridación in situ

La hibridación in situ se basa sobre lacapacidad que poseen los ácidos nucleicospara hibridarse entrs sí, es decir, la capa-L¡dod de unirse entre sí que prcsentan lasmonocadenas de ócidos nucleicos quetienen secuencias de bases complementa-¡ios. La hibridación puede ser de DNA-DNA, DNA-RNA, o RNA-RNA. Debido a lacaracterística muy específica de Ia hibrida-ción es posible demostrar con gran especi-ficidad la presencia de determinadas se-cuencias de DNA o de RNA en su localiza-ción en Ia célula. Para Ia técnica de hibri-dación in situ se utiliza una sonda (ing.sonde, probe), formada por un ácido nu-cleico monocatenario con una secuenciade bases conocida, complementaria de lasecuencia de bases que se desea demos-trar. Las sondas son ploducidas en labora-torios (p. ej., mediante técnicas de clona-ción de genes, véase con mayor detalle enel cap. 4) y se m¿rcan con un isótopo ra-diactivo (para ser demostradas por ra-dioautografía, véase la próxima sección) ocon una ramificación adosada, que permi-te identificar la sonda mediante otras téc-

cAP í ru to MÉToDos HtsroLóctcos 4s

nicas, por ejemplo la inmunohistoquími-ca. Estas sondas varían en longitud, desde10-15 bases hasta varios miles de bases.

Por ejemplo, si se desea demostrar laexistencia de determinada secuencia deDNA en un cromosoma de las células deun corte histológico o en un preparado es-pecial de cromosomas, primero se exponeel preparado a un pH elevado (básico), queinduce la separación de la doble cadena dela molécula de DNA por desnaturaliza-ción. Después se agrega Ia sonda, que pue-de poseer la secuencia complementaria deDNA o de RNA. Una vez hibridada Ia son-da con las zonas comolementarias delDNA de los cromosomas-se transforma envisible la localización en los núcleos celu-lares, por ejemplo, mediante radioautogra-fía o inmunohistoquímica.

Si se desea demostrar la oresencia demoléculas específicas de RNA, no se efec-túa ningún tratamiento previo de los cor-tes histológicos con pH elevado, dado queprecisamente se desea que las cadenas do-bles de las moléculas de DNA no se seDa-ren y, en consecuencia, no se unan a lusonda. En este caso es suficiente incubarIos cortes de tejido con la sonda (despuésde una fijación suave del tejido), que pue-de contener una secuencia complementa-ria de DNA o de RNA.

Así, mediante Ia hibridación rn sifu esposible demostrar las secuencias de áci-dos nucleicos correspondiente a determi-nados genes (véase fig. 4-36), además de laexpresión de determinados genes por lademostración de Ia oresencia de secuen-cias específicas de RNA mensajero (mR-NA).

Radioautograffa

Con esta técnica es Dosible obtener in-formación directa respécto al sitio dentrode Ia célula donde se sintetiza un produc-to y los componentes químicos que lo for-man, además de sus eventuales desplaza-mientos dentro de Ia célula o hacii otrasIocalizaciones del organismo, después desalir de la célula. Además, es posible seguirIos desplazamientos de toda la célula y suposterior destino en el organismo. Por lotanto, la radioautografía provee de infor-mación referida a los aspectos dinómicosde Ia morfología de las célulos y los Lejidos.

La radioautografía se basa sobre dosprincipios fundamentales: 1) la radiaciónionizante tiene el mismo efecto sobre unaemulsión fotogrófica que la luz visible. 2)Un precursor biológico con marca radiac-tiva, por ejemplo, un aminoácido, tieneexactamente iguales propiedades biológi-cas y destino metabólico en el organismoque la molécula correspondiente sin mar-co. Por marca radiactiva se entiende oue


un ótomo de Ia molécula determinada esrcemplazada por su isótopo radiactivo co-rcespondiente, por ejemplo el reemplazode hidrógeno por tritio 3H.

El proce dimienfo radioautográfico pue-de ser el siguiente, por ejemplo: en un ani-mal de experimentación se inyecta unamolécula de importancia biológica marca-da con un isótopo radiactivo, por ejemploeH-leucina, que interviene en la formaciónde varias proteínas. Las moléculas conmarca radñctiva son integradas rápida-mente a las macromoléculas, que se pue-den conservar en los cortes de teiido al ha-cerlas insolubles por fijación. Las molécu-las inyectadas son solubles y se eliminanpor lavado durante Ia preparación de loscortes histológicos, a menos que hayan si-do incorporadas al producto de síntesismacromolecular antes de ser sacrificado elanimal. Después del montaje de los cortesse les agrega en cómara oscura una capamuy delgada de emulsión fotográfica (cris-tales de bromuro de plata en emulsión degelatina) (fig. 2-38). burante el posteriorperíodo de exposición, que puede duraralgunos días o semanas, de acuerdo al tra-bajo experimental, desde los sitios radiac-tivos del tejido se emiten partículas o ra-yos gamma. Algunos de ellos atraviesan laemulsión fotográfica e inciden en los cris-

Fig. 2-38. Dibujo esquemático de un preparadoradioautográfico para uso en el microscopioefectrónico. Parte superior. el preparado du-rante la exposición. Una partícula beta prove-niente de un compuesto tritiado en el corte detejido ha incidido sobre un cristal de bromurode plata (grisado) de la emulsión fotográfica su-prayacente y generado una transformación par-cial de los iones plata del cristal en plata metáli-ca (presentado como una mancha negra arribaa la izquierda del cristal). Parte inferior. el pre-parado tras el revelado y la fijación. El cristal in-cidido se ha transformado totalmente en gránu-lo de plata metálica y se eliminaron los demáscristales (no incididos). (Según Caro.)

B

to,1 t r

I+0,0,6F

Y+0,09rr

ü

GelatinCristal

Corte o

Película

- Gelatin

Corte d

PelÍcul¿sostén

Grano de plata

C A P í T I

F¡9, 2-39, Fotomicrografía de un preparado ra-dioautográfico para microscopia óptica detejido renal. En el animal vivo se inyectó timidi-na tritiada, que antes de ser sacrificado el ani-mal se incorooró al DNA en todos los núcleoscelulares en fase de síntesis como paso previoa la división celular. Los puntos negros repre-sentan los gránulos de plata metálica y se loca-l izan en los núcleos de las células marcadas(nótese que, por lo general, las células total-mente desarrol ladas no se dividen en los túbu-los renales, pero en este caso fueron estimula-das experimentalmente para la división). x870(Cedida por R Rasch )

tales de bromuro de plata, que se transfor-man entonces, en parte, de iones plata aplata metálica. Después de un perÍodoprudencial de exposición se aplica un re-velador químico que transforma todos loscristales incididos por los rayos en platametálica. Por último se eliminan todos loscristales no incididos mediante una solu-ción de tiosulfato (fiiación fotográfica). Acontinuación se nuede tratar el corte de Iamisma manero- que cualquier otro, porejemplo teñirlo de manera adecuada, conoosterior deshidratación e inclusión.-

En Ia observación con el microscopio sedistinguen los granos de plata metálicacomo pequeñas manchas o puntos negrosen los sitios de Localización de la sustan-cia radiactiva en el corte de teiido subva-cente ( f ig . 2 -39) .

El poder de resolución, entendido comola exactitud de la locaiización del isótoooradiactivo, es de alrededor de I ¡ lm con-elmicroscopio óptico, pero si se utiliza el mi-croscopio electrónico (fig. 2-a0) es posibleobtener un ooder de resolución de alrede-dor de 0,1 ¡rm. En las imágenes obtenidaspor microscopio electrónico a menudo losgránulos ocultan varias estructuras y el es-tudio más exhaustivo de Ias radioautogra-fías puede requerir un an¿Ífisrs estadístico.

EI método sólo demuestra sustanciasque se incluyen en los componentes tisu-lares, mientras que el material marcadose encuentra dentro del ors.anismo. Preci-samente por ello es posiblé obtener infor-mación sobre las relaciones dinómicas delos procesos metabólicos. Una importante

Fig.2-40. lmagen de un preparado radioauto-gráfico de eritrocitos y reticulocitos (glóbulos ro-jos inmaduros), captada con microscopio electró-nico. Previo a la preparación para la radioauto-grafía para el microscopio elecfónico se incuba-ron las céfulas ¡n vitro con leucina tritiada; se ob-serva gran cantidad de gránulos de plata por so-bre un reticulocito (F), pero ninguno sobre losdos eritrocitos (4. Esto se debe a que el reticu-locito incorporó la leucina radiactiva durante laincubación, puesto que aún es capaz de sintet¡-zar hemoglobina (proteína que requiere leucina),mientras que los eritrocitos maduros han perdidola capacidad de síntesis proterca. x80.000.(Cedi-do en préstamo por A.B. Maunsbach.)

aplicación de la radiautografía es el mor-cado de los núcleos celulares (fig. 2-39J,tras el cual se puede seguir el desplaza-miento y el destino de las células marca-das dentro del organismo. Si, por ejemplo,se inyecta timidina marcada con tritio(que en el organismo se incluye como labase timina en el DNA) en un feto, será in-cluido en el núcleo de todas las célulasque sintetizaban DNA en el momento dela inyección, como paso previo para la di-visión celular. En la actualidad el métodoes muy importante para el estudio de lahistogénesis (el desarrollo de las célulasembrionarias indiferenciadas a células es-pecial izadas en un tej ido).

Problemas en la interpretaciónde cortes de teiido

Por último se verán algunas condicio-nes que conviene recordar respecto de lamicroscopia óptica práctica.

C A P í T U t O MÉToDosHIST)LÓGIcoS 47

Artificios. La palabra artificio significaproducto artificial y designa estructurasdel preparado que no existen en el tejidovivo, pero que aparecen artificialmnte du-rante el procedimiento de preparación.

Algunos de los artificios más comunessonla retracción (fig. 2-41,a), que en mayoro menor grado son una consecuencia inevi-table de la preparación habitual de los cor-tes tisulares. La retracción se oresenta enIos tei idos como hendiduras u óri f icios va-cíos y sin estructuras (p. ej., no presentan,como los caoilares. una cubierta endotelialhacia el inteiior del espacio vacío). Los pre-cipitados de colorante se observan comocristales coloreados, a menudo ubicadospor encima del corte (fig. z-+tb). Los plega-mientos se oueden formar en el momentode la sección o durante el posterior proce-samiento de los delgados cortes (h9.2-a1,c),mientras que las imperfecciones de la cu-chilla del micrótomo causan defectos en elcorte oue se visualizan como líneas rectasque atiaviesan las estructuras biológicas(fig. 2-a1d). La rotura del tejido durante Iaextracción, por ejemplo debido a la pinza,puede dar lugar a la formación de groserasvariaciones dei aspecto de las células. Porúltimo se debe nombrar Ia fiiación dema-siado ]enta o insuliciente como causa decortes de mala calidad, debido a la degene-ración post mortem (véase con mayor deta-lle en Ia sección de lisosomas, en el cap. 3).

Interpretación tridimensional de uncorte. Siempre se debe recordar que loscortes de tejido representan una delgaday, en principio, bidimensional rodaja deun objeto tridimensional. En la figura2-42se muestra cómo un corte seccionado através del mismo objeto puede presentarasoectos totalmente diferentes de los mis-mós tipos celulares. Muchas estructurashistológicas son tubulares, y Ia figura 2-43presenta el aspecto muy variable de dis-tintos cortes transversales de la misma es-tructura tubular.

Para establecer la forma tridimensionalcorrecta de un órgano o de una estructurade gran tamano a menudo se realizan co¡fesseriados, en los que se presentan sucesivassecciones a través de toda la estructura u ór-sano. Mediante el cuidadoso análisis de Iasielaciones entre los cortes de toda la seriees posible obtener una representación máscierta de Ia conformación espacial, en algu-nos casos desoués de construir un modelosobre la base áe la serie de cortes. La infor-mación obtenida en el análisis también sepuede transferir a una computadora, capazde reconstruir un modelo tridimensional.

Aouí termina Ia somera introducción ala microscopia práctica, recordando quepara el diagnóstico es mrÍs importantedescubrir la estructura de las células y lostejidos que los colores, dado que estosoueden variar de una técnica a otra.

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Fig .2-41 . Escrografías (a-rcoloreados cclina-eosina mrejemplos decios histológcomunes. a rpacros como (cia de retraccchas), mientreb se observagrande de cobre el tejido (fun ejemplo demiento del ccmontado, mied muestra línra muescas ellla del micról(flechas).

48 MÉTODOSHISTOLÓGICOS C A P I T

Corte de 5 Umque atraviesauna célulade 15 pm

ffi---.

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Fig.2-42. Dibulo esquemático que muestra có-mo un corte fino entre un grupo de células si-milares puede presentar un aspecto totalmen-te diferente cuando se observa el corte oor elmicroscopio. (Según Ham.)

Fig.2-43. Este dibujo esquemático muestra có-mo cortes en distinta dirección a través dela misma estructura tubular oueden Dresentaraspectos totalmente diferentes.

Cuestionario sobre métodos histológicos

1. ¿Qué se entiende por poder de reso-lución?

2. ¿Qué se entiende por aumento?3. ¿Cuál es el m¿íximo poder de resolu-

ción para el ojo a distancia normalde lectura, los mejores microscopiosópticos y los mejores microscopioselectrónicos?

. ¿Qué se entiende por in uivo e in vitro?5. ¿Qué es un clon celular, y qué es la

clonación?6, Intente explicar en pocas palabras el

método de fraccionamiento celularque utiliza la centrifugación diferen-cla l .

7. ¿Cuál es el obietivo de la fijación delos tejidos cuando se preparan corteshistológicos?

B. ¿Cuál es la importancia clínica de latécnica de cortes por congelación?

9. ¿Qué se entiende por cortes semifi-nos y cuál es su espesor?

10. ¿Cuál es el objetivo de usar métodoshistológicos?

11. ¿Qué se entiende por acidofilia y ba-sofilia?

12. Nombre un colorante metacromáticoy algunas sustancias tisulares quepresentan metacromasia.

13. ¿Cuál es el principio básico del méto-do de PAS y qué se demuestra conél?

14. ¿Cuál es el principio básico del méto-do de Feulgen y qué demuestra espe-cÍficamente?

15. Describa brevemente el principio bá-sico de un método enzimohistoquí-mico.

16. Intente explicar brevemente el prin-cipio fundamental de un método in-munohistoquímico directo.

1,7. ¿Se puede utilizar la inmunohisto-quÍmica a nivel de microscopia elec-trónica?

18. ¿Qué sustancias se pueden demostrarmediante la histoquímica con lecti-nas?

19. Intente explicar brevemente el prin-cipio fundamental de la hibridaciónin situ.

20. ¿Qué se entiende por marca radiacti-va de una molécula?

C A P I T U L O MÉToDoSHIST)LÓGIC)S 49

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CAPÍTULO 2 Métodos Histológicos