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CAPITULO 13. INTERACCION PROTEINA-DNA. CROMATINA

13.1 Proteínas asociadas al DNA. Histonas y otras.

13.2 El nucleosoma

13.3 Posicionamiento de nucleosomas

13.4 Estructuras de orden superior

13.5 Modificación de DNA e histonas y su relación con la activación de la cromatina.

Bibliografía

Blackburn & Gait

Telsenfeld & McGhee. Cell, 44 (1986) 375.

Daban & Cantor. J.Mol.Biol., 156 (1982) 771.

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Lewin, Genes. Willey, NY 1983.

Richmond and cowokers Nature, 289, 251 (1997).

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13.1 Proteínas asociadas al DNA. Histonas y otras.

El DNA interacciona con numerosas proteínas, como veremos en el capítulo 17.

Estas proteínas son de muy diverso tipo: enzimas involucrados en transcripción,

replicación, preserores, reguladores,..... Una de estas proteínas son las histonas, que

juegan un papel clave en el empaquetamiento del DNA en la célula.

El problema del empaquetamiento no es trivial, ya que aún un organismo simple

como E-Coli tiene alrededor de 3 106 pares de bases de DNA. Ello implica en DNA

doble hélice aproximadamente 1 mm! Es decir, mucho más que la longitud total de la

célula. La situación es aún más dramática en una célula eucariota (véase Fig. 1 y 2). Es

por lo tanto imprescindible que el DNA se compacte para ocupar menos espacio. El

nivel de compactación más inmediato es el de cromatina.

Figura 1. Cromosoma eucariota explotado por choque osmótico. Obsérvese la

cantidad de fibra de DNA que contenía.

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Figura 2. Esquema de compactación del DNA eucariota.

En células procariotas y en virus se pueden producir sistemas de

empaquetamiento primitivos. Por ejemplo el empaquetamiento hexagonal, donde las

fibras de DNA se agruparían como si fuesen un manojo de lápices. Este tipo de

empaquetamiento queda estabilizado por la interacción de proteínas muy básicas no

histonas: las protaminas.

Otra posibilidad de compactación la encontramos en las cabezas de los fagos.

Parece que en este caso el DNA esta enrollado como una manguera, sacando partido de

la capacidad del DNA para curvarse. El DNA enrollado forma una estructura de unos

170 Å de radio lo que da una estructura muy compacta que queda estabilizada por

medio de iones divalentes y de valencia superior. Este tipo de empaquetamiento

“curvado” coincide con datos experimentales y teóricos que demuestran la tendencia del

DNA a curvarse espontáneamente en presencia de muchos cationes de elevada valencia.

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Desde los años setenta se sabe que el DNA eucariota se encontraba en la

cromatina compacto formando unas estructuras que involucraban proteínas y que tenían

un tamaño aproximado de 200 pares de bases (el número exacto varia entre

organismos). Estudios posteriores han demostrado que lo que existe es un octámero de

proteínas muy básicas: las histonas, entorno al cual se enrollo 1 3/4 vueltas de DNA

doble hebra. También se ha demostrado que existe otra histona: la H1 que ayuda al

empaquetamiento, pero que no está en el octámero.

Esta información se derivó a partir de datos de digestión con nucleasa

micrococal de cromatina. Al hacerlo con DNA marcado en uno de los extremos se

observó que se obtenían fragmentos de excisión cada 200 pares de bases (i.e.

fragmentos de 200, 400, 600,…). Es decir, que existína (cada 200 pb) unas estructuras

repetitivas que daban protección al DNA frente a nucleasa microcal. La longitud de

estas estructuras era de 200 pb.

Sabemos ahora que estas estructuras están formadas por el DNA sobreenrollado

sobre un core proteico formado por las histonas (Figura 3) con otra histona (la H1)

dispuesta de modo exterior al core proteico (véase más abajo).

Figura 3. Esquema de un DNA enrollado 1 ¾ vueltas sobre el core proteico del

nucleosoma. Nótese que es una doble hélice levógira.

Las histonas son proteínas muy básicas (lógico porque tienen que interaccionar

con el DNA), lo que viene dado por su alto contenido de Arg y Lys. Se habla de 5 tipos

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de histonas: H1, H2A, H2B, H3 y H4 (Figura 4). Estas se clasifican por su contenido

en: ricas en Arg (H3 y H4), moderadamente ricas en Lys (H2A, H2B) y muy ricas en

Lys (H1 y H5 (una variante de H1 que se da en las aves)). Es interesante notar que las

histonas son de las proteínas más conservadas por la evolución. De hecho la única

variabilidad notable se da en la histona H1 (H5), que es la histona más externa al

octámero. Esto da una idea de la importancia de la nucleación de la cromatina en

nucleosomas para la vida de la célula.

La unión de las histonas al DNA da lugar a las estructuras comentadas más

arriba, estructuras que tienen igual masa de DNA que de proteína. Digestión con

nucleasas o proteasas permiten eliminar o la parte de ácido nucleico o la de proteína de

las estructuras nucleosómicas.

Figura 4. Contenido relativo de residuos básicos de las 4 histonas.

13.2 El nucleosoma

Pasaremos ahora a analizar las estructuras repetitivas del DNA en la cromatina: los

nucleosomas. Como se comentó más arriba fueron los datos de digestión por nucleasa

micrococal los que permitieron detectar la existencia de los nucleosomas. Fueron

también importantes estudios posteriores en los que al incubar en condiciones de

degradación más agresivas se encontraron subpartículas más pequeñas. Así, del

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fragmento de 200 pb se puede obtener por digestión la excisión de un fragmento de 34

pb y una estructura que contiene todas las histonas más DNA enrollado sobre el core

central. Esta estructura de 166 pb (más histonas) se llama cromatosoma. Si se fuerzan

las condiciones de degradación se escinde la histona H1 y se llega a lo que se cosidera

el fragmento core del nucleosoma que tiene unos 145 pares de bases. Si se fuerza aún

mas las condiciones llegamos a la partícula núcleo que contiene el core proteico y unas

136 pb.

Así se demostró que la histona H1 esta fuera del core proteico (Figura 5), que se

encuentra formado por H2A, H2B, H3 y H4. Los contactos entre las histonas (esto es:

su disposición dentro del nucleosoma) se detectó por técnicas de crosslinkers, es decir

por grupos bifuncionales que unen proteínas de modo covalente. Posteriormente el

grupo A.Klug y col. obtuvieron una estructura de baja resolución por difracción de

rayos X (Figura 6) en el año 1984, donde ya se veían detalles del empaquetamiento de

las histobnas. En septiembre de 1997 el grupo de T.J.Richmod (Nature, 289, 251, 1997)

resolvió por rayos X la estructura de un nucleosoma de un fragmento palindrómico de

DNA del satélite humano, que incluía la partícula proteica y 146 pares de bases de

DNA. En este trabajo, tras décadas de trabajo se consiguió resolver el nucleosoma a 2.8

Å de resolución, lo que ya nos permite ver ya los detalles completos de la estructura del

nucleosoma (Figuras 7 y 8).

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Figura 5. Esquema de la estructura del nucleosoma.

Como vemos existe un núcleo proteico entorno al cual se enrolla en sentido

levógiro 1 3/4 vueltas de DNA. El diámetro es aproximadamente 11 nm (110 Å) y la

altura es 5.5 nm (55 Å).

Figura 6. Estructura de baja resolución de la partícula núcleo.

Se ha visto en la estructura de alta resolución que el nucleosoma es bastante

como se postuló a partir de datos de baja resolución y análisis de reactividad química,

pero que también se habían escapado algunos detalles sutiles en los datos de baja

resolución. Primero se ve que el DNA no se encuentra enrollado de manera uniforme,

sino que en algunas zonas es casi recto, mientras que en otras tiene una muy fuerte

curvatura. Esto sugiere que las propensiones intrínsecas a doblarse del DNA marcan en

parte la estructura real del nucleosoma. Interesante, las histonas que constituyen el core

proteico emiten fragmentos polipeptídicos que se prolongan fuera del core. En algunos

casos estas cadenas polipeptídicas “atraviesan” entre 2 cadenas de DNA (ver Figuras 7

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y 8) y salen hacia el exterior. Es posible que estas cadenas sean importantes para niveles

de estructuración más elevados del DNA.

Figura 7. Estructura del nucleosoma a 2.7 Å de resolución.

Figura 8. Detalles de la curvatura del DNA sobre el nucleosoma y de las proturberancias

de cadenas de histona por los surcos.

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Las histonas son muy ricas en hélices alfa y dan lugar a empaquetamientos que

nos recuerdan a -bundle o -corner (ver Figuras 7,8). Las histonas se presentan a pares

y de hecho se observan como dos heterodímeros formados por H3-H4 y por H2A-H2B,

como ya se sabia estos dímeros se repiten 2 veces dando lugar a una estructura bastante

simétrica (ver Figuras 7 y 8). Estos dímeros se forman por interacciones de apilamiento,

que si las observamos nos resultan familiares en empaquetamientos tipo -bundle.

Las interacciones entre DNA y proteína son muy intensas y justifican que el

DNA se curve. Tal como teóricamente se habia previsto las interacciones son

básicamente electrostaticas, y son los fosfatos del DNA los residuos que más

interaccionan con residuos de la proteína. Estos residuos son en muchos casos grupos

básicos de las proteínas, y en otros grupos polares como OH, o incluso los grupos

amida. También se dan muchas interacciones con los grupos apolares de las proteinas y

las ribosas. Finalmente, se han detectado contactos muy itensos entre fragmentos de la

proteína y el hueco que generan los minor groove de 2 cadenas de DNA. Podemos

pensar que esta interacción es clave para enmascarar la fuerte repulsión fosfato-fosfato

que se da fruto de la empaquetación del DNA. De hecho los autores del trabajo en

Nature 389, 251 (1997) sugieren que parte de la propensión que ciertas secuencias, por

ejemplo pasos A.T tienen para formar nucleosomas es debido a la tendencia de estos

pasos a formar estructuras con minor grooves muy estrechos. Estos surcos concentrarán

mucha carga negativa, y que por tanto formarán puentes salinos muy fuertes con las

histonas.

Los estudios de difracción de rayos X a alta resolución han confirmado que la

razón que causa el enrollamiento del DNA sobre el nucleosoma son interacciones

electrostáticas entre las abundantes cargas positivas de las histonas, y los grupos

fosfatos del DNA. Por otro lado, respecto a la forma del DNA sobre el nucleosoma, se

ha visto que es un DNA curvado, pero a parte de eso no está excesivamente

distorsionado. Es interesante notar que el DNA no está “encerrado” o “protegido” por la

proteína, sino solo depositado sobre su superficie. Esto que ahora queda claro por la

estructura del nucleosoma se demostró hace tiempo en un experimento clásico con

DNAasa I. Este enzima corta una cadena de DNa (nick) con gran eficacia, aún en sitios

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en los que este está cercano a proteínas, pero no es capaz de desnaturalizar proteínas, o

tener efecto proteasas. Al incubar DNAasa I a nucleosomas y hacer electroforesis lo que

aparecen son bandas de aproximadamente 10 pares de bases (bp). Esto liga de manera

clara con la hipótesis de que el DNA está enrollado sobre el core proteico, pero no

protegido por él. Recordar que el DNA (B) es una doble hebra de unos diez pares de

bases por vuela, y por tanto cada 10 pares de bases el DNA estará accesible a la acción

de las nucleasas, y podrá ser cortado.

13.2 Posicionamieno de nucleosomas

Recientemente se ha combinado degradación por micrococal nuclease (MNase) con

Deep sequencing para determinar el posicionamiento de los nucleosomas en el genoma.

Para algunos organismos como sacharomyces se tienen mapas de alta resolución, para

otros como el hombre estos no son tan completos. En cualquier caso se ha visto como

los nucleosomas no se posicionan al azar sino en muchos casos tienen posiciones

marcadas, sea por cuestiones físicas del DNA, por la presencia de proteínas

competidoras, o por el efecto de factores de remodelación de la cromatina. La pauta de

posicionamiento es especialmente clara en la región cercana a los orígenes de

transcripción, que muestran una región claramente deplecionada de nucleosomas justo

antes del origen de replicación rodeada de dos señales de 2 nucleosomas bien

posiscionados 1 downstream (el nucleosoma +1) y el otro upstream (el -1)

Figura 9. Esquema de posicionamiento de nucleosomas respecto a lugares singulares.

Resultados de Widom and coworkers Nature 2012, 486, 496.

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El mantenimiento de estas posiciones promedio parece ser clave para una buena

regulación de la expresión génica.

13.4 Estructuras de orden superior

Es evidente que el DNA tiene que compactarse mucho más que el nivel de

compactación que le proporciona el nucleosoma. Un ejemplo de compactación lo

representa el cromosoma (Figura 1). Entre el primer nivel de empaquetamiento y el

último hay un número de etapas intermedias. Así en primer lugar los nucleosomas se

agrupan dando fibras más o menos lineales. Esta fibra de nucleosomas se estructura más

aún formando unas “superhebras” helicoidales de unos 30 nm de anchura, y con un paso

de rosca de unos 6.7 nucleosomas por vuelta (Figuras 2 y 9). No se conoce en detalle la

estructura, pero parece que la histona H1 juega un papel clave para estabilizar el interior

de la hebra (ver Nature 368, 351 (1994)).

Figura 10. Imagen de microscopía electrónica de la fibra de 30 nm. Observar el detalle

de los nucleosomas (partículas blancas).

Existen varios modelos para explicar la estructura de esta sueprfibra, el más

extendido es el modelo del solenoide simple (T17.4). Este modelo no está totalmente

caracterizado a nivel estructural por el tamaño del sistema. La mayoría de los libros

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recogen un modelo como el que se muestra en la Figura 10 con los nucleosomas como

apilados en un eje oblicuo al de la superfibra. Sin embargo otros autores soportan

modelos ligeramente diferentes (véase Figura 11).

Figura 11. Posible modelo del solenoide de la fibra de 30 nm.

Las superfibras constituyen ya un nivel de empaquetamiento elevado, pero no

osbtante, es preciso un nivel mucho mayor de empaquetamiento. Los niveles por

encima de la superfibra de 30 nm no están claros. Se piensa que varias superfibras se

pueden agrupar para dar una suprahélice. En cualquier caso, el paso final de

empaquetamiento es el cromosoma, en el que el elevado grado de empaquetamientod se

consigue a base de formar lazos de super o suprahélice. Se especula que hay unos ocho

lazos en un cromosoma estandard:

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Figura 12. Modelo alternativo del solenoide en la fibra de 30 nm.

13.5 Modificación de DNA e histonas y su relación con la activación de la

cromatina.

Es un tema amplio que veremos solo superficialmente (ver capítulo 30 de

Lewin), en tanto se comentarea en otras asignaturas.

Una pregunta clave cuando hablamos de nucleosoma y actividad del DNA es: está el

DNA (en cromatina) organizado en nucleosomas cuandos e encuentra activo?, o solo

cuando esta “almacenado”?. Los datos experimentales son claros: los enes “activos”

contienen un porcentaje de nucleosomas igual a los genes inactivos. Es decir, no se

produce perdida de estructura nucleosomal cuando el DNA se activa. No sabemos en

detalle cual es la estructuración del DNA en el momento exacto de la replicación o

transcripción. El tamaño de los enzimas implicados en este proceso es muy grande, con

lo que se especulan que “chocarían” con el nucleosoma si este estuviera formado. Así,

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la idea generalizada es que en el momento justo de la replicación o transcripción el

nucleosoma se desestructurará, pero en cuanto a los enzimas implicados pasan de largo

estos se reforman. En este proceso no queda claro si cuando se produce la reformación

ésta se produce en la misma posición. Los resultados no son concluyentes, pero los

experimentos más recientes soportan un cierto “conservadurismo” en cuando a la

posición que ocupa el nucleosoma. Notad que la estructura del nucleosoma podría

jugar un papel clave al acercar en el espacio secuencias lejanas, para el

reconocimiento del DNA por proteínas).

Lo que si que esta claro es que el empaquetamiento del DNA por las histonas

produce en general una inhibición en la unión de otras DNA-binding proteins, como los

factores de transcripción. Mirando la estructura se ve que esta inhibición no se debe

tanto a la reducción del area accesible del DNA (73% de la normal en el nucleosoma),

sino a la distorsion que se genera en la estructura del DNA. Por último, es interesante

destacar que a priori la formación del nucleosoma puede crear centros de

reconocimiento. Es decir, al distorsionar el DNA puede crear un centro de

reconocimiento que sea propio de ese DNa cuando esta en el nucleosoma, pero no

cuando no está. Esta hipótesis se conforma por algunas proteínas, por ejemplo la

integrasa del HIV que tiene preferencia por unirse a fragmentos de DNA que se

encuentran en nucleosomas. Se especula (ver Cell 69, 769 (1992), y PNAS 91, 5913

(1994)) que esto se da por la especificidad de ciertas proteínas por reconocer fragmentos

de gran curvatura.

MODIFICACION QUIMICA DE HISTONAS

Las histonas no son proteínas estáticas sin reactividad alguna, como podría

sugerir su papel estructural. Por el contrario, sus cadenas laterales sufren un gran

número de reacciones tales como acetilaciones (ejemplos en las Lys), fosforilaciones, o

incliso “ubiquitinación”. La importancia biológica de todos estos procesos es algo que

no ha sido clarificado, aunque a menudo se relaciona con la formación o rotura del

nucleosoma. Por ejemplo, la acetilación de ciertas Lys en la histona H4 se ha sugerido

que conduce a una desestabilización del nucleosoma. También se sabe que el proceso de

formación/rotura del DNA implica a menudo fosforilaciones de residuos de las histonas.

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Dada la relación entre rotura/formación de nucleosomas y la funcionalidad del DNA

parece obvio que estos procesos de modificación química de las histonas estén

perfectamente regulados.

MODIFICACIONES QUIMICAS DEL DNA

Los nucleosomas pueden interaccionar con numerosas moléculas. No obstante, la

reactividad más relevante que poseen viene dada por su capacidad de metilarse y

desmetilarse. La metilación se da en citosinas, especialmente en secuencias ricas en CG.

Evidencias diversas paraecen demostrar que el pattern de metilación puede ser muy

constante (siempre en iguales zonas del DNA), y de hecho se supone que el proceso de

metilación esta catalizado por enzimas específicos: loas DNA methylasas, lo que

sugiere una importancia elevada de este proceso para la vida de la célula. Evidencias

experimentales sugieren que la desmetilación viene asociada a la expresión del gen.