Cap 3 Colimetria

MANUAL PRÁCTICO DE MICROBIOLOGÍA - Tomo II: Microbiología Ambiental II Manacorda A. M., Cuadros D. P y Álvarez A. S. Año 2007

Capítulo 3

TÉCNICA DE FERMENTACIÓN EN TUBO MÚLTIPLE (NMP) PARA MIEMBROS DEL GRUPO DE LOS COLIFORMES: COLIMETRÍA

Objetivo

• Poner en práctica una técnica microbiológica de rutina para estimar la calidad bacteriológica del agua.

Introducción Existen numerosas enfermedades bacterianas de transmisión hídrica como el cólera, la fiebre tifoidea y paratifoidea y la disentería bacilar, entre otras. En general los agentes causales de estas enfermedades se encuentran en bajas concentraciones en el agua, lo que dificulta su aislamiento e identificación. Se denomina microorganismos indicadores de contaminación fecal a aquellos que se encuentran en grandes cantidades en las heces humanas y en las de los demás vertebrados de sangre caliente, que son de fácil identificación y detección, y permiten evaluar la potencial presencia de otros microorganismos patógenos que suelen acompañarlos. El grupo de bacterias generalmente utilizadas como indicadores de contaminación fecal son las coliformes. Este grupo pertenece a la familia Enterobacteriaceae e incluye varios géneros: Escherichia, Citrobacter, Enterobacter y Klebsiella. Estos microorganismos son bacilos aerobios y anaerobios facultativos, Gram negativos, no formadores de esporas, capaces de utilizar a la lactosa como fuente de carbono y energía con producción de gas y ácido en 48 horas a 35ºC. Existen microorganismos que reúnen estas características que viven asociados a vegetales o al suelo y no necesariamente se asocian a contaminación fecal. Por esta razón se han desarrollado diferentes métodos para la detección de coliformes fecales. Los microorganismos coliformes, algunos de los cuales son saprofitos de vida libre, pueden multiplicarse en lavaderos de cuero, madera, cuerdas de piscina y empaquetadoras de yute, y producir a veces cienos en el interior de las tuberías. La diferenciación de los coliformes tiene valor en el momento de determinar la fuente de la que procede el aumento de su densidad y que es consecuencia de la multiplicación de microorganismos sobre o dentro de materiales orgánicos. La presencia de un gran número de coliformes del mismo tipo en el agua de un pozo o manantial o en un solo grifo de un sistema de distribución sugiere que se ha producido la citada multiplicación. Los residuos industriales también poseen elevadas concentraciones de elementos nutritivos para las bacterias y pueden favorecer grandes sobrecrecimientos de coliformes en aguas de efluentes y afluentes. Estos crecimientos también pueden aparecer en los sistemas de distribución de aguas tratadas. Una de las pruebas estándar para el grupo de los coliformes puede realizarse mediante la Técnica de Fermentación en Tubos Múltiples (a través de las fases presuntiva, confirmatoria y prueba completa), en la cual los resultados del estudio de los tubos y diluciones replicados se comunican en términos de Número Mas Probable (NMP) de microorganismos existentes (número equivalente a la densidad media de coliformes en la muestra). La precisión del método depende del número de tubos utilizados, pudiendo ser de tres o cinco series de tubos por dilución. La densidad bacteriana puede calcularse mediante una fórmula o por medio de la tabla que utiliza el número de tubos positivos en las diluciones múltiples. Las muestras que pueden utilizarse para la determinación de coliformes, incluyen: agua dulce (potable o no), agua salada, lodos, sedimentos, fangos y alimentos (carnes y leche). La prueba estándar para detectar bacterias coliformes consta básicamente de dos fases: la prueba presuntiva y la prueba confirmatoria, aunque suele realizarse una tercera denominada prueba completa.

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Materiales - Mechero Bunsen - Gradillas - Marcador indeleble - Tubos con 9 ml de agua de dilución estéril - Tubos con 10 ml de CMC doble concentración - Tubos con 10 ml de CMC simple concentración - Tubos con 10 ml de CLVBB y EC - Pipetas 1 ml y 10 ml estériles - Pipeta automática - Tips estériles - Ansa - Estufa de cultivo a 35ºC - Estufa de cultivo o baño termostatizado a 44,5 ºC Procedimiento 1.- Prueba Presuntiva: Para su determinación se utiliza un medio líquido lactosado, pudiendo ser Caldo Lauril Triptosa (CLT), Caldo Lactosa (CL) o Caldo Mac Conkey1 (CMC). Si el medio se ha refrigerado después de su esterilización, se debe de incubar de un día a otro a 35°C antes de utilizarlo, rechazando aquellos tubos que muestren crecimiento, burbujas o ambas cosas. Todos los tubos se preparan con 10 ml del medio elegido (en el caso del presente trabajo se utiliza el CMC), de la siguiente forma: 3 tubos a doble concentración del medio y 6 tubos a simple concentración del medio. Cada tubo debe llevar una campana Durham (tubo de vidrio invertido). Se siembra con pipetas estériles: − 10 ml de la muestra inicial a tubos de doble concentración, por triplicado. − 1 ml de la muestra inicial a tubos de simple concentración, por triplicado. − 0,1 ml de la muestra inicial a tubos de simple concentración, por triplicado. En la figura 1 se indica el procedimiento de la realización de las diluciones. Cuando se trabaja con una muestra de calidad desconocida, se deberán sembrar más series de tubos (más diluciones), para asegurarse de tener alguna serie con todos los resultados negativos. En dicho caso, la metodología para la realización de las diluciones es la misma que la explicada para bacterias heterótrofas totales (figura 2). Los tubos sembrados se incuban a 35 ± 0,5 ºC durante 24 ± 2 horas. El desarrollo de bacterias que atacan la lactosa con producción de gas se evidencia por el viraje de color del medio de cultivo (el viraje de color violeta a amarillo indica la acidez producida en el medio) o por la acumulación de gas en la campana de Durham. En caso que ésta reacción no se produzca, se deben de reincubar aquellos tubos negativos, para luego volver a examinar al final de 48 ± 3 horas. Registrar luego, la presencia o ausencia de gas o ácido. La aparición de dichas reacciones, constituye una presunta reacción positiva, por ello, como existen algunas bacterias grampositivas que son capaces de producir esta reacción, éste resultado debe confirmarse. En las pruebas posteriores, a estos tubos se los denominará tubos primarios

1 Medio preparado color rojo púrpura. La bilis de buey presente en este caldo estimula el crecimiento de las bacterias coliformes mientras que inhibe a gran parte de la flora Gram (+).

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Figura 1. Procedimiento para la realización de las diluciones de tres series de tubos primarios para prueba presuntiva

Figura 2. Procedimiento de realización de las diluciones para mas de tres series de tubos primarios para prueba presuntiva

2.- Prueba confirmatoria (Esquema 1 y 2) En esta fase se confirma la presencia o ausencia de coliformes totales, mediante el cultivo en Caldo Lactosa Verde Brillante Bilis (CLVBB)2, como así también de coliformes fecales, utilizando Caldo EC3. Ambas preparaciones se colocan en tubos de ensayo, con una Campana Durham

2 El caldo es de color verde. 3 El caldo es de color ámbar. Las sales biliares que componen este medio inhiben el crecimiento de gran parte de la flora acompañante.

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invertida en cada uno. Dichos medios son selectivos, pues inhiben notablemente el crecimiento de la flora acompañante indeseable. A la fase de confirmación se llevan todos los tubos primarios positivos en los que haya aparecido cualquier cantidad de gas o de crecimiento ácido dentro de las 24-48 horas de incubación, como así también, aquellos tubos que antes de las 24 horas, presentaron positividad (sin esperar que el tiempo se complete). Si hay otros tubos primarios con crecimiento ácido después de las 48 horas de incubación, también se llevarán a la fase confirmatoria. Para confirmar la presencia de coliformes totales, a partir de tubos positivos primarios, se inocula una porción de cada uno de ellos con un ansa estéril en tubos con CLVBB. Se incuban durante 48 ± 3 horas a 35 ± 0,5ºC. La formación de cualquier cantidad de gas en la campana Durham después del tiempo de incubación constituye un resultado positivo en la fase confirmatoria, la producción de turbidez no indica resultado positivo. Calcular el valor del NMP a partir de los tubos positivos. La confirmación de la presencia de coliformes de origen fecal permite diferenciar entre los coliformes de origen fecal y los procedentes de otras fuentes. El procedimiento consiste en inocular (con ansa) una porción de los tubos primarios positivos en tubos con caldo EC. Los tubos sembrados se incuban en un baño de agua (ver Fig. 3) incubación a 44,5 ± 0,2ºC durante 24 ± 2 horas (prueba a alta temperatura). Depositar todos los tubos en el baño antes de que transcurran los 30 minutos de la inoculación y mantenerlos lo suficientemente profundos, como para que el agua del baño esté a un nivel superior al que tiene el medio en los tubos. Se considera como reacción positiva la aparición de gas a las 24 horas o menos de incubación. La falta de gas constituye un resultado negativo, que indica que el origen de los microorganismos no es el aparato digestivo de los animales de sangre caliente. Una vez obtenido los resultados calcular el valor del NMP a partir de los tubos positivos.

Nota: Para aplicar la técnica de fermentación en tubo múltiple en muestras sólidas o semisólidas, éstas se deben de preparar de la siguiente manera: se pesa la muestra y diluye en un líquido de dilución hasta conseguir una de 10-1. Por ejemplo, se añaden 50 g de muestra en una jarra mezcladora estéril de 450 ml de tampón de fosfato estéril o de agua de dilución con peptona al 1%, y mezclar durante 1 a 2 minutos a baja velocidad (800 rpm). Preparar las diluciones decimales correspondientes del homogeneizado resultante lo antes posible para reducir al mínimo la sedimentación.

Recuentos La cuantificación clásica de las bacterias coliformes se realiza por medio del método estadístico denominado Número más Probable (NMP). Se basa en el concepto de que una o más bacterias inoculadas en un medio de cultivo adecuado, darán origen a una población que se evidenciará dando un resultado positivo. En el caso de las coliformes este resultado consiste en la aparición de turbidez en el medio y/o gas en la campana Durham. Como las bacterias en el agua no se distribuyen en forma homogénea por lo que al sembrar una serie de tubos con porciones de una misma muestra o dilución, habrá series en las que todos los tubos darán resultados positivos, otros negativos y otras en las que los resultados serán positivos y negativos. Para obtener resultados válidos, se deberán sembrar alícuotas apropiadas de la muestra para lograr que la primera serie de tubos (inoculados con la menor dilución), presente resultados todos positivos, y la última (tubos inoculados con la mayor dilución) todos negativos. Utilización de las Tablas Las tablas más comunes están diseñadas para tres series de tubos sembrados con 10, 1 y 0,1 ml de la muestra. Se ingresa a la tabla con el número característico, que consiste en los positivos confirmados de esas series (Tabla 1, ejemplos 1 y 2). Para cada combinación posible de resultados positivos de las tres series, corresponde un valor de NMP. Los valores de NMP expresan cantidad de bacterias por cada 100 ml de muestra.

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Si en lugar de 10, 1 y 0,1 ml de la muestra se sembraron 1, 0,1 y 0,01 ml, el valor de la tabla se multiplicará por 10; si se sembraron 0,1 , 0,01 y 0,001 ml, el valor de la tabla se multiplicará por 100 (Tabla 1, ej. 5 y 6). Cuando se sembraron más de tres diluciones decimales, se ingresa a la tabla con el valor de la mayor dilución que dio todos los resultados positivos, seguidos de los dos siguientes (Tabla 1, ej. 5, 6 y 7). En el ejemplo 4 se eligen las tres primeras diluciones dejando el único resultado positivo en la dilución central. Las tablas 2 y 3, presentan los índices de NMP, para distintas combinaciones de resultados positivos, cuando se utilizan 5 y 3 tubos por dilución, respectivamente. Tabla 1. Ejemplos de utilización de tablas de NMP con tres réplicas por dilución. Ej. 10 1 0,1 0,01 0,001 0,0001 Nº Carac. Valor Tabla Bact./ 100 ml 1 3/3 2/3 0/3 3-2-0 93 93 2 3/3 0/3 0/3 3-0-0 23 23 3 3/3 2/3 1/3 0/3 3-2-1 150 150 4 0/3 1/3 0/3 0/3 0-1-0 3 3 5 3/3 3/3 2/3 0/3 3-2-0 93 93x10 6 0/3 3/3 3/3 2/3 1/3 3-2-1 150 150x100 7 -- -- 3/3 3/3 2/3 0/3 3-2-0 93 93x1000

Tabla 2: Indice de NMP y límites de confianza del 95% para varias combinaciones de resultados positivos, cuando se utilizan 5 tubos por dilución (10 ml, 1 ml y 0,1 ml)

Límites de Confianza 95%

Límites de Confianza 95%

Combinación de tubos positivos

Indice NMP/ 100 ml

Superior Inferior

Combinación de tubos positivos

Indice NMP/ 100 ml

Superior Inferior 0- 0- 0 < 2 --- --- 4-3-0 27 12 67 0- 0- 1 2 1.0 10 4-3-1 33 15 77 0- 1- 0 2 1.0 10 4-4-0 34 16 80 0- 2- 0 4 1.0 13 5-0-0 23 9.0 86 1- 0- 0 2 1.0 11 5-0-1 30 10 110 1- 0- 1 4 1.0 15 5-0-2 40 20 140 1- 1- 0 4 1.0 15 5-1-0 30 10 120 1- 1- 1 6 2.0 18 5-1-1 50 20 150 1- 2- 0 6 2.0 18 5-1-2 60 30 180 2-0-0 4 1.0 17 5-2-0 50 20 170 2-0-1 7 2.0 20 5-2-1 70 30 210 2-1-0 7 2.0 21 5-2-2 90 40 250 2-1-1 9 3.0 24 5-3-0 80 30 250 2-2-0 9 3.0 25 5-3-1 110 40 300 2-3-0 12 5.0 29 5-3-2 140 60 360 3-0-0 8 3.0 24 5-3-3 170 80 410 3-0-1 11 4.0 29 5-4-0 130 50 390 3-1-0 11 4.0 29 5-4-1 170 70 480 3-1-1 14 6.0 35 5-4-2 220 100 580 3-2-0 14 6.0 35 5-4-3 280 120 690 3-2-1 17 7.0 40 5-4-4 350 160 820 4-0-0 13 5.0 38 5-5-0 240 100 940 4-0-1 17 7.0 45 5-5-1 300 100 1300 4-1-0 17 7.0 46 5-5-2 500 200 2000 4-1-1 21 9.0 55 5-5-3 900 300 2900 4-1-2 26 12 63 5-5-4 1600 600 5300 4-2-0 22 9.0 56 5-5-5 > 1600 --- --- 4-2-1 26 12 65

Inóculo: Series A= 10 ml, B= 1 ml y C=0,1 ml de la muestra Fuente: APHA, 1989

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Tabla 3: Indice de NMP, para distintas combinaciones de resultados positivos, cuando se utilizan 3 tubos por dilución (10 ml, 1 ml y 0,1 ml) Combinación de tubos positivos A- B- C

Indice NMP/ 100 ml

Combinación de tubos positivos A- B- C

Indice NMP/ 100 ml

Combinación de tubos positivos A- B- C

Indice NMP/ 100 ml

0- 0- 1 3 1- 1- 2 15 2- 2- 3 42 0- 0- 2 6 1- 1- 3 19 2- 3- 0 29 0- 0- 3 9 1- 2- 0 11 2- 3- 1 36 0- 1- 0 3 1- 2- 1 15 2- 3- 2 44 0- 1- 1 6 1- 2- 2 20 2- 3- 3 53 0- 1- 2 9 1- 2- 3 24 3- 0- 0 23 0- 1- 3 12 1- 3- 0 16 3- 0- 1 39 0- 2- 0 6 1- 3- 1 20 3- 0- 2 64 0- 2- 1 9 1- 3- 2 24 3- 0- 3 95 0- 2 -2 12 1- 3- 3 29 3- 1- 0 43 0- 2- 3 16 2- 0- 0 9 3- 1- 1 75 0- 3- 0 9 2- 0- 1 14 3- 1- 2 120 0- 3- 1 13 2- 0- 2 20 3- 1- 3 160 0- 3- 2 16 2- 0- 3 28 3- 2- 0 93 0- 3- 3 19 2- 1- 0 15 3- 2- 1 150 1- 0- 0 4 2- 1- 1 20 3- 2- 2 210 1- 0- 1 7 2- 1- 2 27 3- 2- 3 290 1- 0- 2 11 2- 1- 3 34 3- 3- 0 240 1- 0- 3 15 2- 2- 0 21 3- 3- 1 460 1- 1- 0 7 2- 2- 1 28 3- 3- 2 1100 1- 1- 1 11 2- 2- 2 35 3- 3- 3 >1100 Inóculo: Series A= 10 ml, B= 1 ml y C=0,1 ml de la muestra Fuente: APHA, 1967 Análisis de los resultados Los recuentos de bacterias coliformes se utilizan internacionalmente para establecer criterios de calidad de aguas para diferentes usos. Si bien existen otros métodos para detección y determinación de bacterias coliformes, el NMP es el más usado a punto tal que en los informes se omite mencionarlo. Los entes oficiales de control frecuentemente utilizan la técnica estándar, sembrando 10, 1 y 0,1 ml de muestra con tres réplicas. Este esquema de trabajo no permite obtener un recuento preciso cuando la población de bacterias excede 1100 bacterias/100 ml. Sin embargo, como este número supera la mayoría de las reglamentaciones, es suficiente para definir el uso de un recurso hídrico y permite un trabajo de rutina normalizado. Tabla 4: Valores guía recomendados por diferentes normativas nacionales e internacionales

vigentes. Indicador Uso del agua Valor guía Referencia C. totales Riego 1000/100 ml * A C. fecales Riego 100/100 ml * C. totales Recreación 500/100 ml ** B C. fecales Recreación 200/100 ml * A C. totales Potable 3/100 ml ** C C. fecales Potable 0/100 ml **

Tratamientos de Potabilización necesarios realizar para los tres casos presentados a) b) c) C. totales Agua superficiales 50 - 5000 - 50000 B C. fecales Para potabilizar 20 - 2000 - 20000

* Media geométrica de un mínimo de cinco análisis en 30 días. ** Frecuencia mínima quincenal.

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a) Filtración y desinfección. b) Coagulación, floculación, filtración y desinfección. c) Cloración, coagulación, floculación, filtración por arena, filtración por carbón activado y desinfección. A. Canadian Water Quality Guidelines. Canadian Council of Resourse and Environmental

Ministers. Marzo 1987. B. L´ètat de l´environnement. Premier Rapport. Commission des Comunautès Europèennes. C. Código Alimentario Argentino. Decreto 141/53. Provisión de agua potable. Decreto 352/79. 3.- Prueba completa A partir de los tubos positivos confirmados, puede realizarse la doble confirmación en medio líquido de CLVBB para coliformes totales, y de medio líquido EC, para coliformes fecales. Los tubos que sean positivos en CLVBB y negativos en medio EC indican la presencia de coliformes no fecales. Esta tercera fase consiste en aislar los microorganismos en agar LES Endo o en EMB4 (Eosina Azul de Metileno), por cada tubo de CLVBB que haya producido gas. Si existen coliformes y se quiere obtener una elevada proporción de aislamientos satisfactorios, se deben tomar las siguientes precauciones: (a) sembrar con ansa estéril; (b) abrir e inclinar el tubo primario positivo evitando la toma con aguja de cualquier membrana o espuma; (c) introducir el ansa a una profundidad de 0,5 cm; (d) sembrar en la placa, evitando no arañar el medio y Flameando el ansa antes de los cuadrantes segundo y tercero, para mejorar el aislamiento de colonias. Las placas se deben incubar en forma invertida a 35 ± 0,5ºC durante 24 ± 2 horas. Las colonias desarrolladas (Ver tabla de Interpretación de resultados) pueden ser típicas (rosas a rojo oscuras con un brillo metálico superficial), atípicas (rosas, rojas, blancas o incoloras sin brillo) a las 24 horas de incubación o negativas (todas las demás). Tómese de cada placa una o más colonias típicas bien definidas o, si no existen, dos o mas dentro de las que se consideran como probablemente formadas por microorganismos del grupo coliforme y se pasan a un tubo con medio lactosado con campana Durham invertida (tubo secundario) y a uno con agar en pico de flauta. Incubar los tubos secundarios a 35 ± 0,5ºC durante 24 ± 2 horas, si no se produce gas en ese período, se prolonga la incubación hasta 48 ± 3 horas. Estudiar microscópicamente colonias obtenidas en los cultivos en agar en pico de flauta, con Tinción de Gram. El resultado positivo de la prueba completa requiere la formación de gas en los tubos secundarios con el medio lactosado, a las 48 ± 3 horas y la demostración de bacilos gramnegativos no esporulados procedentes de los cultivos con agar, demostrando así, la presencia de un miembro del grupo coliforme. Si en los tubos secundarios no se produce gas en 48 ± 3 horas, se deben de ajustar los resultados originales de NMP calculados a partir de la prueba confirmatoria. Tabla 5. Interpretación de Resultados – Siembra en EMB

Microorganismos Tipo de colonias Escherichia coli Verdosas con brillo metálico y centro negro

azulado Enterobacter, Klebsiella spp. Mucosas, rosadas, confluentes Proteus, Salmonella, Shigella Incoloras Candida spp. Incoloras o rosadas, secas, puntiformes Acinetobacter spp. Azul lavanda, pequeñas a medianas.

4 Placas preparadas color púrpura anaranjado verdoso

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Figura 3: Baño de Agua

Esquema 1. Esquema de Prueba Confirmatoria y Completa para la detección de coliformes totales y fecales.

(2) Ausencia de gas o acidez. Incubar

durante otras 24 horas más (total, 48 hs)

(b) Crecimiento

ácido. Confirmar como en B(1)

Ausenacideznegativde grup

(a) Producción de gas. Continuar como en B (1)

(b) Ausencia de gas.

Resultado negativo**

(1.2) Colonias negativas. Ausencia de grupo

coliforme

(a) Producción de gas. Transferir* a LES Endo . Incubar 24 ± 2

horas a 35 ± 0,5°C

(1.1) Colonias de coliformes típicas o atípicas. Transferir a pendiente de agar y tubo de

fermentación con caldo lactosado. Incubar el primero 18 a 24 horas y el segundo 48 ± 3 horas a 35 ± 0,5°C

(b') Ausencia de gas.

Resultado negativo**

(a') Producción de gas. Teñir con Gram parte del crecimiento de la pendiente de agar.

Presencia de besporas. Prueba cocoliforme. PresenRepetir el proced

Presenespora

Prueba cde gr

(1) Producción de gas o acidez. Transferir a

CLVBB. Incubar 48 ± 3 horas a 35 ± 0,5°C

Incubar los tubos de fermentación con medio líquido lactosado inoculados 48 ± 3 horas a 35 ± 0,5°C

* También puede emplearse la prueba EC para coliformes fecales ** Ausencia de grupo coliforme

(1.1.2) cia de esporas o s y bacilos G(-). ompleta: ausencia upo coliforme.

(1.1.1) acilos G(-), ausencia de mpleta: presencia de grupo cia de bacilos G(+) y G(-). imiento comenzado en 1.1

(c) cia de gas o . Resultado o. Ausencia o coliforme

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Esquema 2. Esquema de trabajo indicando las siembras, tiempos de incubación, repiques y selección de resultados positivos, para el recuento de coliformes totales y fecales.

Gas + 24 hs

CMC 35°C

Reincubar 24 hs

Gas + 48 hs

EC 44,5°C

CLVBB 35°C

Gas - 48 hs

Gas - 24 hs

MUESTRA

Test Negativo

Presencia de Coliformes Total

G4

Gas - 24 hs

Gas + 24 hs

Gas - 24 hs

Gas + 24 hs

Bibliografía American Public Health Pollution Control FederatWastewater. 17th ed. APH Madigan, M. T, Martinko, Ged. Editorial Prentice Hall I

Reincubar24 hs

Test Negatives

Gas - 48 hs

as + 8 hs

Association (Aion. 1989. StA, Washington,

. M., Parker, JNC.

Presencia de Coliformes Fecales

o

PHA), American Water Works Association & Water andard Methods for the examination of Water and D.C.USA. Part 9000.

., 2004. “Brock, Biología de los microorganismos”.10 ª

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